WO2022024995A1 - 膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍における新規がんバイオマーカー - Google Patents

膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍における新規がんバイオマーカー Download PDF

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ipmc
antibody
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伸 矢澤
憲生 久保
憲 調
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国立大学法人群馬大学
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    • G01N2470/04—Sandwich assay format

Definitions

  • the present invention relates to a novel cancer biomarker in pancreatic cancer or malignant intraductal papillary mucinous tumor.
  • pancreatic cancer shows the second highest number of deaths after lung cancer, stomach cancer, and colon cancer in Japan, and because early detection is difficult and the prognosis is poor, the number of deaths has decreased in recent years for many cancers, while pancreatic cancer Has been found to have an increasing mortality rate. Therefore, it is strongly desired to develop a new biomarker that enables early diagnosis together with a new treatment method.
  • intraductal papillary mucinous tumor hereinafter, also referred to as IPMN
  • IPMN intraductal papillary mucinous tumor
  • IPMN adenoma
  • IPMA cancer
  • IPMC malignant IPMN
  • IPMN patients are usually determined based on the IPMN International Consensus Guidelines for the presence or absence of carcinogenic risk based on their respective imaging findings, and surgical indications are determined. IPMA that is not indicated for surgery may be included, and its correct diagnosis rate is reported to be 64.3% (Non-Patent Document 1).
  • ⁇ 1 -acid glycoprotein (hereinafter also referred to as AGP) is an inflammatory marker whose blood concentration increases during inflammation, but the present inventors have so far elucidated the cancerous changes related to the sugar chain of AGP molecules.
  • AGP fucosylated AGP
  • fAGP fucosylated AGP
  • Non-Patent Document 3 the present inventors have improved the possibility of application to early detection of recurrence / metastasis and determination of therapeutic effect (Non-Patent Document 3) in various cases of chemotherapy, and further, in recent years, epoch-making therapeutic effect has been improved. It also clarifies the possibility of application of the immunotherapy to determine its effect (Non-Patent Document 4).
  • IPMC biomarkers especially by providing proper preoperative diagnosis of benign or malignant tumors in IPMN, will increase the accuracy rate of IPMC and assist conventional diagnostic imaging.
  • the challenge is to provide new biomarkers useful for the rapid diagnosis of IPMC.
  • fAGP is a useful biomarker for the diagnosis of pancreatic cancer or IPMC, and arrived at the present invention.
  • the present invention is as follows.
  • IPMC intraductal papillary mucinous tumor
  • fAGP fucosylated ⁇ 1 -acidic glycoprotein
  • the above-mentioned measurement measures the amount of fucosyl sugar chains in ⁇ 1 -acid glycoprotein (AGP).
  • the method according to [1] or [2] which comprises a step of measuring the amount of fucosyl sugar chain by an enzyme immunoassay (EIA method).
  • EIA method enzyme immunoassay
  • [4] The method according to [3], wherein the desialylation is performed by sialidase treatment, and the defucosylation is performed by periodic acid oxidation.
  • [5] The method according to [3] or [4], wherein the lectin is Heero Chawantake lectin (AAL).
  • a diagnostic kit for pancreatic cancer or malignant intraductal papillary mucinous tumor IPMC.
  • a kit containing B) an EIA substrate on which an anti-AGP antibody is immobilized, and
  • C a reagent for defucosylating the anti-AGP antibody immobilized on the EIA substrate.
  • the kit according to [9], further comprising D) a labeled lectin and / or (E) an avidin-labeled enzyme.
  • IPMC can be discriminated as IPMA, which is also useful for predicting the prognosis of IPMN.
  • One embodiment of the present invention is a data acquisition method for the diagnosis of pancreatic cancer or IPMC, which comprises measuring the amount of fAGP in a sample.
  • the data acquisition method of this embodiment is for assisting the diagnosis of pancreatic cancer or IPMC.
  • This method is useful for distinguishing between IPMC and IPMA, and is useful for predicting the prognosis of IPMN, especially for diagnosing the development of pancreatic cancer in IPMN.
  • IPMC which is a malignant tumor
  • IPMA which is a benign tumor
  • the animal from which the sample is derived is preferably a mammal such as a human or a rat, and more preferably a human.
  • the sample is preferably a human-derived body fluid, and examples thereof include blood, lymph, cerebrospinal fluid, urine, and ascites. Collection and storage can be done according to conventional methods. In the case of blood, plasma or serum is preferable, and its preparation and storage can be performed according to a conventional method.
  • the present invention may include a step of collecting a sample from an animal to be diagnosed.
  • the amount of fAGP is not particularly limited, but it can be measured by measuring the amount of fucosyl sugar chain in AGP. For example, as shown below, the measurement may be performed based on the method described in Patent Document 1, and according to this measurement method, the amount of fAGP can be easily measured from a very small amount of serum sample (for example, 1 drop, 25 ⁇ l).
  • the measuring method may include a step of desialylated AGP in the sample. If the sugar chain of AGP in the sample remains hypersialylated, the capture of AGP by the anti-AGP antibody and the detection of the fucosyl group by the lectin in the EIA method in the subsequent step are inhibited.
  • Desiarylization is not particularly limited as long as it can release the sialic acid residues of ⁇ 2,3 and ⁇ 2,6 which are sialic acid bonds at the non-reducing end of the AGP sugar chain. It is preferably carried out using a desialylation enzyme, and examples thereof include sialidase (also known as neuraminidase).
  • sialidase also known as neuraminidase.
  • the sialidase is not particularly limited as long as it is an exo type having specificity for the sialyl groups of ⁇ 2,3 and ⁇ 2,6 existing at the non-reducing end of the AGP sugar chain.
  • Cialidases derived from various organisms can also be used. The sialidase may be used alone or in combination of two or more, but a sialidase derived from Arthrobacter ureafaciens, which efficiently hydrolyzes both sialyl bonds, should be used. Is preferable.
  • the amount of sialydase used in the desialylation treatment with sialidase is not particularly limited as long as the sialic acid residue can be sufficiently released from the non-reducing end of the sugar chain, but is preferably 0.005 mU or more, more preferably 0.01 mU or more, per 1 ⁇ g of AGP. More preferably, it is 0.02 mU or more. On the other hand, it is preferably 2 mU or less, more preferably 1.5 mU or less, and further preferably 1 mU or less.
  • the amount of enzyme required to decompose 1 ⁇ mol of sialic acid per minute at pH 5.0 and 37 ° C. is 1 U (unit).
  • the treatment time for desialylation with sialidase is not particularly limited as long as the sialic acid residue can be sufficiently released from the non-reducing end of the sugar chain, but is preferably 20 minutes or longer, more preferably 30 minutes or longer, still more preferably 1. It's more than an hour.
  • the upper limit is not particularly limited, but may be, for example, 2 hours or less.
  • the treatment temperature for desialylation with sialidase is not particularly limited as long as the sialic acid residue can be sufficiently released from the non-reducing end of the sugar chain, but is preferably room temperature (for example, 25 ° C.) or higher, more preferably 30 ° C. or higher. , More preferably 35 ° C. or higher.
  • the upper limit is the temperature at which the sialidase maintains its activity, preferably 38 ° C. or lower, and particularly preferably 37 ° C.
  • a general buffer solution when a biochemical method is used can be used.
  • acetate buffer, phosphate buffer, citrate buffer, borate buffer, tartrate buffer, phosphate buffered saline (PBS) and the like can be mentioned.
  • concentration of the buffer solution the general concentration when the biochemical method is used can be used.
  • the pH of the buffer solution is not particularly limited as long as desialylation proceeds, but is preferably 6.0 or more, more preferably 6.5 or more, still more preferably 6.8 or more. On the other hand, it is preferably 8.0 or less, more preferably 7.5 or less, and even more preferably 7.2 or less.
  • sialidase after desialylation with the sialidase.
  • Deactivation can follow the usual law. For example, treatment at 90 ° C. for 5 minutes in a state of being diluted with 490 ⁇ l PBS per 10 ⁇ l of serum can be mentioned.
  • the step of desialylated includes a step of mixing the sample and the sialidase, a step of treating the mixed solution of the sample and the sialidase at a temperature at which the sialidase remains active for an arbitrary time, and a step of inactivating the sialidase. It may be included.
  • the measuring method recognizes an anti-AGP antibody immobilized on a substrate and defucosylated sugar chains after the step of desialylated AGP in the sample, and the fucosyl group of the desialylated AGP. It includes a step of measuring the amount of fucosyl sugar chain by an enzyme immunoassay (EIA method) using a lectin.
  • EIA method enzyme immunoassay
  • This step is, for example, a step of defucosylating the sugar chain of the anti-AGP antibody, a step of fixing the anti-AGP antibody having the sugar chain defucosylated on the substrate, and a step of adding a sample to the substrate.
  • a step of binding an anti-AGP antibody obtained by defucosylated sugar chains fixed on a material to AGP in a sample a step of binding a lectin that recognizes the fucosyl group of AGP bound to the anti-AGP antibody, and a lectin as EIA. It may include a step of measuring the amount of fucosyl sugar chain by measuring by the method.
  • the anti-AGP antibody immobilized on the substrate used in the EIA method is a defucosylated sugar chain.
  • the lectin that recognizes the fucosyl group of the desialylated AGP when EIA is performed is not only the fucosyl group of the AGP. , It binds to the fucosyl group of the anti-AGP antibody immobilized on the substrate, and the amount of the fucosyl group of the AGP sugar chain cannot be accurately measured.
  • the base material examples include wells provided on a plate, beads, and the like.
  • the anti-AGP antibody used for EIA which is immobilized on a substrate and has sugar chains defucosylated, is one in which the anti-AGP antibody before defucosylation is immobilized on the substrate and then defucosylated on the substrate.
  • the sugar chain may be defucosylated in advance at the stage of fixing to the substrate.
  • the method used in the conventional EIA method can be used as the method for immobilizing the substrate.
  • the method is not particularly limited, but treatment with a defucosylation solution is preferable, for example. , Perioic acid oxidation using a sodium periodate solution.
  • periodic acid its concentration is not particularly limited as long as defucosylation is sufficient, but it is preferably 5 mM or more, more preferably 7 mM or more, still more preferably 8 mM or more. On the other hand, it is preferably 20 mM or less, more preferably 15 mM or less, still more preferably 12 mM or less.
  • the treatment time for defucosylation using periodic acid is not particularly limited as long as the defucosylation is sufficient, but is preferably 20 minutes or longer, more preferably 30 minutes or longer, still more preferably 50 minutes or longer. ..
  • the upper limit is preferably 2 hours or less in order to keep the damage of the antibody used by the defucosylation treatment low.
  • the treatment temperature for defucosylation using periodic acid is not particularly limited as long as the defucosylation is sufficient, but is preferably 15 ° C. or higher, more preferably 20 ° C. or higher, still more preferably 25 ° C. or higher. .. On the other hand, it is preferably 40 ° C. or lower, more preferably 35 ° C. or lower, and further preferably 30 ° C. or lower.
  • the buffer solution when periodic acid a general buffer solution when a biochemical method is used can be used.
  • examples thereof include acetate buffer, phosphate buffer, citrate buffer, borate buffer, tartrate buffer, Tris buffer, phosphate buffer physiological saline (PBS) and the like.
  • the buffer solution may appropriately contain a surfactant such as Tween 20 or Tween 80.
  • concentration of the buffer solution and the surfactant a general concentration when using a biochemical method can be used.
  • the pH of the buffer solution is not particularly limited as long as defucosylation progresses, but is preferably 6.0 or more, more preferably 6.5 or more, still more preferably 6.8 or more. On the other hand, it is preferably 8.0 or less, more preferably 7.5 or less, and even more preferably 7.2 or less.
  • Defucosylation using periodic acid is preferably performed under shading. After defucosylation with periodic acid, the substrate is washed with buffer and kept warm at room temperature for 2 hours to 4 ° C overnight with 1% BSA-containing PBS, and the washing solution (for example, 0.05% Tween 20-containing PBS). ), Then EIA can be performed, and the same preparation as the preparation of the base material used for conventional EIA can be performed.
  • the activity of the antibody may be protected by performing a reduction treatment after defucosylation using periodic acid, but in the measurement method according to the present invention, the reduction treatment may or may not be performed. Since there is no significant difference in the quantification results of fucosyl sugar chains in AGP, it is preferable not to include the reduction treatment step after defucosylation.
  • the step of defucosylating the sugar chain of the anti-AGP antibody is a step of contacting the defucosylated solution with the anti-AGP antibody on the substrate after fixing the anti-AGP antibody on the substrate, and the step is fixed on the substrate. It may also include a step of treating the sugar chain of the anti-AGP antibody at an arbitrary temperature for an arbitrary time and a step of washing the substrate.
  • the step of fixing the anti-AGP antibody obtained by defucosyllating the sugar chain on the substrate can be performed by a method known to those skilled in the art, a step of bringing the substrate into contact with the anti-AGP antibody, and an anti-AGP antibody on the substrate.
  • It may include a step of treating at an arbitrary temperature for an arbitrary time and a step of washing the substrate in order to fix the antibody.
  • the reaction is not particularly limited and can be carried out at any time and temperature.
  • the step of binding the lectin that recognizes the fucosyl group of AGP bound to the anti-AGP antibody is not particularly limited as long as the lectin can recognize the fucosyl group on AGP, and can be performed at any time and temperature.
  • a step of pre-labeling the lectin with biotin may be included.
  • the lectin may be any lectin that binds to the Fuc ⁇ 1,3GlcNAc sugar chain present in the AGP sugar chain, and is preferably Heero Chawantake lectin (AAL). These may be natural or artificially produced. Further, a recombinant protein having high homology with natural AAL may be used, and high homology means, for example, 80% or more homology.
  • AAL may be labeled or modified as used in conventional EIA methods.
  • EIA electrowetting-in-senor
  • lectin itself may be labeled and used, or for example, the lectin is pre-labeled with biotin, the fucosyl group of AGP is bound to the biotin-labeled lectin, and then the avidin-labeled enzyme is bound.
  • Color development or luminescence from the reaction of the enzyme may be used for detection.
  • HRP horseradish peroxidase
  • ALP alkaline phosphatase
  • the substrate may be any one corresponding to the enzyme used, for example, 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) or 2,2'-azinobis [3-2'-azinobis [3-], if it is an HRP substrate.
  • TMB 3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • 2,2'-azinobis 2,2'-azinobis [3-2'-azinobis [3-]
  • HRP substrate Ethylbenzothiazolin-6-sulfonic acid] -diammonium salt (ABTS), o-phenylenediamine dihydrochloride (OPD) and the like.
  • ABTS o-phenylenediamine dihydrochloride
  • OPD o-phenylenediamine dihydrochloride
  • Examples of the substrate for ALP include paranitrophenyl phosphate (PNPP).
  • the EIA method in this step can be performed in the same manner as the conventional method.
  • the type of reagent, the concentration of the reagent, the method for detecting fluorescence and color development, etc. can all follow the conventional method.
  • a lectin that recognizes and binds to the fucosyl group of desialylated AGP is designated as biotin-labeled AAL, and the case where the binding is detected by color development to the substrate TMB by adding the avidin-labeling enzyme HRP is described.
  • an EIA substrate on which an anti-AGP antibody defucosylated by periodic acid oxidation is immobilized is prepared.
  • a blocking buffer commonly used such as PBS containing 1% BlockAce with 10% sorbitol or PBS containing 2% bovine serum albumin (BSA), preferably 10%. Blocking may be performed by PBS containing 1% BlockAce with sorbitol.
  • BSA bovine serum albumin
  • the measuring method according to the present invention preferably further includes a step of converting the amount of fucosylated AGP from the amount of color development. Examples of the method used in this step include a method of converting the amount of fucosylated AGP in a sample from the amount of color development or luminescence measured by the above EIA using a calibration curve.
  • the calibration curve is, for example, desialylated from the hyperfucosylated AGP obtained by the method described in Non-Patent Document 5 from serum or ascites, and the amount of fucosylated AGP obtained by the same EIA method. It is preferable to prepare from the relationship between the amount of color development or the amount of light emission (U / ml).
  • the amount of fucosyl sugar chains in the ⁇ 1 -acidic glycoprotein (AGP) or the converted amount of fucosylated AGP in the thus obtained sample is associated as an index of pancreatic cancer or malignant intraductal papillary mucinous tumor (IPMC). It may include a step.
  • the measuring method further includes a step of quantifying AGP in the sample and a step of normalizing the amount of fucosyl sugar chain by the amount of AGP.
  • the measuring method preferably includes a step of quantifying AGP in the sample.
  • the method for quantifying AGP in a sample is not limited, but for example, an anti-AGP antibody immobilized on a substrate and an enzyme-labeled enzyme are used using a solution obtained by desialylating the AGP in the sample and then diluting it.
  • a method of performing a sandwich ELISA method using the same anti-AGP antibody and converting the amount of color development or luminescence based on the enzyme reaction into the concentration of AGP in the sample using a calibration curve can be mentioned.
  • the calibration curve is, for example, desialylated from commercially available human plasma AGP (specifically, Sigma-Aldrich) (concentration is known) as a standard sample, and the antibody fixed to the substrate is used. It is preferable to carry out a sandwich ELISA method using an AGP antibody and an enzyme-labeled anti-AGP antibody, and prepare from the relationship between the AGP amount (concentration) and the color development amount or the luminescence amount ( ⁇ g / ml).
  • the measuring method further comprises a step of normalizing the amount of fucosyl sugar chains in the sample obtained above with the amount of AGP (U / ⁇ g) obtained in the above-mentioned "step of quantifying AGP in the sample". It is preferable to include it.
  • the conventional method it was possible to analyze the fucose added to the N-type sugar chain by the CAIE method or MALDI-TOF-MS, but the operation was complicated and the results could not be obtained quickly, so its quantification was possible.
  • this step makes it possible to easily and quickly calculate the amount of fucocil sugar chain per unit amount of AGP in a sample.
  • the diagnostic criteria for having pancreatic cancer or IPMC are not particularly limited, but for example, a sample in which the amount of fAGP in the sample is higher than the reference value or collected from a healthy person or an IPMA patient.
  • the diagnostic criteria may be that the patient has pancreatic cancer or IPMC if the amount of fAGP is greater than the amount of fAGP in the sample, and the amount of fAGP in the sample is greater than the reference value or in the sample taken from an IPMA patient.
  • the diagnostic criteria may be that the patient has pancreatic cancer or IPMC if the amount of fAGP is greater than the amount of fAGP.
  • the reference value may be a predetermined cutoff value based on the measured value of a healthy person and / or the measured value of an IPMA patient by a method known to those skilled in the art.
  • the cutoff value may be The average value (mean) + 3 ⁇ standard deviation (SD) of the measured values of healthy subjects may be used.
  • SD standard deviation
  • a healthy person means a person who does not have cancer, acute inflammation, or a disease associated with chronic inflammation.
  • the diagnosis may be a diagnosis of the therapeutic prognosis of pancreatic cancer or IPMC.
  • Treatments for pancreatic cancer include one or more selected from the group consisting of surgery, chemotherapy, radiation therapy, antibody therapy and immunotherapy. Preferably, it is one or more selected from the group consisting of surgery, chemotherapy, and radiation therapy. Examples of immunotherapy include immunotherapy using antibody drugs and molecular-targeted drugs.
  • the treatment of IPMC includes surgery. Without particular limitation, for example, a sample collected from a patient after treatment is measured according to the criteria described in the above-mentioned diagnostic criteria section for pancreatic cancer or malignant intraductal papillary mucinous tumor (IPMC), and the pancreas. If it is determined to have cancer or IPMC, it may be determined that there is no therapeutic effect or the prognosis is poor.
  • kits for pancreatic cancer or IPMC are a diagnostic kit for pancreatic cancer or IPMC.
  • (C) Reagent for defucosylating the anti-AGP antibody immobilized on the EIA substrate (D) Labeled lectins such as biotin-labeled lectins (eg, AAL), and (E) Avidin-labeled enzymes (eg, HRP).
  • the kit further comprises (F) a sandwich ELISA substrate on which an anti-AGP antibody is immobilized for quantifying AGP in a sample, and (G) a solution containing an enzyme (eg, HRP) -labeled anti-AGP antibody. It is preferable to include. Further, it is preferable that the kit further contains a diluting buffer solution, a blocking buffer solution, and an fAGP standard product.
  • a fAGP standard product for example, ascites derived from a human cancer patient or a product partially purified from serum can be used, or a human-derived cultured cell, for example, a culture solution such as hepatoma cell line can also be used.
  • Preferred types and concentrations of the above (A), (C) to (E), (G), labeling, conditions at the time of use, etc. relate to the measurement of the amount of fAGP included in the above-mentioned data acquisition method according to the present invention.
  • each solution may be appropriately concentrated before use, and can be appropriately diluted with water or the like immediately before use.
  • any of the above (A), (C) to (E), and (G) contains a plurality of solvents and solutions, they may be mixed and contained in one container. It may be contained in separate containers.
  • the embodiment described in the above-mentioned description of the measurement method according to the present invention can be mentioned.
  • the kit is for diagnosing pancreatic cancer or IPMN, but as for the diagnostic criteria for having pancreatic cancer or IPMN, the criteria described in the above-mentioned data acquisition method according to the present invention can be used. ..
  • the kit can further include a manual or the like describing a method for measuring the amount of fAGP included in the above-mentioned data acquisition method according to the present invention.
  • Example 1 [Comparison of serum fAGP levels in IPMN patients, pancreatic cancer patients and healthy subjects] Using the specific measurement method of fucosyl sugar chain on AGP molecule (Patent Document 1 and Non-Patent Document 6) already established by the present inventors, it is used as a preoperative serum and a negative control for IPMN patients and pancreatic cancer patients. The amount of fAGP in the serum of healthy subjects was measured. The serum sample used in each sample is very small (1 drop, 25 ⁇ l). In addition, IPMN patients were classified into IPMC and IPMA by postoperative lesion histology examination, which is a method known to those skilled in the art.
  • fAGP in serum To measure the amount of fAGP in serum, first measure the amount of AGP in serum by the sandwich ELISA method using anti-AGP antibody for standardization, and then the EIA method using anti-AGP antibody / fucose-binding lectin (AAL). The amount of fAGP in serum was measured by the above method, and the amount of fucosyl sugar chain per unit amount of AGP in serum was calculated from these measurement results. IPMN patients were divided into IPMC and IPMA, and compared with pancreatic cancer patients and healthy subjects as negative controls (Fig. 1).
  • n 40) (904.37 ⁇ 1708.32U / ⁇ g) was significantly higher than IPMC (P ⁇ 0.05).
  • the cutoff value (mean + 3S.D.
  • pancreatic cancer patients 97.5% (39/40), IPMC patients: 92.86% (13/14), IPMA patients: 28.6% (2/7), healthy subjects: 1.9% (1/53). rice field.
  • the correct diagnosis rate of IPMC was calculated based on this cutoff value, it was 85.7% for IPMC, which was significantly higher than the correct diagnosis rate (58.8%) by conventional diagnostic imaging. It was also shown that the positive rate in pancreatic cancer is extremely high.
  • Example 2 [Comparison of preoperative blood levels of fAGP and other cancer markers for pancreatic cancer in IPMN patients]
  • Table 1 shows the amount of fAGP in serum for each IPMN patient measured by Example 1.
  • the sample used in Example 1 using four antigens CEA, CA19-9, SPAn-1, DUPAN-2) used as markers for conventional pancreatic cancer by a method known to those skilled in the art.
  • the results of measurements using serum samples from the same patient are also shown in Table 1.
  • CEA 7.1%
  • SPAn-1 7.1%
  • DUPAN-2 7.1%
  • any marker other than CA19-9 was also low (Table 1).
  • CA19-9 has a sialyl Le a (NANA ⁇ 2,3Gal ⁇ 1,3 [Fuc ⁇ 1,4] GlcNAc) as its antigenic determinant, and Le a (Gal ⁇ 1,3 [Fuc ⁇ 1,3] GlcNAc), which is a common antigen of human Lewis blood group antigens. 4] GlcNAc)
  • Le a Gal ⁇ 1,3 [Fuc ⁇ 1,3] GlcNAc
  • GlcNAc There is a key enzyme that has a common structure with the antigen and is involved in the synthesis of the same Fuc ⁇ 1,4 sugar chain. In Japan, about 20% of humans are negative for Lewis blood group antigens, Fuc ⁇ 1,4 sugar chains are not synthesized, and therefore sialyl Lea is not genetically synthesized.
  • CA19-9 is It cannot be a cancer marker.
  • the inventors have already clarified that typing a Lewis blood group is difficult with ordinary serological methods, and that type conversion often occurs in relation to cancer, and accurate typing cannot be performed (non-patent literature). 7).
  • FUT6 enzyme activity measurement or FUT6 gene typing is essential for accurate type determination of Lewis blood group (Non-Patent Document 8).
  • the results in Table 1 show that the sensitivity to IPMC diagnosis by CA19-9 measurement is low, and the superiority of IPMN diagnosis and IPMC discrimination by fAGP measurement is clear. ..
  • the fAGP value in serum measured by the specific measurement method for fucosyl sugar chains on AGP molecules already established by the present inventors is significantly increased in pancreatic cancer, and is conventionally used in preoperative diagnosis of IPMN patients.
  • IPMC could be discriminated with a higher positive rate than those of the cancer markers. This has shown the possibility of significantly improving the accuracy rate by conventional diagnostic imaging for surgical indication cases (IPMC) in IPMN patients.
  • IPMC diagnostic imaging for surgical indication cases

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Abstract

フコシル化α１-酸性糖蛋白質（fAGP）が、膵臓がん及び悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断に有用であることを明らかにした結果、新たな膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）のバイオマーカー、特に、膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMN）における良性腫瘍か悪性腫瘍かの適正な術前診断を行うことによって、悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の正診率を上げ、従来の画像診断を補助する、IPMCの迅速な診断に有用な新たなバイオマーカーを見出した。

Description

膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍における新規がんバイオマーカー
　本発明は、膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍における新規がんバイオマーカーに関する。
　膵臓がんは我が国では肺がん、胃がん、大腸がんに次ぐ死亡数を示し、早期発見が困難で予後も悪いために、多くのがんでは近年死亡数の減少が見られる一方で、膵臓がんでは死亡率の増加傾向が認められている。従って新たな治療法とともに、早期診断を可能とする新規バイオマーカーの開発が強く望まれている。
　一方、膵管内乳頭粘液性腫瘍（以下、IPMNとも言う）は膵臓に最も多く見られる嚢胞性腫瘍で、がん化する可能性のある疾患である。IPMNにおいては、腺腫（良性IPMN、以下IPMAとも言う）から、がん（悪性IPMN、以下IPMCとも言う）へと進展することが知られている。検査法の進展に伴いIPMNの診断は比較的容易になったものの、治療の基本となる病変切除に関しては問題が残されている。即ち、IPMN患者は、通常IPMN国際コンセンサスガイドラインに基づき、それぞれの画像所見から発がんリスクの有無を検討して、手術適応が決定されているものの、この中にはがん化したIPMC以外に、本来手術適応ではないIPMAが含まれることがあり、その正診率は64.3%と報告されている（非特許文献1）。
　更に従来から利用されている膵臓がんをターゲットとした血清のがんマーカーによる術前診断もその陽性率の低さから、診断への応用は困難であった。従って、膵臓切除に伴うリスクも考慮し、IPMNにおけるがん化の早期診断並びにIPMCの正診率の向上に有用な新たなバイオマーカーの確立が急務であった。
　また、α1-酸性糖蛋白質（以下、AGPとも言う）は炎症時に血中濃度が亢進する炎症マーカーであるが、本発明者らはこれまでにAGP分子の糖鎖に関するがん性変化を解明し、フコシル化AGP（以下、fAGPとも言う）の量的変化ががんの悪性度のみならず、がんの予後予測や治療効果の判定に有用であることを明らかにした（特許文献1、非特許文献2）。さらに本発明者らは、種々の化学療法施行例において、再発・転移の早期検出や治療効果判定への応用の可能性（非特許文献3）、更には近年、画期的な治療効果を上げている免疫療法についてその効果判定への応用の可能性（非特許文献4）なども明らかにしている。
特開2019-11978号公報
Dig. Dis. Sci., 63:860-867, 2018 Cancer, 101:2825-2836, 2004 PLoS ONE, 11(6)e0156277, 2016 Sci. Reports, doi.org:10.1038, 2019 BioMed. Res. Inter., Vol 2013, Article ID 834790, 2013 Clinica Chimica Acta, 478:120-128, 2018 Jpn. J. Cancer Res. (Gann), 79:538-543, 1988 Cancer Res., 55:1473-1478, 1995
　新たな膵臓がん又はIPMCのバイオマーカーを提供すること、特に、IPMNにおける良性腫瘍か悪性腫瘍かの適正な術前診断を行うことによって、IPMCの正診率を上げ、従来の画像診断を補助する、IPMCの迅速な診断に有用な新たなバイオマーカーを提供することを課題とする。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、fAGPが、膵臓がん又はIPMCの診断に有用なバイオマーカーとなることを見出し、本発明に到達した。
　すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］検体中のフコシル化α１-酸性糖蛋白質（fAGP）の量を測定することを含む、膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断のためのデータ取得方法。
［２］前記検体が、血漿又は血清である、［１］に記載の方法。
［３］前記測定が、α1-酸性糖蛋白質（AGP）におけるフコシル糖鎖の量を測定するものであって、
　検体中のAGPを脱シアリル化する工程、及び
　基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体と、前記脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（EIA法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記脱シアリル化がシアリダーゼ処理によって行われ、前記脱フコシル化が過ヨウ素酸酸化によって行われる、［３］に記載の方法。
［５］前記レクチンがヒイロチャワンタケレクチン（AAL）である、［３］又は［４］に記載の方法。
［６］さらに、以下の工程を含む、［３］～［５］のいずれかに記載の方法。
　前記検体中のAGPを定量する工程、及び
　前記フコシル糖鎖の量を前記AGP量で規格化する工程。
［７］前記診断が、検体中のfAGPの量が、基準値よりも多い又は健常者もしくは良性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMA）患者から採取された検体中のfAGPの量よりも多い場合に、膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）であるという基準に基づく、［１］～［６］のいずれかに記載の方法。
［８］前記診断が、がん治療の予後の診断である、［１］～［７］のいずれかに記載の方法。
［９］膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断用キットであって、
　（Ａ）脱シアリル化用試薬、
　（Ｂ）抗AGP抗体が固定されたEIA用基材、及び
　（Ｃ）EIA用基材に固定化された抗AGP抗体を脱フコシル化するための試薬を含む、キット。
［１０］さらに、（Ｄ）標識レクチン及び／又は（Ｅ）アビジン標識酵素を含む、［９］に記載のキット。
［１１］さらに、
　（Ｆ）検体中のAGPを定量するための、抗AGP抗体が固定されたサンドイッチELISA用基材、及び
　（Ｇ）酵素標識抗AGP抗体を含む溶液、
を含む、［９］又は［１０］に記載のキット。
　本発明によれば、検体中のfAGPの量を測定することによって、膵臓がん又はIPMCの診断に有用な新規バイオマーカーの提供が可能となる。本バイオマーカーを指標とすることでIPMCをIPMAと判別することができ、IPMNの予後の予測にも有用である。
膵臓がん患者及びIPMN患者における血清中のfAGP量の測定結果を示す。図中の各横線はそれぞれの群の平均値を表す。
　本発明の一実施態様は、検体中のfAGPの量を測定することを含む、膵臓がん又はIPMCの診断のためのデータ取得方法である。
　本実施態様のデータ取得方法は、膵臓がん又はIPMCの診断を補助するためのものである。本方法はIPMCとIPMAの判別に有用であり、IPMNの予後の予測、特にIPMNにおける膵臓がん発生の診断に有用である。なお、本発明において、悪性腫瘍であるIPMCは膵臓がんに含まれることがあるが、良性腫瘍であるIPMAは膵臓がんには含まれない。
　検体の由来動物は、ヒトやラットなどのほ乳動物が好ましく、ヒトがより好ましい。検体としては、ヒト由来の体液が好ましく、例えば、血液、リンパ液、髄液、尿、腹水などが挙げられる。採取や保存は常法に従うことができる。また、血液の場合、血漿又は血清が好ましく、その調製や保存は常法に従うことができる。
　本発明は、診断対象の動物から検体を採取する工程を含んでもよい。
　fAGP量の測定は、特に制限されることはないが、AGPにおけるフコシル糖鎖の量を測定することによって行うことができる。例えば、以下に示すように特許文献１に記載する方法に基づき測定してもよく、この測定方法によれば、簡便かつごく少量の血清試料（例えば1滴、25μl）からfAGP量を測定できる。
［検体中のAGPを脱シアリル化する工程］
　該測定方法は検体中のAGPを脱シアリル化する工程を含んでもよい。検体中のAGPの糖鎖が高シアリル化されたままであると、後工程におけるEIA法における抗AGP抗体によるAGPの捕捉及びレクチンによるフコシル基の検出が阻害されてしまう。
（脱シアリル化）
　脱シアリル化は、AGP糖鎖の非還元末端のシアル酸結合であるα2,3及びα2,6のシアル酸残基を遊離できるものであれば特に制限されない。脱シアリル化酵素を用いて行われることが好ましく、例えば、シアリダーゼ（別名：ノイラミニダーゼ）が挙げられる。
　シアリダーゼとしては、AGP糖鎖で非還元末端に存在するα2,3及びα2,6のシアリル基に対して特異性を持つエキソ型であれば特に制限されない。また、種々の生物由来のシアリダーゼを使用することもできる。シアリダーゼは1種単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよいが、両シアリル結合を効率よく加水分解するアルスロバクター・ウレアファシエンス（Arthrobacter ureafaciens）由来のシアリダーゼを用いることが好ましい。
　シアリダーゼによる脱シアリル化処理におけるシアリダーゼの使用量は、糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を十分に遊離できれば特に制限されないが、AGP1μgあたり、好ましくは0.005mU以上、より好ましくは0.01mU以上、さらに好ましくは0.02mU以上である。一方、好ましくは2mU以下、より好ましくは1.5mU以下、さらに好ましくは1mU以下である。
　なお、基質としてシアリルラクトースを使用し、pH5.0、37℃において1分間に1μmolのシアル酸を分解するのに要する酵素量を1U（ユニット）とする。
　また、シアリダーゼによる脱シアリル化の処理時間は、糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を十分に遊離できれば特に制限されないが、好ましくは20分以上、より好ましくは30分以上、さらに好ましくは1時間以上である。一方、上限は特に制限されないが、例えば、2時間以下としてもよい。
　また、シアリダーゼによる脱シアリル化における処理温度は、糖鎖の非還元末端からシアル酸残基を十分に遊離できれば特に制限されないが、好ましくは室温（例えば、25℃）以上、より好ましくは30℃以上、さらに好ましくは35℃以上である。一方、上限はシアリダーゼが活性を保つ温度であって、好ましくは38℃以下であり、特に好ましくは37℃である。
　また、シアリダーゼによる脱シアリル化における緩衝液としては、生化学的手法を用いる場合の一般的な緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等が挙げられる。緩衝液の濃度も、生化学的手法を用いる場合の一般的な濃度を用いることができる。
　緩衝液のpHは、脱シアリル化が進行すれば特に制限されないが、好ましくは6.0以上、より好ましくは6.5以上、さらに好ましくは6.8以上である。一方、好ましくは8.0以下、より好ましくは7.5以下、さらに好ましくは7.2以下である。
　シアリダーゼによる脱シアリル化後にはシアリダーゼを失活させることが好ましい。失活は常法に従うことができる。例えば、血清10μl当たり490μlのPBSで希釈された状態で、90℃で5分間の処理をすること等が挙げられる。
すなわち、脱シアリル化する工程は、検体とシアリダーゼを混合する工程、検体とシアリダーゼとを混合させた混合溶液を、シアリダーゼが活性を保つ温度で任意の時間処理する工程、シアリダーゼを失活させる工程を含んでもよい。
［EIA法によりフコシル糖鎖の量を測定する工程］
　該測定方法は、上記検体中のAGPを脱シアリル化する工程の後、基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体と、前記脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（EIA法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む。AGPを脱シアリル化する工程の後に、基材上の糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体と反応させることにより、AGPを脱シアリル化する工程の前に、基材上の糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体と反応させた場合と比較して、検体中の種々のフコシル糖鎖を含む、より多くのAGPを測定することができる。
　本工程は、例えば、抗AGP抗体の糖鎖を脱フコシル化する工程、糖鎖を脱フコシル化した抗AGP抗体を基材上に固定する工程、基材に検体を添加することにより、この基材上に固定された糖鎖を脱フコシル化した抗AGP抗体と検体中のAGPとを結合させる工程、抗AGP抗体と結合したAGPが有するフコシル基を認識するレクチンを結合させる工程、レクチンをEIA法により測定することによりフコシル糖鎖の量を測定する工程、を含んでもよい。
　本工程において、該EIA法に用いる、基材に固定された抗AGP抗体は、その糖鎖が脱フコシル化されたものである。
　抗AGP抗体（Fc領域）の糖鎖がフコシル化されたままであると、EIAを行った際に、前記脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識するレクチンが、該AGPのフコシル基のみならず、基材に固定された抗AGP抗体のフコシル基にまで結合してしまい、該AGP糖鎖のフコシル基の量を正確に測定することができない。
　該基材としては、例えば、プレートに設けられたウェルや、ビーズなどが挙げられる。EIAに用いる、基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体は、脱フコシル化前の抗AGP抗体を基材に固定した後に該基材上で脱フコシル化したものであってもよいし、基材に固定する段階で予め糖鎖が脱フコシル化されているものであってもよい。脱フコシル化前の抗AGP抗体でも、予め糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体でも、基材に固定する方法は、従来のEIA法で用いられる方法を用いることができる。
（脱フコシル化）
　EIAに用いる基材に固定された脱フコシル化前の抗AGP抗体に対して脱フコシル化を行う場合、その方法は特に制限されないが、脱フコシル化用溶液を用いた処理によることが好ましく、例えば、過ヨウ素酸ナトリウム溶液を用いた過ヨウ素酸酸化が挙げられる。
　過ヨウ素酸を用いる場合のその濃度は、脱フコシル化が十分になされれば特に制限されないが、好ましくは5mM以上、より好ましくは7mM以上、さらに好ましくは8mM以上である。一方、好ましくは20mM以下、より好ましくは15mM以下、さらに好ましくは12mM以下である。
　また、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化の処理時間は、脱フコシル化が十分になされれば特に制限されないが、好ましくは20分以上、より好ましくは30分以上、さらに好ましくは50分以上である。一方、上限は使用した抗体が脱フコシル化処理によって受けるダメージを低く抑えるために、好ましくは2時間以下である。
　また、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化における処理温度は、脱フコシル化が十分になされれば特に制限されないが、好ましくは15℃以上、より好ましくは20℃以上、さらに好ましくは25℃以上である。一方、好ましくは40℃以下、より好ましくは35℃以下、さらに好ましくは30℃以下である。
　また、過ヨウ素酸を用いる場合の緩衝液としては、生化学的手法を用いる場合の一般的な緩衝液を用いることができる。例えば、酢酸緩衝液、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、ホウ酸緩衝液、酒石酸緩衝液、トリス緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）等が挙げられる。また、該緩衝液は、適宜、Tween20やTween80などの界面活性剤を含んでいてもよい。緩衝液及び界面活性剤の濃度としては、生化学的手法を用いる場合の一般的な濃度を用いることができる。
　緩衝液のpHは、脱フコシル化が進行すれば特に制限されないが、好ましくは6.0以上、より好ましくは6.5以上、さらに好ましくは6.8以上である。一方、好ましくは8.0以下、より好ましくは7.5以下、さらに好ましくは7.2以下である。
　過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化は遮光下で行われることが好ましい。
また、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化の後には、基材を緩衝液で洗浄し、1%BSA含有PBSで室温2時間乃至は4℃一晩保温し、洗浄液(例えば、0.05%Tween20含有PBS)で洗浄してからEIAを行うなど、従来のEIAに用いる基材の調製と同様の調製をすることができる。
　また、一般に、過ヨウ素酸を用いる脱フコシル化の後に還元処理をすることで抗体の活性を保護することがあるが、本発明に係る測定方法では、該還元処理をしてもしなくても、AGPにおけるフコシル糖鎖の定量結果に有意差がないことから、脱フコシル化後に還元処理工程を含まないことが好ましい。
　抗AGP抗体の糖鎖を脱フコシル化する工程は、基材に抗AGP抗体を固定した後において、脱フコシル化用溶液を基材上の抗AGP抗体に接触させる工程、基材上に固定された抗AGP抗体の糖鎖を脱フコシル化させるために任意の温度で任意の時間処理する工程、及び基材を洗浄する工程を含んでもよい。
　糖鎖を脱フコシル化した抗AGP抗体を基材上に固定する工程は、当業者に既知の方法により行うことができ、基材と抗AGP抗体を接触させる工程、基材上に抗AGP抗体を固定させるために任意の温度で任意の時間処理する工程、基材を洗浄する工程を含んでもよい。
　基材に検体を添加することにより、この基材上に固定された糖鎖を脱フコシル化した抗AGP抗体と検体中のAGPとを結合させる工程は、AGPと抗AGPとの間の抗原抗体反応が十分に行われる限り特に限定されず、任意の時間及び温度で行うことができる。
　抗AGP抗体と結合したAGPが有するフコシル基を認識するレクチンを結合させる工程は、レクチンがAGP上のフコシル基を認識できる限り特に限定されず、任意の時間及び温度で行うことができる。また、レクチンを予めビオチン標識する工程を含んでもよい。
（脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識するレクチン）
　該レクチンは、AGP糖鎖に存在するFucα1,3GlcNAｃ糖鎖に結合するものであればよく、好ましくはヒイロチャワンタケレクチン（AAL）である。これらは、天然のものでもよく人工的に作製されたものでもよい。また、天然のAALと相同性の高い組換えタンパク質でもよく、相同性が高いとは、例えば、80%以上の相同性であることを指す。該AALは、従来のEIA法に用いられる標識や修飾がなされていてもよい。
（検出）
　脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識するレクチンが該フコシル基を認識してAGPに結合したことを検出する方法としては、従来のEIAを用いることができる。レクチン自体を標識して使用してもよいし、あるいは、例えば、レクチンを予めビオチン標識しておいて、AGPのフコシル基と該ビオチン標識レクチンとを結合させた後、アビジン標識した酵素を結合させ、該酵素の反応による発色又は発光を用いて検出してもよい。
　上記酵素としては、いずれの場合も、従来のEIA法に用いられる一般的な酵素を用いることができる。例えば、ホースラデッシュ・ペルオキシダーゼ（HRP）やアルカリ・フォスファターゼ（ALP）などが挙げられる。
　基質としては、使用する酵素に対応するものであればよく、例えば、HRPの基質であれば3,3',5,5'-テトラメチルベンジジン（TMB）や2,2'-アジノビス［3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸］-ジアンモニウム塩（ABTS）、o-フェニレンジアミン二塩酸塩（OPD）などが挙げられる。ALPの基質であれば、パラニトロフェニルリン酸（PNPP）などが挙げられる。
（EIA法）
　本工程におけるEIA法は、従来法と同様に行うことができる。反応温度や反応時間のほか、試薬の種類や試薬の濃度、蛍光や発色の検出方法等のいずれも常法に従うことができる。
　一例として、脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識して結合するレクチンをビオチン標識AALとし、アビジン標識酵素HRPを加えて基質TMBに対する発色によりその結合を検出する場合を記載する。
　まず、前述したように、過ヨウ素酸酸化で脱フコシル化された抗AGP抗体が固定されたEIA用基材を準備する。基材への非特異的吸着を防ぐために、常法で用いられるブロッキング用緩衝液、例えば10%ソルビトール加1%BlockAceを含むPBS又は2%ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBS、好ましくは10%ソルビトール加1%BlockAceを含むPBSによってブロッキングを行ってもよい。
　次に、脱シアリル化されたAGPを含む試料を用いて、基材に固定され、脱フコシル化された抗AGP抗体と、該脱シアリル化されたAGPとを結合させた後、結合しなかった成分を洗浄液（例えば、0.05%Tween20含有PBS）で洗浄して除去する。
　次に、ビオチン標識AALを用いて、該抗AGP抗体に結合した脱シアリル化AGPにおけるフコシル糖鎖と、該ビオチン標識AALとを結合させ、結合しなかったビオチン標識AALを洗浄液による洗浄で除去する。ビオチン標識AALの濃度調整にはBlockAce不含PBSを使用することができ、その他の抗体の濃度調整は0.4%BlockAce加PBSを使用することができる。
　次に、アビジン標識酵素HRPを用いて、該ビオチン標識AALとアビジン標識酵素HRPとを結合させ、結合しなかったアビジン標識酵素HRPを洗浄液による洗浄で除去する。
　次に、該酵素HRPの基質TMBを加え、従来の抗体-レクチンEIA法と同様にして発色を検出する。
　本発明に係る測定方法では、さらに、前記発色量からフコシル化AGPの量を換算する工程を含むことが好ましい。
　本工程で用いる方法としては、上記EIAで測定された発色量又は発光量から、検量線を用いて検体中のフコシル化AGP量を換算する方法が挙げられる。
　検量線は、例えば、血清又は腹水から非特許文献5に記載された方法で得た高フコシル化AGPに対して脱シアリル化を行い、これに対して同様のEIA法によって得たフコシル化AGP量と発色量又は発光量（U/ml）との関係から作成することが好ましい。
　こうして得られた検体中のα1-酸性糖蛋白質（AGP）におけるフコシル糖鎖の量又は換算されたフコシル化AGP量を、膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の指標として関連付ける工程を含んでもよい。
　該測定方法は、さらに、前記検体中のAGPを定量する工程、フコシル糖鎖の量を前記AGP量で規格化する工程を含むことが好ましい。
［検体中のAGPを定量する工程］
　該測定方法は、検体中のAGPを定量する工程を含むことが好ましい。
検体中のAGPを定量する方法は制限されないが、例えば、検体中のAGPを脱シアリル化した後、それを希釈して得た溶液を用いて、基材に固定された抗AGP抗体と酵素標識した抗AGP抗体とを用いたサンドイッチELISA法を行い、検量線を用いて酵素反応に基づく発色量又は発光量から検体中のAGPの濃度に換算する方法等が挙げられる。
　検量線は、例えば、標準試料とする市販のヒト血漿AGP（具体的にはSigma-Aldrich）（濃度が既知）に対して脱シアリル化を行い、これを用いて、基材に固定された抗AGP抗体と酵素標識した抗AGP抗体とを用いたサンドイッチELISA法を行い、AGP量（濃度）と発色量又は発光量（μg/ml）との関係から作成することが好ましい。
［フコシル糖鎖の量をAGP量で規格化する工程］
　該測定方法は、さらに、上記で得られた検体中のフコシル糖鎖の量を、上記「検体中のAGPを定量する工程」で得られたAGP量（U/μg）で規格化する工程を含むことが好ましい。
　従来法では、N型糖鎖に付加したフコースの分析がCAIE法やMALDI-TOF-MSにより可能であったが、その操作は煩雑であり、結果を迅速に得ることができず、その定量化は困難であるのに対し、本工程により、簡便かつ迅速に、検体中のAGPの単位量あたりのフコシル糖鎖の量を算出することができる。
［膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断基準］
　本実施態様において、膵臓がん又はIPMCを有するか否かの診断基準は特に制限されないが、例えば、検体中のfAGPの量が、基準値よりも多い又は健常者もしくはIPMA患者から採取された検体中のfAGPの量よりも多い場合に、膵臓がん又はIPMCを有するという診断基準であってもよく、また検体中のfAGPの量が、基準値よりも多い又はIPMA患者から採取された検体中のfAGPの量よりも多い場合に、膵臓がん又はIPMCを有するという診断基準であってもよい。
　なお、基準値とは、当業者に既知の方法によって、健常者の測定値及び／又はIPMA患者の測定値に基づき予め定められたカットオフ値であってもよく、例えば、カットオフ値は、健常者の測定値の平均値（mean）＋3×標準偏差（S.D.）としてもよい。
　また、本発明において、健常者とは、がんや急性期炎症又は慢性炎症を伴う疾患を有していない者を意味する。
　本発明において、診断は、膵臓がん又はIPMCの治療予後の診断であってもよい。
　膵臓がんの治療としては、手術、化学療法、放射線療法、抗体療法及び免疫療法からなる群から選択される1以上が挙げられる。好ましくは、手術、化学療法、及び放射線療法からなる群から選択される1以上である。免疫療法としては、抗体医薬や分子標的薬を用いた免疫療法が挙げられる。また、IPMCの治療としては、手術が挙げられる。
　特に限定されないが、例えば、上述の膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断基準の項に記載されている基準により、治療後の患者から採取された検体を測定し、膵臓がん又はIPMCを有すると判断される場合に治療効果が見られないまたは予後が不良であると判断するものであってもよい。
　本発明の他の実施態様は、膵臓がん又はIPMCの診断用キットである。
　下記の要素（Ａ）～（Ｃ）、好ましくは（Ａ）～（Ｄ）、より好ましくは（Ａ）～（Ｅ）を含むキットである。
　（Ａ）脱シアリル化用試薬、
　（Ｂ）抗AGP抗体が固定化されたEIA用基材
　（Ｃ）EIA用基材に固定化された抗AGP抗体を脱フコシル化するための試薬、
　（Ｄ）ビオチン標識レクチンなどの標識レクチン（例えば、AAL）、及び
　（Ｅ）アビジン標識酵素（例えば、HRP）。
　該キットは、さらに、（Ｆ）検体中のAGPを定量するための、抗AGP抗体が固定化されたサンドイッチELISA用基材、及び（Ｇ）酵素（例えば、HRP）標識抗AGP抗体を含む溶液を含むことが好ましい。
　また、該キットは、さらに、希釈用緩衝液、ブロッキング用緩衝液、fAGP標準品を含むことが好ましい。fAGP標準品としては、例えば、ヒト癌患者由来の腹水や血清から部分精製されたものを用いることができ、またヒト由来培養細胞、例えばhepatoma cell lineなどの培養液を用いることもできる。
　前記（Ａ）、（Ｃ）乃至（Ｅ）、（Ｇ）の好ましい種類や濃度、標識、使用時の条件等としては、前述の本発明に係るデータ取得方法に含まれるfAGPの量の測定に関する記載が援用される。また、各溶液については、使用前には適宜濃縮されていてもよく、使用直前に水等で適宜希釈することができる。
　また、前記（Ａ）、（Ｃ）乃至（Ｅ）、（Ｇ）のいずれも、複数の溶媒や溶液を含む場合には、それらは混合されて一の容器に収容されていてもよいし、別々の容器に収容されていてもよい。
　また、前記（Ｂ）及び（Ｆ）の好ましい態様としては、前述の本発明に係る測定方法の説明に記載した態様が挙げられる。
　該キットは、膵臓がん又はIPMNの診断用であるが、膵臓がん又はIPMNを有するか否かの診断基準に関しては、前述の本発明に係るデータ取得方法に記載した基準を用いることができる。
　また、該キットは、さらに、前述の本発明に係るデータ取得方法に含まれるfAGPの量の測定方法を記載した説明書等を含めることもできる。
　以下に実施例を用いて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
＜実施例１＞
［IPMN患者、膵臓がん患者及び健常者における血清中のfAGP量の比較］
　本発明者らが既に確立したAGP分子上のフコシル糖鎖の特異的測定法（特許文献1及び非特許文献6）を用いて、IPMN患者と膵臓がん患者の術前血清及び陰性対照としての健常者血清のfAGP量を測定した。各検体において使用した血清試料は、ごく少量である（1滴、25μl）。また、IPMN患者に関しては、当業者に既知の方法である術後病変組織検査によって、IPMCかIPMAかの分類を行った。
　血清中のfAGP量の測定は、まず規格化のために抗AGP抗体を用いたサンドイッチELISA法によって血清中のAGP量を測定し、次いで抗AGP抗体/フコース結合レクチン（AAL）を用いたEIA法によって血清中のfAGP量を測定し、これらの測定結果から血清中のAGPの単位量あたりのフコシル糖鎖の量を算出することで行った。IPMN患者は、IPMCとIPMAに分けて表し、膵臓がん患者及び陰性対照としての健常者と比較した（図１）。
　IPMC（n=14）及びIPMA（n=7）の血清中のfAGP量は、それぞれ118.15±113.01及び11.63±8.47U/μgでIPMCではIPMAに対して有意に高かった（P<0.05）。またIPMAは健常者（図中、Healthy controlと示す、n=53）（4.07±3.49U/μg）に対して有意に高く（P<0.05）、膵臓がん患者（図中、Ca. Pancreasと示す、n=40）（904.37±1708.32U/μg）ではIPMCに対して有意に高かった（P<0.05）。
　また、健常者のfAGP量の測定値からカットオフ値（mean+3S.D.=14.54U/μg）を求め、それぞれの検体群における陽性率を確認した。その結果、膵臓がん患者：97.5%（39/40）、IPMC患者：92.86%（13/14）、IPMA患者：28.6%（2/7）、健常者：1.9%（1/53）であった。またこのカットオフ値をもとにIPMCの正診率を求めるとIPMCでは85.7%となり、従来の画像診断による正診率（58.8%）に比べ、著しい高値を認めた。また膵臓がんにおける陽性率は極めて高いことが示された。
＜実施例２＞
［IPMN患者におけるfAGP及び他の膵臓がんのがんマーカーの術前血中濃度の比較］
　実施例１によって測定したIPMN患者ごとの血清中のfAGP量を表１に示した。また、当業者に既知の方法により、従来の膵臓がんのマーカーとして利用されている4種の抗原（CEA、CA19-9、SPan-1、DUPAN-2）を実施例１で使用した試料と同じ患者由来の血清試料を用いて測定した結果も表１に示す。
　従来から膵臓がんのがんマーカーとして利用されている、CEA、CA19-9、SPan-1及びDUPAN-2について、IPMC14症例の術前血清でそれぞれの陽性率を見ると、CEA（1/14=7.1%）、CA19-9（5/14=35.7%）、SPan-1（1/14=7.1%）、DUPAN-2（1/14=7.1%）で、CA19-9以外のマーカーはいずれも低いものであった（表１）。
　ここでCA19-9はその抗原決定基がシアリルLea（NANAα2,3Galβ1,3［Fucα1,4］GlcNAc）であり、ヒトLewis式血液型抗原の共通抗原であるLea（Galβ1,3［Fucα1,4］GlcNAc）抗原と共通構造を有し、共に同一のFucα1,4糖鎖合成に関わる鍵酵素の存在がある。我が国では大凡20%弱のヒトはLewis式血液型抗原が陰性であってFucα1,4糖鎖は合成されず、従ってシアリルLeaも遺伝的に合成されないことから、それらの場合ではCA19-9はがんマーカーにはなり得ない。Lewis式血液型のタイピングは通常の血清学的手法では難しく、がんに関連してしばしば型変換が起こり、正確な型判定が出来ないことは既に発明者等が明らかにしている（非特許文献7）。Lewis式血液型の正確な型判定にはFUT6酵素活性測定乃至はFUT6遺伝子タイピングが必須である（非特許文献8）。CA19-9が有するこのような制約に加え、表１の結果から、CA19-9の測定によるIPMCの診断に対する感度は低く、fAGPの測定によるIPMN診断及びIPMCの判別についての優位性は明らかである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　以上から、本発明者らが既に確立したAGP分子上のフコシル糖鎖の特異的測定法を用いて測定した血清中のfAGP値は膵臓がんで著しく上昇する他、IPMN患者の術前診断で従来のがんマーカーに比べいずれも高い陽性率でIPMCを判別することができた。これにより、IPMN患者における手術適応症例（IPMC）について、これまでの画像診断による正診率を大幅に向上させる可能性が示された。またIPMC患者においては膵臓がんの発生率が著しく上昇することからIPMN患者における膵臓がん発生の診断への応用も見込まれた。従ってIPMN患者における悪性腫瘍に関する有用なバイオマーカーとなり得ることが考えられる。

Claims (11)

  1. 　検体中のフコシル化α１-酸性糖蛋白質（fAGP）の量を測定することを含む、膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断のためのデータ取得方法。
  2. 　前記検体が、血漿又は血清である、請求項1に記載の方法。
  3. 　前記測定が、α1-酸性糖蛋白質（AGP）におけるフコシル糖鎖の量を測定するものであって、
    　検体中のAGPを脱シアリル化する工程、及び
    　基材に固定され、糖鎖が脱フコシル化された抗AGP抗体と、前記脱シアリル化されたAGPのフコシル基を認識するレクチンとを用いて、酵素免疫測定法（EIA法）によりフコシル糖鎖の量を測定する工程を含む、請求項1又は2に記載の方法。
  4. 　前記脱シアリル化がシアリダーゼ処理によって行われ、前記脱フコシル化が過ヨウ素酸酸化によって行われる、請求項3に記載の方法。
  5. 　前記レクチンがヒイロチャワンタケレクチン（AAL）である、請求項3又は4に記載の方法。
  6. 　さらに、以下の工程を含む、請求項3～5のいずれか一項に記載の方法。
    　前記検体中のAGPを定量する工程、及び
    　前記フコシル糖鎖の量を前記AGP量で規格化する工程。
  7. 　前記診断が、検体中のfAGPの量が、基準値よりも多い又は健常者もしくは良性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMA）患者から採取された検体中のfAGPの量よりも多い場合に、膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）であるという基準に基づく、請求項1～6のいずれか一項に記載の方法。
  8. 　前記診断が、がん治療の予後の診断である、請求項1～7のいずれか一項に記載の方法。
  9. 　膵臓がん又は悪性膵管内乳頭粘液性腫瘍（IPMC）の診断用キットであって、
    　（Ａ）脱シアリル化用試薬、
    　（Ｂ）抗AGP抗体が固定されたEIA用基材、及び
    　（Ｃ）EIA用基材に固定化された抗AGP抗体を脱フコシル化するための試薬を含む、キット。
  10. 　さらに、（Ｄ）標識レクチン及び／又は（Ｅ）アビジン標識酵素を含む、請求項9に記載のキット。
  11. 　さらに、
    　（Ｆ）検体中のAGPを定量するための、抗AGP抗体が固定されたサンドイッチELISA用基材、及び
    　（Ｇ）酵素標識抗AGP抗体を含む溶液、
    を含む、請求項9又は10に記載のキット。
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