KR20020026483A - 폐암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

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Abstract

폐암과 같은 암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법이 기술되어 있다. 조성물은 하나 이상의 폐 종양 단백질, 이의 면역원성 부분 또는 이러한 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 대안으로서, 치료 조성물은 폐 종양 단백질을 발현하는 항원 제시 세포 또는 이러한 단백질을 발현하는 세포에 대해 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 예를 들면, 폐암과 같은 질환의 예방 및 치료에 사용할 수 있다. 또한, 샘플중에서 폐 종양 단백질 또는 이러한 단백질을 암호화하는 mRNA를 검출하는 것을 기초로 하는 진단 방법이 제공된다.

Description

폐암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 {Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer}
암은 전세계적으로 중대한 건강 문제이다. 비록 암의 검출 및 치료에 진전이 있어왔으나 암을 예방하거나 치료할 수 있는 백신이나 범용적으로 성공해온 방법은 아직까지 없다. 현재의 암에 대한 요법은 화학요법 또는 수술 및 방사선 조사의 병용에 의존하고 있는 것이 일반적이며 많은 환자에게서 적절하지 않은 것으로 입증되어 왔다.
폐암은 미국에서 남성과 여성 모두에게서 암에 의한 사망 원인중 1위이며 1994년의 경우 172,000명의 새로운 폐암 환자가 발생한 것으로 보고되었다. 진단중에 있는 질환 상태와 상관없이 모든 폐암 환자 가운데 5년간 생명을 유지한 비율은 불과 13%에 지나지 않는다. 이것은 폐암이 여전히 국부적인 동안에 검출된 환자의 경우 5년의 생존율이 46%라는 것과 대조를 이룬다. 그러나, 폐암이 만성화되기 전에 발견되는 폐암은 불과 16%에 지나지 않는다.
폐암은 흔히 만성에 이를 때까지 임상 증세가 발견되지 않기 때문에 폐암을 초기에 검출하는 것은 어렵다. 현재, 진단은 흉부 X-선의 사용, 타액에 함유된 세포 유형의 분석 및 기도의 섬유광학 검사에 의해 보조적으로 이루어지고 있다. 치료 섭생은 암의 유형 및 단계에 의해 결정되며 수술, 방사선 요법 및/또는 화학요법을 포함한다.
여러 암에 대한 치료법에 대해 상당한 연구가 이루어지고 있음에도 불구하고, 폐암을 효과적으로 진단하고 치료하는데는 여전히 어려움이 있다. 따라서, 폐암을 검출하고 치료하기 위한 개선된 방법이 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 충족하며 또한 다른 관련된 이점을 제공한다.
발명의 요약
요약하면, 본 발명은 폐암과 같은 암을 진단 및 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 한 가지 관점으로서, 본 발명은 폐 종양 단백질의 적어도 일부분 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 부분 및 다른 변이체들은 이들이 항원-특이적 항혈청과 반응하는 능력이 실질적으로 감소하지 않는 정도로 면역원성을 나타낸다. 특정 양태로서 폴리펩타이드는, (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826으로 기술된 서열; (b) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826으로 기술된 서열의 변이체; 및 (c) (a) 또는 (b) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다. 특정 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 서열 786, 787, 791, 793, 795, 797 내지 799, 806, 809 및 827로 기술된 서열, 및 이들의 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 종양 단백질의 적어도 일부분을 포함한다.
본 발명은 또한 상기된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 일부분(예, 폐 종양 단백질의 15개 이상의 아미노산 잔기를 암호화하는 일부분), 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
다른 관점으로서, 본 발명은 상기된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 관련된 관점으로서, 예방 또는 치료를 위한 백신 또는 면역원성 조성물이 제공된다. 이러한 백신은 상기된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 면역자극제를 포함한다.
또한, 본 발명은 (a) 폐 종양 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 (a) 상기된 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 항원 제시 세포로는 수지상 세포, 대식세포, 단핵세포, 섬유아세포 및 B 세포가 포함된다.
연관된 관점으로서, (a) 상기된 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 (b) 면역자극제를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물이 제공된다.
또한, 본 발명은 다른 관점으로서 상기된 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질뿐만 아니라 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
관련된 관점으로서, 융합 단백질 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
또한, 다른 관점으로서, 융합 단백질 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 면역자극제와 함께 함유하는 백신 또는 면역원성 조성물이 추가로 제공된다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 암 환자에게 상기된 약제학적 조성물 또는 면역원성 조성물을 투여함을 포함하여, 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자가 폐암을 앓고 있는 경우 폐암의 치료를 제공하거나, 이러한 질환에 걸릴 위험이 있다고 생각되는 환자를 예방 차원에서 치료될 수 있다.
또한, 다른 관점으로서, 본 발명은 생물학적 샘플을 폐 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포와 접촉시킴을 포함하여 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공하며, 여기서 접촉 단계는 샘플로부터 단백질을 발현하는 세포의 제거를 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 실시한다.
관련된 관점으로서, 환자에게 상기된 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 투여함을 포함하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법이 제공된다.
또한, 관련된 관점으로서, (i) 상기된 폴리펩타이드, (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 (iii) 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포중 하나 이상과 T 세포를 T 세포의 자극 및/또는 증식을 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여, 폐 종양 단백질에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 증식하는 방법이 제공된다. 상기된 바와 같이 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단이 또한 제공된다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 환자에게 유효량의 상기 T 세포 집단을 투여함을 포함하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 (a) 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 (i) 폐 종양 단백질의 적어도 면역원성 일부분을 포함하는 폴리펩타이드; (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및/또는 (iii) 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포중 하나 이상과 함께 배양하고, (b) 환자에게 유효량의 증식된 T 세포를 투여함으로써 환자에게서 암의 성장을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법을 제공한다. 증식된 세포는 반드시 필요한 것은 아니나, 환자에게 투여하기 전에 클로닝될 수 있다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 (a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 상기된 폴리펩타이드와 결합하는 결합제와 접촉시키고, (b) 샘플중에서 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하며, (c) 폴리펩타이드의 양을 예정된 컷-오프 값과 비교하고, 이로부터 환자에게서 암의 유무를 결정함을 포함하여 환자에게서 암의 유무를 결정하는 방법을 제공한다. 바람직한 양태로서 결합제는 항체이며, 더욱 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 암은 폐암일 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점으로서, 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 상기된 폴리펩타이드와 결합하는 결합제와 첫 번째 시점에서 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 접촉시키고, (b) 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 샘플에서 검출하고, (c) 단계 (a) 및 (b)를 이후의 시점에서 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 사용하여 반복하고, (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하며, 이로부터 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함한다.
또한, 본 발명은 다른 관점으로서, (a) 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 접촉시키고, (b) 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 mRNA의 수준을 샘플에서 검출하며, (c) 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 수준을 예정된 컷-오프 값과 비교하고, 이로부터 환자에게서 암의 유무를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 유무를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 양태로서, mRNA의 양은 예를 들면, 상기된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드의 상보체와 하이브리드화하는 적어도 하나의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 통해 검출한다. 다른 양태로서, mRNA의 양은 상기된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드의 상보체와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 사용하는 하이브리드화 기술을 사용하여 검출한다.
관련된 관점으로서, (a) 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 접촉시키고, (b) 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 샘플에서 검출하고, (c) 이후의 시점에서 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하고, (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리뉴클레오타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하며, 이로부터 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다.
추가의 관점으로서, 본 발명은 상기된 폴리펩타이드와 결합하는 모노클로날 항체와 같은 항체 뿐만 아니라 이러한 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 상기된 올리고뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머를 하나 이상 함유하는 진단 키트가 또한 제공된다.
본 발명의 상기 및 기타 관점은 아래의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로하여 명백할 것이다. 본원에 기술된 모든 문헌은 개개의 전체 내용이 본원에 참고로 인용된다.
동정 서열
서열 1은 클론 #19038(L845P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 2는 클론 #19036의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 3은 클론 #19034의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 4는 클론 #19033의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 5는 클론 #19032의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 6은 클론 #19030(L559S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 7는 클론 #19029의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 8은 클론 #19025의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 9는 클론 #19023의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 10은 클론 #18929의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 11은 클론 #19010의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 12는 클론 #19009의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 13은 클론 #19005, 19007, 19016 및 19017의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 14는 클론 #19004의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 15는 클론 #19002 및 18965의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 16은 클론 #18998의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 17은 클론 #18997의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 18은 클론 #18996의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 19는 클론 #18995의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 20은 클론 #18994(LP864P로 공지됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 21은 클론 #18992의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 22는 클론 #18991의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 23은 클론 #18990(클론 #20111로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 24는 클론 #18987의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 25는 클론 #18985(L839P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 26은 클론 #18984(L847P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 27은 클론 #18983의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 28은 클론 #18976 및 18980의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 29는 클론 #18975의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 30은 클론 #18974의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 31은 클론 #18973의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 32는 클론 #18972의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 33은 클론 #18971(L801P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 34는 클론 #18970의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 35는 클론 #18966의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 36은 클론 #18964, 18968 및 19039의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 37은 클론 #18960의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 38은 클론 #18959의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 39는 클론 #18958 및 18982의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 40은 클론 #18956 및 19015의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 41은 클론 #18954(L848P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 42는 클론 #18951의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 43은 클론 #18950의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 44는 클론 #18949 및 19024(L844P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 45는 클론 #18948의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 46은 클론 #18947(L840P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 47은 클론 #18946, 18953, 18969 및 19027의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 48은 클론 #18942의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 49는 클론 #18940, 18962, 18963, 19006, 19008, 19000 및 19031의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 50은 클론 #18939의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 51은 클론 #18938 및 18952의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 52는 클론 #18938의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 53은 클론 #18937의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 54는 클론 #18934, 18935, 18993 및 19022(L548S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 55는 클론 #18932의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 56은 클론 #18931 및 18936의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 57은 클론 #18930의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 58은 클론 #19014(L773P로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 59는 클론 #19127의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 60은 클론 #19057 및 19064의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 61은 클론 #19122의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 62는 클론 #19120 및 18121의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 63은 클론 #19118의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 64는 클론 #19117의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 65는 클론 #19116의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 66은 클론 #19114의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 67는 클론 #19112(L561S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 68은 클론 #19110의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 69는 클론 #19107(L552S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 70은 클론 #19106(L547S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 71은 클론 #19105 및 19111의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 72는 클론 #19099의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 73은 클론 #19095, 19104 및 19125(L549S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 74는 클론 #19094의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 75는 클론 #19089 및 19101의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 76은 클론 #19088의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 77은 클론 #19087, 19092, 19096, 19100 및 19119의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 78은 클론 #19086의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 79는 클론 #19085(L550S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 80은 클론 #19084(클론 #19079로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 81은 클론 #19082의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 82는 클론 #19080의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 83은 클론 #19077의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 84는 클론 #19076(L551S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 85는 클론 #19074(클론 #20102로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 86는 클론 #19073(L560S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 87은 클론 #19072 및 19115의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 88은 클론 #19071의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 89는 클론 #19070의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 90은 클론 #19069의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 91은 클론 #19068(L563S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 92는 클론 #19066의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 93은 클론 #19065의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 94는 클론 #19063의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 95는 클론 #19061, 19081, 19108 및 19109의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 96은 클론 #19060, 19067 및 19083(L548S로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 97은 클론 #19059 및 19062의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 98은 클론 #19058의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 99는 클론 #19124의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 100은 클론 #18929의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 101은 클론 #18422의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 102는 클론 #18425의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 103은 클론 #18431의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 104는 클론 #18433의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 105는 클론 #18444의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 106은 클론 #18449의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 107은 클론 #18451의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 108은 클론 #18452의 결정된 cDNA 서열이다.
서서열 109는 클론 #18455의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 110은 클론 #18457의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 111은 클론 #18466의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 112는 클론 #18468의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 113은 클론 #18471의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 114는 클론 #18475의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 115은 클론 #18476의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 116은 클론 #18477의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 117은 클론 #20631의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 118은 클론 #20634의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 119는 클론 #20635의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 120은 클론 #20637의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 121은 클론 #20638의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 122는 클론 #20643의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 123은 클론 #20652의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 124는 클론 #20653의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 125는 클론 #20657의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 126은 클론 #20658의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 127은 클론 #20660의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 128은 클론 #20661의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 129는 클론 #20663의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 130은 클론 #20665의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 131은 클론 #20670의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 132는 클론 #20671의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 133은 클론 #20672의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 134은 클론 #20675의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 135는 클론 #20679의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 136은 클론 #20681의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 137는 클론 #20682의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 138는 클론 #20684의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 139은 클론 #20685의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 140은 클론 #20689의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 141은 클론 #20699의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 142는 클론 #20701의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 143은 클론 #20702의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 144은 클론 #20708의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 145는 클론 #20715의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 146은 클론 #20716의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 147은 클론 #20719의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 148는 클론 #19129의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 149은 클론 #19131.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 150는 클론 #19132.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 151은 클론 #19133의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 152는 클론 #19134.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 153은 클론 #19135.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 154은 클론 #19137의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 155는 클론 #19138.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 156은 클론 #19138.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 157은 클론 #19139의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 158은 클론 #19140.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 159는 클론 #19140.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 160은 클론 #19141의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 161은 클론 #19143의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 162은 클론 #19144의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 163은 클론 #19145.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 164는 클론 #19145.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 165는 클론 #19146의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 166은 클론 #19149.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 167은 클론 #19152의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 168은 클론 #19153.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 169는 클론 #19153.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 170은 클론 #19155의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 171은 클론 #19157의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 172는 클론 #19159의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 173은 클론 #19160의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 174는 클론 #19161.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 175는 클론 #19161.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 176은 클론 #19162.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 177은 클론 #19166의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 178은 클론 #19169의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 179는 클론 #19171의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 180은 클론 #19173.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 181은 클론 #19173.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 182은 클론 #19174.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 183은 클론 #19175의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 184은 클론 #19177의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 185는 클론 #19178의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 186은 클론 #19179.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 187은 클론 #19179.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 188은 클론 #19180의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 189는 클론 #19182.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 190은 클론 #19182.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 191은 클론 #19183.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 192는 클론 #19185.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 193은 클론 #19187의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 194은 클론 #19188의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 195은 클론 #19190의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 196는 클론 #19191의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 197은 클론 #19192의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 198은 클론 #19193의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 199은 클론 #19194.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 200는 클론 #19194.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 201은 클론 #19197의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 202은 클론 #19200.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 203은 클론 #19200.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 204는 클론 #19202의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 205은 클론 #19204.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 206은 클론 #19204.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 207은 클론 #19205의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 208는 클론 #19206.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 209은 클론 #19206.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 210은 클론 #19207의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 211은 클론 #19208의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 212는 클론 #19211.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 213은 클론 #19211.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 214은 클론 #19214.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 215은 클론 #19214.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 216는 클론 #19215의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 217은 클론 #19217.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 218은 클론 #19217.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 219은 클론 #19217.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 220는 클론 #19218.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 221은 클론 #19220.1의 일차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 222은 클론 #19220.2의 이차 결정된 cDNA 서열이다.
서열 223은 클론 #22015의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 224는 클론 #22017의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 225은 클론 #22019의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 226은 클론 #22020의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 227은 클론 #22023의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 228는 클론 #22026의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 229은 클론 #22027의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 230은 클론 #22028의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 231은 클론 #22032의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 232는 클론 #22037의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 233은 클론 #22045의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 234은 클론 #22048의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 235은 클론 #22050의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 236는 클론 #22052의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 237은 클론 #22053의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 238은 클론 #22057의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 239은 클론 #22066의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 240는 클론 #22077의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 241은 클론 #22085의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 242은 클론 #22105의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 243은 클론 #22108의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 244는 클론 #22109의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 245은 클론 #24842의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 246은 클론 #24843의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 247은 클론 #24845의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 248는 클론 #24851의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 249은 클론 #24852의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 250은 클론 #24853의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 251은 클론 #24854의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 252는 클론 #24855의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 253은 클론 #24860의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 254은 클론 #24864의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 255은 클론 #24866의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 256는 클론 #24867의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 257은 클론 #24868의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 258은 클론 #24869의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 259은 클론 #24870의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 260는 클론 #24872의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 261은 클론 #24873의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 262은 클론 #24875의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 263은 클론 #24882의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 264는 클론 #24885의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 265은 클론 #24886의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 266은 클론 #24887의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 267은 클론 #24888의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 268는 클론 #24890의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 269은 클론 #24896의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 270은 클론 #24897의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 271은 클론 #24899의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 272는 클론 #24901의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 273은 클론 #24902의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 274은 클론 #24906의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 275은 클론 #24912의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 276는 클론 #24913의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 277은 클론 #24920의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 278은 클론 #24927의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 279은 클론 #24930의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 280는 클론 #26938의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 281은 클론 #26939의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 282은 클론 #26943의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 283은 클론 #26948의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 284는 클론 #26951의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 285은 클론 #26955의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 286은 클론 #26956의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 287은 클론 #26959의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 288는 클론 #26961의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 289은 클론 #26962의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 290은 클론 #26964의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 291은 클론 #26966의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 292는 클론 #26968의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 293은 클론 #26972의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 294은 클론 #26973의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 295은 클론 #26974의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 296는 클론 #26976의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 297은 클론 #26977의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 298은 클론 #26979의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 299은 클론 #26980의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 300는 클론 #26981의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 301은 클론 #26984의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 302은 클론 #26985의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 303은 클론 #26986의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 304는 클론 #26993의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 305은 클론 #26994의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 306은 클론 #26995의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 307은 클론 #27003의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 308는 클론 #27005의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 309은 클론 #27010의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 310은 클론 #27011의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 311은 클론 #27013의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 312는 클론 #27016의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 313은 클론 #27017의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 314은 클론 #27019의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 315은 클론 #27028의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 316는 클론 #19060의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 317은 클론 #18964의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 318은 클론 #18929의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 319은 클론 #18991의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 320는 클론 #18996의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 321은 클론 #18966의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 322은 클론 #18951의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 323은 클론 #18973(L516S로도 공지됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 324는 클론 #19060의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 325은 클론 #19063의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 326은 클론 #19077의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 327은 클론 #19110의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 328는 클론 #19122의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 329은 클론 #19118의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 330은 클론 #19080의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 331은 클론 #19127의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 332는 클론 #19117의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 333은 클론 #19095(L549로도 인용됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 334은 클론 #18964의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 335은 클론 #18929의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 336는 클론 #18991의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 337은 클론 #18996의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 338은 클론 #18966의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 339은 클론 #18951의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 340는 클론 #18973의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 341은 클론 #26461의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 342은 클론 #26462의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 343은 클론 #26463의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 344는 클론 #26464의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 345은 클론 #26465의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 346은 클론 #26466의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 347은 클론 #26467의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 348는 클론 #26468의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 349은 클론 #26469의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 350은 클론 #26470의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 351은 클론 #26471의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 352는 클론 #26472의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 353은 클론 #26474의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 354은 클론 #26475의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 355은 클론 #26476의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 356는 클론 #26477의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 357은 클론 #26478의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 358은 클론 #26479의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 359은 클론 #26480의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 360는 클론 #26481의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 361은 클론 #26482의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 362은 클론 #26483의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 363은 클론 #26484의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 364는 클론 #26485의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 365은 클론 #26486의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 366은 클론 #26487의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 367은 클론 #26488의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 368는 클론 #26489의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 369은 클론 #26490의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 370은 클론 #26491의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 371은 클론 #26492의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 372는 클론 #26493의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 373은 클론 #26494의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 374은 클론 #26495의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 375은 클론 #26496의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 376는 클론 #26497의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 377은 클론 #26498의 결정된 cDNA 서열이다.
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서열 379은 클론 #26500의 결정된 cDNA 서열이다.
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서열 687은 클론 #26905의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 688은 클론 #26906의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 689은 클론 #26708의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 690는 클론 #26709의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 691은 클론 #26710의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 692은 클론 #26711의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 693은 클론 #26712의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 694은 클론 #26713의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 695는 클론 #26714의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 696은 클론 #26715의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 697은 클론 #26716의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 698은 클론 #26717의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 699는 클론 #26718의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 700은 클론 #26719의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 701은 클론 #26720의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 702은 클론 #26721의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 703은 클론 #26722의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 704는 클론 #26723의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 705은 클론 #26724의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 706은 클론 #26725의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 707은 클론 #26726의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 708는 클론 #26727의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 709은 클론 #26728의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 710은 클론 #26729의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 711은 클론 #26730의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 712은 클론 #26731의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 713는 클론 #26732의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 714은 클론 #26733.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 715은 클론 #26733.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 716은 클론 #26734의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 717는 클론 #26735의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 718은 클론 #26736의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 719은 클론 #26737의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 720은 클론 #26738의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 721은 클론 #26739의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 722는 클론 #26741의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 723은 클론 #26742의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 724는 클론 #26743의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 725은 클론 #26744의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 726은 클론 #26745의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 727는 클론 #26746의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 728은 클론 #26747의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 729은 클론 #26748의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 730은 클론 #26749의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 731는 클론 #26750의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 732은 클론 #26751의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 733은 클론 #26752의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 734은 클론 #26753의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 735는 클론 #26754의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 736은 클론 #26755의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 737은 클론 #26756의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 738은 클론 #26757의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 739는 클론 #26758의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 740은 클론 #26759의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 741은 클론 #26760의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 742은 클론 #26761의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 743은 클론 #26762의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 744는 클론 #26763의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 745은 클론 #26764의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 746은 클론 #26765의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 747은 클론 #26766의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 748는 클론 #26767의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 749은 클론 #26768의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 750은 클론 #26769의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 751은 클론 #26770의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 752는 클론 #26771의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 753은 클론 #26772의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 754은 클론 #26773의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 755은 클론 #26774의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 756는 클론 #26775의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 757은 클론 #26776의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 758은 클론 #26777의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 759은 클론 #26778의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 760은 클론 #26779의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 761은 클론 #26781의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 762은 클론 #26782의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 763는 클론 #26783의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 764은 클론 #26784의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 765은 클론 #26785의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 766은 클론 #26786의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 767는 클론 #26787의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 768은 클론 #26788의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 769은 클론 #26790의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 770은 클론 #26791의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 771는 클론 #26792의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 772은 클론 #26793의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 773은 클론 #26794의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 774은 클론 #26795의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 775는 클론 #26796의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 776은 클론 #26797의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 777은 클론 #26798의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 778은 클론 #26800의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 779는 클론 #26801의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 780은 클론 #26802의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 781은 클론 #26803의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 782은 클론 #26804의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 783은 L773P의 아미노산 서열이다.
서열 784는 L773A 발현 작제물의 결정된 DNA 서열이다.
서열 785은 L773PA 발현 작제물의 결정된 DNA 서열이다.
서열 786은 L552S의 추정 아미노산 서열이다.
서열 787은 L840P의 추정 아미노산 서열이다.
서열 788은 L548S의 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 789는 서열 788에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 790은 L552S의 연장된 cDNA 서열이다.
서열 791은 서열 790의 cDNA 서열에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 792는 L552S의 동형의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 793은 서열 792에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 794는 L840P의 연장된 cDNA 서열이다.
서열 795는 서열 794에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 796은 L801P의 연장된 cDNA 서열이다.
서열 797은 서열 796에 의해 암호화된 일차 추정 아미노산 서열이다.
서열 798은 서열 796에 의해 암호화된 이차 추정 아미노산 서열이다.
서열 799는 서열 796에 의해 암호화된 삼차 추정 아미노산 서열이다.
서열 800은 L844P의 결정된 전체 길이 서열이다.
서열 801은 L551S의 5' 컨센서스 cDNA 서열이다.
서열 802는 L551S의 3' 컨센서스 cDNA 서열이다.
서열 803은 STY8의 cDNA 서열이다.
서열 804는 L551S의 연장된 cDNA 서열이다.
서열 805는 STY8의 아미노산 서열이다.
서열 806은 L551S의 연장된 아미노산 서열이다.
서열 807은 L773P의 결정된 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 808은 L552S의 전체 길이 cDNA 서열이다.
서열 809는 L552S의 전체 길이 아미노산 서열이다.
서열 810은 클론 50989의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 811은 클론 50990의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 812는 클론 50992의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 813-824는 폐 종양 조직으로부터 분리된 클론의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 825는 전체 길이 L551S 클론 54305의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 826은 전체 길이 L551S 클론 54298의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 827은 L551S의 전체 길이 아미노산 서열이다.
본 발명은 일반적으로 폐암과 같은 암의 치료 및 진단에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 폐 종양 단백질중 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩타이드 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 폐암의 예방 및 치료를 위한 조성물 및 폐암의 진단 및 모니터링을 위한 조성물에 사용될 수 있다.
상기된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로, 예를 들면 폐암과 같은 암을 치료 및 진단하기 위한 조성물 및 이러한 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기술된 특정 예시적인 조성물은 폐 종양 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 항체와 같은 결합제, 항원 제시 세포(APCs) 및/또는 면역계 세포(예, T 세포)를 포함한다. 본원에 사용된 용어 "폐 종양 단백질"은 일반적으로 본원에 제공된 대표적인 검정법을 사용하여 결정했을 때 정상 조직에서의 발현 수준보다 적어도 2배, 바람직하게는 적어도 5배의 수준으로 폐 종양 세포에서 발현되는 단백질에 관한 것이다. 특정 폐 종양 단백질은 폐암을 앓고 있는 환자의 항혈청과 검출가능한 정도로(ELISA 또는 웨스턴 블롯과 같은 면역검정에서) 반응하는 종양 단백질이다.
따라서, 상기 및 하기 설명에 따라 본 발명은 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열을갖는 예시적인 폴리뉴클레오타이드 조성물, 서열 786, 787, 791, 793, 795, 797 내지 799, 806, 809 및 827에 기술된 아미노산 서열을 갖는 예시적인 폴리펩타이드 조성물, 이러한 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체 조성물, 및 이러한 조성물을 예를 들면 사람 폐암의 검출, 진단 및/또는 치료에 사용하는 많은 추가의 양태를 제공한다.
폴리뉴클레오타이드 조성물
본원에 사용된 용어 "DNA 단편" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 특정 종의 전체 게놈 DNA으로부터 떨어져 분리된 DNA 분자를 가리킨다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 단편은 이 DNA 단편이 유래된 종의 전체 게놈 DNA로부터 실질적으로 분리된 상태이거나 분리되어 정제된 상태에 있는 하나 이상의 암호화 서열을 함유하는 DNA 단편을 가리킨다. 용어 "DNA 단편" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 DNA 단편 및 이들 단편보다 작은 파편을 포함하며 또한 재조합 벡터(예, 플라스미드, 코스미드, 파아지미드, 파아지, 바이러스 등)를 포함한다.
당업자가 이해할 수 있는 바와 같이, 본 발명의 DNA 단편은 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나 발현하도록 변형될 수 있는 게놈 서열, 게놈외 서열 및 플라스미드-암호화된 서열 및 유전공학적으로 조작된 보다 작은 유전자 단편을 포함할 수 있다. 이러한 단편은 사람의 조작에 의해 천연적으로 분리되거나 합성에 의해 변형될 수 있다.
본원에 사용된 용어 "분리된"이란 폴리뉴클레오타이드가 다름 암호화 서열로부터 실질적으로 떨어져 있고 DNA 단편이 커다란 염색체 단편 또는 다른 작용성 유전자 또는 폴리펩타이드 암호 영역과 같이 관련이 없는 암호화 DNA의 커다란 부분을 함유하지 않음을 의미한다. 물론, 이것은 처음에 분리된 DNA 단편을 가리키며 사람의 조작에 의해 후에 그 단편에 부가된 유전자 또는 암호 영역을 배제하지 않는다.
당업자에 의해 인지될 수 있듯이, 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있으며 DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 일-대-일 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자를 포함한다. 추가의 암호화 또는 비암호화 서열이 반드시 필요한 것은 아니지만, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 존재할 수 있으며 폴리뉴클레오타이드는 반드시 그러한 것은 아니지만 다른 분자 및/또는 지지체에 연결될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, 폐 종양 단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나 이러한 서열의 변이체 또는 생물학적 또는 항원성 작용 등가물을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드 변이체는 하기된 바와 같이 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있으며 바람직하게는 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 천연 종양 단백질에 비하여 감소되어서는 안된다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성에 미치는 영향은 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 평가될 수 있다. 용어 "변이체"는 또한 이종발생성 기원의 동종 유전자를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 비교할 때 두 서열은 뉴클레오타이드 또는 아미노산의 서열을 아래에 기술한 바와 같이 최대의 대응을 위해 배열하였을 때 똑 같은 경우 "동일하다"라고 말한다. 두 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국소적 영역을 동정하고 비교하기 위한 비교창 위에서 서열을 비교함으로써 실시된다. 본원에 사용된 용어 "비교창"은 두 서열이 최적으로 배열된 후 동일한 수의 연속 위치의 참조 서열과 비교될 수 있는 서열의 연속 위치가 적어도 약 20개, 보통 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개인 단편을 가리킨다.
비교를 위한 서열의 최적 배열은 바이오정보 소프트웨어(위스콘신 매디슨 소재의 DNASTAR, Inc.)내 Megalign 프로그램을 데폴트 변수로서 사용하여 실시할 수 있다. 이 프로그램은 다음의 참고문헌에 기술된 수 가지의 배열 방법을 포함하고 있다[참조: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O.(ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Acadimic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco,CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730].
대안으로, 비교를 위한 서열의 최적 배열은 문헌[Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482]의 국부 동일성 알고리듬, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443]의 동일성 배열 알고리듬, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]의 유사성 방법에 대한 조사, 이들 알고리듬(위스콘신 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재한 위스콘신 제네틱스 컴퓨터 그룹(GCG)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지내의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA)의 컴퓨터 실행 또는 검색에 의해 실시할 수 있다.
서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 결정하는데 적합한 알고리듬의 한 가지 바람직한 예는 문헌[Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402] 및 [Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215-403-410]에 각각 기술되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면, 본원에 기술된 변수로 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 대한 서열 동일성 비율을 결정할 수 있다. BLAST 분석을 실시하기 위한 소프트웨어는 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션을 통해 널리 이용되고 있는 것이다. 한 가지 예시적인 것으로서 뉴클레오타이드 서열을 위해 변수 M(정합 잔기의 쌍에 대한 보상 점수; 항상 >0)과 N(부정합 잔기에 대한 벌점; 항상 <0)을 사용하여 누적 점수를 계산할 수 있다. 아미노산 서열의 경우, 점수 매트릭스를 사용하여 누적 점수를 산출할 수 있다. 각 방향에서 단어 득점의 신장은 누적 배열 점수가 이의 최대 도달 값으로부터 X 양까지 떨어질 때, 누적 점수가 하나 이상의 음성-점수 잔기 배열의 누적으로 인해 0 이하로 갈 때 또는 양 서열의 말단에 도달될 때 정지한다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 배열의 감도 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 데폴트로서 11개 단어 길이(W) 및 10의 기대값(E), 및 BLOSUM6 점수 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915] 배열, 50의 (B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 본쇄의 비교를 사용한다.
바람직하게는, "서열 동일성의 비율"은 20개 이상 위치의 비교창에서 최적으로 배열된 두 서열을 비교함으로써 결정하며, 비교창에서의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 부분은 두 서열의 최적 배열을 위한 참조 서열(부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여 20% 미만, 보통 5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 비율은 양 서열에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 존재하는 위치의 수를 결정하여 정합된 위치의 수를 수득하고, 정합된 위치의 수를 참조 서열내 위치의 총수(즉, 창 크기)로 나눈 다음, 이 값에 100을 곱하여 서열 동일성의 비율을 산정함으로써 얻는다.
따라서, 본 발명은 본원에 기술된 서열과 실질적인 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드, 예를 들면 본원에 기술된 방법(하기된 바와 같이 표준 변수를 사용한 BLAST 분석)을 사용하여 결정했을 때 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교하여 50% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 적어도 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 당업자는 상기 값을 적절히 조정하여 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치 등을 고려하여 두 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 결정할 수 있다.
추가의 양태로서, 본 발명은 본원에 기술된 서열중 하나 이상과 동일하거나 상보적인 여러 길이의 연속 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들면, 본 발명은 본원에 기술된 한 이상의 서열중 적어도 약 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000개 또는 그 이상의 연속 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 이들 사이의 중간 길이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 당업자는 본원에서의 "중간 길이"에 대하여 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등; 200 내지 500; 또는 500 내지 1000 사이의 모든 정수를 포함한 인용값 사이의 모든 길이를 의미하는 것으로 쉽게 이해할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 자체 암호화 서열의 길이에 상관없이 다른 DNA 서열, 예를 들면, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 추가의 제한 효소 부위, 복수 클로닝 부위, 다른 암호 단편 등과 조합될 수 있으며 이에 따라 이들의 전체 길이는 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 대부분 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있는 것으로 생각되며, 바람직하게는 전체 길이는 제조의 편리성 및 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 사용에 의해 제한된다. 예를 들면, 약 10,000, 약 5,000, 약 3,000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개 염기쌍의 전체 길이(모든 중간 길이를 포함함)를 갖는 예시적인 DNA 단편이 본 발명의 많은 실시에 유용한 것으로 생각된다.
다른 양태로서, 본 발명은 중간 정도의 엄격한 조건하에서 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편 또는 이의 상보체와 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 하이브리드화 기술은 분자생물학 분야에 잘 알려져 있다. 예시하는 목적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 다른 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 시험하기 위해 적합한 중간 정도의 엄격한 조건은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0 mM EDTA(pH 8.0)의 용액으로 예비세척하고; 5X SSC, 50℃ 내지 65℃에서 밤새 하이브리드화하며; 이어서 0.1% SDS를 함유한 2X, 0.5X 및 0.2X SSC 각각으로 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다.
게다가, 유전자 암호의 축퇴성 결과로서, 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 많이 있다는 것은 당업자는 이해할 것이다. 이들 폴리뉴클레오타이드중 일부는 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 용법에서의 차이로 인해 다양한 폴리뉴클레오타이드는 특정적으로 본 발명에 포함된다. 또한, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립형질은 본 발명의 범위에 속한다. 대립형질은 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환과 같은 하나 이상의 돌연변이 결과로서 변형된 내인성 유전자이다. 생성된 mRNA 및 단백질은 필요하지 않을 수 있으나 변형된 구조 또는 기능을 가질 수 있다. 대립형질은 표준 기술(예, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 동정할 수 있다.
탐침 및 프라이머
본 발명의 다른 양태로서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열은 핵산 하이브리드화를 위한 탐침 또는 프라이머로서 유리하게 사용될 수 있다. 본원에 기술된 15개 이상의 뉴클레오타이드 연속 서열과 동일한 서열을 갖거나 이에 상보적인 약 15개 이상의 뉴클레오타이드 연속 서열의 서열 영역을 포함하는 핵산 단편은 특정 이용성이 있는 것으로 이해될 것이다. 좀더 긴 연속적인 동일 또는 상보체, 예를 들면 약 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 개(모든 중간의 길이를 포함함)의 서열 및 심지어 전체 길이 서열도 또한 특정 양태에서 유용될 것이다.
이러한 핵산 탐침이 해당 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 능력은 그러한 핵산 탐침을 주어진 샘플에서 상보체의 존재를 검출하는데 사용할 수 있는 것이다. 그러나, 돌연변이 종 프라이머의 제조를 위한 서열 정보 또는 다른 유전자 작제물을 제조하는데 사용하기 위한 프라이머의 사용과 같이 다른 이용성을 또한 고려할 수 있다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 상보적인 10 내지 14, 15 내지 20, 30, 50 또는 심지어 100 내지 200개 뉴클레오타이드(또한 중간의 길이를 포함함)의 연속 뉴클레오타이드로 이루어진 서열 영역을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자가 특히, 예를 들면 써던 및 노던 블롯팅에 사용하기 위한 하이브리드화 탐침으로서 고려된다. 이것은 다양한 세포 유형 및 여러 세균 세포 모두에서 유전자 생성물 또는 이의 단편의 분석을 가능하게 한다. 단편의 전체 크기 뿐만 아니라 상보적인 직선 길이의 크기는 궁극적으로 특정 핵산 단편의 의도된 용도 또는 응용에 의존한다. 보다 작은 단편은 일반적으로 하이브리드화 양태에 사용할 수 있으며 약 15 내지 약 100개 뉴클레오타이드와 같이 연속적인 상보 영역의 길이가 다양할 수 있으나, 좀더 큰 연속 상보 직선 길이가 검출하고자 하는 상보체에 따라 사용할 수 있다.
길이가 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드인 하이브리드화 탐침의 사용은 안정하고 선택적인 이중 나선 분자의 형성을 가능하게 한다. 그러나, 하이브리드의 안정성 및 선택성을 증가시킴으로써 수득된 특이적 하이브리드 분자의 질과 양을 개선하기 위해 일반적으로 길이가 15개 이상의 직선 염기가 연속적인 상보체인 분자가 바람직하다. 일반적으로, 15 내지 25개 연속 뉴클레오타이드의 유전자-상보 직선 서열 또는 필요한 경우 그 보다 더 긴 서열을 갖는 핵산 분자를 디자인하는 것이 바람직하다.
하이브리드화 탐침은 본원에 기술된 모든 서열의 모든 일부분으로부터 선택될 수 있다. 필요한 모든 것은 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열을 살펴보거나 탐침 또는 프라이머로서 이용하고자 하는 전체 길이 서열을 포함하여 길이가 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드인 연속 서열 부분을 검토하는 것이다. 탐침 및 프라이머 서열의 선택은 여러 요인에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 프라이머를 사용하여 이로부터 전체 서열의 말단을 향하여 진행하기를 원할 수 있다.
작은 폴리뉴클레오타이드 단편은 통상적으로 올리고뉴클레오타이드 자동 합성기를 사용하여 실시하는 바와 같이, 예를 들면 화학적 수단에 의해 단편을 직접 합성함으로써 쉽게 제조할 수 있다. 또한, 단편은 미국 특허 제4,683,202호(이의 내용은 본원에 참고로 인용된다)의 PCRTM기술과 같은 핵산 재생 기술을 응용하거나, 선택된 서열을 재조합 생성을 위한 재조 벡터내로 도입하거나, 일반적으로 분자생물학의 전문가에게 알려져 있는 다른 재조합 DNA 기술을 이용하여 수득할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 해당 전체 유전자 또는 유전자 단편의 상보체와의 이중나선 분자를 선택적으로 형성하는 능력을 위해 사용될 수 있다. 계획된 적용에 따라, 전형적으로 표적 서열에 대한 탐침의 선택성을 다양한 정도로 얻기 위해 다양한 하이브리드화 조건을 사용할 수 있다. 높은 선택성을 필요로 하는 응용에 있어서, 전형적으로 하이브리드를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건을 사용할 수 있다. 예를 들면, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M 염의 염 농도에 의해 제공되는 바와 같이 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도조건을 선택할 수 있다. 이러한 특정 조건은 탐침과 주형 또는 표적 쇄 사이의 부정합을 거의 허용하지 않으며 특히 관련된 서열을 분리하는데 적합하다.
물론, 일부 응용에 있어서, 예를 들면 주형에 하이브리드화된 돌연변이 프라이머 쇄를 사용하여 돌연변이체를 제조하고자 하는 경우, 이종이중나선 (heteroduplex)의 형성을 허용하기 위해 전형적으로 덜 엄격한(감소된 엄격함) 하이브리드화 조건이 필요할 것이다. 이러한 상황에 있어서, 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M 염과 같은 염 조건을 사용할 수 있다. 이에 따라서 교차-하이브리드화 종이 대조 하이브리드화에 대한 양성 하이브리드화 시그날로서 쉽게 동정될 수 있다. 어느 경우든지, 온도를 증가시키는 것과 동일한 방식으로 하이브리드 이본쇄를 불안정하게 만드는 작용을 하는 포름아미드 양을 높여 첨가함으로써 조건을 더욱 엄격하게 만들 수 있다는 것은 잘 알려져 있다. 따라서, 하이브리드화 조건은 쉽게 조작가능하며 이에 일반적으로 목적하는 결과에 따른 선택상의 문제인 것이다.
폴리뉴클레오타이드 동정 및 특성화
폴리뉴클레오타이드는 다양한 공지 기술을 사용하여 동정, 제조 및/또는 조작할 수 있다. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 아래에 자세히 기술되어 있는 바와 같이 종양-연관된 발현(본원에 제공된 대표적인 검정법을 사용하여 결정하는 바와 같이 정상 조직에서보다 종양에서 적어도 2배 많은 발현)에 대해 cDNA의 마이크로어레이를 스크리닝함으로써 동정할 수 있다. 이러한 선별은 예를 들면, 신테니마이크로어레이(캘리포니아 팔로 알토 소재)를 제조업자의 지침에 따라(그리고 문헌[Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:10614-10619, 1996 and Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:2150-2155, 1997]에 기술된 바와 같이) 실시할 수 있다. 대안으로는, 폴리뉴클레오타이드는 폐 종양 세포와 같이 본원에 기술된 단백질을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 통해 증폭시킬 수 있다. 이 방법을 위해 서열-특이적 프라이머를 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 디자인할 수 있으며, 또한 구입하거나 합성할 수도 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 부분은 잘 공지된 기술을 사용하여 적합한 라이브러리(예, 폐 종양 cDNA 라이브러리)로부터 전체 길이 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다. 이러한 기술내에서, 라이브러리(cDNA 또는 게놈)는 증폭에 적합한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머를 사용하여 스크리닝한다. 바람직하게는, 라이브러리는 좀더 큰 분자가 포함되도록 크기별로 선별한다. 또한, 유전자의 5' 및 상류 영역을 동정하기 위해 랜덤 프라임 라이브러리가 바람직할 수 있다. 게놈 라이브러리는 인트론 및 5' 신장 서열을 얻는데 바람직하다.
하이브리드화 기술의 경우, 잘 공지된 기술을 사용하여 부분 서열을 표지화할 수 있다(예를 들면, 닉-해독 또는32P로 말단-표지에 의해). 그런 다음, 일반적으로 표지된 탐침과 변성된 세균 콜로니를 함유한 필터(또는 파아지 플라크를 함유한 단층)를 하이브리드화시킴으로써 세균 또는 박테리오파아지 라이브러리를 스크리닝한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 하이브리드화 콜로니 또는 플라크를 선별 및 증식시키고 추가의 분석을 위해 DNA를 분리한다. cDNA를 부분 서열로부터의 프라이머 및 벡터로부터의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 분석하여 추가 서열의 양을 결정할 수 있다. 제한 지도와 부분 서열을 작성하여 하나 이상의 중복 클론을 동정할 수 있다. 이어서, 일련의 결실 클론을 생성하는 것을 포함할 수 있는 표준 기술을 사용하여 완전한 서열을 결정할 수 있다. 그런 다음, 생성된 중복 서열을 하나의 연속 서열로 조합시킬 수 있다. 잘 공지된 기술을 사용하여 적합한 단편을 연결시켜 전체 서열 cDNA 분자를 제조할 수 있다.
대안으로, 부분 cDNA 서열로부터 전체 길이 암호화 서열을 수득하기 위한 많은 증폭 기술이 있다. 이러한 기술내에서, 증폭은 일반적으로 PCR을 통해 수행한다. 시판되고 있는 많은 키트를 사용하여 증폭 단계를 실시할 수 있다. 프라이머는 예를 들면, 당해 분야에 잘 공지된 소프트웨어를 사용하여 디자인할 수 있다. 프라이머는 길이가 바람직하게는, 22 내지 30개 뉴클레오타이드이며, GC 함량은 50% 이상이고, 약 68℃ 내지 72℃의 온도에서 표적 서열에 어닐링한다. 증폭된 영역은 상기된 바와 같이 서열 분석할 수 있으며 중복 서열은 연속 서열내로 집합시킬 수 있다.
이와 같은 한 가지 증폭 기술은 제한 효소를 사용하여 유전자의 공지 영역내 단편을 생성하는 역 PCR[참조: Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988]이다. 그런 다음, 단편을 분자내 연결에 의해 폐환하고 공지 영역으로부터 유도된 분기하는 프라이머와 함께 PCR을 위한 주형으로서 사용한다. 대안으로서, 부분 서열에 인접한 서열은 링커 서열의 프라이머 및 공지 영역에 특이적인 프라이머로 증폭시켜 복구할 수 있다. 증폭된 서열은 전형적으로 동일한 링커 프라이머 및 공지 영역에 특이적인 제2 프라이머로 2회 증폭시킨다. 공지 서열로부터 반대 방향으로 연장을 개시하는 두 프라이머를 사용하는 이 절차에 대한 변형은 WO 제96/38591호에 기술되어 있다. 이와 같은 다른 기술은 "cDNA 말단의 급속 증폭" 또는 RACE로서 알려져 있다. 이 기술은 폴리A 영역 또는 벡터 서열과 하이브리드화하는 내부 프라이머 및 외부 프라이머를 사용하여 공지 서열의 5' 및 3'인 서열을 동정하는 것을 포함한다. 추가의 기술은 포획 PCR[Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991] 및 워킹 PCR[Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991]을 포함한다. 또한, 증폭을 이용하는 다른 방법을 사용하여 전체 길이 cDNA 서열을 수득할 수 있다.
특정 예로서, 진뱅크로부터 입수할 수 있는 것과 같이 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스에서 제공된 서열을 분석하여 전체 길이 cDNA 서열을 수득할 수 있다. 중복 EST에 대한 조사는 일반적으로 잘 공지된 프로그램(예, NCBI BLAST 조사)을 사용하여 수행할 수 있으며, 이러한 EST를 사용하여 연속적인 전체 길이 서열을 생성할 수 있다. 또한, 전체 길이 DNA 서열은 게놈 단편을 분석하여 수득할 수 있다.
숙주 세포에서의 폴리뉴클레오타이드 발현
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 융합 단백질 또는 이의 작용성 균등물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편을 재조합 DNA 분자에 사용하여 적절한 숙주 세포에서 폴리펩타이드의 발현을 유도할 수 있다. 유전자 암호의 고유 축퇴성으로 인해, 동일하거나 작용상 균등한 아미노산 서열을 실질적으로 암호화하는 다른 DNA 서열을 제조하고 이들 서열을 사용하여 클로닝하고 주어진 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다.
당업자에 의해 이해될 수 있는 바와 같이, 일부 경우에 있어서는 비천연 코돈을 갖는 폴리펩타이드-암호화 뉴클레오타이드 서열을 생성하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 특정 원핵 또는 진핵 숙주에 의해 바람직한 코돈을 선택하여 단백질의 발현 속도를 증가시키거나 천연 서열로부터 생성된 전사물의 반감기보다 더욱 긴 반감기와 같이 원하는 특성을 갖는 재조합 RNA 전사물을 생성할 수 있다.
게다가, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 당해 분야에 공지된 방법에 의해 유전공학적으로 조작하여 이들로 한정되는 것은 아니지만, 유전자 산물의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을 변형시킨 변이를 포함하여 여러 가지 유형으로 폴리펩타이드 암호화 서열을 변이시킬 수 있다. 예를 들면, 랜덤 단편화 및 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오타이드의 PCR 조합에 의한 DNA 셔플링을 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 유전공학적으로 조작할 수 있다. 또한, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 새로운 제한 부위를 삽입하거나, 당화 패턴을 변형시키거나, 코돈 선호도를 변화시키거나, 스플라이스 변이체를 생성하거나, 돌연변이를 도입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 천연, 변형된 또는 재조합 핵산 서열은 융합 단백질을 암호화하는 이종 서열에 연결시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드의 활성의 억제제를 위한 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해 시판되고 있는 항체에 의해 인지될 수 있는 키메라 단백질을 암호화하는데 유용할 수 있다. 융합 단백질은 또한, 폴리펩타이드-암호화 서열과 이종 단백질 서열 사이에 위치하는 절단 부위를 함유하도록 유전공학적으로 조작할 수 있으며, 이에 따라 폴리펩타이드를 이종 잔기로부터 절단하고 정제할 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 전체적으로 또는 부분적으로 당해 분야에 잘 공지된 화학 방법을 사용하여 합성할 수 있다[참조: Caruthers, M.H. et al., (1980) Nucl. Acids. Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids. Res. Symp. Ser. 225-232]. 대안으로서, 화학적 방법을 사용하여 폴리펩타이드의 아미노산 서열 또는 이의 일부분을 합성함으로써 단백질 자체를 생성할 수 있다. 예를 들면, 여러 고체상 기술[Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204]을 사용하여 펩타이드 합성을 실시할 수 있으며, 또한 예를 들면 ABI 431A 펩타이드 합성기(제조원: Perkin Elmer, 캘리포니아 팔로 알토 소재)를 사용하여 자동 합성을 수행할 수 있다.
새로 합성된 펩타이드는 예비 고성능 액체 크로마토그래피[예를 들면, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.] 또는 당해 분야에 이용되고 있는 다른 유사한기술에 의해 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열 분석(예, 에드만 분해 절차)에 의해 검증할 수 있다. 추가로, 폴리펩타이드 또는 이의 일부분의 아미노산 서열은 직접적인 합성 동안에 변형시키고/시키거나 화학적 방법을 사용하여 다른 단백질 또는 이의 일부분으로부터의 서열과 결합시켜 변이체 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 발현하기 위해, 이 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 작용성 균등물을 적절한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 요소를 함유하는 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 당업자에게 잘 알려져 있는 방법을 사용하여 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 및 적절한 전사 및 해독 조절 서열을 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 이러한 기술은 문헌[Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F. M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기술되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하는데는 다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 사용할 수 있다. 이들 시스템으로는 이로써 한정되는 것은 아니지만, 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균과 같은 미생물, 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모, 바이러스 발현 벡터(예, 바큘로바이러스)로 감염된 곤충 세포 시스템, 바이러스 발현 벡터(예, 꽃양배추 모자이크 바이러스(CaMV) 및 담배 모자이크 바이러스(TMV)) 또는 세균 발현 벡터(예, Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질전환된 식물 세포 시스템 또는 동물 세포 시스템을 포함한다.
발현 벡터에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 숙주 세포 단백질과 상호작용하여 전사 및 해독을 수행하는 벡터의 비해독 영역-인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비해독 영역이다. 이러한 요소는 세기 및 특이성에 있어서 다양할 수 있다. 사용된 벡터 시스템 및 숙주에 따라 구성성 및 유도성 프로모터를 포함하여 많은 적합한 전사 및 해독 요소를 사용할 수 있다. 예를 들면, 세균 시스템에서 클로닝할 때, PBLUESCRIPT 파아지미드(제조원: Stratagene, 캘리포니아 라 졸라 소재) 또는 PSPORT1 플라스미드(제조원: Gibco BRL, 매릴랜드 게이더스버그 소재)의 하이브리드 lacZ 프로모터와 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 시스템에서는 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 만일 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 다수 복제물을 함유하는 세포주를 생성하는 것이 필요하다면 SV40 또는 EBV 계통의 벡터를 적절한 선별 마커와 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다.
세균 시스템의 경우, 많은 발현 벡터가 발현된 폴리펩타이드의 의도된 용도에 따라 선택될 수 있다. 예를 들면, 많은 양이 필요한 경우, 예를 들면 항체를 유도하는 경우, 쉽게 정제되는 융합 단백질의 높은 수준 발현을 유도하는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 다기능성 이. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들면 BLUESCRIPT(제조원: Stratagene)(해당 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 베타-갈락토시다제의 아미노-말단 Met 및 7개의 후속 잔기에 대한 서열과 벡터내로 하이브리드 단백질이 생성되도록 프레임내에 맞게 연결될 수 있다), pIN 벡터[Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509] 등을 포함한다. pGEX 벡터(제조원: Promega, 위스콘신 매디슨 소재)가 또한 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)를 함유한 융합단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현하는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 용해성이며 용해된 세포로부터 글루타티온-아가로즈 비드에 흡착한 후 유리 글루타티온의 존재하에 용출시켜 쉽게 정제할 수 있다. 이러한 시스템에서 만든 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인할 수 있으며, 이에 따라 클로닝된 해당 폴리펩타이드는 GST 잔기로부터 원하는데로 유리시킬 수 있다.
효모 사카로마이세스 세레비지애에서 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유한 많은 벡터를 사용할 수 있다[참조: 상기 Ausubel 등 및 Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544].
식물 발현 벡터를 사용하는 경우, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현은 많은 프로모터에 의해 구동될 수 있다. 예를 들면, CaMV의 35S 및 19S 프로모터와 같은 바이러스 프로모터를 단독으로 사용하거나 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 조합하여 사용할 수 있다[Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311]. 대안으로서, RUBISCO의 작은 아단위와 같은 식물 프로모터 또는 열 쇼크 프로모터를 사용할 수 있다[Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984)Science 224:838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17:85-105]. 이들 작제물은 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체-매개된 형질감염에 의해 식물 세포내로 도입할 수 있다. 이러한 기술은 많은 문헌에 기술되어 있다[참조: Hobbs, S. or Murry, L. E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y., pp. 191-196].
또한, 해당 폴리펩타이드를 발현시키기 위해 곤충 시스템을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이러한 한 가지 시스템으로서, 오토그라파 캘리포니카 핵 폴리헤드론형성 바이러스(AcNPV)가 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로서 사용된다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 폴리헤드린 유전자와 같은 바이러스의 비필수 영역내로 클로닝하고 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 배치할 수 있다. 폴리펩타이드-암호화 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성으로 만들고 피복 단백질이 결여된 재조합 바이러스를 생성할 수 있다. 이어서, 재조합 바이러스를 사용하여 예를 들면, 에스. 프루기페르다 세포 또는 트리코플루시아 유충에 감염시킴으로써 해당 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다 [Engelhard, E. K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227].
포유동물 숙주 세포의 경우 많은 바이러스-계통 발현 시스템이 일반적으로 이용되고 있다. 예를 들면, 아데노바이러스가 발현 벡터로서 사용되는 경우, 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 후기 프로모터 및 삼분(tripartite) 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/해독 복합체내로 연결시킬 수 있다. 바이러스게놈의 비필수적인 E1 또는 E3 영역내로의 삽입을 이용하여 감염된 숙주에서 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생존 바이러스를 수득할 수 있다[Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659]. 또한, 라우스 육종 바이러스(RSV)와 같은 전사 인핸서를 사용하여 포유동물 숙주 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.
또한, 특정 개시 시그날을 사용하여 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 보다 효율적인 해독을 달성할 수 있다. 이러한 신호로는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열을 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 개시 코돈 및 상류 서열이 적절한 발현 벡터내로 삽입되는 경우, 어떠한 추가의 전사 또는 해독 조절 신호도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 단지 암호화 서열 또는 이의 일부분이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 조절 시그날이 제공되어야 한다. 게다가, 개시 코돈은 완전한 삽입체의 해독을 보장할 수 있도록 정확한 판독 프레임에 위치하여야 한다. 외인성 해독 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성을 포함하여 여러 기원으로 유래될 수 있다. 발현 효율은 문헌[Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162]에 기술된 것과 같이 사용되는 특정 세포 시스템에 대해 적절한 인핸서의 삽입에 의해 증강될 수 있다.
또한, 숙주 세포 균주를 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 원하는 양상으로 발현된 단백질을 프로세싱하는 능력에 대해 선택할 수 있다. 폴리펩타이드의 그러한 변형으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 아세틸화, 카복실화, 당화, 인산화, 지질화 및 아실화가 포함된다. 단백질의 "프리프로" 형태를 절단하는 해독후프로세싱을 또한 사용하여 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진할 수 있다. 이러한 해독후 활성에 대한 특이적 세포 도구 및 특징적인 기작을 갖는 CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38과 같은 상이한 숙주 세포를 선택하여 외래 단백질의 정확한 변형 및 프로세싱을 보장할 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 고수율로 생성하기 위해, 일반적으로 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들면, 해당 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 발현하는 세포주를 동일한 또는 별도의 벡터에 바이러스 복제 오리진 및/또는 내인성 발현 요소 및 선별 마커 유전자를 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포는 선별 배지로 옮기기 전에 증식 배지에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 둘 수 있다. 선별 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 제공하는데 있으며 이의 존재는 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수를 가능케 한다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 콜로니는 세포 유형에 적절한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
형질전환된 세포주를 회수하기 위해 많은 선별 시스템을 사용할 수 있다. 이들 시스템으로는 이로써 한정하는 것은 아니지만 tk.sup.- 또는 aprt.sup.- 세포에 각각 사용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23] 유전자가 포함된다. 또한, 항대사물, 항생물질 또는 제초제 내성이 선별을 위한 근간으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci.77:3567-70], 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대해 내성을 제공하는 npt[Colbere-Garapin, F. et al (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14] 및 클로르설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 각각 내성을 제공하는 als 또는 pat[상기 Murry]가 포함된다. 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용하도록 하는 trpB 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용하도록 하는 hisD와 같은 추가의 선별 유전자가 공지되어 있다[Hartman, S. C. and R. C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51]. 최근에, 가시적인 마커가 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS 및 루시퍼라제 및 이의 기질 루시페린과 같은 마커와 함께 유행적으로 이용되고 있으며 이들은 형질전환체를 동정하는데 뿐만 아니라 특정 벡터 시스템으로 인한 일시적이거나 안정한 단백질 발현의 양을 정량하는데 널리 이용되고 있다[Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131].
비록 마커 유전자 발현의 유무가 해당 유전자가 또한 존재한다는 것을 제시할지라도, 그의 존재 및 발현은 검증될 필요가 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열이 마커 유전자 서열내에 삽입된다면, 서열을 함유하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재에 의해 동정될 수 있다. 대안으로서, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드-암호화 서열과 직렬로 설정될 수 있다. 유도 또는 선별에 반응한 마커 유전자의 발현은 보통 직렬 유전자의 발현을 또한 지시한다.
대안으로서, 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 공지된 다양한 절차에 의해 동정할 수 있다. 이들 절차로는 이로써 한정되는 것은 아니지만, DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생검정 또는 면역검정 기술(핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량을 위한 막, 용액 또는 칩-근간 기술을 포함함)이 포함된다.
생성물에 대해 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여 폴리뉴클레오타이드-암호화된 생성물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 여러 프로토콜이 당해 분야에 알려져 있다. 이의 예로는 효소-연결된 면역흡착 검정(ELISA), 방사능면역검정(RIA) 및 형광물질 활성화된 세포 분류(FACS)가 포함된다. 주어진 폴리펩타이드상의 두 가지 비-간섭 에피토프와 반응하는 모노클로날 항체를 사용하는 두 가지-부위 모노클로날-기본 면역검정이 일부 적용에서 바람직할 수 있으나 경쟁적 결합 검정이 또한 사용될 수 있다. 이들 및 기타 검정이 문헌[Hampton, R. et al., 1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn 및 Maddox, D. E. et al., 1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216]에 기술되어 있다.
다양한 표지 및 결합 기술이 당업자에게 공지되어 있으며 여러 핵산 및 아미노산 검정에서 사용될 수 있다. 표지된 하이브리드화를 생성하기 위한 수단 또는 폴리뉴클레오타이드와 연관된 서열을 검출하기 위한 PCR 탐침은 올리고표지, 닉 해독, 말단-표지 또는 표지된 뉴클레오타이드를 이용하는 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로서, 서열 또는 이의 일부분을 mRNA 탐침의 생성을 위해 벡터내로 클로닝할 수 있다. 이러한 벡터는 당해 분야에 알려져 있고 시판되고 있으며, 이들을 사용하여 T7, T3 또는 SP6과 같은 적절한 RNA 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오타이드의 부가에 의해 시험관내에서 RNA 탐침을 합성할 수 있다. 이들 절차는 다양한 시판키트를 사용하여 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 리포터 분자 또는 표지로는 방사성핵종, 효소, 형광물질, 화학발광물질 또는 발색제뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자석입자 등이 포함된다.
해당 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 단백질의 발현 및 세포 배양물로부터 단백질의 회수에 적합한 조건하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라 분비되거나 세포내에 함유될 수 있다. 당업자가 이해할 수 있듯이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 원핵 또는 진핵 세포막을 통해 암호화된 폴리펩타이드의 분지를 유도하는 신호 서열을 함유하도록 디자인할 수 있다. 해당 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 가용성 단백질의 정제를 촉진하는 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 연결시키기 위해 다른 재조합 작제물을 사용할 수 있다. 이러한 정제 촉진 도메인으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 고정된 금속에서 정제를 가능케 하는 히스티딘-트립토판 모듈과 같은 금속 킬레이트화 펩타이드, 고정된 면역글로불린에서 정제를 가능케 하는 프로테인 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화성 정제 시스템(제조원: Immunex Corp., 워싱턴 시애틀 소재)에 사용되는 도메인이 포함된다. 정제 도메인과 암호화된 폴리펩타이드 사이에 인자 XA 또는 엔테로키나제(제조원: Invitrogen, 캘리포니아 샌 디에고 소재)에 대해 특이적인 것과 같은 절단성 링커 서열의 삽입이 정제를 촉진하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 한 가지 발현 벡터가 해당 폴리펩타이드와 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위 앞에 6개의 히스티딘 잔기를 암호화하는 핵산을 함유한 융합 단백질의 발현을 위해 제공된다. 히스티딘 잔기는 문헌[Porath, J. et al., 1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281]에 기술된 바와 같이 IMIAC(고정된 금속 이온 친화성 크로마토그래피)에서의 정제를 촉진하는 한편, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 목적하는 폴리펩타이드를 정제하는 수단을 제공한다. 융합 단백질을 함유하는 벡터는 문헌[Kroll, D. J., et al., 1993, DNA Cell Biol. 12:441-453]에 기술되어 있다.
재조합 제조 방법 이외에, 본 발명의 폴리펩타이드 및 이의 단편은 고체상 기술[Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154]을 사용하는 직접적인 펩타이드 합성에 의해 제조할 수 있다. 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 실시될 수 있다. 자동화 합성은 예를 들면 어플라이드 바이오시스템스 431A 펩타이드 합성기(제조원: Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다. 대안으로서, 화학적 합성을 사용하여 여러 단편을 화학적으로 별도로 합성하고 결합시켜 전체 길이의 분자를 제조할 수 있다.
부위-특이적인 돌연변이유발
부위-특이적인 돌연변이유발은 개개의 펩타이드 또는 생물학적 기능성의 균등 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 특정 돌연변이유발을 통해 그들 펩타이드의 제조에 유용한 기술이다. 당업자에게 잘 공지된 이 기술은 또한 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 DNA 도입함으로써 서열 변이체를 제조하고 시험하는 간편한 능력(예, 상기 고려 사항중 하나 이상을 결합)을 제공한다.부위-특이적인 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 서열 뿐만 아니라 충분한 수의 인접한 뉴클레오타이드의 사용을 통해 돌연변이체의 제조를 가능케 하여 결실 교차점의 양쪽상에 안정한 이중나선을 형성하기에 충분한 크기 및 서열 복합성의 프라이머 서열을 제공한다. 돌연변이는 폴리뉴클레오타이드 자체의 특성을 개선, 변이, 감소, 변형 또는 변화시키기 위해 및/또는 암호화된 폴리펩타이드의 특성, 활성, 조성, 안정성 또는 일차 서열을 변형시키기 위해 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 사용될 수 있다.
본 발명의 특정 양태로서, 본 발명자들은 폴리펩타이드 백신의 항원성과 같이 암호화된 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성에 변화를 주기 위해 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이유발을 고려하고 있다. 부위-특이적인 돌연부위유발 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드의 변이체를 생성하기 위해 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 부위-특이적인 돌연변이유발은 흔히 DNA 분자의 특정 부분을 변이시키기 위해 사용된다. 이러한 양태로서, 전형적으로 약 14 내지 약 25개의 뉴클레오타이드를 포함하는 프라이머가 사용되며 서열 교차점의 양쪽에 약 5 내지 약 10개의 잔기가 변형된다.
당업자에 의해 잘 알려져 있듯이, 부위-특이적인 돌연변이유발 기술은 흔히 일본쇄 및 이본쇄 형태 둘 다로 존재하는 파아지 벡터를 사용한다. 부위-특이적인 돌연변이유발에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이들 파아지는 시판되고 있는 것을 쉽게 구입할 수 있으며 이들의 사용은 일반적으로 당업자에게 잘 알려져 있다. 이본쇄 플라스미드가 또한 부위-특이적인 돌연변이유발에 통상적으로 사용되며, 이 경우 해당 유전자를 플라스미드로부터 파아지로 전이시키는 단계가 배제된다.
일반적으로, 본 발명에서 부위-특이적인 돌연변이유발은 우선 목적하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 내재하는 일본쇄 벡터를 수득하거나 이본쇄 벡터의 두 쇄을 용융시켜 분리시킨다. 목적하는 돌연변이된 서열을 함유한 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 합성에 의해 제조된다. 이어서, 이 프라이머는 흔히 일본쇄 벡터와 어닐링되고 돌연변이-함유 쇄의 합성을 완성하기 위해 이. 콜라이 폴리머라제 I 클레나우 단편과 같은 DNA 중합 효소에 적용된다. 따라서, 하나의 쇄는 본래 비변형된 서열을 암호화하고 다른 쇄는 목적하는 돌연변이를 함유하는 이종이중나선이 형성된다. 그런 다음, 이러한 이종이중나선을 사용하여 이. 콜라이 세포와 같은 적절한 세포를 형질전환시키고 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.
부위-특이적인 돌연변이유발을 사용하여 선택된 펩타이드-암호화 DNA 단편의 서열 변이체를 제조하는 것은 잠재적으로 유용한 종을 제조하는 수단을 제공하며 펩타이드의 서열 변이체 및 이들을 암호화하는 DNA 서열을 수득할 수 있는 다른 방법들이 있음에 따라 그들로 한정하는 것으로 해석되는 것이 아니다. 예를 들면, 목적하는 펩타이드 서열을 암호화하는 재조합 벡터를 하이드록실아민과 같은 돌연변이유발제로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이들 방법 및 프로토콜에 관한 자세한 것은 문헌[Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; and Maniatis et al., 1982]에 교시되어 있으며 이들 문헌의 각내용은 본원 명세서에 참고로 원용된다.
본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드 부위-특이적인 돌연변이유발 절차"는 특정 핵산 분자의 농도가 이의 초기 농도에 비해 증가하거나 증폭과 같이 검출 시그날의 농도가 증가하는 결과를 제공하는 주형-의존 과정 및 벡터-매개된 증식을 가리킨다. 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오타이드 부위-특이적인 돌연변이유발 절차"는 프라이머 분자의 주형-의존 신장을 포함하는 과정을 가리킨다. 용어 "주형 의존 과정"은 새로 합성된 핵산 쇄의 서열이 상보 염기 쌍의 잘 공지된 규칙[참조: Watson, 1987]에 따라 규정되어 있는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성을 가리킨다. 전형적으로, 벡터 매개된 방법은 DNA 또는 RNA 벡터내로 핵산 단편의 도입, 벡터의 클론 증폭 및 증폭된 핵산 단편의 회수를 포함한다. 이러한 방법의 예는 미국 특허 제4,237,224호에 기술되어 있으며 이의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다.
폴리뉴클레오타이드 증폭 기술
샘플중에 존재하는 해당 표적 서열을 증폭시키기 위해 많은 주형 의존 과정이 이용되고 있다. 가장 잘 공지된 증폭 방법 가운데 하나는 미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호에 상세히 기술되어 있는 중합효소 연쇄 반응(PCRTM)이며, 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다. PCRTM을 요약하면, 표적 서열의 상반되는 상보쇄의 영역에 대해 상보적인 두 개의 프라이머 서열을 제조한다. DNA 중합효소(예, Taq 중합효소)와 함께 반응 혼합물에 과량의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 첨가한다. 표적 서열이 샘플중에 존재하는 경우, 프라이머가 표적에 결합하고 중합효소는 프라이머가 표적 서열을 따라 뉴클레오타이드가 부가되면서 연장되도록 한다. 반응 혼합물의 온도를 올렸다 내렸다 함으로써 연장된 프라이머는 표적으로부터 해리되어 반응 산물을 형성하고, 과다한 프라이머는 표적 및 반응 산물에 결합하며 이 과정을 반복한다. 증폭된 mRNA의 양을 정량하기 위하여 바람직하게는 역전사 및 PCRTM증폭 절차를 실시할 수 있다. 중합효소 연쇄 반응 방법은 당해 분야에 잘 알려져 있다.
다른 증폭 방법은 유럽특허공고 제320,308호에 기술되어 있는 리가제 연쇄 반응(LCR)이며, 상기 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다. LCR에서는 두 개의 상보적인 탐침 쌍을 제조하고 표적 서열의 존재하에 각 쌍을 표적의 상보쇄에 이들이 접하도록 결합시킨다. 리가제의 존재하에, 두 탐침 쌍이 연결되어 단일 유니트를 형성한다. PCRTM에서와 같이 온도 주기에 의해 결합된 연결 유니트는 표적으로부터 해리되고 이어서 과다한 탐침 쌍의 연결을 위한 "표적 서열"로 작용한다. 미국 특허 제4,883,750호에는 표적 서열에 탐침 쌍을 결합하기 위한 것으로 LCR과 유사한 다른 증폭 방법이 기술되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다.
PCT/US87/00880에 기술되어 있는 Qbeta 레플리카제가 또한, 본 발명에서 또 다른 증폭 방법으로서 사용될 수 있다. 상기 특허원의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 이 방법에 따르면, 표적 서열에 상보적인 영역을 갖는 RNA의 복제 서열이 RNA 폴리머라제의 존재하에 샘플에 첨가된다. 폴리머라제는 서열을 복제하며 이후 그 복제 서열은 검출될 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제 및 리가제가 제한 부위의 한쪽 쇄에 뉴클레오타이드 5'-[α-티오]트리포스페이트를 함유하는 표적 분자의 증폭을 달성하기 위해 사용되는 등온 증폭 방법[전체 내용이 본원에 참고로 원용되는 Walker 등, 1992]이 또한 본 발명에서 핵산을 증폭하는데 유용할 수 있다.
쇄 치환 증폭(SDA)는 쇄 치환 및 합성(즉, 닉 해독)의 많은 반복을 포함하는 핵산의 등온 증폭을 실시하는 다른 방법이다. 복원 연쇄 반응(RCR)이라고 하는 유사한 방법이 본 발명에서 유용할 수 있는 또 다른 증폭 방법이며 증폭을 위해 표적화된 영역을 통해 수 개의 탐침을 어닐링한 후 4개 염기중 단지 두 개가 존재하는 복원 반응을 실시하는 것을 포함한다. 다른 두 개 염기는 간단한 검출을 위해 바이오티닐화 유도체로서 첨가될 수 있다. 유사한 방법이 SDA에서 사용된다.
또한, 서열은 사이클릭 탐침 반응(CPR)을 사용하여 검출할 수 있다. CPR에 따르면, 비표적 DNA의 3' 및 5' 서열 및 표적 단백질 특이적 RNA의 내부 또는 "중간" 서열을 갖는 탐침을 샘플중에 존재하는 DNA와 하이브리드화시킨다. 하이브리드화시 반응물을 RNAase H로 처리하고 탐침의 생성물이 분해 후 발산되는 시그날을 발생함으로써 구분되는 산물로서 동정된다. 최초 주형은 다른 주기 탐침에 어닐링시키고 반응을 반복한다. 따라서, CPR은 표적 유전자 특이적 발현된 핵산에 대한 탐침의 하이브리드화에 의해 발생된 시그날을 증폭하는 것을 포함한다.
영국 특허원 제2 202 328호 및 PCT/US89/01025에 기술되어 있는 다른 증폭 방법이 본 발명에서 사용될 수 있으며, 이들 특허의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다. 영국 특허 제2 202 328호에 따르면, "변형된" 프라이머가 PCR-유사 주형 및 효소 의존 합성에 사용된다. 프라이머는 포획 잔기(예, 바이오틴) 및/또는 검출 잔기(예, 효소)로 표지시켜 변형시킬 수 있다. PCT/US89/01025에 따르면, 과량의 표지된 탐침이 샘플에 첨가된다. 표적 서열의 존재하에 탐침이 촉매적으로 결합하고 분리된다. 분리 후 표적 서열은 완전하게 분리되어 과량의 탐침과 결합된다. 표지된 탐침의 분리는 표적 서열의 존재를 신호로 발생한다.
다른 핵산 증폭 절차는 핵산 서열 기본 증폭(NASBA) 및 3SR을 포함하여 전사-기본 증폭 시스템(TAS)[Kwoh 등, 1989; WO 제88/10315호, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다]을 포함한다. NASBA에 따르면, 핵산은 증폭을 위해 표준 페놀/클로로포름 추출, 샘플의 열 변성, 용해 완충액으로 처리 및 DNA 및 RNA의 분리를 위한 미니스핀 컬럼 또는 RNA의 구아니디늄 클로라이드 추출에 의해 제조할 수 있다. 이들 증폭 기술은 표적 서열에 특이적인 서열을 갖는 프라이머를 어닐링하는 것을 포함한다. 중합 후, DNA/RNA 하이브리드를 RNase H로 분해시키는 한편 이본쇄 DNA 분자는 다시 열 변성시킨다. 어느 경우든, 일본쇄 DNA는 제2의 표적-특이적 프라이머를 첨가한 후 중합하여 완전히 이본쇄로 만든다. 이어서, 이본쇄 DNA 분자를 T7 또는 SP6과 같은 중합효소에 의해 증폭 전사된다. 등온 사이클릭 반응에 따르면, RNA는 DNA로 역전사되고 T7 또는 SP6과 같은 폴리머라제로 한번 더 전사된다. 생성된 산물이 절단된 것이든 완전한 것이든 표적-특이적 서열을 가리킨다.
유럽특허공보 제329,822호에는 본 발명에서 사용할 수 있는 일본쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 주기적으로 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법이 기술되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다. ssRNA는 역전사효소(RNA-의존 DNA 중합효소)에 의해 신장되는 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드에 대한 제1 주형이다. 이어서, RNA는 리보뉴클레아제 H(RNase H, DNA 또는 RNA와의 이중나선에서 RNA에 대해 특이적인 RNase)에 의해 생성된 DNA:RNA 이중나선으로부터 제거된다. 생성된 ssDNA는 주형의 상동성에 5'으로 RNA 중합효소 프로모터(T7 RNA 중합효소로 예시됨)의 서열을 포함하는 제2 프라이머에 대한 제2 주형이다. 그런 다음, 이 프라이머는 DNA 폴리머라제(이. 콜라이 DNA 중합효소 I의 큰 "클레나우" 단편으로 예시됨)에 의해 연장되어 프라이머 사이에 최초 RNA의 서열과 동일한 서열을 갖고 추가로 한쪽 말단에 프로모터 서열을 갖는 이본쇄 DNA("dsDNA") 분자를 생성한다. 이 프로모터 서열은 적절한 RNA 중합효소에 의해 DNA의 많은 RNA 복제물을 생성하는데 사용할 수 있다. 이들 복제물은 이후 매우 신속한 증폭을 초래하는 주기로 재진입될 수 있다. 효소의 적절한 선택으로, 이 증폭은 매 주기에서 효소를 첨가하지 않으면서 등온적으로 실시할 수 있다. 이 공정의 주기 성질로 인해 출발 서열은 DNA 또는 RNA의 형태인 것으로 선택할 수 있다.
WO 제89/06700호에는 표적 일본쇄 DNA(ssDNA)에 프로모터/프라이머 서열의 하이브리드화에 이어서 서열의 많은 RNA 복제물의 전사를 기초로 하여 핵산 서열증폭 방법이 기술되어 있으며, 상기 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 이 방법은 주기적인 방식이 아니다. 즉, 새로운 주형이 생성된 RNA 전사물로부터 생성되지 않는다. 다른 증폭 방법으로 당업자에게 잘 공지된 "RACE"[Frohman, 1990] 및 "일방적 PCR"[Ohara, 1989]이 포함된다.
생성된 "디-올리고뉴클레오타이드"의 서열을 갖는 핵산의 존재하에 두 개 이상의 올리고뉴클레오타이드의 연결하고 이로써 디-올리고뉴클레오타이드를 증폭하는 것을 기초로 하는 방법[Wu and Dean, 1996, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 원용된다]이 또한 본 발명의 DNA 서열의 증폭에 사용될 수 있다.
생물학적 기능 균등물
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조는 변이 및 변형시키고 원하는 특성을 갖는 폴리펩타이드를 암호화하는 작용성 분자를 수득할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 하나 이상의 돌연변이를 특정 폴리뉴클레오타이드 서열내로 도입하는 것이 흔히 바람직할 수 있다. 특정 상황에서 생성된 암호화된 폴리펩타이드 서열이 그러한 돌연변이에 의해 변형되거나, 다른 경우로서 폴리펩타이드의 서열은 암호화 폴리뉴클레오타이드에서의 하나 이상의 돌연변이에 의해 변하지 않는다.
폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변이시켜 균등물 또는 보다 개선된 제2-발생 분자를 생성하는 것이 바람직할 경우, 아미노산 변화는 표 1에 따른 암호화 DNA 서열의 코돈 하나 이상을 변화시킴으로써 달성할 수 있다.
예를 들면, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자상의 결합 부위와 같은 구조와의 상호작용 결합능이 감지할 정도로 상실되지 않고서 특정 아미노산을 단백질 구조에서 다른 아미노산으로 치환시킬 수 있다. 단백질의 생물학적 작용 활성을 규정하는 것은 단백질의 상호작용 성능 및 성질에 있기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환이 단백질 서열 및 물론 이의 기초가 되는 DNA 암호화 서열에서 이루어질 수 있으며 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 제공한다. 이에 따라 본 발명자들은 기술된 조성물의 펩타이드 서열 및 이를 암호화하는 DNA 서열에서 생물학적 이용성 또는 활성이 감지될 정도로 손실되지 않으면서 여러 변화가 이루어질 수 있음을 고려하고 있다.
이러한 변화를 수행함에 있어서, 아미노산의 수친화도 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 기능을 부여함에 있어서 수친화성 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당해 분야에서 이해되고 있다[Kyte and Doolittle, 1982, 이의 내용은 본원에 참고로 원용된다]. 아미노산의 상대적인 수화성 특성은 생성된 단백질의 이차 구조에 기인하는 것으로 받아들여지고 있으며 그러한 이차 구조는 그 단백질의 다른 분자(예, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등)와의 상호작용을 규정한다. 각 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특징을 근거로 하여 수성향 지수가 부여되어 있다[Kyte and Doolittle, 1982]. 이들 값은 다음과 같다: 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산은 유사한 수친화성 지수 및 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 그 결과로서 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질이 생성되고, 즉 생물학적 기능상 균등한 단백질이 수득된다는 것은 당해 분야에 알려져 있다. 이러한 변화를 수행함에 있어서, 수친화성 지수가 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하고, 특히 바람직하게는 ±1 이내이며, 훨씬 더 바람직하게는 ±0.5 이내이다. 또한, 유사한 아미노산의 치환은 친수성을 기초로 하여 효과적으로 달성될 수 있음이 당해 분야에서 이해되고 있다. 미국 특허 제4,554,101호(이의 내용 전체는 참조로 본원에 구체적으로 원용함)에는 인접한 아미노산의 친수성에 의해 통제받는 바와 같이 단백질의 가장 큰 국부 평균 친수성이 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있는 것으로 기술되어 있다.
미국 특허 제4,554,101호에 기술되어 있는 바와 같이, 각 아미노산 잔기의 친수성 값은 다음과 같다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+0.3); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신 (0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있으며, 그 결과로 생물학적으로 균등한 단백질, 특히 면역학적으로 균등한 단백질을 얻을 수 있는 것으로 이해되고 있다. 이러한 변화에 있어서, 친수성 값이 ±2 이내인 아미노산의 치환이 바람직하며, 특히 바람직하게는 ±1 이내이고, 훨씬 더 바람직하게는 ±0.5 이내이다.
상기한 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들면 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등을 기준으로 하고 있고. 상기 특성을 고려해 볼 수 있는 예시적인 치환은 당업자에게 잘 공지되어 있으며, 아르기닌과 라이신, 글루타메이트와 아스파테이트, 세린과 트레오닌, 글루타민과 아스파라긴 및 발린, 루이신과 이소루이신을 포함한다.
또한, 어떠한 폴리펩타이드도 추가로 변형시켜 생체내에서의 안정성을 높일 수 있다. 가능한 변형으로는 이로써 한정되는 것은 아니지만, 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹 서열의 부가, 골격에서 포스포디에스터라제 연결이라기 보다는 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용 및/또는 이노신, 쿠에오신(queosine) 및 와이부토신(wybutosine)과 같은 비고전적 염기뿐만 아니라 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 다른 변형된 형태의 삽입이 포함된다.
생체내 폴리뉴클레오타이드 전달 기술
추가의 양태로서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드중 하나 이상을 포함하는 유전자 작제물은 생체내 세포내로 도입된다. 이것은 공지된 여러 방법에 의해 달성될 수 있으며, 수가지 방법이 예시 목적상 아래에 기술되어 있다.
1. 아데노바이러스
하나 이상의 핵산 서열의 생체내 전달을 위해 바람직한 방법중 하나는 아데노바이러스 발현 벡터의 사용을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지지하고 (b) 센스 또는 안티센스 방향으로 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유한 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 물론, 안티센스 작제물에서, 발현은 유전자 산물의 합성을 필요로 하지 않는다.
발현 벡터는 아데노바이러스의 유전공학적으로 조작된 형태를 포함한다. 아데노바이러스의 유전자 구성(36 kb 선형 이본쇄 DNA 바이러스)에 대한 지식으로 인해 아데노바이러스 DNA의 큰 단편을 7 kb까지의 외래 서열로 치환하는 것이 가능하다[Grunhaus and Horwitz, 1992]. 레트로바이러스와 대조적으로, 숙주 세포의 아데노바이러스 감염은 아데노바이러스가 잠재적인 유전자독성없이 에피좀 방식으로 복제할 수 있기 때문에 염색체 통합을 초래하지 않는다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하며 광대한 증폭 후에 게놈 재배열은 전혀 검출되지 않는다. 아데노바이러스는 모든 내피 세포를 이들의 세포 주기 단계에 상관없이 실질적으로 감염시킬 수 있다. 지금까지 아데노바이러스 감염은 사람에게서 급성 호흡 질환과 같은 경미한 질환에만 연관되어 있는 듯이 보인다.
아데노바이러스는 이의 중간 크기 게놈, 조작의 편리, 높은 역가, 넓은 표적-세포 범위 및 높은 감염성 때문에 유전자 전달 벡터로서 사용하기에 특히 적합하다. 바이러스 게놈의 양 말단은 바이러스 DNA 복제 및 패키징에 필요한 cis 요소인 100 내지 200개 염기쌍 역방향반복서열(ITR)을 함유한다. 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스 DNA 복제의 개시에 의해 분류되는 상이한 전사 단위를 함유한다. E1 영역(E1A 및 E1B)는 바이러스 게놈과 소수 세포 유전자의 전사를 조절하는 역할을 하는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)의 발현은 바이러스 DNA 복제에 대한 단백질의 합성을 초래한다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단에 연루되어 있다[Renan, 1990]. 바이러스 캡시드 단백질의 주요부를 포함하는 후기 유전자의 생성물은 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 생성되는 단일 일차 전사물의 중요한 프로세싱 후에만 발현된다. MLP(16.8 m.u.에 위치함)는 감염의 후기 단계 동안에 특히 효율적이며 이 프로모터로부터 생성된 모든 mRNA는 5'-삼분 리더(TPL) 서열을 보유하고 이 서열은 mRNA가 전사를 위해 선취되도록 한다.
현재의 시스템에서, 재조합 아데노바이러스는 셔틀 벡터와 프로바이러스 벡터 사이의 상동성 재조합으로부터 생성된다. 두 프로바이러스 벡터사이의 가능한 재조합으로 인해 이 방법으로부터 야생형 아데노바이러스를 생성할 수 있다. 따라서, 개개의 플라크로부터 바이러스의 단일 클론을 분리하고 이의 게놈 구조를 검사하는 것이 중요하다.
복제가 결핍된 현 아데노바이러스 벡터의 생성 및 증식은 Ad5 DNA 단편에 의해 사람 배 신장 세포로부터 형질전환되고 구성적으로 E1 단백질을 발현하는 독특한 헬퍼 세포주(293으로 명명)에 의해 좌우된다[Graham et al., 1977]. E3 영역은 아데노 게놈으로부터 제거되어도 되기 때문에[Jones and Shenk, 1978], 현 아데노바이러스 벡터는 293 세포의 보조로 E1, D3 또는 양 영역에 외래 DNA를 보유한다[Graham and Prevec, 1991]. 천연적으로, 아데노바이러스는 야생형 게놈의 약 105%를 패키징할 수 있으며[Ghosh-Choudhury et al., 1987] 추가로 약 2 kB의 DNA에 대한 수용능력을 제공한다. E1 및 E3 영역에서 치환될 수 있는 약 5.5 kB의 DNA와 조합했을 때, 현 아데노바이러스 벡터의 최대 수용능력은 7.5 kB 이하이거나 벡터의 전체 길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 게놈의 80% 이상은 벡터의 골격에 남아 있으며 벡터-유래 세포독성의 근원이 된다. 또한, E1-결여된 바이러스의 복제 결핍성은 불완전하다. 예를 들면, 바이러스 유전자 발현의 누출이 높은 감염중복도(MOI)의 현재 이용되고 있는 벡터에서 관찰되어 왔다[Mulligan, 1993].
헬퍼 세포주는 사람 배 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 기타 사람 배 간엽 또는 내피 세포와 같은 사람 세포로부터 유도할 수 있다. 대안으로서, 헬퍼 세포는 사람 아데노바이러스에 대해 수동적인 다른 포유동물 종의 세포로부터 유도할 수 있다. 이러한 세포로는 예를 들면, 베로(Vero) 세포 또는 다른 원숭이 배 간엽 또는 내피 세포가 포함된다. 상술된 바와 같이 현재 바람직한 헬퍼 세포주는 293이다.
최근에, 문헌[Racher et al., 1995]에 293 세포를 배양하고 아데노바이러스를 증식시키는 개선된 방법이 기술되었다. 한 가지 방식으로서, 100 내지 200 ㎖의 배지를 함유한 1 리터의 실리콘화 스피너 플라스크(제조원: Techne, 영국 캠프리지 소재)에 개개 세포를 접종하여 천연 세포 응집체로 성장시킨다. 40 rpm으로 교반시킨 후 트립판 블루로 세포 생존력을 산정한다. 다른 방식으로서, Fibra-Cel 마이크로캐리어(제조원: Bibby Sterlin영국 스톤 소재)(5 g/l)를 다음과 같이 사용한다. 5 ㎖의 배지에 재현탁된 세포 접종물을 250 ㎖ 에를렌메이어 플라스크내의 캐리어(50 ㎖)에 첨가하고 경우에 따라 진탕시키면서 1 내지 4시간 동안 정치시킨다. 이어서, 배지를 50 ㎖의 새로운 배지로 대체하고 진탕을 개시한다. 바이러스 생성을 위해 세포를 약 80% 군락(confluence)으로 성장시키고 그 후 배지를 대체시키며(최종 용적 25%로) 아데노바이러스를 0.05의 MOI로 첨가한다. 배양물을 밤새 정치해 두며 이때 용적은 100%로 증가하고 다시 72시간 동안 진탕시킨다.
아데노바이러스 벡터가 복제 결손이거나 적어도 상태에 따라 결손인 요건이외에, 아데노바이러스 벡터의 성질은 본 발명의 성공적인 실시에 중요한 것으로 믿어지지 않는다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지 혈청형 또는 아그룹 A 내지 F으로 존재할 수 있다. 아그룹 C의 아데노바이러스 유형 5가 본 발명에 사용하기 위한 조건적 복제-결손 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위해 바람직한 출발 물질이다. 그 이유는 아데노바이러스 유형 5는 많은 생화학적 및 유전적 정보가 알려져 있는 사람 아데노바이러스이고 벡터로서 아데노바이러스를 사용한 대부분의 작제에 전통적으로 사용되어 왔기 때문이다.
상술된 바와 같이, 본 발명의 전형적인 벡터는 복제 결손이고 아데노바이러스 E1 영역을 갖지 않는 것이다. 따라서, 해당 유전자의 폴리뉴클레오타이드를 E1-암호화 서열이 제거된 위치에 도입하는 것이 가장 편리할 것이다. 그러나, 아데노바이러스 서열내에 작제물의 삽입 위치는 본 발명에 중요한 것은 아니다. 해당 유전자의 폴리뉴클레오타이드는 또한 결실된 E3 영역 대신에 문헌[Karlsson et al., 1986]에 기술된 바와 같이 E3 치환 벡터 또는 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E4 결손을 보충하는 E4 영역에 삽입될 수 있다.
아데노바이러스는 성장 및 조작이 쉽고 넓은 시험관내 및 생체내 숙주 범위를 나타낸다. 이 바이러스 그룹은 높은 역가(예, ㎖당 109-1011플라크-형성 단위)로 수득될 수 있으며 매우 감염성이 높다. 아데노바이러스의 생활사는 숙주 세포 게놈내로의 통합을 필요로하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 외래 유전자는 에피좀성이고, 따라서 숙주 세포에 대해 유전독성이 낮다. 야생형 아데노바이러스로의 백신화 연구에서 어떠한 부작용도 보고된 바 없으며[Couch et al., 1963; Top et al., 1971] 이것은 생체내 유전자 전달 벡터로서의 안정성 및 치료효능을 증명하는 것이다.
아데노바이러스 벡터는 진핵 유전자 발현[Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992] 및 백신 개발[Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992]에 사용되어 왔다. 최근에, 동물 연구는 재조합 아데노바이러스가 유전자 요법에 사용될 수 있음을 시사하였다[Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993]. 상이한 조직에 재조합아데노바이러스를 투여하는 연구는 기도 적하[Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992], 근육주사[Ragot et al., 1993], 말초 정맥내 주사[Herz and Gerard, 1993] 및 뇌내로의 입체적 접종[Le Gal La Salle et al., 1993]을 포함한다.
2. 레트로바이러스
레트로바이러스는 이들의 RNA를 감염된 세포에서 역전사의 과정에 의해 이본쇄 DNA로 전환시키는 능력으로 특징지워지는 일본쇄 RNA 바이러스의 그룹이다[Coffin, 1990]. 그런 다음 생성된 DNA는 프로바이러스로서 세포 염색체내로 안정하게 통합하고 바이러스 단백질의 합성을 지시한다. 통합은 수용 세포 및 이의 자손 세포에 바이러스 유전자 서열이 유지되는 결과를 초래한다. 레트로바이러스 게놈은 캡시드 단백질, 중합효소 및 외피(envelop) 성분을 각각 암호화하는 세 개의 유전자 gag, pol 및 env를 함유한다. gag 유전로부터 상류에서 발견되는 서열은 게놈이 비리온으로 패키징하기 위한 시그날을 함유한다. 두 개의 긴 말단 반복(LTR) 서열이 바이러스 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터와 인핸서 서열을 함유하며 또한 숙주 세포 게놈에 통합하는데 필요하다[Coffin, 1990].
레트로바이러스 벡터를 작제하기 위해, 하나 이상의 해당 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산이 특정 바이러스 서열 대신에 바이러스 게놈내로 삽입되어 복제-결손 바이러스를 생성한다. 비리온을 생성하기 위해,gag, pol 및 env 유전자를 함유하지만 LTR 및 패키징 성분이 없는 패키징 세포주를 작제한다[Mann et al., 1983]. 레트로바이러스 LTR 및 패키징 서열과 함께 cDNA를 함유한 재조합 플라스미드가 이 세포주내로 예를 들면, 인산칼슘 침전법에 의해 도입될 때, 패키징 서열은 재조합 플라스미드의 RNA 전사물이 바이러스 입자로 패키징되도록 하며 이어서 바이러스 입자는 배양 배지로 분비된다[Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983]. 그런 다음, 재조합 레트로바이러스를 함유한 배지를 수거하고, 임의로 농축시키며, 유전자 전달을 위해 사용한다. 레트로바이러스 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현은 숙주 세포의 분열을 필요로 한다[Paskind et al., 1975].
레트로바이러스 벡터의 특정 표적화를 허용하도록 디자인된 새로운 방법이 바이러스 외피에 락토즈 잔기의 화학적 첨가에 의한 레트로바이러스의 화학적 변형을 기초로 하여 최근에 개발되었다. 이 변형은 시알로글리코단백질 수용체를 통한 간세포(hepatocyte)의 특정 감염을 허용한다.
재조합 레트로바이러스의 표적화에 대한 다른 방법이 디자인되었는데, 이 방법은 레트로바이러스 외피 단백질 및 특정 세포 수용체에 대한 바이오티닐화 항체가 사용되었다. 이 항체는 스트렙타비딘을 사용하여 바이오틴 성분을 통해 결합되었다[Roux et al., 1989]. 주요 조직적합성 복합체 부류 I 및 II 항원에 대한 항체를 사용하여 이들은 시험관내에서의 포식 바이러스로 표면 항원을 갖는 여러 사람 세포의 감염을 증명하였다[Roux et al., 1989].
3. 아데노-연관된 바이러스
AAV[Ridgeway, 1988; Hermonat and Muzycska, 1984]은 아데노바이러스 저장액의 오염에 의해 발견된 파로바이러스이다. AAV는 어떠한 질병과도 관련이 없는 편재성 바이러스이다(항체가 미 국민의 85%에 존재한다). 또한, AAV는 이의 복제가 아데노바이러스와 같은 헬퍼 바이러스의 존재에 의존하기 때문에 디펜도바이러스로 분류된다. 5가지의 혈청형이 분리되었고 이중에서 AAV-2가 가장 잘 특성화되었다. AAV는 일본쇄 선형 DNA를 가지면 이 DNA는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3으로 캡슐화되어 직경이 20 내지 24 nm인 20면체 비리온을 형성한다[Muzyczka and McLaughlin, 1988].
AAV DNA는 길이가 약 4.7 kb이다. 이것은 두 개의 개방 판독 프레임을 함유하고 두 개의 ITR에 의해 플랭킹되어 있다. AAV 게놈에는 두 개의 주요 유전자가 있다: rep 및 cap. rep 유전자는 바이러스 복제를 담당하는 단백질을 암호화하는 반면 cap는 캡시드 단백질 VP1-3을 암호화하고 있다. 각 ITR은 T-모양의 헤어핀 구조를 형성한다. 이들 말단 반복체는 염색체 통합을 위해 AAV의 유일한 필수 cis 성분이다. 따라서, AAV는 모든 바이러스 암호화 서열이 제거되고 전달을 위한 유전자 카세트로 대체된 벡터로서 사용될 수 있다. 세 가지의 바이러스 프로모터가 동정되었으며 이들의 지도 위치에 따라 p5, p19 및 p40으로 명명되었다. p5 및 p19로부터의 전사는 rep 단백질을 생성하고 p40으로부터의 전사는 캡시드 단백질을 생성한다[Hermonat and Muzyczka, 1984].
연구자들로 하여금 rAAV를 발현 벡터로 사용할 수 있는 가능성을 연구하도록고무시킨 몇 가지 요인이 있다. 하나는 숙주 염색체내로 통합하도록 유전자를 전달하기 위한 요건이 놀랍게도 거의 없다는 점이다. AAV 게놈의 6%에 불과한 145-bp ITR을 갖는 것이 필요하다. 이것은 4.5-kb DNA 삽입을 집결하기 위해 벡터내에 공간을 남겨두고 있는 것이다. 이러한 용적이 AAV가 커다란 유전자를 전달하지 못하도록 할 수 있는 한편 본 발명의 안티센스 작제물을 전달하기에 충분히 적합하다.
AAV는 또한, 이의 안정성으로 인해 전달 비히클의 양호한 선택이다. 비교적 복잡한 구원 메카니즘이 있다. rAAV를 이동시키기 위해 야생형 아데노바이러스 뿐만 아니라 AAV 유전자가 요구된다. 유사하게, AAV는 병원성이 아니고 어떠한 질병과도 관련이 없다. 바이러스 암호화 서열의 제거는 바이러스 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화하며, 이에 따라 rAAV는 염증 반응을 일으키지 않는다.
4. 발현 작제물로서의 기타 바이러스 벡터
숙주 세포로 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 전달하기 위해 본 발명에서의 발현 작제물로서 다른 바이러스 벡터가 사용될 수 있다. 백시니아 바이러스[Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988], 렌티바이러스, 폴리오 바이러스 및 헤르페스 바이러스와 같은 바이러스로부터 유래된 벡터가 사용될 수 있다. 이들은 여러 포유동물 세포에 대해 수 가지의 유리한 특징을 제공한다 [Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990].
최근에 결손 B형 간염 바이러스가 인식되면서, 상이한 바이러스 서열의구조-기능 관계에 대해 새로운 고찰이 이루어지고 있다. 시험관내 연구는 그 바이러스가 이의 게놈의 80%가 결실되었음에도 불구하고 헬퍼-의존 패키징 및 역전자에 대한 능력을 유지할 수 있음을 보여주었다[Horwich et al., 1990]. 이것은 게놈의 커다란 부분이 외래 유전 물질로 치환될 수 있음을 시사하는 것이다. 간친화성 및 존속(통합)이 간-지시된 유전자 전달에 특히 유리한 특성이다. 창(Chang) 등(1991)은 중합효소, 표면 및 표면전 암호화 서열 대신에 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 오리 B형 간염 바이러스 게놈내로 도입하였다. 이것은 야생형 바이러스와 조류 간 종양 세포주로 동시감염되었다. 고역가의 재조합 바이러스를 함유한 배양 배지를 사용하여 원시 오리새끼 간세포를 감염시켰다. 안정한 CAT 유전자 발현이 형질감염 후 적어도 24일 동안 검출되었다[Chang et al., 1991].
5. 비-바이러스 벡터
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위해 발현 작제물은 세포내로 전달되어야 한다. 이 전달은 세포주를 형질전환시키기 위한 실험실 절차에서와 같이 시험관내에서 또는 특정 질환 상태의 치료에서와 같이 생체내 또는 생체외에서 달성될 수 있다. 상기된 바와 같이, 전달을 위한 한 가지 바람직한 메카니즘은 발현 작제물을 감염성 바이러스 입자내로 캡슐화하는 바이러스 감염을 통한 것이다.
일단 발현 작제물이 세포내로 전달되면, 목적하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 핵산은 다른 부위에 위치하고 발현될 수 있다. 특정 양태로서, 작제물의 핵산은 세포의 게놈내로 안정하게 통합될 수 있다. 이러한 통합은 상동성 재조합(유전자 치환)을 통한 특정 부위에서 및 방향으로 이루어질 수 있거나 랜덤, 비특정 위치(유전자 증대)에서 통합될 수 있다. 또 다른 양태로서, 핵산은 세포내에서 별도의 에피좀 DNA 단편으로서 안정하게 유지될 수 있다. 이러한 핵산 단편 또는 "에피좀"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 병행하여 존속 및 복제를 허용하기에 충분한 서열을 암호화한다. 발현 작제물이 세포로 전달되는 방법 및 핵산이 세포내에서 유지하는 장소는 사용된 발현 작제물의 유형에 의해 좌우된다.
본 발명의 특정 양태로서, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 작제물은 단순히 나출된(naked) 재조합 DNA 또는 플라스미드로 이루어질 수 있다. 작제물의 전달은 세포막을 물리적으로 또는 화학적으로 투과하도록 하는 상기 방법중 어느 것에 의해서도 수행될 수 있다. 이것은 시험관내 전달에 특히 적용될 수 있으나 또한 생체내 사용에도 적용될 수 있다. 두벤스키(Dubensky) 등(1984)은 폴리오마바이러스 DNA를 인산칼슘 침전물의 형태로 성숙 및 신생 마우스의 간 및 비장내로 성공적으로 주입하고 활성 바이러스 복제 및 급성 감염을 증명하였다. 또한, 벤베니스티(Benvenisty) 및 레세프(Reshef) (1986)는 또한 인산칼슘-침전된 플라스미드의 직접적인 복강내 주사가 형질감염된 유전자의 발현을 초래하였음을 증명하였다. 또한, 해당 유전자의 DNA는 생체내로 유사한 방식으로 전달되고 유전자 생성물을 발현할 수 있는 것으로 나타난다.
세포내로 나출된 DNA 발현 작제물을 전달하기 위한 본 발명의 다른 양태는 입자 폭격(particle bombardment)을 포함할 수 있다. 이 방법은 DNA-피복된 미세주입물을 고속으로 가속하여 이들이 세포막을 관통하고 세포를 사멸시키지 않으면서 세포내로 들어갈 수 있는 능력에 의존한다[Klein et al., 1987]. 작은 입자를 가속하기 위한 수 가지 장치가 개발되어 있다. 이러한 한 가지 장치는 전류를 발생하여 동력을 제공하는 고전압 방전에 의존한다[Yang et al., 1990]. 사용된 미세주입물은 텅스텐 또는 금 비드와 같은 생물학적 불활성 물질로 구성되었다.
랫트 및 마우스의 간, 피부 및 근육 조직을 포함한 선택된 기관은 생체내에서 폭격되었다[Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991]. 이것은 총과 표적 기관 사이의 중간 조직을 제거하기 위해(즉, 생체외 처리) 조직 또는 세포의 외과적 노출을 필요로 할 수 있다. 다시, 이 방법을 통해 특정 유전자의 DNA가 전달될 수 있으며 본 발명에 의해 편입될 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드
유전 정보의 유동의 최종 결과는 단백질의 합성이다. DNA는 중합효소에 의해 전령 RNA로 전사되고 리보좀위에서 해독되어 폴딩된 기능성 단백질을 형성한다. 따라서, 단백질 합성이 억제될 수 있는 경로를 따라 몇 단계가 있다. 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 천연 DNA 단편은 모든 그러한 포유동물 DNA 쇄으로서 두 개의 쇄를 갖는다. 즉, 센스 쇄와 안티센스 쇄가 수소 결합에 의해 함께 결합되어 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 전령 RNA는 DNA 티미딘이 우리딘으로 대체된 것을 제외하고는 센스 DNA와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 따라서, 합성 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 mRNA와 결합하고 이 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현을 억제할 것이다.
mRNA에 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 표적화는 단백질 합성을 정지시키는 한 가지 메카니즘이며, 결과적으로 강력하고 표적화된 치료 방법을 나타낸다. 예를 들면, 폴리갈락타우로나제 및 무스카린 2형 아세틸콜린 수용체는 개개 mRNA 서열로 지정된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다[미국 특허 제5,739,119호 및 제5,759,29호, 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다]. 또한, 안티센스 억제의 예가 핵 단백질 사이클린, 복수 약물 내성 유전자(MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA수용체 및 사람 EGF로 입증되었다 [Jaskulski et al., 1988; Vasanthakumar and Ahmed, 1989; Peris et al., 1998; 미국 특허 제5,801,154호; 미국 특허 제5,789,573호; 미국 특허 제5,718,709호 및 미국 특허 제5,610,288호, 이들 문헌의 각 내용은 본원에 참고로 원용된다]. 여러 비정상적인 세포 증식(예, 암)을 억제하고 치료하는데 사용할 수 있는 안티센스 작제물이 또한 공개되어 왔다[미국 특허 제5,747,470호; 미국 특허 제5,591,317호 및 미국 특허 제5,783,683호, 이들의 각 내용은 본원에 참고로 원용된다].
따라서, 예시적인 양태로서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 서열 또는 이의 상보체의 전부 또는 일부를 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 한 가지 양태로서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 다른 양태로서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 세 번째 양태로서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오화된 변형 골격을 포함하는 변형된 DNA이다. 네 번째 양태로서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 펩타이드 핵산 또는 이의 유도체를 포함한다. 각 경우에 있어서, 바람직한 조성은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 하나 또는 그 이상의 부분에 상보적인 서열 영역을 포함하는 것이고, 더욱 바람직하게는 실질적으로 상보적인 서열 영역을, 훨씬 더 바람직하게는 완전히 상보적인 서열을 포함하는 하는 것이다.
주어진 유전자 서열에 대해 특이적인 안티센스 조성의 선택은 선택된 표적 서열(즉, 이러한 대표적인 예로서 랫트 및 사람 서열)의 분석 및 이차 구조, Tm, 결합 에너지, 상대적인 안정성의 결정을 기초로 하며 안티센스 조성은 숙주 세포에서 표적 mRNA와의 특이적 결합을 감소 또는 억제시키는 이량체, 헤어핀 또는 다른 이차 구조를 형성하는 그들의 상대적인 무능력을 기초로 하여 선택되었다.
mRNA의 고도로 바람직한 표적 영역은 AUG 해독 개시 코돈에 또는 근처에 있는 서열 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보적인 서열이다. 이들 이차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려는 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 v.4[Rychlik, 1997] 및 BLASTN 2.0.5 알고리듬 소프트웨어[Altschul et al., 1997]를 사용하여 실시하였다.
또한, MPG(27개 잔기)라고 하는 짧은 펩타이드 벡터를 사용한 안티센스 전달방법의 사용이 고려된다. MPG 펩타이드는 HIV gp41의 융합 서열로부터 유도된 소수성 도메인 및 SV40 T-항원의 핵-내재 서열로부터의 친수성 도메인을 함유한다[Morris et al., 1997]. MPG 펩타이드의 수 가지 분자가 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 피복하고 1시간 미만내에 비교적 높은 효율(90%)로 배양된 포유동물 세포내로 전달될 수 있는 것으로 증명되었다. 또한, MPG와의 상호작용은 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오타이드의 안정성 및 혈장 막을 통과하는 능력 모두를 강력히 증가시킨다[Morris et al., 1997].
리보자임
비록 단백질이 전통적으로 핵산의 촉매작용을 위해 사용되어 왔을 지라도 다른 부류의 거대분자들은 이러한 시도에 유용한 것으로서 드러났다. 리보자임은 부위-특이적인 양상으로 핵산을 절단하는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 보유한 특이적 촉매작용 도메인이다[Kim and Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symons, 1987]. 예를 들면, 많은 리보자임은 고도의 특이성으로 포스포에스테르 전이 반응을 촉진하며 흔히 올리고뉴클레오타이드 기질내의 수 개 포스포에스테르 중 단지 하나만을 절단한다[Cech et al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992]. 이러한 특이성은 기질이 화학반응 이전에 특이적 염기-쌍 상호작용을 통해 리보자임의 내부 안내 서열(IGS)과 결합해야 하는 요건에 기인되어 왔다.
리보자임 촉매작용은 주로 핵산이 연루된 서열-특이적 절단/연결 반응의 일부로서 관찰되어 왔다[Joyce, 1989; Cech et al., 1981]. 예를 들면, 미국 특허 제5,354,855호(본원에 참고로 원용된다)는 특정 리보자임이 공지된 리보뉴클레아제보다 크고 DNA 제한 효소와 비슷한 서열 특이성을 갖는 엔도뉴클레아제로서 작용할 수 있음을 보고하고 있다. 따라서, 유전자 발현의 서열-특이적 리보자임-매개된 억제는 특히 치료 용도에 적합할 수 있다[Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990]. 최근에, 리보자임은 이들이 적용되는 일부 세포주에서 유전적 변화를 나타낸 것으로 보고되었다. 변이된 유전자로는 원종양 유전자 H-ras, c-fos 및 HIV의 유전자가 포함된다. 이 연구의 대부분은 특이적 리보자임에 의해 절단되는 특정 돌연변이 코돈을 기초로 한 표적 mRNA의 변형을 포함하였다.
천연 효소작용 RNA의 6 가지 변이체가 현재 알려져 있다. 각각은 생리학적 조건하에서 트랜스 형태의 RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 촉매할 수 있으며 이에 따라 다른 RNA 분자를 절단할 수 있다. 일반적으로, 효소작용 핵산은 우선 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 이러한 결합은 표적 RNA를 절단하도록 작용하는 분자의 효소작용 부분에 인접하여 고정되어 있는 효소작용 핵산의 표적 결합 부분을 통해 일어난다. 따라서, 효소작용 핵산은 우선 표적 RNA를 인식하고 상보적인 염기쌍을 통해 결합하며, 일단 정확한 위치에 결합되면, 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단한다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단은 암호화된 단백질의 합성을 유도하는 능력을 파괴할 것이다. 효소작용 핵산은 RNA 표적과 결합하여 절단한 후 그 RNA로부터 분리되어 다른 표적을 검출하고 반복하여 새로운 표적에 결합하여 절단할 수 있다.
리보자임의 효소적 특성은 치료 효과를 나타내는데 필요한 리보자임의 농도가 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도보다 낮기 때문에 안티센스 기술(핵산 분자가 단순히 핵산 표적과 결합하여 이의 해독을 차단한다)과 같은 많은 기술에 비해 유리하다. 이러한 잇점은 리보자임이 효소적으로 작용하는 능력을 반영한다. 따라서, 단일 리보자임 분자는 많은 표적 RNA 분자를 절단할 수 있다. 또한, 리보자임은 고도로 특이적인 억제제이며, 억제의 특이성은 표적 RNA에 결합하는 염기쌍 메카니즘 뿐만 아니라 표적 RNA 절단의 메카니즘에 의해 좌우된다. 절단 부위 근처에서의 단일 부정합 또는 염기-치환은 리보자임의 촉매 활성을 완전히 제거할 수 있다. 안티센스 분자에서의 유사한 부정합은 이들의 작용을 제어하지 못한다 [Woolf et al., 1992]. 따라서, 리보자임의 작용의 특이성은 동일한 RNA 부위와 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 특이성보다 크다.
효소작용 핵산 분자는 헤머헤드, 헤어핀, δ형 간염 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNase P RNA(RNA 안내 서열과 연합하여) 또는 뉴로스포라 VS RNA 모티프로 형성될 수 있다. 헤머헤드 모티프의 예는 문헌[Rossi et al., (1992)]에 기술되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 문헌[Hampel et al. (유럽특허공개 제0360257호), Hampel and Tritz (1989), Hampel et al. (1990) 및 미국 특허 제5,631,359호]에 기술되어 있으며, 이들 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. δ형 간염 바이러스 모티프의 예는 문헌[Perrotta and Been (1992)]에 기술되어 있고 RNase P 모티프의 예는 문헌[Guerrier-Takada et al. (1983)]에 기술되어 있으며 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프는 문헌[Saville and Collins, 1990; Saville and Collins,1991; Collins and Olive, 1993]에 기술되어 있고 그룹 I 인트론의 예는 미국 특허 제4,987,071호에 기술되어 있으며, 상기 문헌들의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 본 발명의 효소작용 핵산 분자에 있어서 중요한 모든 것은 이 핵산 분자가 표적 유전자 RNA 영역중 하나 이상에 대해 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 갖고 있으며 RNA 절단 활성을 그 분자에 부여하는 기질 결합 부위내에 또는 주변에 뉴클레오타이드 서열을 갖고 있다는 것이다. 따라서, 리보자임 작제물은 본원에 언급된 특정 모티프로 한정될 필요가 없다.
특정한 양태로서, 본원에 기술된 서열중의 하나와 같은 목적하는 표적의 RNA에 대해 고도의 특이성을 나타내는 효소작용 절단제를 생성하는 것이 중요할 수 있다. 효소작용 핵산 분자는 바람직하게는 표적 mRNA의 고도의 보존된 서열 영역으로 표적화된다. 이러한 효소작용 핵산 분자는 필요에 따라 특정 세포로 외인성으로 전달될 수 있다. 대안으로서, 리보자임은 특정 세포로 전달되는 DNA 또는 RNA 벡터로부터 발현될 수 있다.
작은 효소작용 핵산 모티프(예, 헤머헤드 또는 헤어핀 구조의 모티프)가 또한 외인성 전달을 위해 사용될 수 있다. 이들 분자의 단순한 구조는 mRNA 구조의 표적 겨냥된 영역을 효소작용 핵산이 침입하는 능력을 증가시킨다. 대안으로서, 촉매적 RNA 분자는 진핵 프로모터로부터 세포내에서 발현될 수 있다[예를 들면, Scanlon et al., 1991; Kashani-Sabet et al., 1992; Dropulic et al., 1992; Weerashinghe et al., 1991; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Sarver et al., 1990]. 당업자는 어떠한 리보자임도 적절한 DNA 벡터로부터 진핵세포내에서발현될 수 있음을 이해할 것이다. 이러한 리보자임의 활성은 제2 리보자임에 의해 원시 전사물로부터 유리됨으로써 증가될 수 있다[참조: WO 제93/23569호 및 WO 제94/02595호; Ohkawa et al., 1992; Taira et al., 1991; 및 Ventura et al., 1993, 상기 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다].
리보자임은 직접 부가되거나 양이온성 지질, 지질 복합체와 복합체를 형성하거나 리포좀내에 패키징되거나 표적 세포에 전달될 수 있다. RNA 또는 RNA 복합체는 생체중합체에 혼합시키거나 혼입하지 않고서 주사, 에어로졸 흡입, 주입 펌프 또는 스텐트를 통해 생체외 또는 생체내로 관련된 조직으로 국소 투여될 수 있다.
리보자임은 문헌[WO 제93/23569호 및 WO 제94/02595호]에 기술된 바와 같이 디자인하고 합성하여 기술된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 시험할 수 있다. 이러한 리보자임은 또한 전달을 위해 최적으로 만들 수 있다. 특정 예가 제공되고 있으나 당업자는 다른 종에서의 균등한 RNA 표적이 필요한 경우 사용될 수 있음을 인정할 것이다.
헤머헤드 또는 헤어핀 리보자임은 컴퓨터 폴딩[Jaeger et al., 1989]에 의해 개별적으로 분석하여 리보자임 서열이 적절한 이차 구조로 폴딩하는지를 평가할 수 있다. 결합 아암(arm)과 촉매적 코어 사이에 불리한 분자내 상호작용을 갖는 리보자임은 고려 대상에서 제외된다. 다양한 결합 아암 길이를 선택하여 활성을 최적화할 수 있다. 일반적으로, 각 아암에 적어도 5개의 염기가 표적 RNA와 결합하거나 상호작용할 수 있다.
헤머헤드 또는 헤어핀 모티프의 리보자임은 mRNA 메시지에서 여러 부위로 어닐링하도록 디자인될 수 있으며 화학적으로 합성될 수 있다. 사용된 합성 방법은 문헌[Usman et al., 1987 and Scaringe et al., 1990]에 기술된 바와 같이 정상적인 RNA 합성의 절차에 따라 진행되며 통상적인 핵산 보호 및 결합 그룹(예, 5'-말단에 디메톡시트리틸 및 3'-말단에 포스포르아미다이트)을 이용한다. 평균 단계별 결합 수율은 전형적으로 >98%이다. 헤어핀 리보자임은 두 부분으로 합성될 수 있으며 활성 리보자임을 재구성하기 위해 어닐링될 수 있다[Chowrira and Burke, 1992]. 리보자임은 예를 들면 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-o-메틸, 2'-H와 같은 뉴클레아제 내성 그룹으로 변형시켜 안정성을 증가시키기 위해 광범위하게 변형시킬 수 있다[참조: Usman and Cedergren, 1992]. 리보자임은 일반적인 방법을 사용하여 겔 전기영동에 의해서 또는 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고 수중에 재현탁시킬 수 있다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 아암의 길이를 변형시키거나 혈청 리보뉴클레아제에 의해 분해되지 않도록 방지하는 변형[참조: WO 제92/07065호; Perrault et al., 1990; Pieken et al., 1991; Usman and Cedergren, 1992; WO 제93/15187호; WO 제91/03162호; 유럽특허공개 제92110298.4호; 미국 특허 제5,334,711호 및 WO 제94/13688호, 이들 문헌에는 효소작용 RNA 분자의 당 잔기에 대한 여러 가지 화학적 변형이 기술되어 있다], 세포에서의 리보자임 효능을 증가시키는 변형 및 RNA 합성 시간을 단축하고 화학적 요건을 줄이기 위한 스템 II 염기의 제거가 수반된 리보자임을 화학적으로 합성하여 최적화할 수 있다.
설리반(Sullivan) 등의 WO 제94/02595호에는 효소작용 RNA 분자를 전달하기위한 일반적인 방법이 기술되어 있다. 리보자임은 당업자에게 공지된 여러 방법에 의해 세포로 투여될 수 있다. 그러한 방법으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 리포좀내의 캡슐화, 이온도입 또는 다른 비히클(예, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생체분해성 나노캡슐 및 생체접착성 미소구체)내로의 혼입이 포함된다. 일부 시도된 경우로서, 리보자임은 상기 언급된 비히클과 함께 또는 이러한 비히클 없이 세포 또는 조직에 생체외로 직접 전달될 수 있다. 대안으로서, RNA/비히클 결합물이 직접적인 흡입, 직접적인 주사 또는 카테테르, 흡인 펌프 또는 스텐트의 이용에 의해 국소적으로 전달될 수 있다. 다른 전달 경로로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 혈관내, 근육내, 피하 또는 관절 주사, 에어로졸 흡입, 경구(정제 또는 환제), 국소, 전신, 안내, 복강내 및/또는 포막내 전달이 포함된다. 리보자임 전달 및 투여에 관한 보다 자세한 설명은 WO 제94/02595호 및 WO 제93/23569호에서 제공되며, 이들 특허의 내용은 본원에 참고로 원용된다.
세포내에 고농도의 리보자임을 축적하는 다른 수단은 리보자임-암호화 서열을 DNA 발현 벡터내로 혼입하는 것이다. 리보자임 서열의 전사는 진핵 RNA 중합효소 I(pol I), RNA 중합효소 II(pol II) 또는 RNA 중합효소 III(pol III)에 대한 프로모터로부터 구동된다. pol II 또는 pol III으로부터의 전사물은 모든 세포에서 높은 수준으로 발현될 것이다. 주어진 세포 유형에서의 주어진 pol II 프로모터의 수준은 근처에 존재하는 유전자 조절 서열[인핸서, 사일런서(silencer) 등]의 성질에 의존한다. 원핵 RNA 중합효소 프로모터가 또한 사용될 수 있으며 원핵 RNA 중합효소가 적절한 세포에서 발현된다[Elroy-Stein and Moss, 1990; Gao and Huang,1993; Lieber et al., 1993; Zhou et al., 1990]. 이러한 프로모터로부터 발현된 리보자임은 포유동물 세포에서 작용할 수 있다[예를 들면, Kashani-Saber et al., 1992; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Yu et al., 1993; L'Huillier et al., 1992; Lisziewicz et al., 1993]. 이러한 전사 단위는 포유동물 세포내로의 도입을 위해 여러 벡터내로 혼입될 수 있다. 이러한 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만, 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터(예, 아데노바이러스 또는 아데노-연관된 벡터) 또는 바이러스 RNA 벡터(예, 레트로바이러스, 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 벡터)가 포함된다.
리보자임은 질병에 걸린 세포에서의 유전자 표류 및 변이를 검사하기 위한 진단 도구로서 사용할 수 있다. 이들은 또한, 표적 RNA 분자의 수준을 평가하기 위해 사용할 수 있다. 리보자임 활성과 표적 RNA의 구조 사이의 밀접한 관계는 표적 RNA의 염기쌍 및 삼차원 구조에 변화를 주는 분자의 어떠한 영역에 있어서의 돌연변이에 대한 검출를 가능하게 한다. 복수의 리보자임을 사용함으로써, 시험관내뿐만 아니라 세포 및 조직내에서 RNA 구조 및 기능에 중요한 뉴클레오타이드 변화를 지도로 작성할 수 있다. 리보자임으로 표적 RNA를 절단하는 것은 유전자 발현을 억제하고 질병의 진행에서 특정된 유전자 산물의 역할(필수적으로)을 규명하는데 사용할 수 있다. 이러한 방식으로, 다른 유전자 표적물이 질병의 중요한 매개체로서 규명될 수 있다. 이들 연구는 병용 요법(상이한 유전자에 표적화된 복수의 리보자임, 공지된 작은 분자 억제와 결합된 리보자임 또는 리보자임 및/또는 다른 화학적 또는 생물학적 분자의 배합을 통한 간헐적 치료)의 가능성을 제공함으로써질병의 진행을 호전시킬 수 있을 것이다. 리보자임의 다른 시험관내 사용은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 IL-5 연관된 상태와 관련된 mRNA의 존재에 대한 검출를 포함한다. 이러한 RNA는 표준 방법을 사용하여 리보자임으로 처리한 후 절단 산물의 존재를 결정함으로써 검출할 수 있다.
펩타이드 핵산
특정 양태로서, 본 발명자들은 본 발명의 방법을 실시함에 있어서 펩타이드 핵산(PNA)의 사용을 고려한다. PNA는 핵산염기가 슈도펩타이드 골격에 연결되어 있는 DNA 모사체이다[Good and Nielsen, 1997]. PNA는 전통적으로 RNA 또는 DNA를 사용한 많은 방법에서 이용될 수 있다. 흔히, PNA 서열은 상응하는 RNA 또는 DNA 서열보다 기술에 있어서 더욱 양호하게 작용하며 RNA 또는 DNA에서 발견되지 않는 유용성을 제공한다. PNA의 제법, 특징 및 용법에 관해서는 문헌[Corey, 1997]에서 찾아 볼 수 있으며 이 문헌의 내용은 본원에 참고로 원용된다. 특정 양태로서, 당업자는 ACE mRNA 서열중 하나 이상의 부분에 상보적인 PNA 서열을 제조할 수 있으며 이러한 PNA 조성물은 ACE-특정 mRNA의 해독을 조절, 변형 또는 감소시키고 이로써 그러한 PNA 조성물이 투여된 숙주 세포에서의 ACE 활성 수준에 변화를 주기 위해 사용할 수 있다.
PNA는 DNA의 정상적인 포스포디에스테르 골격을 대체하는 2-아미노에틸-글리신 연결을 갖는다[Nielsen et al., 1991; Hanvey et al., 1992; Hyrup and Nielsen, 1996; Neilsen, 1996]. 이러한 화학은 세 가지 중요한 결론을 갖는다:첫째는 DNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드와 대조적으로, PNA는 중성 분자이다; 둘째, PNA는 비키랄성이어서 입체선택적 합성을 개발할 필요가 없다; 셋째, PNA 합성은 비록 변형된 메리필드 방법을 포함한 다른 방법[Christensen et al., 1995]이 사용되었을 지라도 고체상 펩타이드 합성을 위해 표준 Boc[Dueholm et al., 1994] 또는 Fmoc[Thomson et al., 1995] 프로토콜을 사용한다.
PNA 단량체 또는 기성 올리고머는 제조원(PerSeptive Biosystems, 매사추세츠 프래밍햄 소재)으로부터 구입할 수 있다. Boc 또는 Fmoc 프로토콜에 의한 PNA 합성은 수동 또는 자동 프로토콜을 이용한 수월한 방법이다[Norton et al., 1995]. 수동 프로토콜은 화학적으로 변형된 PNA를 생성하거나 밀접하게 연관된 PNA의 그룹을 동시에 합성한다.
펩타이드 합성과 마찬가지로, 특정 PNA 합성의 성공은 선택된 서열의 특성에 의해 좌우된다. 예를 들면, 이론적으로 PNA는 뉴클레오타이드 염기의 어떠한 조합도 혼입할 수 있는 한편, 인접한 퓨린의 존재는 생성물에서 하나 이상의 잔기를 결실시킬 수 있다. 이러한 어려움이 예상되는 가운데, 인접한 퓨린을 갖는 PNA를 제조함에 있어서 당업자는 비효율적으로 첨가될 것이 명백한 잔기의 결합을 반복해야하는 것으로 제안된다. 이 과정에 이어서 PNA는 역상 고압 액체 크로마토그래피 (Norton et al., 1995)에 의해 정제해야 하며 그 결과 펩타이드의 합성동안에 관찰된 것과 유사한 생성물의 수율 및 순도를 제공한다.
주어진 응용에 대한 PNA의 변형은 고체상 합성 동안에 아미노산을 결합시키거나 노출된 N-말단 아민에 카복실산 그룹을 함유하는 화합물을 연결시킴으로써 달성할 수 있다. 대안으로서, PNA는 합성 후에 도입된 라이신 또는 시스테인을 결합시킴으로써 변형시킬 수 있다. PNA는 간단히 변형시킬 수 있음으로써 보다 양호한 용해성 또는 특정적인 작용상의 요건에 대한 최적화를 촉진할 수 있다. 일단 합성되면, PNA 및 이들의 유도체의 본질은 질량 분광분석에 의해 검증될 수 있다. PNA 변형에 관한 수 가지 연구가 이루어져 왔고 그러한 변형이 이용되어 왔다[Norton et al., 1995; Haaima et al., 1996; Stetsenko et al., 1996; Petersen et al., 1995; Ulmann et al., 1996; Koch et al., 1995; Orum et al., 1995; Footer et al., 1996; Griffith et al., 1995; Kremsky et al., 1996; Pardridge et al., 1995; Boffa et al., 1995; Landsdorp et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1996; Armitage et al., 1997; Seeger et al., 1997; Ruskowski et al., 1997]. 미국 특허 제5,700,922호에는 PNA-DNA-PNA 키메라 분자 및 이들의 진단 용도, 유기체에서의 단백질 조절 및 치료제에 민감한 상태의 치료가 기술되어 있다.
음전하 연결을 함유하는 DNA 및 RNA와 대조적으로, PNA 골격은 중성이다. 이러한 극적인 변형에도 불구하고 PNA는 와트슨-크리크 쌍에 의해 상보적인 DNA 및 RNA를 인식하며[Egholm et al., 1993], 닐센(Nielsen) 등(1991)에 의한 초기 모델링을 유효하게 한다. PNA는 3' 및 5' 극성이 결여되어 있으며 동일한 방향으로 또는 반대 방향으로 결합할 수 있으며, 바람직한 것은 반대 방향이다[Egholm et al., 1993].
DNA 및 RNA에 DNA 올리고뉴클레오타이드의 하이브리드화는 상보적인 쇄의 음전하 포스페이트 골격 사이의 정전반발에 의해 불안정하게 된다. 반대로, PNA-DNA 또는 PNA-RNA 이중나선에서 전하 반발의 부재는 융점(Tm)을 증가시키고 일가 또는 이가 양이온의 농도에 대한 Tm의 의존성을 감소시킨다[Nielsen et al., 1991]. 하이브리드화의 증가된 속도 및 친화도는 PNA가 느슨한 이본쇄 DNA내에 상보적인 서열의 본쇄 침입을 실행할 수 있도록 하기 때문에 중요하다. 또한, 역전된 반복 서열에서의 효율적인 하이브리드화는 PNA가 이본쇄 DNA내에서 이차 구조를 효과적으로 인식할 수 있음을 제시한다. 또한 표면에 PNA가 고정되면서 인식이 증가한다. 왕 등은 지지체-결합된 PNA를 하이브리드화 발생을 검출하는데 사용할 수 있음을 제시하였다[Wang et al., 1996].
상보적인 서열에 PNA의 치밀한 결합은 또한 유사한(그러나 동일하지 않음) 서열과의 결합을 증가시키며 PNA 인식의 서열 특이성을 감소시키는 것으로 예상할 수 있다. 그러나, DNA 하이브리드화와 같이, 선택적인 인식을 올리고머 길이와 배양 온도를 균형 있게 조절함으로써 달성할 수 있다. 게다가, PNA의 선택적인 하이브리드화는 DNA-DNA 하이브리드화보다 염기 부정합에 대해 내성이 보다 약한 PNA-DNA 하이브리드화에 의해 촉진된다. 예를 들면, 16 bp PNA-DNA 이중나선내의 단일 부정합은 Tm을 15℃까지 감소시킬 수 있다[Egholm et al., 1993]. 이러한 높은 수준의 차별에 의해 점 돌연변이의 분석을 위한 수 가지의 PNA-기본 전략을 개발할 수 있었다[Wang et al., 1996; Carlsson et al., 1996; Thiede et al., 1996; Webb and Hurskainen, 1996; Perry-O'Keefe et al., 1996].
고 친화성 결합은 분자 인식에 대한 뚜렷한 잇점과 PNA에 대한 새로운 응용 개발을 제공한다. 예를 들면, 11 내지 13개 뉴클레오타이드 PNA는 필수 RNA 주형을 사용하는 텔로미어 말단을 연장하는 리보뉴클레오-단백질인 텔로머라제의 활성을 억제하는 한편 유사한 DNA 올리고머는 억제하지 못한다[Norton et al., 1996].
중성 PNA는 유사한 DNA 올리고머보다 더욱 소수성이며 이것은 특히 PNA가 높은 퓨린 함량을 갖거나 이차 구조를 형성하려는 가능성을 갖고 있는 경우 중성 pH에서 PNA가 용해되기가 어렵게 할 수 있다. PNA의 용해성은 PNA 말단에 하나 이상의 양성 전하를 부착시킴으로써 증강될 수 있다[Nielsen et al., 1991].
알프레이(Allfrey) 등에 의한 발견은 쇄 침입이 염색체 DNA내의 서열에서 동시에 발생한다는 것을 제시한다[Boffa et al., 1995; Boffa et al., 1996]. 이들 연구는 PNA를 뉴클레오타이드 CAG의 삼중 반복 서열로 표적화하였고 이러한 인식을 이용하여 전사적으로 활성적인 DNA를 정제하고[Boffa et al., 1995] 전사를 억제하였다[Boffa et al., 1996]. 이 결과는 만일 PNA가 세포내에서 전달될 수 있다면 이때는 PNA가 유전자 발현의 일반적인 서열-특이적 조절인자가 될 가능성을 갖는 다는 것을 시사한다. 안티센스 및 항-유전자 물질로서 PNA를 사용하고자 하는 것에 대한 연구로는 문헌[Nielsen et al. (1993b), Hanvey et al. (1992), and Good and Nielsen (1997)]을 포함한다. 코펠후스(Koppelhus) 등(1997)은 PNA를 사용하여 HIV-1 역전사를 억제하였으며 이것은 PNA가 항바이러스 요법에 사용될 수 있음을 보여준다.
PNA의 안티센스 결합 특성을 특성화하는 방법은 문헌[Rose, 1993 및 Jensenet al., 1997]에 기술되어 있다. 로스는 모세관 겔 전기영동을 사용하여 PNA가 이들의 상보적인 올리고뉴클레오타이드에 결합하는 것을 결정하고 상대적인 결합 역학 및 화학량론을 측정하였다. 유사한 유형의 측정이 BIAcoreTM기술을 이용한 젠센(Jensen) 등에 의해 이루어졌다.
PNA의 다른 응용으로는 DNA 본쇄 침입[Nielsen et al., 1991], 안티센스 억제[Hanvey et al., 1992], 돌연변이 분석[Orum et al., 1993], 전사의 인핸서[Mollegaard et al., 1994], 핵산 정제[Orum et al., 1995], 전사적으로 활성적인 유전자의 분리[Boffa et al., 1995], 전사 인자 결합의 차단[Vickers et al., 1995], 게놈 절단[Veselkov et al., 1996], 바이오센서[Wang et al., 1996], 원 위치 하이브리드화[Thisted et al., 1996] 및 써던 블롯팅의 대안[Perry-O'Keefe, 1996]이 포함된다.
폴리펩타이드 조성물
다른 관점에서, 본 발명은 폴리펩타이드 조성물을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 포유동물 종으로부터 유도된 분리된 폴리펩타이드(또는 이의 에피토프, 변이체 또는 활성 단편)이다. 바람직하게는, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이 서열에 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열에 의해 암호화된다. 대안으로서, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 아미노산 서열중의 연속하는 아미노산 서열을 포함하거나 본원에 기술된전체 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서 정의될 수 있다.
본 발명에 있어서, 폴리펩타이드 조성물은 또한 본 발명의 폴리펩타이드, 특히 서열 786, 787, 791, 793, 795, 797 내지 799, 806 또는 809에 기술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 활성 단편 또는 이의 변이체 또는 생물학적 작용성 균등체에 대해 발생된 항체와 면역학적으로 반응하는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열에 함유된 하나 이상의 연속 핵산 서열 또는 이의 단편 또는 변이체 또는 이들 서열중 하나 이상과 중간 내지 고 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드와 면역학적으로 반응하는 항체를 나타낼 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다. 특히 예시적인 예시적인 폴리뉴클레오타이드로는 서열 786, 787, 791, 793, 795, 797 내지799, 806, 809 및 827에 기술된 아미노산 서열이 포함된다.
본원에 사용된 폴리펩타이드의 활성 단편은 통상적인 기술(예, 돌연변이유발)에 의해서거나 부가, 결실 또는 치환에 의해 변형되지만 본원에 기술된 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 구조, 기능, 항원성 등을 나타내는 폴리펩타이드의 전체 또는 일부를 포함한다.
특정 예시적인 양태로서, 본 발명의 폴리펩타이드는 본원에 기술된 폐 종양 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함한다. 상기된 바와 같이 "폐 종양 단백질"은 폐 종양 세포에 의해 발현되는 단백질이다. 폐 종양 단백질인 단백질은 또한 면역검정(예, ELISA)에서 검출될 정도로 폐암 환자의 항혈청과 반응한다. 본원에 기술된 폴리펩타이드는 어떠한 길이도 가능할 수 있다. 천연 단백질 및/또는 이종 서열로부터 유도된 추가의 서열이 존재할 수 있으며 이러한 서열은 추가의 면역원성 또는 항원성을 필요로 하지는 않지만 보유한다.
본원에 사용된 "면역원성 부분"은 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합하는) 단백질의 부분이다. 이러한 면역원성 부분은 일반적으로 폐 종양 단백질 또는 이의 변이체의 5개 이상의 아미노산 잔기, 더욱 바람직하게는 10개 이상, 훨씬 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 특정한 바람직한 면역원성 부분은 N-말단 리더 서열 및/또는 트랜스막 도메인이 결실된 펩타이드를 포함한다. 다른 바람직한 면역원성 부분은 성숙 단백질에 대하여 작은 N- 및/또는 C-말단 결실(예, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)을 함유할 수 있다.
면역원성 부분은 일반적으로 잘 공지된 기술, 예를 들면 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993)] 및 본원에 인용된 참조 문헌에 요약된 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 이러한 기술로는 항원-특이적 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응할 수 있는 능력에 대해 폴리펩타이드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본원에 사용된 항혈청 및 항체는 이들이 항원과 특이적으로 결합하는 경우(즉, 이들이 ELISA 또는 면역검정에서 그 항원 단백질과 반응하고 무관한 단백질과는 검출될 정도로 반응하지 않음) "항원-특이적"인 것이다. 이러한 항혈청 및 항체는 본원에 기술된 바와 같이 및 잘 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 천연 폐 종양 단백질의 면역원성 부분은 (ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정에서) 전체 길이 폴리펩타이드의 반응성보다 실질적으로 적지 않은 수준에서 그러한 항체 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다. 이러한 면역원성 부분은 상기 검정에서 전체 길이 폴리펩타이드의 반응성과 유사하거나 그 이상인 수준으로 반응할 수 있다. 이러한 선별은 일반적으로 당업자에게 잘 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 고체 지지체 상에 고정시키고 환자의 혈청과 접촉시켜 혈청내의 항체가 고정된 폴리펩타이드에 결합되도록 할 수 있다. 이어서, 비결합된 혈청은 제거하고 결합된 항체는 예를 들면125I-표지된 프로테인 A를 사용하여 검출할 수 있다.
상기된 바와 같이 조성물은 천연 폐 종양 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 폴리펩타이드 "변이체"는 천연 폐 종양 단백질과 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입으로 상이하지만 폴리펩타이드의 면역원성이 실질적으로 감소되지 않은 폴리펩타이드이다. 다시 말해서, 변이체가 항원-특이적 항혈청과 반응하는 능력은 천연 단백질에 비해 증가되거나 불변일 수 있거나 천연 단백질에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만으로 감소할 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩타이드 서열중 하나를 변형시키고 본원에 기술된 바와 같이 항원-특이적 항체 또는 항혈청과 변형된 폴리펩타이드의 반응성을 평가함으로써 동정할 수 있다. 바람직한 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 트랜스막 도메인과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 것을 포함한다. 다른 바람직한 변이체는 성숙 단백질의 N- 및/또는 C-말단으로부터 작은 일부분(예, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)이 제거된 변이체를 포함한다.
본 발명에 속하는 폴리펩타이드 변이체는 본원에 기술된 폴리펩타이드와 (상기된 바와 같이 결정되었을 때) 적어도 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 나타내는 것을 포함한다.
바람직하게는, 변이체는 보존 치환을 함유한다. "보존 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 펩타이드 화학 분야의 전문가가 그 폴리펩타이드의 이차 구조 및 수친화성 특성이 실질적으로 변하지 않을 것으로 기대할 수 있는 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로 잔기의 극성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성에서의 유사성을 기초로 이루어질 수 있다. 예를들면, 음전하 아미노산으로는 아스파트산 및 글루탐산이 포함되고, 양전하 아미노산으로는 라이신 및 아르기닌이 포함되며, 비전하 극성 헤드 그룹이 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산으로는 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다. 보존 변화를 나타낼 수 있는 아미노산의 다른 그룹으로는 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his가 포함된다. 변이체는 또한, 비보존 변이를 함유할 수 있다. 바람직한 양태로서, 변이체 폴리펩타이드는 5개 이하의 아미노산이 치환, 결실 또는 부가되어 천연 서열과 다르다. 변이체는 또한 예를 들면, 폴리펩타이드의 면역원성, 이차 구조 및 수친화성 성질에 최소로 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있다.
상기된 바와 같이, 폴리펩타이드는 해독과 동시에 또는 해독 후에 단백질의 전달을 지시하는 단백질의 N-말단에 신호(또는 리더) 서열을 함유할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 이의 편리한 합성, 정제 또는 동정을 위해 또한 고체 지지체에 폴리펩타이드의 결합을 증강시키기 위해 링커 또는 다른 서열(예, 폴리-His)에 연결될 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 결합될 수 있다.
폴리펩타이드는 잘 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 상기된 DNA 서열에 의해 암호화된 재조합 폴리펩타이드는 당업자에게 공지된 여러 발현 벡터를 사용하여 DNA 서열로부터 쉽게 제조할 수 있다. 발현은 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 함유한 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 적절한 숙주 세포에서 달성될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵세포, 효모 및 고등 진핵세포(예, 포유동물 세포 및 식물 세포)가 포함된다. 바람직하게 사용되는 숙주 세포는 이. 콜라이, 효모 또는 포유동물 세포주(예, COS 또는 CHO)이다. 재조합 단백질 또는 폴리펩타이드를 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주/백터 시스템으로부터의 상청액은 우선 시판되고 있는 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 후 농축물을 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적합한 정제 매트릭스에 적용할 수 있다. 마지막으로, 하나 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 추가로 재조합 폴리펩타이드를 정제할 수 있다.
약 100개 미만, 일반적으로 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 부분 및 다른 변이체는 또한 당업자에게 잘 공지된 기술을 사용하는 합성 수단에 의해 생성할 수 있다. 예를 들면, 아미노산을 연속적으로 성장하는 아미노산 수지에 첨가하는 이러한 폴리펩타이드는 메리필드 고체상 합성 방법과 같이 시판중에 있는 고체상 기술중 하나를 사용하여 합성할 수 있다[참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동 합성 장비는 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼(캘리포니아 포스터 시티 소재)과 같은 제조업체로부터 시판되고 있으며 제조업자의 지침에 따라 작동시킬 수 있다.
특정 양태로서, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 다수의 폴리펩타이드를 포함하거나 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드와 종양 단백질과 같이 무관한 서열을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 파트너는 예를 들면 T 헬퍼에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼 에피토프를 제공하는데 보조 역할을 할 수 있거나 단백질(발현 인핸서)을 천연 재조합 단백질보다 높은 수율로 발현하는데 보조 역할을 할 수 있다. 특정한 바람직한 융합 파트너는 면역학적 및 발현 증강성을 둘다 제공하는 융합 파트너이다. 다른 융합 파트너는 단백질의 용해성을 증가시키거나 단백질이 목적하는 새포내 구획에 표적화될 수 있도록 선택될 수 있다. 추가의 융합 파트너는 단백질의 정제를 촉진하는 친화성 태그를 포함한다.
융합 단백질은 일반적으로 화학적 결합을 포함하여 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 재조합 단백질로서 발현되며, 비융합된 단백질에 비하여 증가된 수준의 생성을 발현 시스템에서 허용한다. 요약하면, 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 별도로 집합될 수 있으며 적절한 발현 벡터내로 연결될 수 있다. 한 개의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단은 펩타이드 링커를 통해 또는 펩타이드 링커 없이 제2 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결되어 서열의 판독 프레임이 같은 상에 존재한다. 이것은 양 성분의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 유지하는 단일 융합 단백질로의 해독을 허용한다.
펩타이드 링커 서열을 사용하여 각 폴리펩타이드가 이의 이차 및 삼차 구조로 확실히 폴딩하도록 하기에 충분한 거리 만큼 제1 및 제2 폴리펩타이드 성분을 분리할 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당업자에게 잘 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 단백질내로 혼입한다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 하기의 요소를기초로 선택할 수 있다: (1) 가용성 신장된 형태를 수용할 수 있는 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩타이드상의 작용성 에피토프와 상호작용할 수 있는 이차 구조를 수용할 수 없는 무능력; 및 (3) 폴리펩타이드 작용성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 결여. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. Thr 및 Ala와 같은 다른 중성 근접 아미노산이 또한 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열로는 문헌[Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 기술된 것이 포함된다. 링커 서열은 일반적으로 길이가 1개 내지 약 50개의 아미노산일 수 있다. 링커 서열은 제1 및 제2 폴리펩타이드가 작용성 도메인을 분리하고 입체 장애를 방지하기 위해 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 가질 때 필요하지 않다.
연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동적으로 연결된다. DNA의 발현을 담당하는 조절 요소는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에만 위치한다. 유사하게, 해독 및 전사 종결 시그날을 종결하기 위해 필요한 종결 코돈은 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3'에만 존재한다.
또한, 융합 단백질이 제공된다. 이러한 단백질은 본원에 기술된 폴리펩타이드를 무관한 면역원성 단백질과 함게 포함한다. 바람직하게는, 면역원성 단백질은 리콜 반응을 나타낼 수 있다. 이러한 단백질의 예로는 파상풍, 폐렴 및 간염 단백질이 포함된다[참조: Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997].
바람직한 양태로서, 면역학적 융합 파트너는 그람-음성 세균인 헤모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도된다[WO 제91/18926호]. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 단백질중 약 삼분의 일(예, 처음 N-말단 100 내지 110개 아미노산)을 포함하며 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 특정한 바람직한 양태로서, 지단백질 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기가 N-말단에 포함되어 추가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 폴리펩타이드를 제공하고 이. 콜라이에서 발현 수준을 증가시킨다(따라서, 발현 인핸서로서 작용한다). 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 항원의 최적 제시를 보장한다. 다른 융합 파트너로는 인플루엔자 바이러스 NS1(헤마글루티닌)로부터의 비-구조적 단백질을 포함한다. 전형적으로, T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편을 사용할 수 있지만, N-말단 81개 아미노산이 사용된다.
다른 양태로서, 면역학적 융합 파트너는 LYTA로 공지된 단백질 또는 이의 일부분(바람직하게는 C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다제 LYTA[LytA 유전자에 의해 암호화됨; Gene 43:265-292, 1986]로 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성하는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 유도된다. LYTA는 펩티도글리칸 골격내의 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 오토라이신이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 일부 콜린 유사체(예, DEAE)에 대한 친화성을 담당하고 있다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현 플라스미드의 개발을 위해 활용되어 왔다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 공개되어 있다[참조: Biotechnology 10:795-798, 1992]. 바람직한 양태로서, LYTA의 반복 부분은 융합 단백질내로 혼입될 수 있다. 반복 부분은 잔기 178에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 부분은 잔기 188 내지 305를 포함한다.
일반적으로, 본원에 기술된 폴리펩타이드(융합 단백질을 포함함) 및 폴리뉴클레오타이드는 분리된다. "분리된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드"는 이의 최초 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들면, 천연 단백질은 자연계에서 공존하는 물질중 일부 또는 전부로부터 분리된 경우 분리된 것이다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩타이드는 순도가 적어도 약 90%, 더욱 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다. 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 이것이 천연 환경의 일부분이 아닌 벡터내로 클로닝된 경우 분리된 것으로 고려된다.
결합제
본 발명은 또한 폐 종양 단백질과 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 항원-결합 단편과 같은 물질을 제공한다. 본원에 사용된 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 만일 이것이 검출가능한 수준으로(예를 들면 ELISA에서) 폐 종양 단백질과 반응하고 검출될 정도로 관련이 없는 단백질과 유사한 조건하에서 반응하지 않는 경우 폐 종양 단백질과 "특이적으로 결합"하는 것이라 한다. 본원에 사용된 "결합"은 두 개의 분리된 분자가 비공유로 결합하여 복합체를 형성한 것을 가리킨다. 결합 능력은 예를 들면 복합체의 형성에 대한 결합 상수를 결정함으로써 평가될 수 있다. 결합 상수는 복합체의 농도가 성분 농도의 결과로서 나누었을 때 얻은 값이다. 일반적으로, 두 화합물은 복합체 형성에 대한 결합 상수가 약 103L/mol을 초과할 때 본 발명에 있어서 "결합한다"라고 말한다. 결합 상수는 당해 분야에 잘 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
결합제는 또한 본원에 제공된 대표적인 검정을 사용하여 폐암과 같은 암 환자와 정상인을 구별해 줄 수 있다. 다시 말해서, 폐 종양 단백질과 결합하는 항체 또는 다른 결합제는 질환자의 약 20% 이상에서 암의 존재를 지시하는 시그날을 발생하며 암이 없는 사람의 약 90% 이상에서 암의 부재를 지시하는 음성 시그날을 발생한다. 결합제가 이러한 요건을 만족하는 지를 결정하기 위해, 암환자 및 암을 앓고 있지 않은 사람으로부터의 생물학적 샘플(예, 혈액, 혈청, 타액, 뇨 및/또는 종양 생검)은 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대해 본원에 기술된 바와 같이 검정할 수 있다. 질환자와 정상인의 샘플에 대해 통계상 유의적인 수가 검정되어야 함을 분명하다. 각 결합제는 상기 기준을 충족해야 한다. 그러나, 당업자는 결합제의 민감성을 향상시키기 위해 배합하여 사용할 수 있음을 인지할 것이다.
상기 요건을 만족하는 어떠한 물질도 결합제가 될 수 있다. 예를 들면, 결합제는 펩타이드 성분, RNA 분자 또는 폴리펩타이드를 갖거나 갖지 않는 리보좀일 수 있다. 바람직한 양태로서, 결합제는 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다. 항체는 당업자에게 공지된 여러 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기술된 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술에의해 제조하거나 재조합 항체의 생성을 위해 항체 유전자를 적합한 세균 또는 포유동물 세포 숙주내로 형질감염시켜 제조할 수 있다. 한 가지 기술로서, 폴리펩타이드를 포함한 면역원을 먼저 여러 포유동물(예, 마우스, 랫트, 토끼, 양 또는 염소)에 주사한다. 이 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형없이 면역원으로서 작용할 수 있다. 대안으로서, 특히 비교적 짧은 폴리펩타이드의 경우, 이 폴리펩타이드가 소 혈청 알부민 또는 키홀 삿갓조개 헤모시아닌과 같은 담체 단백질에 결합되는 경우 우수한 면역 반응이 나타날 수 있다. 면역원은 바람직하게는 하나 이상의 추가접종 면역화를 포함하여 예정된 절차에 따라 동물 숙주로 주사하고 동물로부터 주기적으로 채혈한다. 이어서, 폴리펩타이드에 대해 특이적인 폴리클로날 항체를 항혈청으로부터 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 사용하여 친화성 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
해당 항원성 폴리펩타이드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들면 문헌[Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6:511-519, 1976]의 기술 및 이의 개선된 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 간단히 설명하면, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 해당 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 생성할 수 있는 불멸 세포주의 제조를 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면, 상기된 바와 같이 면역화된 동물로부터 수득될 수 있는 비장 세포로부터 생성할 수 있다. 이어서, 비장 세포는 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 것과의 융합에 의해 불멸화한다. 여러 융합 기술이 사용될 수 있다. 예를 들면, 비장 세포와 골수종 세포를 비이온성 세정제와 수분 동안 배합한 다음, 하이브리드세포의 성장을 지지하지만 골수종 세포는 지지하지 않는 선택 배지에서 낮은 밀도로 플레이팅한다. 바람직한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 사용한다. 충분한 시간 후에, 보통 약 1 내지 2 주 후에 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니가 선별되고 이들의 배양 상청액을 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해 검사한다. 높은 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체를 성장시킨 하이브리도마 콜로니의 상청액으로부터 분리할 수 있다. 또한, 여러 기술을 사용하여 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복강내로 하이브리도마 세포주를 주사하는 것과 같이 수율을 증대시킬 수 있다. 그런 다음, 복수액 또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수확할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 항체로부터 오염물을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 예를 들면, 친화성 크로마토그래피 단계의 정제 과정에서 사용할 수 있다.
특정 양태로서, 항체의 항원-결합 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 단편으로는 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있는 Fab 단편이 포함된다. 간단히 설명하면, 프로테인 A 비드 컬럼에서 친화성 크로마토그래피하여 토끼 혈청으로부터 면역글로불린을 정제하고[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], 파파인으로 분해시켜 Fab 및 Fc 단편을 수득할 수 있다. Fab 및 Fc 단편은 프로테인 A 비드 컬럼에서 친화성 크로마토그래피에 의해 분리할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체는 하나 이상의 치료제에 결합시킬 수 있다. 이러한 관점에서 적합한 물질은 방사성 핵종, 분화 유도제, 약물, 독소 및 이들의 유도체를 포함한다. 바람직한 핵종으로는90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi가 포함된다. 바람직한 약물로는 메토트렉세이트 및 피리디민 및 퓨린 유사체가 포함된다. 바람직한 분화 유도제로는 포르볼 에스테르 및 부틸산이 포함된다. 바람직한 독소로는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 엑소톡신, 쉬겔라 독소 및 미국자리공 항바이러스 단백질이 포함된다.
치료제는 적합한 모노클로날 항체에 직접적으로 또는 간접적으로(예, 링커 그룹을 통해) 결합될 수 있다(예, 공유 결합). 치료제와 항체 사이의 직접적인 반응은 각각이 다른 것과 반응할 수 있는 치환체를 소유할 때 가능하다. 예를 들면, 한쪽의 친핵성 그룹(예, 아미노 또는 설프하이드릴 그룹)은 다른 쪽의 카보닐-함유 그룹(예, 무수물 또는 산 할라이드) 또는 양호한 이탈 그룹(예, 할라이드)을 함유한 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
대안으로서, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통해 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 결합능에 대한 간섭을 피하기 위해 치료제로부터 항체를 떨어뜨리기 위해 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 또한 치료제 또는 항체상의 치환체의 화학 반응성을 증가시키고 이에 따라 결합 효능을 증가시키는 작용을 할 수 있다. 화학 반응성의 증가는 또한 치료제 또는 치료제상의 작용기의 사용을 촉진할 수 있는 한편 가능하지 않을 수 있다.
호모- 및 헤테로-작용성인 다양한 이작용성 또는 다작용성 시약(예, 일리노이 락포드 소재 피어스 케미칼 컴퍼니의 카달로그에 기술되어 있는 시약)이 링커 그룹으로서 사용될 수 있음을 당업자에게는 명백하다. 결합은 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해 이루어질 수 있다. 많은 문헌에 이러한 방법이 기술되어 있으며 예를 들면, 로드웰 (Rodwell) 등의 미국 특허 제4,671,958호가 있다.
치료제가 본 발명의 면역결합체의 항체 부분으로 유리될 때 더욱 효능적일 경우, 세포내로 내부화되는 동안 또는 내부화될 때 절단될 수 있는 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 많은 상이한 절단가능한 링커 그룹이 기술되어 있다. 이들 링커 그룹으로부터 물질의 세포내 방출에 대한 메카니즘은 디설파이드 그룹의 환원[예, 스피틀러의 미국 특허 제4,489,710호], 광분해성 결합의 조사[예, 센터 등의 미국 특허 제4,625,014호], 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해[예, 콘 등의 미국 특허 제4,638,045호], 혈청 보체-매개된 가수분해[예, 로드웰 등의 미국 특허 제4,671,958호] 및 산-촉매된 가수분해[예, 블라틀러 등의 미국 특허 제4,569,789호]에 의한 절단을 포함한다.
한 개 이상의 치료제를 항체에 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 한 가지 양태로서, 치료제의 다수 분자가 한 개의 항체 분자에 결합된다. 다른 양태로서, 한 가지 이상의 치료제 유형이 하나의 항체에 결합될 수 있다. 특정 양태와 상관없이, 한 개 이상의 치료제를 갖는 면역결합체는 여러 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 한 개 이상의 치료제는 항체 분자에 직접 결합되거나 다수의 결합 부위를 제공하는 링커가 사용될 수 있다. 대안으로서 담체가 사용될 수 있다.
담체는 직접적이거나 링커 그룹을 통해서거나 공유 결합을 포함하여 여러 방법으로 치료제를 함유할 수 있다. 적합한 담체로는 알부민[예, 카토 등의 미국 특허 제4,507,234호]과 같은 단백질, 아미노덱스트란[시흐 등의 미국 특허 제4,699,784호]과 같은 펩타이드 및 다당류가 포함된다. 담체는 또한 치료제를 비공유 결합에 의해서거나 리포좀 소포[미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호]내에서와 같은 캡슐화에 의해 함유할 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사성할로겐화 소분자 및 이들의 제조방법이 기술되어 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속, 금속 산화물 또는 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 데이비슨 등의 미국 특허 제4,673,562호에는 대표적인 킬레이트 화합물 및 이들의 제조방법이 기술되어 있다.
항체 및 면역결합체에 대한 여러 투여 경로가 사용될 수 있다. 전형적으로, 투여는 정맥내, 근육내, 피하 또는 절개된 종양의 베드내이다. 항체/면역결합체의 정확한 용량은 사용된 항체, 종양 상의 항원 밀도 및 항체의 청소율에 따라 다양하다는 것은 명백하다.
T 세포
면역치료 조성물은 또한 폐 종양 단백질에 대해 특이적인 T 세포를 포함한다. 이러한 세포는 일반적으로 표준 절차를 사용하여 시험관내 또는 생체외에서제조할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 골수, 말초혈액 또는 환자의 골수 또는 말초혈액의 분획으로부터 넥셀 쎄라퓨틱스 인코포레이티드(캘리포니아 어어빈 소재)의 IsolexTMSystem과 같이 시판되고 있는 세포 분리 시스템을 사용하여 분리할 수 있다[참조: 미국 특허 제5,240,856호; 미국 특허 제5,215,926호; WO 제89/06280호; WO 제91/16116호 및 WO 제92/07243호]. 대안으로서, T 세포는 관련되거나 관련되지 않은 사람, 비-사람 포유동물, 세포주 또는 배양물로부터 유도될 수 있다.
T 세포는 폐 종양 폴리펩타이드, 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 그러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포(APC)로 자극할 수 있다. 이러한 자극은 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포의 발생을 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 실시한다. 바람직하게는, 폐 종양 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 특정 T 세포의 발생을 촉진하기 위해 미세구체와 같은 전달 비히클내에 존재한다.
T 세포는 만일 이러한 T 세포가 특이적으로 증식하거나, 사이토킨을 분비하거나, 폴리펩타이드로 피복되거나 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 경우, 폐 종양 폴리펩타이드에 특이적인 것으로 고려된다. T 세포 특이성은 여러 표준 기술을 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 크롬 방출 검정 또는 증식 검정에서, 음성 대조군에 비하여 용해 및/또는 증식이 2배 이상 증가한 자극 지수는 T 세포 특이성을 가리킨다. 이러한 검정은 예를 들면 문헌[Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기술된 바와 같이 수행할수 있다. 대안으로서, T 세포 증식의 검출은 여러 공지 기술에 의해 달성할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가 속도를 측정함으로써(예, T 세포의 배양물을 삼중수소화 티미딘으로 펄스 표지하고 DNA내로 혼입된 삼중수소화 티미딘의 양을 측정함으로써) 검출할 수 있다. 3 내지 7일 동안 폐 종양 폴리펩타이드(100 ng/㎖ - 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 200 ng/㎖ - 25 ㎍/㎖)와의 접촉은 T 세포의 증식을 적어도 2배 증가시키는 결과를 제공해야 한다. 상기된 바와 같이 2 내지 3시간 동안의 접촉은 표준 사이토킨 검정을 사용하여 측정했을 때 T 세포의 활성화를 유발해야 한다. 사이토킨(예, TNF 또는 IFN-γ)의 방출 수준이 2배 증가하는 것은 T 세포의 활성화를 지시한다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]. 폐 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드-발현 APC에 반응하여 활성화된 T 세포는 CD4+및/또는 CD8+일 수 있다. 폐 종양 단백질 특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다. 바람직한 양태로서, T 세포는 환자, 관련된 공여자 또는 관련이 없는 공여자로부터 유도되고 자극 및 증식 후 환자에 투여된다.
치료 목적상, 폐 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+및/또는 CD8+T 세포는 시험관내 또는 생체내로 증식시킬 수 있다. 시험관내에서의 그러한 T 세포의 증식은 여러 방법으로 달성될 수 있다. 예를 들면, T 세포를 T 세포 성장 인자(예, 인터루킨-2) 및/또는 폐 종양 폴리펩타이드를 합성하는 자극 세포를 첨가하거나 첨가하지 않고서, 폐 종양 폴리펩타이드 또는 이러한 폴리펩타이드의 면역원 부분에 상응하는 짧은 펩타이드에 재노출시킬 수 있다. 대안으로서, 폐 종양 단백질의 존재하에 증식하는 하나 이상의 T 세포는 클로닝에 의해 증식시킬 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 제한 희석법이 포함된다.
약제학적 조성물
추가의 양태에서, 본 발명은 세포 또는 동물에 단독으로, 또는 하나 이상의 치료 양식과 병행 투여를 위한 약제학적으로 허용되는 용액 중의 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T-세포 및/또는 항체 조성물 중 하나 이상의 제형에 관한 것이다.
또한, 필요에 따라, 예를 들면 본원에서 기재된 폴리펩타이드를 발현하는 핵산 단편, RNA, DNA 또는 PNA 조성물이 타 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 각종 약제학적 활성 제제와 함께 투여될 수 있음이 이해될 것이다. 사실, 부수적인 제제가 표적 세포나 숙주 조직과 접촉시에 심각한 부작용을 일으키지 않는 한, 포함될 수 있는 다른 성분에는 실질적으로 어떠한 제한도 없다. 따라서, 조성물은 특정 경우에 요구되는 바에 따라 각종 타 제제와 함께 전달될 수도 있다. 그러한 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 본원에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 또한, 이러한 조성물은 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 비내, 및 근육내 투여 및 제형을 포함한다양한 처치법으로 본원에 기재된 특정 조성물의 사용을 위한 적당한 투약 및 처리방법의 개발로, 약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형 방법은 당업자에 익히 공지되어 있다.
1. 경구 전달
특정의 적용에 있어서, 본원에 기재된 약제학적 조성물은 동물에 경구 투여를 통해 전달될 수 있다. 이와 같이, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 제형될 수 있거나, 경질 또는 연질-외피 젤라틴 캡슐에 봉입될 수 있거나, 정제로 타정될 수 있거나, 다이어트 식품과 직접 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 부형제와도 혼입될 수 있고 섭취가능한 정제, 구강용 정제, 트로키제, 캡슐, 엘릭서, 현탁제, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다[Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; 미국 특허 제5,641,515호; 미국 특허 제5,580,579호 및 미국 특허 제5,792,451호, 각각 본원에 참조로 인용됨]. 정제, 트로키제, 환제, 캡슐 등은 또한 하기의 성분을 함유할 수 있다: 결합제, 예를 들면 트라가칸트 고무, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면 인산이칼슘; 붕해제, 예를 들면 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예를 들면 슈크로스, 락토스 또는 사카린이 첨가될 수 있거나 페퍼민트, 윈터그린 오일, 또는 체리 향과 같은 향미제가 첨가될 수 있다. 투약 단위 형태가 캡슐일 경우, 상기한 종류의 물질 외에도, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 기타 물질이 코팅으로서 또는 투약 단위의물리적 형태를 변형시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제, 또는 캡슐은 쉘락, 당, 또는 양자 모두로 코팅될 수 있다. 엘리서 시럽은 활성 화합물, 감미제로 슈크로스, 방부제로 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제로 체리 향 또는 오렌지 향을 함유할 수 있다. 물론, 투약 단위형의 제조에 사용된 물질은 약제학적으로 순수하고 사용된 양에서 실질적으로 무독해야 한다. 아울러, 활성 화합물은 서방형 제제 및 제형 중으로 혼입될 수 있다.
전형적으로, 이들 제형은 활성 화합물을 적어도 약 0.1% 이상 함유할 수 있지만, 활성 성분의 %는 물론 변할 수 있으며 편의상 전체 제형의 약 1% 또는 2%, 약 60% 또는 70% 이상(중량% 또는 용적%)일 수 있다. 당연히, 각각의 치료적으로 유용한 조성물내 활성 화합물의 양은 적당한 용량이 화합물의 주어진 단위 용량으로 수득되도록 하는 방식으로 제조될 수 있다. 용해도, 생체이용율, 생물학적 반감기, 투여 경로, 산물의 저장 수명, 및 기타 약리학적 고려사항 등의 요인이 이러한 약학 제제 제조 분야의 당업자에 의해 고려될 것이며, 이와 같이 다양한 투여량 및 처치 방법이 요망될 수 있다.
경구 투여의 경우, 본 발명의 조성물은 구강세척제, 치마제(dentifrice), 구강용 정제, 경구용 스프레이, 또는 설하 경구-투여 제형 형태로 하나 이상의 부형제와 혼입될 수 있다. 예를 들면, 나트륨 보레이트 용액(Dobell's Solution)과 같이 적당한 용매에 활성 성분을 필요량으로 포함하는 구강세척제를 제조할 수 있다. 대안으로, 활성 성분은 나트륨 보레이트, 글리세린 및 칼륨 비카보네이트와 같은 경구용액에 혼입시키거나, 치마제에 분산시키거나, 또는 물, 결합제, 연마제, 향미제, 발포제, 및 보습제를 포함할 수 있는 조성물에 치료 유효량으로 첨가될 수 있다. 대안으로, 조성물은 혀 밑에 두거나 구강에서 용해될 수 있는 정제 또는 용액 형태로 제형될 수 있다.
2. 주사가능한 전달
특정한 상황에서는, 미국 특허 제5,543,158호; 미국 특허 제5.641,515호 및 미국 특허 제5,399,363호(각각 본원에서 참조로 인용)에 기재된 바와 같이 본원에 개시된 약제학적 조성물을 비경구, 정맥내, 근육내, 또는 복막내로 전달하는 것이 바람직할 것이다. 유리 염기 또는 약리학적 허용 염으로서 활성 화합물의 용액은 하이드록시프로필셀룰로스와 같은 계면활성제와 적당히 혼합된 물에서 제조될 수 있다. 분산액도 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물에서 및 오일에서 제조할 수 있다. 통상의 보관 및 사용 조건하에서, 이들 제제는 미생물 증식 방지를 위한 방부제를 함유한다.
주사용으로 적당한 약제학적 형태로는 멸균 수용액 또는 분산액 및 멸균 주사액 또는 분산액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말이 포함된다[미국 특허 제5,466,468호, 본원에 참조로 인용]. 모든 경우에, 형태는 멸균성이어야 하고 용이하게 주사가능할 정도의 유체이어야 한다. 제조 및 보관 조건에서 안정하여야 하고 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대해 방부성이어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적당한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산매일 수 있다. 적당한 유동성은 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅을 이용하거나, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써 및 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진될 수 있다. 다수의 경우에, 등장화제, 예를 들면 당이나 염화나트륨을 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 조성물에 사용함으로써 달성된다.
예를 들어, 수용액으로 비경구 투여할 경우, 용액은 필요에 따라 적절히 완충시켜야 하고 액체 희석제는 먼저 충분량의 생리식염수 또는 글루코스로 등장성이 되게 한다. 이들 특정 수용액은 정맥내, 근육내, 피하 및 복막내 투여에 특히 적당하다. 이와 관련하여, 사용될 수 있는 멸균 수성 매질은 본 명세서의 개시 내용에 비추어 당업자라면 알 수 있을 것이다. 예를 들면, 1회 투여량을 등장성 NaCl 용액 1 ㎖에 용해시킬 수 있고 피하주입액 1000 ㎖에 가하거나 제시된 주입 부위에 주사할 수 있다[예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]. 치료되는 피검자의 증상에 따라 투약량의 약간의 변화가 필요할 것이다. 여하튼간에, 투여를 담당하는 사람이 개개 피검자에 대한 적정 용량을 결정하게 된다. 또한, 인간에 투여할 경우, 제제는 생물학적 약제 표준에 대한 FDA(FDA Office of Biologics standard)에 의해 요구되는 멸균성, 발열성, 및 일반 안전성과 순도 표준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사액은 전술한 각종 다른 성분과 함께 필요량의 활성 화합물을 적당한 용매에 혼입시킨 다음 멸균 여과함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산매 및 상기 열거된 것들로부터의 필요한 다른 성분을 함유하는 멸균 비히클에 다양한 멸균 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조된다. 멸균 주사액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우에, 바람직한 제조방법은 활성 성분과 사전에 멸균 여과한 용액으로부터의 추가의 목적 성분의 분말을 생성하는 진공-건조 및 동결건조술이다.
본원에 개시된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염은 (단백질의 유리 아미노 그룹으로 형성되고) 예를 들면, 염산 또는 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타타르산, 만델릭산 등과 같은 유기산으로 형성되는 산 부가염을 포함한다. 유리 카복실 그룹으로 형성된 염은 또한, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 철 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 투약 제형과 상용성이고 치료 유효량으로 투여될 것이다. 제형은 주사액, 약물-방출 캡슐 등과 같은 다양한 투약형으로 용이하게 투여된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "담체"는 임의의 모든 용매, 분산매, 비히클, 코팅, 희석제, 항균제 및 항진균제, 등장화제 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함한다. 약제학적 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업자에 익히 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고는, 치료 조성물에서의 사용이 고려된다. 보충적인 활성 성분도 조성물에 혼입될 수 있다.
"약제학적으로 허용되는"이란 구절은 인간에 투여시 알레르기 반응 또는 이와 유사한 다루기 힘든 반응을 일으키지 않는 분자 실체 및 조성물을 말한다. 활성 성분으로 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조도 당업계에 잘 이해되어 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사 가능한 액체 용액 또는 현탁액으로 제조되고; 주사에 앞서 액체 중의 용액, 또는 현탁액용으로 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다.
3. 비강 전달
특정 양태에서, 약제학적 조성물은 비내 스프레이, 흡입, 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달될 수 있다. 비강 에어로졸 스프레이를 통해 폐에 유전자, 핵산, 및 펩타이드 조성물을 직접 전달하는 방법은 예를 들면, 미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호(각각 본원에 참조로 인용)에 기재되어 있다. 이와 마찬가지로, 비내 미립자 수지[Takenaga et al., 1998] 및 라이소포스파티딜-글리세롤 화합물[미국 특허 제5,725,871호, 본원에 참조로 인용]을 이용한 약제 전달 방법도 제약업계에 익히 공지되어 있다. 또한, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지 매트릭스 형태로 점막을 경유한 약제 전달도 미국 특허 제5,780,045호(본원에 참조로 인용)에 기재되어 있다.
4. 리포솜-, 나노캡슐-, 및 미립자-매개 전달
특정 양태에서, 본 발명자는 본 발명의 조성물을 적당한 숙주 세포에 도입하는데에, 리포솜, 나노캡슐, 미립자, 미세구체, 지질 입자, 소포 등의 사용을 고려에 넣는다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포솜, 소포, 나노스피어, 또는 나노입자 등에 캡슐화된 전달용으로 제형될 수 있다.
이러한 제형은 본원에서 개시된 핵산 또는 작제물의 약제학적으로 허용되는 제형의 도입에 바람직하다. 리포솜의 형성과 사용이 당업자에 일반적으로 공지되어 있다[예를 들면, Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1998 참조; 세포내 박테리아 감염 및 질환에 대한 표적화된 항생제 요법에서 리포솜 및 나노캡슐의 사용을 기술하고 있음]. 최근에 와서, 혈청 안정성 및 순환 반감기가 향상된 리포솜이 개발되었다[Gabizon and Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987; 미국 특허 제5,741,516호, 본원에 참조로 인용]. 또한, 잠재적인 약물 담체로서 리포솜 및 리포솜 유사 제제의 다양한 방법이 고찰되었다[Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; 미국 특허 제5,567,434호; 미국 특허 제5,552,157호; 미국 특허 제5,565,213호; 미국 특허 제5,738,868호 및 미국 특허 제5,795,587호, 각각 본원에 참조로 인용].
리포솜은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양액 및 PC 12 세포를 포함하며 다른 절차에 의한 형질감염에 통상적으로 내성을 보이는 다수의 세포 종에 성공적으로 사용되어 왔다[Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990]. 또한, 리포솜은 바이러스계 전달 시스템에서 통상적인 DNA 길이로 인한 구속이 없다. 리포솜은 유전자, 약물[Heath and Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta and Puglisi, 1996], 방사능치료제[Pikul et al., 1987], 효소[Imaizumi et al., 1990a; Imaizumi et al., 1990b], 바이러스[Faller and Baltimore, 1984], 전사 인자 및 알로스테릭 이펙터[Nicolau and Gersonde, 1979]를 다양한 배양 세포주 및 동물에 도입하는데 효과적으로 사용되어져 왔다. 또한, 리포솜-매개 약물 전달의 효과를 검사하는 여러 성공적인 임상적 시도가 이루어졌다[Lopez-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988]. 또한, 여러 연구에 따르면, 리포솜의 사용이 전신 전달 후에 자가면역 반응, 독성 또는 생식선 편중을 수반하지 않음을 암시한다[Mori and Fukatsu, 1992].
리포솜은 수성 매질에 분산되어 다층상 동심성 이중층 소포(다층상 소포(MLV)로도 불림)를 자발적으로 형성하는 인지질로부터 형성된다. MLV는 일반적으로 25 nm 내지 4 ㎛의 두께를 갖는다. MLV를 초음파처리하면 직경이 200 내지 500 Å 범위이고, 코어에 수용액을 함유하는 작은 단층상 소포(SUV)가 형성된다.
리포솜은 세포막과 유사하며 펩타이드 조성물에 대한 담체로서 본 발명과 관련한 사용이 고려된다. 이들은 수용성 및 지용성 물질 모두가 트래핑될 수 있으므로, 즉 각각, 수성 공간에 및 이중층 자체 내에 트래핑될 수 있어 광범위하게 적합하다. 약제-함유 리포솜은 리포솜 제형을 선택적으로 변성시킴으로써 활성제의 부위-특이적 전달에도 사용될 수 있다.
문헌[Couvreur et al.(1977; 1988)]의 교시 외에도, 하기의 정보가 리포솜 제형의 생산에 사용될 수 있다. 인지질은 물에 대한 지질의 몰비에 따라, 물에 분산될 때 리포솜 이외의 다양한 구조를 형성할 수 있다. 낮은 비에서, 리포솜은 바람직한 구조이다. 리포솜의 물리적 특징은 pH, 이온 강도 및 이가 양이온의 존재에 좌우된다. 리포솜은 이온 및 극성 물질에 낮은 투과성을 보이지만, 고온에서는 투과성을 현저히 변성시키는 상 전이를 겪는다. 상 전이는 밀접하게 패킹되고 정렬된 구조(겔 상태로 알려져 있음)에서 느슨하게 패킹되고 덜 정렬된 구조(유체 상태로 알려져 있음)로의 변화를 동반한다. 이러한 현상은 특징적인 상 전이 온도에서 일어나고 이온, 당 및 약제에 대한 투과성 증가를 일으킨다.
온도 외에, 단백질에의 노출도 리포솜의 투과성을 변성시킬 수 있다. 사이토크롬 C와 같은 특정의 가용성 단백질은 이중층에 결합하여 이를 변형시키고 침투하여, 투과성의 변화를 일으킨다. 콜레스테롤은 명백히 인지질을 더욱 긴밀하게 패킹함으로써 단백질의 이러한 침투를 억제한다. 항생물질 및 억제제 전달을 위한 가장 유용한 리포솜 형성은 콜레스테롤을 함유하리라고 생각된다.
용질 트래핑 능력은 리포솜의 상이한 종류 간에 다양하다. 예를 들면, MLV는 용질의 트래핑에서 적당히 효율적이지만, SUV는 지극히 비효율적이다. 그러나, SUV는 크기 분포에 있어서 균질성과 재생성의 장점을 제공하지만, 대형 단일층상 소포(LUV)에 의해 크기와 트래핑 효율 간의 타협이 제공된다. 이들은 에테르 증발에 의해 제조되고 MLV보다 용질 트래핑에 있어 3 내지 4배 더 효율적이다.
리포솜 특성 이외에, 화합물 트래핑의 중요한 결정인자는 화합물 자체의 물리화학적 성질이다. 극성 화합물은 수성 공간에 트래핑되며 비극성 화합물은 소포의 지질 이중층에 결합한다. 극성 화합물은 투과를 통해 또는 이중층이 파괴될 경우에 방출되지만, 비극성 화합물은 온도나 리포단백질에의 노출에 의해 파괴될 때까지는 이중층과 제휴된 채로 남는다. 두 유형 모두 상 전이 온도에서 최대 유출율을 보인다.
리포솜은 4종의 상이한 메커니즘을 통해 세포와 상호작용한다: 대식구 및 호중구와 같은 세망내피조직계의 식균 세포에 의한 엔도사이토시스; 비특이성의 약한 소수성 또는 정전기적 힘, 또는 세포-표면 성분과의 특이적 상호작용에 의한 세포 표면에의 흡착; 원형질막 중으로 리포솜 지질 이중층의 삽입에 의한 원형질 세포막과의 융합(이와 동시에 세포질 중으로 리포솜 내용물의 방출); 및 리포솜 내용물의 회합 없이, 세포 또는 아세포 막으로 리포솜 지질의 전달(또는 그 반대). 종종, 어느 메커니즘이 작동적인지 결정하기가 곤란하고 하나 이상이 동시에 작동될 수도 있다.
정맥내 주사된 리포솜의 운명과 배치는 크기, 유동성, 및 표면 전하와 같은 물리적 성질에 좌우된다. 이들은 조성에 따라 수 시간 또는 수 일간 조직에서 지속될 수 있고, 혈액에서의 반감기는 수 분 내지 수 시간 범위이다. MLV 및 LUV와 같은 대형 리포솜은 세망내피조직계의 식균 세포에 의해 신속히 섭취되지만, 순환계의 생리기능은 대부분의 위치에서 이러한 거대종의 빠져나감을 제지한다. 이들은 거대 개구 또는 세공이 간 또는 비장의 동양혈관과 같은 모세관 내피에 존재할 경우에만 빠져나갈 수 있다. 따라서, 이들 기관은 흡수의 우점 부위이다. 한편, SUV는 좀더 넓은 조직 분포를 보이지만, 여전히 간과 비장에서 고도로 격리된다. 일반적으로, 이러한 생체내 행동은 리포솜의 잠재적인 표적화를 이들의 대형 크기에 접근 가능한 기관과 조직에 국한시킨다. 이러한 것들에는 혈액, 간, 비장, 골수, 및 림프 기관이 포함된다.
표적화는 일반적으로 본 발명의 맥락에서 제한 사항이 아니다. 그러나, 특이적 표적화를 목적하는 경우, 이를 성취할 방법이 이용될 수 있다. 항체를 이용하여 리포솜 표면에 결합시키고 항체와 이의 약제 내용물을 특정 세포형 표면에 위치된 특이적 항원 수용체로 지향시킬 수 있다. 탄수화물 결정자(세포-세포 인식, 상호작용 및 부착에서 소정의 역할을 하는 당단백질 또는 당지질 세포-표면 성분)도 이들이 리포솜을 특정 세포 종으로 지향시키는 잠재능이 있으므로 인식 부위로 사용될 수 있다. 대부분, 리포솜 제제의 정맥내 주사가 이용되겠지만, 다른 투여 경로도 생각해 볼 수 있는 것으로 기대된다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재현가능한 방식으로 화합물을 트래핑할 수 있다[Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987]. 세포내 중합체 과부하에 기인한 부작용을 피하기 위하여, 이러한 초미세 입자(0.1 ㎛ 부근의 크기)는 생체내 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 디자인되어야 한다. 이러한 요구조건을 충족하는 생분해성 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에서의 사용이 기대된다. 이러한 입자는 문헌에 기재된 바와 같이 용이하게 제조할 수 있다[Couvreur et al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al., 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 and 미국 특허 제5,145,684호, 본원에서 참조로 인용].
면역원 조성물
본 발명의 특정의 바람직한 양태에서, 면역원 조성물, 또는 백신이 제공된다. 면역원 조성물은 일반적으로 전술한 바와 같은 하나 이상의 약리학적 조성물을 면역자극제와 함께 포함할 것이다. 면역조절제는 외인성 항원에 대한 면역반응 (항체 및/또는 세포-매개성)을 증진하거나 강화하는 임의 물질일 수 있다. 면역촉진제의 예로는 보조제, 생분해성 미세구체(예를 들면, 폴리락틱 갈락타이드) 및 리포솜[화합물이 혼입됨; 예를 들면, Fullerton, 미국 특허 제4,235,877호]이 포함된다. 백신 제제는 일반적으로, 문헌[예를 들면 M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design(the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press(NY, 1995)]에 기재되어 있다. 본 발명 범위내의 약제학적 조성물 및 면역원 조성물, 또는 백신은 생물학적으로 활성이거나 불활성일 수 있는 다른 화합물도 함유할 수 있다. 예를 들면, 다른 종양 항원의 하나 이상의 면역원성 부분이 조성물내의 융합 폴리펩타이드 중으로 혼입되거나 분리된 화합물로서 존재할 수 있다.
예시되는 면역원 조성물은 폴리펩타이드가 현장에서 생성되도록, 전술한 폴리펩타이드 하나 이상을 암호화하는 DNA를 함유할 수 있다. 전술한 바와 같이, DNA는 핵산 발현 시스템, 박테리아 및 바이러스 발현 시스템을 포함하여 당업자에 공지되어 있는 다양한 전달 시스템으로 존재할 수 있다. 문헌[Rolland, Crit. Rev. Therp. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998, 및 본원에 인용된 참조 문헌에 기재된 것들]과 같이 다수의 유전자 전달 기술이 당업계에 익히 공지되어 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자에서의 발현에 필요한 DNA 서열(적당한 프로모터및 종결 시그널 등)을 함유한다. 박테리아 전달 시스템은 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 세포 표면상에서 발현하거나 그러한 에피토프를 분비하는 박테리아(예를 들면, 바실러스-칼메트-구에린)의 투여를 수반한다. 바람직한 양태에서, DNA는 비-병원성(결손형), 복제능 바이러스의 사용을 수반할 수 있는 바이러스 발현 시스템(예를 들면, 백시니아 또는 다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스, 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입시킬 수 있다. 적당한 시스템은 예를 들면, 문헌[Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci, 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8;17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호, 및 제5,017,487호; WO 제89/01973호; 미국 특허 제4,777,127호; GB 제2,200,651호; EP 제0,345,242호; WO 제91/02805호; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; and Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993]에 기술되어져 있다. DNA를 그러한 발현 시스템에 혼입시키는 기술은 당업자에 익히 공지되어 있다. DNA는 또한 예를 들면, 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에 기재되고 문헌[Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에 의해 고찰된 바와 같이 "나출될" 수도 있다. 나출된 DNA의 흡수는 세포 중으로 효율적으로 수송되는 생분해성 비드에 DNA를 코팅함으로써 증가시킬 수 있다. 면역원 조성물이 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 성분 양자 모두를 포함할 수 있음이 자명해진다. 이러한 면역원 조성물은 증진된 면역 반응을 제공할 수 있다.
면역원 조성물이 본원에서 제공된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있음이 자명해진다. 이러한 염은 유기 염기(예를 들면, 1급, 2급 및 3급 아민과 염기성 아미노산의 염) 및 무기 염기(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)를 포함한 약제학적으로 허용되는 무독성 염기로부터 제조될 수 있다.
당업자에 공지된 적당한 임의의 담체가 본 발명의 면역원 조성물에 사용될 수 있지만, 담체의 종류는 투여 양식에 따라 다양해질 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들면, 국소, 경구, 비강, 정맥내, 두개내, 복막내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한 적당한 투여 방식을 위해 조제될 수 있다. 피하 주사와 같은 비경구 투여의 경우, 담체는 바람직하게는 물, 생리식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여의 경우, 만니톨, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 활석, 셀룰로스, 글루코스, 슈크로스, 및 마그네슘 카보네이트와 같은 전술한 담체나 고체 담체가 사용될 수 있다. 생분해성 미세구체(예를 들면, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)도 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 담체로 사용될 수 있다. 적당한 생분해성 미세구체는 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호; 제5,853,763호; 제5,814,344호 및 제5,942,252호에 기재되어 있다. 클래스 I-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 숙주에서 유도할 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기술된 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체도 사용할 수 있다.
이러한 조성물은 또한, 완충제(예를 들면, 중성의 완충된 생리식염수 또는 포스페이트 완충된 생리식염수), 탄수화물(예를 들면, 글루코스, 만노스, 슈크로스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산(예를 들면, 글라이신), 항산화제, 세균성장억제제, 킬레이트화제(예를 들면, 알루미늄 하이드록사이드), 피수혈자의 혈액으로 제형을 등장성, 저장성 또는 약 고장성으로 만드는 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 방부제를 포함할 수 있다. 이와 달리, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형될 수도 있다. 화합물은 또한 익히 공지된 기술을 이용하여 리포솜에 캡슐화시킬 수도 있다.
다양한 면역자극제가 본 발명의 면역원 조성물에 사용될 수 있다. 예를 들면, 보조제가 포함될 수 있다. 대부분의 보조제는 알루미늄 하이드록사이드 또는 미네럴 오일과 같이 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 디자인된 물질, 및 지질 A, 보르타델라 퍼투시스 또는 마이코박테리움 튜버쿨로시스 유래 단백질과 같은 면역 반응 자극제를 함유할 수 있다. 적당한 보조제는 예를 들면, 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제(제조원: Difco Laboratories, 미국 미시건 디트로이트 소재); Merck Adjuvant 65(제조원: Merck and Company, Inc., 미국 뉴저지 러웨이 소재); AS-2(제조원: SmithKline Beecham, 미국 펜실베이니아 필라델피아 소재); 알루미늄 하이드록사이드 겔(알룸) 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연 염; 아실화 타이로신의 불용성 현탁액; 아실화 당; 양이온 또는 음이온 유도체화된 폴리사카라이드; 폴리포스파젠; 생분해성 미세구체; 모노포스포릴 지질 A 및 quil A로서 시판되고 있다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7, 또는 -12와 같은 사이토카인도 보조제로서 사용될 수 있다.
본원에 제공된 면역원 조성물에서, 보조제 조성물은 바람직하게는, Th1형의 면역 반응을 우세하게 유도하도록 디자인된다. 고수준의 Th1형 사이토카인(예를 들면, IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 이와는 대조적으로, 고수준의 Th2형 사이토카인 (예를 들면, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도를 선호하는 경향이 있다. 본원에서 제공된 면역원 조성물의 적용 뒤에, 환자는 Th1형 및 Th2형 반응을 포함하는 면역 반응을 지원할 것이다. 반응이 우세하게 Th1형인 바람직한 양태에서, Th1형 사이토카인의 수준은 Th2형 사이토카인의 수준보다 더 큰 정도로 증가할 것이다. 이들 사이토카인의 수준은 표준 분석을 이용하여 용이하게 평가될 수 있다. 사이토카인 계통을 고찰하기 위해 문헌[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989]를 참조한다.
우세한 Th1형 반응을 도출하는데 사용하기에 바람직한 보조제는 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-탈-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 알루미늄 염의 배합물을 포함한다. MPL 보조제는 제조원[Corixa Corporation, 미국 워싱턴 시애틀 소재; 미국 특허 제4,436,727호; 제4,877,611호; 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조]로부터 입수 가능하다. (CpG 디뉴클레오타이드가 비-메틸화된) CpG-함유 올리고뉴클레오타이드 또한 우세하게 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 익히 공지되어 있고 예를 들면, 문헌[WO 제96/02555호,WO 제99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호]에 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열도 예를 들면, 문헌[Sato et al., Science 273:352, 1996]에 의해 기재되어 있다. 다른 바람직한 보조제는 사포닌, 바람직하게는 QS21(제조원: Aquila Biopharmaceuticals Inc., 미국 매사추세츠 프래밍햄 소재)으로서 단독으로 또는 다른 보조제와 함께 사용된다. 예를 들면, 증진된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체의 배합물, 예를 들면 WO 제94/00153호에 기재된 바와 같은 QS21과 3D-MPL의 배합물, 또는 WO 제96/33739호에 기재된 바와 같이, QS21이 콜레스테롤로 퀀칭되는 덜 반응원성인 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 에멀션 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 에멀션에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 수반하는 특히 강력한 보조제 제형이 WO 제95/17210호에 기재되어 있다.
다른 바람직한 보조제는 Montanide ISA 720(제조원: Seppic, 프랑스), SAF(제조원: Chiron, 미국 캘리포니아 소재), ISCOMS(제조원: CSL), MF-59(제조원: Chiron), SBAS 시리즈의 보조제(예를 들면, SBAS-2 또는 SBAS-4, 제조원: SmithKline Beecham에서 입수 가능, 벨기에 릭센사르 소재), Detox(제조원: Corixa, 미국 몬태나 해밀턴 소재), RC-529(제조원: Corixa, 미국 몬태나 해밀턴 소재) 및 다른 아미노알킬 글루코사미나이드 4-포스페이트(AGP), 예를 들면 계류중인 미국 특허출원 제08/853,826호 및 제09/074,720호(본원에서 참조로 인용)에 기재된 것들을 포함한다.
본원에서 제공된 면역원 조성물은 항원, 면역반응 증진제 및 적당한 담체 또는 부형제의 조합을 일으키는 익히 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 서방형 제형(즉, 투여 후 화합물의 서방출을 달성하는 (예를 들면 폴리사카라이드로 구성된) 캡슐, 스폰지 또는 겔과 같은 제형)의 부분으로서 투여될 수 있다. 그러한 제형은 일반적으로, 익히 공지된 기술[예를 들면, Coombes et al., Vaccine 14:1429-1438, 1996 참조]을 이용하여 제조되고, 예를 들면, 경구, 직장 또는 피하 이식에 의해, 또는 목적하는 표적 부위에의 이식에 의해 투여될 수 있다. 서방형 제형은 담체 매트릭스에 분산되고/되거나 속도 조절 막에 의해 둘러싸인 저장소에 함유된 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체를 함유할 수 있다.
이러한 제형에 사용하기 위한 담체는 생체적합성이고, 또한 생분해성이며; 바람직하게는 제형은 비교적 일정한 수준의 활성 성분 방출을 제공한다. 이러한 담체로는 폴리(락타이드-코-글리콜라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로스, 덱스트란 등의 미립자가 포함된다. 다른 지연-방출 담체로는 비-액체 친수성 코어(예를 들면, 가교결합된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드), 및 임의로는 인지질과 같은 양쪽성 화합물을 포함하는 외층으로 구성되는 초분자성 바이오벡터가 포함된다[예를 들면, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 WO 제94/20078호, WO 제94/23701호 및 WO 제96/06638호 참조]. 서방형 제형에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도와 예상되는 지속기간 및 치료 또는 예방하고자 하는 증상의 성질에 좌우된다.
임의의 다양한 전달 비히클이 종양 세포를 표적화하는 항원-특이성 면역반응의 생성을 촉진하기 위하여 약제학적 조성물 및 면역원 조성물에 사용될 수 있다.전달 비히클로는 수지상 세포, 대식구, B 세포, 단핵구 및 효율적인 APC로 유전공학적 처리될 수 있는 다른 세포와 같은 항원 제시 세포(APC)가 포함된다. 이러한 세포는 필요한 것은 아니지만, 항원 제시능을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키며, 항종양 효과 자체를 보유하고/하거나 수용자와 면역학적으로 상용성이 되도록(즉, 매치된 HLA 반수체형) 유전자 변형시킬 수 있다. APC는 일반적으로, 종양 및 종양 주변 조직을 포함한 다양한 생물학적 유체 및 기관으로부터 분리될 수 있으며, 자기유래, 타계, 동계 또는 이종 세포일 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 양태는 항원-제시 세포로 수지상 세포 또는 이의 조상세포를 사용한다. 수지상 세포는 매우 강력한 APC이고[Banchereau and Steinman, Nature 392;245-251, 1998], 예방 또는 치료적인 항종양 면역성 도출을 위한 생리학적 보조제로서 효과적인 것으로 나타났다[Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이들의 전형적인 형상[원위치에서 성상(星狀), 시험관내에서 가시적인 현저한 세포질 프로세스(수지상 돌기) 수반], 고효율의 항원 흡수, 프로세스 및 제시능 및 나이브(naive) T 세포 반응 활성화능에 기초하여 동정될 수 있다. 수지상 세포는 물론, 생체내 또는 생체외의 수지상 세포에서 통상적으로 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 유전공학적 처리될 수 있으며, 이러한 변형된 수지상 세포가 본 발명에 의해 고려된다. 수지상 세포에 대한 대용물로서, 분비된 소포 항원-로딩 수지상 세포(엑소솜으로 불림)가 백신, 또는 면역원 조성물에 사용될 수 있다[Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600, 1998 참조].
수지상 세포 및 선조세포는 말초혈, 골수, 종양-침윤 세포, 종양 주변 조직-침윤 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대 혈액 또는 여타 적당한 조직 또는 유체로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토카인의 배합물을 말초혈로부터 수거한 단핵구 배양액에 첨가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 이와 달리, 말초혈, 제대 혈액 또는 골수로부터 수거한 CD34 양성 세포는 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 다른 화합물을 배양 배지 배합물에 첨가함으로써 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 편의상 "미성숙" 및 "성숙" 세포로 분류되며, 이는 간단한 방식으로 두 가지의 잘 특성화된 표현형을 식별하게 해준다. 그러나, 이러한 용어는 분화의 모든 가능한 중간 단계를 배제하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 미성숙 수지상 세포는 항원 흡수와 프로세싱에 대한 능력이 높은 APC로 특성화되는데, 이는 Fcγ수용체 및 만노스 수용체의 고발현과 상관 관계가 있다. 성숙 표현형은 전형적으로 이들 마커의 저발현으로 특성화되지만, 클래스 I 및 클래스 II MHC, 부착 분자(예를 들면, CD54 및 CD11) 및 공-자극 분자(예를 들면, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)와 같은 T 세포 활성화를 담당하는 세포 표면 분자는 고발현된다.
APC는 일반적으로, 폐 종양 폴리펩타이드, 또는 이의 면역원성 일부가 세포 표면에서 발현되도록, 폐 종양 단백질(또는 이의 일부 또는 다른 변이체)을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 일어날 수 있고, 이러한 형질감염된 세포를 포함하는 조성물은 이어서 본원에 기재된 바와 같이 치료용으로 사용될 수 있다. 이와 달리, 수지상 또는 다른 항원 제시 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클을 환자에 투여하여 생체내에서 형질감염이 일어나게 할 수도 있다. 예를 들면, 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로, WO 제97/24447호에 기재된 것들과 같은 당업계에 공지된 임의 방법, 또는 문헌[Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75:456-460, 1997]에 의해 기술된 유전자 건 방법을 이용하여 수행될 수 있다. 수지상 세포의 항원 로딩은 수지상 세포 또는 조상 세포를 폐 종양 폴리펩타이드, DNA(나출형 또는 플라스미드 벡터 내) 또는 RNA와; 또는 항원-발현 재조합 박테리아 또는 바이러스(예를 들면, 백시니아, 전염성상피종, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 배양함으로써 달성될 수 있다. 로딩에 앞서, 폴리펩타이드는 T 세포 조력을 제공하는 면역학적 파트너(예를 들면, 담체 분자)에 공유 접합될 수 있다. 또한, 수지상 세포는 별도로 또는 폴리펩타이드의 존재하에, 비-접합 면역학적 파트너로 펄싱될 수 있다.
면역원 조성물 및 약제학적 조성물은 밀봉된 앰플 또는 바이얼과 같은 단위 용량 또는 다용량 용기로 제공될 수 있다. 이러한 용기는 바람직하게는 사용시까지 제형의 멸균성을 보존하기 위해 밀봉 밀폐된다. 일반적으로, 제형은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 유액으로 보관될 수 있다. 또한, 면역원 또는 약제학적 조성물은 사용 직전에 멸균액 담체의 첨가만을 요하는 동결건조 상태로 보관될 수 있다.
암 치료법
본 발명의 추가의 관점으로서, 본원에 기술된 조성물은 폐암과 같은 암의 면역요법에 사용할 수 있다. 이러한 방법에서 조성물은 전형적으로 환자에게 투여된다. 본원에 사용된 "환자"는 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 가리킨다. 환자는 암을 앓고 있거나 그렇지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은 암의 발전을 예방하거나 암을 앓고 있는 환자를 치료하는데 사용할 수 있다. 암은 악성 종양의 존재를 포함하여 당해 분야에서 일반적으로 수용하는 기준을 사용하여 진단할 수 있다. 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은 원시 종양의 외과적 제거 전 또는 후 및 방사선요법 또는 통상적인 화학요법 약물의 투여와 같은 치료 전 또는 후에 투여할 수 있다. 투여는 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 피내, 항문내, 질내, 국소 및 경구 경로에 의한 투여를 포함하여 어떠한 적합한 방법에 의해서도 이루어질 수 있다.
특정한 양태로서, 면역요법은 치료가 면역반응-변형 물질(예, 본원에 제공된 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드)의 투여로 종양에 대하여 반응하는 내인성 숙주 면역 시스템의 생체내 자극에 의존하는 능동 활성요법일 수 있다.
다른 양태로서, 면역요법은 치료가 항종양 효과를 직접적으로 또는 간접적으로 매개할 수 있고 완전한 숙주 면역 시스템에 반드시 의존하지 않는 설정된 종양-면역 반응성을 갖는 물질(예, 이펙터 세포 또는 항체)의 전달을 포함하는 수동 면역요법일 수 있다. 이펙터 세포의 예로는 상기된 T 세포, T 림프구(예, CD8+세포독성 T 림프구 및 CD4+T-헬퍼 종양-침윤 림프구), 킬러 세포(예, 내츄럴 킬러 세포 및 림포카인-활성화된 킬러 세포), B 세포 및 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현하는 항원-제시 세포(예, 수지상 세포 및 대식세포)가 포함된다. 본원에 인용된 폴리펩타이드에 대해 특이적인 T 세포 수용체 및 항체 수용체는 입양면역요법을 위해 다른 벡터 또는 이펙터 세포내로 클로닝, 발현 및 전이할 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드는 또한 수동 면역요법을 위해 사용하여 항체 또는 항-유전형 항체[미국 특허 제4,918,164호]를 생성할 수 있다.
이펙터 세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이 시험관내에서 성장시켜 입양면역요법을 위해 충분한 양으로 수득할 수 있다. 단일 항원-특이적 이펙터 세포를 생체내 항원 인지력을 유지하면서 수십억 개로 증식시키기 위한 배양 조건은 당해 분야에 잘 공지되어져 있다. 이러한 시험관내 배양 조건은 전형적으로 흔히 사이토킨(예, IL-2) 및 비분열 지지(feeder) 세포의 존재하에서 항원으로 간헐적인 자극을 사용한다. 상기된 바와 같이, 본원에 제공된 면역반응성 폴리펩타이드는 면역요법을 위해 충분한 수의 세포를 생성하기 위해 항원-특이적 T 세포 배양물을 신속히 증식시키기 위해 사용할 수 있다. 특히, 수지상 세포, 대식 세포, 단핵 세포, 섬유아세포 및/또는 B 세포와 같은 항원-제시 세포를 당해 분야에 잘 공지된 표준 기술을 사용하여 면역반응성 폴리펩타이드로 펄스시키고 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들면, 항원-제시 세포는 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템에서 발현을 증가시키기에 적절한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 치료에 사용하기 위해 배양된 이펙터 세포는 광범위하게 성장하고 분포하며 생체내에서 장기간 생존할 수 있어야 한다. 연구에 따르면 배양된 이펙터 세포는 IL-2로 보충된 항원으로 반복적인 자극에 의해 생체내에서 성장하고 실질적인 수로 장기간 생존하도록 유도될 수 있다[참조: Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997].
대안으로서, 본원에 기술된 폴리펩타이드를 발현하는 벡터는 환자로부터 채취된 항원 제시 세포내로 도입하고 다시 동일한 환자에게 이식하기 위해 생체외로 클로닝으로 증식할 수 있다. 형질감염된 세포는 당해 분야에 공지된 수단을 사용하여, 바람직하게는 정맥내, 강내, 복강내 또는 종양내 투여에 의해 멸균 형태로 환자에게 재주입할 수 있다.
본원에 기술된 치료 조성물의 투여 경로 및 빈도 뿐만 아니라 용량은 개인에 따라 다를 수 있으며 표준 기술을 사용하여 쉽게 설정할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은 주사(예, 피부내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예, 흡입) 또는 경구로 투여할 수 있다. 바람직하게는 1 내지 10회 용량을 52주에 걸쳐 투여할 수 있다. 바람직하게는, 6회 용량을 한달 간격으로 투여하고 그후 추가접종 백신화는 주기적으로 행할 수 있다. 다른 프로토콜이 개인 환자에 따라 적절히 사용될 수 있다. 적합한 용량은 상기된 바와 같이 투여되었을 때 항-종양 면역반응을 촉진할 수 있으며 기본 (즉, 비처리된) 수준에 면역반응이 적어도 10 내지 50% 이상인 화합물의 양이다. 이러한 반응은 환자의 체내에 항-종양 항체를 측정하거나 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 이펙터 세포의 백신-의존 생성에 의해 모니터링할 수 있다. 이러한 백신 또는 면역원성 조성물은 또한 비백신화 환자에 비해 백신화 환자에게서 향상된 임상 결과(예, 보다 빈도가 높은 완화, 완전하거나 부분적이거나 좀더 긴 질병-해방 생존)를 유도하는 면역 반응을 일으킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 조성물의 경우, 1회 용량에 존재하는 각 폴리펩타이드의 양은 숙주 kg당 약 25 ㎍ 내지 5 mg이다. 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 다양하지만 전형적으로 약 0.1 ㎖ 내지 약 5 ㎖이다.
일반적으로, 적절한 용량 및 치료 섭생은 치료 및/또는 예방 효과를 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물을 제공한다. 이러한 반응은 비치료 환자에 비해 치료 환자에게서 향상된 임상 결과(예, 보다 빈번한 완화, 완전하거나 부분적이거나 좀더 긴 질병-해방 생존)를 설정함으로써 모니터링할 수 있다. 폐 종양 단백질에 대해 이미 존재하는 면역 반응의 증가는 일반적으로 향상된 임상 결과와 상관 관계가 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 검정을 사용하여 평가할 수 있으며, 이러한 검정은 치료 전후에 환자로부터 채취된 샘플을 사용하여 실시할 수 있다.
암 검출 및 진단
일반적으로, 암은 환자로부터 채취된 생물학적 샘플(예, 혈액, 혈청, 타액, 뇨 및/또는 종양 생검)중에 하나 이상의 폐 종양 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 근거로 환자에게서 검출할 수 있다. 다시 말해서, 이러한 단백질은 폐암과 같은 암의 유무를 지시하는 마커로서 사용할 수 있다. 또한, 이러한 단백질은 다른 암의 검출에 유용할 수 있다. 본원에 제공된 결합제는 일반적으로 생물학적 샘플중에서 그 결합제와 결합하는 항원의 수준의 검출을 허용한다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 탐침은 암의 유무를 지시하기도 하는 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하는데 사용할 수 있다. 일반적으로, 폐 종양 서열은 정상 조직에서보다 종양 조직에서 적어도 3배 높은 수준으로 존재해야 한다.
결합제를 사용하여 샘플중에서 폴리펩타이드 마커를 검출하기 위한 것으로 당업자에게 공지된 여러 검정 방법이 있다[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 환자체내에 암의 유무는 (a) 환자로부터 얻은 생물학적 샘플을 결합제와 접촉시키고, (b) 샘플중에서 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 수준을 검출하며, (c) 폴리펩타이드의 수준을 예정된 컷-오프 값과 비교함으로써 결정할 수 있다.
바람직한 양태로서, 검정은 고체 지지체상에 고정된 결합제를 사용하여 샘플의 나머지로부터 폴리펩타이드와 결합시키고 제거하는 것을 포함한다. 그런 다음 결합된 폴리펩타이드는 리포터 그룹을 함유하고 특이적으로 결합제/폴리펩타이드 복합체와 결합하는 검출 시약을 사용하여 검출할 수 있다. 이러한 검출 시약은 예를 들면, 폴리펩타이드와 결합하는 결합제 또는 그 결합제와 특이적으로 결합하는 항체 또는 다른 물질(예, 항-면역글로불린, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 렉틴)을 포함할 수 있다. 대안으로서, 폴리펩타이드를 리포터 그룹으로 표지시키고 결합제를 샘플와 배양한 후 고정된 결합제에 결합하도록 하는 경쟁 검정을 사용할 수 있다. 샘플의 성분이 결합제에 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 정도는 고정된 결합제와 샘플의 반응성을 지시한다. 이러한 검정에서 사용하기에 적합한 폴리펩타이드는 전체 길이 폐 종양 단백질 및 상기된 바와 같이 결합제가 결합하는 이의 일부분을 포함한다.
고체 지지체는 당업자에게 공지된 것으로 종양 단백질이 결합할 수 있는 물질이면 어떠한 것도 가능할 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 미세역가 플레이트내의 시험 웰 또는 니트로셀룰로즈 또는 다른 적합한 막일 수 있다. 대안으로서, 지지체는 유리, 섬유유리, 라텍스 또는 플라스틱 소재(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)와 같은 비드 또는 디스크일 수 있다. 지지체는 또한 예를 들면, 미국 특허 제5,359,681호에 기술된 것과 같은 자석 입자 또는 광섬유 센서일 수 있다. 결합제는 당업자에게 알려져 있는 것으로 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되어 있는 여러 기술을 사용하여 고체 지지체상에 고정시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "고정화"는 흡착과 같은 비공유 결합 및 공유 결합(결합제와 지지체상의 작용기 사이에 직접적인 결합이거나 가교제를 통한 결합일 수 있다) 둘 다를 가리킨다. 미세역가 플레이트내 웰 또는 막에 흡착에 의한 고정화가 바람직하다. 이러한 경우에 있어서, 흡착은 적합한 완충액중의 결합제를 적당한 시간 동안 고체 지지체와 접촉시켜 달성할 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만 전형적으로 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로 플라스틱 미세역가 플레이트(예, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10 ng 내지 약 10 ㎍, 바람직하게는 약 100 ng 내지 약 1㎍의 결합제와 접촉시키는 것이 적당한 양의 결합제를 고정시키기에 충분하다.
고체 지지체에 결합제의 공유 결합은 일반적으로 우선 지지체를 이 지지체와 결합제상의 작용기(예, 하이드록실 또는 아미노 그룹)과 반응하는 이작용성 시약과 반응시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 결합제는 벤조퀴논을 사용하여 적절한 중합체 피막을 갖는 지지체에 공유 결합시키거나 지지체상의 알데하이드 그룹을 결합 파트너상의 아민 및 활성 수소와 축합시켜 결합시킬 수 있다[참조: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13].
특정한 양태로서, 검정은 두-항체 샌드위치 검정이다. 이 검정은 우선 고체 지지체, 흔히 미세역가 플레이트의 웰상에 고정된 항체를 샘플와 접촉시켜 샘플내의 폴리펩타이드가 고정된 항체와 결합하도록 함으로써 실시될 수 있다. 그런 다음, 비결합된 샘플을 고정된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고 리포터 그룹을 함유한 검출 시약(바람직하게는 폴리펩타이드상의 다른 부위에 결합할 수 있는 제2 항체)을 첨가한다. 이어서, 고체 지지체에 결합한 검출 시약의 양을 특정 리포터 그룹에 알맞은 방법을 사용하여 결정한다.
보다 자세하게는, 일단 항체가 상기된 바와 같이 지지체상에 고정되면, 지지체상의 남은 단백질 결합 부위는 전형적으로 차단시킨다. 적합한 차단제는 당업자에게 공지되어 있으며 예를 들면 소 혈청 알부민 또는 트윈 20TM(미조리 세인트 루이스 소재 시그마 케미칼 컴퍼니)이 포함된다. 그런 다음 고정된 항체를 샘플와배양시키고 폴리펩타이드가 항체와 결합이 이루어지도록 방치한다. 샘플은 배양전에 포스페이트-완충 염수(PBS)와 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적절한 접촉 시간(즉, 배양 시간)은 폐암 환자로부터 얻은 샘플중에서 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 충분한 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드와 비결합된 폴리펩타이드사이에 평형이 도달되는 것의 95% 이상인 결합 수준에 도달하기에 충분한 시간이다. 당업자는 일정 시간에 걸쳐 발생하는 결합 수준을 검정함으로써 평형에 이르는데 필요한 시간을 쉽게 결정할 수 있음을 인식할 것이다. 실온에서 배양 시간은 약 30분이면 일반적으로 충분하다.
그런 다음 비결합된 샘플은 고체 지지체를 0.1% 트윈 20TM을 함유한 PBS와 같은 적절한 완충액으로 세척함으로써 제거할 수 있다. 이어서, 리포터 그룹을 함유한 제2 항체를 고체 지지체에 첨가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹으로는 상기된 그룹이 포함된다.
이어서, 검출 시약을 고정된 항체-폴리펩타이드 복합체와 결합된 폴리펩타이드를 검출하기에 충분한 시간 동안 배양한다. 적당한 시간 양은 일반적으로 일정 기간에 걸쳐 발생하는 결합 수준을 검정함으로써 결정할 수 있다. 그런 다음 비결합된 검출 시약을 제거하고 결합된 검출 시약을 리포터 그룹으로 검출한다. 리포터 그룹을 검출하는데 사용하는 방법은 리포터 그룹의 성질에 따라 좌우된다. 방사성 그룹의 경우, 신틸레이션 계수 또는 자가방사선사진술이 일반적으로 적절하다. 분광법은 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출하는데 사용할 수 있다. 바이오틴은 다른 리포터 그룹(흔히 방사성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질을 첨가한 후 반응 산물을 분광 또는 다른 분석하여 검출할 수 있다.
폐암과 같은 암의 유무를 결정하기 위해서는, 고체 지지체에 결합되어 있는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그날을 일반적으로 예정된 컷-오프 값에 상응하는 신호와 비교한다. 한 가지 바람직한 양태로서, 암의 검출을 위한 컷-오프 값은 고정된 항체를 암이 없는 환자로부터의 샘플와 배양하였을 때 얻어지는 평균 시그날이다. 일반적으로, 예정된 컷-오프 값보다 표준편차가 3 이상인 시그날을 발생하는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 고려된다. 다른 바람직한 양태로서, 컷-오프 값은 문헌[Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7]의 방법에 따른 리씨버 오퍼레이터 커브를 사용하여 결정한다. 간단히 설명하면, 이 양태에서, 컷-오프 값은 진단 시험 결과에 대해 각각 가능한 컷-오프 값에 상응하는 참 양성율(즉, 민감성)과 위 양성율(100%-특이성)의 쌍의 플로트로부터 결정할 수 있다. 상단 좌측 코너에 가장 가까운 플로트상의 컷-오프 값(즉, 가장 큰 영역을 차지하는 값)이 가장 정확한 컷-오프 값이고 이 방법에 의해 결정된 컷-오프 값보다 큰 시그날을 발생하는 샘플은 양성으로 고려될 수 있다. 대안으로서, 컷-오프 값은 플로트를 따라 좌측으로 이동하여 위 양성율을 최소화할 수 있고 우측으로 이동하여 위 음성율을 최소화할 수 있다. 일반적으로, 이 방법에 의해 결정된 컷-오프 값보다 큰 시그날을 발생하는 샘플은 암에 대해 양성으로 고려된다.
관련된 양태로서, 검정은 결합제가 니트로셀룰로즈와 같은 막상에 고정되어 있는 통류(flow-through) 또는 스트립 시험 방식으로 실시한다. 통류 시험에서 샘플중의 폴리펩타이드는 샘플이 막을 통과하면서 고정된 결합제와 결합한다. 그런 다음 제2 표지된 결합제가 이를 함유한 용액이 막을 통과하면서 결합제-폴리펩타이드 복합체와 결합한다. 이어서, 상기한 바와 같이 결합된 제2 결합제의 검출을 실시할 수 있다. 스트립 시험 방식에서는 결합제가 결합된 막의 한쪽 말단을 샘플을 함유한 용액중에 담근다. 샘플은 막을 따라서 제2 결합제를 함유한 영역을 지나 고정된 결합제의 영역으로 이동한다. 고정된 항체의 영역에서의 제2 결합제의 농도는 암의 존재를 지시한다. 전형적으로 그 부위에서의 제2 결합제의 농도는 시각적으로 판독할 수 있는 선과 같은 패턴을 발생한다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 지시한다. 일반적으로, 막상에 고정된 결합제의 양은 생물학적 샘플이 상기된 방식에서 두-항체 샌드위치 검정에서 양성 시그날을 발생하기에 충분한 폴리펩타이드의 수준을 함유할 때 시각적으로 식별가능한 패턴을 발생하도록 선택된다. 이러한 검정에 사용하기에 바람직한 결합제는 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 막에 고정된 항체의 양은 약 25 ng 내지 약 1 ㎍이고 더욱 바람직하게는 약 50 ng 내지 약 500 ng이다. 이러한 시험은 전형적으로 아주 소량의 생물학적 샘플로 실시할 수 있다.
물론, 본 발명의 종양 단백질 또는 결합제와 함께 사용하기에 적합한 다른 많은 검정 프로토콜이 있다. 상기 설명은 단지 예시하고자 하는데 그 목적이 있다. 예를 들면, 폐 종양 폴리펩타이드를 사용하여 생물학적 샘플중의 상기 폴리펩타이드와 결합하는 항체를 검출하기 위해 상기 프로토콜을 쉽게 변형시킬 수 있다는 것은 당업자에게는 자명한 것이다. 이러한 폐 종양 단백질 특이적 항체의 검출은 암의 존재와 상관 관계가 있을 수 있다.
암은 또한 생물학적 샘플중의 폐 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재를 기초로 하여 검출할 수 있다. 특정 방법으로서, 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 폐 종양 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 그러한 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분을 발현하는 APC와 배양하고 T 세포의 특정 활성화의 유무를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 분리된 T 세포가 포함된다. 예를 들면, T 세포는 통상의 기술(예, 말초 혈액 림프구의 피콜/하이파크 밀도 구배 원심분리)에 의해 환자로부터 분리할 수 있다. T 세포는 폴리펩타이드(예, 5 내지 25 ㎍/㎖)와 37℃에서 2 내지 9일 동안(전형적으로 4일) 시험관내에서 배양할 수 있다. 대조군으로 사용하기 위해 폐 종양 폴리펩타이드의 부재하에 T 세포 샘플의 다른 분획물을 배양하는 것이 바람직할 수 있다. CD4+T 세포의 경우, 활성화는 바람직하게는 T 세포의 증식을 평가함으로써 검출한다. CD8+T 세포의 경우, 활성화는 바람직하게는 세포용해 활성을 평가함으로써 검출한다. 질병에 걸리지 않은 환자보다 적어도 2배 높은 증식 수준 및/또는 적어도 20% 큰 세포용해 활성의 수준은 환자에게서 암의 존재를 지시한다.
상기된 바와 같이, 암은 또한 생물학적 샘플중의 폐 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 기초로 하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 중합효소 연쇄 반응(PCR) 기본 검정에서 적어도 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 생물학적 샘플로부터 유도된 폐 종양 cDNA의 일부를 증폭시킬 수 있다. 여기서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머중 적어도 하나는 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 대해 특이적이다(즉, 하이브리드화한다). 그런 다음 증폭된 cDNA를 겔 전기영동과 같은 당해 분야에 잘 공지된 기술을 사용하여 분리하고 검출한다. 유사하게, 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 탐침을 하이브리드화 검정에서 사용하여 생물학적 샘플에서 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출할 수 있다.
검정 조건하에서 하이브리드화를 달성하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 탐침은 길이가 적어도 10개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 20개 뉴클레오타이드인 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부와 적어도 약 60%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90% 동일성을 갖는 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함해야 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 탐침은 상기 정의한 바와 같이 중간 정도의 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화한다. 본원에 기술된 진단 방법에서 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 탐침은 바람직하게는 길이가 적어도 10 내지 40개 뉴클레오타이드이다. 바람직한 양태로서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열을 갖는 DNA 분자의 적어도 10개 연속 뉴클레오타이드, 더욱 바람직하게는 적어도 15개 연속 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 기본 검정과 하이브리드화 검정에 대한 기술은 당해 분야에 잘 알려져 있다[참조: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989].
한 가지 바람직한 검정은 PCR이 역전사와 접목하여 응용된 RT-PCR을 사용한다. 전형적으로, RNA는 생검 조직과 같은 생물학적 샘플로부터 추출하며 역전사시켜 cDNA 분자를 생성한다. 적어도 하나의 특정 프라이머를 사용하는 PCR 증폭은 예를 들면, 겔 전기영동을 사용하여 분리하고 가시화할 수 있는 cDNA 분자를 생성한다. 증폭은 피검 환자 및 암을 앓고 있지 않은 사람으로부터 채취된 생물학적 샘플에 대해 실시할 수 있다. 증폭 반응은 cDNA를 2 차수로 수개 희석하여 이러한희석물에 대해 실시할 수 있다. 비암 샘플의 동일한 희석물에 비하여 피검 환자 샘플의 수 개 희석물에서의 발현이 2배 이상 증가된 경우 전형적으로 양성으로 고려된다.
다른 양태로서, 본원에 기술된 조성물은 암의 진행을 위한 마커로서 사용할 수 있다. 이 양태로서, 암의 진단을 위한 상기 검정은 주기적으로 실시할 수 있으며 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준 변화를 평가할 수 있다. 예를 들면, 검정을 6개월 내지 1년의 기간 동안에 매 24 내지 72시간 마다 실시하고, 그 이후에는 필요에 따라 실시할 수 있다. 일반적으로, 암은 검출된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준이 시간이 지나면서 증가하는 환자에게서 진행되는 것이다. 대조적으로, 암은 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준이 시간이 경과하면서도 일정하거나 감소할 때 진행되는 것이 아니다.
특정 생체내 진단 검정이 종양에 대해 직접적으로 실시될 수 있다. 이러한 한 가지 검정은 종양 세포를 결합제와 접촉시키는 것이다. 이후 결합된 결합제를 직접적으로 또는 리포터 그룹을 통해 간접적으로 검출할 수 있다. 이러한 결합제는 또한 조직학 분야에 응용할 수 있다. 대안으로서, 이러한 분야에서 폴리뉴클레오타이드 탐침을 응용할 수 있다.
상기된 바와 같이, 민감성을 향상시키기 위해, 주어진 샘플에서 복수의 폐 종양 단백질 마커를 검정할 수 있다. 본원에 제공된 상이한 단백질에 대해 특이적인 결합제는 단일 검정에서 배합할 수 있음은 명백하다. 또한, 다수의 프라이머 또는 탐침은 동시에 사용할 수 있다. 종양 단백질 마커의 선택은 최적의 민감성을제공하는 조합을 결정하는 통상의 실험을 기초로 할 수 있다. 또한, 본원에 제공된 종양 단백질에 대한 검정은 다른 공지된 종양 항원에 대한 검정과 병합할 수 있다.
진단 키트
본 발명은 또한 상기 진단 방법에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로 진단 검정을 수행하는데 필요한 둘 이상의 성분을 포함한다. 성분은 화합물, 시약, 용기 및/또는 장비일 수 있다. 예를 들면, 키트내의 한 개 용기는 폐 종양 단백질과 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 항체 또는 단편은 상기된 바와 같이 지지체 물질에 결합하여 제공될 수 있다. 한 개 이상의 추가적인 용기는 검정에 사용될 시약 또는 완충액과 같은 요소를 포장할 수 있다. 이러한 키트는 또한 항체 결합의 직접 또는 간접 검출에 적합한 리포트 그룹을 함유하는 상기된 검출 시약을 함유할 수 있다.
대안으로서, 키트는 생물학적 샘플중에서 폐 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있도록 디자인될 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 상기된 한 개 이상의 올리고뉴클레오타이드 탐침 또는 프라이머를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면, PCR 또는 하이브리드화 검정내에서 사용할 수 있다. 이러한 키트내에 존재할 수 있는 추가의 성분으로는 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출을 촉진하기 위해 제2 올리고뉴클레오타이드 및/또는 진단시약 또는 용기가 포함된다.
하기 실시예로 본 발명을 예시한다. 그러나 이들 실시예가 본 발명을 한정하는 것은 아니다.
실시예 1
폐 종양 단백질 cDNA의 동정 및 특성화
본 실시예는 폐 종양 단백질을 암호화하는 cDNA 분자의 동정을 예시한다.
A. 통상적인 cDNA 라이브러리 공제를 사용하여 폐 선암종 라이브러리로부터의 cDNA 서열의 분리
제조업자의 프로토콜에 따라 cDNA 합성 및 플라스미드 클로닝을 위한 슈퍼스크립트 플라스미드 시스템 키트(제조원: BRL Life Technologies, 매릴랜드 게이더스버그 소재)를 사용하여 환자 조직(# 40031486)으로부터 폴리 A+RNA로부터 사람 폐선암종 cDNA 발현 라이브러리를 작제하였다. 자세하게는, 폐암종 조직을 폴리트론(제조원: Kinematica, 스위스)으로 균질화하고 제조업자의 지침에 따라 트리졸 시약(제조원: BRL Life Technologies)을 사용하여 전체 RNA를 추출하였다. 이어서, 폴리 A+RNA를 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술된 바와 같이 올리고 dT 셀룰로즈 컬럼을 사용하여 정제하였다. NotI/올리고-dT18프라이머를 사용하여 제1 쇄 cDNA를 합성하였다. 이본쇄 cDNA를 합성하고 BstXI/EcoRI 어뎁터(제조원: Invitrogen, 캘리포니아 샌 디에고 소재)와 연결시킨 다음 NotI으로 분해시켰다. cDNA 크기 분별 컬럼(제조원: BRL Life Technologies)으로 크기별 분류한 후, cDNA를 pcDNA3.1(제조원: Invitrogen)의 BstXI/NotI 부위내로 연결시키고 전기천공법에 의해 일렉트로맥스(ElectroMax) 이. 콜라이 DH10B 세포(제조원: BRL Life Technologies)를 형질전환시켰다. 전체 3 x 106개의 독립적인 콜로니가 생성되었다.
동일한 절차를 사용하여 폐, 간, 췌장, 피부, 신장, 뇌 및 휴지기 PBMC를 포함한 정상 조직 샘플의 패널로부터 정상적인 사람 cDNA 발현 라이브러리를 제조하였다.
문헌[Hara et al., Blood, 84:189-199, 1994]에 기술된 것을 약간 변형시켜 상기 폐선암종 및 정상 조직 cDNA 라이브러리로 cDNA 라이브러리 공제를 수행하였다. 자세하게는, 폐선암종-특이적 공제된 cDNA 라이브러리를 다음과 같이 생성하였다. 정상 조직 cDNA 라이브러리(80 ㎍)를 BamHI 및 XhoI로 분해시킨 후 DNA 중합효소 클레나우 단편과 채움 반응(filling-in reaction)시켰다. 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전 후 DNA를 133 ㎕의 물에 용해시키고, 열변성시킨 다음 133 ㎕(133 ㎍)의 광탐침 바이오틴(제조원: Vector Laboratories, 캘리포니아 버링겜 소재)과 혼합하였다. 제조업체의 권장에 따라, 생성된 혼합물을 빙상에서 20분 동안 270W 광램프로 조사하였다. 추가의 광탐침 바이오틴(67 ㎕)를 첨가하고 바이오티닐화 반응을 반복하였다. 부탄올로 5회 추출한 후 DNA를 에탄올로 침전시키고 23 ㎕의 물에 용해시켰다. 생성된 DNA + 이전의 폐 공제에서 빈번히 회수된 다른 고도의 중복 cDNA 클론이 드라이버 DNA를 형성하였다.
추적자 DNA를 형성하기 위해, 10 ㎍ 폐 선암종 cDNA 라이브러리를 NotI 및 SpeI으로 분해하고, 페놀 클로로포름으로 추출한 다음 크로마 스핀-400 컬럼(제조원: Clontech, 캘리포니아 팔로 알토 소재)을 통해 통과시켰다. 전형적으로, 5 ㎍의 cDNA를 사이징 컬럼 후 회수하였다. 에탄올로 침전시킨 후, 추적자 DNA를 5 ㎕의 물에 용해시켰다. 추적자 DNA를 15 ㎕의 드라이버 DNA 및 20 ㎕의 2 x 하이브리드화 완충액(1.5 M NaCl/10 mM EDTA/50 mM HEPES pH 7.5/0.2% 나트륨 도데실 설페이트)와 혼합하고, 광유로 덮어씌우고 완전히 열변성시켰다. 샘플을 즉시 68℃ 수욕으로 옮기고 20시간 동안 배양하였다(장시간의 하이브리드화[LH]). 이어서, 반응 혼합물을 스트렙타비딘으로 처리한 후 페놀/클로로포름으로 추출하였다. 이 과정을 3회 이상 반복하였다. 공제된 DNA를 침전시키고 12 ㎕의 물에 용해시킨 다음, 8 ㎕의 드라이버 DNA 및 20 ㎕의 2 x 하이브리드화 완충액과 혼합하고 68℃에서 2시간 동안 하이브리드화시켰다(단시간 하이브리드화 [SH]). 바이오티닐화된 이본쇄 DNA를 제거한 후, 공제된 cDNA를 클로람페니콜 내성 pBCSK+(제조원: Stratagene, 캘리포니아 라 졸라 소재)의 NotI/SpeI 부위내로 연결시키고 전기천공법에 의해 일렉트로맥스 이. 콜라이 DH10B 세포를 형질전환시켜 폐 선암종 특이적 공제된 cDNA 라이브러리(LAT-S1으로 인용함)를 생성하였다. 유사하게, 추가의 드라이버로서 추적자에서 과다 발현된 23개 유전자를 포함시킴으로써 LAT-S2를 생성하였다.
두 번째 환자로부터의 선암종 조직(# 86-66)을 사용하여 제2 사람 폐선암종 cDNA 발현 라이브러리를 작제하고, 이로부터 동일한 정상 조직 패널과 LAT-S1에서 과다하게 발현된 추가의 유전자를 사용하여 상기된 바와 같이 제2 폐선암종-특이적 공제된 cDNA 라이브러리(LAT2-S2로 인용함)를 제조하였다.
폐 및 위 선암종 기원의 두 개의 폐 늑막 삼출액의 풀로부터 제3 사람 전이성 폐 선암종 라이브러리를 작제하였다. 동일한 정상 조직 패널을 사용하여 상기한 바와 같이 공제된 cDNA 라이브러리 Mets-sub2를 생성하였다. 그러나, 드라이버로서 51개의 추가의 유전자를 포함시킴으로써 Mets-sub3 공제된 라이브러리를 작제하였다. 피검자에서 과다 발현된 하우스키핑 유전자를 나타내는 이들 51개 유전자를 Mets-sub2에서 회수하였다. 결과로서 Mets-sub3은 보다 더 복잡하고 정상화되었다.
LAT-S1으로부터 분리된 16개 cDNA 단편, LAT-S2로부터 분리된 585개 cDNA 단편, LAT2-S2로부터의 568개 cDNA 클론, Mets-sub2로부터의 15개 cDNA 클론 및 Mets-sub3으로부터의 343개 cDNA 클론 전체를 콜로니 PCR 증폭시키고, 이들의 폐 종양, 정상 폐 및 여러 다른 정상 및 종양 조직에서의 mRNA 발현 수준을 마이크로어레이 기술(제조원: Incyte, 캘리포니아 팔로 알토 소재)로 결정하였다. 간단히 설명하면, PCR 증폭 산물을 배열 방식으로 슬라이드에 점적하고 각 산물은 배열내의 특정 위치를 점유하게 한다. 피검 조직 샘플로부터 mRNA를 추출하고 역전사시킨 다음 형광물질-표지된 cDNA 탐침을 생성하였다. 마이크로어레이를 표지된 cDNA 탐침으로 탐침시키고 슬라이드를 스캐닝한 다음 형광 강도를 측정하였다. 이 강도는 하이브리드화 강도와 상관 관계가 있다. 73개의 비-중복 cDNA 클론(이중 42개는 독특한 것으로 밝혀졌다)은 폐 종양에서 과다 발현을 보여주었으며, 피검 정상 조직(폐, 피부, 림프절, 결장, 간, 췌장, 유방, 심장, 골수, 대장, 신장, 위, 뇌, 소장, 방광 및 타액선)에서의 발현은 검출될 수 없거나 폐선암종에 비하여 상당히 낮은 수준이었다. 이들 클론을 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 자동 서열분석기 모델 373A 및/또는 모델 377(캘리포니아 포스터 시티)로 DNA 서열을 분석함으로써 좀더 특성화하였다.
이들 서열을 EMBL 진뱅크 데이터베이스(96 공개)를 사용하여 진뱅크내의 공지 서열과 비교하였다. 서열 67로 제공된 서열에 대해 유의적인 상동성은 발견되지 않았으며 이전에 동정된 발현 서열 tag(EST)와도 뚜렷한 상동성은 나타나지 않았다. 서열 60, 62, 65, 66, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97 및 98의 서열은 이전에 동정된 발현 서열 tag(EST)와 약간의 상동성을 보여주었다. 서열 59, 61, 63, 64, 67, 68, 72, 73, 75, 77, 78, 81 내지 83, 85, 87, 88, 93, 94, 96, 99 및 100의 cDNA 서열은 이전에 동정된 유전자와 상동성을 보여주었다. 서열 96 및 100의 클론에 대한 전체 길이 cDNA 서열은 각각 서열 316 및 318로 제공된다. 서열 59, 61, 63, 64, 68, 73, 82, 83, 94, 96 및 100의 클론에 대한 아미노산 서열은 각각 서열 331, 328, 329, 332, 327, 333, 330, 326, 325, 324 및 335로 제공된다. 서열 69(L552S로 인용됨)의 서열에 의해 암호화된 추정아미노산 서열은 서열 786으로 제공된다.
추가의 연구로 L552S에 대한 연장된 cDNA 서열 및 개방 판독 프레임이 분리되었다(서열 790). 서열 790의 cDNA 서열에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 서열 791로 제공된다. L552S의 동형의 결정된 cDNA 서열은 서열 792로 제공되며 상응하는 추정 아미노산 서열은 서열 793으로 제공된다. 추가의 연구로 L552S의 전체 길이 cDNA 서열(서열 808)이 분리되었다. 상응하는 아미노산 서열은 서열 809로 제공된다. L552S의 단백질 서열에 대해 어떠한 상동성도 발견되지 않았다. 그러나, 전체 길이 cDNA 서열의 뉴클레오타이드 533-769는 이전에 동정된 DNA 서열과 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
L552S에 대한 전체 길이 클로닝 노력으로 전이성 폐선암종 라이브러리로부터 세 개의 추가 cDNA 서열(서열 810 내지 812)이 분리되었다. 서열 810의 서열은 이전에 동정된 사람 DNA 서열과 일부 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 서열 811의 서열은 이전에 동정된 사람 DNA 서열과 일부 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 서열 812의 서열은 이전에 동정된 EST와 일부 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
서열 84의 유전자(L551S로 인용함)는 실시간 RT-PCR 분석에 의해 2/9 원시 선암종에서 과다 발현되고 2/2 전이성 선암종 및 1/2 편평 세포암종에서 보다 낮은 수준으로 발현되는 것으로 결정되었다. 정상조직에서는 발현이 관찰되지 않았으며, 단, 정상 위에서 아주 낮은 수준으로 발현되었다. L551S에 대한 추가의 연구로 서열 801 및 802로 각각 제공된 5' 및 3' cDNA 컨센서스 서열이 분리되었다.L551S 5' 서열은 미토겐 활성화된 단백질 키나제 포스파타제인 이전에 동정된 유전자 STY8(서열 803으로 제공된 cDNA 서열; 상응하는 아미노산 서열은 서열 805로 제공된다)와 일부 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 그러나, L551S의 3' 서열에 대해 유의적인 상동성은 발견되지 않았다. 계속해서, L551S에 대한 연장된 cDNA 서열이 분리되었다(서열 804). 상응하는 아미노산 서열은 서열 806으로 제공된다. 추가의 연구로 L551S에 대한 두 개의 독립적인 전체 길이 클론(54298 및 54305로 인용함)이 분리되었다. 이들 두 클론은 STY8 DNA 서열과 비교하여 5개의 뉴클레오타이드가 차이가 있다. 이들 차이중 둘은 암호화된 아미노산 서열에 영향을 미치지 않는 단일 뉴클레오타이드 다형성(SNP)이다. 나머지 세 개 뉴클레오타이드 차이는 두 개의 L551S 클론 사이에서 일치하지만, STY8 단백질 서열과 상이한 암호화된 아미노산 서열을 유도한다. L551S 전체 길이 클론 54305 및 54298에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 825 및 826으로 제공되며, L551S에 대한 아미노산 서열은 서열 827로 제공된다.
B. PCR-기본 cDNA 라이브러리 공제를 사용하여 폐선암종 라이브러리로부터 cDNA 서열의 분리
피부, 결장, 폐, 식도, 뇌, 신장, 비장, 췌장 및 간을 포함한 9가지의 정상인 조직 cDNA의 풀(제조원: Clontech, 캘리포니아 팔로 알토 소재)에 대해 공제된 두 개의 사람 폐 원시 선암종의 풀로부터의 cDNA를 함유하는 PCR-기본 공제 라이브러리로부터의 cDNA 클론을 유도하고 1회 PCR 증폭하였다. 이 라이브러리 (ALT-1로인용함)를 제조업자의 프로토콜에 따라 2회 PCR 증폭에 적용시켰다. 폐 종양, 정상 폐 및 여러 다른 정상 및 종양 조직에서 760개 cDNA 클론의 발현 수준을 상기된 바와 같이 마이크로어레이 기술을 사용하여 검사하였다. 총 118개의 클론(이중 55개는 독특한 것으로 밝혀졌다)은 폐 종양 조직에서 과다 발현을 보여주었으며 피검 정상 조직(폐, 피부, 림프절, 결장, 간, 췌장, 유방, 심장, 골수, 대장, 신장, 위, 뇌, 소장, 방광 및 타액선)에서의 발현은 검출될 수 없거나 상당히 낮은 수준이었다. 이들 서열을 EMBL 및 진뱅크 데이터베이스(96 공개)를 사용하여 진뱅크내의 공지 서열과 비교하였다. 서열 44에 제공된 서열에 대해 유의적인 상동성(EST를 포함)은 발견되지 않았다. 서열 1, 11, 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43, 45, 46, 51 및 57의 서열은 이전에 동정된 발현 서열 tag(EST)와 일부 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 서열 2 내지 10, 12, 14, 16 내지 19, 21, 22, 28, 31, 32, 35 내지 38, 40, 42, 44, 47 내지 50, 52 내지 56 및 58의 cDNA 서열은 이전에 동정된 유전자와 상동성을 보여주었다. 서열 18, 22, 31, 35, 36 및 42의 클론에 대한 전체 길이 cDNA 서열은 각각 서열 320, 319, 323, 321, 317, 321 및 322로 제공되고, 상응하는 아미노산 서열은 각각 서열 337, 336, 340, 338, 334 및 339로 제공된다.
추가의 연구로 서열 33(L801P로 인용됨)의 클론에 대해 연장된 cDNA 서열이 분리되었다. 이 연장된 cDNA 서열(서열 796으로 제공됨)은 세 개의 잠재적인 개방 판독 프레임(ORF)를 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이 세 개 ORF에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 각각 서열 797 내지 799로 제공된다.
이후의 연구에서, 서열 44(L844P로 인용함)의 클론에 대한 전체 길이 cDNA 서열이 분리되었다(서열 800으로 제공됨). 이 서열을 공지된 데이터베이스의 서열과 비교한 결과, 서열의 5' 말단에 있는 470개 염기가 공지된 유전자 디하이드로디올 데하이드로게나제와 상동성을 나타냈으며, 이것은 L844P가 이전에 비동정된 3' 비해독 영역의 2007개 염기쌍을 갖는 디하이드로디올 데하이드로게나제 패밀리의 신규한 전사물임을 가리킨다.
서열 46(L840P로 인용함)의 서열에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이 서열 787로 제공된다. 개방 판독 프레임을 포함하는 것으로 결정된 L840P에 대한 연장된 cDNA 서열은 서열 794로 제공된다. 서열 794의 cDNA 서열에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열은 서열 795로 제공된다. 서열 54(L548S로 인용함)의 클론에 대한 전체 길이 cDNA 서열은 서열 788로 제공되고 상응하는 아미노산 서열은 서열 789로 제공된다.
서열 25 및 46(각각 L839P 및 L840P로 인용함)의 유전자의 노던 블롯 분석은 현저히 유사하였다. 양 유전자는 3.6 kb 및 1.6 kb의 두 밴드로서 1/2 폐선암종에서 발현되었다. L839P의 발현은 정상 폐 및 기도에서 발견되지 않았다. L840P의 발현은 정상 골수, 휴지기 또는 활성화된 PBMC, 식도 또는 정상 폐에서 관찰되지 않았다. 유사한 발현 패턴을 근거로 보면, L839P 및 L840P는 동일한 유전자로부터 유도될 수 있다.
L773P(서열 58)에 대한 추가의 연구 결과, 서열 807로 제공된 연장된 컨센서스 cDNA 서열이 분리되었다.
추가의 폐선암종 cDNA 클론은 다음과 같이 분리하였다. 두 폐선암종의 풀로부터 cDNA 라이브러리를 제조하고 폐, 뇌, 간, 신장, 췌장, 피부, 심장 및 비장을 포함한 정상 조직의 패널로부터의 cDNA에 대해 공제하였다. 공제는 PCR-기본 프로토콜(제조원: Clontech)을 사용하여 실시하였으며 좀더 큰 단편을 생성하기 위해 변형시켰다. 이 프로토콜내에서, 피검 및 드라이버 이본쇄 cDNA를 6-뉴클레오타이드 제한 부위(MluI, MscI, PvuII, SalI 및 StuI)를 인식하는 5개의 제한 효소로 별도로 분해시켰다. 이 분해 결과 제조원(Clontech) 프로토콜에 따른 RsaI으로 분해시켜 얻은 300 bp의 평균 크기가 아닌 600 bp의 평균 cDNA 크기가 수득되었다. 제한효소 분해된 피검 cDNA의 말단을 채워 어뎁터 연결을 위해 평활 말단을 형성하였다. 이 변형은 공제 효능에 영향을 미치지 않았다. 두 피검 집단을 상이한 어뎁터로 형성하고, 드라이버 라이브러리는 어뎁터없이 잔류되었다. 이어서, 피검 및 드라이버 라이브러리를 과량의 드라이버 cDNA를 사용하여 하이브리드화하였다. 일차 하이브리드화 단계에서, 드라이버는 두 피검 cDNA 집단의 각각과 별도로 하이브리드화시켰다. 이 결과, (a) 비하이브리드화된 피검 cDNA, (b) 다른 피검 cDNA에 하이브리드화된 피검 cDNA, (c) 드라이버 cDNA에 하이브리드화된 피검 cDNA 및 (d) 비하이브리드화된 드라이버 cDNA의 집단이 생성되었다. 그런 다음, 두 개의 별개 하이브리드화 반응물을 혼합하고 추가의 변성된 드라이버 cDNA의 존재하에 재하이브리드화시켰다. 이러한 이차 하이브리드화 후, (a) 내지 (d) 집단 이외에, 하나의 어뎁터를 갖는 피검 cDNA가 제2 어뎁터를 갖는 피검 cDNA와 하이브리드화한 제5 집단(e)이 생성되었다. 따라서, 이차 하이브리드화 단계 결과 어뎁터-특이적 프라이머로 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용할 수 있는 차별적으로 발현된 서열이 농축되었다.
이어서, 말단을 채우고 PCR 증폭을 어뎁터-특이적 프라이머를 사용하여 실시하였다. 드라이머 cDNA와 하이브리드화하지 않은 피검 cDNA를 함유한 (e) 집단 만이 지수적으로 증폭되었다. 그런 다음, 이차 PCR 증폭 단계를 실시하여 배경값을 감소시키고 또한 차별적으로 발현된 서열을 농축시켰다.
공제된 라이브러리(LAP1로 인용함)로부터 57개 cDNA 클론을 분리하고 서열분석하였다. 이들 클론중 16개에 대해 결정된 cDNA 서열이 서열 101 내지 116으로 제공된다. 서열 101 및 114의 서열은 이전에 동정된 서열과 유의적인 상동성을 나타내지 않았다. 서열 102 내지 109 및 112의 서열은 이전에 동정된 서열과 일부 유사성을 나타냈고, 서열 113, 115 및 116의 서열은 이전에 분리된 EST와 약간 유사성을 나타냈다.
C. PCR-기본 cDNA 라이브러리 공제를 사용하여 작은 세포 폐선암종 라이브러리로부터 cDNA 서열의 분리
상기된 변형 PCR-기본 공제 방법을 필수적으로 사용하여 작은 세포 폐선암종(SCL1로 인용함)의 공제된 cDNA 라이브러리를 제조하였다. 작은 세포 폐선암종으로부터의 cDNA는 정상 폐, 뇌, 신장, 간, 췌장, 피부, 심장, 림프절 및 비장을 포함한 정상 조직의 패널로부터의 cDNA에 대해 공제하였다. 피검 및 드라이버 폴리 A+RNA를 처음에 SMART PCR cDNA 합성 키트(제조원: Clontech, 캘리포니아 팔로 알토 소재)를 사용하여 증폭시켰다. 피검 및 드라이버 이본쇄 cDNA를 별도로 5개의 제한 효소(DraI, MscI, PvuII, SmaI 및 StuI)으로 분해시켰다. 이들 제한 효소는 평활 말단 절단부를 형성하였고 분해 결과 600 bp의 평균 삽입체 크기가 생성되었다. 이 제한 효소 세트로의 분해는 cDNA 말단을 채움으로써 평활 말단을 생성하는데 필요한 단계를 제거한다. 이들 변형은 공제효능에 영향을 미치지 않았다.
85개 클론을 분리하고 서열분석하였다. 이들 클론중 31개에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 117 내지 147로 제공된다. 서열 122, 124, 126, 127, 130, 131, 133, 136, 139 및 147의 서열은 이전에 동정된 서열과 유의적인 상동성을 나타내지 않았다. 서열 120, 129, 135, 137, 140, 142, 144 및 145의 서열은 이전에 동정된 유전자 사열과 일부 유사성을 나타냈고, 서열 114, 118, 119, 121, 123, 125, 128, 132, 134, 138, 141, 143 및 147의 서열은 이전에 분리된 EST와 일부 유사성을 나타냈다.
추가의 연구에서, 9가지의 정상 조직(폐, 뇌, 신장, 간, 췌장, 피부, 심장, 뇌하수체 및 비장)으로부터의 폴리 A+RNA의 풀에 대해 공제된 단일 작은 세포 폐선암종 샘플로부터의 폴리 A+RNA로부터 세 개의 추가적인 cDNA 라이브러리를 생성하였다. 첫 번째 라이브러리(SCL2로 인용함)의 경우, 공제는 필수적으로 LAP1 라이브러리에 대해 상기된 바와 같이 실시하였고 단 피검 및 드라이버를 PvuII, StuI,MscI 및 DraI으로 분해시켰다. 사용된 피검 및 드라이버 cDNA의 비율은 제조원(Clontech)의 권장에 따라 이행하였다. 두 번째 라이브러리(SCL3으로 인용함)의 경우, 공제는 필수적으로 SCL2와 마찬가지로 실시하였고, 단 SCL2 라이브러리로부터 동정된 고도의 중복 클론에 대한 cDNA가 드라이버 cDNA에 포함되었다. SCL4 라이브러리의 작제는 SCL3 라이브러리에 대해 기술된 바와 같이 필수적으로 실시하였고 단 드라이버 대 피검의 비율 높여서 사용하였다.
각 라이브러리를 DNA 서열분석 및 데이터베이스 분석에 의해 특성화하였다. SCL2 라이브러리부터 분리된 35개 클론에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 245 내지 279로 제공되고 SCL3 라이브러리로부터 분리된 21개 클론 및 SCL4 라이브러리로부터 분리된 15개 클론에 대해 결정된 cDNA 서열은 각각 서열 280 내지 300, 및 301 내지 315로 제공된다. 서열 246, 254, 261, 262, 304, 309 및 311의 서열은 이전에 동정된 서열과 유의적인 상동성을 나타내지 않았다. 서열 245, 248, 255, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288 내지 290, 292, 295, 301 및 303의 서열은 이전에 분리된 EST와 일부 상동성을 나타내는 반면, 서열 247, 249 내지 253, 256 내지 260, 263 내지 265, 267 내지 269, 271 내지 274, 276 내지 279, 281, 284 내지 287, 291, 293, 294, 296 내지 300, 302, 305 내지 308, 310 및 312-315의 서열은 이전에 동정된 유전자 서열과 일부 상동성을 나타냈다.
D. PCR-기본 cDNA 라이브러리 공제를 사용하여 신경내분비 라이브러리로부터 cDNA 서열의 분리
LAP1 공제된 라이브러리에 대해 상기된 바와 같이 필수적으로 변형 PCR-기본 공제 방법을 사용하여, 정상 폐, 뇌, 신장, 간, 췌장, 피부, 심장, 림프절 및 비장을 포함한 9개의 정상 조직의 패널로 공제함으로써 용골하 림프절에 전이된 폐 신경내분비 선암종으로부터 공제된 cDNA 라이브러리(MLN1로 인용함)을 유도하였다.
91개 클론을 분리하고 서열분석하였다. 이들 클론중 58개에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 147 내지 222로 제공된다. 서열 150, 151, 154, 157, 158, 159, 160, 163, 174, 175, 178, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 200, 208 내지 210, 212 내지 215 및 220의 서열은 이전에 동정된 서열과 유의적인 상동성을 나타내지 않았다. 서열 152, 155, 156, 161, 165, 166, 176, 179, 182, 184, 185, 191, 194, 221 및 222는 이전에 동정된 유전자 서열과 일부 유사성을 나타냈고 서열 148, 149, 153, 164, 167 내지 173, 177, 180, 181, 183, 201 내지 207, 211 및 216 내지 219의 서열은 이전에 분리된 EST와 일부 유사성을 나타냈다.
MLN1 라이브러리로부터 분리된 추가의 442개 클론의 결정된 cDNA 서열은 서열 341 내지 782로 제공된다.
E. PCR-기본 cDNA 라이브러리 공제를 사용하여 편평 세포 폐 선암종 라이브러리로부터 cDNA 서열의 분리
상기된 변형 PCR-기본 공제 방법을 필수적으로 사용하여, 편평 세포 폐 선암종에 대해 공제된 cDNA 라이브러리(SQL1로 인용함)를 제조하였다. 단, 피검 및 드라이버 이본쇄 cDNA는 4개의 제한 효소(DraI, MscI, PvuII 및 StuI)로 별도로 분해시키고 두 개의 편평 세포 폐 선암종의 풀로부터의 cDNA를 정상 폐, 뇌, 신장, 간, 췌장, 피부, 심장, 비장, 식도 및 기도를 포함한 10개의 정상 조직의 풀로부터의 cDNA에 대해 공제하였다.
74개 클론을 분리하고 서열분석하였다. 이들 클론중 22개에 대해 결정된 cDNA 서열은 서열 223 내지 244로 제공된다. 서열 241의 서열은 이전에 동정된 서열과 유의적인 상동성을 나타내지 않았다. 서열 223, 225, 232, 233, 235, 238, 239, 242 및 243의 서열은 이전에 동정된 유전자 서열과 일부 유사성을 나타냈고 서열 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241 및 244의 서열은 이전에 분리된 EST와 일부 유사성을 나타냈다.
폐 종양 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리의 특성화 동안에 분리된 추가의 12개 클론의 서열은 서열 813 내지 824로 제공된다. 이들 서열을 진뱅크 데이터베이스 및 GeneSeq DNA 데이터 베이스와 비교한 결과, 이전에 동정된 서열과 유의적인 상동성이 없는 것으로 밝혀졌다.
실시예 2
폴리펩타이드의 합성
HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성화와 함께 FMOC 화학반응을 사용하여 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 430A 펩타이드 합성기에서 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. Gly-Cys-Gly 서열을 펩타이드의 아미노 말단에 결합시켜 결합 방법, 고정된 표면에의 결합 또는펩타이드의 표지를 제공할 수 있다. 고체 지지체로부터 펩타이드를 절단하는 것은 다음의 절단 혼합물을 사용하여 실시할 수 있다: 트리플루오로아세트산:에탄디티올:티오아니솔:물:페놀(40:1:2:2:3). 2시간 동안 절단한 후, 펩타이드를 찬 메틸-t-부틸-에테르중에서 침전시킬 수 있다. 이어서, 펩타이드 펠렛을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)이 함유된 물에 용해시키고 C18 역상 HPLC에 의해 정제하기 전에 동결건조시킬 수 있다. 물(0.1% TFA를 함유)중의 0% 내지 60% 아세토니트릴(0.1% TFA를 함유)의 구배를 사용하여 펩타이드를 용출시킬 수 있다. 순수한 분획을 동결건조시킨 후 전기분무 또는 질량분석 및 아미노산 분석 등을 사용하여 펩타이드를 특성화할 수 있다.
실시예 3
폐암 항원에 대한 항체의 제조
폐암 항원 L773P(서열 783)에 대한 폴리클로날 항체를 다음과 같이 제조하였다.
상기한 바와 같이 이. 콜라이에서 발현되고 정제된 재조합 단백질로 토끼를 면역화하였다. 초기 면역화의 경우, 무라밀 디펩타이드(MDP)와 배합된 항원 400 ㎍을 피하(S.C.) 주사하였다. 4주 후에 불완전 프로인트 보조제(IFA)와 혼합된 항원 200 ㎍으로 동물에 추가 접종하였다. 높은 항체 역가 반응을 유도하기 위해 필요에 따라 IFA와 혼합된 항원 100 ㎍으로 피하 주사하여 추가 접종하였다. 면역화된 토끼로부터 채혈된 혈청을 정제된 단백질로 ELISA 검정을 사용하여 L773P-특이적 반응성에 대해 검사하였으며, 그 결과 L733P에 대해 강력한 반응성을 나타냈다. L773P에 대한 폴리클로날 항체를 고체 지지체에 결합된 정제된 단백질을 사용하여 고역가 폴리클로날 혈청으로부터 친화성 정제하였다.
실시예 4
폐 종양-특이적 항원의 단백질 발현
6X His 태그를 갖는 전체 길이 L773P(서열 783의 아미노산 2 내지 364)을 표준 기술을 사용하여 pPDM 발현 벡터내로 서브클로닝시키고 BL21 CodonPlus 또는 BL21 pLysS 숙주 세포를 형질전환시켰다. 양 경우에 있어서 고 수준의 발현이 관찰되었다. 유사하게, 6X His 태그를 갖는 L773P의 N-말단 부분(서열 783의 아미노산 2 내지 71; L773PA로 인용함)을 벡터 pPDM내로 서브클로닝시키고 BL21 CodonPlus 숙주 세포를 형질전환시켰다. N-말단 서열분석에 의해 낮은 수준의 발현이 관찰되었다. L773P 및 L773PA에 대해 발현된 작제물의 서열은 서열 784 및 785로 각각 제공된다.
비록 본 발명의 특정 양태가 예시의 목적으로 본원에 기술되었으나 본 발명의 정신 및 범위로부터 벗어나지 않으면서 다양한 변형이 이루어질 수 있다는 것은 상기 설명으로부터 이해될 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기 예시로 제한되는 것이 아니며 첨부된 특허청구범위에 의해 결정되는 것이다.

Claims (60)

  1. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826에 기술된 서열;
    (b) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; 및
    (c) 상기 (a) 또는 (b) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 폴리펩타이드가 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  3. 서열 786, 787, 791, 793, 795, 797 내지 799, 806, 809 및 827중의 어느 하나로 기술된 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  4. 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한 폐 종양 단백질중 15개 이상의 아미노산 잔기를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 이와 한 개 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 의해 상이하지만 항원-특이적 항혈청과 반응하는 능력은 실질적으로 감소되지 않은 변이체.
  5. 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261,262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한 폐 종양 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 변이체.
  6. 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  7. 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제4항 내지 제7항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제4항 내지 제8항중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항의 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포.
  11. 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224,226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질과 특이적으로 결합하는 분리된 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  12. 제1항에 따른 폴리펩타이드를 한 개 이상 포함하는 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염된 숙주 세포에서 그 융합 단백질의 발현을 증가시키는 발현 인핸서를 포함하는 융합 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 제1항의 폴리펩타이드내에 존재하지 않는 T 헬퍼 에피토프를 포함하는 융합 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질.
  16. 제12항의 융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  17. 생리학적으로 허용되는 담체 및, (a) 제1항의 폴리펩타이드, (b) 제4항의 폴리뉴클레오타이드, (c) 제11항의 항체, (d) 제12항의 융합 단백질 및 (e) 제16항의 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  18. 면역자극제 및, (a) 제1항의 폴리펩타이드, (b) 제4항의 폴리뉴클레오타이드, (c) 제11항의 항체, (d) 제12항의 융합 단백질 및 (e) 제16항의 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 성분을 포함하는 면역원성 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 면역자극제가 보조제인 면역원성 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 면역자극제가 우세한 I형 반응을 유도하는 면역원성 조성물.
  21. 환자에게 유효량의 제17항의 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  22. 환자에게 유효량의 제18항의 면역원성 조성물을 투여함을 포함하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  23. 제1항의 폴리펩타이드를 발현하는 항원-제시 세포를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 배합하여 포함하는 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, 항원 제시 세포가 수지상 세포 또는 대식세포인 약제학적 조성물.
  25. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열;
    (b) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; 및
    (c) 상기 (a) 또는 (b) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 항원-제시 세포를 면역자극제와 배합하여 포함하는 면역원성 조성물.
  26. 제25항에 있어서, 면역자극제가 보조제인 면역원성 조성물.
  27. 제25항에 있어서, 면역자극제가 우세한 I형 반응을 유도하는 면역원성 조성물.
  28. 제25항에 있어서, 항원-제시 세포가 수지상 세포인 면역원성 조성물.
  29. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84,86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열;
    (b) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; 및
    (c) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 상기 (a) 또는 (b) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드를 발현하는 유효량의 항원-제시 세포를 환자에게 투여하고 환자에게서 암의 성장을 억제함을 포함하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 항원-제시 세포가 수지상 세포인 방법.
  31. 제21항, 제22항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
  32. (i) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드; 및
    (ii) 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포와 생물학적 샘플을 샘플로부터 항원을 발현하는 세포의 제거를 허용하기에 충분한 조건하에서 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법.
  33. 제32항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 또는 이의 분획인 방법.
  34. 제32항의 방법에 따라 처리된 생물학적 샘플을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  35. (a) (i) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160,162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열;
    (ii) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; 및
    (iii) 상기 (i) 또는 (ii) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드;
    (b) (a)의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (c) (a)의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 성분과 T 세포를 T 세포의 자극 및/또는 증식을 허용하기에 충분한 조건하에 및 시간 동안 접촉시킴을 포함하여 폐 종양 단백질에 대해 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 증식시키는 방법.
  36. 제35항의 방법에 따라 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단.
  37. 유효량의 제36항의 T 세포 집단을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  38. (a) (i) (1) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열;
    (2) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84,86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; 및
    (3) 상기 (1) 또는 (2) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드;
    (ii) (i)의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (iii) (i)의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 성분과 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 배양하여 T 세포를 증식시키고;
    (b) 유효량의 증식된 T 세포를 환자에게 투여하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  39. (a) (i) (1) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39,41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826에 기술된 서열;
    (2) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 서열과 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; 및
    (3) 상기 (1) 또는 (2) 서열의 상보체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드;
    (ii) (i)의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및
    (iii) (i)의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 한 개 이상의 성분과 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 배양하여 T 세포를 증식시키고;
    (b) 한 개 이상의 증식된 세포를 클로닝하여 클로닝된 T 세포를 제공하며;
    (c) 유효량의 클로닝된 T 세포를 환자에게 투여하여 환자에게서 암의 성장을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에게서 암의 성장을 억제하는 방법.
  40. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질과 결합하는 결합제와 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 접촉시키고;
    (b) 샘플중에서 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하며;
    (c) 폴리펩타이드의 양을 예정된 컷-오프 값과 비교하여 이로부터 환자에게서 암의 유무를 결정하는 단계를 포함하여 환자에게서 암의 유무를 결정하는 방법.
  41. 제40항에 있어서, 결합제가 항체인 방법.
  42. 제43항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  43. 제40항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
  44. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질과 결합하는 결합제와 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 한 시점에서 접촉시키고;
    (b) 샘플중에서 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하며;
    (c) 이후의 시점에서 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하고;
    (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하여 이로부터 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하여 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 결합제가 항체인 방법.
  46. 제45항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 암이 폐암인 방법.
  48. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220,224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 접촉시키고;
    (b) 샘플중에서 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하며;
    (c) 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 예정된 컷-오프 값과 비교하여 이로부터 환자에게서 암의 유무를 결정하는 단계를 포함하여 환자에게서 암의 유무를 결정하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 중합효소 연쇄 반응으로 결정되는 방법.
  50. 제48항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 하이브리드화 검정으로 결정되는 방법.
  51. (a) 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800 내지 804, 807, 808, 및 810 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 접촉시키고;
    (b) 샘플중에서 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하며;
    (c) 이후의 시점에서 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하고;
    (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리뉴클레오타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하여 이로부터 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하여 환자에게서 암의 진행을 모니터링하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 중합효소 연쇄 반응으로 결정되는 방법.
  53. 제51항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 하이브리드화 검정으로 결정되는 방법.
  54. (a) 제11항에 따른 하나 이상의 항체 및 (b) 리포터 그룹을 포함하는 검출 시약을 포함하는 진단 키트.
  55. 제54항에 있어서, 항체가 고체 지지체상에 고정되는 키트.
  56. 제54항에 있어서, 검출 시약이 항-면역글로불린, 프로테인 G, 프로테인 A 또는 렉틴을 포함하는 키트.
  57. 제54항에 있어서, 리포터 그룹이 방사능동위원소, 형광 그룹, 발광 그룹, 효소, 바이오틴 및 염료 입자로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 키트.
  58. 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이중 어느 하나의 상보체에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 폐 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 10 내지 40개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  59. 제58항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드가 서열 1, 11 내지 13, 15, 20, 23 내지 27, 29, 30, 33, 34, 39, 41, 43 내지 46, 51, 52, 57, 58, 60, 62, 65 내지 67, 69 내지 71, 74, 76, 79, 80, 84, 86, 89 내지 92, 95, 97, 98, 101, 110, 111, 113 내지 119, 121 내지 128, 130 내지 134, 136, 138, 139, 141, 143, 146 내지 151, 153, 154, 157 내지 160, 162 내지 164, 167 내지 178, 180, 181, 183, 186 내지 190, 192, 193, 195 내지 220, 224, 226 내지 231, 234, 236, 237, 240, 241, 244 내지 246, 248, 254, 255, 261, 262, 266, 270, 275, 280, 282, 283, 288, 289, 290, 292, 295, 301, 303, 304, 309, 311, 341 내지 782, 784, 785, 790, 792, 794, 796, 800, 802, 804, 807, 808, 및 811 내지 826중 어느 하나에 기술된 10 내지 40개 연속 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  60. (a) 제59항의 올리고뉴클레오타이드 및 (b) 중합효소 연쇄 반응 또는 하이브리드화 검정에 사용하기 위한 진단 시약을 포함하는 진단 키트.
KR1020017016849A 1999-06-30 2000-06-30 폐암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 KR20020026483A (ko)

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KR100873629B1 (ko) * 2007-01-05 2008-12-12 경북대학교 산학협력단 신규한 폐암 진단용 마커
KR101219519B1 (ko) * 2011-05-06 2013-01-09 한국기초과학지원연구원 렉틴을 이용한 암 진단 방법

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