KR101158986B1 - 인간 ｄｃｃ1에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인간 DCC1 (defective in sister chromatid cohesion 1 homolog)에 특이적인 단일클론항체, 이를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 단일클론항체를 포함하는 대장암 진단용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트 및 상기 단일클론항체를 포함하는 대장암 진단용 단백질 칩에 관한 것이다.

Description

인간 ＤＣＣ1에 특이적인 단일클론항체 및 이의 용도 {Monoclonal antibody specific to human DCC1, and uses thereof}

본 발명은 인간 DCC1 (defective in sister chromatid cohesion 1 homolog)에 특이적으로 반응하는 단일클론항체 및 이의 용도에 관한 것이다.

DCC1은 염색체 복제에 관여하는 Replication factor C (RFC) 중합체를 구성하는 단백질로 보고되어 있다 (Merkle et al., 2003; J Biol Chem). 즉 DNA 복제를 하기 위해서는 DCC1-CTF18-CTF8 단백질들이 RFC와 중합체를 형성하고 이를 통해 PCNA와 DNA가 결합하면 polymerase가 복제를 한다 (Bermudez et al., 2003; Proc. Natl. Acad. Sci.).

DCC1 유전자 (NM_024094)는 염색체의 8q24.12 위치에 존재하며 전사과정을 거쳐 발현된 단백질 (393개 아미노산, 45Kda)은 세포의 핵에서 염색체 복제에 관여한다. 따라서 DCC1은 염색체 복제 과정에 필수 단백질로 DCC1의 분자학적 기능 연구는 매우 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

현재 DCC1은 암을 포함한 질병과의 연구는 보고되어 있지 않고 분자 생물학적 기능 연구도 현저히 부족한 상태이다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 인간 DCC1의 단백질을 코딩하는 DNA를 PCR 방법에 의해 클로닝하고, 이를 이용해 DCC1의 125-393 아미노산을 코딩하는 부위의 DNA를 PCR과 제한효소를 이용해 대장균 E.coli BL21 DE3에 형질전환시켰다. Ni-NTA 컬럼을 이용해 DCC1 125-393 (125Cterm) 단백질을 분리 정제하여 Balb/c 쥐에 면역화하고 ELISA를 통해 항체 생성을 확인 후 쥐에서 비장과 골수종 세포를 분리하였다. 분리한 비장 세포와 NS-1 세포를 섞어 배양시켜 하이브리도마 세포 형성을 유도한 후 ELISA 방법을 통해 항원에 반응하는 하이브리도마 세포주를 획득하여 최종 DCC1에 대한 항체 생성을 검증하였다. 최종 선별한 항체 DCC28H4 클론 항체는 ELISA, Western blotting, Isotyping, Confocal microscopy를 통해 항체의 반응성을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인간 DCC1에 대한 특이적이고 민감도 높은 단일클론항체 개발이 목적이다. 따라서, 125-393 아미노산 부위를 단백질 항원으로 제조하여 단일클론항체를 선별하고 이를 통해 세포 내 DCC1 단백질을 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 면역조직화학법(Immunohistochemistry), ELISA, 면역형광법(Immunofluorescence) 등의 분석방법에 적용하기 위함이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 인간 DCC1 (defective in sister chromatid cohesion 1 homolog)에 특이성을 가지는 단일클론 항체 및 이를 분비하는 하이브리도마 세포를 제공한다.

본 발명자는 인간 DCC1 단백질을 고친화적으로 특이하게 인식하는 단일클론항체를 제조하고자, DCC1 유전자(GenBank 등록번호: NM_024094)가 발현되는 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로 염기서열이 5'-ATGAAGAGGACCCGCGACGAGGTG-3'(서열번호 1)과 5'-TTAAGAAATGGGTCTTCTCGAATT-3'(서열번호 2)인 프라이머를 이용하여 35 사이클 (95℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1.1분)의 DCC1의 연쇄중합반응 (RT-PCR)을 통해 얻어진 1182bp의 DCC1 유전자를 획득한 후 pTOPO 벡터를 이용하여 클로닝하고 염기 서열을 확인하여 DCC1 유전자임을 확인하였다. pTOPO 벡터에 클로닝되어 있는 DCC1 유전자를 5'-CCGGAATTCATGTATTGGGAATTAAGAAGACGT-3'(서열번호 3)과 5'-ACGCGTCGACTTAAGAAATGGGTCTTCTCGAATT-3'(서열번호 4)의 프라이머를 이용하여 DCC1의 125 아미노산부터 393 아미노산 까지를 코딩하는 DNA를 PCR로 증폭 후 EcoRI과 SalI으로 잘라내어 대장균 발현 벡터인 pET28a 벡터에 접합하고, BL21 대장균에 형질전환(transformation)시켜 269개의 아미노산으로 구성된 DCC1 재조합 단백질을 얻었다. 발현된 단백질을 이용 마우스를 면역화하고 이로부터 적출한 비장 세포와 골수종 세포를 융합하였으며 하이브리도마 중 인간 DCC1 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주 DCC28H4J를 선별하였다. 수득된 하이브리도마는 2009년 12월 29일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC 11611BP로 기탁하였다. 1 개의 클론을 최종적으로 얻어 서브클래스 타입을 확인한 결과 클론 DCC28H4J는 IgG1으로 판명되었다. 인간 DCC1에 특이적으로 반응하는 단일클론항체의 항원 반응성을 웨스턴 블랏팅 방법을 사용하여 DCC1 항원과의 고친화적 특이 반응성을 확인하였다.

단일클론항체는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있는 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler et al. European Journal of Immunology 6;511-519). 일반적으로, 단일클론항체를 분비하는 하이브리도마 세포는 항원 단백질을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 면역 세포와 암 세포주를 융합함으로써 만들어진다. 이런 두 집단의 세포 융합은 폴리에틸렌 클리콜과 같이 본 발명이 속하는 기술 분야에 공지되어 있는 방법을 이용하여 융합시키고 항체 생산 세포를 표준적인 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution)에 의한 서브 클로닝을 실시하여 균일한 세포 집단을 수득하고 난 뒤 항원에 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마 세포를 시험관 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

세포 융합에 사용되는 골수종 세포로는 마우스 유래의 p3/x63-Ag8, p3-U1, NS-1, MPC-11, SP-2/0, F0, P3x63 Ag8, V653, S194, 랫트 유래의 R210 등 다양한 세포주를 사용할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예 사용된 세포주는 골수종 세포 NS-1이다.

상기의 하이브리도마 세포가 생산하는 단일클론항체는 정제하지 않은 상태로 사용될 수 있으며, 또한 다양한 통상의 방법, 예를 들면 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 크기배제 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등을 이용하여 고순도로 정제하여 사용될 수 있다.

DCC1을 선택적으로 인식하는 단일 클론을 선별하기 위하여 통상 사용되는 다양한 방법, 예를 들면, 방사능면역분석법(RIA), 효소면역흡착법(ELISA), 면역형광법(Immunofluorescence), 웨스턴 블랏팅(Western blotting) 및 유세포 분석법 등을 사용할 수 있는데 꼭 이들로만 국한되는 것은 아니다. 본 발명의 예시된 방법은 효소면역흡착법(ELISA)이다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 대장암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서, 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명의 단일클론항체를 대장암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하고, 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하여 대장암을 진단 또는 검출할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "생물학적 시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇌척수액, 뇨 등을 포함한다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체 또는 동일한 에피토프를 특이성을 가지는 항체와 반응시켜서 DCC1의 발현 정도를 측정할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"는 생물학적 시료 중의 DCC1의 발현 여부를 확인하기 위하여 반응시킨 상기 DCC1 단백질과 단일클론항체의 결합물을 의미한다.

상기한 항원-항체 복합체의 형성은 비색법(colormetric method), 전기화학법(electrochemical method), 형광법(fluorimetric method), 발광법(luminometry), 입자계수법(particle counting method), 육안측정법(visual assessment) 및 섬광계수법(scintillation counting method)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법으로 검출할 수 있다. 그러나 반드시 이들로만 제한되지 않고 다양한 응용과 적용이 가능하다.

본 명세서상의 "검출"은 항원-항체 복합체를 검출하기 위한 것으로 여러 가지 표지체를 사용한다. 구체적인 예로는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자, 방사성 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 그러나 반드시 이들로만 국한되지는 않는다.

검출 표지체로서 사용되는 효소로는 아세틸콜린에스테라제, 알칼라인 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 호스래디쉬 퍼옥시다제, β-락타마제 등을 포함하며, 형광물로는 플루오레세인, Eu^{3 +}, Eu^{3 +} 킬레이트 또는 크립테이트 등을 포함하며, 리간드로는 바이오틴 유도체 등을 포함하며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 이소루미놀 유도체 등을 포함하며, 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등을 포함하며, 방사성 동위원소로는 ⁵⁷Co, ³H, ¹²⁵I, ¹²⁵I-볼톤(Bonton) 헌터(Hunter) 시약 등을 포함한다.

바람직하게는, 항원-항체 복합체를 효소면역흡착법(ELISA)을 이용하여 검출할 수 있다. 효소면역흡착법(ELISA)에는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 이차 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 상기 단일클론항체는 검출 표지를 가질 수 있으며, 검출표지를 가지지 않을 경우는 이들 단일클론항체를 포획할 수 있고 검출 표지를 가지는 또 다른 항체를 처리하여 확인할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 대장암 진단용 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스티렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기 단일클론항체를 포함하는 대장암 진단용 단백질 칩에 관한 것이다. 상기 단일클론항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 대장암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명은 인간 DCC1 단백질에 특이적인 단일클론항체를 제조하였으며, 상기 항체는 대장암 진단에 유용하게 이용될 수 있다. 또한, 세포 내 DCC1 단백질을 웨스턴 블랏팅(Western blotting), 면역조직화학법(Immunohistochemistry), ELISA, 면역형광법(Immunofluorescence) 등의 분석방법을 통해 DCC1의 분자 생리학적인 기능규명에 기여한다.

도 1은 pET28a-DCC1으로 대장균을 형질전환시킨 후 DCC1의 재조합 단백질 발현을 확인하고, 발현된 단백질을 친화성 컬럼 (Ni-NTA column)을 이용하여 정제한 후의 전기영동 결과이다.
도 2는 DCC1 재조합 단백질을 항원으로 주사한 후 얻어진 융합 세포주에서 생산된 항체를 pET28a-DCC1으로부터 발현된 재조합 항원에 대하여 반응하는 정도를 검사한 효소면역흡착법 (ELISA) 결과이다.
도 3은 발현한 DCC1을 전기영동하고 이를 DCC28H4J 클론의 배양 상등액을 이용하여 웨스턴 블랏팅(Western blotting)한 결과이다.
도 4는 도 2에서 DCC1 특이적 단일클론항체를 분비하는 것으로 밝혀진 DCC28H4J의 클론을 선정하여 이소타입을 결정한 결과이다. DCC28H4J 클론은 IgG1 이소타입 형태의 항체를 분비한다는 것을 보여주고 있다.
도 5는 정제한 인간 DCC1에 대한 단일클론항체를 이용하여 대장암 세포주와 대장암 환자의 조직 샘플을 웨스턴 블랏팅(Western blotting)한 결과이다. 대장암 환자 조직에서의 밴드가 나오는 것을 보아 대장암에서 과발현되는 것을 보여주고 있다.
도 6은 제조한 DCC1 항체와 핵을 염색하는 DAPI를 이용해 Colo205 대장암 세포주에 염색하여 confocal microscope로 분석한 결과 세포의 핵에 위치하는 것을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것으로, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: DCC1 의 cDNA 발현벡터 제조

DCC1 유전자(GenBank 등록번호: NM_024094)가 발현되는 세포의 cDNA 라이브러리를 주형으로 염기서열이 5'-ATGAAGAGGACCCGCGACGAGGTG-3'(서열번호 1)과 5'-TTAAGAAATGGGTCTTCTCGAATT-3'(서열번호 2)인 프라이머를 이용하여 35 사이클 (95℃ 1분, 57℃ 1분, 72℃ 1.1분)의 DCC1의 연쇄중합반응 (RT-PCR)을 통해 얻어진 1182bp의 DCC1 유전자를 획득한 후 pTOPO 벡터를 이용하여 클로닝하고 염기 서열을 확인하여 DCC1 유전자임을 확인하였다. pTOPO 벡터에 클로닝되어 있는 DCC1 유전자를 5'-CCGGAATTCATGTATTGGGAATTAAGAAGACGT-3'(서열번호 3)과 5'-ACGCGTCGACTTAAGAAATGGGTCTTCTCGAATT-3'(서열번호 4)의 프라이머를 이용하여 DCC1의 125 아미노산부터 393 아미노산 까지를 코딩하는 DNA를 PCR로 증폭 후 EcoRI과 SalI으로 잘라내어 대장균 발현 벡터인 pET28a 벡터에 접합하였다.

실시예 2: 대장균 세포 내에서 재조합 DCC1 의 발현분석

DCC1의 C-말단 125-393 아미노산을 포함하는 DCC125Cterm 유전자를 포함하는 pET28a-DCC125Cterm 플라스미드를 BL21 DE3 대장균에 형질전환하여 DCC125Cterm 단백질을 확인하였다. 이를 500mL 삼각 플라스크에 대량 배양하여 1mM IPTG로 4시간 배양하여 DCC125Cterm 단백질 발현을 유도하였다. 대장균을 원심분리로 수확후 세포 lysis 완충액을 넣어 소니케이터로 세포를 lysis 시키고 원심분리기로 상등액을 획득하였다. 상등액을 Ni-NTA 컬럼으로 His-DCC125Cterm 단백질을 정제한 후 SDS-PAGE로 단백질 발현 및 정제를 분석하였다.

실시예 3: 생쥐의 항원 면역화

하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 생쥐를 얻기 위하여, 50 ㎍ 재조합 DCC125Cterm 융합단백질과 동량의 면역보조항원(MPL-TDM Adjuvant)을 혼합하여 40 내지 45℃에서 30분간 중탕한 뒤 4 내지 6 주된 Balb/c 마우스의 복강 내에 주사하였다. 2 주 후에 25㎍씩의 DCC125Cterm 융합 단백질과 동량의 면역보조항원 (MPL+TDM Adjuvant)을 잘 혼합하여 마우스의 복강 내로 부스터 (booster) 주사하였다. 그 후 4~5 일 후에 생쥐 안구정맥에서 소량의 피를 뽑아내어 역가를 확인한 후 세포융합 실험 3일 전에 DCC125Cterm 단백질을 복강 내에 마지막 주사하였다.

실시예 4: 세포융합에 의한 하이브리도마 세포의 제조

하이브리도마 세포의 제조에 필요한 세포 융합을 실시하기 위하여, 제조한 면역원을 주사하여 얻은 생쥐의 비장세포 10⁷개와 골수종 세포 (myeloma cell) 10⁶개를 50 ml의 시험관에 모았다. 세포융합의 모 (parent) 세포로는 P3/NS/1-Ag4-1 (NS-1)을 사용하였다. 이 모세포는 10% FBS를 함유하는 DMEM 배지에서 최대밀도 5x10⁵/㎖ 정도로 항상 유지시켰다. 실시예 3에서 면역화된 생쥐를 경추탈골 후 몸통의 좌측에 위치한 비장을 꺼내서 그물망(mesh)에 곱게 갈아서 현탁액을 만들고, 이때 얻어진 비장세포를 50 ml의 원심분리관에 넣어서 원심분리하고, 이 방법을 2회 반복하여 비장 세포를 충분히 세척하였다. 비장세포와 NS-1 세포를 각각 10 ㎖씩 재현탁 시킨 후 각자의 세포 수를 세어서 비장세포와 NS-1을 10:1 이 되도록 50 ㎖의 원심분리관에서 섞고 다시 원심분리하여 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 손가락으로 가볍게 두드려서 분산시키고, 37℃에서 1 분간 유지시킨 후에 한스 완충액 (HBSS)에 들어있는 45% 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG)의 융합촉진물 (fusogen) 1 ㎖를 1 분간에 걸쳐 넣고 또 다시 1분간 약간 흔들어 주었다. 그 후 배양배지 (DMEM) 5 ㎖을 1 분간 걸쳐 첨가하고, 30 ml이 될 때까지 흔들어 주면서 서서히 DMEM을 첨가하였다. 이 현탁액을 다시 원심분리한 후 세포 침전물을 분리배지 (HAT 배지)에 1~2x10⁵/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96 웰 마이크로타이터 플레이트에 0.2 ㎖씩 분주한 후 37℃ 습윤 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.

실시예 5: 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 선별

상기 실시예 4에서 제조한 하이브리도마 세포군 중에서 DCC125Cterm 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위해 DCC125Cterm 항원을 이용한 효소면역흡착법(ELISA) 분석 방법으로 스크리닝하였다. 마이크로타이터 플레이트에 DCC125Cterm 항원을 한 웰당 각각 100 ul (1 ug/ml)씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 인산 완충용액-트윈 20 (PBST) 용액으로 세척한 후 3% skim milk로 blocking 하였다. 실온에서 한 시간 반응시킨 후 PBST 용액으로 세척하고, 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 100 ul씩을 가하여 실온에서 2 시간 동안 반응시킨 후 PBST 용액으로 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하였다. 다음 퍼옥시다제의 기질용액 (OPD)을 넣어 반응시키고, 그 반응정도는 490nm에서 흡광도로 측정하였다. 그 결과로 DCC125Cterm 항원에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 선별하였고, 여러 번 반복 실험을 통하여 DCC125Cterm 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별한 후 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 선별하였다. 이때 1 개의 클론, DCC28H4J를 최종적으로 얻었다. 이러한 하이브리도마 DCC28H4J를 2009년 12월 29일자로 국제기탁기관인 대전시 유성구 어은동 52번지 소재의 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 수탁번호 KCTC 11611BP로 기탁하였다.

또한, 이들 클론을 클로닝하여 동결하였고 상등액을 효소면역흡착법으로 역가를 측정하고, 서브클래스 타입(subclass type)을 확인하였다. 단클론 DCC28H4J은 IgG1로 판명되었으며 DCC1에 특이적으로 높은 결합력을 보여 주었다. DCC28H4J 클론은 마우스에 주사하여 복수액을 만들었다.

실시예 6: 단일클론항체의 대량 생산

상기 실시예 5에서 얻은 계속적으로 항체를 분비하는 하이브리도마 세포로부터 단일클론성 항체를 대량 생산하기 위하여 마우스(Balb/c)에 0.5 ㎖의 불완전 보조항원 (Incomplete Freund Adjuvant)을 복강 내로 주사하였다. 1 주일 후에 각각의 하이브리도마들을 실험쥐의 복강 내에 마리당 2x10⁶씩 주사하고, 7 내지 10일 후 복강이 부풀어 오른 실험쥐에서 복수액을 채취하였다. 이 복수액에 함유된 고농도의 하이브리도마 세포는 10,000 rpm에서 원심분리하여 제거하고 얻어진 상층액을 취하여 일부는 정제될 때까지 -70℃에서 보관하고 일부는 친화성 컬럼(Protein G agarose column)을 이용 분리정제하였다.

실시예 7: 본 발명의 단일 클론 항체를 이용한 대장암 세포주 및 대장암 조직에서의 DCC1 단백질 발현 연구

분리 정제된 단일 클론 항체를 이용해 대장암 세포주와 대장암 환자의 조직에서 DCC1 단백질의 발현 정도를 분석하였다. 먼저 30 ㎍의 세포주 및 조직 추출액을 SDS-PAGE 전기영동을 수행하고, PVDF membrane에 단백질을 고정시킨 후 단일 클론 항체 DCC1으로 0.1㎍/ml의 농도로 상온에서 2시간 반응시켰다. HRP가 고정된 마우스 항체를 2차 반응시킨 후 x-ray 필름에 감광시켜 DCC1 단백질의 발현을 비교분석하였다. DCC1의 대장암 세포주에서의 발현 및 대장암 환자의 암화된 조직에서 특히 과발현 되어짐을 확인하였다.

실시예 8: 본 발명의 단일클론 항체를 이용한 공초점 레이저 현미경에서의 세포내 DCC1 단백질 위치 분석

colo205 대장암 세포주를 유리 coverslip에 자라게 하고 4% 파라포름알데히드로 30분간 상온에서 세포를 고정 후 0.5% triton x100을 처리하였다. 1% bovine serum albumin으로 상온에서 30분간 blocking 후 DCC1 항체를 0.2㎍/ml의 농도로 2시간 반응시켰다. PBS 완충액으로 세척 후 2차 항체로 항-마우스-TRITC로 반응시켰고 세포 핵을 염색하기 위해 DAPI를 사용하였다. 공초점 레이저 현미경 (laser scanning confocal microscope)을 통해 405nm와 543nm 파장에서 DAPI와 DCC1 단백질의 세포 내 위치를 분석하였다.

한국생명공학연구원 KCTC11611 20100104

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3. 기탁번호 KCTC 11611BP의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 항체로서, 인간 DCC1 단백질 중 아미노 말단으로부터 125번째 내지 393번째 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인, 인간 DCC1에 특이성을 가지는 단일클론항체를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
4. 제3항의 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
5. 기탁번호 KCTC 11611BP의 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 항체로서, 인간 DCC1 단백질 중 아미노 말단으로부터 125번째 내지 393번째 아미노산 서열로 표시되는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것인, 인간 DCC1에 특이성을 가지는 단일클론항체를 포함하는 대장암 진단용 단백질 칩.
   
   

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