CN104797937A - 用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法及试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题提供以少的分析样品高灵敏度地再现性优良地识别前列腺癌和前列腺肥大的方法。作为其解决手段的本发明的识别前列腺癌和前列腺肥大的方法包括：使含前列腺特异抗原(PSA)的分析样品和固定化了抗游离PSA抗体的载体接触，而使游离PSA结合于载体上固定化了的抗游离PSA抗体之后，使游离PSA结合于固定化了的抗游离PSA抗体的载体和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体接触，而使特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体结合于与载体上固定化了的抗游离PSA抗体结合的游离PSA，测定有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量，通过将得到的测定量与预先设定的前列腺癌和前列腺肥大的截止值比较，将相比截止值更多的情况判断为前列腺癌或其似然性高，少的情况判断为前列腺肥大或其似然性高。

Description

用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法及试剂盒
【技术领域】
本发明涉及，用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法及试剂盒。
【背景技术】
公知前列腺癌(prostatecarcinoma：以下简称为“Pca”)是男性的主要的死亡原因，前列腺特异抗原(prostate-specific antigen：以下简称为“PSA”)被认为对Pca的最重要的肿瘤标志物(非专利文献1)。PSA是约34kDa的糖蛋白，糖链占其约8％。已经在多种文献中记载了对Pca的早期诊断的血清PSA测试的有用性，但在罹患Pca的男性和罹患前列腺肥大(benign prostate hyperplasia：以下简称为“BPH”)的男性之间有被称为灰色区(grayzone)的既说不上是Pca也说不上是BPH的区域(非专利文献2)。从而至今实施用于正确地区别2种病变的尝试，例如，将PSA密度、PSA梯度、游离PSA/总PSA的比等作为指标的尝试。但是，这样的方法难以正确地区别2种病变。因此，现在的血清PSA测试对Pca不是特异性的、且无使灵敏度和特异性一同满足的适宜的截止值成为世界性的问题。
基于这样的背景、作为本发明人的大山等的组将从精囊液纯化的PSA用N-糖苷酶F处理，切出PSA的N型糖链，由基质关联激光解吸/电离飞行时间(MALDITOF)质谱(MS)进行解析，作为PSA的糖链鉴定19种，得知PSA的糖链非常地富多样性(非专利文献3)。其以前，Stamey等的组报告，作为PSA的糖链，仅表达以双链在末端，唾液酸以α(2,6)键与半乳糖结合的N型糖链(非专利文献4)、由大山等的组明了，末端的唾液酸不仅通过α(2,6)键、还存在约10％通过α(2,3)键与半乳糖结合的。其后，大山等的组在不仅含糖链、还含PSA的肽序列的状态下由MS-MS解析PSA而得知，PSA的N型糖链的末端唾液酸残基，伴随癌化，相比通过α(2,6)键，通过α(2,3)键与半乳糖结合增加(非专利文献5)。
鉴于以上的见解，认为以有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的PSA量作为指标识别Pca和BPH是可能的，实际上，由作为本发明人的大山在专利文献1中提议的使用特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的朝鲜槐凝集素的亲和性层析，确认可识别Pca和BPH。但是，由使用朝鲜槐凝集素的亲和性层析识别Pca和BPH的方法作为与至今提议的方法完全不同的方法被关注，由于有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的PSA量是总PSA量的仅1～2％，是极微量，为了进行精度高的识别，有作为分析样品大量(10ml左右)需要血清的问题。另外，使用的朝鲜槐凝集素由于是自天然物的提取物，也有确认在批间的品质的偏差等的问题。
【现有技术文献】
【专利文献】
专利文献1：专利第4514919号公报
【非专利文献】
非专利文献1：StameyTA，YangN，HayAR，etal.，N.Engl.J.Med.1987；317：909-916
非专利文献2：CatalonaWJ，etal.，JAMA1998；279：1542-1547
非专利文献3：OhyamaC，etal.，Glycobiology，2004；14：671-679
非专利文献4：BelangerA，VanHalbeekH，GravuxesHC，etal.Prostate，1995；27：187-197
非专利文献5：TajiriM，OhyamaC，WadaY，Glycobiology，2008；18：2-8
【发明内容】
【发明要解决的技术课题】
从而本发明以提供以少的分析样品高灵敏度地再现性良好地识别Pca和BPH的方法作为目的。
【解决课题的技术方案】
本发明人鉴于上述的方面进行锐意探讨的结果发现，通过使用特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体的免疫学测定法测定分析样品中含的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量，可以少的分析样品高灵敏度地再现性良好地识别Pca和BPH。
基于上述的见解进行的本发明的用于识别Pca和BPH的方法，如实施方式1所述，包括：使含PSA的分析样品和固定化了抗游离PSA抗体的载体接触，而使游离PSA结合于载体上固定化了的抗游离PSA抗体之后，使游离PSA结合于固定化了的抗游离PSA抗体的载体和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体接触，而使特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体结合于与载体上固定化了的抗游离PSA抗体结合的游离PSA，测定有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量，通过将得到的测定量与预先设定的Pca和BPH的截止值比较，将相比截止值更多的情况判断为Pca或其似然性高，少的情况判断为BPH或其似然性高。
另外，实施方式2所述的方法是在实施方式1所述的方法中，含PSA的分析样品是选自血清、尿、前列腺组织提取液、精液、膀胱清洗液的至少1种。
另外，实施方式3所述的方法是在实施方式1所述的方法中，抗游离PSA抗体是抗人游离PSA特异性单克隆抗体(不与复合物PSA反应)。
另外，实施方式4所述的方法是在实施方式1所述的方法中，载体是磁性粒子。
另外，本发明的用于识别Pca和BPH的试剂盒，如实施方式5所述，至少含固定化了抗游离PSA抗体的载体，和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体。
【发明效果】
由本发明可提供以少的分析样品高灵敏度地再现性良好地识别Pca和BPH的方法。
【附图说明】
【图1】是实施例1中的，Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量的测定结果(根据荧光强度)。
【图2】同是实施例1中的，基于测定结果的ROC曲线。
【图3】实施例2中的，Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量的测定结果(左)和基于此测定结果的ROC曲线(右)。
【图4】实施例3中的，Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量的测定结果(左)和基于此测定结果的ROC曲线(右)。
【图5】实施例4中的，Pca患者和BPH患者的血清中的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量的测定结果(用空白样品的荧光强度或HLT样品的荧光强度补正的)。
【实施方式】
本发明的用于识别Pca和BPH的方法包括：使含PSA的分析样品和固定化了抗游离PSA抗体的载体接触，而使游离PSA结合于载体上固定化了的抗游离PSA抗体之后，使游离PSA结合于固定化了的抗游离PSA抗体的载体和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体接触，而使特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体结合于与载体上固定化了的抗游离PSA抗体结合的游离PSA，测定有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量，通过将得到的测定量与预先设定的Pca和BPH的截止值比较，将相比截止值更多的情况判断为Pca或其似然性高，少的情况判断为BPH或其似然性高。
在本发明中，作为含PSA的分析样品，可举出血清、尿、前列腺组织提取液、精液、膀胱清洗液等。其制备可由公知的方法进行。分析样品是少量即可。优选为1～1000μl、更优选为5～500μl、最优选为10～100μl。
固定化了抗游离PSA抗体的载体可使用市售的抗游离PSA抗体和载体，由公知的方法制备。为了高灵敏度地测定有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量，作为抗游离PSA抗体，优选使用抗人游离PSA特异性单克隆抗体(不与复合物PSA反应的)(例如克隆2E2来源的或克隆8A6来源的等被市售)。载体只要是可固定化磁性粒子或孔板等的抗体即可，由于可由磁力容易地回收而处理性优良等的点，优选为磁性粒子。再有，在本发明中“游离PSA”是指不与α1-抗胰凝乳蛋白酶等的蛋白结合的PSA，也被称为非蛋白结合型PSA或游离型PSA(复合物PSA是指与蛋白结合的PSA)。
特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体只要是末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链、即，特异性地识别Siaα(2,3)Gal糖链的单克隆抗体即可。作为市售的例示有由是本发明人的铃木等的组确立的HYB4单克隆抗体(和光纯药公司)，但不限于此。
使含PSA的分析样品和固定化了抗游离PSA抗体的载体接触，而使游离PSA结合于载体上固定化了的抗游离PSA抗体的工序，及使游离PSA结合于固定化了的抗游离PSA抗体的载体和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体接触，而使以90>特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体结合于与载体上固定化了的抗游离PSA抗体结合的游离PSA的工序，均在例如，在2℃～5℃的温度条件下进行10分钟～3小时即可。有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量的测定可由例如ELISA(酶联免疫吸附试验)夹心法或流式细胞术进行。后者的情况中，测定例如使用进行可检测的荧光标记的第二抗体进行即可，但将特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体荧光标记也可不使用第二抗体进行。再有，抗体的标记只要是可检测即可，不限于荧光标记。测定时可根据需要，进行清洗、纯化、分级分离等的操作。另外，可将固定化了抗游离PSA抗体的载体，和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体与清洗液等一同试剂盒化而至可容易并且简便地识别Pca和BPH。
通过将如此测定的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量与预先设定的Pca和BPH的截止值比较，可将相比截止值更多的情况判断为Pca或其似然性高，少的情况判断为BPH或其似然性高。截止值可基于罹患Pca的男性组的测定值和罹患BPH的男性组的测定值设定。例如使用荧光标记测定时，截止值，作为荧光强度(MFI：平均荧光强度)，可根据测定条件等设定为在1～10000的范围的数值。
【实施例】
以下，由实施例详细地说明本发明，但本发明不被解释为限于以下的记载。
【参考例1：特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的HYB4单克隆抗体的制作】
由以下的顺序制作根据本发明的在前列腺癌和前列腺肥大的识别中使用的特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体。
【(1)抗原的制备】
将作为糖脂质的IV3NeuAcnLc4Cer(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)作为免疫原使用。
【(2)杂交瘤的制作】
使IV3NeuAcnLc4Cer(NeuAcα2-3Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-1’Cer)228μg溶解于EtOH114μl，超声波处理后，加PBS 1820μl，加温到37℃。其后，作为佐剂加将酸处理的明尼苏达沙门氏菌(Salmonella minnesota)菌体膜级分用PBS悬浮至1mg/ml的溶液568μl，于37℃静置10分钟。将此混合溶液200μl在第0、4、7、11、21、25天尾静脉内施用于C3H小鼠。在最终施用后第3天，将从免疫的小鼠的脾脏制备的淋巴细胞根据Kohler和Milstein的常规方法(Nature，256,495,1975)供于细胞融合。在融合对象的亲本细胞中使用作为小鼠骨髓瘤细胞株的PAI(人类科学研究资源银行、JCRB0113)，作为融合剂使用聚乙二醇4000(Merck公司)。将如此融合的细胞悬浮于HAT培养基，分注于96孔的微培养板上进行培养。约2周后，将集落阳性孔的培养上清中的抗体产生通过以IV3NeuAcnLc4Cer作为抗原的ELISA法进行筛选。筛选使用96孔微滴定板(Dynatech公司、IMMULON1B)如以下一样进行。将IV3NeuAcnLc4Cer用95％EtOH制备成0.1nmol/50μl，加至达50μl/孔。在成为空白的孔中放入95％EtOH 50μl。减压下使EtOH蒸发，将抗原糖脂质固相化后，加1％人血清白蛋白(Sigma公司、含有A6784)的PBS(PBS-1)至达200μl/孔，于室温放置1小时。除去PBS-1后，加杂交瘤培养上清至达50μl/孔，以室温反应1小时。除去培养上清后，用PBS以100μl/孔清洗孔1次。加用PBS-1稀释10000倍的第二抗体(蛋白A-HRP)溶液至达100μl/孔，以室温反应1小时。除去第二抗体溶液后，将孔用PBS100μl/孔清洗5次。加过氧化物酶底物(将O-苯二胺2mg用80mM柠檬酸-磷酸缓冲液(pH5.6)5ml、30％过氧化氢2μl溶解的)至达100μl/孔。遮光放置而见到显色时以100μl/孔加1M HCl而使显色停止。其后，用测定波长设定为492nm、对照波长设定为630nm的酶标仪测定吸光度。得到具有高的抗体产生能力、良好的增殖能力的3个杂交瘤克隆的产生(抗体的阳性率：0.5％)。产生得到的克隆的抗体的类(免疫球蛋白的类型)全部是IgG3(κ)。在如上所述选择的杂交瘤之中，克隆HYB4来源的单克隆抗体与Siaα(2,3)Gal糖链特异性地反应。
【(3)HYB4单克隆抗体的制备】
将(2)中得到的杂交瘤(克隆HYB4)使用75cm2瓶(CORNING公司、430720)，在含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的RPMI1640培养基(日水公司、05918)25ml中，于37℃、在5％CO2存在下预培养2天。从2瓶75cm2瓶回收细胞，悬浮于E-RDF培养基(极东公司、26500)1l后，移到大量培养装置(旋转瓶)，于37℃进行4天旋转培养。此培养液中以高浓度含与Siaα(2,3)Gal糖链特异性地反应的单克隆抗体。克隆HYB4来源的培养液用由蛋白A琼脂糖的亲和层析纯化。由此，从杂交瘤(克隆HYB4)制备的HYB4单克隆抗体是，免疫球蛋白的类型是IgG3，分子量是约15万道尔顿。由此确立的HYB4单克隆抗体由和光纯药公司市售。
【实施例1：使用HYB4单克隆抗体的Pca和BPH的识别(之1)】
由以下的顺序进行。
【(1)向载体的抗游离PSA抗体的固定化】
将作为磁性珠的Magplex微球(Luminex公司)作为载体使用，将抗游离PSA抗体根据XMAP抗体偶联试剂盒的手册固定于其表面。具体而言，向1.5ml管添加6.25×106个/500μl的Magplex微球，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。向管添加500μl的活化缓冲液，混合10秒钟后，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。再度向管添加400μl的活化缓冲液，混合10秒钟。接下来添加50μl的磺基-NHS和50μl的EDC溶液，混合10秒钟后，于室温放置20分钟。在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。为了清洗磁性珠，添加500μl的洗涤缓冲液，混合10秒钟后，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。将此清洗操作重复计3次。使25μg的抗人游离PSA特异性单克隆抗体(不与克隆2E2来源的复合物PSA反应的抗游离PSA抗体)(船越公司)与1000μl的活化缓冲液混合，向放入磁性珠的管添加。于室温缓慢混合(15-30rpm)着放置2小时。在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。为了清洗磁性珠，添加500μl的洗涤缓冲液，混合10秒钟后，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。将此清洗操作重复计3次。最后，添加1ml的洗涤缓冲液，制备每1μl固定化6250个抗游离PSA抗体的Magplex微球，于4℃保存至使用。
【(2)使用Luminex系统的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA的定量】
【(A)定量对象者】
作为总PSA的水平20.0ng/ml以下的Pca患者79名及BPH患者96名，从各自的患者采集血清，进行测定。进行前列腺活体检查确认患者的组织病理学诊断。患者的年龄、PSA值、病理组织学恶性度分类及临床病期示于表1。
【表1】
BPH Pca P-值
患者数 96 79
年龄(中位值) 69.5±8.0 72.0±7.3 0.2634
总PSA值(ng/mL) 2.1～19.7 3.0～17.6 0.1421
总PSA值中位值 6.60 7.5
0～4ng/mL(％) 2.1 2.5
4～10ng/mL(％) 78.1 69.6
10～20ng/mL(％) 19.7 27.8
>20ng/mL(％) 0 0
Gleasson分值
GS6(％) - 3.3
GS7(％) - 43.3
GS8(％) - 18.3
GS9(％) - 35
GS10(％) - 0
cT阶段(临床性肿瘤径)
T1c-T2a(％) - 75.9
T2b(％) - 7.6
T2c-T3(％) - 13.9
T4 - 0
【(B)定量方法】
向96孔白色板(WATMAN公司)的各孔添加(1)中制备的12500个/2μl的抗游离PSA抗体固定化Magplex微球。添加50μl无碳阻断缓冲液(船越公司)，封闭磁性珠之后，向各孔添加20μl作为分析样品的血清，于4℃放置1小时后，将磁性珠用含100μl的0.01％Tween20的Tris-缓冲盐水(TBST)清洗3次。接下来混合50μl的HYB4单克隆抗体，于4℃放置1小时。将磁性珠用50μl的TBST清洗3次后，混合50μl的藻红蛋白荧光染料(PE)标记抗小鼠IgG3抗体(SantaCruz Biotechnology公司)，于室温放置45分钟后，在Lumine×100流量计中设置96孔白色板，测定各孔的荧光强度(MFI：平均荧光强度)。
【(C)定量结果】
示于图1。如图1所示，Pca患者的血清的荧光强度相比BPH患者的血清的荧光强度显著地更高(P<0.001，Man-whitney U-检验)。这即表明，Pca患者的血清中的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量相比BPH患者的血清中的该量更多。另外，从此定量结果由相关运行特性曲线(ROC曲线)进行解析时，MFI值的截止值＝128.5，灵敏度是0.8354、特异性是0.7083、AUC(曲线下面积：Area Under the Curve)＝0.8445(图2)。
【(3)Pca和BPH的识别】
以(2)中设定的MFI的截止值作为基准，由本发明的方法进行Pca和BPH的识别时，在由以往的PSA检查被判断为疑似Pca的患者(177名)中施行针活体检查，对被诊断为BPH的患者(98名)之中的约75％(73名)的患者可判断为BPH。从以上的结果知，由本发明可以少的分析样品高灵敏度地再现性良好地识别Pca和BPH。在作为现在进行的Pca诊断法的血清PSA测试中，Pca和BPH的识别是困难的，当PSA值是4ng/ml以上时，对前列腺刺入针的活体检查变得必要。但是，施行针活体检查的患者之中被诊断为Pca的患者不过约20％，作为结果，在余下的约80％的患者不得不施行原本不要的针活体检查是现状。而且针活体检查是侵袭性的，伴随出血或感染症等的重度的有害事件。由于由本发明可以少的分析样品高灵敏度地再现性良好地识别Pca和BPH，以针活体检查的施行作为必要的病例的锁定变得可能，从而可实施至今困难的非侵袭性的Pca诊断。
【实施例2：使用HYB4单克隆抗体的Pca和BPH的识别(之2)】
由以下的顺序进行。
【(1)向载体的抗游离PSA抗体的固定化】
将作为磁性珠的Magplex微球(Luminex公司)作为载体使用，将抗游离PSA抗体根据XMAP抗体偶联试剂盒的手册固定于其表面。具体而言，向1.5ml管添加1.25×107个/1000μl的Magplex微球，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。向管添加500μl的活化缓冲液，混合10秒钟后，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。再度向管添加400μl的活化缓冲液，混合10秒钟。接下来添加50μl的磺基-NHS和50μl的EDC溶液，混合10秒钟后，于室温放置20分钟。在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。为了清洗磁性珠，添加500μl的洗涤缓冲液，混合10秒钟后，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。将此清洗操作重复计3次。使62.5μg的抗人游离PSA特异性单克隆抗体(不与克隆8A6来源的复合物PSA反应的抗游离PSA抗体)(Abcam公司)与500μl的活化缓冲液混合，向放入磁性珠的管添加。于室温缓慢混合(15-30rpm)着放置2小时。在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。为了清洗磁性珠，添加500μl的洗涤缓冲液，混合10秒钟后，在磁力分离器上静置2分钟。磁性珠沉淀后，吸出上清，除去。将此清洗操作重复计3次。最后，添加2ml的洗涤缓冲液，制备每1μl固定化6250个的抗游离PSA抗体的Magplex微球，于4℃保存至使用。
【(2)使用Luminex系统的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA的定量】
【(A)定量对象者】
作为总PSA的水平10.0ng/ml以下的Pca患者138名及BPH患者176名，从各自的患者采集血清，进行测定。进行前列腺活体检查确认患者的组织病理学诊断。患者的年龄、PSA值、病理组织学恶性度分类及临床病期示于表2(表中，非-PCa是指BPH患者)。
【表2】
特征 非-PCa PCa P
患者(n) 176 138
中位年龄(范围) 68.0(51～83) 69.0(50～84) 0.0181
中位PSA，ng/mL(范围) 5.8(2.0～10.0) 6.4(2.2～10.0) 0.0008
中位fPSA，ng/mL(范围) 0.12(0～2.43) 0.10(0～4.40) 0.1267
中位％fPSA(％，范围) 2.1(0～51.6) 1.6(0～44.0) 0.0020
中位S2,3PSA，MFI(范围) 940(395～2221) 1484(693～2971) <0.0001
活体检查Gleason合计，n(％)
5～6 24(17.5)
7 66(48.2)
8～10 48(34.3)
临床阶段(n，％)
cT1c-cT2a 127(92.0)
cT2b 3(2.2)
cT2c 7(5.1)
未知 1(0.7)
D'Amico风险类别(n，％)
低 24(17.4)
中 64(46.4)
高 50(36.2)
【(B)定量方法】
用与实施例1中记载的方法同样的方法进行。
【(C)定量结果】
示于图3左侧(图中，非-PCa是指BPH患者)。如图3左所示，Pca患者的血清的荧光强度相比BPH患者的血清的荧光强度显著地更高(P<0.0001，Man-whitney U-检验)。这即表明，Pca患者的血清中的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量相比BPH患者的血清中的该量更多。另外，从此定量结果由相关运行特性曲线(ROC曲线)进行解析时，MFI值的截止值＝1130，灵敏度是90.6％、特异性是64.2％、AUC＝0.84(图3右：S2,3PSA)。对此，总PSA测定法的AUC＝0.61、％游离PSA测定法(以游离PSA/总PSA的比作为指标的方法)的AUC＝0.60(图3右：图中，PSA是指总PSA测定法、％fPSA是指％游离PSA测定法)。从而，本发明的方法是灵敏度90％以上，AUC＝0.80以上，证实本发明的方法在Pca和BPH的识别精度上优良。对本发明的方法，总PSA测定法及％游离PSA测定法比较特异性、诊断精度、阳性诊断率、阴性诊断率的结果示于表3(表中，S2,3PSA是指本发明的方法、PSA是指总PSA测定法、％fPSA是指％游离PSA测定法)。如表3所示，由本发明的方法具有特异性60％以上、诊断精度70％以上、阳性诊断率60％以上、阴性诊断率80％以上，知可识别Pca和BPH。
【表3】
S2,3PSA PSA ％fPSA
由对S2,3PSA测试的灵敏度标准化的截止值 >1130(MFI) >4.5ng/mL <5.39％
灵敏度(％) 90.6 90.6 90.6
特异性(％) 64.2 9.7 11.9
精度(％) 75.8 45.2 46.5
阳性诊断率(％) 66.5 44.0 44.6
阴性诊断率(％) 89.7 56.7 61.8
【实施例3：使用HYB4单克隆抗体的Pca和BPH的识别与使用朝鲜槐凝集素的Pca和BPH的识别的比较】
由以下的顺序进行。
【(1)向载体的抗游离PSA抗体的固定化】
用与实施例2中记载的方法同样的方法进行。
【(2)使用Luminex系统的有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA的定量】
【(A)定量对象者】
作为总PSA的水平20.0ng/ml以下的Pca患者48名及BPH患者54名，从各自的患者采集血清，进行测定。进行前列腺活体检查确认患者的组织病理学诊断。患者的年龄、PSA值、病理组织学恶性度分类及临床病期示于表4(表中，非-PCa是指BPH患者)。
【表4】
特征 非-PCa PCa P
患者(n) 54 48
中位年龄(范围) 69.0(53～81) 72.5(58～84) 0.0737
中位PSA(ng/mL，范围) 6.65(2.4～17.1) 7.10(3.1～15.3) 0.5989
中位fPSA(ng/mL，范围) 0.23(0.05～1.09) 0.16(0.00～0.69) 0.0166
中位％fPSA(％，范围) 3.00(0.84～18.7) 2.24(0.14～9.02) 0.0083
中位S2,3PSA HYB4(MFI，范围) 922(621～2030) 1670(716～3545) <0.0001
中位S2,3PSA MAA(MFI，范围) 953(239～1436) 1095(118～1970) 0.0288
活体检查Gleason合计，n(％)
5～6 0(0)
7 26(54.2)
8～10 22(45.8)
临床阶段(n，％)
cT1c-cT2a 39(81.25)
cT2b 3(6.25)
cT2c-cT3 6(12.5)
D'Amico风险类别(n，％)
低 0(0)
中 23(47.9)
高 25(52.1)
【(B)定量方法】
【(i)使用HYB4单克隆抗体时】
用与实施例1中记载的方法同样的方法进行。
【(ii)使用朝鲜槐凝集素时】
向96孔白色板(WATMAN公司)的各孔添加(1)中制备的12500个/2μl的抗游离PSA抗体固定化Magplex微球。添加50μl无碳阻断缓冲液(船越公司)，封闭磁性珠之后，向各孔添加20μl作为分析样品的血清，于4℃放置1小时后，将磁性珠用含100μl的0.01％Tween20的Tris-缓冲盐水(TBST)清洗3次。接下来混合50μl的生物素标记朝鲜槐凝集素(Biotinylated MAA：Vector laboratories公司)，于4℃放置1小时。将磁性珠用50μl的TBST清洗3次后，混合50μl的藻红蛋白荧光染料(PE)标记链霉亲和素(Santa Cruz Biotechnology公司)，于室温放置45分钟后，在Lumine×100流量计中设置96孔白色板，测定各孔的荧光强度(MFI)。
【(C)定量结果】
示于图4左(图中，非-PCa是指BPH患者、HYB4是指本发明的方法、MAA是指使用朝鲜槐凝集素的方法)。从图4左可知，由本发明的方法可以20μl的少的血清量识别Pca患者的血清的荧光强度和BPH患者的血清的荧光强度的差异，但使用朝鲜槐凝集素的方法则不行。另外，从此定量结果由相关运行特性曲线(ROC曲线)进行解析时，从图4右可知，本发明的方法是AUC＝0.8561(S2,3PSAHYB4)。与此相比，使用朝鲜槐凝集素的方法是AUC＝0.6256(S2,3PSAMAA)、总PSA测定法的AUC(0.5305：PSA)和％游离PSA测定法的AUC(0.6582：％fPSA)无大差别。从而知，本发明的方法与使用朝鲜槐凝集素的方法比较，以少的分析样品，Pca和BPH的识别精度也优良。
【实施例4：使用HYB4单克隆抗体的Pca和BPH的识别用的截止值的设定】
为了标准化实施例2中的由本发明的方法的Pca和BPH的识别用的截止值，对27例的不含血清的样品(空白样品：磷酸缓冲液)或80例的健康者的血清(HLT样品)通过用与实施例2中记载的方法同样的方法测定的荧光强度除以作为分析样品的血清的荧光强度而以比率表示。结果示于图5。从图5可知，在HLT样品中由于不存在有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA，其荧光强度与空白样品的荧光强度大致相同。用27例的空白样品的荧光强度的平均值或中位值或80例的HLT样品的荧光强度的平均值或中位值除以Pca患者的血清的荧光强度及BPH患者的血清的荧光强度，求出比率的结果知，满足检测灵敏度90％的截止值如表5所示，疑似Pca的患者的血清的荧光强度除以空白样品的荧光强度的平均值或中位值或HLT样品的荧光强度的平均值或中位值的值可将相比截止值更高时判断为Pca或其似然性高，少的情况判断为BPH或其似然性高。
【表5】
【工业实用性】
本发明在可提供以少的分析样品高灵敏度地再现性优良地识别Pca和BPH的方法的点有产业上的利用可能性。

Claims (5)

1.用于识别前列腺癌和前列腺肥大的方法，其包括：
使含前列腺特异抗原(PSA)的分析样品和固定化了抗游离PSA抗体的载体接触，而使游离PSA结合于载体上固定化了的抗游离PSA抗体之后，
使游离PSA结合于固定化了的抗游离PSA抗体的载体和特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体接触，而使特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体结合于与载体上固定化了的抗游离PSA抗体结合的游离PSA，
测定有末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的N型糖链的游离PSA量，
通过将得到的测定量与预先设定的前列腺癌和前列腺肥大的截止值比较，将相比截止值更多的情况判断为前列腺癌或其似然性高，少的情况判断为前列腺肥大或其似然性高。
2.权利要求1所述的方法，其中含PSA的分析样品是选自血清、尿、前列腺组织提取液、精液、膀胱清洗液的至少1种。
3.权利要求1所述的方法，其中抗游离PSA抗体是抗人游离PSA特异性单克隆抗体，所述抗体不与复合物PSA反应。
4.权利要求1所述的方法，其中载体是磁性粒子。
5.用于识别前列腺癌和前列腺肥大的试剂盒，其至少含：
固定化了抗游离PSA抗体的载体，及
特异性地识别末端唾液酸残基通过α(2,3)键与半乳糖结合的糖链的单克隆抗体。
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