KR20030008369A - 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법 - Google Patents

유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20030008369A
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쉬장춘
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코릭사 코포레이션
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    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals

Abstract

본 발명은 암, 예를 들면, 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법에 관한 것이다. 조성물은 하나 이상의 유방 종양 단백질, 이의 면역원성 부분, 또는 이러한 부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또 다른 한편, 치료학적 조성물은 유방 종양 단백질을 발현하는 항원 제공 세포, 또는 이러한 단백질을 발현하는 세포에 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 조성물은, 예를 들면, 질병(예: 유방암)의 예방 및 치료에 사용될 수 있다. 샘플 내에서 유방 종양 단백질, 또는 이러한 단백질을 암호화하는 mRNA를 검출하는 것에 기초한 진단 방법이 또한 제공된다.

Description

유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법{Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer}
유방암은 미국과 전세계 여성들에게 있어 건강상 상당히 중요한 문제가 되고 있다. 이러한 질병을 검출하고 치료하는 기술이 진전되어 왔지만, 매년 미국에서 180,000명 이상의 여성에게 걸릴 정도로, 유방암이 여전히 암 관련 여성 사망률 2위를 차지하고 있다. 북미 여성의 경우, 유방암에 걸린 환자의 생존율은 현재 8명중 1명이다.
유방암의 예방 또는 치료를 위한 어떠한 백신이나 기타 널리 성공적인 방법도 현재 이용가능하지 않다. 이 질병의 관리는 현재, 초기 진단(통상적인 유방 스크리닝 과정을 통하여 이루어짐)과, 수술, 방사선요법, 화학요법 및 호르몬 요법과 같은 각종 치료법 한 가지 이상을 포함할 수 있는 적극적인 치료를 병행하는 것에만 의존하고 있다. 특정 유방암에 대한 치료 과정은 종종, 특이적 종양 마커의 분석을 포함한 각종 예후 파라미터에 근거하여 선택된다[참조: Porter-Jordan and Lippman,Breast Cancer8:73-100(1994)]. 그러나, 정착된 마커를 사용하게 되면, 종종 판단하기 어려운 결과가 야기되고, 유방암 환자에게서 관찰되는 높은 사망률은 이러한 질병의 치료, 진단 및 예방 기술이 향상될 필요가 있다는 것을 지시해준다.
따라서, 당해 분야에서는, 유방암의 치료 및 진단을 위한 개선된 방법이 요망된다. 본 발명은 이러한 요망을 충족시켜 주고, 또한 이와 관련된 기타 이점을 추가로 제공해준다.
발명의 요약
간략하게 언급하면, 본 발명은 암, 예를 들면, 유방암의 진단 및 치료용 조성물 및 이의 방법을 제공한다. 한 국면에 있어서, 본 발명은 유방 종양 단백질의 적어도 일정 부분, 또는 이의 변이체를 포함하는 폴리펩타이드를 제공한다. 특정 부분 및 기타 변이체는 면역원성이기 때문에, 항원-특이적 항혈청과 반응하는 상기 변이체의 능력은 실질적으로 저하되지 않는다. 특정 양태 내에서는, 상기 폴리펩타이드가 (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489에 제시된 서열; (b) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479,484, 486 및 489에 제시된 서열의 변이체 및 (c) (a) 또는 (b) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 서열을 포함한다. 특정 양태에서는, 본 발명의 폴리펩타이드가 서열 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 및 488에 제시된 서열 및 이들의 변이체로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 종양 단백질의 적어도 일정 부분을 포함한다.
본 발명은 추가로, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 일정 부분(이러한 일정 부분은 유방 종양 단백질의 15개 이상의 아미노산 잔기를 암호화한다), 이러한 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터, 및 상기 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다.
기타 국면 내에서는, 본 발명이 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 관련 국면 내에서는, 면역원성 조성물, 또는 예방용 또는 치료용 백신이 제공된다. 이러한 조성물은 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드와 면역자극제를 포함한다.
본 발명은 추가로, (a) 유방 종양 단백질과 특이적으로 결합되는 항체 또는 이의 항원-결합 단편 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 국면 내에서는, 본 발명이 (a) 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 항원 제공 세포에는 수지상 세포, 대식세포(macrophage), 단구, 섬유아세포 및 B 세포가 포함된다.
관련 국면 내에서는, (a) 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 및 (b) 면역자극제를 포함하는 면역원성 조성물, 또는 백신이 제공된다.
본 발명은 추가로, 한 국면에 있어서, 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 및 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 본 발명에 따라서 예시되는 융합 단백질은 제1 아미노산 부분과 제2 아미노산 부분을 포함하는데, 이러한 제1 아미노산 부분은 서열 493의 아미노산 1-93으로써 제시된 바와 같이 맘마글로빈(mammaglobin)으로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하고, 제2 아미노산 부분은 서열 475, 서열 469 또는 서열 176으로써 제시된 바와 같이 B726P로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하며 상기 제1 아미노산 부분은 제2 아미노산 부분의 아미노 말단 또는 카복시 말단에 연결되어 있다.
본 발명의 추가의 양태는 제1 아미노산 부분이 IDELKECFLNQTDETLSNVE(서열 493의 아미노산 59-78); TTNAIDELKECFLNQ(서열 493의 아미노산 55-69); SQHCYAGSGCPLLENVISKTI(서열 493의 아미노산 13-33); EYKELLQEFIDDNATTNAID(서열 493의 아미노산 41-60); KLLMVLMLA(서열 493의 아미노산 2-10); QEFIDDNATTNAI(서열 493의 아미노산 47-59) 및 LKECFLNQTDETL(서열 493의 아미노산 62-74)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질을 제공한다.
또 다른 양태는 제2 아미노산 부분이 (1) 서열 475에 제시된 바와 같이 B726P의 조합된 업스트림 및 다운스트림 개방 판독 프레임(ORF); (2) 서열 469에 제시된 바와 같은 B726P의 업스트림 ORF 및 (3) 서열 176에 제시된 바와 같은 B726P의 다운스트림 ORF에 의해 암호화된 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 본 발명에 따르는 융합 단백질은 또한, 서열 475의 아미노산 1-129로써 제시된 아미노산 서열로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 제2 아미노산 부분을 포함할 수 있다. 또한, 부가의 융합 단백질의 예가 서열 493; 서열 494 및 서열 495로써 본원에 제시되어 있다.
맘마글로빈 아미노산 부분이 B726P 아미노산 부분의 아미노-말단에 연결되어 있는 융합 단백질이 제공되지만, 또한 맘마글로빈 아미노산 부분이 B726P 아미노산 부분의 카복시-말단에 연결되는 기타 융합 단백질도 제공된다. 맘마글로빈 아미노산 부분과 B726P 부분 간의 연결은 공유 결합일 수 있다. 부가적으로, 맘마글로빈 및/또는 B726P와 관련되거나 관련되지 않은 아미노산 연장물을 아미노- 또는 카복시-말단 내지 맘마글로빈 및/또는 B726P 아미노산 부분 사이에 혼입할 수도 있다.
본 발명은 또한, 본원에 구체적으로 기재된 모든 융합 단백질 뿐만 아니라 통상의 당업자에 의한 실험으로 달성될 수 있는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.
관련 국면 내에서는, 융합 단백질 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 생리학적으로 허용되는 담체와 함께 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
기타 국면에서는, 융합 단백질 또는 이러한 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 면역억제제와 함께 포함하는 조성물이 추가로 제공된다.
추가 국면 내에서는, 본 발명이 상기 언급된 바와 같은 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에게서 암 발생을 억제하는 방법을 제공한다. 상기 환자는 유방암에 걸릴 수 있고, 이러한 경우, 상기 방법으로 상기 질병을 치료할 수 거나, 또는 이러한 질병에 걸릴 위험이 있는 것으로 간주된 환자를 예방적으로 처치할 수 있다.
본 발명은 추가로, 기타 국면 내에서, 생물학적 샘플을, 유방 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포와 접촉시키는 단계(이러한 접촉 단계는 상기 샘플로부터 상기 단백질을 발현하는 세포를 제거하기에 충분한 시간 및 조건 하에 수행한다)를 포함하는, 특정 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
관련 국면 내에서는, 상기 언급된 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에게서 암 발생을 억제시키는 방법이 제공된다.
기타 국면 내에서는, T 세포를 (i) 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드; (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 중 하나 이상과, 세포의 자극 및/또는 확장을 허용하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 접촉시키는 단계를 포함하는, 유방 종양 단백질에 특이적인 T 세포를 자극 및/또는 확장시키는 방법이 추가로 제공된다. 상기 언급된 바와 같이 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단이 또한제공된다.
추가의 국면 내에서는, 본 발명이 상기 언급된 바와 같은 T 세포 집단의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에게서 암 발생을 억제시키는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, (a) 특정 환자로부터 분리된 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 (i) 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드; (ii) 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포 중 하나 이상과 함께 항온 배양하는 단계 및 (b) 이로써 증식된 T 세포의 유효량을 상기 환자에게 투여함으로써, 환자에게서 암 발생을 억제시키는 단계를 포함하는, 환자에게서 암 발생을 억제시키는 방법. 증식된 세포를 환자에게 투여하기에 앞서 클론화시킬 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다.
추가의 국면 내에서는, 본 발명이 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드와 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; (b) 이러한 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 상기 샘플 내에서 검출하는 단계 및 (c) 상기 폴리펩타이드의 양을 예정된 컷-오프(cut-off)치와 비교함으로써, 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 기타 국면 내에서, 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 방법을 제공한다. 이러한 방법은 (a) 제1 시점에서 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드와 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; (b) 이러한 결합제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 상기 샘플 내에서 검출하는 단계; (c) 후속 시점에서 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하고, 이로부터 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 단계를 포함한다.
기타 국면 내에서는, 본 발명이 추가로, (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을, 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; (b) 이러한 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 mRNA의 수준을 상기 샘플 내에서 검출하는 단계 및 (c) 상기 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 수준을 예정된 컷-오프치와 비교함으로써, 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 양태에서는, 예를 들면, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드의 상보성 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 사용하여 폴리머라제 연쇄 반응을 통하여 mRNA의 양을 검출한다. 기타 양태에서는, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드의 상보성 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브를 이용하는 하이브리드화 기술을 사용하여 mRNA의 양을 검출한다.
관련 국면에서는, (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을, 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; (b) 이러한 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 상기 샘플 내에서 검출하는 단계; (c) 후속 시점에서 상기 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a) 및 (b)를 반복하는 단계 및 (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리뉴클레오타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하고, 이로부터 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 단계를 포함하는, 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 방법이 제공된다.
추가의 국면 내에서는, 본 발명이 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드와 결합되는 항체, 예를 들면, 모노클로날 항체, 및 이러한 항체를 포함하는 진단용 키트를 제공한다. 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함하는 진단용 키트가 또한 제공된다.
본 발명의 이들 및 기타 국면은 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 하여 명백해질 것이다. 본원에 언급된 모든 참조문헌은 각각이 개별적으로 삽입된 경우처럼 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입된다.
본 발명은 일반적으로, 암, 예를 들면, 유방암의 치료 및 진단에 관한 것이다. 더욱 특히, 본 발명은 유방 종양 단백질의 적어도 일정 부분을 포함하는 폴리펩타이드, 및 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 이러한 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 유방암의 예방 및 치료용 조성물, 및 유방암의 진단 및 모니터용 조성물에 사용할 수 있다.
도 1은 클론 SYN18C6(서열 40)의 노던 블롯(Northern blot)의 결과를 도시한 것이다.
서열 1은 JBT2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 2은 JBT6의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 3은 JBT7의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 4은 JBT10의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 5은 JBT13의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 6은 JBT14의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 7은 JBT15의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 8은 JBT16의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 9은 JBT17의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 10은 JBT22의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 11은 JBT25의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 12은 JBT28의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 13은 JBT32의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 14은 JBT33의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 15은 JBT34의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 16은 JBT36의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 17은 JBT37의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 18은 JBT51의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 19은 JBTT1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 20은 JBTT7의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 21은 JBTT11의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 22은 JBTT14의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 23은 JBTT18의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 24은 JBTT19의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 25은 JBTT20의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 26은 JBTT21의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 27은 JBTT22의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 28은 JBTT28의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 29은 JBTT29의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 30은 JBTT33의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 31은 JBTT37의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 32은 JBTT38의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 33은 JBTT47의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 34은 JBTT48의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 35은 JBTT50의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 36은 JBTT51의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 37은 JBTT52의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 38은 JBTT54의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 39은 SYN17F4의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 40은 SYN18C6(또한 B709P로서 공지됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 41은 SYN19A2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 42은 SYN19C8의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 43은 SYN20A12의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 44은 SYN20G6의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 45은 SYN20G6-2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 46은 SYN21B9의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 47은 SYN21B9-2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 48은 SYN21C10의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 49은 SYN21G10의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 50은 SYN21G10-2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 51은 SYN21G11의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 52은 SYN21G11-2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 53은 SYN21H8의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 54은 SYN22A10의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 55은 SYN22A10-2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 56은 SYN22A12의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 57은 SYN22A2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 58은 SYN22B4의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 59은 SYN22C2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 60은 SYN22E10의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 61은 SYN22F2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 62은 SYN18C6(또한 B709P로서 공지됨)의 추정 아미노산 서열이다.
서열 63은 B723P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 64은 B724P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 65은 B770P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 66은 B716P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 67은 B725P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 68은 B717P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 69은 B771P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 70은 B722P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 71은 B726P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 72은 B727P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 73은 B728P의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 74-87은 공지된 서열과 상동성을 나타내는 분리된 클론의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 88은 13053의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 89은 13057의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 90은 13059의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 91은 13065의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 92은 13067의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 93은 13068의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 94은 13071의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 95은 13072의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 96은 13073의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 97은 13075의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 98은 13078의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 99은 13079의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 100은 13081의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 101은 13082의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 102은 13092의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 103은 13097의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 104은 13101의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 105은 13102의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 106은 13119의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 107은 13131의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 108은 13133의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 109은 13135의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 110은 13139의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 111은 13140의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 112은 13146의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 113은 13147의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 114은 13148의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 115은 13149의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 116은 13151의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 117은 13051의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 118은 13052의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 119은 13055의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 120은 13058의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 121은 13062의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 122은 13064의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 123은 13080의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 124은 13093의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 125은 13094의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 126은 13095의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 127은 13096의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 128은 13099의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 129은 13100의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 130은 13103의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 131은 13106의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 132은 13107의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 133은 13108의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 134은 13121의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 135은 13126의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 136은 13129의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 137은 13130의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 138은 13134의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 139은 13141의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 140은 13142의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 141은 14376의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 142은 14377의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 143은 14383의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 144은 14384의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 145은 14387의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 146은 14392의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 147은 14394의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 148은 14398의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 149은 14401의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 150은 14402의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 151은 14405의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 152은 14409의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 153은 14412의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 154은 14414의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 155은 14415의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 156은 14416의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 157은 14419의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 158은 14426의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 159은 14427의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 160은 14375의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 161은 14378의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 162은 14379의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 163은 14380의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 164은 14381의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 165은 14382의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 166은 14388의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 167은 14399의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 168은 14406의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 169은 14407의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 170은 14408의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 171은 14417의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 172은 14418의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 173은 14423의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 174은 14424의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 175은 B726P-20의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 176은 B726P-20의 추정 아미노산 서열이다.
서열 177은 PCR 프라이머이다.
서열 178은 B726P-74의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 179은 B726P-74의 추정 아미노산 서열이다.
서열 180은 B726P-79의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 181은 B726P-79의 추정 아미노산 서열이다.
서열 182은 맘마글로빈 유전자와 상동성을 나타내는, 19439.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 183은 사람 케라틴 유전자와 상동성을 나타내는, 19407.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 184은 사람 염색체 17 클론과 상동성을 나타내는, 19428.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 185은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B808P(19408)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 186은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19460.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 187은 Ig 카파 경쇄와 상동성을 나타내는, 19419.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 188은 사람 알파-1 콜라겐과 상동성을 나타내는, 19411.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 189은 mus 근육 프로테이나제-3과 상동성을 나타내는, 19420.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 190은 사람 고 운동성 그룹 박스와 상동성을 나타내는, 19432.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 191은 사람 플라스미노겐 활성화 인자 유전자와 상동성을 나타내는, 19412.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 192은 미토겐 활성화된 단백질 키나제와 상동성을 나타내는, 19415.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 193은 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸 단백질과 상동성을 나타내는, 19409.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 194은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19406.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 195은 사람 피브로넥틴과 상동성을 나타내는, 19421.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 196은 레티노산 수용체 반응인자 3과 상동성을 나타내는, 19426.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 197은 MyD88 mRNA와 상동성을 나타내는, 19425.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 198은 펩타이드 수송체(TAP-1) mRNA와 상동성을 나타내는, 19424.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 199은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19429.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 200은 사람 다형성 상피 뮤신과 상동성을 나타내는, 19435.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 201은 사람 GATA-3 전사 인자와 상동성을 나타내는, B813P(19434.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 202은 사람 AP-2 유전자와 상동성을 나타내는, 19461.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 203은 DNA 결합 조절 인자와 상동성을 나타내는, 19450.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 204은 Na/H 교환 조절 조인자와 상동성을 나타내는, 19451.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 205은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19462.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 206은 히스톤 HAS.Z에 대한 사람 mRNA와 상동성을 나타내는, 19455.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 207은 PAC 클론 179N16과 상동성을 나타내는, 19459.1의 결정된 cDNA서열이다.
서열 208은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19464.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 209은 리포필린 B와 상동성을 나타내는, 19414.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 210은 염색체 17 클론 hRPK.209_J_20과 상동성을 나타내는, 19413.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 211은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19416.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 212은 사람 클론 24976 mRNA와 상동성을 나타내는, 19437.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 213은 PG-M 코어 단백질에 대한 마우스 DNA와 상동성을 나타내는, 19449.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 214은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19446.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 215은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19452.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 216은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19483.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 217은 사람 리포필린 C와 상동성을 나타내는, 19526.1의 결정된 cDNA서열이다.
서열 218은 분비된 시멘트샘 단백질 XAG-2와 상동성을 나타내는, 19484.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 219은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19470.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 220은 사람 HLA-DM 유전자와 상동성을 나타내는, 19469.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 221은 사람 pS2 단백질 유전자와 상동성을 나타내는, 19482.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 222은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B805P(19468.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 223은 사람 트롬보스폰딘 mRNA와 상동성을 나타내는, 19467.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 224은 세포 주기 조절에 관여하는 CDC2 유전자와 상동성을 나타내는, 19498.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 225은 TREB 단백질에 대한 사람 cDNA와 상동성을 나타내는, 19506.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 226은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B806P(19505.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 227은 유형 I 표피 케라틴과 상동성을 나타내는, 19486.1의 결정된cDNA 서열이다.
서열 228은 당단백질에 대한 글루코즈 수송체와 상동성을 나타내는, 19510.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 229은 사람 리실 하이드록실라제 유전자와 상동성을 나타내는, 19512.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 230은 사람 팔리모토일-단백질 티오에스테라제와 상동성을 나타내는, 19511.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 231은 사람 알파 에놀라제와 상동성을 나타내는, 19508.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 232은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B807P(19509.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 233은 염색체 11q13.31 상의 클론 102D24와 상동성을 나타내는, B809P(19520.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 234은 프로솜(prosome) 베타-서브유니트와 상동성을 나타내는, 19507.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 235은 사람 프로-유로키나제 전구체와 상동성을 나타내는, 19525.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 236은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 19513.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 237은 사람 PAC 128M19 클론과 상동성을 나타내는, 19517.1의 결정된cDNA 서열이다.
서열 238은 사람 시토크롬 P450-IIB와 상동성을 나타내는, 19564.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 239은 사람 GABA-A 수용체 pi 서브유니트와 상동성을 나타내는, 19553.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 240은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B811P(19575.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 241은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B810P(19560.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 242은 대동맥 카복시펩티다제-유사 단백질과 상동성을 나타내는, 19588.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 243은 사람 BCL-1 유전자와 상동성을 나타내는, 19551.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 244은 사람 프로테아솜-관련 mRNA와 상동성을 나타내는, 19567.1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 245은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B803P(19583.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 246은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B812P(19587.1)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 247은 사람 염색체 17과 상동성을 나타내는, B802P(19392.2)의 결정된cDNA 서열이다.
서열 248은 사람 니세인 B2 쇄와 상동성을 나타내는, 19393.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 249은 사람 MHC 부류 II DQ 알파 mRNA와 상동성을 나타내는, 19398.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 250은 사람 Xp22 BAC GSHB-184P14와 상동성을 나타내는, B804P(19399.2)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 251은 사람 ikB 키나제-b 유전자와 상동성을 나타내는, 19401.2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 252은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20266의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 253은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B826P(20270)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 254은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20274의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 255은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20276의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 256은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20277의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 257은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B823P(20280)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 258은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B821P(20281)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 259은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B824P(20294)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 260은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20303의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 261은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B820P(20310)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 262은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B825P(20336)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 263은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, B827P(20341)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 264은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20941의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 265은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20954의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 266은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20961의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 267은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20965의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 268은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않는, 20975의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 269은 사람 p120 카테닌과 상동성을 나타내는, 20261의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 270은 사람 막 당단백질 4F2와 상동성을 나타내는, B822P(20262)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 271은 사람 Na,K-ATPase 알파 1과 상동성을 나타내는, 20265의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 272은 사람 심장 HS 90, 부분 cds와 상동성을 나타내는, 20267의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 273은 사람 mRNA GPI-고정된 단백질 p137과 상동성을 나타내는, 20268의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 274은 사람 절단 자극 인자 77kDa 서브유니트와 상동성을 나타내는, 20271의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 275은 사람 p190-B와 상동성을 나타내는, 20272의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 276은 사람 리보포린과 상동성을 나타내는, 20273의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 277은 사람 오르니틴 아미노 트랜스퍼라제와 상동성을 나타내는, 20278의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 278은 사람 S-아데노실메티오닌 신테타제와 상동성을 나타내는, 20279의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 279은 사람 x 불활성화 전사체와 상동성을 나타내는, 20293의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 280은 사람 시토크롬 p450과 상동성을 나타내는, 20300의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 281은 사람 연장 인자-1 알파와 상동성을 나타내는, 20305의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 282은 사람 상피 ets 단백질과 상동성을 나타내는, 20306의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 283은 사람 시그날 전달 인자의 mRNA와 상동성을 나타내는, 20307의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 284은 사람 GABA-A 수용체 pi 서브유니트 mRNA와 상동성을 나타내는, 20313의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 285은 사람 티로신 포스파타제와 상동성을 나타내는, 20317의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 286은 사람 카텝신 B 프로테이나제와 상동성을 나타내는, 20318의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 287은 사람 2-포스포피루베이트-하이드라타제-알파-에놀라제와 상동성을 나타내는, 20320의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 288은 사람 E-카드헤린과 상동성을 나타내는, 20321의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 289은 사람 hsp86과 상동성을 나타내는, 20322의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 290은 사람 x 불활성화 전사체와 상동성을 나타내는, B828P(20326)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 291은 사람 염색질 조절인자, SMARCA5와 상동성을 나타내는, 20333의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 292은 사람 스핑고리피드 활성화 인자 단백질 1과 상동성을 나타내는, 20335의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 293은 사람 간세포 성장 인자 활성화 억제 인자 유형 2와 상동성을 나타내는, 20337의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 294은 사람 세포 부착 분자 CD44와 상동성을 나타내는, 20338의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 295은 사람 핵 인자(적혈구계-유도된)-유사 1과 상동성을 나타내는, 20340의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 296은 사람 빈쿨린 mRNA와 상동성을 나타내는, 20938의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 297은 사람 연장 인자 EF-1-알파와 상동성을 나타내는, 20939의 결정된cDNA 서열이다.
서열 298은 사람 네스틴 유전자와 상동성을 나타내는, 20940의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 299은 사람 췌장 리보뉴클레아제와 상동성을 나타내는, 20942의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 300은 사람 트랜스코발라민 I와 상동성을 나타내는, 20943의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 301은 사람 베타-투불린과 상동성을 나타내는, 20944의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 302은 사람 HS1 단백질과 상동성을 나타내는, 20946의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 303은 사람 카텝신 B와 상동성을 나타내는, 20947의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 304은 사람 고환 증진된 유전자 전사체와 상동성을 나타내는, 20948의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 305은 사람 연장 인자 EF-1-알파와 상동성을 나타내는, 20949의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 306은 사람 ADP-리보실화 인자 3과 상동성을 나타내는, 20950의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 307은 트립토파닐-tRNA 신테타제에 대한 사람 IFP53 또는 WRS와 상동성을 나타내는, 20951의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 308은 사람 사이클린-의존성 단백질 키나제와 상동성을 나타내는, 20952의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 309은 사람 알파-투불린 이소형 1과 상동성을 나타내는, 20957의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 310은 사람 티로신 포스파타제-61bp 결실물과 상동성을 나타내는, 20959의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 311은 사람 티로신 포스파타제와 상동성을 나타내는, 20966의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 312은 사람 핵 인자 NF 45와 상동성을 나타내는, B830P(20976)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 313은 사람 델타-6 지방산 데사투라제(desaturase)와 상동성을 나타내는, B829P(20977)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 314은 사람 핵 아코니타제와 상동성을 나타내는, 20978의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 315은 클론 23176의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 316은 클론 23140의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 317은 클론 23166의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 318은 클론 23167의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 319은 클론 23177의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 320은 클론 23217의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 321은 클론 23169의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 322은 클론 23160의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 323은 클론 23182의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 324은 클론 23232의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 325은 클론 23203의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 326은 클론 23198의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 327은 클론 23224의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 328은 클론 23142의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 329은 클론 23138의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 330은 클론 23147의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 331은 클론 23148의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 332은 클론 23149의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 333은 클론 23172의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 334은 클론 23158의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 335은 클론 23156의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 336은 클론 23221의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 337은 클론 23223의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 338은 클론 23155의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 339은 클론 23225의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 340은 클론 23226의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 341은 클론 23228의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 342은 클론 23229의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 343은 클론 23231의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 344은 클론 23154의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 345은 클론 23157의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 346은 클론 23153의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 347은 클론 23159의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 348은 클론 23152의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 349은 클론 23161의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 350은 클론 23162의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 351은 클론 23163의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 352은 클론 23164의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 353은 클론 23165의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 354은 클론 23151의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 355은 클론 23150의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 356은 클론 23168의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 357은 클론 23146의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 358은 클론 23170의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 359은 클론 23171의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 360은 클론 23145의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 361은 클론 23174의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 362은 클론 23175의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 363은 클론 23144의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 364은 클론 23178의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 365은 클론 23179의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 366은 클론 23180의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 367은 클론 23181의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 368은 클론 23143의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 369은 클론 23183의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 370은 클론 23184의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 371은 클론 23185의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 372은 클론 23186의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 373은 클론 23187의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 374은 클론 23190의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 375은 클론 23189의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 376은 클론 23202의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 378은 클론 23191의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 379은 클론 23188의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 380은 클론 23194의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 381은 클론 23196의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 382은 클론 23195의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 383은 클론 23193의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 384은 클론 23199의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 385은 클론 23200의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 386은 클론 23192의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 387은 클론 23201의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 388은 클론 23141의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 389은 클론 23139의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 390은 클론 23204의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 391은 클론 23205의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 392은 클론 23206의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 393은 클론 23207의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 394은 클론 23208의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 395은 클론 23209의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 396은 클론 23210의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 397은 클론 23211의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 398은 클론 23212의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 399은 클론 23214의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 400은 클론 23215의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 401은 클론 23216의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 402은 클론 23137의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 403은 클론 23218의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 404은 클론 23220의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 405은 클론 19462의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 406은 클론 19430의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 407은 클론 19407의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 408은 클론 19448의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 409은 클론 19447의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 410은 클론 19426의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 411은 클론 19441의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 412은 클론 19454의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 413은 클론 19463의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 414은 클론 19419의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 415은 클론 19434의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 416은 B820P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 417은 B821P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 418은 B822P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 419은 B823P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 420은 B824P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 421은 B825P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 422은 B826P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 423은 B827P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 424은 B828P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 425은 B829P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 426은 B830P의 결정된 연장 cDNA 서열이다.
서열 427은 클론 266B4의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 428은 클론 22892의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 429은 클론 266G3의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 430은 클론 22890의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 431은 클론 264B4의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 432은 클론 22883의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 433은 클론 22882의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 434은 클론 22880의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 435은 클론 263G1의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 436은 클론 263G6의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 437은 클론 262B2의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 438은 클론 262B6의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 439은 클론 22869의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 440은 클론 21374의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 441은 클론 21362의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 442은 클론 21349의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 443은 클론 21309의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 444은 클론 21097의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 445은 클론 21096의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 446은 클론 21094의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 447은 클론 21093의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 448은 클론 21091의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 449은 클론 21089의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 450은 클론 21087의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 451은 클론 21085의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 452은 클론 21084의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 453은 클론 2BT1-40의 제1 부분 cDNA 서열이다.
서열 454은 클론 2BT1-40의 제2 부분 cDNA 서열이다.
서열 455은 클론 21063의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 456은 클론 21062의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 457은 클론 21060의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 458은 클론 21053의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 459은 클론 21050의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 460은 클론 21036의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 461은 클론 21037의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 462은 클론 21048의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 463은 B726P의 보존된 cDNA 서열(B726P-스플라이스된_seq_B726P로서 지칭됨)이다.
서열 464은 B726P의 제2 스플라이스 형태의 결정된 cDNA 서열(27490.seq_B726P로서 지칭됨)이다.
서열 465은 B726P의 제3 스플라이스 형태의 결정된 cDNA 서열(27068.seq_B726P로서 지칭됨)이다.
서열 466은 B726P의 제2 스플라이스 형태의 결정된 cDNA 서열(23113.seq_B726P로서 지칭됨)이다.
서열 467은 B726P의 제2 스플라이스 형태의 결정된 cDNA 서열(23103.seq_B726P로서 지칭됨)이다.
서열 468은 B726P의 제2 스플라이스 형태의 결정된 cDNA 서열(19310.seq_B726P로서 지칭됨)이다.
서열 469은 서열 463의 업스트림 ORF에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 470은 서열 464에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 471은 서열 465에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 472은 서열 466에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 473은 서열 467에 의해 암호화된 추정 아미노산 서열이다.
서열 474은 B726P의 대체 스플라이스 형태에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 475은 서열 474에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 476은 B720P의 분리된 cDNA 서열이다.
서열 477은 공지된 케라틴 유전자의 cDNA 서열이다.
서열 478은 서열 477에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 479은 클론 19465에 대한 결정된 cDNA 서열이다.
서열 480 및 481은 PCR 프라이머이다.
서열 482은 B726P의 발현된 다운스트림 ORF에 대한 cDNA 서열이다.
서열 483은 B726P의 발현된 재조합 다운스트림 ORF에 대한 아미노산 서열이다.
서열 484은 B720P에 대한 결정된 완전한 길이의 cDNA 서열이다.
서열 485은 서열 484에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 486은 B729P의 절단된 형태(B720P-tr로서 지칭됨)의 결정된 cDNA 서열이다.
서열 487은 B720P-tr의 아미노산 서열이다.
서열 488은 B726P-특이적 CTL에 의해 인식된 B726P의 천연 프로세스된 에피토프의 아미노산 서열이다.
서열 489은 서열 488에 제시된 B726P 에피토프를 발현하는 DNA 서열이다.
서열 490은 맘마글로빈이 B726P 조합된 업스트림 및 다운스트림 개방 판독 프레임(ORF)(이러한 B726P 조합된 ORF의 아미노산 서열은 서열 474의 DNA 서열에의해 암호화된 서열 475로써 본원에 기재되어 있다)에 융합되는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 491은 맘마글로빈이 B726P 업스트림 ORF(이러한 B726P 업스트림 ORF의 아미노산 서열은 서열 463의 DNA 서열에 의해 암호화된 서열 469로써 본원에 기재되어 있다)에 융합되는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 492은 맘마글로빈이 B726P 다운스트림 ORF(이러한 B726P 다운스트림 ORF의 아미노산 서열은 서열 175의 DNA 서열에 의해 암호화된 서열 176으로써 본원에 기재되어 있다)에 융합되는 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열이다.
서열 493은 서열 490의 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 494은 서열 491의 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
서열 495은 서열 492의 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열이다.
상기 인지된 바와 같이, 본 발명은 일반적으로, 암, 예를 들면, 유방암의 치료 및 진단용 조성물, 및 이러한 조성물을 상기 유방암의 치료 및 진단에 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 기재된 조성물의 특정 예로는 유방 종양 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 결합제, 예를 들면, 항체, 항원 제공 세포(APCs) 및/또는 면역계 세포(예: T 세포)가 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "유방 종양 단백질"은 일반적으로, 본원에 제공된 대표적인 검정을 이용하여 결정된 바와 같이, 정상 조직에서의 발현 수준 보다 2배 이상, 바람직하게는 5배 이상 큰 수준으로 유방 종양 세포에서 발현되는 단백질을 지칭한다. 특정의 유방 종양 단백질은 유방암에 걸린 환자의 항혈청과 검출 가능한 수준으로(면역검정, 예를 들면, ELISA 또는 웨스턴 블롯 내에서) 반응하는 종양 단백질이다.
따라서, 상기 내용과 다음에 추가로 기재되는 바에 따르면, 본 발명은 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489에 제시된 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드 조성물; 서열 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 및 488에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 조성물; 이러한 폴리펩타이드와 결합할 수 있는 항체 조성물 및 이러한 조성물을, 예를 들면, 사람 유방암의 검출, 진단 및/또는 치료에 이용하는 수 많은 부가 양태를 제공한다.
폴리뉴클레오타이드 조성물
본원에 사용된 바와 같은 용어 "DNA 세그먼트" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 특정한 종의 전체 게놈 DNA로부터 분리된 DNA 분자를 지칭한다. 따라서, 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 세그먼트는, 이러한 DNA 세그먼트가 수득되는 종의 전체 게놈 DNA로부터 실질적으로 분리 제거되거나 이로부터 정제되는 하나 이상의 암호화 서열을 함유하는 DNA 세그먼트를 지칭한다. 용어 "DNA 세그먼트" 및 "폴리뉴클레오타이드"에는, DNA 세그먼트 및 이러한 세그먼트의 보다 작은 단편, 및 재조합 벡터, 예를 들면, 플라스미드, 코스미드, 파아지미드, 파아지, 바이러스 등이 포함된다.
당업자에게 인지되는 바와 같이, 본 발명의 DNA 세그먼트는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나 또는 발현하도록 적응시킬 수 있는, 게놈 서열, 엑스트라-게놈 및 플라스미드-암호화된 서열 및 유전공학적으로 처리된 보다 작은 유전자 세그먼트가 포함될 수 있다. 이러한 세그먼트는 천연적으로 분리될 수 있거나, 또는 수동으로 합성적으로 변형시킬 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "분리된"이란 폴리뉴클레오타이드가 실질적으로 기타 암호화 서열을 갖고 있지 않으며, DNA 세그먼트가 관련되지 않은 암호화 DNA의 큰 부분, 예를 들면, 큰 염색체성 단편 또는 기타 작용성 유전자 또는 폴리펩타이드 암호화 서열을 함유하지 않는 것을 의미한다. 물론, 이는 본래 분리된 바와 같은 DNA 세그먼트를 지칭하며, 수동으로 나중에 세그먼트에 부가된 암호화 영역 또는 유전자를 배제하지는 않는다.
당업자에게 인식되는 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호화 또는 안티센스) 또는 이본쇄일 수 있고, DNA(게놈, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자에는 인트론을 함유하고 1대1 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자, 및 인트론을 함유하지 않는 mRNA 분자가 포함된다. 부가의 암호화 또는 비-암호화 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 내에 존재할 수도 있으나, 반드시 존재할 필요는 없으며, 폴리뉴클레오타이드가 기타 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수도 있으나, 반드시 연결될 필요는 없다.
폴리뉴클레오타이드는 본래의 서열(즉, 유방 종양 단백질을 암호화하는 내인성 서열 또는 이의 일정 부분)을 포함할 수 있거나, 또는 이러한 서열의 변이체 또는 생물학적 또는 항원성 기능적 등가물을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드변이체는 다음에 추가로 기재되는 바와 같은, 하나 이상의 치환물, 부가물, 결실물 및/또는 삽입물을 함유할 수 있는데, 바람직하게는 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 본래의 종양 단백질과 비교해서 저하되지 않아야 한다. 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성에 대한 효과는 일반적으로 본원에 기재된 바와 같이 평가할 수 있다. 용어 "변이체"는 또한, 이종발생적 기원의 상동 유전자를 포괄한다.
폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열을 비교하는 경우, 2개의 서열은, 다음에 기재된 바와 같이 최대의 상응을 위해 정렬될 때 두 서열 내의 뉴클레오타이드 서열 또는 아미노산 서열이 동일한 경우에 "동일한" 것으로 간주된다. 두 서열 간의 비교는 전형적으로, 서열 유사성을 지닌 국부 영역을 동정하여 이를 비교해주는 비교 창을 통하여 상기 서열들을 비교함으로써 수행한다. 본원에 사용된 바와 같은 "비교 창"은 두 서열을 최적으로 정렬시킨 후에 한 서열을 동일한 수의 연속된 위치의 기준 서열과 비교할 수 있는, 약 20개 이상, 통상적으로 30 내지 약 75개, 40 내지 약 50개의 연속된 위치의 세그먼트를 지칭한다.
비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하는 것은 생략성 파라미터를 사용하여, 바이오인포매틱스 소프트웨어의 레이저진(Lasergene) 스위트 내의 메그알린(Megalign) 프로그램(공급처: DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 프로그램은 다음 참조 문헌에 기재된 몇몇 정렬 도식을 포함한다[참조: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in protein - Matrices for detecting distant relationships; Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Proteins Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation,Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645Methods in Enzymologyvol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M.(1989)CABIOS5:151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988)CABIOS4:11-17; Robinson, E.D. (1971)Comb. Theor 11: 105; Santou, N. Nes, M. (1987)Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973)Numerical Taxonomy - the Principles and Practice fo Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983)Proc. Natl. Acad., Sci. USA 80:726-730].
또 다른 한편, 비교를 위해 서열을 최적으로 정렬하는 것은 문헌[참조: Smith and Waterman (1981)Add. APL. Math.2:482]의 국부 동일률 알고리듬; 문헌[참조: Needleman and Wunshc (1970)J. Mol. Biol.48:443]의 동일률 정렬 알고리듬; 문헌[참조: Pearson and Lipman (1988)Proc. Natl. Acad. Sci. USA85:2444]의 유사성 방법에 대한 조사; 이들 알고리듬를 컴퓨터로 이행하는 것[Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group(GCG)(575 Science Dr., Madison, WI)의 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA]; 또는 검사함으로써 수행할 수 있다.
서열 동일률과 서열 유사율을 결정하는데 적합한 알고리듬의 한 가지 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬인데, 이는 각각 문헌[참조: Altschul et al. (1977)Nucl. Acids Res.25:3389-3402; and Altschul et al. (1990)J. Mol.Biol.215:403-410]에 기재되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은, 예를 들면, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드에 대한 서열 동일률을 결정하기 위해, 본원에 기재된 파라미터를 사용할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 다음 공급처[National Center for Biotechnology Information]로부터 입수 가능하다. 한 가지 예에서는, 뉴클레오타이드 서열의 경우에는, 파라미터 M(매칭 잔기 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0이다) 및 N(미스매칭 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0이다)을 사용하여, 누적 스코어를 산정할 수 있다. 아미노산 서열의 경우에는, 스코어링 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 산정할 수 있다. 누적 정렬 스코어가 이의 최대 달성치로부터 양 X 정도로 떨어지거나; 하나 이상의 음성-스코어링 잔기 정렬의 축적으로 인해, 누적 스코어가 0 이하로 되거나; 또는 어느 한 서열의 말단에 도달하게 되면, 각 방향으로의 워드 히트(word hit)의 확장을 중지한다. BLAST 알고리듬 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감도와 속도를 결정해준다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열의 경우)은 생략성으로서 11의 워드길이(W), 10의 기대값(E) 및 BLOSUM62 스코어링 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff (1989)Proc.Natl. Acad. Sci. USA89:10915] 정렬, 50의 (B), 10의 기대값(E), M=5, N=-4 및 양 쇄에 대한 비교치를 이용한다.
바람직하게는, "서열 동일률"은 최적으로 정렬된 두 서열을 20개 이상 위치의 비교 창을 통해 비교함으로써 결정하는데, 여기서 상기 비교 창 내의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열의 일정 부분은, 두 서열의 최적 정렬을 위해 기준 서열(부가물 또는 결실물을 포함하지 않음)과 비교해서 20% 이하, 통상적으로5 내지 15% 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 이러한 비율%는 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 양 서열에서 발생되는 위치의 수를 결정하여, 매치된 위치의 수를 산출하고; 이와 같이 산출된 매치된 위치의 수를 기준 서열 내의 위치 총 수(즉, 창 크기)로 나눈 다음; 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일률을 산출함으로써 산정한다.
따라서, 본 발명은 본원에 기재된 서열과 상당한 동일성을 나타내는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열, 예를 들면, 본원에 기재된 방법(예: 다음에 기재된 바와 같은, 표준 파라미터를 사용하는 BLAST 분석)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열과 비교한 서열 동일률이 50% 이상, 바람직하게는 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상인 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열을 포괄한다. 당업자는 이들 값을 적당히 조정하여, 코돈 축퇴성(codon degeneracy), 아미노산 유사율, 판독 프레임 위치 등을 고려하여 두 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일률을 결정할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
부가의 양태에서는, 본 발명이 본원에 기재된 하나 이상의 서열과 동일하거나 이에 상보성인 서열의 연속되는 각종 길이의 연장물을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드를 제공한다. 예를 들면, 본원에 기재된 하나 이상의 서열의 약 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000개 이상의 연속되는 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 이들 사이의 모든 중간 길이의 뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 제공된다. 이러한맥락에서 "중간 길이"란 인용된 값 사이의 모든 길이, 예를 들면, 16, 17, 18, 19 등; 21, 22, 23 등; 30, 31, 32등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103 등; 150, 151, 152, 153 등(200-500, 500-1,000 사이의 모든 정수 등을 포함함)를 의미한다는 것을 용이하게 인지할 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편은 그 자체의 암호화 서열의 길이와 상관없이, 기타 DNA 서열, 예를 들면, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 부가의 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 기타 암호화 세그먼트 등과 조합할 수 있기 때문에, 이들의 전반적인 길이가 상당히 다양할 수 있다. 따라서, 거의 모든 길이의 핵산 단편을 이용할 수 있다는 것이 고려되는데, 총 길이는 바람직하게는 제조의 용이성 및 의도하는 재조합 DNA 프로토콜에서의 용도에 따라서 제한된다. 예를 들면, 총 길이가 약 10,000, 약 5000, 약 3000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개(모든 중간 길이 포함) 염기쌍인 것으로 예시되는 DNA 세그먼트가 본 발명의 수 많은 이행에 유용한 것으로 고려된다.
기타 양태에서는, 본 발명이 적당하게 엄격한 조건 하에서 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편 또는 상보 서열에 관한 것이다. 하이브리드화 기술은 분자 생물학 분야에 널리 공지되어 있다. 예시 목적상, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 기타 폴리뉴클레오타이드의 하이브리드화를 시험하는데 적합한 적당하게 엄격한 조건에는 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비 세척하고; 50 내지 65℃, 5 X SSC에서 밤새 하이브리드화시킨 다음; 0.1% SDS를 함유하는 2X, 0.5X 및 0.2X SSC를 각각 사용하여 65℃에서 20분 동안 2회 세척하는 것이 포함된다.
더우기, 유전적 암호의 축퇴성 결과로 인해, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 많은 뉴클레오타이드 서열이 존재한다는 것을 당업자는 인지할 것이다.이들 폴리뉴클레오타이드 중 몇몇은 본래의 어떠한 유전자의 뉴클레오타이드 서열과도 최소한의 상동성을 나타낸다. 그럼에도 불구하고, 코돈 활용의 차이로 인해 다양해진 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 의해 구체적으로 고려된다. 추가로, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립형질체가 본 발명의 범주 내에 속한다. 대립형질체는 하나 이상의 돌연변이, 예를 들면, 뉴클레오타이드의 결실, 부가 및/또는 치환으로 인해 변화되는 내인성 유전자이다. 이로써 생성된 mRNA 및 단백질은 변화된 구조 또는 기능을 가질 수 있으나, 반드시 그럴 필요는 없다. 대립형질체는 표준 기술(예를 들면, 하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 동정할 수 있다.
프로브 및 프라이머
본 발명의 기타 양태에서는, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열이 유리하게는, 핵산 하이브리드화용 프로브 또는 프라이머로서 사용될 수 있다. 그 자체로서, 본원에 기재된 15개 뉴클레오타이드 길이의 연속되는 서열과 동일하거나 이에 상보적인 서열을 갖는 약 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 연속되는 서열의 서열 영역을 포함하는 핵산 세그먼트가 특정한 용도를 지닐 것으로 고려된다. 보다 길고 연속되는 동일하거나 상보적인 서열, 예를 들면, 약 20, 30, 40, 50, 100,200, 500, 1000(모든 중간 길이 포함) 및 심지어 완전한 길이의 서열까지도 특정 양태에 사용될 것이다.
이러한 핵산 프로브가 관심있는 서열과 특이적으로 하이브리드화하는 능력을 지님으로써, 상기 프로브를 소정의 샘플 중 상보 서열의 존재 여부를 검출하는데 사용할 수 있을 것이다. 그러나, 기타 용도, 예를 들면, 돌연변이체 종 프라이머 또는 기타 유전 작제물의 제조에 사용하기 위한 프라이머를 제조하기 위한 서열 정보의 용도가 고려되기도 한다.
본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 이에 상보적인, 10-14, 15-20, 30, 50 또는 심지어 100-200개 뉴클레오타이드(또한 중간 길이도 포함함)의 연속되는 뉴클레오타이드 연장물로 이루어진 서열 영역을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자가, 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅에 사용하기 위한 하이브리드화용 프로브로서 특히 고려된다. 이로써, 유전자 생성물 또는 이의 단편을 다양한 세포 유형 뿐만 아니라 각종 세균성 세포에서도 분석할 수 있게 되었다. 단편의 총 크기 뿐만 아니라 상보성 연장물(들)의 크기는 궁극적으로, 특정한 핵산 세그먼트의 목적하는 용도 또는 적용 분야에 따라서 좌우될 것이다. 보다 작은 단편은 일반적으로 하이브리드화 양태에 사용될 것인데, 연속되는 상보성 영역의 길이는 약 15 내지 약 100개 뉴클레오타이드로 다양할 수 있으며, 검출하고자 하는 상보 서열의 길이에 따라서, 보다 큰 연속적 상보성 연장물을 사용할 수 있다.
길이가 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드인 하이브리드화용 프로브를 사용함으로써, 안정적이면서 선택적인 이본쇄 분자에 관한 정보가 허용된다. 그러나, 하이브리드의 안정성과 선택성을 증가시킴으로써 수득된 특이적 하이브리드 분자의 질과 수준을 향상시키기 위해서는, 길이가 15개 염기 보다 큰 연장물에 걸쳐 연속되는 상보성 서열을 갖는 분자가 일반적으로 바람직하다. 15 내지 25개의 연속되는 뉴클레오타이드, 또는 경우에 따라 훨씬 더 긴 뉴클레오타이드의 유전자-상보성 연장물을 갖는 핵산 분자를 고안하는 것이 일반적으로 바람직할 것이다.
하이브리드화용 프로브는 본원에 기재된 모든 서열의 어떠한 부분으로부터도 선택할 수 있다. 프로브 또는 프라이머로서 활용하고자 하는, 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489에 제시된 서열, 또는 길이가 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드인 상기 서열의 연속되는 모든 부분(완전한 길이의 서열 포함)을 고찰하는 것이 요구 조건이다. 프로브 및 프라이머 서열의 선택은 각종 인자에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 전체 서열의 말단쪽으로부터의 프라이머를 이용할 수도 있다.
작은 폴리뉴클레오타이드 세그먼트 또는 단편은, 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 통상 실시되는 바와 같이, 예를 들면, 상기 단편을 화학적 수단에 의해 직접 합성함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 단편은 핵산 재생 기술, 예를 들면, 미국 특허 제4,683,202호(본원에 참조문헌으로써 삽입됨)의 PCR™ 기술을 적용하는 방법, 선택된 서열을 재조합 생산용 재조합 벡터 내로 도입하는 방법, 및 분자 생물학 분야의 숙련인에게 일반적으로 공지된 기타 재조합 DNA 기술에 의해 수득할 수 있다.
관심있는 전체 유전자 또는 유전자 단편의 상보성 연장물과 이본쇄 분자를선택적으로 형성하는 능력을 알아보기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열을 사용할 수 있다. 고려된 적용 분야에 따라서, 전형적으로, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 선택도를 달성하기 위해 다양한 하이브리드화 조건을 이용하는 것이 요망된다. 높은 선택도를 요구하는 적용 분야의 경우에는, 해당 하이브리드를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건을 이용해야 할 것이며, 예를 들면, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M 염의 염 농도로써 제시된 바와 같이 비교적 저염 및/또는 고온 조건을 선택해야 할 것이다. 그러나, 프로브와 주형 또는 표적 쇄 간에 미스매치가 존재하는 경우에는 이러한 선택적인 조건을 거의 견디기 어려우므로, 이는 관련 서열을 분리하는데 특히 적합할 것이다.
물론, 몇몇 적용 분야의 경우, 예를 들면, 기본(underlying) 주형과 하이브리드화된 돌연변이체 프라이머 쇄를 이용하여 돌연변이체를 제조하고자 하는 경우에는, 헤테로-이본쇄의 형성을 허용하기 위해서는 전형적으로 덜 엄격한(엄격성이 감소된) 하이브리드화 조건이 필요할 것이다. 이러한 상황 하에서는, 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도 및 약 0.15M 내지 약 0.9M의 염 조건을 이용하는 것이 요망될 수 있다. 이로써, 교차-하이브리드화하는 종은 대조용 하이브리드화물과 비교해서 양성적으로 하이브리드화하는 시그날로서 용이하게 동정할 수 있다. 어떠한 경우든, 온도 증가와 동일한 방식으로 하이브리드 이본쇄를 탈안정화시키는 작용을 하는 포름아미드의 양을 증가시키면서 부가함으로써, 조건을 더 엄격하게 만들 수 있다는 것이 용이하게 인지된다. 따라서, 하이브리드화 조건은 용이하게 조작할 수 있으므로, 이는 목적하는 결과에 따라서 한 가지 선택 방법이 될 것이다.
폴리뉴클레오타이드 동정 및 성상 확인
폴리뉴클레오타이드는 널리 확립된 각종 기술을 사용하여 동정, 제조 및/또는 조작할 수 있다. 예를 들면, 종양 관련된 발현(즉, 본원에 제공된 대표적인 검정을 이용하여 결정된 바와 같이, 정상적인 조직에서 보다 종양에서 2배 이상 많이 나타나는 발현)을 알아보기 위해 cDNA의 마이크로어레이(microarray)를 스크리닝함으로써, 다음에 보다 상세히 기재되는 바와 같이 폴리뉴클레오타이드를 동정할 수 있다. 이러한 스크린은, 예를 들면, 신테니(Synteni) 마이크로어레이(Palo Alto CA)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라서 수행할 수 있고, 본질적으로 문헌[참조: Schena et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA93:10614-10619, 1996 and Heller et al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA94:2150-2155, 1997]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 또 다른 한편으론, 본원에 기재된 단백질을 발현하는 세포, 예를 들면, 유방 종양 세포로부터 제조된 cDNA로부터 폴리뉴클레오타이드를 증폭시킬 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통하여 증폭시킬 수 있다. 이러한 접근 방법의 경우에는, 본원에 제공된 서열을 기준으로 하여 서열-특이적 프라이머를 고안할 수 있고, 이는 구입하거나 합성할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 부분을 사용하여, 널리 공지된 기술을 이용하여 적합한 라이브러리(예: 종양 유방 cDNA 라이브러리)로부터 완전한 길이의 유전자를 분리시킬 수 있다. 이러한 기술 내에서는, 증폭에 적합한 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 사용하여, 라이브러리(cDNA 또는게놈)를 스크리닝한다. 바람직하게는, 라이브러리가 보다 큰 분자를 포함하도록 이를 크기-선별한다. 유전자의 5' 및 업스트림 영역을 동정하는 데에는, 무작위로 프라이밍된 라이브러리가 적합할 수도 있다. 인트론을 수득하고 5' 서열을 연장시키는 데에는 게놈 라이브러리가 바람직하다.
하이브리드화 기술의 경우에는, 널리 공지된 서열을 사용하여 부분 서열을 표지시킬 수 있다(예를 들면, 니크-해독시키거나32P로 말단-표지시킴). 이어서, 변성된 세균성 콜로니를 함유하는 필터[또는 파아지 플라크를 함유하는 론(lawn)]를 상기와 같이 표지된 프로브와 하이브리드화시킴으로써, 세균성 또는 박테리오파아지 라이브러리를 일반적으로 스크리닝시킨다[참조: Sambrook et al.,Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 하이브리드화하는 콜로니 또는 플라크를 선별 및 확장하고, 추가의 분석을 위해 DNA를 분리시킨다. cDNA 클론을 분석하여, 상기 부분 서열로부터의 프라이머 및 벡터로부터의 프라이머를 이용하는 PCR에 의해 부가의 서열량을 결정할 수 있다. 제한 지도 및 부분 서열을 생성시켜 하나 이상의 중첩되는 클론을 동정할 수 있다. 이어서, 일련의 결실 클론을 생성시키는 것을 포함할 수 있는 표준 기술을 사용하여 완전한 서열을 결정할 수 있다. 이어서, 이로써 생성된, 중첩되는 서열을 단일 연속 서열 내로 어셈블리시킬 수 있다. 널리 공지된 기술을 사용하여 적합한 단편을 연결시킴으로써, 완전한 길이의 cDNA 분자를 생성시킬 수 있다.
또 다른 한편, 부분 cDNA 서열로부터 완전한 길이의 암호화 서열을 수득하기 위한 수 많은 증폭 기술이 있다. 이러한 기술 내에서는, 증폭을 일반적으로 PCR을 통하여 수행한다. 어떠한 각종 시판용 키트를 사용해서도 증폭 단계를 수행할 수 있다. 예를 들면, 당해 분야에 널리 공지된 소프트웨어를 사용하여 프라이머를 고안할 수 있다. 프라이머는 바람직하게는, 길이가 22 내지 30개 뉴클레오타이드가고, GC 함량이 50% 이상이며, 약 68 내지 70℃의 온도에서 표적 서열에 대해 어닐링시킨다. 이와 같이 증폭된 영역을 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같이 서열 분석할 수 있고, 중첩되는 서열을 연속된 서열 내로 어셈블리시킨다.
이러한 증폭 기술 중 한 가지 기술은, 제한 효소를 사용하여 유전자의 공지된 영역 내에 특정 단편을 생성시키는 역(inverse) PCR이다[참조: Triglia et al.,Nucl. Acids Res. 16:8186, 1988]. 이어서, 상기 단편을 분자내 연결시킴으로써 환형으로 만들고, 이를 공지된 영역으로부터 유도된 다양한 프라이머와 함께 PCR용 주형으로서 사용한다. 또 다른 접근법 내에서는, 부분 서열에 인접한 서열을, 링커 서열에 대한 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 프라이머와 함께 증폭시킴으로써 검색할 수 있다. 이와 같이 증폭된 서열을 대상으로 하여, 전형적으로 상기와 동일한 링커 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 제2 프라이머와 함께 증폭 2회전을 수행한다. 공지된 서열로부터 반대 방향으로 연장을 개시하는 2개의 프라이머를 이용하는, 상기 과정에 대한 변형법이 WO 96/38591에 기재되어 있다. 이러한 또 다른 기술은 "cDNA 말단의 신속한 증폭 기술" 또는 RACE로서 공지되어 있다. 상기 기술은 폴리 A 영역 또는 벡터 서열과 하이브리드화하는, 내부 프라이머와 외부 프라이머를 사용하여 공지된 서열의 5' 또는 3'인 서열을 동정하는 것을 포함한다. 부가의 기술에는 포획 PCR[참조: Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1:111-19, 1991] 및 워킹(walking) PCR[참조: Parker et al., Nucl. Acids. Res. 19:3055-60, 1991]이다. 증폭을 이용하는 기타 기술을 이용하여, 완전한 길이의 cDNA 서열을 수득할 수도 있다.
특정의 경우, 유전자 뱅크(GenBank)로부터 입수 가능한 것과 같은, 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스에 제공된 서열을 분석함으로써 완전한 길이의 cDNA 서열을 수득하는 것이 가능한다. 중첩되는 ESTs에 대한 조사는 일반적으로, 널리 공지된 프로그램(예: NCBI BLAST 조사)을 사용하여 수행할 수 있고, 이러한 ESTs를 사용하여 연속되는 완전한 길이의 서열을 생성시킬 수 있다. 완전한 길이의 cDNA 서열은 또한, 게놈 단편을 분석함으로써 수득할 수 있다.
숙주 세포에서의 폴리뉴클레오타이드 발현
본 발명의 기타 양태에서는, 본 발명의 폴리펩타이드, 또는 융합 단백질 또는 이의 작용성 등가물을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이의 단편을 재조합 DNA 분자에 사용하여, 적당한 숙주 세포에서의 폴리펩타이드의 발현을 지시할 수 있다. 유전적 암호의 내재된 축퇴성으로 인해, 실질적으로 동일하거나 작용적으로 등가인 아미노산 서열을 암호화하는 기타 DNA 서열을 생성시킬 수 있고, 이들 서열을 사용하여 소정의 폴리펩타이드를 클로닝 및 발현할 수 있다.
당업자에게 인식되는 바와 같이, 몇몇 경우에서는, 천연이 아닌 코돈을 보유하는 폴리펩타이드-암호화 뉴클레오타이드 서열을 생성시키는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 특정한 원핵성 또는 진핵성 숙주에 의해 바람직한 코돈을 선별하여, 단백질 발현 속도를 증가시키거나, 또는 목적하는 특성, 예를 들면, 천연의 서열로부터 생성된 전사체의 반감기 보다 더 긴 반감기를 지닌 재조합 RNA 전사체를 생성시킬 수 있다.
더우기, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은, 유전자 생성물의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을 변형시키는 변형법을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는, 각종 이유로 폴리펩타이드 암호화 서열을 변화시키기 위해 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 공학적으로 처리할 수 있다. 예를 들면, 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오타이드의 PCR 리어셈블리(reassembly) 및 무작위 단편화에 의한 DNA 셔플링(shuffling)을 사용하여, 뉴클레오타이드 서열을 공학적으로 처리할 수 있다. 또한, 부위-지시된 돌연변이 유발을 이용하여, 새로운 제한 부위를 삽입하거나, 글리코실화 패턴을 변화시키거나, 코돈 선호도를 변화시키거나, 스플라이스 변이체를 생성시키거나, 또는 돌연변이를 도입할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에서는, 천연의 변형되거나 재조합 핵산 서열을 이종 서열에 연결하여 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드 활성 억제제에 대해 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해서는, 시판용 항체에 의해 인식될 수 있는 키메릭 단백질을 암호화하는 것이 유용할 수 있다. 융합 단백질을 또한 공학적으로 처리하여, 폴리펩타이드-암호화 서열과 이종 단백질 서열 사이에 위치된 절단 부위를 함유하도록 함으로써, 상기 폴리펩타이드를 이종 잔기로부터 절단 및 정제할 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은, 당해 분야에 널리 공지된 화학적 방법을 사용하여 완전히 또는 부분적으로 합성할 수 있다[참조: Caruthers, M.H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al., (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232]. 또 다른 방법으로는, 폴리펩타이드 또는 이의 일정 부분의 아미노산 서열을 합성하는 화학적 방법을 사용하여, 단백질 그 자체를 생성할 수도 있다. 예를 들면, 각종 고체 상 기술을 사용하여 펩타이드 합성을 수행할 수 있고[참조: Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269:202-204], 예를 들면, ABI 431A 펩타이드 합성기(Perkin Elmer, Palo Alto, CA)를 사용하여 자동화 합성을 달성할 수 있다.
새로이 합성된 펩타이드는, 조제적 고성능 액체 크로마토그래피[참조: Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.] 또는 당해 분야에서 이용 가능한 기타 필적하는 기술에 의해 실질적으로 정제시킬 수 있다. 이와 같이 합성된 펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열 분석(예를 들면, 에드만 분해 과정)에 의해 확인할 수 있다. 부가적으로, 폴리펩타이드, 또는 이의 일정 부분의 아미노산 서열은 직접적인 합성 동안에 변화될 수 있고/있거나 화학적 방법을 이용하여 기타 단백질 또는 이의 부분으로부터의 서열과 조합하여, 변이체 폴리펩타이드를 생성시킬 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 발현하기 위해서는, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 이의 작용성 등가물을 적당한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 요소를 함유하는 벡터 내로 삽입할 수 있다. 당업자에게 널리 공지된 방법을 사용하여, 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 함유하고 적당한 전사 및 해독 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이들 방법에는 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전적 재조합 방법이 포함된다. 이러한 기술은 문헌[참조: Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F.M. et al.(1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기재되어 있다.
각종 발현 벡터/숙주 시스템을 활용하여, 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유 및 발현시킬 수 있다. 이들에는 재조합 박테리오파아지, 플라스미드 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환시킨 세균; 효모 발현 벡터로 형질전환시킨 효모; 바이러스 발현 벡터(예: 바쿨로바이러스)로 감염시킨 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터[예: 콜리플라워 모자이크(cauliflower mosaic) 바이러스(CaMV); 담배 모자이크 바이러스(TMV)] 또는 세균성 발현 벡터(예: Ti 또는 pBR322 플라스미드)로 형질감염시킨 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
발현 벡터 내에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 해독을 수행하기 위해 숙주 세포성 단백질과 상호작용하는 해당 벡터의 비-해독 영역--인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비-해독 영역--이다. 이러한 요소들은 강도와 특이성 면에서 다양할 수 있다. 이용된 벡터 시스템과 숙주에 따라서, 항상성 프로모터 및 유도성 프로모터를 포함한, 적합한 어떠한 수의 전사 및 해독 요소를 사용할 수도 있다. 예를 들면, 세균성 시스템에서 클로닝하는 경우에는, PBLUESCRIPT 파아지미드(Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSPORT1 플라스미드(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)의 하이브리드 lacZ 프로모터 등의 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 포유류 세포 시스템에서는, 포유류 유전자 또는 포유류 바이러스로부터의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 특정 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 다중 복사물을 함유하는 세포주를 생성시키는 것이 필요한 경우에는, SV40 또는 EBV계 벡터를 적당한 선별 마커와 함께 사용하는 것이 유리할 수 있다.
세균성 시스템에서는, 발현된 폴리펩타이드에 대해 의도된 용도에 따라서 수 많은 발현 벡터를 선택할 수 있다. 예를 들면, 항체를 유도하기 위해 다량이 필요한 경우에는, 용이하게 정제되는 융합 단백질을 높은 수준으로 발현하도록 지시해주는 벡터를 사용할 수 있다. 이러한 벡터에는 다작용성 이. 콜라이(E. coli) 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들면, BLUESCRIPT(Stratagene)[여기서는, 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을, 베타-갈락토시다제의 아미노 말단 Met 및 후속 7개 잔기에 대한 서열과 동일한 프레임 내에서 상기 벡터 내로 연결하여 하이브리드 단백질을 생성시킬 수 있다]; pIN 벡터[참조: Van Heeke, G. and S.M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264:5503-5509] 등이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. pGEX 벡터(Promega, Madison, Wis.)를 사용하여, 외래 폴리펩타이드를 글루타치온 S-트랜스퍼라제(GST)와의 융합 단백질로서 발현시킬 수도 있다. 일반적으로, 이러한 융합 단백질은 가용성이고, 글루타치온-아가로즈 비드에 흡착시킨 다음 자유 글루타치온의 존재 하에 용출시킴으로써, 용융된 세포로부터 용이하게 정제할수 있다. 이러한 시스템에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 함유하도록 고안하여, 클로닝된 관심있는 폴리펩타이드를 GST 잔기로부터 마음대로 방출시킬 수 있다.
효모 삭카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)에서는, 항상성 또는 유도성 프로모터, 예를 들면, 알파 인자, 알코올 옥시다제 및 PGH를 함유하는 수 많은 벡터를 사용할 수 있다[참조: Ausubel et al. (상기 참조) and Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544].
식물 발현 벡터를 사용하는 경우에는, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 발현을, 수 많은 어떠한 프로모터에 의해서도 구동시킬 수 있다. 예를 들면, 바이러스성 프로모터, 예를 들면, CaMV의 35S 및 19S 프로모터를 단독으로 사용하거나, 또는 TMV로부터의 오메가 리더 서열과 조합하여 사용할 수 있다[참조: Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311]. 또 다른 한편, 식물 프로모터, 예를 들면, RUBISCO의 작은 서브유니트 또는 열 쇼크 프로모터를 사용할 수 있다[참조: Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell. Differ. 17:85-105]. 이들 작제물은, 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체-매개된 형질감염에 의해 식물 세포 내로 도입할 수 있다. 이러한 기술은 일반적으로 이용 가능한 수 많은 문헌[참조; Hobbs, S. or Murry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; pp. 191-196]에 기재되어 있다.
곤충 시스템을 사용하여 관심있는 폴리펩타이드를 발현시킬 수도 있다. 예를 들면, 이러한 한 가지 시스템에서는, 오토그라파 캘라포니아 핵 다면증 바이러스(Autographa california nuclear polyhedrosis virus; AcNPV)를, 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아(Trichoplusia) 유충에서 외래 유전자를 발현하기 위한 벡터로서 사용한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 바이러스의 비-필수 영역, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자 내로 클로닝하고, 이러한 폴리헤드린 프로모터의 조절 하에 놓아둔다. 이러한 폴리펩타이드-암호화 서열을 성공적으로 삽입하게 되면, 상기 폴리헤드린 유전자가 불활성이 되고, 코트 단백질이 결여된 재조합 바이러스가 생성될 것이다. 이어서, 상기 재조합 바이러스를 사용하여, 예를 들면, 에스. 프루기페르다(S. frugiperda) 세포 또는 트리코플루시아 유충을 감염시킬 수 있으며, 여기서 관심있는 폴리펩타이드가 발현될 수 있다[참조: Engelhard, E.K. et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91:3224-3227].
포유류 숙주 세포에서는, 바이러스-이용된 수 많은 발현 시스템이 일반적으로 이용 가능하다. 예를 들면, 아데노바이러스를 발현 벡터로서 사용하는 경우에는, 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을, 후기 프로모터 및 삼부분 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/해독 복합체에 연결시킬 수 있다. 바이러스성 게놈의 비-필수 E1 또는 E3 영역 내의 삽입을 이용하여, 감염된 숙주 세포에서 해당 폴리펩타이드를 발현할 수 있는 생육 가능한 바이러스를 수득할 수 있다[참조: Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81:3655-3659]. 또한, 전사 인핸서, 예를 들면, 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서를 사용하여, 포유류 숙주 세포에서의 발현을 증가시킬 수 있다.
특이적 개시 시그날을 사용하여, 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 보다 효율적으로 해독시킬 수도 있다. 이러한 시그날에는 ATG 개시 코돈 및 인접한 서열이 포함된다. 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 이의 개시 코돈 및 업스트림 서열을 적당한 발현 벡터 내로 삽입하는 경우에는, 부가의 어떠한 전사 또는 해독 조절 시그날도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 암호화 서열 또는 이의 부분 만이 삽입된 경우에는, ATG 개시 코돈을 포함한 외인성 해독 조절 서열이 제공되어야 한다. 더우기, 개시 코돈이 정확한 판독 프레임 내에 존재하여, 전체 삽입물의 해독을 보장해주어야 한다. 외인성 해독 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성의 각종 기원일 수 있다. 발현 효율은, 문헌[참조: Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:125-162]에 기재된 바와 같이 사용되는 특정한 세포 시스템에 적당한 인핸서를 혼입함으로써 증대시킬 수 있다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 또는 발현된 단백질을 목적하는 방식으로 프로세싱하는 능력이 있는 숙주 세포 균주를 선택할 수 있다. 이러한 폴리펩타이드의 변형법에는 아세틸화, 카복실화, 글리코실화, 인산화, 지질화 및 아실화가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 단백질의 "프레프로(prepro)" 형태를 절단시키는 해독 후 프로세싱을 이용하여, 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진시킬 수도 있다. 이러한 해독 후 활성에 대한 특이적인 세포성 기구와 특징적인 기전을 지니는 상이한 숙주 세포, 예를 들면, CHO, HeLa, MDCK, HEK293 및 WI38을선택하여, 외래 단백질의 정확한 변형과 프로세싱을 보장할 수 있다.
재조합 단백질을 장기간 고수율로 생성하기 위해서는, 안정적인 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 동일한 벡터 또는 별개의 벡터 상에 바이러스성 복제 오리진 및/또는 내인성 발현 요소 및 선별 마커를 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용하여, 관심있는 폴리뉴클레오타이드를 안정적으로 발현시키는 세포주를 형질전환시킬 수 있다. 이러한 벡터를 도입한 후, 세포를 증균 배지에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 다음, 이들을 선별 배지에 작동시킬 수 있다. 선별 마커의 목적은 선별에 대한 내성을 부여하는 것이며, 이의 존재로 인해, 상기 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포를 성장 및 회수할 수 있게 된다. 안정적으로 형질전환된 세포의 내성 클론을, 세포 유형에 적당한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
수 많은 선별 시스템을 사용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이들에는 tk.sup.- 또는 aprt.sup.-세포에 각각 이용될 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[참조: Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[참조: Lowy, I. et al. (1990) Cell 22:817-23]가 포함되지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 항대사물, 항생제 또는 제초제 내성을 선별 기준으로서 사용할 수 있는데; 예를 들면, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여해주는 dhfr[참조: Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77:3567-70]; 아미노글리코시드, 네오마이신 및 G-418에 대한 내성을 부여해주는 npt[참조: Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14] 및 클로르설푸론 및포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 대한 내성을 각각 부여해주는 als 및 pat[Murry 상기 참조]가 있다. 부가의 선별 유전자, 예를 들면, 세포가 트립토판 대신 인돌을 활용하도록 허용해주는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신 히스티놀을 활용하도록 허용해주는 hisD가 문헌[참조: Hartman, S.C. and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85:8047-51]에 기재되어 있다. 최근에, 가시적인 마커의 사용이 대중성을 획득하였으며, 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS, 및 루시퍼라제 및 이의 기질 루시페린과 같은 마커가 형질전환체를 동정하는데 광범위하게 사용될 뿐만 아니라 특이적 벡터 시스템에 기여할 수 있는 일시적인 또는 안정적인 단백질 발현량을 정량화하는데 광범위하게 사용되고 있다[참조: Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55:121-131].
마커 유전자 발현의 존재/부재가, 관심있는 유전자가 존재한다는 것을 제시해주긴 하지만, 이의 존재 및 발현을 확인할 필요는 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 마커 유전자 서열 내로 삽입하는 경우에는, 서열을 함유하는 재조합 세포가 마커 유전자 기능의 부재로써 동정될 수 있다. 또 다른 한편으론, 마커 유전자를 단일 프로모터의 조절 하에 폴리펩타이드 암호화 서열과 일렬로 위치시킬 수 있다. 유도 또는 선별에 반응하여 마커 유전자가 발현하는 것은 통상적으로, 또한 일렬로 된 유전자의 발현을 지시해준다.
또 다른 한편, 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유 및 발현하는 숙주 세포는 당업자에게 공지된 각종 과정에 의해 동정할 수 있다. 이들 과정에는 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생검정 또는 면역검정 기술[이는 핵산또는 단백질을 검출 및/또는 정량화하기 위한 막, 용액 또는 칩 이용된 기술이 포함된다]이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
해당 생성물에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여, 폴리뉴클레오타이드-암호화된 생성물의 발현을 검출 및 측정하기 위한 각종 프로토콜이 당해 분야에 공지되어 있다. 이의 예에는 효소 결합 면역 흡착 검정(ELISA), 방사성면역검정(RIA) 및 형광성 활성화된 세포 분류법(FACS)가 있다. 소정의 폴리펩타이드 상의 2개의 비-간섭 에피토프에 반응성인 모노클로날 항체를 활용하는 2개-부위의 모노클로날 이용된 면역검정이 몇몇 적용 분야에 바람직할 수 있지만, 경쟁적 결합 검정을 이용할 수도 있다. 이들 및 기타 검정이 특히, 문헌[참조: Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) and Maddox, D. E. et al. (1983; J. Exp. Med. 158:1211-1216)]에 기재되어 있다.
광범위한 표지물 및 접합 기술이 당업자에게 공지되어 있고, 이를 각종 핵산 및 아미노산 검정에 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드와 관련된 서열을 검출하기 위한 표지된 하이브리드화 또는 PCR 프로브를 생성하기 위한 수단에는, 올리고표지화, 니크 해독, 말단-표지화 또는 표지된 뉴클레오타이드를 이용한 PCR 증폭이 포함된다. 또 다른 한편, 상기 서열 또는 이의 일정 부분을, mRNA 프로브를 생성시키기 위한 벡터 내로 클로닝시킬 수 있다. 이러한 벡터는 당해 분야에 공지되어 있고, 시판중이며, 이를 사용하여, 적당한 RNA 폴리머라제, 예를 들면, T7, T3 또는 SP6 및 표지된 뉴클레오타이드를 부가함으로써 RNA 프로브를 시험관내에서 합성할 수 있다. 이들 과정은 각종 시판용 키트를 사용하여 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 리포터 분자 또는 표지물에는 방사성핵종, 효소, 형광체, 화학발광체 또는 색소생성제 뿐만 아니라 기질, 조인자, 억제제, 자기 입자 등이 포함된다.
관심있는 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환시킨 숙주 세포를, 세포 배양물로부터 해당 단백질의 발현 및 회수에 적합한 조건 하에서 배양할 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용된 서열 및/또는 벡터에 따라서 세포내로 분비되거나 세포내에 함유될 수 있다. 당업자에게 인지되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는, 암호화된 폴리펩타이드를 원핵성 또는 진핵성 세포 막을 통하여 분비하도록 지시해주는 시그날 서열을 함유하도록 고안될 수 있다. 기타 재조합 작제 기술을 이용하여, 관심있는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을, 가용성 단백질의 정제를 촉진시킬 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 연결시킬 수 있다. 이러한 정제 촉진성 도메인에는 고정화된 금속 상에서의 정제를 허용해주는 금속 킬레이트화 펩타이드, 예를 들면, 히스티딘-트립토판 모듈; 고정화된 면역글로불린 상에서의 정제를 허용해주는 단백질 A 도메인 및 FLAGS 연장/친화 정제 시스템(Immunex Corp., Seattle, Wash.)에서 이용된 도메인이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 정제 도메인과 암호화된 폴리펩타이드 사이에 절단 가능한 링커 서열, 예를 들면, 인자 XA 또는 엔테로키나제에 특이적인 링커 서열(Invitrogen, San Diego, Calif.)을 혼입하여, 정제를 촉진시킬 수 있다. 이러한 발현 벡터는 관심있는 폴리펩타이드와, 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위 앞의 6개 히스티딘 잔기를 암호화하는 핵산을 함유하는융합 단백질을 발현시켜 준다. 상기 히스티딘 잔기는 문헌[참조: Porath, J. et al. (1992, Prot. Exp. Purif. 3:263-281)]에 기재된 바와 같이 IMIAC(고정화된 금속 이온 친화 크로마토그래피) 상에서의 정제를 촉진시켜주는 반면, 엔테로키나제 절단 부위는 상기 융합 단백질로부터 목적하는 폴리펩타이드를 정제시켜 주는 수단을 제공해준다. 융합 단백질을 함유하는 벡터에 관한 논의가 다음 문헌에 제공되어 있다[참조: Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol. 12:441-453].
재조합 생성 방법 이외에도, 본 발명의 폴리펩타이드 및 이의 단편은 고체 상 기술을 이용하는 직접적인 펩타이드 합성법으로 제조할 수 있다[참조: Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154]. 단백질 합성은 매뉴얼 기술 또는 자동화 기술을 이용하여 수행할 수 있다. 자동화 합성은, 예를 들면, 다음 자동화기[Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer; Perkin Elmer]를 사용하여 달성할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 각종 단편을 화학적으로 별개로 합성하고, 완전한 길이의 분자를 생성시키는 화학적 방법을 사용하여 이를 조합할 수 있다.
부위 특이적 돌연변이 유발
부위 특이적 돌연변이 유발은 개별적인 펩타이드 또는 생물학적 작용상 등가물인 폴리펩타이드를 암호화하는 기본 폴리뉴클레오타이드의 특이적 돌연변이를 통하여, 상기 개별적인 펩타이드 또는 생물학적 작용상 등가물인 폴리펩타이드를 제조하는데 유용한 기술이다. 당업자에게 널리 공지된 상기 기술은, 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화물을 DNA 내로 도입함으로써, 예를 들면, 전술된 한 가지이상의 고려 사항을 혼입하면서, 서열 변이체를 즉시 제조 및 시험하는 능력을 추가로 제공해준다. 부위 특이적 돌연변이 유발은, 목적하는 돌연변이물의 DNA 서열을 암호화하는 특이적 올리고뉴클레오타이드 서열의 사용을 통하여 돌연변이체를 생성시킬 뿐만 아니라, 서로 가로지르는 결실 연결부의 양 측면 상에 안정한 이본쇄를 형성시키기에 충분한 크기와 서열 복합성을 지닌 프라이머 서열을 제공하기에 충분한 수의 인접한 폴리뉴클레오타이드를 생성할 수 있게 해준다. 돌연변이물을 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 사용하여, 폴리뉴클레오타이드 자체의 특성을 향상, 변화, 저하, 변형 또는 변화시킬 수 있고/있거나 암호화된 폴리펩타이드의 특성, 활성, 조성, 안정성 또는 1차적인 서열을 변화시킬 수 있다.
본 발명의 특정 양태에서, 본 발명자들은 암호화된 폴리펩타이드의 한 가지 이상의 특성, 예를 들면, 폴리펩타이드 백신의 항원성을 변화시키기 위해 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열을 돌연변이 유발시키는 것을 고려하고 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 폴리펩타이드와 폴리뉴클레오타이드 모두에 대한 변이체를 생성시키기 위해 광범위하게 사용되고 있다. 예를 들면, 부위 특이적 돌연변이 유발은 종종, DNA 분자의 특정 부분을 변화시키기 위해 사용된다. 이러한 양태에서는, 전형적으로 약 14 내지 약 25개 뉴클레오타이드 등을 포함하는 프라이머를 이용할 수 있는데, 해당 서열의 연결부 양 측면 상의 약 5 내지 약 10개 잔기를 변화시킨다.
당업자에게 인지되는 바와 같이, 부위 특이적 돌연변이 유발 기술은 종종, 일본쇄 형태와 이본쇄 형태 둘 다로 존재하는 파아지 벡터를 이용한다. 부위 특이적 돌연변이 유발에 유용한 전형적인 벡터에는 M13 파아지와 같은 벡터가 포함된다. 이들 파아지는 용이하게 입수 가능하고 이들의 용도는 당업자에게 일반적으로 널리 공지되어 있다. 이본쇄 플라스미드를 통상적으로 부위 지시된 돌연변이 유발에 이용하기도 하는데, 여기서는 관심있는 유전자를 플라스미드로부터 파아지로 전이시키는 단계가 생략된다.
일반적으로, 본 발명에 따르는 부위 지시된 돌연변이 유발은, 먼저 일본쇄 벡터를 수득하거나, 또는 목적하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 이의 서열 내에 포함하는 이본쇄 벡터의 2개 쇄를 별도로 분리시킴으로써 수행한다. 목적하는 돌연변이된 서열을 보유하는 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 일반적으로 합성 제조한다. 이어서, 상기 프라이머를 일본쇄 벡터와 함께 어닐링시키고, 이에 DNA 중합 효소, 예를 들면, 이. 콜라이 폴리머라제 I 클레노우(Klenow) 단편을 적용시켜, 돌연변이-보유 쇄의 합성을 완료시킨다. 이로써, 1개의 쇄가 본래의 돌연변이되지 않은 서열을 암호화하고 제2의 쇄가 목적하는 돌연변이를 보유하고 있는 헤테로-이본쇄가 형성된다. 이어서, 상기 헤테로-이본쇄 벡터를 사용하여, 적당한 세포, 예를 들면, 이. 콜라이 세포를 형질전환시키고, 돌연변이된 서열 배열을 지닌 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선별한다.
부위 지시된 돌연변이 유발을 사용하여 상기와 같이 선별된 펩타이드 암호화 DNA 세그먼트의 서열 변이체를 제조함으로써, 효능적으로 유용한 종을 생성시키는 수단을 제공할 수 있으며, 이는 펩타이드 및 이를 암호화하는 DNA 서열의 서열 변이체를 수득할 수 있는 기타 방법이 존재한다는 것을 제한하는 것으로 해석되서는안된다. 예를 들면, 목적하는 펩타이드 서열을 암호화하는 재조합 벡터를 돌연변이 유발제, 예를 들면, 하이드록실아민으로 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이들 방법 및 프로토콜에 관한 구체적인 내역이 문헌[참조: Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; and Maniatis et al., 1982; 각각 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 기재되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이 유발 과정"은 특이적 핵산 분자의 농도를 초기 농도에 비해 증가시켜 주거나 또는 검출 가능한 시그날의 농도, 예를 들면, 증폭 농도를 증가시켜 주는, 주형-의존적 프로세스 및 벡터-매개된 증식 과정을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이 유발 과정"은 프라이머 분자의 주형-의존적 연장을 포함하는 프로세스를 지칭한다. 용어 주형-의존적 프로세스는 새로이 합성된 핵산 쇄의 서열이 널리 공지된 상보성 염기쌍 형성 법칙[Watson, 1987 참조]에 의해 지시되는, RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성 과정을 지칭한다. 전형적으로, 벡터 매개된 방법론은 핵산 단편을 DNA 또는 RNA 내로 도입하고, 이러한 벡터를 클론성 증폭시키며, 이와 같이 증폭된 핵사 단편을 회수하는 것을 포함한다. 이러한 방법론의 예가 미국 특허 제4,237,224호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 제시되어 있다.
폴리뉴클레오타이드 증폭 기술
수 많은 주형 의존적 프로세스를 이용하여, 샘플 내에 존재하는 관심있는 표적 서열을 증폭시킬 수 있다. 가장 우수한 것으로 공지된 증폭 방법 중 한 방법은미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로 삽입됨)에 상세히 기재되어 있는 폴리머라제 연쇄 반응(PCR™)이다. 간략하게 언급하면, PCR™에서는, 표적 서열의 반대편 상보 쇄 상의 영역에 상보적인 2개의 프라이머 서열을 제조한다. 과량의 데옥시뉴클레오시드 트리포스페이트를 DNA 폴리머라제(예:Taq폴리머라제)와 함께 반응 혼합물에 가한다. 표적 서열이 샘플 내에 존재하는 경우에는, 상기 프라이머가 이러한 표적에 결합되고, 상기 폴리머라제는 상기 프라이머를 뉴클레오타이드 상에 부가함으로써 표적 서열을 따라 연장될 수 있도록 해줄 것이다. 반응 혼합물의 온도를 상승 또는 강하시킴으로써, 상기와 같이 연장된 프라이머는 표적으로부터 해리되어 반응 생성물을 형성할 것이며, 과량의 프라이머는 표적 및 반응 생성물에 결합될 것이며, 이러한 과정을 반복한다. 바람직하게는, 역전사 및 PCR™증폭 과정을 수행하여, 증폭된 mRNA의 양을 정량화할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법론은 당해 분야에 널리 공지되어 있다.
또 다른 증폭 방법은 유럽 공개특허공보 제320,308호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 리가제 연쇄 반응(LCR로서 지칭됨)이다. LCR에서는, 2개의 상보성 프로브 쌍을 제조하고, 표적 서열의 존재하에서는 각 쌍이 상기 표적의 반대편 상보성 쇄와 결합함으로써, 이들이 인접해 있다. 리가제의 존재하에서는 2개의 프로브 쌍이 연결하여 단일 단위를 형성할 것이다. PCR™에서와 같이 온도 주기에 의해, 결합되고 연결된 단위는 상기 표적으로부터 해리되어 과량의 프로브 쌍의 연결을 위한 "표적 서열"로서 작용한다. 미국 특허 제4,883,750호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에는 프로브 쌍을 표적 서열에 결합시키기 위한, LCR과 유사한 대체 증폭 방법이 기재되어 있다.
PCR 국제특허출원 PCT/US87/00880(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 Qbeta 레플리카제를, 본 발명의 또 다른 증폭 방법으로서 사용할 수도 있다. 이러한 방법에서는, 특정 표적의 것에 상보적인 영역을 지닌 RNA의 복제 서열을 RNA 폴리머라제의 존재 하에 샘플에 가한다. 이러한 폴리머라제는 상기 복제 서열을 복사할 것이며, 이어서 이를 검출할 수 있다.
제한 엔도뉴클레아제 및 리가제를 사용하여, 제한 부위의 한 쇄 내에 뉴클레오타이드 5'-[α-티오]트리포스페이트를 함유하는 표적 분자의 증폭을 달성시키는, 등온 증폭 방법[참조: Walker et al., 1992; 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]이 또한, 본 발명에서 핵산을 증폭시키는데 유용할 수 있다.
쇄 대체와 합성, 즉 니크 해독을 수회 수행하는 것을 포함하는 쇄 대체 증폭(SDA) 방법이 핵산의 등온 증폭을 수행하는 또 다른 방법이다. 수복 연쇄 반응(RCR)으로 지칭되는 유사한 방법이 본 발명에서 유용할 수 있는 또 다른 증폭 방법이고, 이는 증폭용으로 표적된 영역 전반에 걸쳐 여러 개의 프로브를 어닐링시킨 다음, 4개의 염기 중 2개 만이 존재하는 수복 반응을 수행하는 것을 포함한다. 다른 2개 염기는 용이한 검출을 위해 바이오티닐화 유도체로서 가할 수 있다. 유사한 접근법을 SDA에 사용한다.
사이클릭 프로브 반응(CPR)을 사용하여 서열을 검출할 수도 있다. CPR에서는, 비-표적 DNA의 3' 및 5' 서열과 표적 단백질 특이적 RNA의 내부 또는 "중간"서열을 갖는 프로브를, 샘플 내에 존재하는 DNA와 하이브리드화시킨다. 하이브리드화시, 상기 반응물을 RNAse로 처리하고, 분해 후 방출되는 시그날을 생성시킴으로써 상기 프로브의 생성물을 독특한 생성물로서 동정한다. 본래의 주형을 또 다른 사이클링 프로브에 어닐링시키고, 이 반응을 반복한다. 따라서, CPR은 표적 유전자 특이적 발현된 핵산에 프로브를 하이브리드화시킴으로써 생성된 시그날을 증폭시키는 것을 포함한다.
영국 특허원 제2 202 328호 및 PCT 국제특허출원 PCT/US89/01025(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 기타 증폭 방법을 본 발명에 따라서 사용할 수 있다. 전자 출원에서는, "변형된" 프라이머를 PCR-유사, 주형 및 효소 의존적 합성에 사용한다. 상기 프라이머는 포획 잔기(예: 바이오틴) 및/또는 검출인자 잔기(예: 효소)로 표지시킴으로써 변형시킬 수 있다. 후자 출원에서는, 과량의 표지된 프로브를 샘플에 가한다. 표적 서열의 존재 하에서는, 상기 프로브가 결합되고 촉매적으로 절단된다. 절단 후, 상기 표적 서열이 본래 상태로 방출되어, 과량의 프로브에 의해 결합되어진다. 표지된 프로브의 절단은 표적 서열이 존재한다는 것을 신호한다.
기타 핵산 증폭 과정에는 핵산 서열 이용된 증폭(NASBA) 및 3SR을 포함한, 전사 이용된 증폭 시스템(TAS)[참조: Kwoh et al., 1989; PCT 국제공개공보 WO 88/10315; 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]이 포함된다. NASBA에서는, 표준 페놀/클로로포름 추출, 샘플의 열 변성, DNA 및 RNA를 분리시키기 위해 용해 완충액 및 미니스핀(minispin) 칼럼으로의 처리, 또는 RNA의 구아니디늄 클로라이드 추출에 의해 증폭시키기 위한 핵산을 제조할 수 있다. 이들 증폭 기술은 표적 서열에 특이적인 서열을 갖는 프라이머를 어닐링시키는 것을 포함한다. 중합 후, DNA/RNA 하이브리드는 RNAse H로 분해시키는 반면, 이본쇄 DNA 분자는 다시 열변성시킨다. 어느 한 경우든, 제2 표적 특이적 프라이머를 가한 후, 이를 중합시킴으로써, 일본쇄 DNA를 완전한 이본쇄로 만든다. 이어서, 이러한 이본쇄 DNA 분자를 T7 또는 SP6 등의 폴리머라제에 의해 다중 전사시킨다. 등온 사이클릭 반응에서는, RNA를 DNA로 역전사시키고, T7 또는 SP6 등의 폴리머라제로 다시 한번 전사시킨다. 이로써 생성된 생성물은 절단된 것이든 완전한 것이든 간에, 표적 특이적 서열을 지시한다.
유럽 공개특허공보 제329,822호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에는 본 발명에 따라서 사용될 수 있는, 일본쇄 RNA("ssRNA"), ssDNA 및 이본쇄 DNA(dsDNA)를 주기적으로 합성하는 것을 포함하는 핵산 증폭 방법이 기재되어 있다. ssRNA는 제1 프라이머 올리고뉴클레오타이드에 대한 제1 주형이고, 이는 역전사효소(RNA-의존적 DNA 폴리머라제)에 의해 신장된다. 이어서, 리보뉴클레아제 H(RNAse H; 이는 DNA 또는 RNA와의 이본쇄에서 RNA에 특이적인 RNAse이다)의 작용에 의해, 상기와 같이 생성된 DNA:RNA 이본쇄로부터 RNA를 제거한다. 이로써 생성된 ssDNA는 제2의 프라이머에 대한 제2의 주형이고, 이는 이의 상동성으로 이의 주형에 대해 5'인 RNA 폴리머라제 프로모터(T7 RNA 폴리머라제로써 예시됨)의 서열을 포함한다. 이어서, 상기 프라이머를 DNA 폴리머라제(이. 콜라이 DNA 폴리머라제 I의 큰 "클레노우" 단편으로써 예시됨)에 의해 연장시키면, 이는, 상기 두 프라이머사이에 본래의 RNA의 서열과 동일한 서열을 갖고 한 말단에 프로모터 서열을 부가적으로 갖는 이본쇄 DNA("dsDNA") 분자로서 생성된다. 이러한 프로모터 서열을 적당한 RNA 폴리머라제에 의해 사용하여, DNA의 수 많은 RNA 복사물을 만들 수 있다. 이어서, 이들 복사물을, 극히 신속한 증폭을 가져다 주는 사이클에 재유입시킬 수 있다. 효소를 적당히 선택함으로써, 각 사이클에 효소를 부가하지 않고서도 상기 증폭을 등온적으로 수행할 수 있다. 상기 방법의 순환 특성으로 인해, 출발 서열을 DNA 또는 RNA의 형태로 선택할 수 있다.
PCT 국제공개공보 WO 89/06700(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에는 프로모터/프라이머 서열을 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")와 하이브리드화한 다음 상기 서열의 많은 RNA 복사물을 전사시키는 것을 포함하는 핵산 서열 증폭 도식이 기재되어 있다. 이러한 도식은 순환적이지 않은데, 즉 생성된 RNA 전사체로부터 새로운 주형이 생성되지 못한다. 기타 증폭 방법에는 당업자에게 널리 공지되어 있는 "RACE"(Frohman, 1990) 및 "한측(one-sided) PCR"(Ohara, 1989)이 포함된다.
생성된 "디-올리고뉴클레오타이드"의 서열을 갖는 핵산 서열의 존재 하에 2개(또는 그 이상)의 올리고뉴클레오타이드를 연결함으로써 상기 디-올리고뉴클레오타이드를 증폭시키는 것을 이용하는 방법[참조: Wu and Dean, 1996; 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]을 본 발명의 DNA 서열의 증폭에 사용할 수도 있다.
생물학적 작용성 등가물
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조 내부를 변형 및 변화시킬 수 있으며, 이로써 목적하는 특징을 지닌 폴리펩타이드를 암호화하는 작용성분자를 수득할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 한 가지 이상의 돌연변이를 특이적 폴리뉴클레오타이드 서열에 도입하는 것이 종종 요망된다. 특정한 상황하에서는, 이로써 생성된 암호화된 폴리펩타이드 서열이 상기 돌연변이에 의해 변화되고, 기타 경우에는, 상기 폴리펩타이드의 서열이 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에서의 한 가지 이상의 돌연변이에 의해서 변화되지 않는다.
폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시켜 등가물 또는 심지어 개선된 2세대 분자를 생성시키고자 하는 경우에는, 표 1에 따라서, 암호화한 DNA 서열의 코돈 하나 이상을 변화시킴으로써 아미노산 변화를 달성할 수 있다.
예를 들면, 특정 아미노산을, 특정 구조물, 예를 들면, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위와의 상호 작용성 결합 능력은 인지적으로 상실하지 않고서, 단백질 구조 내의 기타 아미노산으로 치환할 수 있다. 단백질의 생물학적 작용 활성을 규정하는 것은 이러한 단백질의 상호 작용성 능력과 본성이기 때문에, 특정 아미노산 치환이 단백질 서열, 및 물론 기본 DNA 암호화 서열에서 만들어짐에도 불구하고, 유사한 특성을 지닌 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 이들의 생물학적 유용성 또는 활성은 인지적으로 상실하지 않고서도, 본원에 기재된 조성물의 펩타이드 서열, 또는 이러한 펩타이드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열 내에서 각종 변화가 이루어질 수 있다는 것이 본 발명자들에 의해 고려된다.
아미노산 코돈
알라닌 Ala A GCA GCC GCG GCU시스테인 Cys C UGC UGU아스파르트산 Asp D GAC GAU글루탐산 Glu E GAA GAG페닐알라닌 Phe F UUC UUU글리신 Gly G GGA GGC GGG GGU히스티딘 His H CAC CAU이소루이신 Ile I AUA AUC AUU리신 Lys K AAA AAG루이신 Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU메티오닌 Met M AUG아스파라긴 Asn N AAC AAU프롤린 Pro P CCA CCC CCG CCU글루타민 Gln Q CAA CAG아르기닌 Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU세린 Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU트레오닌 Thr T ACA ACC ACG ACU발린 Val V GUA GUC GUG GUU트립토판 Trp W UGG티로신 Tyr Y UAC UAU
이러한 변화를 만드는데 있어서, 아미노산의 수치료 지수(hydropathic index)를 고려할 수 있다. 단백질에 상호작용성 생물학적 작용을 부여해주는데 있어서의 수치료 아미노산 지수의 중요성은 당업계 널리 인지되고 있다[참조: Kyte and Doolittle, 1982, 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 이는 생성된 단백질의 2차 구조에 기인하는 아미노산의 상대적 수치료 특징(이는 결국 상기 단백질과 기타 분자, 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 규정하고 있다)으로서 용인되고 있다. 각각의 아미노산에는, 이의 소수성과 전하 특징에 근거하여 수치료 지수가 할당되어 있다[참조: Kyte and Doolittle, 1982]. 이들 값은 다음과 같다: 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 리신(-3.9) 및 아르기닌(-4.5).
특정 아미노산을 유사한 수치료 지수 또는 스코어를 갖는 기타 아미노산으로 치환할 수 있으며, 이로써 유사한 생물학적 활성을 지닌 단백질, 즉 생물학적 작용상 등가물인 단백질이 생성될 수 있다는 것은 당해 분야에 공지되어 있다. 이러한 변화를 만드는데 있어서, 이의 수치료 지수가 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, ±0.5 내인 아미노산의 치환이 보다 특히 바람직하다. 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 근거하여 효과적으로 만들어질 수 있다는 것도 당해 분야에 인식되고 있다. 미국 특허 제4,554,101호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에는 이의 인접한 아미노산의 소수성에 의해 좌우되는 바와 같이, 단백질의 가장 큰 국소 평균 소수성이 이러한 단백질의 생물학적 특성과 상관이 있다고 언급되어 있다.
미국 특허 제4,554,101호에 기재된 바와 같이, 다음의 친수성 값이 아미노산 잔기에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 리신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+3.0); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산을 유사한 친수성 값을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환할 수 있고, 이로써 생물학적 등가물, 특히 면역학적으로 등가물인 단백질을 수득할 수 있다. 이러한 변화를 만드는데 있어서, 친수성 값이 ±2 내인 아미노산의 치환이 바람직하고, ±1 내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하며, ±0.5 내인 아미노산의 치환이 보다 특히 바람직하다.
따라서, 상기 언급된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로, 아미노산 측쇄 치환체의 상대적 유사성, 예를 들면, 이들의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 근거한다. 전술된 각종 특징을 고려한 치환의 예는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 이에는 아리그닌 및 리신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴 및 발린, 루이신 및 이소루이신이 포함된다.
또한, 어떠한 폴리뉴클레오타이드도 추가로 변형시켜 생체내 안정성을 증가시킬 수 있다. 가능한 변형법에는 5' 및/또는 3' 말단에 플랭킹 서열을 부가하는 방법; 주쇄 내에 포스포디에스테라제 연결 이외의 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸을 사용하는 방법 및/또는 비-전통적인 염기, 예를 들면, 이노신, 쿠에오신 및 위부토신을 혼입시킬 뿐만 아니라 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘의 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 기타 변형된 형태를 혼입시키는 방법이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
생체내 폴리뉴클레오타이드 전달 기술
부가의 양태에서는, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 하나 이상을 포함하는 유전적 작제물을 생체내에서 세포에 도입한다. 이는 널리 공지된 접근법 또는 각종 접근법 중 어느 방법을 이용해서도 달성할 수 있으며, 이들 중 몇몇이 예시 목적으로 다음에 요약되어 있다.
1. 아데노바이러스
하나 이상의 핵산 서열을 생체내 전달하기 위한 바람직한 한 가지 방법은 아데노바이러스 발현 벡터를 사용하는 것을 포함한다. "아데노바이러스 발현 벡터"는 (a) 작제물의 패키징을 지지하기에 충분하고 (b) 센스 또는 안티센스 배향으로 그 안에 클로닝된 폴리뉴클레오타이드를 발현하기에 충분한 아데노바이러스 서열을 함유하는 작제물을 포함하는 것을 의미한다. 물론, 안티센스 작제물의 맥락에서는, 발현이 유전자 생성물을 반드시 합성시킨다는 것을 요구하지 않는다.
상기 발현 벡터는 유전 공학적으로 처리된 형태의 아데노바이러스를 포함한다. 아데노바이러스의 유전적 체제에 관한 지식, 즉 36kb의 선형인 이본쇄 DNA 바이러스란 사실을 이용하여, 아데노바이러스성 DNA의 큰 조각을 7kb 이하의 외래 서열로 치환시킬 수 있다[참조: Grunhaus and Horwitz, 1992]. 레트로바이러스와는 달리, 숙주 세포를 아데노바이러스성 감염시키면, 염색체성 통합이 이루어지지 않는데, 이는 아데노바이러스성 DNA가 잠재적인 유전자독성 없이 에피솜성 방식으로 복제할 수 있기 때문이다. 또한, 아데노바이러스는 구조적으로 안정하며, 연장 증폭 후에 어떠한 게놈 재배열도 검출되지 않았다. 아데노바이러스는 이들의 세포 주기 단계와 상관없이 모든 상피 세포를 실질적으로 감염시킬 수 있다. 지금까지는, 아데노바이러스성 감염이 사람에게서 급성 호흡기 질병과 같은 순한 질병에만 연관되는 것으로 여겨지고 있다.
아데노바이러스는 유전자 전이 벡터로서 사용하기에 특히 적합한데, 이는 이의 게놈이 중간 크기이고, 조작이 용이하며, 역가치가 높고, 표적 세포 범위가 넓으며 감염력이 크기 때문이다. 바이러스성 게놈의 양 말단은 바이러스성 DNA 복제 및 패키징에 필요한 시스 요소인, 100 내지 200개 염기쌍 역방향 반복서열(ITRs)을 함유한다. 이러한 게놈의 초기(E) 및 후기(L) 영역은 바이러스성 DNA 복제 개시에 의해 분할되는 상이한 전사 단위를 함유한다. E1 영역(E1A 및 E1B)은 바이러스성 게놈과 몇몇 세포성 유전자의 전사 조절에 관여하는 단백질을 암호화한다. E2 영역(E2A 및 E2B)을 발현시키면, 바이러스성 DNA 복제용 단백질이 합성된다. 이들 단백질은 DNA 복제, 후기 유전자 발현 및 숙주 세포 차단(shut-off)와 관련이 있다[Renan, 1990]. 대부분의 바이러스성 캡시드 단백질을 포함한 후기 유전자의 생성물은, 주요 후기 프로모터(MLP)에 의해 유출된 단일 1차 전사체의 실재적인 프로세싱 후에만 발현된다. 이러한 MLP(16.8m.u.에 위치됨)은 감염 후기 상 동안에 특히 효율적이며, 이러한 프로모터로부터 유출된 모든 mRNA는 5'-삼부분 리더(TPL) 서열을 보유하는데, 이는 이들을 해독에 바람직한 mRNA로 만든다.
현 시스템에서는, 제조합 아데노바이러스를, 셔틀(shuttle) 벡터와 프로바이러스 벡터 간의 상동 재조합으로부터 생성시킨다. 2개의 프로바이러스성 벡터 간에 재조합이 가능하기 때문에, 이러한 방법으로 야생형 아데노바이러스를 생성시킬 수도 있다. 따라서, 개개의 플라크로부터 단일 클론의 바이러스를 분리시키고, 이의 게놈 구조를 검사하는 것이 중요하다.
복제 결핍성인 현 아데노바이러스 벡터의 발생과 증식은, A5d DNA 단편에 의해 사람 배아 신장 세포로부터 형질전환시키고 E1 단백질을 구성상 발현하는 독특한 헬퍼 세포주(293으로 명명됨)에 좌우된다[참조: Graham et al., 1977]. E3 영역은 아데노바이러스 게놈으로부터 제거될 수 있기 때문에[참조: Jones and Shenk, 1978], 현 아데노바이러스 벡터는 293 세포의 도움 하에, E1, D3 또는 양 영역에 외래 DNA를 수반한다[참조: Graham and Prevec, 1991]. 본래, 아데노바이러스는 약 2엑스트라 kB의 DNA에 대한 수용 능력을 제공하면서, 대략 105%의 야생형 게놈을 패키징할 수 있다[참조: Ghosh-Choudhury et al., 1987]. E1 또는 E3 영역에서 대체 가능한 대략 5.5kB의 DNA와 조합함으로써, 현 아데노바이러스 벡터의 최대 수용 능력은 7.5kB이거나 상기 벡터 총 길이의 약 15%이다. 아데노바이러스 바이러스성 게놈의 80% 이상이 벡터 주쇄 내에 잔존하고, 이는 벡터로부터 발생되는 세포독성의 공급원이 된다. 또한, E1-결실된 바이러스의 복제 결핍성은 불완전하다. 예를 들면, 감염 다중도(MOI)가 높은 현재 시판중인 벡터를 이용하여, 바이러스성 유전자 발현 누출을 관찰하였다[참조: Mulligan, 1993].
헬퍼 세포주는 사람 세포, 예를 들면, 사람 배아 신장 세포, 근육 세포, 조혈 세포 또는 기타 사람 배아 간엽 또는 상피 세포로부터 유도할 수 있다. 또 다른 한편, 헬퍼 세포는 사람 아데노바이러스의 복제를 허용하는 기타 포유류 종 세포로부터 유도할 수 있다. 이러한 세포에는, 예를 들면, 베로(Vero) 세포 또는 기타 원숭이 배아 간엽 또는 상피 세포가 포함된다. 상기 언급된 바와 같이, 현재 바람직한 헬퍼 세포주는 293이다.
최근에, 293 세포를 배양하고 아데노바이러스를 증식시키는 개선된 방법이 문헌[참조: Racher et al. (1995)]에 기재되었다. 한 포맷에서는, 100 내지 200ml의 배지를 함유하는 1리터용 규소화 스피너 플라스크(Techne, Cambridge, UK) 내로개개의 세포를 접종함으로써 천연 세포 응집체를 성장시킨다. 40rpm으로 교반시킨 후, 트리판 블루로 세포 생육성을 평가한다. 또 다른 포맷에서는, 피브라-셀 마이크로캐리어(Fibra-Cel microcarrier; Bibby Sterlin, Stone, UK)(5g/l)를 다음과 같이 이용한다. 5ml 배지에 재현탁된 세포 접종물을 250ml 에를렌마이어 플라스크 중 상기 캐리어(50ml)에 가하고, 가끔씩 진탕시키면서 1 내지 4시간 동안 정치 상으로 놓아둔다. 이어서, 상기 배지를 신선한 배지 50ml로 대체시키고 진탕을 시작한다. 바이러스 생성을 위해, 세포를 약 80% 밀집도로 성장시키고, 이후에는 상기 배지를 대체시키고(25% 최종 용적이 되게함) 아데노바이러스를 MOI 0.05로 가한다. 배양물을 밤새 정지 상으로 놓아둔 다음, 용적을 100%로 증가시키고, 72시간 더 진탕을 개시한다.
아데노바이러스 벡터가 복제 결핍성이거나 적어도 조건적으로는 결함이 있어야 한다는 요구 조건 이외의 아데노바이러스 벡터의 특성은 본 발명의 성공적인 실시에 결정적인 것으로 여겨지지 않는다. 아데노바이러스는 42개의 상이한 공지된 혈청형 또는 아그룹 A-F 중 어느 것일 수도 있다. 아그룹 C의 아데노바이러스 유형 5는, 본 발명에 사용하기 위한 조건적 복제-결함있는 아데노바이러스 벡터를 수득하기 위한 바람직한 출발 물질인데, 이는 아데노바이러스 유형 5가 상당량의 생화학적 및 유전적 정보가 공지되어 있는 사람 아데노바이러스이고, 이는 벡터로서 아데노바이러스를 이용하는 대부분의 작제에 오래전부터 사용되어 왔기 때문이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명에 따르는 전형적인 벡터는 복제 결함성이고 아데노바이러스 E1 영역을 가지지 않을 것이다. 따라서, E1-암호화 서열을 제거시킨 위치에서 관심있는 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 도입하는 것이 가장 편리할 것이다. 그러나, 아데노바이러스 서열 내의 작제물의 삽입 위치는 본 발명에 중요하지 않다. 관심있는 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를, 결실된 E3 영역 대신 문헌[참조: Karlsson et al. (1986)]에 기재된 바와 같은 E3 치환 벡터 내에 삽입할 수 있거나, 또는 E4 영역(여기서, 헬퍼 세포주 또는 헬퍼 바이러스가 E 결함을 보충해준다)에 삽입할 수도 있다.
아데노바이러스는 잘 성장하고, 조작하기가 용이하며 시험관내 및 생체내에서 광범위한 숙주 범위를 나타낸다. 이러한 바이러스 그룹은 고역가, 예를 들면, 109내지 1011플라크 형성 단위/ml로 수득될 수 있고, 이들은 고도로 감염성이다. 아데노바이러스의 라이프 사이클은 숙주 세포 게놈으로의 통합을 요구하지 않는다. 아데노바이러스 벡터에 의해 전달된 외래 유전자는 에피솜성이므로, 숙주 세포에 대한 세포독성치가 낮다. 야생형 아데노바이러스를 이용한 백신 주사에 관한 연구에서는 어떠한 부작용도 보고된 바 없으며[참조: Couch et al., 1963; Top et al., 1971], 이는 이들이 생체내 유전자 전이 벡터로서 치료학적 효능을 지니고 있고 안전하다는 것을 입증해준다.
아데노바이러스 벡터는 진핵성 유전자 발현[참조: Levrero et al., 1991; Gomez-Foix et al., 1992] 및 백신 개발[참조: Grunhaus and Horwitz, 1992; Graham and Prevec, 1992]에 사용되어 왔다. 최근에, 동물 연구 결과는, 재조합 아데노바이러스가 유전자 치료법에 사용될 수 있다고 제안하고 있다[참조:Stratford-Perricaudet and Perricaudet, 1991; Stratford-Perricaudet et al., 1990; Rich et al., 1993]. 재조합 아데노바이러스를 상이한 조직에 투여하는데 있어서의 연구에는 기관 적하[참조: Rosenfeld et al., 1991; Rosenfeld et al., 1992], 근육 주사[참조: Ragot et al., 1993], 말초 정맥 주사[참조: Herz and Gerard, 1993] 및 뇌 내로의 정위고정성 접종[참조: Le Gal La Salle et al., 1993]이 포함된다.
2. 레트로바이러스
레트로바이러스는 이들의 RNA를 역전사 프로세스에 의해 감염된 세포에서 이본쇄 DNA로 전환시키는 능력을 특징적으로 나타내는 일본쇄 RNA 바이러스 그룹이다. 이어서, 이로써 생성된 DNA를 프로바이러스로서 세포성 염색체 내로 안정적으로 통합되고, 바이러스성 단백질의 합성을 지시한다. 이러한 통합으로 인해, 바이러스성 유전자 서열이 수용체 세포 및 이의 자손에 체류하게 된다. 레트로바이러스성 게놈은 캡시드 단백질, 폴리머라제 효소 및 엔벨로프 성분을 각각 암호화하는 3가지 유전자인 gag, pol 및 env를 함유한다. gag 유전자로부터의 업스트림에 발견된 서열은 상기 게놈을 비리온 내로 패키징하기 위한 시그날을 함유한다. 2개의 장 말단 반복(LTR) 서열은 바이러스성 게놈의 5' 및 3' 말단에 존재한다. 이들은 강력한 프로모터와 인핸서 서열을 함유하고, 또한 숙주 세포 게놈으로의 통합에 요구된다[참조: Coffin, 1990].
레트로바이러스성 벡터를 작제하기 위해서는, 관심있는 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드를 암호화하는 핵산을 특정한 바이러스성서열 대신 바이러스성 게놈 내로 삽입하여 복제 결함성인 바이러스를 생성시킨다. 비리온을 생성시키기 위해서는, gag, pol 및 env 유전자는 함유하지만 LTR 및 패키징 성분은 함유하지 않는 패키징 세포주를 작제한다[참조: Mann et al., 1983]. cDNA를 함유하는 재조합 플라스미드를 레트로바이러스성 LTR 및 패키징 서열과 함께 상기 세포주 내로 도입(예를 들면, 인산칼슘 침전에 의함)하는 경우에는, 이러한 패키징 서열이, 상기 재조합 플라스미드의 RNA 전사체가 바이러스성 입자 내로 패키징된 다음 배양 배지 내로 분비되도록 해준다[참조: Nicolas and Rubenstein, 1988; Temin, 1986; Mann et al., 1983]. 이어서, 재조합 레트로바이러스를 하유하는 배지를 수집하고, 임의로 농축시킨 다음, 유전자 전이에 사용한다. 레트로바이러스성 벡터는 광범위한 세포 유형을 감염시킬 수 있다. 그러나, 통합 및 안정한 발현을 위해서는, 숙주 세포를 분할해야 한다[참조: Paskind et al., 1975].
레트로바이러스 벡터를 특이적 표적화시킬 수 있도록 고안된 새로운 접근법이 최근에 개발되었는데, 이는 락토즈 잔기를 바이러스성 엔벨로프에 화학적으로 부가함으로써 레트로바이러스를 화학적으로 변형시키는 것에 근거한 것이다. 이러한 변형으로 인해, 시알로글리코프로테인 수용체를 통하여 간 세포를 특이적으로 감염시킬 수 있었다.
레트로바이러스성 엔벨로프 단백질에 대한 바이오티닐화 항체 및 특이적 세포 수용체 대한 바이오티닐화 항체를 사용하는, 재조합 레트로바이러스를 표적화시키는 상이한 접근법이 고안되었다. 상기 항체는 스트렙트아비딘을 사용함으로써 바이오틴 성분을 통하여 커플링시켰다[참조: Roux et al., 1989]. 주요 조직적합성 복합체 부류 I 및 부류 II 항원에 대한 항체를 사용하여, 표면 항원을 시험관내에서 에코트로픽(ecotropic) 바이러스로 곤란하게 만드는 각종 사람 세포의 감염을 입증하였다[참조: Roux et al., 1989].
3. 아데노-관련 바이러스
AAV[참조: Ridgeway, 1988; Hermonat and Muzycska, 1984]는 아데노바이러스 스톡의 오염물로서 발견된 파로바이러스이다. 이는 어떠한 질병과도 연관된 적이 없었던 편재성 바이러스(미국인의 85%에 이의 항체가 존재한다)이다. 이는 또한, 의존적 바이러스로서 분류되는데, 이는 이의 복제가 헬퍼 바이러스, 예를 들면, 아데노바이러스의 존재에 의존적이기 때문이다. 5가지 혈청형이 분리되었는데, 이중 AAV-2의 성상이 가장 잘 확인되었다. AAV는 직경이 20 내지 24nm인 20면체 비리온을 형성하기 위해 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3 내로 캡시드화되는 일본쇄의 선형 DNA를 갖는다[참조: Muzyczka and McLaughlin, 1988].
AAV DNA는 길이가 대략 4.7킬로염기이다. 이는 2개의 개방 판독 프레임을 함유하고 2개의 LTR에 의해 플랭킹된다. AAV 게놈 내에는 2개의 주요 유전자인rep및cap가 존재한다.rep유전자는 바이러스성 복제에 관여하는 단백질을 암호화하는 반면,cap유전자는 캡시드 단백질 VP1-3을 암호화한다. 각각의 ITR은 T-형태의 헤어핀 구조를 형성한다. 이들 말단 반복 서열은 염색체 통합을 위한 AAV의 유일한 필수cis성분이다. 따라서, AAV는 모든 바이러스성 암호화 서열이 제거되고 전달용 유전자 카셋트로써 대체된 벡터로서 사용될 수 있다. 3가지 바이러스성 프로모터가 동정되었으며, 이는 이들의 지도 위치에 따라서 p5, p19 및 p40으로 명명되었다. p5 및 p19로부터 전사시키면, rep 단백질이 생성되고, p40으로부터 전사시키면, 캡시드 단백질이 생성된다[참조: Hermonat and Muzyczka, 1984].
rAAV를 발현 벡터로서 사용할 수 있는지에 관한 연구 조사를 촉구시키는 몇 가지 요인이 있다. 한 가지는 특정 유전자를 숙주 염색체 내로 통합시키기 위해 이러한 유전자를 전달해야 할 필요가 놀랍게도 거의 없다는 것이다. 145-bp ITR을 가지는 것이 필요한데, 이는 AAV 게놈의 단지 6% 수준이다. 이로써 벡터가 4.5kb DNA 삽입물을 어셈블리할 여지가 있다. 이러한 운반 능력은 AAV가 큰 유전자를 전달하지 못하게 할 수 있지만, 이는 본 발명의 안티센스 작제물을 전달하는데 충분히 적합하다.
AAV는 또한, 이의 안전성으로 인해 우수한 전달 비히클로 선택된다. 비교적 복잡한 보호 기전이 있는데; 야생형 아데노바이러스 뿐만 아니라 AAV 유전자가 rAAV를 고정화시켜야 한다는 것이다. 마찬가지로, AAV는 병원성이 아니므로, 어떠한 질병과도 연관이 없다. 바이러스성 암호화 서열을 제거함으로써 바이러스성 유전자 발현에 대한 면역 반응을 최소화시키므로, rAAV는 염증 반응을 유발시키지 않는다.
4. 발현 작제물로서의 기타 바이러스성 벡터
기타 바이러스성 벡터가, 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 숙주 세포에 전달하기 위해 본 발명에서 발현 작제물로서 이용될 수 있다. 백시니아 바이러스[참조: Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988], 렌티바이러스, 폴리오 바이러스 및 헤르페스 바이러스 등의 바이러스로부터 유도된 벡터를 이용할수 있따. 이들은 각종 포유류 세포에 대해 몇 가지 관심을 끄는 양태를 부여해준다[참조: Friedmann, 1989; Ridgeway, 1988; Coupar et al., 1988; Horwich et al., 1990].
결함있는 B형 간염 바이러스를 최근에 인식함에 따라, 상이한 바이러스성 서열의 구조-기능 관계를 새롭게 고찰하게 되었다. 시험관내 연구 결과, 상기 바이러스는, 이의 게놈의 80% 이하가 결실됨에도 불구하고 헬퍼-의존적 패키징 및 역전사를 수행할 능력을 보유할 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Horwich et al., 1990]. 이는 게놈의 상당 부분이 외래 유전 물질로 대체될 수 있다는 것을 제시해준다. 간친화성과 존속성(통합)이 간-지시된 유전자 전이에 특히 관심을 끄는 특성이다. 창(Chang) 등은(1991) 폴리머라제, 표면 및 예비-표면 암호화 서열 대신 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT) 유전자를 듀크(duck) B형 간염 바이러스 게놈 내로 도입하였다. 야생형 바이러스를 이용하여 이를 조류 간암 세포주 내로 공동형질감염시켰다. 고역가치의 재조합 바이러스를 함유하는 배양 배지를 사용하여, 1차적인 튜클링(duckling) 간세포를 감염시켰다. 형질감염시킨지 적어도 24일이 지난 후에, 안정적인 CAT 유전자 발현이 검출되었다[참조: Chang et al., 1991].
5. 비-바이러스성 벡터
본 발명의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 발현시키기 위해서는, 발현 작제물을 세포 내로 전달해야만 한다. 이러한 전달은 세포주를 형질전환시키기 위한 실험실 과정에서와 같이 시험관내에서 수행하거나, 또는 특정질병 상태를 치료하는 것과 같이 생체내 또는 생체외에서 수행할 수 있다. 상기 언급된 바와 같이, 한 가지 바람직한 전달 기전은 발현 작제물을 감염성 바이러스성 입자 내에서 캡슐화시키는 바이러스성 감염을 통해서이다.
발현 작제물을 일단 세포 내로 전달하면, 목적하는 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 암호화하는 핵산을 위치시키고, 상이한 위치에서 발현시킬 수 있다. 특정 양태에서는, 상기 작제물을 암호화하는 핵산을 세포의 게놈 내로 안정적으로 통합시킬 수 있다. 이러한 통합은 상동 재조합을 통하여 특이적 위치 및 배향으로 이루어질 수 있거나(유전자 치환), 또는 무작위로 비-특이적 위치로 통합될 수 있다(유전자 증대). 추가의 양태에서는, 상기 핵산을 DNA의 별개의 에피솜성 세그먼트로서 세포 내에 안정적으로 유지시킬 수 있다. 이러한 핵산 세그먼트 또는 "에피솜"은 숙주 세포 주기와 독립적으로 또는 이와 동시에 유지 및 복제될 수 있기에 충분한 서열을 암호화한다. 그러나, 발현 작제물은 특정 세포로 전달되며, 이러한 세포에 잔존하는 핵산은 이용된 발현 작제물의 유형에 의존적이다.
본 발명의 특정 양태에서는, 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 발현 작제물이 단순히 노출된 재조합 DNA 또는 플라스미드로 이루어질 수 있다. 이러한 작제물의 전이는 세포막을 물리적 또는 화학적으로 침투할 수 있는 상기 언급된 어떠한 방법에 의해서도 수행할 수 있다. 이는 시험관내 전이에 특히 적용 가능하지만, 이를 또한 생체내 용도에 적용할 수도 있다. 문헌[참조: Dubensky et al. (1984)]에는 폴리오마바이러스 DNA를 인산칼슘침전물의 형태로 성인 마우스와 신생아 마우스의 간과 비장에 성공적으로 주사하였는데, 이로써 활성 바이러스성 복제와 급성 감염을 입증하였다고 기재되어 있다. Benvenisty and Reshef(1986)는 인산칼슘 침전된 플라스미드를 직접적으로 복강내 주사하면, 형질감염된 유전자가 발현된다는 것을 입증하였다. 관심있는 유전자를 암호화하는 DNA를 또한 유사한 방식으로 생체내에서 전이시킬 수 있고 유전자 생성물을 발현할 수 있는 것으로 간주된다.
노출된 DNA 발현 작제물을 세포 내로 전이시키기 위한 본 발명의 또 다른 양태는 입자 충격을 포함한다. 이러한 방법은 DNA-코팅된 마이크로포사체를 고속으로 가속화시켜 이들이 세포막을 뚫고 들어가 세포를 사멸시키지 않고서 이들 세포 내로 유입되도록 해주는 능력에 의존한다[참조: Klein et al., 1987]. 작은 입자를 가속화시키는 몇몇 장치가 개발되었다. 이러한 장치 중 하나는 전류를 발생시킴으로써 원동력을 제공해주는 고전압 방전에 좌우된다[참조: Yang et al., 1990]. 사용된 마이크로포사체는 생물학적으로 불활성인 물질, 예를 들면, 텅스텐 또는 금 비드로 이루어진다.
랫트 및 마우스의 간, 피부 및 근육 조직을 포함한 선택된 기관에 생체내에서 충격을 가하였다[참조: Yang et al., 1990; Zelenin et al., 1991]. 총(gun)과 표적 기관 사이의 어떠한 간섭 조직도 제거하기 위해, 즉 생체외 처리하기 위해서는, 상기 조직 또는 세포를 외과적으로 노출시킬 필요가 있다. 다시, 특정한 유전자를 암호화하는 DNA를 상기 방법을 통하여 전달할 수 있으며, 이를 본 발명에 의해 혼입시킬 수 있다.
안티센스 올리고뉴클레오타이드
유전적 정보 플로우의 최종 결과는 단백질을 합성하는 것이다. DNA는 폴리머라제에 의해 메신저 RNA로 전사되고, 리보솜 상에서 해독되어 폴딩된 작용성 단백질을 생성시킨다. 따라서, 이러한 경로를 따라, 단백질 합성을 억제시킬 수 있는 몇 가지 단계가 있다. 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 본래의 DNA 세그먼트는 모든 포유류 DNA 쇄와 같이 2개의 쇄, 즉 수소 결합에 의해 함께 유지되는 센스 쇄 및 안티센스 쇄를 갖는다. 폴리펩타이드를 암호화하는 메신저 RNA는, DNA 티미딘이 우리딘으로 대체되는 것을 제외하고는 센스 DNA 쇄와 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 따라서, 합성 안티센스 뉴클레오타이드 서열은 mRNA와 결합하여 이러한 mRNA에 의해 암호화된 단백질의 발현을 억제할 것이다.
따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 mRNA에 표적화시키는 것이 단백질 합성을 중단시키는 한 가지 기전이므로, 이는 강력하고 표적화된 치료학적 접근법을 나타낸다. 예를 들면, 폴리갈락타우로나제 및 뮤스카린 유형 2 아세틸콜린 수용체의 합성은, 이들의 각각의 mRNA 서열에 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다(미국 특허 제5,739,119호 및 제5,759,829호; 각각의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨). 추가로, 핵 단백질 사이클린, 다중 약제 내성 유전자(MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 줄무늬 GABAA수용체 및 사람 EGF를 사용하여, 안티센스 억제 예들을 입증하였다[참조: Jaskulski et al., 1988;Vasanthakumar and Ahmed, 1989; Peris et al., 1998; 미국 특허 제5,801,154호; 미국 특허 제5,789,573호; 미국 특허 제5,718,709호 및 미국 특허 제5,610,288호; 각각의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 비정상적인 각종 세포 증식, 예를 들면, 암을 억제하여 이를 치료하는데 사용할 수 있는 안티센스 작제물이 또한 보고되었다(미국 특허 제5,747,470호; 제5,591,317호 및 제5,783,683호; 각각의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨).
따라서, 예시 양태에서는, 본 발명이 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보성 서열과 특이적으로 결합할 수 있는 서열 전부 또는 이의 일부을 포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 한 양태에서는, 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 DNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 또 다른 양태에서는, 올리고뉴클레오타이드가 RNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 제3의 양태에서는, 상기 올리고뉴클레오타이드가 포스포로티오화 변형된 주쇄를 포함하는 변형된 DNA이다. 제4의 양태에서는, 상기 올리고뉴클레오타이드 서열이 펩타이드 핵산 또는 이의 유도체를 포함한다. 각 경우에서, 바람직한 조성물은 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 부분과 상보적인, 더욱 바람직하게는 실질적으로 상보적인, 더욱 더 바람직하게는 완전히 상보적인 서열 영역을 포함한다.
소정의 유전자 서열에 특이적인 안티센스 조성물의 선별은 선택된 표적 서열(즉, 예시 예에서는, 랫트 및 사람 서열)에 관한 분석과, 2차 구조, Tm, 결합 에너지, 상대적 안정성에 관한 결정에 기초한 것이며, 안티센스 조성물은 이들이숙주 세포에서 표적 mRNA와의 특이적 결합을 저하 또는 억제시킬 수도 있는 이량체, 헤어핀 또는 기타 2차 구조를 형성하지 못하는 상대적인 능력에 기초하여 선별한다.
mRNA에 대한 고도의 바람직한 표적 영역은 AUG 해독 개시 코돈 영역 또는 그 근처 영역, 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보적인 서열이다. 이들 2차 구조 분석 및 표적 부위 선별 고려 사항들은 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어(Rychlik, 1997)의 v.4 및 BLASTN 2.0.5 알고리듬 소프트웨어(Altschul et al., 1997)를 사용하여 수행한다.
MPG(27개 잔기)로 명명된 짧은 펩타이드 벡터를 이용하는 안티센스 전달 방법의 사용이 또한 고려된다. MPG 펩타이드는 HIV gp41의 융합 서열로부터 유도된 소수성 도메인과 SV40 T-항원의 핵 국재 서열로부터 유도된 친수성 도메인을 함유한다[참조: Morris et al., 1997]. MPG 펩타이드의 몇몇 분자가 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 코팅하고, 이를 비교적 고효율(90%)로 1시간 미만 내에 배양된 포유류 세포 내로 전달할 수 있다는 사실이 입증되었다. 추가로, MPG와의 상호작용은 뉴클레아제에 대한 올리고뉴클레오타이드의 안정성과 혈장 막을 가로지르는 능력 모두를 상당히 증가시킨다[참조: Morris et al., 1997].
리보자임
핵산을 촉매 작용시키는데 단백질이 전통적으로 사용되어 왔지만, 또 다른 부류의 거대분자가 이러한 시도에 유용한 것으로 나타났다. 리보자임은 핵산을 부위 특이적 방식으로 절단시키는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 보유하고 있는 특이적고도 촉매적인 도메인을 갖는다[참조: Kim and Cech, 1987; Gerlach et al., 1987; Forster and Symon, 1987]. 예를 들면, 다수의 리보자임은 포스포에스테르 전이 반응을 고 특이도로 가속화시키면서, 종종 올리고뉴클레오타이드 기질 내의 수개의 포스포에스테르 중 단지 1개만을 절단시킨다[참조: Cech et al., 1981; Michel and Westhof, 1990; Reinhold-Hurek and Shub, 1992]. 이러한 특이성은, 상기 기질이 특이적 염기쌍 형성 상호작용을 통하여, 화학적 반응에 앞서 리보자임의 내부 안내 서열("IGS")과 결합되어야 하는 요구 조건으로부터 비롯된 것이다.
리보자임 촉매작용은 주로, 핵산과 관련된 서열 특이적 절단/연결 반응의 일부로서 관찰되었다[참조: Joyce, 1989; Cech et al., 1981]. 예를 들면, 미국 특허 제5,354,855호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에는 특정한 리보자임이, 공지된 리보뉴클레아제 보다 큰 서열 특이성을 지니고 DNA 제한 효소에 근접하는 서열 특이성을 지닌 엔도뉴클레아제로서 작용할 수 있다고 보고되어 있다. 따라서, 유전자 발현의 서열 특이적 리보자임 매개된 억제가 치료학적 적용 분야에 특히 적합할 수 있다[참조: Scanlon et al., 1991; Sarver et al., 1990]. 최근에는, 리보자임이 이들이 적용된 몇몇 세포주에서 유전적 변화를 유발시켰으며; 이와 같이 변화된 유전자에는 온코진(oncogene) H-ras, c-fos및 HIV의 유전자가 포함된다고 보고되었다. 이러한 대부분의 작업은 특이적 리보자임에 의해 절단되는 특이적 돌연변이체 코돈에 기초한, 표적 mRNA의 변형과 관련이 있다.
천연 효소적 RNA의 6개 기본 변종이 현재 공지되어 있다. 각각은 생리적 조건 하에서 RNA 포스포디에스테르 결합의 가수분해를 트랜스로 촉매함으로써 기타 RNA 분자를 절단할 수 있다. 일반적으로, 효소적 핵산은 먼저 표적 RNA와 결합함으로써 작용한다. 이러한 결합은 표적 RNA를 절단시키는 작용을 하는 분자의 효소적 부분과 밀접하게 유지되는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통하여 이루어진다. 따라서, 효소적 핵산이 먼저 인식된 다음, 상보성 염기쌍 형성을 통하여 표적 RNA에 결합되고, 일단 정확한 위치에 결합되면, 이는 효소적으로 작용하여 표적 RNA를 절단시킨다. 이러한 표적 RNA의 전략적 절단으로 인해, 암호화된 단백질의 합성을 지시하는 이의 능력이 파괴될 것이다. 효소적 핵산을 결합시키고 이의 RNA 표적을 절단시킨 후, 이를 상기 RNA로부터 방출시켜 또 다른 표적에 대해 조사한 다음, 반복적으로 결합시키고, 새로운 표적을 절단시킬 수 있다.
리보자임의 효소적 특성은 많은 기술, 예를 들면, 안티센스 기술(여기서는 핵산 분자가 단순히 핵산 표적과 결합하여 이의 해독을 차단시킨다)에 비해 유리한데, 이는 치료학적 처치에 영향을 미치는데 필요한 리보자임의 농도가 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 농도 보다 낮기 때문이다. 이러한 이점은 리보자임이 효소적으로 작용하는 능력을 반영해준다. 따라서, 단일 리보자임 분자는 많은 표적 RNA 분자를 절단시킬 수 있다. 또한, 리보자임은 고도로 특이적인 억제제인데, 억제 특이도는 표적 RNA에 대한 결합의 염기쌍 형성 기전 뿐만 아니라 표적 RNA 절단 기전에 좌우된다. 절단 부위 근처의 염기-치환 또는 단일 미스매치는 리보자임의 촉매 활성을 완전히 없앨 수 있다. 안티센스 분자 내의 유사한 미스매치는 이들의작용을 방해하지 못한다[참조: Woolf et al., 1992]. 따라서, 리보자임의 작용 특이성은 동일한 RNA 부위를 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드 보다 더 크다.
효소적 핵산 분자는 해머헤드(hammerhead), 헤어핀, δ형 간염 바이러스, 그룹 I 인트론 또는 RNAseP RNA(RNA 안내 서열과 연관됨) 또는 뉴로스포라(Neurospora) VS RNA 모티프로 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 예가 문헌[참조: Rossi et al., 1992]에 기재되어 있다. 헤어핀 모티프의 예는 문헌[참조: Hampel et al., Eur. Pat. Appl. Publ. No. EP 0360257; Hampel and Tritz (1989), Hampel et al., (1990) 및 미국 특허 제5,631,359호(본원에 참조문헌으로써 특정하게 혼입됨)]에 기재되어 있다. δ형 간염 바이러스 모티프의 예는 문헌[참조: Perrotta and Been (1992)]에 기재되어 있고; RNAseP RNA 모티프의 예는 문헌[참조: Guerrier-Takada et al., (1983)]에 기재되어 있으며; 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프는 문헌[참조: Saville and Collins, 1990; Saville and Collins, 1991; Collins and Olive, 1993]에 기재되어 있고; 그룹 I 인트론의 예는 미국 특허 제4,987,071호(본원에 참조문헌으로써 특정하게 혼입됨)에 기재되어 있다. 본 발명의 효소적 핵산 분자에 중요한 것은 모두, 표적 유전자 RNA 영역 하나 이상에 상보적인 특이적 기질 결합 부위를 가지며, 또한 해당 분자에 RNA 절단 활성을 부여해주는 기질 결합 부위 내에 또는 이를 둘러싸고 있는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다. 따라서, 리보자임 작제물은 본원에 언급된 특이적 모티프로 제한할 필요가 없다.
특정 양태에서는, 목적하는 표적, 예를 들면, 본원에 기재된 서열 중 하나의RNA에 대한 높은 특이도를 나타내는 효소적 절단 제제를 생성시키는 것이 중요할 수 있다. 상기 효소적 핵산 분자를 표적 mRNA의 고도로 항상성 서열 영역에 표적화시키는 것이 바람직하다. 이러한 효소적 핵산 분자는 필요에 따라 특이적 세포에 외인적으로 전달할 수 있다. 또 다른 한편, 리보자임을 특이적 세포에 전달되는 DNA 또는 RNA 벡터로부터 발현시킬 수 있다.
작은 효소적 핵산 모티프(예: 해머헤드 또는 헤어핀 구조의 모티프)를 또한 외인적 전달에 사용할 수도 있다. 이들 분자의 간단한 구조는 mRNA 구조의 표적화 영역을 침입하는 효소적 핵산의 능력을 증대시킨다. 또 다른 한편, 촉매적 RNA 분자를 진핵성 프로모터로부터의 세포 내에서 발현시킬 수 있다[참조: Scanlon et al., 1991; Kashani-Sabet et al., 1992; Dropulic et al, 1992; Weerasinghe et al., 1991; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Sarver et al., 1990]. 당업자는 어떠한 리보자임도 적당한 DNA 벡터로부터의 진핵성 세포 내에서 발현할 수 있다는 것을 인지한다. 이러한 리보자임의 활성은 제2의 리보자임에 의해 1차 전사체로부터 이들이 방출됨으로써 증대될 수 있다(국제공개공보 WO 93/23569 및 WO 94/02595, 둘다 본원에 참조문헌으로써 삽입됨; Ohkawa et al., 1992; Taira et al., 1991; and Ventura et al., 1993).
리보자임을 표적 세포에 직접 부가하거나, 또는 양이온성 지질, 지질 복합체와 복합체를 형성할 수 있거나, 리포좀 내에 패키징되거나 또는 기타 방법으로 표적 세포에 전달할 수 있다. 이러한 RNA 또는 RNA 복합체는, 이들을 바이오폴리머에 혼입시키거나 홉입시키지 않고서, 주사, 에어로솔 흡입, 주입 펌프 또는 스텐트를 통하여 생체외 또는 생체내에서 관련 조직에 국소 투여할 수 있다.
리보자임은 국제공개공보 WO 93/23569 및 WO 94/02595(본원에 참조문헌으로써 특정하게 혼입됨)에 기재된 바와 같이 고안하고, 합성하여 기재된 바와 같이 시험관내 및 생체내에서 시험할 수 있다. 이러한 리보자임은 전달을 위해 최적화시킬 수도 있다. 특정 예가 제공되긴 하였지만, 당업자는 기타 종에서의 등가의 RNA 표적이 필요에 따라 이용될 수 있다는 것을 인식하고 있다.
해머헤드 또는 헤어핀 리보자임은 리보자임 서열이 적당한 2차 구조 내로 폴딩하는지를 평가해주는 컴퓨터 폴딩(Jaeger et al., 1989)에 의해 개별적으로 분석할 수 있다. 결합 암(arm)과 촉매적 코어(core) 간의 바람직하지 못한 분자내 상호작용을 나타내는 리보자임은 고려 대상으로부터 제외시킨다. 다양한 결합 암의 길이는 활성을 최적화시키도록 선택할 수 있다. 일반적으로, 각 암 상의 5개 이상의 염기가 표적 RNA와 결합되거나 이와 상호작용할 수 있다.
해머헤드 또는 헤어핀 모티프의 리보자임은 mRNA 메시지 내의 각종 부위에 어닐링하도록 고안할 수 있으며, 이는 화학적으로 합성할 수 있다. 사용된 합성 방법은 문헌[참조: Usman et al. (1987) and Scaringe et al. (1990)]에 기재된 바와 같이 정상적인 RNA 합성에 대한 과정을 따르며, 5'-말단에서의 디메톡시트리틸 및 3'-말단에서의 포스포르아미다이트와 같이, 통상의 핵산 보호 및 커플링 그룹을 사용한다. 평균 단계별 커플링 수율은 전형적으로 >98%이다. 헤어핀 리보자임은 두 부분으로 합성할 수 있고, 이를 어닐링시켜 활성 리보자임을 재작제할 수 있다[참조: Chowrira and Burke, 1992]. 리보자임은, 뉴클레아제 내성 그룹, 예를 들면, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-o-메틸, 2'-H를 사용하여 변형시킴으로써, 안정성을 증진시키기 위해 연장적으로 변형시킬 수 있다[참조: Usman and Cedergren, 1992]. 리보자임은 일반적인 방법을 이용하는 겔 전기영동 또는 고압 액체 크로마토그래피에 의해 정제하고 물에 재현탁시킬 수 있다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 암의 길이를 변화시키거나, 혈청 리보뉴클레아제에 의한 이들의 분해를 방지해주는 변형[참조: 국제공개공보 WO 92/07065; Perrault et al., 1990; Pieken et al., 1991; Usman and Cedergren, 1992; 국제공개공보 WO 93/15187; WO 91/03162; 유럽 공개공보 제92110298호; 미국 특허 제5,334,711호 및 국제공개공보 WO 94/13688; 이들에는 효소적 DNA 분자의 당 잔기에 대해 만들어질 수 있는 각종 화학적 변형이 기재되어 있다], 이들의 세포 내에서의 효능을 증진시키는 변형, 및 RNA 합성 시간을 단축시키고 화학적 요구사항을 감소시키기 위한 스템 II 염기의 제거를 수행하면서 리보자임을 화학적으로 합성함으로써, 최적화시킬 수 있다.
국제공개공보 WO 94/02595(Sullivan et al.)에는 효소적 RNA 분자를 전달하는 일반적인 방법이 기재되어 있다. 리보자임은, 리포좀 내의 캡슐화, 전기영동, 또는 기타 비히클, 예를 들면, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생접착성 미세구 내로의 혼입을 포함하지만 이에 제한되지 않는, 당업자에게 공지된 각종 방법에 의해 세포에 투여할 수 있다. 몇몇 징후의 경우에는, 리보자임을, 전술된 비히클을 사용하거나 사용하지 않으면서 세포 또는 조직에 직접 생체외 전달할 수 있다. 또 다른 한편으론, RNA/비히클 조합물을 직접 흡입시키거나, 직접 주사하거나, 또는 카테터, 주입용 펌프 또는 스텐트를 사용함으로써 국부적으로 전달할 수 있다. 기타 전달 경로에는 혈관내, 근육내, 피하 또는 관절 주사, 에어로졸 흡입, 경구(정제 또는 환제 형태), 국소, 전신, 안내, 복강내 및/또는 포막내 전달이 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 리보자임 전달 및 투여에 관한 보다 상세한 내역이 국제공개공보 WO 94/02595 및 WO 93/23569(각각 본원에 참조문헌으로써 특정하게 삽입됨)에 제공되어 있다.
고농도의 리보자임을 세포 내에 축적시키는 또 다른 방법은 리보자임 암호화 서열을 DNA 발현 벡터 내로 혼입시키는 것이다. 리보자임 서열의 전사는 진핵성 RNA 폴리머라제 I(pol I), RNA 폴리머라제 II(pol II) 또는 RNA 폴리머라제 III(pol III)에 대한 프로모터로부터 구동시킨다. pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사체는 모든 세포에서 고수준으로 발현될 것이며; 소정의 세포 유형에서의 소정의 pol II 프로모터의 수준은 이로써 존재하는 유전자 조절 서열[인핸서, 사일런서(silencer) 등]의 종류에 좌우된다. 원핵성 RNA 폴리머라제 프로모터를 사용할 수도 있는데, 이러한 원핵성 RNA 폴리머라제 효소는 적당한 세포에서 발현되어야 한다[참조: Elroy-Stein and Moss, 1990; Gao and Huang, 1993; Lieber et al., 1993; Zhou et al., 1990]. 이러한 프로모터로부터 발현된 리보자임은 포유류 세포에서 작용할 수 있다[참조: Kashani-Saber et al., 1992; Ojwang et al., 1992; Chen et al., 1992; Yu et al., 1993; L'Huillier et al., 1992; Lisziewicz et al., 1993]. 이러한 전사 단위는, 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스성 DNA 벡터(예; 아데노바이러스 또는 아데노 관련 벡터) 또는 바이러스성 RNA 벡터[예: 레트로바이러스성, 셈리키 포레스트(semliki forest) 바이러스, 신드비스(sindbis) 바이러스 벡터]를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 포유류 세포 내로 도입하기 위한 각종 벡터 내로 혼입할 수 있다.
리보자임을 질병에 걸린 세포 내의 유전자 부동 및 돌연변이를 검사하기 위한 진단 도구로서 사용할 수 있다. 이들은 또한, 표적 RNA 분자의 수준을 평가하기 위해 사용할 수도 있다. 리보자임 활성과 표적 RNA의 구조 간의 밀접한 관계로 인해, 표적 RNA의 염기쌍 형성과 이의 3차원 구조를 변화시키는 분자의 모든 영역에서의 돌연변이를 검출할 수 있게 된다. 다중 리보자임을 사용함으로써, 시험관내 뿐만 아니라 세포 및 조직 내에서 RNA 구조와 기능에 중요한 뉴클레오타이드 변화를 지도화할 수 있다. 리보자임을 이용하여 표적 RNA를 절단시켜, 유전자 발현을 억제시킬 수 있고, 질병 진행 과정에 있어서의 특이화된 유전자 생성물의 역할(본질적)을 규정할 수 있다. 이러한 방식으로, 기타 유전적 표적을 해당 질병의 중요한 매개인자로서 규정할 수 있다. 이들 연구 결과, 조합 치료법(예를 들면, 상이한 유전자에 표적화된 다중 리보자임, 공지된 작은 분자 억제제와 커플링된 리보자임, 또는 리보자임 및/또는 기타 화학적 또는 생물학적 분자의 조합물로의 간헐적인 치료)의 가능성을 부여함으로써 질병의 진행을 보다 잘 치료할 수 있을 것이다. 리보자임의 기타 시험관내 용도가 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 IL-5 관련 조건과 연관된 mRNA의 존재 검출이 포함된다. 이러한 RNA는, 표준 방법을 이용하여 리보자임으로 처리한 후의 절단 생성물의 존재 여부를 결정함으로써 검출한다.
펩타이드 핵산
특정 양태에서는, 본 발명의 방법을 실시하는데 있어서의 펩타이드 핵산(PNA)의 용도가 고려된다. PNA는 뉴클레오염기를 슈도펩타이드(pseudopeptide) 주쇄에 부착시킨 DNA 모사체이다[참조: Good and Nielsen, 1997]. PNA는 전통적으로 RNA 또는 DNA에 사용되어 왔던 수 많은 방법을 활용할 수 있다. 종종 PNA 서열은 상응하는 RNA 또는 DNA 서열 보다 더 우수하게 특정 기술에서 수행되고, RNA 또는 DNA에 내재되지 않은 유용성을 지니고 있다. PNA의 제조 방법, 특징 및 사용 방법에 관한 고찰은 문헌[참조: Corey(1997); 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 제공되어 있다. 그 자체로서, 특정 양태에서는, ACE mRNA 서열의 하나 이상의 부분에 상보적인 PNA 서열을 제조할 수 있고, 이러한 PNA 조성물을 사용하여, ACE-특이적 mRNA의 해독을 조절, 변화, 감소 또는 저하시킴으로써, 이러한 PNA 조성물이 투여된 숙주 세포에서의 ACE 활성 수준을 변화시킬 수 있다.
PNA는 DNA의 정상적인 포스포디에스테르 주쇄를 대체하는 2-아미노에틸-글리신 연결을 갖고 있다[참조: Nielsen et al., 1991; Hanvery et al., 1992; Hyrup and Nielsen, 1996; Neilsen, 1996]. 이러한 화학은 3가지 중요한 결과를 가져다 준다: 첫째, DNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드와는 달리, PNA는 중성 분자이고; 둘째, PNA는 입체선택적 합성을 개발할 필요가 없는 비키랄성이며; 셋째, PNA 합성은 변형된 메리필드(Merrifield) 방법을 포함한 기타 방법이 사용되어 왔지만[참조: Christensen et al., 1995], 고체 상 펩타이드 합성을 위한 표준Boc[참조: Dueholm et al., 1994] 또는 Fmoc[참조: Thomson et al., 1995] 프로토콜을 이용한다는 것이다.
PNA 단량체 또는 기성(ready-made) 올리고머는 다음 공급처[PerSeptive Biosystems; Framingham, MA]로부터 시판되고 있다. Boc 또는 Fmoc 프로토콜에 의한 PNA 합성은 수동 또는 자동화 프로토콜을 이용하는 간단한 방법이다[참조: Norton et al., 1995]. 수동 프로토콜은 화학적으로 변형된 PNA를 생성시키거나 밀접하게 관련된 PNA 계열을 동시에 합성하게 해준다.
펩타이드 합성을 이용하는 경우처럼, 특정한 PNA 합성의 성공 여부는 선택된 서열의 특성에 좌우될 것이다. 예를 들면, 이론상 PNA를 뉴클레오타이드 염기의 어떠한 조합물에 혼입시킬 수 있지만, 인접한 퓨린이 존재하게 되면, 생성물 내의 하나 이상의 잔기가 결실될 수 있다. 이러한 어려움을 예상하여, 인접한 퓨린을 갖는 PNA를 생성하는데 있어서, 비효율적으로 부가될 것으로 보이는 잔기의 커플링을 반복해야만 한다고 제안하고 있다. 그 다음, 역상 고압 액체 크로마토그래피[참조: Norton et al., 1995]하여 PNA를 정제하여, 펩타이드 합성 동안에 관찰된 것과 유사한 생성물 수율과 순도를 제공해야 한다.
소정의 적용 분야를 위해 PNA를 변형시키는 것은, 고체 상 합성 동안에 아미노산을 커플링시키거나 또는 카복실산 그룹을 함유하는 화합물을 노출된 N-말단 아민에 부착시킴으로써 수행할 수 있다. 또 다른 한편, PNA는 도입된 리신 또는 시스테인에 커플링시킴으로써 합성 후에 변형시킬 수 있다. PNA 변형 용이성으로 인해, 보다 우수한 용해도를 위해 최적화시키거나 특이적 기능상 요구 조건을 위해최적화시키는 것이 촉진된다. 일단 합성되면, PNA의 실체 및 이들의 유도체는 질량 분광법으로 확인할 수 있다. 몇몇 연구가 이루어져서 PNA 변형에 활용되었다[참조: Norton et al., 1995; Haaima et al., 1996; Stetsenko et al., 1996; Petersen et al., 1995; Ulman et al., 1996; Koch et al., 1995; Orum et al., 1995; Footer et al., 1996; Griffith et al., 1995; Kremsky et al., 1996; Pardridge et al., 1995; Boffa et al., 1995; Landsdorp et al., 1996; Gambacorti-Passerini et al., 1996; Armitage et al., 1997; Seeger et al., 1997; Ruskowski et al., 1997]. 미국 특허 제5,700,922호에는 PNA-DNA-PNA 키메릭 분자, 및 진단, 유기체에서의 단백질 조절 및 치료에 감수성인 질환을 치료하는데 있어서의 이들의 용도가 기재되어 있다.
음전하를 띤 연결물을 함유하는 DNA 및 RNA와는 달리, PNA 주쇄는 중성이다. 이러한 극적인 변화에도 불구하고, PNA는 왓슨-크릭(Watson-Crick) 쌍형성에 의해 상보적 DNA 및 RNA를 인식하는데[참조: Egholm et al., 1993], 이로써 문헌[참조: Nielsen et al., 1991]에 의해 개시 모델링을 확인하였다. PNA에는 3' 내지 5' 극성이 결여되어 있고, 병렬식 또는 직렬식으로 결합할 수 있는데, 직렬식이 바람직하다[참조: Egholm et al., 1993].
DNA 올리고뉴클레오타이드를 DNA 및 RNA에 하이브리드화시키는 것은, 상보쇄의 음전하를 띤 포스페이트 주쇄 간의 정전기 반발력으로 인해 탈안정화된다. 이와는 달리, PNA-DNA 또는 PNA-RNA 이본쇄 내에는 전하 반발력이 존재하지 않기 때문에, 융점(Tm)이 증가되고, 1가 또는 2가 양이온의 농도에 대한 Tm의 의존도가 저하된다[참조; Nielsen et al., 1991]. 하이브리드화의 속도와 친화도를 증대시키는 것이 중요한데, 이는 이것이, 이완된 이본쇄 DNA 내의 상보적 서열의 쇄 침입을 수행할 수 있는 PNA의 놀라운 능력에 관여하기 때문이다. 또한, 역방향 반복서열에서의 효율적인 하이브리드화는, PNA가 이본쇄 DNA 내에서 2차 구조를 효율적으로 인식할 수 있다는 것을 제시하고 있다. 인식 증대는 또한, 표면 상에 고정화된 PNA를 이용하여 이루어지는데, 왕(Wang) 등은 지지체 결합된 PNA가 하이브리드화 사건을 검출하는데 사용될 수 있다는 것을 밝혀내었다[참조: Wang et al., 1996].
PNA를 상보성 서열에 단단하게 결합시키면, PNA 인식 서열 특이성은 저하시키면서 유사한(동일하지는 않음) 서열과의 결합이 증가될 것으로 예상될 수 있다. 그러나, DNA 하이브리드화를 이용하는 경우처럼, 선별적인 인식은 올리고머 길이와 항온 배양 온도 간의 균형을 맞춤으로써 달성할 수 있다. 더우기, PNA의 선별적인 하이브리드화는, DNA-DNA 하이브리드화 보다는 염기 미스매치에 덜 저항하는 PNA-DNA 하이브리드화에 의해 고무된다. 예를 들면, 16pb PNA-DNA 이본쇄 내의 단일 미스매치는 Tm을 15℃ 이하 정도 강하시킬 수 있다[참조: Egholm et al., 1993]. 이러한 높은 수준의 강하로 인해, 점 돌연변이를 분석하기 위한 몇몇 PNA-이용된 전략이 개발되었다[참조: Wang et al., 1996; Carlsson et al., 1996; Thiede et al., 1996; Webb and Hurskainen, 1996; Perry-O'Keefe et al., 1996].
고 친화도 결합은 분자상 인식과 PNA에 대한 새로운 적용 분야 개발에 명백한 이점을 제공해준다. 예를 들면, 11-13개 뉴클레오타이드 PNA는, 필수 RNA 주형을 사용하여 텔로머 말단을 연장시켜 주는 리보뉴클레오-단백질인 텔로머라제의 활성을 억제하는 반면, 유사한 DNA 올리고머는 그렇치 못하다[참조: Norton et al., 1996].
중성 PNA는 유사한 DNA 올리고머 보다 더 소수성이므로, 특히 PNA의 퓨린 함량이 높거나 PNA가 2차 구조를 형성할 잠재력을 지니고 있는 경우에는, 이들을 중성 pH에서 가용화시키는 것이 어려울 수 있다. 이들의 용해도는, 하나 이상의 양성 전하를 PNA 말단에 부착시킴으로써 증진시킬 수 있다[참조: Nielsen et al., 1991].
알프레이(Allfrey)와 그의 동료들의 발견은 쇄 침입이 염색체성 DNA 내의 서열에서 자발적으로 이루어질 것이고 제안하고 있다[참조: Boffa et al., 1995; Boffa et al., 1996]. 이들 연구는 PNA를 뉴클레오타이드 CAG의 삼중 반복서열에 표적화시켰고, 이러한 인식을 이용하여 전사 활성 DNA을 정제하였고[참조: Boffa et al., 1995] 전사를 억제하였다[참조: Boffa et al., 1996]. 이들 결과는, PNA가 세포 내에 전달될 수 있는 경우, 이는 유전자 발현의 일반적인 서열-특이적 조절 인자가 될 잠재력을 지닐 것이라는 사실을 제안해준다. 안티센스 및 안티-유전자 제제로서의 PNA의 용도에 관한 연구 및 고찰에는 다음 문헌이 포함된다[참조: Nielsen et al., 1993b; Hanvey et al., 1992; and Good and Nielsen, 1997]. 코펠후스(Koppelhus)(1997) 등은 PNA를 사용하여 HIV-1 역전사를 억제시켰는데, 이는 PNA가 항바이러스 치료에 사용될 수 있다는 것을 보여준다.
PNA의 안티센스 결합 성질을 특징화하는 방법이 문헌[참조: Rose (1993) and Jensen et al.(1997)]에 논의되어 있다. 로즈(Rose)는 모세관 겔 전기영동을 이용하여 PNA가 이의 상보성 올리고뉴클레오타이드와 결합하는지를 결정하는데, 이로써 상대적 결합 역학과 화학량론을 측정한다. 유사한 유형의 측정법이 BIAcore™ 기술을 이용하여 옌센(Jensen) 등에 의해 만들어졌다.
PNA의 기타 적용 분야에는 DNA 쇄 침입[참조: Nielsen et al., 1991], 안티센스 억제[참조: Hanvey et al., 1992], 돌연변이 분석[참조: Orum et al., 1993], 전사 인핸서[참조: Mollegaard et al., 1994], 핵산 정제[참조: Orum et al., 1995], 전사적 활성 유전자의 분리[참조: Boffa et al., 1995], 전사 인자 결합 차단[참조: Vickers et al., 1995], 게놈 절단[참조: Veselkov et al., 1996], 바이오센서[참조: Wang et al., 1996], 원위치 하이브리드화[참조: Thisted et al., 1996] 및 서던 블롯팅에 대한 대체 방안[참조: Perry-O'Keefe, 1996]에서의 용도가 포함된다.
폴리펩타이드 조성물
기타 국면에서는, 본 발명이 폴리펩타이드 조성물을 제공한다. 일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드는 포유류 종으로부터 유도된 분리된 폴리펩타이드(또는 이의 에피토프, 변이체 또는 활성 단편)일 것이다. 바람직하게는, 당해 폴리펩타이드는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 적당한 엄중 조건 하에 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화하는 서열에 의해 암호화된다. 또다른 한편, 당해 폴리펩타이드는 본원에 기재된 아미노산 서열로부터의 연속되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 본원에 기재된 완전한 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로서 규정될 수 있다.
본 발명에서는, 폴리펩타이드 조성물이 또한, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히 서열 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 및 488에 제시된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 또는 이의 활성 단편, 변이체 또는 생물학적 작용상 등가물에 대해 생성된 항체와 면역학적으로 반응성인 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다.
마찬가지로, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489에 제시된 연속되는 하나 이상의 핵산 서열, 또는 이의 활성 단편, 변이체, 또는 적당히 엄격하거나 상당히 엄격한 조건 하에서 이들 서열의 하나 이상과 하이브리드화하는 하나 이상의 핵산 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 폴리펩타이드와 면역학적으로 반응성인 항체를 유도할 수 있는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해된다. 특히 예시되는 폴리펩타이드에는 서열 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 및 488에 제시된 아미노산 서열이 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 폴리펩타이드의 활성 단편에는 통상적인 기술, 예를 들면, 돌연변이 유발, 부가, 결실 또는 치환에 의해 변형되는 폴리펩타이드의 전부 또는 일부분이 포함되지만, 이러한 활성 단편은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 구조, 기능, 항원성 등을 나타낸다.
특정의 예시 양태에서는, 본 발명의 폴리펩타이드가 본원에 기재된 바와 같은 유방 종양 단백질 또는 이의 변이체의 적어도 면역원성 부분을 포함할 것이다. 상기 인지된 바와 같이, "유방 종양 단백질"은 유방 종양 세포에 의해 발현되는 단백질이다. 유방 종양 단백질인 단백질은 또한, 면역검정(예: ELISA) 내에서 유방암에 걸린 환자로부터의 항혈청과 검출 가능한 수준으로 반응한다. 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드는 어떠한 길이일 수 있다. 본래의 단백질로부터 유도된 부가의 서열 및/또는 이중 서열이 존재할 수 있고, 이러한 서열은 추가의 면역원성 또는 항원성 특성을 보유할 수 있다(반드시 필요한 것은 아니다).
본원에 사용된 바와 같은 "면역원성 부분"은 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체에 의해 인식되는(즉, 특이적으로 결합되는) 단백질의 일정 부분이다. 이러한 면역원성 부분은 일반적으로, 유방 종양 단백질 또는 이의 변이체의 5개 이상, 보다 바람직하게는 10개 이상, 더욱 더 바람직하게는 20개 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 특정의 바람직한 면역원성 부분에는 N-말단 리더 서열 및/또는 막관통 도메인이 결실된 펩타이드가 포함된다. 기타 바람직한 면역원성 부분은 성숙한 단백질에 비해 작은 N- 및/또는 C-말단 결실물(예를 들면, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)을 함유할 수 있다.
면역원성 부분은 일반적으로, 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247(Raven Press, 1993] 및 이에 인용된 참조문헌에 요약된 바와 같은 널리 공지된 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 이러한 기술에는 항원 특이적 항체, 항혈청 및/또는 T-세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 스크리닝하는것이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같은 항혈청 및 항체는 이들이 항원과 특이적으로 결합되는 경우(즉, 이들이 ELISA 또는 기타 면역검정에서 단백질과 반응하고, 관련되지 않은 단백질과는 검출 가능한 수준으로 반응하지 않을 경우)에 "항원 특이적"이다. 이러한 항혈청 및 항체는 널리 공지된 기술을 사용하고, 본원에 기재된 바와 같이 제조할 수 있다. 본래의 유방 종양 단백질의 면역원성 부분은 완전한 길이의 폴리펩타이드 보다 실질적으로 덜하지 않는 수준으로 상기 항혈청 및/또는 T-세포와 반응하는 부분이다(예를 들면, ELISA 및/또는 T-세포 반응성 검정으로 이루어짐). 이러한 면역원성 부분은 상기 검정 내에서 완전한 길이의 폴리펩타이드의 반응성과 유사하거나 이보다 큰 수준으로 반응할 수 있다. 이러한 스크린은 일반적으로, 당업자에게 널리 공지된 방법, 예를 들면, 문헌[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재된 바와 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드를 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있고, 이를 환자 혈청과 접촉시켜 이러한 혈청 내의 항체가 상기 고정화된 폴리펩타이드와 결합할 수 있게 한다. 결합되지 않은 혈청을 제거한 다음, 예를 들면,125I-표지된 단백질 A를 사용하여 결합된 항체를 검출할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 조성물은 본래의 유방 종양 단백질의 변이체를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 폴리펩타이드 "변이체"는 폴리펩타이드의 면역원성을 실질적으로 저하시키지 않는, 하나 이상의 치환, 결실, 부가 및/또는삽입을 지니고 있다는 점에서 본래의 유방 종양 단백질과 상이한 폴리펩타이드가다. 달리 말하면, 항원 특이적 항혈청과 반응하는 변이체의 능력은 본래의 단백질에 비해 증진되거나 변하지 않을 수 있거나, 또는 본래의 단백질에 비해 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만 정도 저하될 수 있다. 이러한 변이체는 일반적으로, 상기 폴리펩타이드 서열 중 하나를 변형시킨 다음, 이와 같이 변형된 폴리펩타이드와, 본원에 기재된 바와 같은 항원 특이적 항체 또는 항혈청과의 반응성을 평가함으로써 동정할 수 있다. 바람직한 변이체에는 하나 이상의 부분, 예를 들면, N-말단 리더 서열 또는 막관통 도메인을 제거시킨 변이체가 포함된다. 기타 바람직한 변이체에는 작은 부분(예를 들면, 1-30 아미노산, 바람직하게는 5-15 아미노산)을 성숙한 단백질의 N- 및/또는 C-말단으로부터 제거시킨 변이체가 포함된다.
본 발명에 의해 포괄된 폴리펩타이드 변이체에는 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드와 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일률(상기 언급된 바와 같이 결정됨)을 나타내는 변이체가 포함된다.
바람직하게는, 변이체는 보존적 치환물을 함유한다. "보존적 치환"은 하나의 아미노산을 유사한 특성을 지니고 있는 또 다른 아미노산으로 대체하는 것이어서, 펩타이드 화학 분야의 숙련인은 이러한 폴리펩타이드의 2차 구조와 수치료 성질이 실질적으로 변화되지 않는다고 예상할 것이다. 아미노산 치환은 일반적으로, 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양친매성 성질에 있어서의 유사성에 근거하여 이루어질 수 있다. 예를 들면, 음전하를 띤 아미노산에는 아스파르트산 및 글루탐산이 포함되고; 양전하를 띤 아미노산에는 리신 및 아르기닌이 포함되며; 전하를 띠지 않는 극성 헤드 그룹을 가지고 유사한 친수성 값을 갖는 아미노산에는 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신이 포함된다. 보존적 변화를 나타낼 수 있는 기타 그룹의 아미노산에는 다음이 포함된다: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his 및 (5) phe, tyr, trp, his. 변이체는 또한, 비-보존적 변화를 가질 수도 있다. 바람직한 양태에서는, 변이체 폴리펩타이드는 5개 이하의 아미노산을 치환, 결실 또는 부가시킴으로써 본래의 서열과 상이하다. 변이체는 또한, 예를 들면, 해당 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 양친매성 성질에 최소한의 영향을 미치는 아미노산을 결실 또는 부가함으로써 변형시킬 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 폴리펩타이드는 해당 단백질의 전이를 해독과 동시에 또는 해독 후에 지시하는, 이러한 단백질의 N-말단부에 시그날(또는 리더) 서열을 포함할 수 있다. 상기 폴리펩타이드는 또한, 이러한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정을 용이하게 하기 위해, 또는 고체 지지체에 대한 상기 폴리펩타이드의 결합을 증진시키기 위해 링커 또는 기타 서열(예: 폴리-His)에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합시킬 수 있다.
폴리펩타이드는 널리 공지된 각종 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 상기 언급된 바와 같은 DNA 서열에 의해 암호화된 재조합 폴리펩타이드는 당업자에게 널리 공지된 각종 어떠한 발현 벡터를 사용해서도 상기 DNA 서열로부터 용이하게 제조할 수 있다. 재조합 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 분자를 함유하는 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 어떠한 적당한 숙주 세포에서도 발현을 달성할 수 있다. 적합한 숙주 세포에는 원핵생물, 효모 및 고등 진핵성 세포, 예를 들면, 포유류 세포 및 식물 세포가 포함된다. 바람직하게는, 이용된 숙주 세포는 이. 콜라이, 효모 또는 포유류 세포주, 예를 들면, COS 또는 CHO이다. 재조합 폴리펩타이드 또는 단백질을 배양 배지 내로 분비시키는 적합한 숙주/벡터 시스템으로부터의 상등액을 먼저, 시판용 필터를 사용하여 농축시킬 수 있다. 농축 후, 이러한 농축액을 적합한 정제용 매트릭스, 예를 들면, 친화성 매트릭스 또는 이온 교환 수지에 적용할 수 있다. 최종적으로, 하나 이상의 역 상 HPLC 단계를 이용하여 재조합 폴리펩타이드를 추가로 정제할 수 있다.
당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여, 합성 방법에 의해 약 100개 미만의 아미노산, 일반적으로 약 50개 미만의 아미노산을 갖는 부분 및 기타 변이체를 생성시킬 수도 있다. 예를 들면, 이러한 폴리펩타이드는, 성장하고 있는 아미노산 쇄에 아미노산을 순차적으로 부가하는 메리필드 고체 상 합성 방법과 같은, 시판용 고체 상 기술을 사용하여 합성할 수 있다[참조: Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동화 합성 장비가 공급업자[예를 들면, Perkin Elmer/Applied BioSystems Division; Foster City, CA]로부터 시판중이고, 이는 제조업자의 지시에 따라서 작동할 수 있다.
특정의 양태 내에서는, 폴리펩타이드가 본원에 기재된 바와 같은 다중의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 또는 본원에 기재된 바와 같은 하나 이상의폴리펩타이드 및 관련되지 않은 서열, 예를 들면, 공지된 종양 단백질을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 융합 단백질은, 예를 들면, T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 파트너), 바람직하게는 사람에 의해 인식된 T 헬퍼 에피토프를 제공하는 것을 도와주거나, 또는 본래의 재조합 단백질 보다 높은 수율로 단백질(발현 인핸서)를 발현시키는 것을 도와줄 수 있다. 특정의 바람직한 융합 파트너는 면역학적이면서 발현 증진성인 융합 파트너이다. 기타 융합 파트너는 해당 단백질의 용해도를 증가시키거나 해당 단백질이 목적하는 세포내 구획으로 표적화될 수 있도록 선택될 수 있다. 또한, 추가의 융합 파트너에는 단백질의 정제를 촉진시키는 친화성 태그가 포함된다.
융합 단백질은 일반적으로, 화학적 접합을 포함한 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 단백질은 융합되지 않은 단백질에 비해, 발현 시스템에서 증가된 수준으로 생성할 수 있게 해주는 재조합 단백질로서 발현된다. 간략하게 언급하면, 상기 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열은 별개로 어셈블리하고, 적당한 발현 벡터에 연결할 수 있다. 하나의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단을, 펩타이드 링커를 사용하거나 사용하지 않고, 제2의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결시켜, 이들 서열의 판독 프레임이 동일한 상에 있게 한다. 이로써, 양 성분 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하고 있는 단일 융합 단백질로 해독할 수 있다.
펩타이드 링커 서열을 사용하여, 각각의 폴리펩타이드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되도록 보장해주기에 충분한 거리 정도 만큼 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드 성분을 분리시킬 수 있다. 이러한 펩타이드 링커 서열은 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 단백질 내로 혼입시킨다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음 요인들을 기준으로 하여 선택할 수 있다: (1) 가요성으로 연장된 입체 구조에 적응하는 이들의 능력; (2) 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드 상의 작용성 에피토프와 반응할 수 있는 2차 구조에 적응하지 못하는 이들의 능력 및 (3) 폴리펩타이드 작용성 에피토프와 반응할 수도 있는 소수성 또는 전하를 띤 잔기의 결여. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 함유한다. 기타 밀접한 중성 아미노산, 예를 들면, Thr 및 Ala를 링커 서열에 사용할 수도 있다. 링커로서 유용하게 이용될 수 있는 아미노산 서열에는 문헌[참조: Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 제4,751,180호]에 기재된 것들이 포함된다. 링커 서열은 일반적으로 길이가 1 내지 약 50개 아미노산일 수 있다. 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드가 작용성 도메인을 분리시키고 입체 간섭을 방지시키는데 사용할 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에는, 링커 서열이 요구되지 않는다.
이와 같이 연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동적으로 연결된다. DNA의 발현에 관여하는 조절 요소는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에만 위치되어 있다. 유사하게, 말단 해독에 요구되는 정지 코돈 및 전사 종결 시그날은 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3'에만 존재한다.
융합 단백질이 또한 제공된다. 이러한 단백질은 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를, 관련되지 않은 면역원성 단백질과 함께 포함한다. 바람직하게는,면역원성 단백질은 회수(recall) 반응을 유발시킬 수 있다. 이러한 단백질의 예에는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질이 포함된다[참조: Stoute et al., New Engl. J. Med., 336:86-91, 1997].
바람직한 양태 내에서는, 면역학적 융합 파트너를, 그람-음성 세균 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza) B의 표면 단백질인 단백질 D로부터 유도시킨다(WO 91/18926). 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 대략 상기 단백질의 첫 번째 1/3(예를 들면, 제1 N-말단 100-110 아미노산)을 포함하고, 단백질 D 유도체를 지질화할 수 있다. 특정의 바람직한 양태 내에서는, 리포프로테인 D 융합 파트너의 처음 109개 잔기가 N 말단 상에 포함되어 부가의 외인성 T-세포 에피토프를 갖는 폴리펩타이드를 제공하고 이. 콜라이에서의 발현 수준을 증가시킨다(이로써 발현 인핸서로서 작용함). 상기 지질 말미(tail)는 항원 제공 세포에 대한 항원의 최적의 표시를 보장해준다. 기타 융합 파트너에는 인플루엔자 바이러스인 NS1로부터의 비-구조 단백질(헤마글루티닌)이 포함된다. T-헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편을 사용할 수도 있지만, 전형적으로, N-말단 81개 아미노산을 사용한다.
또 다른 양태에서는, 면역학적 융합 파트너가 LYTA로서 공지된 단백질, 또는 이의 일정 부분(바람직하게는, C-말단 부분)이다. LYTA는 아미다제 LYTA(LytA 유전자에 의해 암호화됨; Gene 43:265-292, 1986)로서 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성시키는 스트렙토코커스 뉴모니애(Streptococcus pneumoniae)로부터 유도시킨다. LYTA는 펩티도글리칸 주쇄 내의 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 오토리신(autolysin)이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 몇몇 콜린동족체, 예를 들면, DEAE에 대한 친화성에 관여한다. 이러한 성질은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA 발현성 플라스미드의 개발을 이끌어내었다. 아미노 말단에 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 문헌에 보고되었다[참조: Biotechnology 10:795-798, 1992]. 바람직한 양태 내에서는, LYTA의 반복 서열 부분을 융합 단백질 내로 혼입할 수 있다. 반복 서열 부분은 잔기 178에서 출발하는 C-말단 영역에서 발견된다. 특히 바람직한 반복 서열 부분에는 잔기 188-305가 혼입되어 있다.
일반적으로, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드(융합 단백질 포함) 및 폴리뉴클레오타이드가 분리된다. "분리된" 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 이의 본래의 환경으로부터 제거되는 것이다. 예를 들면, 천연 단백질은, 이들이 천연 시스템 내의 공존하는 물질 전부 또는 일부로부터 분리되는 경우에 분리되어진다. 바람직하게는, 이러한 폴리펩타이드는 순도가 약 90% 이상, 보다 바람직하게는 약 95% 이상, 가장 바람직하게는 약 99% 이상이다. 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들면, 이것이 천연 환경의 일부가 아닌 벡터 내로 클로닝된 경우에 분리된 것으로 간주된다.
본 발명에 따르는 유방 종양 단백질의 항원성 및/또는 면역원성을 향상시키기 위해, 둘 이상의 유방 종양 단백질의 항원성 및/또는 면역원성 부분을 포함하는 융합 단백질을 제조할 수 있다. 예시되는 유방 종양 융합 단백질은, 맘마글로빈을 암호화하는 DNA 서열을, (1) 조합된 B726P 업스트림 및 다운스트림 ORF(서열 490); (2) 업스트림 B726P ORF(서열 491) 및/또는 (3) 다운스트림 B726P ORF(서열 492)중 어느 하나를 암호화하는 DNA 서열과 조합함으로써 통상적인 재조합 DNA 기술을 통하여 제조할 수 있다[참조: Ausubel, F.M. et al. "Short Protocols in Molecular"(4thed. 1999); 이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)]. 예시되는 융합 단백질은 서열 493(맘마글로불린-조합된 B726P ORF), 서열 494(맘마글로불린-업스트림 B726P ORF), 및 서열 495(맘마글로불린-다운스트림 B726P ORF)로써 본원에 기재되어 있다. 맘마글로빈을 암호화하는 DNA 서열은 서열 490-492의 뉴클레오타이드 1-279로써 본원에 기재되어 있고, 상응하는 맘마글로빈 아미노산 서열은 아미노산 493-495의 아미노산 1-93으로서 본원에 기재되어 있다[참조: 미국 특허 제5,668,267호; 제5,922,836호; 제5,855,889호; 제5,968,754호 및 제6,004,756호; 이의 전분이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
완전한 길이의 맘마글로빈 암호화 영역과 각종 B726P 암호화 영역과의 융합에 의해 제조된 것으로 예시되는 융합 단백질 이외에도, 본 발명은 추가로, 맘마글로빈과 B726P 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산 의 면역원성 부분을 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 더욱 바람직하게는, 면역원성 부분은 맘마글로빈 및/또는 B726P 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20개 이상의 연속되는 아미노산일 수 있다. 또 다른 한편, 면역원성 부분은 맘마글로빈 및/또는 B726P 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 250, 500 또는 1095개 이상의 연속되는 아미노산일 수 있고, 맘마글로빈 및/또는 B726P 중 어느 하나 또는 둘 다로부터의 20개내지 1095개의 연속되는 어떠한 정수의 아미노산을 포함할 수도 있다.
맘마글로빈의 대표적인 면역원성 부분은 현재 계류중인 미국 특허원 제60/136,528호에 기재되어 있다. 예시되는 면역원성 부분에는 다음의 맘마글로빈 펩타이드 서열이 포함된다: IDELKECFLNQTDETLSNVE(서열 493의 아미노산 59-78); TTNAIDELKECFLNQ(서열 493의 아미노산 55-69); SQHCYAGSGCPLLENVISKTI(서열 493의 아미노산 13-33); EYKELLQEFIDDNATTNAID(서열 493의 아미노산 41-60) 및/또는 KLLMVLMLA(서열 493의 아미노산 2-10). 기타 바람직한 에피토프는 맘마글로빈의 글리코실화 부위를 포함한다. 이러한 에피토프는 글리코실화 맘마글로빈와 특이적으로 결합하는 항체의 생성에 특히 유용하다. 이러한 부위 2개는 N-연결된 글리코실화 부위 아스파라긴(Asp)-53(QEFIDDNATTNAI; 서열 493의 아미노산 47-59) 및 Asp-68(LKECFLNQTDETL; 서열 493의 아미노산 62-74)이다.
본 발명은 또한, B726P 조합된 아미노산 서열, B726P 업스트림 아미노산 서열 및/또는 B726P 다운스트림 아미노산 서열로부터의 광범위한 면역원성 부분이 맘마글로빈-B726P 융합 단백질에 사용할 수 있다는 것을 고려한다. 예를 들면, 특히 적합한 맘마글로빈-B726P 융합 단백질은, 본원 실시예 4에 기재된, B726P-특이적 CTL 클론에 의해 인식된 다운스트림 B726P 에피토프[이러한 에피토프는 B726P의 다운스트림 영역의 N-말단부 내에 포함된다(예를 들면, 서열 176의 아미노산 1-129)]에 맘마글로빈을 융합시킴으로써 제조할 수 있다.
상기 융합 단백질의 맘마글로빈 및/또는 B726P 부분의 정확한 아미노산 서열 및 1차 서열 배열은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고서 다양할 수 있다는 것이 당업자에게는 명백할 것이다. 예를 들면, 맘마글로빈 또는 B726P 부분 중 어느 하나 또는 둘 다 내에서의 보존적 아미노산 치환을 수행하여, 예를 들면, 단백질 안정성 및/또는 면역원성 증가와 같은 개선된 특성을 지닌 융합 단백질을 달성할 수 있다. 또한, 본 발명은 맘마글로빈 부분이 B726P 부분의 N-말단 또는 C-말단 중 어느 하나에 융합되어, 목적하는 항원성 및/또는 면역원성 특성을 지닌 융합 단백질을 달성할 수 있다.
상기 실시예에 의해 본원에 기재된 맘마글로빈-B726P 융합 단백질로써 예시된 바와 같은, 본 발명에 따르는 융합 단백질은 암 백신으로서, 항체 치료에 대한 시약으로서 및/또는 각종 진단 검정에 유용할 것이다. 이들 융합 단백질이 맘마글로빈 및/또는 B726P 단백질 단독과 비교해서, 개선된 항원성 및/또는 면역원성 특성을 지닐 것으로 기대된다.
결합 제제
본 발명은 추가로, 유방 종양 단백질과 특이적으로 결합되는 제제, 예를 들면, 항체 및 이의 항원-결합 단편을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편은, 이것이 유방 종양 단백질과 검출 가능한 수준(예를 들면, ELISA 내에서)으로 반응하고 유사한 조건 하에 관련되지 않은 단백질과는 검출 가능한 수준으로 반응하지 않는 경우에, 유방 종양 단백질에 "특이적으로 결합"되는 것으로 여겨진다. 본원에 사용된 바와 같은 "결합"은 복합체가 형성되도록 2개의 별개의 분자 간의 비공유적 연합을 지칭한다. 결합 능력은, 예를 들면, 상기 복합체의 형성을 위한 결합 상수를 결정함으로써 평가할 수 있다. 이러한 결합 상수는 상기 복합체의 농도를 성분 생성물 농도로 나눈 값이다. 일반적으로, 복합체 형성을 위한 결합 상수가 약 103L/mol을 초과하는 경우에, 두 화합물은 본 발명의 맥락에서 "결합"된 것으로 간주된다. 결합 상수는 당해 분야에 널리 공지된 방법을 사용하여 결정할 수 있다.
결합 제제는 본원에 제공된 대표적인 검정을 사용하여, 암, 예를 들면, 유방암에 걸린 환자와 걸리지 않은 환자를 구별할 수 있게 해준다. 달리 말하면, 유방 종양 단백질과 결합되는 항체 또는 기타 결합 제제는 암 질병에 걸린 환자의 약 20% 이상에서 암의 존재를 지시해주는 시그날을 발생시킬 것이며, 암에 걸리지 않은 개개인의 약 90% 이상에서는 이러한 질병의 부재를 지시해주는 음성 시그날을 발생시킬 것이다. 결합 제제가 이러한 요구 사항을 충족시키는지를 결정하기 위해, 암에 걸린 환자 및 암에 걸리지 않은 환자(표준 임상 시험을 이용하여 결정된 바와 같음)로부터의 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈청, 타액, 뇨 및/또는 종양 생검)을 대상으로 하여, 결합 제제와 결합하는 폴리펩타이드의 존재를 알아보기 위해 본원에 기재된 바와 같이 검정할 수 있다. 질병에 걸린 샘플 및 질병에 걸리지 않은 샘플의 통계상 유의적 수가 검정되어야 한다는 것은 명백하다. 각각의 결합 제제는 상기 기준을 충족시켜야 하지만, 당업자는 결합 제제를 조합하여 사용하여 민감도를 개선시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.
상기 요구 사항을 충족시키는 어떠한 제제도 결합 제제일 수 있다. 예를 들면, 결합 제제는 펩타이드 성분을 갖거나 갖지 않는 리보솜, RNA 분자 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 바람직한 양태에서는, 결합 제제가 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 이러한 항체는 당업자에게 공지된 각종 기술에 의해 제조할 수 있다[참조: Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기재된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성을 포함한 세포 배양 기술에 의해, 또는 재조합 항체의 생성을 허용하기 위해, 항체 유전자를 적합한 세균성 또는 포유류 세포 숙주 내로 형질감염시키는 것을 통하여 생성시킬 수 있다. 하나의 기술에서는, 당해 폴리펩타이드를 포함하는 면역원을 광범위한 모든 포유류[예: 마우스, 랫트, 래빗, 쉽(sheep) 또는 고우트(goat)]에게 초기에 주입한다. 이 단계에서는, 본 발명의 폴리펩타이드가 변형되지 않고서도 면역원으로서 작용될 수 있다. 또 다른 한편, 특히, 비교적 짧은 폴리펩타이드의 경우에는, 이러한 폴리펩타이드를 소의 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanion)과 같은 캐리어 단백질에 연결시킨 경우에 뛰어난 면역 반응이 유도될 수 있다. 이러한 면역원을, 바람직하게는 하나 이상의 부스터 면역화 과정이 들어간 예정된 스케쥴에 따라서 동물 숙주에게 주사하고, 이 동물로부터 주기적으로 피를 뺀다. 이어서, 당해 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체를, 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 커플링된 폴리펩타이드를 사용하여 친화 크로마토그래피함으로써 상기 항혈청으로부터 정제할 수 있다.
관심있는 항원성 폴리펩타이드에 특이적인 모노클로날 항체는, 예를 들면, 문헌[참조: Kohler and Milstein,Eur. J. Immunol. 6:511-519(1976)]의 기술 및 이에 대한 개선 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 간략하게 언급하면, 이들 방법은 목적하는 특이성(즉, 관심있는 폴리펩타이드와의 반응성)을 지닌 항체를 생산할 수 있는 불멸의 세포주를 제조하는 것을 포함한다. 이러한 세포주는 예를 들면, 상기 언급된 바와 같이 면역시킨 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 생성시킬 수 있다. 이어서, 이러한 비장 세포를, 예를 들면, 골수종 세포 융합 파트너, 바람직하게는 상기 면역시킨 동물과 공통 유전형인 것과 융합시킴으로써 불멸화시킨다. 각종 융합 기술을 이용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포와 골수종 세포를 수 분 동안 비이온성 세정제에서 함께 배합한 다음, 하이브리드 세포의 성장은 뒷받침 해주지만 골수종 세포의 성장은 뒷받침 해주지 않는 선택 배지 상에서 저밀도로 도말한다. 바람직한 선별 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘) 선별을 이용한다. 충분한 시간, 통상적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하고, 이의 배양 상등액을 대상으로 하여, 당해 폴리펩타이드에 대한 결합 활성을 시험하였다. 높은 반응성과 특이성을 지닌 하이브리도마가 바람직하다.
성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 모노클로날 항체를 분리할 수 있다. 또한, 하이브리도마 세포주를 마우스와 같은 적합한 척추동물 숙주의 복막강 내로 주사하는 것과 같은 각종 기술을 이용하여 수율을 증가시킬 수 있다. 이어서, 복수 또는 혈액으로부터 모노클로날 항체를 수거할 수 있다. 크로마토그래피, 겔 여과, 침전 및 추출과 같은 통상적인 기술에 의해 상기 항체로부터 오염물을 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드를, 예를 들면, 친화 크로마토그래피 단계로 정제 공정에 사용할 수 있다.
특정 양태 내에서는, 항체의 항원 결합 단편을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 단편에는 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있는 Fab 단편이 포함된다. 간략하게 언급하면, 면역글로불린을 단백질 A 비드 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 래빗 혈청으로부터 정제할 수 있고[참조: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988], 파파인에 의해 분해시켜 Fab 및 Fc 단편을 수득할 수 있다. 이러한 Fab 및 Fc 단편을 단백질 A 비드 칼럼 상에서 친화 크로마토그래피함으로써 분리시킬 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체를 하나 이상의 치료제에 커플링시킬 수 있다. 이와 관련하여 적합한 치료제에는 방사성핵종, 분화 유도제, 약제, 독소, 및 이들의 유도체가 포함된다. 바람직한 방사성핵종에는90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi가 포함된다. 바람직한 약제에는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 퓨린 동족체가 포함된다. 바람직한 분화 유도체에는 포르볼 에스테르 및 부티르산이 포함된다. 바람직한 독소에는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라 독소 및 포크위드(pokeweed) 항바이러스성 단백질이 포함된다.
치료제를 적합한 모노클로날 항체에 직접 또는 간접적으로(예를 들면, 링커 그룹을 통함) 커플링시킬 수 있다(예를 들면, 공유 결합시킴). 각각이 서로 반응할 수 있는 치환체를 보유하는 경우에는, 치료제와 항체 간의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들면, 어느 하나의 친핵성 그룹, 예를 들면, 아미노 또는 설프하이드릴 그룹은, 다른 하나의 우수한 이탈 그룹(예: 할라이드)을 함유하는 알킬 그룹, 또는 카보닐 함유 그룹, 예를 들면, 무수물 또는 산 할라이드와 반응할 수 있다.
또 다른 한편, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통하여 커플링시키는 것이 요망될 수도 있다. 링커 그룹은 결합 능력이 간섭받는 것을 피하기 위해 항체와 치료제 사이에 간격을 두는 스페이서로서 작용할 수 있다. 링커 그룹은 제제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증가시킴으로써, 커플링 효율을 증가시키는 작용을 할 수도 있다. 화학적 반응성 증가로 인해, 가능하지 않았던 제제, 또는 제제 상의 작용성 그룹의 사용을 촉진시킬 수도 있다.
호모-작용성 및 헤테로-작용성인 각종 이작용성 또는 다작용성 시약(예를 들면, Pierce Chemical Co., Rockford, IL의 카탈로그에 기재된 것)이 링커 그룹으로서 이용될 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 커플링 반응은, 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프하이드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통하여 수행할 수 있다. 이러한 방법에 관해 기재된 수 많은 참조문헌 있다[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)].
치료제가 본 발명의 면역접합체의 항체 부분으로부터 분리될 때 보다 효능이 있는 경우에는, 세포 내로의 내부 이행 동안 또는 내부 이행시 절단 가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 요망될 수 있다. 수 많은 상이한 절단 가능한 링커 그룹이 보고되었다. 이들 링커 그룹으로부터 제제의 세포내 방출 기전에는 디설파이드 결합을 환원시킴으로써 절단시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,489,710호(Spitler)], 광 불안정한 결합에 조사하는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,625,014호(Senter et al.)], 유도체화된 아미노산 측쇄를 가수분해시키는 방법[예를 들면, 미국 특허 제4,638,045호(Kohn et al.)], 혈청 보체 매개된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호(Rodwell et al.)] 및 산 촉매된 가수분해 반응[예를 들면, 미국 특허 제4,569,789호(Blattler et al.)]이 포함된다.
하나 이상의 제제를 항체에 커플링시키는 것이 요망될 수 있다. 한 양태에서는, 제제의 다중 분자를 한 항체 분자에 커플링시킨다. 또 다른 양태에서는, 한 가지 이상의 유형의 제제를 한 항체에 커플링시킬 수 있다. 특정 양태에 상관없이, 하나 이상의 제제와의 면역접합체를 각종 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접 커플링시키거나, 또는 부착용 다중 부위를 제공해주는 링커를 사용할 수 있다. 또 다른 한편으론, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적인 공유 결합 또는 링커 그룹을 통한 공유 결합을 포함한 각종 방법으로 상기 제제를 보유할 수 있다. 적합한 담체에는 단백질, 예를 들면, 알부민[참조: 미국 특허 제4,507,234호(Kato et al.)], 펩타이드 및 폴리삭카라이드, 예를 들면, 아미노덱스트란[참조: 미국 특허 제4,699,784호(Shih et al.)]이 포함된다. 담체는 비공유 결합에 의해, 또는 리포좀 소포체 내에서의 캡슐화에 의해 특정 제제를 보유할 수도 있다[참조: 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호]. 방사성핵종 제제에 특이적인 담체에는 방사성할로겐화 작은 분자 및 킬레이트화 화합물이 포함된다. 예를 들면, 미국 특허 제4,735,792호에는 대표적인 방사성할로겐화 작은 분자 및 이의 합성법이 기재되어 있다. 방사성핵종 킬레이트는 금속 또는 금속 산화물 방사성핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성될 수 있다. 예를 들면, 미국 특허 제4,673,562호(Davison et al.)에는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이의 합성법이 기재되어 있다.
항체 및 면역접합체에 대한 각종 투여 경로를 이용할 수 있다. 전형적으로, 투여는 정맥내, 근육내, 피하, 또는 절개된 종양 상 내일 것이다. 항체/면역접합체의 정확한 용량은 사용된 항체, 종양에 대한 항원 밀도, 및 항체의 클리어런스(clearance) 속도에 따라서 다양할 것이라는 것은 명백하다.
T 세포
면역치료학적 조성물은 또한, 유방 종양 단백질에 특이적인 T 세포를 포함할 수 있다. 이러한 세포는 일반적으로, 표준 과정을 사용하여 시험관내 또는 생체외에서 제조할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 공급업자[Nexell Therapeutics, Inc.; Irvine, CA]로부터 입수 가능한 Isolex™ 시스템과 같은 시판용 세포 분리 시스템을 사용하여, 환자의 골수, 말초혈, 또는 골수 또는 말초혈의 특정 분획으로부터 분리시킬 수 있다[참조: 미국 특허 제5,240,856호; 제5,215,926호; WO 89/06280; WO 91/16116 및 WO 92/07243]. 또 다른 한편, T 세포는 관련되거나 관련되지 않은 사람, 비-사람 포유류, 세포주 또는 배양물로부터 유도시킬 수 있다.
T 세포는 유방 종양 폴리펩타이드, 유방 종양 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 이러한 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포(APC)로 자극할 수 있다. 이러한 자극은 상기 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포를 발생시키는데 충분한 조건 및 시간 하에서 수행한다. 바람직하게는, 유방 종양 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 전달 비히클, 예를 들면, 미세구 내에 존재하여 특이적 T 세포의 발생을 촉진시킨다.
T 세포는, 이러한 T 세포가 특이적으로 증식되거나, 사이토킨을 분비하거나, 또는 유방 종양 폴리펩타이드로 피복되거나 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현하는 표적 세포를 사멸시키는 경우에, 상기 유방 종양 폴리펩타이드에 특이적인 것으로 간주된다. T 세포 특이성은 각종 표준 기술 중 어떠한 것을 사용해서도 평가할 수 있다. 예를 들면, 크롬 방출 검정 또는 증식 검정 내에서는, 음성 대조군과 비교해서 융균 및/또는 증식을 2배 이상 증가시키는 자극 지수는 T 세포 특이성을 지시해준다. 이러한 검정은, 예를 들면, 문헌[참조: Chen et al., Cancer Res. 54:1065-1070, 1994]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 또 다른 한편, T 세포 증식의 검출은 공지된 각종 기술에 의해 수행할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성 증가 속도를 측정함으로써(예를 들면, T 세포 배양물을 삼중수소화 티미딘으로 펄스-표지화시킨 다음, DNA 내로 혼입된 삼중수소화 티미딘의 양을 측정함으로써) 검출할 수 있다. 유방 종양 폴리펩타이드(100ng/ml 내지 100㎍/ml, 바람직하게는 200ng/ml 내지 25㎍/ml)와 3 내지 7일 동안 접촉시키면, T 세포의 증식이 2배 이상 증가되어야 한다. 상기 언급된 바와 같이 2 내지 3시간 접촉시키면, T 세포가 활성화되어야 하는데, 이는 사이토킨 방출(예를 들면, TNF 또는 IFN-γ) 수준의 2배 증가가 T 세포 활성화를 지시해주는 표준 사이토킨 검정을 이용하여 측정하였다[참조: Coligan et al., Current Protocols inImmunology, vol. 1, Wiley Interscience(Greene 1998)]. 유방 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 발현성 APC에 반응하여 활성화된 T 세포는 CD4+및/또는 CD8+일 수 있다. 유방 종양 단백질 특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 확장시킬 수 잇다. 바람직한 양태 내에서는, 이러한 T 세포를 환자, 관련 공여체 또는 관련되지 않은 공여체로부터 유도시키고, 이를 자극 및 확장시킨 후 환자에게 투여한다.
치료 목적상, 유방 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+또는 CD8+T 세포를 시험관내 또는 생체내에서 수적으로 확장시킬 수 있다. 시험관내에서의 이러한 T 세포의 증식은 각종 방법으로 달성할 수 있다. T 세포는, T 세포 성장 인자, 예를 들면, 인터루킨-2, 및/또는 유방 종양 폴리펩타이드를 합성하는 자극인자 세포를 부가하거나 부가하지 않으면서, 유방 종양 폴리펩타이드에 다시 노출시키거나, 또는 이러한 폴리펩타이드의 면역원성 부분에 상응하는 짧은 펩타이드에 다시 노출시킬 수 있다. 또 다른 한편, 유방 종양 단백질의 존재 하에 증식되는 하나 이상의 T 세포는 클로닝시킴으로써 수적으로 확장시킬 수 있다. 세포를 클로닝하는 방법은 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 이에는 제한 희석법이 포함된다.
약제학적 조성물
부가의 양태에서는, 본 발명이 세포 또는 동물에게 단독으로 투여하거나 또는 한 가지 이상의 기타 치료 양식과 조합하여 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 용액 중의, 본원에 기재된 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T 세포 및/또는 항체 조성물의 제형에 관한 것이다.
경우에 따라, 본원에 기재된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 핵산 세그먼트, RNA, DNA 또는 PNA 조성물을 기타 제제, 예를 들면, 기타 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 각종 약제학적 활성 제제와 조합하여 투여할 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다. 사실상, 부가의 제제가 표적 세포 또는 숙주 조직과의 접촉시 상당한 역효과를 유발시키지 않는 한은, 포함될 수 있는 기타 성분은 거의 제한되지 않는다. 이로써, 상기 조성물은 특정 경우에 요구되는 바와 같이 각종 기타 제제와 함께 전달될 수 있다. 이러한 조성물은 숙주 세포 또는 기타 생물학적 공급원으로부터 정제할 수 있거나, 또는 본원에 기재된 바와 같이 화학적으로 합성할 수 있다. 마찬가지로, 상기 조성물은 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적으로 허용되는 부형제 및 담체 용액의 제형화는 당업자에게 널리 공지되어 있고, 경구, 비경구, 정맥내, 비내 및 근육내 투여 및 제형을 포함한, 각종 치료 섭생에 있어서 본원에 기재된 특정한 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여량 및 치료 섭생이 개발중이다.
1. 경구 전달
특정 적용 분야에서는, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 경구 투여를 통하여 동물에게 전달할 수 있다. 그 자체로서, 이들 조성물은 불활성 희석제 또는 동화될 수 있는 식용 담체와 함께 제형화할 수 있거나, 이들을 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 봉입시킬 수 있거나, 정제로 압착시키거나, 또는 식이 음식과 함께 직접 혼입할 수 있다.
활성 화합물은 심지어, 부형제와 함께 혼입될 수 있고, 섭취 가능한 정제, 볼내 정제, 트로키제, 캅셀제, 엘릭서제, 현탁제, 시럽, 웨어퍼 등의 형태로 사용될 수 있다[참조: Mathiowitz et al., 1997; Hwang et al., 1998; 미국 특허 제5,641,515호; 제5,580,579호 및 제5,792,451호; 각각의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 상기 정제, 트로키제, 환제, 캅셀제 등은 다음을 함유할 수도 있다: 트라가칸드 검, 아카시아 검, 옥수수 전분 또는 젤라틴 등의 결합제; 인산이칼슘 등의 부형제; 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등의 붕해제; 마그네슘 스테아레이트 등의 윤활제 및 슈크로즈, 락토즈 또는 삭카린 등의 감미제 또는 박하, 윈터그린(wintergreen) 추출 항유 또는 체리향 등의 향미제. 투여 단위 형태가 캅셀제인 경우에는, 상기 유형의 물질 이외에도, 액상 담체를 함유할 수 있다. 각종의 기타 물질이 코팅재로서 존재할 수 있거나 투여 단위의 물리적 형태를 변화시킬 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캅셀제는 쉘락(shellac), 당 또는 이들 둘 다로 코팅시킬 수 있다. 엘릭서 시럽은 활성 화합물을, 감미제로서의 슈크로즈, 방부제로서의 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 향미제, 예를 들면, 체리향 또는 오렌지향과 함께 함유할 수 있다. 물론, 어떠한 투여 단위 형태를 제조하는데 사용된 물질도 이용된 양에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물을 지속 방출형 제제 및 제형 내로 혼입할 수 있다.
전형적으로, 이들 제형은 활성 화합물을 약 0.1% 이상 함유할 수 있긴 하지만, 활성 성분(들)의 비율은, 물론 다양할 수 있고, 편리하게는 총 제형의 중량 또는 용량을 기준으로 하여 약 1 또는 2% 내지 약 60 또는 70%일 수 있다. 본래, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물 내의 활성 화합물(들)의 양은, 해당 화합물의 소정의 단위 용량 내에서 적합한 투여량이 수득되는 방식으로 얻을 수 있는 양이다. 용해도, 생체내 이용 효율, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 주기 등의 요인들 뿐만 아니라 기타 약리학적 고려 사항도 당해 약제학적 제형을 제조하는 분야의 숙련인에 의해 고려될 것이므로, 각종 투여량 및 치료 섭생이 요망될 수 있다.
경구 투여의 경우에는, 본 발명의 조성물을 구강 세정제, 치약, 볼내 정제, 경구용 스프레이 또는 설하 경구 투여된 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 함께 혼입시킬 수도 있다. 예를 들면, 구강 세정제는 필요한 양의 활성 성분을 적당한 용매, 예를 들면, 붕산나트륨 용액(Dobell's Solution)에 혼입시킴으로써 제조할 수 있다. 또 다른 한편으론, 경구용 용액, 예를 들면, 붕산나트륨, 글리세린 및 중탄산칼륨을 포함하는 용액 내로 혼입시키거나, 치약에 분산시키거나, 또는 치료학적으로 유효한 양으로, 물, 결합제, 마모제, 향미제, 소포제 및 보습제를 포함할 수 있는 조성물에 가할 수 있다. 또 다른 한편, 당해 조성물은 혀 아래에 놓거나 입에 용해될 수 있는 정제 또는 정제 형태로 만들 수 있다.
2. 주사 전달
특정한 상황에서는, 본원에 기재된 약제학적 조성물을 미국 특허 제5,543,158호; 제5,641,515호 및 제5,399,363호(각각의 전문이 특정하게 본원에참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 바와 같이, 비경구, 정맥내, 근육내 또는 심지어 복강내 전달하는 것이 요망될 것이다. 자유 염기 또는 약리학적으로 허용되는 염으로서의 활성 화합물의 용제는, 하이드록시프로필셀룰로즈와 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 수 중에서 제조할 수 있다. 분산제는 또한, 글리세롤, 액상 폴리에틸렌 글리콜, 및 이들의 혼합물 및 오일 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건 하에서, 이들 제제는 미생물의 성장을 억제시키는 방부제를 함유한다.
주사용으로 적합한 약제학적 형태에는 멸균 수성 용제 또는 분산제 및 멸균성 주사용 용제 또는 분산제를 즉흥적으로 제조하기 위한 멸균성 산제가 포함된다(미국 특허 제5,466,468호; 이의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨). 모든 경우에 있어서, 상기 형태는 멸균성이어야만 하고, 용이하게 주사할 수 있을 정도로 유체이어야만 한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이어야 하고 미생물(예: 세균 및 진균)의 작용을 억제시켜야 한다. 담체는, 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예: 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 이들의 적합한 혼합물 및/또는 식물성 오일을 함유하는 분산 매질 또는 용매일 수 있다. 적절한 유동성은, 예를 들면, 레시틴과 같은 코팅재를 사용하고, 분산제의 경우에는 요구되는 입자 크기를 유지시키며, 계면활성제를 사용함으로써 유지시킬 수 있다. 미생물 작용 억제는 각종 항균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 촉진시킬 수 있다. 많은 경우에 있어서, 등장성 제제, 예를 들면, 당 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사용 조성물을 장기간 흡수시키는 것은, 해당 조성물 내에 흡수를 지연시키는 제제, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용함으로써 이루어질 수 있다.
수성 용제 형태로 비경구 투여하는 경우에는, 예를 들면, 상기 용제를 필요에 따라 적합하게 완충시켜야 하고, 충분한 식염수 또는 글루코즈를 사용하여 액상 희석제를 먼저 등장성으로 만들어야 한다. 이들 특정한 수성 용제는 정맥내, 근육내, 피하 및 복강내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 이용될 수 있는 멸균성 수성 매질이 본 명세서 측면에서 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 하나의 투여량을 등장성 NaCl 용액 1ml에 용해시키고 대량 피하 주사액 1000ml에 가하거나 제안된 주입 부위에 주사할 수 있다[참조: "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]. 시험되는 대상체의 상태에 따라서 약간의 투여량 변화가 반드시 일어날 것이다. 투여에 관여하는 사람은 어떠한 경우에도, 개개의 대상체에 적당한 용량을 결정할 것이다. 더우기, 사람에게 투여하는 경우에는, FDA에 의해 생물학적 표준에 요구되는 바와 같은 멸균성, 발열성, 및 일반적인 안전성 및 순도 표준을 충족시켜야 한다.
멸균 주사용 용제는, 필요한 양의 활성 화합물을 상기 열거된 기타 각종 성분들과 함께 적당한 용매에 혼입시킨 다음, 여과 멸균시킴으로써 제조한다. 일반적으로, 분산제는 기본 분산 매질과 상기 열거된 것으로부터의 기타 요구 성분을 함유하는 멸균 비히클 내로, 각종 멸균된 활성 성분을 혼입시킴으로써 제조한다. 멸균 주사용 용제를 제조하기 위한 멸균 산제의 경우에는, 바람직한 제조 방법이진공 건조 및 동결 건조 방법이며, 이로써 미리 멸균-정제된 이의 용제로부터 활성 성분 플러스 부가의 목적 성분의 산제가 생성된다.
본원에 기재된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 염에는 산 부가 염(해당 단백질의 자유 아미노 그룹과 형성됨), 및 무기 산, 예를 들면, 염산 또는 인산과 형성된 염 또는 유기 산, 예를 들면, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 형성된 염이 포함된다. 자유 카복실 그룹과 형성된 염은 또한, 무기 염기, 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 산화철, 및 유기 염기, 예를 들면, 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등으로부터 유도시킬 수 있다. 제형화시, 용제는 투여 제형과 부합되는 방식 및 치료학적으로 유효한 양으로 투여될 것이다. 이러한 제형은 각종 투여 형태, 예를 들면, 주사용 용제, 약제-방출 캅셀제 등으로 용이하게 투여된다.
본원에 사용된 바와 같은 "담체"에는 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 코팅재, 희석제, 항균제, 항진균제, 등장성 제제, 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등이 포함된다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 부합되지 않는 경우를 제외하고는, 이의 치료학적 조성물에서의 용도가 고려된다. 보충 활성 성분을 상기 조성물 내로 혼입시킬 수도 있다.
"약제학적으로 허용되는"이란 사람에게 투여될 때, 알레르기성 반응 또는 유사한 바람직하지 못한 반응을 유발시키지 않는 분자상 실체 및 조성물을 지칭한다. 활성 성분으로서 단백질을 함유하는 수성 조성물의 제조는 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 전형적으로, 이러한 조성물은 주사용 액상 용제 또는 현탁제로서 제조하며; 주사하기에 앞서 액체 중에 용해 또는 현탁시키기에 적합한 고체 형태를 제조할 수도 있다. 상기 제제를 유화시킬 수도 있다.
3. 비내 전달
특정 양태에서는, 당해 약제학적 조성물을 비내 스프레이, 흡입 및/또는 기타 에어로졸 전달 비히클에 의해 전달할 수 있다. 유전자, 핵산 및 펩타이드 조성물을 비내 에어로졸 스프레이를 통하여 폐에 직접적으로 전달하는 방법이, 예를 들면, 미국 특허 제5,756,353호 및 제5,804,212호(각각의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 보고되었다. 마찬가지로, 비내 미세입자 수지[참조: Takenaga et al., 1998] 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물[참조: 미국 특허 제5,725,871호; 이의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]을 사용하여 약물을 전달하는 것은 약제 분야에 널리 공지되어 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스의 형태로 경점막 약물 전달하는 방법이 미국 특허 제5,780,045호(이의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재되어 있다.
4. 리포좀-, 나노캡슐- 및 미세입자-매개된 전달
특정 양태에서는, 본 발명자들이 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포 내로 도입하기 위해 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 미세구, 액상 입자, 소포체 등을 사용하는 것을 고려한다. 특히, 본 발명의 조성물은 액상 입자, 리포좀, 소포체, 나노구 또는 나노입자 등에 캡슐화하여 전달하도록 제형화할 수 있다.
이러한 제형은 본원에 기재된 핵산 또는 작제물의 약제학적으로 허용되는 제형을 도입하는데 바람직할 수 있다. 리포좀의 형성 및 용도는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Couvreur et al., 1977; Couvreur, 1988; Lasic, 1988; 이에는 세포내 세균성 감염 및 질병에 대해 표적화된 항생제 치료법에 있어서의 리포좀 및 나노캡슐의 용도가 기재되어 있다]. 최근에, 개선된 혈청 안정성과 순환 반감기를 지닌 리포좀이 개발되었다[참조: Gabizon and Papahadjopoulos, 1988; Allen and Choun, 1987; 미국 특허 제5,741,516호; 각각의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]. 추가로, 효능있는 약물 담체로서의 리포좀 및 리포좀 유사 제제의 각종 방법이 보고되었다[참조: Takakura, 1998; Chandran et al., 1997; Margalit, 1995; 미국 특허 제5,567,434호; 제5,552,157; 제5,565,213호; 제5,738,868호 및 제5,795,587호; 각각의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨].
리포좀은 T 세포 현탁액, 1차 간세포 배양물 및 PC 12 세포를 포함하는 기타 과정에 의해 정상적으로 형질감염에 내성이 있는 수 많은 세포 유형을 이용하여 성공적으로 사용되어 왔다(Renneisen et al., 1990; Muller et al., 1990). 또한, 리포좀에는 바이러스-이용된 전달 시스템에서는 전형적인 DNA 길이 억제인자가 없다. 리포좀은 유전자, 약물(Heath and Martin, 1986; Heath et al., 1986; Balazsovits et al., 1989; Fresta and Puglisi, 1996), 방사선치료제(Pikul et al., 1987), 효소(Imaizumi et al., 1990a; Imaizumi et al., 1990b), 바이러스(Faller and Baltimore, 1984), 전사 인자 및 동종입체 유효인자(Nicolauand Gersonde, 1979)를 각종의 배양된 세포주 및 동물 내로 도입하는데 효과적으로 사용되어 왔다. 또한, 리포좀 매개된 약물 전달의 효능을 검사하는 몇몇 성공적인 임상 시도가 완성되었다[참조: Lopez-Berestein et al., 1985a; 1985b; Coune, 1988; Sculier et al., 1988]. 추가로, 몇몇 연구는 리포좀의 용도가 전신 전달 후의 자가면역 반응, 독소, 생식선 국재와 연관되지 않는다고 제안하고 있다[참조: Mori and Fukatsu, 1992].
리포좀은 수성 매질에서 분산되는 인지질로부터 형성되고, 이는 다층 동심 이층 소포체[다층 소포체(MLV)로서 명명되기도 함]를 자발적으로 형성한다. MLV는 일반적으로, 직경이 25nm 내지 4㎛이다. MLV를 초음파처리하면, 코어에 수용액을 함유하는, 직경이 200 내지 500Å의 범위인 작은 단층 소포체(SUV)가 형성된다.
리포좀은 세포성 막과 유사한 것을 보유하고 있으며, 펩타이드 조성물용 담체로서 본 발명과 연계해서 사용하는 것이 고려된다. 이들은 광범위하게 적합한데, 이는 수용성 물질과 지질 가용성 물질 모두가 수성 공간내 및 이층 자체 내에 각각 포획될 수 있기 때문이다. 약물 보유 리포좀은, 리포좀 제형을 선택적으로 변형시킴으로써 활성제를 부위 특이적으로 전달하는데 이용할 수도 있다.
문헌[참조: Couvreur et al., 1977]의 교시 이외에도, 다음 정보를 리포좀 제형을 생성시키는데 활용할 수 있다. 인지질은 물에 분산될 때, 물에 대한 지질의 몰 비에 따라서 리포좀 이외의 각종 구조물을 형성할 수 있다. 낮은 몰 비에서는, 리포좀이 바람직한 구조이다. 리포좀의 물리적 특징은 2가 양이온의 pH, 이온 강도 및 존재 여부에 좌우된다. 리포좀은 이온성 물질과 극성 물질에 대한 낮은투과성을 나타낼 수 있지만, 승온에서는 이들의 투과성을 현저하게 변화시키는 상 전이가 진행된다. 이러한 상 전이는 겔 상태로서 공지된 밀접하게 패킹되고 정돈된 구조로부터 유체 상태로서 공지된 느슨하게 패킹되고 덜 정돈된 구조로의 변화를 포함한다. 이는 특징적인 상 전이 온도에서 발생되며, 이로써 이온, 당 및 약물에 대한 투과성이 증가된다.
온도 이외에도, 단백질에 대한 노출이 리포좀의 투과성을 변화시킬 수 있다. 특정의 가용성 단백질, 예를 들면, 시토크롬 c가 상기 이층과 결합하고, 이를 변형시키며 관통함으로써, 투과성 변화를 야기시킨다. 콜레스테롤은, 상기 인지질을 보다 단단하게 가시적으로 패킹함으로써, 이와 같은 단백질의 관통을 억제시킨다. 항생제 및 억제제 전달에 가장 유용한 리포좀 제형이 콜레스테롤을 함유할 것이라는 것이 고려된다.
용질을 포집하는 능력은 상이한 유형의 리포좀 간에 다양하다. 예를 들면, MLV는 용질을 포집하는데 적당하게 효율적이지만, SUV는 극도로 비효율적이다. 그러나, SUV는 크기 분포에 있어서 균일성과 재현성 이점을 부여해주며, 크기와 포집 효율 간의 절충이 큰 단층 소포체(LUV)에 의해 부여된다. 이들은 에테르 증발시킴으로써 제조되고, 용질 포집에 있어서 MLV 보다 3 내지 4배 더 효율적이다.
리포좀 특징 이외에도, 화합물을 포집하는데 있어서 중요한 결정 요인은 화합물 자체의 물리화학적 성질이다. 극성 화합물을 수성 공간에 포집시키면, 비극성 화합물이 소포체의 지질 이층에 결합된다. 극성 화합물은 투과를 통하여 방출되거나 상기 이층이 깨어질 때 방출되지만, 비극성 화합물은 이것이 온도 또는 리포단백질에 대한 노출에 의해 파열되지 않는 한은 상기 이층과 연합된 채로 있다. 양 유형은 상 전이 온도에서 최대의 유출 속도을 나타낸다.
리포좀은 4가지 상이한 기전을 통하여 세포와 상호작용한다: 대식세포 및 호중구와 같은 세망내피계의 식세포에 의한 세포내이입; 비특이적의 약한 소수성 또는 정전기력에 의한, 또는 세포 표면 성분과의 특이적 상호작용에 의한 세포 표면에 대한 흡착; 리포좀 내용물을 세포질 내로 동시에 방출시키면서, 리포좀의 지질 이층을 혈장막 내로 삽입시킴으로써 혈장 세포막과 융합시킴 및 리포좀 내용물과의 어떠한 연합 없이도, 리포좀 지질을 세포내 막 또는 세포하 막으로 전이시키는 것, 또는 그 반대로 전이시키는 것. 기전이 효과가 있는지를 결정하고 한 가지 이상을 동시에 작동할 수 있는지를 결정하는 것은 종종 어려운 일이다.
정맥내 주입된 리포좀의 운명과 경향은 이들의 물리적 성질, 예를 들면, 크기, 유동성 및 표면 전하에 좌우된다. 이들은 이들의 조성에 따라서, 조직에서 수 시간 내지 수 일 동안 지속될 수 있고, 혈중 반감기가 수 분 내지 수 시간일 수 있다. 보다 큰 리포좀, 예를 들면, MLV 및 LUV는 세망내피계의 식세포에 의해 신속하게 흡수되지만, 순환계의 생리학은 대부분의 부위에서의 이러한 큰 종의 방출을 억제한다. 이들은 모세혈관 내피, 예를 들면, 간 또는 비장의 동양 혈관(sinusoid)에 큰 개구 또는 공극이 존재하는 장소에서만 방출될 수 있다. 따라서, 이들 기관은 우선적인 흡수 부위이다. 한편, SUV는 보다 넓은 조직 분포도를 나타내지만, 여전히 간 및 비장 내에 고도로 봉쇄되어 있다. 일반적으로, 이러한 생체내 행위는 이들의 큰 크기에 접근할 수 있는 상기 기관 및 조직에만 리포좀을 효능적으로 표적화하는 것으로 제한한다. 이들에는 혈액, 간, 비장, 골수 및 림프계 기관이 포함된다.
표적화는 일반적으로, 본 발명의 맥락에서만 제한되는 것은 아니다. 그러나, 특이적 표적화가 요망되는 경우에는, 이에 이용 가능한 방법이 달성되어야 한다. 항체를 사용하여 리포좀 표면에 결합시킬 수 있고, 항체 및 이의 약물 내용물을, 특정한 세포 유형 표면 상에 위치된 특이적 항원성 수용체에 지시할 수 있다. 탄수화물 결정인자(세포-세포 인식, 상호작용 및 부착에 있어서 특정 역할을 하는당단백질 또는 당지질 세포-표면 성분)를 또한 인식 부위로서 사용할 수 있는데, 이는 이들이 리포좀을 특정한 세포 유형에 대해 지시하는데 효능이 있기 때문이다. 대부분은, 리포좀 제제의 정맥내 주사가 사용될 수 있지만, 기타 투여 경로도 가능하다.
또 다른 한편, 본 발명은 본 발명의 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로, 화합물을 안정적이고 재현가능한 방식으로 포집할 수 있다[참조: Henry-Michelland et al., 1987; Quintanar-Guerrero et al., 1998; Douglas et al., 1987]. 세포내 중합체성 과부하, 예를 들면, 초미립자(크기가 대략 0.1㎛이다)로 인한 부작용을 피하기 위해서는, 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 고안해야 한다. 이들 요구 조건을 충족시키는 생분해 가능한 폴리알킬-시아노아크릴레이트 나노입자가 본 발명에 사용하기 위해 고려된다. 이러한 입자는 문헌[참조: Couvreur et al., 1980; 1988; zur Muhlen et al., 1998; Zambaux et al., 1998; Pinto-Alphandry et al., 1995 and 미국 특허제5,145,684호; 각각의 전문이 특정하게 본원에 참조문헌으로써 삽입됨]에 기재된 바와 같이, 용이하게 제조할 수 있다.
면역원성 조성물
본 발명의 특정의 바람직한 양태에서는, 면역원성 조성물 또는 백신이 제공된다. 이러한 면역원성 조성물은 일반적으로, 상기 논의된 바와 같은 하나 이상의 약제학적 조성물을 면역자극제와 조합하여 포함한다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 면역 반응(항체 및/또는 세포 매개된 면역 반응)을 증진 또는 증강시키는 어떠한 물질일 수도 있다. 면역자극제의 예에는 애쥬반트(adjuvant), 생분해 가능한 미세구(예: 폴리락트성 갈락티드) 및 리포좀[이러한 리포좀 내로 해당 화합물이 혼입된다; 참조: 미국 특허 제4,235,877호(Fullerton)]이 포함된다. 백신 제제는 일반적으로, 예를 들면, 문헌[참조: M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccins Design(the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995)]에 기재되어 있다. 본 발명의 범위 내의 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은 생물학적으로 활성이거나 불활성일 수 있는 기타 화합물을 함유할 수도 있다. 예를 들면, 기타 종양 항원의 하나 이상의 면역원성 부위가 해당 조성물 내에서, 융합 폴리펩타이드 내로 혼입되어 존재하거나, 또는 별개의 화합물로서 존재할 수 있다.
예시되는 면역원성 조성물은 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 함유할 수 있기 때문에, 이러한 폴리펩타이드가 원위치에서 생성된다. 상기 인지된 바와 같이, 상기 DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스성 발현 시스템을 포함한, 당업자에게 공지된 각종 전달 시스템 내에 존재할 수 있다. 수 많은 유전자 전달 기술이 당해 분야에 널리 공지되어 있고, 예를 들면, 문헌[참조: Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems 15:143-198, 1998 및 이에 인용된 참조문헌]에 기재되어 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자에게서 발현하는데 필수적인 DNA 서열(예: 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유한다. 세균성 전달 시스템은 이의 세포 표면 상에 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 발현하거나 이러한 에피토프를 분비시키는 세균(예:Bacillus-Calmette-Guerrin)의 투여와 관련이 있다. 바람직한 양태에서는, 상기 DNA를, 비-병원성(결함있는)의 복제 적격한 바이러스의 사용을 포함할 수 있는 바이러스성 발현 시스템(예: 백시니아 또는 기타 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입할 수 있다. 적합한 시스템은, 예를 들면, 다음 문헌에 기재되어 있다[참조: Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569:86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8:17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; WO 89/01973; 미국 특허 제4,777,127호; GB 2,200,651; EP 0,345,242; WO 91/02805; Berkner, Biotechniques 6:616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252:431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:215-219, 1994; Kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88:2838-2848, 1993; and Guzman et al., Cir. Res. 73:1202-1207, 1993]. DNA를 상기 발현 시스템 내로 혼입시키는 기술은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 상기 DNA는 예를 들어, 문헌[참조: Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993]에 기재되고 문헌[참조: Cohn, Science 259:1691-1692, 1993]에 의해 고찰된 바와 같이, "노출된" 것일 수도 있다. 노출된 DNA의 흡수는, 이러한 DNA를, 세포 내로 효율적으로 수송되는 생분해 가능한 비드 상으로 코팅함으로써 증가시킬 수 있다. 면역원성 조성물이 폴리뉴클레오타이드 성분과 폴리펩타이드 성분 둘 다를 포함할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 면역원성 조성물은 증강된 면역 반응을 제공해줄 수 있다.
면역원성 조성물이 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다는 것은 명백할 것이다. 이러한 염은 유기 염기(예: 1급, 2급 및 3급 아민 및 염기성 아미노산의 염) 및 무기 염(예: 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)을 포함한 약제학적으로 허용되는 비독성 염기로부터 제조할 수 있다.
당업자에게 공지된 적합한 어떠한 담체도 본 발명의 조성물에 이용될 수 있긴 하지만, 담체의 유형은 투여 방식에 따라서 결정될 것이다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면, 국소, 경구, 비내, 정맥내, 두개내, 복강내, 피하 또는 근육내 투여를 포함한, 적당한 투여 방식을 위해 제형화할 수 있다. 비경구 투여, 예를 들면, 피하 주사인 경우에는, 담체가 바람직하게는 물, 식염수, 알코올, 지방, 왁스 또는 완충제를 포함한다. 경구 투여의 경우에는, 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 삭카린, 탈큠, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산마그네슘과 같은 고형 담체 또는 상기 담체 중 어떠한 것도 이용할 수 있다. 생분해 가능한 미세구(예: 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 또한 본 발명의 약제학적 조성물에 대한 담체로서 이용할 수 있다. 적합한 생분해 가능한 미세구는, 예를 들면, 미국 특허 제4,897,268호; 제5,075,109호; 제5,928,647호; 제5,811,128호; 제5,820,883호; 제5,853,763호; 제5,814,344호 및 제5,942,252호에 기재되어 있다. 숙주에서 부류 I-제한된 세포독성 T 림프구 반응을 유도시킬 수 있는, 미국 특허 제5,928,647호에 기재된 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 이용할 수도 있다.
이러한 조성물은 완충제(예: 중성 완충된 식염수 또는 인산염 완충된 식염수), 탄수화물(예: 글루코즈, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드 또는 아미노산, 예를 들면, 글리신, 산화방지제, 제균제, 킬레이트제, 예를 들면, EDTA 또는 글루타치온, 애쥬반트(예: 수산화알루미늄), 해당 제형을 수용체의 혈액과 등장성, 저장성 또는 약한 고장성이 되도록 해주는 용질, 현탁화제, 증점제 및/또는 방부제를 포함할 수도 있다. 또 다른 한편, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화시킬 수 있다. 널리 공지된 기술을 사용하여 화합물을 리포좀 내에 캡슐화시킬 수도 있다.
각종 면역자극제를 본 발명의 면역원성 조성물에 이용할 수 있다. 예를 들면, 애쥬반트가 포함될 수 있다. 대부분의 애쥬반트는 항원이 신속하게 이화되지 못하도록 고안된 물질, 예를 들면, 수산화알루미늄 또는 광유, 및 면역 반응 자극제, 예를 들면, 지질 A, 보르타델라 페르튜시스(Bortadella pertussis) 또는 미코박테륨 튜베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질을 함유한다.적합한 애쥬반트는, 예를 들면, 프로인트 불완전 애쥬반트 및 완전 아주벤트(공급처: Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 애쥬반트 65(공급처: Merck and Company, Inc., Rahway, NJ); AS-2(공급처: SmithKline Beecham, Philadelphia, PA); 수산화알루미늄 겔(알룸) 또는 알루미늄 포스페이트와 같은 알루미늄 염; 칼슘, 철 또는 아연 염; 아실화 티로신의 불용성 현탁제; 아실화 당; 양이온적으로 또는 음이온적으로 유도체화된 폴리삭카라이드; 폴리포스파젠; 생분해 가능한 미세구; 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A로서 시판중이다. GM-CSF 또는 인터루킨-2, -7 또는 -12와 같은 사이토킨이 애쥬반트로서 사용될 수도 있다.
본원에 제공된 면역원성 조성물 내에서는, 애쥬반트 조성물을 주로 Th1 유형의 면역 반응을 유도하도록 고안하는 것이 바람직하다. 고수준의 Th1-유형 사이토킨(예: IFN-γ, TNFα, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응을 주로 유도하는 경향이 있다. 이와는 달리, 고수준의 Th2-유형 사이토킨(예: IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응을 주로 유도하는 경향이 있다. 본원에 제공된 바와 같은 면역원성 조성물을 투여한 후, 환자는 Th1- 및 Th2-유형 반응을 포함하는 면역 반응을 견뎌낼 것이다. 반응이 주로 Th1-유형인 바람직한 양태 내에서는, Th1-유형 사이토킨의 수준이 Th2-유형 사이토킨의 수준 보다 훨씬 더 크게 증가할 것이다. 이들 사이토킨의 수준은 표준 검정을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨 계열에 관한 고찰은 다음 문헌을 참조하기 바란다[참조: Mosmann and Coffman,Ann. Rev. Immunol. 7:145-173, 1989].
주로 Th1-유형 반응을 유도하는데 사용하기 바람직한 애쥬반트로는, 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A(3D-MPL)과 알루미늄 염과의 조합물이 있다. MPL 애쥬반트는 다음 공급처(Corixa Corporation, Seattle, WA; 미국 특허 제4,436,727호, 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호 참조)로부터 입수 가능하다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(여기서, CpG 디뉴클레오타이드는 메틸화되지 않는다)가 또한, 주로 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 널리 공지되어 있고, 예를 들면, WO 96/02555 및 WO 99/33488, 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호에 기재되어 있다. 면역자극성 DNA 서열이 또한, 예를 들면, 문헌[참조: Sato et al.,Science 273:352, 1996]에 기재되어 있다. 또 다른 바람직한 애쥬반트는 단독으로 사용되거나 기타 애쥬반트와 함께 사용될 수 있는 사포닌, 바람직하게는 QS21(공급처: Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA)이다. 예를 들면, 증진된 시스템은 모노포스포릴 지질 A와 사포닌 유도체와의 조합물, 예를 들면, WO 94/00153에 기재된 바와 같은 3D-MPL과 QS21의 조합물, 또는 WO 96/33739에 기재된 바와 같이, QS21이 콜레스테롤로 급냉되는 덜 반응 발생적인 조성물을 포함한다. 기타 바람직한 제형은 유중수 에멀션 및 토코페롤을 포함한다. 유중수 에멀션 중에 QS21, 3D-MPL 및 토코페롤을 포함하는 특히 효능있는 애쥬반트 제형이 WO 95/17210에 기재되어 있다.
기타 바람직한 애쥬반트로는 계류중인 미국 특허원 제08/853,826호 및 제09/074,720호(이의 전문이 본원에 참조문헌으로써 삽입됨)에 기재된 바와 같은, 몬타니드 ISA 720(공급처: Seppic, France), SAF(공급처: Chiron, California,United States), ISCOMS(공급처: CSL), MF-59(공급처: Chiron), SBAS 시리즈의 애쥬반트[예: SBAS-2 또는 SBAS-4(공급처: SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium)], Detox(공급처: Corixa, Hamilton, MT), RC-529(공급처: Corixa, Hamilton, MT) 및 기타 아미노알킬 글루코사미니드 4-포스페이트(AGPs)이 있다.
항원, 면역 반응 인핸서 및 적합한 담체 또는 부형제의 조합물을 생성시키는 것으로 널리 공지된 방법을 사용하여, 본원에 제공된 면역원성 조성물을 제조할 수 있다. 본원에 기재된 조성물은 지속 방출형 제형[즉, 투여 후에 화합물을 서서히 방출시키는 제형, 예를 들면, 캅셀제, 스폰지 또는 겔(예를 들면, 폴리삭카라이드로 구성됨)]의 일부로서 투여할 수 있다. 이러한 제형은 일반적으로, 널리 공지된 기술[참조: Coombers et al.,Vaccine 14:1429-1438, 1996]을 사용하여 제조할 수 있고, 예를 들면, 경구, 직장 또는 피하 주입하여 투여하거나 목적하는 표적 부위에 주입함으로써 투여할 수 있다. 지속 방출형 제형은 담체 매트릭스에 분산되고/되거나 속도 제어 막으로 둘러 싸인 저장기 내에 함유된, 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 항체를 함유할 수 있다.
이러한 제형 내에 사용하기 위한 담체는 생물학적으로 적합하고, 또한 생분해 가능할 수 있는데; 바람직하게는, 상기 제형이 비교적 일정 수준의 활성 성분 방츨을 제공해준다. 이러한 담체로는 폴리(락티드-코-글리콜리드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로즈, 덱스트란 등의 미세입자가 있다. 기타 지연 방출형 담체로는 비-액상 친수성 코어(예: 가교결합된 폴리삭카라이드 또는 올리고삭카라이드)와, 임의로, 인지질과 같은 양친매성 화합물을 포함하는 외부 층을 포함하는 초분자 바이오벡터가 있다[참조: 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 공개특허공보 WO 94/20078, WO 94/23701 및 WO 96/06638]. 지속 방출형 제형 내에 함유된 활성 화합물의 양은 주입 부위, 방출 속도 및 예상 기간, 및 치료 또는 예방하고자 하는 질환의 종류에 좌우된다.
종양 세포를 표적시키는 항원-특이적 면역 반응의 생성을 촉진시키는 각종 전달 비히클이 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물 내에 이용될 수 있다. 전달 비히클로는 항원 제공 세포(APCs), 예를 들면, 수지상 세포, 대식세포, B 세포, 단구, 및 효율적인 APC가 되도록 공학적으로 처리시킬 수 있는 기타 세포가 있다. 이러한 세포를 유전적으로 변형시켜 항원 표시 능력을 증가시키고, T 세포 반응의 활성화 및/또는 유지를 향상시키며, 항-종양 효과 자체를 지니고/지니거나 수용자와 면역학적으로 화합되도록(즉, 부합된 HLA 반수형) 할 수 있으나, 반드시 필요한 것은 아니다. APC는 일반적으로, 종양 조직 및 종양 주변 조직을 포함한 각종 생물학적 유체와 기관으로부터 분리할 수 있고, 이는 자가, 동종이계, 공통유전형 또는 이종발생 세포일 수 있다.
본 발명의 특정의 바람직한 양태는 항원 제공 세포로서 수지상 세포 또는 이의 자손을 사용한다. 수지상 세포는 고도로 효능있는 APC이고[참조: Banchereau and Steinman,Nature 392:245-251, 1998], 예방적 또는 치료학적 항종양 면역을 유도하기 위한 생리학적 애쥬반트로서 유효한 것으로 밝혀졌다[참조: Timmerman and Levy,Ann. Rev. Med. 50:507-529, 1999]. 일반적으로, 수지상 세포는 이의 전형적인 외관(시험관내에서 볼 수 있는 현저한 세포질 과정(수지상 결정)을 나타내는, 원위치에서 별모양을 지님), 항원을 고효율로 흡수, 프로세스 및 표시하는 능력, 및 본래의 T 세포 반응을 활성화시키는 능력을 기준으로 하여 동정할 수 있다. 수지상 세포는 물론, 생체내 또는 생체외 수지상 세포에서 통상 발견되지 않는 특이적 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 공학적으로 처리할 수 있으며, 이와 같이 변형된 수지상 세포가 본 발명으로써 고려된다. 수지상 세포에 대한 대체물로서, 분비된 소포 항원-부하된 수지상 세포(엑소솜으로 지칭됨)가 면역원성 조성물 내에 사용될 수 있다[참조: Zitvogel et al.,Nature Med. 4: 594-600, 1998].
수지상 세포 및 이의 자손은 말초혈, 골수, 종양-침윤성 세포, 종양 주변 조직-침윤성 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대혈 또는 기타 적합한 조직 또는 유체로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 수지상 세포는 GM-CSF, IL-4, IL-13 및/또는 TNFα와 같은 사이토킨의 조합물을, 말초혈로부터 수거된 단구 배양물에 가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 또 다른 방법으로는, GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드, 및/또는 수지상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도시키는 기타 화합물(들)의 조합물을 배양 배지에 가함으로써, 말초혈, 제대혈 또는 골수로부터 수거된 CD34 양성 세포를 수지상 세포로 분화시킬 수 있다.
수지상 세포는 "미숙한" 세포와 "성숙한" 세포로 통상 분류되는데, 이는 널리 특징적인 두 표현형을 구별해주는 간단한 방법이다. 그러나, 이러한 명명법이 가능한 모든 분화 중간 단계를 배제하고자 한 것은 아니다. 미숙한 수지상 세포는 Fcγ수용체와 만노즈 수용체의 높은 발현과 상관있는 높은 항원 흡수 및 프로세싱능력을 지닌 APC로서 특징지워진다. 성숙한 표현형은 전형적으로, 이들 마커는 낮은 수준으로 발현하지만, T 세포 활성화에 관여하는 세포 표면 분자, 예를 들면, 부류 I 및 부류 II MHC, 부착 분자(예: CD54 및 CD11) 및 보조자극 분자(예: CD40, CD80, CD86 및 4-1BB)는 높은 수준으로 발현하는 것을 특징으로 한다.
APC는 일반적으로, 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드(또는 이의 일정 부분 또는 기타 변이체)로 형질감염시켜 상기 유방 종양 단백질 또는 이의 면역원성 부분이 세포 표면 상에서 발현되도록 할 수 있다. 이러한 형질감염은 생체외에서 수행할 수 있으며, 이와 같이 형질감염된 세포를 포함하는 조성물을 본원에 기재된 바와 같은 치료학적 목적에 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 수지상 세포 또는 기타 항원 제공 세포를 표적으로 하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여하면, 생체내에서 형질감염이 이루어질 수 있다. 수지상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로, 예를 들면, WO 97/24447에 기재된 바와 같이 당해 분야에 공지된 방법을 사용하거나, 또는 문헌[참조: Mahvi et al.,Immunology and Cell Biology 75:456-460, 1997]에 기재된 유전자 총 접근법을 사용하여 수행할 수 있다. 수지상 세포의 항원 부하는 수지상 세포 또는 이의 자손 세포를 유방 종양 폴리펩타이드, DNA(노출된 것이거나 플라스미드 벡터 내에 함유된 것) 또는 RNA와 함께 항온 배양하거나 항원-발현성 재조합 세균 또는 바이러스(예: 백시니아, 전염성 상피종, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스 벡터)와 함께 항온 배양함으로써 달성할 수 있다. 부하에 앞서, 상기 폴리펩타이드를 T 세포 헬퍼를 제공해주는 면역학적 파트너(예: 캐리어 분자)에 공유적으로 접합시킬 수 있다. 또 다른 한편, 수지상 세포를 개별적으로 또는 폴리펩타이드의 존재하에, 비-접합된 면역학적 파트너로 펄싱할 수 있다.
면역원성 조성물 및 약제학적 조성물은 단위-용량 또는 수회분-용량 용기, 예를 들면, 밀봉형 앰풀 또는 바이알에 제공될 수 있다. 이러한 용기는 사용될 때까지 제형의 멸균성을 보존하도록 용접 봉합하는 것이 바람직하다. 일반적으로, 제형은 오일상 또는 수성 비히클 중의 현탁제, 용제 또는 에멀션으로서 저장할 수 있다. 또 다른 한편으론, 면역원성 조성물 또는 약제학적 조성물은 사용 직전에 멸균성 액상 담체의 부가만을 필요로 하는 동결 건조된 조건 하에서 저장할 수 있다.
암 치료법
본 발명의 추가의 국면에서는, 본원에 기재된 조성물이 암, 예를 들면, 유방암의 면역요법에 사용될 수 있다. 이러한 방법 내에서는, 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물을 전형적으로, 환자에게 투여한다. 본원에 사용된 바와 같은 "환자"는 모든 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 지칭한다. 환자는 암에 걸리거나 걸리지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은 암의 발생을 예방하거나 암에 걸린 환자를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 암은 악성 종양의 존재를 포함한, 당해 분야에서 일반적으로 허용된 기준을 사용하여 진단할 수 있다. 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은, 1차 종양을 외과적으로 제거하고/하거나 방사선 요법 또는 통상적인 화학요법 약물을 투여함으로써 치료하기에 앞서 또는 그 후에 투여한다. 정맥내, 복강내, 근육내, 피하, 비내, 피내, 항문, 질내,국소 및 경구 투여를 포함한 적합한 어떠한 방법으로든 투여할 수 있다.
특정 양태에서는, 면역요법이 능동 면역요법일 수 있는데, 여기서는 치료가, 면역 반응-변형제(예: 본원에 제공된 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드)의 투여를 이용하여 종양에 대해 반응하는 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극에 의존한다.
기타 양태에서는, 면역요법이 수동 면역요법일 수 있는데, 여기서는 치료가, 항종양 효과를 직접적 또는 간접적으로 매개할 수 있고 반드시 본래의 숙주 면역계 에만 의존하지 않는, 정립된 종양-면역 반응성을 나타내는 제제(예: 이펙터(effector) 세포 또는 항체)의 전달을 포함한다. 이펙터 세포의 예로는 상기 언급된 바와 같은 T 세포, T 림프구(예를 들면, CD8+세포독성 T-림프구 및 CD4+T-헬퍼 종양-침윤성 림프구), 킬러 세포(천연 킬러 세포 및 림포킨-활성화 킬러 세포), B 세포, 및 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포(예: 수지상 세포 및 대식세포)가 있다. 본원에 인용된 폴리펩타이드에 특이적인 항체 수용체 및 T 세포 수용체를 클로닝, 발현, 및 양자 면역요법을 위해 기타 벡터 또는 이펙터 세포 내로 전이시킬 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드를 또한 사용하여, 수동 면역요법을 위해 항체 또는 항-유전형 항체(상기 언급된 것 및 미국 특허 제4,918,164호에 기재된 것)를 생성시킬 수 있다.
이펙터 세포는 일반적으로, 본원에 기재된 바와 같이 시험관내에서 성장시킴으로써 양자 면역요법에 충분한 양으로 수득할 수 있다. 생체내 항원 인식은 유지시키면서, 단일 항원 특이적 이펙터 세포를 수 십억개 확장시키기 위한 배양 조건은 당해 분야에 널리 공지되어 있다. 이러한 시험관내 배양 조건은 전형적으로, 종종 사이토킨(예: IL-2) 및 비-분할 공급인자 세포의 존재하에, 항원으로의 간헐적인 자극을 이용한다. 상기 언급된 바와 같이, 본원에 제공된 바와 같은 면역반응성 폴리펩타이드를 사용하여 항원 특이적 T 세포 배양물을 신속하게 확장시킴으로써, 면역요법에 충분한 수의 세포를 생성시킨다. 특히, 항원 제공 세포, 예를 들면, 수지상 세포, 대식세포, 단구, 섬유아세포 및/또는 B 세포를 면역반응성 폴리펩타이드로 펄싱하거나, 또는 이를 당해 분야에 널리 공지된 표준 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리펩타이드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들면, 항원 제공 세포를, 재조합 바이러스 또는 기타 발현 시스템에서의 발현을 증가시키기에 적당한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 치료법에 사용하기 위해 배양된 이펙터 세포는 광범위하게 성장 및 분포되어야 하고, 생체내에서 장기간 생존해야만 한다. 연구 결과, IL-2이 보충된 항원으로의 자극을 반복함으로써, 생체내에서 성장시키고 상당수가 장기간 생존하도록 배양된 이펙터 세포를 유도시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다[참조: Cheever et al., Immunological Reviews 157:177, 1997].
또 다른 한편, 본원에 인용된 폴리펩타이드를 환자로부터 취한 항원 제공 세포 내로 도입하고, 이식물을 동일한 환자에게 다시 주입하기 위해 이를 생체외에서 클론적으로 증식시킬 수 있다. 형질감염된 세포는 당해 분야에 공지된 모든 수단을 이용하여, 정맥내, 동내, 복강내 또는 종양내 투여에 의해, 바람직하게는 멸균성 형태로 환자에게 재도입할 수 있다.
당해 치료학적 조성물의 투여 경로 및 투여 횟수 뿐만 아니라 투여량은 개개인마다 상이할 것이고, 이는 표준 기술을 사용하여 용이하게 정립될 수 있다. 일반적으로, 당해 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물은 주사(예를 들면, 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하), 비내(예를 들면, 흡인에 의함) 또는 경구 투여할 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 10회분을 52주 동안 투여할 수 있다. 바람직하게는, 6회분을 1개월 간격으로 투여한 후, 부스터 백신 접종을 주기적으로 제공할 수 있다. 또 다른 프로토콜이 개개 환자에 적당할 수 있다. 적합한 용량은 상기 언급된 바와 같이 투여될 때, 항-종양 면역 반응을 증진시킬 수 있는 화합물의 양이며, 이는 기준(즉, 치료되지 않은) 수준의 10 내지 50% 이상이다. 이러한 반응은 환자에게서 항-종양 항체를 측정함으로써 모니터하거나, 또는 시험관내에서 환자의 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 세포 용해성 이펙터 세포의 백신-의존적 생성에 의해 모니터할 수 있다. 이러한 면역원성 조성물은 또한, 치료되지 않은 환자와 비교해서 치료된 환자에게서 개선된 임상적 결과(예를 들면, 보다 빈번한 병의 차도, 완전하거나 부분적 또는 보다 긴 생존율)을 가져다 주는 면역 반응을 유발시킬 수 있어야 한다. 일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 면역원성 조성물의 경우, 용량 내에 존재하는 각 폴리펩타이드의 양은 숙주 1kg당 약 25㎍ 내지 5mg의 범위이다. 적합한 용량 크기는 환자의 크기에 따라 다양할 것이지만, 전형적으로 약 0.1ml 내지 약 5ml의 범위이다.
일반적으로, 적당한 투여량 및 치료 섭생은 치료학적 및/또는 예방적 이점을제공하기에 충분한 양의 활성 화합물(들)을 제공해준다. 이러한 반응은 치료되지 않은 환자와 비교해서 치료된 환자에게서 개선된 임상적 결과(예를 들면, 보다 빈번한 병의 차도, 완전하거나 부분적 또는 보다 긴 생존율)를 확립시킴으로써 모니터할 수 있다. 유방 종양 단백질에 대해 선재하는 면역 반응 증가는 일반적으로, 개선된 임상적 결과와 상관이 있다. 이러한 면역 반응은 일반적으로, 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 검정을 사용하여 평가할 수 있는데, 이는 치료 전 및 후의 환자로부터 수득된 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
암 검출 및 진단
일반적으로, 암은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플(예: 혈액, 혈청, 타액, 뇨 및/또는 종양 생검) 내에, 하나 이상의 유방 종양 단백질 및/또는 이러한 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 존재하는지를 기초로 하여 환자에게서 검출할 수 있다. 달리 말하면, 이러한 단백질은 암(예: 유방암)의 존재 또는 부재를 지시해주는 마커로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 단백질은 기타 암을 검출하는데 유용할 수 있다. 본원에 제공된 결합 제제는 일반적으로, 생물학적 샘플 내의 상기 제제와 결합되는 항원의 수준을 검출할 수 있게 해준다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용하여, 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있으며, 이는 또한 암의 존재 또는 부재를 지시해준다. 일반적으로, 유방 종양 단백질은 정상 조직에서 보다 종양 조직에서 3배 이상 더 높은 수준으로 존재해야 한다.
특정 샘플에서 폴리펩타이드 마커를 검출하기 위해 결합 제제를 사용하는 것으로 당업자에게 공지된 각종 검정 포맷이 있다[참조: Harlow and Lane,Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 환자에게 암이 존재 또는 부재하는지의 여부는 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 상기 결합 제제와 접촉시키고; (b) 이러한 샘플 내에서, 결합 제제와 결합되는 폴리펩타이드의 수준을 검출하며; (c) 상기 폴리펩타이드의 수준을 컷-오프 예정치와 비교함으로써 결정할 수 있다.
또 다른 양태에서는, 상기 검정이, 고체 지지체 상에 고정화된 결합 제제를 사용하여 폴리펩타이드에 결합시키고 이를 나머지 샘플로부터 제거하는 것을 포함한다. 이어서, 리포터 그룹을 함유하고 상기 결합 제제/폴리펩타이드 복합체와 특이적으로 결합되는 검출용 시약을 사용하여, 상기와 같이 결합된 폴리펩타이드를 검출할 수 있다. 이러한 검출용 시약은, 예를 들면, 폴리펩타이드와 특이적으로 결합되는 결합 제제 또는 항체, 또는 이러한 결합 제제와 특이적으로 결합되는 기타 제제, 예를 들면, 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴을 포함할 수 있다. 또 다른 방법으로는, 폴리펩타이드에 리포터 그룹을 표지시키고, 상기 샘플을 결합 제제와 함께 항온 배양한 후 고정화된 결합 제제에 결합될 수 있게 해주는 경쟁적 검정이 이용될 수 있다. 샘플 성분이 결합 제제에 대한 상기 표지된 폴리펩타이드의 결합을 억제하는 정도가, 상기 고정화된 결합 제제와 샘플 간의 반응도를 지시해준다. 이러한 검정 내에서 사용하기 적합한 폴리펩타이드에는 상기 언급된 바와 같이, 완전한 길이의 유방 종양 단백질 및 이에 결합 제제가 결합되는 이의 부분이 포함된다.
고체 지지체는 종양 단백질이 부착될 수 있는 것으로 당업자에게 공지된 어떠한 물질일 수 있다. 예를 들면, 이러한 고체 지지체는 미세역가판 내의 시험용 웰 또는 니트로셀룰로즈 또는 기타 적합한 막일 수 있다. 또 다른 한편, 상기 지지체는 비드 또는 디스크, 예를 들면, 유리, 섬유 유리, 라텍스 또는 플라스틱 물질, 예를 들면, 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드일 수 있다. 상기 지지체는 또한, 예를 들면, 미국 특허 제5,359,681호에 기재된 바와 같은 섬유 광 센서 또는 자기 입자일 수 있다. 결합 제제는 특허 및 과학지에 상세히 기재되어 있는, 당업자에게 공지된 각종 기술을 사용하여 고체 지지체 상에 고정화시킬 수 있다. 본 발명의 맥락에서, 용어 "고정화"는 흡착과 같은 비공유적 결합과 공유적 부착(이는 지지체 상에서 상기 제제와 작용성 그룹 간의 직접적인 연결일 수 있거나 가교결합제에 의한 연결일 수 있다) 모두를 지칭한다. 미세역가판 내의 웰 또는 막에 흡착으로써 고정화시키는 것이 바람직하다. 이러한 경우, 흡착은 적합한 완충액 중의 결합 제제를 적합한 시간 동안 고체 지지체와 접촉시킴으로써 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양하지만, 전형적으로 약 1시간 내지 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가판(예: 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드)의 웰을 약 10ng 내지 약 10㎍, 바람직하게는 약 100ng 내지 1㎍ 범위의 결합 제제와 접촉시키는 것이 적당한 양의 결합 제제를 고정화시키는데 충분하다.
결합 제제를 고체 지지체에 공유적 부착시키는 것은 일반적으로, 결합 제제 상의 지지체와 작용성 그룹(예: 하이드록실 또는 아미노 그룹) 모두와 반응하게 될 이작용성 시약을 상기 지지체와 먼저 반응시킴으로써 이루어질 수 있다. 예를 들면, 상기 결합 제제는, 벤조퀴논을 사용하거나 또는 지지체 상의 알데히드 그룹을 결합 파트너 상의 활성 수소 및 아민으로 축합시킴으로써, 적당한 중합체 코팅을 갖는 지지체에 공유적으로 부착시킬 수 있다[참조: Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook(1991) at A12-A13].
특정 양태에서는, 상기 검정이 2개-항체 샌드위치 검정이다. 이러한 검정은 먼저, 고체 지지체, 통상적으로는 미세역가판의 웰 상에서 고정화시킨 항체를 생물학적 샘플과 접촉시켜 이러한 샘플 내의 폴리펩타이드가 상기 고정화된 항체와 결합되도록 해줌으로써 수행할 수 있다. 이어서, 이와 같이 고정화된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 결합되지 않은 샘플을 제거하고, 리포터 그룹을 함유하는 검출용 시약(바람직하게는, 상기 폴리펩타이드 상의 상이한 부위와 결합할 수 있는 제2의 항체)를 가한다. 이어서, 특이적 리포터 그룹에 적당한 방법을 사용하여, 고체 지지체에 결합되어 있는 검출용 시약의 양을 결정한다.
보다 구체적으로 언급하면, 일단 항체를 상기 언급된 바와 같이 지지체 상에 고정화시키면, 이러한 지지체 상의 나머지 단백질 결합 부위가 전형적으로 차단된다. 적합한 모든 차단제, 예를 들면, 소의 혈청 알부민 또는 트윈 20™(공급처: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)가 당업자에게 공지되어 있다. 이어서, 상기와 같이 고정화된 항체를 샘플과 함께 항온 배양하고, 폴리펩타이드가 이 항체와 결합되도록 한다. 항온 배양에 앞서, 상기 샘플을 적합한 희석제, 예를 들면, 인산염 완충 식염수(PBS)로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적당한 접촉 시간(즉,항온 배양 시간)은 유방암에 걸린 개개인으로부터 수득된 샘플 내에 폴리펩타이드가 존재하는지를 검출하기에 충분한 시간이다. 바람직한 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드와 결합되지 않은 폴리펩타이드 간의 평형을 가져다준 결합 수준의 약 95% 이상을 달성하기에 충분한 시간이다. 당업자는 평형을 달성하는데 필요한 시간이, 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 용이하게 결정될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실온에서는 일반적으로, 약 30분 동안 항온 배양하면 충분하다.
0.1% 트윈 20™을 함유하는 PBS와 같은 적당한 완충액으로 고체 지지체를 세척함으로써 결합되지 않은 샘플을 제거할 수 있다. 이어서, 리포터 그룹을 함유하는 제2의 항체를 상기 고체 지지체에 가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹에는 상기 언급된 그룹이 포함된다.
이어서, 검출용 시약을, 결합된 폴리펩타이드를 검출하기에 충분한 시간 동안 상기 고정화 항체-폴리펩타이드 복합체와 함께 항온 배양한다. 적당한 시간은 일반적으로, 일정 시간에 걸쳐 일어나는 결합 수준을 검정함으로써 결정할 수 있다. 이어서, 결합되지 않은 검출용 시약을 제거하고, 리포터 그룹을 사용하여 결합된 검출용 시약을 검출한다. 리포터 그룹을 검출하기 위해 이용되는 방법은 리포터 그룹의 종류에 의존한다. 방사성 그룹의 경우에는, 신틸레이션 계수 또는 자기방사법이 일반적으로 적당하다. 분광법을 이용하여 염료, 발광성 그룹 및 형광성 그룹을 검출할 수 있다. 상이한 리포터 그룹(통상적으로 방사성 또는 형광성그룹 또는 효소)과 커플링된 바이오틴은 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로, 기질을 가한 다음(일반적으로 특정 시간 동안), 이러한 반응 생성물을 분광법 또는 기타 분석법으로 검출할 수 있다.
암(예: 유방암)의 존재 또는 부재를 결정하기 위하여, 고체 지지체에 결합된 채로 있는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그날을 일반적으로, 컷-오프 예정치에 상응하는 시그날과 비교한다. 한 가지 바람직한 양태에서는, 암을 검출하기 위한 상기 컷-오프치가, 상기 고정화 항체를 암에 걸리지 않은 환자로부터의 샘플과 함께 항온 배양한 경우에 수득된 시그날 평균치이다. 일반적으로, 컷-오프 예정치 이상의 3 표준 편차인 시그날을 생성시키는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 간주될 수 있다. 또 다른 바람직한 양태에서는, 문헌[참조: Sackett et al.,Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p.106-7]의 방법에 따라서, 리시버 오퍼레이터 곡선(Receiver Operator Curve)을 사용하여 컷-오프치를 결정한다. 간략하게 언급하면, 이 양태에서는, 진단 시험 결과에 대해 가능한 각각의 컷-오프치에 상응하는 진짜 양성율(즉, 민감도)과 가짜 양성율(100%-특이도) 쌍을 플롯팅함으로써 컷-오프치를 결정할 수 있다. 업스트림 좌측 코너에 가장 근접한 플롯 상의 컷-오프치(즉, 가장 큰 면적을 포괄하는 값)가 가장 정확한 컷-오프치이고, 이러한 방법에 의해 결정된 컷-오프치 보다 높은 시그날을 생성하는 샘플이 양성으로 간주될 수 있다. 또 다른 한편, 이러한 컷-오프치는 가짜 양성율을 최소화하기 위해 플롯을 따라 좌측으로 이동할 수 있거나, 가짜 음성율을 최소화하기 위해 우측으로 이동할 수 있다. 일반적으로,이 방법에 의해 결정된 컷-오프치 보다 높은 시그날을 생성하는 샘플은 암에 대해 양성인 것으로 간주한다.
관련 양태에서는, 결합 제제를 니트로셀룰로즈와 같은 막 위에 고정화시키는 병류(flow-through) 또는 스트립 시험 포맷으로 검정을 수행한다. 이러한 병류 시험에서는, 샘플이 막 내로 통과함에 따라 샘플 내의 폴리펩타이드가 고정화 결합 제제와 결합된다. 이어서, 제2의 결합 제제를 함유하는 용액이 막 내로 유동함에 따라 제2의 표지된 결합 제제가 결합 제제-폴리펩타이드 복합체와 결합된다. 이어서, 결합된 제2의 결합 제제의 검출을 상기 언급된 바와 같이 수행할 수 있다. 스트립 시험 포맷에서는, 결합 제제가 결합되는 막의 한쪽 말단을 상기 샘플 함유 용액에 함침시킨다. 이 샘플은 제2의 결합 제제를 함유하는 영역을 통하여 막을 따라 고정화 결합 제제 영역 내로 이동한다. 고정화 항체 영역에 제2의 결합 제제가 농축되어 있는 것은 암의 존재를 지시해준다. 전형적으로, 이러한 부위에 제2의 결합 제제가 농축되어 있는 것은 가시적으로 판독할 수 있는 라인과 같은 특정 패턴을 만든다. 이러한 패턴의 부재는 음성 결과를 지시해준다. 일반적으로, 막 위에 고정화된 결합 제제의 양은 상기 논의된 포맷에서, 생물학적 샘플이 2개-항체 샌드위치 검정에서 양성 시그날을 생성시키기에 충분할 수 있는 폴리펩타이드 수준을 함유하는 경우에 가시적으로 식별할 수 있는 패턴을 생성시키도록 선택한다. 이러한 검정에 사용하기 바람직한 결합 제제는 항체 및 이의 항원 결합 단편이다. 바람직하게는, 막 위에 고정화된 항체의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍, 더욱 바람직하게는 약 50ng 내지 약 1㎍의 범위이다. 이러한 시험은 전형적으로 극히 소량의 생물학적 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
물론, 본 발명의 종양 단백질 또는 결합 제제와 함께 사용하기에 적합한 수 많은 기타 검정 프로토콜이 존재한다. 상기 기재 내용은 단지 예일 뿐이다. 예를 들면, 상기 프로토콜을 용이하게 변형시켜, 생물학적 샘플 내에서 유방 종양 폴리펩타이드와 결합되는 항체를 검출하기 위해 상기 폴리펩타이드를 사용할 수 있다는 것은 당업자에게 명백할 것이다. 이러한 유방 종양 단백질 특이적 항체의 검출은 암의 존재와 상관이 있을 수 있다.
암은 또한, 생물학적 샘플 내에 유방 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재를 근거로 하여 검출할 수 있다. 특정 방법 내에서는, 환자로부터 분리시킨 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 함유하는 생물학적 샘플을 유방 종양 폴리펩타이드, 이러한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분을 발현하는 APC와 함께 항온 배양하고, T 세포의 특이적 활성화가 존재 또는 부재하는지를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플에는 분리된 T 세포가 포함되지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, T 세포를 통상적인 기술(예를 들면, 말초혈 림프구를 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리시킴)에 의해 환자로부터 분리시킬 수 있다. T 세포를 폴리펩타이드(예: 5 내지 25㎍/ml)와 함께 37℃에서 2 내지 9일 동안(전형적으로 4일 동안) 시험관내에서 항온 배양할 수 있다. 대조군으로서 작용하는, 유방 종양 폴리펩타이드의 부재하에 또 다른 분취량의 T 세포 샘플을 항온 배양하는 것이 요망될 수 있다. CD4+T 세포의 경우,활성화는 T 세포의 증식을 평가함으로써 검출하는 것이 바람직하다. CD8+T 세포의 경우, 활성화는 세포용해 활성을 평가함으로써 검출하는 것이 바람직하다. 질병이 없는 환자 보다 증식 수준이 2배 이상 더 높고 세포용해 활성이 20% 이상 더 큰 것이 환자에게 암이 존재한다는 것을 지시해준다.
상기 언급된 바와 같이, 암은 또한, 생물학적 샘플 내에 유방 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 기준으로 하여 검출할 수도 있다. 예를 들면, 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 이용된 검정에 사용하여, 생물학적 샘플로부터 유도된 유방 종양 cDNA의 일정 부분을 증폭시킬 수 있는데, 여기서는 상기 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적이다(즉, 이와 하이브리드화된다). 이어서, 이와 같이 증폭된 cDNA를 분리시키고, 당해 분야에 널리 공지된 기술, 예를 들면, 겔 전기영동을 이용하여 검출한다. 유사하게는, 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 하이브리드화 검정에 사용하여, 생물학적 샘플 내에 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 존재하는지를 검출할 수 있다.
검정 조건 하에서 하이브리드화를 수행하기 위해서는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브가, 길이가 10개 이상, 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오타이드인 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일정 부분과의 동일률이 약 60% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 더욱 바람직하게는 약 90% 이상인 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함해야 한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브가 상기 언급된 바와 같은 적당한 엄중 조건 하에서, 본원에 기재된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화된다. 본원에 기재된 진단 방법에 유용하게 이용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 바람직하게는 길이가 10 내지 40개 이상의 뉴클레오타이드가다. 바람직한 양태에서는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489에 제시된 서열을 갖는 DNA 분자의 10개 이상의 연속되는 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15개 이상의 연속되는 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 이용 검정과 하이브리드화 검정 모두에 대한 기술은 당해 분야에 널리 공지되어 있다[참조: Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, 1987; Erlich et al., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989].
한 가지 바람직한 검정은 RT-PCR을 이용하는데, 여기서는 PCR을 역전사와 연계해서 적용한다. 전형적으로, RNA를 생물학적 샘플, 예를 들면, 생검 조직으로부터 추출하고, 이를 역전사시켜 cDNA 분자를 생성시킨다. 하나 이상의 특이적 프라이머를 사용하는 PCR 증폭으로 인해, cDNA 분자가 생성되며, 이는 예를 들어, 겔 전기영동을 이용하여 분리 및 가시화할 수 있다. 증폭은 시험 환자로부터 취한 생물학적 샘플 및 암에 걸리지 않은 개개인으로부터 취한 생물학적 샘플 상에서 수행할 수 있다. 증폭 반응은 2차수 크기로 확장되는 cDNA의 몇몇 희석물 상에서 수행할 수 있다. 암에 걸리지 않은 개개인으로부터의 샘플의 동일한 희석물과 비교한,시험 환자 샘플의 몇몇 희석물에서의 2배 이상의 발현 증가는 전형적으로, 양성인 것으로 간주된다.
또 다른 양태에서는, 본원에 기재된 조성물을 암 진행 과정의 마커로서 사용할 수 있다. 이러한 양태에서는, 암 진단을 위해 상기 언급된 바와 같은 검정을 시간에 따라 수행하고, 반응성 폴리펩타이드(들) 또는 폴리뉴클레오타이드(들)의 수준 변화를 평가한다. 예를 들면, 검정을 6개월 내지 1년에 걸쳐 24 내지 72시간 마다 수행한 후, 필요에 따라 수행할 수 있다. 일반적으로, 검출된 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 수준이 시간에 따라 증가하는 환자에게서 암이 진행되고 있다. 이와는 달리, 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 수준이 시간에 따라 일정하거나 감소될 때, 암은 진행되고 있지 않다.
특정의 생체내 진단 검정을 종양 상에서 직접 수행할 수 있다. 이러한 한 가지 검정은 종양 세포를 결합 제제와 접촉시키는 것을 포함한다. 이어서, 결합된 결합 제제를 리포터 그룹을 통하여 직접 또는 간접적으로 검출할 수 있다. 이러한 결합 제제를 또한, 조직학적 적용 분야에 사용할 수 있다. 또 다른 한편, 폴리뉴클레오타이드 프로브를 이러한 적용 분야 내에서 사용할 수 있다.
상기 언급된 바와 같이, 민감도를 개선시키기 위해, 다중의 유방 종양 단백질 마커를 소정의 샘플 내에서 검정할 수 있다. 본원에 제공된 상이한 단백질에 특이적인 결합 제제를 단일 검정 내에서 조합할 수 있다. 추가로, 다중 프라이머 또는 프로브를 동시에 사용할 수 있다. 종양 단백질 마커의 선별은 최적의 민감도를 가져다주는 조합물을 결정하기 위한 통상적인 실험에 근거할 수 있다. 또한,본원에 제공된 종양 단백질에 대한 검정을 기타 공지된 종양 항원에 대한 검정과 조합할 수 있다.
진단용 키트
본 발명은 추가로, 상기 진단 방법 내에 사용하기 위한 키트를 제공한다. 이러한 키트는 전형적으로, 진단 검정을 수행하는데 필요한 2개 이상의 성분을 포함한다. 성분들은 화합물, 시약, 용기 및/또는 장비일 수 있다. 예를 들면, 키트 내의 1개의 용기는 유방 종양 단백질과 특이적으로 결합되는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 이러한 항체 또는 단편은 상기 언급된 바와 같이, 지지체 물질에 부착되어 제공될 수 있다. 하나 이상의 부가의 용기에는 당해 검정에 사용될 요소, 예를 들면, 시약 또는 완충제가 함유될 수 있다. 이러한 키트는 또한, 항체 결합을 직접 또는 간접적으로 검출하는데 적합한 리포터 그룹을 함유하는, 상기 언급된 바와 같은 검출용 시약을 함유할 수 있다.
또 다른 한편, 키트는 생물학적 샘플 내의, 유방 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하도록 고안될 수 있다. 이러한 키트는 일반적으로, 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는, 상기 언급된 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는, 예를 들면, PCR 또는 하이브리드화 검정 내에서 사용할 수 있다. 상기 키트 내에 존재할 수 있는 부가의 성분에는 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출을 촉진시켜 주는 제2의 올리고뉴클레오타이드 및/또는 진단용 시약 또는 용기가 포함된다.
다음 실시예가 예시되며, 이로써 제한되지 않는다.
실시예 1
유방 종양 폴리펩타이드의 분리 및 성상 확인
본 실시예에는 유방 종양 cDNA 라이브러리로부터 유방 종양 폴리펩타이드를 분리하는 것이 기재되어 있다.
정상적인 유방 cDNA가 공제된 유방 종양으로부터의 cDNA를 함유하는 cDNA 공제 라이브러리를 다음과 같이 작제한다. 트리졸(Trizol) 시약[Gibco BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD]을 제조업자가 기재한 바와 같이 사용하여 1차 조직으로부터 총 RNA를 추출한다. 표준 프로토콜에 따라서 올리고(dT) 셀룰로즈 칼럼을 사용하여 폴리A + RNA를 정제한다. 다음 키트[Clontech PCR-Selet cDNA Subtraction Kit; Clontech, Palo Alto, CA]에 공급된 프라이머를 사용하여 제1 쇄 cDNA를 합성한다. 드라이버(driver) DNA는 2개의 정상적인 유방 조직으로부터의 cDNA로 구성되며, 테스터(tester) cDNA는 3개의 1차 유방 종양으로부터의 것이다. 테스터와 드라이버 모두에 대한 이본쇄 cDNA를 합성하고, 6개 염기쌍 DNA를 인식하는 엔도뉴클레아제(MluI, MscI, PvuII, SalI 및 StuI)의 조합물로 분해시킨다. 이러한 변형으로 인해, 클론테크(Palo, Alto, CA)의 프로토콜에 따라서 발생된 cDNA와 비교해서 평균 DNA 크기가 상당히 증가하였다. 상기와 같이 분해된 테스터 cDNA를 2개의 상이한 어댑터(adaptor)에 연결시키고, 클론테크 프로토콜에 따라서 상기 공제를 수행한다. 이와 같이 공제된 cDNA를 대상으로 하여, 제조업자의 프로토콜에 따라서 PCR 증폭을 2회전 수행한다. 이로써 생성된 PCR 생성물을 TA 클로닝 벡터인 pCRII(Invitrogen, San Diego, CA) 내로 아클로닝시키고, 전기천공에 의해 ElectroMax 이. 콜라이 DH10B 세포[Gibco BRL Life, Technologies] 내로 형질전환시킨다. DNA를 독립적인 클론으로부터 분리하고, 다음의 자동화 서열 분석기 모델 373A[Perkin Elmer/Applied Biosystems Division(Foster City, CA)]를 사용하여 서열 분석하였다.
63개의 독특한 cDNA 클론이 공제된 유방 종양 특이적 cDNA 라이브러리에서 발견되었다. 상기 클론에 대해 결정된 하나의 쇄(5' 또는 3') cDNA 서열이 서열 1-61, 72 및 73에 각각 제공되어 있다. EMBL 및 유전자 뱅크 데이터베이스(Release 97)를 사용하여 유전자 뱅크 내의 공지된 서열과 상기 cDNA 서열을 비교한 결과, 서열 14, 21, 22, 27, 29, 30, 32, 38, 44, 45, 53, 72 및 73에 제공된 서열과는 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않았다. 서열 1, 3, 16, 17, 34, 48, 57, 60 및 61은 공지된 사람 유전자를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 서열 2, 4, 23, 39 및 50은 기존에 동정된 비-사람 유전자와 몇몇 유사성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 나머지 클론(서열 5-13, 15, 18-20, 24-26, 28, 31, 33, 35-37, 40-43, 46, 47, 49, 51, 52, 54-56, 58 및 59)은 기존에 동정된 발현된 서열 태그(EST)와 적어도 일부 상동율을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
분리된 cDNA 클론의 mRNA 발현 수준을 결정하기 위해, 상기 언급된 유방 공제물로부터의 cDNA 클론을 무작위로 채취하고 콜로니 PCR 증폭시킨다. 마이크로어레이 기술[Synteni, Palo Alto, CA]을 사용하여, 유방 종양, 정상적인 유방 및 각종 기타 정상 조직에서의 이들의 mRNA 발현 수준을 결정한다. 간략하게 언급하면, PCR 증폭 생성물을 어레이 포맷으로 슬라이드 상에 어레이시킨는데, 각 생성물은 상기 어레이에서 독특한 위치를 점유하고 있다. mRNA를 시험하고자 하는 조직 샘플로부터 추출하고, 역전사시키며, 형광성 표지된 cDNA 프로브를 생성시킨다. 상기 마이크로어레이를 상기 표지된 cDNA 프로브로 프로빙시키고, 슬라이드를 스캐닝한 다음, 형광 세기를 측정한다. 신테니(Synteni) 제공된 GEMTOOLS 소프트웨어를 이용하여 데이터를 분석하였다. 검사된 17개 cDNA 클론 중에서, 서열 40, 46, 59 및 73의 클론이 유방 종양에서 과발현되었고, 시험된 모든 정상 조직(유방, PBMC, 결장, 태아 조직, 타액선, 골수, 폐, 췌장, 대장, 척수, 부신, 신장, 췌장, 간, 위, 골격근, 심장, 소장, 피부, 뇌 및 사람 포유류 상피 세포)에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 41 및 48의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 골수를 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 42의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 골수 및 척수를 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 43의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 척수, 심장 및 소장를 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 51의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 대장을 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 54의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, PBMC, 위 및 소장를 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 56의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 대장 및 소장, 사람 유방 상피 세포 및SCID 마우스-계대접종된 유방 종양을 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 60의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 척수 및 심장을 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 61의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 소장을 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 서열 72의 클론은 유방 종양에서 과발현되었고, 결장 및 타액선을 제외한 시험된 기타 모든 조직에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다.
클론 SYN18C6(서열 40)의 노던 블롯 분석 결과가 도 1에 도시되어 있다. SYN18C6에 의해 암호화된 예상되는 단백질 서열이 서열 62에 제공되어 있다.
유방 종양 조직에서 과발현되는 부가의 cDNA 클론을 유방 cDNA 공제 라이브러리로부터 다음과 같이 분리한다. 테스터로서 유방 종양 cDNA의 풀(pool)을 이용하고 드라이버로서 정상적인 유방 cDNA 또는 기타 정상 조직으로부터의 cDNA의 풀을 이용하여 PCR-이용된 공제에 의해, 상기 언급된 바와 같이 유방 공제 라이브러리를 제조한다. 유방 공제물로부터의 cDNA 클론을 무작위로 채취하고 콜로니 PCR 증폭시키며, 상기 언급된 바와 같은 마이크로어레이 기술을 사용하여, 유방 종양, 정상적인 유방 및 각종 기타 정상 조직에서의 이들의 mRNA 발현 수준을 결정한다. 24개의 독특한 cDNA 클론이 유방 종양에서 과발현되었고, 시험된 모든 정상 조직(유방, 뇌, 간, 췌장, 폐, 타액선, 위, 결장, 신장, 골수, 골격근, PBMC, 심장, 소장, 부신, 척수, 대장 및 피부)에서 낮은 수준으로 발현된 것으로 밝혀졌다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이 서열 63-87에 제시되어 있다. 서열 74-87을 상기언급된 바와 같은 유전자 뱅크 내의 서열과 비교한 결과, 기존에 동정된 사람 유전자와 상동성을 나타내었다. 서열 63-73의 서열에 대해서는 어떠한 실재적인 상동성도 발견하지 못하였다.
클론 B726P에 대한 3가지 DNA 이소형(서열 71에 제공된 부분 서열)은 다음과 같이 분리하였다. BamHI/XbaI 제한 분해시킴으로써 pT7Blue 벡터(Novagen)으로부터 B726P DNA를 절단하고, 이로써 생성된 DNA를 주형으로서, [α-32P]dCTP의 존재하에 일본쇄 PCR에 사용함으로써, 방사성 프로브를 B726P로부터 합성한다. 이러한 PCR에 이용된 프라이머의 서열이 서열 177에 제공되어 있다. 이로써 생성된 방사성 프로브를 사용하여, 유방 종양으로부터 분리된 RNA를 사용하여 만든 무작위 프라이밍된 cDNA 라이브러리 및 방향성 cDNA 라이브러리를 프로빙시킨다. 85개 클론을 동정, 절제, 정제 및 서열 분석하였다. 이들 85개 클론 중에서, 3개가 각각 실재적인 개방 판독 프레임을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이소형 B726P-20의 결정된 cDNA 서열이 서열 175에 제공되어 있고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열이 서열 176에 제시되어 있다. 이소형 B726P-74의 결정된 cDNA 서열이 서열 178에 제공되어 있고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열이 서열 179에 제시되어 있다. 이소형 B726P-79의 결정된 cDNA 서열이 서열 180에 제공되어 있고, 이에 상응하는 예상 아미노산 서열이 서열 181에 제시되어 있다.
표준 기술을 사용하여 완전한 길이의 B726P 클론을 수득하기 위한 일환으로, B726P의 부가의 5' 서열을 나타내는 5개의 부가의 클론을 분리하였다. 이들 클론은 동일한 유전자의 대체 스플라이스 형태인 것으로 보인다. 이들 클론의 결정된cDNA이 서열 464-468에 제시되어 있고, 서열 464-467에 의해 암호화된 예상 아미노산 서열이 각각 서열 470-473에 제시되어 있다. 표준 컴퓨터 기술을 사용하여, 2개의 큰 개방 판독 프레임을 함유하는 3,681bp 컨센서스 DNA 서열(서열 463)을 생성시켰다. 다운스트림 ORF는 서열 181의 아미노산 서열을 암호화한다. 업스트림 ORF에 의해 암호화된 예상 아미노산 서열이 서열 469에 제시되어 있다. 후속 연구 결과, 다른 형태에 비해 184bp 삽입물을 갖는 B726P의 부가의 스플라이스 형태를 분리하였다. 이러한 184bp 삽입물은, 다운스트림 및 업스트림 ORF를 함께 길이가 1002aa인 단일 ORF로 만드는 프레임시프트(frameshift)를 유발시킨다. 이러한 대체 스플라이스 형태의 결정된 cDNA 서열이 서열 474에 기재되어 있고, 상응하는 아미노산 서열이 서열 475에 제공되어 있다.
상기 언급된 cDNA 공제 라이브러리 기술을 사용하여, 유방 종양 조직에서 과발현되는 개개의 클론을 추가로 분리시킨다. 특히, 5가지 기타 정상적인 사람 조직 cDNA(뇌, 간, PBMC, 췌장 및 정상적인 유방)이 공제된 유방 종양으로부터의 cDNA를 함유하는 cDNA 공제 라이브러리를 상기 스크리닝에 활용하였다. 본래의 공제물로부터, DNA 서열 분석 및 마이크로어레이 분석에 의해 추가로 성상 확인하기 위해 177개 클론을 선별하였다. 마이크로어레이 분석 결과, 서열 182-251 및 479에서의 서열이 정상적인 사람 조직에 비해 사람 유방 종양 조직에서 2배 이상 과발현된 것으로 입증되었다. 서열 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246 및 479를 포함한, 이들 클론 중의 19개 클론에 대해서는 실재적인 상동성이 전혀 발견되지 않았으며, 몇몇 기존에 동정된 발현된 서열 태그(EST)는 제외된다. 나머지 클론은 기존에 동정된 유전자, 구체적으로는 서열 181-184, 187-193, 195-198, 200-204, 206, 207, 209, 210, 212, 213, 217, 218, 220, 221, 223-225, 227-231, 233-235, 237-239, 242-244 및 247-251과 일부 상동성이 있다.
마이크로어레이에 의해 유방 종양 조직에서 과발현되는 것으로 밝혀진, 상기 언급된 바와 같은 PCR 공제에 의해 분리된 cDNA 클론 중의 1개 클론(서열 176; B720P로서 지칭됨)이 공지된 케라틴 유전자와 동일한 것으로 밝혀졌다. 공지된 케라틴 유전자의 완전한 길이의 cDNA 서열이 서열 477에 제공되어 있고, 상응하는 아미노산 서열이 서열 478에 제시되어 있다. 서열 477의 서열을 기준으로 하여 프라이머를 생성시키고, 이를 사용하여 실시간 PCR 분석에서 B720P의 고발현을 나타내는 전체 RNA로부터 수득되는 mRNA로부터 완전한 길이의 cDNA를 클로닝하였다. 이어서, 생성물을 클로닝하고 서열 분석하였다. B720P에 대해 결정된 완전한 길이의 cDNA 서열이 서열 484에 제공되고, 상응하는 아미노산 서열이 서열 485에 제시되어 있다.
추가의 연구에서는, 절단된 형태의 B720P(B720P-tr로서 지칭됨)가 유방 암종에서 동정되었다. 이러한 항원은 실시간 PCR 분석에서 B720P-tr의 고발현을 나타내는 전체 유방 종양 RNA로부터 유도된 mRNA로부터 클로닝하였다. mRNA를 사용하여 cDNA 풀을 생성시킨 다음, 이를 주형으로서 사용하여, PCR에 의해 B720P-tr에 상응하는 cDNA를 증폭시킨다. B720P-tr에 대해 결정된 cDNA 서열이 서열 486에 제공되어 있다. B720P-tr은 236개 아미노산 단백질(서열 487)을 암호화하는 708개염기쌍의 ORF를 갖는다. 상기 전사체의 크기는 노던 분석으로 확인하였다.
유방 종양 조직에서 과발현을 나타내는 70개 클론 중에서, 15개가 정상 사람 조직에 비해 유방 종양에서 특히 우수한 발현 수준을 나타내었다. 다음의 11개 클론은 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 나타내지 않는다. 클론 19463.1(서열 185)은 대다수의 유방 종양 및 시험된 SCID 유방 종양에서 과발현되었으며(실시예 2 참조); 부가적으로, 과발현은 대다수의 정상적인 유방 조직에서 발견되었다. 클론 19483.1(서열 216)은 수 개의 유방 종양에서 과발현을 나타냈지만, 시험된 어떠한 정상 조직에서는 과발현을 전혀 나타내지 않았다. 클론 19470.1(서열 219)은 몇몇 유방 조직에서 약간 과발현을 나타내었다. 클론 19468.1(서열 222)은 시험된 대다수의 유방 종양에서 약간 과발현된 것으로 나타났다. 클론 19505.1(서열 226)은 유방 종양의 50% 및 SCID 종양 조직에서 약간 과발현된 것으로 나타났고, 정상적인 유방에서도 어느 정도의 과발현이 나타났다. 클론 1509.1(서열 232)은 유방 종양에서 거의 과발현되지 않았지만, 전이성 유방 종양 조직에서는 특정도의 과발현을 나타내었으며, 정상 조직에서는 상당한 수준의 과발현을 전혀 나타내지 않았다. 클론 19513.1(서열 236)은 수개의 유방 종양에서만 약간 과발현을 나타냈지만, 정상 조직에서는 상당한 수준의 과발현을 전혀 나타내지 않았다. 클론 19575.1(서열 240)은 몇몇 유방 종양 및 정상적인 유방에서 낮은 수준의 과발현을 나타내었다. 클론 19560.1(서열 241)은 시험된 유방 종양의 50% 및 몇몇 정상적인 유방 조직에서 과발현되었다. 클론 19583.1(서열 245)은 몇몇 유방 종양에서 약간 과발현되었으며, 정상 조직에서는 극히 낮은 수준의 과발현이 발견되었다. 클론 19587.1(서열 246)은 몇몇 유방 종양에서 낮은 수준의 과발현을 나타냈고 정상 조직에서는 어떠한 상당한 수준의 과발현도 나타내지 않았다.
염색체 11q13.31 상의 102D24와의 상동성을 나타내는 클론 19520.1(서열 233)은 유방 종양 및 SCID 종양에서 과발현된 것으로 나타났다. 사람 PAC 128M19 클론와의 상동성을 나타내는 클론 19517.1(서열 237)은 시험된 대다수의 유방 종양에서 약간 과발현된 것으로 나타났다. 사람 염색체 17과의 상동성을 나타내는 클론 19392.2(서열 247)은 시험된 유방 종양의 50%에서 과발현된 것으로 나타났다. 사람 Xp22 BAC GSHB-184P14와의 상동성을 나타내는 클론 19399.2(서열 250)은 시험된 제한된 수의 유방 종양에서 약간 과발현된 것으로 나타났다.
후속 연구에서는, 5개의 정상 조직(뇌, 간, PBMC, 췌장 및 정상적인 유방)으로부터의 cDNA가 공제된 유방 종양 풀로부터의 cDNA를 함유하는 공제된 cDNA 라이브러리로부터 64개 개개의 클론을 분리하였다. 상기 공제된 cDNA 라이브러리를 다음과 같이 변형시키면서, 상기 언급된 바와 같이 제조하였다. RsaI 대신 5가지의 6개 염기 커터(MluI, MscI, PvuII, SalI 및 StuI)의 조합물을 사용하여 cDNA를 분해시킨다. 이로써, 평균 삽입물 크기가 300bp에서 600bp로 증가되었다. 64개의 분리된 클론을 콜로니 PCR 증폭시키고, 상기 언급된 바와 같은 마이크로어레이 기술을 사용하여, 유방 종양 조직, 정상적인 유방 및 각종 기타 정상 조직에서의 이들의 mRNA 발현 수준을 검사한다. 유방 종양 조직에서 과발현되는 것으로 나타난 11개 클론의 결정된 cDNA 서열이 서열 405-415에 제공되어 있다. 이들 서열을 상기 요약된 바와 같은 공개된 데이터베이스와 비교한 결과, 서열 408, 411, 413 및414와 기존에 분리된 EST 간에는 상동성이 있는 것으로 나타났다. 서열 405-407, 409, 410, 412 및 415는 기존에 동정된 서열과 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
추가의 연구에서는, 상기 언급된 바와 같은 클론테크의 PCR-공제 프로토콜을 사용하여 5가지 정상 조직(유방, 뇌, 폐, 췌장 및 PBMC)로부터의 cDNA 풀이 공제된 전이성 유방 종양으로부터의 cDNA로부터, 공제된 cDNA 라이브러리를 제조한다. 상기 라이브러리로부터 분리된 90개 클론의 결정된 cDNA 서열이 서열 316-404에 제공되어 있다. 이들 서열을 상기 요약된 바와 같은 공개된 데이터베이스와 비교한 결과, 서열 366과 어떠한 실재적인 상동성도 나타내지 않았다. 서열 321-325, 343, 354, 368, 369, 377, 382, 385, 389, 395, 397 및 400는 기존의 분리된 EST와 약간의 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 나머지 서열은 기존에 동정된 유전자 서열과 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌다.
추가의 연구에서는, 상기 언급된 바와 같은 클론테크의 PCR-공제 프로토콜을 사용하여 6가지 정상 조직(간, 뇌, 위, 소장, 신장 및 심장)로부터의 cDNA 풀이 공제된 유방 종양으로부터의 cDNA로부터, 공제된 cDNA 라이브러리(2BT로서 지칭됨를 제조한다. 이러한 공제로부터 분리된 cDNA 클론을 대상으로 하여, 상기 언급된 바와 같은 DNA 마이크로어레이 분석을 수행하고, 이로써 생성된 데이터에 4가지 변형된 GEMTOOLS 분석을 수행한다. 첫 번째 분석은 28개 유방 종양을 28개 비-유방 정상 조직과 비교하였다. 선별 컷-오프로서 2.1배 이상의 평균 과발현도를 사용하였다. 두 번째 분석은 6개 전이성 유방 종양을 29개 비-유방 정상 조직과 비교하였다. 컷-오프로서 2.5배 이상의 평균 과발현도를 사용하였다. 세 번째 및 네 번째 분석은 2개의 초기 SCID 마우스-계대접종된 종양과 2개의 후기 SCID 마우스-계대접종된 종양과 비교하였다. 컷-오프로서 초기 또는 후기 계대접종된 종양에서 2.0배 이상의 평균 과발현도를 사용하였다. 또한, 2BT 클론에 대한 마이크로어레이 데이터을 대상으로 하여, 가시적인 분석을 수행하였다. 이러한 가시적인 분석에서 동정된 13개 클론의 결정된 cDNA 서열이 서열 427-439에 제공되어 있다. 변형된 GEMTOOLS 분석을 사용하여 동정된 22개 클론의 결정된 cDNA 서열이 서열 440-462에 제공되어 있고, 서열 453 및 454는 동일한 클론의 2개의 부분적, 비-중첩성 서열을 나타낸다.
서열 436 및 437의 클론 서열(263G6 및 262B2로서 지칭됨)을 상기 언급된 바와 같은 공개된 데이터베이스와 분석한 결과, 기존에 동정된 서열과 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않은 것으로 밝혀졌다. 서열 427, 429, 431, 435, 438, 441, 443, 444, 445, 446, 450, 453 및 454(266B4, 266G3, 264B4, 263G1, 262B6, 2BT2-34, 2BT1-77, 2BT1-62, 2BT1-60,61, 2BT1-59, 2BT1-52 및 2BT1-40으로서 각각 지칭됨)의 서열은 기존에 분리된 발현된 서열 태그(EST)와 약간의 상동성을 나타낸다. 서열 428, 430, 432, 433, 434, 439, 440, 442, 447, 448, 449, 451, 452 및 455-462(클론 22892, 22890, 22883, 22882, 22880, 22869, 21374, 21349, 21093, 21091, 21089, 21085, 21084, 21063, 21062, 21060, 21053, 21050, 21036, 21037 및 21048로서 각각 지칭됨)은 기존에 사람에게서 동정된 유전자 서열과 약간의 상동성을 나타낸다.
실시예 2
SCID-계대접종된 종양 RNA를 사용하여 PCR-이용된 공제에 의해 수득된 유방 종양 폴리펩타이드의 분리 및 성상 확인
다음과 같이 SCID 마우스 계대접종된 유방 종양을 사용하여 PCR-이용된 공제에 의해 사람 유방 종양 항원을 수득하였다. 사람 유방 종양을, 미국 특허원 제08/556,659호(11/13/95자 출원), 미국 특허 제5,986,170호에 기재된 바와 같이, SCID 마우스에 이식하고, 첫 번째 또는 6번째 일련의 계대접종시 이를 수거한다. 초기 및 후기 계대접종 SCID 종양 사이에 시차적으로 발현될 것으로 밝혀진 유전자는 단계 특이적이므로, 치료 및 진단 적용 분야에 유용하다. 첫 번째 및 6번째 계대접종 모두로부터의 스냅 동결된 SCID 계대접종된 사람 유방 종양으로부터 전체 RNA를 제조하였다.
PCR 이용 공제를 본질적으로 상기 언급된 바와 같이 수행한다. 제1 공제(T9로서 지칭됨)에서는, 제1 계대접종 종양으로부터의 RNA를 제6 계대접종 종양 RNA로부터 공제하여, 보다 공격적인, 후기 계대접종 특이적 항원을 동정한다. 이러한 공제로부터 분리 및 서열 분석된 64개 클론 중에서, 30개 클론이 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않았는데, 이들은 나중에 13053, 13057, 13059, 13065, 13067, 13068, 13071-13073, 13075, 13078, 13079, 13081, 13082, 13092, 13097, 13101, 13102, 13131, 13133, 13119, 13135, 13139, 13140, 13146-13149 및 13151로서 지칭되며, 몇몇의 기존에 동정된 발현된 서열 태그(EST)는 예외다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이 서열 88-116에 각각 제시되어 있다. 서열 117-140의 분리된 cDNA 서열이 공지된 유전자와 상동성을 나타내었다.
제2 PCR 이용 공제에서는, 제6 계대접종 종양으로부터의 RNA를 제1 계대접종 종양 RNA로부터 공제하여, 다중 계대접종 전반에 걸쳐 하향 조절된 항원을 동정한다. 분리 및 서열 분석된 36개 클론 중에서, 19개 클론이 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않았는데, 이들은 나중에 14376, 14377, 14383, 14384, 14387, 14392, 14394, 14398, 14401, 14402, 14405, 14409, 14412, 14414-14416, 14419, 14426 및 14427로서 지칭되며, 몇몇의 기존에 동정된 발현된 서열 태그(EST)는 예외다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이 서열 141-159에 각각 제시되어 있다. 서열 160-174의 분리된 cDNA 서열이 기존의 공지된 유전자와 상동성을 나타내었다.
제1 및 제6 계대접종 SCID 종양 RNA를 사용하여 PCR 이용 공제를 통하여 사람 유방 종양 항원을 추가로 분석하였다. 63개 클론이, 마이크로어레이 분석으로써 결정된 바와 같이, 2배 이상 간격으로 시차적으로 발현되는 것으로 밝혀졌는데, 즉 후기 계대접종 종양에 비해 초기 계대접종 종양에서 보다 높은 수준으로 발현된다. 이들 클론 중 17개는 공지된 어떠한 유전자와도 실재적인 상동성을 전혀 나타내지 않았지만, 기존에 동정된 발현된 서열 태그(EST)와는 몇몇 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌는데, 이들은 나중에 20266, 20270, 20274, 20276, 20277, 20280, 20281, 20294, 20303, 20310, 20336, 20341, 20941, 20954, 20961, 20965 및 20975(각각 서열 252-268)로서 지칭된다. 나머지 클론은 공지된 유전자와 몇몇 상동성을 나타내는 것으로 밝혀졌으며, 상기 도면의 간단한 설명 및 서열 동정 섹션에서 동정되었고, 나중에 20261, 20262, 20265, 20267, 20268, 20271, 20272,20273, 20278, 20279, 20293, 20300, 20305, 20306, 20307, 20313, 20317, 20318, 20320, 20321, 20322, 20326, 20333, 20335, 20337, 20338, 20340, 20938, 20939, 20940, 20942, 20943, 20944, 20946, 20947, 20948, 20949, 20950, 20951, 20952, 20957, 20959, 20966, 20976, 20977 및 20978로서 지칭된다. 이들 클론에 대해 결정된 cDNA 서열이 서열 269-314에 각각 제공되어 있다.
마이크로어레이 분석을 이용하여 수득된 결과에 근거하여 추가로 분석하기 위해, 클론 20310, 20281, 20262, 20280, 20303, 20336, 20270, 20341, 20326 및 20977(B820P, B821P, B822P, B823P, B824P, B825P, B826P, B827P, B828P 및 B829P로서 각각 지칭됨)을 선별하였다. 구체적으로 언급하면, 마이크로어레이 데이터 분석은 이들 클론이 시험된 정상 조직과 비교해서 유방 종양 RNA에서 2 내지 3배 이상 과발현된다는 것을 지시해준다. 후속 연구는, 클론 B820P, B821P, B822P, B823P, B824P, B825P, B826P, B827P, B828P 및 B829P에 대한 완전한 삽입 서열을 결정해준다. 이들 연장된 cDNA 서열이 서열 416-426에 각각 제시되어 있다.
실시예 3
폴리펩타이드의 합성
HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성화를 이용한 FMOC 화학을 사용하여, 합성기[Perkin Elmer/Applied Biosystems Division 430A 펩타이드 합성기] 상에서 폴리펩타이드를 합성할 수 있다. Gly-Cys-Gly 서열을 상기 펩타이드의 아미노 말단에 부착하여 이러한 펩타이드의 접합, 고정화 표면에 대한 결합 또는 표지화 방법을 제공할 수 있다. 상기 펩타이드를고체 지지체로부터 절단시키는 것은 다음의 절단 혼합물을 사용하여 수행할 수 있다: 트리플루오로아세트산:에탄디티올:티오아니졸:물:페놀(40:1:2:2:3). 2시간 동안 절단시킨 후, 상기 펩타이드를 찬 메틸-t-부틸-에테르에 침전시킬 수 있다. 이어서, 펩타이드 펠릿을 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)을 함유하는 물에 용해시키고, 동결건조시킨 후, C18 역상 HPLC함으로써 정제할 수 있다. 수(0.1% TFA 함유) 중의 0 내지 60% 아세토니트릴(0.1% TFA 함유)의 구배를 사용하여 펩타이드를 용출시킨다. 순수한 분획을 동결건조시킨 후, 전기분무 또는 기타 유형의 질량 분광법 및 아미노산 분석에 의해 상기 펩타이드를 성상 확인할 수 있다.
실시예 4
사람 혈액에서 유방 항원 특이적 CTL 반응의 유도
본 실시예는 정상적인 사람으로부터의 말초혈 림프구에서 세포독성 T 림프구(CTL) 반응을 유도시키는 유방 특이적 항원 B726P의 능력을 예시하고 있다.
10% 사람 혈청, 30ng/ml GM-CSF 및 30ng/ml IL-4를 함유하는 RPMI 배지에서 5일 동안 성장시킴으로써, 자가 수지상 세포(DC)를 정상적인 공여자의 PBMC로부터 유도된 단구 배양물과 구별시킨다. 5일 동안 배양한 후, DC를 재조합 B726P(다운스트림 ORF; 서열 181)를 발현하는 아데노바이러스로 M.O.I. 2.5로 밤새 감염시키고, 2마이크로그램/ml CD40 리간드를 가함으로써 8시간 동안 성숙시킨다. CD4 및 CD14-양성 세포를 고갈시킴으로써 CD8 양성 세포를 강화시킨다. 프라이밍 배양을, 몇몇 96-웰 판의 개개의 웰에서 사이토킨 IL-6 및 IL-12와 함께 개시한다. 이들 배양물을, IFN-감마로 처리되고 B726P 및 CD80으로 형질도입시킨 자가 섬유아세포를 사용하여 IL-2의 존재하에 재자극시킨다. 3회 자극시킨 후, 항원 제공 세포(APC)로서 B726P 또는 무관한 대조군 항원을 발현하도록 형질도입된, IFN-감마 처리된 자가 섬유아세포를 사용하여, IFN-감마 엘리스폿 검정[참조: Lalvani et al., J. Exp. Med. 186:859-865, 1997]에서 B726P 특이적 CTL 활성의 존재 여부를 평가한다. 대략 96개 라인 중에서, B726P-형질도입된 APC를 특이적으로 인식하지만, 대조군 항원-형질도입된 APC는 특이적으로 인식하지 못하는 것으로 보이는 1개의 라인(6-2B로서 지칭됨)이 동정되었다. 이러한 미세배양물을 표준 프로토콜을 사용하여 클로닝한다. B726P 특이적 CTL을 엘리스폿 분석에 의해 동정하고, 추가의 분석을 위해 확장시킨다. 이들 CTL 클론은 크롬-51 방출 검정을 사용하여, B726P 발현성 섬유아세포는 인식하지만, 대조군 항원 MART-1은 인식하지 못하는 것으로 입증하였다. 더우기, 항체 차단 검정에서 B726P로 형질도입된 동종이계 섬유아세포 패널을 사용하여, 이들 B726P 특이적 CTL에 대한 HLA 제한 요소를 HLA-B*1501로서 동정하였다.
B726P 특이적 CTL 클론에 의해 인식된 에피토프의 위치를 보다 정확히 규정하기 위해, B726P의 N-말단 절반만을 포함하는 결실 작제물(B726Pdelta3')을 pBIB 레트로바이러스성 발현 플라스미드 내로 작제하였다(aa 1-129). 상기 플라스미드 및 B726P를 함유하는 기타 플라스미드를 단독으로 또는 HLA-B*1501을 발현하는 플라스미드와 조합하여 COS-7 세포 내로 형질감염시킨다. 형질감염시킨지 대략 48시간 후, B726P 특이적 CTL 클론(1-9B)을 웰당 대략 10e4 세포로 가한다. 그 다음날 웰을 수거하고, 방출된 IFN-감마의 양을 ELISA로 측정한다. CTL은 B726P 및 HLA-B*1501 모두로 형질감염시킨 COS-7 세포에 대해 위 배경(EGFP) 반응하였다. B726P 또는 HLA-B*1501 만으로 형질감염시킨 COS-7 세포에 대해서는 위 배경 반응이 전혀 없었다. 중요하게는, HLA-B*1501 및 B726delta3'으로 형질감염시킨 COS-7 세포를 이용해서는 보다 높은 반응을 관찰하였다. 이러한 결과는, 에피토프가 B726P의 N-말단 영역(a.a. 1-129)에 위치하고 있다는 것을 지시해준다. 상기 영역을 검사하고, HLA-B*1501 펩타이드 결합 모티프[참조: J. Immunol. 1999, 162:7277-84]에 상응하는 아미노산 서열을 동정 및 합성하였다. 이들 펩타이드를 10㎍/ml로 자가 B-LCL 상으로 밤새 펄싱하였다. 그 다음날, 상기 세포를 세척하고, B726P 특이적 CTL 클론 1-9B를 자극하는 상기 세포의 능력을 IFN-감마 ELISPOT 검정으로 검정하였다. 시험된 11개 펩타이드 중에서, 아미노산 서열 SLTKRASQY(a.a. 76-84; 서열 488)을 갖는 1개의 펩타이드만이 CTL에 의해 인식될 수 있었다. 이러한 결과는 상기 펩타이드를, 상기 B726P 특이적 CTL 클론에 의해 인식된 천연-처리된 에피토프로서 확인시켜 준다.
실시예 5
유방 종양 폴리펩타이드에 대한 항체의 제조 및 성상 확인
유방 종양 항원 B726P에 대한 폴리클로날 항체를 다음과 같이 제조하였다.
이. 콜라이 재조합 발현 시스템에서 발현된 B726P의 다운스트림 ORF(서열 181)을 진탕 항온 배양기에서 37℃ 하에 적당한 항생제와 함께 LB 육즙에서 밤새 성장시킨다. 그 다음날 아침, 밤새 배양물 10ml를 2L 배플된 에를렌마이어 플라스크에서 500ml 내지 2x YT 플러스 적당한 항생제에 가한다. 배양물의 광밀도(560nm에서)가 0.4 내지 0.6에 도달하면, 상기 세포를 IPTG(1mM)로 유도시킨다. IPTG로 유도시킨지 4시간 후, 세포를 원심분리시켜 수거한다. 이어서, 상기 세포를 인산염 완충 식염수로 세척하고 다시 원심분리시킨다. 상등액을 경사 제거하고, 세포를 추가의 사용 또는 즉시 처리하기 위해 동결시킨다. 용균 완충액 20ml를 세포 펠릿에 가하고 와동시킨다. 이. 콜라이 세포를 파쇄시키기 위해, 상기 혼합물을 프렌치 프레스 내로 16,000psi의 압력으로 수행한다. 이어서, 상기 세포를 다시 원심분리시키고, 재조합 단백질을 분별시키기 위해 상등액과 펠릿을 SDS-PAGE로 체크한다. 세포 펠릿에 국재된 단백질의 경우에는, 펠릿을 10mM 트리스 pH 8.0, 1% CHAPS에 재현탁시키고, 봉입체 펠릿을 세척한 다음, 다시 원심분리시킨다. 이러한 과정을 2회 이상 반복하였다. 이와 같이 세척된 봉입체 펠릿을 8M 우레아 또는 6M 구아니딘 HCL(10mM 트리스 pH 8.0 플러스 10mM 이미다졸을 함유함)로 가용화시킨다. 이와 같이 가용화된 단백질을 5ml의 니켈-킬레이트 수지(Qiagen)에 가하고, 지속적으로 진탕시키면서 실온에서 45분 내지 1시간 동안 항온 배양한다. 항온 배양 후, 수지 및 단백질 혼합물을 1회용 칼럼 내로 따라 붓고 병류를 수집한다. 이어서, 상기 칼럼을 가용화 완충액 10 내지 20칼럼 용적으로 세척한다. 이어서, 항원을 8M 우레아, 10mM 트리스 pH 8.0 및 300mM 이미다졸을 사용하여 상기 칼럼으로부터 용출시키고, 3ml 분획으로 수집한다. SDS-PAGE 겔을 수행하여, 추가의 정제를 위해 모아진 분획을 결정한다.
최종 정제 단계로서, 강력한 음이온 교환 수지, 예를 들면, HiPrepQ(Biorad)를 적당한 완충액으로 평형시키고, 위로부터 모아진 분획을 상기 칼럼에 부하한다.염 구배를 증가시키면서 칼럼으로부터 항원을 용출 제거시킨다. 칼럼을 수행함에 따라 분획을 수집하고, 또 다른 SDS-PAGE 겔을 수행하여, 칼럼으로부터 풀에 모아진 분획을 결정한다. 이와 같이 모아진 분획을 10mM 트리스 pH 8.0에 대해 투석시킨다. 이어서, 0.22마이크론 필터 내로 여과시킨 후 바이알에 담고, 면역화에 필요할 때까지 항원을 동결시킨다.
400마이크로그램의 B726P 항원을 100마이크로그램의 뮤라밀디펩타이드(MDP)와 조합한다. 4주마다 래빗을, 등 용적의 불완전 프로인트 애쥬반트(IFA)로 혼합된 100마이크로그램으로 부스팅한다. 각 부스팅한지 7일 후에, 상기 동물을 방혈시킨다. 상기 혈액을 4℃에서 12 내지 24시간 동안 항온 배양한 다음 원심분리시킴으로써 혈청을 생성시킨다.
96웰 판을 4℃에서 20시간 동안 재조합 단백질 50마이크로리터(전형적으로 1마이크로그램)와 함께 항온 배양함으로써 B726P 항원으로 코팅시킨다. BSA 차단 완충액 250마이크로리터를 상기 웰에 가하고, 실온에서 2시간 동안 항온 배양한다. 판을 PBS/0.01% 트윈으로 6회 세척한다. 래빗 혈청을 PBS에서 희석시킨다. 희석된 혈청 50마이크로리터를 각 웰에 가하고 실온에서 30분 동안 항온 배양한다. 판을 상기 언급된 바와 같이 세척한 후, 고우트 항-래빗 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 500마이크로리터를 1:10000 희석도로 가하고 실온에서 30분 동안 항온 배양한다. 판을 상기 언급된 바와 같이 다시 세척하고, TMB 마이크로웰 퍼옥시다제 기질 100마이크로리터를 각 웰에 가한다. 실온하 암실에서 15분 동안 항온배양한 후, 1N H2SO4100마이크로리터를 사용하여 비색 반응을 중단시키고, 450nm에서 즉시 판독한다. 폴리클로날 항체는 B726P에 대한 면역반응성을 나타내었다.
실시예 6
유방 종양 항원의 단백질 발현
B726P의 다운스트림 ORF(서열 181)을 C-말단 6X His 태그와 함께, 다음과 같이 바쿨로바이러스 발현 시스템을 사용하여 곤충 세포에서 발현시킨다.
B726P의 완전한 길이의 다운스트림 ORF에 대한 cDNA를, 서열 480 및 481의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭시킨다. 예상된 크기를 갖는 PCR 생성물을 아가로즈 겔로부터 회수하고, EcoRI 및 HindII로 제한 분해시키며, 전이 플라스미드 pFastBac1에 연결하는데, 이를 동일한 제한 효소로 분해시킨다. 삽입물의 서열을 DNA 서열 분석으로 확인한다. 재조합 전이 플라스미드 pFBB726P를 사용하여, Bac-To-Bac 바쿨로바이러스 발현 시스템(BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 이용하여 재조합 백미드 DNA 및 바이러스를 만든다. 높은 5개의 세포를 재조합 바이러스 BVB726P로 감염시켜 단백질을 생성시킨다. 발현된 B726P 재조합 단백질의 cDNA 및 아미노산 서열이 서열 482 및 483에 각각 제공되어 있다.
전술한 내용으로부터, 본 발명의 특정한 양태가 예시를 목적으로 본원에 기재되었지만, 본 발명의 요지 및 범위를 벗어나지 않은 각종 변형이 일어날 수 있다는 것을 인지해야 할 것이다.

Claims (72)

  1. (a) 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489에 제시된 서열;
    (b) 적당한 엄중 조건(stringent condition)하에서 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열 및
    (c) (a) 또는 (b) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  2. 제1항에 있어서, 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열 중 어느 하나의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  3. 서열 176, 179, 181, 469-473, 475, 485, 487 및 488 중 어느 하나에 제시된서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  4. 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484 및 486 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 15개 이상의 아미노산 잔기를 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드; 또는 항원 특이적 항혈청과 반응하는 변이체의 능력이 실질적으로 감소되지 않도록 해주는 하나 이상의치환, 결실, 부가 및/또는 삽입에 있어서 상이한 이의 변이체.
  5. 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 또는 이러한 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 변이체.
  6. 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489 중 어느 하나에 제시된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  7. 적당한 엄중 조건 하에서 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 따르는 폴리뉴클레오타이드에 상보적인 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따르는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  10. 제9항에 따르는 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
  11. 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열, 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질과 특이적으로 결합되는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  12. 제1항에 따르는 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질.
  13. 제12항에 있어서, 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염된 숙주 세포에서 이러한 융합 단백질의 발현을 증가시키는 발현 인핸서를 포함하는 융합 단백질.
  14. 제12항에 있어서, 제1항의 폴리펩타이드 내에 존재하지 않는 T 헬퍼(helper) 에피토프를 포함하는 융합 단백질.
  15. 제12항에 있어서, 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질.
  16. 제1 아미노산 부분과 제2 아미노산 부분을 포함하여, 당해 제1 아미노산 부분이 서열 493의 아미노산 1-93으로써 제시된 바와 같은 맘마글로빈으로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하고; 당해 제2 아미노산 부분이 서열 475, 469 또는 176으로써 제시된 바와 같은 B726P로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하며; 당해 제1 아미노산 부분이 제2 아미노산 부분의 아미노 말단부 또는 카복시 말단부에 연결됨을 특징으로 하는 융합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 제1 아미노산 부분이 IDELKECFLNQTDETLSNVE(서열 493의 아미노산 59-78); TTNAIDELKECFLNQ(서열 493의 아미노산 55-69); SQHCYAGSGCPLLENVISKTI(서열 493의 아미노산 13-33); EYKELLQEFIDDNATTNAID(서열 493의 아미노산 41-60); KLLMVLMLA(서열 493의 아미노산 2-10); QEFIDDNATTNAI(서열 493의 아미노산 47-59) 및 LKECFLNQTDETL(서열 493의 아미노산 62-74)로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 융합 단백질.
  18. 제16항에 있어서, 제2 아미노산 부분이 서열 475에 제시된 바와 같은 B726P의 조합된 업스트림 및 다운스트림 개방 판독 프레임(ORF)에 의해 암호화된 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
  19. 제16항에 있어서, 제2 아미노산 부분이 서열 469에 제시된 바와 같은 B726P의 업스트림 ORF에 의해 암호화된 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
  20. 제16항에 있어서, 제2 아미노산 부분이 서열 176에 제시된 바와 같은 B726P의 다운스트림 ORF에 의해 암호화된 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
  21. 제16항에 있어서, 제2 아미노산 부분이 서열 475의 아미노산 1-129로써 제시된 아미노산 서열로부터의 9개 이상의 연속되는 아미노산을 포함하는 융합 단백질.
  22. 제16항에 있어서, 서열 493에 제시된 바와 같은 융합 단백질.
  23. 제16항에 있어서, 서열 494에 제시된 바와 같은 융합 단백질.
  24. 제16항에 있어서, 서열 495에 제시된 바와 같은 융합 단백질.
  25. 제12항 또는 제16항에 따르는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  26. 제16항에 있어서, 제1 아미노산 부분이 제2 아미노산 부분의 N-말단에 연결되는 융합 단백질.
  27. 제16항에 있어서, 제1 아미노산 부분이 제2 아미노산 부분의 C-말단에 연결되는 융합 단백질.
  28. 제12항 또는 제16항에 따르는 융합 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  29. (a) 제1항에 따르는 폴리펩타이드;
    (b) 제4항에 따르는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 제11항에 따르는 항체;
    (d) 제12항 또는 제16항에 따르는 융합 단백질 및
    (e) 제28항에 따르는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분과 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. (a) 제1항에 따르는 폴리펩타이드;
    (b) 제4항에 따르는 폴리뉴클레오타이드;
    (c) 제11항에 따르는 항체;
    (d) 제12항 또는 제16항에 따르는 융합 단백질 및
    (e) 제28항에 따르는 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분과 면역자극제를 포함하는 면역원성 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 면역자극제가 애쥬반트(adjuvant)인 면역원성 조성물.
  32. 제30항에 있어서, 면역자극제가 주로 유형 I 반응을 유도시키는 면역원성 조성물.
  33. 제29항에 따르는 약제학적 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 당해 환자에게서 암 발생을 억제하는 방법.
  34. 제30항에 따르는 면역원성 조성물의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 당해 환자에게서 암 발생을 억제하는 방법.
  35. 제1항에 따르는 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포를 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 함께 포함하는 약제학적 조성물.
  36. 제29항에 있어서, 항원 제공 세포가 수지상 세포 또는 대식세포인 약제학적 조성물.
  37. (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492에 제시된 서열;
    (b) 적당한 엄중 조건 하에서 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열 및
    (c) (a) 또는 (b) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체를 발현하는항원 제공 세포를, 면역자극제와 함께 포함하는 면역원성 조성물.
  38. 제37항에 있어서, 면역자극제가 애쥬반트인 면역원성 조성물.
  39. 제37항에 있어서, 면역자극제가 주로 유형 I 반응을 유도시키는 면역원성 조성물.
  40. 제37항에 있어서, 항원 제공 세포가 수지상 세포인 면역원성 조성물.
  41. (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492에 제시된 서열;
    (b) 적당한 엄중 조건 하에서 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열 및
    (c) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 (a) 또는 (b) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체를 발현하는 항원 제공 세포의 유효량을 환자에게 투여함으로써 당해 환자에게서 암의 발생을 억제함을 포함하여, 당해 환자에게서 암의 발생을 억제하는 방법.
  42. 제41항에 있어서, 항원 제공 세포가 수지상 세포인 방법.
  43. 제33항, 제34항 및 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  44. (i) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 및
    (ii) 당해 폴리뉴클레오타이드의 상보성 폴리뉴클레오타이드로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포를, 해당 항원을 발현하는 세포를 특정 생물학적 샘플로부터 제거시키기에 충분한 시간 및 조건 하에서 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계를 포함하는, 당해 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 생물학적 샘플이 혈액 또는 이의 분획인 방법.
  46. 제44항의 방법에 따라서 처리된 생물학적 샘플을 환자에게 투여함을 포함하여, 상기 환자에게서 암의 발생을 억제하는 방법.
  47. (a) (i) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492에 제시된 서열;
    (ii) 적당한 엄중 조건 하에서 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열 및
    (iii) (i) 또는 (ii) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체;
    (b) (a)의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및
    (c) (a)의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분을, T 세포를 자극하고/하거나 확장시키기에 충분한 시간 및 조건 하에서 T 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 당해 유방 종양 단백질에 대해 특이적인 T 세포를 자극하고/하거나 확장시키는 방법.
  48. 제47항의 방법에 따라서 제조된 T 세포를 포함하는, 분리된 T 세포 집단.
  49. 제49항에 따르는 T 세포 집단의 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 상기 환자에게서 암의 발생을 억제하는 방법.
  50. (a) (i) (1) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486및 489-492에 제시된 서열;
    (2) 적당한 엄중 조건 하에서 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열 및
    (3) (1) 또는 (2) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체;
    (ii) (i)의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및
    (iii) (i)의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분을, 환자로부터 분리시킨 CD4+및/또는 CD8+T 세포와 함께 항온 배양하여 T 세포를 증식시키는 단계 및
    (b) 이와 같이 증식된 T 세포의 유효량을 당해 환자에게 투여함으로써 당해 환자에게서 암 발생을 억제시키는 단계를 포함하는, 당해 환자에게서 암의 발생을 억제하는 방법.
  51. (a) (i) (1) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492에 제시된 서열;
    (2) 적당한 엄중 조건 하에서 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 서열과 하이브리드화하는 서열 및
    (3) (1) 또는 (2) 서열의 상보성 서열로 이루어진 그룹 중에서 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드, 또는 이의 변이체;
    (ii) (i)의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및
    (iii) (i)의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제공 세포로 이루어진 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 성분을, 환자로부터 분리시킨 CD4+및/또는 CD8+T 세포와 함께 항온 배양하여 T 세포를 증식시키는 단계;
    (b) 이와 같이 증식된 하나 이상의 세포를 클로닝하여 클론된 T 세포를 제공하는 단계 및
    (c) 이와 같이 클론된 T 세포의 유효량을 당해 환자에게 투여함으로써 당해 환자에게서 암 발생을 억제시키는 단계를 포함하는, 당해 환자에게서 암의 발생을 억제하는 방법.
  52. (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질과 결합하는 결합 제제를, 특정 환자로부터 수득된 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 당해 샘플에서, 당해 결합 제제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하는 단계 및
    (c) 이러한 폴리펩타이드의 양을 컷-오프(cut-off) 예정치와 비교하고, 이로부터 상기 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 당해 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 방법.
  53. 제52에 있어서, 결합 제제가 항체인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  55. 제52항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  56. (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질과 결합하는 결합 제제를, 제1 시점에서 특정 환자로부터 수득한 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 당해 샘플에서, 당해 결합 제제와 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하는 단계;
    (c) 후속 시점에서 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a)와(b)를 반복하는 단계 및
    (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리펩타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하고, 이로부터 당해 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 단계를 포함하는, 당해 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 방법.
  57. 제56에 있어서, 결합 제제가 항체인 방법.
  58. 제57항에 있어서, 항체가 모노클로날 항체인 방법.
  59. 제56항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
  60. (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를, 특정 환자로부터 수득한 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 당해 샘플에서, 당해 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하는 단계 및
    (c) 이러한 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 컷-오프 예정치와 비교하고, 이로부터 당해 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 단계를 포함하는, 당해 환자에게서 암의 발병 여부를 결정하는 방법.
  61. 제60에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 폴리머라제 연쇄 반응을 이용하여 결정되는 방법.
  62. 제60항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 하이브리드화 검정을 이용하여 결정되는 방법.
  63. (a) 서열 1-175, 178, 180, 182-468, 474, 476, 477, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드를, 특정 환자로부터 수득된 생물학적 샘플과 접촉시키는 단계;
    (b) 당해 샘플에서, 당해 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하는 단계;
    (c) 후속 시점에서 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 사용하여 단계 (a)와 (b)를 반복하는 단계 및
    (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리뉴클레오타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하고, 이로부터 상기 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 단계를 포함하는, 당해 환자에게서 암의 진행 과정을 모니터하는 방법.
  64. 제63에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 폴리머라제 연쇄 반응을 사용하여 결정되는 방법.
  65. 제63항에 있어서, 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양이 하이브리드화 검정을 사용하여 결정되는 방법.
  66. (a) 제11항에 따르는 하나 이상의 항체 및
    (b) 리포터(reporter) 그룹을 포함하는 검출용 시약을 포함하는 진단용 키트.
  67. 제66항에 있어서, 항체가 고체 지지체 상에 고정화되는 키트.
  68. 제66항에 있어서, 검출용 시약이 항-면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴을 포함하는 키트.
  69. 제66항에 있어서, 리포터 그룹이 방사성 동위원소, 형광성 그룹, 발광성 그룹, 효소, 바이오틴 및 염료 입자로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 키트.
  70. 적당한 엄중 조건 하에서, 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이러한 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보성 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함하는 유방 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 10 내지 40개의 연속되는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  71. 제70항에 있어서, 서열 2, 4-15, 18-33, 35-47, 49-56, 58, 59, 63-73, 88-116, 141-159, 175, 178, 180, 185, 186, 194, 199, 205, 208, 211, 214-216, 219, 222, 226, 232, 236, 240, 241, 245, 246, 252-268, 321-325, 343, 354, 367-369, 377, 382, 385, 389, 395, 397, 400, 408, 411, 413, 414, 416, 417, 419-423, 426, 427, 429, 431, 435-438, 441, 443-446, 450, 453, 454, 463-468, 474, 479, 484, 486 및 489-492 중 어느 하나에 제시된 10 내지 40개의 연속되는 뉴클레오타이드를 포함하는 올리고뉴클레오타이드.
  72. (a) 제71항에 따르는 올리고뉴클레오타이드 및
    (b) 폴리머라제 연쇄 반응 또는 하이브리드화 검정에 사용하기 위한 진단용 시약을 포함하는 진단용 키트.
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