WO2017130578A1 - 前立腺癌の判定方法 - Google Patents

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WO2017130578A1 PCT/JP2016/086537 JP2016086537W WO2017130578A1 WO 2017130578 A1 WO2017130578 A1 WO 2017130578A1 JP 2016086537 W JP2016086537 W JP 2016086537W WO 2017130578 A1 WO2017130578 A1 WO 2017130578A1
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大山　力
徹 米山
悠葵 飛澤
友一 石川
竜雄 黒澤
中村　賢治
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和光純薬工業株式会社
国立大学法人弘前大学
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Definitions

  • the present invention relates to a novel method for determining prostate cancer and its malignancy.
  • Prostate cancer prostate carcinoma: hereinafter abbreviated as “Pca” was the most common cancer among men in Western countries, but in recent years it has been increasing rapidly in Japan. It is estimated that it became the most prevalent malignant tumor.
  • PSA Prostate specific antigen
  • PSA is mostly present in the blood as bound PSA that forms a complex by binding to binding proteins such as ⁇ 1-antichymotrypsin and ⁇ 2-macroglobulin (hereinafter abbreviated as “bound PSA”). .
  • bound PSA binding proteins
  • total PSA value the total amount of PSA (ie, the total amount of free PSA and combined PSA, hereinafter referred to as “total PSA value”) is not distinguished from this free PSA and bound PSA. Is abbreviated as).
  • the reference value (normal value) of the total PSA value is less than 4 ng / mL. If there is any disease in the prostate, the total PSA value rises. It is said that Pca is found in about 40% of patients with a total PSA value of 10 to 20 ng / mL, and more than 50% of patients with a total PSA value of 20 ng / mL or more.
  • Non-patent Document 2 The intermediate range of 4.1-10 ng / mL, where the total PSA value is higher than the normal value but lower than the above high value, is called the so-called gray zone (Non-patent Document 2). It is said that the probability that cancer is found in patients with this gray zone total PSA value is about 25-30%. For example, it is known that the total PSA level is often high even when there is other prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia (abbreviated as “BPH”) and prostatitis. . That is, even if the total PSA value is higher than the normal value, it does not necessarily mean that the patient is suffering from Pca. Therefore, when the total PSA value in the serum PSA test is in the gray zone, a normal needle biopsy is performed to obtain a definitive diagnosis. However, the risk of infectious disease increases due to the needle biopsy. ing.
  • BPH benign prostatic hyperplasia
  • glycoproteins By the way, most of the molecules currently used as tumor markers are glycoproteins. It is known that the sugar chain structure of this tumor marker is greatly different between that derived from normal tissue and that derived from cancer.
  • PSA is also a glycoprotein with a molecular weight of 34 kDa, and sugar chains occupy about 8%.
  • Non-Patent Document 3 In the research on the sugar chain that PSA has, PSA has a double-chain sugar chain, and that sugar chain is only an N-type sugar chain with sialic acid bound to galactose at the end with ⁇ (2,6) bond There was a report (Non-Patent Document 3).
  • Patent Document 1 Performed affinity chromatography using MAA (Maackia amurensis Lectin), which specifically recognizes sugar chains in which terminal sialic acid residues are linked to galactose by ⁇ (2,3) bonds.
  • MAA Mesackia amurensis Lectin
  • a method for identifying BPH was completed (Patent Document 1). The method takes the following: “Percentage ratio of free PSA value and total PSA value of lectin-binding fraction to free PSA value and total PSA value of serum before fractionation, or serum before fractionation Is a method of taking the percentage ratio of the free PSA value of the lectin-binding fraction to the free PSA value and discriminating Pca and BPH from the value ”.
  • Non-patent Document 4 the terminal sialic acid of the PSA sugar chain is not only ⁇ (2,6) bond but also ⁇ (2,3) bond. Oyama et al. Found that there are about 10% of those bound to galactose.
  • PSA in which the terminal sialic acid residue of the N-type sugar chain is bound to galactose by ⁇ (2,3) bond rather than PSA that is bound to galactose by ⁇ (2,6) bond It has been clarified that increases (Non-Patent Document 5).
  • the median total PSA value of the Pca patient-derived sample used in Patent Document 1 was 138 ng / mL, which was much higher than the gray zone. Therefore, it is extremely difficult to determine the Pca of a patient whose total PSA value is in a gray zone by the identification method described in this document.
  • Pca has benign Pca and malignant Pca. Since benign Pca progresses slowly, there is an option to follow up without invasive treatment such as surgery. On the other hand, since malignant Pca progresses rapidly, it is necessary to discover Pca at an early stage and determine its malignancy. However, markers and methods for distinguishing between benign Pca and malignant Pca are not yet known.
  • the present invention has been made in view of the above situation, and an object thereof is to provide a new determination method of Pca and a determination method of its malignancy.
  • the present inventors have determined that the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose residue from the end of the sugar chain relative to the amount of free PSA in the biological sample. It has been found that the ratio of the amount of free PSA having an ⁇ (2,) 3) -linked sugar chain serves as an index for determining whether or not it is Pca. As a result of further intensive research, it can be determined that Pca is high or the probability is high when the ratio is higher than 40%, and that the malignancy of Pca is high when the ratio is higher than 47%. The present invention has been completed.
  • the present invention has the following configuration. “Amount of free PSA with sugar chain in which ⁇ - (2,3) -linked sialic acid residue of sugar chain is linked to the second galactose residue from the end of sugar chain relative to the amount of free prostate specific antigen in biological samples A method for determining prostate cancer, wherein the ratio is determined to be prostatic cancer or probable if the ratio is higher than 40%. "
  • the method for determining Pca of the present invention can non-invasively and easily determine (diagnose, test) Pca and its malignancy with high accuracy.
  • a patient whose total PSA value, which has been difficult to determine in the past is in the gray zone, it is possible to determine whether it is Pca or has a high probability.
  • the determination result obtained by the determination method of the present invention is an important guideline for setting the subsequent Pca treatment policy. It becomes.
  • the Pca determination method of the present invention can determine Pca with high accuracy even when using a foreign sample that is likely to affect the measurement of PSA such as sugar chain diversity and the determination of Pca.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of an example of a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, ⁇ 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • FIG. 1 is a schematic diagram of a microchip used in Example 1.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of an in-chip flow path of a microchip used in Example 1.
  • 2 is an electropherogram obtained in Example 1.
  • 2 is an electropherogram obtained in Example 2.
  • Fig. 6 (1) shows the results obtained using electrophoresis sample A containing recombinant ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA, and Fig.
  • FIG. 6 (2) shows recombinant ⁇ (2, 6) sugar.
  • the results obtained using the electrophoresis sample A containing the chain free PSA are shown respectively. It is the result of confirming the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA obtained in Example 3 by measurement by microchip capillary electrophoresis.
  • FIG. 7 (1) shows the relationship between the ratio of the ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount calculated based on the actual measurement value of each sample solution and the theoretical value.
  • FIG. 7 (2) shows the measured peak area ( ⁇ ) of the fraction of complex 1 obtained for each sample solution, the measured peak area ( ⁇ ) of the fraction of composite 2, and the sample solution. The relationship with the theoretical value of is shown.
  • FIG. 9 (1) shows the result of comparing the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount obtained in Example 4 between Pca patients and BPH patients.
  • FIG. 9 (2) shows the result of comparing the total PSA value (total PSA) obtained in Comparative Example 1 between the Pca patient and the BPH patient.
  • FIG. 9 (3) shows the result of comparison between the Pca patient and the BPH patient in the ratio of the free PSA value to the total PSA value (% fPSA) obtained in Comparative Example 2. Moreover, the lower figure of FIG. 9 is the result of the ROC analysis obtained based on each measurement result. 7 is an ROC curve obtained in Example 5. The results obtained in Example 7 and Comparative Examples 3 and 4 are shown.
  • FIG. 11 (1) shows the results of comparing the ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount obtained in Example 7 in Pca patients and BPH patients.
  • FIG. 11 (2) shows the results of ROC analysis obtained in Example 7 and Comparative Examples 3 and 4.
  • FIG. 14 (1) shows the results of analysis of the ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount.
  • FIG. 14 (2) shows the result of analyzing the total PSA value. It is the result of having performed the test of the cut-off value based on the result of the ROC analysis performed in Example 8. The results obtained in Example 9 and Comparative Example 5 are shown.
  • FIG. 16 (1) shows the relationship between the Gleason score and the “ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount” obtained in Example 9.
  • FIG. 16 (1) shows the relationship between the Gleason score and the “ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount” obtained in Example 9.
  • FIG. 16 (2) shows the relationship between the Gleason score and the total PSA value obtained in Comparative Example 5. It is the result of having performed the test of the cut-off value based on the result of the ROC curve analysis obtained in Example 9. The results obtained in Example 10 and Comparative Example 6 are shown.
  • FIG. 18 (1) shows the results of comparison of the ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount obtained in Example 10 between Pca patients and BPH patients.
  • FIG. 18 (2) shows the result of comparing the amount of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA (MFI) obtained in Comparative Example 6 between Pca patients and non-cancer patients.
  • 10 is a sensorgram obtained by the surface plasmon resonance method performed in Example 11.
  • bound PSA refers to a PSA generally called “bound PSA”, that is, “PSA bound to a binding protein such as ⁇ 1-antichymotrypsin or ⁇ 2-macroglobulin to form a complex”.
  • the “free PSA” means a PSA generally called “free PSA”, that is, “PSA not bound to a binding protein such as ⁇ 1-antichymotrypsin or ⁇ 2-macroglobulin”.
  • the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain means that the end of the sugar chain (non-reducing end) is It means a sugar chain having a structure of Sia ⁇ 2 ⁇ 3 Gal.
  • the terminal sialic acid residue include N-acetylneuraminic acid.
  • the “sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain” specifically refers to the following structure.
  • FIG. 1 an example of a PSA having a sugar chain of the formula (I) is schematically shown in FIG.
  • the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the sugar chain is bound to the asparagine residue (N) in the amino acid sequence of isoleucine-arginine-asparagine-lysine (IRNK) of the PSA protein.
  • the “free PSA having a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain” is a free PSA.
  • PSA refers to a PSA having a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA ( ⁇ (2, 3) free PSA).
  • the “free PSA having a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 6) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain” means “free PSA”.
  • PSA refers to a PSA having a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 6) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA ( ⁇ (2, 6) free PSA).
  • the method for determining Pca of the present invention is to measure the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA in a biological sample (hereinafter also simply referred to as “sample”).
  • sample a biological sample
  • a method for determining prostate cancer wherein if the ratio is higher than 40%, it is determined that the cancer is prostate cancer or the probability thereof is high. Is.
  • the amount of free PSA according to the present invention is the total amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the sample.
  • the “free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA” according to the present invention means that the terminal sialic acid residue of the sugar chain according to the present invention is the second galactose residue from the end of the sugar chain. It means free PSA without ⁇ (2, ⁇ 3) linked sugar chain.
  • the method for determining Pca of the present invention is as follows: ⁇ Measure the amount of free PSA and the amount of ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA in a sample derived from a living body, and use ⁇ (2, 3 for the obtained free PSA amount. ) A method for determining prostate cancer, wherein the ratio of the sugar chain free PSA amount is determined, and when the ratio is 40% or higher, it is determined that the cancer is prostate cancer or the probability thereof is high.
  • Method for directly measuring the amount of free PSA in a sample In order to directly measure the amount of free PSA, a known method for measuring the amount of free PSA may be used. For example, it may be measured by a known immunoassay method using an anti-free PSA antibody or an anti-PSA antibody and an anti-free PSA antibody.
  • the anti-PSA antibody according to the present invention is an antibody having affinity for PSA, specifically, an antibody having affinity (binding) to the core protein of PSA. That is, the anti-PSA antibody according to the present invention includes an antibody that binds to both free PSA and bound PSA, and an antibody that specifically binds to free PSA (anti-free PSA antibody). Unless otherwise specified, the term “anti-PSA antibody” as used herein includes an antibody that binds to both free PSA and bound PSA, and an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the type of the anti-PSA antibody according to the present invention is not particularly limited, and may be, for example, either a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, and these may be used alone or in appropriate combination. Further, it may be Fab, (ab ′) 2 , Fab ′ fragment, or antibody variable region of these antibodies.
  • a commercially available antibody may be used as the anti-PSA antibody according to the present invention.
  • AntiAnPSA monoclonal antibody PSA10 Anti PSA monoclonal antibody Clone No. PSA10, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) Kogyo Co., Ltd.
  • Anti-PSA monoclonal antibody (5A6) (HyTest), Anti-PSA monoclonal antibody (5G6) (HyTest), Anti-PSA monoclonal antibody (PS6) (HyTest), Anti-PSA monoclonal antibody (PSA14) ) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Anti-Prostate Specific Antigen antibody EP1588Y
  • Anti-Prostate Specific Antigen antibody A67-B / E3
  • Anti-Prostate Specific Antigen Antibody 35H9
  • Anti-Prostate Specific Antigen antibody KLK3 / 801)
  • Anti-Prostate Specific Antigen antibody 3E6
  • Anti-Prostate SpecificProAntigen antibody 8301)
  • Anti-Prostate Specific Antigen antibody A5D5
  • Anti-Prostate Specific Antigen antibody PSA 28 / A4)
  • anti-PSA antibodies include, for example, Anti PSA monoclonal antibody PSA12 (Anti PSA monoclonal antibody Clone No. PSA12, Japanese Koyo Pharmaceutical Co., Ltd. own product), Anti PSA monoclonal antibody (8A6) (HyTest), Anti PSA monoclonal antibody (PS1) (HyTest), Anti PSA monoclonal antibody (clone 108) (Anogen), Anti-Prostate Specific Antigen antibody (PS2) (Abcam), Anti-Prostate Antigen antibody (2H9) (Abcam) and the like.
  • the anti-PSA antibody (including anti-free PSA antibody) according to the present invention may be labeled with a detectable labeling substance.
  • the labeling substance used for labeling the antibody include the same labeling substances as those for labeling “the antibody used as the affinity substance according to the present invention” described later.
  • the antibody labeling method may be the same as the method for labeling an antibody used as the affinity substance according to the present invention described later.
  • the amount of free PSA is measured using commercially available kits for measuring free PSA (for example, Human Circulating Cancer BioMarker Panel 1 Select Kit (manufactured by LUMINEX)), Free PSA / Abbott (Abbott), Lumipulse Free PSA (Fujirebio ( Co., Ltd.), Vitros Free PSA (Ortho Clinical Diagnostics Co., Ltd.), ST AIA-PACK free PSA (Tosoh Co., Ltd.), Eclus TM Reagent free PSA (Roche Diagnostics Co., Ltd.) You may measure using.
  • kits for measuring free PSA for example, Human Circulating Cancer BioMarker Panel 1 Select Kit (manufactured by LUMINEX)
  • Free PSA / Abbott Abbott
  • Lumipulse Free PSA Flujirebio ( Co., Ltd.)
  • Vitros Free PSA Ortho Clinical Diagnostics Co., Ltd.
  • ST AIA-PACK free PSA Tosoh Co., Ltd.
  • the “method of measuring the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA” means the method of measuring“ the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA ”or“ ⁇ And a method of measuring the amount of (2, PS3) sugar chain free PSA and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA ”.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA it is preferable to measure by a measuring method in which the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is 80% or more.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is ⁇ From the free PSA with various sugar chain-modified isomers mixed in the sample, the terminal sialic acid residue of the target sugar chain is ⁇ (2,2) from the end of the sugar chain to the second galactose residue.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA according to the present invention means that ⁇ (2, 3) sugar chain release that can finally be detected with respect to the total amount of free PSA present in the sample. It can be said that it is the ratio of type PSA.
  • the capture efficiency of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA according to the present invention is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 100%. .
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA according to the present invention can be confirmed by the method described later. However, it is not necessary to confirm the capture efficiency every time the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is measured.
  • “Method of measuring the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA or the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA” as, For example, 1) a substance having affinity for a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain (hereinafter abbreviated as “affinity substance”).
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain and the affinity substance ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount using interaction, or ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount and free PSA amount other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA How to measure
  • the affinity substance used in the affinity substance above method the second galactose residue terminal sialic acid residue of the carbohydrate is from the end of the sugar chain alpha (2, 3) has an affinity for binding sugar chains ( It is a substance that binds).
  • a substance having a specific affinity (specifically binding) to a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2,3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain is preferable.
  • the terminal sialic acid residue of the sugar chain has affinity (bonds) to the sugar chain in which ⁇ (2, 3) is bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain, but other sugar chains (for example, sugar A substance having no affinity for (does not bind to) a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the chain is ⁇ (2, 6) -linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain is particularly preferred.
  • affinity substance according to the present invention examples include lectins or antibodies having such properties.
  • lectins and antibodies as affinity substances will be described in more detail.
  • Affinity substance lectin
  • the lectin used as the affinity substance according to the present invention has an affinity for a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • Examples include lectins having (binding) sex.
  • a lectin having a specific affinity (specifically binds) to a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2,3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain is preferred.
  • the terminal sialic acid residue of the sugar chain has affinity (bonds) to the sugar chain in which ⁇ (2, 3) is bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain, but other sugar chains (for example, sugar A lectin that has no affinity for (does not bind to) a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the chain is ⁇ (2, 6) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain) is particularly preferred.
  • Examples of lectins having such properties include plant example lectins such as MAA which is a lectin derived from canine eel (Maackia amurensis), ACG which is a lectin derived from willow matsutake (Agrocybe cylindracea), and CD169 (sialic acid-binding Ig-like lectin 1). And animal lectins such as rat MAG, CD328, siglec-9 (sialic acid-binding immunoglobulin-like lectin-9). Of these, MAA is preferable.
  • the lectin may be labeled with a detectable labeling substance.
  • labeling substances used for labeling lectins include fluorescent dyes (fluorescein isothiocyanate (FITC), Cy5, Alexa Fluor 647, etc.), enzymes (horseradish-derived peroxidase), coenzymes, chemiluminescent substances, radioactive substances ( 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, etc.) and biotin and other labeling substances.
  • fluorescent dyes fluorescein isothiocyanate (FITC), Cy5, Alexa Fluor 647, etc.
  • enzymes horseradish-derived peroxidase
  • coenzymes chemiluminescent substances
  • radioactive substances 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, etc.
  • biotin and other labeling substances include fluorescent dyes (fluorescein isothiocyanate (FITC), Cy5, Alexa Fluor 647, etc.), enzymes (horseradish-derived peroxidase), coenzymes,
  • Affinity substance antibody An antibody used as an affinity substance according to the present invention is specific to a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain. And antibodies having a specific affinity (binding). An antibody having a specific affinity (specifically binds) to a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain is preferable.
  • the terminal sialic acid residue of the sugar chain has affinity (bonds) to the sugar chain in which ⁇ (2, 3) is bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain, but other sugar chains (for example, sugar Particularly preferred is an antibody that does not have affinity (does not bind), such as a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the chain is ⁇ (2, 6) -linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the type of antibody used as the affinity substance according to the present invention is not particularly limited.
  • any of a polyclonal antibody and a monoclonal antibody may be used, and these may be used alone or in appropriate combination.
  • These antibodies may be Fab, (ab ′) 2 , Fab ′ fragments, or antibody variable regions.
  • the antibody used as the affinity substance according to the present invention may be a commercially available antibody.
  • An antibody used as an affinity substance according to the present invention that is, an antibody having affinity for a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain
  • Examples of commercially available products include Anti-Sia ⁇ 2-3, Monoclonal Antibody (HYB4) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Anti-GM3 (Neu-Ac), Monoclonal Antibody (Clone: M2590) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) ), Anti-sialyl Lea antigen, monoclonal antibody (MSW113) (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), Anti-GM3 Monoclonal Antibody (Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.), Anti-Sialyl Lewis A Monoclonal Antibody (1H4) (Tokyo Chemical Industry) Co., Ltd.), Anti-Sialyl Lewis A Monoclonal
  • the antibody used as the affinity substance according to the present invention may be labeled with a detectable labeling substance.
  • the labeling substance used for labeling the antibody include alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, peroxidase, microperoxidase, glucose oxidase, glucose-6- used in EIA (ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay).
  • Enzymes such as phosphate dehydrogenase, acetylcholinesterase, malate dehydrogenase, and luciferase, for example, radioisotopes such as 99m Tc, 131 I, 125 I, 14 C, and 3 H used in RIA (Radioimmunoassay), such as HiLyte 647 (manufactured by AhaSpec), fluorescent materials such as fluorescein, dansyl, fluorescamine, coumarin, naphthylamine or their derivatives, such as luciferin, isoluminol, luminol, bis (2,4,6-trifluorophenyl) Luminescent substances such as oxalate, such as phenol, naphthol, Substances having absorption in the ultraviolet region such as tracene or derivatives thereof, such as 4-amino-2,2,6,6-tetramethylpiperidine-1-oxyl, 3-amino-2,2,5,5-tetra Methy
  • Method 1 that is, “a sugar having a terminal sialic acid residue of ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA linked ⁇ (2, 3) to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA is preferably 80% or more.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the above method is “the terminal sial of the target sugar chain from the free PSA protein having various sugar chain-modified isomers mixed in the sample.
  • To capture and detect (measure) free PSA having sugar chains ( ⁇ 2,3-type sialyl sugar chains) with acid residues ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain Efficiency ".
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the above-described method is ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA present in the sample with respect to the total amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA. 2, 3) It can also be said that it is the ratio of sugar chain free PSA.
  • examples of the method for obtaining the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA include the following methods.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is measured using an affinity substance and an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard labeled with a detectable labeling substance.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA labeled with a detectable labeling substance is measured without using an affinity substance.
  • the capture efficiency can be obtained by determining the ratio of the measurement result obtained using the affinity substance to the measurement result obtained without using the affinity substance.
  • Specific examples of the method for obtaining the capture efficiency include the following methods. That is, an affinity substance is reacted with an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard (with a known concentration). After the reaction, ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA and affinity substance-complexed fraction are separated from unreacted fraction, and the amount of target sugar chain in each fraction is analyzed with a mass spectrometer To do.
  • the capture efficiency can be obtained by calculating the amount of target sugar chain of the complexed fraction / (the amount of target sugar chain of the complexed fraction + the amount of target sugar chain of the unreacted fraction).
  • Examples of the method for preparing the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard include the method described in Example 2 (1) described later. That is, for example, according to the method disclosed in 2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA) of Non-Patent Document 6, r-free PSA (r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA And r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA). From the obtained r-free PSA, r ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA and r ⁇ ⁇ (2, ⁇ 6) sugar chain-free PSA are separated and purified by a known method.
  • r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain released by lectin column chromatography using a lectin with high affinity for sialyl ⁇ 2,3-galactose structure Separate from type PSA.
  • gel filtration is performed to purify r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA, respectively.
  • the obtained purified r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA can be used as the “ ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard”.
  • the obtained purified r ⁇ ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA can be used as an “ ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA standard” as necessary.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount using a certain affinity substance or ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount and free PSA amount other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA
  • the capture efficiency of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, particularly preferably 100%. Once it is confirmed, it is not necessary to confirm the capture efficiency again when measuring the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA using the affinity substance.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the method for measuring ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA according to the method 1) above is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, more preferably 98% or more, and particularly preferably 100%.
  • a (2, 3) sugar chain-free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain and affinity ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA content or free of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA content and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA
  • As a method to measure the amount of type PSA “The ⁇ - (2, 3) sugar chain free PSA sugar chain has a terminal sialic acid residue ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA is preferably 80% or more.
  • a (2, 3) sugar chain free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain
  • “sugar chain of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA” The ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinities of the affinity substance to the sugar chain in which the terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain
  • a method for producing a complex with an affinity substance The specific method varies depending on the subsequent measurement method of the complex. What is necessary is just to select and implement the optimal method suitably for every measuring method of this composite_body
  • “ ⁇ (2,) 3) sugar chain-free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) to the second galactose residue from the sugar chain end.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinity substance is formed by the interaction between the bound sugar chain and the affinity substance, components other than the complex are removed from the system.
  • the amount of the complex was measured, and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount or ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount and ⁇ (2, 3) sugar based on the result And a method of measuring the amount of free PSA other than the chain free PSA ”.
  • Method for measuring the amount of the complex without removing components other than the complex (complex of ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA and affinity substance) from the system is a so-called B
  • B This means a method for measuring the amount of complex of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and affinity substance by a homogeneous method without / F separation.
  • a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain A complex of ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA and the affinity substance by the interaction between the affinity substance and the affinity substance, and without removing components other than the complex from the system (the The amount of the complex is measured (without performing a washing operation usually performed to remove components other than the complex from the measurement system), and the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount or A method of measuring the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is preferable.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA is preferably 80% or more.
  • the amount of affinity substance used is determined in consideration of the binding constant of the affinity substance to ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the sample. It is done.
  • the amount of the affinity substance used to satisfy the above conditions is preferably an excess amount (saturation amount) of the affinity substance relative to the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the sample.
  • ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the sugar chain end.
  • ⁇ (2, 3) glycan free PSA amount or ⁇ (2, 3) glycan free PSA amount and ⁇ (2, ⁇ 3) glycan release As a method for measuring only ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in “Method for measuring free PSA amount other than type PSA”, for example, a labeled affinity substance labeled with a detectable labeling substance To detect only the complex of labeled affinity substance and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA without detecting free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA Can include a method of measuring only ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA.
  • the following is a method for measuring only the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, and the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and free type other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA.
  • a specific example of a method for measuring both PSA amounts will be described.
  • the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain is referred to as “target sugar chain” for convenience. There is a case.
  • Method 1 A sample that has an affinity for a biological sample and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain labeled with the labeling substance is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • Affinity to 1 antibody, 2nd antibody having affinity for PSA, and sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain A lectin (affinity substance) having contact, a labeled first antibody, an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, a second antibody and the lectin complex (first complex), ⁇ (2, 3) forming a complex (second complex) of free PSA other than sugar chain free PSA and the second antibody; 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in 1) as necessary, 3) The amount of the first complex is measured by measuring the signal derived from the labeled substance of the labeled antibody constituting the complex, and the ⁇ (2, 3) sugar chain free type is measured based on the measured value. A process to determine the amount of PSA.
  • the second antibody used in the above method 1 may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • Method 2 1 It has affinity for a biological sample and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain, and is labeled with a labeling substance.
  • the first antibody (affinity substance) thus prepared is brought into contact with a second antibody having affinity for PSA, and a complex of the labeled first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody ( Forming a complex of the second antibody with a free PSA other than the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody, 2)
  • the amount of the first complex is measured by measuring the signal derived from the labeled substance of the labeled first antibody constituting the complex, and the ⁇ (2, 3) sugar chain is measured based on the measured value.
  • the second antibody used in the above method 2 may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the first antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • Method 3 1) It has affinity for a biological sample and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain and is labeled with a labeling substance.
  • the first antibody (affinity substance), the second antibody having affinity for PSA, and the third antibody that specifically binds to free PSA are contacted, and the labeled first antibody and ⁇ (2, 3)
  • a complex of a sugar chain free PSA, a second antibody and a third antibody (first complex), and a complex of a free PSA other than an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, a second antibody and a third antibody Forming a body (second complex); 2)
  • the amount of the first complex is measured by measuring the signal derived from the labeled substance of the labeled first antibody constituting the complex, and the ⁇ (2, 3) sugar chain is measured based on the measured value.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the first antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • the amount of free PSA may be determined by carrying out the above-described method for directly determining the amount of free PSA.
  • the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is determined by a conventional method using the results obtained by measuring in the same manner using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard with a known concentration in advance. What is necessary is just to calculate
  • Method 4 1) A biological sample, an antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance (labeled anti-PSA antibody), and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose residue from the end of the sugar chain Is then contacted with a lectin (affinity substance) having an affinity for ⁇ (2, 3) -linked sugar chains, and a complex of the labeled anti-PSA antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the lectin ( Forming a complex (second complex) of the first complex) and a labeled anti-PSA antibody and a free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) A step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2) above by measuring a signal derived from the labeling substance of the labeled anti-PSA antibody constituting the complex.
  • a lectin affinity substance
  • the antibody relating to the antibody having affinity for PSA used in Method 4 and labeled with a labeling substance may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • Method 5 1) a biological sample, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, a second antibody having affinity for PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the terminal of the sugar chain
  • the first antibody and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA are contacted with a lectin (affinity substance) having affinity for the sugar chain ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from A complex of the second antibody and the lectin (first complex), a labeled first antibody, a free PSA other than the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, and a second antibody complex (second complex) Body)
  • Examples of combinations of the first antibody and the second antibody used in the method 5 include the following combinations. However, the epitopes of the first antibody and the second antibody are preferably different.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies having affinity for PSA.
  • the first antibody is an antibody having affinity for PSA
  • the second antibody is an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that specifically bind to free PSA.
  • the first antibody is an antibody that specifically binds to free PSA
  • the second antibody is an antibody having affinity for PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • Method 6 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, and a terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2 , 3) Affinity to the second antibody having affinity for the bound sugar chain and the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain
  • a labeled lectin (affinity substance), a labeled first antibody, an ⁇ (2,3) sugar chain free PSA, a second antibody, a complex of the lectin (first complex), and a labeled first antibody Forming a complex (second complex) of 1 antibody and a free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA; 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) A step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2) above by measuring a signal derived
  • Examples of combinations of the first antibody and the second antibody used in the method 6 include the following combinations. However, the epitopes of the first antibody and the second antibody are preferably different.
  • the first antibody is an antibody having affinity for PSA
  • the second antibody is a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain. It is an antibody having affinity for.
  • the first antibody is an antibody that specifically binds to free PSA
  • the second antibody is the terminal sialic acid residue of sugar chain ⁇ (2, 3) binding to the second galactose residue from the end of sugar chain It is an antibody having affinity for the sugar chain.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • Method 7 (Method without using labeled antibody) 1) Affinity to biological samples, antibodies having affinity for PSA, and sugar chains in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain A lectin (affinity substance) having a contact with the antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the lectin complex (first complex), and the antibody and ⁇ (2, 3) Forming a complex (second complex) of free PSA other than sugar chain free PSA, 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) The sum of the amount of the first complex and the amount of the second complex obtained in the step 3) above is obtained, the amount of the first complex is ⁇ (2, 3) sugar chain free type, The step of making the sum of the amount of the complex and the amount of the second complex the
  • the antibody having affinity for PSA used in Method 7 may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method 8 (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, a second antibody that specifically binds to free PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose from the end of the sugar chain A lectin (affinity substance) having affinity for an ⁇ (2, 3) -linked sugar chain is contacted with a residue, and the first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, the second antibody, Forming a complex of lectin (first complex), a complex of the first antibody and a free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody (second complex); 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) The sum of the amount of the first complex and the amount of the second complex obtained in the step 3) above is obtained,
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the difference in mass between the first complex and the second complex.
  • Good for example, electrophoresis
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method 9 (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain. A second antibody with affinity, and a lectin (affinity substance) having affinity for the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain The first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, second antibody and the lectin complex (first complex), the first antibody and ⁇ (2, 3) sugar.
  • Forming a complex of free PSA other than chain free PSA (second complex), 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) The sum of the amount of the first complex and the amount of the second complex obtained in the step 3) above is obtained, the amount of the first complex is ⁇ (2, 3) sugar chain free type, The step of making the sum of the amount of the complex and the amount of the second complex the amount of free PSA.
  • the first antibody used in the above method 9 may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method 10 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, and a terminal sialic acid residue of a sugar chain are added to the second galactose residue from the end of the sugar chain by ⁇ (2, 3) A second antibody (affinity substance) having an affinity for the bound sugar chain is brought into contact with the labeled first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody complex (first antibody).
  • the first antibody used in the above method 10 may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the second antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • Method 11 1) a biological sample, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, a second antibody having affinity for PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the terminal of the sugar chain
  • the first antibody and the ⁇ (2, 3) sugar chain are released by contacting a third antibody (affinity substance) having affinity for the sugar chain ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from Type PSA, second antibody and third antibody complex (first complex), labeled first antibody and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA other than complex PSA and second antibody ( Forming a second composite)
  • Examples of combinations of the first antibody and the second antibody used in the method 11 include the following combinations. However, the epitopes of the first antibody and the second antibody are preferably different.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies having affinity for PSA.
  • the first antibody is an antibody having affinity for PSA
  • the second antibody is an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first antibody is an antibody that specifically binds to free PSA
  • the second antibody is an antibody having affinity for PSA.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that specifically bind to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the third antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • Method 12 (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the first antibody used in the above method 12 may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the second antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method 13 (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, a second antibody that specifically binds to free PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose from the end of the sugar chain First antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, second antibody, and third antibody are contacted with a third antibody having affinity for ⁇ (2, 3) linked sugar chain to the residue.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the third antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • the capture efficiency of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA is preferably 80% or more.
  • An example is a method using a mass spectrometer.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the method is “the target sugar chain among the free PSA proteins having various sugar chain-modified isomers mixed in the sample” Captures and detects (measures) free PS with a sugar chain ( ⁇ 2,3 type sialyl sugar chain) in which the terminal sialic acid residue is ⁇ (2,3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain ) "Efficiency to do”.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) glycan free PSA in the method refers to ⁇ (2, 3) glycan free PSA present in the sample, which is finally detectable ⁇ ( 2, 3) It can also be said that it is the ratio of sugar chain free PSA.
  • one or more reference solutions prepared in advance using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard and having a known ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to free PSA Then, the amount of ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA is measured by the method described above. Next, the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA is measured using the test sample in the same manner as described above. Then, by comparing the measurement results obtained using the reference solution with the measurement results obtained using the test sample, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA with respect to the free PSA amount of the test sample. The ratio of can be determined.
  • a reference solution whose numerical value is such that the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount is used as an index for subsequent Pca determination is used.
  • a reference solution having a ratio of 25%, 45%, or 50% may be used.
  • Examples of the method for preparing the reference solution include the following methods.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard and ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA standard are each dissolved in an appropriate buffer and adjusted so that the protein mass of each solution is the same. To do.
  • a standard solution is obtained by diluting the ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA standard solution with the ⁇ (2, 6) sugar chain-free PSA standard solution and adjusting to the desired ratio. be able to.
  • Method-2 for measuring the ratio for example, (I) “The amount of free PSA in a biological sample is measured, and the terminal sialic acid residue of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is the second galactose residue from the end of the sugar chain. After the ⁇ (2, 3) -linked sugar chain and the affinity substance (lectin or antibody) interact to form a complex of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinity substance, By measuring the amount of the complex and measuring the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA based on the result, the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is measured and obtained.
  • the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA or the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is preferably 80% or more.
  • the capture efficiency of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA according to the present invention is 80% or more, preferably 90% or more, more preferably 95% or more, still more preferably 98% or more, and particularly preferably 100%. It is.
  • the method (i) or (ii) is preferable.
  • ⁇ (2, 3) After the ⁇ (2, 3) -linked sugar chain and the affinity substance (lectin or antibody) interact with each other to form a complex of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinity substance , By measuring the amount of the complex without removing components other than the complex from the system, and measuring the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA based on the result, ⁇ ( 2, 3) A method of measuring the amount of sugar chain free PSA and determining the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the obtained free PSA.
  • the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA were measured.
  • a method for determining the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the total amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA. Is more preferable.
  • the above method which uses a lectin as an affinity substance, is more preferable.
  • Free glycan free PSA and free PSA other than ⁇ (2, 3) glycan free PSA were measured, and the obtained ⁇ (2, 3) glycan free PSA and ⁇ (2, 3 ) ⁇ (2, 3) glycan relative to the total amount of free PSA other than glycan free PSA Method for determining the proportion of the release amount of PSA. " Is particularly preferred.
  • the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA are measured.
  • the trapping efficiency of the type PSA is preferably 80% or more.
  • the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA when determining the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA, the amount of free PSA, the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, ⁇ (2, 3) It is not necessary to measure the absolute amount of free PSA amount (PSA protein amount) other than sugar chain free PSA.
  • the ratio can also be obtained by using the actual measurement values (signal values such as fluorescence intensity and absorbance, peak area).
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA are separated, the peak area of each separated fraction is obtained, and ⁇ (2, 3 ) Peak area of sugar chain free PSA fraction / (Peak area of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA fraction + Peak area of free PSA fraction other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA) ) May be the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA.
  • Fluorescence of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA fraction / (Fluorescence of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA fraction + Free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA can also be the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA.
  • the amount of free PSA and the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in a biological sample are measured, and the ⁇ (2, 3) sugar chain relative to the obtained free PSA amount.
  • An example of a specific embodiment of “method for determining the ratio of the amount of free PSA” is described below.
  • the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, ⁇ 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain is referred to as “target sugar chain” for convenience. May be described.
  • “having affinity” means, for example, “binding”.
  • “separating based on affinity” means, for example, “separating objects to be separated based on the difference in binding strength”.
  • “separating the first complex and the second complex based on the affinity for the lectin” means, for example, “the first complex and the second complex are separated from each other by the first complex. "Separation is based on the difference between the strength of binding of the complex to the lectin and the strength of binding of the second complex to the lectin”.
  • Method A 1) A biological sample, an antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance (labeled anti-PSA antibody), and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose residue from the end of the sugar chain Is then contacted with a lectin (affinity substance) having an affinity for ⁇ (2, 3) -linked sugar chains, and a complex of the labeled anti-PSA antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the lectin ( Forming a complex (second complex) of the first complex) and a labeled anti-PSA antibody and a free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) A step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2) above by measuring a signal derived from the labeling substance of the labeled anti-PSA antibody constituting the complex.
  • a lectin affinity substance
  • step 4) Obtain the sum of the amount of the first complex obtained in the step 3) and the amount of the second complex, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in the step 3) to the sum.
  • the antibody relating to the antibody having affinity for PSA used in Method A and labeled with a labeling substance may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • Method B 1) a biological sample, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, a second antibody having affinity for PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the terminal of the sugar chain
  • the first antibody and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA are contacted with a lectin (affinity substance) having affinity for the sugar chain ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from A complex of the second antibody and the lectin (first complex), a labeled first antibody, a free PSA other than the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, and a second antibody complex (second complex) Body)
  • step 4) Obtain the sum of the amount of the first complex obtained in the step 3) and the amount of the second complex, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in the step 3) to the sum.
  • the combination of the first antibody and the second antibody used in the method B include, for example, the following combinations.
  • the epitopes of the first antibody and the second antibody are preferably different.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies having affinity for PSA.
  • the first antibody is an antibody having affinity for PSA
  • the second antibody is an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that specifically bind to free PSA.
  • the first antibody is an antibody that specifically binds to free PSA
  • the second antibody is an antibody having affinity for PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • Method C 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, and a terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2 , 3) Affinity to the second antibody having affinity for the bound sugar chain and the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain
  • a labeled lectin (affinity substance), a labeled first antibody, an ⁇ (2,3) sugar chain free PSA, a second antibody, a complex of the lectin (first complex), and a labeled first antibody Forming a complex (second complex) of 1 antibody and a free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA; 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) A step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2) above by measuring a signal derived
  • step 4) Obtain the sum of the amount of the first complex and the amount of the second complex obtained in step 3) above, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in step 4) to the sum.
  • the combination of the first antibody and the second antibody used in the method C include, for example, the following combinations.
  • the epitopes of the first antibody and the second antibody are preferably different.
  • the first antibody is an antibody having affinity for PSA
  • the second antibody is a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain. It is an antibody having affinity for.
  • the first antibody is a labeled antibody that specifically binds to free PSA
  • the second antibody has ⁇ (2, 3) as the terminal sialic acid residue of the sugar chain at the second galactose residue from the end of the sugar chain. It is an antibody having affinity for the bound sugar chain.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex.
  • Method D 1) A sample that has an affinity for a biological sample and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain labeled with the labeling substance is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • Affinity to 1 antibody, 2nd antibody having affinity for PSA, and sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain A lectin (affinity substance) having contact, a labeled first antibody, an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, a second antibody and the lectin complex (first complex), ⁇ (2, 3) forming a complex (second complex) of free PSA other than sugar chain free PSA and the second antibody; 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in 1) as necessary, 3) The amount of the first complex is measured by measuring the signal derived from the labeled substance of the labeled antibody constituting the complex, and the ⁇ (2, 3) sugar chain free type is measured based on the measured value.
  • the process of determining the amount of PSA 4) A step of determining the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount obtained in 3) above to the free PSA amount in
  • the second antibody used in the above method D may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of free PSA may be determined by carrying out the above method for directly determining the amount of free PSA.
  • the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is determined by a conventional method using the results obtained by measuring in the same manner using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard with a known concentration in advance. What is necessary is just to calculate
  • Method E (Method without using labeled antibody) 1) Affinity to biological samples, antibodies having affinity for PSA, and sugar chains in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain A lectin (affinity substance) having a contact with the antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the lectin complex (first complex), and the antibody and ⁇ (2, 3) Forming a complex (second complex) of free PSA other than sugar chain free PSA, 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) Obtain the sum of the amount of the first complex obtained in the step 3) and the amount of the second complex, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in the step 3) to the sum. A step of determining the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free
  • the antibody having affinity for PSA used in the above method E may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method F (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, a second antibody that specifically binds to free PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose from the end of the sugar chain A lectin (affinity substance) having affinity for an ⁇ (2, 3) -linked sugar chain is contacted with a residue, and the first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, the second antibody, Forming a complex of lectin (first complex), a complex of the first antibody and a free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody (second complex); 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) Obtain the sum of the amount of the first complex and the amount of the second complex obtained in step 3) above, and
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method G (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain. A second antibody with affinity, and a lectin (affinity substance) having affinity for the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain The first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, second antibody and the lectin complex (first complex), the first antibody and ⁇ (2, 3) sugar.
  • Forming a complex of free PSA other than chain free PSA (second complex), 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) Obtain the sum of the amount of the first complex obtained in the step 3) and the amount of the second complex, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in the step 3) to the sum.
  • the first antibody used in the above method G may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the lectin for the target sugar chain, or may be separated based on the mass difference between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method H 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, and a terminal sialic acid residue of a sugar chain are added to the second galactose residue from the end of the sugar chain by ⁇ (2, 3) A second antibody (affinity substance) having an affinity for the bound sugar chain is brought into contact with the labeled first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody complex (first antibody).
  • the first antibody used in the above method H may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the second antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • Method I 1) It has affinity for a biological sample and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain, and is labeled with a labeling substance.
  • the first antibody (affinity substance) thus prepared is brought into contact with a second antibody having affinity for PSA, and a complex of the labeled first antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody ( Forming a complex of the second antibody with a free PSA other than the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the second antibody, 2)
  • the amount of the first complex is measured by measuring the signal derived from the labeled substance of the labeled first antibody constituting the complex, and the ⁇ (2, 3) sugar chain is measured based on the measured value.
  • a step of determining the amount of free PSA, 4) A step of determining the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount obtained in 3) above to the free PSA amount in the biological sample obtained in advance.
  • the second antibody used in the above method I may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the first antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • the amount of free PSA may be determined by carrying out the method for directly determining the amount of free PSA.
  • the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is determined by a conventional method using the results obtained by measuring in the same manner using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard with a known concentration in advance. What is necessary is just to calculate
  • Method J 1) a biological sample, a first antibody having affinity for PSA and labeled with a labeling substance, a second antibody having affinity for PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the terminal of the sugar chain
  • the first antibody and the ⁇ (2, 3) sugar chain are released by contacting a third antibody (affinity substance) having affinity for the sugar chain ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from Type PSA, second antibody and third antibody complex (first complex), labeled first antibody and ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA other than complex PSA and second antibody ( Forming a second composite)
  • step 4) Obtain the sum of the amount of the first complex obtained in the step 3) and the amount of the second complex, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in the step 3) to the sum.
  • the combination of the first antibody and the second antibody used in the method J include the following combinations.
  • the epitopes of the first antibody and the second antibody are preferably different.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies having affinity for PSA.
  • the first antibody is an antibody having affinity for PSA
  • the second antibody is an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first antibody is an antibody that specifically binds to free PSA
  • the second antibody is an antibody having affinity for PSA.
  • the first antibody and the second antibody are antibodies that specifically bind to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the third antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • Method K 1 It has affinity for a biological sample and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain and is labeled with a labeling substance.
  • the first antibody (affinity substance), the second antibody having affinity for PSA, and the third antibody that specifically binds to free PSA are contacted, and the labeled first antibody and ⁇ (2, 3) A complex of a sugar chain free PSA, a second antibody and a third antibody (first complex), and a complex of a free PSA other than an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, a second antibody and a third antibody Forming a body (second complex); 2) The process of isolate
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the first antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • the amount of free PSA may be determined by carrying out the method for directly determining the amount of free PSA.
  • the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is determined by a conventional method using the results obtained by measuring in the same manner using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard with a known concentration in advance. What is necessary is just to calculate
  • Method L (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, and a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) bonded to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • Forming a complex of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA (second complex) 2) A step of separating the first complex and the second complex obtained in the step 1) above, 3) a step of measuring the amount of the first complex and the amount of the second complex separated in the step 2); 4) Obtain the sum of the amount of the first complex obtained in the step 3) and the amount of the second complex, and calculate the ratio of the amount of the first complex obtained in the step 3) to the sum.
  • a step of determining the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount by obtaining.
  • the first antibody used in the above method L may be an antibody that specifically binds to free PSA.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the second antibody for the target sugar chain, or based on the difference in mass between the first complex and the second complex. You may isolate
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • Method M (Method without using labeled antibody) 1) A sample derived from a living body, a first antibody having affinity for PSA, a second antibody that specifically binds to free PSA, and the terminal sialic acid residue of the sugar chain is the second galactose from the end of the sugar chain First antibody, ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, second antibody, and third antibody are contacted with a third antibody having affinity for ⁇ (2, 3) linked sugar chain to the residue.
  • the first complex and the second complex may be separated based on the affinity of the third antibody for the target sugar chain, or may be separated based on the difference in mass between the first complex and the second complex. (For example, electrophoresis etc.).
  • the amount of PSA protein in each complex may be measured.
  • the above-described anti-PSA antibody is used as a primary antibody, and the labeled antibody is labeled with a labeling substance that can be measured as a secondary antibody.
  • a method of measuring the amount of PSA protein in each separated fraction by performing a known Western blotting method using
  • ⁇ (2, (3) sugar chain-free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the sugar chain end.
  • the method of measuring the amount of the complex and measuring the amount of ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA based on the result is to remove components other than the complex from the measurement system. In order to achieve this, there is a method of measuring the amount of the complex without carrying out a usual washing operation.
  • the methods A, B, E, F, and H to M are preferable.
  • the methods B and I are more preferable.
  • the methods E, F, L, and M are more preferable.
  • the methods B and I are particularly preferred.
  • the “ ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain and the affinity to the sugar chain” -After the complex of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinity substance is formed by interaction with the substance, the amount of the complex is measured, and ⁇ (2,2 Specific examples of ⁇ 3) Method for measuring sugar chain free PSA amount or ⁇ (2, ⁇ ⁇ 3) sugar chain free PSA amount and free PSA amount other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA '' Examples thereof include ELISA and RIA.
  • the “ ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA sugar chain terminal sialic acid residue is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain and the affinity to the sugar chain” according to the present invention -After generating a complex of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinity substance by interaction with the substance, components other than the complex are removed from the system without removing the complex.
  • Specific examples of the method of measuring the amount and measuring the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA based on the result include, for example, capillary electrophoresis, surface plasmon resonance, mass spectrometry, lectin microarray, etc. ) And the like.
  • the sugars of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA sugar chain are ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the complex of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and the affinity substance is formed using the interaction between the chain and the affinity substance, components other than the complex are removed from the system.
  • Measure the amount of the complex measure the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA based on the result, and release ⁇ (2, 3) sugar chain relative to the obtained free PSA amount.
  • Example of “Method for Determining Ratio of Type PSA Amount” will be described.
  • the method for confirming the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is as described above.
  • an affinity substance when used, it may be performed as follows.
  • the affinity substance is reacted with ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA standard by the following method.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA and affinity substance-complexed fraction are separated from unreacted fraction, and the amount of target sugar chain in each fraction is analyzed with a mass spectrometer To do.
  • the capture efficiency can be obtained by calculating the amount of target sugar chain of the complexed fraction / (the amount of target sugar chain of the complexed fraction + the amount of target sugar chain of the unreacted fraction).
  • Capillary electrophoresis As a method for determining the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA by capillary electrophoresis and determining the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA, for example, A biological sample containing PSA is contacted and reacted with a labeled anti-PSA antibody obtained by labeling the anti-PSA antibody according to the present invention (preferably an anti-free PSA antibody) with a labeling substance, and [ A labeled anti-PSA antibody- ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA] complex and a [labeled anti-PSA antibody-free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA] complex are used as an affinity substance.
  • a labeled anti-PSA antibody obtained by labeling the anti-PSA antibody according to the present invention (preferably an anti-free PSA antibody) with a labeling substance
  • the amount of the labeling substance derived from the complex 1 and the amount of the labeling substance derived from the complex 2 correspond to the respective peak area values obtained by capillary electrophoresis. You can ask for.
  • anti-PSA antibody and the labeling substance of the labeled anti-PSA antibody used in the above method are as described above.
  • Examples of the solvent for reacting a biological sample with a labeled anti-PSA antibody include a buffer solution.
  • the buffer solution used for this purpose is not particularly limited as long as it is usually used in this field, but usually has a pH value of 5.0 to 10.0, and preferably has a buffering action near neutrality of pH value of 6.5 to 8.5.
  • Specific examples include Tris-HCl buffer, MES buffer, HEPES buffer, borate buffer, phosphate buffer, veronal buffer, Good buffer, and the like.
  • the buffering agent concentration of these buffers is appropriately selected from the range of usually 5 to 1000 ⁇ mM, preferably 5 to 300 ⁇ mM.
  • the buffer further includes a sensitizer, a surfactant, an antiseptic (eg, sodium azide, salicylic acid, benzoic acid, etc.), a stabilizer (eg, albumin, globulin, water-soluble gelatin, surfactant, saccharide, etc.).
  • an antiseptic eg, sodium azide, salicylic acid, benzoic acid, etc.
  • a stabilizer eg, albumin, globulin, water-soluble gelatin, surfactant, saccharide, etc.
  • Activators and other substances used in this field which may inhibit stability with coexisting reagents or do not inhibit antigen-antibody reaction.
  • concentration range of these reagents and the like may be appropriately selected from the concentration ranges usually used in the measurement method known per se.
  • a buffer solution attached to the kit may be used.
  • the concentration of the antibody in the solution containing the labeled anti-PSA antibody may be a concentration that falls within the target concentration range when the sample and the solution containing the labeled anti-PSA antibody are mixed.
  • it may be 0.1 to 200 ⁇ M, preferably 0.5 to 50 ⁇ M, more preferably 0.5 to 20 ⁇ M, and still more preferably 0.5 to 10 ⁇ M. That is, the lower limit is 0.1 ⁇ M, preferably 0.5 ⁇ M.
  • the upper limit is 200 ⁇ M, preferably 50 ⁇ M, more preferably 20 ⁇ M, and still more preferably 10 ⁇ M.
  • the concentration in the reaction solution of the labeled anti-PSA antibody according to the present invention when contacting and reacting the biologically-derived sample with the labeled anti-PSA antibody according to the present invention varies depending on the concentration of PSA in the sample and is not particularly limited. 0.1 to 1000 nM, preferably 0.1 to 500 nM, more preferably 0.5 to 200 nM. That is, the lower limit is 0.1 nM, preferably 0.5 nM. The upper limit is 1000 nM, preferably 500 nM, more preferably 200 nM.
  • the pH at the time of reaction between the biological sample and the labeled anti-PSA antibody according to the present invention is not particularly limited as long as it does not suppress the antigen-antibody reaction, and is usually in the range of 6.0 to 10.0, preferably 6.0 to 8.0.
  • the temperature during the reaction is not particularly limited as long as it does not inhibit the antigen-antibody reaction, and it is usually in the range of 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C.
  • the reaction time varies depending on the antibody according to the present invention used and the reaction conditions such as pH and temperature. Therefore, the reaction time may be 1 to 60 minutes, preferably about 1 to 15 minutes depending on each.
  • capillary electrophoresis it is preferable to carry out electrophoresis performed by a capillary chip.
  • (Micro) chip capillary electrophoresis is a technique in which a capillary having a cross-sectional diameter of 100 ⁇ m or less is formed on a chip substrate, and electrophoresis is performed in this capillary, and it exists in a sample by applying a voltage in the capillary. In this method, a difference in charge of a substance is separated as a difference in mobility.
  • Capillary electrophoresis is classified into capillary zone electrophoresis and capillary gel electrophoresis depending on the electrophoresis solution used, but the method of the present invention can be applied to any of them. Considering the accuracy of separation, capillary gel electrophoresis is preferable among the above.
  • the electrophoresis solution used in capillary electrophoresis according to the present invention is not particularly limited as long as it is usually used in this field.
  • the pH is 5 to 10, preferably 6 to 8.
  • a buffer solution may be mentioned.
  • Specific examples of the buffer include Tris-HCl buffer, HEPES buffer, lactate buffer, citrate buffer, acetate buffer, succinate buffer, glycine buffer, phthalate buffer, and phosphate buffer. Solution, triethanolamine buffer solution, borate buffer solution, glycine buffer solution, barbiturate buffer solution, tartaric acid buffer solution, borate buffer solution and the like, but are not limited thereto.
  • the buffering agent concentration in these buffers is appropriately selected from the range of usually 10 to 500 ⁇ mM, preferably 10 to 300 ⁇ mM.
  • the electrophoresis solution may contain substances for reducing the influence of electroosmotic flow, such as polyethylene glycol, polyacrylamide, polyethyleneimine, fluorine-containing aromatic hydrocarbons, saccharides, etc. What is necessary is just to set in the range used in a field
  • this buffer solution contains, for example, salts such as NaCl, surfactants, preservatives, proteins such as BSA, etc., so long as they do not interfere with the antigen-antibody reaction and the interaction between the sugar chain and the affinity substance. It may be.
  • polyethers such as polyethylene oxide (polyethylene glycol) and polypropylene oxide
  • polyalkyleneimines such as polyethyleneimine
  • polyacrylic acid polyacrylic acid ester
  • polymethyl acrylate polymethyl acrylate
  • Polyacrylic acid polymers for example, polyamide polymers such as polyacrylamide and polymethacrylamide, for example, polymethacrylic acid polymers such as polymethacrylic acid, polymethacrylate, polymethyl methacrylate, such as polyvinyl acetate, polyvinyl pyrrolidone, polyvinyl oxazolidone Polyvinyl polymers such as pullulan, erucinane, xanthan, dextran, guar gum and the like water soluble hydroxyl polymers such as methyl Buffers for use in water-soluble cellulose compounds such as cellulose, hydroxyethyl cellulose, hydroxypropyl cellulose, derivatives thereof, and polymers such as copolymers containing a plurality of monomer units constituting these polymers as electrophoresis solutions for capillary electrophoresis And the like added to.
  • polyamide polymers such as polyacrylamide and polymethacrylamide
  • polymethacrylic acid polymers such as polymethacrylic
  • the above polymers may be added in combination of two or more.
  • the molecular weight of the polymer as described above is usually 500 Da to 6000 kDa, preferably 1 to 1000 kDa, more preferably 100 to 1000 kDa.
  • the concentration of the polymer may be appropriately selected from the range usually used in this field, and is usually 0.01 to 40% (w / v), preferably 0.01 to 20% (w / v), more preferably 0.1 to 10% (w / v).
  • the viscosity of the electrophoresis buffer when the filler is added to the electrophoresis buffer is usually 2 to 1000 centipoise, preferably 5 to 200 centipoise, and more preferably 10 to 100 centipoise.
  • the affinity substance may be contained in the electrophoresis solution. However, during the separation by capillary electrophoresis, it is desirable that the affinity substance has a higher concentration than the amount capable of completely binding the ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA and the affinity substance.
  • the affinity substance when it is lectin, it is 0.1 mg / mL to 20 mg / mL, preferably 1.0 mg / mL to 10 mg / mL, more preferably 2.0 mg / mL to 5.0 mg / mL.
  • the affinity substance is an antibody, it is 0.01 mg / mL to 20 mg / mL, preferably 0.05 mg / mL to 10 mg / mL, more preferably 0.1 mg / mL to 5.0 mg / mL.
  • the concentration of MAA in the micro flow path may be 0.1 mg / mL to 20 mg / mL.
  • any antibody used in the measurement system is labeled with a charged carrier molecule such as an anionic substance. It is preferable. Specifically, for example, it is preferably labeled with a nucleic acid chain. In this case, the antibody may be labeled with both the charge carrier molecule and the labeling substance for detection described above.
  • the nucleic acid chain used for such a purpose has a nucleotide residue consisting of a purine base or pyrimidine base, a pentose which is a sugar moiety, and a phosphate as a basic unit, and the phosphate has a 3 ′ sugar between each nucleotide. It is a chain polynucleotide that is polymerized by being linked by a diester bond between 5′-position carbons, and examples thereof include RNA whose sugar moiety is ribose and / or DNA whose sugar moiety is deoxyribose.
  • the nucleic acid strand may be a single strand or a double strand or a plurality of nucleic acid strands.
  • the length of the nucleic acid chain used is not particularly limited as long as the object of the present invention can be achieved, and is usually 1 bp to 1000 kbp, preferably 5 bp to 100 kbp, more preferably 10 bp to 50 kbp, and further preferably 50 bp to 2500 bp. is there.
  • Examples of the method for binding the nucleic acid chain and the antibody according to the present invention include known methods disclosed in, for example, Japanese Patent Nos. 42147779 and 48602093.
  • the functional group of each of the antibody and the nucleic acid chain is directly or linker [for example, sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate (Sulfo-SMPB), sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane- 1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), etc.] may be used.
  • linker for example, sulfosuccinimidyl 4- (p-maleimidophenyl) butyrate (Sulfo-SMPB), sulfosuccinimidyl 4- (N-maleimidomethyl) cyclohexane- 1-carboxylate (Sulfo-SMCC), N- ( ⁇ -maleimidocaproyloxy) succinimide (EMCS), etc.
  • the antibody according to the present invention and the reactive functional group-introduced nucleic acid chain may be combined by the method described in Japanese Patent No. 42147779.
  • a method for introducing a reactive functional group into a nucleic acid chain a method known per se can be mentioned.
  • PCR is performed using a PCR primer having a reactive functional group introduced at the 5 ′ end, and a nucleic acid having a reactive functional group introduced at the 5 ′ end as a PCR product.
  • Reactive functional groups may be introduced at the ends of nucleic acids by methods such as molecular cloning, molecular cloning, laboratory manuals, second editions, J. Sambrook, E. F. Frisch, T. Maniatis, cold springs, harbors, laboratory presses, etc. it can.
  • Samples to be subjected to capillary electrophoresis, solutions for dissolving antibodies, etc. include, for example, Tris buffer, BisTris buffer, Good buffer, HEPES buffer, glycine buffer, borate buffer, phosphate buffer, veronal Examples include a buffer solution and a MOPS buffer solution. Further, the concentration of the buffer in these buffers is appropriately selected from the range of usually 10 to 500 ⁇ mM, preferably 10 to 300 ⁇ mM.
  • the pH is not particularly limited as long as it does not interfere with the antigen-antibody reaction and the reaction between the sugar chain and the affinity substance, but it is usually preferably in the range of 5-9.
  • the solution may contain, for example, sugars, salts such as NaCl, surfactants, preservatives, proteins, etc., as long as they do not interfere with the antigen-antibody reaction and the reaction between the sugar chain and the affinity substance. .
  • a method for introducing a sample (a solution containing a [labeled anti-PSA antibody-free PSA] complex) in capillary electrophoresis according to the present invention may be any method usually used in this field, and is not particularly limited. Examples thereof include a suction method, a pressurizing method, and an electrical introduction method, and among them, the pressurizing method is preferable.
  • the amount of sample introduced varies depending on conditions such as the inner diameter and length of the capillary, the type of detector and the sensitivity.
  • the sample may be concentrated by known isotachophoresis (ITP), and then the concentrate may be directly introduced into capillary electrophoresis (CE).
  • ITP isotachophoresis
  • CE capillary electrophoresis
  • capillary electrophoresis may be in accordance with a method known per se.
  • capillary electrophoresis it may be carried out according to the method described in J. Chromatogr. 593 253-258 (1992), Anal. Chem. 64 1926-1932 (1992), WO2007 / 027495 and the like.
  • the voltage at the time of electrophoresis in electrophoresis according to the present invention varies depending on the electrophoresis solution, the apparatus used, and the like, it may be appropriately set from the range normally used in this field.
  • capillary electrophoresis When capillary electrophoresis is performed with an automatic analyzer, capillary electrophoresis may be performed according to the method described in the instruction manual under the conditions described in the instruction manual attached to the apparatus.
  • a labeled first antibody using MAA as an affinity substance and an anti-free PSA antibody labeled with a fluorescent substance as a labeled anti-PSA antibody is used.
  • a second antibody labeled with anti-PSA antibody with DNA microchip capillary electrophoresis using lectin affinity is performed, and PSA is separated based on the degree of affinity of lectin for PSA sugar chain, The method of measuring with a fluorescence detector is shown below.
  • a biological sample containing PSA is reacted with a test solution containing 0.001 to 10 ⁇ M, preferably 0.01 to 1 ⁇ M, of a fluorescently labeled anti-free PSA antibody.
  • a sample derived from a living body used for capillary electrophoresis may be a sample collected from a living body, or a sample prepared by desalting a sample collected from a living body or performing various purification steps.
  • the obtained reaction solution usually 2 to 50 ⁇ L of a test solution containing 0.001 to 10 ⁇ M, preferably 0.01 to 1 ⁇ M of a DNA-labeled anti-PSA antibody, a buffer for electrophoresis, and an internal standard substance (for example, fluorescent substance: HiLyte647 (AnaSpec) Etc.) is introduced into a capillary having an inner diameter of 5 to 500 ⁇ m, preferably 50 to 200 ⁇ m, more preferably 50 to 100 ⁇ m and a length of 1 to 10 cm by a pressurization method at 1 to 10 psi for 30 to 60 seconds.
  • the reaction is carried out at a temperature of 20 to 40 ° C. for 5 seconds to 30 minutes, preferably 10 seconds to 15 minutes.
  • ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA peak (including [fluorescent labeled anti-free PSA antibody]-[ ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA]-[DNA labeled anti-PSA antibody] complex ) And other free PSA peaks ([fluorescent labeled anti-free PSA antibody]-[free PSA other than ⁇ (2, (3) sugar chain free PSA)]-[DNA labeled anti-PSA antibody] Can be distinguished from the migration position. Therefore, the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in the sample is defined as the peak area. Further, the sum of the peak area of the obtained ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA and the peak area of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is defined as the amount of free PSA.
  • the amount of free PSA and the amount of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA can be measured and determined at the same time in the same specimen.
  • the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount is the ratio of the obtained peak area (peak area of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA / free PSA amount). It is obtained by seeking.
  • Capillary electrophoresis may be performed using a commercially available fully automatic measuring device.
  • Mutus Wako i30 manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • Wako Pure Chemical Industries, Ltd. can be mentioned.
  • PSA when PSA in a sample and a fluorescently labeled anti-free PSA antibody are reacted in a liquid phase, PSA binds to the fluorescently labeled anti-free PSA antibody, and [fluorescently labeled anti-free PSA antibody-free PSA]. To form a complex.
  • a solution (sample A for electrophoresis) containing this [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-free PSA] complex is transferred to a predetermined well (immune reaction solution well) on a dedicated chip of a fully automatic fluorescence immunoassay device Mutus Wako® i30. Dispense into. Next, running buffer 2 (R2 well) (containing MAA), running buffer 3 (R3 well), running buffer 4 (R4 well), DNA labeled antibody solution (C1 well) and fluorescent solution (FD well) Dispense into predetermined wells on the dedicated chip.
  • FIG. 1 A schematic diagram of a dedicated chip (microchip) is schematically shown in FIG. 1
  • the waste well is used as a waste reservoir (drain well) when introducing R2, R3, R4, C1 and the sample A for electrophoresis into the analysis channel.
  • the complex 1 and complex 2 and the free DNA-labeled anti-PSA antibody further move toward the anode due to the charge of the anion. Since the unreacted fluorescence-labeled anti-free PSA antibody is not bound to the DNA-labeled PSA antibody and is not charged, it does not move further in the anode direction.
  • complex 1 interacts with MAA contained in the zone, but complex 2 does not interact with MAA.
  • complex 1 migrates later than complex 2, the appearance position of the fluorescence peak derived from the fluorescently labeled anti-PSA antibody to be detected differs between complex 1 and complex 2. Therefore, the peak of the complex 1 and the peak of the complex 2 can be known from the position of the peak.
  • the PSA amount of each peak can be obtained by determining the peak area of each peak.
  • the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount is the ratio of the obtained peak area (peak area of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA / free PSA amount). It is obtained by seeking.
  • examples of the method for obtaining the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA include the following methods, but are not limited thereto.
  • complex 1 [fluorescent labeled anti-free PSA Antibody]-[ ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA]-[DNA-labeled anti-PSA antibody] is determined (measurement value 2).
  • the ratio of measured value 1 to measured value 2 obtained (measured value 1 / measured value 2) is obtained, and the obtained ratio is defined as the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in this method.
  • the surface plasmon resonance method analyzes the interaction between biomolecules using the optical phenomenon of surface plasmon resonance (SPR) that occurs when surface plasmons are excited at the metal / liquid interface. It is an intermolecular interaction analysis system.
  • the surface plasmon resonance method uses a surface plasmon resonance spectrometer to detect a small amount of mass change that occurs on the sensor chip surface as a result of binding and dissociation between two molecules as an SPR signal. Since interactions between biomolecules are monitored in real time, kinetic information can be obtained that the binding / dissociation between biomolecules is fast / slow.
  • Biacore As a typical analysis system of the surface plasmon resonance method, there is a Biacore TM method.
  • the Biacore method is generally simply called Biacore.
  • the term “Biacore” may refer to a Biacore device used in a Biacore analysis system.
  • the measurement by the surface plasmon resonance method may be performed under the optimum conditions for the measurement according to the attached instruction manual.
  • an anti-PSA antibody is immobilized on the surface of the sensor chip.
  • the detection light is applied from the back side of the sensor chip so as to be totally reflected at the interface between the gold thin film and the glass of the sensor chip, a part of the reflected light has a reduced reflection intensity.
  • the angle at which this dark portion of light appears depends on the refractive index of the solvent on the sensor chip surface.
  • the mass of the molecule immobilized on the gold thin film surface increases and the refractive index of the solvent changes. To do. At this time, the position of the dark portion of the reflected light is shifted according to the change in mass. Conversely, when molecules dissociate, the dark part returns from the shifted position.
  • the shifting angle represents a change in mass of the surface of the sensor chip. In the surface plasmon resonance method, the bond / dissociation between molecules is monitored from this angle change. Based on the obtained results, first, the amount of free PSA in a biological sample can be measured.
  • a solution containing an affinity substance is caused to flow from the flow path of the surface plasmon resonance spectrometer to the surface of the sensor chip.
  • the PSA of the “anti-PSA antibody PSA complex” formed on the gold thin film surface binds to the affinity substance flowing through the flow path, the refractive index of the solvent changes in the same way. Monitor. Based on the obtained results, the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA in a biological sample can be measured.
  • Examples of methods for measuring the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA in a biological sample by surface plasmon resonance include the following methods.
  • one or more reference solutions prepared in advance using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard and having a known ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to free PSA The measurement is performed by the surface plasmon resonance method, and each sensorgram is obtained. Next, measurement is performed in the same manner using the test sample, and a sensorgram is obtained. By comparing the sensorgram obtained using the reference solution with the sensorgram obtained using the test sample, the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA was compared with the free PSA content of the test sample. Determine the ratio.
  • the reference solution to be used is such that the ratio of the ⁇ (2, (3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount serves as an index when subsequently determining Pca. For example, a reference solution having a ratio of 25%, 45%, or 50% may be used.
  • Examples of the method for obtaining the capture efficiency of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount in the surface plasmon resonance method include the following methods, but are not limited thereto.
  • the affinity substance is immobilized on the surface of the sensor chip.
  • a sample containing an ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA standard with a known concentration is flowed from the flow path of the surface plasmon resonance spectrometer to the surface of the sensor chip.
  • measurement by the surface plasmon resonance method is performed to obtain a sensorgram.
  • the peak value of the sensorgram is determined (measurement value 1).
  • a sample containing the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard at the same concentration as that used to obtain the measured value 1 was immobilized with the anti-PSA antibody from the channel of the surface plasmon resonance spectrometer. Flow over the surface of the sensor chip. During the above, measurement by the surface plasmon resonance method is performed to obtain a sensorgram. The peak value of the sensorgram is determined (measurement value 2).
  • the anti-PSA antibody used for obtaining the measurement value 2 should have sufficient specificity and affinity with the antigen in consideration of the dissociation constant and the like. Must be selected.
  • the ratio of measured value 1 to measured value 2 obtained (measured value 1 / measured value 2) is obtained, and the obtained ratio is defined as the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in this method.
  • Microarray method The lectin microarray method developed by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Glycomedical Engineering Research Center, etc. can also be used for the determination method of the present invention.
  • a lectin array is an array in which lectins, which are proteins having a property of binding to several tens of sugar chains having different specificities, are arranged in a spot shape on a slide glass and immobilized.
  • the evanescent field refers to a state in which weak light oozes from the substrate (slide glass) interface. After the fluorescently labeled glycoprotein interacts with the lectin microarray, the slide glass is irradiated with excitation light to generate an evanescent field.
  • the excitation light reaches about 100 nm to 200 nm from the interface, and the sugar chain bound to the lectin also exists from 100 nm to 200 nm from the interface, so that only the sugar chain bound to the lectin array can emit light.
  • the fluorescence of the lectin array can be detected without performing a washing operation. After allowing the glycoprotein to interact with the lectin microarray without fluorescent labeling, the antibody against the core protein of the glycoprotein may be reacted with the fluorescently labeled fluorescent antibody, and then fluorescence may be detected by the same method as described above.
  • Measurement with a lectin microarray may be carried out according to the protocol described in, for example, MICROARRAY METHODS AND PROTOCOLS (CRC Press), edit by Robert S. Matson, “Chapter 9: Lectin Microarrays”, Masao Yamada, p.141, 2009.
  • the amount of ⁇ (2, A3) sugar chain free PSA according to the present invention is measured, and the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA is determined. For example, the following may be performed.
  • the lectin which is an affinity substance according to the present invention, and the sugar chain of PSA other than the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain
  • a microarray on which a plurality of lectins having affinity are immobilized is prepared.
  • the target microarray may be prepared according to the method described in, for example, Kuno A. et al., Nat Methods. 2005 Nov, vol. 2, No. 11, pp. 851-856.
  • a commercially available microarray manufactured by LecChip TM Glyco Technica may be used.
  • Pre-treated biological sample and fluorescent labeled anti-free PSA antibody are dropped onto the microarray and allowed to react as necessary.
  • [Fluorescent labeled anti-free PSA antibody- ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA -Lectin] complex is dropped onto the microarray and allowed to react as necessary.
  • fluorescence derived from the fluorescence-labeled anti-free PSA antibody is measured using an evanescent wave excitation fluorescence scanner.
  • the ⁇ (2, 3) sugar in the sample is converted into a quantitative value based on the measured value. Obtain the amount of free PSA.
  • the ratio of the amount of ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA measured by the microarray method to the amount of free PSA obtained separately is determined.
  • the method for measuring the amount of free PSA is as described above in “(1) Method for measuring the amount of free PSA”.
  • Examples of the method for obtaining the capture efficiency of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount in the lectin microarray method include the following methods, but are not limited thereto.
  • the concentration of sialic acid residues at the terminal sialic acid residues of PSA is fixed on a lectin microarray on which a lectin having affinity for a sugar chain in which ⁇ (2, 3) is linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain is immobilized.
  • a sample containing ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard is contacted and reacted with the solid phase.
  • the unreacted fraction including the washed fraction
  • the ⁇ (2, (3) sugar chain free PSA concentration remaining in the fraction is measured by a known PSA measurement method.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in this method can be determined from the following equation. [Concentration of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard used for measurement-concentration of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in unreacted fraction (including washing fraction)] / Measurement Concentration of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard provided
  • ELISA As a method for determining the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount by ELISA and determining the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount, for example, the following [Method 1] And [Method 2].
  • [Method 1] An affinity substance is immobilized on a solid phase. A sample containing PSA is contacted and reacted with the solid phase. After washing the solid phase, a labeled anti-PSA antibody labeled with a labeling substance capable of detecting an anti-PSA antibody (which may be an anti-free PSA antibody) is brought into contact with and reacted with the solid phase.
  • the amount of the labeled substance is measured by a measuring method corresponding to the labeled substance of the labeled anti-PSA antibody. Based on the obtained measurement results, a quantitative value was converted by a conventional method using the results obtained by measuring in advance using ⁇ (2,3) sugar chain free PSA standard with a known concentration, and ⁇ (2, 3) Obtain the amount of free sugar chain PSA. Separately, the amount of free PSA is determined by measuring the amount of free PSA in the sample. The ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the obtained free PSA amount is determined.
  • examples of the method for obtaining the capture efficiency of the amount of ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA include the following methods, but are not limited thereto.
  • a sample containing an ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard with a known concentration is brought into contact with and reacted with the solid phase to which the affinity substance is immobilized.
  • the unreacted fraction including the washed fraction
  • the ⁇ (2, (3) sugar chain free PSA concentration remaining in the fraction is measured by a known PSA measurement method.
  • the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in this method can be determined from the following equation. [Concentration of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard used for measurement-concentration of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in unreacted fraction (including washing fraction)] / Measurement Concentration of supplied ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard [Method 2] An antibody that specifically binds to free PSA is immobilized on a solid phase. A sample containing PSA is contacted and reacted with the solid phase. After washing the solid phase, a labeled affinity substance labeled with a labeling substance capable of detecting the affinity substance is brought into contact with and reacted with the solid phase.
  • the labeled substance is measured by a method corresponding to the labeled substance of the labeled affinity substance. Based on the obtained measurement results, a quantitative value was converted by a conventional method using the results obtained by measuring in advance using ⁇ (2,3) sugar chain free PSA standard with a known concentration, and ⁇ (2, 3) Obtain the amount of free sugar chain PSA. Separately, the amount of free PSA is determined by measuring the amount of free PSA in the sample. The ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the obtained free PSA amount is determined.
  • the structure of a sugar chain of a component in a sample can be analyzed using a mass spectrometer.
  • the structure of the sugar chain of PSA in a sample is analyzed using a mass spectrometer, the amount of free PSA in the sample, the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA, and ⁇ ( 2, 3) The amount of free PSA other than sugar chain free PSA can be measured. Then, the ratio of the ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to the obtained free PSA amount is determined.
  • the amount of free PSA may be determined using a mass spectrometer.
  • the total amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA obtained using a mass spectrometer and the amount of free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA can be used as the free PSA amount. Good.
  • the ratio is higher than 40%, preferably higher than 43.2%, it is determined that the subject is Pca (Pca positive) or has a high probability.
  • the ratio is higher than 47%, preferably higher than 50%, it is determined that the subject is Pca and its malignancy is high.
  • “high malignancy of Pca” corresponds to a case classified as a so-called Gleason score of 4 + 3 or more.
  • the determination method of the present invention is applied to a patient who is difficult to determine whether it is Pca from the serum PSA value in a conventional clinical test, for example, a patient whose total PSA value is more than zero to 50 ⁇ ng / mL. , More detailed Pca can be determined.
  • the “value exceeding 0” indicates the total PSA value when the total PSA is measured. Therefore, if the total PSA value cannot be measured, it does not fall under “value exceeding zero”.
  • one or more standard solutions prepared in advance using ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA standard and having a known ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to free PSA content Using this, the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is measured.
  • a reference solution having a ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount of, for example, 25%, 40%, and 50% is used as the reference solution.
  • the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is measured in the same manner as described above.
  • the measurement result obtained using the reference sample is compared with the measurement result obtained using the test sample.
  • the measurement result obtained using the test sample is the measurement result obtained using the 25% reference solution. If the value is lower than the measurement result obtained using a 40% reference solution, it is determined as Pca negative.
  • the measurement result obtained using the test sample is higher than the measurement result obtained using the 40% reference solution, it is determined to be Pca or to have a high probability.
  • the measurement result obtained using the test sample is higher than the measurement result obtained using the 40% reference solution but lower than the measurement result obtained using the 50% reference solution. For example, it is Pca or its probability is high, but it is determined that its malignancy is low. If the measurement result obtained using the test sample is higher than the measurement result obtained using the 50% reference solution, it is determined to be Pca and its malignancy is high.
  • the biological sample according to the present invention includes, for example, blood, plasma, serum, semen, bladder wash, urine, tissue extract, prostate tissue section, prostate tissue biopsy sample, etc. And the like. Among them, serum, plasma and the like are preferable.
  • the Pca determination kit according to the present invention includes an affinity substance as a constituent element.
  • affinity substance and its constituent elements are as described in the description of the method for determining prostate cancer of the present invention. Moreover, a preferable embodiment such as the concentration of these reagents may be appropriately selected from a concentration range usually used in this field.
  • the kit may further contain an anti-PSA antibody according to the present invention as a constituent requirement.
  • the reagents included in these kits include reagents usually used in this field, such as buffers, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, and the like.
  • reagents usually used in this field such as buffers, reaction accelerators, sugars, proteins, salts, stabilizers such as surfactants, preservatives, and the like.
  • a reagent that does not inhibit the stability of the coexisting reagent or the like and does not inhibit the reaction between the ⁇ (2,) 3) sugar chain free PSA and the affinity substance may be contained.
  • the concentration may be appropriately selected from the concentration range usually used in this field.
  • kit of the present invention may contain instructions for use in the Pca determination method of the present invention.
  • the “instructions” are the instruction manuals, package inserts, pamphlets (leaflets), etc. of the kits in which the features, principles, operation procedures, judgment procedures, etc. of the method are substantially described in text or diagrams. Means.
  • Example 1 Measurement of PSA separation and determination of ratio (1) Preparation of sample and test solution 1) Preparation of DNA-labeled anti-PSA antibody A PSA antibody Fab ′ fragment to which DNA was bound was prepared according to the procedure shown in FIG.
  • a 250 bp DNA fragment having an NH 2 group introduced at the 5 ′ end was purified by a conventional method (purified end aminated DNA), and then the NH 2 group introduced into this DNA fragment and sulfosuccinimidyl.
  • 4- (p-maleimidophenyl) butyrate (Sulfo-SMPB) linker (linker having succinimide group and maleimide group, manufactured by Pierce) reacted with succinimide group by a conventional method, followed by gel filtration treatment, unreacted The linker was removed to obtain a 250 bp DNA fragment to which the linker was bound.
  • Anti-PSA prepared according to a conventional method using the obtained linker-binding 250 bp DNA fragment and the anti-human PSA mouse monoclonal antibody PSA10 (Anti PSA monoclonal antibody clone No. PSA10, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (own product)).
  • the antibody PSA10 Fab ′ fragment was reacted.
  • the obtained reaction product was purified using a DEAE column to prepare an anti-PSA antibody PSA10 Fab ′ fragment to which a 250 bp DNA fragment was bound (hereinafter abbreviated as “DNA-labeled anti-PSA antibody”).
  • the anti-human PSA mouse monoclonal antibody (Anti-PSA monoclonal antibody-clone No. PSA10) used is an antibody having affinity for human PSA and binds to both bound PSA and free PSA. That is, the antibody binds to both ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and free PSA other than ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA.
  • Anti PSA monoclonal antibody PSA12 that recognizes an epitope of PSA different from PSA10 and specifically binds only to free PSA was processed by a conventional method to obtain an anti-PSA antibody PSA12 Fab ′ fragment.
  • HiLyte647 manufactured by AnaSpec
  • HiLyte647-labeled anti-free PSA antibody PSA12 Fab ′ fragment (hereinafter abbreviated as “fluorescent-labeled anti-free PSA antibody”).
  • microchip capillary electrophoresis Electrophoresis (microchip capillary electrophoresis) Using a fully automatic fluorescence immunoassay device Mutus Wako i30 (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), microchip capillary electrophoresis was performed according to the procedure shown below according to the instruction manual of the device.
  • r free PSA Preparation of sample A for electrophoresis Recombinant free PSA (hereinafter referred to as “r free PSA”) according to the method disclosed in 2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2, 3PSA) of Non-Patent Document 6. ”[Recombinant ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA (hereinafter abbreviated as“ r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA ”)] and Recombinant ⁇ (2, 6) Sugar chain free PSA (hereinafter abbreviated as “r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA”).
  • the final concentration of the fluorescence-labeled anti-free PSA antibody in this reaction solution is 100 nM.
  • reaction solution containing the [fluorescently labeled anti-free PSA antibody-r free PSA] complex obtained by the above reaction ie, [fluorescently labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA
  • the complex and [fluorescent-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA] complex) (10 ⁇ L) were used as electrophoresis sample A.
  • Running buffer 2 (containing MAA) A 75 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 4.5% (w / v) polyethylene glycol (PEG8000), 3% (w / v) glycerol, 10 mM NaCl, 0.01% BSA was prepared. To this, MAA (manufactured by VECTOR) was added and mixed to a final concentration of 4 mg / mL to prepare electrophoresis buffer 2.
  • MAA manufactured by VECTOR
  • Running buffer 3 A buffer containing 2% (w / v) polyethylene glycol (PEG 20000), 3% (w / v) glycerol, 0.01% BSA, 125 mM HEPES, 75 mM Tris-HCl (no pH adjustment) was used as running buffer 3 .
  • Running buffer 4 The running buffer 4 was 75 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 2% (w / v) polyethylene glycol (PEG 20000), 3% (w / v) glycerol, and 0.01% BSA.
  • DNA labeled antibody solution (containing DNA labeled anti-PSA antibody) Buffer containing 100 nM of the DNA-labeled anti-PSA antibody obtained in (1) 1) above [2% (w / v) polyethylene glycol (PEG20000), 0.5 mM EDTA (2Na), 3% (w / v) glycerol, Contains 50 mM NaCl, 0.01% BSA, 75 mM BisTris (pH 6.0). Was prepared as a DNA-labeled antibody solution. Fluorescent liquid 30nM HiLyte647,20% of (w / v) 50mM containing glycerol BisTris (pH 6.0), was used as the fluorescent solution. The fluorescent solution is used for adjustment such as position confirmation at the detection unit of the measuring device (Mutasu Wako i30).
  • Electrophoresis procedure i) Introduction of electrophoresis sample A and electrophoresis sample solution 5.4 ⁇ L of electrophoresis sample A prepared in (2) 1) above is dispensed into a predetermined well (SP well) of a Mutus Wako i30 dedicated microchip. Noted. Subsequently, each test solution prepared in the above (2) 2) was dispensed into each well of the microchip as described below.
  • R2 well R2 (FLB) well, R2 (LB) well
  • R2 (FLB) well 10.0 ⁇ L of running buffer 2
  • R3 well 10.0 ⁇ L of running buffer 3 -R4 well: 5.4 ⁇ L of running buffer 4
  • ⁇ C1 well 3.0 ⁇ L of DNA labeled antibody solution
  • ⁇ FD well 7.0 ⁇ L of fluorescent solution.
  • FIG. 1 A schematic diagram of the microchip used is shown in FIG. 1
  • the waste well is used as a waste liquid reservoir (drain well) when the sample solution for each well (R2, R3, R4, C1) and the sample A for electrophoresis are introduced into the analysis channel.
  • FIG. 4 schematically shows the flow path in the chip of the used microchip.
  • W indicates a waste well.
  • the R3 well side is the cathode and the R2 (LB) well side is the anode.
  • the arrangement portion of the sample A for electrophoresis and the reagent solution in each well is shown by color-coded into a dot portion and a white portion (portion without a dot).
  • PSA was separated and detected by the following method.
  • a voltage of 4000 V is applied between the R3 well and R2 (LB) well in FIG. 4 and the DNA labeled anti-PSA antibody in the test solution is added to the sample solution for electrophoresis at 30 ° C.
  • ITP isotachophoresis
  • the immune reaction time for each labeled antibody for capturing free PSA was about 200 seconds.
  • the complex formed here is specifically a complex (complex 1) of [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA-DNA-labeled anti-PSA antibody].
  • This is a complex (complex 2) of [fluorescently labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA-DNA labeled anti-PSA antibody].
  • Detection is performed by measuring the fluorescence intensity of the capillary part 2 cm downstream from the channel cross part of R2 (FLB) and R2 (LB) with a photodiode (Fuji Film Co., Ltd.) over time by 635 nm laser excitation. It was.
  • the same method as above was carried out using the same electrophoresis sample A, electrophoresis reagent and measuring device as described above, and PSA was separated and detected. .
  • an electrophoretic image obtained by carrying out the same detection using the electrophoresis buffer 2 not containing MAA is also shown in FIG. 5 by a gray line (light line).
  • the peak that appears in this detection is shown in FIG. 5 as “Lectin ( ⁇ )”.
  • the complex (complex 1) of [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA-DNA-labeled anti-PSA antibody] reacted with MAA does not react with MAA
  • the complex of free PSA antibody-r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA -DNA labeled anti-PSA antibody] (complex 2), the appearance of peaks is delayed. That is, the peak of the complex 2 is a peak that appears at the same position as the peak of “Lectin ( ⁇ )”, and the peak of the complex 1 is a peak that appears immediately after the peak of the complex 2.
  • the peak area of the fraction of complex 1 obtained and the peak area of the fraction of complex 2 were determined with the analysis software attached to the measuring device.
  • free electrophoresis PSA other than complex 1 ( ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount) and complex 2 ( ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA) by capillary electrophoresis this implementation
  • ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA can be separated and measured, and the peak area obtained based on the measurement is used to determine ⁇ (2, 3) sugar chain release relative to the amount of free PSA. It was found that the ratio of the type PSA amount can be obtained.
  • Example 2 Confirmation of capture efficiency (1) Preparation of sample A for electrophoresis containing r ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA or r ⁇ (2, 6) sugar chain-free PSA 2. Materials and methods (2.7 Forced r-free PSA (including r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA) according to the method disclosed in expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA) Acquired. From the obtained r-free PSA, r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA were separated and purified.
  • Separation and purification is carried out by first using r ⁇ (2, 3) sugar by lectin column chromatography using an ACG lectin column (J-Oil Mills Co., Ltd.), which has high affinity for the sialyl ⁇ 2,3-galactose structure. Chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA were separated. Subsequently, gel filtration was performed to purify r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA, respectively.
  • the obtained r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA were each diluted with PBS (-) (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • a sample solution was obtained by adjusting the concentration to 1 ng / mL PSA protein.
  • 10 ⁇ L of each reaction solution was prepared by adding 7 ⁇ L of pH 7.5 to a 0.5 mL tube and mixing.
  • the final concentration of the fluorescently labeled anti-free PSA antibody in the nuclear reaction solution is 100 nM.
  • the reaction solution (10 ⁇ L) containing the [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA] complex obtained in the above reaction was released into r ⁇ (2, 3) sugar chain released.
  • Sample A for electrophoresis containing type PSA was obtained.
  • the reaction solution (10 ⁇ L) containing the [fluorescent-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA] complex obtained by the above reaction was used as the r ⁇ (2, 6) sugar.
  • Sample A for electrophoresis containing free-chain PSA was used.
  • Electrophoresis (microchip capillary electrophoresis) Other than using electrophoresis sample A containing r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA prepared in (1) above or electrophoresis sample A containing r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA Is the same as that used in Example 1, using the same electrophoresis reagent, measuring device, etc. as in Example 1, and using the same reagents and measuring device as in Example 1, in the same manner as in Example 1, Electrophoresis was performed.
  • FIG. 6 shows the obtained electrophoresis image (electropherogram).
  • the vertical axis represents fluorescence intensity
  • the horizontal axis represents mobility (sec).
  • an electrophorogram obtained by performing the same measurement using the electrophoresis sample A containing r ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA and the electrophoresis buffer 2 not containing MAA. Is also shown in FIG. 6 (1) by a black line (a dark line).
  • an electrophorogram obtained by performing the same measurement using the electrophoresis sample A containing r ⁇ (2, 6) sugar chain-free PSA and the electrophoresis buffer 2 not containing MAA. Is also shown in FIG. 6 (2) by a black line (a dark line).
  • the sugar chain structure of MAA and ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA with affinity for MAA, that is, the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2 , 3) Since interaction occurs with the bound sugar chain, the migration peak of ⁇ (2, 3) glycan free PSA obtained by measurement using electrophoresis buffer 2 containing MAA is MAA Should appear after the migration peak of ⁇ (2, 3) sugar chain-free PSA obtained by measurement using the electrophoresis buffer 2 containing no. As is clear from FIG. 6 (1), the migration peak of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA obtained by measurement using the electrophoresis buffer 2 containing MAA is the electrophoresis buffer 2 containing no MAA. It was confirmed that there was a delay from the appearance position of the migration peak of ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA obtained by measurement using.
  • the area of the obtained peak was obtained with analysis software attached to the apparatus.
  • the peak area of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA obtained by the measurement using running buffer 2 containing MAA was obtained by the measurement using running buffer 2 containing no MAA.
  • the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA peak area was almost 100%.
  • ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA does not have a sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain.
  • the migration peak of ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA obtained by measurement using migration buffer 2 containing MAA was obtained by measurement using migration buffer 2 containing no MAA. It should appear at the same position as the migration peak of ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA.
  • the area of the obtained peak was obtained with analysis software attached to the apparatus.
  • the peak area of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA obtained by the measurement using running buffer 2 containing MAA was obtained by the measurement using running buffer 2 containing no MAA. It was almost 100% of the peak area of ⁇ (6, 3) sugar chain free PSA.
  • this measurement system is based on the interaction between “MAA and the sugar chain in which the terminal sialic acid residue of the sugar chain is ⁇ (2, 3) linked to the second galactose residue from the end of the sugar chain”. It was confirmed that the capture efficiency of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and ⁇ (6, 3) sugar chain free PSA was almost 100%. In other words, it has been clarified that in this measurement system, the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA and the amount of ⁇ (6, 3) sugar chain free PSA can be measured without loss.
  • Example 3 Preparation of Sample A for Electrophoresis
  • the r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA prepared in Example 2 were added to PBS (-) Diluted with Yakuhin Kogyo Co., Ltd.) and adjusted to a concentration of 1.5 ng / mL PSA protein.
  • dilute the r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA solution with the obtained r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA solution to obtain r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA.
  • Sample solutions containing 10%, 20%, 30%, 40%, or 50% were obtained.
  • the content of the r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA is defined as “theoretical value”.
  • Reaction solution containing [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-free PSA] complex obtained by the above reaction ie, [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA]
  • the complex and [fluorescent-labeled anti-free PSA antibody-r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA] complex (10 ⁇ L) were used as sample A for electrophoresis.
  • the final concentration of the fluorescence-labeled anti-free PSA antibody in this reaction solution is 100 nM.
  • microchip capillary electrophoresis A microchip capillary electrophoresis was carried out in the same manner as in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared in (1) above was used, using the same electrophoresis reagent and measuring apparatus as those used in Example 1. Went.
  • FIG. 7 (1) shows the ratio (%) of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA calculated based on the actual measurement value of each sample solution, and ⁇ ( 2, 3) The relationship with the content (theoretical value) of sugar chain free PSA.
  • ⁇ indicates the protein concentration of free PSA in each sample solution (fPSA). The protein concentration in each sample used is all 1.5 ng / mL.
  • ⁇ indicates the ratio (%) of the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA of each sample solution, calculated based on the actual measurement value.
  • FIG. 7 (2) shows the measured peak area ( ⁇ , peak area) of the fraction of complex 1 obtained in (3) above and the measured peak area of the fraction of complex 2 for each sample solution. The relationship between the value ( ⁇ , Peak area) and the theoretical value of the sample solution is shown.
  • the peak area of the complex 1 fraction reflects the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA concentration
  • the peak area of the complex 2 fraction reflects the ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA concentration.
  • the ratio (%) of the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA obtained by the measurement method of this example is expressed as ⁇ (2,2) relative to the actual amount of free PSA. 3) It was confirmed that it almost coincided with the ratio (%) of the amount of sugar chain free PSA.
  • Example 4 Comparison of ratios obtained using samples from Pca patients and BPH patients (1) Preparation of sample A for migration 22 prostate cancer (Pca) patients with total PSA value of 10.0 ng / mL or less and non-cancer Serum collected from 24 patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) was used as a sample. Histopathological diagnosis of each patient was confirmed by performing prostate biopsy. Table 1 shows the patient background (age, PSA value (total PSA value), histopathological grade and clinical stage).
  • reaction solution (10 ⁇ L) containing the [fluorescence-labeled anti-free PSA antibody-free PSA] complex obtained by the above reaction was used as sample A for electrophoresis.
  • Example 2 Separation measurement of PSA and determination of ratio Example 1 was carried out using the same electrophoresis sample solution and measuring apparatus as those used in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared in (1) above was used. Microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as described above. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined.
  • the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount was compared between Pca patients and BPH patients.
  • the value was “P ⁇ 0.0001”. Therefore, it was found that the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of the Pca patient-derived sample was significantly higher than that of the BPH patient-derived sample.
  • the free PSA value in each sample was determined using a Human Circulating Cancer BioMarker Panel 1 selection kit (manufactured by LUMINEX) according to the protocol attached to the kit.
  • FIG. 9 (1) shows the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount ( ⁇ (2,3) PSA ratio) obtained in Example 4 in Pca patients. And the results of comparison between BPH patients (same as FIG. 2).
  • Fig. 9 The upper diagram shows the result of comparing the total PSA value (total PSA) between Pca patients and BPH patients (Comparative Example 1).
  • Fig. 9 The upper diagram shows the results of comparing the ratio of free PSA value to total PSA value (% fPSA) between Pca patients and BPH patients (Comparative Example 2).
  • FIG. 9 (1) the P value comparing the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to free PSA is between Pca and BPH patients is “ ⁇ 0.0001”.
  • FIG. 9 (1) upper diagram the P value comparing the total PSA value between the Pca patient and the BPH patient.
  • the P value 0.0289 (the upper diagram in FIG. 9 (2)).
  • the P value was 0.1458 (FIG. 9 (3) upper diagram).
  • the method for determining Pca using the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount of the present invention is the conventional total PSA value or free PSA relative to the total PSA value. It was found that the Pca can be determined with higher accuracy than the method using the ratio of the values.
  • the determination method of the present invention is superior in sensitivity and specificity of the measurement system as compared with the conventional determination method.
  • the determination method of the present invention is a conventional determination method. It was found that it was possible to determine Pca of patients with total PSA values in the gray zone with higher accuracy.
  • Embodiment 5 FIG. Cut-off value test (1) Preparation of sample A for electrophoresis Derived from the serum sample used in Example 4 and 43 patients (Pca positive; 26 cases, negative; 17 cases) showing a total PSA value of 10-50 ng / mL Sample A for electrophoresis was prepared in the same manner as in Example 4 (1) using a total of 89 serum samples from the above-mentioned serum samples.
  • Example 2 Separation measurement of PSA and determination of ratio Example 1 was carried out using the same electrophoresis sample solution and measuring apparatus as those used in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared in (1) above was used. Microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as described above. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined.
  • the cut-off value when judging the Pca determination based on the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount is “43.1%”. (Fig. 10).
  • MFI Mean Fluorescence Intensity
  • microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared above was used, using the same electrophoresis reagent, measurement device, and the like as used in Example 1. went. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined. The results are shown in Table 2.
  • MFI indicates the result of measuring the fluorescence intensity (MFI) of each sample by the method of (3) above.
  • the cut-off value when determining Pca using the amount of ⁇ (2, ⁇ 3) sugar chain free PSA defined in Patent Document 3 as an index is 1130 as fluorescence intensity (MFI).
  • MFI fluorescence intensity
  • the determination method using the cutoff value with the ratio of the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA to the amount of free PSA according to the present invention as an index is more known ⁇ (2, 3) It was found that this is a method that can determine Pca with higher accuracy than the determination method using the cut-off value with the amount of sugar chain free PSA as an index.
  • Example 7 Sample Serum collected from 28 prostate cancer (Pca) patients and 28 non-cancer prostatic hypertrophy (BPH) patients whose total PSA value was 20.0 ng / mL or less was used as a sample.
  • sample used here is a sample that has been determined to be difficult to determine cancer as a result of determination using the total PSA test, which is a conventional determination marker, and the ratio of free PSA to the total PSA value as an index.
  • sample A for electrophoresis was prepared in the same manner as in Example 4 (1) did.
  • microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared above was used, using the same electrophoresis reagent, measurement device, and the like as used in Example 1. went. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined.
  • Fig. 11 (1) shows the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount of each sample ( ⁇ (2, 3) PSA ratio ⁇ (%)).
  • Comparative Examples 3 and 4 (1) Measurement of total PSA value (Comparative Example 3) Using the same sample as that used in Example 7, Lumipulse Presto PSA (Fujirebio Co., Ltd.), an in vitro diagnostic drug, was used to determine the total PSA value in each sample according to the protocol attached to the kit. Moreover, the significant value test (Manwhitney U-TEST) was performed about the obtained value between the Pca patient and the BPH patient.
  • the sensitivity when the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount 40% was the cut-off value in prostate cancer judgment was 85.7%, and the specificity was 46.4% .
  • the prostate cancer determination method of the present invention is a normal method In the method, it was confirmed that even a case that is difficult to determine is an excellent determination method with higher sensitivity and specificity of prostate cancer determination than the conventional determination method.
  • the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount 40% as a cut-off value, and the determination method of the present invention for determining Pca based on this value It has been found that Pca can be determined with higher accuracy than known methods that perform determination based on the total PSA value and the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA.
  • Example 8 Preparation of Sample A for Migration Serum collected from 103 prostate cancer (Pca) patients and 50 non-cancerous persons (those determined not to be prostate cancer, including BPH patients) were used as samples. Histopathological diagnosis of each patient was confirmed by performing prostate biopsy. Table 3 shows the patient background (age, total PSA value).
  • Example 2 Separation measurement of PSA and determination of ratio Example 1 was carried out using the same electrophoresis sample solution and measuring apparatus as those used in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared in (1) above was used. Microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as described above. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined.
  • the ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount was compared between Pca patients and non-cancer patients.
  • the value was “P ⁇ 0.0001”. Therefore, it was found that the ratio of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of the Pca patient-derived sample was significantly higher than that of the non-cancerous sample.
  • the determination method of the present invention is superior to the conventional determination method in terms of sensitivity and specificity of the measurement system, and the determination method of the present invention is more accurate than the conventional determination method based on the total PSA amount. It can be seen that this is a high determination method.
  • the prostate cancer determination method of the present invention is a conventional method It was confirmed that this is an excellent determination method with higher sensitivity and specificity for determining prostate cancer than the determination method.
  • Example 9 and Comparative Example 5 Determination of malignancy of prostate cancer (1) Sample 36 prostate cancer (Pca) patients whose malignancy was determined by post-operative Gleason score (GS) determination, and non-cancer patients (those who were determined not to be prostate cancer). Serum collected from 40 people was used as a sample. Histopathological diagnosis of each patient was confirmed by performing prostate biopsy. Table 4 shows the patient background (age, total PSA value, Gleason score, etc.).
  • microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared above was used, using the same electrophoresis reagent, measurement device, and the like as used in Example 1. went. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined.
  • FIG. 16 (1) is a graph showing the ratio of the ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of samples derived from non-cancer patients and Pca patients. For Pca patients, the ratio for each postoperative Gleason score (postoperative GS) is shown.
  • FIG. 16 (2) is a diagram showing the total PSA amount of samples derived from non-cancer patients and Pca patients. For Pca patients, the ratio for each postoperative GS was shown.
  • the “ratio of ⁇ (2,) 3) glycan free PSA amount to free PSA amount” “47.2%” is the cut-off value for determining malignancy, and this cut-off value “47.2%” Using it to determine the malignancy of Pca, it was found that cases with low malignancy could be selected, and that it was highly possible to avoid excessive medical care.
  • Example 10 and Comparative Example 6 About the influence of the sugar chain diversity of a foreign sample The structure of 19 kinds of sugar chains of PSA has been identified, and it has been revealed that the sugar chain is extremely rich (Non-Patent Document 4). In addition, it is reported that sugar chains of glycoproteins have diversity depending on race ("Difference in placental alkaline phosphatase molecule based on genetic phenotype", Matsuo Sato, Tokyo Women's Medical University Journal, 60 (8), p.609-619, 1990).
  • the PSA values (total PSA values) of the samples are shown in Table 5 below.
  • Example 10 PSA separation measurement and ratio determination (Example 10) Sample A for electrophoresis was prepared in the same manner as in Example 4 (1) using the sample of (1) above.
  • microchip capillary electrophoresis was performed in the same manner as in Example 1 except that the electrophoresis sample A prepared above was used, using the same electrophoresis reagent, measurement device, and the like as used in Example 1. went. Then, in the same manner as in Example 1, the ratio of the ⁇ (2, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 3) sugar chain free PSA amount to the free PSA amount of each sample was determined.
  • FIG. 18 (1) shows the ratio of ⁇ (2,3) sugar chain free PSA amount to free PSA amount ( ⁇ (2,3) PSA ratio), Pca patients (Pca) and non-cancerous.
  • the result (Example 10) compared with a person (non-Pca) is shown.
  • Fig. 18 (2) shows the result of comparing the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA (fluorescence intensity (MFI)) between Pca patients (Pca) and non-cancer patients (non-Pca) (comparative example). 6).
  • MFI fluorescence intensity
  • the determination method of the present invention for determining Pca based on this value It was found that Pca can be determined with higher accuracy than the known method of determining based on the amount of ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA. Further, it was found that even when using a foreign sample that is expected to cause a concern such as sugar chain diversity, the determination method of the present invention can be used to determine Pca with high accuracy.
  • Example 11 Determination by surface plasmon resonance method
  • SPR surface plasmon resonance
  • BIACORE TM GE Bio
  • the measurement was performed by the following method.
  • Chip Sensor Chip CM5 (GE Healthcare UK Ltd.)
  • Running buffer HBS-EP buffer (10 mM HEPES, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P 20, pH7.4, manufactured by GE Healthcare UK Ltd.)
  • sugar chain free PSA and r ⁇ (2, 6) sugar chain free PSA have a peptide sequence of FLAG tag.
  • HBS-EP buffer containing 15 mg / mL of MAA is slowly fed under conditions of a temperature of 20 ° C., a flow rate of 30 ⁇ L / min, a binding time of 2 minutes, and ⁇ (2, 3)
  • the interaction between the target sugar chain and MAA was assayed.
  • the signal (resonance angle shift) was measured over time.
  • the obtained measurement results were analyzed using BIAevaluation (Version 4.1) IV which is Biacore dedicated analysis software to obtain a sensorgram.
  • the horizontal axis represents time (s (seconds)), and the vertical axis represents signal intensity (RU, Resonance Unit).
  • (1) shows the results obtained using a sample containing 55% ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA
  • (2) shows the ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA
  • (3) shows the results obtained using a sample containing 25% ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA.
  • FIG. 19 shows that the determination method of the present invention is applied to a sensorgram obtained using a sample containing ⁇ (2, 3) sugar chain free PSA in a normal range (25%) corresponding to non-cancer in the present invention.
  • the determination method using the cut-off value of the present invention (cut-off value of 40% for Pca determination, cut-off value for 47% determination of malignancy of Pca) can be performed also by the surface plasmon resonance method. It was revealed.
  • the method for determining Pca of the present invention can non-invasively and easily determine (diagnose, test) Pca and its malignancy with high accuracy. In particular, it is possible to determine with high diagnostic accuracy whether a patient has a total PSA value in the gray zone, which has been difficult to determine in the past, whether it is Pca or has a high probability.
  • the determination result obtained by the determination method of the present invention is an important guideline for setting the subsequent Pca treatment policy. It becomes.

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Abstract

本発明は、Pcaの新たな判定方法及びその悪性度の判定方法を提供することを目的とし、「生体由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量に対する 糖鎖の末端シアル酸慚愧が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSA量の比率を測定し、その比率が40％より高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。」に関する発明である。

Description

前立腺癌の判定方法
　本発明は、前立腺癌及びその悪性度の新規な判定方法に関する。
　前立腺癌(prostate carcinoma：以下「Pca」と略記する。)は、欧米諸国の男性において最も罹患率が高い癌であったが、近年我が国においても急増傾向が続き、2015年には日本人男性でも最も罹患率の高い悪性腫瘍になったと推測されている。
　前立腺特異抗原(prostate specific antigen：以下「PSA」と略記する。)は、前立腺で産生される、前立腺に特異的な糖タンパクの一種である。Pcaに罹患すると血液中のPSA値が高くなることから、PSA値は、Pcaを判定するための最も重要な腫瘍マーカーとして認識されている(非特許文献１)。
　PSAは、血液中では大部分がα１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合して複合体を形成した結合型PSAとして存在する（以下、「結合型PSA」と略記する。）。また、一部のPSAは複合体を形成していない遊離型として存在する(以下、「遊離型PSA」と略記する。)。
　現在広く行われている血清PSA検査では、この遊離型PSAと結合型PSAを区別せずに、PSAの総量（すなわち、遊離型PSAと結合型PSAの合計の量、以下、「トータルPSA値」と略記する。)を測定する。トータルPSA値の基準値(正常値)は4 ng/mL未満である。前立腺に何らかの疾患があるとトータルPSA値は上昇する。トータルPSA値が10～20 ng/mLの場合は40%程度、20 ng/mL以上の場合には50%以上の患者にPcaが発見されるといわれている。
　トータルPSA値が正常値よりも高いが、上記の高値よりも低い中間の4.1～10 ng/mLの範囲は、所謂グレーゾーン(gray zone)と呼ばれている (非特許文献２)。このグレーゾーンのトータルPSA値を示す患者に癌が発見される確立は約25～30%であると言われている。例えば、前立腺肥大症(benign prostatic hyperplasia：以下「BPH」と略記する。)や前立腺炎等の、他の前立腺の病気がある場合にも、しばしばトータルPSA値が高値になることが知られている。すなわち、トータルPSA値が正常値よりも高値だったとしても必ずしもPcaに罹患しているとは限らない。そのため、血清PSA検査でトータルPSA値がグレーゾーンであった場合には、確定診断を得るために通常針生検を行うが、その針生検をおこなうことにより感染症リスクが増加することが問題となっている。
　この問題を解決するために、トータルPSA値の他に、例えばPSA密度、PSA勾配、遊離型PSA／トータルPSAの比、等を指標にしてPcaを判定する試みが行われてきた。しかし、これらの指標を用いたコンビネーション・アッセイにより、Pcaの診断精度が向上する可能性が報告されてきているが、臨床現場において一般的に普及される状況には至っていない。
　ところで、現在腫瘍マーカーとして使用されている分子の多くは、糖タンパク質である。この腫瘍マーカーの糖鎖構造は、正常組織由来のものと癌由来のものでは、その構造が大きく異なることが知られている。
　PSAも分子量34kDaの糖タンパク質であり、糖鎖は、その約8%を占める。
　PSAが有する糖鎖に関する研究で、PSAは二本鎖の糖鎖を持ち、その糖鎖は末端にシアル酸がα(2,6)結合でガラクトースに結合したN型糖鎖のみであるとの報告があった(非特許文献３)。
　しかし大山らは、末端シアル酸残基がα(2,3)結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するMAA（Maackia amurensis Lectin、イヌエンジュレクチン）を用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、PcaとBPHを識別する方法を完成した(特許文献１)。該方法は、「分画前の血清のフリーPSA（遊離型PSA）値およびトータルPSA値に対する、レクチン結合分画のフリーPSA値およびトータルPSA値のパーセント比を取るか、あるいは分画前の血清のフリーPSA値に対する、レクチン結合分画のフリーPSA値のパーセント比を取り、その値からPcaとBPHを識別する方法」である。
　その後、PSAの糖鎖が非常に多様性に富んでいること(非特許文献４)、及びPSAの糖鎖の末端シアル酸はα(2,6)結合のみでなくα(2,3)結合でガラクトースに結合しているものも約10%存在することが、大山らによって明らかになった。次いで、Pca患者の血清中には、そのN型糖鎖の末端シアル酸残基がα(2,6)結合でガラクトースに結合したPSAよりもα(2,3)結合でガラクトースに結合したPSAが増加することが明らかになった(非特許文献５)。
　また、セイヨウニワトコレクチン(SNA)を用いて患者の血清試料中のPSAが有する糖鎖のα(2,6)結合シアル化の程度、及びPSAが有する糖鎖のα(2,3)結合シアル化の程度を分析することにより、患者がPcaを有しているか否か（Pcaに罹患しているか否か）を確認する方法が開示された（特許文献２）。
　更に、大山らは、抗遊離型PSA抗体と末端シアル酸残基がα(2, 3)結合でガラクトースに結合した糖鎖を特異的に認識するモノクローナル抗体を用いて試料中の末端シアル酸残基がα(2, 3)結合でガラクトースに結合したＮ型糖鎖を有する遊離型PSA量を測定し、得られた測定量を予め設定されたPcaとBPHのカットオフ値と比較することにより、カットオフ値よりも多い場合はPcaであるかその蓋然性が高く、少ない場合にはBPHであるかその蓋然性が高いと判定する、PcaとBPHを識別する方法を報告している（特許文献３、非特許文献６）。
特許４５１４９１９号公報 特表２０１１－５２９１８４号公報 ＷＯ２０１４－０５７９８３号パンフレット
Stamey T.A. et al., N. Engl. J. Med., 1987, vol. 317, pp.909-916 Catalona W.J., et al., JAMA, 1998, vol. 279, pp.1542-1547 Belanger A, Van Halbeek H, Gravuxes HC, et al., Prostate, 1995, vol. 27, pp. 187-197 Ohyama C., et al., Glycobiology, 2004, vol. 14, pp. 671-679 Tajiri M., Ohyama C., Wada Y., Glycobiolgy, 2008, vol. 18, pp. 2-8 Yoneyama T. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2014 vol. 448, No. 4, pp. 390-396
　特許文献１には「癌患者におけるフリーPSA（遊離型PSA）およびトータルPSAに対するMAA結合分画の割合」は、それぞれ16.9±5.2(平均±標準偏差)％および7.5±4.2％であった。一方、BPHの場合、その割合は、それぞれ0.6±0.2％および0.3±0.1％であった。」と記載されている。
　しかしながら、特許文献１で検討された検体数はPca患者１７名、BPH患者１５名であり、極めて少ない。よって、特許文献１に記載の「癌患者におけるフリーPSA（遊離型PSA）およびトータルPSAに対するMAA結合分画の割合」、及び得られた具体的な数値を、Pca判定の指標として用いることはできなかった。
　また、特許文献１で使用したPca患者由来試料のトータルPSA値の中央値は138 ng/mLであり、グレーゾーンよりはるかに高い値であった。従って該文献に記載された識別方法で、トータルPSA値がグレーゾーンの患者のPcaの判定を行うことは極めて困難であった。
　また、カットオフ値を用いてPcaの判定を行う特許文献３の方法でも、本願明細書の実施例６、比較例４、及び比較例６で検証した結果、精度の高いPcaの判定を行うことは困難であることが判った。
　すなわち、上記したように、従来の各種指標を用いても、特に臨床検査で血清PSA値がグレーゾーンであった患者について、精度の高いPcaの判定を行うことは困難であった。
　更に、Pcaには良性Pcaと悪性Pcaがあり、良性Pcaの場合にはその進行が遅いことから、手術等の侵襲性の治療はせずに経過観察する選択肢もある。一方、悪性Pcaは急速に進行するので、早い段階でPcaを発見し、且つその悪性度を判別する必要がある。しかし、良性Pcaと悪性Pcaを判別できるマーカーや判別方法は、未だ知られていない。
　本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、Pcaの新たな判定方法及びその悪性度の判定方法を提供することを課題とする。
　本発明者等は、上記問題点を解決すべく鋭意研究の結果、生体由来試料中の遊離型PSA量に対する、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSAの量の比率が、Pcaか否かを判定する指標となることを見出した。そして更に鋭意研究の結果、該比率が40％より高い場合にPcaであるかその蓋然性が高いと判定することができること、更に該比率が47％より高い場合にPcaの悪性度が高いと判定することができることを見出し、本発明を完成した。
　すなわち、本発明は以下の構成よりなる。
「生体由来試料中の遊離型前立腺特異抗原量に対する糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSA量の比率を測定し、その比率が40％より高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。」
　本発明のPcaの判定方法は、非侵襲的且つ簡便にPca及びその悪性度を、高い精度で判定（診断、検査）することが出来る。特に、従来判定が困難であったトータルPSA値がグレーゾーンにある患者において、Pcaであるか又その蓋然性が高いか否かを判定することが出来る。
　また、本発明のPcaの判定方法は、Pcaの悪性度を判定することができるので、本発明の判定方法により得られた判定結果は、その後のPcaの治療方針を設定する上で重要な指針となる。
　更に本発明のPcaの判定方法は、糖鎖多様性などのPSAの測定やPcaの判定に影響を及ぼすことが懸念される外国人試料を用いた場合でも、Pcaを高い精度で判定できる。
糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖の一例の模式図である。 実施例１におけるDNA標識抗PSA抗体の調製方法を示した図である。 実施例１で使用したマイクロチップの模式図である。 実施例１で使用したマイクロチップのチップ内流路の模式図である。 実施例１で得られた、エレクトロフェログラムである。 実施例２で得られた、エレクトロフェログラムである。図６（１）は、リコンビナントα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａを用いて得られた結果を、図６（２）は、リコンビナントα(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａを用いて得られた結果をそれぞれ示す。 実施例３で得られた、マイクロチップキャピラリー電気泳動による測定の、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率を確認した結果である。図７(１)は、各サンプル溶液の実測値をもとに算出した遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率と理論値との関係を示す。図７(２)は、各サンプル溶液について得られた複合体１の分画のピーク面積の実測値（■）及び複合体２の分画のピーク面積の実測値（◆）と、そのサンプル溶液の理論値との関係を示す。 実施例４で得られた、遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者とBPH患者で比較した結果を示す。 実施例４、比較例１、及び比較例２で得られた結果を示す。図９(１)（上図）は、実施例４で得られた、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者とBPH患者間で比較した結果を示す。図９(２)（上図）は、比較例１で得られた、トータルPSA値（total PSA）をPca患者とBPH患者間で比較した結果を示す。図９(３)（上図）は、比較例２で得られた、トータルPSA値に対する遊離型PSA値の比率（%fPSA）をPca患者とBPH患者間で比較した結果を示す。また、図９の下図は、夫々の測定結果をもとに得られたROC解析の結果である。 実施例５で得られたROC曲線である。 実施例７及び比較例３，４で得られた結果を示す。図１１(１)は、実施例７で得られた、遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者とBPH患者で比較した結果を示す。図１１(２)は、実施例７及び比較例３，４で得られたROC解析の結果である。(a)は、実施例７で得られた遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率について解析した結果を示し、(b)は比較例３で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量について解析した結果を示し、(c)は比較例４で得られたトータルPSA値について解析した結果を示す。 比較例３及び４で得られた結果を示す。図１２(１)は、比較例３で得られた、トータルPSA値をPca患者とBPH患者で比較した結果を示し、図１２(２)は、比較例４で得られた、α(2,3)糖鎖遊離型PSA量(MFI)をPca患者とBPH患者で比較した結果を示す。 実施例８で得られた、遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者と非癌者で比較した結果を示す。 実施例８で得られたROC解析の結果である。図１４(１)は、遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率について、解析を行った結果である。図１４(２)は、トータルPSA値について解析を行った結果である。 実施例８でられたROC解析の結果をもとにカットオフ値の検定を行った結果である。 実施例９及び比較例５で得られた結果を示す。図１６(１)は、実施例９で得られた、グリーソンスコアと“遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率”との関係を示す。図１６(２)は、比較例５で得られた、グリーソンスコアとトータルPSA値との関係を示す。 実施例９で得られたROC曲線解析の結果をもとにカットオフ値の検定を行った結果である。 実施例１０及び比較例６で得られた結果を示す。図１８(１)は、実施例１０で得られた、遊離型PSA量に対するα(2,3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者とBPH患者で比較した結果を示す。図１８(２)は、比較例６で得られた、α(2,3)糖鎖遊離型PSA量(MFI)をPca患者と非癌者で比較した結果を示す。 実施例１１で行った表面プラズモン共鳴法で得られたセンサグラムである。
＜本発明に係るPSAについて＞
　本発明に係る「結合型PSA」とは、一般に「結合型PSA」と呼ばれるPSA、すなわち「α１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合して複合体を形成したPSA」をいう。
　本発明に係る「遊離型PSA」とは、一般に「遊離型PSA」と呼ばれるPSA、すなわち「α１-アンチキモトリプシンやα2-マクログロブリンなどの結合タンパク質と結合していないPSA」をいう。
　本発明に係る「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」とは、糖鎖の末端（非還元末端）がSiaα2→3 Galの構造である糖鎖を意味し、末端シアル酸残基としては、例えばN-アセチルノイラミン酸が挙げられる。
　本発明に係る「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」とは、具体的には以下の構造をいう。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000001
　本発明に係る「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」を有するPSAの糖鎖の構造の一例を下記式(I)に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000002
　更に、式(I)の糖鎖を有するPSAの一例を、図１に模式図で示す。図１において、糖鎖の末端シアル酸残基は糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合している。また図１では、糖鎖はPSAタンパク質のイソロイシン－アルギニン－アスパラギン－リジン（IRNK）のアミノ酸配列のアスパラギン残基(N)に結合している。
　本発明に係る糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有するPSAは、Pca患者の血清中に出現する（非特許文献５）。
　本発明に係る「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSA」とは、遊離型PSAであって、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有するPSAをいう。以下、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」（α(2, 3) free PSA）と略記する。
　また、本発明に係る「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖を有する遊離型PSA」とは、遊離型PSAであって、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖を有するPSAをいう。以下、「α(2, 6)糖鎖遊離型PSA」（α(2, 6) free PSA）と略記する。
＜本発明のPcaの判定方法＞
　本発明のPcaの判定方法は、「生体由来試料（以下、単に「試料」ともいう。）中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を測定し、その比率が40％より高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。」である。
　本発明に係る遊離型PSA量とは、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総量である。
　本発明に係る「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA」とは、本発明に係る糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有さない遊離型PSAを意味する。
　本発明のPcaの判定方法としては、「生体由来試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定し、その比率が40％又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。」が好ましい。
（１）遊離型PSA量を測定する方法
　本発明に係る試料中の遊離型PSA量を測定する方法としては、
１）試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法、又は
２）試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量をそれぞれ測定し、その総和を遊離型PSA量とする方法
が挙げられる。
１）試料中の遊離型PSA量を直接測定する方法
　遊離型PSA量を直接測定するには、公知の遊離型PSA量を測定する方法で測定すればよい。例えば、抗遊離型PSA抗体、又は抗PSA抗体と抗遊離型PSA抗体を用いた公知の免疫学的測定法等で測定すればよい。
　本発明に係る抗PSA抗体は、PSAに親和性を有する抗体、具体的にはPSAのコアタンパク質に親和性を有する（結合する）抗体である。すなわち、本発明に係る抗PSA抗体は、遊離型PSAと結合型PSAの両方に結合する抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する抗体(抗遊離型PSA抗体)を含む。特に定めない限り、本明細書において単に抗PSA抗体と言う場合は、遊離型PSAと結合型PSAの両方に結合する抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する抗体を含む。
　本発明に係る抗PSA抗体の種類は特に限定されず、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗体のFab、(ab')2、Fab'フラグメント、あるいは抗体可変領域であってもよい。
　本発明に係る抗PSA抗体は、市販の抗体を用いてもよい。
　本発明に係る抗PSA抗体のうち、遊離型PSAと結合型PSAの両方に親和性を有する抗体の市販品としては、例えばAnti PSAモノクローナル抗体 PSA10（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA10、和光純薬工業(株)自製品）、Anti PSAモノクローナル抗体 （5A6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（5G6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PS6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PSA14）（和光純薬工業(株)自製品）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（EP1588Y）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（A67-B/E3）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（35H9）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（KLK3/801）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（3E6）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（8301）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（A5D5）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（PSA 28/A4）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（1H12）（アブカム社）等が挙げられる。
　本発明に係る抗PSA抗体のうち、遊離型PSAに特異的に結合する抗体(抗遊離型PSA抗体)の市販品としては、例えばAnti PSAモノクローナル抗体 PSA12（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA12、和光純薬工業(株)自製品）、Anti PSAモノクローナル抗体（8A6）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（PS1）（HyTest社）、Anti PSAモノクローナル抗体（クローン108）（Anogen社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（PS2）（アブカム社）、Anti-Prostate Specific Antigen 抗体（2H9）（アブカム社）等が挙げられる。
　本発明に係る抗PSA抗体（抗遊離型PSA抗体を含む。）は、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。該抗体を標識するために用いられる標識物質は、後記する「本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体」を標識する標識物質と同じものが挙げられる。また、該抗体の標識方法も、後記する本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体を標識する方法と同じ方法が挙げられる。
　遊離型PSA量は、市販されている遊離型PSA測定用キット（例えばHuman Circulating Cancer BioMarker Panel 1 セレクトキット（LUMINEX社製）等）、フリーPSA・アボット（アボット社）、ルミパルス フリーＰＳＡ（富士レビオ(株)）、ビトロス フリーPSA（オーソ・クリニカル・ダイアグノスティックス(株)）、ST AIA-PACK free PSA（東ソー(株)）、エクルーシスTM試薬 free PSA（ロシュ・ダイアグノスティックス(株)）を用いて測定してもよい。
２）試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量をそれぞれ測定し、その総量を遊離型PSA量とする方法
　上記方法としては、後記する「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」に記載された方法が挙げられる。
（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法
　本発明の判定方法において、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法」とは、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量」を測定する方法、又は「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」を含む。
　また、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定するには、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率が80%以上である測定方法で測定することが好ましい。
　本発明において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは、
・試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖（α2,3型シアリル糖鎖）を有する遊離型PSAを捕捉し、検出（測定）するための効率、又は
・試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖（α2,3型シアリル糖鎖）を有する遊離型PSAを検出（測定）するための効率
をいう。
　言い換えれば、本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは、試料中に存在する遊離型PSAの全量に対する、最終的に検出できるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの割合である、とも言える。
　本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98％以上、特に好ましくは100%である。
　本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は後記する方法により確認することが出来る。但し、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量等を測定する度に捕捉効率を確認する必要はない。
　「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」としては、
例えば
１）糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質（以下、「アフィニティー物質と略記する。」）を用い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と該アフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法、又は
２）アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法
が挙げられる。
１）α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法
アフィニティー物質
　上記の方法に用いられるアフィニティー物質とは、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する（結合する）物質である。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する（特異的に結合する）物質が好ましい。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する（結合する）が、それ以外の糖鎖（例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖等）には親和性を有さない（結合しない）物質が特に好ましい。
　本発明に係るアフィニティー物質としては、例えばそのような性質を持つレクチン又は抗体が挙げられる。以下に、アフィニティー物質としてのレクチン及び抗体について、より詳細に説明する。
アフィニティー物質：レクチン
　本発明に係るアフィニティー物質として用いられるレクチンとしては、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する（結合する）レクチンが挙げられる。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する（特異的に結合する）レクチンが好ましい。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する（結合する）が、それ以外の糖鎖（例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖等）には親和性を有さない（結合しない）レクチンが特に好ましい。
　そのような性質を持つレクチンとしては、例えばイヌエンジュ(Maackia amurensis)由来レクチンであるMAA、ヤナギマツタケ(Agrocybe cylindracea)由来レクチンであるACG等の植物例レクチンや、CD169 （シアル酸結合Ig様レクチン１)、ラットMAG、CD328、siglec-9（シアル酸結合イムノグロブリン様 レクチン－９）等の動物性レクチンが挙げられる。中でも、MAAが好ましい。
　レクチンは、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。
　レクチンを標識するために用いられる標識物質としては、例えば蛍光色素（フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、Cy5、Alexa Fluor 647等）、酵素（西洋ワサビ由来ペルオキシダーゼ）、補酵素、化学発光物質、放射性物質（32P、14C、125I、3H、131I等）、ビオチン等の標識物質が挙げられる。また、標識物質は直接レクチンに結合させてもよいし、適当なスペーサーを介して結合させてもよい。レクチンは、標識物質の種類に応じた自体公知の標識方法で、標識すればよい。
アフィニティー物質：抗体
　本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体としては、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する（結合する）抗体が挙げられる。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に特異的な親和性を有する（特異的に結合する）抗体が好ましい。糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する（結合する）が、それ以外の糖鎖（例えば糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 6)結合した糖鎖等）には親和性を有さない（結合しない）抗体が特に好ましい。
　本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体の種類は特に限定されず、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体の何れであってもよく、これらを単独であるいはこれらを適宜組み合わせて用いる等は任意である。また、これら抗体のFab、(ab')2、Fab'フラグメント、あるいは抗体可変領域であってもよ。
　本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体は、市販の抗体を用いてもよい。
　本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体、すなわち糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する抗体の市販品としては、例えばAnti Siaα2-3, Monoclonal Antibody (HYB4)（和光純薬工業(株)製）、抗GM3(Neu Ac), モノクローナル抗体 (Clone : M2590)（和光純薬工業(株)製）、抗シアリルLea抗原, モノクローナル抗体(MSW113)（和光純薬工業(株)製）、Anti-GM3 Monoclonal Antibody（東京化成工業(株)）、Anti-シアリルルイスA Monoclonal Antibody(1H4)（東京化成工業(株)）、Anti-シアリルルイスA Monoclonal Antibody(NKH3)（GLYCONEX INC.）等が挙げられる。
　本発明に係るアフィニティー物質として用いられる抗体は、検出可能な標識物質で標識されていてもよい。該抗体を標識するために用いられる標識物質としては、例えばEIA(ELISA, Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)に於いて用いられるアルカリホスファターゼ，β-ガラクトシダーゼ，パーオキシダーゼ，マイクロペルオキシダーゼ，グルコースオキシダーゼ，グルコース-6-リン酸脱水素酵素，アセチルコリンエステラーゼ，リンゴ酸脱水素酵素，ルシフェラーゼ等の酵素類、例えばRIA（Radioimmunoassay）で用いられる99mTc，131I，125I，14C，3H等の放射性同位元素、例えばHiLyte 647（AhaSpec社製），フルオレセイン，ダンシル，フルオレスカミン，クマリン，ナフチルアミン或はこれらの誘導体等の蛍光性物質、例えばルシフェリン，イソルミノール，ルミノール，ビス(2,4,6-トリフロロフェニル)オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール，ナフトール，アントラセン或はこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば4-アミノ-2,2,6,6-テトラメチルピペリジン-1-オキシル，3-アミノ-2,2,5,5-テトラメチルピロリジン-1-オキシル，2,6-ジ-t-ブチル-α-(3,5-ジ-t-ブチル-4-オキソ-2,5-シクロヘキサジエン-1-イリデン)-p-トリルオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
　上記した如き標識物質を抗体に結合させる（標識する）には、例えば自体公知のEIA、RIAあるいはFIA等において一般に行われている自体公知の標識方法［例えば、医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971；図説　蛍光抗体、川生明著、第1版、(株)ソフトサイエンス社、1983；酵素免疫測定法、石川栄治、河合忠、室井潔編、第2版、医学書院、1982等］を適宜利用して行えばよい。また、標識方法として、アビジン（又はストレプトアビジン）とビオチンの反応を利用した常法を利用しても良いことは言うまでもない。
　上記１）の方法、すなわち「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　上記方法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは「試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAタンパクの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖（α2,3型シアリル糖鎖）を有する遊離型PSAを捕捉し、検出（測定）するための効率」である。
　言い換えれば、上記方法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは、試料中に存在するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの全量に対する、最終的に検出できるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの割合である、とも言える。
　上記の方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率を求める方法としては、例えば以下の方法があげられる。
　アフィニティー物質と、濃度既知の「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖のみを有するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA」（以下、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準」と記載する。）を用いて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定を行う。捕捉効率は、試料として測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量に対する、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定値の割合を求めることにより、得られる。
　又は、アフィニティー物質と、検出可能な標識物質で標識したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定を行う。次いで、アフィニティー物質を用いないで、同様に検出可能な標識物質で標識したα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定を行う。捕捉効率は、アフィニティー物質を用いないで得られた測定結果に対するアフィニティー物質を用いて得られた測定結果の割合を求めることにより、得られる。
　捕捉効率を求める方法の具体例としては、例えば以下の方法が挙げられる。すなわち、アフィニティー物質と、（濃度既知の）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を反応させる。反応後、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとアフィニティー物質とが複合体形成した画分と未反応画分を分離し、それぞれの画分の標的糖鎖の量を質量分析装置で分析する。捕捉効率は、複合体形成した画分の標的糖鎖の量／（複合体形成した画分の標的糖鎖の量＋未反応画分の標的糖鎖の量）を求めることによって、得られる。
　α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の作製方法としては、例えば、後記する実施例２(１)に記載された方法が挙げられる。すなわち、例えば非特許文献６の2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA)に開示された方法に従ってr遊離型PSA（r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含む）を取得する。取得したr遊離型PSAから、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを公知の方法で分離・精製する。例えば、まずシアリルα2,3-ガラクトース構造に対して高い親和性を示すレクチンを用いたレクチンカラムクロマトグラフィーによりr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAとを分離する。次いでゲルろ過を行って、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、それぞれ精製する。得られた精製r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準」として用いることができる。また、得られた精製r α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、必要に応じ「α(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準」として用いることが出来る。
　なお、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量等を測定する毎に捕捉効率を確認する必要はない。あるアフィニティー物質を用いてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定した場合の、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率が80%以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98％以上、特に好ましくは100%であることを一度確認すれば、そのアフィニティー物質を使用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する場合には、改めて捕捉効率を確認する必要はない。
　上記１）の方法に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定方法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98％以上、特に好ましくは100%である。
　本発明に係る「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」としては、
「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」が挙げられる。
　上記方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　上記の方法において、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させる方法」としては、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に対する該アフィニティー物質の親和性によってα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させる方法」が挙げられる。その具体的な方法は続いて行う該複合体の測定方法によって変わる。実施する該複合体の測定方法毎に、適宜最適な方法を選択して実施すればよい。
　上記の方法のより好ましい例としては、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」が挙げられる。
　「該複合体（α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとアフィニティー物質との複合体）以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定する方法」とは、所謂B/F分離を行わないホモジニアスな方法でα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとアフィニティー物質との複合体の量を測定する方法を意味する。例えば、該複合体以外の成分を測定系から除去するために通常行う洗浄操作を行わずに該複合体の量を測定する方法、が挙げられる。
　以上の方法の中でも、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに（該複合体以外の成分を測定系から除去するために通常行う洗浄操作を行わずに）該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」が好ましい。
　更に、上記方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法に使用するアフィニティー物質は、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以上を測定出来るのに十分な量でなくてはならない。
　すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定時には、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以上の量を測定し得るようなα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとの複合体を形成できる、十分な量のアフィニティー物質を用いる必要がある。
　そのようなアフィニティー物質の使用量は、アフィニティー物質のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対する結合定数と、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの量を考慮して定められる。
　α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対する親和性が強く、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに結合すれば再解離しないアフィニティー物質を用いる場合には、測定時には、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以上がアフィニティー物質と複合体を形成している程度に、十分な量のアフィニティー物質を使用する。
　α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対する親和性が十分ではなく、一旦α(2, 3)糖鎖遊離型PSAに結合しても再解離してしまうようなアフィニティー物質を用いる場合には、再解離した後でも、測定時には、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの80%以がアフィニティー物質と複合体を形成している程度に、十分な量のアフィニティー物質を使用する必要がある。
　以上の条件を満たすために使用するアフィニティー物質の量は、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAに対して過剰量（飽和量）のアフィニティー物質を使用することが好ましい、
　なお、上記１）の方法、すなわち「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAのみを測定する方法としては、例えば、アフィニティー物質を検出可能な標識物質で標識した標識アフィニティー物質を用いて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAは検出せずに、標識アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとの複合体のみを検出することにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAのみを測定する方法等が挙げられる。α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の両方を測定する方法としては、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとアフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 6)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離した後、抗PSA抗体等を用いてPSAを測定することにより、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 6)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの両方を測定する方法等が挙げられる。
　以下に、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量のみを測定する方法、及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の両方を測定する方法の具体例を記載する。
　以下の具体例において、「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」を便宜的に「標的糖鎖」と記載する場合がある。
（ａ）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量のみを測定する方法
［方法１］
１）生体由来試料と、標識物質で標識された糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第１抗体と、PSAに親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
　上記方法１に用いられる第２抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法２］
１）生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し、且つ標識物質で標識された第１抗体（アフィニティー物質）と、PSAに親和性を有する第２抗体とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体の複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程。
　上記方法２に用いられる第２抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第１抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法３］
１）生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体（アフィニティー物質）と、PSAに親和性を有する第２抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第３抗体とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と第３抗体の複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体と第３抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
　また、第１複合体と第２複合体とは、第１抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　上記方法１、２、３の場合、遊離型PSA量は、上記した遊離型PSA量を直接求める方法を実施することによって、求めればよい。また、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行って求めればよい。
（ｂ）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の両方を測定する方法
［方法４］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された抗体（標識抗PSA抗体）と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体（第１複合体）と、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識抗PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法４に用いられるPSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された抗体に係る抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法５］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と、PSAに親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法５に用いられる第１抗体と第２抗体の組合せの例としては、例えば以下の組合せが挙げられる。但し、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
・第１抗体及び第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第１抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第１抗体及び第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第１抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法６］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法６に用いられる第１抗体と第２抗体の組合せの例としては、例えば以下の組合せが挙げられる。但し、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
・第１抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第２抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
・第１抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第２抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法７］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体（第１複合体）と、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法７に用いられるPSAに親和性を有する抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法８］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法９］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法９に用いられる第１抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法１０］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体の複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法１０に用いられる第１抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第２抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法１１］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と、PSAに親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第３抗体（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と第３抗体の複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記２）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記３）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法１１に用いられる第１抗体と第２抗体の組合せの例としては、例えば以下の組合せが挙げられる。但し、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
・第１抗体及び第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第１抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第１抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第１抗体及び第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第３抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法１２］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体（アフィニティー物質）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体の複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　上記方法１２に用いられる第１抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第２抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法１３］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第３抗体とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と第３抗体（アフィニティー物質）の複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、第１複合体の量をα(2, 3)糖鎖遊離型とし、第１複合体の量と第２複合体の量の和を遊離型PSA量とする工程。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第３抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
２）アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法
　上記方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　例えば質量分析装置を用いる方法が挙げられる。
　また、該方法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは、「試料中に混在する様々な糖鎖修飾異性体を有する遊離型PSAタンパクの中から、標的となる糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖（α2,3型シアリル糖鎖）を有する遊離型PSを捕捉し、検出（測定）するための効率」をいう。
　言い換えれば、該方法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とは、試料中に存在するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの全量に対する、最終的に検出できるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの割合である、とも言える。
（３）比率を決定する方法
１）比率を測定する方法－１
　本発明に係る「生体由来試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの比率を決定する」方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて予め作製した、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率がわかっている基準液１種以上を用いて、上記した方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定を行う。次いで、被検試料を用いて、同様に上記した方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定を行う。そして、基準液を用いて得られた測定結果と被検試料を用いて得られた測定結果を比較することにより、被検試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの比率を決定することができる。
　用いる基準液は、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が、続いて行うPcaの判定を行う際に指標となるような数値のものを用いる。例えば、該比率が25%、45%、50%の基準液を用いればよい。
　該基準液の作成方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準とα(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準を、それぞれ適当な緩衝液に溶解し、各溶液の蛋白質量が同じになるように調整する。次いで、α(2, 6)糖鎖遊離型PSA標準溶液でα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準溶液を希釈して、目的の比率となるように調整することにより、基準液を得ることができる。
２）比率を決定する方法－２
　比率を測定する別の方法としては、本発明の判定方法に係る「生体由来試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」があげられる。
　上記方法における遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定方法の詳細は、上記した「（１）遊離型PSA量を測定する方法」及び「（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」に記載した通りである。
　比率を測定する方法－２の具体例としては、例えば、
（ｉ）「生体由来試料中の遊離型PSA量を測定し、またα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質（レクチン又は抗体）との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法により、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」、
（ii）「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質（レクチン又は抗体）との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法により、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」、又は
（iii）「アフィニティー物質を用いずにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」
が挙げられる。
　上記（ｉ）～（ｉｉｉ）の方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法の、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　また、本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80％以上、好ましくは90％以上、より好ましくは95%以上、更に好ましくは98％以上、特に好ましくは100%である。
　上記方法の中でも(ｉ)又は(ii)の方法が好ましい。
　中でも、
(i)’「生体由来試料中の遊離型PSA量を測定し、またα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質（レクチン又は抗体）との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法する方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」、又は
(ii)’「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質（レクチン又は抗体）との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」
が、より好ましい。
　上記(i)’又は(ii)’の方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法の、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　上記の方法であって、アフィニティー物質としてレクチンを用いる上記方法が、より好ましい。
　上記(ii)’の方法であって、アフィニティー物質としてレクチンを用いる方法、すなわち
「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンとの相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンとの複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法により、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定し、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」
が、特に好ましい。
　上記の方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法の、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は80%以上であることが好ましい。
　なお、本発明において遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める場合、遊離型PSA量、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の絶対量（PSAタンパク質量）を測定しなくてもよい。測定の実測値（蛍光強度、吸光度等のシグナル値、ピーク面積）を用いて、その比率を求めることもできる。例えば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離した場合、各分離画分のピーク面積を求め、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分のピーク面積＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分のピーク面積）を、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率とすればよい。
　また、例えば、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAを分離し、それぞれを蛍光標識抗PSA抗体を用いて検出した場合、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量／（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA画分の蛍光量＋α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA画分の蛍光量）を、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率とすることもできる。
　本発明の判定方法に係る「生体由来試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法。」の具体的な実施態様の例を、以下に記載する。
　以下の実施態様の例において、「糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」を便宜的に「標的糖鎖」と記載する場合がある。
　なお、本明細書において「親和性を有する」とは、例えば「結合する」を意味する。また、「親和性に基づいて分離する」とは、例えば、分離する対象を、その「結合の強さの違いに基づいて分離する」ことを意味する。例えば以下の実施態様において、「第１複合体と第２複合体とを該レクチンに対する親和性に基づいて分離する」とは、例えば、「第１複合体と第２複合体とを、第１複合体の該レクチンに対する結合の強さと第２複合体の該レクチンに対する結合の強さの違いに基づいて分離する」ことを意味する。
（ａ）アフィニティー物質として糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチンを用いる方法
［方法Ａ］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された抗体（標識抗PSA抗体）と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体（第１複合体）と、標識抗PSA抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識抗PSA抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ａに用いられるPSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された抗体に係る抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法Ｂ］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と、PSAに親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｂに用いられる第１抗体と第２抗体の組合せの例としては、例えば以下の組合せが挙げられる。但し、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
・第１抗体及び第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第１抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第１抗体及び第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第１抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法Ｃ］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記４）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｃに用いられる第１抗体と第２抗体の組合せの例としては、例えば以下の組合せが挙げられる。但し、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
・第１抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第２抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
・第１抗体が遊離型PSAに特異的に結合する標識抗体であり、第２抗体が糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体である。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法Ｄ］
１）生体由来試料と、標識物質で標識された糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第１抗体と、PSAに親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
４）予め求めた生体由来試料中の遊離型PSA量に対する上記３）で求めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｄに用いられる第２抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　また、上記方法Ｄにおいて、遊離型PSA量は、上記した遊離型PSA量を直接求める方法を実施することによって、求めればよい。また、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行って求めればよい。
［方法Ｅ］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該レクチンの複合体（第１複合体）と、該抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｅに用いられるPSAに親和性を有する抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法Ｆ］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記４）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法Ｇ］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有するレクチン（アフィニティー物質）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と該レクチンの複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｇに用いられる第１抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、レクチンの標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
（ｂ）アフィニティー物質として糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する抗体を用いる方法
［方法Ｈ］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体の複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｈに用いられる第１抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第２抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法Ｉ］
１）生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し、且つ標識物質で標識された第１抗体（アフィニティー物質）と、PSAに親和性を有する第２抗体とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体の複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
４）予め求めた生体由来試料中の遊離型PSA量に対する上記３）で求めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記Ｉ方法に用いられる第２抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第１抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　また、上記方法Ｉにおいて、遊離型PSA量は、上記した遊離型PSA量を直接求める方法を実施することによって、求めればよい。また、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行って求めればよい。
［方法Ｊ］
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体と、PSAに親和性を有する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第３抗体（アフィニティー物質）とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と第３抗体の複合体（第１複合体）と、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記２）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、上記３）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｊに用いられる第１抗体と第２抗体の組合せの例としては、例えば以下の組合せが挙げられる。但し、第１抗体と第２抗体のエピトープは異なることが好ましい。
・第１抗体及び第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第１抗体がPSAに親和性を有する抗体であり、第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
・第１抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体であり、第２抗体がPSAに親和性を有する抗体である。
・第１抗体及び第２抗体が遊離型PSAに特異的に結合する抗体である。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第３抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
［方法Ｋ］
１）生体由来試料と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有し且つ標識物質で標識された第１抗体（アフィニティー物質）と、PSAに親和性を有する第２抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第３抗体とを接触させて、標識第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と第３抗体の複合体（第１複合体）と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体と第３抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）必要に応じ、上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）該複合体を構成する標識第１抗体の標識物質に由来するシグナルを測定することにより、第１複合体の量を測定し、その測定値をもとにα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める工程、
４）予め求めた生体由来試料中の遊離型PSA量に対する上記３）で求めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第１抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　また、上記方法Ｋにおいて、遊離型PSA量は、上記した遊離型PSA量を直接求める方法を実施することによって、求めればよい。また、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量は、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行って求めればよい。
［方法Ｌ］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第２抗体（アフィニティー物質）とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体の複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　上記方法Ｌに用いられる第１抗体は、遊離型PSAに特異的に結合する抗体であってもよい。
　また、第１複合体と第２複合体とは、第２抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
［方法Ｍ］（標識抗体を使用しない方法）
１）生体由来試料と、PSAに親和性を有する第１抗体と、遊離型PSAに特異的に結合する第２抗体と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3) 結合した糖鎖に親和性を有する第３抗体とを接触させて、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと第２抗体と第３抗体（アフィニティー物質）の複合体（第１複合体）と、第１抗体とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAと第２抗体の複合体（第２複合体）を形成させる工程、
２）上記１）の工程で得られた第１複合体と第２複合体とを分離する工程、
３）上記２）の工程で分離した第１複合体の量及び第２複合体の量を測定する工程、
４）上記３）の工程で得られた第１複合体の量と第２複合体の量の和を求め、その和に対する上記３）の工程で得られた第１複合体の量の比率を求めることにより、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する工程。
　第１複合体と第２複合体とは、第３抗体の標的糖鎖に対する親和性に基づいて分離してもよいし、第１複合体と第２複合体の質量の差に基づいて分離してもよい（例えば電気泳動等）。
　第１複合体の量と第２複合体の量を測定するには、例えば各複合体のPSAタンパク量を測定すればよい。具体的には、第１複合体と第２複合体を電気泳動で分離した場合には、例えば一次抗体として上記した抗PSA抗体を用い、二次抗体として測定可能な標識物質で標識した標識抗体を用いた公知のウエスタンブロッティング法を実施して、分離した各画分の中のPSAタンパク量を測定する方法等が挙げられる。
　上記した実施態様Ａ～Ｍにおいて、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法」を実施する方法としては、該複合体以外の成分を測定系から除去するために通常行う洗浄操作を行わずに該複合体の量を測定する方法が挙げられる。
　上記したＡ～Ｍの方法の中でも、Ａ、Ｂ、Ｅ，Ｆ、及びＨ～Ｍの方法が好ましい。標識抗体を用いる方法としては、Ｂ及びＩの方法が、より好ましい。標識抗体を用いない方法としては、Ｅ，Ｆ、Ｌ、及びＭの方法が、より好ましい。Ｂ及びＩの方法が、特に好ましい。
　本発明に係る「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、又はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定する方法」の具体例としては、例えばELISA、RIAが挙げられる。
　本発明にかかる「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法」の具体例としては、例えばキャピラリー電気泳動、表面プラズモン共鳴法、質量分析、又はレクチンマイクロアレイ等）等が挙げられる。
　以下に、それぞれの方法により「α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖とアフィニティー物質との相互作用を利用してα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、（該複合体以外の成分を系内から除去せずに）該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法」の具体例を説明する。
　α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率の確認方法は、上記した通りであるが、例えばアフィニティー物質を用いる場合は、以下のように行えばよい。
　アフィニティー物質とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を下記の方法で反応させる。反応後、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとアフィニティー物質とが複合体形成した画分と未反応画分を分離し、それぞれの画分の標的糖鎖の量を質量分析装置で分析する。捕捉効率は、複合体形成した画分の標的糖鎖の量／（複合体形成した画分の標的糖鎖の量＋未反応画分の標的糖鎖の量）を求めることによって、得られる。
　なお、下記方法それぞれについて、捕捉効率の求め方の例を記載するが、その方法に限定されるものではない。
キャピラリー電気泳動
　キャピラリー電気泳動によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法としては、例えばまずPSAを含有する生体由来試料と、本発明に係る抗PSA抗体（好ましくは抗遊離型PSA抗体）を標識物質で標識した標識抗PSA抗体とを接触・反応させ、得られた反応液中の[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体とを、アフィニティー物質の存在下でキャピラリー電気泳動を実施することにより分離し、[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体１由来の標識物質の量、及び[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体２由来の標識物質の量を測定する。試料中の遊離型PSA量は、複合体１と複合体２の標識物質の量の和とする。そして、そして、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
　複合体１由来の標識物質の量及び複合体２由来の標識物質の量は、キャピラリー電気泳動で得られたそれぞれのピーク面積値に対応するので、それぞれのピーク面積値を使用して、該比率を求めればよい。
　上記の方法に用いられる標識抗PSA抗体の抗PSA抗体及びその標識物質の具体例は、上記した通りである。
　生体由来試料と標識抗PSA抗体（好ましくは抗遊離型PSA抗体）とを反応させる際の溶媒としては、例えば緩衝液が挙げられる。そのために用いられる緩衝液としては、通常この分野で使用されるものであれば特に限定されないが、通常pH 5.0～10.0、好ましくはpH 6.5～8.5の中性付近に緩衝作用を有するものが挙げられる。具体的には、例えばTris-HCl緩衝液、MES緩衝液、HEPES緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、グッド緩衝液等が挙げられる。また、これらの緩衝液の緩衝剤濃度としては、通常5～1000 mM、好ましくは5～300 mMの範囲から適宜選択される。
　該緩衝液には、更に増感剤、界面活性剤、防腐剤（例えばアジ化ナトリウム、サリチル酸、安息香酸等）、安定化剤（例えばアルブミン、グロブリン、水溶性ゼラチン、界面活性剤、糖類等）、賦活剤その他この分野で用いられているものであって、共存する試薬との安定性を阻害したり、抗原抗体反応を阻害しないものを有していてもよい。またこれら試薬類等の濃度範囲等も、自体公知の該測定方法において通常用いられる濃度範囲等を適宜選択して用いればよい。
　キャピラリー電気泳動装置専用の市販のキットを用いる場合は、該キットに添付の緩衝液を用いてもよい。
　標識抗PSA抗体を含有する溶液中の該抗体の濃度は、試料と標識抗PSA抗体を含有する溶液を混合したときに目的の濃度範囲内になるような濃度であればよい。例えば0.1～200μM、好ましくは0.5～50μM、より好ましくは0.5～20μM、更に好ましくは0.5～10μMであればよい。すなわち、下限値は0.1μM、好ましくは0.5μMである。またその上限値は200μM、好ましくは50μM、より好ましくは20μM、更に好ましくは10μMである。
　生体由来試料と本発明に係る標識抗PSA抗体を接触・反応させる際の本発明に係る標識抗PSA抗体の反応液中の濃度は、試料中のPSAの濃度により異なり、特に限定されないが、通常0.1～1000nM、好ましくは0.1～500nM、より好ましくは0.5～200nMである。すなわち、下限値は0.1nM、好ましくは0.5nMである。またその上限値は1000nM、好ましくは500nM、より好ましくは200nMである。
　また、生体由来試料と本発明に係る標識抗PSA抗体の反応時のpHとしては、抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、通常6.0～10.0、好ましくは6.0～8.0の範囲が挙げられ、反応時の温度も抗原抗体反応を抑制しない範囲であれば特に限定されず、通常10～50℃、好ましくは20～40℃の範囲が挙げられる。また、その反応時間は、用いられる本発明に係る抗体並びにpH及び温度等の反応条件により異なるので、各々に応じて１～60分、好ましくは1～15分程度で反応させればよい。
　反応後、得られた反応液中の[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA]複合体とを、アフィニティー物質の存在下でキャピラリー電気泳動を実施することにより分離し、[標識抗PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体の量を測定する。
　本発明においては、キャピラリー電気泳動の中でも、キャピラリーチップで行われる電気泳動を実施することが好ましい。（マイクロ）チップキャピラリー電気泳動とは、チップ基板上に断面の直径100μm以下のキャピラリーを形成させ、このキャピラリー中で電気泳動を行なう技術であり、キャピラリー内に電圧をかけることによってサンプル内に存在する物質の電荷の差をその移動度の差として分離する方法である。
　キャピラリー電気泳動は、用いられる泳動溶液により、キャピラリーゾーン電気泳動やキャピラリーゲル電気泳動に分類されるが、本発明の方法は何れにも適用し得る。分離の精度を考慮すると、上記の中でもキャピラリーゲル電気泳動が好ましい。
　本発明に係るキャピラリー電気泳動で用いられる泳動溶液としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばpH5～10、好ましくは6～8の緩衝液が挙げられる。緩衝液としては、具体的には例えばTris-HCl緩衝液、HEPES緩衝液、乳酸緩衝液、クエン酸緩衝液、酢酸緩衝液、コハク酸緩衝液、グリシン緩衝液、フタル酸緩衝液、リン酸緩衝液、トリエタノールアミン緩衝液、ホウ酸緩衝液、グリシン緩衝液、バルビツール緩衝液、酒石酸緩衝液、ホウ酸緩衝液等を挙げることができるがこれらに限定されるものではない。これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10～500 mM、好ましくは10～300 mMの範囲から適宜選択される。
　また、上記泳動溶液には、電気浸透流の影響を減らすための物質、例えばポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、含フッ素芳香族炭化水素、糖類等を含んでいてもよく、その濃度は通常この分野で用いられる範囲で設定されればよい。また、この緩衝液中には、抗原抗体反応及び糖鎖とアフィニティー物質との相互作用を妨げない量であれば、例えばNaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、BSA等のタンパク質等が含まれていても良い。
　また、キャピラリーゲル電気泳動の場合、例えばポリエチレンオキサイド（ポリエチレングリコール），ポリプロピレンオキサイド等のポリエーテル類、例えばポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミン、例えばポリアクリル酸，ポリアクリル酸エステル，ポリアクリル酸メチル等のポリアクリル酸系ポリマー、例えばポリアクリルアミド，ポリメタクリルアミド等のポリアミド系ポリマー、例えばポリメタクリル酸，ポリメタクリル酸エステル，ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリル酸系ポリマー、例えばポリビニルアセテート，ポリビニルピロリドン，ポリビニルオキサゾリドン等のポリビニル系ポリマー、例えばプルラン，エルシナン，キサンタン，デキストラン，グアガム等の水溶性ヒドロキシルポリマー、例えばメチルセルロース，ヒドロキシエチルセルロース，ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性セルロース化合物、これらの誘導体、及びこれらポリマーを構成するモノマーユニットを複数種含有するコポリマー等のポリマーを、上記キャピラリー電気泳動の泳動溶液として用いられる緩衝液に添加したもの等が挙げられる。
　上記ポリマーは、２種以上を組み合わせて添加してもよい。また、上記した如きポリマーの分子量としては、通常500Da～6000kDa、好ましくは１～1000kDa、より好ましくは100～1000kDaである。また、上記ポリマーの濃度は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常0.01～40％（w/v）、好ましくは0.01～20％（w/v）、より好ましくは0.1～10％（w/v）である。なお、上記充填剤を泳動用緩衝液に添加した際の、泳動用緩衝液の粘度は、通常２～1000センチポアズ、好ましくは５～200センチポアズ、より好ましくは10～100センチポアズである。
　アフィニティー物質は、泳動溶液に含有させればよい。但し、キャピラリー電気泳動により分離する間、アフィニティー物質はα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質とが完全に結合することが出来る量よりも高濃度であることが望ましい。
　例えば、アフィニティー物質がレクチンの場合、0.1 mg/mL～20 mg/mL、好ましくは1.0mg/mL～10mg/mL、更に好ましくは2.0mg/mL～5.0mg/mLである。、アフィニティー物質が抗体の場合、0.01 mg/mL～20 mg/mL、好ましくは0.05mg/mL～10mg/mL、更に好ましくは0.1mg/mL～5.0mg/mLである。
　MAAのマイクロ流路内での濃度は、0.1 mg/mL～20 mg/mLであればよい。
　キャピラリー電気泳動によって複合体を分離する場合、アフィニティー物質としてレクチンを用いる場合でも抗体を用いる場合でも、測定系に使用するいずれかの抗体は、陰イオン性物質等の荷電キャリヤー分子で標識されていることが好ましい。具体的には、例えば核酸鎖で標識されていることが好ましい。この場合、抗体は荷電キャリヤー分子と上記した検出に係る標識物質の両方で標識されていてもよい。
　このような目的に使用される核酸鎖は、プリン塩基又はピリミジン塩基、糖部分であるペントース、及びリン酸からなるヌクレオチド残基を基本単位とし、このリン酸が各ヌクレオチド間が糖の３'と５'位炭素の間でジエステル結合によって結ばれ重合した鎖状のポリヌクレオチドであり、例えば糖部分がリボースであるRNA又は／及び糖部分がデオキシリボースであるDNAが挙げられる。また、当該核酸鎖は、１本鎖でも、２本鎖ないしこれ以上の複数の核酸鎖からなるものであってもよい。
　使用される核酸鎖の長さとしては、本発明の目的を達成し得るものであればよく、通常１bp～1000kbp、好ましくは５bp～100kbp、より好ましくは10bp～50kbp、更に好ましくは50bp～2500bpである。
　核酸鎖と本発明に係る抗体を結合させる方法としては、例えば特許第４２１４７７９号、特許第４８６２０９３号等に開示された公知の方法が挙げられる。
　例えば抗体及び核酸鎖が夫々有する官能基を、直接又はリンカー[例えばスルホサクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）、スルホサクシニミジル4-（N-マレイミドメチル）シクロヘキサン-1-カルボキシレイト（Sulfo-SMCC）、N-（ε-マレイミドカプロイルオキシ）スクシンイミド（EMCS）、等]等を介して結合させればよい。
　また、核酸鎖に予め反応性官能基を導入した後、特許第４２１４７７９号に記載の方法により本発明に係る抗体と反応性官能基導入核酸鎖を結合させてもよい。核酸鎖へ反応性官能基を導入する方法としては、自体公知の方法が挙げられる。
　また、核酸鎖と抗体を結合させる方法として、例えば、５'末端に反応性官能基を導入したPCRプライマーを用いてPCRを行い、PCR産物として5’末端に反応性官能基が導入された核酸鎖を得る方法（モレキュラー クローニング ア ラボラトリー マニュアル セカンド エディション、J. サムブルック, E. F. フリッシュ, T. マニアティス、コールド スプリング ハーバー ラボラトリー プレス等）等により核酸末端へ反応性官能基を導入することができる。
　キャピラリー電気泳動に供せられる試料、抗体等を溶解させる溶液としては、例えばトリス緩衝液、BisTris緩衝液、グッド緩衝液、HEPES緩衝液、グリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、MOPS緩衝液等が挙げられる。また、これらの緩衝液中の緩衝剤濃度としては、通常10～500 mM、好ましくは10～300 mMの範囲から適宜選択される。また、そのpHとしては抗原抗体反応及び糖鎖とアフィニティー物質との反応を妨げない範囲であれば特に限定されないが、通常5～9の範囲が好ましい。該溶液中には、抗原抗体反応及び糖鎖とアフィニティー物質との反応を妨げない量であれば、例えば糖類、NaCl等の塩類、界面活性剤、防腐剤、タンパク質等が含まれていても良い。
　本発明に係るキャピラリー電気泳動における試料（[標識抗PSA抗体－遊離型PSA]複合体を含有する溶液）の導入方法は通常この分野でなされている方法であればよく、特に限定されないが、例えば吸引法、加圧法、電気的導入法等が挙げられ、中でも加圧法が好ましい。試料の導入量は、キャピラリーの内径や長さ、検出器の種類や感度等の条件により異なる。
　通常、試料は、自体公知の等速電気泳動（ITP）により濃縮した後、その濃縮物をそのままキャピラリー電気泳動(CE)に導入してもよい。この場合、例えばマイクロチップ電気泳動で行う場合には、ITP電気泳動とCE電気泳動とが連結しているチップを用い、連続してITP電気泳動、CE電気泳動を行うのが望ましい。
　キャピラリー電気泳動の具体的な条件は、自体公知の方法に準ずればよい。例えばキャピラリー電気泳動を用いる場合には、Ｊ.Chromatogr. 593 253－258 （1992）、Anal.Chem. 64 1926－1932 （1992）、WO2007/027495等に記載の方法に準じて行えばよい。
　本発明に係る電気泳動における泳動時の電圧は、泳動溶液や用いられる装置等により異なるため通常この分野で用いられている範囲から適宜設定されればよい。
　キャピラリー電気泳動を自動分析装置で行う場合は、該装置に添付の取扱説明書に記載の条件で、該取扱説明書に記載の方法に従って、キャピラリー電気泳動を実施すればよい。
　本発明のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定方法の具体例として、アフィニティー物質としてMAAを用い、標識抗PSA抗体として抗遊離型PSA抗体を蛍光物質で標識した標識第１抗体を用い、抗PSA抗体をDNAで標識した第２抗体を用いて、レクチン親和性を利用したマイクロチップキャピラリー電気泳動を行い、PSAの糖鎖に対するレクチンの親和性の程度に基づいてPSAを分離し、蛍光検出器で測定する方法を以下に示す。
　すなわち、PSAを含有する生体由来試料１～50μLと、通常0.001～10μM、好ましくは0.01～1μMの蛍光標識抗遊離型PSA抗体を含有する試液とを反応させる。
　キャピラリー電気泳動に用いられる生体由来試料は、生体から採取した試料であってもよいし、生体から採取した試料を脱塩や各種の精製工程を得て調製した試料であってもよい。
　得られた反応液と、通常0.001～10μM、好ましくは0.01～1μMのDNA標識抗PSA抗体を含有する試液2～50μLと、泳動用緩衝液と、内部標準物質（例えば蛍光物質：HiLyte647（AnaSpec社製）等）を、1～10psiで30～60秒の加圧法により、例えば、内径5～500μm、好ましくは50～200μm、より好ましくは50～100μm、長さ１～10cmのキャピラリーに導入する。20～40℃保温下に5秒～30分、好ましくは10秒～15分反応させる。得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA－DNA標識抗PSA抗体]の複合体と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA－DNA標識抗PSA抗体]の複合体とを、MAA（0.1 mg/mL～20 mg/mL）の存在下に1000～5000Vの電圧を10秒～60分印加することにより電気泳動を行って、分離する。そして、複合体の泳動状態を蛍光検出器やUV検出器等の検出器により測定してエレクトロフェログラムを得る。
　α(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク（［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］－［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA］－［DNA標識抗PSA抗体］の複合体を含む）と、その他の遊離型PSAのピーク（［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］－［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA］－［DNA標識抗PSA抗体］の複合体を含む）は、その泳動位置から区別することが出来る。そこで、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量はそのピークのピーク面積とする。また、得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積と、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAのピーク面積の和を遊離PSA量とする。
　以上のように、キャピラリー電気泳動を用いれば、遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とを、同一検体で一度に測定し、決定することができる。
　遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、得られたピーク面積の比率（α(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積／遊離型PSA量）を求めることにより得られる。
　キャピラリー電気泳動は、市販の全自動測定装置を用いて行ってもよい。例えばミュータスワコーi30（和光純薬工業(株)製）等が挙げられる。
　アフィニティー物質としてMAAを用い、標識抗PSA抗体として抗遊離型PSA抗体を蛍光物質で標識した標識第１抗体を用い、抗PSA抗体をDNAで標識した第２抗体を用い、全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30（和光純薬工業（株））を用い、レクチン親和性を利用したマイクロチップキャピラリー電気泳動を行って、PSAを測定する原理を以下に簡単に説明する。
　まず、試料中のPSAと蛍光標識抗遊離型PSA抗体を液相中で反応させると、PSAは蛍光標識抗遊離型PSA抗体と結合して、［蛍光標識抗遊離型PSA抗体－遊離型PSA］の複合体を形成する。
　この［蛍光標識抗遊離型PSA抗体－遊離型PSA］複合体を含有する溶液（泳動用試料Ａ）を全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30の専用チップ上の所定ウェル（免疫反応液ウェル）に分注する。次いで、泳動緩衝液２(R2ウェル)（MAAを含有）、泳動緩衝液３(R3ウェル)、泳動緩衝液４(R4ウェル)、DNA標識抗体液(C1ウェル)及び蛍光液(FDウェル)も、専用チップ上の所定ウェルに分注する。
　専用チップ（マイクロチップ）の模式図を図３に模式的に示す。
　図３においてWasteウェルは、R2、R3、R4、C1及び泳動用試料Ａを分析用流路に導入する際の廃液だめ（ドレイン用ウェル）として使用する。
　泳動用試料Ａ及び各試液を各ウェルに分注後、電圧を掛ける。するとC1ウェルに分注したDNA標識抗PSA抗体は、等速電気泳動の原理に従い、陽極方向に濃縮されながら移動する。次いで濃縮されたDNA標識抗PSA抗体は泳動用試料Ａ中の［蛍光標識抗遊離型PSA抗体－遊離型PSA］複合体と結合し、以下の複合体１及び複合体２が形成される。
複合体１
［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］-［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA］-［DNA標識抗PSA抗体］
複合体２
［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］-［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA］-［DNA標識抗PSA抗体］
　更に電気泳動を続けると、上記の複合体１及び複合体２と、フリーのDNA標識抗PSA抗体は、更にアニオンの荷電により陽極方向に移動する。未反応の蛍光標識抗遊離型PSA抗体はDNA標識PSA抗体と結合していないので荷電がないため、更に陽極方向へは移動しない。
　次に、R2ウェルに分注したMAAを含む電気泳動ゾーンに移動した複合体中、複合体１は、ゾーン中に含まれるMAAと相互作用するが、複合体２はMAAと相互作用しない。
　そこで、複合体１の方が複合体２よりも遅く泳動されるので、検出される蛍光標識抗PSA抗体由来の蛍光のピークの出現位置が複合体１と複合体２とで異なる。そこで、ピークの位置より、複合体１のピーク及び複合体２のピークをそれぞれ知ることが出来る。
　各ピークのPSA量は、各ピークのピーク面積を求めることにより、得ることができる。
　遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、得られたピーク面積の比率（α(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積／遊離型PSA量）を求めることにより得られる。
　キャピラリー電気泳動法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率を求める方法としては、例えば以下の方法が挙げられるが、これに限定されない。
　アフィニティー物質と濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用い、上記したキャピラリー電気泳動を実施した際、当該糖鎖とアフィニティー物質との相互作用により泳動移動度がシフトした複合体１（［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］-［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA］-［DNA標識抗PSA抗体］）のピーク面積を求める（測定値１）。
　別に、アフィニティー物質を用いずに、濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて、上記したキャピラリー電気泳動を実施することにより、複合体１（［蛍光標識抗遊離型PSA抗体］-［α(2, 3)糖鎖遊離型PSA］-［DNA標識抗PSA抗体］）のピーク面積を求める（測定値２）。
　得られた測定値２に対する測定値１の比率（測定値１／測定値２）を求め、得られた比率を、本法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とする。
表面プラズモン共鳴法
　表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモンが金属／液体界面で励起した場合に起こる、いわゆる表面プラズモン共鳴（Surface Plasmon Resonance ＝ SPR）の光学現象を利用して生体分子間の相互作用を解析する分子間相互作用解析システムである。表面プラズモン共鳴法は、表面プラズモン共鳴分光装置を用いて、2分子間の結合と解離にともなってセンサーチップ表面で生じる微量な質量変化をSPR シグナルとして検出する。生体分子間の相互作用をリアルタイムにモニターするので、生体分子間の結合・解離が早い・遅いというカイネティクス情報が得られる。
　表面プラズモン共鳴法の代表的な分析システムとして、ビアコアＴＭ法がある。ビアコア法は、一般には単にビアコア（Biacore）と呼ばれる。また、「ビアコア」といった場合、ビアコアの分析システムに用いられるビアコア機器を指すこともある。
　表面プラズモン共鳴法での測定は、添付の使用説明書に従って、その測定にとって至適な条件で行えばよい。
　表面プラズモン共鳴法により本発明の判定方法を実施するには、例えば以下の方法が挙げられる。
　すなわち、センサーチップの表面に抗PSA抗体を固定化する。検出光をセンサーチップの裏側からセンサーチップの金薄膜とガラスの境界面で全反射するように当てると、反射光の一部に反射強度が低下した部分があらわれる。この光の暗い部分が現れる角度はセンサーチップ表面の溶媒の屈折率に依存する。次に生体由来試料を表面プラズモン共鳴分光装置の流路からセンサーチップの表面に流す。金薄膜表面に固定化した抗PSA抗体と流路を流れてきた生体由来試料に含まれるPSA分子とが結合すると、金薄膜表面に固定化した分子の質量が増加し、溶媒の屈折率が変化する。このとき、反射光の暗い部分は質量の変化に応じて位置がシフトする。逆に分子同士が解離すると、暗い部分の位置がシフトした位置から戻る。そのシフトする角度はセンサーチップの表面の質量変化を表す。表面プラズモン共鳴法ではこの角度変化から、分子間の結合・解離をモニターする。得られた結果を基に、まず生体由来試料中の遊離型PSA量を測定することが出来る。
　次いで、アフィニティー物質を含有する溶液を表面プラズモン共鳴分光装置の流路からセンサーチップの表面に流す。金薄膜表面に生成した「抗PSA抗体PSAの複合体」のPSAと流路を流れてきたアフィニティー物質が結合すると、同様に溶媒の屈折率が変化するので、同様に分子間の結合・解離をモニターする。得られた結果を基に、生体由来試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定することが出来る。
　得られた生体由来試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する。
　表面プラズモン共鳴法で生体由来試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの比率を測定する方法としては、例えば以下の方法が挙げられる。
　すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて予め作製した、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率がわかっている基準液１種以上を用いて表面プラズモン共鳴法による測定を行い、それぞれのセンサーグラムを得る。次いで、被検試料を用いて同様に測定を行い、センサーグラムを得る。基準液を用いて得られたセンサーグラムと被検試料を用いて得られたたセンサーグラムを比較することにより、被検試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの比率を決定する。用いる基準液は、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が、続いて行うPcaの判定を行う際に指標となるような数値のものを用いる。例えば、該比率が25%、45%、50%の基準液を用いればよい。
　該基準液の作成方法の例は、上記した通りである。
　表面プラズモン共鳴法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の捕捉効率を求める方法としては、例えば以下の方法が挙げられるが、これに限定されない。
　すなわち、センサーチップの表面に、アフィニティー物質を固定化する。次に、濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を含有する試料を表面プラズモン共鳴分光装置の流路からセンサーチップの表面に流す。以上の間、表面プラズモン共鳴法による測定を行い、センサーグラムを得る。センサーグラムのピークの値を決定する（測定値１）。
　別に、測定値１を得るために使用したものと同じ濃度のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を含有する試料を、表面プラズモン共鳴分光装置の流路から、抗PSA抗体を固定化したセンサーチップの表面に流す。以上の間、表面プラズモン共鳴法による測定を行い、センサーグラムを得る。センサーグラムのピークの値を決定する（測定値２）。
　なお、この方法で捕捉効率を求める場合には、測定値２を得るために使用する抗PSA抗体には、解離定数等を勘案して、抗原との十分な特異性および親和性を有するものを選択する必要がある。
　得られた測定値２に対する測定値１の比率（測定値１／測定値２）を求め、得られた比率を、本法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率とする。
マイクロアレイ法
　産業技術総合研究所糖鎖医工学研究センター等の開発したレクチンマイクロアレイ法も、本発明の判定法に用いることが出来る。
　レクチンアレイ（レクチンマイクロアレイ）とは、特異性の異なる数十種の糖鎖と結合する性質を持つタンパク質であるレクチンをスライドガラス上にスポット状に並べて固定化したアレイである。また、エバネッセント場とは微弱な光が基板（スライドガラス）界面からしみ出る状態のことをいう。蛍光標識した糖タンパク質とレクチンマイクロアレイとを相互作用させた後、スライドガラスに励起光を照射してエバネッセント場を発生させる。励起光が届くのは界面から100nm～200nm程度であり、レクチンと結合した糖鎖が存在するのも界面から100nm～200nmなので、レクチンアレイに結合した糖鎖だけを発光できる。この技術により、洗浄操作を行うことなく、レクチンアレイの蛍光を検出できる。糖タンパク質を蛍光標識せずにレクチンマイクロアレイと相互作用させた後、糖タンパク質のコアタンパク質に対する抗体を蛍光標識した蛍光抗体と反応させた後、上記と同様の方法で蛍光を検出してもよい。
　レクチンマイクロアレイによる測定は、例えばMICROARRAY METHODS AND PROTOCOLS（CRC Press）, edited by Robert S. Matson, “Chapter 9：Lectin Microarrays”, Masao Yamada, p.141, 2009に記載のプロトコルに従って実施すればよい。
　レクチンマイクロアレイの技術を利用して本発明に係るα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定するには、例えば以下の通り行えばよい。
　本発明に係るアフィニティー物質であるレクチンと、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖以外の、PSAの糖鎖に親和性を有する複数のレクチンを固定化したマイクロアレイを作製する。目的のマイクロアレイは、例えばKuno A. et al., Nat Methods. 2005 Nov, vol.2, No.11, pp.851-856に記載の方法に順じて作製すればよい。あるいは、市販のマイクロアレイ（LecChipTM(株)グライコテクニカ製)等を使用してもよい。
　必要に応じ前処理した生体由来試料と蛍光標識抗遊離型PSA抗体をマイクロアレイに滴下して反応させて、マイクロアレイ上に[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－α(2, 3)糖鎖遊離型PSA－レクチン]の複合体を形成させる。次いで、蛍光標識抗遊離型PSA抗体由来の蛍光をエバネッセント波励起蛍光型スキャナーを用いて測定する。濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて同様に測定を行い、得られた測定値をもとに定量値換算することによって、試料中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。
　別途求めた遊離型PSAの量に対する、マイクロアレイ法で測定したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する。
　遊離型PSAの量の測定方法は、上記した「（１）遊離型PSA量を測定する方法」に記載した通りである。
　レクチンマイクロアレイ法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の捕捉効率を求める方法としては、例えば以下の方法が挙げられるが、これに限定されない。
　PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンを固定化したレクチンマイクロアレイに、濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を含有する試料を上記固相と接触・反応させる。一方、その未反応画分（洗浄画分を含む）を回収し、当該画分に残存するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA濃度を、公知のPSA測定法で測定する。
　本法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は、以下の式より求めることが出来る。
[測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度－未反応画分（洗浄画分を含む）中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度]／測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度
ELISA
　ELISAによりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求め、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する方法としては、例えば以下の［方法１］及び［方法２］が挙げられる。
［方法１］
　アフィニティー物質を固相に固定化する。PSAを含有する試料を上記固相と接触・反応させる。固相を洗浄処理した後、抗PSA抗体（抗遊離型PSA抗体でもよい。）を検出可能な標識物質で標識した標識抗PSA抗体を、固相と接触・反応させる。未反応の標識抗PSA抗体を洗浄等により除去した後、標識抗PSA抗体の標識物質に応じた測定方法で標識物質の量を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
　上記方法において、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の捕捉効率を求める方法としては、例えば以下の方法が挙げられるが、これに限定されない。
　アフィニティー物質を固定化した固相に、濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を含有する試料を上記固相と接触・反応させる。一方、その未反応画分（洗浄画分を含む）を回収し、当該画分に残存するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA濃度を、公知のPSA測定法で測定する。
　本法におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率は、以下の式より求めることが出来る。
[測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度－未反応画分（洗浄画分を含む）中のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの濃度]／測定に供したα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準の濃度
［方法２］
　遊離型PSAに特異的に結合する抗体を固相に固定化する。PSAを含有する試料を、上記固相と接触・反応させる。固相を洗浄処理した後、アフィニティー物質を検出可能な標識物質で標識した標識アフィニティー物質を、固相と接触・反応させる。未反応の標識アフィニティー物質を洗浄等により除去した後、標識アフィニティー物質の標識物質に応じた方法で標識物質を測定する。得られた測定結果をもとに、予め濃度既知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて測定を行って得られた結果を用いた常法による定量値換算を行い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を求める。別途上記した試料中の遊離型PSA量を測定する方法で遊離型PSA量を求める。得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
質量分析装置を用いる方法
　質量分析装置を用いて、試料中の成分の糖鎖の構造を解析することが出来る。本発明の判定方法では、質量分析装置を用いて試料中のPSAの糖鎖の構造を解析し、試料中の遊離型PSA量、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量、及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量を測定することが出来る。そして、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求める。
　遊離型PSA量は、質量分析装置を用いて求めても良い。また、質量分析装置を用いて得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量とα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA量の総和を遊離型PSA量としてもよい。
（４）Pcaの判定方法
　本発明のPcaの判定方法を実施するには、まず上記した方法により得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定する。そしてその比率が40％より低い場合には、Pcaではない（Pca陰性）、またはその蓋然性は低い、と判定される。
　その比率が40％より高い場合、好ましくは43.2％より高い場合には、被検者がPcaである（Pca陽性）又はその蓋然性が高い、と判定される。
　また、該比率が47％より高い場合、好ましくは50%より高い場合に、被検者がPcaであり且つその悪性度が高いと判定される。
　ここで、「Pcaの悪性度が高い」とは、所謂グリーソンスコアが４＋３以上であると分類される症例に相当する。
　特に、従来の臨床検査で、血清PSA値からはPcaか否かを判別しにくい患者、例えばトータルPSA値がゼロを超える値～50 ng/mLであった患者について本発明の判定法を行えば、より詳細なPcaの判定が行える。「0を超える値」とは、トータルPSAが測定された場合のトータルPSA値を示す。よってトータルPSA値が測定出来なかった場合は、「ゼロを超える値」に該当しない。
　更にトータルPSA値が4～20 ng/mLであった患者、特に、トータルPSA値が4～10 ng/mLの範囲にある所謂グレーゾーンの患者について本発明の判定方法を行うことにより、従来の臨床検査の検査項目であるトータルPSA値をもとに判定する場合ではPcaか否かを判定することが出来なかったグレーゾーンの患者について、Pca又はその蓋然性が高いか否かの判定を行うことができるので、特に有効である。
　更に別の判定方法として、以下の方法が挙げられる。
　すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA標準を用いて予め作製した、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率がわかっている基準液１種以上を用いて、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定を行う。この際、基準液として、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が、例えば25%、40%、50%の基準液を用る。次いで、被検試料を用いて、同様に上記した方法によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定を行う。そして、基準液を用いて得られた測定結果と被検試料を用いた測定結果を比較する
　被検試料を用いて得られた測定結果が、25%の基準液を用いて得られた測定結果、及び40%の基準液を用いて得られた測定結果より低い値であれば、Pca陰性と判定される。
　検試料を用いて得られた測定結果が、40%の基準液を用いて得られた測定結果より高い値であれば、Pcaである、又はその蓋然性が高いと判定される。
　更に、検試料を用いて得られた測定結果が、40%の基準液を用いて得られた測定結果より高い値であるが50%の基準液を用いて得られた測定結果より低いであれば、Pcaであるかその蓋然性が高いが、悪性度は低いと判定される。検試料を用いて得られた測定結果が、50%の基準液を用いて得られた測定結果より高い値であれば、Pcaであり、且つその悪性度が高いと判定される。
（５）生体由来試料
　本発明に係る生体由来試料としては、例えば血液、血漿、血清、精液、膀胱洗浄物、尿、組織抽出液、前立腺組織切片、前立腺組織生検試料等、あるいはこれらから調製されたもの等が挙げられる。中でも血清、血漿等が好ましいものとして挙げられる。
＜Pca判定用キット＞
　本発明に係るPca判定用キットは、アフィニティー物質を構成要件として含むものである。
　アフィニティー物質及びその構成要件の好ましい態様と具体例は、上記の本発明の前立腺癌の判定方法に関する説明において記載した通りである。また、これら試薬の濃度等の好ましい態様も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　該キットは、更に本発明に係る抗PSA抗体を構成要件として含んでいてもよい。
　また、これらキットに含まれる試薬中には、通常この分野で用いられる試薬類、例えば緩衝剤、反応促進剤、糖類、タンパク質、塩類、界面活性剤等の安定化剤、防腐剤等であって、共存する試薬等の安定性を阻害したりせず、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとアフィニティー物質との反応を阻害しないものが含まれていてもよい。またその濃度も、通常この分野で通常用いられる濃度範囲から適宜選択すればよい。
　更にまた本発明のキットには、本発明のPcaの判定法での使用のための説明書等を含ませておいても良い。当該「説明書」とは、当該方法における特徴・原理・操作手順、判定手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取扱説明書、添付文書、あるいはパンフレット（リーフレット）等を意味する。
　以下に実施例等を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれにより何ら限定されるものではない。
実施例１．PSAの分離測定及び比率の決定
（１）試料及び試液の調製
１）DNA標識抗PSA抗体の調製
　図２に示した手順に従って、DNAが結合したPSA抗体Fab’フラグメントを調製した。
　すなわち、先ず、常法により５'末端にNH2基が導入された250bpのDNA断片を精製し（精製末端アミノ化DNA）、次いで、このDNA断片に導入されたNH2基とスルホサクシニミジル 4-（p-マレイミドフェニル）ブチレイト（Sulfo-SMPB）リンカー（スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカー、ピアス社製）のスクシンイミド基とを常法により反応させた後、ゲルろ過処理を行い、未反応リンカーを除去して、リンカーが結合した250bpDNA断片を得た。得られたリンカー結合250bpDNA断片と、予め抗ヒトPSAマウスモノクローナル抗体 PSA10（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA10、和光純薬工業(株)製（自製品））を用いて常法に従い調製した抗PSA抗体PSA10 Fab'フラグメントとを反応させた。得られた反応物を、DEAEカラムを用いて精製し、250bpDNA断片が結合した抗PSA抗体PSA10 Fab'フラグメント（以下、「DNA標識抗PSA抗体」と略記する。）を調製した。
　なお、用いた抗ヒトPSAマウスモノクローナル抗体（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo.PSA10）は、ヒトPSAに対して親和性を有する抗体で、結合型PSA及び遊離型PSAの両方に結合する。すなわち該抗体は、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSAの両方に結合する。
２）蛍光標識抗遊離型PSA抗体の調製　　　　　
　Anti PSAモノクローナル抗体 PSA10とは異なるPSAのエピトープを認識し、遊離型PSAのみと特異的に結合する抗ヒトPSAモノクローナル抗体 PSA12（Anti PSAモノクローナル抗体 クローンNo. PSA12、和光純薬工業(株)製（自製品））を常法により処理して、抗PSA抗体PSA12 Fab'フラグメントを得た。得られたフラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質HiLyte647（AnaSpec社製）を導入して、HiLyte647標識抗遊離型PSA抗体PSA12 Fab'フラグメント（以下、「蛍光標識抗遊離型PSA抗体」と略記する。）を得た。
（２）電気泳動（マイクロチップキャピラリー電気泳動）
　全自動蛍光免疫測定装置ミュータスワコー i30（和光純薬工業（株）製）を用い、装置の取扱説明書に従い、以下に示した手順にてマイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
１）泳動用試料Ａの調製
　非特許文献６の2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA)に開示された方法に従ってリコンビナント遊離型PSA（以下、「r 遊離型PSA」と略記する。）[リコンビナントα(2, 3)糖鎖遊離型PSA（以下、「r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と略記する。）と、リコンビナントα(2, 6)糖鎖遊離型PSA（以下、「r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA」と略記する。）を含む。]を取得した。取得したr 遊離型PSA溶液中のPSA濃度を測定し、PBS(-)(和光純薬工業（株）製)で希釈して１ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調製し、サンプル溶液を得た。得られたサンプル溶液を２μL、上記(１)２)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１[5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl、10mM MESを含有する。pH 7.5] ７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
なお、この反応液中の蛍光標識抗遊離型PSA抗体の最終濃度は、100nMである。
　上記反応で得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r 遊離型PSA]複合体を含有する反応液（すなわち[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA]複合体を含有する溶液）（10μL）を、泳動用試料Ａとした。
２）泳動用試液の調製
　下記の各試液を調製した。
・泳動緩衝液２（MAA含有）
　4.5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG8000)、3％(w/v) グリセロール、10mM NaCl、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を調製した。これにMAA（VECTOR社製）を終濃度4mg/mLとなるように添加・混合したものを調製し、泳動緩衝液２とした。
・泳動緩衝液３
　2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、0.01 ％ BSA、125mM HEPES、75mM Tris-HClを含有するバッファー(pH調製なし)を、泳動緩衝液３とした。
・泳動緩衝液４
　2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、0.01 ％ BSAを含有する75mM Tris-HClバッファー(pH 7.5)を、泳動緩衝液４とした。
・DNA標識抗体液（DNA標識抗PSA抗体含有）
　上記(１)１)で得られたDNA標識抗PSA抗体 100nMを含有するバッファー[2％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、0.5mM EDTA(2Na)、3％(w/v) グリセロール、50mM NaCl、0.01 ％ BSA、75mM BisTris(pH 6.0)を含有する。]を調製し、DNA標識抗体液とした。
・蛍光液
　30nM HiLyte647、20％(w/v) グリセロールを含有する50mM BisTris(pH 6.0)を、蛍光液とした。蛍光液は測定装置（ミュータスワコー i30）の検出部での位置確認等の調整のために用いられる。
３）電気泳動手順
ｉ）泳動用試料Ａ及び泳動用試液の導入
　上記（２）１)で調製した泳動用試料Ａ 5.4μLを、ミュータスワコー i30専用マイクロチップの所定ウェル（SPウェル）に分注した。次いで、下記のように該マイクロチップの各ウェルに上記(２)２)で調製した各試液を分注した。
・R2ウェル（R2(FLB)ウェル、R2(LB)ウェル）：泳動緩衝液２を10.0μLずつ、
・R3ウェル：泳動緩衝液３を10.0μL、
・R4ウェル：泳動緩衝液４を5.4μL、
・C1ウェル：DNA標識抗体液を3.0μL、
・FDウェル：蛍光液を7.0μL。
　使用したマイクロチップの模式図を図３に示す。
　図３においてWasteウェルは、各ウェル（R2、R3、R4、C1）の試液及び泳動用試料Ａを分析用流路に導入する際の廃液だめ（ドレイン用ウェル）として使用する。
　次いで、各4つのWasteウェル（ドレイン用ウェル）間に30秒間、-５psiの圧力を印加して、チップの分析用流路に泳動用試料Ａ及び各試液を導入した。
ｉｉ）ITP（反応、濃縮、分離）・検出
　使用したマイクロチップのチップ内流路を模式化したものを図４に示す。
図４において、WはWasteウェルを示す。R3ウェル側が陰極、R2(LB)ウェル側が陽極になる。また、図４において、泳動用試料Ａ及び各ウェルの試液の配置部分を点部分と白部分（点のない部分）とに色分けして示す。
　チップの分析用流路に泳動用試料Ａ及び各試液を導入した後、以下の方法でPSAの分離及び検出を行った。
　図４のR3ウェル－R2(LB)ウェル間に4000Vの電圧を印加して、30℃で、試液中のDNA標識抗PSA抗体を泳動用試料Ａ中の[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r 遊離型PSA]複合体と接触させて、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r 遊離型PSA－DNA標識抗PSA抗体]の複合体を形成させ、これを等速電気泳動（ITP）で濃縮した。等速電気泳動の泳動方向は図４に“ITP”と点線により示される。
　遊離型PSAを捕捉するための各標識抗体による免疫反応時間は約200秒であった。
　ここで形成された複合体は、具体的には[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA－DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体１）と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA－DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体２）である。
　R2(FLB)ウェルまで等速電気泳動されて、複合体がR2(FLB)ウェルを通り抜けたことを電圧の変化で判断して、陰電極をR3からR2(FLB)に切り替えた。そして、更に検出部分（R2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分から２cm下流のキャピラリー部分）で、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r 遊離型PSA－DNA標識抗PSA抗体]の複合体のピークが検出されるまでMAAの存在下でキャピラリーゲル電気泳動(CE)を行った。CEが行われた位置及び電気泳動の泳動方向は、図４に“CE”と点線により示した。
　検出は、635nmレーザー励起によりR2(FLB)とR2(LB)のチャネルクロス部分から２cm下流のキャピラリー部分の蛍光強度を、フォトダイオード（富士フィルム(株）製）により経時的に測定することによって行った。
　また、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いる以外は、上記と同じ泳動用試料Ａ及び泳動用試液及び測定装置を用い、上記と同様の方法を実施して、PSAの分離及び検出を行った。
（３）結果
　得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）を図５に示す。図５において、縦軸は蛍光強度を、横軸は移動度（sec）をそれぞれ示す。
　また、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いて同様に検出を行って得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）を、図５に灰色の線（色の薄い線）で併せて示す。また、この検出の場合に出現したピークを“Lectin(-)”として図５に示す。
　MAAと反応した[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA-DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体１）は、MAAと反応しない[蛍光標識抗遊離型PSA抗体-r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA -DNA標識抗PSA抗体]の複合体（複合体２）と比べて泳動に時間がかかるので、ピークの出現が遅れる。すなわち、複合体２のピークは“Lectin(-)”のピークと同じ位置に出現したピークであり、複合体１のピークは、複合体２のピークのすぐ後に出現したピークである。
　得られた複合体１の分画のピーク面積及び複合体２の分画のピーク面積を、測定装置付属の解析用ソフトで求めた。
　次いで、得られた複合体１の分画のピーク面積と複合体２の分画のピーク面積を用い、試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）を計算した。
　具体的な算出方法は、以下の通りである。
・遊離型PSA量（遊離型PSAの総量）＝[複合体１の分画のピーク面積]＋[複合体２の分画のピーク面積]
・遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）＝［複合体１の分画のピーク面積］/[遊離型PSA量]×100
　その結果、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は「49.9％」であった。
　以上の結果から、キャピラリー電気泳動で複合体１（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量）と複合体２（α(2, 3)糖鎖遊離型PSA以外の遊離型PSA、本実施例ではα(2, 6)糖鎖遊離型PSA）を分離測定出来ること、及び該測定をもとに得られたピーク面積を用いて、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めることが出来ることが判った。
実施例２．捕捉効率の確認
(１)r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA又はr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａの調製
　非特許文献６の2. Materials and methods (2.7 Forced expression of FLAG-tag-fused S2,3PSA)に開示された方法に従ってr遊離型PSA（r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含む）を取得した。取得したr遊離型PSAから、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを分離精製した。分離精製の方法は、まずシアリルα2,3-ガラクトース構造に対して高い親和性を示すACGレクチンカラム（(株)J-オイルミルズ）を用いたレクチンカラムクロマトグラフィーによりr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAとを分離した。次いでゲルろ過を行って、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAをそれぞれ精製した。
　最終的に、r 遊離型PSA（29μg）を出発材料として、1.3μgのr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAと、2.1μgのr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAが得られた。
　得られたr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、それぞれPBS(-)(和光純薬工業（株）製)で希釈して、１ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調整し、サンプル溶液を得た。得られたサンプル溶液を２μLずつ、実施例１の(１)２)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１[5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl、10mM MESを含有する。pH 7.5]７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を各々調製した。
　なお、核反応液中の蛍光標識抗遊離型PSA抗体の最終濃度は、100nMである。
　上記反応で得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体を含有する反応液（10μL）を、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａとした。また、上記反応で得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA]複合体を含有する反応液（10μL）を、r α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａとした。
（２）電気泳動（マイクロチップキャピラリー電気泳動）
　上記（１）で調製したr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａ、又はr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の試薬及び測定装置等を用いて、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
（３）結果
　得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）を図６に示す。図６において、縦軸は蛍光強度を、横軸は移動度（sec）をそれぞれ示す。
　r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａを用いて得られた結果を、図６(１)に、灰色の線（色の薄い線）で示す。
　また、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料ＡとMAAを含有しない泳動緩衝液２を用いて同様に測定を行って得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）を、図６(１)に、黒線（色の濃い線）で併せて示す。
　r α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料Ａを用いて得られた結果を、図６(２)に、灰色の線（色の薄い線）で示す。
　また、r α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを含有する泳動用試料ＡとMAAを含有しない泳動緩衝液２を用いて同様に測定を行って得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）を、図６(２)に、黒線（色の濃い線）で併せて示す。
　MAAと、MAAが親和性を有するα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖構造、すなわち糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖との間に相互作用が生じるので、MAAを含有する泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークは、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークより後に出現する筈である。図６（１）から明らかな通り、MAAを含有する泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークは、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークの出現位置より遅延することが確認された。
　次に、図６(１)の結果をもとに、得られたピークの面積を、装置付属の解析ソフトで求めた。その結果、MAAを含有する泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積は、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積のほぼ100%であった。
　一方、α(2, 6)糖鎖遊離型PSAは、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有しないため、MAAとの相互作用は生じない。そのため、MAAを含有する泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークは、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークと同じ位置に出現する筈である。図６(２)から明らかな通り、MAAを含有する泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークと、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの泳動ピークとは、泳動ピーク位置に変化が認められなかった。
　次に、図６(２)の結果をもとに、得られたピークの面積を、装置付属の解析ソフトで求めた。その結果、MAAを含有する泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(2, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積は、MAAを含有しない泳動緩衝液２を用いた測定で得られたα(6, 3)糖鎖遊離型PSAのピーク面積のほぼ100%であった。
　以上の結果から、本測定系では、「MAAと糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖」との相互作用による、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びα(6, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率がほぼ100%であることが確認された。言い換えれば、本測定系では、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量及びα(6, 3)糖鎖遊離型PSA量を、ロス無く測定できることが明らかになった。
　なお、本発明者等は、特許文献１に記載のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定方法では、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率が低い（80%未満）であることを確認している。
実施例３．
(１)泳動用試料Ａの調製
　実施例２で調製したr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAを、それぞれPBS(-)(和光純薬工業（株）製)で希釈して、1.5ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調整した。次いで、得られたr α(2, 6)糖鎖遊離型PSA溶液でr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA溶液を希釈して、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを10%, 20%, 30%, 40%, 又は50%含有するサンプル溶液を得た。このr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの含有率を「理論値」とする。
　得られたサンプル溶液を２μL、実施例１の(１)２)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１ [5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl、10mM MESを含有する。pH 7.5]７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
　上記反応で得られた[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－遊離型PSA]複合体を含有する反応液（すなわち[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体と[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA]複合体を含有する溶液）（10μL）を、泳動用試料Ａとした。
　なお、この反応液中の蛍光標識抗遊離型PSA抗体の最終濃度は、100nMである。
（２）電気泳動（マイクロチップキャピラリー電気泳動）
　上記（１）で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。
（３）比率の算出
　得られた電気泳動像（エレクトロフェログラム）をもとに、複合体１（[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA]複合体）のピーク面積と複合体２（[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－r α(2, 6)糖鎖遊離型PSA]複合体）のピーク面積を、装置付属の解析用ソフトで求めた。得られた値を、以下、単に「実測値」と記載する場合がある。
　次いで、複合体１の分画のピーク面積と複合体２の分画のピーク面積をもとに、試料中の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）を、実施例１と同様の計算方法で求めた。
（４）結果
　結果を図７に示す。
　図７（１）は、各サンプル溶液の実測値をもとに算出した遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）と、使用したサンプル溶液のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの含有率（理論値）との関係を示す。図７（１）において、■は、各サンプル溶液中の遊離型PSAのタンパク質濃度を示す（fPSA）。使用した各試料中のタンパク質濃度は、すべて1.5ng/mLである。◆は、実測値をもとに算出した、各サンプル溶液の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）を示す。
　図７(１)より、使用したサンプル溶液の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の理論値（α(2, 3) PSA ratio (％)）と、実測値をもとに算出した遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2, 3) PSA ratio (％)）が殆ど一致した。例えば、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを10%（理論値）含有するサンプル溶液の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）は、理論値は10%であるのに対し、実測値をもとに算出した該比率も殆ど10%であった。
　図７（２）は、各サンプル溶液について、上記（３）で得られた複合体１の分画のピーク面積の実測値（■、peak area）及び複合体２の分画のピーク面積の実測値（◆、Peak area）と、そのサンプル溶液の理論値との関係を示す。
　複合体１の分画のピーク面積はα(2, 3)糖鎖遊離型PSA濃度を反映し、複合体２の分画のピーク面積はα(2, 6)糖鎖遊離型PSA濃度を反映する。
　例えば、図７(２)より、理論値（α(2, 3)PSA ratio）が10%の試料を用いたとき、複合体１の分画のピーク面積の実測値（■）は約2.7であり、複合体２の分画のピーク面積の実測値（◆）は約24.2であった。以上のことから、実測値をもとに計算すると、
α(2, 3)糖鎖遊離型PSA濃度／遊離型PSA濃度
＝複合体１の画分のピーク面積／（複合体１の画分のピーク面積＋複合体２の画分のピーク面積）
＝2.7／（2.7+24.2）×100＝10.0%
となった。すなわち、実測値をもとに算出した遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、理論値と殆ど同じになった。
　以上のことから、本実施例の測定方法で得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）は、実際の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）と殆ど一致したことが確認された。
　従って、本実施例の測定方法を実施することにより、正確な「遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（％）」が得られることが確認された。また、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAとα(2, 6)糖鎖遊離型PSAの測定値が直線性を示すことが確認された。この結果は、本測定系におけるα(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率がほぼ100%であることを裏付けている。
実施例４．Pca患者及びBPH患者由来試料を用いて得られた比率の比較
（１）泳動用試料Ａの調製
　トータルPSA値が10.0 ng/mL以下であった前立腺癌（Pca）患者22名及び非癌である前立腺肥大症（BPH）患者24名から採取した血清を試料として用いた。各患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の背景（年齢、PSA値（トータルPSA値）、病理組織学的悪性度分類及び臨床病期）を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　試料２μL、実施例１(１)２)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１[5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MESを含有する]７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
　上記反応で得られた、[蛍光標識抗遊離型PSA抗体－遊離型PSA]複合体を含有する反応液（10μL）を、泳動用試料Ａとした。
（２）PSAの分離測定及び比率の決定
　上記(１)で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
　上記で得られた値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定（Manwhitney U-TEST）を行った。
（３）結果
得られた結果を図８に示す。
　図８から明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2,3) PSA ratio (%)）をPca患者とBPH患者間で比較したP値は「P＜0.0001」であった。よって、Pca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、BPH患者由来試料の該比率と比較して有意に高いことが判った。
比較例１及び２．従来の判定方法との比較
（１）試料
　実施例４で使用したものと同じ試料を用いた。
（２）従来の判定項目の測定
　体外診断用医薬品であるルミパルスプレストPSA（富士レビオ(株)）を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた（比較例１）。
　また、Human Circulating Cancer BioMarker Panel 1 セレクトキット（LUMINEX社製）を用い、キットに添付のプロトコルに従って、各試料中の遊離型PSA値を求めた。
　得られた結果を基に、各試料のトータルPSA値に対する遊離型PSA値の比率を求めた（比較例２）。
　上記で得られた各値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定（Manwhiteney U-TEST）を行った。
（３）結果
　得られた結果及び、実施例４で得られた結果を図９の上図に併せて示す。
　図９（１）上図は、実施例４で得られた、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2,3)PSA ratio）を、Pca患者とBPH患者間で比較した結果を示す（図２と同じ）。
　図９（２）上図は、トータルPSA値（total PSA）を、Pca患者とBPH患者間で比較した結果を示す（比較例１）。
　図９（３）上図は、トータルPSA値に対する遊離型PSA値の比率（%fPSA）を、Pca患者とBPH患者間で比較した結果を示す（比較例２）。
　図９(１)（上図）から明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者とBPH患者間で比較したP値は「＜0.0001」であった（図９（１）上図）。一方、トータルPSA値をPca患者とBPH患者間で比較した結果、P値=0.0289（図９（２）上図）であった。また、トータルPSA値に対する遊離型PSA値の比率をPca患者とBPH患者間で比較した結果、P値=0.1458（図９（３）上図）であった。
　以上のことから、本発明の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を用いてPcaを判定する方法は、従来のトータルPSA値又はトータルPSA値に対する遊離型PSA値の比率を用いて判定する方法よりも、精度の高いPcaの判定を行えることが判った。
　また、この結果をもとに、更にRelative Operating Characteristic curve（ROC曲線）による解析を行った。結果を図９の下図に併せて示す。
　図９(１)（下図）から明らかな通り、本発明の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率でPcaを判定した結果、AUC（曲線下面積＝Area Under the Curve）＝0.8580（図９（１）下図）となった。一方、従来のトータルPS値でPcaを判定した結果、AUC＝0.6875（図９（２）下図）であった。従来のトータルPSA値に対する遊離型PSA値の比率でPcaを判定した結果、AUC＝0.6275であった（図９（３）下図）。
　すなわち、本発明の判定方法は、従来の判定方法と比べて測定系の感度・特異度の点で優れていることが示された。また、Pca判定のグレーゾーンとされる試料中のトータルPSA値が10.0 ng/mL以下の患者由来試料を用いて上記の結果が得られたことから、本発明の判定方法は、従来の判定方法よりも高い精度で、トータルPSA値がグレーゾーンの患者のPcaの判定が行えることが判った。
実施例５．カットオフ値の検定
（１）泳動用試料Ａの調製
　実施例４で使用した血清試料と、トータルPSA値10～50ng/mLを示す患者43名（Pca陽性；26例、陰性；17例）由来の血清試料の、計89名の患者由来の血清試料を用い、実施例４(１)と同様の方法で泳動用試料Ａを調製した。
（２）PSAの分離測定及び比率の決定
　上記(１)で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
（３）カットオフ値の検定
　上記（２）で得られた結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）により解析を行った。結果を図１０に示す。
　次に、常法通り、ROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点（図１０に矢印で示した）の値、すなわち「感度－（１－特異度）」が最大となる値を求めた。その結果、その値（遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率）は「43.1％」であった。
　このことから、本実施例の検証では、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をもとにPca判定を判定する場合のカットオフ値は「43.1%」となった（図１０）。
実施例６．公知のカットオフ値による判定との比較
（１）試料
　WO2014/057983号パンフレット（特許文献３）には、その実施例２に記載の方法で各試料の蛍光強度（MFI：Mean Fluorescence Intensity）を測定し、その値を各試料のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量としたこと、Pca判定のためのカットオフ値を「蛍光強度（MFI）＝１１３０」に定めたことが記載されている。しかし、本発明者等が特許文献３の実施例２に記載された方法で、本明細書の実施例４で使用した試料（計46症例）のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定した結果、蛍光強度（MFI）が１１３０以上であっても、実際には陰性（BPH）の場合があった（偽陽性）。すなわち、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量でPcaを判定すると、偽陽性の判定が生じる可能性があることが示唆された。
　そこで、本発明者等が上記測定を行った結果、陰性（BPH）であるのにもかかわらず蛍光強度（MFI）が特許文献３で定められたカットオフ値「１１３０」より高値であった５検体の試料を用いて、本発明の判定方法と特許文献３に開示された公知の判定方法との比較検討を行った。
（２）遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の決定
　上記（１）で選択した５検体の試料を用い、実施例４(１)と同様の方法で泳動用試料Ａを調製した。
　次いで、上記で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。結果を表２に示す。
（３）α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定
　上記（１）の５検体の試料を用い、特許文献３の実施例２に記載の方法と同様の方法を実施して、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量（蛍光強度（MFI））を測定した。結果を表２に併せて示す。
（４）結果
　表２において、「比率」は、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を示す。
　表２において、「MFI」は、上記(３)の方法で各試料の蛍光強度（MFI）を測定した結果を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　特許文献３が定めたα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を指標としてPcaを判定する場合のカットオフ値は、蛍光強度（MFI）として１１３０である。表２の結果から明らかなように、今回測定対象となった５検体はすべて陰性（BPH）であるにもかかわらず、蛍光強度（MFI）≧１１３０であった。従って、特許文献３に記載のカットオフ値をもとにPcaを判定した結果、５検体はすべてPcaと判定された（偽陽性判定）。
　これに対し、実施例５で決定した遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率のカットオフ値「43.1％」を用いて判定を行った結果、測定対象となった５検体の該比率はすべてこのカットオフ値未満であり、すべて陰性と判定された。
　以上のことから、本発明に係る遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を指標にしたカットオフ値を用いた判定方法の方が、公知のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を指標としたカットオフ値を用いた判定方法よりも、精度の高いPcaの判定が行える方法であることが判った。
実施例７．
（１）試料
　トータルPSA値が20.0 ng/mL以下であった、前立腺癌（Pca）患者28名及び非癌である前立腺肥大症（BPH）患者28名から採取した血清を、試料として用いた。
　なお、ここで用いた試料は、従来の判定マーカーであるトータルPSA test及びはトータルPSA値に対する遊離型PSAの比率を指標として判定した結果、癌の判定が難しいと判断された試料である。
（２）遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の決定
　上記(１)の試料を用い、実施例４(１)と同様の方法で泳動用試料Ａを調製した。
　次いで、上記で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
　上記で得られた値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定（Manwhitney U-TESTを行った。
（３）結果
　結果を図１１に示す。
　図１１(１)は、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2, 3) PSA ratio (%)）を示す。
　また、図１１(１)の結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）により解析を行った。結果を図１１(２)に示す（図１１（２）(a)である。）。
比較例３、４
（１）トータルPSA値の測定（比較例３）
　実施例７で使用したものと同じ試料を用い、体外診断用医薬品であるルミパルスプレストPSA（富士レビオ(株)）を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた。また、得られた値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定（Manwhitney U-TEST）を行った。
　結果を図１２（１）に示す。
　また、得られた結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）により解析を行った。結果を図１１(２)に併せて示す（図１１(２)(ｃ)）。
（２）α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの測定（比較例４）
　実施例７で使用したものと同じ試料を用い、特許文献３（WO2014/057983）の実施例２に記載の方法と同様の方法を実施して、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量（蛍光強度（MFI）を測定した。また、得られた値について、Pca患者とBPH患者間で有意差検定（Manwhitney U-TEST）を行った。
　結果を図１２(２)に併せて示す。
　また、得られた結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）により解析を行った。結果を図１１(２)に併せて示す（図１１(２)(ｂ)）。
（３）結果
１）ROC曲線解析の結果
　実施例７及び比較例３，４で得られたROC曲線解析の結果を図１１(２)に併せて示す。
　解析の結果、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（実施例７、図１１(２)(a)）では、AUC＝0.7423であった。一方、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量（比較例４、図１１(２)(ｂ)）では、AUC＝0.5344であった。トータルPSA量（比較例３、図１１(２)(ｃ)）では、AUC=0.5064であった。
　また、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率＝40%を前立腺癌の判定におけるカットオフ値とした場合の感度は85.7％、特異度は46.4％であった。一方、公知のPcaマーカーであるα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量(b)、およびトータルPSA量(c)において85.7％の感度を達成した場合の特異度は、それぞれ17.9％、および14.3％であった。
　以上のことから、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率＝40%を前立腺癌の判定におけるカットオフ値とする本発明の前立腺癌の判定方法は、通常の方法において、判定の難しい症例であっても、従来の判定方法よりも前立腺癌判定の感度及び特異度が高い、優れた判定方法であることが確認された。
２）有意差検定の結果
　図１１(１)から明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2,3) PSA ratio (%)）をPca患者とBPH患者間で比較したP値は「P＝0.0019」であった。よって、Pca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、BPH患者由来試料の該比率と比較して有意に高いことが判った。
　一方、図１２から明らかな通り、トータルPSA量（図１２(１)）及び遊離型α(2,3)遊離型PSA量（図１２(２)）は、Pca患者とBPH患者間では有意差は認められなかった。
　以上のことからも、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率＝40%をカットオフ値として、この値をもとにPcaの判定を行う本発明の判定方法は、トータルPSA値やα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量をもとに判定を行う公知の方法よりも、精度の高いPcaの判定を行うことができることが判った。
実施例８
（１）泳動用試料Ａの調製
　前立腺癌（Pca）患者103名及び非癌者（前立腺癌ではないと判定された者。BPH患者を含む。）50名から採取した血清を試料として用いた。各患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の背景（年齢、トータルPSA値）を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　試料２μL、実施例１(１)２)で調製した1μM 蛍光標識抗遊離型PSA抗体を１μL、及び泳動緩衝液１ [5％ (w/v) ポリエチレングリコール(PEG20000)、3％(w/v) グリセロール、150mM NaCl、0.01％ BSA、75mM Tris-HCl(pH 7.5)、10mM MESを含有する] ７μLを0.5mLチューブに加えて混合して、10μLの反応液を調製した。
　得られた反応液10μＬを、泳動用試料Ａとした。
（２）PSAの分離測定及び比率の決定
　上記(１)で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
（３）結果
　上記で得られた値について、Pca患者と非癌者で有意差検定（Manwhitney U-TESTを行った。得られた結果を図１３に示す。
　図１３から明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2,3) PSA ratio (%)）をPca患者と非癌者で比較したP値は「P＜0.0001」であった。よって、Pca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率は、非癌者由来試料の該比率と比較して有意に高いことが判った。
　また、得られた該比率をもとに、更にRelative Operating Characteristic curve（ROC曲線）による解析を行った。結果を図１４に示す（図１４(１)）。
　また、既に測定されていたトータルPSA値をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）による解析を行った。結果を図１４に併せて示す（図１４(２)）
　図１４のROC曲線解析の結果、本発明の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率でPcaを判定した結果、AUC（曲線下面積＝Area Under the Curve）＝0.851となった。一方、従来のトータルPS値でPcaを判定した結果、AUC＝0.658であった
　すなわち、本発明の判定方法は、従来の判定方法と比べて測定系の感度・特異度の点で優れており、本発明の判定方法は、従来のトータルPSA量に基づく判定方法よりも診断精度の高い判定方法であることが分かる。
　また、図１４のROC曲線解析の結果、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率＝40%を前立腺癌の判定におけるカットオフ値とした場合の感度は、81.6％、特異度は76.0％であった。一方、公知技術であるトータルPSA量を用いた判定方法において、81.6％の感度を達成した場合の特異度は、46.0であった。以上のことから、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率＝40%を前立腺癌の判定におけるカットオフ値とする本発明の前立腺癌の判定方法は、従来の判定方法よりも前立腺癌判定の感度及び特異度が高い、優れた判定方法であることが確認された。
（４）カットオフ値の検定
　上記（３）で得られたPca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の結果をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線、図１５）により解析を行った。次に、常法通り、ROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点（図１５に矢印で示した）、すなわち「感度－（１－特異度）」が最大となる値を求めた。その結果、その値（遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率）は「42.7％」であった。
　このことから、本実施例の検証では、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をもとにPca判定を判定する場合のカットオフ値は「42.7%」となった。
実施例９、比較例５．前立腺癌の悪性度の判定
（１）試料
　術後のグリーソンスコア（GS)判定により悪性度を確定した前立腺癌（Pca）患者36名、及び非癌者（前立腺癌ではないと判定された者。BPH患者を含む。）40名から採取した血清を試料として用いた。各患者の組織病理学的診断は前立腺生検を行って確認した。患者の背景（年齢、トータルPSA値、グリーソンスコア等）を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
（２）遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の決定（実施例９）
　上記(１)の試料を用い、実施例４(１)と同様の方法で泳動用試料Ａを調製した。
　次いで、上記で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
　結果を図１６(１)に示す。
　また、術後グリーソンスコアが４＋３（術後GS=4+3）又はそれより悪性の患者由来の血清試料を用いて得られた、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をもとに、Relative Operating Characteristic curve（ROC曲線）による解析を行った。結果を図１７に示す。
（2）トータルPSA値の測定（比較例５）
　実施例９で使用したものと同じ試料を用い、体外診断用医薬品であるルミパルスプレストPSA（富士レビオ(株)）を用いてキット添付のプロトコルに従って、各試料中のトータルPSA値を求めた。
　結果を図１６(２)に示す。
（３）結果
　図１６（１）は、非癌者及びPca患者由来試料の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を示した図である。Pca患者については、術後グリーソンスコア（術後GS）ごとの該比率を示した。
　図１６（2）は、非癌者及びPca患者由来試料のトータルPSA量を示した図である。Pca患者については、術後GSごとの該比率を示した。
　図１６（１）から明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が40%の値をカットオフ値とした場合、非癌者の該比率はカットオフ値より低く、Pca患者の該比率はカットオフ値よりも高くなる傾向を強く示した。このことから、カットオフ値40%を用いることにより、Pca患者と非癌例との良好な識別判定が可能であることが示された。
　次に、ROC曲線による解析結果（図１７）から明らかな通り、本発明の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率でPcaを判定した結果、AUC＝0.921となった。また、その感度は91.3％、特異度は90.6％であった。
　さらに、常法通り、図１７のROC曲線に接する45度の角度をもつ直線を引き、その直線との交点（図１７に矢印で示した）の値、すなわち「感度－（１－特異度）」が最大となる値を求めた。その結果、その値（遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率）は「47.2％」であった。このことから、本実施例の検証では、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をもとにPcaの悪性度を判定する場合のカットオフ値は「47.2%」となった（図１７）。
　更に、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が47.2％の値をカットオフ値とした場合、図１６(１)の結果から明らかな通り、グリーソンスコアが４＋３（GS=4+3）又はそれ以上の患者の該比率は、カットオフよりも高くなる傾向を強く示した。すなわち、術後グリーソンスコアによる確定診断との良好な相関性を示した。
　また、GS=3+4の場合の該比率はカットオフ値40%より高いが47.2％よりは低くなる傾向があるため、Pcaではあるが悪性度は低い症例として識別できた。
　以上のことから、「遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率」＝「47.2％」を悪性度判定のカットオフ値とし、このカットオフ値「47.2％」を用いてPcaの悪性度を判定すれば、悪性度の低い症例を選別でき、またそれにより過剰診療を回避することができる可能性が高いことが判った。
　一方、図１６(２)から明らかな通り、トータルPSA値とグリーソンスコアの指標の間には、関連性が認められなかった。このことから、トータルPSA値を指標として用いても、Pcaの判定も、Pcaの悪性度の判定も行うことは出来ないことが判る。
実施例１０、比較例６．外国人試料の糖鎖多様性の影響について
　PSAの糖鎖は、計19種類の構造が同定され、非常に多様性に富んでいることが明らかとなっている（非特許文献４）。また、糖タンパク質の糖鎖には、人種による多様性があることが報告されている（「遺伝的表現形に基づく胎盤型アルカリ性ホスファターゼ分子の差異について」、佐藤松男、東京女子医科大学雑誌、60(8)、p.609-619、1990）。
　そこで、PSAの糖鎖も、患者の背景にある国や地域、人種により多様性があることが予測された。そして、この糖鎖多様性がPSAの測定及びPcaの判定に影響を及ぼすことが懸念された。
　そこで、日本人以外のサンプルを用い、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を指標として判定する公知の判定方法（WO2014/057983：特許文献３）と、本発明の遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を指標とした判定方法を実施し、その結果を比較検討した。
（１）試料
カナダSt. Joseph's Healthcare HamiltonのDr. Pinthusラボから提供された、非日本人であって、トータルPSA値が20.0 ng/mL以下である、Pca患者29名及び非癌者（前立腺癌ではないと判定された者。BPH患者を含む）10名から採取した血清を試料として用いた。
　試料のPSA値（トータルPSA値）等を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
（２）PSAの分離測定及び比率の決定（実施例１０）
　上記（１）の試料を用い、実施例４（１)と同様の方法で泳動用試料Ａを調製した。
　次いで、上記で調製した泳動用試料Ａを用いる以外は、実施例１で使用したものと同様の泳動用試液、測定装置等を用い、実施例１と同様の方法で、マイクロチップキャピラリー電気泳動を行った。そして、実施例１と同様の方法で、各試料の、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を求めた。
（３）α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の測定（比較例６）
　上記（１）の試料を用い、特許文献３の実施例２に記載の方法と同様の方法を実施して、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量（蛍光強度（MFI））を測定した。
（４）結果
　結果を図１８に示す。図１８において、図１８（１）は、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率（α(2,3)PSA ratio）を、Pca患者（Pca）と非癌者（non-Pca）間で比較した結果（実施例１０）を示す。図１８（２）は、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量（蛍光強度（MFI））を、Pca患者（Pca）と非癌者（non-Pca）間で比較した結果（比較例６）を示す。
　図１８(１)及び(２)において、箱ひげ図の箱の中の横線が各結果の中央値を示すのは常法通りである。
　Pca患者と非癌者間の有意差検定（Manwhiteney U-TEST）を行った結果、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率をPca患者と非癌者間で比較したP値は「0.0062」であった（実施例１０，図１８（１））。一方α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量をPca患者と非癌者間で比較したP値は「0.0818」であった（比較例６，図１８（２））。
　図１８（１）より明らかな通り、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率の、非癌者の該比率の中央値は40%未満（38%付近）であった。一方、Pca患者の該比率の中央値は40%よりはるかに高値（47%付近）であった。
　以上のことから、遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率＝40%をカットオフ値として用い、この値をもとにPcaの判定を行う本発明の判定方法は、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量をもとに判定を行う公知の方法よりも、精度の高いPcaの判定を行うことができることが判った。また、糖鎖多様性などの懸念材料が生じる事の予想される外国人試料を用いた場合でも、本発明の判定方法を行えば、精度の高いPcaの判定が行えることが判った。
　一方、図１８（２）より明らかな通り、α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量のカットオフ値「1130」を用いて判定を行った場合、非癌者のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量もPca患者のα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量もカットオフ値よりもはるかに高値となり、Pcaの正確な判定が行えないことがわかる。
実施例１１．表面プラズモン共鳴法による判定
マイクロチップ電気泳動とは異なる測定原理として、表面プラズモン共鳴（SPR）技術を利用し、その代表的な測定装置であるBIACORETM（GEバイオ）を用いたS2,3PSA含有比率測定を下記の方法で行った。
（１）測定機器等
測定機器： Biacore X (GE Healthcare UK Ltd.製)
チップ： Sensor Chip CM5 (GE Healthcare UK Ltd.製)
ランニングバッファー： HBS-EP バッファー（10mM HEPES, 0.15M NaCl, 3mM EDTA, 0.005 % Surfactant P 20, pH7.4, GE Healthcare UK Ltd.製）
（２）サンプル溶液
　実施例２で精製し、調製したr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA又はr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAが、それぞれ1000 ng/mL PSAタンパク質濃度となるように調製した。次いで、得られたr α(2, 6)糖鎖遊離型PSA溶液でr α(2, 3)糖鎖遊離型PSA溶液を希釈して、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSAを25%, 45%, 又は55%含有するサンプル溶液を得た。このr α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの含有率を「理論値」とする。
　なお、r α(2, 3)糖鎖遊離型PSA及びr α(2, 6)糖鎖遊離型PSAは、FLAGタグのペプチド配列を持つ。
（３）センサーチップへのLCA固定化
　アミンカップリングキット（GE Healthcare UK Ltd.製）を用いて、抗FLAGタグ抗体(ANTI-FLAG M2 Monoclonal Antibody,シグマ社製)をSensor Chip CM5（CMセンサーチップ、GE Healthcare UK Ltd.製）のセンサーチップ上に固定化した。
（４）表面プラズモン共鳴法の実施
　以下の測定は、Biacore X (GE Healthcare UK Ltd.製)を用いて行った。
　上記(２)で調製したサンプル溶液100μLを、温度20℃、流速10μL/min、結合時間10分間の条件でゆっくりと送液して、抗タグ（FLAG）抗体が固定化されているセンサーチップに流し、上記試料中に任意の比率で各々含まれるα(2, 3) 糖鎖遊離型PSAおよびα(2, 6)糖鎖遊離型PSAと抗FLAGタグ抗体との反応を行った。送液直後から、シグナル（共鳴角のシフト）を経時的に測定した。
　次いで、MAAを15mg/mL含有するHBS-EP バッファーを、温度20℃、流速30μL/min、結合時間 2分間の条件でゆっくりと送液して、抗FLAGタグFLAG抗体を介してα(2, 3) 糖鎖遊離型PSAおよびα(2, 6)糖鎖遊離型PSAが任意の比率で固定化されているセンサーチップに流し、センサーチップ上のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAが有する標的糖鎖とMAAとの相互作用を検定した。送液直後から、シグナル（共鳴角のシフト）を経時的に測定した。
　次いでHBS-EPバッファーのみを、180秒間（解離時間）送液した。
　得られた測定結果を、ビアコア専用解析ソフトであるBIAevaluation(Version4.1) を用いて解析して、センサーグラムを得た。
（５）結果
　得られたセンサーグラムを図１９に示す。
　図１９において、横軸は時間（s (秒)）、縦軸は、シグナルの強度（RU, Resonance Unit）を示す。
　また、図１９において(１)はα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを55%含有する試料を用いて得られた結果を、(２)はα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを45%含有する試料を用いて得られた結果を、(３)はα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを２５％含有する試料を用いて得られた結果をそれぞれ示す。
　図１９より、本発明における非癌に相当する正常範囲（25%）のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する試料を用いて得られたセンサーグラムに対し、本発明の判定方法に係るカットオフ値（40%）を上回る「45％」ならびに「55%」のα(2, 3)糖鎖遊離型PSAを含有する試料を用いて得られたセンサ－グラムでは、有意にレスポンスが高くなった。以上のことから、表面プラズモン共鳴法によっても、本発明のカットオフ値（Pcaの判定のカットオフ値40%、Pcaの悪性度判定のカットオフ値47%）を用いた判定方法が行えることが明らかになった。
　本発明のPcaの判定方法は、非侵襲的且つ簡便にPca及びその悪性度を、高い精度で判定（診断、検査）することが出来る。特に、従来判定が困難であったトータルPSA値がグレーゾーンにある患者において、Pcaであるか又その蓋然性が高いか否かを高い診断精度で、判定することが出来る。
　また、本発明のPcaの判定方法は、Pcaの悪性度を判定することができるので、本発明の判定方法により得られた判定結果は、その後のPcaの治療方針を設定する上で重要な指針となる。

Claims (13)

  1. 生体由来試料中の遊離型前立腺特異抗原（以下、前立腺特異抗原を「PSA」と記載する。）量に対する糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖を有する遊離型PSA（以下、「α(2, 3)糖鎖遊離型PSA」と記載する。）量の比率を決定し、その比率が40％又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、前立腺癌の判定方法。
  2. 生体由来試料中の遊離型PSA量及びα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定し、得られた遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率を決定し、その比率が40％又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定する、請求項１に記載の判定方法。
  3. 生体由来試料中のトータルPSA値が0を超える値～50 ng/mLである、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 生体由来試料中のトータルPSA値が4～10ng/mLである、請求項１又は２に記載の方法。
  5. α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有する物質（以下、「アフィニティ－物質」と記載する。）との相互作用を利用して測定する方法である、請求項２に記載の方法。
  6. α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と、アフィニティ－物質との相互作用を利用して測定する方法が、 α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と該アフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を決定する方法である、請求項５に記載の方法。
  7. α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と、アフィニティ－物質との相互作用を利用して測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖と該アフィニティ－物質との相互作用によりα(2, 3)糖鎖遊離型PSAと該アフィニティー物質との複合体を生成させた後、該複合体以外の成分を系内から除去せずに該複合体の量を測定し、その結果に基づいてα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を決定する方法である、請求項５に記載の方法。
  8. α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、α(2, 3)糖鎖遊離型PSAの捕捉効率が80%以上の測定方法である、請求項１，２又は５に記載の方法。
  9. アフィニティー物質がレクチンである、請求項５に記載の方法。
  10. レクチンが、糖鎖の末端シアル酸残基が糖鎖の末端から２番目のガラクトース残基にα(2, 3)結合した糖鎖に親和性を有するレクチンである、請求項９に記載の方法。
  11. レクチンがイヌエンジュレクチン（MAA）である、請求項９に記載の方法。
  12. 遊離型PSA量に対するα(2, 3)糖鎖遊離型PSA量の比率が40％又はそれより高い場合に前立腺癌であるかその蓋然性が高いと判定し、該比率が47％又はそれより高い場合に前立腺癌の悪性度が高い蓋然性が高いと判定する、請求項１又は２に記載の方法。
  13. α(2, 3)糖鎖遊離型PSA量を測定する方法が、キャピラリー電気泳動法、ビアコア法、質量分析法、又はレクチンマイクロアレイ法である、請求項２に記載の方法。
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