CN112136047A - 判断前列腺癌的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种能够以更高的活检避免率来判断前列腺癌的新型的判断方法。本发明的判断方法为确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与具有糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链的游离型前列腺特异抗原、即α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的方法。

Description

判断前列腺癌的方法
技术领域
本发明涉及一种新型的前列腺癌的判断方法。
背景技术
前列腺癌(prostate carcinoma)在欧美男性的恶性肿瘤中患有率最高，近年来日本患者数量也急剧增加。根据2015年的统计，前列腺癌超过胃癌成为日本男性患有率最高的癌症。
前列腺特异抗原(prostate specific antigen，以下，称之为“PSA”)是在前列腺产生的前列腺特异性的、分子量约3万的糖蛋白质的一种，具有天冬酰胺结合型(N型)糖链。患有前列腺癌后血液中的PSA值会升高，因而PSA值被认为是判断前列腺癌的最重要的肿瘤标志物(非专利文献1)。
血液中PSA大部分以与α1-抗胰凝乳蛋白酶或α2-巨球蛋白等结合蛋白结合形成复合物的结合型PSA形式存在(以下，简称为“结合型PSA”)。并且，一部分PSA以没有形成复合物的游离型形式存在(以下，简称为“游离型PSA”)。
现在普遍使用的前列腺癌的诊断方法是以血清中的PSA总量(即，游离型PSA和结合型PSA的合计量，以下，简称为“总PSA值”)作为指标的方法。总PSA值的基准值(正常值)低于4ng/mL，患有前列腺癌后血清中的总PSA值上升。
然而，已知总PSA值在患有良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia)或前列腺炎等前列腺癌以外的前列腺疾病时也会升高。并且，总PSA值在4.1～10ng/mL的范围被称为所谓的灰色地带(gray zone)。就总PSA值处于灰色地带的患者而言，难以用总PSA值来鉴别前列腺癌与良性前列腺增生。
鉴于此，以总PSA值作为指标的检查的结果为，对于该数值高的患者及处于灰色地带的患者需要鉴别患有了前列腺癌、还是患有了其他疾病(良性前列腺增生等)的问题。通常，需要进行超声波检查、乃至组织检查(活检)，但基于活检的结果时常会判断为不是前列腺癌。即，出现了本来无须进行活检的患者也进行活检的过度检查的情况，且活检伴有感染的风险，患者的身体上、经济上的负担加大。
因此，为了提高诊断的特异性、避免不必要的活检，目前尝试了使用各种指标的附加诊断。例如，以游离型PSA/总PSA的比值作为指标的诊断中，游离型PSA/总PSA的比值有在前列腺癌降低、在良性前列腺增生增高的倾向(非专利文献3)。并且，前列腺具有任何疾病(前列腺癌、良性前列腺增生等)时，前列腺体积会增大。因此，就组合了前列腺体积与PSA相关值的指标的诊断而言，如以PSA密度(PSA density,PSAD,PSA量/前列腺体积)作为指标的诊断成为用于判断前列腺癌的一个选项。这也是基于PSA密度越高，患有前列腺癌的可能性越高的假定。
进而，已知前列腺癌患者的PCA3基因(prostate cancer gene 3)高水平表达，因而有检测从患者收集的尿液中的PCA3 RNA的PCA3检查法。针对总PSA检查出现异常、活检的结果为阴性的患者，PCA3检查法为用于监测患有前列腺疾病的可能性的日常诊疗中普遍采用的方法。
并且，目前也在进行采用如组合了总PSA、游离型PSA及p2PSA(PSA前体)的前列腺健康指数(Prostate Health Index,PHI)指标的前列腺癌的诊断，该PHI指标用“p2PSA/freePSA×PSA0.5”来计算。PHI为25以上时，即便总PSA值在基准值以下也判断为需要活检。并且，目前已明确在前列腺癌患者的血清中，糖链的末端唾液酸残基利用α(2,3)键结合半乳糖的PSA多于利用α(2,6)键结合半乳糖的PSA的问题(非专利文献2)。
大山等人发现相对于试样中的游离型PSA量，具有糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链的游离型PSA量的比率可以作为判断是否患有前列腺癌的指标。再者，还发现该比率为40％或更高时可以判断为患有前列腺癌或其可能性高，该比率为47％或更高时可以判断为前列腺癌的恶性等级高，并基于这些进行了专利申请(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2017/130578号公报
非专利文献
非专利文献1：Stamey T.A.et al.,N.Engl.J.Med.,1987,vol.317,pp.909-916
非专利文献2：Tajiri M.,Ohyama C.,Wada Y.,Glycobiolgy,2008,vol.18,pp.2-8
非专利文献3：Suzuki H.et al.,Urology,2006,vol.67,No.1,pp.131-136
发明内容
发明要解决的问题
然而，上述任意一种判断方法都难以使患者避免不必要的活检的概率(活检避免率)提高。因此，为了得到前列腺癌的确切诊断，现状还是需要针对患者进行过度的检查。
鉴于上述的状况，本发明的目的是提供能够以更高的活检避免率来判断前列腺癌的新型判断方法。
解决问题的方法
以下，将“前列腺特异抗原”简写为“PSA”。
为了解决上述问题，本发明人进行了潜心研究，结果发现“受试者的前列腺体积”与“源自相同受试者的试样中的游离型PSA量与具有糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链的游离型PSA量的比率”的比率可以用作为判断是否患有前列腺癌的指标，且进一步潜心研究的结果发现将该比率用作为指标进行判断时会提高活检避免率，从而完成了本发明。
即，本发明的构成如下。
1)一种判断前列腺癌的方法，其特征在于，确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与具有糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链的游离型前列腺特异抗原、即α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌。
2)上述1)所述的判断前列腺癌的方法，其中，测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法为使α(2,3)糖链游离型PSA与对于糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链具有亲和性的物质、即α(2,3)糖链亲和性物质反应，生成α(2,3)糖链游离型PSA与该α(2,3)糖链亲和性物质的复合物后，测定该复合物的量，基于得到的测定结果来求出α(2,3)糖链游离型PSA量的方法。
3)上述2)所述的判断前列腺癌的方法，其中，α(2,3)糖链亲和性物质是凝集素。
4)上述3)所述的判断前列腺癌的方法，其中，凝集素是怀槐凝集素。
5)一种获取用于判断前列腺癌的数据的方法，其特征在于，确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2。
6)一种判断前列腺癌的方法，其特征在于，求出源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量，使该源自受试者的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质反应来生成α(2,3)糖链游离型PSA与该α(2,3)糖链亲和性物质的复合物后，测定该复合物的量，基于得到的测定结果求出α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌。
7)一种判断前列腺癌的方法，其特征在于，求出源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量，使该源自受试者的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA与对于糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链具有亲和性的凝集素反应来生成α(2,3)糖链游离型PSA与该凝集素的复合物后，测定该复合物的量，基于得到的测定结果求出α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌。
8)一种判断前列腺癌的方法，其特征在于，求出源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量，使该源自受试者的试样中的α(2,3)糖链游离型PSA与怀槐凝集素反应来生成α(2,3)糖链游离型PSA与怀槐凝集素的复合物后，测定该复合物的量，基于得到的测定结果求出α(2,3)糖链游离型PSA量，确定得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌。
9)一种前列腺癌判断用试剂盒，其特征在于，试剂盒包含
i)α(2,3)糖链亲和性物质，
ii)记载了确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的判断顺序的使用说明书。
此外，本发明的判断前列腺癌的方法也可以用作为辅助医师等的诊断的方法。
发明的效果
本发明的判断前列腺癌的方法能够以高的活检避免率来判断前列腺癌，可以减少需要活检的受试者的数量。换言之，能够以高的概率避免对于没有前列腺癌的患者的不必要的活检。
附图说明
图1为糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链的一个例子的示意图。
图2为实施例1的DNA标记抗PSA抗体的配制方法的示意图。
图3为实施例1中使用的微芯片的示意图。
图4为实施例1中使用的微芯片的芯片内流路的示意图。
图5为基于实施例1的测定结果得到的ROC解析的结果。
具体实施方式
<关于本发明的PSA>
本发明的“结合型PSA”是指通常被称作为“结合型PSA”的PSA。即，本发明的“结合型PSA”是指“与α1-抗胰凝乳蛋白酶或α2-巨球蛋白等结合蛋白结合后形成了复合物的PSA”。
本发明的“游离型PSA”是指通常被称作为“游离型PSA”的PSA。即，本发明的“游离型PSA”是指“没有与α1-抗胰凝乳蛋白酶或α2-巨球蛋白等结合蛋白结合的PSA”。
本发明的“糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链”是指糖链的末端(非还原末端)为Siaα2→3Gal结构的糖链(以下，亦简称为“α(2,3)糖链”)，作为末端唾液酸残基，如可以是N-乙酰神经氨酸。
本发明的“α(2,3)糖链”具体是指以下的结构。
Figure BDA0002779403990000061
下述式(1)示出了本发明的具有“α(2,3)糖链”的PSA的糖链结构的一个例子。
Figure BDA0002779403990000062
图1示意性地示出了具有式(I)的糖链的PSA的一个例子。图1中，糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基上。且图1中，糖链结合在PSA蛋白质的异亮氨酸-精氨酸-天冬酰胺-赖氨酸(IRNK)的氨基酸序列的天冬酰胺残基(N)上。
本发明的具有α(2,3)糖链的PSA出现在前列腺癌患者的血清中(非专利文献2)。本发明的“具有α(2,3)糖链的游离型PSA”为游离型PSA，是指具有α(2,3)糖链的PSA。以下，简称为“α(2,3)糖链游离型PSA”。
<判断前列腺癌的方法>
本发明的判断前列腺癌的方法为“确定源自受试者的试样中的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的方法”。本发明的判断前列腺癌的方法可以用作为辅助医师等的诊断的方法。
一、源自受试者的试样
作为本发明的源自受试者的试样(以下，称之为“被检测试样”或简称为“试样”)为源自受试者、即源自人的试样，例如，可以列举血液、血浆、血清、精液、膀胱冲洗物、尿液、组织提取液、前列腺组织切片、前列腺组织活检试样等，或由这些配制而成的试样等。其中，优选血清、血浆等，特别优选血清。
二、确定比率1的方法
本发明的比率1是指源自受试者的试样中的“游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率”。以下，说明比率1的测定“游离型PSA量”的方法及测定“α(2,3)糖链游离型PSA量”的方法。
1)测定游离型PSA量的方法
本发明的游离型PSA量是指试样中的游离型PSA的总量。也可以由α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的和求得。本发明的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA是指不具有α(2,3)糖链的游离型PSA。
作为本发明的测定试样中的游离型PSA量的方法，可以列举1-1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法，或1-2)测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由这些量的和求出游离型PSA量的方法。
1-1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法
作为直接测定游离型PSA量的方法，例如，可以列举已知的测定游离型PSA量的方法。例如，可以列举采用与游离型PSA特异性结合的抗体的已知的免疫学测定方法等。
本发明的抗PSA抗体为对于PSA具有亲和性的抗体。具体地说，为对于PSA的核心蛋白具有亲和性的抗体。即，本发明的抗PSA抗体包括与游离型PSA和结合型PSA可结合的抗体、及与游离型PSA特异性结合的抗体(抗游离型PSA抗体)。抗PSA抗体为与游离型PSA特异性结合的抗体时，记载为“抗游离型PSA抗体”。并且，抗PSA抗体包括与游离型PSA和结合型PSA可结合的抗体及抗游离型PSA抗体时，简单记载为“抗PSA抗体”。此外，本说明书中提到的“具有亲和性”是指“结合”。
本发明的抗PSA抗体具有上述的性质即可，可以是市售品或通过常规方法适宜配制的抗体，并可以是单克隆抗体或多克隆抗体。并且，抗体可以单独或适宜组合来进行使用等。本发明的抗PSA抗体为单克隆抗体时，对于其来源没有特殊的限定，可以使用市售品、或利用细胞融合技术或基因重组技术等已知方法(Eur.J immunol,6,511,1976)等制备的具有上述性质的单克隆抗体。本发明的抗PSA抗体为多克隆抗体时，对于其来源没有特殊的限定，例如，可以列举源自兔子、小鼠、大鼠、羊、山羊、马等的具有上述性质的多克隆抗体。并且，可以使用市售品、或利用“免疫学实验入门第2版，松桥直等，(株)学会出版中心，1981年”等记载的方法获得的多克隆抗体。
并且，本发明的抗PSA抗体也可以是抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键结合的Fv(sdFv)、VL、VH、双特异抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三特异抗体(三价抗体)、四特异抗体(四价抗体)、微小抗体((scFV-CH3)2)、IgG-delta-CH2、scFv-Fc、(scFv)2-Fc片段等。
本发明的抗PSA抗体中，作为与游离型PSA和结合型PSA可结合的抗体的市售品，例如，可以列举抗PSA单克隆抗体PSA10(抗PSA单克隆抗体克隆编号PSA10，和光纯药工业(株))、抗PSA单克隆抗体(5A6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(5G6)(HyTest公司)，抗PSA单克隆抗体(PS6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(PSA14)(和光纯药工业(株))、抗前列腺特异抗原抗体(EP1588Y)(Abcam公司)，抗前列腺特异抗原抗体(A67-B/E3)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(35H9)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(KLK3/801)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(3E6)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(8301)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(A5D5)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(PSA28/A4)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(1H12)(Abcam公司)等。
本发明的抗PSA抗体中，作为抗游离型PSA抗体的市售品，例如，可以列举抗PSA单克隆抗体PSA12(抗PSA单克隆抗体克隆编号PSA12，和光纯药工业(株))、抗PSA单克隆抗体(8A6)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(PS1)(HyTest公司)、抗PSA单克隆抗体(克隆108)(Anogen公司)、抗前列腺特异抗原抗体(PS2)(Abcam公司)、抗前列腺特异抗原抗体(2H9)(Abcam公司)等。
本发明的抗PSA抗体可以用可检测的标记物进行标记。作为用于标记该抗体的标记物，可以列举本领域通常使用的全部标记物，例如，可以列举碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、过氧化物酶、微过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、6-磷酸葡萄糖葡萄糖脱氢酶、乙酰胆碱酯酶、苹果酸脱氢酶、荧光素酶等酶，99mTc、131I、125I、14C、3H、32P、35S等放射性同位素，HiLyte 647(AhaSpec公司制)、荧光素、丹磺酰基、荧光胺、香豆素、萘胺、荧光素异硫氰酸酯(FITC)、若丹明、若丹明X异硫氰酸酯、硫羟胺101、荧光素黄、吖啶、吖啶异硫氰酸酯、核黄素或这些的衍生物等荧光物质，荧光素、异羟甲酚、鲁米诺、双(2,4,6-三氟苯基)草酸酯等发光物质，苯酚、萘酚、蒽或这些的衍生物等吸收紫外线的物质，4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基、3-氨基-2,2,5,5-四甲基吡咯烷-1-氧基、2,6-二叔丁基-α-(3,5-二叔丁基-4-氧代-2,5-环己二烯-1-基)-对甲苯基氧基等以具有氧基的化合物为代表的具有自旋标记物性质的物质，并且，还可以列举HiLyte Fluor 647、HiLyte Fluor 488、HiLyte Fluor 555、Fluor680、HiLyte Fluor 750等HiLyte类色素(均为HiLyte Bioscience公司的商品名)，AlexaFluor Dye 350、Alexa Fluor Dye 430、Alexa Fluor Dye 488、Alexa Fluor Dye 532、Alexa Fluor Dye 546、Alexa Fluor Dye 555、Alexa Fluor Dye 568、Alexa Fluor Dye594、Alexa Fluor Dye 633、Alexa Fluor Dye 647、Alexa Fluor Dye 660、Alexa FluorDye 680、Alexa Fluor Dye 700、Alexa Fluor Dye 750等Alexa类色素(均为MolecularProbes公司的商品名)，Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy7等CyDye类色素(均为AmershamBiosciences公司的商品名)，及考马斯亮蓝R250、甲基橙等色素等。
作为将上述标记物结合在抗PSA抗体的方法，例如，可以列举已知的EIA、RIA或FIA等中通常使用的已知标记方法(例如，医学化学实验讲座第8卷、山村雄一主编第1版、中山书店、1971年，图说荧光抗体、川生明著第1版、(株)软科学公司、1983年，酶免疫测定法、石川英治、河合忠、室孔洁编著第2版、医学书院、1982年等)等。并且，也可以使用通过亲和素(或链霉亲和素)与生物素反应的常规方法将标记物结合在抗体的方法。本发明中，可以适宜采用这些标记方法。
作为本发明的直接测定试样中的游离型PSA量的方法的具体例子，可以列举以下的方法。
方法i
使试样与用可检测的标记物标记的抗游离型PSA抗体反应，生成标记抗游离型PSA抗体与游离型PSA的复合物。其次，测定源自构成该复合物的标记抗游离型PSA抗体的标记物的信号，从而测定该复合物的量。基于得到的测定值，通过常规方法求出试样中的游离型PSA量。测定该复合物的量前，可以适宜进行去除未与游离型PSA结合的标记抗游离型PSA抗体的操作。
方法ii
使试样与作为抗PSA抗体的第一抗体、用可检测抗PSA抗体的标记物标记的标记第二抗体反应，生成第一抗体、游离型PSA及标记第二抗体的复合物。其次，测定源自构成该复合物的标记第二抗体的标记物的信号，从而测定该复合物的量。基于得到的测定值，通过常规方法求出试样中的游离型PSA量。测定该复合物的量前，可以适宜进行去除未与游离型PSA结合的第一抗体及标记第二抗体的操作。
上述方法ii中，第一抗体和第二抗体中至少一个是抗游离型PSA抗体。并且，优选第一抗体和第二抗体的表位不同。
上述方法i及方法ii中，游离型PSA量可以通过利用用预先已知浓度的游离型PSA标准品进行相同的测定得到的结果的、常规方法的定量值换算法求出。即，用浓度已知的游离型PSA，用与测定试样中的游离型PSA量时相同的试剂进行相同的操作来测定信号。绘制得到的测定值与所使用的游离型PSA标准品的浓度的标准曲线。通过将用试样测定得到的信号测定值与该标准曲线进行匹配，求出该试样中的游离型PSA量。
上述方法ii中使用的第一抗体优选固定在固定相。固定在固定相的第一抗体优选为抗游离型PSA抗体。采用固定在固定相的抗体时，可以利用已知的B/F分离法来分离未与游离型PSA结合的标记第二抗体。
作为该固定相，例如，可以列举通常的免疫学测定方法等中使用的不溶性载体。具体地说，例如，可以列举聚苯乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸缩水甘油酯、聚氯乙烯、聚乙烯、聚氯碳酸酯、有机硅树脂和有机硅橡胶等合成高分子化合物，以及多孔玻璃、磨砂玻璃、陶瓷、氧化铝、硅胶、活性炭、金属氧化物等无机物等。并且，这些不溶性载体能够以微量滴定板、珠子、微管、多个微管一体成形的专用托盘、圆盘状片、微粒(乳胶颗粒)等各种形式来使用。
就在上述不溶性载体上固定抗PSA抗体的方法而言，通过使抗PSA抗体与不溶性载体接触来进行即可，没有特殊的限定。例如，典型的为本领域通常使用的已知固定方法(例如，所谓的物理吸附法)。并且，采用市售的不溶性载体时，可以依据使用说明书推荐的固定方法在不溶性载体上固定抗PSA抗体。
就测定源自上述标记抗PSA抗体的标记物的信号的方法而言，因标记物的种类不同而有所不同，可以根据标记物具有的并利用某种方法可检测的性质，依据各自指定的方法来实施。例如，标记物为酶时，可以依据免疫测定法的常规方法如“酶免疫测定法”(蛋白质核酸酶别册No.31，北川常广、南原利夫、辻章夫、石川荣治编撰，51～63页，共立出版(株)，1987年)等记载的方法进行测定，标记物为放射性物质时，例如，可以按照采用RIA进行的常规方法，依据该放射性物质释放的放射线的种类及强度来适宜选用浸没型GM计数器、液体闪烁计数器、阱型闪烁计数器、HPLC计数器等测定设备进行测定(例如，参见“医学化学实验讲座”第8卷，山村雄一监修第1版，中山书店，1971年等)。并且，标记物为荧光物质时，可以按照采用荧光光度计等测定设备及FIA进行的常规方法如根据“图说荧光抗体，川生明著第1版，(株)软科学公司，1983年”等记载的方法进行测定，标记物为发光物质时，可以按照采用光计数器等测定设备的常规方法如“酶免疫测定法”(蛋白质核酸酶别册No.31，北川常广、南原利夫、辻章夫、石川荣治编撰，252～263页，共立出版(株)，1987年)等记载的方法进行测定。进而，标记物为吸收紫外线的物质时，可以按照采用分光光度计等测定设备的常规方法进行测定，标记物具有自旋的性质时，可以按照采用电子自旋共振装置的常规方法如“酶免疫测定法”(蛋白质核酸酶别册No.31，北川常广、南原利夫、辻章夫、石川荣治编撰，264～271页，共立出版(株)，1987年)等记载的方法分别进行测定。
游离型PSA量可以利用市售的游离型PSA测定用试剂盒进行测定。作为这种试剂盒，例如，可以列举Human Circulating Cancer BioMarker Panel 1分选试剂盒(LUMINEX公司制等)、Free PSA Abbott(雅培公司制)、Lumipulse Free PSA(Fujirebio公司制)、Vitros Free PSA(奥森多临床诊断公司制)、ST AIA-PACK free PSA(东曹公司制)、EclusisTM试剂free PSA(罗氏诊断公司制)等。
上述1-1)的方法中，可以使用本身已知的免疫学测定方法等该领域通常使用的分离测定装置、各种试剂等。就测定使用的抗PSA抗体及试剂类的使用浓度而言，可以在该领域通常使用的浓度范围内适宜选择。并且，本发明的用于标记抗PSA抗体的标记物可以基于该标记物的测定方法或测定装置等来适宜设定。并且，固定相的种类可以依据采用的测定装置和实施的测定方法来适宜选择。实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以按照本身已知的方法来适宜选择。
此外，上述1-1)的方法不局限于手工方法，也可以采用使用自动分析装置的测定系统，从而可以轻松且迅速地进行测定。此外，对于用手工方法或自动分析装置进行测定时的试剂类等的组合等也没有特殊的限定，基于采用的自动分析装置的环境、机种或考虑其他因素可以适宜选择被认为最佳的试剂类等的组合。并且，上述1-1)的方法中，更优选方法ii的作为第一抗体使用与不溶性载体结合的抗游离型PSA抗体的方法。
1-2)测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由该量的和求出游离型PSA量的方法
作为上述的方法，例如，可以列举使用对于α(2,3)糖链具有亲和性的物质(以下，简称为“α(2,3)糖链亲和性物质”)的方法或质量分析法等，优选使用α(2,3)糖链亲和性物质的方法。
以下，说明“用α(2,3)糖链亲和性物质测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由该量的和求出游离型PSA量的方法”。此外，质量分析法的细节在以下“3)测定比率1的方法”项的最后进行说明。
α(2,3)糖链亲和性物质
上述方法使用的本发明的α(2,3)糖链亲和性物质是指对于α(2,3)糖链具有亲和性的物质，优选对于α(2,3)糖链具有亲和性，且对于其他的糖链(例如，糖链的末端唾液酸残基经由α(2,6)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的α(2,6)糖链)没有亲和性的α(2,3)糖链特异性物质。并且，作为本发明的α(2,3)糖链亲和性物质，例如，可以列举具有这种性质的凝集素或抗体，其中优选凝集素。以下，更为详细地说明作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素及抗体。
α(2,3)糖链亲和性物质：凝集素
就本发明的用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素而言，可以列举对于α(2,3)糖链具有亲和性的凝集素，优选对于α(2,3)糖链具有亲和性，且对于其他的糖链没有亲和性的α(2,3)糖链特异性凝集素。作为具有这种性质的凝集素，例如，可以列举源自怀槐(Maackia amurensis)的凝集素MAA、源自茶树菇(Agrocybe cylindracea)的凝集素ACG等植物凝集素，CD169(结合唾液酸的Ig样凝集素1)、小鼠MAG、CD328、siglec-9(结合唾液酸的免疫球蛋白样凝集素9)等动物凝集素，其中优选MAA。并且，凝集素可以用可检测的标记物进行标记。
作为用于标记凝集素的标记物，例如，可以列举荧光色素(异硫氰酸酯荧光素(FITC)、Cy5、Alexa Fluor 647等)、酶(源自西洋辣根的过氧化物酶)、辅酶、化学发光物质、放射性物质(32P、14C、125I、3H、131I等)、生物素等标记物。并且，标记物可以直接与凝集素结合或经由适宜的连接子结合。凝集素可以用与标记物的种类相匹配的本身已知的标记方法进行标记。
α(2,3)糖链亲和性物质：抗体
就本发明的用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体而言，例如，可以列举对于α(2,3)糖链具有亲和性的抗体。优选对于α(2,3)糖链具有特异性的亲和性的抗体，最优对于α(2,3)糖链具有亲和性，且对于其他的糖链(例如，α(2,6)糖链等)没有亲和性的抗体。
对于本发明的用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体的种类没有特殊的限定，可以是上述的具有α(2,3)糖链亲和性物质性质的抗体，可以是市售品或用常规方法适宜配制。并且，可以是单克隆抗体或多克隆抗体，这些抗体可以单独使用或适宜组合后使用。
用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体为单克隆抗体时，对于其来源没有特殊的限定，可以使用市售品、或利用细胞融合技术或基因重组技术等的本身已知的方法(Eur.Jimmunol,6,511,1976)等制造的上述具有α(2,3)糖链亲和性物质性质的单克隆抗体。用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体为多克隆抗体时，对于其来源没有特殊的限定，例如，可以列举源自兔子、小鼠、大鼠、羊、山羊、马等的上述具有α(2,3)糖链亲和性物质性质的多克隆抗体。并且，可以使用市售品、或通过“免疫学实验入门第2版，松桥直等，(株)学会出版中心，1981”等记载的方法获得的多克隆抗体。
就用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体而言，可以是抗体的Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、Fd、单链Fv(scFv)、二硫键结合的Fv(sdFv)、VL、VH、双特异抗体((VL-VH)2或(VH-VL)2)、三特异抗体(三价抗体)、四特异抗体(四价抗体)、微小抗体((scFV-CH3)2)、IgG-delta-CH2、scFv-Fc、(scFv)2-Fc片段等。
就本发明的用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体的市售品而言，例如，可以列举抗Siaα2-3单克隆抗体(HYB4，和光纯药工业(株)制)、抗GM3(Neu Ac)单克隆抗体(克隆编号M2590，和光纯药工业(株)制)、抗唾液酸Lea抗原单克隆抗体(MSW113，和光纯药工业(株)制)、抗GM3单克隆抗体(东京化成工业(株)制)、抗唾液酸路易斯A单克隆抗体(1H4，东京化成工业(株)制)、抗唾液酸路易斯A单克隆抗体(NKH3，GLYCONEX公司制)等。
并且，本发明的用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体可以用可检测的标记物进行标记。就本发明的用于标记用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体的标记物的例子及其结合方法而言，例如，可以列举与上述“1-1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法”项中记载的用于标记抗PSA抗体的标记物及其抗体的结合方法相同的方法。
作为“1-2)用α(2,3)糖链亲和性物质，测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由该和求出游离型PSA量的方法”，例如，可以列举1-2-1)用α(2,3)糖链亲和性物质，分别测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由这些的和求出游离型PSA量的方法，及1-2-2)用α(2,3)糖链亲和性物质，在一个步骤分别测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由这些的和求出游离型PSA量的方法。
1-2-1)用α(2,3)糖链亲和性物质，分别测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由这些的和求出游离型PSA量的方法
作为该方法，例如，可以列举“使试样与α(2,3)糖链亲和性物质反应，生成α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物。其次，分离该复合物与含有没有与α(2,3)糖链亲和性物质结合的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的溶液。测定分离的该复合物中的游离型PSA量，求出α(2,3)糖链游离型PSA量。并且，测定分离的溶液中的游离型PSA量，求出α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量。求出得到的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的和，得到游离型PSA量”的方法。
作为该1-2-1)的方法中使用的α(2,3)糖链亲和性物质，例如，可以列举上述本发明的α(2,3)糖链亲和性物质，其中，优选用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素或用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体，更优选用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素。作为1-2-1)的方法，例如，可以列举下述方法1及方法2，其中优选方法2。
方法1
试样注入到填充有将α(2,3)糖链亲和性物质固定在琼脂糖珠子等固定相的填料的色谱柱中，α(2,3)糖链游离型PSA与填料上的α(2,3)糖链亲和性物质结合，α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA不与α(2,3)糖链亲和性物质结合，从色谱柱上脱离。因此，测定洗脱液中的游离型PSA量即可以得到“α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”。其次，用适宜的缓冲液洗涤色谱柱后，将色谱柱体积约2～5倍的含乳糖缓冲液(0.4M)注入到该色谱柱，从而洗脱α(2,3)糖链游离型PSA。测定洗脱液中的游离型PSA量，得到“α(2,3)糖链游离型PSA量”。
上述方法1中，测定α(2,3)糖链游离型PSA量及α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量时，可以采用与上述“1-1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法”项中记载的方法相同的方法。求出得到的“α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”与“α(2,3)糖链游离型PSA量”的和，得到“游离型PSA量”。
方法2
使试样与固定有α(2,3)糖链亲和性物质的微量滴定板或聚苯乙烯珠子等固定相接触。α(2,3)糖链游离型PSA与固定相上的α(2,3)糖链亲和性物质结合，α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA不与α(2,3)糖链亲和性物质结合，存在于液相中。分离固定相与液相，测定液相中的游离型PSA量，得到“α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”。其次，测定与固定相结合的游离型PSA量，得到α(2,3)糖链游离型PSA量。
上述方法2中，液相中的α(2,3)糖链游离型PSA以外的PSA量的测定可以采用与上述1-1)项中记载的方法相同的方法。并且，上述方法2中，与固定相结合的α(2,3)糖链游离型PSA量可以用以下的方法测定。
使与固定相结合的α(2,3)糖链游离型PSA与标记抗游离型PSA抗体反应，在固定相上形成α(2,3)糖链游离型PSA与标记抗游离型PSA抗体的复合物。其次，测定源自构成该复合物的标记抗游离型PSA抗体的标记物的信号，从而测定该复合物的量。基于用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行相同的测定得到的结果，可以进行常规的定量值换算来求出α(2,3)糖链游离型PSA。
这里，就本发明使用的α(2,3)糖链游离型PSA标准品的制作方法而言，例如，可以列举Yoneyama T.et al.,Biochem Biophys Res Commun.2014vol.448,No.4,pp.390-396记载的方法。具体地说，按照该文献的“2.Materials and methods(2.7Forced expressionof FLAG-tag-fusedα(2,3)PSA)”公开的方法，获得重组游离型PSA(以下，称之为“r游离型PSA”)。获得的r游离型PSA含有重组α(2,3)糖链游离型PSA(以下，称之为“rα(2,3)糖链游离型PSA”)和重组α(2,6)糖链游离型PSA(以下，称之为“rα(2,6)糖链游离型PSA”)。此外，α(2,6)糖链游离型PSA是指“具有α(2,6)糖链的PSA”。
利用已知的方法，从获得的r游离型PSA中分离纯化rα(2,3)糖链游离型PSA与rα(2,6)糖链游离型PSA。例如，首先通过采用对于唾液基α2,3-半乳糖结构具有高亲和性的凝集素的凝集素柱色谱法，分离rα(2,3)糖链游离型PSA与rα(2,6)糖链游离型PSA。随后，进行凝胶过滤来分别纯化rα(2,3)糖链游离型PSA及rα(2,6)糖链游离型PSA。得到的纯化rα(2,3)糖链游离型PSA可以用作为“α(2,3)糖链游离型PSA标准品”。并且，基于需要，可以将得到的纯化rα(2,6)糖链游离型PSA用作为“α(2,6)糖链游离型PSA标准品”。
就用于标记上述方法2使用的抗游离型PSA抗体的标记物及该抗体的结合方法而言，可以列举与上述1-1)项中用于标记抗PSA抗体的标记物及其结合方法记载的相同的方法。就用标记抗游离型PSA抗体测定源自复合物的标记物的信号的方法而言，可以列举与上述1-1)项中记载的相同的方法。并且，作为上述方法1及方法2中的固定相的种类及在固定相上固定抗体的固定方法，可以列举与上述1-1)记载的相同的固定相及固定方法。
求出得到的“α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”与“α(2,3)糖链游离型PSA量”的和，得到“游离型PSA量”。
上述方法1及方法2中，可以使用本身已知的免疫学测定方法等的本领域使用的分离测定装置、各种试剂类等。测定时使用的α(2,3)糖链亲和性物质及固定相的种类依据使用的测定装置或实施的测定方法来适宜选择，且测定时使用的抗游离型PSA抗体及试剂类的使用浓度可以在该领域通常使用的浓度范围适宜选择。就用于标记抗游离型PSA抗体的标记物而言，基于该标记物的测定方法或测定装置等适宜选择。并且，实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以依据本身已知的方法适宜选择。
1-2-2)用α(2,3)糖链亲和性物质，在一个步骤分别测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，由这些的和求出游离型PSA量的方法
作为上述的方法，例如，可以列举“使试样与α(2,3)糖链亲和性物质、抗游离型PSA抗体反应，生成α(2,3)糖链亲和性物质、α(2,3)糖链游离型PSA与抗游离型PSA抗体的复合物(第1复合物)，及α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与抗游离型PSA抗体的复合物(第2复合物)。分离(鉴别)两种复合物后，通过测定第1复合物的量与第2复合物的量，在一个步骤分别测定α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA。求出得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，得到游离型PSA量”的方法。
作为上述1-2-2)方法中使用的α(2,3)糖链亲和性物质，例如，可以列举上述本发明的α(2,3)糖链亲和性物质，优选用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素或用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体，更优选用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素。
作为1-2-2)方法的具体例子，例如，可以列举利用下述方法3～方法8的工序的方法。下述方法3～方法8中，“基于亲和性的分离”是指将分离的对象“基于其结合强度的差异进行分离”。例如，“基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物与第2复合物”是指“基于第1复合物对于该α(2,3)糖链亲和性物质的结合强度和第2复合物对于该α(2,3)糖链亲和性物质的结合强度的差异，分离第1复合物与第2复合物”。
方法3
1)使试样、用标记物标记的标记抗游离型PSA抗体及α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成标记抗游离型PSA抗体、α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及标记抗游离型PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)上述1)的工序得到的第1复合物与第2复合物的工序，
3)通过测定源自构成第1复合物及第2复合物的标记抗游离型PSA抗体的标记物的信号，测定上述2)的工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量的工序，
4)求出上述3)的工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，将该和设为游离型PSA量的工序。
第1复合物和第2复合物可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性进行分离，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
方法4
1)使试样、抗PSA抗体用标记物标记的标记第一抗体、作为抗PSA抗体的第二抗体及α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)上述1)工序得到的第1复合物与第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物及第2复合物的标记第一抗体的标记物的信号，从而测定在上述2)工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量的工序，
4)求出在上述3)工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，将该和作为游离型PSA量的工序。
上述方法4中使用的第一抗体和第二抗体中至少一个是抗游离型PSA抗体。优选第一抗体与第二抗体的表位不同，更优选第一抗体是抗游离型PSA抗体。并且，可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
方法5
1)使试样、抗游离型PSA抗体用标记物标记的标记第一抗体、对于α(2,3)糖链具有亲和性的第二抗体(α(2,3)糖链亲和性物质1)及对于α(2,3)糖链具有亲和性的凝集素(α(2,3)糖链亲和性物质2)接触，形成标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体与凝集素的复合物(第1复合物)，及标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)上述1)工序得到的第1复合物与第2复合物工序，
3)测定源自构成第1复合物及第2复合物的标记第一抗体的标记物的信号，从而测定在上述2)工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量的工序，
4)求出在上述3)工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，将该和作为游离型PSA量的工序。
可以基于α(2,3)糖链亲和性物质1或α(2,3)糖链亲和性物质2对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
方法6
1)使试样、抗游离型PSA抗体及α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成抗游离型PSA抗体、α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及抗游离型PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定在上述2)工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量的工序，
4)求出在上述3)工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，将该和作为游离型PSA量的工序。
可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。并且，测定第1复合物的量和第2复合物的量时，例如，可以测定各复合物的PSA蛋白量。具体地说，用电泳分离第1复合物和第2复合物时，例如，可以列举用上述本发明的抗PSA抗体作为一次抗体、及用可测定的标记物标记的标记抗体作为二次抗体来实施已知的蛋白质印迹法，测定分离的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
方法7
1)使试样、作为抗PSA抗体的第一抗体、作为抗PSA抗体的第二抗体及α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体和α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA和第二抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定在上述2)工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量的工序，
4)求出在上述3)工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，将该和作为游离型PSA量的工序。
上述方法7中使用的第一抗体及第二抗体中至少一个是抗游离型PSA抗体，优选第一抗体和第二抗体的表位不同。并且，可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。测定第1复合物的量和第2复合物的量时，例如，可以测定各复合物的PSA蛋白量。具体地说，用电泳分离第1复合物和第2复合物时，例如，可以列举用上述本发明的抗PSA抗体作为一次抗体、及用可测定的标记物标记的标记抗体作为二次抗体来实施已知的蛋白质印迹法，测定分离的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
方法8
1)使试样、作为抗游离型PSA抗体的第一抗体、对于α(2,3)糖链具有亲和性的第二抗体(α(2,3)糖链亲和性物质1)、对于α(2,3)糖链具有亲和性的凝集素(α(2,3)糖链亲和性物质2)接触，形成第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体和凝集素的复合物(第1复合物)，及第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定在上述2)工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量的工序，
4)求出在上述3)工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和，将该和作为游离型PSA量的工序。
可以基于凝集素对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。并且，测定第1复合物的量和第2复合物的量时，例如，可以测定各复合物的PSA蛋白量。具体地说，用电泳分离第1复合物和第2复合物时，例如，可以列举用上述本发明的抗PSA抗体作为一次抗体、及用可测定的标记物标记的标记抗体作为二次抗体来实施已知的蛋白质印迹法，测定分离的各组分中的PSA蛋白量的方法等。
就用于标记上述方法1～方法8中使用的抗PSA抗体的标记物及该抗体的结合方法而言，与上述1-1)项记载的用于标记抗PSA抗体的标记物及结合方法相同。并且，就用标记抗PSA抗体测定源自复合物中的标记物的信号的方法而言，也与上述1-1)项记载的方法相同。
上述方法3～方法8中，抗PSA抗体及α(2,3)糖链亲和性物质也可以基于测定方法固定在固定相。并且，上述方法3～方法8中使用的固定相、使用的各抗体在该固定相的固定方法也与上述1-1)项记载的方法相同。
上述方法3～方法8中，可以使用本身已知的免疫学测定方法等本领域使用的分离测定装置、各种试剂类等。测定时使用的α(2,3)糖链亲和性物质及固定相的种类可以基于使用的装置、或实施的测定方法适宜选择。并且，测定时使用的抗PSA抗体及试剂类的使用浓度可以在本领域通常使用的浓度范围适宜选择。用于标记抗PSA抗体的标记物可以基于该标记物的测定方法或测定装置等适宜选择。并且，实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以基于本身已知的方法适宜选择。
作为“测定(1)游离型PSA量的方法”，优选1-2)的方法，更优选1-2-2)的方法。1-2-2)的方法中，优选方法3、方法4、方法6及方法7，更优选方法4。
2)测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法
作为该方法，可以列举2-1)直接测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量的方法，2-2)将从试样中的游离型PSA量减去α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量得到的值设为α(2,3)糖链游离型PSA量的方法。
2-1)直接测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量的方法
作为该方法，可以列举“使α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质反应，生成α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物后，测定该复合物的量，基于得到的测定结果来求出α(2,3)糖链游离型PSA量的方法”。
具体地说，例如，可以按照上述1-2-1)项记载的方法，分离α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA，测定α(2,3)糖链游离型量。此外，此时无需测定α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量。更具体地说，例如，可以列举下述方法1’及方法2’，其中优选方法2’。
方法1’
将试样注入到填充有将α(2,3)糖链亲和性物质固定在琼脂糖珠子等固定相的填料的色谱柱。α(2,3)糖链游离型PSA与填料上的α(2,3)糖链亲和性物质结合，α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA不与α(2,3)糖链亲和性物质结合，从色谱柱洗出。用适宜的缓冲液洗涤色谱柱后，将5倍色谱柱体积的含乳糖缓冲液(0.4M)注入到色谱柱来洗脱α(2,3)糖链游离型PSA。测定洗脱液中的游离型PSA量，得到“α(2,3)糖链游离型PSA量”。
上述方法1’中，α(2,3)糖链游离型PSA量的测定可以用与上述1-1)项记载的相同的方法进行。
方法2’
使试样与固定了α(2,3)糖链亲和性物质的微量滴定板或聚苯乙烯珠子等固定相接触，α(2,3)糖链游离型PSA与固定相上的α(2,3)糖链亲和性物质结合。分离固定相与液相，测定与固定相结合的游离型PSA量，得到α(2,3)糖链游离型PSA量。上述方法2’中，就与固定相结合的α(2,3)糖链游离型PSA量而言，例如，可以用以下的方法测定。
使与固定相结合的α(2,3)糖链游离型PSA与标记抗游离型PSA抗体反应，在固定相上形成α(2,3)糖链游离型PSA与标记抗游离型PSA抗体的复合物。其次，测定源自构成该复合物的标记抗游离型PSA抗体的标记物的信号，从而测定该复合物的量。可以进行利用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行相同测定得到的结果的、常规方法的定量值换算来求出α(2,3)糖链游离型PSA。
就用于标记上述方法2’中使用的标记抗游离型PSA抗体的标记物及该抗体的结合方法而言，可以列举与上述1-1)项记载的用于标记抗PSA抗体的标记物及其结合方法相同的标记物及其结合方法。并且，就用标记抗游离型PSA抗体测定源自复合物的标记物的信号的方法而言，可以列举与上述1-1)项记载的相同的方法。
作为上述方法1’及方法2’中使用的固定相的种类及使用的各抗体在该固定相的固定方法的例子，可以列举上述1-1)项记载的相同的种类和固定方法。并且，上述方法1’及方法2’中，可以使用本身已知的免疫学测定方法等本领域使用的分离测定装置、各种试剂类等。测定中使用的α(2,3)糖链亲和性物质及固定相的种类可以基于使用的测定装置或实施的测定方法适宜选择。测定中使用的抗游离型PSA抗体及试剂类的使用浓度可以在本领域通常使用的浓度范围适宜选择。用于标记抗游离型PSA抗体的标记物可以基于该标记物的测定方法或测定装置等适宜选择。并且，实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以基于本身已知的方法适宜选择。
并且，也可以按照采用标记物标记的α(2,3)糖链亲和性物质的下述方法9～方法11的方法直接测定α(2,3)糖链游离型PSA量。作为下述方法9～方法11的方法中使用的α(2,3)糖链亲和性物质，可以列举上述本发明的α(2,3)糖链亲和性物质。其中，优选用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素或用作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体，更优选用作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素。
方法9
1)使试样、对于用标记物标记的α(2,3)糖链具有亲和性的标记第一抗体(α(2,3)糖链亲和性物质1)、作为抗游离型PSA抗体的第二抗体和对于α(2,3)糖链具有亲和性的凝集素(α(2,3)糖链亲和性物质2)接触，形成标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体和凝集素的复合物(第1复合物)，及α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA和第二抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)基于需要，分离上述1)得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物的标记第一抗体的标记物的信号，从而测定第1复合物的量，基于该测定值求出α(2,3)糖链游离型PSA量的工序。
可以基于α(2,3)糖链亲和性物质1或α(2,3)糖链亲和性物质2对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。上述方法9中，就α(2,3)糖链游离型PSA量而言，可以通过采用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行相同测定得到的结果的、常规方法的定量值换算求出。
方法10
1)使试样、用标记物标记的标记α(2,3)糖链亲和性物质和抗游离型PSA抗体接触，形成标记α(2,3)糖链亲和性物质、α(2,3)糖链游离型PSA与抗游离型PSA抗体的复合物(第1复合物)，及α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与抗游离型PSA抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)基于需要，分离上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物的标记α(2,3)糖链亲和性物质的标记物的信号，从而测定第1复合物的量，基于该测定值求出α(2,3)糖链游离型PSA量的工序。
可以基于第一抗体对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物与第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。上述方法10中，就α(2,3)糖链游离型PSA量而言，可以通过使用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行相同测定得到的结果的、常规方法的定量值换算求出。
方法11
1)使试样、用标记物标记的标记α(2,3)糖链亲和性物质、作为抗PSA抗体的第一抗体与作为抗PSA抗体的第二抗体接触，形成标记α(2,3)糖链亲和性物质、α(2,3)糖链游离型PSA、第一抗体与第二抗体的复合物(第1复合物)，及α(2,3)糖链游离型PSA以外游离型PSA、第一抗体与第二抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)基于需要，分离上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物的标记α(2,3)糖链亲和性物质的标记物的信号，从而测定第1复合物的量，基于该测定值求出α(2,3)糖链游离型PSA量的工序。
上述方法11中使用的第一抗体及第二抗体中至少一个为抗游离型PSA抗体，优选第一抗体和第二抗体的表位不同。并且，可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。上述方法11中，就α(2,3)糖链游离型PSA量而言，可以通过利用使用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行相同测定得到的结果的、常规方法的定量值换算求出。
上述方法9～方法11中使用的α(2,3)糖链亲和性物质为抗体时，就用于标记该抗体的标记物及该抗体的结合方法而言，可以列举与上述1-1)项记载的用于标记抗PSA抗体的标记物及其结合方法相同的标记物及结合方法。并且，就用标记抗PSA抗体测定源自复合物的标记物的信号的方法而言，可以列举与上述1-1)项记载的相同的方法。并且，上述方法9～方法11中使用的α(2,3)糖链亲和性物质为凝集素时，就用于标记该凝集素的标记物及其在该凝集素的结合方法而言，可以列举与上述1-2)项的“α(2,3)糖链亲和性物质：凝集素”项记载的相同的标记物及结合方法。并且，就用该标记凝集素测定源自复合物中的标记物的信号的方法而言，可以依据上述1-1)项记载的方法并基于使用的标记物的种类适宜选择优选的方法。
上述方法9～方法11中，抗PSA抗体或α(2,3)糖链亲和性物质可以基于实施的测定方法固定在固定相上。作为上述方法9～方法11中使用的固定相、使用的各抗体在该固定相的固定方法的例子，可以列举与上述1-1)项记载的相同的固定相和固定方法。并且，作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体在该固定相的固定方法的例子，可以列举上述1-1)项记载的相同的固定方法。就作为α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素在该固定相的固定而言，可以利用本领域通常使用的本身已知的固定方法进行。
上述方法9～方法11中，可以使用本身已知的免疫学测定方法等本领域使用的分离测定装置、各种试剂类等。测定中使用的α(2,3)糖链亲和性物质及固定相的种类可以基于使用的测定装置或实施的测定方法适宜选择。测定中使用的抗PSA抗体及试剂类的使用浓度可以在本领域通常使用的浓度范围适宜选择。用于标记α(2,3)糖链亲和性物质的标记物可以基于该标记物的测定方法或测定装置等适宜选择。并且，实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以基于本身已知的方法适宜选择。
进而，利用上述1-2-2)的测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法等也可以测定α(2,3)糖链游离型PSA量。即，可以按照上述1-2-2)项记载的方法分离α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA，测定α(2,3)糖链游离型PSA量。此时，无需测定α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，且无需求出α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的和。
具体地说，例如，可以列举以下的方法。
方法3’
1)使试样、用标记物标记的标记抗游离型PSA抗体和α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成标记抗游离型PSA抗体、α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及标记抗游离型PSA抗体和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物与第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物的标记抗游离型PSA抗体的标记物的信号，从而测定在上述2)工序分离的第1复合物的量的工序。
可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
方法4’
1)使试样、用标记物标记抗PSA抗体的标记第一抗体、作为抗PSA抗体的第二抗体和α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物与第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物的标记第一抗体的标记物的信号，从而测定在上述2)工序分离的第1复合物的量的工序。
上述方法4’中使用的第一抗体与第二抗体中至少一个为抗游离型PSA抗体，优选第一抗体为抗游离型PSA抗体。并且，可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
方法5’
1)使试样、用标记物标记抗游离型PSA抗体的标记第一抗体、对于α(2,3)糖链具有亲和性的第二抗体(α(2,3)糖链亲和性物质1)、对于糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链具有亲和性的凝集素(α(2,3)糖链亲和性物质2)接触，形成标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体和凝集素的复合物(第1复合物)，及标记第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定源自构成第1复合物的标记第一抗体的标记物的信号，从而测定在上述2)工序分离的第1复合物的量的工序。
可以基于α(2,3)糖链亲和性物质1或α(2,3)糖链亲和性物质2对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
方法6’
1)使试样、抗游离型PSA抗体及α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成抗游离型PSA抗体、α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及抗游离型PSA抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定在上述2)工序分离的第1复合物的量的工序。
可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。测定第1复合物的量时，例如，可以测定第1复合物的PSA蛋白量。具体地说，用电泳分离第1复合物和第2复合物时，例如，可以列举将上述本发明的抗PSA抗体作为一次抗体，将用可测定的标记物标记的标记抗体用作为二次抗体来实施已知的蛋白质印迹法，测定分离的第1复合物组分中的PSA蛋白量的方法等。
方法7’
1)使试样、作为抗PSA抗体的第一抗体、作为抗PSA抗体的第二抗体和α(2,3)糖链亲和性物质接触，形成第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物(第1复合物)，及第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA与第二抗体的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定在上述2)工序分离的第1复合物的量的工序。
上述方法7’中使用的第一抗体及第二抗体中至少一个为抗游离型PSA抗体，优选第一抗体和第二抗体的表位不同。并且，可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。测定第1复合物的量时，例如，可以测定第1复合物的PSA蛋白量。具体地说，用电泳分离第1复合物和第2复合物时，例如，可以列举将上述本发明的抗PSA抗体作为一次抗体，将用可测定的标记物标记的标记抗体作为二次抗体来实施已知的蛋白质印迹法，测定分离的第1复合物组分中的PSA蛋白量的方法等。
方法8’
1)使试样、作为抗游离型PSA抗体的第一抗体、对于α(2,3)糖链具有亲和性的第二抗体(α(2,3)糖链亲和性物质1)和对于α(2,3)糖链具有亲和性的凝集素(α(2,3)糖链亲和性物质2)接触，形成第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体与凝集素的复合物(第1复合物)，及第一抗体与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的复合物(第2复合物)的工序，
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物和第2复合物的工序，
3)测定在上述2)工序分离的第1复合物的量的工序。
可以基于凝集素对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。测定第1复合物的量时，例如，可以测定第1复合物的PSA蛋白量。具体地说，用电泳分离第1复合物和第2复合物时，例如，可以列举将上述本发明的抗PSA抗体作为一次抗体，将用可测定的标记物标记的标记抗体作为二次抗体来实施已知的蛋白质印迹法，测定分离的第1复合物组分中的PSA蛋白量的方法等。
就用于标记上述方法3’～方法8’中使用的抗PSA抗体的标记物及在该抗体的结合方法而言，可以与上述1-1)项记载的用于标记抗PSA抗体的标记物及其结合方法相同。并且，就用标记抗PSA抗体测定源自复合物中的标记物的信号的方法而言，可以与上述1-1)项记载的方法相同。上述方法3’～方法8’中，抗PSA抗体、抗游离型PSA抗体及α(2,3)糖链亲和性物质可以基于测定方法固定在固定相上。并且，作为上述方法3’～方法8’中使用的固定相、使用的各抗体在该固定相的固定方法的例子，可以列举与上述1-1)项记载的相同的固定相和固定方法。
上述方法3’～方法8’中，可以使用本身已知的免疫学测定方法等本领域使用的分离测定装置、各种试剂类等。测定中使用的α(2,3)糖链亲和性物质及固定相的种类根据使用的测定装置或实施的测定方法适宜选择。测定中使用的抗PSA抗体及试剂的使用浓度可以在本领域通常使用的浓度范围适宜选择。并且，用于标记抗PSA抗体的标记物可以基于该标记物的测定方法或测定装置等适宜选择。并且，实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)可以基于本身已知的方法适宜选择。
2-2)将从试样中的游离型PSA量减去α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量得到的值设为α(2,3)糖链游离型PSA量的方法
2-2)的方法中，“游离型PSA量”可以依据上述的“1)测定游离型PSA量的方法”项记载的方法求出。并且，2-2)的方法中，就“α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”而言，可以采用“使试样与α(2,3)糖链亲和性物质反应，生成α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的复合物。其次，分离含有该复合物和没有与α(2,3)糖链亲和性物质结合的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的溶液，测定分离的溶液中的游离型PSA量，求出α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”的方法。
即，可以按照上述1-2-1)或1-2-2)项记载的方法分离α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA，随后测定分离的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量。此时，无需测定α(2,3)糖链游离型PSA量。
具体地说，例如，按照上述1-2)项记载的方法1～方法8的方法分离α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA。其次，测定分离的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的量。进而，从另行测定的相同试样中的游离型PSA量中减去得到的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量，求出α(2,3)糖链游离型PSA量。上述2-2)的方法中，作为α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的测定方法，优选只测定通过上述方法3、方法4、方法6或方法7的方法分离的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法，更优选只测定通过方法4的方法分离的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的方法。
作为“测定(2)α(2,3)糖链游离型PSA量的方法”，优选2-1)的方法。2-1)的方法中，优选方法3’、方法4’、方法6’、方法7’、方法10’及方法11’，更优选方法4’及方法10’，特别优选方法4’。
此外，本发明中，实施使用α(2,3)糖链亲和性物质的测定方法时，测定α(2,3)糖链游离型PSA量时使用的α(2,3)糖链亲和性物质的量必须是足以测定试样中的80％以上α(2,3)糖链游离型PSA的量。作为这种α(2,3)糖链亲和性物质的用量，例如，可以基于α(2,3)糖链亲和性物质对于α(2,3)糖链游离型PSA的结合常数和试样中的α(2,3)糖链游离型PSA的量来确定。例如，在采用对于α(2,3)糖链游离型PSA的亲和性强、结合α(2,3)糖链游离型PSA后不再解离的α(2,3)糖链亲和性物质的情形，测定时使用足够量的α(2,3)糖链亲和性物质，从而使试样中的80％以上的α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质形成复合物。例如，在采用对于α(2,3)糖链游离型PSA的亲和性不强、结合α(2,3)糖链游离型PSA后会再解离的α(2,3)糖链亲和性物质的情形，测定时也需要使用足够量的α(2,3)糖链亲和性物质，从而即便出现再解离也可以使试样中的80％以上α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质形成复合物。
作为满足以上条件的α(2,3)糖链亲和性物质的量，优选α(2,3)糖链亲和性物质相对于试样中的α(2,3)糖链游离型PSA为过量(饱和量)。
3)比率1的测定方法
作为确定本发明的比率1的方法，例如，可以列举“测定试样中的游离型PSA量及α(2,3)糖链游离型PSA量，计算并确定得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率的方法”。即，本发明的比率1为“游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率”。以下，亦简称为“比率1”。
作为比率1，可以列举a)α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)，或b)游离型PSA量相对于α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(游离型PSA量/α(2,3)糖链游离型PSA量)。优选将上述a)的比率、即“α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)”用作为比率1。
作为上述方法中使用的游离型PSA量的测定方法，可以列举上述“二、确定比率1的方法”的“1)测定游离型PSA量的方法”项记载的方法。作为上述方法中使用的α(2,3)糖链游离型PSA量的测定方法，可以列举上述“二、确定比率1的方法”的“2)测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法”项记载的方法。并且，作为求得比率1的具体方法的例子，例如，可以列举以下的方法A及方法B。
方法A：用上述方法1’、方法2’、方法9、方法10及方法11中任意一个方法测定α(2,3)糖链游离型PSA量。此外，用上述“1)测定游离型PSA量的方法”项记载的方法测定游离型PSA量。求出得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率，从而确定比率1。
作为方法A的比率1，可以列举α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量、或游离型PSA量/α(2,3)糖链游离型PSA量，其中，优选将α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量设为比率1。
就方法A而言，优选用1-1)项记载的方法测定游离型PSA量，用方法10或方法11测定α(2,3)糖链游离型PSA量，更优选用1-1)项记载的方法测定游离型PSA量，用方法10测定α(2,3)糖链游离型PSA量。
方法B：用上述方法3’～方法8’中任意一个方法测定游离型PSA量。求出得到的α(2,3)糖链游离型PSA量与用上述方法3～方法8中任意一个方法得到的“α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的和”的比率，从而确定比率1。
作为方法B的比率1，可以列举α(2,3)糖链游离型PSA量/(α(2,3)糖链游离型PSA量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量)、或(α(2,3)糖链游离型PSA量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量)/α(2,3)糖链游离型PSA量，其中，优选将α(2,3)糖链游离型PSA量/(α(2,3)糖链游离型PSA量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量)设为比率1。
就得到比率1的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的测定而言，优选用方法3及方法3’、方法4及方法4’、方法5及方法5’、方法6及方法6’、方法7及方法7’、以及方法8及方法8’中任意一个方法进行。其中，更优选用方法3及方法3’、方法4及方法4’、方法6及方法6’、以及方法7及方法7’中任意一个方法进行测定，进一步优选用方法4及方法4’进行测定。
特别优选用上述方法4及方法4’]的方法在一个步骤中分离、测定游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量两者，随后求出α(2,3)糖链游离型PSA量与“α(2,3)糖链游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的和”的比率，从而确定比率1的方法。该方法中，特别优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/(α(2,3)糖链游离型PSA量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量)”设为比率1的方法。
此外，本发明在求出游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)时，也可以不采用游离型PSA量、α(2,3)糖链游离型PSA量、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量的绝对量(PSA蛋白质量)。可以将测定的实测值(荧光强度、吸光度等的信号值、峰面积或峰高等)用作为游离型PSA量及α(2,3)糖链游离型PSA量，进而求出比率1。作为该实测值，优选面积。例如，上述1-2-2)或2)的方法中，在用后述的毛细管电泳法分离(鉴别)α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA时，可以求出各分离组分的峰面积，将“α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积”与“α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积”的比率设为比率1。
例如，可以将“α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)]”、或“(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)/α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积”设为比率1，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)”设为比率1。
并且，在分离(鉴别)α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA，两者分别用荧光标记抗PSA抗体进行检测的情形，例如，也可以将用“α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的荧光量)”、或“(α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的荧光量)/α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量”求出的比率设为比率1。其中，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的荧光量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的荧光量)”用作为比率1。
作为确定比率1的方法的一个实施方式，可以列举用凝集素作为α(2,3)糖链亲和性物质，用方法4及方法4’的方法测定游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量，从而确定比率1的方法。以下，详细说明该方法。
1)使试样、用标记物标记抗PSA抗体的标记第一抗体、作为抗PSA抗体的第二抗体、对于糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链具有亲和性的凝集素(α(2,3)糖链亲和性物质)接触，形成标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA、第二抗体和凝集素的复合物(第1复合物)，及标记第一抗体、α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA和第二抗体的复合物(第2复合物)。
2)分离(鉴别)在上述1)工序得到的第1复合物与第2复合物。
3)测定源自构成该第1复合物及第2复合物的标记第一抗体的标记物的信号，从而测定在上述2)工序分离的第1复合物的量及第2复合物的量。
4)求出在上述3)工序得到的第1复合物的量与第2复合物的量的和(游离型PSA量)，求出该和与在上述3)工序得到的第1复合物的量的比率，从而确定游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1。
第一抗体和第二抗体中至少一个为抗游离型PSA抗体，且第一抗体优选为抗游离型PSA抗体。可以基于凝集素对于α(2,3)糖链的亲和性分离第1复合物和第2复合物，也可以基于第1复合物与第2复合物的质量、电荷、尺寸等的差异进行分离(例如，电泳等)。
并且，在上述4)的工序得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1优选为“第1复合物的量/(第1复合物的量+第2复合物的量)]＝α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量”。
上述采用α(2,3)糖链亲和性物质的测定中，分离(鉴别)与α(2,3)糖链亲和性物质结合的α(2,3)糖链游离型PS、与没有与α(2,3)糖链亲和性物质结合的α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的工序可以通过毛细管电泳、表面等离子共振法，凝集素微阵列、免疫学测定方法来实施。其中，优选毛细管电泳、表面等离子共振法或免疫学测定方法，更优选毛细管电泳法。
以下，说明在上述的各方法用α(2,3)糖链亲和性物质测定α(2,3)糖链游离型PSA及游离型PSA量，进而确定比率1的方法的具体例子。
<毛细管电泳>
就用毛细管电泳求出α(2,3)糖链游离型PSA量，确定游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)的方法而言，例如，首先使含有PSA的试样与用标记物标记本发明的抗游离型PSA抗体的标记抗游离型PSA抗体接触反应，将得到的反应液中的“标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA”复合物与“标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA”复合物在α(2,3)糖链亲和性物质的存在下实施毛细管电泳来进行分离，测定源自“标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA”(第1复合物)的标记物的量、及源自“标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA”(第2复合物)的标记物的量。试样中的游离型PSA量为第1复合物与第2复合物的标记物的量的和。随后，求出得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率。
源自第1复合物的标记物的量及源自第2复合物的标记物的量对应于用毛细管电泳得到的各自的峰面积值，因而可以用各自的峰面积值求出该比率。
作为上述方法中使用的抗游离型PSA抗体及其标记物的具体例子，如上所述。作为使试样与标记抗游离型PSA抗体反应时的溶剂，例如，可以列举缓冲液。这些缓冲液为通常在该领域使用的即可，对于这些缓冲液没有特殊的限定，可以列举通常在pH5.0～10.0、优选在pH6.5～8.5的中性附近具有缓冲作用的缓冲液。具体地说，例如，可以列举Tris-HCl缓冲液、MES缓冲液、HEPES缓冲液、硼酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、佛罗那缓冲液、古德氏缓冲液等。并且，作为这些缓冲液的缓冲剂浓度，通常在5～1000mM、优选在5～300mM的范围适宜选择。
该缓冲液中还可以具有增敏剂、表面活性剂、防腐剂(例如，叠氮化钠、水杨酸、苯甲酸等)、稳定剂(例如，白蛋白、球蛋白、水溶性明胶、表面活性剂、糖类等)、活化剂、以及其他在本领域使用且不阻碍共存试剂的稳定性、抗原抗体反应的添加剂。并且，这些试剂等的浓度范围等可以适宜选用本身已知的该测定方法中通常使用的浓度范围等。在采用毛细管电泳装置专用的市售试剂盒的情形，也可以使用该试剂盒附带的缓冲液。
就含有标记抗游离型PSA抗体的溶液中的该抗体的浓度而言，为混合试样与含有标记抗游离型PSA抗体的溶液后形成目的浓度范围内的即可。例如，可以为0.1～200μM，优选0.5～50μM，更优选0.5～20μM，进一步优选0.5～10μM。即，下限值为0.1μM，优选0.5μM，且上限值为200μM，优选50μM，更优选20μM，进一步优选10μM。
就使试样与本发明的标记抗游离型PSA抗体接触反应时的本发明的标记抗游离型PSA抗体在反应液中的浓度而言，因试样中的PSA浓度不同而有所不同，没有特殊的限定，通常为0.1～1000nM，优选0.1～500nM，更优选0.5～200nM。即，下限值为0.1nM，优选0.5nM，且上限值是1000nM，优选500nM，更优选200nM。
并且，作为试样与本发明的标记抗游离型PSA抗体反应时的pH，在不抑制抗原抗体反应的范围即可，没有特殊的限定，通常为6.0～10.0，优选6.0～8.0的范围，反应时的温度在不抑制抗原抗体反应的范围即可，没有特殊的限定，通常为10～50℃，优选20～40℃的范围。并且，反应时间基于使用的本发明的抗体及pH和温度等反应条件而有所不同，可以基于不同的条件反应1～60分钟，优选反应1～15分钟程度。
反应后，得到的反应液中的第1复合物和第2复合物在α(2,3)糖链亲和性物质的存在下用实施毛细管电泳进行分离，从而测定第1复合物和第2复合物的量。
本发明中，毛细管电泳优选实施用毛细管芯片或微毛细管芯片进行的电泳。微芯片毛细管电泳是指在芯片基板上形成截面的直径100μm以下的毛细管，在该毛细管中进行电泳的技术，为通过将电压施加在毛细管内，将样本内存在的物质的电荷差作为其迁移率的差来进行分离的方法。基于使用的电泳液，毛细管电泳分为毛细管区带电泳和毛细管凝胶电泳，这些方法均适用于本发明。考虑到分离的精度，其中优选毛细管凝胶电泳。作为毛细管电泳中使用的电泳液，可以是该领域通常使用的电泳液，没有特殊的限定。
α(2,3)糖链亲和性物质可以包含在电泳液中。但在用毛细管电泳进行分离的过程中，α(2,3)糖链亲和性物质优选与α(2,3)糖链游离型PSA和该α(2,3)糖链亲和性物质可完全结合的量相比为高浓度。例如，α(2,3)糖链亲和性物质为凝集素时，为0.1mg/mL～20mg/mL，优选1.0mg/mL～10mg/mL，更优选2.0mg/mL～5.0mg/mL。α(2,3)糖链亲和性物质为抗体时，为0.01mg/mL～20mg/mL，优选0.05mg/mL～10mg/mL，更优选0.1mg/mL～5.0mg/mL。α(2,3)糖链亲和性物质在微流路内的浓度可以为0.1mg/mL～20mg/mL的范围。
在用毛细管电泳分离复合物的情形，无论是用凝集素或抗体作为α(2,3)糖链亲和性物质，抗PSA抗体、作为α(2,3)糖链亲和性物质的抗体等测定体系使用的任意一种抗体均优选用阴离子性物质等的带电载体分子进行标记。具体地说，优选用核酸链进行标记。此时，抗体也可以用带电载体分子和上述检测相关的标记物两者进行标记。并且，也可以采用用检测相关的标记物标记的抗游离型PSA抗体及用带电载体分子标记的抗PSA抗体。
作为用于这种目的的核酸链的种类、长度及核酸链与抗体结合的方法，例如，可以列举专利第4214779号、专利第4862093号等公开的已知方法。并且，也可以在核酸链预先导入反应性官能团后，基于专利第4214779号记载的方法使本发明的抗体与反应性官能团导入核酸链结合。作为在核酸链导入反应性官能团的方法，例如，可以列举本身已知的方法。并且，作为使核酸链与抗体结合的方法，例如，可以通过用在5’末端引入了反应性官能团的PCR引物进行PCR，作为PCR产物得到在5’末端引入了反应性官能团的核酸链的方法(“分子克隆实验指南”第2版，J.萨姆布鲁克等编撰，冷泉港实验室出版等)等在核酸末端引入反应性官能团。
就溶解用于毛细管电泳的试样或抗体等的溶液、电泳液的种类、添加剂、毛细管电泳的具体条件而言，可以参照本身已知的方法。例如，在采用毛细管电泳的情形，可以依据J.Chromatogr.593 253-258(1992)、Anal.Chem.641926-1932(1992)、WO2007/027495、专利第4214779号等记载的方法来进行。在用自动分析装置进行毛细管电泳的情形，可以在该装置附带的操作说明书记载的条件，依据该操作说明书记载的方法实施毛细管电泳。
作为采用毛细管电泳的α(2,3)糖链游离型PSA测定方法的具体例子，可以列举用MAA作为α(2,3)糖链亲和性物质、用抗游离型PSA抗体用荧光物质标记的标记第一抗体及用将抗PSA抗体用DNA标记的第二抗体进行利用凝集素亲和性的微芯片毛细管电泳，基于凝集素对于PSA糖链的的亲和性程度分离PSA，用荧光检测器进行测定的方法。以下，说明该方法。
即，使含有PSA的试样1～50μL与含有通常为0.001～10μM、优选0.01～1μM的荧光标记抗游离型PSA抗体的试液反应。毛细管电泳中使用的试样可以为采自生体的试样、或将采自生体的试样进行脱盐或各种纯化工序来配制得到的试样。
得到的反应液、含有通常为0.001～10μM，优选0.01～1μM的DNA标记抗PSA抗体的试液2～50μL、电泳缓冲液及内部标准物(例如，AnaSpec公司制HiLyte647等荧光物质)在1～10psi加压30～60秒，导入到内径5～500μm、优选50～200μm、更优选50～100μm的长度1～10cm的毛细管。在20～40℃反应5秒～30分钟，优选反应10秒～15分钟。得到的“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物和“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物在MAA(0.1mg/mL～20mg/mL)的存在下施加10秒～60分钟、1000～5000V的电压来进行电泳和分离。随后，用荧光检测器或UV检测器等检测器测定复合物的泳动状态来得到电泳谱图。
可以基于其泳动位置来区別α(2,3)糖链游离型PSA的峰(含有荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体的复合物)与其他游离型PSA的峰(含有荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体的复合物)。此时，试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量为其峰的峰面积。并且，将得到的α(2,3)糖链游离型PSA的峰面积与α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA的峰面积的和作为游离PSA量。
如上所述，采用毛细管电泳时，可以用同一检体一次性地测定游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA量。比率1可以基于得到的峰面积的比率、即“α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)”或“(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)/α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积”来求出。其中，更优选将“α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积/(α(2,3)糖链游离型PSA组分的峰面积+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA组分的峰面积)”用作为比率1。
毛细管电泳可以采用市售的全自动测定仪进行，例如，可以列举和光纯药工业(株)制的Mutasu wako i30等。
<表面等离子共振法>
表面等离子共振法是利用表面等离子体在金属、液体界面激发时产生的、所谓表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance,SPR)的光学现象来解析生体分子间的相互作用的分子间相互作用解析系统。表面等离子共振法利用表面等离子共振光谱仪，将伴随两分子间的结合和解离在传感片表面生成的微量的质量变化作为SPR信号来进行检测。表面等离子共振法可以实时监控生体分子间的相互作用，得到生体分子间的结合、解离快慢的动力学信息。
作为表面等离子共振法的代表性分析系统，可以列举BiacoreTM法。通常，将Biacore法简称为Biacore，且“Biacore”有时也指代Biacore分析系统使用的Biacore设备。并且，表面等离子共振法的测定可以参照附带的操作说明书，在该测定的最适宜条件进行。作为用表面等离子共振法来确定比率1的方法，例如，可以列举以下的方法。
即，在传感片的表面固定抗游离型PSA抗体。从传感片的背面照射检测光使之在传感片的金薄膜与玻璃的界面产生全反射，一部分反射光出现反射强度下降的部分。产生该光的暗部的角度取决于传感片表面的溶剂的折射率。其次，使试样经由表面等离子共振光谱仪的流路流到传感片的表面。在金薄膜表面固定的抗游离型PSA抗体与经流路流入的试样中含有的PSA分子结合后，在金薄膜表面固定的分子的质量增加，溶剂的折射率产生变化。此时，反射光的暗部基于质量的变化产生位移。与此相反，分子彼此解离时，暗部自位移的位置返回。其位移的角度表示传感片表面的质量变化。表面等离子共振法基于该角度变化来监测分子间的结合与解离。基于得到的结果，首先可以测定试样中的游离型PSA量。
其次，使含有α(2,3)糖链亲和性物质的溶液经由表面等离子共振光谱仪的流路流到传感片的表面。在金薄膜表面形成的复合物、即“抗PSA游离型抗体-游离型PSA”的PSA与经流路流入的α(2,3)糖链亲和性物质结合后，溶剂的折射率产生变化，由此来监测分子间的结合和解离。基于得到的结果，可以测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量。确定得到的试样中的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)。此时，更优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量”用作为比率1。
作为用表面等离子共振法确定比率1的方法，例如，可以列举以下的方法。
即，使用用α(2,3)糖链游离型PSA标准品预先配制的、α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率已知的一种以上标准液进行表面等离子共振法的测定，得到各自的传感图谱。其次，用被检测试样进行相同的测定，得到传感图谱。比较用标准液得到的传感图谱与用被检测试样得到的传感图谱，确定被检测试样的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)。此时，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量”设为比率1。
就上述方法中使用的标准液而言，选用具有使α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率成为后续的前列腺癌判断时指标的数值的标准液。例如，可以选用该比率为25％、45％、50％的标准液。作为该标准液的配制方法，例如，可以列举以下的方法。
即，将α(2,3)糖链游离型PSA标准品与α(2,6)糖链游离型PSA标准品分别溶解在适宜的缓冲液中，进行调整来使各溶液的蛋白质量相同。其次，用α(2,6)糖链游离型PSA标准液稀释α(2,3)糖链游离型PSA标准液，并调整至目的比率，从而得到标准液。作为α(2,3)糖链游离型PSA标准品与α(2,6)糖链游离型PSA标准品的制作方法，如上述1-2-1)项所述。
<凝集素微阵列法>
产业技术综合研究所糖链医学工程研究中心等开发的凝集素微阵列法也可以用于本发明。凝集素微阵列是将不同糖链特异性的数十种凝集素在载玻片上呈点状排列固定的阵列。并且，倏逝场是指微弱的光从基板(载玻片)界面渗出的状态。使荧光标记的糖蛋白与凝集素微阵列相互作用后，将激发光照射在载玻片来生成消逝场。激发光到达的程度为自界面起100nm～200nm，与凝集素结合的糖链也在自界面起100nm～200nm的范围，由此可以只使与凝集素微阵列结合的糖链发光。该技术无需洗涤操作，可以检测凝集素微阵列的荧光。也可以使没有荧光标记的糖蛋白与凝集素微阵列相互作用，使针对糖蛋白的核心蛋白的抗体与荧光标记了的荧光抗体反应后，利用与上述相同的方法检测荧光。
作为利用凝集素微阵列的测定，例如，可以按照MICROARRAY METHODS ANDPROTOCOLS(CRC Press),edited by Robert S.Matson,“Chapter 9：LectinMicroarrays”,Masao Yamada,p.141,2009记载的方案来实施。并且，作为用凝集素微阵列法求出α(2,3)糖链游离型PSA量、确定游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)的方法，例如，可以列举以下的方法。
制作固定了作为本发明的α(2,3)糖链亲和性物质的凝集素和对于α(2,3)糖链以外的PSA糖链具有亲和性的多个凝集素的微阵列。就目的微阵列而言，例如，可以按照KunoA.et al.,Nat Methods.2005Nov,vol.2,No.11,pp.851-856记载的方法制作，也可以使用市售的微阵列(Glyco Technica公司制的LecChipTM)等。
将基于需要进行了前处理的试样与荧光标记抗游离型PSA抗体滴在微阵列上并使之反应，在微阵列上形成“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-凝集素”的复合物。其次，用倏逝波激发荧光扫描仪测定源自荧光标记抗游离型PSA抗体的荧光。用已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行相同的测定，基于得到的测定值进行定量值换算，从而求出试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量。
确定其他方式求出的游离型PSA的量与微阵列法测定的α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)。此时，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量”用作为比率1。作为游离型PSA的量的测定方法，如在以上“1)测定游离型PSA量的方法”所述。
<免疫学测定方法>
作为用通常的免疫学测定方法求出α(2,3)糖链游离型PSA量、确定游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)的方法，例如，可以列举以下的方法a及方法b。
方法a
将α(2,3)糖链亲和性物质固定在固定相。使试样与该固定相接触并反应。洗涤处理固定相后，使抗游离型PSA抗体用可检测的标记物标记的标记抗游离型PSA抗体与固定相接触并反应，在固定相上形成α(2,3)糖链亲和性物质、α(2,3)糖链游离型PSA和标记抗游离型PSA抗体的复合物。通过洗涤等去除未反应的标记抗游离型PSA抗体后，用与标记抗游离型PSA抗体的标记物相匹配的测定方法测定标记物的量。在得到的测定结果的基础上，进行基于用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行测定得到的结果的常规方法的定量值换算，求出α(2,3)糖链游离型PSA量。此外，利用测定上述试样中的游离型PSA量的方法，求出相同试样中的游离型PSA量。求出得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)。此时，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量”设为比率1。
方法b
将抗游离型PSA抗体固定在固定相。使试样与该固定相接触并反应。洗涤处理固定相后，使α(2,3)糖链亲和性物质用可检测的标记物标记的标记α(2,3)糖链亲和性物质与固定相接触并反应，在固定相上形成抗游离型PSA抗体、α(2,3)糖链游离型PSA和标记α(2,3)糖链亲和性物质的复合物。通过洗涤等去除未反应的标记α(2,3)糖链亲和性物质后，用与标记α(2,3)糖链亲和性物质的标记物相匹配的方法测定标记物。在得到的测定结果的基础上，进行基于用预先已知浓度的α(2,3)糖链游离型PSA标准品进行测定得到的结果的常规方法的定量值换算，求出α(2,3)糖链游离型PSA量。此外，利用测定上述试样中的游离型PSA量的方法，求出相同试样中的游离型PSA量。求出得到的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率(比率1)。此时，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量”设为比率1。
上述免疫学测定方法中，就用作为固定相的不溶性载体及游离型PSA抗体、该抗体在该不溶性载体的固定方法的例子而言，可以与上述“1-1)直接测定试样中的游离型PSA量的方法”项记载的相同。并且，测定中使用的各种试剂的种类及使用浓度、实施测定时的测定条件等(反应温度、反应时间、反应时的pH、测定波长、测定装置等)均可以依据本身已知的免疫学测定方法等的测定操作进行设定。并且，上述方法的标记物、固定相、抗游离型PSA抗体、标记物的测定方法及测定条件等与在以上说明的相同。
<质量分析法>
此外，作为求出本发明的比率1的其他方法，可以列举不采用α(2,3)糖链亲和性物质来测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法。例如，可以列举采用多级串联质谱仪、及高效液相色谱与质谱联用的质量分析方法。以下，说明利用质量分析法求得比率1的方法的一个例子。
首先，用固定了抗游离型PSA抗体的固定相，利用常规方法分离试样中的游离型PSA。其次，利用高效液相色谱与质谱联用的手段等解析分离的游离型PSA的糖链结构。该方法无需使用α(2,3)糖链亲和性物质，可以测定试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量及α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量。基于得到的测定值，求出α(2,3)糖链游离型PSA量与“α(2,3)糖链游离型PSA量和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量”的比率(比率1)。此时，优选将“α(2,3)糖链游离型PSA量/(α(2,3)糖链游离型PSA量+α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA量)”设为比率1。
三、前列腺体积的测定方法
就前列腺体积(prostate volume,PV)而言，可以用通常的超声波检查、核磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)检查等非侵袭方法进行测定，优选用超声波检查进行测定。对于超声波检查的方法没有特殊的限定，通常，可以采用将产生超声波的装置抵在下腹部、或经肛门插入的任意一种方法来进行。对于产生超声波的装置也没有特殊的限定，可以列举临床上经常使用的通用超声波图像诊断设备、超声波诊断装置等。
可以用包括本领域技术人员熟知的现有方法(基于H×W×L×0.52算式的TRUS检查等)在内的测定前列腺体积的任意方法测定前列腺体积。例如，超声波检查中绘制前列腺，测量前列腺的大小(体积)。通常，前列腺体积由超声波图像诊断设备附带的诊断软件自动算出。
四、确定比率2的方法
本发明的比率2是指用上述“二、确定比率1的方法”项记载的方法得到的比率1、与采集求出比率1的试样时同一受试者的前列腺体积的比率。即，比率2会有i)(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)/前列腺体积、ii)(游离型PSA量/α(2,3)糖链游离型PSA量)/前列腺体积、iii)前列腺体积/(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)、及iv)前列腺体积/(游离型PSA量/α(2,3)糖链游离型PSA量)的4种情形。其中，特别优选用i)求出的比率2。以下，说明比率1及比率2为下述情形的确定比率2(上述i)的情形)的方法的一个例子。
其中，比率1为α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量，比率2为比率1/前列腺体积。在比率1为40％、前列腺体积为50cm3时，比率2即为(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)/前列腺体积，得到的数值为0.80。
五、判断前列腺癌的方法
本发明的判断前列腺癌的方法为“确定源自受试者的试样中的游离型PSA量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的方法”。即，基于上述“四、确定比率2的方法”项记载的方法确定比率2。在该结果的基础上，得到将比率2用作为指标的判断前列腺癌的数据(例如，比率2值、比率2值与截点值的比较、比率2的增加程度等的信息)。
用得到的数据，进行前列腺癌的判断(诊断、检查)。以下，说明用上述i)(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)/前列腺体积作为比率2时的判断方法的例子。
用源自受试者的试样得到的该比率2与预先确定的截点值(基准值)相同或高时，可以作出提供试样的受试者患有前列腺癌(前列腺癌阳性)、或患有前列腺癌的可能性高等的判断。比率2低于截点值时，可以作出受试者没有患有前列腺癌(前列腺癌阴性)、或患有前列腺癌的可能性低等的判断。
并且，可以列举对应于该比率2的截点值或该值的范围设定多个判断区间来进行判断的方法。例如，设定“1)无前列腺风险、2)前列腺风险低、3)有前列腺征兆、4)前列腺风险高等”的判断区间。再者，通过判断源自受试者的试样的比率2值落入哪一个判断区间，可以进行前列腺癌的判断。并且，针对同一被验者，通过比较在某一时间点确定的源自被验者的试样的比率2值与在不同时间点确定的该比率2值，评价该比率2值的有无增减和/或増減的程度，可以进行前列腺癌的进展度或恶性度的诊断、或术后的预后诊断。即，在得到如确认该比率2值的増加的检查结果时，可以作出认定病况进展为前列腺癌(或前列腺癌的恶性度增加)、或认定存在病况向前列腺癌进展的征兆(或认定前列腺癌的恶性度增加的征兆)的判断。并且，在得到如没有确认该比率2变动的检查结果时，可以作出前列腺癌的病况没有变化的判断。并且，在得到如确定该比率2下降的检查结果时，可以作为前列腺癌的病况改善的判断。
就上述截点值(基准值)而言，可以用源自前列腺癌患者的试样及源自非癌症患者的试样，通过上述测定方法求出比率2后，基于前列腺癌患者的比率2和非癌症患者的比率2值的分界值等设定。也可以将非癌症患者的比率2平均值设为截点值。此外，本发明中“非癌症患者”是指确认为不是前列腺癌的“非前列腺癌患者”。“非癌症患者”可以是健康人、或是前列腺肥大等的患者。作为截点值，例如，也可以通过常规方法的采用相对操作特征曲线(Relative Operating Characteristic curve，以下，亦简称为“ROC曲线”)的解析求出。
作为通过利用ROC曲线的解析求出截点值的方法，例如，可以列举以下的方法。首先，基于得到比率2，利用常规方法绘制ROC曲线。其次，依据常规方法画一条与ROC曲线相接的45度角的直线，求出与该直线的交点、即“敏感度％-(100-特异性％)”为最大的值，可以将该值设为截点值。
以下，说明本发明的将上述i)(α(2,3)糖链游离型PSA量/游离型PSA量)/前列腺体积用作为比率2来判断前列腺癌时的具体例子。作为例子1，包括1)用源自非癌症患者的试样确定比率2，2)用源自受试者的试样确定比率2’，及3)比较该比率2’与该比率2，该比率2’与该比率2相同或更高时，判断为提供试样的受试者患有前列腺癌(前列腺癌阳性)、或该可能性高。作为例子2，包括1)用源自非癌症患者的试样确定比率2，基于该比率2设定用于判断前列腺癌的该比率2的截点值，2)用源自受试者的试样确定比率2，及3)将该比率2与在上述1)设定的截点值比较，该比率2与该截点值相同或更高时，判断为提供试样的受试者患有前列腺癌(前列腺癌阳性)、或该可能性高。此外，确定了适宜的截点值后，每次进行受试者的判断时无需重新设定截点值。
用本发明的判断前列腺癌的方法判断作为受试者的患者患有前列腺癌时，随后可以针对该受试者实施前列腺癌的适宜治疗。并且，用本发明的判断前列腺癌的方法判断作为受试者的患者具有患有前列腺癌的可能性或该可能性高时，可以选择进行组织检查(活检)。并且，判断为没有患有前列腺癌或该可能性低时，可以选择不做活检，基于需要可以选择进行随访等的治疗方案。
六、关于活检避免率
可避免不必要的活检的概率用“活检避免率”来表示。“活检避免率”是指“维持诊断敏感度90％状态的特异性”。例如，截点值0.8且活检避免率55％的情形是指在截点值0.8以下的病例中，无需实施活检即可以诊断(确定)为阴性的比例为55％。换言之，在截点值0.8判断前列腺癌的方法是指以前列腺癌的诊断敏感度达到90％的水平作为前提，非前列腺癌的受试者可以55％避免不必要的活检的实施。就现有的以总PSA值作为指标的前列腺癌的方法等而言，特异性明显不足。因此，活检结果为阴性的患者也需要反复接受活检，以排除前列腺癌的可能性。其结果，除了活检具有感染等的危险性以外，还存着如大量进行不必要的活检的问题。
与之相比，本发明的判断前列腺癌的方法能够以高的特异性及敏感度、以及非侵袭性的方式判断前列腺癌。并且，以高的活检避免率判断前列腺癌，因而可以减少需要活检的受试者的数量。换言之，进行利用本发明的判断前列腺癌的方法的判断，可以避免对于非前列腺癌受试者的不必要的活检。
并且，前列腺癌分为良性前列腺癌和恶性前列腺癌，良性前列腺癌的情形其进展缓慢，因而可以选择不做手术等侵袭性治疗、而是进行随访的措施。另一方面，恶性前列腺癌的进展迅速，因而需要在早期发现前列腺癌并辨别其恶性度。并且，能够判断前列腺癌的恶性度会成为确立前列腺癌的治疗方案时的重要指针。
作为推测、评价前列腺癌的恶性度相关的前列腺癌复发的可能性、生存预后等的方法，采用D’Amico分级。针对前列腺癌患者实施并比较本发明的判断前列腺癌的方法与基于D’Amico分级的分类的结果，有本发明的比率2值低的患者在D’Amico分级中被归为低危组，比率2值高的患者在D’Amico分级中被归为高危组的倾向。由此可知，基于本发明的方法判断前列腺癌的结果与基于D’Amico分级的分类具有相关性。
<前列腺癌判断用试剂盒>
本发明的前列腺癌判断用试剂盒为“一种前列腺癌判断用试剂盒，包含1)α(2,3)糖链亲和性物质，2)记载有确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定该比率1与该受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的判断顺序的使用说明书”。其中，α(2,3)糖链亲和性物质及其优选的实施方式和具体例子等如在以上1-2)的“α(2,3)糖链亲和性物质”项所述。α(2,3)糖链亲和性物质可以是悬浮在适宜的缓冲液中的悬浮液等溶液状态的试液形式、或是冷冻制品或冻干制品。
该试剂盒还可以包含本发明的抗PSA抗体(可结合在游离型PSA和结合型PSA的抗体和/或抗游离型PSA抗体)。其优选方式和具体例子等如在以上“二、确定比率1的方法”的本发明的PSA抗体相关说明中所述。本发明的抗PSA抗体可以是悬浮在适宜的缓冲液中的悬浮液等溶液状态的试液形式、或是冷冻制品或冻干制品。
α(2,3)糖链亲和性物质为试液形式时，可以使本发明的抗PSA抗体共存在含有α(2,3)糖链亲和性物质的试液中，也可以包含在与α(2,3)糖链亲和性物质不同的试液中，或以冷冻制品或冻干制品的形式保存。并且，就α(2,3)糖链亲和性物质及本发明的抗PSA抗体在该试液中的浓度而言，为目的测定的反应在混合各试液的时间点开始的浓度即可，具体如在以上<判断前列腺癌的方法>项所述，且构成该试液的溶剂的具体例子也如在以上<判断前列腺癌的方法>项所述。
含有构成本发明的试剂盒的α(2,3)糖链亲和性物质和/或本发明的抗PSA抗体的试液中，在不妨碍α(2,3)糖链游离型PSA与α(2,3)糖链亲和性物质的反应的前提下，可以含有本领域通常使用的添加剂如试剂类、缓冲剂、反应促进剂、糖类、蛋白质、盐类、表面活性剂等稳定剂，以及防腐剂等。并且，这些试剂的浓度等也可以在本领域通常使用的浓度范围适宜选择。
以下，列举实施例等更为详细地说明本发明，但本发明不局限于这些实施例。
实施例
实施例1：用源自前列腺癌患者及良性前列腺增生患者的试样得到的比率的比较
1)患者的背景及试样的采集
将从诊断为前列腺癌(PCa)的患者174人、及诊断为非癌症的良性前列腺增生(BPH)的患者94人采集的血清用作为试样。针对各患者进行前列腺的活检、组织病理学诊断。表1示出了患者的背景(年龄、总PSA值、病理组织学恶性度分级(活检格里森评分、术后格里森评分等)。
表1
Figure BDA0002779403990000471
表1中，PSAD为总PSA值/前列腺体积，prostate biopsy GS为前列腺活检格里森评分，pathological GS为术后格里森评分。
2)前列腺体积的测定
通过超声波诊断的测定求出各患者的前列腺体积。诊断采用通用的超声波图像诊断设备日立阿洛卡医疗公司制的ProSoundα7，前列腺体积(cm3)用ProSoundα4附带的软件求出。
3)总PSA的测定
用作为体外诊断用医药品的ArchitectTM总PSA Abbott(雅培日本公司制)，依据试剂盒附带的手册求出各试样中的总PSA值。
4)毛细管电泳
i)DNA标记抗PSA抗体的配制
按照图2所示的顺序，配制结合了DNA的PSA抗体Fab’片段。即，首先用常规方法纯化在5’末端导入了NH2基的250bp的DNA片段(纯化末端氨基化DNA)，其次，用常规方法使导入到该DNA片段的NH2基与磺基琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸酯(Sulfo-SMPB)连接子(具有琥珀酰亚胺基和马来酰亚胺基的连接子，Pierce公司制)的琥珀酰亚胺基反应后，凝胶过滤处理来去除未反应的连接子，得到结合了连接子的250bp的DNA片段。得到的连接子结合250bp的DNA片段、与预先用抗人PSA大鼠单克隆抗体PSA10(抗PSA单克隆抗体克隆编号PSA10，和光纯药工业(株)制)通过常规方法配制的抗PSA抗体PSA10 Fab’片段反应，用DEAE色谱柱纯化得到的反应物，从而得到250bp的DNA片段结合了的抗PSA抗体PSA10 Fab’片段(以下，简称为“DNA标记抗PSA抗体”)。
此外，使用的抗人PSA小鼠单克隆抗体(抗PSA单克隆抗体克隆编号PSA10)为对于人PSA具有亲和性的抗体，与结合型PSA和游离型PSA结合。即，该抗体与α(2,3)糖链游离型PSA和α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA结合。
ii)荧光标记抗游离型PSA抗体的配制
用常规方法处理识别与抗PSA单克隆抗体PSA10不同的PSA表位、只与游离型PSA特异性结合的抗人PSA单克隆抗体PSA12(抗PSA单克隆抗体克隆编号PSA12，和光纯药工业(株)制)，得到抗PSA抗体PSA12 Fab’片段。在得到的片段的氨基，用常规方法导入荧光物质HiLyte647(AnaSpec公司制)，得到了HiLyte647标记抗游离型PSA抗体PSA12 Fab’片段(以下，简称为“荧光标记抗游离型PSA抗体”)。
iii)试样、试液的配制
电泳用试样A的配制
将试样2μL、在上述ii)配制的1μM荧光标记抗游离型PSA抗体1μL及电泳缓冲液1(含有5％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)甘油、150mM NaCl、0.01％BSA、75mM Tris-HCl(pH7.5)、10mM MES)7μL加入到0.5mL试管中进行混合，从而配制了10μL的反应液。将上述反应得到的含有“荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA”复合物的反应液10μL用作为电泳用试样A。此外，该反应液中荧光标记抗游离型PSA抗体的终浓度为100nM。
电泳缓冲液2(MAA含有)的配制
配制含有4.5％(w/v)聚乙二醇(PEG8000)、3％(w/v)甘油、10mM NaCl，0.01％BSA的75mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)，其中添加并混合MAA(VECTOR公司制)，使其终浓度达到4mg/mL，将得到的溶液用作为电泳缓冲液2。
电泳缓冲液3的配制
将含有2％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)甘油、0.01％BSA、125mM HEPES、75mM Tris-HCl的缓冲液(没有调整pH)用作为电泳缓冲液3。
电泳缓冲液4的配制
将含有2％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、3％(w/v)甘油、0.01％BSA的75mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)用作为电泳缓冲液4。
DNA标记抗体液(含有DNA标记抗PSA抗体)的配制
配制含有在上述i)得到的DNA标记抗PSA抗体100nM的缓冲液(含有2％(w/v)聚乙二醇(PEG20000)、0.5mM EDTA·2Na、3％(w/v)甘油、50mM NaCl、0.01％BSA、75mM BisTris，pH 6.0)，将得到的溶液用作为DNA标记抗体液。
荧光液的配制
将含有30nM HiLyte647、20％(w/v)甘油的50mM BisTris(pH6.0)用作为荧光液。荧光液用于在测定装置(Mutasuwako i30)的检测部的位置确认等的调整。
iv)电泳
用全自动荧光免疫测定装置Mutasuwako i30(和光纯药工业(株)制)，按照装置的操作说明书和以下的顺序进行了微芯片毛细管电泳。即，将在上述iii)配制的电泳用试样A5.4μL注入到Mutasuwako i30专用微芯片的指定孔(SP孔)中。其次，按照以下的顺序将在上述iii)配制的各试液注入到了微芯片的各孔中。
R2孔(R2(FLB)孔、R2(LB)孔)：电泳缓冲液2(含有MAA)各10.0μL，
R3孔：电泳缓冲液3 10.0μL，
R4孔：电泳缓冲液4 5.4μL，
C1孔：DNA标记抗体液3.0μL，
FD孔：荧光液7.0μL。
图3为所使用的微芯片的示意图。图3中，废液孔用于各孔(R2、R3、R4及C1)的试液及电泳用试样A导入分析用流路时的废液储存(排出孔)。随后，在4个废液孔(排出孔)间施加30秒、-5psi的圧力，从而将电泳用试样A及各试液导入到了芯片的分析用流路。电泳用试样A及各试液导入芯片的分析用流路后，用以下的方法进行了PSA的分离及检测。
图4示意性地示出了所使用的微芯片的芯片内流路。图4中，W表示废液孔，R3孔侧为阴极，R2(LB)孔侧为阳极。图4中，分别用点部分和白部分(没有点的部分)的不同颜色表示电泳用试样A及各孔的试液的配置部分。
在图4的R3孔至R2(LB)孔间施加4000V的电压，在30℃使试液中的DNA标记抗PSA抗体与电泳用试样A中的“荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA”复合物接触，形成“荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物后，用等速电泳(ITP)进行浓缩。图4中，用“ITP”和虚线表示等速电泳的泳动方向。并且，用于捕获游离型PSA的各标记抗体的免疫反应时间为约200秒。此时，形成的复合物具体为“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物(第1复合物)、及“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物(第2复合物)。
等速电泳至R2(FLB)孔，利用电压的变化来判断复合物穿过R2(FLB)孔的情况后，将阴极由R3切换至R2(FLB)。随后，在MAA的存在下进行毛细管凝胶电泳(CE)，直至在检测部分(自R2(FLB)与R2(LB)的通道交叉部分2cm下游的毛细管部分)检测到“荧光标记抗游离型PSA抗体-游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”复合物的峰。图4中，用“CE”和虚线表示CE进行的位置及电泳的泳动方向。
检测是通过用光电二极管(富士胶片公司制)即时测定635nm激光激发的自R2(FLB)与R2(LB)的通道交叉部分2cm下游的毛细管部分的荧光强度来进行。并且，除了使用不含有MAA的电泳缓冲液2以外，用与上述相同的电泳用试样A、电泳用试液及测定装置，实施与上述相同的方法进行了PSA的分离及检测。
第2复合物的峰出现在与使用不含有MAA的电泳缓冲液2时出现的峰相同的位置。另一方面，与不与MAA反应的“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA以外的PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物(第2复合物)相比，与MAA反应的“荧光标记抗游离型PSA抗体-α(2,3)糖链游离型PSA-DNA标记抗PSA抗体”的复合物(第1复合物)的泳动时间长，因而峰的出现晚。即，第1复合物的峰在第2复合物的峰之后出现。
用测定装置附带的解析用软件求出得到的第1复合物组分的峰面积及第2复合物组分的峰面积。其次，用得到的第1复合物组分的峰面积和第2复合物组分的峰面积，算出试样中的α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％)。具体的计算方法如在以下所述。
游离型PSA量＝(第1复合物组分的峰面积)+(第2复合物组分的峰面积)
α(2,3)糖链游离型PSA量相对于游离型PSA量的比率(％，比率1)＝(第1复合物组分的峰面积/游离型PSA量)×100
随后，求出在以上得到的各患者的比率1相对于同一患者的前列腺体积的比率、即比率1相对于前列腺体积的比率(％，比率2)。
比率2＝[(第1复合物组分的峰面积/游离型PSA量)×100]/前列腺体积＝比率1(％)/前列腺体积
表1示出了由前列腺癌患者(PCa)及良性前列腺增生患者(BPH)得到的结果。表1中，分别记载了列腺体积的平均值(cm3)、比率1的平均值(％)及比率2的平均值(％/cm3)。基于以上结果，进一步进行了ROC曲线的解析。
5)结果
结果示于图5中。图5中，(1)及(2)为基于比率2绘制的ROC曲线，(3)及(4)为基于比率1绘制的ROC曲线。图5中，(1)及(3)示出了采用源自血清中总PSA值为50ng/mL以下的受试者的血清时的结果，(2)及(4)示出了采用源自血清中总PSA值为10ng/mL以下的受试者的血清时的结果。其次，按照已知方法，基于诊断敏感度(Sensitivity)90％时的特异性(Specificity)的数值求出了活检避免率。图5中，横轴表示“100-特异性”。因此，基于图5可以得到“100-诊断敏感度90％时的横轴数值”＝诊断敏感度90％时的特异性(％)＝活检避免率(％)的结果。以下表2总结了基于ROC曲线解析得到的结果。
表2
Figure BDA0002779403990000521
如图5及表2所示，与用比率1作为指标判断前列腺癌的情形相比，用比率2作为指标判断前列腺癌时的曲线下面积(Area Under the Curve，AUC)高。由此可知，与将比率1用作为指标的判断方法相比，将比率2用作为指标的判断方法在判断的敏感度、特异性上更为优异。以下表3总结了采用总PSA值为10ng/mL以下的试样时(图5中(2)的情形)的ROC曲线的解析结果。
表3
生物标志物 比率2 比率1 总PSA PCA3 PHI
截点值 0.895 40％ 4 20-35 -
AUC 0.82 0.77 0.51 0.66-0.69 0.70-0.77
PPV(％) 78 73 65 - -
NPV(％) 78 69 55 88-90 67-92
Pca漏判的风险(％) 10 10 10 10-12 8-33
活检避免率(％) 55 36 20 44 36
AUC：曲线下面积、PPV：阳性预估值、NPV：阴性预估值
Pca：前列腺癌、PCA3：前列腺癌基因3、PHI：前列腺健康指数
表3中，截点值是按照用ROC曲线求出截点值的常规方法绘制与图5的ROC曲线相接且呈45度角的直线后，求出的与该直线的交点的值、即“敏感度-(100％-特异性％)”为最大的值。如表3所示，用比率2时的活检避免率(％,Avoided Biopsies)为55％，用比率1时的活检避免率是36％。由此可知，与用比率1判断前列腺癌的方法相比，用比率2判断前列腺癌的本发明的方法的活检避免率及AUC高。本实施例的验证中，基于比率1判断前列腺癌时的截点值为40％，基于比率2判断前列腺癌时的截点值为0.895。
此外，数据虽没有示出，但本实施例得到的前列腺癌患者的比率2与基于D’Amico分级进行分类两者比较的结果，本发明的比率2值低的患者有在D’Amico分级中被归为低危组的倾向。并且，比率2值高的患者有在D’Amico分级中被归为高危组的倾向。由此可知，基于本发明的方法判断前列腺癌的结果与基于D’Amico分级的分类两者具有相关性。
并且，基于上述的其他方式得到的总PSA值，同样用ROC曲线进行了解析。其结果，基于总PSA值判断前列腺癌时的活检避免率为20％，基于总PSA值判断前列腺癌时的截点值为4.0。基于总PSA值判断前列腺癌的方法特异性低，因此，总PSA值低于截点值时也可以基于其他症状来怀疑是否患有前列腺癌。此时，即便案例的总PSA值低于截点值，多数也需要进行进一步的确定诊断。因此，实际临床诊断中，基于总PSA值判断前列腺癌的方法的活检避免率远低于20％。
作为参考，表3中一并示出了用前列腺癌基因3(prostate cancer gene 3,PCA3)作为指标的判断方法的数据、及用前列腺健康指数(Prostate Health Index,PHI)作为指标的判断方法的数据。与表3的用PCA3作为指标的判断方法相关的各数据分别为以下文献记载的数据。
截点值：Gittelman M et al.J Urol 2013；190:64-9、Wei JT et al.J ClinOncol 2014；20；32:4066-72、Haese A et al.Eur Urol 2008；54:1081-8
AUC：Haese A et al.Eur Urol 2008,54:1081-8、Aubin SM et al.J Urol 2010，184:1947-52
NPV(％)：Wei JT et al.J Clin Oncol 2014 20,32:4066-72
Pca的风险(％)：Gittelman M et al.J Urol 2013,190:64-9、Wei JT et al.JClin Oncol 2014 20,32:4066-72、Haese A et al.Eur Urol 2008,54:1081-8、Aubin SMet al.J Urol 2010,184:1947-52
活检避免率(％)：Haese A et al.Eur Urol 2008,54:1081-8、Aubin SM et al.JUrol 2010,184:1947-52
并且，与表3的用PHI作为指标的判断方法相关的各数据分别为以下文献记载的数据。
AUC：Filella X et al.Clin Chem Lab Med 2013；51:729-39
PPV(％)：Filella X et al.Clin Chem Lab Med 2013；51:729-39
NPV(％)：Filella X et al.Clin Chem Lab Med 2013；51:729-39
Pca漏判的风险(％,Risk of missing Pca)：Filella X et al.Clin Chem LabMed 2013；51:729-39、De la Calle C et al.J Urol 2015；194:65-72
活检避免率(％)：Filella X et al.Clin Chem Lab Med 2013；51:729-39
如表3所示，与现有的用PCA3作为指标的判断方法及用PHI作为指标的判断方法的情形相比，用比率2判断前列腺癌的本发明的方法的活检避免率及AUC高。由上可知，与现有的判断方法相比，本发明的判断前列腺癌的方法精度高、能够以高的活检避免率判断前列腺癌。因此，根据本发明的方法，可以使现有的基于血清标志物(总PSA值)怀疑患有前列腺癌的病例因不必要的活检、即过度诊断导致的不利情况显著降低。
产业实用性
本发明的判断前列腺癌的方法能够以高的活检避免率判断前列腺癌，可以得到如使受试者避免过度活检的显著效果。

Claims (6)

1.一种判断前列腺癌的方法，其特征在于，该方法为确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定所述比率1与所述受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的方法，
所述α(2,3)糖链游离型PSA为具有糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链的游离型前列腺特异抗原。
2.如权利要求1所述的判断前列腺癌的方法，其中，测定α(2,3)糖链游离型PSA量的方法为使α(2,3)糖链游离型PSA与对于糖链的末端唾液酸残基经由α(2,3)结合在自糖链的末端起第2个半乳糖残基的糖链具有亲和性的α(2,3)糖链亲和性物质反应，形成α(2,3)糖链游离型PSA与所述α(2,3)糖链亲和性物质的复合物后，测定所述复合物的量，基于得到的测定结果求出α(2,3)糖链游离型PSA量的方法。
3.如权利要求2所述的判断前列腺癌的方法，其中，所述α(2,3)糖链亲和性物质为凝集素。
4.如权利要求3所述的判断前列腺癌的方法，其中，所述凝集素是怀槐凝集素。
5.一种获取用于判断前列腺癌的数据的方法，其特征在于，确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定所述比率1与所述受试者的前列腺体积的比率2。
6.一种前列腺癌判断用试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含
1)α(2,3)糖链亲和性物质，及
2)记载了确定源自受试者的试样中的游离型前列腺特异抗原量与α(2,3)糖链游离型PSA量的比率1，确定所述比率1与所述受试者的前列腺体积的比率2，基于得到的比率2来判断前列腺癌的判断顺序的使用说明书。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114527222A (zh) * 2022-02-22 2022-05-24 广州市番禺区中心医院 前列腺癌相关标志物及其应用

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20210318317A1 (en) * 2018-10-04 2021-10-14 Konica Minolta, Inc. Method for acquiring auxiliary information
HUP2100233A1 (hu) 2021-06-16 2023-10-28 Pannon Egyetem Integrált módszer a vizelet prosztata-specifikus antigén N-glikozilációs profiljának kapilláris elektroforézissel történõ meghatározására

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010091308A (ja) * 2008-10-04 2010-04-22 Sapporo Medical Univ レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット
CN102317785A (zh) * 2009-02-04 2012-01-11 国立大学法人东京工业大学 Psa的分析方法、以及使用上述分析方法的前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法
CN104797937A (zh) * 2012-10-12 2015-07-22 国立大学法人弘前大学 用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法及试剂盒
WO2017130578A1 (ja) * 2016-01-27 2017-08-03 和光純薬工業株式会社 前立腺癌の判定方法

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4514919B2 (ja) * 2000-08-14 2010-07-28 力 大山 前立腺特異抗原の糖鎖構造の違いに基づく前立腺癌と前立腺肥大とを識別する方法
WO2002082083A1 (fr) 2001-04-04 2002-10-17 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. Electrophorese
JP4719669B2 (ja) 2003-04-14 2011-07-06 カリパー・ライフ・サイエンシズ・インク． 移動度シフトアッセイ干渉の低減
DE602006011756D1 (de) 2005-09-02 2010-03-04 Wako Pure Chem Ind Ltd Komplexformierungs- und -trennungsverfahren

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010091308A (ja) * 2008-10-04 2010-04-22 Sapporo Medical Univ レクチン吸収法による前立腺がんの診断方法及び判定キット
CN102317785A (zh) * 2009-02-04 2012-01-11 国立大学法人东京工业大学 Psa的分析方法、以及使用上述分析方法的前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法
CN104797937A (zh) * 2012-10-12 2015-07-22 国立大学法人弘前大学 用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法及试剂盒
WO2017130578A1 (ja) * 2016-01-27 2017-08-03 和光純薬工業株式会社 前立腺癌の判定方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KAZUTO ITO等: "The Diagnostic Accuracy of the Age-Adjusted and Prostate Volume-Adjusted Biopsy Method in Males with Prostate Specific Antigen Levels of 4.1–10.0 ng/mL", CANCER ., vol. 95, no. 10 *
TOHRU YONEYAMA等: "Measurement of aberrant glycosylation of prostate specific antigen can improve specificity in early detection of prostate cancer", BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS, vol. 448, no. 4, pages 390 - 396, XP055537541, DOI: 10.1016/j.bbrc.2014.04.107 *
TOMOKAZU ISHIKAWA等: "An Automated Micro-Total Immunoassay System for Measuring Cancer-Associated 2, 3-linked Sialyl N-Glycan-Carrying Prostate-Specific Antigen May Improve the Accuracy of Prostate Cancer Diagnosis", INT J MOL SCI ., vol. 18, no. 2, XP055503642, DOI: 10.3390/ijms18020470 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114527222A (zh) * 2022-02-22 2022-05-24 广州市番禺区中心医院 前列腺癌相关标志物及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
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