JP2022122282A - Dupan-2抗原の測定方法、測定試薬及び測定キット - Google Patents
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Abstract
【課題】異なる種類の標準物質を測定した際の測定値の差を無くし、又は測定値の差を小さくし、試料中のDUPAN-2抗原を正確に測定できる測定方法、測定試薬及び測定キットを提供する。【解決手段】水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製することを含み、前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。【選択図】なし
Description
本発明は、DUPAN-2抗原の測定方法、測定試薬及び測定キット、並びに、DUPAN-2抗原の測定試薬及び測定キットに含まれる、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法に関する。
モノクローナル抗体DUPAN-2は、ヒト膵癌培養細胞HPAFを免疫原として用いて作製されたモノクローナル抗体であり、膵癌細胞から高率に産生されるムチン様タンパク質(抗原)に反応することが報告されている(非特許文献1、2)。この抗原は、DUPAN-2抗原と呼ばれており、膵癌及び胆道系癌などの癌マーカーとして用いられている。
DUPAN-2抗原の測定方法としては、competition radioimmunoassay(非特許文献1)及びEnzyme-Linked ImmunoSorbent Assay(特許文献1)が報告されている。
Metzgarら、"Detection of a pancreatic cancer-associated antigen (DU-PAN-2 antigen) in serum and ascites of patients with adenocarcinoma"、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1984年,Vol.81,pp.5242-5246
櫻林ら、「膵癌関連糖蛋白抗原,DU-PAN-2に関する研究I.酵素免疫測定法における基礎的検討および健常人の測定値の分布」、臨床病理、1986年,Vol.34,pp.705-710
試料中のDUPAN-2抗原を測定する場合、標準物質の測定値を基準として、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定する。DUPAN-2抗原の測定に用いられる標準物質として、ヒト膵癌患者の腹水由来のDUPAN-2抗原、ヒト膵癌培養細胞HPAF由来のDUPAN-2抗原等が用いられるが、異なる種類の標準物質を測定した場合に、同じ濃度の標準物質であるにもかかわらず、それぞれの測定値が異なることがあった。そのため、どの種類の標準物質を使用したかによって、試料中のDUPAN-2抗原の濃度が変わることがあった。そこで、異なる種類の標準物質を測定した際の測定値の差を無くし、又は測定値の差を小さくし、試料中のDUPAN-2抗原を正確に測定できる測定方法及び測定試薬が必要とされていた。
本発明の課題は、試料中のDUPAN-2抗原を正確に測定できる測定方法、測定試薬及び測定キットを提供することにある。また、本発明の課題は、前記測定試薬及び測定キットに含まれる、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法を提供することにある。
本発明の課題は、試料中のDUPAN-2抗原を正確に測定できる測定方法、測定試薬及び測定キットを提供することにある。また、本発明の課題は、前記測定試薬及び測定キットに含まれる、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法を提供することにある。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを反応させる際に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを所定の割合で混合させることにより、異なる種類の標準物質を測定した際の測定値の差を無くし、又は測定値の差を小さくすることができ、試料中のDUPAN-2抗原を正確に測定できることを見出し、本開示内容の発明を完成するに至った。
すなわち、本開示は一態様において以下を提供する。
[1] 水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製することを含み、
前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[1] 水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製することを含み、
前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[2] (1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含み、
工程(1)の反応液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含み、
工程(1)の反応液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[3] (1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(2)DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、水性媒体中で、工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(3)工程(2)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
を含み、
工程(2)おいて、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
(2)DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、水性媒体中で、工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(3)工程(2)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
を含み、
工程(2)おいて、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[4] (1)DUPAN-2抗原を含む試料に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を添加する工程;
(2)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原に、前記不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(3)工程(2)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含み、
工程(1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
(2)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原に、前記不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(3)工程(2)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含み、
工程(1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[5] (1)DUPAN-2抗原を含む試料に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を添加する工程;
(2)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原に、前記不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(3)工程(2)で生成した免疫複合体1に、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する工程;
(4)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、工程(2)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(5)工程(4)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
を含み、
工程(1)における、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量が、工程(3)における、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[6] DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に標識が結合している、[1]~[5]のいずれか1に記載の方法。
[7] 標識がアルカリホスファターゼである、[6]に記載の方法。
(2)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原に、前記不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(3)工程(2)で生成した免疫複合体1に、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する工程;
(4)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、工程(2)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(5)工程(4)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
を含み、
工程(1)における、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量が、工程(3)における、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。
[6] DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に標識が結合している、[1]~[5]のいずれか1に記載の方法。
[7] 標識がアルカリホスファターゼである、[6]に記載の方法。
[8] DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含み、
前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬。
前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬。
[9] DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体を含む第1試薬と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を含む第2試薬と、を含み、
第1試薬における前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、第2試薬における前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定キット。
第1試薬における前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、第2試薬における前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定キット。
[10] [8]に記載の試薬における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法であって、
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程、
を含む、方法。
[11] 前記工程(1)において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度が6μg/mL以上30μg/mL以下である、[10]に記載の方法。
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程、
を含む、方法。
[11] 前記工程(1)において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度が6μg/mL以上30μg/mL以下である、[10]に記載の方法。
[12] [9]に記載のキットにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法であって、
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程、
を含む、方法。
[13] 前記工程(1)において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度が6μg/mL以上30μg/mL以下である、[12]に記載の方法。
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程、
を含む、方法。
[13] 前記工程(1)において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度が6μg/mL以上30μg/mL以下である、[12]に記載の方法。
本開示によれば、異なる種類の標準物質を測定した場合であっても、それぞれの標準物質の測定値の差が無くなる、又は測定値の差が小さくなる。従って、試料中のDUPAN-2抗原を正確に測定できる方法、試薬及びキットを提供することができる。
以下、本開示を実施するための形態ついて詳細に説明する。なお、以下に説明する実施形態は、本開示の代表的な実施形態の一例を示したものであり、これにより開示の範囲が狭く解釈されることはない。
なお、「~」を用いて示された数値範囲は、「~」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また、溶液中の各成分の量は、溶液中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、試薬中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本開示において、「%(w/v)」とは、体積(100mL)を基準とする質量(g)の百分率を意味する。
なお、「~」を用いて示された数値範囲は、「~」の前後に記載される数値をそれぞれ最小値及び最大値として含む範囲を示す。また、溶液中の各成分の量は、溶液中に各成分に該当する物質が複数存在する場合、特に断らない限り、試薬中に存在する当該複数の物質の合計量を意味する。
本開示において、「%(w/v)」とは、体積(100mL)を基準とする質量(g)の百分率を意味する。
本開示において、抗体とDUPAN-2抗原とが「結合する」、「反応する」、あるいは抗体がDUPAN-2抗原を「認識する」と表現する場合、本開示の分野で通常使用される意味を含み、いずれも同義で用いる。抗体とDUPAN-2抗原とが「結合する」ことを確認する方法としては、当業者に周知の競合ELISA法、サンドイッチELISA法、表面プラズモン共鳴の原理を利用した方法などにより行うことができる。
「水性媒体」
本開示における水性媒体としては、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、酢酸緩衝液、グッド緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤は、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
水性媒体には、塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
塩類としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。金属イオンとしては、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。蛋白質としては、ウシ血清アルブミン(以下、BSAと記す)等が挙げられる。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
本開示における水性媒体としては、脱イオン水、蒸留水、緩衝液等が挙げられ、緩衝液が好ましい。緩衝液の調製に使用される緩衝剤としては、酢酸緩衝液、グッド緩衝剤等が挙げられる。緩衝剤は、1種を単独で使用してもよいし、2種以上を併用してもよい。
水性媒体には、塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
塩類としては、塩化リチウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム等が挙げられる。金属イオンとしては、ナトリウムイオン、マグネシウムイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン等が挙げられる。糖類としては、マンニトール、ソルビトール等が挙げられる。蛋白質としては、ウシ血清アルブミン(以下、BSAと記す)等が挙げられる。界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、両イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤等が挙げられる。
「試料」
本開示における試料としては、DUPAN-2抗原を含有する可能性がある試料であれば特に制限はなく、全血、血漿、血清、尿、腹水、髄液、唾液、羊水、尿、汗及び膵液からなる群から選択されるいずれか1以上の生体試料等が挙げられ、好ましくは全血、血漿、血清、腹水等が挙げられる。また、ヒト膵癌培養細胞HPAFの細胞可溶化物(cell lysate)、ヒト膵癌培養細胞HPAFを培養した際に得られる培養上清であってもよい。
本開示における試料は、水性媒体に含まれるDUPAN-2抗原であってもよく、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(0.15mol/Lの塩化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液、pH7.2、以下、PBSと記す)等で希釈されたDUPAN-2抗原が挙げられる。水性媒体に含まれるDUPAN-2抗原としては、前記生体試料、前記細胞可溶化物又は前記培養上清から精製されたDUPAN-2抗原を用いることができる。
本開示における試料としては、DUPAN-2抗原を含有する可能性がある試料であれば特に制限はなく、全血、血漿、血清、尿、腹水、髄液、唾液、羊水、尿、汗及び膵液からなる群から選択されるいずれか1以上の生体試料等が挙げられ、好ましくは全血、血漿、血清、腹水等が挙げられる。また、ヒト膵癌培養細胞HPAFの細胞可溶化物(cell lysate)、ヒト膵癌培養細胞HPAFを培養した際に得られる培養上清であってもよい。
本開示における試料は、水性媒体に含まれるDUPAN-2抗原であってもよく、例えば、リン酸緩衝化生理食塩水(0.15mol/Lの塩化ナトリウムを含有する10mmol/Lリン酸緩衝液、pH7.2、以下、PBSと記す)等で希釈されたDUPAN-2抗原が挙げられる。水性媒体に含まれるDUPAN-2抗原としては、前記生体試料、前記細胞可溶化物又は前記培養上清から精製されたDUPAN-2抗原を用いることができる。
「不溶性担体」
本開示において、不溶性担体は、本開示のDUPAN-2抗原の測定方法を可能とし、又は本開示の測定試薬若しくは測定キットに使用可能な不溶性担体であれば特に制限はなく、スライドグラス、ELISAプレート(マイクロタイタープレート)、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、フィルター、フィルム、メンブレン等が挙げられる。不溶性担体の材料としては、無機基材、多糖類基材、高分子基材等からなるものが挙げられ、例えばガラス、シリコン、セラミック、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタンが挙げられる。
本開示において、不溶性担体は、本開示のDUPAN-2抗原の測定方法を可能とし、又は本開示の測定試薬若しくは測定キットに使用可能な不溶性担体であれば特に制限はなく、スライドグラス、ELISAプレート(マイクロタイタープレート)、ビーズ、ラテックス粒子、磁性粒子、フィルター、フィルム、メンブレン等が挙げられる。不溶性担体の材料としては、無機基材、多糖類基材、高分子基材等からなるものが挙げられ、例えばガラス、シリコン、セラミック、セルロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリカーボネート、ポリエチレン、ポリプルピレン、ポリスチレン、ポリエチレンテレフタレート、ポリウレタンが挙げられる。
「DUPAN-2抗原」
本開示におけるDUPAN-2抗原は、モノクローナル抗体「DUPAN-2」(Metzgarら、“Antigens of Human Pancreatic Adenocarcinoma Cells Defined by Murine Monoclonal Antibodies”、 CANCER RESEARCH(1982), 42:601-608)が結合するムチン様タンパク質(糖タンパク質)、モノクローナル抗体「DUPAN-2」が結合する糖鎖、又は当該糖鎖を含むペプチドをいう。具体的には、DUPAN-2抗原は、モノクローナル抗体「DUPAN-2」が結合すると報告されているシアリルルイスC糖鎖(Kawaら、“Epitope Analysis of Span-1 and DUPAN-2 using Synthesized Glycoconjugates Sialyllact-N-Fucopentaose II and Sialyllact-N-Tetraose”、 Pancreas (1994), 9 (6):692-697)、当該糖鎖を有するタンパク質、又は当該糖鎖を有するペプチドをいう。DUPAN-2抗原としては、ヒト膵癌患者の腹水、又はヒト膵癌培養細胞HPAFの培養上清に含まれるDUPAN-2抗原を使用することができる。ヒト膵癌培養細胞HPAFは、「HPAF-II」という名称でATCC(American Type Culture Collection)から入手することができる。
本開示におけるDUPAN-2抗原は、モノクローナル抗体「DUPAN-2」(Metzgarら、“Antigens of Human Pancreatic Adenocarcinoma Cells Defined by Murine Monoclonal Antibodies”、 CANCER RESEARCH(1982), 42:601-608)が結合するムチン様タンパク質(糖タンパク質)、モノクローナル抗体「DUPAN-2」が結合する糖鎖、又は当該糖鎖を含むペプチドをいう。具体的には、DUPAN-2抗原は、モノクローナル抗体「DUPAN-2」が結合すると報告されているシアリルルイスC糖鎖(Kawaら、“Epitope Analysis of Span-1 and DUPAN-2 using Synthesized Glycoconjugates Sialyllact-N-Fucopentaose II and Sialyllact-N-Tetraose”、 Pancreas (1994), 9 (6):692-697)、当該糖鎖を有するタンパク質、又は当該糖鎖を有するペプチドをいう。DUPAN-2抗原としては、ヒト膵癌患者の腹水、又はヒト膵癌培養細胞HPAFの培養上清に含まれるDUPAN-2抗原を使用することができる。ヒト膵癌培養細胞HPAFは、「HPAF-II」という名称でATCC(American Type Culture Collection)から入手することができる。
「DUPAN-2抗原を認識する抗体」
本開示において、DUPAN-2抗原を認識する抗体(DUPAN-2抗原を認識する第1抗体、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体)とは、DUPAN-2抗原のシアリルルイスCを認識し、DUPAN-2抗原に結合することができる抗体をいう。
本開示において、DUPAN-2抗原を認識する抗体(DUPAN-2抗原を認識する第1抗体、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体)とは、DUPAN-2抗原のシアリルルイスCを認識し、DUPAN-2抗原に結合することができる抗体をいう。
DUPAN-2抗原を認識する抗体は、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体若しくはキメラ抗体であってよく、又は他の種由来抗体であってもよい。また、DUPAN-2抗原を認識する抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス(例えば、IgG、IgE、IgM、IgD及びIgA)、任意のサブクラス(例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及びIgA2)であり得る。
DUPAN-2抗原を認識する抗体としては、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、二量体、多量体等が挙げられ、均質性及び安定性の観点からはモノクローナル抗体が好ましい。
本開示において、DUPAN-2抗原を認識する抗体は抗体断片であってもよい。抗体断片とは、前記DUPAN-2抗原を認識する抗体の一部であって、抗体の可変ドメインを含むか、少なくとも抗原結合領域を含むものをいう。本開示における抗体断片としては、例えばFab、Fab’、F(ab’)2、Fv断片、線状抗体、一本鎖抗体(scFv)、sc(Fv)2、Fab3、ドメイン抗体(dAb)、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ及びミニボディが挙げられる。「Fv断片」は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識領域と抗原結合領域を含む。
本開示のDUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とは、それぞれの抗体が結合するDUPAN-2抗原の部位は同じであっても、異なっていてもよい。また、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とは同一の抗体であってもよいし、異なる抗体であってもよい。
本開示におけるDUPAN-2抗原を認識する抗体は、DUPAN-2抗原、又はDUPAN-2抗原を産生する癌細胞を免疫原として用いて、通常の抗体の作製方法により取得することができる。例えば、前記免疫原を動物に免疫することで得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞とを融合した細胞(ハイブリドーマ)を作製し、前記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を得ることにより取得することができる。DUPAN-2抗原を認識するモノクローナル抗体としては、前述のモノクローナル抗体「DUPAN-2」(Metzgarら、“Antigens of Human Pancreatic Adenocarcinoma Cells Defined by Murine Monoclonal Antibodies”、CANCER RESEARCH(1982),42:601-608)等が挙げられる。なお、本開示において、当該モノクローナル抗体DUPAN-2を「DUPAN-2抗体」とも記載する。
「不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体」
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の、不溶性担体への結合方法としては、本開示のDUPAN-2抗原の測定方法を可能とし、又は本開示の測定試薬若しくは測定キットに使用可能な結合方法であれば特に制限はなく、物理吸着による結合、化学結合による結合等が挙げられる。物理吸着としては、静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、共有結合、配位結合等が挙げられる。
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の、不溶性担体への結合方法としては、本開示のDUPAN-2抗原の測定方法を可能とし、又は本開示の測定試薬若しくは測定キットに使用可能な結合方法であれば特に制限はなく、物理吸着による結合、化学結合による結合等が挙げられる。物理吸着としては、静電的結合、水素結合、疎水結合等が挙げられる。化学結合としては、共有結合、配位結合等が挙げられる。
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体は、前述の物理吸着及び/又は化学結合を利用して、直接、不溶性担体に結合させてもよいし、間接的に不溶性担体に結合させてもよい。間接的な結合方法としては、ビオチンとアビジン類(アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等)等の一組の親和性物質の特異的結合を利用して、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を不溶性担体に結合する方法、リンカーを介した共有結合により不溶性担体に結合する方法等が挙げられる。
一組の親和性物質を用いる場合、一組の親和性物質の一方(A)が結合したDUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、一組の親和性物質の他方(a)が結合した不溶性担体とを、結合させることにより、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を生成させることができる。
A-aの組み合わせとしては、以下の組み合わせ等が挙げられる。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・DUPAN-2抗原を認識する第1抗体のFc領域と、Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
・ビオチンとアビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)との組み合わせ;
・アビジン類(アビジン、ニュートラアビジン、ストレプトアビジン等)とビオチンとの組み合わせ;
・DUPAN-2抗原を認識する第1抗体のFc領域と、Fc領域と結合する抗体との組み合わせ。
リンカーとしては、不溶性担体表面の官能基と、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が有する官能基との両者を共有結合できる分子等が挙げられ、例えば、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が有する官能基と反応することができる第1の反応活性基と、不溶性担体表面の官能基と反応することができる第2の反応活性基とを同時に持つ分子であって、第1の反応活性基と第2の反応活性基とが異なる基である分子が好ましく用いられる。DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が有する官能基、及び不溶性担体がその表面に保持している官能基としては、カルボキシル基、アミノ基、グリシジル基、スルフヒドリル基、水酸基、アミド基、イミノ基、N-ヒドロキシサクシニル基、マレイミド基等が挙げられる。リンカーにおける反応活性基としては、アリルアジド、カルボジイミド、ヒドラジド、アルデヒド、ヒドロキシメチルホスフィン、イミドエステル、イソシアネート、マレイミド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、ペンタフルオロフェニル(PFP)エステル、ソラレン、ピリジルジスルフィド、ビニルスルホン等の基が挙げられる。
「試料中のDUPAN-2抗原の測定方法」
本開示における試料中のDUPAN-2抗原の測定方法の一つの態様は、水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製することを含む、DUPAN-2抗原の測定方法である。
本開示における試料中のDUPAN-2抗原の測定方法の一つの態様は、水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製することを含む、DUPAN-2抗原の測定方法である。
水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製した後、以下の工程を行うことで、試料中のDUPAN-2抗原を測定することができる。
(1)DUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程。
(1)DUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程。
更に、工程(2)の後に、以下の工程(3)及び工程(4)を行うことにより、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定することもできる。
(3)試料として既知濃度のDUPAN-2抗原を用いて、前記工程(1)から(2)を行い、DUPAN-2抗原濃度と測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(4)工程(3)で作成された検量線と、工程(2)の測定により得られた測定値とから、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定する工程。
(3)試料として既知濃度のDUPAN-2抗原を用いて、前記工程(1)から(2)を行い、DUPAN-2抗原濃度と測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(4)工程(3)で作成された検量線と、工程(2)の測定により得られた測定値とから、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定する工程。
既知濃度のDUPAN-2抗原としては、ヒト膵癌患者の腹水由来のDUPAN-2抗原(以下、単に「腹水由来のDUPAN-2抗原」と記す)又はヒト膵癌培養細胞HPAF由来のDUPAN-2抗原をPBSで希釈したDUPAN-2抗原溶液等が挙げられる。既知濃度のDUPAN-2抗原について、複数の濃度を用意してもよい。
既知濃度のDUPAN-2抗原におけるDUPAN-2抗原の濃度としては、DUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、10U/mL以上、20U/mL以上、30U/mL以上、40U/mL以上、50U/mL以上、60U/mL以上、70U/mL以上、80U/mL以上、90U/mL以上、又は100U/mL以上であってよい。また、既知濃度のDUPAN-2抗原におけるDUPAN-2抗原の濃度は、200U/mL以下、300U/mL以下、350U/mL以下、400U/mL以下、500U/mL以下、600U/mL以下、700U/mL以下、800U/mL以下、900U/mL以下、1000U/mL以下、1100U/mL以下、1200U/mL以下、1400U/mL以下、1600U/mL以下、1800U/mL以下、2000U/mL以下、3000U/mL以下、4000U/mL以下、5000U/mL以下、6000U/mL以下、7000U/mL以下、8000U/mL以下、9000U/mL以下、10000U/mL以下、又は15000U/mL以下であってよい。
なお、DUPAN-2抗原の濃度単位「U/mL」について、「特定の膵癌患者の血清を競合ラジオイムノアッセイ法により測定した場合の、当該血清に含まれるDUPAN-2抗原の濃度を1000U/mLする」と定義される(Metzgarら、“Detection of a pancreatic cancer-associated antigen (DU-PAN-2 antigen) in serum and ascites of patients with adenocarcinoma”、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1984年,Vol.81,pp.5242-5246)。
なお、DUPAN-2抗原の濃度単位「U/mL」について、「特定の膵癌患者の血清を競合ラジオイムノアッセイ法により測定した場合の、当該血清に含まれるDUPAN-2抗原の濃度を1000U/mLする」と定義される(Metzgarら、“Detection of a pancreatic cancer-associated antigen (DU-PAN-2 antigen) in serum and ascites of patients with adenocarcinoma”、Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America、1984年,Vol.81,pp.5242-5246)。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、10U/mL~10000U/mLであってよく、20U/mL~5000U/mLであってよく、30U/mL~1600U/mLであってよく、40U/mL~400U/mLであってよく、40U/mL~350U/mLであってよい。
本開示では、ある濃度について、上限値の例と下限値の例とからそれぞれ任意の数値を選択し、それらを組み合わせて得られる数値範囲も、本開示に例示されているものとみなす。重量倍、モル当量倍、温度、時間の他の数値についても同様である。
本開示では、ある濃度について、上限値の例と下限値の例とからそれぞれ任意の数値を選択し、それらを組み合わせて得られる数値範囲も、本開示に例示されているものとみなす。重量倍、モル当量倍、温度、時間の他の数値についても同様である。
前記工程(2)の前に、洗浄工程を設けることもできる。不溶性担体の洗浄に使用する洗浄液としては、DUPAN-2抗原の測定を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、PBS、界面活性剤を含有するPBS等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばTween 20等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
前記混合液を調製することにおいて、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを、どのような順序で混合してもよい。例えば、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体に、試料中のDUPAN-2抗原と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを混合してもよいし、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを混合してもよいし、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体とを混合してもよい。
前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上、2.7重量倍以上、2.8重量倍以上、2.9重量倍以上、3重量倍以上、4重量倍以上、5重量倍以上、6重量倍以上、7重量倍以上、8重量倍以上、又は9重量倍以上であってよい。また、前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10重量倍以下、12重量倍以下、13重量倍以下、14重量倍以下、15重量倍以下、20重量倍以下、25重量倍以下、30重量倍以下、35重量倍以下、40重量倍以下、45重量倍以下、50重量倍以下、60重量倍以下、70重量倍以下、80重量倍以下、90重量倍以下、100重量倍以下、150重量倍以下、又は200重量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上200重量倍以下であってもよく、2.8重量倍以上150重量倍以下であってもよく、3重量倍以上100重量倍以下であってもよく、3重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上10重量倍以下であってもよい。
前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上、2.7モル当量倍以上、2.8モル当量倍以上、2.9モル当量倍以上、3モル当量倍以上、4モル当量倍以上、5モル当量倍以上、6モル当量倍以上、7モル当量倍以上、8モル当量倍以上、又は9モル当量倍以上であってよい。また、前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10モル当量倍以下、12モル当量倍以下、13モル当量倍以下、14モル当量倍以下、15モル当量倍以下、20モル当量倍以下、25モル当量倍以下、30モル当量倍以下、35モル当量倍以下、40モル当量倍以下、45モル当量倍以下、50モル当量倍以下、60モル当量倍以下、70モル当量倍以下、80モル当量倍以下、90モル当量倍以下、100モル当量倍以下、150モル当量倍以下、又は200モル当量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上200モル当量倍以下、2.8モル当量倍以上150モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上100モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上10モル当量倍以下であってもよい。
前記混合液における不溶性担体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、0.001mg/mL以上、0.002mg/mL以上、0.003mg/mL以上、0.004mg/mL以上、0.005mg/mL以上、0.01mg/mL以上、0.02mg/mL以上、0.03mg/mL以上、0.04mg/mL以上、0.05mg/mL以上、0.06mg/mL以上、0.07mg/mL以上、0.08mg/mL以上、0.09mg/mL以上、0.1mg/mL以上、0.2mg/mL以上、0.3mg/mL以上、0.4mg/mL以上、又は0.5mg/mL以上であってよい。また、前記混合液における不溶性担体の濃度は、0.6mg/mL以下、0.7mg/mL以下、0.8mg/mL以下、0.9mg/mL以下、1mg/mL以下、2mg/mL以下、3mg/mL以下、4mg/mL以下、5mg/mL以下、6mg/mL以下、7mg/mL以下、8mg/mL以下、9mg/mL以下、又は10mg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記混合液における不溶性担体の濃度は、0.003mg/mL~10mg/mLであってもよく、0.01mg/mL~3mg/mLであってもよく、0.05mg/mL~1mg/mLであってもよい。
前記混合液中の、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、前記混合液中の、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記混合液中の、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~30μg/mLであってもよく、6μg/mL~30μg/mLであってもよく、10μg/mL~20μg/mLであってもよい。
前記混合液中の、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.33μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、又は0.9μg/mL以上であってよい。また、前記混合液中の、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、1μg/mL以下、2μg/mL以下、3μg/mL以下、4μg/mL以下、5μg/mL以下、6μg/mL以下、7μg/mL以下、7.5μg/mL以下、8μg/mL以下、9μg/mL以下、10μg/mL以下、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記混合液中の、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.03μg/mL~30μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~20μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~1μg/mLであってもよい。
なお、本明細書において、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の量又は濃度とは、当該第2抗体自体の量又は濃度を意味する他、後述の標識と当該第2抗体とが結合した標識抗体の量又は濃度も意味する。
なお、本明細書において、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の量又は濃度とは、当該第2抗体自体の量又は濃度を意味する他、後述の標識と当該第2抗体とが結合した標識抗体の量又は濃度も意味する。
前記混合液中のDUPAN-2抗原の濃度としては、DUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、1U/mL~1000U/mLであってよく、2U/mL~500U/mLであってよく、3U/mL~160U/mLであってよく、4U/mL~160U/mLであってよく、4U/mL~40U/mLであってよく、6U/mL~35U/mLであってよい。
本開示における試料中のDUPAN-2抗原の測定方法の他の態様は、
(1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含む、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法である。
(1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含む、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法である。
更に、工程(2)の後に、以下の工程(3)及び工程(4)を行うことにより、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定することもできる。
(3)試料として既知濃度のDUPAN-2抗原を用いて、前記工程(1)から(2)を行い、DUPAN-2抗原濃度と測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(4)工程(3)で作成された検量線と、工程(2)の測定により得られた測定値とから、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定する工程。
(3)試料として既知濃度のDUPAN-2抗原を用いて、前記工程(1)から(2)を行い、DUPAN-2抗原濃度と測定値との関係を表す検量線を作成する工程;
(4)工程(3)で作成された検量線と、工程(2)の測定により得られた測定値とから、試料中のDUPAN-2抗原の濃度を決定する工程。
既知濃度のDUPAN-2抗原としては、腹水由来のDUPAN-2抗原又はヒト膵癌培養細胞HPAF由来のDUPAN-2抗原をPBSで希釈したDUPAN-2抗原溶液等が挙げられる。既知濃度のDUPAN-2抗原について、複数の濃度を用意してもよい。
既知濃度のDUPAN-2抗原におけるDUPAN-2抗原の濃度としては、DUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、例えば前述の濃度等が挙げられる。
前記工程(2)の前に、洗浄工程を設けることもできる。不溶性担体の洗浄に使用する洗浄液としては、DUPAN-2抗原の測定を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、PBS、界面活性剤を含有するPBS等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばTween(登録商標) 20等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
<工程(1)>
工程(1)は、水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程である。
工程(1)は、水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程である。
工程(1)において、DUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体との反応は、不溶性担体上に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体が生成する限りは特に制限はなく、例えば、DUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させて、不溶性担体上に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体とDUPAN-2抗原との免疫複合体を生成させた後に、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を反応させてもよいし、DUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを混合して反応させてもよい。
DUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを混合して反応させる場合、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する順番は、いかなる順番であってもよい。例えば、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体に、試料中のDUPAN-2抗原と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを添加してもよいし、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを添加してもよいし、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体とを添加してもよい。
DUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを混合して反応させる場合、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する順番は、いかなる順番であってもよい。例えば、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体に、試料中のDUPAN-2抗原と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを添加してもよいし、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とを添加してもよいし、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体とを添加してもよい。
工程(1)は、以下の工程(1-1)と工程(1-2)に分けて行い、その後、工程(2)を行ってもよい。
(1-1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(1-2)DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、水性媒体中で、工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(2)工程(1-2)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
(1-1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(1-2)DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、水性媒体中で、工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(2)工程(1-2)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
前記工程(1-1)と工程(1-2)の間に、洗浄工程を設けることもできる。また、前記工程(1-2)と工程(2)の間に、洗浄工程を設けることもできる。不溶性担体の洗浄に使用する洗浄液としては、DUPAN-2抗原の測定を可能とする洗浄液であれば特に制限はなく、PBS、界面活性剤を含有するPBS等が挙げられる。界面活性剤としては、例えばTween 20等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。
前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上、2.7重量倍以上、2.8重量倍以上、2.9重量倍以上、3重量倍以上、4重量倍以上、5重量倍以上、6重量倍以上、7重量倍以上、8重量倍以上、又は9重量倍以上であってよい。また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10重量倍以下、12重量倍以下、13重量倍以下、14重量倍以下、15重量倍以下、20重量倍以下、25重量倍以下、30重量倍以下、35重量倍以下、40重量倍以下、45重量倍以下、50重量倍以下、60重量倍以下、70重量倍以下、80重量倍以下、90重量倍以下、100重量倍以下、150重量倍以下、又は200重量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上200重量倍以下であってもよく、2.8重量倍以上150重量倍以下であってもよく、3重量倍以上100重量倍以下であってもよく、3重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上10重量倍以下であってもよい。
前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上、2.7モル当量倍以上、2.8モル当量倍以上、2.9モル当量倍以上、3モル当量倍以上、4モル当量倍以上、5モル当量倍以上、6モル当量倍以上、7モル当量倍以上、8モル当量倍以上、又は9モル当量倍以上であってよい。また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10モル当量倍以下、12モル当量倍以下、13モル当量倍以下、14モル当量倍以下、15モル当量倍以下、20モル当量倍以下、25モル当量倍以下、30モル当量倍以下、35モル当量倍以下、40モル当量倍以下、45モル当量倍以下、50モル当量倍以下、60モル当量倍以下、70モル当量倍以下、80モル当量倍以下、90モル当量倍以下、100モル当量倍以下、150モル当量倍以下、又は200モル当量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上200モル当量倍以下、2.8モル当量倍以上150モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上100モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上10モル当量倍以下であってもよい。
前記工程(1)及び工程(1-1)における不溶性担体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、0.001mg/mL以上、0.002mg/mL以上、0.003mg/mL以上、0.004mg/mL以上、0.005mg/mL以上、0.01mg/mL以上、0.02mg/mL以上、0.03mg/mL以上、0.04mg/mL以上、0.05mg/mL以上、0.06mg/mL以上、0.07mg/mL以上、0.08mg/mL以上、0.09mg/mL以上、0.1mg/mL以上、0.2mg/mL以上、0.3mg/mL以上、0.4mg/mL以上、又は0.5mg/mL以上であってよい。また、前記工程(1)及び工程(1-1)における不溶性担体の濃度は、0.6mg/mL以下、0.7mg/mL以下、0.8mg/mL以下、0.9mg/mL以下、1mg/mL以下、2mg/mL以下、3mg/mL以下、4mg/mL以下、5mg/mL以下、6mg/mL以下、7mg/mL以下、8mg/mL以下、9mg/mL以下、又は10mg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)及び工程(1-1)における不溶性担体の濃度は、0.003mg/mL~10mg/mLであってもよく、0.01mg/mL~3mg/mLであってもよく、0.05mg/mL~1mg/mLであってもよい。
前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする量であれば特に制限はなく、0.5ng以上、1ng以上、1.5ng以上、2ng以上、2.5ng以上、3ng以上、3.5ng以上、4ng以上、4.5ng以上、5ng以上、10ng以上、15ng以上、20ng以上、25ng以上、30ng以上、35ng以上、40ng以上、45ng以上、50ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、250ng以上、300ng以上、350ng以上、400ng以上、450ng以上、又は500ng以上であってよい。また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、550ng以下、600ng以下、650ng以下、700ng以下、750ng以下、800ng以下、850ng以下、900ng以下、950ng以下、1μg以下、1.5μg以下、2μg以下、2.5μg以下、又は5μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.5ng~5μgであってもよく、5ng~1.5μgであってもよく、150ng~1μgであってもよく、300ng~1μgであってもよく、500ng~1μgであってもよい。
前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~30μg/mLであってもよく、6μg/mL~30μg/mLであってもよく、10μg/mL~20μg/mLであってもよい。
前記工程(1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする量であれば特に限定はなく、0.1ng以上、1ng以上、2ng以上、3ng以上、4ng以上、5ng以上、6ng以上、7ng以上、8ng以上、9ng以上、10ng以上、20ng以上、30ng以上、40ng以上、50ng以上、60ng以上、70ng以上、80ng以上、又は90ng以上であってよい。また、前記工程(1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量は、100ng以下、200ng以下、300ng以下、400ng以下、500ng以下、600ng以下、700ng以下、800ng以下、900ng以下、1μg以下、1.1μg以下、1.2μg以下、1.3μg以下、1.4μg以下、1.5μg以下、1.6μg以下、1.7μg以下、1.8μg以下、1.9μg以下、2μg以下、3μg以下、4μg以下、5μg以下、又は10μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量は、1ng~10μgであってもよく、3ng~3μgであってもよく、10ng~2μgであってもよく、10ng~100ngであってもよい。
前記工程(1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.33μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、又は0.9μg/mL以上であってよい。また、前記工程(1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、1μg/mL以下、2μg/mL以下、3μg/mL以下、4μg/mL以下、5μg/mL以下、6μg/mL以下、7μg/mL以下、7.5μg/mL以下、8μg/mL以下、9μg/mL以下、10μg/mL以下、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)及び工程(1-2)における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.03μg/mL~30μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~20μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~1μg/mLであってもよい。
前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)は水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。
また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)の反応温度は、DUPAN-2抗原の測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば、0~50℃であり、4~45℃が好ましく、20~40℃が特に好ましい。また、前記工程(1)、工程(1-1)及び工程(1-2)の反応時間は、DUPAN-2抗原の測定を可能とする時間であれば特に限定はなく、例えば、5分間~3時間であり、10分間~2時間が好ましい。
<工程(2)>
工程(2)において、前記工程(1)で生成した免疫複合体又は前記工程(1-2)で生成した免疫複合体2を以下の方法を用いて測定することにより、試料中のDUPAN-2抗原の測定値が決定される。
工程(2)において、前記工程(1)で生成した免疫複合体又は前記工程(1-2)で生成した免疫複合体2を以下の方法を用いて測定することにより、試料中のDUPAN-2抗原の測定値が決定される。
[DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に標識が結合していない場合]
DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に結合する抗体(以下、第3抗体と記す)に標識が結合した標識化第3抗体を用いて、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2を測定することができる。すなわち、前記免疫複合体に前記標識化第3抗体を反応させ、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2と、標識化第3抗体との複合体3を形成させ、当該複合体3の標識を後述の方法により測定することにより、前記工程(1)で生成した免疫複合体の量、又は工程(1-2)で生成した免疫複合体2の量を測定することができる。第3抗体としては、例えばDUPAN-2抗原を認識する第2抗体のFc領域に結合する抗体等が挙げられる。
DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に結合する抗体(以下、第3抗体と記す)に標識が結合した標識化第3抗体を用いて、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2を測定することができる。すなわち、前記免疫複合体に前記標識化第3抗体を反応させ、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2と、標識化第3抗体との複合体3を形成させ、当該複合体3の標識を後述の方法により測定することにより、前記工程(1)で生成した免疫複合体の量、又は工程(1-2)で生成した免疫複合体2の量を測定することができる。第3抗体としては、例えばDUPAN-2抗原を認識する第2抗体のFc領域に結合する抗体等が挙げられる。
標識化第3抗体と、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2との反応の反応温度は、DUPAN-2抗原の測定を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば、0~50℃であってよく、4~45℃であってよく、20~40℃であってよい。当該反応の反応時間は、DUPAN-2抗原の測定を可能とする時間であれば特に制限はなく、例えば、1分間~4時間であってよく、5分間~3時間であってよく、10分間~2時間であってよい。標識化第3抗体の反応溶液中の濃度は、DUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、例えば、0.01~100μg/mLであってよく、0.1~20μg/mLであってよい。
[DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に標識が結合している場合]
工程(2)は、標識を用いて、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2を測定することにより行うことができる。
DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、標識を結合させる方法は、免疫測定の技術分野において公知である。例えば、1個若しくは数個のアミノ酸を介して、又は、1個若しくは数個のアミノ酸とリンカーを介して、抗体に標識を結合させることができる。また、標識をタンパク質に結合させるキットも各種市販されている。
工程(2)は、標識を用いて、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2を測定することにより行うことができる。
DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、標識を結合させる方法は、免疫測定の技術分野において公知である。例えば、1個若しくは数個のアミノ酸を介して、又は、1個若しくは数個のアミノ酸とリンカーを介して、抗体に標識を結合させることができる。また、標識をタンパク質に結合させるキットも各種市販されている。
標識としては、通常の免疫測定方法において用いられる、酵素、放射性同位元素、蛍光性物質、発光性物質、DNA、RNA、補酵素又は補酵素と特異的に結合するもの(ビオチン、アビジン)、タグ、紫外部~赤外部に吸収を有する物質、発色性微粒子、蛍光性微粒子、金属性微粒子、磁性物質、スピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
酵素としては、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、ガラクトシダーゼ、グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ等が挙げられる。放射性同位元素としては、3H、14C、35S、32P、125P、131I等が挙げられる。蛍光性物質としては、FITC(フルオレッセイン イソチオシアナート)、RITC(ローダミンB-イソチオシアナート)等が挙げられる。発光性物質としては、アクリジニウム及びその誘導体、ルテニウム錯体化合物、ロフィン等が挙げられる。
これらの標識から生じるシグナルを検出することにより、前記免疫複合体又は前記免疫複合体2を測定することができる。
前記標識から生じるシグナルの測定方法は、用いる標識により適宜選択すればよい。
標識が発色物質、すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計、マルチウェルプレートリーダー等を用いて吸光度を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が蛍光性物質の場合には、蛍光光度計、蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いて蛍光強度を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が発光性物質の場合には、発光光度計、発光マルチウェルプレートリーダー等を用いて、発光強度を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が放射性同位元素である場合、放射活性をシンチレーションカウンター、γ-ウェルカウンター等により、放射活性を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が酵素である場合には、酵素活性を測定することにより、標識を測定することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識を測定することができる。
前記標識から生じるシグナルの測定方法は、用いる標識により適宜選択すればよい。
標識が発色物質、すなわちある波長の光を吸収する物質の場合には、分光光度計、マルチウェルプレートリーダー等を用いて吸光度を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が蛍光性物質の場合には、蛍光光度計、蛍光マルチウェルプレートリーダー等を用いて蛍光強度を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が発光性物質の場合には、発光光度計、発光マルチウェルプレートリーダー等を用いて、発光強度を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が放射性同位元素である場合、放射活性をシンチレーションカウンター、γ-ウェルカウンター等により、放射活性を測定することにより、標識を測定することができる。
標識が酵素である場合には、酵素活性を測定することにより、標識を測定することができる。例えば酵素の基質を当該酵素と反応させ、生成した物質を測定することにより、標識を測定することができる。
本開示における測定方法は、前記工程(1)の前に、以下の添加工程(A)を含んでいてもよい。
(A)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を添加する工程。
(A)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を添加する工程。
本開示における測定方法は、前記工程(1-1)の前に、以下の添加工程(A1)を含んでいてもよい。
(A1)DUPAN-2抗原を含む試料に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を添加する工程。
前記工程(A1)は、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体に、DUPAN-2抗原を含む試料を添加する工程であってもよい。
(A1)DUPAN-2抗原を含む試料に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を添加する工程。
前記工程(A1)は、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体に、DUPAN-2抗原を含む試料を添加する工程であってもよい。
本開示における測定方法は、前記工程(1-2)の前に、以下の添加工程(A2)を含んでいてもよい。
(A2)前記工程(1-1)で生成した免疫複合体1に、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する工程。
前記工程(A2)は、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、前記工程(1-2)で生成した免疫複合体1を添加する工程であってもよい。
(A2)前記工程(1-1)で生成した免疫複合体1に、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する工程。
前記工程(A2)は、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に、前記工程(1-2)で生成した免疫複合体1を添加する工程であってもよい。
前記工程(A)及び工程(A1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の2.6重量倍以上、2.7重量倍以上、2.8重量倍以上、2.9重量倍以上、3重量倍以上、4重量倍以上、5重量倍以上、6重量倍以上、7重量倍以上、8重量倍以上、又は9重量倍以上であってよい。また、前記工程(A)及び工程(A1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の10重量倍以下、12重量倍以下、13重量倍以下、14重量倍以下、15重量倍以下、20重量倍以下、25重量倍以下、30重量倍以下、35重量倍以下、40重量倍以下、45重量倍以下、50重量倍以下、60重量倍以下、70重量倍以下、80重量倍以下、90重量倍以下、100重量倍以下、150重量倍以下、又は200重量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(A)及び工程(A1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の2.6重量倍以上200重量倍以下であってもよく、2.8重量倍以上150重量倍以下であってもよく、3重量倍以上100重量倍以下であってもよく、3重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上10重量倍以下であってもよい。
前記工程(A)及び工程(A1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の2.6モル当量倍以上、2.7モル当量倍以上、2.8モル当量倍以上、2.9モル当量倍以上、3モル当量倍以上、4モル当量倍以上、5モル当量倍以上、6モル当量倍以上、7モル当量倍以上、8モル当量倍以上、又は9モル当量倍以上であってよい。また、前記工程(A)及び工程(A1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の10モル当量倍以下、12モル当量倍以下、13モル当量倍以下、14モル当量倍以下、15モル当量倍以下、20モル当量倍以下、25モル当量倍以下、30モル当量倍以下、35モル当量倍以下、40モル当量倍以下、45モル当量倍以下、50モル当量倍以下、60モル当量倍以下、70モル当量倍以下、80モル当量倍以下、90モル当量倍以下、100モル当量倍以下、150モル当量倍以下、又は200モル当量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(A)及び工程(A1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の2.6モル当量倍以上200モル当量倍以下、2.8モル当量倍以上150モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上100モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上10モル当量倍以下であってもよい。
前記工程(A)及び工程(A1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする添加量であれば特に制限はなく、0.5ng以上、1ng以上、1.5ng以上、2ng以上、2.5ng以上、3ng以上、3.5ng以上、4ng以上、4.5ng以上、5ng以上、10ng以上、15ng以上、20ng以上、25ng以上、30ng以上、35ng以上、40ng以上、45ng以上、50ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、250ng以上、300ng以上、350ng以上、400ng以上、450ng以上、又は500ng以上であってよい。また、前記工程(A)及び工程(A1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、550ng以下、600ng以下、650ng以下、700ng以下、750ng以下、800ng以下、850ng以下、900ng以下、950ng以下、1μg以下、1.5μg以下、2μg以下、2.5μg以下、又は5μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(A)及び工程(A1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、0.5ng~5μgであってもよく、5ng~1.5μgであってもよく、150ng~1μgであってもよく、300ng~1μgであってもよく、500ng~1μgであってもよい。
前記工程(A)及び工程(A1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする添加濃度であれば特に制限はなく、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、前記工程(A)及び工程(A1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(A)及び工程(A1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~30μg/mLであってもよく、6μg/mL~30μg/mLであってもよく、10μg/mL~20μg/mLであってもよい。
前記工程(A)及び工程(A2)における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする添加量であれば特に制限はなく、0.1ng以上、1ng以上、2ng以上、3ng以上、4ng以上、5ng以上、6ng以上、7ng以上、8ng以上、9ng以上、10ng以上、20ng以上、30ng以上、40ng以上、50ng以上、60ng以上、70ng以上、80ng以上、又は90ng以上であってよい。また、前記工程(A)及び工程(A2)における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量は、100ng以下、200ng以下、300ng以下、400ng以下、500ng以下、600ng以下、700ng以下、800ng以下、900ng以下、1μg以下、1.1μg以下、1.2μg以下、1.3μg以下、1.4μg以下、1.5μg以下、1.6μg以下、1.7μg以下、1.8μg以下、1.9μg以下、2μg以下、3μg以下、4μg以下、5μg以下、又は10μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(A)及び工程(A2)における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量は、1ng~10μgであってもよく、3ng~3μgであってもよく、10ng~2μgであってもよく、10ng~100ngであってもよい。
前記工程(A)及び工程(A2)における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の添加濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする添加濃度であれば特に制限はなく、0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.33μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、又は0.9μg/mL以上であってよい。また、前記工程(A)及び工程(A2)における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の添加濃度は、1μg/mL以下、2μg/mL以下、3μg/mL以下、4μg/mL以下、5μg/mL以下、6μg/mL以下、7μg/mL以下、7.5μg/mL以下、8μg/mL以下、9μg/mL以下、10μg/mL以下、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(A)及び工程(A2)における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の添加濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.03μg/mL~30μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~20μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~1μg/mLであってもよい。
「試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬」
本開示の試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬は、本開示の試料中のDUPAN-2抗原の測定方法に用いられる試薬であり、当該測定試薬の1つの態様としては、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む、試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬である。
本開示の試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬は、本開示の試料中のDUPAN-2抗原の測定方法に用いられる試薬であり、当該測定試薬の1つの態様としては、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む、試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬である。
本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上、2.7重量倍以上、2.8重量倍以上、2.9重量倍以上、3重量倍以上、4重量倍以上、5重量倍以上、6重量倍以上、7重量倍以上、8重量倍以上、又は9重量倍以上であってよい。また、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10重量倍以下、12重量倍以下、13重量倍以下、14重量倍以下、15重量倍以下、20重量倍以下、25重量倍以下、30重量倍以下、35重量倍以下、40重量倍以下、45重量倍以下、50重量倍以下、60重量倍以下、70重量倍以下、80重量倍以下、90重量倍以下、100重量倍以下、150重量倍以下、又は200重量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上200重量倍以下であってもよく、2.8重量倍以上150重量倍以下であってもよく、3重量倍以上100重量倍以下であってもよく、3重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上10重量倍以下であってもよい。
本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上、2.7モル当量倍以上、2.8モル当量倍以上、2.9モル当量倍以上、3モル当量倍以上、4モル当量倍以上、5モル当量倍以上、6モル当量倍以上、7モル当量倍以上、8モル当量倍以上、又は9モル当量倍以上であってよい。また、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10モル当量倍以下、12モル当量倍以下、13モル当量倍以下、14モル当量倍以下、15モル当量倍以下、20モル当量倍以下、25モル当量倍以下、30モル当量倍以下、35モル当量倍以下、40モル当量倍以下、45モル当量倍以下、50モル当量倍以下、60モル当量倍以下、70モル当量倍以下、80モル当量倍以下、90モル当量倍以下、100モル当量倍以下、150モル当量倍以下、又は200モル当量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上200モル当量倍以下、2.8モル当量倍以上150モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上100モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上10モル当量倍以下であってもよい。
本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における不溶性担体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に限定はなく、0.001mg/mL以上、0.002mg/mL以上、0.003mg/mL以上、0.004mg/mL以上、0.005mg/mL以上、0.01mg/mL以上、0.02mg/mL以上、0.03mg/mL以上、0.04mg/mL以上、0.05mg/mL以上、0.06mg/mL以上、0.07mg/mL以上、0.08mg/mL以上、0.09mg/mL以上、0.1mg/mL以上、0.2mg/mL以上、0.3mg/mL以上、0.4mg/mL以上、又は0.5mg/mL以上であってよい。また、前記測定試薬における不溶性担体の濃度は、0.6mg/mL以下、0.7mg/mL以下、0.8mg/mL以下、0.9mg/mL以下、1mg/mL以下、2mg/mL以下、3mg/mL以下、4mg/mL以下、5mg/mL以下、6mg/mL以下、7mg/mL以下、8mg/mL以下、9mg/mL以下、又は10mg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記測定試薬における不溶性担体の濃度は、0.003mg/mL~10mg/mLであってもよく、0.01mg/mL~3mg/mLであってもよく、0.05mg/mL~1mg/mLであってもよい。
本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~30μg/mLであってもよく、6μg/mL~30μg/mLであってもよく、10μg/mL~20μg/mLであってもよい。
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体がマイクロタイタープレートに結合しており、且つ、水性媒体を含んでおらず乾燥状態である場合、マイクロタイタープレートの1ウェルにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.001μg以上、0.01μg以上、0.02μg以上、0.03μg以上、0.04μg以上、0.05μg以上、0.06μg以上、0.07μg以上、0.08μg以上、0.09μg以上、0.1μg以上、0.2μg以上、0.3μg以上、0.4μg以上、又は0.5μg以上であってよい。また、前記マイクロタイタープレートの1ウェルにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.6μg以下、0.7μg以下、0.8μg以下、0.9μg以下、1μg以下、2μg以下、3μg以下、4μg以下、5μg以下、6μg以下、7μg以下、7.5μg以下、8μg以下、9μg以下、10μg以下、11μg以下、12μg以下、13μg以下、14μg以下、15μg以下、16μg以下、17μg以下、18μg以下、19μg以下、20μg以下、30μg以下、40μg以下、50μg以下、又は100μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記マイクロタイタープレートの1ウェルにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.01μg~30μgであってもよく、0.1μg~10μgであってもよく、0.3μg~3μgであってもよい。
本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、本開示のDUPAN-2抗原の測定を可能とする濃度であれば特に制限はなく、0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.33μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、又は0.9μg/mL以上であってよい。また、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、1μg/mL以下、2μg/mL以下、3μg/mL以下、4μg/mL以下、5μg/mL以下、6μg/mL以下、7μg/mL以下、7.5μg/mL以下、8μg/mL以下、9μg/mL以下、10μg/mL以下、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、本開示のDUPAN-2抗原の測定試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.03μg/mL~30μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~20μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~1μg/mLであってもよい。
本開示の測定試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。凍結乾燥状態の測定試薬を使用する場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。
液状の測定試薬においては、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体からなる群より選ばれる少なくとも1種は、水性媒体で溶解された状態となっている。
液状の測定試薬においては、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体からなる群より選ばれる少なくとも1種は、水性媒体で溶解された状態となっている。
水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
本開示の測定方法における「不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体」と、本開示の測定試薬における「DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体」及び後述の測定キットにおける「DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体」とは同義である。
「試料中のDUPAN-2抗原の測定キット」
本開示の試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。
以下、本開示の、試料中のDUPAN-2抗原の測定キットの好適な実施形態を例示する。なお、下記の実施形態において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体としては、例えば前述のDUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体を用いることができる。
本開示の試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬は、保存、運搬、流通等の観点からキットの形態を取ることもできる。
以下、本開示の、試料中のDUPAN-2抗原の測定キットの好適な実施形態を例示する。なお、下記の実施形態において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体としては、例えば前述のDUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体を用いることができる。
[測定キット(1)]
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体を含む第1試薬;及び、 DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を含む第2試薬、
を含む、測定キット。
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体を含む第1試薬;及び、 DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を含む第2試薬、
を含む、測定キット。
前記測定キット(1)は、試料を希釈するための試薬として、水性媒体を含む第3試薬を含んでいてもよい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。また、前記測定キット(1)には、前述の洗浄液、標準物質としての既知濃度のDUPAN-2抗原、本開示の測定方法が記載された取扱説明書等が含まれていてもよい。
本開示のDUPAN-2抗原の測定キットにおいて、前記第1試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記第2試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上、2.7重量倍以上、2.8重量倍以上、2.9重量倍以上、3重量倍以上、4重量倍以上、5重量倍以上、6重量倍以上、7重量倍以上、8重量倍以上、又は9重量倍以上であってよい。また、本開示のDUPAN-2抗原の測定キットにおいて、前記第1試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記第2試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10重量倍以下、12重量倍以下、13重量倍以下、14重量倍以下、15重量倍以下、20重量倍以下、25重量倍以下、30重量倍以下、35重量倍以下、40重量倍以下、45重量倍以下、50重量倍以下、60重量倍以下、70重量倍以下、80重量倍以下、90重量倍以下、100重量倍以下、150重量倍以下、又は200重量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、本開示のDUPAN-2抗原の測定キットにおいて、前記第1試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記第2試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6重量倍以上200重量倍以下であってもよく、2.8重量倍以上150重量倍以下であってもよく、3重量倍以上100重量倍以下であってもよく、3重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上30重量倍以下であってもよく、5重量倍以上10重量倍以下であってもよい。
本開示のDUPAN-2抗原の測定キットにおいて、前記第1試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記第2試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上、2.7モル当量倍以上、2.8モル当量倍以上、2.9モル当量倍以上、3モル当量倍以上、4モル当量倍以上、5モル当量倍以上、6モル当量倍以上、7モル当量倍以上、8モル当量倍以上、又は9モル当量倍以上であってよい。また、本開示のDUPAN-2抗原の測定キットにおいて、前記第1試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記第2試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の10モル当量倍以下、12モル当量倍以下、13モル当量倍以下、14モル当量倍以下、15モル当量倍以下、20モル当量倍以下、25モル当量倍以下、30モル当量倍以下、35モル当量倍以下、40モル当量倍以下、45モル当量倍以下、50モル当量倍以下、60モル当量倍以下、70モル当量倍以下、80モル当量倍以下、90モル当量倍以下、100モル当量倍以下、150モル当量倍以下、又は200モル当量倍以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、本開示のDUPAN-2抗原の測定キットにおいて、前記第1試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、前記第2試薬におけるDUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の2.6モル当量倍以上200モル当量倍以下、2.8モル当量倍以上150モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上100モル当量倍以下であってもよく、3モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上30モル当量倍以下であってもよく、5モル当量倍以上10モル当量倍以下であってもよい。
前記第1試薬における不溶性担体の濃度は、0.001mg/mL以上、0.01mg/mL以上、0.02mg/mL以上、0.03mg/mL以上、0.04mg/mL以上、0.05mg/mL以上、0.06mg/mL以上、0.07mg/mL以上、0.08mg/mL以上、0.09mg/mL以上、0.1mg/mL以上、0.2mg/mL以上、0.3mg/mL以上、0.4mg/mL以上、又は0.5mg/mL以上であってよい。また、前記第1試薬における不溶性担体の濃度は、0.6mg/mL以下、0.7mg/mL以下、0.8mg/mL以下、0.9mg/mL以下、1mg/mL以下、2mg/mL以下、3mg/mL以下、4mg/mL以下、5mg/mL以下、6mg/mL以下、7mg/mL以下、8mg/mL以下、9mg/mL以下、又は10mg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記第1試薬における不溶性担体の濃度は、0.01mg/mL~10mg/mLであってもよく、0.03mg/mL~5mg/mLであってもよく、0.1mg/mL~2mg/mLであってもよい。
前記第1試薬における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の濃度は、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、前記第1試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記第1試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~30μg/mLであってもよく、6μg/mL~30μg/mLであってもよく、10μg/mL~20μg/mLであってもよい。
前記第1試薬において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体がマイクロタイタープレートに結合しており、且つ、水性媒体を含んでおらず乾燥状態である場合、マイクロタイタープレートの1ウェルにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.001μg以上、0.01μg以上、0.02μg以上、0.03μg以上、0.04μg以上、0.05μg以上、0.06μg以上、0.07μg以上、0.08μg以上、0.09μg以上、0.1μg以上、0.2μg以上、0.3μg以上、0.4μg以上、又は0.5μg以上であってよい。また、前記マイクロタイタープレートの1ウェルにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.6μg以下、0.7μg以下、0.8μg以下、0.9μg以下、1μg以下、2μg以下、3μg以下、4μg以下、5μg以下、6μg以下、7μg以下、7.5μg以下、8μg以下、9μg以下、10μg以下、11μg以下、12μg以下、13μg以下、14μg以下、15μg以下、16μg以下、17μg以下、18μg以下、19μg以下、20μg以下、30μg以下、40μg以下、50μg以下、又は100μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記マイクロタイタープレートの1ウェルにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量は、0.01μg~30μgであってもよく、0.1μg~10μgであってもよく、0.3μg~3μgであってもよい。
前記第2試薬における、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の濃度は、0.001μg/mL以上、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.33μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、又は0.9μg/mL以上であってよい。また、前記第2試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、1μg/mL以下、2μg/mL以下、3μg/mL以下、4μg/mL以下、5μg/mL以下、6μg/mL以下、7μg/mL以下、7.5μg/mL以下、8μg/mL以下、9μg/mL以下、10μg/mL以下、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記第2試薬における、DUPAN-2抗原に結合する第2抗体の濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.03μg/mL~30μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~20μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~1μg/mLであってもよい。
本開示の測定キットの構成試薬は、凍結乾燥状態でも液状でもよい。
測定キットの構成試薬が凍結乾燥状態である場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
測定キットの構成試薬が凍結乾燥状態である場合には、測定前に水性媒体で溶解して液状にして測定に供する。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
測定キットの構成試薬が液状である場合には、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体、及びDUPAN-2抗原を認識する第2抗体からなる群より選ばれる少なくとも1種は、水性媒体で溶解された状態となっている。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。水性媒体には、前述の塩類、金属イオン、糖類、蛋白質、界面活性剤等が含有されてもよい。
標準物質としての既知濃度のDUPAN-2抗原としては、腹水由来のDUPAN-2抗原又はヒト膵癌培養細胞HPAF由来のDUPAN-2抗原をPBSで希釈したDUPAN-2抗原溶液等が挙げられる。本開示のキットにおいて、複数の既知濃度のDUPAN-2抗原を含んでいてもよい。
標準物質としての既知濃度のDUPAN-2抗原における、DUPAN-2抗原の濃度としては、例えば前述の濃度等が挙げられる。
「DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法」
本開示の測定試薬及び測定キットに含まれる、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体は、以下の工程を含む方法で製造できる。
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程。
本開示の測定試薬及び測定キットに含まれる、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体は、以下の工程を含む方法で製造できる。
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程。
DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、不溶性担体へ結合させる方法としては、例えば前述の方法が挙げられる。
前記工程(1)における不溶性担体の濃度は、0.001mg/mL以上、0.01mg/mL以上、0.02mg/mL以上、0.03mg/mL以上、0.04mg/mL以上、0.05mg/mL以上、0.06mg/mL以上、0.07mg/mL以上、0.08mg/mL以上、0.09mg/mL以上、0.1mg/mL以上、0.2mg/mL以上、0.3mg/mL以上、0.4mg/mL以上、又は0.5mg/mL以上であってよい。また、前記工程(1)における不溶性担体の濃度は、0.6mg/mL以下、0.7mg/mL以下、0.8mg/mL以下、0.9mg/mL以下、1mg/mL以下、2mg/mL以下、3mg/mL以下、4mg/mL以下、5mg/mL以下、6mg/mL以下、7mg/mL以下、8mg/mL以下、9mg/mL以下、又は10mg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)における不溶性担体の濃度は、0.01mg/mL~10mg/mLであってもよく、0.03mg/mL~5mg/mLであってもよく、0.1mg/mL~2mg/mLであってもよい。
前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、本開示の、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法を可能とする添加量であれば特に制限はない。
前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、0.5ng以上、1ng以上、1.5ng以上、2ng以上、2.5ng以上、3ng以上、3.5ng以上、4ng以上、4.5ng以上、5ng以上、10ng以上、15ng以上、20ng以上、25ng以上、30ng以上、35ng以上、40ng以上、45ng以上、50ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、250ng以上、300ng以上、350ng以上、400ng以上、450ng以上、又は500ng以上であってよい。また、前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、550ng以下、600ng以下、650ng以下、700ng以下、750ng以下、800ng以下、850ng以下、900ng以下、950ng以下、1μg以下、1.5μg以下、2μg以下、2.5μg以下、又は5μg以下であってよい。
前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、0.5ng以上、1ng以上、1.5ng以上、2ng以上、2.5ng以上、3ng以上、3.5ng以上、4ng以上、4.5ng以上、5ng以上、10ng以上、15ng以上、20ng以上、25ng以上、30ng以上、35ng以上、40ng以上、45ng以上、50ng以上、100ng以上、150ng以上、200ng以上、250ng以上、300ng以上、350ng以上、400ng以上、450ng以上、又は500ng以上であってよい。また、前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、550ng以下、600ng以下、650ng以下、700ng以下、750ng以下、800ng以下、850ng以下、900ng以下、950ng以下、1μg以下、1.5μg以下、2μg以下、2.5μg以下、又は5μg以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量は、0.5ng~5μgであってもよく、5ng~1.5μgであってもよく、150ng~1μgであってもよく、300ng~1μgであってもよく、500ng~1μgであってもよい。
前記工程(1)における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度は、本開示の、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法を可能とする添加濃度であれば特に制限はない。
前記工程(1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、前記工程(1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記工程(1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、0.01μg/mL以上、0.02μg/mL以上、0.03μg/mL以上、0.04μg/mL以上、0.05μg/mL以上、0.06μg/mL以上、0.07μg/mL以上、0.08μg/mL以上、0.09μg/mL以上、0.1μg/mL以上、0.2μg/mL以上、0.3μg/mL以上、0.4μg/mL以上、0.5μg/mL以上、0.6μg/mL以上、0.7μg/mL以上、0.8μg/mL以上、0.9μg/mL以上、1μg/mL以上、2μg/mL以上、3μg/mL以上、4μg/mL以上、5μg/mL以上、6μg/mL以上、7μg/mL以上、7.5μg/mL以上、8μg/mL以上、9μg/mL以上、又は10μg/mL以上であってよい。また、前記工程(1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、11μg/mL以下、12μg/mL以下、13μg/mL以下、14μg/mL以下、15μg/mL以下、16μg/mL以下、17μg/mL以下、18μg/mL以下、19μg/mL以下、20μg/mL以下、30μg/mL以下、40μg/mL以下、50μg/mL以下、又は100μg/mL以下であってよい。
前記の数値は自由に組み合わせることができる。例えば、前記工程(1)における、DUPAN-2抗原に結合する第1抗体の添加濃度は、0.01μg/mL~100μg/mLであってもよく、0.1μg/mL~30μg/mLであってもよく、6μg/mL~30μg/mLであってもよく、10μg/mL~20μg/mLであってもよい。
前記工程(1)及び工程(2)は水性媒体中で行うことが好ましい。水性媒体としては、例えば前述の水性媒体が挙げられる。
前記工程(2)の結合反応温度は、本開示の、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法を可能とする温度であれば特に制限はなく、例えば、0~50℃であり、4~45℃が好ましく、20~40℃が特に好ましい。また、前記工程(2)の結合反応時間は、DDUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法を可能とする時間であれば特に限定はなく、例えば、5分間~72時間であり、10分間~48時間が好ましく、2時間~24時間がより好ましく、12時間~18時間が特に好ましい。
以下、本開示を実施例により、更に詳細に説明するが、これらは本開示の範囲を何ら制限するものではない。なお、以下の実施例においては、次のメーカーの試薬類を使用した。
リン酸水素二ナトリウム(無水)(関東化学株式会社製)、リン酸二水素ナトリウム(無水)(関東化学株式会社製)、トリスヒドロキシメチルアミノメタン(関東化学株式会社製)、塩化ナトリウム(富士フイルム和光純薬株式会社製)、MES(株式会社同仁化学研究所製)、MOPS(株式会社同仁化学研究所製)、NP-40(シグマアルドリッチ社製)、Tween 20(関東化学株式会社製)、Minimum Essential Medium Eagle(シグマアルドリッチ社製)、ウシ胎仔血清(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)、ウシ血清アルブミン(BSA)(Bovogen社製)、「デタミナーDUPAN-2 N」(日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社製)の構成試薬「検体希釈液」を使用した。
[実施例1]
DUPAN-2抗体結合マイクロプレート、及びペルオキシダーゼ(POD)標識DUPAN-2抗体溶液を含む、DUPAN-2抗原の測定キット1及びキット2を作製した。なお、下記のDUPAN-2抗体結合マイクロプレートの作製時において、DUPAN-2抗体溶液におけるDUPAN-2抗体濃度を10μg/mLとしたものを測定キット1に、20μg/mLとしたものを測定キット2に使用した。
DUPAN-2抗体結合マイクロプレート、及びペルオキシダーゼ(POD)標識DUPAN-2抗体溶液を含む、DUPAN-2抗原の測定キット1及びキット2を作製した。なお、下記のDUPAN-2抗体結合マイクロプレートの作製時において、DUPAN-2抗体溶液におけるDUPAN-2抗体濃度を10μg/mLとしたものを測定キット1に、20μg/mLとしたものを測定キット2に使用した。
<DUPAN-2抗体結合マイクロプレート:第1抗体>
96ウェルポリスチレンプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)の各ウェルに、結合用緩衝液[0.14mol/Lの塩化ナトリウムを含有する0.01mol/Lリン酸緩衝液(pH7.3)]で調製したDUPAN-2抗体溶液を50μL添加し、25℃で16時間インキュベートした。次いで、当該DUPAN-2抗体溶液を除去し、ブロッキング液[1%(w/v)BSA、0.05%(w/v)Tween 20を含むリン酸緩衝液(pH7.2)]を各ウェルに250μL加えて洗浄した後、当該ブロッキング液を各ウェルに250μL加えて、4℃で16時間インキュベートした。その後、当該ブロッキング液を除去し、DUPAN-2抗体結合マイクロプレートを調製した。
96ウェルポリスチレンプレート(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)の各ウェルに、結合用緩衝液[0.14mol/Lの塩化ナトリウムを含有する0.01mol/Lリン酸緩衝液(pH7.3)]で調製したDUPAN-2抗体溶液を50μL添加し、25℃で16時間インキュベートした。次いで、当該DUPAN-2抗体溶液を除去し、ブロッキング液[1%(w/v)BSA、0.05%(w/v)Tween 20を含むリン酸緩衝液(pH7.2)]を各ウェルに250μL加えて洗浄した後、当該ブロッキング液を各ウェルに250μL加えて、4℃で16時間インキュベートした。その後、当該ブロッキング液を除去し、DUPAN-2抗体結合マイクロプレートを調製した。
<POD標識DUPAN-2抗体溶液:第2抗体>
Peroxidase Labeling Kit-NH2(株式会社同仁化学研究所製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、DUPAN-2抗体をPODで標識し、POD標識DUPAN-2抗体を作製した。得られたPOD標識DUPAN-2抗体を用いて、以下の組成のPOD標識DUPAN-2抗体溶液を調製した。
Peroxidase Labeling Kit-NH2(株式会社同仁化学研究所製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、DUPAN-2抗体をPODで標識し、POD標識DUPAN-2抗体を作製した。得られたPOD標識DUPAN-2抗体を用いて、以下の組成のPOD標識DUPAN-2抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 0.1 mol/L
POD標識DUPAN-2抗体 1 μg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
NP-40 0.2 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.15 mol/L
POD標識DUPAN-2抗体 1 μg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
NP-40 0.2 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.15 mol/L
[比較例]
前記のDUPAN-2抗体結合マイクロプレートの作製方法において、DUPAN-2抗体溶液におけるDUPAN-2抗体濃度を5μg/mLとした、DUPAN-2抗体結合マイクロプレートを作製した。当該DUPAN-2抗体結合マイクロプレートと、実施例1記載の方法で調製したPOD標識DUPAN-2抗体溶液とを組み合わせた、測定キットAを比較例として作製した。
前記のDUPAN-2抗体結合マイクロプレートの作製方法において、DUPAN-2抗体溶液におけるDUPAN-2抗体濃度を5μg/mLとした、DUPAN-2抗体結合マイクロプレートを作製した。当該DUPAN-2抗体結合マイクロプレートと、実施例1記載の方法で調製したPOD標識DUPAN-2抗体溶液とを組み合わせた、測定キットAを比較例として作製した。
[実施例2]
<試料中のDUPAN-2の測定方法1>
ヒト膵癌患者の腹水由来のDUPAN-2抗原(以下、単に「腹水由来のDUPAN-2抗原」と記す)を、抗原希釈液[1%(w/v)BSA、0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.05mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)]で40U/mL、100U/mL、350U/mLに調整した腹水由来DUPAN-2抗原溶液を調製した。同様に、ヒト膵癌培養細胞HPAF-IIの培養上清由来のDUPAN-2抗原を、前記抗原希釈液で40U/mL、100U/mL、350U/mLに調整したヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を調製した。
なお、公知の方法(R. S. Metzgar et. al. CANCER RESEARCH (1982), 42 (2):601-608)に従い、ヒト膵癌培養細胞HPAF-IIを培養し、当該培養で得られた培養上清を、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原として用いた。
<試料中のDUPAN-2の測定方法1>
ヒト膵癌患者の腹水由来のDUPAN-2抗原(以下、単に「腹水由来のDUPAN-2抗原」と記す)を、抗原希釈液[1%(w/v)BSA、0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.05mol/Lトリス緩衝液(pH8.0)]で40U/mL、100U/mL、350U/mLに調整した腹水由来DUPAN-2抗原溶液を調製した。同様に、ヒト膵癌培養細胞HPAF-IIの培養上清由来のDUPAN-2抗原を、前記抗原希釈液で40U/mL、100U/mL、350U/mLに調整したヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を調製した。
なお、公知の方法(R. S. Metzgar et. al. CANCER RESEARCH (1982), 42 (2):601-608)に従い、ヒト膵癌培養細胞HPAF-IIを培養し、当該培養で得られた培養上清を、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原として用いた。
DUPAN-2抗体結合マイクロプレートの各ウェルに、検体希釈液を100μL添加した。その後、当該各ウェルに、腹水由来DUPAN-2抗原溶液、又はヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液20μLをそれぞれ添加し、25℃で1時間インキュベートした(1次反応)。1次反応後のプレートの各ウェルを、洗浄液[0.05%(w/v)Tween 20、0.15mol/L塩化ナトリウムを含む0.01mol/Lリン酸緩衝液(pH7.4)]で洗浄した後、各ウェルに、POD標識DUPAN-2抗体溶液100μLを添加し、25℃で1時間反応を行った(2次反応)。2次反応後のプレートの各ウェルを前記洗浄液で洗浄した後、各ウェルに、TMB(3,3´,5,5´-テトラメチルベンジジン)水溶液を100μL添加し、25℃で30分間インキュベートし、0.5mol/L硫酸50μLを添加し反応を停止した(発色反応)。発色反応で得られた反応液の吸光度(主波長450nm、副波長650nm)を、マイクロプレートリーダー「Emax」(モレキュラーデバイスジャパン株式会社製)を用いて測定した。
腹水由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの吸光度を(A)、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの吸光度を(B)とした場合の(B)/(A)値を算出した。(B)/(A)値を表1に示す。
腹水由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの吸光度を(A)、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの吸光度を(B)とした場合の(B)/(A)値を算出した。(B)/(A)値を表1に示す。
また、比較例キットAを用いて、実施例2記載の試料中のDUPAN-2の測定方法1に従い、腹水由来DUPAN-2抗原溶液、及びヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定した。その後、実施例2記載の方法で(B)/(A)値を算出した。(B)/(A)値を表1に示す。
表1の結果より、キット1及びキット2の(B)/(A)値は1.0に近い値となった。このような(B)/(A)値を示すキット1及びキット2は、比較例キットAと比べて、腹水由来のDUPAN-2抗原の測定値と、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原の測定値との差が小さい傾向にあり、正確な測定ができていることが判明した。
[実施例3]
以下のDUPAN-2抗体結合磁性粒子液、アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体溶液を含む、DUPAN-2抗原の測定キット3を作製した。
以下のDUPAN-2抗体結合磁性粒子液、アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体溶液を含む、DUPAN-2抗原の測定キット3を作製した。
<DUPAN-2抗体結合磁性粒子液:第1抗体>
(1)磁性粒子懸濁液
磁性粒子として、ストレプトアビジンが結合した市販の磁性粒子[Dynabeads MyOne Streptavidin T1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)]を用いて、以下の組成の磁性粒子懸濁液を調製した。
(1)磁性粒子懸濁液
磁性粒子として、ストレプトアビジンが結合した市販の磁性粒子[Dynabeads MyOne Streptavidin T1(サーモフィッシャーサイエンティフィック社製)]を用いて、以下の組成の磁性粒子懸濁液を調製した。
MES(pH6.5) 50 mmol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.4 mg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ストレプトアビジン結合磁性粒子 0.4 mg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
(2)ビオチン結合DUPAN-2抗体溶液
Biotin Labeling kit-NH2(株式会社同仁化学研究所製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、DUPAN-2抗体にビオチンが結合した、ビオチン結合DUPAN-2抗体を作製した。得られたビオチン結合DUPAN-2抗体を用いて、以下の組成のビオチン結合DUPAN-2抗体溶液を調製した。
Biotin Labeling kit-NH2(株式会社同仁化学研究所製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、DUPAN-2抗体にビオチンが結合した、ビオチン結合DUPAN-2抗体を作製した。得られたビオチン結合DUPAN-2抗体を用いて、以下の組成のビオチン結合DUPAN-2抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 50 mmol/L
ビオチン結合DUPAN-2抗体 7.5 μg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
ビオチン結合DUPAN-2抗体 7.5 μg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
(3)DUPAN-2抗体結合磁性粒子液
磁性粒子懸濁液とビオチン結合DUPAN-2抗体溶液とを1:1で混合し、25℃で16時間放置し、磁性粒子と、DUPAN-2抗体とを結合させた。この溶液をDUPAN-2抗体結合磁性粒子液とした。
磁性粒子懸濁液とビオチン結合DUPAN-2抗体溶液とを1:1で混合し、25℃で16時間放置し、磁性粒子と、DUPAN-2抗体とを結合させた。この溶液をDUPAN-2抗体結合磁性粒子液とした。
<アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体溶液:第2抗体>
Alkaline Phosphatase Labeling kit-SH2(株式会社同仁化学研究所製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、DUPAN-2抗体にアルカリホスファターゼが結合した、アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体を作製した。得られたアルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体を用いて、以下の組成のアルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体溶液を調製した。
Alkaline Phosphatase Labeling kit-SH2(株式会社同仁化学研究所製)を用いて、当該キットの取扱説明書に従い、DUPAN-2抗体にアルカリホスファターゼが結合した、アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体を作製した。得られたアルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体を用いて、以下の組成のアルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体溶液を調製した。
MES(pH6.5) 50 mmol/L
アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体 0.33 μg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体 0.33 μg/mL
BSA 0.1 %(w/v)
塩化ナトリウム 0.1 mol/L
[実施例4]
<試料中のDUPAN-2の測定方法2>
実施例2で調製した、350U/mLの腹水由来DUPAN-2抗原溶液、及び、350U/mLのヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定用試料とした。
<試料中のDUPAN-2の測定方法2>
実施例2で調製した、350U/mLの腹水由来DUPAN-2抗原溶液、及び、350U/mLのヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定用試料とした。
測定用試料10μLに、実施例3で調製したDUPAN-2抗体結合磁性粒子液60μLと、アルカリホスファターゼ標識DUPAN-2抗体溶液30μLとを加えて攪拌し、37℃で20分間反応させた。磁性粒子を磁力で集めて、磁性粒子以外の反応溶液を除去すると共に、洗浄液[0.1%(w/v)Tween 20を含有する50mmol/L MOPS緩衝液(pH7.35)]で磁性粒子を5回洗浄した。その後、9-(4-クロロフェニルチオホスホリルオキシメチリデン)-10-メチルアクリダン・二ナトリウム塩を主成分とする発光基質液を100μL加えて攪拌し、生じた発光量を、全自動化学発光免疫測定装置「CL-JACK NX」(日立化成ダイアグノスティックス・システムズ株式会社製)を用いて測定した。
腹水由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの発光量を(A)、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの発光量を(B)とした場合の(B)/(A)値を算出した。(B)/(A)値を表2に示す。
腹水由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの発光量を(A)、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定したときの発光量を(B)とした場合の(B)/(A)値を算出した。(B)/(A)値を表2に示す。
また、比較例キットAを用いて、実施例2記載の試料中のDUPAN-2の測定方法1に従い、腹水由来DUPAN-2抗原溶液、及びヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原溶液を測定した。その後、実施例2記載の方法で(B)/(A)値を算出した。(B)/(A)値を表2に示す。
表2の結果より、キット3の(B)/(A)値は1.0に近い値となった。このような(B)/(A)値を示すキット3は、比較例キットAと比べて、腹水由来のDUPAN-2抗原の測定値と、ヒト膵癌培養細胞HPAF-II由来のDUPAN-2抗原の測定値との差が小さい傾向にあり、正確な測定ができていることが判明した。
本開示により、膵癌、胆道系癌などの癌診断に有効で且つ正確な、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法、測定試薬及び測定キットが提供される。
Claims (13)
- 水性媒体と、試料中のDUPAN-2抗原と、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含む混合液を調製することを含み、
前記混合液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。 - (1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(2)工程(1)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含み、
工程(1)の反応液において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。 - (1)水性媒体中で、試料中のDUPAN-2抗原に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(2)DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、水性媒体中で、工程(1)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体とからなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(3)工程(2)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
を含み、
工程(2)おいて、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。 - (1)DUPAN-2抗原を含む試料に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を添加する工程;
(2)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原に、前記不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体を生成させる工程;及び
(3)工程(2)で生成された免疫複合体を測定する工程、
を含み、
工程(1)において、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。 - (1)DUPAN-2抗原を含む試料に、不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を添加する工程;
(2)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原に、前記不溶性担体に結合した、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、からなる免疫複合体1を生成させる工程;
(3)工程(2)で生成した免疫複合体1に、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を添加する工程;
(4)水性媒体中で、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を、工程(2)で生成した免疫複合体1と反応させ、前記不溶性担体上に、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体と、前記DUPAN-2抗原と、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、からなる免疫複合体2を生成させる工程;及び
(5)工程(4)で生成された免疫複合体2を測定する工程、
を含み、
工程(1)における、前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加量が、工程(3)における、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の添加量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定方法。 - DUPAN-2抗原を認識する第2抗体に標識が結合している、請求項1~5のいずれか1項に記載の方法。
- 標識がアルカリホスファターゼである、請求項6に記載の方法。
- DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体と、を含み、
前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定試薬。 - DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体を含む第1試薬と、DUPAN-2抗原を認識する第2抗体を含む第2試薬と、を含み、
第1試薬における前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の量が、第2試薬における前記DUPAN-2抗原を認識する第2抗体の量の3重量倍以上100重量倍以下である、試料中のDUPAN-2抗原の測定キット。 - 請求項8に記載の試薬における、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法であって、
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程、
を含む、方法。 - 前記工程(1)において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度が6μg/mL以上30μg/mL以下である、請求項10に記載の方法。
- 請求項9に記載のキットにおける、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体が結合した不溶性担体の製造方法であって、
(1)不溶性担体に、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を含む水性媒体を添加する工程;及び
(2)前記DUPAN-2抗原を認識する第1抗体を、前記不溶性担体に結合させる工程、
を含む、方法。 - 前記工程(1)において、DUPAN-2抗原を認識する第1抗体の添加濃度が6μg/mL以上30μg/mL以下である、請求項12に記載の方法。
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