KR100873629B1

KR100873629B1 - 신규한 폐암 진단용 마커

Info

Publication number: KR100873629B1
Application number: KR1020070001416A
Authority: KR
Inventors: 조제열; 박혜정; 이응배
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-01-05
Filing date: 2007-01-05
Publication date: 2008-12-12
Also published as: KR20080064462A

Abstract

본 발명은 신규한 폐암 진단용 마커에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 폐암 조직 유래 내피세포에서 과량 발현되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물 및 상기 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 폐암 진단용 마커는 폐암 조직 유래 내피세포에서도 특이적으로 과량 발현되므로 폐암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하는데 매우 유용하다.

폐암, 진단, 마커

Description

신규한 폐암 진단용 마커{Novel biomaker for the diagnosis of lung cancer}

도 1은 폐암 환자로부터 면역마그네틱 분리 방법을 사용하여 분리한 인간 미세혈관 내피세포를 나타낸 것이다.

A: (a) 폐암 조직, (b) 인접한 정상 조직

B: 폐 조직으로부터 분리된 단일 세포

C: 내피 세포가 결합된 CD31-면역마그네틱 비드

도 2는 본 발명에서 분리한 내피세포를 혈관내피세포 특이적인 내피세포 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase; eNOS) 항체를 이용한 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다.

TCL: 총 폐 조직 용해물

HLVEC: 본 발명에서 분리한 인간 폐 모세혈관 내피세포

HUVEC: 인간 제대혈관 내피세포

A549: 인간 폐암 세포주

도 3은 5개의 인간 폐암 조직 및 인접한 정상 조직 유래의 내피세포로부터 추출한 단백질의 1차원 겔 전기영동 결과를 나타낸 것이다.

SM: 사이즈 마커

N: 정상 조직 유래 내피세포 단백질

C: 폐암 조직 유래 내피세포 단백질

도 4는 인간 폐암 조직 및 정상 조직 유래 내피세포의 프로테옴(proteome)을 분석한 결과이다.

도 5는 인간 폐암 조직 유래 내피세포의 프로테옴을 정상 조직 유래 내피세포의 프로테옴과 비교한 결과이다.

N: 정상 조직 유래 내피세포

C: 폐암 조직 유래 내피세포

N1-N5: 정상 조직 유래 내피세포 1 내지 5

C1-C5: 폐암 조직 유래 내피세포 1 내지 5

도 6은 본 발명에 따라 정상 조직 유래 내피세포(A 및 C) 및 폐암 조직 유래 내피세포(B 및 D)로부터 동정한 단백질을 세포내 위치(A 및 B) 및 생물학적 과정(C 및 D)에 따라 분리하여 나타낸 것이다.

도 7은 본 발명의 방법에 따라 각각 5개의 폐암 조직 유래 내피세포 및 정상 조직 유래 내피세포로부터 동정된 단백질을 개별적으로 비교한 결과이다.

도 8은 폐암 조직 유래 내피세포 및 정상 조직 유래 내피세포에서 COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)의 발현을 웨스턴 블롯 분석법으로 확인한 결과이다.

도 9는 폐암 조직 유래 내피세포 및 정상 조직 유래 내피세포에서 Prdx Ⅳ(peroxiredoxin Ⅳ)의 발현을 웨스턴 블롯 분석법으로 확인한 결과이다.

폐암은 전 세계적으로 암으로 인한 사망 중 가장 큰 부분을 차지하는 질병이다. 전체 암사망자의 1/6 정도는 폐암으로 사망하며 다른 종류의 암에 비해 생존율이 약 10-15% 정도 낮은 것으로 알려져 있다. 폐암은 소세포폐암(small cell lung cancer)과 비소세포폐암(Non-small cell lung cancer)으로 나누어진다. 그 중에서 비소세포페암은 폐암의 약 80%에 해당하는 가장 대표적인 암으로, 선암(adenocarcinoma), 편평상피세포암(squamous cell carcinoma) 및 대세포 폐암(large cell carcinoma)으로 구분된다. 상기 비소세포암의 경우, 최근의 암 치료법의 발달에도 불구하고 10년 생존률이 10% 이하로 매우 낮다. 이는 암의 진단이 대부분 늦게 이루어지는데 원인이 있다. 따라서 폐암을 조기 진단하여 환자의 생존율을 증가시킬 수 있는 마커의 개발이 절실히 필요하다.

최근, 보다 향상된 진단 및 치료를 위한 바이오마커로서 사용할 수 있는 특이적인 유전자 또는 단백질을 동정하기 위해서, 정상조직과 질병조직 자체를 비교 분석하는 지노믹스 및 프로테오믹스 분석을 이용한 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 이러한 접근법은 진단 및 가능한 치료 타겟을 위한 분자 정보의 과잉을 생성하여, 대량 정보로부터 유용한 후보들을 정리하는데 있어서 어려움을 주고 있다. 또한, 대부분의 바이오마커들은 조직내부와 같이 복잡하고 접근하기 힘든 부분을 타겟으로 하고 있다. 따라서 조직 데이터 복잡성을 감소시키고 병든 조직에 접근하기 어려운 점을 극복하기 위하여 접근가능한 조직 특이적 타겟의 발견 및 확인에 대한 새로운 연구가 필요하다. 이에 따라 조직 내에 위치하기 때문에 접근이 어렵고 복잡한 세포보다는 조직 내 혈액과 내부세포 사이의 경계면인 내피세포를 타겟으로 하는 연구가 이루어지고 있다.

문헌에는 암-특이적인 내피세포 마커로서 아미노펩티다아제-P(aminopepti dase-P) 및 아넥신 A1(annexin A1)이 개시된 바 있으며(Oh, P. et al., Nature, 429, 2004), 암의 병기(stage)나 타입에 특이적인 내피세포 분자들이 규명된 바 있다(Joyce, J. A., et al., Cancer Cell, 4, 2003)

그러나 현재까지 폐암의 내피세포 특이적인 분자들의 연구에 대해서는 미비한 실정이다. 이는 폐암 조직의 경우 세포가 낮은 퍼센트로 이루어져 있어 내피세포의 분자적 프로파일링에 기술적 한계를 가지고 있기 때문이다.

이에 본 발명자들은 폐암을 진단할 수 있는 새로운 진단마커를 개발하고자 연구한 결과, 인간 폐암 조직에서 유래된 내피세포와 정상 폐 조직에서 유래된 내피세포의 프로테옴(Proteome)을 프로테오믹스 분석법을 이용하여 비교분석함으로써 폐암 조직유래 내피세포에서만 특이적으로 검출되는 새로운 바이오마커를 규명함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 신규한 폐암 진단용 마커를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 폐암 조직 유래 내피세포에서 과량 발현되는 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 폐암 조직 유래 내피세포에서 과량 발현되는 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명에서 사용된 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "폐암 (lung cancer)"은 폐에 발생하는 악성종양을 의미하며 바람직하게는, 비소세포폐암, 더욱 바람직하게는 비소세포폐암 중 선암(adenocarcinoma)을 의미한다.

본 발명에서 사용된 용어, "암 진단용 마커"란 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로 정상 세포에 비하여 암이 발병된 세포에서 증가를 보이는 유기 생체 분자를 말한다. 상기 유기 생체 분자로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나, 폴리펩타이드, 단백질, 핵산, 지질 , 당지질, 당단백질, 당 등이 포함된다. 본 발명에서 암 진단용 마커는 폐암 조직 유래 내피세포에서 특이적으로 과량 발현하는 단백질 또는 이를 암호화하는 핵산일 수 있다.

본 발명자들은 새로운 폐암 진단용 마커를 규명하고자, 인간의 폐암 조직으로부터 유래된 내피세포의 프로테옴을 프로테오믹스 기술을 이용하여 분석하고, 이를 정상 조직으로부터 유래된 내피세포의 프로테옴과 비교하여 20개의 폐암 내피세포-특이적인 단백질들을 동정하였다. 한편, 내피세포는 소조직이기 때문에 이를 하나의 기관으로부터 분리하는 것이 어렵다(Garlanda C. and Dejana E, Arteroscler Thromb Vasc Biol, 17, 1997). 본 발명의 일 실시예에서는 내피세포 특이적 마커인 CD31 항체 마그네틱 비드를 이용한 면역마그네틱 분리법에 의해 각각 5명의 환자로부터 인간 폐 선암 조직과 인접한 정상 조직의 내피세포를 분리하였다(실시예 1 참조).

상기에서 분리한 내피세포 단백질 복합체를 1차 SDS-PAGE로 분리한 후(실시예 <2-1> 참조) 각 레인의 겔 밴드를 인-겔 트립신 소화하여(실시예 <2-2> 참조) 수득된 펩타이드를 1차 역상 크로마토그래피로 분획하고 전자분사형 이온화와 이온 트랩형 질량 분석기를 이용하여 분석하였다(실시예 <2-3> 참조). 상기에서 수득한 분석 데이터를 대상으로 IPI 인간 단백질 데이터베이스를 이용하여 검색하여 폐암 조직 유래 내피세포 및 정상 조직 유래 내피세포에 존재하는 단백질을 동정하고 폐암 조직 유래 내피세포의 데이터세트를 정상 조직 유래 내피세포의 데이터세트와 비교분석함으로써 폐암 조직에서 유래된 내피세포에만 존재하는 130개의 단백질을 동정하였다(실시예 <2-4> 참조). 상기에서 동정된 130개의 단백질은 표 1에 나타낸 바와 같다.

나아가, 본 발명자들은 폐암 조직 및 인접한 정상 조직의 내피세포로부터 추출된 데이터를 대상으로 ProtAn을 이용하여 감산 프로테오믹스를 수행하였다(실시예 <2-5> 참조). 그 결과, 폐암 조직 유래 내피세포 특이적인 단백질 44개를 동정하고 이 들 중에서 단일-히트(single-hit) 펩타이드에 의해 동정된 단백질을 제외한 후 겔의 정확한 분자 질량 영역에 위치하는지 여부와 단백질 당 동정된 펩타이드 수를 고려하여, 폐암 조직 유래 내피세포에서만 확실하게 동정될 수 있는 20개의 가능한 후보 단백질을 수득하였다(표 2). 따라서 상기 표 2에 나타낸 20개의 후보 단백질들은 모두 폐암 조직 유래 내피세포에서만 검출될 수 있는 것이므로 폐암 진단용 마커로서 사용될 수 있다.

본 발명자들은 상기 표 2에 나타낸 20개의 후보 단백질 중에서 특히, COPG 가 실제적으로 폐암 조직으로부터 유래된 내피세포에서 검출되는지 여부를 확인하고자 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(실시예 3 참조). 그 결과, COPG는 정상조직에 비해 폐암 조직의 내피세포에서 현저히 높게 검출됨을 확인할 수 있었다(도 8).

따라서 본 발명의 COPG는 정상 조직 유래 내피세포에 비하여 폐암 조직 유래 내피세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이므로, 폐암 진단 마커로 사용될 수 있다. 한편, 본 발명에서는 상기 COPG 이외에도 표 2에 나타낸 단백질을 모두 폐암 진단용 마커로서 사용할 수 있다. 그러나 의학적 판단을 내리기에 충분한 정도의 과다하지 않는 수의 마커를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 폐암 진단용 마커를 이용한 폐암의 진단은 생물학적 샘플 중 본 발명의 마커 단백질 또는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인하는 방법으로는 당 업계에 공지된 다양한 분석방법을 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 복합체의 형성여부를 측정함으로써 생물학적 샘플 중에서 본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인할 수 있다. 본 발명에서 사용된 용어 "항원-항체 복합체"란 생물학적 샘플 중의 특정 단백질과 이를 특이적으로 인지하는 항체의 결합물을 의미한다.

따라서 본 발명은 COPG(Coatomer protein complex subunit gamma, IPI accession number: IPI00001890.6), IGHA-1(Immunoglobulin Heavy Constant Alpha-1, IPI accession number: IPI00061977.1), IVD(Isovaleryl Coenzyme A Dehydrogenase, IPI accession number: IPI00032297.2), TIβ/γ(Thymopoietin isoforms beta/gamma,IPI accession number: IPI00030131.2), MAPRC-2(Membrane Associated Progesterone Receptor Component 2,IPI accession number: IPI00005202.1), RPS4X(40S Ribosomal Protein S4, X isoform, IPI accession number: IPI00217030.7), NDUFA5(NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex 5, IPI accession number: IPI00412545.4), RPS8(Ribosomal protein S8, IPI accession number: IPI00216587.6), 7kDa 단백질(IPI accession number: IPI00333233.1), CSA(Coatomer subunit alpha, IPI accession number: IPI00295857.6), CYFIP-1(Cytoplasmic FMR1 Interacting protein 1, IPI accession number: IPI00030960.2), SERPINH1(47kDa heat shock protein precursor, IPI accession number: IPI00019880.1), SF3-S1(Splicing factor 3 subunit 1, IPI accession number: IPI00017451.1), SILUCTH-5(Splicing isoform long of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5, IPI accession number: IPI00024664.1), EF1-β(Elongation factor 1-beta, IPI accession number: IPI00178440.2), IGKC(Ig Kappa Chain C Region, IPI accession number: IPI00550315.1), HCV1R HG3 전구체(Similar to Ig heavy chain V-I region HG3 precursor, IPI accession number: IPI00382937.7) 및 OCIAP(Ovarian carcinoma immunoreactive antigen-like protein, IPI accession number: IPI00555902.1)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명은 COPG에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

상기 COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)는 헵토머 단백질 복합체(heptomeric protein complex)로서 COPI(Coatomer protein complex-I)의 일원이다. 상기 COPI는 진핵세포의 세포질 그물(endoplasmic reticulum) 및 골지체(Golgi appratatus) 사이의 트래픽킹 경로(trafficking pathway)와 관련된 단백질 코팅 운반체로서, COPI 코팅 운반체가 형성되는 동안 골지 멤브레인에 공급되는 수용성 사이토졸 복합체의 형태로 존재하는 것으로 알려져 있다(Wu, W. J. et al., Nature 405, 2000).

본 발명에서 "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명에 사용되는 항체는 단클론 또는 다클론 항체, 면역학적으로 활성인 단편(예를 들어, Fab 또는 (Fab)₂ 단편), 항체 중쇄, 인간화 항체, 항체 경쇄, 유전자 조작된 단일쇄 Fν 분자, 키메릭 항체 등일 수 있다.

본 발명의 폐암 진단용 마커 단백질들은 공지된 단백질이므로 본 발명에 사용되는 항체는 상기 공지된 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 항체의 항원으로서 사용되는 단백질은 천연에서 추출하거나 합성될 수 있으며 DNA 서열을 기초로 하여 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다. 유전자 재조합 기술을 이용할 경우 단백질을 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체에서 목적으로 하는 단백질이 발현되도록 숙주 세포를 배양한 후 형질전환체로부터 목적으로 하는 단백질을 회수함으로써 수득될 수 있다.

예를 들어, 다클론 항체는 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 래트와 같은 여러 온혈 동물을 이용하여 제조할 수 있다.

단클론 항체도 공지된 융합방법(fusion method)(Kohler and Milstein, European J. Immnunol. 6:511-519 1976), 재조합 DNA 방법(미국특허 제4816567호) 및 파지 항체 라이브러리(Clackson et al., Nature, 352, 624-628, 1991; Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 58:1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물은 단백질에 특이적인 항체이외에 면역학적 분석에 사용되는 당 업계에 공지된 시약을 추가로 포함할 수 있다.

상기에서 면역학적 분석은 항원과 항체의 결합을 측정할 수 있는 있는 방법이라면 모두 포함될 수 있다. 이러한 방법들은 당 분야에 공지되어 있으며 예를 들어, 면역세포화학 및 면역조직화학, 방사선 면역 분석법(radioimmunoassays), 효소결합면역법(ELISA: Enzyme Linked Immunoabsorbent assay), 면역 블롯(immunoblotting), 파아르 분석법(Farr assay), 면역침강, 라텍스 응집, 적혈구 응집, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법, 면역크로마토그래피법, 단백질 칩 및 면역형광법이 있다.

면역학적 분석에 사용되는 시약으로는 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지, 용해제, 세정제가 포함된다. 또한, 표지물질이 효소인 경우에는 효소활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

상기에서 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지는 항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하며, 이의 예로는 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사성 동위원소 등을 사용할 수 있다. 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라아제, 글리코즈 옥시다아제, 헥소키나제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있다. 형광물로는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, 플루오르신이소티옥시아네이트 등을 사용할 수 있다. 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 발광물로는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있다. 미소입자로는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있고 레독스 분자로는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있다. 방사성 동위원소로는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있다. 그러나 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 마커 단백질의 존재여부를 확인할 수 있는 방법으로는 본 발명의 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 이용할 수 있다.

따라서 본 발명은 표 2에 나타낸 단백질에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 COPG에 특이적으로 결합하는 펩타이드를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 펩타이드는 본 발명의 마커 단백질로부터 유래된 7-35개의 아미노산으로 이루어진 것일 수 있다.

한편, 본 발명의 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Labotory Manual, Harlow ＆ Lane; Cold SpringHarbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등 이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트, 마이크로어레이, 단백질 칩의 형태로 제공될 수 있다.

상기 진단용 키트로는 예를 들면, 샘플 중의 특정 단백질을 검출하기 위해 면역크로마토그래피법을 기초로 하는 측방 유동 검정 키트(lateral flow assay kit)의 형태로 제공될 수 있다. 측방 유동 검정 키트는 샘플에 적용되는 샘플패드(sample pad), 탐지용 항체가 코팅되어 있는 방출패드(releasing pad), 샘플이 이동하여 분리되고 항원-항체 반응이 일어나는 전개용 막(예를 들어 니트로셀룰로스) 또는 스트립, 그리고 흡수패드(absorption pad)로 이루어져 있다.

상기 마이크로어레이는 일반적으로 특정 시약으로 처리된 슬라이드 글라스 표면 위에 항체를 부착하여 항원-항체 반응에 의해 상기 항체에 특이적으로 부착하 는 단백질을 검출할 수 있도록 하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에서는 폐암 조직 유래 내피세포를 대상으로 COPG 단백질에 특이적인 항체(Santa Cruz회사)를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다(실시예 3 참조). 그 결과, 폐암 조직 유래 내피세포에서 COPG 단백질이 정상 조직 유래 내피세포에 비해 현저하게 높게 발현됨을 확인할 수 있었다(도 8 참조).

또한, 본 발명은 COPG(Coatomer protein complex subunit gamma), IGHA-1(Immunoglobulin Heavy Constant Alpha-1), IVD(Isovaleryl Coenzyme A Dehydrogenase), TIβ/γ(Thymopoietin isoforms beta/gamma), MAPRC-2(Membrane Associated Progesterone Receptor Component 2), RPS4X(Ribosomal Protein S4, X isoform), NDUFA5(NADH dehydrogenase (ubiquinone) 1 alpha subcomplex 5), RPS8(Ribosomal protein S8), 7kDa 단백질, CSA(Coatomer subunit alpha), CYFIP-1(Cytoplasmic FMR1 Interacting protein 1), SERPINH1(47kDa heat shock protein precursor), TABCSFBI-2(Transporter 2, ATP-binding cassette, subfamily B isoform 2), SF3-S1(Splicing factor 3 subunit 1), SILUCTH-5(Splicing isoform long of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase 5), EF1-β(Elongation factor 1-beta), IGKC(Ig Kappa Chain C Region), HCV1R HG3 전구체(Similar to Ig heavy chain V-I region HG3 precursor) 및 OCIAP(Ovarian carcinoma immunoreactive antigen-like protein)로 이루어진 그룹 중에서 선택된 어느 하나의 단백질을 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명은 COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)를 암호화하는 핵산에 특이적인 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물을 제공한다.

프라이머를 이용한 특정 핵산의 검출은 PCR과 같은 증폭 방법을 사용하여 목적 유전자의 서열을 증폭한 다음 당 분야에 공지된 방법으로 유전자의 증폭여부를 확인함으로써 수행될 수 있다. 또한, 프로브를 이용한 특정 핵산의 검출은 적합한 조건하에서 시료 핵산을 프로브와 접촉시킨 후 하이브리드화되는 핵산의 존재여부를 확인함으로써 수행될 수 있다.

상기 "프라이머"란 짧은 자유 수산화기를 가지는 핵산서열로서 상보적인 템플레이트와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산서열을 말한다. 본 발명의 프라이머는 예를 들면, 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법과 같은 당 분야에 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

상기 "프로브"는 mRNA와 특이적으로 결합할 수 있는 수개 내지 수백 개의 염기로 이루어진 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있어 특정 mRNA의 존재유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드 프로브, 단쇄 DNA 프로브, 이중쇄 DNA 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있고 비오틴, FITC, 로다민, DIG 등으로 표지되거나 방사선 동위 원소 등으로 표지될 수 있다.

또한, 상기 프로브는 검출 가능한 물질 예를 들면, 적합한 신호를 제공하고 충분한 반감기를 갖는 방사성 표지로 표지할 수 있다. 표지된 프로브는 문헌(Sambook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Mannual, 1989)에 공지된 바 와 같은 고체 지지체 상의 핵산에 하이브리드화시킬 수 있다.

상기 프로브나 프라이머를 이용하여 특정 핵산을 검출할 수 있는 방법으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 중합효소 연쇄반응(PCR), DNA 시퀀싱, RT-PCR, 프라이머 연장법(Nikiforeov et al., Nucl Acids Res 22, 4167-4175, 1994), 올리고뉴클레오타이드 연장 분석(Nickerson et al., Pro Nat Acad Sci USA, 87, 8923-8927, 1990), 대립형질 특이적 PCR법(Rust et al., Nucl Acids Res, 6, 3623-3629, 1993), RNase 불일치 절단(RNase mismatch cleavage, Myers et al., Science, 230, 1242-1246, 1985), 단일가닥 입체 다형화(single strand conformation lymorphism, Orita et al., Pro Nat Acad Sci USA, 86, 2766-2770, 1989), SSCP 및 헤테로두플렉스 동시 분석법(Lee et al., Mol Cells, 5:668-672, 1995), 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Cariello et al., Am J Hum Genet, 42, 726-734, 1988), 변성 고압 액체 크로마토그래피(denaturing high performance liquid chromatography, Underhill et al., Genome Res, 7, 996-1005, 1997), 혼성화 반응, DNA 칩 등이 있다. 상기 혼성화 반응의 예로는 노던 하이브리다이제이션(Maniatis T. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory, NY, 1982), 인시츄 하이브리다이제이션(Jacquemier et al., Bull Cancer, 90:31-8, 2003) 및 마이크로어레이(Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3:185-200, 2003) 방법 등이 있다.

상기 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 상술한 핵산을 검출하는 방법에 일반적으로 사용되는 시약을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들면, PCR 반응에 요구되는 dNTP(deoxynulceotide triphosphate), 내열성 중합효소(polymerase), 염화마그네슘 등의 금속이온염이 포함할 수 있으며, 시퀀싱에 요구되는 dNTP, 시쿼나제(sequenase) 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 폐암 진단용 조성물은 진단용 키트, 마이크로어레이 및 DNA 칩의 형태로 제공될 수 있다.

예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 본 발명의 마커 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함하는 RT-PCR 키트, 본 발명의 마커 유전자의 cDNA 또는 올리고뉴클레오타이드가 부착된 기판을 포함하는 DNA 칩 등이 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

인간 폐 조직으로부터 내피세포의 분리

<1-1> 폐 선암 조직 및 인접한 정상 폐 조직으로부터 내피세포의 분리

폐 선암 조직 및 인접한 정상 폐 조직을 경북대학교 병원에서 암 수술을 받은 5명의 환자로부터 수득하였다. 상기 조직을 외과 수술용 칼을 이용하여 미세한 조각으로 자르고 혈액과 필요 없는 조직을 제거하기 위하여 0.1% BSA/PBS로 세척하였다. 그 다음 상기 조직을 글라스 그라인더(glass grinder, Kontes, USA)를 이용 하여 분쇄하여 단일 세포로 제조한 후 분쇄된 조직을 세포 여과기(BD Falcon, USA)로 여과함으로써 조직 잔여물을 여과하였다. 여과된 분쇄 조직을 700rpm, 4℃로 5분간 원심분리하여 반복적으로 세척하고 세포 펠렛을 0.1% BSA/PBS에 현탁하였다.

CD31 항체로 코팅된 마그네틱 비드를 이용한 면역마그네틱 분리 방법을 사용하여 상기에서 준비한 폐 조직으로부터 인간 미세혈관 내피세포를 분리하였다. CD31-면역마그네틱 비드(Dynal, Norway)를 상기 단일 세포 현탁액에 첨가하고 4℃에서 40분간 약하게 교반하면서 배양하였다. 배양 후, 배양액을 마그네틱 분리 장치에 1분간 넣고 비드의 반대편으로부터 매우 조심스럽게 상등액을 폐기시킴으로써 복합 단일 세포 현탁액으로부터 내피세포를 분리하였다. 상기 펠렛을 폐기한 부피와 동일한 부피의 0.1% BSA/PBS에 반복적으로 피펫팅함으로써 재현탁하였다. 분리된 내피세포를 프로테아제 억제 칵테일이 함유된 용해 완충액(50 mM 트리스-HCl, pH 7.4, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1% 트립토 X-100)에서 용해하고 4℃에서 20분간 배양한 후 4℃에서 1200rpm으로 20분간 원심분리하였다. 상등액에 함유된 총 단백질의 농도를 BSA를 표준(standard)으로 사용한 단백질 분석 키트로 측정하였다.

그 결과, 폐 선암 조직 및 인접한 정상 폐 조직 각각 약 1∼1.5g 으로부터 평균 4×10⁵ 로제트(rosetted) 내피세포가 분리되었다(도 1).

<1-2> 분리된 내피세포의 순도 분석

상기 실시예 <1-1>에서 분리된 내피세포의 순도를 공지된 내피세포 특이적인 단백질인 내피세포 산화질소 합성효소(endothelial nitric oxide synthase; eNOS)에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 이때, 분리된 내피세포와의 비교를 위해 총 폐 조직 용해물(total lung tissue lysate; TCL)과 양성 대조군으로 인간 제대혈관 내피세포(human umbilical vascular endothelial cell)를 사용하였고 음성 대조군으로 인간 폐 선암 세포주 A549를 사용하였다. 로딩 대조군으로 β-액틴을 사용하였다.

실험 결과, 상기 실시예 <1-1>에서 수득한 인간 폐혈관 내피세포에서 eNOS는 확립세포주인 인간 제대혈관 내피세포(HUVECs)에 비해 낮은 발현 수준을 나타냈으나 특이적으로 검출되었다(도 2).

<실시예 2>

프로테옴 분석

<2-1> 1차원 겔 전기영동 및 쿠마시 염색

인간 폐 선암 조직 및 인접한 폐 정상 조직 유래 내피세포 프로테옴을 분석하기 위해 각각 5종의 폐 선암 조직 및 인접한 정상 조직 유래 내피세포로부터 총 단백질을 추출하였다. 상기 내피세포로부터 분리한 단백질 혼합물을 1차원 겔 전기영동으로 분리하고 쿠마시 염색으로 시각화하였다. 즉, 상기 실시예 1에서 수득 한 내피세포를 환원 SDS 시료 완충액(63mM 트리스-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% 글리세롤, 0.005% 브로모페놀 블루 및 1:20(v/v) β-메캅토에탄올)에 넣고 5분간 끓여서 추출한 다음 10% 또는 12%의 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동에 의해 분리하였다. 전기영동 후, 단백질들을 쿠마시 브릴리언트 블루 G-250 염색용액으로 염색하여 시각화였다. 그 다음 상기 내피세포에서 검출될 수 있는 모든 단백질을 분석하기 위해 상기 겔 레인을 동일한 크기의 10-15개의 연속적인 슬라이스로 잘라내었다. 상기 SDS-PAGE 결과는 도 3에 나타낸 바와 같다.

<2-2> 인-겔 트립신 소화

상기 실시예 <2-1>에서 수득한 겔을 시료로 하여 트립신 인-겔 소화(tryptic in-gel digestion)를 수행하였다. 상기 겔 슬라이스를 0.1M 암모늄 바이카보네이트 및 0.1M 암모늄 바이카보네이트에 용해되어 있는 50%(v/v) 아세토니트릴을 이용하여 SDS 및 코마시 블루 염료가 완전히 제거될 때까지 세척하였다. 그 다음 겔 슬라이스를 아세토니트릴에서 탈수시켜 수축시키고 진공 원심분리기에서 건조시켰다. 수축된 겔 내의 단백질들을 pH 8.0의 25mM 암모늄 바이카보네이트에서 넣고 기질/효소 비율이 10:1(wt/wt)이 되도록 트립신을 처리하여 하룻밤 동안 소화시켰다. 물에 용해되어 있는 0.1% 포름산을 처리하여 상기 효소반응을 종결시켰다. 겔 조각으로부터 유래된 펩타이드를 10분간 소니케이션(sonication)으로 추출하고 펩타이드를 함유한 상등액을 새로운 튜브로 옮겨놓았다.

<2-3> uLC-ESI-MS/MS 분석

프로테옴 분석을 위해 역상-액체 크로마토그래피(RP-LC)가 장착된 2D-LC-MS/MS 시스템을 사용하여 상기 실시예 <2-2>에서 트립신 소화한 펩타이드를 분석하였다. 상기 시스템은 서베이어 MS 펌프(Surveyor MS pump, Thermo Electron, San Jose, CA, USA), 스파크 자동 샘플러(Spark auto sampler, Thermo Electron, San Jose, CA, USA) 및 나노스프레이 이온화(nonospray ionization; NSI) 소스가 장착된 핀니간 LTQ 리니어 이온 트랩 질량 스펙트로미터(Finnigan LTQ linear ion trap mass spectrometer, Thermo Electron, San Jose, CA, USA)로 구성되어 있다. 0.1% 포름산 12㎕에 용해되어 있는 트립신 소화된 펩타이드를 LC-MS/MS에 분석을 위해 주입하였다. 우선 펩타이드 농축 및 탈염을 위해 소화된 시료를 펩타이드 캡트랩 카트리지(CapTrap cartirige)에 주입하고, 상기 펩타이드를 역상(reverse phase; RP) 컬럼 상에서 소수성에 따라 분리하기 위해, 5㎛, 직경 300Å의 C18 실리카겔이 하우스 안에 충진되어 있는 RP 컬럼에 로딩하였다. 상기 RP 컬럼은 전자분사(electrospray)용 이온 트랜스퍼 튜브 바로 정면에 설치하였다. 이동상으로는 용액 A(H₂O)와 B(아세토니트릴, ACN)를 각각 사용하였으며, 상기 두 용액은 모두 0.1%(v/v) 포름산을 함유하였다. 유속은 200nL/min으로 유지하였다. 용매 그래디언트는 43분 내에 5% B 용액으로 시작하여 65% B 용액까지 리니어 그래디언트를 수행한 다음 7분간 80% B 용액으로 끌어올린 후 그 다음 10분간 100% A 용액을 사용하였다. 질량 스펙트로미터는 5개의 MS/MS 스캔 후 각각의 전체 MS 스캔이 이루어 지는 데이터-의존 모드(m/z 300-1800)로 작동시켰다. 상기 모드에서는 5개의 가장 많은 펩타이드 분자 이온이 35%의 표준화된 충돌 에너지를 이용한 충돌-유도 분리(collision-induced dissociation; CID)를 위한 이전의 스캔으로부터 선별된다. 가열된 모세관의 온도 및 전자분사 전압은 각각 195℃ 및 2.0kV였다.

<2-4> 생물정보 분석

상기 실시예 <2-3>에서 수득한 MS/MS 데이터를 바이오워크스 소프트웨어(버전 3.2)가 포함된 SEQUEST 알고리즘(Thermo Electron, San Jose, CA)을 이용하여 IPI 인간 단백질 데이터베이스에서 검색하였다. 상기 데이터베이스 검색은 시스테인 잔기(57Da) 상의 카르복시아미도메틸레이션(carboxyamidomethylation) 및 메티오닌 잔기(16Da)상의 옥시데이션(oxidation)의 다양한 변이와 펩타이드 질량 오차 2Da 및 단편 질량 오차 1Da를 허용한다. 상기 데이터베이스 검색은 트립신 절단에 의해 생성되는 펩타이드에 한정된다. 상기 SEQUEST 결과를 전하 단계에 대한 Xcorr에 의해 필터링하였다. Xcorr값은 단독으로 이온화된 이온의 경우 1.9, 이중으로 이온화된 이온의 경우 2.2 및 3중으로 이온화된 이온의 경우 3.75와 일치되도록 사용하였다. 델타 Cn ≥ 0.1 및 Rsp ≤ 4 및 확률 점수(Probability score) ≥ 1.0E-3으로 셋팅하였다. 상기와 같은 조건으로 동정된 펩타이드에 대한 필터링하여 위양성(false positive) 동정을 제거하였다. 그 결과 각 샘플에 대해 약 550∼1052개의 단백질(평균 790개 단백질)이 동정되었다.

보다 더 신뢰성이 높은 프로테옴을 선별하기 위해, 상기에서 1차적으로 필터 링된 데이터세트에 대해 엄중성(stringency)을 펩타이드 ≥2로 보다 더 높게 적용하여 2차 필터링을 수행하였다. 즉, 상기 1차 필터링된 데이터세트 중 2 이상의 펩타이드가 동정된 단백질을 양성 동정으로 간주하였다. 그 결과, 각 샘플에 대해 약 400∼736개의 단백질의 단백질이 동정되었다(도 4).

상기와 같이 정상 조직 유래 내피세포와 암 조직 유래 내피세포를 펩타이드≥2 로 필터링한 후 5개의 단백질 동정 데이터세트 중 3개 이상의 샘플(60%)에서 검출된 공통 단백질을 수집하여 각 환자 샘플의 변수를 감소시켰다. 그 결과, 병합된 정상 데이터세트의 996개의 단백질 및 병합된 암 데이터세트의 1233개의 단백질로부터 각각 449개의 단백질(45%)과 498개의 단백질(40%)이 추출되었다.

상기 방법에 의해 감소된 폐암 조직 유래 내피세포의 데이터세트를 정상 조직 유래 내피세포의 데이터세트와 비교하였다. 그 결과, 폐암 조직 유래 내피세포의 498개 단백질 중 368개의 단백질(74%)이 정상에서도 발현되는 공통 단백질이며, 130개의 단백질은 폐암 조직에서 유래된 내피세포에만 존재하는 것으로 나타났다(도 5).

표 1에 본 발명에서 동정된 폐암 조직 내피세포 특이적인 단백질의 일부를 세포내(subcellular) 위치 및 기능과 함께 기재하였다. 상기 폐암 조직 유래 내피세포 특이적인 단백질 130개와 정상 조직 유래 내피세포 단백질 81개의 세포내 위치 및 생리적 프로세스에 따라 분류하였다(도 6). 그 결과, 세포내 위치의 경우 암-특이적 단백질의 경우 세포질 그물(endoplasmic reticulum) 및 리보솜 유래 단 백질이 정상세포 단백질에 비해 각각 6.4배 및 5.4배 많은 것으로 나타났다. 생리적 프로세스의 경우에는, 암세포-특이적 단백질에서 대사 관련 단백질이 정상세포 단백질에 비해 1.7배 더 많은 것으로 검출되었다. 특히, 이들 중에서, 단백질 대사 관련 리보솜 단백질이 현저하게 많은 것으로 나타났다.

표 1. 폐암 조직 유래 내피세포에서 특이적으로 동정된 단백질

<2-5> 감산 분석

폐암 조직 유래 내피세포에서만 특이적으로 발현하는 단백질을 동정하기 위하여, 폐암 조직 및 인접한 정상 조직의 내피세포로부터 추출된 5개의 개별적인 데이터를 대상으로 ProtAn을 이용하여 감산 프로테오믹스를 수행하였다. 암 조직 유래 내피세포 단백질의 경우 정상 조직 유래 내피세포 단백질에 대해 평균적으로 59%의 동질성을 나타냈다(도 7). 개별적으로 추출된 암-특이적 단백질에 대해 통합 분석을 수행하여 다른 종류의 암 데이터세트에서 공통적으로 발현되는 단백질을 탐색하였다. 5개의 샘플에서 모두에서 발현된 단백질을 기대했으나 발견되지 않았다. 대신, 5 개 샘플의 데이터세트 중 3개 이상의 샘플에서 검출된 85개의 단백질을 수집할 수 있었다. 85개의 단백질 중, 44개의 단백질은 정상 조직 유래 내피세포 단백질에서는 검출되지 않은 것 들이였다. 단백질 44개 중, 9개는 단일-히트(single-hit) 펩타이드에 의해 동정된 단백질을 포함하는 것으로 나타났다. 그 다음, 상기 단백질이 겔의 정확한 분자 질량 영역에 위치하는지를 확인하고, 단백질 당 동정된 펩타이드 수를 추가적으로 고려하였다. 그 결과, 암 조직 유래 내피세포에서만 확실하게 동정될 수 있는 20개의 가능한 후보 단백질을 수득할 수 있었다(표 2).

보다 더 확실한 후보 단백질을 찾기 위하여, 펩타이드 ≥ 2에 의해 동정된 단백질의 수와 겔의 정확한 분자 질량 영역으로부터 유래된 동정된 펩타이드의 수를 만족시키는 정도에 따라 상, 중 및 하의 3종류의 계층으로 구분하였다.

표 2. 폐암 조직 유래 내피세포의 바이오마커

<실시예 3>

후보 단백질의 웨스턴 블롯 분석에 의한 확인

<3-1> COPG의 웨스턴 블롯 분석

표 2에 나타낸 20개의 후보 단백질 중에서 코아토머 단백질 감마(coatomer protein gamma; COPG)가 폐암 조직 유래 내피세포에서만 특이적으로 검출되는지 여부를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 상기 COPG는 하위 그룹에 속하지만(표 2), SEQUEST 점수가 평균 27.6이며 4개의 암 조직 유래 내피세포에서 특이적으로 동정되었다. 따라서 MS/MS 분석에 의해 COPG가 동정된 샘플 2, 4, 5로부터 유래된 내피세포 단백질과 추가로 3개의 폐암 조직으로부터 유래된 내피세포 단백질(extra-case 1, 2, 3)에서 COPG가 검출되는지 여부를 COPG에 특이적인 항체를 이용하여 확인하였다. 이때, 상기 폐암 조직과 인접한 정상 조직의 내피세포 단백질을 대조군으로 사용하였고, 젤에 동일 양의 샘플이 주입되었는지 모니터링하기 위하여 β-액틴을 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석은 각 시료 단백질을 SDS겔에 로딩하여 전기영동을 수행한 다음 상기 겔 상의 단백질을 니트로셀룰로오스 막으로 트랜스퍼한 후 COPG 항체(Santa Cruz biotechnology, CA, USA)를 처리함으로써 수행하였다.

실험 결과, 정상조직에 비해 폐암 조직의 내피세포에서 COPG가 현저히 높게 검출됨을 알 수 있었다(도 8).

<3-2> Prdx Ⅳ의 웨스턴 블롯 분석

퍼옥시레독신 IV(peroxiredoxin IV, Prdx Ⅳ)이 폐암 조직의 내피세포에서만 특이적으로 발현되는지 여부를 웨스턴 블롯 분석으로 확인하였다. 상기 Prdx Ⅳ는 하위 그룹에 속하나(표 2), 약간 낮은 SEQUEST 점수(평균 16.8)를 가지며 3개의 폐암 조직 유래 내피세포 샘플에서 암-특이적으로 동정되었다. 상기 Prdx Ⅳ의 웨스턴 블롯 분석은 상기 실시예 <3-1>과 동일하게 수행하되 Prdx Ⅳ에 대한 특이적인 항체(Santa Cruz biotechnology, CA, USA)를 이용 하였다.

실험 결과, Prdx Ⅳ는 폐암 조직 유래 내피세포에서 정상 조직 유래 내피세포에 비해 높게 발현하는 것을 확인할 수 있었다(도 9).

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 폐암 진단용 마커는 폐암 조직 유래 내피세포에서도 특이적으로 과량 발현되므로 폐암의 진단, 병의 진행 상태 및 치료전후의 예후를 평가하는데 매우 유용하다.

Claims

COPG(Coatomer protein complex subunit gamma, IPI accession number: IPI00001890.6)에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
삭제
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)에 특이적으로 결합하는 항체 를 포함하는 폐암 진단용 키트.
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)에 특이적으로 결합하는 항체가 부착된 폐암 진단용 마이크로어레이.
삭제
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)에 특이적으로 결합하는 폴리펩타이드가 부착된 폐암 진단용 단백질 칩.
삭제
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 조성물.
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)를 암호화하는 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 폐암 진단용 키트.
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 부착된 폐암 진단용 마이크로어레이.
COPG(Coatomer protein complex subunit gamma)에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브가 부착된 폐암진단용 DNA 칩.