JP6183880B2 - ヒトコア2β1,6−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1を特異的に認識するモノクローナル抗体の使用およびこの抗体を含むキット - Google Patents
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Description
また、請求項2記載の発明は、Pcaの悪性度の判定および/またはPcaとBPHの識別を行うための、ヒトC2GnT1を特異的に認識し、分子量が14万Da〜16万Daであって、免疫グロブリンタイプがIgG1(κ)である、ハイブリドーマHU127(NITE P−1409)から産生されるモノクローナル抗体を少なくとも含むキットである。
(1)抗原の調製
ヒトC2GnT1の241〜261番目のアミノ酸配列に相当する配列番号1に記載のアミノ酸配列(NLETERMPSHKEERWKKRYEV)を有するペプチドを化学合成し、免疫原として用いた。
免疫原として用いる21アミノ酸残基からなるペプチド228μgをEtOH114μlに溶かし、超音波処理後、PBS1820μlを加えて、37℃に加温した。その後、アジュバントとして酸処理したSalmonela minnesota菌体膜画分をPBSで1mg/mlに懸濁した溶液568μlを加えて37℃で10分間静置させた。この混合溶液200μlを0,4,7,11,21,25日目にBALB/cマウスに腹腔内投与した。最終投与後3日目に、免疫したマウスの脾臓から調製したリンパ球をケーラーとミルシュタインの常法(Nature,256,495,1975)に従って、細胞融合に供した。融合相手の親細胞に、マウス骨髄腫細胞株であるP3U1(ATCC CRL−1580)を用い、融合剤としてはポリエチレングリコール4000(メルク社)を用いた。このようにして融合した細胞は、HAT培地に懸濁し、96穴のマイクロカルチャープレートに分注して培養した。約2週間後、コロニー陽性ウェルの培養上清中の抗体産生を、前立腺癌細胞株PC3の細胞破壊液を抗原とするドットブロット法、および大腸菌大量発現系を用いて作製した組み換えヒトC2GnT1タンパク質を用いたELISA法でスクリーニングした。ドットブロット法によるスクリーニングは次のようにして行った。前立腺癌細胞株PC3の細胞破壊液を、20600xgで5分間遠心し、上清20μlを採取した。ニトロセルロース膜に各検体をブロット後、室温でよく乾燥させた。0.05%Tween20−PBS(PBST)にて膜を洗浄後、5%スキムミルク−PBSにて室温で1時間ブロッキング処理を行った。PBST洗浄後、コロニー陽性ウェルの培養上清100μl/spotを室温で1時間反応させた。PBST洗浄後、0.1%スキムミルク−PBSにより2500倍に希釈したHRP標識Goat Anti−mouse IgG(H+L)(Cell signaling technology社)を室温で1時間反応させた。PBST洗浄後、ECL prime(GE healthcare社)により化学発光させ、ChemiDoc XRS Plus(Bio−Rad社)により発光を検出した。ELISA法によるスクリーニングは96穴マイクロタイタープレート(ダイナテック社、IMMULON 1B)を用いて次のようにして行った。組み換えヒトC2GnT1タンパク質をPBSで5ng/mlに調整し、75μl/wellとなるように加えた。ブランクとなるウェルにはPBS75μlを入れた。4℃で一晩静置し、組み換えヒトC2GnT1タンパク質を固相化後、3%BSA−PBS(PBS−1)を200μl/wellとなるように加え、室温で1時間放置した。PBS−1を除去後、コロニー陽性ウェルの培養上清を75μl/wellとなるように加え、室温にて1時間反応させた。培養上清を除去後、PBS100μl/wellでウェルを1回洗浄した。PBS−1で2000倍希釈した二次抗体(HRP標識Goat Anti−mouse IgG(H+L)(Cell signaling technology社))を100μl/wellとなるように加え、室温にて1時間反応させた。二次抗体溶液を除去後、ウェルをPBS100μl/wellで5回洗浄した。ペルオキシダーゼ基質としてTMB One Solution(Promega社,Cat.No.G7431)を100μl/wellとなるように加えた。遮光放置して発色が見られたところで1M HCl100μl/wellを加えて発色を停止させた。その後、測定波長450nmに設定したマイクロプレートリーダーで吸光度を測定した(対照波長は設定なし)。以上の方法によって高い抗体産生能と良好な増殖能をもつハイブリドーマクローンとしてHU127を得た。このクローンHU127由来のモノクローナル抗体は、大腸菌大量発現系を用いて作製した組み換えヒトC2GnT1タンパク質と特異的に反応し、組み換えヒトC2GnT2タンパク質と組み換えヒトC2GnT3タンパク質とは交差反応性を示さなかった(ウエスタンブロット法による)。このクローンHU127は、独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センターに受託番号NITE P−1409として寄託されている。
(2)において得られたハイブリドーマ(クローンHU127)を、75cm2フラスコ(BD pharmingen社)を用いて、5%(v/v)HLCM含有Alys Ab Pro培地(細胞科学研究所社)20ml中、37℃、5%CO2存在下で7日間培養した。この培養液中にヒトC2GnT1を特異的に認識するモノクローナル抗体が高濃度に含まれていた。クローンHU127由来の培養液は、プロテインGセファロースによるアフニティクロマトグラフィーで精製した。こうしてクローンHU127から調製したHU127モノクローナル抗体(以下「HU127mAb」と略す)は、分子量が約15万Daであって、免疫グロブリンのタイプがIgG1(κ)であった。ELISA法によるHU127mAbのヒトC2GnT1に対する特異性評価の結果を図3に示す(ELISA法のプロトコルは前述の通り)。図3から明らかなように、HU127mAbは抗体濃度依存的にシグナルを増強した。
前立腺全摘除術を施行された250例のPca患者の前立腺組織標本を、HU127mAbを用いて免疫組織染色し、その臨床的意義を調べた。
泌尿器科を受診し、PSAが高値のため前立腺マッサージ尿を採取された検体48例をニトロセルロース膜にブロットし、HU127mAbを用いてC2GnT1の検出を行った。前立腺マッサージ尿は、Pca検診の一つとして利用される、直腸から前立腺をマッサージすることにより得られる前立腺タンパク質を高濃度に含む尿検体であり、通常の検査に使用した残りの検体を凍結し保存していたものを用いた。マッサージ尿検体を自然解凍後、よく混和し、2000xgで5分間遠心し、上清20μlを採取した。ニトロセルロース膜に各検体をブロット後、室温でよく乾燥させた。0.05%Tween20−PBS(PBST)にて膜を洗浄後、5%スキムミルク−PBSにて室温で1時間ブロッキング処理を行った。PBST洗浄後、Can Get Signal Solution 1(TOYOBO社)により2μg/mlに調整したHU127mAbを室温で1時間反応させた。PBST洗浄後、Can Get Signal Solution 2(TOYOBO社)により2500倍に希釈したHRP標識Goat Anti−mouse IgG(H+L)(Cell signaling technology社)を室温で1時間反応させた。PBST洗浄後、ECL prime(GE healthcare社)により化学発光させ、ChemiDoc XRS Plus(Bio−Rad社)により発光を検出した。ブロッテイング結果とPcaまたはBPHの関係を図6と表3に示す。図6と表3から明らかなように、PcaにおいてはC2GnT1の発現がある場合(C2GnTpositive)と発現がない場合(C2GnTnegative)が併存するが、BPHにおいてはほとんどの場合においてC2GnT1の発現がないので、C2GnT1の発現がある場合にはPcaであるかその蓋然性が高いと判断できることから、前立腺マッサージ尿中のC2GnT1の存在の有無に基づいてPcaとBPHを識別できることがわかった。
以上の結果から、本発明によって提供されるモノクローナル抗体であるHU127mAbを用いて分析試料中のC2GnT1を検出することで、その存在の有無や存在量に基づいてPcaの悪性度の判定やPcaとBPHの識別を高感度に再現性よく行うことができることがわかった。現在のところ、こうした判定や識別には、前述の通り、PSAを指標にして行うことが困難なため、前立腺に針を刺入する生検が必要となる。しかしながら、針生検は侵襲的であり、出血や感染症などの重篤な有害事象を伴うことが懸念される。本発明によれば、Pcaの悪性度の判定やPcaとBPHの識別を少ない分析試料で高感度に再現性よく行うことができるので、針生検の施行を必要とする症例の絞り込みが可能になるため、これまで困難であった非侵襲的な診断の実施ができる。
Claims (2)
- 前立腺癌の悪性度の判定および/または前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うために、分析試料中のヒトコア2β1,6−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1を検出するための、ヒトコア2β1,6−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1を特異的に認識し、分子量が14万Da〜16万Daであって、免疫グロブリンタイプがIgG1(κ)である、ハイブリドーマHU127(NITE P−1409)から産生されるモノクローナル抗体の使用。
- 前立腺癌の悪性度の判定および/または前立腺癌と前立腺肥大の識別を行うための、ヒトコア2β1,6−N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ1を特異的に認識し、分子量が14万Da〜16万Daであって、免疫グロブリンタイプがIgG1(κ)である、ハイブリドーマHU127(NITE P−1409)から産生されるモノクローナル抗体を少なくとも含むキット。
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