WO2021261483A1 - 腺癌の検出方法及び検査キット - Google Patents

腺癌の検出方法及び検査キット Download PDF

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WO2021261483A1 PCT/JP2021/023578 JP2021023578W WO2021261483A1 WO 2021261483 A1 WO2021261483 A1 WO 2021261483A1 JP 2021023578 W JP2021023578 W JP 2021023578W WO 2021261483 A1 WO2021261483 A1 WO 2021261483A1
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駒子 石川
仰 天野
敏文 高尾
宣明 奥村
俊樹 武居
雅光 中里
拡伸 坪内
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三井化学株式会社
国立大学法人大阪大学
国立大学法人宮崎大学
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    • G01N2800/7028—Cancer

Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting adenocarcinoma and a test kit.
  • Adenocarcinoma is one of the epithelial malignancies that develops from the cells of secretory glandular tissue. It can occur in any organ of the body, including lung adenocarcinoma, liver adenocarcinoma, pancreatic adenocarcinoma, lymph adenocarcinoma, uterine adenocarcinoma, spermatic adenocarcinoma, and gastric adenocarcinoma.
  • lung adenocarcinoma is one of the adenocarcinomas whose initial symptoms are difficult to detect and early detection is difficult.
  • Lung adenocarcinoma has the highest incidence among the histological types of lung cancer, and lung adenocarcinoma accounts for about 40% of male lung cancers, about 70% of females, and about 50% of all lung cancers. Since lung cancer has the highest number of malignant tumor deaths in Japan, there is a need for a technique for early detection of lung adenocarcinoma.
  • the survival rate of lung cancer decreases as the clinical stage progresses.
  • the 5-year survival rates are 82.0%, 66.1%, 54.5% and 46.1%, respectively.
  • 42.8% Japanese lung cancer registry study of 11,663 surgical cases in 2004: demographic and prognosis changes over decade", J.Thorac.Oncol., 6 ( 7), p.1229-1235
  • the median survival time is 22.4 months (Atagi, S., et al. (2012), respectively.
  • Carcinoembryonic antigen (CEA) in serum is used for clinical diagnosis as an existing tumor marker for lung adenocarcinoma.
  • CEA Carcinoembryonic antigen
  • the positive rate of CEA in lung adenocarcinoma cases is only 36.6 to 56.5% (Molina, R., et al. (2016): "Assessment of a Combined Panel of Six Serum Tumor Markers for Lung Cancer". ", Am.J.Respir.Crit.CareMed., 193 (4), doi.org/10.1164/rccm.201404-0603OC, Matsuoka, K., et al.
  • the method for obtaining the protein fragmentation rate (Fn) by the MRM method embodied in the invention described in Patent Document 1 is usually 2 to 2 to pretreatment of the sample until it is subjected to measurement. It takes three days, and it requires frequent manual work. Not only is it prone to errors, but it also has the drawback of being able to quickly inspect multiple samples (hereinafter referred to as "high throughput"). It was found that there is a problem that it is difficult to put it into clinical practical use.
  • the present inventors attempted to detect lung adenocarcinoma by detecting a protein fragment peculiar to lung adenocarcinoma by the sandwich method.
  • the means for solving the above-mentioned problems include the following aspects.
  • ⁇ 1> A method for detecting adenocarcinoma based on a protein fragment of WFDC2 protein in a sample derived from a subject, which is the amount of a protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 obtained by the sandwich method in the sample.
  • the first determination value which is a value obtained by dividing the amount of one fragment by the total WFDC2 protein mass in the sample obtained by the sandwich method or the reference amount defined by the creatinine concentration, with a predetermined threshold value.
  • a method for detecting adenocarcinoma to determine the presence or absence of adenocarcinoma.
  • ⁇ 2> N from the first anti-C-terminal antibody that specifically binds to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the method for detecting adenocarcinoma according to ⁇ 1>, wherein the amount of the protein fragment measured using the anti-N-terminal region antibody that recognizes the terminal side is the amount of the first fragment in the sample.
  • the amount of the second fragment which is the amount of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 obtained by the sandwich method in the sample, is divided by the reference amount to obtain the protein fragment.
  • the method for detecting adenocarcinoma according to ⁇ 1> or ⁇ 2> which uses a modified determination value which is the sum of a second determination value which is a value and a value obtained by multiplying the first determination value by 5 to 100.
  • N from the second anti-C-terminal antibody that specifically binds to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 and the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the amount of the protein fragment measured using the anti-N-terminal region antibody that recognizes the terminal side is defined as the amount of the second fragment in the sample, and the adenocarcinoma according to ⁇ 3> cited in ⁇ 2>.
  • a third anti-C-terminal antibody that specifically binds to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and the N-terminal from the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the amount of the protein fragment measured using the anti-N-terminal region antibody that recognizes the side is taken as the total WFDC2 protein mass, and ⁇ 2> or ⁇ 3> cited ⁇ 2> is cited in ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> The method for detecting adenocarcinoma according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 5>, wherein the reference amount is the total WFDC2 protein mass.
  • ⁇ 7> The method for detecting adenocarcinoma according to any one of ⁇ 1> and ⁇ 4>, wherein the reference amount is the creatinine concentration.
  • ⁇ 8> The method for detecting adenocarcinoma according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 7>, wherein the sample is urine of the subject or a sample derived from urine.
  • a test kit for determining the presence or absence of adenocarcinoma by the sandwich method which comprises a first microplate and two antibodies that specifically bind to a protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the test kit according to ⁇ 9> which is an anti-N-terminal region antibody that recognizes the N-terminal side from the region.
  • ⁇ 11> It further comprises a second microplate and a second anti-C-terminal antibody that specifically binds to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, the second anti-C-terminal antibody and the anti-N-terminal.
  • the embodiment of the present invention is configured as described above, it is possible to provide a method and a kit for efficiently detecting adenocarcinoma with high sensitivity and specificity in a sandwich method excellent in high throughput.
  • the values not normalized for each of the first judgment value (A), the second judgment value (B), and the modified judgment value (C) are set for each of the patient group and the healthy subject group. It is a plotted graph. It is a graph in which the unnormalized first judgment value and the second judgment value are paired and plotted on a two-dimensional plane when the creatinine concentration is used as a reference amount.
  • the values normalized for each of the first judgment value (A), the second judgment value (B), and the modified judgment value (C) when the total WFDC2 protein mass is used as the reference amount are set for each of the patient group and the healthy subject group, respectively. It is a graph plotted about.
  • the values that are not normalized for each of the first judgment value (A), the second judgment value (B), and the modified judgment value (C) are the values of the patient group and the healthy subject group. It is a graph plotted for each. It is a graph in which the unnormalized first judgment value and the second judgment value are paired and plotted on a two-dimensional plane when the total WFDC2 protein mass is used as a reference amount. It is a graph which plotted the value when the new subject was judged by the correction judgment value when the creatinine concentration was used as a reference amount, for each of a patient and a healthy person group.
  • the method for detecting adenocarcinoma according to the first embodiment is a method for detecting adenocarcinoma based on a protein fragment of WFDC2 protein in a sample derived from a subject, and is a protein having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 obtained by the sandwich method.
  • the first determination value which is a value obtained by dividing the amount of the first fragment, which is the amount of the fragment in the sample, by the total WFDC2 protein mass in the sample obtained by the sandwich method or the reference amount defined by the creatinine concentration.
  • the presence or absence of adenocarcinoma is determined by comparison with a predetermined threshold.
  • WFDC2 is an abbreviation for "WAP (whey acidic protein) four-disulfide core domain protein 2" and is also known as “human epididymis protein 4" (HE4).
  • the WFDC2 protein is a secretory protein, and it is known that the signal peptide on the N-terminal side is cleaved when it is released extracellularly.
  • the full-length amino acid sequence of the WFDC2 protein released extracellularly typically consists of 94 amino acid residues of SEQ ID NO: 3 shown below.
  • SEQ ID NO: 3 EKTGVCPELQ ADQNCTQECV SDSECADNLK CCSAGCATFC SLPNDKEGSC PQVNINFPQL GLCRDQCQVD SQCPGQMKCC RNGCGKVSCV TPNF
  • either the total WFDC2 protein mass or the creatinine concentration in the sample derived from the subject is measured by the sandwich method, and this is used as the reference amount. Further, the amount of W10409 fragment is measured by the sandwich method, and this is used as the first fragment amount. Then, the first determination value, which is a value obtained by dividing the amount of the first fragment by the reference amount, that is, the ratio of the W10409 fragment to the reference amount is calculated, and the presence or absence of adenocarcinoma is determined by this value. This determination is, for example, positive for adenocarcinoma if it is larger than this threshold value by comparison with a predetermined threshold value.
  • the above-mentioned first determination value is calculated for a sample collected from a plurality of known adenocarcinoma patients (for example, lung adenocarcinoma patient) in advance, and a plurality of healthy subjects (that is, no adenocarcinoma disease is observed).
  • the first judgment value is calculated for the sample collected from the person), the first judgment value is compared between the adenocarcinoma patient and the healthy person, and the sensitivity (that is, the sample of the adenocarcinoma patient is positive).
  • the threshold value can be a value such that the specificity (that is, the ratio at which a healthy person's sample can be determined to be negative) becomes higher.
  • MSE mean square error
  • ROC-AUC Receiveiver Operating Characteristic-Area Under the Curve
  • the threshold value may be a normalized value.
  • the first determination value derived from the sample may be normalized in the same manner as the threshold value, and the normalized threshold value and the normalized first determination value may be compared.
  • the term "threshold value" is a concept including both a non-normalized threshold value and a normalized threshold value.
  • the mean value of the group including the patient group and the healthy person group is 0, and the variance is 1.
  • an antibody against a substance to be detected (antigen) (hereinafter, also referred to as “primary antibody”) is immobilized in a measurement region such as a microplate, magnetic particles, or a sensor chip in advance, and the substance to be detected is subjected to an immune reaction. Then, another antibody (hereinafter, also referred to as “secondary antibody”) that specifically binds to the substance to be detected is bound, and the abundance of the antigen is measured using this secondary antibody. It is a method to do.
  • the method for measuring the abundance of the antigen using the secondary antibody is not particularly limited, and a method may be used in which the secondary antibody is labeled in advance and the abundance of the antigen is measured by the labeling.
  • a method may be used in which a further antibody (hereinafter, also referred to as “tertiary antibody”) that specifically binds to the antibody is labeled in advance and the abundance of the antigen is measured by the labeling.
  • the primary antibody and the secondary antibody are not particularly limited as long as the object of the present embodiment can be achieved, and various antibodies described later and commercially available antibodies can be used.
  • the sign is not particularly limited as long as the object of the present embodiment can be achieved, and a known sign can be used.
  • the label include fluorescent dyes, fluorescent nanoparticles, aggregated nanoparticles, magnetic beads, enzymes / coenzymes, chemiluminescent substances, and radioactive substances.
  • the amount of antigen can be measured by measuring the enzyme substrate reaction and chemical reaction caused by these labels, and the amount of luminescence, absorption, fluorescence, radiation, etc. generated from the label itself.
  • examples of the enzyme / coenzyme include peroxidase (HRP) and alkaline phosphatase (ALP) derived from horseradish peroxidase.
  • HRP peroxidase
  • ALP alkaline phosphatase
  • a calibration curve is prepared using the signal intensity obtained from a biological substance whose concentration is known as a sample, and the signal intensity obtained from the substance to be detected is applied to obtain the concentration. Can be done.
  • the sandwich method known methods have been put into practical use, and any of them may be used.
  • Specific examples of the sandwich method include an ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) method, a CLIA (chemiluminescent immunoassay) method, and an ECLIA (Electro Chemiluminescence Immunoassay) method.
  • the ELISA method is preferable as the sandwich method.
  • sandwich methods may be performed according to the standard method.
  • the primary antibody is fixed in a well of a microplate, a sample is added, and a specific fragment or the like in the sample is bound to the primary antibody.
  • the secondary antibody is bound, and the substrate is reacted with an enzyme such as peroxidase for detection (which may be bound to the secondary antibody later) bound to the secondary antibody, and the color development, luminescence, and fluorescence generated by the reaction are reacted. Etc. are measured.
  • the judgment can usually be made in about 2 to 8 hours, so that the high throughput property is excellent.
  • the ELISA method is preferable from the viewpoint of further improving the quantitativeness and further improving the ROC-AUC.
  • the method for detecting adenocarcinoma in the second embodiment is, in the first embodiment, a first anti-C-terminal antibody that specifically binds to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and the above-mentioned SEQ ID NO:.
  • the amount of the protein fragment measured using the anti-N-terminal region antibody that recognizes the N-terminal side from the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of 1 is defined as the amount of the first fragment in the sample.
  • the first anti-C-terminal antibody is an antibody that specifically binds to the C-terminal of the W10409 fragment.
  • the antibody that specifically binds to the C-terminal 4 amino acid residue that is, the C-terminal “PQLG” (proline-glutamine-lysine-glycine) is defined as the first anti-C-terminal antibody.
  • PQLG proline-glutamine-lysine-glycine
  • the number of amino acid residues recognized by the first anti-C-terminal antibody is not particularly limited as long as the first anti-C-terminal antibody can specifically bind to the C-terminal, and can be, for example, 3 to 10.
  • the anti-N-terminal region antibody is an antibody that recognizes the N-terminal side of the C-terminal region to which the first anti-C-terminal antibody binds.
  • the site recognized by the anti-N-terminal region antibody may be a plurality of consecutive amino acid residues on the N-terminal side of the C-terminal region to which the first anti-C-terminal antibody binds, or may not be present. It may have a three-dimensional structure composed of consecutive amino acid residues.
  • the anti-N-terminal region antibody is at least the amino acid residue located on the N-terminal side of this "P" (proline).
  • the W10409 fragment can be detected with high sensitivity in the above-mentioned first embodiment.
  • the W10409 fragment not only the W10409 fragment itself but also the fragment lacking the amino acid residue on the N-terminal side of the site recognized by the anti-N-terminal region antibody binds to the first anti-C-terminal antibody. Any fragment that can be detected can be detected.
  • the method for detecting adenocarcinoma in the third embodiment is the sample of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 obtained by the sandwich method in place of the first determination value in the first embodiment or the second embodiment.
  • a correction judgment value which is the sum of the second judgment value which is a value obtained by dividing the amount of the second fragment which is the amount in the medium by the reference amount and the value obtained by multiplying the first judgment value by 5 to 100.
  • the amount of the first fragment which is the amount of the W10409 fragment in the sample
  • the amount of the first fragment is divided by the reference amount to obtain the first determination value.
  • the amount of the second fragment which is the amount of the W14309 fragment in the same sample
  • the sandwich method is measured by the sandwich method, and the amount of the second fragment is divided by the reference amount to calculate the second determination value.
  • the sum of the value obtained by multiplying the amount of the first fragment by a predetermined magnification, specifically 5 to 100, and the second determination value is calculated and used as the correction determination value.
  • the presence or absence of adenocarcinoma is determined by this modified determination value.
  • This determination is, for example, positive for adenocarcinoma if it is larger than this threshold value by comparison with a predetermined threshold value.
  • the above magnification is preferably 7 to 50, more preferably 8 to 40, and particularly preferably 10 to 30 from the viewpoint of better balancing ROC-AUC and MSE.
  • this threshold value as in the first embodiment, any value that can distinguish between positive and negative adenocarcinoma can be selected, but the second determination value is combined with the first determination value. It is desirable to select the threshold value in consideration of the value. For example, for a sample collected from a plurality of known adenocarcinoma patients (for example, lung adenocarcinoma patients) in advance, the above-mentioned first judgment value and second judgment value are calculated, and the correction judgment value is calculated in the same manner as above.
  • the first judgment value and the second judgment value are similarly calculated for the samples collected from a plurality of healthy subjects (that is, those who are not found to have adenocarcinoma), and the correction judgment value is calculated in the same manner as above.
  • the correction judgment values of the adenocarcinoma patient and the healthy subject can be compared, and the sensitivity (that is, the ratio at which the sample of the adenocarcinoma patient can be determined to be positive) and the specificity (that is, the sample of the healthy subject can be determined to be negative).
  • a value such that the ratio) becomes higher can be set as a threshold.
  • a threshold value for example, it is conceivable to select a value that minimizes MSE (mean square error) based on the ROC-AUC value.
  • magnification so that the MSE is minimized, multiply this by the amount of the first fragment, and further add the amount of the second fragment to obtain the correction determination value and the threshold value. Further, it is also preferable to adjust the above-mentioned magnification so that the ROC-AUC is maximized, multiply this by the first fragment amount, and further add the second fragment amount to obtain the correction determination value and the threshold value. Further, it is also preferable to adjust the above-mentioned magnification in consideration of the balance between MSE and ROC-AUC, multiply this by the amount of the first fragment, and further add the amount of the second fragment to obtain the correction determination value and the threshold value. ..
  • the presence or absence of adenocarcinoma can be determined with higher sensitivity and specificity by using not only the amount of W10409 fragment in the sample but also the amount of W14309 fragment as an index. It becomes possible to judge.
  • the method for detecting adenocarcinoma in the fourth embodiment is the second anti-C-terminal that specifically binds to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 in the third embodiment based on the second embodiment.
  • the amount of the protein fragment measured using the antibody and the anti-N-terminal region antibody that recognizes the N-terminal side of the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 is the amount of the protein fragment in the sample. The amount is two fragments.
  • the second anti-C-terminal antibody is an antibody that specifically binds to the C-terminal of the W14309 fragment.
  • an antibody that specifically binds to the C-terminal 5 amino acid residue that is, the C-terminal "QVNIN" (glutamine-valine-asparagine-isoleucine-asparagine) is a second anti-C-terminal antibody.
  • QVNIN glutamine-valine-asparagine-isoleucine-asparagine
  • the number of amino acid residues recognized by the second anti-C-terminal antibody is not particularly limited as long as the second anti-C-terminal antibody can specifically bind to the C-terminal, and can be, for example, 3 to 10.
  • the anti-N-terminal region antibody is an antibody that recognizes the N-terminal side of the C-terminal region to which the second anti-C-terminal antibody binds.
  • the site recognized by the anti-N-terminal region antibody may be a plurality of consecutive amino acid residues on the N-terminal side of the C-terminal region to which the second anti-C-terminal antibody binds, or may not be present. It may have a three-dimensional structure composed of consecutive amino acid residues.
  • the anti-N-terminal region antibody is at least the amino acid residue located on the N-terminal side of this "Q" (glutamine). It is desirable to make it a part of the site that recognizes the group. However, if the second anti-C-terminal antibody and the antigen recognition site are in close proximity, binding may compete, so it is desirable that the antigen recognition sites are as far apart as possible.
  • the anti-N-terminal region antibody for detecting the W14309 fragment may be a different antibody from the anti-N-terminal region antibody for detecting the W10409 fragment, but it is desirable to use the same antibody.
  • the W14309 fragment can be detected with high sensitivity in the above-mentioned third embodiment.
  • the W14309 fragment not only the W14309 fragment itself but also the fragment lacking the amino acid residue on the N-terminal side of the site recognized by the anti-N-terminal region antibody binds to the second anti-C-terminal antibody. Any fragment that can be detected can be detected.
  • the method for detecting adenocarcinoma in the fifth embodiment is the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 in the fourth embodiment based on the second embodiment or the third embodiment based on the second embodiment.
  • a protein fragment measured using a third anti-C-terminal antibody that specifically binds and an anti-N-terminal region antibody that recognizes the N-terminal side of the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3. Is the total WFDC2 protein mass.
  • the third anti-C-terminal antibody is an antibody that specifically binds to the C-terminal of a protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3.
  • the antibody that specifically binds to the C-terminal 5 amino acid residue that is, the C-terminal “VTPNF” (valine-threonine-proline-asparagin-phenylalanine) is a third anti-C-terminal antibody.
  • VTPNF valine-threonine-proline-asparagin-phenylalanine
  • the number of amino acid residues recognized by the third anti-C-terminal antibody is not particularly limited as long as the third anti-C-terminal antibody can specifically bind to the C-terminal, and can be, for example, 3 to 10.
  • the anti-N-terminal region antibody is an antibody that recognizes the N-terminal side of the C-terminal region to which the third anti-C-terminal antibody binds.
  • the site recognized by the anti-N-terminal region antibody may be a plurality of consecutive amino acid residues on the N-terminal side of the C-terminal region to which the third anti-C-terminal antibody binds, or may not be present. It may have a three-dimensional structure composed of consecutive amino acid residues.
  • the anti-N-terminal region antibody is at least the amino acid residue located on the N-terminal side of this "V" (valine).
  • the anti-N-terminal region antibody for detecting the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is the anti-N-terminal region antibody for detecting the W10409 fragment and the anti-N-terminal region antibody for detecting the W14309 fragment. It may be different from any of the region antibodies, or it may be the same as any of these, but it is desirable to use the same antibody as both of these. In that case, the anti-N-terminal region antibody should be a part of the site that recognizes the amino acid residue located on the N-terminal side of the site to which the second anti-C-terminal antibody that binds to the C-terminal of the W14309 fragment binds. Is desirable.
  • the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 is sensitively obtained in the above-mentioned second embodiment and fourth embodiment. Can be detected.
  • the protein fragment itself having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 but also the fragment lacking the amino acid residue on the N-terminal side of the site recognized by the anti-N-terminal region antibody may be used. Any fragment to which the third anti-C-terminal antibody can bind can be detected.
  • the method for detecting adenocarcinoma in the sixth embodiment is any of the first to fifth embodiments, in which the reference amount is the total WFDC2 protein mass.
  • the total WFDC2 protein mass is one in which no nick is contained at any position and one in which the disulfide bond between the fragments separated by the nick is maintained although the nick is contained as described above. And include.
  • the amount of the W10409 fragment or the W14309 fragment as the substance to be measured in the sample can be standardized and grasped as the ratio of the mutated WFDC2 protein to the entire WFDC2 protein. ..
  • the method for detecting adenocarcinoma in the seventh embodiment is any of the first to fourth embodiments, in which the reference amount is the creatinine concentration.
  • Creatinine is said to be produced almost constantly in one day, and all of it is excreted in urine. Therefore, it is used in clinical tests to correct the concentration error due to the difference in urine volume of substances to be measured in urine such as protein. Therefore, the creatinine concentration has significance as a reference substance in standardizing the amount of the W10409 fragment or the W14309 fragment as the measurement target substance in the sample.
  • the method for detecting adenocarcinoma in the eighth embodiment is, in any one of the first to seventh embodiments, the sample from which the subject's urine or urine is derived. Since the WFDC2 protein is excreted in urine and there are few extra proteins such as serum albumin, it is desirable that the sample is the urine of the subject or a sample derived from urine.
  • the sample derived from urine refers to a sample obtained by diluting the urine itself collected from the subject or adding an appropriate reagent for the convenience of measurement.
  • the test kit of the ninth embodiment is a test kit for determining the presence or absence of adenocarcinoma by the sandwich method, and specifically binds to the first microplate and the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 2
  • a test kit comprising a seed antibody and one of the two antibodies immobilized on a first microplate.
  • the microplate used as the first microplate consists of a flat plate with a large number of dents, and each dent is used as a test tube or a petri dish.
  • a 96-hole type is widely used as the microplate.
  • the first microplate in this embodiment contains two antibodies that specifically bind to a protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and one of the two or more antibodies is immobilized on the microplate A. Has been done. Immobilization is preferably performed on all indentations, but is not limited to this. Further, it is preferable that the antibody to be immobilized is only one of the above-mentioned two antibodies.
  • the two types of antibodies contained in the test kit of the ninth embodiment are antibodies that are less likely to compete with each other.
  • the site recognized by the two antibodies is not particularly limited as long as it can quantify the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the two kinds of antibodies may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody.
  • the unimmobilized antibody is included in the kit in a container.
  • the non-immobilized antibody may be labeled with horseradish peroxidase (HRP) or the like for quantification.
  • the test kit of the ninth embodiment may further contain materials commonly used in the sandwich method, in addition to the above-mentioned two types of antibodies and the first microplate.
  • Other materials included in the kit of the ninth embodiment include, for example, one of the two antibodies, a tertiary antibody capable of specifically binding to an antibody not particularly immobilized, a buffer solution, a washing solution, a coloring solution, and the like. Can be mentioned.
  • Other materials included in the test kit of the ninth embodiment are not limited thereto.
  • the tertiary antibody may be labeled with horseradish peroxidase (HRP) or the like.
  • test kit of the ninth embodiment can be used for the adenocarcinoma detection method described in the above-described embodiment.
  • inspection kit of the ninth embodiment By using the inspection kit of the ninth embodiment, the throughput of the above-described embodiment can be further improved.
  • the test kit of the tenth embodiment is the kit described in the ninth embodiment, in which the two antibodies specifically bind to the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It is an anti-C-terminal antibody and an anti-N-terminal region antibody that recognizes the N-terminal side of the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the first anti-C-terminal antibody and the anti-N-terminal region antibody are the same as in the second embodiment.
  • the test kit of the eleventh embodiment is the test kit according to the tenth embodiment, and further specifically binds to the second microplate and the C-terminal region of the protein fragment having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2.
  • the second anti-C-terminal antibody and one of the anti-N-terminal region antibody are immobilized on the second microplate.
  • one of the second anti-C-terminal antibody and the anti-N-terminal region antibody is immobilized.
  • the microplate used as the second microplate is the same as in the ninth embodiment.
  • the second anti-C-terminal antibody and the anti-N-terminal region antibody are the same as those in the fourth embodiment.
  • SEQ ID NO: 4 (standard peptide 1): TGAEKTGVCP ELQADQNCTQ ECVSDSECAD NLKCCSAGCA TFCSLPNDKE GSSPQVNINF PQLG
  • SEQ ID NO: 5 (standard peptide 2): TGAEKTGVCP ELQADQNCTQ ECVSDSECAD NLKCCSAGCA TFCSLPNDKE GSSPQVNIN
  • the sulfhydryl group of the 50th cysteine of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 forms a disulfide bond with the sulfhydryl group of the 80th cysteine of SEQ ID NO: 3. Therefore, in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 in which the 80th cysteine residue does not exist, a disulfide bond is formed with the sulfhydryl group of another cysteine, and the proteins of SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 existing in the living body. It may have a three-dimensional structure different from that of the fragment. If the three-dimensional structure changes, the antibody may not be recognized. Therefore, amino acids are substituted as described above.
  • the standard peptide 3 differs from the full-length WFDC2 protein shown in SEQ ID NO: 3 only in that the three amino acid residues T (threonine) -G (glycine) -A (alanine) are added to the N-terminal.
  • SEQ ID NO: 6 standard peptide 3: TGAEKTGVCP ELQADQNCTQ ECVSDSECAD NLKCCSAGCA TFCSLPNDKE GSCPQVNINF PQLGLCRDQC QVDSQCPGQM KCCRNGCGKV SCVTPNF
  • the first anti-C-terminal antibody as the C-terminal recognition antibody of the W10409 fragment shown in SEQ ID NO: 1 is the "new edition anti-peptide antibody experimental protocol" (Shinobu Oumi, Kunio Tsujimura). , Supervised by Masaki Inagaki, Shujunsha, published on September 6, 2004).
  • SEQ ID NO: 7 the synthetic peptide shown in SEQ ID NO: 7 below is used, in which CGGG (cysteine-glycine-glycine-glycine) is attached to the N-terminal side of PQLG (proline-glutamine-lysine-glycine) which is the C-terminal of the W10409 fragment. board.
  • This synthetic peptide was administered intravenously to chickens at weekly intervals. After the 4th administration, the antibody titer in chicken serum was measured by the ELISA method. As a result, it was found that the antibody titer was sufficiently increased, and the antiserum was collected one week after the day of the final immunization.
  • the synthetic peptide of SEQ ID NO: 7 was immobilized on an agarose carrier, and the antibody was purified from antiserum using this as an affinity column.
  • the antibody thus obtained was subclass IgY, and this antibody was used as the first anti-C-terminal antibody.
  • the second anti-C-terminal antibody as the C-terminal recognition antibody of the W14309 fragment shown in SEQ ID NO: 2 is the "new anti-peptide antibody experiment" shown in (1-3). It was made according to the method described in "Protocol”.
  • the immunogen used was the synthetic peptide shown in SEQ ID NO: 8 below, in which CGGG was added to the N-terminal side of QVNIN (glutamine-valine-asparagine-isoleucine-asparagine), which is the C-terminal of the W14309 fragment.
  • This synthetic peptide was administered intravenously to rabbits at weekly intervals. After the 4th administration, the antibody titer in rabbit serum was measured by the ELISA method. As a result, it was found that the antibody titer was sufficiently increased, and the antiserum was collected one week after the day of the final immunization.
  • the synthetic peptide of SEQ ID NO: 8 was immobilized on an agarose carrier, and the antibody was purified from antiserum using this as an affinity column.
  • the antibody thus obtained was a subclass IgG, and this antibody was used as a second anti-C-terminal antibody.
  • This synthetic peptide was administered intravenously to chickens at weekly intervals. After the 4th administration, the antibody titer in chicken serum was measured by the ELISA method. As a result, it was found that the antibody titer was sufficiently increased, and the antiserum was collected one week after the day of the final immunization.
  • the synthetic peptide of SEQ ID NO: 9 was immobilized on an agarose carrier, and the antibody was purified from antiserum using this as an affinity column.
  • the antibody thus obtained was subclass IgY, and this antibody was used as a third anti-C-terminal antibody.
  • Anti-N-terminal region antibody As the anti-N-terminal region antibody, a commercially available anti-HE4 antibody (Product No.ab200828, Abcam) was used. This antibody has an amino acid sequence on the N-terminal side of QVNIN, which is the amino acid sequence recognized by the second anti-C-terminal antibody, or a three-dimensional structure composed of several amino acids in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3. Is presumed to recognize.
  • the standard peptide 4 shown in SEQ ID NO: 10 below was synthesized as a peptide on the C-terminal side of the standard peptide 1 (SEQ ID NO: 1) and the standard peptide 2 (SEQ ID NO: 2). .. The method for synthesizing the standard peptide 4 was based on the standard peptide 1 and the standard peptide 2.
  • the commercially available anti-HE4 antibody has an amino acid on the N-terminal side. It was found to recognize a sequence or a three-dimensional structure composed of several amino acids.
  • Example 1 when the creatinine concentration in the urine of the sample is used as a reference amount and the first fragment amount, which is the W10409 fragment amount, is used as an index as a detection model for lung adenocarcinoma, the second fragment amount, which is the W14309 fragment amount, is used as an index. In addition, the case where the combined amount of the first fragment amount and the second fragment amount was used as an index was examined.
  • the ELISA plate was washed 3 times with PBS-Tween, and then 200 ⁇ L of Blocking One (Product No. 03953-66, Nacalai Tesque) diluted 1: 5 with pure water was added per well for 2 hours at 25 ° C. After incubation, washing was performed three times with Tween-added PBS (hereinafter referred to as "PBS-Tween"). Then, 100 ⁇ L of a sample diluted 1: 3 with BSA-PBS was added per well, incubated at 25 ° C. for 2 hours, and washed with PBS-Tween three times.
  • PBS-Tween Tween-added PBS
  • the first anti-C-terminal antibody diluted 1: 5000 with BSA-PBS was added at 100 ⁇ L per well, incubated at 25 ° C. for 1.5 hours, and then washed with PBS-Tween. It was carried out three times. After that, a horseradish peroxidase (HRP) -labeled antibody (Peroxidase Affinity pure Donkey Anti-Chicken IgY (IgG) (H + L), Product No.703-035-155, Jacson IRL), which is an anti-chicken IgY antibody, was used as BSA-. It was diluted 1: 5000 with PBS, 100 ⁇ L was added per well, incubated at 25 ° C.
  • HRP horseradish peroxidase
  • TMB Substrate Ultra Solution (Product No. ES022-100ML, Merc) was added per well as a substrate. After the enzymatic reaction at 25 ° C. for 5 to 10 minutes, the reaction was stopped by adding sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (iMark microplate reader, BIO-RAD). The measured absorbance was applied to a calibration curve prepared in advance using the standard peptide 1 to calculate the amount of the first fragment.
  • the first judgment value was obtained by dividing the amount of the first fragment obtained for each sample by the urinary creatinine concentration. Similarly, the amount of the second fragment obtained for each sample was divided by the urinary creatinine concentration to obtain the second judgment value. Further, for each sample, the correction judgment value (10 times) was obtained by adding the second judgment value to the value obtained by multiplying the first judgment value by 10. Further, the magnification was changed to 20 times and 30 times to obtain a correction determination value (20 times) and a correction determination value (30 times).
  • the values normalized in this way are shown in FIG. 2 (A) for the first judgment value, in FIG. 2 (B) for the second judgment value, and in FIG. 2 (C) for the correction judgment value (10 times). Plotd on the graph as follows.
  • non-normalized first judgment value is shown in FIG. 3 (A)
  • the non-normalized second judgment value is shown in FIG. 3 (B)
  • the non-normalized correction judgment value (10 times) is shown in FIG. 3 ( Plots were made on the graph as shown in C).
  • FIG. 3 (A) the degree of overlap in the first determination value of FIG. 3 (A) is shown in FIG. 3 (B). It can be seen that it is smaller than the degree of overlap in the second determination value. Further, it can be seen that the degree of overlap in the correction determination value of FIG. 3C is smaller than that of both the first determination value of FIG. 3A and the second determination value of FIG. 3B.
  • ROC- when the first judgment value, the second judgment value, the correction judgment value (10 times), the correction judgment value (20 times), and the correction judgment value (30 times) in the case of normalization are used as inspection indexes.
  • the AUC was calculated, it was 0.83, 0.62, 0.84, 0.87 and 0.83, respectively. From this ROC-AUC value, it can be said that the first determination value based on the W10409 fragment amount is superior to the second determination value based on the W14309 fragment amount as a test index for lung adenocarcinoma. Further, the correction judgment value obtained by combining the first judgment value and the second judgment value is further excellent as an inspection index as compared with the case where the first judgment value and the second judgment value are used alone. Can be said.
  • the ROC-AUC when not normalized has the same value as above.
  • FIG. 4 shows a graph in which the unnormalized first judgment value and the second judgment value are paired and plotted on a two-dimensional plane for each sample.
  • the circular symbol in the graph indicates a healthy person's sample, and the square symbol indicates a patient's sample.
  • neither the first judgment value nor the second judgment value shows a prominent value in the sample of a healthy person, but either the first judgment value or the second judgment value is shown in the patient sample.
  • the frequency of mutations in which the W10409 fragment occurs is higher than the frequency of mutations in which the W14309 fragment occurs, it can be explained that the first determination value is superior to the second determination value as a test index. Then, it is not possible to determine that the mutation that causes the W14309 fragment is positive with the first determination value, but it is presumed that this mutation can be made positive without being missed to some extent by adding the second determination value. Will be done.
  • N is the total number of samples
  • t is the threshold value
  • x i is the individual judgment value in the patient group
  • x j is the individual judgment value in the healthy subject group.
  • the MSE was 0.0269, which was the minimum when the threshold value was -0.21.
  • the MSE was 0.0948, which was the minimum when the threshold value was 0.62.
  • the MSE was 0.00681, which was the minimum when the threshold value was ⁇ 0.106.
  • the MSE was 0.0835 when the threshold value was ⁇ 0.079.
  • the MSE was 0.01258 when the threshold value was 0.08405.
  • the MSE For the first judgment value that was not normalized, the MSE was 0.000245, which was the minimum when the threshold value was 0.141. Regarding the second determination value not normalized, the MSE was 0.02, which was the minimum when the threshold value was 0.485. Further, regarding the normalized correction determination value (10 times), the MSE was 0.0069, which was the minimum when the threshold value was 2.1. Further, for the correction judgment value (20 times) that was not normalized, the MSE was 0.03 when the threshold value was 3.668. Further, for the unnormalized correction determination value (30 times), the MSE was 0.087 when the threshold value was 5.192.
  • ROC-AUC, threshold value and MSE for each of the above-mentioned normalized judgment values are shown in Table 1 below, and the ROC-AUC, threshold value and MSE for each of the above-mentioned non-normalized judgment values are shown in Table 2 below.
  • the judgment model using the first judgment value based on the detection of the W10409 fragment has an extremely high ROC-AUC and a smaller MSE than the judgment model using the second judgment value based on the detection of the W14309 fragment. Therefore, it was found to be an excellent method for detecting lung adenocarcinoma.
  • the judgment model that uses the modified judgment value that takes into account the second judgment value while placing more emphasis on the first judgment value has almost the same ROC-AUC as the judgment model with the first judgment value alone. There was. In addition, MSE was remarkably small in each of the correction determination values. Therefore, it was found that the judgment model using the modified judgment value is superior to the judgment model using the first judgment value alone as a method for detecting lung adenocarcinoma.
  • the method for detecting lung adenocarcinoma is as follows. That is, urine is collected from a subject whose patient is unknown whether or not the patient has lung adenocarcinoma, and the creatinine concentration in the urine is measured according to the above (2-1) using this urine as a sample. Measure the amount of fragments. Then, if the first determination value calculated according to (2-4) above and the value normalized in the same manner is ⁇ 0.21 or more shown in Table 1 above, it can be determined to be positive for lung adenocarcinoma. can. When not normalized, the value before normalization is used as the threshold value, and if it is 0.141 or more shown in Table 2 above, it can be determined to be positive for lung adenocarcinoma.
  • the detection method of lung adenocarcinoma is as follows when the detection of the W14309 fragment is taken into consideration. That is, urine is collected from a subject whose patient is unknown whether or not the patient has lung adenocarcinoma, and the creatinine concentration in the urine is measured according to the above (2-1) using this urine as a sample. The amount of the fragment is measured, and the amount of the second fragment is further measured according to (2-3) above. Then, the first judgment value and the second judgment value are calculated according to the above (2-4), the correction judgment value is further calculated from these, and the values normalized in the same manner are shown in Table 1 above.
  • the value before normalization is used as the threshold value, and if it is 2.1 or more shown in Table 2 above, it can be determined to be positive for lung adenocarcinoma.
  • the case of the correction determination value of 10 times has been described as an example, but the same applies to the correction determination values of other magnifications. This also applies to Example 2 described later.
  • the ELISA method is adopted for measuring the amount of the first fragment and the amount of the second fragment, and it is completed within 8 hours from the addition of the sample derived from the subject until each judgment value is obtained.
  • a general-purpose automated device it is possible to measure a large number of samples at the same time in a short time, and it is excellent in high throughput. The same applies to Example 2 described later.
  • Example 2 when the total WFDC2 protein mass in the urine of the sample is used as a reference amount and the first fragment amount, which is the W10409 fragment amount, is used as an index as a detection model for lung adenocarcinoma, the second fragment amount, which is the W14309 fragment amount, is used as an index. Was used as an index, and the case where the combined amount of the first fragment amount and the second fragment amount was used as an index was examined.
  • HRP Horseradish peroxidase
  • Peroxidase Affinity pure Donkey Anti-Rabbit IgG, Product No.711-035-152, Jacson IRL that recognizes the above-mentioned N-terminal region antibody is diluted 1: 5000 with BSA-PBS. 100 ⁇ L was added per well, and the mixture was incubated at 25 ° C. for 1 hour, and washed with PBS-Tween 5 times. Then, 100 ⁇ L of TMB Substrate Ultra Solution (Product No. ES022-100ML, Merck) was added per well as a substrate. After the enzymatic reaction at 25 ° C.
  • TMB Substrate Ultra Solution Product No. ES022-100ML, Merck
  • the reaction was stopped by adding sulfuric acid, and the absorbance at 450 nm was measured using a microplate reader (iMark microplate reader, BIO-RAD). The measured absorbance was applied to a calibration curve prepared in advance using the standard peptide 3, and the total WFDC2 protein mass was calculated.
  • the first judgment value was obtained by dividing the amount of the first fragment obtained for each sample by the total WFDC2 protein mass. Similarly, the second fragment amount obtained for each sample was divided by the total WFDC2 protein mass to obtain a second determination value. Further, for each sample, the correction judgment value was obtained by adding the second judgment value to the value obtained by multiplying the first judgment value by 10.
  • the first judgment value, the second judgment value, and the correction judgment value obtained above are the average values and standard deviations of the combined group of the patient group and the healthy subject group, and are the same as in (2-4) above. Normalization was done. The values normalized in this way are shown in the graph as shown in FIG. 5 (A) for the first judgment value, FIG. 5 (B) for the second judgment value, and FIG. 5 (C) for the correction judgment value. Plotted.
  • the non-normalized first judgment value is shown in FIG. 6 (A)
  • the non-normalized second judgment value is shown in FIG. 6 (B)
  • the non-normalized correction judgment value is shown in FIG. 6 (C). It was plotted on the graph as follows.
  • the ROC-AUC when the first judgment value, the second judgment value and the correction judgment value were used as inspection indexes were 0.76, 0.72 and 0.76, respectively. From this ROC-AUC value, it can be said that the first determination value based on the W10409 fragment amount is slightly superior to the second determination value based on the W14309 fragment amount as a test index for lung adenocarcinoma. Further, it can be said that the correction determination value obtained by combining the first determination value and the second determination value is equivalent to the first determination value from the ROC-AUC value.
  • the ROC-AUC in the non-normalized case has the same value as above.
  • FIG. 4 shows a graph in which the unnormalized first judgment value and the second judgment value are paired and plotted on a two-dimensional plane for each sample.
  • the circular symbol in the graph indicates a healthy person's sample, and the square symbol indicates a patient's sample.
  • neither the first judgment value nor the second judgment value shows a prominent value in the sample of a healthy person, but either the first judgment value or the second judgment value is shown in the patient sample. May show a prominent value for the sample. That is, in a lung adenocarcinoma patient, when a mutation occurs in the WFDC2 protein, it is presumed that either the mutation resulting in the W10409 fragment occurs or the mutation resulting in the W14309 fragment occurs. Since the frequency of mutations in which the W10409 fragment occurs is higher than the frequency of mutations in which the W14309 fragment occurs, it is presumed that the first determination value is somewhat superior to the second determination value as a test index. ..
  • the MSE was 0.0713, which was the minimum when the threshold value was -0.31.
  • the MSE was 0.047, which was the minimum when the threshold value was ⁇ 0.31.
  • the MSE was 0.0581, which was the minimum when the threshold value was set to ⁇ 0.34.
  • the MSE was 0.0004, which was the minimum when the threshold value was 0.051.
  • the MSE was 0.004, which was the minimum when the threshold value was 0.157.
  • the MSE was 0.045, which was the minimum when the threshold value was 0.68.
  • ROC-AUC, threshold value and MSE for each of the above-mentioned normalized judgment values are shown in Table 3 below, and the ROC-AUC, threshold value and MSE for each of the above-mentioned non-normalized judgment values are shown in Table 4 below.
  • the ROC-AUC is higher in the former and the lung adenocarcinoma. It can be seen that it is an excellent detection method.
  • the judgment model that uses the modified judgment value that takes into account the second judgment value while placing more emphasis on the first judgment value has the same ROC-AUC as the judgment model of the first judgment value alone, but MSE. I was able to make it smaller. Since ROC-AUC itself has a certain height, it can be seen that it is useful as a determination model for lung adenocarcinoma.
  • the method for detecting lung adenocarcinoma is as follows. That is, urine is collected from a subject whose patient is unknown whether or not it is a lung adenocarcinoma patient, and the creatinine concentration in the urine is measured according to the above (3-1) using this urine as a sample, and the first according to the above (3-2). Measure the amount of fragments. Then, if the first determination value calculated according to (3-4) above and the value normalized in the same manner is ⁇ 0.31 or more shown in Table 3 above, it can be determined to be positive for lung adenocarcinoma. can. When not normalized, if it is 0.051 or more shown in 4 above, it can be determined to be positive for lung adenocarcinoma.
  • the detection method of lung adenocarcinoma is as follows when the detection of the W14309 fragment is taken into consideration. That is, urine is collected from a subject whose patient is unknown whether or not the patient has lung adenocarcinoma, and the creatinine concentration in the urine is measured according to the above (3-1) using this urine as a sample. The amount of the fragment is measured, and the amount of the second fragment is further measured according to (3-3) above. Then, the first judgment value and the second judgment value are calculated according to the above (3-4), the correction judgment value is further calculated from these, and the values normalized in the same manner are shown in Table 3 above.
  • the model using the creatinine concentration as the reference amount is the total WFDC2 protein mass even if it is based on the same first fragment amount and second fragment amount. It was shown that it is superior to the model based on the above as a method for detecting lung adenocarcinoma.
  • Example 3 In Example 3, it was verified whether or not lung adenocarcinoma could be detected by using the threshold value 2.1 of the correction determination value (10 times) obtained in Example 1.
  • the two patients diagnosed with lung adenocarcinoma were patients diagnosed with lung adenocarcinoma by surgery, transbronchial biopsy, lymph node biopsy or cytology.
  • the 10 patients who were determined not to have lung adenocarcinoma were healthy subjects. The result is shown in FIG.

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Abstract

ハイスループット性に優れるＥＬＩＳＡ法において、腺癌を高い感度及び特異度をもって効率的に検出する。被験者に由来する試料中におけるＷＦＤＣ２蛋白質の蛋白質断片に基づく腺癌の検出方法であって、ＥＬＩＳＡ法により求められる配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第一断片量を、ＥＬＩＳＡ法により求められる前記試料中における総ＷＦＤＣ２蛋白質量又はクレアチニン濃度で定義される基準量で除して求められる値である第一判定値と、あらかじめ定めた閾値との比較によって腺癌の有無を判定する腺癌の検出方法。

Description

腺癌の検出方法及び検査キット
　本発明は、腺癌の検出方法及び検査キットに関する。
　腺癌（adenocarcinoma）とは、分泌腺組織の細胞から発生する上皮性悪性腫瘍の一つである。肺腺癌、肝臓腺癌、膵臓腺癌、リンパ腺癌、子宮腺癌、精嚢腺癌、胃腺癌など、身体のあらゆる臓器に発生し得る。
　このうち、肺腺癌は初期症状が出づらく早期発見が困難な腺癌の一つである。肺腺癌は、肺癌の組織型の中でも最も発生頻度が高く、男性の肺癌のうち約４０％、女性では約７０％、全体では約５０％程度を肺腺癌が占めている。肺癌は国内の悪性腫瘍死亡数の第一位であることから、肺腺癌を早期に検出する技術が求められている。
　肺癌の生存率は臨床病期の進行とともに低下する。例えば手術が可能な臨床病期ＩＡ、ＩＢ、ＩＩＡ、ＩＩＢおよびＩＩＩＡ期の非小細胞肺癌では、５年生存率がそれぞれ８２．０％、６６．１％、５４．５％、４６．１％及び４２．８％であり（Sawabata, N., et al. (2011): "Japanese lung cancer registry study of 11,663 surgical cases in 2004: demographic and prognosis changes over decade", J.Thorac.Oncol., 6(7), p.1229-1235）、手術適応のない臨床病期ＩＩＩＢ及びＩＶ期の非小細胞肺癌では、生存期間中央値はそれぞれ２２．４か月（Atagi, S., et al. (2012): "Thoracic radiotherapy with or without daily low-dose carboplatin in elderly patients with non-small-cell lung cancer: a randamised, controlled, phase 3 trial by the Japan Clinical Oncology Group (JCOG0301)", Lancet Oncol., 13, p.671-678）及び１０．３か月（Scagliotti, G.V., et al. (2008): "Phase III study comparing cisplatin plus gemcitabine with cisplatin plus pemetrexed in chemotherapy-naive patients with advanced-stage non-small-cell lung cancer", J.Clin.Oncol., 26(21),p.3543-3551）である。
　肺腺癌に対する既存の腫瘍マーカーとして血清中の癌胎児性抗原（carcinoembryonic antigen、ＣＥＡ）が臨床的な診断に用いられている。しかし、肺腺癌症例におけるＣＥＡの陽性率は３６．６～５６．５％に過ぎず（Molina, R., et al. (2016): "Assessment of a Combined Panel of Six Serum Tumor Markers for Lung Cancer", Am.J.Respir.Crit.Care Med., 193(4), doi.org/10.1164/rccm.201404-0603OC、Matsuoka, K., et al. (2007): "Prognostic value of carcinoembryonic antigen and CYFRA21-1 in patients with pathological stage I non-small cell lung cancer", Eur.J.Cardiothorac.Surg., 32(3), p.435-439）、特にＩ期の早期肺腺癌では陽性率が２７％と低いため（前記Matsuoka, K., et al.）、ＣＥＡでは根治可能な病期で肺腺癌を診断することは困難である。
　臨床応用に向けて開発が進められている検査方法として、蛋白質における不正常な切断の有無を検出して腺癌の有無を検出する方法が提案されている（国際公開第２０１７／１４２０２５号）。具体的には、蛋白質断片化率（Ｆｎ）なる指標を、多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring、ＭＲＭ）により測定された特定蛋白質の特定断片のピーク強度と別の特定断片のピーク強度の比より求める手法が記載されている。
　本件発明者らが検討したところ、特許文献１に記載の発明において具体化されているＭＲＭ法により蛋白質断片化率（Ｆｎ）を求める手法は、測定に供するまでの試料の前処理に通常２～３日もかかってしまい、しかも人の手による作業が頻繁に必要であり、誤差が生じやすいのみならず、同時に多検体を迅速に検査できる性質（以下、「ハイスループット性」という。）に関し難点があり、臨床的な実用に供しにくいという課題があることが分かった。
　そこで本発明者らは、ハイスループット性を向上させるために、サンドイッチ法で肺腺癌特有の蛋白質断片を検出して肺腺癌を検出することを試みた。
　しかし、単に特許文献１に記載のＭＲＭ法をサンドイッチ法に変更しようとしても、サンドイッチ法については発明が具体化されてない場合もあり、直ちに実施するのが困難な場合があることが分かった。たとえば、特許文献１においては、中間の配列のピーク強度と、特定配列のピーク強度とから断片化率を求めているが、特定配列のピーク強度をサンドイッチ法で得ることは困難であった。本発明者らが鋭意検討してサンドイッチ法を適用したが、特許文献１に記載のＲＯＣ（receiver operating characteristic）－ＡＵＣ（area under the curve）値は得られなかった。
　そこで、本発明の実施形態では、ハイスループット性に優れるサンドイッチ法において、腺癌を高い感度及び特異度をもって効率的に検出する方法及びキットを提供することを課題とする。
　前記課題を解決するための手段には、以下の態様が含まれる。
＜１＞被験者に由来する試料中におけるＷＦＤＣ２蛋白質の蛋白質断片に基づく腺癌の検出方法であって、サンドイッチ法により求められる配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第一断片量を、サンドイッチ法により求められる前記試料中における総ＷＦＤＣ２蛋白質量又はクレアチニン濃度で定義される基準量で除して求められる値である第一判定値と、あらかじめ定めた閾値との比較によって腺癌の有無を判定する腺癌の検出方法。
＜２＞前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第一抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記試料中の前記第一断片量とする、＜１＞に記載の腺癌の検出方法。
＜３＞前記第一判定値に換えて、サンドイッチ法により求められる配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第二断片量を、前記基準量で除して求められる値である第二判定値と、前記第一判定値を５～１００倍した値との和である修正判定値を用いる、＜１＞又は＜２＞に記載の腺癌の検出方法。
＜４＞前記配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第二抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記試料中の前記第二断片量とする、＜２＞を引用した＜３＞に記載の腺癌の検出方法。
＜５＞配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第三抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記総ＷＦＤＣ２蛋白質量とする、＜２＞又は＜２＞を引用した＜３＞を引用した＜４＞に記載の腺癌の検出方法。
＜６＞前記基準量は、前記総ＷＦＤＣ２蛋白質量である、＜１＞から＜５＞までのいずれかに記載の腺癌の検出方法。
＜７＞前記基準量は、前記クレアチニン濃度である、＜１＞か＜４＞までのいずれかに記載の腺癌の検出方法。
＜８＞前記試料が前記被験者の尿又は尿に由来する試料である、＜１＞から＜７＞までのいずれかに記載の腺癌の検出方法。
＜９＞
　サンドイッチ法により腺癌の有無を判定するための検査キットであって、第一マイクロプレートと、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片と特異的に結合する２種の抗体と、を含み、前記２種の抗体のうちの１つが第一マイクロプレートに固相化されている、検査キット。
＜１０＞
　前記２種の抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第一抗Ｃ末端抗体、及び前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体である、＜９＞に記載の検査キット。
＜１１＞
　第二マイクロプレートと、配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第二抗Ｃ末端抗体と、をさらに含み、前記第二抗Ｃ末端抗体及び前記抗Ｎ末端側領域抗体の一方が前記第二マイクロプレートに固相化されている、＜１０＞に記載の検査キット。
　本発明の実施形態は、上記のように構成されているので、ハイスループット性に優れるサンドイッチ法において、腺癌を高い感度及び特異度をもって効率的に検出する方法及びキットを提供することができる。
市販の抗ＨＥ４抗体（Product No.ab200828、Abcam）（抗Ｎ末端側領域抗体）を用いて、標準ペプチド１、標準ペプチド２及び標準ペプチド４に対して常法にてＥＬＩＳＡを行った際の、吸光度と標準ペプチドとの濃度の相関をプロットしたグラフである。 クレアチニン濃度を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化した値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。 クレアチニン濃度を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化していない値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。 クレアチニン濃度を基準量とした場合の、正規化していない第一判定値と第二判定値とを対にして二次元平面上にプロットしたグラフである。 総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化した値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。 総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とした場合の、第一判定値（Ａ）、第二判定値（Ｂ）及び修正判定値（Ｃ）のそれぞれについて正規化していない値を患者群及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。 総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とした場合の、正規化していない第一判定値と第二判定値とを対にして二次元平面上にプロットしたグラフである。 クレアチニン濃度を基準量とした場合の、新規被検体を修正判定値で判定した際の値を患者及び健常者群のそれぞれについてプロットしたグラフである。
［第一実施形態］
　第一実施形態に係る腺癌の検出方法は、被験者に由来する試料中におけるＷＦＤＣ２蛋白質の蛋白質断片に基づく腺癌の検出方法であって、サンドイッチ法により求められる配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第一断片量を、サンドイッチ法により求められる前記試料中における総ＷＦＤＣ２蛋白質量又はクレアチニン濃度で定義される基準量で除して求められる値である第一判定値と、あらかじめ定めた閾値との比較によって腺癌の有無を判定する。
　ＷＦＤＣ２は、「WAP（whey acidic protein） four-disulfide core domain protein 2」の略であり、「human epididymis protein 4」（ＨＥ４）としても知られている。ＷＦＤＣ２蛋白質は分泌蛋白質であり、細胞外に放出される際にＮ末端側のシグナルぺプチドが切断されることが知られている。細胞外に放出されたＷＦＤＣ２蛋白質の全長アミノ酸配列は、典型的には、下記に示す配列番号３の９４アミノ酸残基からなる。
　配列番号３：EKTGVCPELQ ADQNCTQECV SDSECADNLK CCSAGCATFC SLPNDKEGSC PQVNINFPQL GLCRDQCQVD SQCPGQMKCC RNGCGKVSCV TPNF
　肺腺癌患者のＷＦＤＣ２蛋白質では、上記全長アミノ酸配列のうち、６１番目のグリシン（Ｇ）と６２番目のロイシン（Ｌ）との間にニックが入る変異の起こる頻度が、健常者よりも高いことが分かっている。このニックのＮ末端側のペプチド断片のアミノ酸配列は下記に示す配列番号１のとおりであり、以下このペプチド断片を「Ｗ１０４０９断片」と称する。
　配列番号１：EKTGVCPELQ ADQNCTQECV SDSECADNLK CCSAGCATFC SLPNDKEGSC PQVNINFPQL G
　本実施形態では、サンドイッチ法によって被験体に由来する試料中の総ＷＦＤＣ２蛋白質量又はクレアチニン濃度のいずれかを測定し、これを基準量とする。また、サンドイッチ法によってＷ１０４０９断片の量を測定し、これを第一断片量とする。そして、第一断片量を基準量で除して求められる値である第一判定値、すなわち、基準量に対するＷ１０４０９断片の割合を算出し、この値によって、腺癌の有無が判定される。この判定は、あらかじめ定めた閾値との比較によって、たとえばこの閾値より大きければ腺癌陽性とされる。
　ここでこの閾値としては、腺癌の陽性と陰性とを峻別することが可能であるような任意の値を選択することができる。たとえば、あらかじめ複数の既知の腺癌患者（たとえば、肺腺癌患者）から採取した試料について、上記した第一判定値を算出し、また、複数の健常者（すなわち、腺癌罹患が認められない者）から採取した試料についても同様に第一判定値を算出しておいて、腺癌患者と健常者とでそれぞれの第一判定値を比較し、感度（すなわち、腺癌患者の試料を陽性と判定できる割合）及び特異度（すなわち、健常者の試料を陰性と判定できる割合）がより高くなるような値を閾値とすることができる。このような閾値の選定は、たとえばＲＯＣ－ＡＵＣ（Receiver Operating Characteristic-Area Under the Curve）値を基準にして、ＭＳＥ（mean square error、平均二乗誤差）が最小となるような値を選定することが考えられる。
　また、閾値は、正規化した値であってもよい。正規化した値を閾値とする場合には、試料に由来する第一判定値を閾値と同様に正規化し、正規化後の閾値と正規化後の第一判定値とを比較すればよい。なお、本開示において「閾値」との用語は、正規化しない閾値と、正規化後の閾値との両方を含む概念である。
　正規化の例としては、正規化前の個別の値をｘ、平均値をμ及び標準偏差をσとした場合、正規化後の値ｎを、
　ｎ＝（ｘ－μ）／σ
で算出する方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。例示した正規化によれば、患者群及び健常者群を合わせた群の平均値は０、分散は１となる。
　このような閾値と第一判定値とを比較することで、試料中のＷ１０４０９断片の量を指標として、腺癌の有無を高い感度及び特異度をもって判定することが可能となる。
　サンドイッチ法は、マイクロプレート、磁性粒子又はセンサーチップ等の測定領域に、あらかじめ検出対象物質（抗原）に対する抗体（以下「一次抗体」ともいう。）を固相化しておき、免疫反応によって検出対象物質を捕捉した後、続いて、検出対象物質に特異的に結合する、他の抗体（以下「二次抗体」ともいう。）を結合させて、この二次抗体を用いて抗原の存在量を測定する手法である。二次抗体を用いて抗原の存在量を測定する手法は特に制限されず、二次抗体にあらかじめ標識を付与しておき標識により抗原の存在量を測定する方法であってもよく、二次抗体に特異的に結合するさらなる抗体（以下「三次抗体」ともいう。）にあらかじめ標識を付与しておきその標識により抗原の存在量を測定する方法であってもよい。
　一次抗体及び二次抗体は、本実施形態の目的を達成することができれば特に制限されず、後述する各種の抗体や市販されている抗体を用いることが出来る。
　標識は、本実施形態の目的を達成することが出来れば特に制限されず、公知の標識を用いることができる。標識としては、例えば、蛍光色素、蛍光ナノ粒子、凝集ナノ粒子、磁気ビーズ、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質が挙げられる。これらの標識による酵素基質反応および化学反応並びに標識自体から生じる発光、吸光、蛍光および放射線量などを測定することで、抗原の量を測定することができる。
　標識として酵素・補酵素を用いる場合、酵素・補酵素としては、例えば西洋ワサビ由来のペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）やアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）を挙げることができる。それぞれに対応した適切な基質と組み合わせて用いることで、蛋白質量及び断片量の定量化が可能である。
　サンドイッチ法による蛋白質量及び断片量の定量では、検体として濃度が既知の生体由来物質から得られるシグナル強度を用いて検量線を作成し、検出対象物質から得たシグナル強度をあてはめて濃度を求めることができる。
　サンドイッチ法は、公知の手法が実用化されており、それらのいずれを用いても良い。サンドイッチ法としては、具体的には、ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）法、CLIA（chemiluminescent immunoassay）法、ECLIA（Electro　Chemiluminescence　Immunoassay）法などが挙げられる。これらの中でも、サンドイッチ法としてはELISA法が好ましい。
　なお、これらのサンドイッチ法は定法に従って行えばよい。ＥＬＩＳＡ法を例にとると、具体的には、マイクロプレートのウェルに一次抗体を固定し、試料を添加し、試料中の特定断片等を一次抗体に結合させる。その後、二次抗体を結合させ、二次抗体に結合した検出用のペルオキシダーゼ等の酵素（後から二次抗体に結合させてもよい）に基質を反応させ、反応により生じた発色、発光、蛍光等を測定する。
　サンドイッチ法によれば、通常、２時間～８時間程度で判定を行うことができるため、ハイスループット性に優れる。
　これらのサンドイッチ法の中でも、定量性をより向上させてＲＯＣ－ＡＵＣをより向上させる観点から、ＥＬＩＳＡ法が好ましい。
［第二実施形態］
　第二実施形態の腺癌の検出方法は、第一実施形態において、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第一抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記試料中の前記第一断片量とする。
　第一抗Ｃ末端抗体とは、Ｗ１０４０９断片のＣ末端と特異的に結合する抗体である。たとえば、前記配列番号１において、Ｃ末端の４アミノ酸残基、すなわち、Ｃ末端の「ＰＱＬＧ」（プロリン－グルタミン－リシン－グリシン）と特異的に結合する抗体を、第一抗Ｃ末端抗体とすることができる。第一抗Ｃ末端抗体が認識するアミノ酸残基の数は、第一抗Ｃ末端抗体がＣ末端に特異的に結合できれば特に制限されず、たとえば３～１０とすることができる。
　抗Ｎ末端側領域抗体とは、第一抗Ｃ末端抗体が結合するＣ末端領域よりもＮ末端側を認識する抗体である。ここでこの抗Ｎ末端側領域抗体が認識する部位は、第一抗Ｃ末端抗体が結合するＣ末端領域よりもＮ末端側の複数個連続したアミノ酸残基であってもよいし、また、不連続なアミノ酸残基で構成される立体構造であってもよい。たとえば、上記した「ＰＱＬＧ」と特異的に結合する抗体を第一抗Ｃ末端抗体とした場合、抗Ｎ末端側領域抗体は少なくともこの「Ｐ」（プロリン）よりもＮ末端側に位置するアミノ酸残基を認識する部位の一部とすることが望ましい。ただし、第一抗Ｃ末端抗体と抗原認識部位が近接していると結合が競合することが考えられるため、互いの抗原認識部位はなるべく離れていることが望ましい。
　このような抗Ｎ末端側領域抗体と第一抗Ｃ末端抗体とを用いたサンドイッチ法によって、前記した第一実施形態においてＷ１０４０９断片を感度よく検出することができる。なお、本実施形態では、Ｗ１０４０９断片そのもののみならず、抗Ｎ末端側領域抗体が認識する部位よりもＮ末端側のアミノ酸残基が欠損した断片であっても、第一抗Ｃ末端抗体が結合できる断片であれば検出することができる。
［第三実施形態］
　第三実施形態の腺癌の検出方法は、第一実施形態又は第二実施形態において、前記第一判定値に換えて、サンドイッチ法により求められる配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第二断片量を、前記基準量で除して求められる値である第二判定値と、前記第一判定値を５～１００倍した値との和である修正判定値を用いる。
　肺腺癌患者のＷＦＤＣ２蛋白質では、前記した配列番号３の全長アミノ酸配列のうち、前記した６１番目のグリシン（Ｇ）と６２番目のロイシン（Ｌ）との間にニックが入る変異の頻度には及ばないものの、５６番目のアスパラギン（Ｎ）と５７番目のフェニルアラニン（Ｆ）との間にニックが入る変異の起こる頻度が、健常者よりも高いことが分かっている。このニックのＮ末端側のペプチド断片のアミノ酸配列は下記に示す配列番号２のとおりであり、以下このペプチド断片を「Ｗ１４３０９断片」と称する。
　配列番号２：EKTGVCPELQ ADQNCTQECV SDSECADNLK CCSAGCATFC SLPNDKEGSC PQVNIN
　本実施形態では、第一実施形態と同様に、サンドイッチ法によって試料中のＷ１０４０９断片の量である第一断片量を測定して、この第一断片量を基準量で除して第一判定値を算出する。さらに、サンドイッチ法によって同じ試料中のＷ１４３０９断片の量である第二断片量を測定して、この第二断片量を基準量で除して第二判定値を算出する。そして、第一断片量を所定の倍率、具体的には５～１００で乗じた値と、第二判定値との和を算出してこれを修正判定値とする。本実施形態ではこの修正判定値によって、腺癌の有無が判定される。この判定は、あらかじめ定めた閾値との比較によって、たとえばこの閾値より大きければ腺癌陽性とされる。上記の倍率は、ＲＯＣ－ＡＵＣとＭＳＥとをよりよく両立させる観点から、７～５０が好ましく、８～４０がより好ましく、１０～３０が特に好ましい。
　ここでこの閾値としては、第一実施形態と同様、腺癌の陽性と陰性とを峻別することが可能であるような任意の値を選択することができるが、第一判定値とともに第二判定値をも考慮して閾値を選択することが望ましい。たとえば、あらかじめ複数の既知の腺癌患者（たとえば、肺腺癌患者）から採取した試料について、上記した第一判定値及び第二判定値を算出して、上記と同様に修正判定値を算出し、また、複数の健常者（すなわち、腺癌罹患が認められない者）から採取した試料についても同様に第一判定値及び第二判定値を算出して、上記と同様に修正判定値を算出し、腺癌患者と健常者とでそれぞれの修正判定値を比較し、感度（すなわち、腺癌患者の試料を陽性と判定できる割合）及び特異度（すなわち、健常者の試料を陰性と判定できる割合）がより高くなるような値を閾値とすることができる。このような閾値の選定は、たとえばＲＯＣ－ＡＵＣ値を基準にして、ＭＳＥ（mean square error、平均二乗誤差）が最小となるような値を選定することが考えられる。
　なお、修正判定値及び閾値は、ＭＳＥが最小となるように、上記の倍率を調整して、これを第一断片量に乗じてさらに第二断片量を足し合わせて求めることも好ましい。また、修正判定値及び閾値は、ＲＯＣ－ＡＵＣが最大となるように、上記の倍率を調整して、これを第一断片量に乗じてさらに第二断片量を足し合わせて求めることも好ましい。また、修正判定値及び閾値は、ＭＳＥとＲＯＣ－ＡＵＣのバランスを考慮して上記の倍率を調整して、これを第一断片量に乗じてさらに第二断片量を足し合わせて求めることも好ましい。
　このような閾値と修正判定値とを比較することで、試料中のＷ１０４０９断片の量のみならずＷ１４３０９断片の量をも加味したものを指標として、腺癌の有無をより高い感度及び特異度をもって判定することが可能となる。
［第四実施形態］
　第四実施形態の腺癌の検出方法は、第二実施形態に基づく第三実施形態において、前記配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第二抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記試料中の前記第二断片量とする。
　第二抗Ｃ末端抗体とは、Ｗ１４３０９断片のＣ末端と特異的に結合する抗体である。たとえば、前記配列番号２において、Ｃ末端の５アミノ酸残基、すなわち、Ｃ末端の「ＱＶＮＩＮ」（グルタミン－バリン－アスパラギン－イソロイシン－アスパラギン）と特異的に結合する抗体を、第二抗Ｃ末端抗体とすることができる。第二抗Ｃ末端抗体が認識するアミノ酸残基の数は、第二抗Ｃ末端抗体がＣ末端に特異的に結合できれば特に制限されず、たとえば３～１０とすることができる。
　抗Ｎ末端側領域抗体とは、第二抗Ｃ末端抗体が結合するＣ末端領域よりもＮ末端側を認識する抗体である。ここでこの抗Ｎ末端側領域抗体が認識する部位は、第二抗Ｃ末端抗体が結合するＣ末端領域よりもＮ末端側の複数個連続したアミノ酸残基であってもよいし、また、不連続なアミノ酸残基で構成される立体構造であってもよい。たとえば、上記した「ＱＶＮＩＮ」と特異的に結合する抗体を第二抗Ｃ末端抗体とした場合、抗Ｎ末端側領域抗体は少なくともこの「Ｑ」（グルタミン）よりもＮ末端側に位置するアミノ酸残基を認識する部位の一部とすることが望ましい。ただし、第二抗Ｃ末端抗体と抗原認識部位が近接していると結合が競合することが考えられるため、互いの抗原認識部位はなるべく離れていることが望ましい。
　なお、Ｗ１４３０９断片を検出するための抗Ｎ末端側領域抗体は、Ｗ１０４０９断片を検出するための抗Ｎ末端側領域抗体とは異なる抗体であってもよいが、同じ抗体を使用することが望ましい。
　このような抗Ｎ末端側領域抗体と第二抗Ｃ末端抗体とを用いたサンドイッチ法によって、前記した第三実施形態においてＷ１４３０９断片を感度よく検出することができる。なお、本実施形態では、Ｗ１４３０９断片そのもののみならず、抗Ｎ末端側領域抗体が認識する部位よりもＮ末端側のアミノ酸残基が欠損した断片であっても、第二抗Ｃ末端抗体が結合できる断片であれば検出することができる。
［第五実施形態］
　第五実施形態の腺癌の検出方法は、第二実施形態又は第二実施形態に基づく第三実施形態に基づく第四実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第三抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記総ＷＦＤＣ２蛋白質量とする。
　第三抗Ｃ末端抗体とは、配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端と特異的に結合する抗体である。たとえば、前記配列番号３において、Ｃ末端の５アミノ酸残基、すなわち、Ｃ末端の「ＶＴＰＮＦ」（バリン－トレオニン－プロリン－アスパラギン－フェニルアラニン）と特異的に結合する抗体を、第三抗Ｃ末端抗体とすることができる。第三抗Ｃ末端抗体が認識するアミノ酸残基の数は、第三抗Ｃ末端抗体がＣ末端に特異的に結合できれば特に制限されず、たとえば３～１０とすることができる。
　抗Ｎ末端側領域抗体とは、第三抗Ｃ末端抗体が結合するＣ末端領域よりもＮ末端側を認識する抗体である。ここでこの抗Ｎ末端側領域抗体が認識する部位は、第三抗Ｃ末端抗体が結合するＣ末端領域よりもＮ末端側の複数個連続したアミノ酸残基であってもよいし、また、不連続なアミノ酸残基で構成される立体構造であってもよい。たとえば、上記した「ＶＴＰＮＦ」と特異的に結合する抗体を第三抗Ｃ末端抗体とした場合、抗Ｎ末端側領域抗体は少なくともこの「Ｖ」（バリン）よりもＮ末端側に位置するアミノ酸残基を認識する部位の一部とすることが望ましい。ただし、第三抗Ｃ末端抗体と抗原認識部位が近接していると結合が競合することが考えられるため、互いの抗原認識部位はなるべく離れていることが望ましい。
　なお、配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片を検出するための抗Ｎ末端側領域抗体は、Ｗ１０４０９断片を検出するための抗Ｎ末端側領域抗体及びＷ１４３０９断片を検出するための抗Ｎ末端側領域抗体のいずれとも異なっていてもよいし、また、これらのいずれかと同じであってもよいが、これらの両方と同じ抗体を使用することが望ましい。その場合、抗Ｎ末端側領域抗体は、Ｗ１４３０９断片のＣ末端に結合する第二抗Ｃ末端抗体が結合する部位よりもＮ末端側に位置するアミノ酸残基を認識する部位の一部とすることが望ましい。
　このような抗Ｎ末端側領域抗体と第三抗Ｃ末端抗体とを用いたサンドイッチ法によって、前記した第二実施形態及び第四実施形態において、配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片を感度よく検出することができる。なお、本実施形態では、配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片そのもののみならず、抗Ｎ末端側領域抗体が認識する部位よりもＮ末端側のアミノ酸残基が欠損した断片であっても、第三抗Ｃ末端抗体が結合できる断片であれば検出することができる。
［第六実施形態］
　第六実施形態の腺癌の検出方法は、第一実施形態から第五実施形態までのいずれかにおいて、前記基準量は、前記総ＷＦＤＣ２蛋白質量である。なお、総ＷＦＤＣ２蛋白質量は、いずれの位置にもニックが入っていないものと、前記したようなニックが入っているもののニックで分かたれる断片同士のジスルフィド結合が維持された状態にあるものとを含む。このような総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とすることで測定対象物質としてのＷ１０４０９断片又はＷ１４３０９断片の試料中の量を、ＷＦＤＣ２蛋白質全体に対する変異したＷＦＤＣ２蛋白質の割合として標準化して把握することができる。
［第七実施形態］
　第七実施形態の腺癌の検出方法は、第一実施形態から第四実施形態までのいずれかにおいて、前記基準量は、前記クレアチニン濃度である。クレアチニンは１日における産生量がほぼ一定であるとされ、すべてが尿中に排泄されるため、臨床検査において蛋白など尿中の測定対象物質の尿量の差による濃縮誤差を補正するために用いられていることから、クレアチニン濃度は、測定対象物質としてのＷ１０４０９断片又はＷ１４３０９断片の試料中の量を標準化する上での基準物質としての意義を有する。
［第八実施形態］
　第八実施形態の腺癌の検出方法は、第一実施形態から第七実施形態までのいずれかにおいて、前記試料が前記被験者の尿又は尿に由来する試料である。ＷＦＤＣ２蛋白質は尿中に排泄されるとともに、血清アルブミン等の余分な蛋白質が少ない点から、前記試料が前記被験者の尿又は尿に由来する試料であることが望ましい。ここで、「尿に由来する試料」とは、被験者から採取した尿そのものを希釈したり、また測定の便宜のために適宜の試薬を添加したりしたものをいう。
［第九実施形態］
　第九実施形態の検査キットは、サンドイッチ法により腺癌の有無を判定するための検査キットであって、第一マイクロプレートと、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片と特異的に結合する２種の抗体と、を含み、前記２種の抗体のうちの１つが第一マイクロプレートに固相化されている、検査キットである。
　第一マイクロプレートとして用いられるマイクロプレートは、多数のくぼみのついた平板からなり、各くぼみを試験管あるいはシャーレとして利用されるものである。マイクロプレートとしては、９６穴タイプのものが汎用されている。
　本実施形態における第一マイクロプレートは、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片と特異的に結合する２種の抗体を含み、前記２以上の抗体のうちの１つがマイクロプレートＡに固相化されている。固相化は、全てのくぼみに行われていることが好ましいが、これに制限されるものではない。また、固相化される抗体は、前述の２つの抗体のうちの１つのみであることが好ましい。
　第九実施形態の検査キットが含む２種の抗体は、それぞれが競合しにくい抗体であることが好ましい。２種の抗体が認識する部位は特に制限されず、配列番号１のアミノ酸配列を定量できるものであればよい。また、２種の抗体は、ポリクロ―ナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。固相化されていない抗体は、容器に入った状態でキットに含まれる。また固相化されていない抗体は定量のために西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などで標識されていてもよい。
　第九実施形態の検査キットは、前述の２種の抗体及び第一マイクロプレートの他に、サンドイッチ法にて常用されている材料をさらに含んでいてもよい。第九実施形態のキットに含まれる他の材料としては、例えば、２種の抗体の一方、特に固相化されていない抗体と特異的に結合できる三次抗体、緩衝液、洗浄液および発色液などを挙げることができる。第九実施形態の検査キットが含む他の材料は、これらに限定されるものではない。また、三次抗体は、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）などで標識されていてよもよい。
　第九実施形態の検査キットは、上述の実施形態に記載された腺癌の検出方法に用いることができる。第九実施形態の検査キットを用いることで、上述の実施形態のスループット性をより向上させることができる。
［第十実施形態］
　第十実施形態の検査キットは、第九実施形態に記載されたキットであって、前記２種の抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第一抗Ｃ末端抗体、及び前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体である。
　第一抗Ｃ末端抗体及び抗Ｎ末端側領域抗体は、第二実施形態と同様である。
［第十一実施形態］
　第十一実施形態の検査キットは、第十実施形態に記載の検査キットであって、さらに、第二マイクロプレートと、配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第二抗Ｃ末端抗体と、をさらに含み、前記第二抗Ｃ末端抗体及び前記抗Ｎ末端側領域抗体の一方が前記第二マイクロプレートに固相化されている。
　本実施形態における第二マイクロプレートは、第二抗Ｃ末端抗体及び抗Ｎ末端側領域抗体の一方が固相化されている。
　第二マイクロプレートとして用いられるマイクロプレートについては第九実施形態と同様である。また、第二抗Ｃ末端抗体および抗Ｎ末端側領域抗体は第四実施形態と同様である。
（１）測定用試料及び標準品の準備
（１－１）試料の採取
　胸部画像検査にて原発性肺癌が疑われる肺内結節影又は腫瘤影が存在する患者のうち、手術、経気管支生検、リンパ節生検又は細胞診により、肺腺癌と診断された患者を１０名選定した。選定した肺腺癌患者１０名及び健常者９名から試料として初尿を、滅菌コップを用いて採取し、測定まで－８０℃で保存した。測定に使用する際には凍結尿を室温で自然解凍したものをそれぞれ試料としてそのまま、総ＷＦＤＣ２タンパク質量、ＷＦＤＣ２タンパク質断片量及びクレアチニン濃度を解析に供した。
（１－２）標準品となるペプチドの合成
　Ｗ１０４０９断片及びＷ１４３０９断片にそれぞれ対応する標準品としての標準ペプチド１及び標準ペプチド２の合成は、常法の一つであるＦｍｏｃペプチド固相合成法によって行い、ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）カクテルを用いた通常の脱保護処理を経て粗ペプチドを得た。続いて粗ペプチドにおいてグルタチオンを用いた酸化還元条件にてシステイン（Ｃ）残基間のジスルフィド結合を形成させ、逆相ＨＰＬＣによって精製することで、下記の配列番号４に示す標準ペプチド１及び配列番号５に示す標準ペプチド２を得た。精製後の純度は標準ペプチド１が９６％、標準ペプチド２が９８％であった。
　配列番号４（標準ペプチド１）：TGAEKTGVCP ELQADQNCTQ ECVSDSECAD NLKCCSAGCA TFCSLPNDKE GSSPQVNINF PQLG
　配列番号５（標準ペプチド２）：TGAEKTGVCP ELQADQNCTQ ECVSDSECAD NLKCCSAGCA TFCSLPNDKE GSSPQVNIN
　なお、標準ペプチド１及び標準ペプチド２はいずれも、それぞれ対応するＷ１０４０９断片及びＷ１４３０９断片のＮ末端にＴ（トレオニン）－Ｇ（グリシン）－Ａ（アラニン）の３アミノ酸残基が付加されているが、Ｃ末端はいずれも対応する断片と同一である。さらに、Ｗ１０４０９断片の前記配列番号１及びＷ１４３０９断片の前記配列番号２において５０番目のアミノ酸残基であるＣ（システイン）が、標準ペプチド１及び標準ペプチド２において対応する５３番目でＳ（セリン）に置換されている。配列番号１及び配列番号２の５０番目のシステインのスルフヒドリル基は、配列番号３における８０番目のシステインのスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成していると考えられている。そのため、８０番目のシステイン残基が存在しない配列番号１及び配列番号２においては、他のシステインのスルフヒドリル基とジスルフィド結合を形成してしまい、生体内に存在する配列番号１及び配列番号２の蛋白質断片とは異なった立体構造となるおそれがある。立体構造が変化すると、抗体が認識できなくなる恐れがある。そのため、上記のとおりアミノ酸を置換している。
　全長ＷＦＤＣ２蛋白質に対応する標準品としての標準ペプチド３は、同じくＦｍｏｃペプチド固相合成法によって２つの断片ペプチドを合成した後、蛋白質の化学合成法の常法の一つであるネイティブケミカルライゲーションを用いて全長配列を構築した。続いてグルタチオンを用いた酸化還元条件にてシステイン（Ｃ）残基間のジスルフィド結合を形成させ、逆相ＨＰＬＣによって精製することで、下記の配列番号６に示す標準ペプチド３を得た。精製後の純度は９５％であった。なお、標準ペプチド３は、Ｎ末端にＴ（トレオニン）－Ｇ（グリシン）－Ａ（アラニン）の３アミノ酸残基が付加されている点のみ、前記配列番号３に示す全長ＷＦＤＣ２蛋白質と相違している。
　配列番号６（標準ペプチド３）：TGAEKTGVCP ELQADQNCTQ ECVSDSECAD NLKCCSAGCA TFCSLPNDKE GSCPQVNINF PQLGLCRDQC QVDSQCPGQM KCCRNGCGKV SCVTPNF
（１－３）第一抗Ｃ末端抗体の作製
　前記配列番号１に示すＷ１０４０９断片のＣ末端認識抗体としての第一抗Ｃ末端抗体は、「新版　抗ペプチド抗体実験プロトコール」（大海忍、辻村邦夫、稲垣昌樹監修、秀潤社、２００４年９月６日発行）に記載された方法に基づいて作製した。免疫原として、Ｗ１０４０９断片のＣ末端であるＰＱＬＧ（プロリン－グルタミン－リシン－グリシン）のＮ末端側にＣＧＧＧ（システイン－グリシン－グリシン－グリシン）を付した、下記配列番号７に示す合成ペプチドを用いた。
　配列番号７：CGGGPQLG
　この合成ペプチドをニワトリに対して１週間間隔で静注にて投与した。４回目の投与の後、ＥＬＩＳＡ法によりニワトリ血清中の抗体価の測定を行った。その結果、充分な抗体価の上昇を見出したため、最終免疫の日から１週間後に抗血清を回収した。
　前記配列番号７の合成ペプチドをアガロース担体に固定し、これをアフィニティーカラムとして、抗血清から抗体を精製した。
　次いで、ウェスタンブロッティングにより、末端がＰＱＬＧであるペプチドには結合するものの、配列の途中にのみＰＱＬＧを有するペプチドには結合しないことを確認した。このようにして得られた抗体はサブクラスＩｇＹであり、この抗体を第一抗Ｃ末端抗体として用いた。
（１－４）第二抗Ｃ末端抗体の作製
　前記配列番号２に示すＷ１４３０９断片のＣ末端認識抗体としての第二抗Ｃ末端抗体は、（１－３）に示した「新版　抗ペプチド抗体実験プロトコール」に記載された方法に基づいて作製した。免疫原は、Ｗ１４３０９断片のＣ末端であるＱＶＮＩＮ（グルタミン－バリン－アスパラギン－イソロイシン－アスパラギン）のＮ末端側にＣＧＧＧを付した、下記配列番号８に示す合成ペプチドを用いた。
　配列番号８：CGGGQVNIN
　この合成ペプチドをウサギに対して１週間間隔で静注にて投与した。４回目の投与の後、ＥＬＩＳＡ法によりウサギ血清中の抗体価の測定を行った。その結果、充分な抗体価の上昇を見出したため、最終免疫の日から１週間後に抗血清を回収した。
　前記配列番号８の合成ペプチドをアガロース担体に固定し、これをアフィニティーカラムとして、抗血清から抗体を精製した。
　次いで、ウェスタンブロッティングにより、末端がＱＶＮＩＮであるペプチドには結合するものの、配列の途中にのみＱＶＮＩＮを有するペプチドには結合しないことを確認した。このようにして得られた抗体はサブクラスＩｇＧであり、この抗体を、第二抗Ｃ末端抗体として用いた。
（１－５）第三抗Ｃ末端抗体の作製
　前記配列番号３に示す全長ＷＦＤＣ２蛋白質のＣ末端認識抗体としての第三抗Ｃ末端抗体は、（１－３）に示した「新版　抗ペプチド抗体実験プロトコール」に記載された方法に基づいて作製した。免疫原は、全長ＷＦＤＣ２蛋白質のＣ末端ＴＰＮＦ（トレオニン－プロリン－アスパラギン－フェニルアラニン）のＮ末端側にＣＧＧＧを付した、下記配列番号９に示す合成ペプチドを用いた。
　配列番号９：CGGGTPNF
　この合成ペプチドをニワトリに対して１週間間隔で静注にて投与した。４回目の投与の後、ＥＬＩＳＡ法によりニワトリ血清中の抗体価の測定を行った。その結果、充分な抗体価の上昇を見出したため、最終免疫の日から１週間後に抗血清を回収した。
　前記配列番号９の合成ペプチドをアガロース担体に固定し、これをアフィニティーカラムとして、抗血清から抗体を精製した。
　次いで、ウェスタンブロッティングにより、末端がＴＰＮＦであるペプチドには結合するものの、配列の途中にのみＴＰＮＦを有するペプチドには結合しないことを確認した。このようにして得られた抗体はサブクラスＩｇＹであり、この抗体を、第三抗Ｃ末端抗体として用いた。
（１－６）抗Ｎ末端側領域抗体
　抗Ｎ末端側領域抗体として、市販の抗ＨＥ４抗体（Product No.ab200828、Abcam）を使用した。この抗体は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３において、第二抗Ｃ末端抗体が認識するアミノ酸配列であるＱＶＮＩＮよりもＮ末端側のアミノ酸配列又はいくつかのアミノ酸により構成される立体構造を認識すると推測される。
　この抗体の抗原認識部位を確認するため、標準ぺプチド１（配列番号１）及び標準ペプチド２（配列番号２）よりもＣ末端側のペプチドとして、下記配列番号１０に示す標準ペプチド４を合成した。標準ペプチド４の合成方法は標準ペプチド１及び標準ペプチド２に準じた。
　配列番号１０（標準ペプチド４）：RDQCQVDSQCPGQMKCCRNGCGKVSCVTPNF
　常法により、様々な濃度の標準ペプチド１、標準ペプチド２及び標準ペプチド４について、市販の抗ＨＥ４抗体（Product No.ab200828、Abcam）及び各Ｃ末端認識抗体を用いたＥＬＩＳＡを行い、それぞれの吸光度を測定することで濃度依存性があるかどうかの確認を実施した。結果を図１に示す。
　図１に示された通り、また、後述の実施例においてＣ末端認識抗体と競合しないことが示されている通り、市販の抗ＨＥ４抗体（Product No.ab200828、Abcam）は、Ｎ末端側のアミノ酸配列又はいくつかのアミノ酸により構成される立体構造を認識することが分かった。
（２）実施例１
　実施例１では試料の尿中のクレアチニン濃度を基準量として、肺腺癌の検出モデルとして、Ｗ１０４０９断片量である第一断片量を指標とした場合、Ｗ１４３０９断片量である第二断片量を指標とした場合、並びに第一断片量と第二断片量とを組み合わせた量を指標とした場合を検討した。
（２－１）尿中クレアチニン濃度の測定
　得られた各試料のクレアチニン濃度を、尿試料中のクレアチニンの測定キット（Creatinine, Assay Kit, Colorimetric, for Urine Sample、Product No.500701、Cayman Chemical Company）を用いて測定した。プロトコルはキットに記載の方法に準拠した。
（２－２）第一断片量の測定
　各肺腺癌患者及び健常者から得られた試料中の第一断片量を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno（商標） MicroWell（商標） 96 well solid plates、Merck）の各ウェルに、一次抗体として前記した抗Ｎ末端側領域抗体を、１重量％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）含有リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（以下、「ＢＳＡ－ＰＢＳ」とする。）で１：４０００に希釈したものを１００μＬ添加し、４℃で一晩固定化した。その後ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ブロッキングワン（Product No.03953-66、ナカライテスク）を純水で１：５に希釈したものを１ウェルあたり２００μＬ加えて２５℃で２時間インキュベートし、その後Ｔｗｅｅｎ添加ＰＢＳ（以下、「ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ」とする。）で３回洗浄を実施した。その後、ＢＳＡ－ＰＢＳで１：３に希釈した試料を１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で２時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、二次抗体として第一抗Ｃ末端抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈したものを、１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で１．５時間インキュベートした後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、抗ニワトリＩｇＹ抗体である、西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（Peroxidase Affinity pure Donkey Anti-Chicken IgY(IgG)(H+L)、Product No.703-035-155、Jacson IRL）をＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈して１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎにて洗浄を５回実施した。そして、基質としてTMB Substrate Ultra Solution（Product No.ES022-100ML、Merc)を１ウェルあたり１００μＬ添加した。２５℃で５～１０分酵素反応後に硫酸の添加によって反応をストップさせ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（iMark マイクロプレートリーダー、BIO-RAD）を用いて測定した。測定した吸光度を、あらかじめ前記標準ペプチド１を用いて作成した検量線に当てはめ、第一断片量を算出した。
（２－３）第二断片量の測定
　各肺腺癌患者及び健常者から得られた試料中の第二断片量を、ELISA法で測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno（商標） MicroWell（商標） 96 well solid plates、Merck）の各ウェルに、一次抗体として前記した第二抗Ｃ末端抗体を、ＢＳＡ－ＰＢＳで１：４０００に希釈したものを１００μＬ添加し、４℃で一晩固定化した。その後ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ブロッキングワン（Product No.03953-66、ナカライテスク）を純水で１：５に希釈したものを１ウェルあたり２００μＬ加えて２５℃で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、ＢＳＡ－ＰＢＳで１：３に希釈した試料を１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で２時間でインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、二次抗体として、ペルオキシダーゼ標識キット（Dojindo Labeling Kit シリーズ　ペルオキシダーゼ標識キット、Product No.LK11、DMT）によりペルオキシダーゼ標識を行った前記抗Ｎ末端側領域抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：２０００に希釈して１ウェルあたり１００μＬ添加し室温で１．５時間インキュベートした。そして、基質としてTMB Substrate Ultra Solution(Product No.ES022-100ML,Merck)を１ウェルあたり１００μＬ添加した。２５℃で５～１０分酵素反応後に硫酸の添加によって反応をストップさせ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（iMark マイクロプレートリーダー、BIO-RAD）を用いて測定した。測定した吸光度を、あらかじめ前記標準ペプチド２を用いて作成した検量線に当てはめ、第二断片量を算出した。
（２－４）第一判定値、第二判定値及び修正判定値の算出
　各試料につき得られた第一断片量を尿中クレアチニン濃度で除して第一判定値を得た。同様に、各試料につき得られた第二断片量を尿中クレアチニン濃度で除して第二判定値を得た。さらに、各試料につき、第一判定値を１０倍した値に第二判定値を足し合わせて修正判定値（１０倍）を得た。また、倍率を２０倍及び３０倍に変更して、修正判定値（２０倍）及び修正判定値（３０倍）を得た。
　上記で得られた第一判定値、第二判定値及び修正判定値は、いずれも患者群及び健常者群を合わせた群の平均値及び標準偏差で正規化を行った。具体的には、正規化前の個別の値をｘ、平均値をμ及び標準偏差をσとした場合、正規化後の値ｎは、
　ｎ＝（ｘ－μ）／σ
で算出した。この正規化により、患者群及び健常者群を合わせた群の平均値は０、分散は１となる。このように正規化した値を、第一判定値について図２（Ａ）に、第二判定値について図２（Ｂ）に、及び修正判定値（１０倍）について図２（Ｃ）にそれぞれ示すようにグラフにプロットした。
　また、正規化していない第一判定値について図３（Ａ）に、正規化していない第二判定値について図３（Ｂ）に、及び正規化していない修正判定値（１０倍）について図３（Ｃ）にそれぞれ示すようにグラフにプロットした。
（２－５）閾値の決定
　次に、正規化した場合及び正規化していない場合のそれぞれにおける第一判定値、第二判定値及び各修正判定値のそれぞれについて、患者群と健常者群との重なりの程度を解析した。ここで、「重なりの程度」とは、患者群について得られた各判定値の低い範囲と、健常者群について得られた各判定値の高い範囲とがどのくらい重複しているか、ということを意味する。そして、この重複している範囲が狭いほど、当該判定値は患者群と健常者群とをより鋭敏に峻別することができる、ということを意味する。
　まず、正規化した場合において図２（Ａ）と図２（Ｂ）とを比較すると、一見して、図２（Ａ）の第一判定値における重なりの程度が、図２（Ｂ）の第二判定値における重なりの程度より小さいことが分かる。さらに、図２（Ｃ）の修正判定値における重なりの程度は、図２（Ａ）の第一判定値及び図２（Ｂ）の第二判定値のいずれよりも小さいことが見て取れる。
　また、正規化しない場合において、図３（Ａ）と図３（Ｂ）とを比較すると、一見して、図３（Ａ）の第一判定値における重なりの程度が、図３（Ｂ）の第二判定値における重なりの程度より小さいことが分かる。さらに、図３（Ｃ）の修正判定値における重なりの程度は、図３（Ａ）の第一判定値及び図３（Ｂ）の第二判定値のいずれよりも小さいことが見て取れる。
　次に、正規化した場合の第一判定値、第二判定値、修正判定値（１０倍）、修正判定値（２０倍）及び修正判定値（３０倍）を検査指標とした場合のＲＯＣ－ＡＵＣを算出したところ、それぞれ０．８３、０．６２、０．８４、０．８７及び０．８３であった。このＲＯＣ－ＡＵＣの値から、Ｗ１０４０９断片量に基づく第一判定値は、Ｗ１４３０９断片量に基づく第二判定値よりも肺腺癌の検査指標として優れている、ということがいえる。さらに、第一判定値と第二判定値とを組み合わせて得られる修正判定値は、第一判定値及び第二判定値それぞれ単独の場合に比較して、さらに検査指標として優れている、ということがいえる。なお、正規化しない場合のＲＯＣ－ＡＵＣも上記と同じ値である。
　なお、各試料について、正規化していない第一判定値と第二判定値とを対にして二次元平面上にプロットしたグラフを図４に示す。グラフ中の円形のシンボルは健常者の試料を示し、正方形のシンボルは患者の試料を示す。このグラフから分かるように、健常者の試料では第一判定値及び第二判定値のいずれも突出した値を示すことはないが、患者の試料では、第一判定値又は第二判定値のいずれかが突出した値を示す傾向がある。すなわち、肺腺癌患者では、ＷＦＤＣ２蛋白質において、Ｗ１０４０９断片が生ずる変異が起こるか、又は、Ｗ１４３０９断片が生ずる変異が起こるかのいずれかであると推測される。そして、Ｗ１０４０９断片が生ずる変異の頻度の方がＷ１４３０９断片が生ずる変異の頻度よりも高いことで、第一判定値の方が第二判定値よりも検査指標として優れていることが説明できる。そして、第一判定値ではＷ１４３０９断片が生ずる変異を陽性と判定することはできないが、この変異を第二判定値を加味することである程度取りこぼすことなく陽性とすることができている、と推測される。
　次に、患者群と健常者群との重なりの程度について、図２（Ａ）～（Ｃ）に示す正規化したデータ及び図３（Ａ）～（Ｃ）に示す正規化していないデータをそれぞれ用いて、ＭＳＥを指標として、第一判定値、第二判定値及び修正判定値をそれぞれ検査指標とする場合の閾値の算出を試みた。ＭＳＥは下記数式にて算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
　なお、上記数式中、Ｎは全試料数、ｔは閾値、ｘｉは患者群における個々の判定値、ｘｊは健常者群における個々の判定値である。上記数式を補足すると、患者群の個々の判定値（ｘｉ）については閾値（ｔ）を下回るもののみについて閾値（ｔ）との差を二乗した上で総計し、また、健常者群の個々の判定値（ｘｊ）については閾値（ｔ）を上回るもののみについて閾値（ｔ）との差を二乗した上で総計し、これらの和を全試料数（Ｎ）で除した値が、ＭＳＥである。上記数式から、ＭＳＥは、両軍の重なりの程度が小さいほど小さい値となることが分かる。
　そして、上記数式から、各判定値について、ＭＳＥが最小となるようなｔの値を閾値とした。
　その結果、正規化した第一判定値については、閾値を－０．２１としたときに、ＭＳＥが０．０２６９と最小となった。また、正規化した第二判定値については、閾値を０．６２としたときに、ＭＳＥが０．０９４８と最小となった。また、正規化した修正判定値（１０倍）については、閾値を－０．１０６としたときに、ＭＳＥが０．００６８１と最小となった。また、正規化した修正判定値（２０倍）については、閾値を－０．０７９としたときに、ＭＳＥが０．０８３５となった。さらに、正規化した修正判定値（３０倍）については、閾値を０．０８４０５としたときに、ＭＳＥが０．０１２５８となった。
　正規化していない第一判定値については、閾値を０．１４１としたときに、ＭＳＥが０．０００２４５と最小となった。また、正規化しない第二判定値については、閾値を０．４８５としたときに、ＭＳＥが０．０２と最小となった。また、正規化した修正判定値（１０倍）については、閾値を２．１としたときに、ＭＳＥが０．００６９と最小となった。また、正規化していない修正判定値（２０倍）については、閾値を３．６６８としたときに、ＭＳＥが０．０３となった。さらに、正規化してない修正判定値（３０倍）については、閾値を５．１９２としたときに、ＭＳＥが０．０８７となった。
　上記した正規化した各判定値についてのＲＯＣ－ＡＵＣ、閾値及びＭＳＥを下記表１に、上記した正規化していない各判定値についてのＲＯＣ－ＡＵＣ、閾値及びＭＳＥを下記表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　以上より、Ｗ１０４０９断片の検出に基づく第一判定値を用いる判定モデルの方が、Ｗ１４３０９断片の検出に基づく第二判定値を用いる判定モデルに比べ、ＲＯＣ－ＡＵＣが極めて高く、また、ＭＳＥも小さいため、肺腺癌の検出方法として優れていることが分かった。
　さらに、第一判定値により重きを置きつつ第二判定値をも加味した修正判定値を用いる判定モデルは、第一判定値単独の判定モデルに比べ、ＲＯＣ－ＡＵＣは高いものとほぼ同等のものとがあった。また、いずれの修正判定値も、ＭＳＥが著しく小さかった。そのため、修正判定値を用いる判定モデルは、第一判定値単独の判定モデルに比べ、肺腺癌の検出方法としてより優れていることが分かった。
　また、各判定値は、正規化していても正規化していなくてもよいことが分かった。
（２－６）肺腺癌の検出
　Ｗ１０４０９断片の検出を単独の指標とする場合、肺腺癌の検出方法は以下の通りとなる。すなわち、肺腺癌患者かどうか未知の被験者から尿を採取し、この尿を試料として、前記（２－１）に従い尿中のクレアチニン濃度を測定し、また、前記（２－２）に従い第一断片量を測定する。そして、前記（２－４）に従い第一判定値を算出してこれを同様に正規化した値が、上記表１に示す－０．２１以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。正規化しない場合には閾値に正規化前の値を用い、上記表２に示す０．１４１以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。
　また、Ｗ１０４０９断片の検出に加えＷ１４３０９断片の検出を加味する場合、肺腺癌の検出方法は以下の通りとなる。すなわち、肺腺癌患者かどうか未知の被験者から尿を採取し、この尿を試料として、前記（２－１）に従い尿中のクレアチニン濃度を測定し、また、前記（２－２）に従い第一断片量を測定し、さらに前記（２－３）に従い第二断片量を測定する。そして、前記（２－４）に従い第一判定値及び第二判定値を算出してさらにこれらから修正判定値を算出し、これを同様に正規化した値が、上記表１に示す－０．１０６以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。正規化しない場合には閾値に正規化前の値を用い、上記表２に示す２．１以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。ここでは１０倍の修正判定値の場合を例示して説明したが、他の倍率の修正判定値でも同様である。このことは後述の実施例２も同様である。
　なお、上記検出方法では第一断片量及び第二断片量の測定にＥＬＩＳＡ法を採用しており、被検体に由来する試料を添加してから各判定値が得られるまでを８時間以内で完了でき、汎用されている自動化装置によれば多数の検体を同時に短時間で測定することが可能であり、ハイスループット性に優れることとなっている。後述の実施例２も同様である。
（３）実施例２
　実施例２では試料の尿中の総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量として、肺腺癌の検出モデルとして、Ｗ１０４０９断片量である第一断片量を指標とした場合、Ｗ１４３０９断片量である第二断片量を指標とした場合、並びに第一断片量と第二断片量とを組み合わせた量を指標とした場合を検討した。
（３－１）総ＷＦＤＣ２蛋白質量の測定
　実施例１と同じ試料について、試料中の総ＷＦＤＣ２蛋白質量を、ＥＬＩＳＡ法で測定した。ＥＬＩＳＡプレート（Nunc-Immuno（商標） MicroWell（商標） 96 well solid plates、Merck）の各ウェルに、一次抗体として前記した第三抗Ｃ末端抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：８０００に希釈したものをに希釈したものを１００μＬ添加し、４℃で一晩固定化した。その後ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３回洗浄した後、ブロッキングワン（Product No. 03953-66、ナカライテスク）を純水で１：５に希釈したものを１ウェルあたり２００μＬ加えて２５℃で２時間インキュベートし、その後ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、ＢＳＡ－ＰＢＳで１：３に希釈した試料を１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で２時間でインキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。その後、二次抗体として前記した抗Ｎ末端側領域抗体をＢＳＡ－ＰＢＳで１：１０００に希釈したものを１ウェルあたり１００μＬ添加し、２５℃で１．５時間インキュベートした後、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎによる洗浄を３回実施した。前述のＮ末端側領域抗体を認識する西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識抗体（Peroxidase Affinity pure Donkey Anti-Rabbit IgG,Product No.711-035-152、Jacson IRL)をＢＳＡ－ＰＢＳで１：５０００に希釈したものを１ウェル当たり１００μＬ添加し、２５℃で１時間インキュベートし、ＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎにて洗浄を５回実施した。そして、基質としてTMB Substrate Ultra Solution（Product No.ES022-100ML、Merck）を１ウェルあたり１００μＬ添加した。２５℃で５～１０分酵素反応後に硫酸の添加によって反応をストップさせ、４５０ｎｍの吸光度をマイクロプレートリーダー（iMark マイクロプレートリーダー、BIO-RAD）を用いて測定した。測定した吸光度を、あらかじめ前記標準ペプチド３を用いて作成した検量線に当てはめ、総ＷＦＤＣ２蛋白質量を算出した。
（３－２）第一断片量の測定
　前記（２－２）の測定結果を流用した。
（３－３）第二断片量の測定
　前記（２－３）の測定結果を流用した。
（３－４）第一判定値、第二判定値及び修正判定値の算出
　各試料につき得られた第一断片量を総ＷＦＤＣ２蛋白質量で除して第一判定値を得た。同様に、各試料につき得られた第二断片量を総ＷＦＤＣ２蛋白質量で除して第二判定値を得た。さらに、各試料につき、第一判定値を１０倍した値に第二判定値を足し合わせて修正判定値を得た。
　上記で得られた第一判定値、第二判定値及び修正判定値は、いずれも患者群及び健常者群を合わせた群の平均値及び標準偏差で、前記（２－４）と同様にして正規化を行った。このように正規化した値を、第一判定値について図５（Ａ）に、第二判定値について図５（Ｂ）に、及び修正判定値について図５（Ｃ）にそれぞれ示すようにグラフにプロットした。
　正規化していない第一判定値については図６（Ａ）に、正規化していない第二判定値について図６（Ｂ）に、及び正規化していない修正判定値について図６（Ｃ）にそれぞれ示すようにグラフにプロットした。
（３－５）閾値の決定
　次に、正規化した第一判定値、第二判定値及び修正判定値のそれぞれについて、患者群と健常者群との重なりの程度を解析した。ここで、「重なりの程度」の意義については前記（２－５）と同じである。
　まず、正規化した場合の図５（Ａ）と図５（Ｂ）とについては一見しただけでは重なりの程度の差異は明らかではない。また、図５（Ｃ）の修正判定値における重なりの程度についても、図５（Ａ）の第一判定値及び図５（Ｂ）の第二判定値の重なりの程度との差異は明らかでない。
　また、正規化していない場合において、図６（Ａ）と図６（Ｂ）とについては一見しただけでは重なりの程度の差異は明らかではない。また、図６（Ｃ）の修正判定値における重なりの程度についても、図６（Ａ）の第一判定値及び図６（Ｂ）の第二判定値の重なりの程度との差異は明らかでない。
　次に、第一判定値、第二判定値及び修正判定値を検査指標とした場合のＲＯＣ－ＡＵＣを算出したところ、それぞれ０．７６、０．７２及び０．７６であった。このＲＯＣ－ＡＵＣの値から、Ｗ１０４０９断片量に基づく第一判定値は、Ｗ１４３０９断片量に基づく第二判定値よりも肺腺癌の検査指標として僅かに優れている、ということがいえる。さらに、第一判定値と第二判定値とを組み合わせて得られる修正判定値は、ＲＯＣ－ＡＵＣの値からは第一判定値と同等である、ということがいえる。正規化していない場合のＲＯＣ－ＡＵＣも上記と同じ値である。
　なお、各試料について、正規化していない第一判定値と第二判定値とを対にして二次元平面上にプロットしたグラフを図４に示す。グラフ中の円形のシンボルは健常者の試料を示し、正方形のシンボルは患者の試料を示す。このグラフから分かるように、健常者の試料では第一判定値及び第二判定値のいずれも突出した値を示すことはないが、患者の試料では、第一判定値又は第二判定値のいずれかについて突出した値を示す場合がある。すなわち、肺腺癌患者では、ＷＦＤＣ２蛋白質において変異が生ずる場合は、Ｗ１０４０９断片が生ずる変異が起こるか、又は、Ｗ１４３０９断片が生ずる変異が起こるかのいずれかであると推測される。そして、Ｗ１０４０９断片が生ずる変異の頻度の方がＷ１４３０９断片が生ずる変異の頻度よりも高いことで、第一判定値の方が第二判定値よりも幾分検査指標として優れていると推測される。
　次に、患者群と健常者群との重なりの程度について、図５（Ａ）～（Ｃ）に示す正規化したデータ及び図６（Ａ）～（Ｃ）に示す正規化していないデータをそれぞれ用いて、ＭＳＥを指標として、第一判定値、第二判定値及び修正判定値をそれぞれ検査指標とする場合の閾値の算出を前記（２－５）と同様にして試みた。そして、各判定値について、ＭＳＥが最小となるようなｔの値を閾値とした。
　その結果、正規化した第一判定値については、閾値を－０．３１としたときに、ＭＳＥが０．０７１３と最小となった。また、正規化した第二判定値については、閾値を－０．３１としたときに、ＭＳＥが０．０４７と最小となった。さらに、正規化した修正判定値については、閾値を－０．３４としたときに、ＭＳＥが０．０５８１と最小となった。
　正規化していない第一判定値については、閾値を０．０５１としたときに、ＭＳＥが０．０００４と最小となった。また、正規化していない第二判定値については、閾値を０．１５７としたときに、ＭＳＥが０．００４と最小となった。さらに、正規化していない修正判定値については、閾値を０．６８としたときに、ＭＳＥが０．０４５と最小となった。
　上記した正規化した各判定値についてのＲＯＣ－ＡＵＣ、閾値及びＭＳＥを下記表３に、上記した正規化していない各判定値についてのＲＯＣ－ＡＵＣ、閾値及びＭＳＥを下記表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　以上より、Ｗ１０４０９断片の検出に基づく第一判定値を用いる判定モデルと、Ｗ１４３０９断片の検出に基づく第二判定値を用いる判定モデルとでは、ＲＯＣ－ＡＵＣは前者の方が高く、肺腺癌の検出方法として優れていることが分かる。
　また、第一判定値により重きを置きつつ第二判定値をも加味した修正判定値を用いる判定モデルは、第一判定値単独の判定モデルに比べ、ＲＯＣ－ＡＵＣは同等であるものの、ＭＳＥを小さくすることができた。ＲＯＣ－ＡＵＣ自体はある程度の高さを有しているため、肺腺癌の判定モデルとして有用であることが分かる。
　また、各判定値は、正規化していても正規化していなくてもよいことが分かった。
（３－６）肺腺癌の検出
　Ｗ１０４０９断片の検出を単独の指標とする場合、肺腺癌の検出方法は以下の通りとなる。すなわち、肺腺癌患者かどうか未知の被験者から尿を採取し、この尿を試料として、前記（３－１）に従い尿中のクレアチニン濃度を測定し、また、前記（３－２）に従い第一断片量を測定する。そして、前記（３－４）に従い第一判定値を算出してこれを同様に正規化した値が、上記表３に示す－０．３１以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。正規化しない場合には上記４に示す０．０５１以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。
　また、Ｗ１０４０９断片の検出に加えＷ１４３０９断片の検出を加味する場合、肺腺癌の検出方法は以下の通りとなる。すなわち、肺腺癌患者かどうか未知の被験者から尿を採取し、この尿を試料として、前記（３－１）に従い尿中のクレアチニン濃度を測定し、また、前記（３－２）に従い第一断片量を測定し、さらに前記（３－３）に従い第二断片量を測定する。そして、前記（３－４）に従い第一判定値及び第二判定値を算出してさらにこれらから修正判定値を算出し、これを同様に正規化した値が、上記表３に示す－０．３４以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。正規化しない場合には上記表４に示す０．６８以上であれば、肺腺癌陽性と判定することができる。
（４）基準量の検討
　上記（２）及び（３）より、同じ第一断片量及び第二断片量に基づいていても、基準量としてクレアチニン濃度を使用するモデルの方が、総ＷＦＤＣ２蛋白質量を基準量とするモデルよりも肺腺癌の検出方法としては優れていることが示された。
（５）実施例３
　実施例３では、実施例１で求めた修正判定値（１０倍）の閾値２．１を用いて、肺腺癌の検出が可能であるか否かを検証した。
（５－１）試料の採取
　新たに、胸部画像検査にて原発性肺癌が疑われる肺内結節影又は腫瘤影が存在する患者のうち、手術、経気管支生検、リンパ節生検又は細胞診により、肺腺癌と診断された患者を２名選定した。選定した肺腺癌患者２名及び健常者１０名から試料として初尿を、滅菌コップを用いて採取し、測定まで－８０℃で保存した。測定に使用する際には凍結尿を室温で自然解凍したものをそれぞれ試料としてそのまま、クレアチニン濃度を解析に供した。
（５－２）第一断片量の測定
　上記（５－１）で新たに採取した試料を用いたこと以外は（２－２）と同様にして、各試料における第一断片量を求めた。
（５－３）第二断片量の測定
　上記（５－１）で新たに採取した試料を用いたこと以外は（２－３）と同様にして、各試料における第二断片量を求めた。
（５－４）修正判定値の算出
　上記（５－２）及び上記（５－３）にて得られた第一断片量及び第二断片量から、上記（２－４）と同様にして、正規化していない修正判定値（１０倍）を得た。
（５－５）判定
　正規化していない修正判定値（１０倍）のそれぞれについて、実施例１で求めた修正判定値（１０倍）の閾値２．１を超えるか否かにより、癌であるか否かを判定した。すなわち、閾値２．１を超える修正判定値が得られた場合には、その試料の提供者は肺腺癌であると判定し、閾値２．１を下回る修正判定値が得られた場合には、その試料の提供者は肺腺癌ではないと判定した。その結果、２名が肺腺癌であり、１０名が肺腺癌ではないと判定された。肺腺癌と判定された２名は、手術、経気管支生検、リンパ節生検又は細胞診により、肺腺癌と診断された患者であった。肺腺癌ではないと判定された１０名は健常者であった。この結果を図８に示す。
　この結果から、各判定値を用いることで、肺腺癌であるか否かを判定できることが分かった。

Claims (11)

  1. 　被験者に由来する試料中におけるＷＦＤＣ２蛋白質の蛋白質断片に基づく腺癌の検出方法であって、サンドイッチ法により求められる配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第一断片量を、サンドイッチ法により求められる前記試料中における総ＷＦＤＣ２蛋白質量又はクレアチニン濃度で定義される基準量で除して求められる値である第一判定値と、あらかじめ定めた閾値との比較によって腺癌の有無を判定する腺癌の検出方法。
  2. 　前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第一抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記試料中の前記第一断片量とする、請求項１に記載の腺癌の検出方法。
  3. 　前記第一判定値に換えて、サンドイッチ法により求められる配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記試料中における量である第二断片量を、前記基準量で除して求められる値である第二判定値と、前記第一判定値を５～１００倍した値との和である修正判定値を用いる、請求項１又は２に記載の腺癌の検出方法。
  4. 　前記配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第二抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記試料中の前記第二断片量とする、請求項２を引用した請求項３に記載の腺癌の検出方法。
  5. 　配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第三抗Ｃ末端抗体と、前記配列番号３のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体とを用いて測定した蛋白質断片の量を、前記総ＷＦＤＣ２蛋白質量とする、請求項２又は請求項２を引用した請求項３を引用した請求項４に記載の腺癌の検出方法。
  6. 　前記基準量は、前記総ＷＦＤＣ２蛋白質量である、請求項１から請求項５までのいずれか１項に記載の腺癌の検出方法。
  7. 　前記基準量は、前記クレアチニン濃度である、請求項１から請求項４までのいずれか１項に記載の腺癌の検出方法。
  8. 　前記試料が前記被験者の尿又は尿に由来する試料である、請求項１から請求項７までのいずれか１項に記載の腺癌の検出方法。
  9. 　サンドイッチ法により腺癌の有無を判定するための検査キットであって、
    　第一マイクロプレートと、
    　配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片と特異的に結合する２種の抗体と、を含み、
    　前記２種の抗体のうちの１つが第一マイクロプレートに固相化されている、検査キット。
  10. 　前記２種の抗体が、配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第一抗Ｃ末端抗体、及び前記配列番号１のアミノ酸配列を有する蛋白質断片の前記Ｃ末端領域よりＮ末端側を認識する抗Ｎ末端側領域抗体である、請求項９に記載の検査キット。
  11. 　第二マイクロプレートと、
    　配列番号２のアミノ酸配列を有する蛋白質断片のＣ末端領域と特異的に結合する第二抗Ｃ末端抗体と、をさらに含み、
    　前記第二抗Ｃ末端抗体及び前記抗Ｎ末端側領域抗体の一方が前記第二マイクロプレートに固相化されている、請求項１０に記載の検査キット。
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