CN111323588B - 食管癌相关抗原蛋白组合或其特异性抗体在食管癌检测试剂盒中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体公开了肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用，尤其是将其应用于制备早期筛查食管癌检测试剂盒中，极大地提高了临床食管癌的检测效率和诊断效率，有利于在普通实验室广泛推广使用。将这8种蛋白应用于ELISA试剂盒可同时检测血清样品中8种TAA抗体的表达水平，检出成功率高，技术重现性好。对应地，能够特异性检测RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合的表达水平的分子，也可以作为食管癌检测试试剂，应用于食管癌检测试剂盒中，同样具有较高特异性和敏感性。

Description

食管癌相关抗原蛋白组合或其特异性抗体在食管癌检测试剂 盒中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学和肿瘤学领域，具体涉及食管癌相关抗原蛋白组合或其特异性抗体在食管癌检测试剂盒中的应用。

背景技术

食管癌(esophageal cancer,EC)是起源于食管粘膜上皮的恶性肿瘤，病理类型包括鳞癌、腺癌等，是常见消化道恶性肿瘤之一。2018年全球食管癌发病率在恶性肿瘤中居第7位(6.3/100000)，死亡率居第6位(5.5/100000)。同年，我国食管癌发病率(13.9/100000)和死亡率(12.7/100000)在恶性肿瘤中分别居第5位和第4位，新发病例和死亡病例分别占全球总数的53.7％和55.7％。我国是食管癌发病率最高的国家，因此，快速攻克食管癌发病机制，实现早诊早治，降低食管癌死亡率和发病率是科研工作者的终极目标。

食管癌发病模式在中西方国家之间差异显著，食管鳞状细胞癌是中国和亚洲地区食管癌最常见的组织学类型，占95％以上；而西方国家以食管腺癌为主(80％以上)，因此，西方的食管癌防治模式并不完全适用于我国。食管癌确切的发病因素仍不清楚。营养元素缺乏(如核黄素等)，亚硝胺及霉菌毒素是中国人食管癌主要危险因素；而吸烟、饮酒、反流性食管炎、Barrett′s食管等被认为是西方国家的食管癌主要危险因素，吸烟、饮酒对中国人食管癌患病风险的影响不明显。且食管癌患者早期主要临床症状相对并不特异，发现困难，因此95％患者在就诊时，疾病已经进展到中晚期，尽管采用综合手术治疗，五年生存率仅15-20％。传统胃镜筛查是食管癌早期诊断的主要途径，但因其诊断的侵入性和价格昂贵仍然限制了其在无症状人群筛查中的应用。因此，发现新的早期食管癌的生物标志物作为非侵入性筛查实验以提高食管癌的早期发现，提高患者的生存率是有巨大应用意义。

人体免疫系统可对自身抗肿瘤相关抗原(Tumor-associated Antigens,TAAs)产生体液免疫应答，引发大量自身抗体释放至血清中，且在癌症患者临床症状出现前3-5年即可被检测到，作为早期肿瘤患者新的可识别的生物标记物。因此，针对TAA血清自身抗体的检测可为早期无症状肿瘤患者的检测提供更灵敏且可行的方法，使其有望成为ESCC早期诊断的理想血清学标志物。同时，肿瘤高度异质性的特点，因此，结合多个肿瘤相关抗原来联合检测患者体内某类肿瘤的自身抗体，有利于大大提高肿瘤的检出率。

RECK基因定位于第9p13-12区，长度约87kb，是新近发生的一种肿瘤抑制基因，在维持细胞增殖、分化和凋亡中起重要作用，并可能参与调节细胞生长、肿瘤浸润、转移和血管形成。RFT2基因定位于20p13，是调控核黄素转运及吸收的关键基因，编码产物为核黄素转运蛋白，主要功能是将核黄素由细胞外转入细胞内。核黄素即维生素B2，不仅是生命活动重要营养元素，缺乏时与食管癌的发生发展有极为密切的关系。PTCH1基因定位于9q22,是Hedgehog(HH)信号通路异常激活与多种肿瘤发生密切相关的关键分子，突变后可使肿瘤细胞生长受限乃至凋亡。NOTCH1蛋白是NOTCH信号通路中的膜结合蛋白受体，协调活化的NOTCH通路参与组织细胞的正常生长发育过程，也与乳腺癌、胃癌和食管癌等多种肿瘤的发生有关。本研究团队之前研究发现，NOTCH1活化成分在食管癌组织细胞表达中明显高于癌旁组织。FAT4基因位于染色体4q28.1，共17个外显子，编码含4981个氨基酸的蛋白质，具有肿瘤抑制作用。目前研究发现，FAT4基因突变后，细胞增殖、侵袭和迁移能力增强。AJUBA基因位于人类染色体14q11.2,蛋白结构与LIM家族的其它成员相似，作为支架蛋白参与多种生物学过程，包括细胞黏附、迁移、增殖和存活等。P53是位于17p13短臂上重要的抑癌基因，调节细胞生长，当细胞核受到算是、缺氧等外界刺激时将转录激活大量下游基因，从而阻滞细胞周期进展，是迄今为止发现的与人类恶性肿瘤关系最为密切基因之一。YAP1基因位于11q22染色体，是Hippo通路的核心因子，在胃癌、食管癌、肝癌和结直肠癌等多种肿瘤中表达上调，且YAP1高表达可促进肿瘤新生血管生成，促进肿瘤细胞的上皮-间质转化，从而在肿瘤细胞的侵袭转移中发挥重要作用。本课题组最新基因组学和蛋白组学分析数据，将8种TAA联合检测，作为食管癌早期筛查诊断，未见相关文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供食管癌相关血清标志物组RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用，相应的，还提供了能够特异性检测食管癌中RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合表达水平的分子在制备食管癌检测试剂盒中的应用。

基于上述目的，本发明采用的技术方案如下：

肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备食管癌检测试剂盒中的应用。

在上述应用中，所述检测是指通过酶联免疫吸附法进行的检测。

本发明请求保护的第二个主题为；肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备筛查早期食管癌检测试剂盒中的应用。

本发明请求保护的第三个主题为：一种用于食管癌检测的ELISA试剂盒，包括固相载体和被包被于固相载体上的RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白。

上述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。

进一步地，在上述试剂盒中，所述第二抗体带有可检测的标记物。

优选地，在上述试剂盒中，所述样品稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述第二抗体稀释液为含有1％(W/V)BSA的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液；所述显色液由显色液A和显色液B组成，所述显色液A为0.02％(W/V)TMB(3,3’,5,5’-四甲基联苯胺)，所述显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；所述终止液为2mol/L的浓硫酸；所述洗涤液为含0.05％吐温-20的0.01M的PBST(磷酸盐吐温)缓冲液(Ph7.4)。

优选地，在上述试剂盒中，所述标记物为辣根过氧化物酶。

优选地，在上述试剂盒中，所述第二抗体为RecA蛋白。

优选地，在上述试剂盒中，所述阳性对照血清为P53阳性对照血清，所述阴性对照血清为P53阴性对照血清。更加优选地，所述P53阳性对照血清是使用间接ELISA和Westernblot方法检测P53抗体均为阳性的食管癌患者血清，所述P53阴性对照血清是使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平均为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清。大量研究已表明P53基因在食管癌的发生发展过程中起十分重要的调节作用，并且P53抗体在食管癌患者血清中具有较高的表达。本发明选择P53抗体阳性血清作为阳性对照，P53抗体阴性血清作为阴性对照，同一ELISA试剂盒的其他抗原抗体反应的强弱可以据此作为参照，达到质控的目的。

优选地，在上述试剂盒中，所述固相载体为酶标板。更加优选地，所述酶标板为96孔酶标板(共8行12列)，所述96孔酶标板按照精心设计的布局图(参见图1)包被RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1这8种肿瘤相关抗原，其中每行包被有一种抗原，每种抗原包被于11个点样孔中。同一检测对象的血清样品经过稀释后加入该96孔酶标板同一列，该ELISA测试剂盒可同时用于检测8个待测血清样品中8种肿瘤相关抗原自身抗体的表达水平，有利于进行大规模的样品检测。所述96孔酶标板第12列中设有空白对照孔、阳性对照孔和阴性对照孔，所述空白对照孔中包被不含抗原的包被液，所述阳性对照孔和阴性对照孔中均包被P53抗原。

优选地，在上述试剂盒中，所述自身抗体联合检测ELISA试剂盒的检测对象为人类血清。

由于自身抗体是在患者血清中产生的，与对应的标志物的丰度成正比，因此，较高浓度的自身抗体指示抗原的较高表达。基于此，本发明将RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白作为抗原作为一个组合包被于ELISA检测试剂盒中，利用该ELISA试剂盒检测人体血清中的自身抗体含量来检测食管癌，创造性联合检测人血清中上述8种肿瘤相关抗原的抗体表达水平，可以有效检测食管癌，即使是早期食管癌，也具有较高的检测准确性。针对早期食管癌，其检测灵敏度高达94％(即早期食管癌患者中应用这8个肿瘤相关抗原进行诊断时被正确的诊断为早期食管癌的比率为94.0％)，特异性达到了70％(即非食管癌患者用8种肿瘤相关抗原联合检测时，被确定为未患食管癌者的比率为70％)，远高于现有临床内镜在普通人群中筛查早期食管癌的特异性(0.4％—4.7)。

基于本发明的ELISA试剂盒具有较高的灵敏度和特异度，可用于食管癌高发区无症状人群的大规模筛查，能够大大提高早期食管癌的检出率，有利于无症状高危人群筛查和早期发现，从而大大降低了食管癌患者的死亡率，为癌症患者和家庭带来极大的福祉。

最后，本发明人所在实验室在基因组学和蛋白质组学分析的基础上，应用自身抗体组织芯片技术在早期食管癌尤其是食管鳞癌患者中，RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1，均在食管癌组织中高表达，明显区别于正常对照组织，在具有较高特异性和敏感性，其中NOTCH1与P53-Rb通路间存在明显相关性，与环境因素诱导食管癌发生密切相关。

对应地，因此以基因蛋白组为检测目标，可以作为本申请第4个保护主题：能够特异性检测RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合的表达水平的分子在制备食管癌检测试剂盒中的应用。

在上述应用中，所述分子为核酸或蛋白质。

在上述应用中，所述蛋白质为抗体。

在上述应用中，所述检测是指利用组织芯片技术通过免疫组织化学法进行的检测。

综上，本发明制备的ELISA试剂盒可同时检测血清样品中8种TAA抗体的表达水平，与8种TAA抗体的单独检测相比，8种TAA抗体联合检测，检出成功率高，技术重现性好，耗材少，成本低，操作简单，使用方便、快捷，极大地提高了临床食管癌的检测效率和诊断效率，有利于在普通实验室广泛推广使用。对应地，利用免疫组织化学法检测能够特异性检测RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合的表达水平的分子，也可以作为食管癌检测试试剂，同样具有较高特异性和敏感性。

附图说明

图1为本发明ELISA试剂盒中96孔酶标板的抗原包被布局图(其中，抗原名称代表了该孔包被了此抗原，加入的是待测血清，用来检测待测血清中相应抗体的表达水平；“+”代表阳性对照孔，加入的是阳性对照血清；“-”代表阴性对照孔，加入的是阴性对照血清；“空白”代表空白对照孔，该孔加入不含血清的样本稀释液，其它操作均相同，该空白对照用于反应实验过程中的背景值)。

图2为间接酶联免疫吸附实验原理图。

图3为8种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌组血清中分布图。

图4为8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组血清中的分布图。

图5为8种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌组合对照组中阳性率。

图6为不同肿瘤相关抗原组合方法对早期食管癌中检出效率。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明作进一步阐释。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径买到。

实施例1 8种肿瘤相关抗原在制备早期筛查食管癌检测试剂盒中的应用

本申请根据间接酶联免疫法的原理制备了一种可用于早期食管癌筛查和诊断的自身抗体联合检测ELISA试剂盒。间接酶联免疫法的原理如图2所示，将抗原连接到固相载体上，样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物，再用酶标二抗与固相抗原-受检抗体复合物中的抗体结合，形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物，然后测定加底物后的显色程度，确定待测抗体含量。

本实施例用于早期食管癌检测的ELISA试剂盒，包括固相载体(96孔酶标板)和被包被于固相载体上的8种肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白，以及ELISA试剂盒辅助药剂。

实施例2 ELISA试剂盒的制备

1、实验材料及试剂：

(1)8种肿瘤相关抗原蛋白(RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1)；

(2)96孔酶标板：3590(costar.美国)；

(3)包被液：50mM碳酸盐缓冲液，pH＝9.6；

(4)封闭液：含2％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(5)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(6)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(7)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(8)洗涤液：pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐)缓冲液；

(9)阳性对照血清：P53阳性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体均为阳性的食管癌患者血清；

(10)阴性对照血清：P53阴性对照血清，即使用间接ELISA和Western blot方法检测P53抗体表达水平为正常人群血清抗体平均含量的正常人的血清；

(11)显色液A：0.02％(W/V)TMB，配制：取甲基联苯胺(TMB)0.005g，溶解于25ml去离子水中；

(12)显色液B：0.006％(W/V)过氧化脲，配制：取柠檬酸4.665g、Na₂HPO₄ 18.40g，充分溶解于400ml去离子水中，加0.75％过氧化氢脲素3.2ml，调整pH值至5.0-5.5，加去离子水定容至终体积500ml，混匀4℃保存；

(13)终止液：10％的硫酸；

(14)酶标仪：Star Fax 2100(Awareness.美国)。

2.制备抗原包被的酶标板：

(1)制备8种肿瘤相关抗原溶液：将8种肿瘤相关抗原蛋白分别溶解于包被液中，充分混匀，配制成浓度均为0.5μg/μL的8种抗原溶液。

(2)包被酶标板：将制备好的8种肿瘤相关抗原溶液按照图1所示的布局分别加入到96孔酶标板的点样孔中，加样量为100μl/孔；阳性对照孔和阴性对照孔中加入P53抗原溶液，空白对照孔加入包被液，37℃恒温培养箱孵育1h，4℃过夜后去除包被液，然后用洗涤液洗涤3次，每次洗涤3min。

(3)封闭：向包被后的96孔酶标板的点样孔中加入封闭液(加样量为300μl/孔)，室温孵育2小时，然后除去封闭液。

(4)干燥，包装：将封闭处理后的96孔酶标板放置37℃烘干箱烘干后，包装，得到抗原包被的96孔酶标板，4℃保存备用。

3.本发明试剂盒的组成如下：

(1)抗原包被的96孔酶标板；

(2)样品稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(3)第二抗体稀释液：含有1％(W/V)BSA的PBST缓冲液；

(4)酶标第二抗体：辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白(Invitrogen公司)；

(5)显色液：显色液由显色液A和显色液B组成，其中，显色液A为0.02％(W/V)TMB，显色液B为0.006％(W/V)过氧化脲素；使用时将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀；

(6)终止液：10％的硫酸；

(7)洗涤液：pH7.4的0.01M的PBST(磷酸盐)缓冲液；

(8)阳性对照血清：P53阳性对照血清；

(9)阴性对照血清：P53阴性对照血清。

试剂(2)-(9)分别包装后与抗原包被的96孔酶标板构成试剂盒。

实施例3 ELISA试剂盒的应用过程

1.样本来源

收集来自省部共建食管癌防治国家重点实验室400份血清样本，其中正常人血清200份(对照组)，早期食管癌患者血清200份(早期食管癌组)。200例正常人血清来自该实验室合作医院体检中心的健康体检人群，无任何肿瘤相关的证据。200例正常人中，男性100例，女性100例，年龄范围40-70岁，平均年龄58.9±5.3岁。200份早期食管癌患者血清来源于经组织病理学证实的早期(0期+I期)食管癌患者，均未接受放疗或化疗治疗。200例食管癌患者中，男性100例，女性100例，年龄范围45-75岁，平均年龄60.5±4.3岁。

2.血清样本孵育

(1)抽取空腹静脉血5ml至离心管中，室温中静置30分钟，离心(2000转/min)，吸取上层血清分装，每管100μl，-80℃冰箱储存。

将待检测的血清样本用样品稀释液按1：500的比例进行稀释，然后将稀释后的血清样本加入已包被抗原的96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育1h，然后弃去反应孔中液体，用洗涤液洗涤5次，每次洗涤3min。

3.酶标二抗孵育

将辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白用第二抗体稀释液按1：40000的比例进行稀释，然后将稀释后的辣根过氧化物酶标记的RecA蛋白加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃恒温培养箱孵育50min，然后弃去点样孔中液体，用洗涤液洗涤3次，每次3min。

4.显色及终止反应

将显色液A和显色液B按照1:1等体积混合均匀，然后将混合后的显色液迅速加入96孔酶标板的反应孔中，加样量为100μl/孔，置于37℃避光反应15min，然后向每个反应孔中再加入50μl终止液，终止反应，于20分钟内用酶标仪器在450nm(检测波长)和595nm(参比波长)读取OD值，并用空白对照孔调零。

5.判定条件

以阴性对照孔所测OD值得平均数加两个标准差(Mean+2SD)为截断值(cut-off值)，反应孔中OD值读数大于等于截断值的判断为阳性，反应孔中OD值读数小于截断值的判断为阴性。

6.结果分析

8种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌患者血清含量如图3所示，8种肿瘤相关抗原自身抗体在对照组血清中含量如图4所示。

分别计算食管癌组和对照组中8种肿瘤相关抗原自身抗体的阳性率(每组中检测出的阳性对象例数除以该组被检测对象总例数即为阳性率)，并绘制8种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌组和对照组中阳性率的柱形图，如图5所示；应用SPSS22.0软件进行统计学检验，采用两独立样本卡方检验方法比较食管癌组和对照组抗体阳性率，检验水准α＝0.05，当P＜0.05时，结果具有统计学意义，然后采用筛检试验的评价方法评价自身抗体检测食管癌的诊断价值，结果参见表1和图6。

表1不同肿瘤相关抗原自身抗体组合联合检测结果

注：P<0.05；n代表样本总数

由表1可知，随着抗原组合数目的增加，对早期食管癌诊断的灵敏度也随之增加。当8种抗原组合时，灵敏度高达94.0％，也就是说早期食管癌患者中应用该方法能够正确诊断为食管癌的百分比为94.0％。另一方面，随着抗原数目的增加，检测特异度逐渐降低，当8种肿瘤相关抗原组合时，其特异度仍然能够达到70.0％，该结果表明非食管癌患者采用8种肿瘤相关抗原联合检测时，被正确诊断为未患食管癌的百分比为70％；因此，使用RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1这8种肿瘤相关抗原组合进行早期食管癌诊断，可以在保证诊断特异度的前提下大幅度提高诊断的灵敏度。此外，约登指数在统计学中是指敏感度和特异度之和减去1，其数值范围是0-1，约登指数越接近1，指标对肿瘤的诊断价值越大，表明该方法的应用价值越高。由表1可知，随着抗原数目的增加，约登指数在不断增大且逐渐趋向于1，表明8种肿瘤相关抗原的组合用于诊断和筛查早期食管癌的方法具有较好的诊断价值。因此，采用RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1这8种肿瘤相关抗原联合检测待测血清中相应自身抗体表达水平的方法，既能保持较高的特异度又能提高诊断的敏感度，对评估待测对象患食管癌的风险具有较好诊断和应用价值。

比较8种肿瘤相关抗原自身抗体在早期食管癌患者血清和对照组血清中含量(图3、图4)可知，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组中平均表达量与对照组中表达量均具有明显差异，P<0.0001，具有明确统计学意义，表明该8种肿瘤相关抗原可以用作早期食管癌筛查。

比较8种肿瘤相关抗原在食管癌组和对照组中的阳性率结果(图5)可知，本组设计中8种肿瘤相关抗原的自身抗体在食管癌组中阳性率在37.5％-47.3％,而在对照组中阳性率在4％-9％之间。经统计学检验，这8种肿瘤相关抗原自身抗体在食管癌组中阳性率明显高于对照组。进一步证明这8种肿瘤相关抗原自身抗体可以作为早期食管癌诊断检测指标。

联合检测RECK、RFT2、PTCH1和NOTCH1蛋白表达水平(图6)，早期食管癌组和对照组，曲线下面积为0.7542(95％CL 0.6870-0.8214，P<0.0001)；联合检测FAT4、AJUBA、P53和YAP1蛋白表达水平，早期食管癌组和对照组，曲线下面积为0.6875(95％CL 0.6127-0.7623，P<0.0001)；联合8种肿瘤相关抗原RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1，在早期食管癌组和对照组中，曲线下面积为0.9445(95％CL 0.9199-0.9623，P<0.0001)。在不同抗原组合方式中，随着抗原组合数目的增加，ROC曲线下面积由0.68升至0.94，说明使用者8种肿瘤相关抗原联合检测ELISA试剂盒对于早期食管癌具有较高的诊断价值，进一步证实了该试剂盒可以作为较理想的早期食管癌的筛查方法和手段。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，但不仅限于上述实例，凡在本发明精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.肿瘤相关抗原RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白在制备早期食管癌检测试剂盒中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测是指通过酶联免疫吸附法进行的检测。

3.一种用于早期食管癌检测的ELISA试剂盒，其特征在于，包括固相载体和被包被于固相载体上的RECK蛋白、RFT2蛋白、PTCH1蛋白、NOTCH1蛋白、FAT4蛋白、AJUBA蛋白、P53蛋白和YAP1蛋白。

4.根据权利要求3所述的用于早期食管癌检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、第二抗体、第二抗体稀释液、阴性对照血清、阳性对照血清、洗涤液、显色液和终止液。

5.根据权利要求4所述的用于早期食管癌检测的ELISA试剂盒，其特征在于，所述第二抗体带有可检测的标记物。

6.能够特异性检测RECK、RFT2、PTCH1、NOTCH1、FAT4、AJUBA、P53和YAP1组合的表达水平的分子在制备早期食管癌检测试剂盒中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述分子为核酸或蛋白质。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述蛋白质为抗体。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述检测是指通过免疫组织化学法进行的检测。

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