KR20030028474A - 유방암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 - Google Patents

유방암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 암, 특히 유방암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 예시적인 조성물은 유방암 폴리펩타이드, 이의 면역원성 부분, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 특이적인 T 세포 하나 이상을 포함한다. 상기된 조성물은 예를 들면, 질환, 특히 유방암의 진단, 예방 및/또는 치료에 유용하다.

Description

유방암의 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법 {Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer}
유방암은 미국 및 전세계에서 여성들에게 있어서 중요한 건강 문제이다. 당해 질환의 검출 및 치료에 관하여 상당한 연구가 이루어져 있지만, 유방암은 여성에서 암과 관련된 사망 원인 중 제2의 주요 원인으로서 매년 미국내 18만명 이상의 여성들이 이 질환에 걸리고 있다. 북미 여성의 경우에는, 일생에 유방암에 걸릴 확률이 현재 1/8이다.
현재, 유방암의 예방 또는 치료에 유용한 백신이나 보편적으로 성공적인 다른 방법은 없다. 당해 질환은 현재 조기 진단(통상의 유방 진단 절차를 통해)과공격적인 치료의 조합에 따라 처치되고 있으며, 공격적 치료에는 외과수술, 방사능요법, 화학요법 및 호르몬 요법과 같은 각종 치료법 하나 이상을 포함할 수 있다. 특정 유방암의 치료 과정은 종종 특이적 종양 마커의 분석을 비롯하여 각종 예후적 변수에 기초하여 선택한다[참조: 예를 들면, Porter-Jordan and Lippman, Breast Cancer 8: 73-100(1994)]. 그러나, 확립된 마커의 사용은 해석하기가 어려운 결과를 초래하기도 하고, 유방암 환자에서 관찰되는 높은 치사율은 당해 질환의 치료, 진단 및 예방에 개선책이 필요하다는 것을 시사한다.
따라서, 당해 기술 분야에서는 유방암의 치료 및 진단에 개선된 방법을 필요로 하고 있다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시키고 이와 관련된 다른 잇점을 제공하는 것이다.
발명의 요약
한 가지 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열; (b) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열의 상보체; (c) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열의 20개 이상의 연속하는 잔기로 이루어진 서열; (d) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열에 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; (e) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열과 75%의 이상 동일성을 갖는 서열; (f) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및 (g) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열의 축퇴성 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 정상 조직 보다 약 2배 이상, 바람직하게는 약 5배 이상, 및 가장 바람직하게는 약 10배 이상 높은 수준으로, 시험된 유방암 샘플의 약 20% 이상, 바람직하게는 약 30% 이상 및 가장 바람직하게는 약 50% 이상에서 발현된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 조성물을 제공한다.
본 발명은 추가로 서열 번호 299, 300, 304 내지 306, 308 내지 312, 314, 326 및 331 내지 334에 언급된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드 조성물을 제공한다.
특정 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드는 면역원성이며, 즉 이들은 본원에서 추가로 기술되는 바와 같이, 면역 반응, 특히 체액성 및/또는 세포성 면역 반응을 유발시킬 수 있다.
본 발명은 추가로, 서열 번호 299, 300, 304 내지 306, 308 내지 312, 314,326 및 331 내지 334에 나타낸 폴리펩타이드 서열 또는 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 폴리펩타이드 서열의 면역원성 활성의 바람직하게는 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 수준을 갖는, 본원에 기술된 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 단편, 변이체 및/또는 유도체를 제공한다.
본 발명은 추가로 상기 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염시킨 숙주 세포를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 관련 양태에서, 약제학적 조성물, 예를 들면, 백신 조성물은 예방 또는 치료적 용도를 위해서 제공된다. 상기 조성물은 일반적으로 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 및 면역자극제, 예를 들면 애주번트를 포함한다.
본 발명은 추가로, (a) 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 단편에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원-결합 단편; 및 (b) 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 예시적인 항원 제시 세포는 수상 세포, 대식세포, 단핵구, 섬유아세포 및 B 세포를 포함한다.
관련 양태에서, (a) 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 및 (b) 면역자극제를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명은 추가로, 다른 양태에서, 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 뿐만 아니라 상기 융합 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전형적으로 생리학적으로 허용되는 담체 및/또는 면역자극제를 포함하는 약제학적 조성물의 형태, 예를 들면, 백신 조성물의 형태로 제공한다. 융합 단백질은 본원에 기술된 바와 같은 다중 면역원성 폴리펩타이드 또는 이의 일부분/변이체를 포함할 수 있으며, 추가로 폴리펩타이드(들)의 발현, 정제 및/또는 면역원성을 촉진시키기 위한 하나 이상의 폴리펩타이드 단편을 포함할 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 환자에서 면역 반응, 바람직하게는 사람 환자에서 T 세포 반응을 자극하는 방법을 제공한다. 상기 환자는 유방암에 걸렸을 수도 있으며, 이러한 경우, 상기 방법은 상기 질환의 치료 방법을 제공하며, 또는 상기 질환에 걸릴 위험이 있는 환자는 예방학적으로 치료될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 환자에게 상기 언급된 바와 같은 약제학적 조성물을 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 발생을 억제시키는 방법을 제공한다. 상기 환자는 유방암에 걸렸을 수도 있으며, 이러한 경우, 상기 방법은 상기 질환의치료 방법을 제공하며, 또는 상기 질환에 걸릴 위험이 있는 환자는 예방학적으로 치료될 수 있다.
본 발명은 추가로 다른 양태에서, 생물학적 샘플로부터 단백질을 발현하는 세포를 제거시키기에 충분한 조건하 및 충분한 시간 동안, 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩타이드와 특이적으로 반응하는 T 세포와 접촉시킴을 포함하여, 생물학적 샘플로부터 종양 세포를 제거하는 방법을 제공한다.
관련 양태에서, 환자에게 상기 기술된 바와 같이 처리된 생물학적 샘플을 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 발생을 억제하는 방법이 제공된다.
다른 양태에서, T 세포를 자극하고/하거나 증식시키기에 충분한 조건하 및 시간 동안 T 세포를 (i) 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드, (ii) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 및/또는 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 중 하나 이상과 접촉시킴을 포함하여, 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포를 자극하고/하거나 증식시키는 방법이 제공된다. 상기와 같이 제조된 T 세포를 포함하는 분리된 T 세포 집단이 또한 제공된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 환자에게 유효량의 상기 기술된 바와 같은 T 세포 집단을 투여함을 포함하여, 환자에서 암의 발생을 억제하는 방법을 제공한다.
본 발명은 추가로, 환자로부터의 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 (a) (i) 본원에 기술된 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분을 포함하는 폴리펩타이드; (ii) 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드; 및 (iii) 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포 중 하나 이상과 항온 처리하고; (b) 환자에게 유효량의 증식된 T 세포를 투여함으로써, 환자에서 암의 발생을 억제함을 포함하여, 환자에서 암의 발생을 억제하는 방법을 제공한다. 증식된 세포는 환자에게 투여하기에 앞서, 반드시 필요하지는 않지만 클로닝될 수 있다.
추가의 양태에서, 본 발명은 (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플 중에서 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 측정하며; (c) 예정된 컷-오프 값으로 폴리펩타이드의 양을 비교하여 환자에서 암의 존재 또는 부재를 결정함을 포함하여, 환자에서 암, 바람직하게는 유방암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 바람직한 구체적인 양태에서, 결합제는 항체이며, 보다 바람직하게는 모노클로날 항체이다.
본 발명은 또한, 다른 양태에서, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 처음 시점에 적합한 시간내에 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 상기 언급된 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키고; (b) 샘플 중에서 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하고; (c) 단계 (a) 및 (b)를 후속적인 시점에 적합한 시간내에 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 반복하고; (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리펩타이드 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하여 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함한다.
본 발명은 추가로, 다른 양태에서, (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키고; (b) 샘플 중에서 상기 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드, 바람직하게는 mRNA의 수준을 검출하며; (c) 예정된 컷-오프 값으로 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 수준을 비교하여, 환자에서 암의 존재 또는 부재를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 존재 또는 부재를 결정하는 방법을 제공한다. 특정 구체적인 양태에서, mRNA의 양은 예를 들면, 상기 언급된 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보체 하나 이상에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 하나 이상을 사용한 폴리머라제 연쇄 반응을 통해 검출된다. 다른 구체적인 양태에서, mRNA의 양은 상기 언급된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 또는 상기 폴리뉴클레오타이드의 상보체에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하여, 하이브리드화 기술을 사용하여 검출된다.
관련 양태에서, (a) 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키고; (b) 샘플 중에서 상기 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하고; (c) 단계 (a) 및 (b)를 후속적인 시점에서 적합한 시기에 환자로부터 수득된 생물학적 샘플을 사용하여 반복하며; (d) 단계 (c)에서 검출된 폴리뉴클레오타이드의 양을 단계 (b)에서 검출된 양과 비교하여, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 진행을 모니터링하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 상기 기술된 폴리펩타이드에 결합하는 항체, 예를 들면, 모노클로날 항체 뿐만 아니라 상기 항체를 포함하는 진단 키트를 제공한다. 상기 기술된 바와 같은 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머 하나 이상을 포함하는 진단 키트가 또한 제공된다.
본 발명의 상기 및 다른 양태들은 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조하여 명백해 질 것이다. 본원에 기술된 모든 참고 문헌은 각각 개별적으로 인용되는 것과 같이 이의 전체를 참고 문헌으로서 본원에서 인용한다.
본 발명은 일반적으로 유방암 같은 암의 치료 및 진단에 관한 것이다. 본 발명은 보다 구체적으로 유방암 단백질의 적어도 일부분을 포함하는 폴리펩타이드, 및 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 상기 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 유방암의 진단 및 치료를 위한 약제학적 조성물, 예를 들면, 백신, 및 다른 조성물에서 유용하다.
도 1은 정상 유방 조직으로부터 제조된 cDNA(레인 1 및 2) 및 동일한 환자의 유방암 조직으로부터 제조된 cDNA(레인 3 및 4)로부터 수득된, 겔 전기영동으로 분리한 차동 디스플레이 PCR 생성물을 나타낸다. 화살표는 B18Ag1에 상응하는 밴드를 나타낸다.
도 2는 유방암 조직(레인 1)에서 B18Ag1 mRNA의 수준을 정상 유방 조직에서의 수준과 비교한 노던 블롯이다.
도 3은 RNase 보호 분석에 의해 측정된 바와 같은 다양한 정상 및 비유방암 조직에서의 수준과 비교된 유방암 조직에서의 B18Ag1 mRNA의 수준을 나타낸다.
도 4는 B18Ag1과 관련된 XbaI 제한 분해물의 말단으로부터 수득된 부가적인 레트로바이러스 서열의 위치(서열 번호 3 내지 10에서 제공됨)를 나타내는 게놈성 클론 맵이다.
도 5A 및 5B는 B18Ag1을 함유하는 레트로바이러스 요소에 대한 서열분석 전략, 게놈 조직 및 예견되는 개방 판독 프레임을 나타낸다.
도 6은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B18Ag1의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 7은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B17Ag1의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 8은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B17Ag2의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 9는 대표적인 유방암-특이적 cDNA B13Ag2a의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 10은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B13Ag1b의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 11은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B13Ag1a의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 12는 대표적인 유방암-특이적 cDNA B11Ag1의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 13은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B3CA3c의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 14는 대표적인 유방암-특이적 cDNA B9CG1의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 15는 대표적인 유방암-특이적 cDNA B9CG3의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 16은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B2CA2의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 17은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B3CA1의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 18은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B3CA2의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 19는 대표적인 유방암-특이적 cDNA B3CA3의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 20은 대표적인 유방암-특이적 cDNA B4CA1의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다.
도 21A는 유방암 조직(레인 1 내지 8) 및 정상 유방 조직(레인 9 내지 13) 및 H2O(레인 14)에서 유방암 유전자의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 21B는 전립선암(레인 1 및 2), 결장암(레인 3), 폐암(레인 4), 정상 전립선(레인 5), 정상 결장(레인 6), 정상 신장(레인 7), 정상 간(레인 8), 정상 폐(레인 9), 정상 난소(레인 10 및 18), 정상 췌장(레인 11 및 12), 정상 골격근(레인 13), 정상 피부(레인 14), 정상 위(레인 15), 정상 정소(레인 16), 정상 소장(레인 17), HBL-100(레인 19), MCF-12A(레인 20), 유방암(레인 21 내지 23), H2O(레인24), 및 결장암(레인 25)에서 유방암 유전자의 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 22는 항-B11-8 CTL주에 의한 B11Ag1 펩타이드(B11-8로서 언급됨)의 인식을 나타낸다.
도 23은 항-B11-8 특이적 클론 A1에 의한 항원 B11Ag1을 사용하여 형질전환시킨 세포주의 인식을 나타낸다.
도 24는 B1-8 특이적 클론 A1에 의한 폐 선암종 주(LT-140-22) 및 유방 선암종 주(CAMA-1)의 인식을 나타낸다.
본 발명은 일반적으로, 암, 특히 유방암의 치료 및 진단에서 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 하기 추가로 기술되는 바와 같이, 본 발명의 예시적인 조성물은 폴리펩타이드, 특히 면역원성 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 항체 및 다른 결합제, 항원 제시 세포(APC) 및 면역계 세포(예를 들면, T 세포)를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 실시는 그밖에 특별한 언급이 없는 한, 당해 분야의 기술 범위내에서 바이러스학, 면역학, 미생물학, 분자생물학 및 재조합 DNA 기술의 통상적인 방법들을 사용할 것이며, 이들 중 다수는 예시를 위해서 하기 기술된다. 상기 기술들은 문헌에서 자세히 설명되어져 있다. 문헌 참조[예를 들면, Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2nd Edition, 1989); Maniatis et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning: A PracticalApproach, vol. I & II(D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis(N. Gait, ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization(B. Hames & Higgins, eds., 1985); Transcription and Translation(B. Hames & Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture(R. Freshney, ed., 1986); Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)].
상기에서 또는 하기에서 본원에 인용된 모든 공보, 특허 및 특허 출원은 이의 전체로서 참고 문헌으로 본원에 도입된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서 사용되는 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백히 그밖의 경우를 지시하지 않는 한 복수 표시를 포함한다.
폴리펩타이드 조성물
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩타이드"는 통상적인 의미, 즉 아미노산의 서열로서 사용된다. 폴리펩타이드는 특정 길이의 생성물로 제한되지 않으며, 즉 펩타이드, 올리고펩타이드 및 단백질이 폴리펩타이드의 정의내에 포함되며, 상기 용어는 특별한 언급이 없는 한, 본원에서 상호교환가능하게 사용될 수 있다. 상기 용어는 또한, 폴리펩타이드의 발현 후 변형, 예를 들면, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화 등, 뿐만 아니라 천연 및 비천연적으로 발생하는 당해 분야에 공지된 다른 변형들을 인용하지 않거나 배제하지 않는다. 폴리펩타이드는 전체 단백질, 또는 이의 서브서열일 수 있다. 본 발명의 내용에서 관심의 대상인 특정 폴리펩타이드는 에피토프, 즉 폴리펩타이드의 면역원성 특성에 실질적으로 관여하며 면역 반응을 유발시킬 수 있는 항원성 결정기를 포함하는 아미노산 서브서열이다.
본 발명의 특정 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330 중 어느 하나로 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열, 중간 정도의 엄격한 조건 또는 대안으로, 높은 엄격한 조건하에서 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330 중 어느 하나로 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 하이브리드화하는 서열에 의해 암호화되는 것들을 포함한다. 본 발명의 특정 다른 예시적인 폴리펩타이드는 서열 번호 299, 300, 304 내지 306, 308 내지 312, 314, 326 및 331 내지 334 중 어느 하나로 나타낸 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 폴리펩타이드는 유방암 단백질 또는 유방암 폴리펩타이드로서 본원에서 종종 인용되며, 이는 이들의 확인이 유방암 샘플에서 이들의 증가된 발현 수준에 적어도 부분적으로는 기초한다는 것을 나타낸다. 따라서, "유방암 폴리펩타이드" 또는 "유방암 단백질"은 일반적으로 본 발명의 폴리펩타이드 서열, 또는 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 의미하며, 이는 본원에서 제공되는 대표적인 분석법을 사용하여 결정된 바와 같이, 정상 조직에서의 발현 수준에 비해 2배 이상, 및 바람직하게는 5배 이상 더 많은 수준으로, 유방암 샘플의 실질적인 비율, 예를 들면, 시험된 유방암 샘플의 약 20% 이상, 보다 바람직하게는 약 30% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 50% 이상의 비율로 발현된다. 종양세포에서 발현 수준의 증가에 기초한, 본 발명의 유방암 폴리펩타이드 서열은 하기 추가로 기술되는 바와 같이, 진단 마커로서 뿐만 아니라 치료학적 표적 모두로서 특정 용도를 갖는다.
특정 바람직한 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 면역원성이며, 즉 이는 유방암에 걸린 환자로부터의 항혈청 및/또는 T-세포를 사용한 면역분석법(ELISA 또는 T-세포 자극 분석법 같은)에서 검출가능하게 반응한다. 면역원성 활성의 스크리닝은 숙련된 기술자에게 공지된 기술들을 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들면, 상기 스크리닝은 문헌[Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기술된 것과 같은 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 한 가지 예시적인 예에서, 폴리펩타이드는 고체 지지체에 고정되어 환자 혈청과 접촉시켜 혈청내 항체가 고정된 폴리펩타이드에 결합되게 할 수 있다. 이후, 비결합된 혈청을 제거하고 예를 들면,125I-표지된 단백질 A를 사용하여 결합된 항체를 검출할 수 있다.
숙련된 기술자에 의해 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 폴리펩타이드의 면역원성 부분은 본 발명에 또한 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "면역원성 부분"은 그 자체로, 폴리펩타이드를 인식하는 B-세포 및/또는 T-세포 표면 항원 수용체와 면역학적으로 반응성인(즉, 특이적으로 결합하는) 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드의 단편이다. 면역원성 부분은 일반적으로 문헌[Paul, Fundamental Immunology, 3rd ed., 243-247 (Raven Press, 1993) 및 이에 인용된문헌들]에 요약된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 확인할 수 있다. 상기 기술들은 항체, 항혈청 및/또는 T 세포주 또는 클론과 반응하는 능력에 대해 폴리펩타이드를 스크리닝하는 것을 포함한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 항혈청 및 항체는 이들이 항원에 특이적으로 결합하는 경우(즉, 이들이 ELISA 또는 다른 면역분석법에서 단백질과 반응하지만, 관련되지 않은 단백질과는 검출가능하게 반응하지 않는 경우), "항원-특이적"이다. 상기 항혈청 및 항체는 본원에서 기술된 바와 같이, 및 공지된 기술들을 사용하여 제조할 수 있다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드의 면역원성 부분은 (예를 들면, ELSIA 및/또는 T 세포 반응성 분석법에서) 전체 길이 폴리펩타이드의 반응성과 실질적으로 적지 않은 수준으로 항혈청 및/또는 T 세포와 반응하는 부분이다. 바람직하게는, 면역원성 부분의 면역원성 활성 수준은 전체 길이 폴리펩타이드의 면역원성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상이다. 특정 예에서, 바람직한 면역원성 부분은 상응하는 전체 길이 폴리펩타이드의 면역원성 활성 보다 더 큰 면역원성 활성 수준을 갖는, 예를 들면, 면역원성 활성의 약 100% 이상 또는 150% 이상을 갖는 것으로 확인될 수 있다.
특정 다른 구체적인 양태에서, 예시적인 면역원성 부분은 N-말단 리더 서열 및/또는 트랜스막 도메인이 결실된 펩타이드를 포함할 수 있다. 다른 예시적인 면역원성 부분은 성숙 단백질에 비해 작은 N- 및/또는 C-말단 결실(예를 들면, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산 결실)을 함유할 것이다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물은 또한, 본 발명의 폴리펩타이드, 특히 본원에 기술된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 단편 또는 변이체에 대해서 생성된 T 세포 및/또는 항체와 면역학적으로 반응성인 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본원에 기술된 폴리펩타이드 하나 이상, 또는 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드에 함유된 연속하는 핵산 서열 또는 또는 중간 정도 내지 높은 엄격함의 조건하에서 상기 서열 하나 이상과 하이브리드화하는 핵산 서열 하나 이상에 의해 암호화된 폴리펩타이드 하나 이상과 면역학적으로 반응성인 T 세포 및/또는 항체를 유도할 수 있는 폴리펩타이드 하나 이상을 포함하는 폴리펩타이드가 제공된다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 제시된 폴리펩타이드 조성물의 약 5, 10, 15, 20, 25, 50 또는 100개 이상의 연속하는 아미노산, 또는 이의 모든 중간 길이를 포함하는 폴리펩타이드 단편, 예를 들면, 서열 번호 299, 300, 304 내지 306, 308 내지 312, 314, 326 및 331 내지 334에 나타낸 것들 또는 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330의 서열에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 것들을 제공한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리펩타이드 조성물의 변이체를 제공한다. 본 발명에 의해 일반적으로 포함되는 폴리펩타이드 변이체는 전형적으로 본원에 제시된 폴리펩타이드 서열과 이의 길이를 따라서, 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성(하기기술되는 바와 같이 측정됨)을 나타낼 것이다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명에 의해 제공된 폴리펩타이드 단편 및 변이체는 본원에 구체적으로 제시된 전체 길이 폴리펩타이드와 반응성인 항체 및/또는 T 세포와 면역학적으로 반응성이다.
다른 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명에 의해 제공된 폴리펩타이드 단편 및 변이체는 본원에 구체적으로 제시된 전체 길이 폴리펩타이드 서열에 의해 나타나는 면역원성 활성의 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 면역원성 활성 수준을 나타낸다.
본원에서 사용되는 용어와 같이, 폴리펩타이드 "변이체"는 치환, 결실, 부가 및/또는 삽입 하나 이상으로 본원에서 구체적으로 기술된 폴리펩타이드로부터 전형적으로 상이한 폴리펩타이드이다. 상기 변이체는 천연적으로 생성되거나, 예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드 서열 하나 이상을 변형시키고 본원에 기술된 바와 같이 이의 면역원성 활성을 평가하고 당해 분야에 공지된 수 많은 기술들 중 하나를 사용함으로써 합성적으로 생성시킬 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 폴리펩타이드의 특정 예시적인 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 트랜스막 도메인 같은 하나 이상의 일부분이 제거된 것들을 포함한다. 다른 예시적인 변이체는 작은 부분(예를 들면, 1 내지 30개 아미노산, 바람직하게는 5 내지 15개 아미노산)이 성숙 단백질의 N- 및/또는 C-말단으로부터 제거된 변이체를 포함한다.
수 많은 예에서, 변이체는 보존적인 치환을 함유할 것이다. "보존적인 치환"은 아미노산이 유사한 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어, 펩타이드 화학 분야의 숙련자가 폴리펩타이드의 2차 구조 및 수화도 특성이 실질적으로 변화되지 않을 것으로 예견하는 치환이다. 상기 기술된 바와 같이, 변형은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 구조에서 수행될 수 있으며, 여전히 바람직한 특성, 예를 들면, 면역원성 특성을 갖는 변이체 또는 유도체 폴리펩타이드를 암호화하는 기능성 분자를 수득할 수 있다. 본 발명의 등가물, 또는 보다 개선된 면역원성 변이체 또는 일부분을 제조하기 위해서 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 변화시키는 것이 바람직한 경우, 당해 분야의 숙련자는 전형적으로 표 1에 따른 DNA 서열을 암호화하는 코돈 하나 이상을 변화시킬 것이다.
예를 들면, 특정 아미노산은 예를 들면, 항체의 항원-결합 영역 또는 기질 분자 상의 결합 부위 같은 구조와 상호작용적으로 결합하는 능력의 상당한 손실 없이 단백질 구조에서 다른 아미노산과 치환될 수 있다. 단백질의 상호작용 능력 및 특성은 단백질의 생물학적 기능적 활성으로 정의되기 때문에, 특정 아미노산 서열 치환은 단백질 서열, 및 물론 이의 기초를 이루는 DNA 암호화 서열내에서 수행될 수 있으며, 그럼에도 불구하고, 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 다양한 변화들이 기술된 조성의 펩타이드 서열 또는 상기 펩타이드를 암호화하는 상응하는 DNA 서열에서, 이의 생물학적 유용성 또는 활성의 상당한 손실 없이 수행될 수 있는 것으로 이해된다.
상기 변화를 수행하는데 있어서, 아미노산의 수화도 지수(hydropathic index)가 고려될 수 있다. 단백질 상에 상호작용적인 생물학적 기능을 부여하는데 있어서 수화도 아미노산 지수의 중요성은 일반적으로 당해 분야에서 이해되고있다[Kyte and Doolittle, 1982, 본원에 참조로 도입됨]. 아미노산의 상대적인 수화도 특성이 결과적으로 단백질의 2차 구조에 영향을 미치며, 이로써 단백질의 다른 분자, 예를 들면, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과의 상호작용을 정의하게 된다는 것이 인정되고 있다. 각각의 아미노산은 이의 소수성 및 전하 특성에 기초하여 수화도 지수로 배정되었다[Kyte and Doolittle, 1982]. 이러한 값은 이소루이신(+4.5); 발린(+4.2); 루이신(+3.8); 페닐알라닌(+2.8); 시스테인/시스틴(+2.5); 메티오닌(+1.9); 알라닌(+1.8); 글리신(-0.4); 트레오닌(-0.7); 세린(-0.8); 트립토판(-0.9); 티로신(-1.3); 프롤린(-1.6); 히스티딘(-3.2); 글루타메이트(-3.5); 글루타민(-3.5); 아스파르테이트(-3.5); 아스파라긴(-3.5); 라이신(-3.9); 및 아르기닌(-4.5)이다.
특정 아미노산은 유사한 수화도 지수 또는 득점을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질을 수득할 수 있으며, 즉 생물학적 기능성 등가 단백질을 수득할 수 있는 것으로 공지되어져 있다. 상기 변화를 수행하는데 있어서, 수화도 지수가 ±2 범위내인 아미노산의 치환이 바람직하며, ±1 내인 것이 특히 바람직하며, ±0.5내인 것이 보다 더 특히 바람직하다. 유사한 아미노산의 치환은 친수성에 기초하여 효과적으로 수행할 수 있는 것으로 당해 분야에서 이해되고 있다. 문헌[미국 특허 제4,554,101호; 이의 전체가 본원에 참조로 도입됨]은 단백질의 가장 큰 국부적인 평균 친수성은 이의 인접하는 아미노산들의 친수성에 의해 영향을 받기 때문에, 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있다는 것을 진술하고 있다.
문헌[미국 특허 제4,554,101호]에 상세히 설명되는 바와 같이, 하기 친수성 값이 아미노산 잔기들에 할당되었다: 아르기닌(+3.0); 라이신(+3.0); 아스파르테이트(+3.0±1); 글루타메이트(+3.0±1); 세린(+3.0); 아스파라긴(+0.2); 글루타민(+0.2); 글리신(0); 트레오닌(-0.4); 프롤린(-0.5±1); 알라닌(-0.5); 히스티딘(-0.5); 시스테인(-1.0); 메티오닌(-1.3); 발린(-1.5); 루이신(-1.8); 이소루이신(-1.8); 티로신(-2.3); 페닐알라닌(-2.5); 트립토판(-3.4). 아미노산은 유사한 친수성 값을 갖는 다른 아미노산으로 치환되어 여전히 생물학적 등가물, 특히 면역학적으로 등가 단백질을 수득할 수 있는 것으로 이해된다. 상기 변화에서, 친수성이 ±2내인 아미노산의 치환이 바람직하며 ±1내인 것이 특히 바람직하며, ±0.5인 것이 보다 더 특히 바람직하다.
따라서, 상기 요약된 바와 같이, 아미노산 치환은 일반적으로 아미노산 측쇄 치환체의 상대적인 유사성, 예를 들면, 이의 소수성, 친수성, 전하, 크기 등에 기초한다. 다양한 전술한 특성들을 고려한 예시적인 치환은 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있으며 아르기닌 및 라이신; 글루타메이트 및 아스파르테이트; 세린 및 트레오닌; 글루타민 및 아스파라긴; 및 발린, 루이신 및 이소루이신을 포함한다.
또한, 임의의 폴리뉴클레오타이드는 추가로 생체내 안정성을 증가시키도록 변형될 수 있다. 가능한 변형은 5' 및/또는 3' 말단에서 플랭킹 서열의 부가; 골격에서 포스포디에스테라제 결합 대신 포스포로티오에이트 또는 2' O-메틸의 사용; 및/또는 이노신, 퀘오신 및 위부토신 뿐만 아니라 아세틸-, 메틸-, 티오- 및 다른 변형된 형태의 아데닌, 시티딘, 구아닌, 티민 및 우리딘 같은 통상적이지 않은 염기의 포함을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
아미노산 치환은 추가로 잔기의 극성, 전하, 용해도, 소수성, 친수성 및/또는 양쪽성 특성에서의 유사성에 기초하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 음으로 하전된 아미노산은 아스파르트산 및 글루탐산을 포함하며, 양으로 하전된 아미노산은 라이신 및 아르기닌을 포함하며; 유사한 친수성 값을 갖는 하전되지 않은 극성 헤드 그룹을 갖는 아미노산 루이신, 이소루이신 및 발린; 글리신 및 알라닌; 아스파라긴 및 글루타민; 및 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 티로신을 포함한다. 보존적인 변화를 나타낼 수 있는 다른 아미노산 그룹은 (1) ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; 및 (5) phe, tyr, trp, his를 포함한다. 변이체는 또한, 또는 선택적으로 비보존적인 변화를 함유할 수 있다. 바람직한 구체적인 양태에서, 변이체 폴리펩타이드는 5개 이하의 아미노산의 치환, 결실 또는 부가에 의해 천연 서열과는 상이하다. 변이체는 또한 (또는 선택적으로) 예를 들면, 폴리펩타이드의 면역원성, 2차 구조 및 소수성 특성에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 부가에 의해 변형될 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 폴리펩타이드는 해독과 동시에 또는 해독후 단백질의 수송을 지시하는, 단백질의 N 말단에서 시그날 (또는 리더) 서열을 포함할 수 있다. 폴리펩타이드는 또한 폴리펩타이드의 합성, 정제 또는 동정에 용이성을 위해서, 또는 고체 지지체에 대한 폴리펩타이드의 결합을 증강시키기 위해서 링커 또는 다른 서열(예를 들면, 폴리-His)에 접합시킬 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드는 면역글로불린 Fc 영역에 접합될 수 있다.
폴리펩타이드 서열을 비교하는 경우, 두 개의 서열에서 아미노산 서열이 하기 기술되는 바와 같이, 최대 상응하도록 배열시킨 경우에 동일한 경우, 두 개의 서열은 "동일"한 것으로 언급된다. 두 개의 서열 사이에서 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부적 영역을 확인하고 비교하기 위한 비교창 상에서 서열을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용된 바와 같은 "비교창"은 두 개의 서열을 최적으로 배열한 후 서열을 동일한 수의 연속적인 부분의 참조 서열과 비교할 수 있는, 약 20개 이상의 연속적인 부분, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 연속적인 부분의 절편을 의미한다.
비교를 위한 서열의 최적 배열은 디폴트 변수를 사용하는 생물정보학 소프트웨어의 Lasergene 슈트에서 Megalign 프로그램(제조원: DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 프로그램은 하기 문헌들에서 기술된 수 개의 배열도를 구체화한다[Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary chagne in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5: 1151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Robinson, 425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973)Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Fransisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730].
대안으로, 비교를 위한 서열의 최적 배열은 문헌[smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2: 482]의 국부적 확인 알고리듬에 의해, 문헌[Meedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]의 확인 배열 알고리듬에 의해, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]의 유사성 조사 방법에 의해, 상기 알고리듬의 컴퓨터화된 수단[GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA, in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI]에 의해, 또는 정밀 조사에 의해 수행할 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 결정하는데 적합한 알고리듬의 한 가지 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이며, 이는 문헌[Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에 각각 기술되어져 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면, 본원에 기술된 변수들과 함께 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 서열 동일성(%)을 측정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI(the National Center for Biotechnology Information)를 통해 공식적으로 입수가능하다. 아미노산 서열에 있어서, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 득점을 산출할 수 있다. 각각의 방향에서 워드 적중의 신장은, 누적 배열 득점이 이의 최대 달성치로부터 X 양만큼 감소될 때; 하나 이상의 음(-)-득점 잔기 배열의 축적으로 인해, 누적 득점이 0 또는 그 이하로 도달할 때; 또는 서열의 두 말단 중 하나에 도달할 때, 종결된다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 배열의 감수성 및 속도를 결정한다.
한 가지 바람직한 접근법에서, "서열 동일성의 백분율(%)"은 20개 이상 위치의 비교창 상에서 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 결정되며, 이때, 비교창내의 폴리펩타이드의 위치는 두 개의 서열의 최적 배열에 대해서 참조 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여, 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(예를 들면, 갭)을 포함할 수 있다. 상기 백분율은 동일한 아미노산 잔기가 매치된 위치의 수를 산출하기 위해서 두 개의 서열 모두에서 발생하는 위치의 수를 결정하고, 매치된 위치를 참조 서열내 전체 위치의 수(즉, 창 크기)로 나누고 서열 동일성(%)를 산출하기 위해서 100으로 곱하여 산출된다.
다른 예시적인 구체적인 양태에서, 폴리펩타이드는 본원에 기술된 바와 같은 다중 폴리펩타이드를 포함하거나, 본원에 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 및 관련되지 않은 서열, 예를 들면, 공지된 종양 단백질 하나 이상을 포함하는 융합 폴리펩타이드일 수 있다. 융합 상대는 예를 들면, T 헬퍼 에피토프(면역학적 융합 상대), 바람직하게는 사람에 의해 인식되는 T 헬퍼를 제공하는 것을 보조할 수 있거나, 천연 재조합 단백질 보다 큰 생산량으로 단백질을 발현시키는 것(발현 인핸서)을 보조할 수 있다. 특정 바람직한 융합 상대는 면역학적 및 발현 증강 융합 상대모두이다. 다른 융합 상대는 폴리펩타이드의 용해도를 증가시키거나 폴리펩타이드를 목적하는 세포내 구획내로 표적화시키기 위해서 선택될 수 있다. 또한 추가의 융합 상대는 폴리펩타이드의 정제를 촉진시키는 친화도 태그를 포함한다.
융합 폴리펩타이드는 일반적으로 화학적 접합을 포함하여, 표준 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 바람직하게는, 융합 폴리펩타이드는 재조합 폴리펩타이드로서 발현되어, 발현 시스템내에서 비-융합된 폴리펩타이드에 비해, 증가된 수준의 생산을 가능하게 한다. 간략하면, 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열을 각각 조합하여 적합한 발현 벡터내로 연결시킬 수 있다. 하나의 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 3' 말단을 펩타이드 링커와 함께 또는 부재하에서, 제2 폴리펩타이드 성분을 암호화하는 DNA 서열의 5' 말단에 연결하여 상기 서열들의 판독 프레임이 동일 상에 위치하게 한다. 이로서 두 성분 모두의 폴리펩타이드의 생물학적 활성을 보유하는 단일 융합 폴리펩타이드가 해독된다.
펩타이드 링커 서열을 사용하여 각각의 폴리펩타이드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되는 것을 보장하기에 충분히 떨어진 위치로 제1 및 제2 폴리펩타이드 성분을 격리시킬 수 있다. 상기 펩타이드 링커 서열을 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 융합 폴리펩타이드내로 도입시킨다. 적합한 펩타이드 링커 서열은 다음 변수들에 기초하여 선택할 수 있다: (1) 유연성있는 신장된 형태를 허용하는 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩타이드 상의 기능적 에피토프와 상호작용할 수 있는 2차 구조를 허용하지 않는 능력; 및 (3) 폴리펩타이드 기능성 에피토프와 반응할 수 있는 소수성 또는 하전된 잔기의 부재. 바람직한 펩타이드 링커 서열은 Gly, Asn및 Ser 잔기를 함유한다. Thr 및 Ala 같은 다른 인접 중성 아미노산이 또한 링커 서열로서 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[Maratea et al., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 기술된 것들을 포함한다. 링커 서열은 일반적으로 1 내지 약 50개 아미노산 길이일 수 있다. 링커 서열은 제1 및 제2 폴리펩타이드가 기능성 도메인을 분리시키고 공간적 방해를 예방하는데 사용될 수 있는 비-필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에는 불필요하다.
연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 요소에 작동가능하게 연결된다. DNA 발현에 관여하는 조절 요소는 제1 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 5' 바로 앞에 위치한다. 유사하게, 해독을 종결하는데 필요한 종결 코돈 및 전사 종결 신호는 제2 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA 서열의 3' 바로 뒤에 위치한다.
융합 폴리펩타이드는 회상 반응을 유도할 수 있는 면역원성 단백질 같은 관련되지 않은 면역원성 단백질과 함께 본원에서 기술된 바와 같은 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 상기 단백질의 예는 파상풍, 결핵 및 간염 단백질을 포함한다[참조: 예를 들면, Stoute et al. New Engl. J. Med., 336: 86-91, 1997].
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 면역학적 융합 상대는 마이코박테리움 종, 예를 들면, 마이코박테리움 투베르쿨로시스-유도된 Ra12 단편으로부터 유도된다. Ra12 조성물 및 이종 폴리뉴클레오타이드/폴리펩타이드 서열의 발현 및/또는 면역원성에서의 이의 사용 방법은 문헌[미국 특허원 제60/158,585호]에 기술되어져있으며, 이의 내용은 이의 전체를 본원에 참조로 인용한다. 간략하면, Ra12는 마이코박테리움 투베르쿨로시스 MTB32A 핵산의 서브 서열인 폴리뉴클레오타이드 영역을 나타낸다. MTB32A는 엠. 투베르쿨로시스의 독성 및 비독성 균주내 한 유전자에 의해 암호화되는 32KD 분자량의 세린 프로테아제이다. MTB32A의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열은 기술되어져 있다[예를 들면, 미국 특허원 60/158,585호; 또한 참조: Skeiky et al., Infection and Immun. (1999) 67: 3998-4007, 본원에 참조로 인용됨]. MTB32A 암호화 서열의 C-말단 단편들은 높은 수준으로 발현되며 정제 과정 동안 가용성 폴리펩타이드로서 잔류한다. 또한, Ra12는 이와 융합되는 이종성 면역원성 폴리펩타이드의 면역원성을 증강시킬 수 있다. 한 가지 바람직한 Ra12 융합 폴리펩타이드는 MTB32A의 아미노산 잔기 192 내지 323에 상응하는 14KD C-말단 단편을 포함한다. 다른 바람직한 Ra12 폴리뉴클레오타이드는 일반적으로 Ra12 폴리펩타이드의 일부분을 암호화하는 약 15개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드, 약 30개 이상, 약 60개 이상, 약 100개 이상, 약 200개 이상, 또는 약 300개 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. Ra12 폴리뉴클레오타이드는 천연 서열(즉, Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부분을 암호화하는 내인성 서열)을 포함하거나, 상기 서열의 변이체를 포함할 수 있다. Ra12 폴리뉴클레오타이드 변이체는 암호화된 융합 폴리펩타이드의 생물학적 활성이 천연 Ra12 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드와 비교하여, 실질적으로 감소되지 않는, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 수 있다. 변이체는 바람직하게는 천연 Ra12 폴리펩타이드 또는 이의 일부분을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열과 약 70% 이상의 동일성,보다 바람직하게는 약 80% 이상 동일성 및 가장 바람직하게는 약 90% 이상의 동일성을 나타낸다.
다른 바람직한 구체적인 양태에서, 면역학적 융합 상대는 그램-네가티브 박테리움 헤모필러스 인플루엔자 B의 표면 단백질인, 단백질 D로부터 유도된다[WO 제91/18926호]. 바람직하게는, 단백질 D 유도체는 상기 단백질의 대략 처음 1/3(예를 들면, 처음 N-말단 100 내지 110개 아미노산)을 포함하며 단백질 D 유도체는 지질화될 수 있다. 특정 바람직한 구체적인 양태에서, 지단백질 D 융합 상대의 처음 109개 잔기가 N-말단 상에 포함되어 부가적인 외인성 T 세포 에피토프를 갖는 폴리펩타이드를 제공하며 이. 콜라이에서의 발현을 증가시킨다(결과적으로 발현 증강제로서 기능한다). 지질 꼬리는 항원 제시 세포에 대한 항원의 최적 제시를 보장한다. 다른 융합 상대는 인플루엔자 바이러스의 비-구조적 단백질, NS1(헤마글루티닌)을 포함한다. 전형적으로, N-말단 81개 아미노산이 사용되지만, T 헬퍼 에피토프를 포함하는 상이한 단편들이 사용될 수도 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 면역원성 융합 상대는 LYTA로 공지된 단백질 또는 이의 일부분(바람직하게는, C-말단 부분)이다. LYTA는 스트렙토코커스 뉴모니애로부터 유도되며, 상기 균주는 아미다제 LYTA로 공지된 N-아세틸-L-알라닌 아미다제를 합성한다[LytA 유전자로부터 암호화됨; Gene 43: 265-292, 1986]. LYTA는 펩티도글리칸 골격에서 특정 결합을 특이적으로 분해시키는 자가분해효소이다. LYTA 단백질의 C-말단 도메인은 콜린 또는 DEAE 같은 특정 콜린 유사체에 대한 친화도에 관여한다. 이러한 특성은 융합 단백질의 발현에 유용한 이. 콜라이 C-LYTA발현 플라스미드의 개발에 사용되어져 왔다. 아미노 말단에서 C-LYTA 단편을 함유하는 하이브리드 단백질의 정제가 기술되어져 있다[참조: Biotechnology 10: 795-798, 1992]. 바람직한 구체적인 양태에서, LYTA의 반복적인 일부분이 융합 폴리펩타이드내로 도입될 수 있다. 반복적인 일부분은 잔기 178에서 출발하여 C-말단 영역에서 발견된다. 특정 바람직한 반복적인 일부분이 잔기 188 내지 305를 도입시킨다.
또 다른 예시적인 구체적인 양태는 융합 폴리펩타이드 및 이를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드와 관련되며, 이때, 상기 융합 상대는 문헌[미국 특허 제5,633,234호]에 기술된 바와 같이, 폴리펩타이드를 엔도좀/라이소좀 구획내로 지시할 수 있는 표적화 시그날을 포함한다. 이러한 표적화 시그날에 융합되는 경우, 본 발명의 면역원성 폴리펩타이드는 II형 MHC 분자와 보다 효과적으로 결합될 것이며, 따라서, 폴리펩타이드에 대해서 CD4+T 세포 특이적인 증강된 생체내 자극을 제공할 것이다.
본 발명의 폴리펩타이드는 다양한 공지된 합성 및/또는 재조합 기술들 중 하나를 사용하여 제조하며 후자는 하기 추가로 기술된다. 일반적으로 약 150개 미만의 아미노산인 폴리펩타이드, 이의 일부분 또는 다른 변이체들은 일반적으로 당해 분야의 숙련자들에게 공지된 기술들을 사용하여, 합성 방법으로 제조할 수 있다. 한 가지 예시적인 예에서, 상기 폴리펩타이드는 아미노산이 연속적으로 성장하는 아미노산 쇄에 부가되는 메리필드 고체상 합성법 같은 시판중인 고체상 기술 중 하나를 사용하여 합성된다. 문헌 참조[Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963]. 폴리펩타이드의 자동합성을 위한 장비는 공급원(Perkin Elmer/Applied BioSystems Division, Foster City, CA)으로부터 시판중이며, 제조원의 지침에 따라서 작동시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 폴리펩타이드 조성물(융합 폴리펩타이드를 포함)은 분리된다. "분리된" 폴리펩타이드는 이의 천연 환경으로부터 제거된 것이다. 예를 들면, 천연 단백질 또는 폴리펩타이드는 천연계에서 공존하는 물질 중 일부 또는 전부로부터 격리되는 경우 분리된 것이다. 바람직하게는, 상기 폴리펩타이드는 또한 정제되며, 예를 들면, 약 90% 이상 순수, 보다 바람직하게는 약 95% 이상 순수, 및 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하다.
폴리뉴클레오타이드 조성물
다른 양태에서, 본 발명은 폴리뉴클레오타이드 조성물을 제공한다. 용어 "DNA" 및 "폴리뉴클레오타이드"는 특정 종의 전체 게놈성 DNA를 비함유하는 분리된 DNA 분자를 의미하는 것으로 본원에서 본질적으로 상호교환가능하게 사용된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, "분리된"이란 폴리뉴클레오타이드가 다른 암호화 서열로부터 실질적으로 제거되는 것을 의미하며, DNA 분자는 큰 염색체성 단편 또는 다른 기능성 유전자 또는 폴리펩타이드 암호화 영역 같은 비관련된 암호화 DNA의 큰 부분을 함유하지 않는다는 것을 의미한다. 물론, 이는 천연적으로 분리된 것과 같은 DNA 분자를 의미하며, 인위적으로 상기 절편에 차후에 부가된 유전자 또는 암호화 영역을 배제하지는 않는다.
당해 분야의 숙련자에 의해 이해되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 게놈성 서열, 게놈외 및 플라스미드-암호화된 서열, 및 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드 등을 발현하거나 발현하도록 적응된 보다 작은 유전공학적으로 조작된 유전자 절편을 포함할 수 있다. 상기 절편들은 천연적으로 분리되거나, 인위적으로 합성적으로 변형될 수 있다.
또한, 당해 분야의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 일본쇄(암호화 또는 안티센스)이거나 이본쇄일 수 있으며, DNA(게놈성, cDNA 또는 합성) 또는 RNA 분자일 수 있다. RNA 분자는 인트론을 함유하고 1 대 1의 방식으로 DNA 분자에 상응하는 HnRNA 분자 또는 인트론을 함유하지 않는 mRNA를 포함할 수 있다. 부가적인 암호화 또는 비암호화 서열이 본 발명의 폴리뉴클레오타이드내에 존재할 수 있지만, 필수적이지는 않으며, 폴리뉴클레오타이드는 다른 분자 및/또는 지지체 물질에 연결될 수 있지만, 필수적이지는 않다.
폴리뉴클레오타이드는 천연 서열을 포함할 수 있거나(즉, 본 발명의 폴리펩타이드/단백질 또는 이의 일부분을 암호화하는 내인성 서열), 상기 서열의 변이체 또는 유도체, 및 바람직하게는 면역학적 변이체 또는 유도체를 암호화하는 서열을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에서 따라서, 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330 중 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열 중 일부 또는 전부; 서열 번호 1, 3 내지 86, 142내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330 중 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 상보체; 및 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330 중 하나에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열의 축퇴성 변이체를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 특정 바람직한 구체적인 양태에서, 본원에 나타낸 폴리뉴클레오타이드 서열은 상기 기술된 바와 같이, 면역원성 폴리펩타이드를 암호화한다.
다른 관련 구체적인 양태에서, 본 발명은 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에서 본원에 기술된 서열과 실질적으로 동일성을 갖는, 예를 들면, 본원에 기술된 방법(예를 들면, 하기 기술된 바와 같이, 표준 변수들을 사용하는 BLAST 분석)을 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열과 비교하여, 약 70% 이상의 동일성, 바람직하게는 약 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드 변이체를 제공한다. 당해 분야의 숙련자는 이러한 값들이 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치화 등을 고려하여, 두 개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 측정하기 위해서 적합하게 조절될 수 있다는 것을 인식할 것이다.
전형적으로, 폴리뉴클레오타이드 변이체는, 바람직하게는 변이체 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 면역원성이 본원에서 구체적으로 제시된 폴리뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 폴리펩타이드와 비교하여 실질적으로 감소되지 않도록, 하나 이상의 치환, 부가, 결실 및/또는 삽입을 함유할 것이다. 용어 "변이체"는 또한 이종성 기원의 상동성 유전자를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
부가적인 구체적인 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 서열 하나 이상과 동일하거나 상보성인 서열의 다양한 길이의 연속하는 신장물을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 단편을 제공한다. 예를 들면, 본 발명에 의해 본원에 기술된 서열 중 하나 이상의 약 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 또는 1000개 이상의 연속적인 뉴클레오타이드 뿐만 아니라 상기 길이의 모든 중간체 길이를 포함하는 폴리뉴클레오타이드가 제공된다. 상기 내용에서, "중간체 길이"는 16, 17 18, 19 등; 21, 22, 23, 등; 30, 31, 32 등; 50, 51, 52, 53 등; 100, 101, 102, 103, 등; 150, 151, 152, 153 등과 같은 인용된 값 및 200 내지 500; 500 내지 1000 사이의 모든 정수들을 포함하는 값 사이의 임의의 길이를 의미한다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본원에 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편, 또는 이의 상보적인 서열에 중간 정도 내지 높은 엄격한 조건하에서 하이브리드화할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 하이브리드화 기술은 분자생물학 분야에 공지되어져 있다. 예시를 위해서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리뉴클레오타이드와의 하이브리드화를 시험하기 위한 적합한 중간 정도의 엄격한 조건은 5 X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액에서 예비세척; 50℃ 내지 60℃에서 5 X SSC에서 밤새 하이브리드화; 이후 65℃에서 각각 0.1% SDS를 함유하는 2 X, 0.5 X 및 0.2 X SSC를 사용하여 20분 동안 2회 세척하는 것을 포함한다. 당해 분야의 숙련자는 하이브리드화의 엄격성은 하이브리드화 용액의 염 함량 및/또는 하이브리드화 수행 온도를 변화시키는 등의 방법으로써, 용이하게 조절될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 예를 들면, 다른 구체적인 양태에서, 적합한 높은 엄격한 하이브리드화 조건은 하이브리드화 온도를 승온시키는 것, 예를 들면 60 내지 65℃ 또는 65 내지 70℃로 승온시키는 것을 제외하고는, 상기 기술된 조건을 포함한다.
특정 바람직한 양태에서, 상기 기술된 폴리뉴클레오타이드, 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드 변이체, 단편 및 하이브리드화 서열은 본원에 구체적으로 제시된 폴리펩타이드 서열과 면역학적으로 교차-반응성인 폴리펩타이드를 암호화한다. 다른 바람직한 구체적인 양태에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 본원에 구체적으로 제시된 폴리펩타이드 서열에 대해서 약 50% 이상, 바람직하게는 약 70% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 면역원성 활성 수준을 갖는 폴리펩타이드를 암호화한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드, 또는 이의 단편은 그 자체의 암호화 서열의 길이에 관계 없이, 프로모터, 폴리아데닐화 시그날, 부가적인 제한 효소 부위, 다중 클로닝 부위, 다른 암호화 절편 등과 같은 다른 DNA 서열과 혼용되어, 이들의 전체적인 길이가 상당히 다양화될 수 있다. 따라서, 모든 임의의 길이의 핵산 단편이 사용될 수 있으며, 전체 길이는 바람직하게는 의도된 재조합 DNA 프로토콜에서의 제조 및 사용의 용이성에 의해서 제한되는 것으로 이해된다. 예를 들면, 약 10,000, 약 5,000, 약 3,000, 약 2,000, 약 1,000, 약 500, 약 200, 약 100, 약 50개 염기쌍 길이의 전체 길이(모든 중간체 길이 포함)를 갖는 예시적인 폴리뉴클레오타이드 절편이 본 발명의 수 많은 수행에서 유용한 것으로 이해된다.
폴리뉴클레오타이드 서열을 비교하는 경우, 두 개의 서열은, 하기 기술된 바와 같이, 최대 상응하도록 배열되는 경우 두 개의 서열내 뉴클레오타이드 서열이 동일한 경우에 "동일한" 것으로 언급된다. 두 개의 서열 사이의 비교는 전형적으로 서열 유사성의 국부적 영역을 확인하고 비교하기 위한 비교창 상에서 서열들을 비교함으로써 수행된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "비교창"은 약 20개 이상의 연속하는 위치, 일반적으로 30 내지 약 75, 40 내지 약 50개의 연속하는 위치의 절편을 의미하며, 이때, 두 개의 서열을 최적으로 배열한 후 서열을 동일한 수의 연속하는 위치의 참조 서열과 비교할 수 있다.
비교를 위한 서열의 최적 배열은 디폴트 변수를 사용하여, 생물정보학 소프트웨어의 Lasergene 슈트 중 Megalign 프로그램(DNASTAR, Inc., Madison, WI)을 사용하여 수행할 수 있다. 상기 프로그램은 하기 참조 문헌에 기술된 수 개의 배열도를 구체화한다[Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships. In Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC Vol. 5, Suppl. 3, pp. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes pp. 626-645 Methods in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. and Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5: 151-153; Myers, E.W. and Muller W. (1988) CABIOS 4: 11-17; Robinson, E.D. (1971) Comb. Theor 11: 105; Santou, N. Nes, M.(1987) Mol. Biol. Evol. 4: 406-425; Sneath, P.H.A. and Sokal, R.R. (1973) Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. and Lipman, D.J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730].
또한, 비교를 위한 서열의 최적 배열은 문헌[Smith and Waterman (1981) Add. APL. Math 2:482]의 국부적 동일성 알고리듬에 의해, 문헌[Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443]의 동일성 배열 알고리듬에 의해, 문헌[Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444]의 유사성 조사 방법에 의해, 상기 알고리듬의 컴퓨터화된 수단(위스콘신 제네틱스 소프트웨어 팩키지 중 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA 및 TFASTA, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI)에 의해, 또는 정밀 조사에 의해서 수행될 수 있다.
서열 동일성(%) 및 서열 유사성(%)을 측정하는데 적합한 알고리듬의 한 가지 바람직한 예는 문헌[Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25: 3389-3402 and Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410]에서 각각 기술된 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리듬이다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들면, 본원에 기술된 변수들을 사용하여, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드에 대한 서열 동일성(%)을 측정할 수 있다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 NCBI(National Center for Biotechnology Information)를 통해 시판중이다. 한 가지 예시적인 예에서, 누적 득점은 뉴클레오타이드에 있어서, 변수 M(일치하는 잔기쌍에 대한 보상 득점; 항상> 0) 및 N(일치하지 않는 잔기에 대한 페널티 득점; 항상 < 0)을 사용하여 산출할 수 있다. 각각의 방향에서 워드 적중의 신장은, 누적 배열 득점이 이의 최대 달성치로부터 X 양만큼 감소될 때; 하나 이상의 음(-)-득점 잔기 배열의 축적으로 인해, 누적 득점이 0 또는 그 이하로 도달할 때; 또는 서열의 두 말단 중 하나에 도달할 때, 종결된다. BLAST 알고리듬 변수 W, T 및 X는 배열의 감수성 및 속도를 결정한다. BLASTIN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 디폴트로서 11의 워드 길이(W), 10의 기대치(E) 및 BLOSUM62 득점 매트릭스[참조: Henikoff and Henikoff (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915] 배열, 50의 (B), 10의 기대치(E), M=5, N=-4 및 두 쇄의 비교를 사용한다.
바람직하게는, "서열 동일성(%)"은 20개 이상의 위치의 비교창 상에서 두 개의 최적으로 배열된 서열들을 비교함으로써 측정되며, 이때 비교창내의 폴리뉴클레오타이드 서열 부분은 두 개의 서열의 최적 배열을 위한 참조 서열(이는 부가 또는 결실을 포함하지 않는다)과 비교하여, 20% 이하, 일반적으로 5 내지 15%, 또는 10 내지 12%의 부가 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 백분율(%)은 두 서열내에서 동일한 핵산 염기가 발생되는 부위의 수를 측정하여 일치된 위치의 수를 수득하고, 일치된 위치의 수를 참조 서열내 전체 위치의 수(즉, 창 크기)로 나누고 그 결과를 100으로 곱하여 서열 동일성의 백분율(%)을 수득하여 산출된다.
당해 분야의 숙련자는, 유전자 암호의 축퇴성으로 인해, 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 수 많은 핵산 서열이 존재한다는 것을 이해할 것이다. 이러한 폴리뉴클레오타이드 중 일부는 임의의 천연 유전자의 뉴클레오타이드 서열과 최소한의 상동성을 갖는다. 그럼에도 불구하고, 코돈 사용에서의 상이성으로 인해 다양한 폴리뉴클레오타이드가 본 발명에 명확히 포함된다. 추가로, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 유전자의 대립형질이 본 발명의 범위내에 포함된다. 대립형질은 뉴클레오타이드의 결실, 부가, 및/또는 치환 같은 하나 이상의 돌연변이의 결과로서 변형된 내인성 유전자이다. 수득되는 mRNA 및 단백질은 변형된 구조 또는 기능을 가질 수도 있지만, 반드시 그런 것은 아니다. 대립형질은 표준 기술(하이브리드화, 증폭 및/또는 데이터베이스 서열 비교)을 사용하여 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 부위-특이적 돌연변이유발 같은 돌연변이유발 방법을 사용하여 본원에 기술된 폴리펩타이드의 면역원성 변이체 및/또는 유도체를 제조한다. 이러한 방법으로, 폴리펩타이드 서열내 특정 변형들이 이를 암호화하는 기본적인 폴리뉴클레오타이드의 돌연변이유발을 통해서 수행될 수 있다. 이러한 기술들은, 예를 들면, 전술한 고려사항 하나 이상을 반영하여 폴리뉴클레오타이드내로 하나 이상의 뉴클레오타이드 서열 변화를 도입시킴으로써 서열 변이체를 제조하고 시험하는 직접적인 방법을 제공한다.
부위-특이적인 돌연변이유발은 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화하는 특정 올리고뉴클레오타이드 뿐만 아니라, 결실 접합부 양쪽에서 신장되는 안정한 이합체를 형성하도록 충분한 크기 및 서열 복합성의 프라이머 서열을 제공하기 위한 충분한 수의 인접하는 뉴클레오타이드의 사용을 통해 돌연변이체를 제조하는 것을 가능하게 한다. 돌연변이는 선택된 폴리뉴클레오타이드 서열에서 사용되어 폴리뉴클레오타이드 그 자체의 특성을 개선, 변화, 감소, 변형 또는 그밖에 변화시키고/시키거나 암호화된 폴리펩타이드의 특성, 활성, 조성, 안정성 또는 1차 구조를 변화시킬 수 있다.
본 발명의 특정 구체적인 양태에서, 본 발명자들은 폴리펩타이드 백신의 면역원성과 같은 암호화된 폴리펩타이드의 하나 이상의 특성을 변화시키기 위한 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열의 돌연변이유발을 의도한다. 부위-특이적인 돌연변이유발 기술은 당해 분야에 공지되어져 있으며, 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드 모두의 변이체를 제조하는데 널리 사용되고 있다. 예를 들면, 부위-특이적인 돌연변이유발은 종종 DNA 분자의 특정 부분을 변화시키는데 사용된다. 상기 구체적인 양태에서, 전형적으로 약 14 내지 약 25개 뉴클레오타이드 정도의 길이를 포함하는 프라이머를 사용하며, 서열의 접합부 양쪽에서 약 5 내지 약 10개 잔기가 변화되게 한다.
당해 분야의 숙련자가 이해하는 바와 같이, 부위-특이적 돌연변이유발 기술은 일본쇄 및 이본쇄 형태 모두로 존재하는 파아지 벡터를 종종 사용한다. 부위-특이적인 돌여변이유발에 유용한 전형적인 벡터는 M13 파아지 같은 벡터를 포함한다. 이러한 파아지는 용이하게 구입할 수 있으며 이의 사용은 당해 분야의 숙련자들에게 일반적으로 공지되어져 있다. 이본쇄 플라스미드가 또한 플라스미드로부터 관심 대상 유전자의 파아지로의 전달 단계를 제거하는 부위 지시된 돌연변이유발에서 통상적으로 사용된다.
일반적으로, 이에 따른 부위-지시된 돌연변이유발은 우선, 일본쇄 벡터를 수득하거나 목적하는 펩타이드를 암호화하는 DNA 서열을 이의 서열내에 포함하는 이본쇄 벡터의 두 쇄를 따로 용융시킴으로써 수행된다. 목적하는 돌연변이된 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 일반적으로 합성에 의해 제조한다. 이후, 이러한 프라이머를 일본쇄 벡터와 어닐링시키고, 이. 콜라이 폴리머라제 I 클레나우 단편 같은 DNA 폴리머라제 효소와 접촉시켜 돌연변이를 갖는 쇄의 합성을 완결한다. 따라서, 이종이합체는 제1 쇄가 비-돌연변이된 서열을 암호화하고 제2 쇄가 목적하는 돌연변이를 갖도록 형성된다. 이후, 이러한 이종이합체 벡터를 사용하여 이. 콜라이 세포 같은 적합한 세포를 형질전환시키고 돌연변이된 서열 배열을 갖는 재조합 벡터를 포함하는 클론을 선택한다.
부위-지시된 돌연변이유발을 사용한 선택된 펩타이드-암호화된 DNA 절편의 서열 변이체의 제조는 잠재적으로 유용한 종을 제조하는 수단을 제공하지만 펩타이드의 서열 변이체 및 이를 암호화하는 DNA 서열이 수득될 수 있는 다른 방법들이 존재하기 때문에 제한하고자 하는 것은 아니다. 예를 들면, 목적하는 펩타이드 서열을 암호화하는 재조합 벡터를 돌연변이유발제, 예를 들면, 하이드록시아민을 사용하여 처리하여 서열 변이체를 수득할 수 있다. 이러한 방법 및 프로토콜과 관련된 구체적인 상세 설명은 문헌[Maloy et al., 1994; Segal, 1976; Prokop and Bajpai, 1991; Kuby, 1994; and Maniatis et al., 1982, 각각은 본원에 참조로 도입된다]의 교시로부터 확인할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발 방법"은 최초 농도에 비해 특정 핵산 분자의 농도를 증가시키거나 증폭 같은검출가능한 시그날 농도의 증가를 초래하는, 주형-의존적인 방법 및 벡터-매개된 증식과 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "올리고뉴클레오타이드 지시된 돌연변이유발 방법"은 프라이머 분자의 주형-의존적인 신장과 관련된 방법을 의미하는 것으로 의도된다. 용어 주형 의존적인 방법은 신규 합성된 핵산 쇄의 서열이 상보성 염기쌍의 공지된 법칙에 의해 결정되는 RNA 또는 DNA 분자의 핵산 합성과 관련된다[참조: 예를 들면, Watson, 1987]. 전형적으로, 벡터 매개된 방법은 핵산 단편의 DNA 또는 RNA 벡터내로의 도입, 벡터의 클로닝 증폭, 및 증폭된 핵산 단편의 회수와 관련된다. 상기 방법의 예는 문헌[미국 특허 제4,237,224호, 이의 전체가 본원에 참조로 구체적으로 도입된다]에서 제공된다.
본 발명의 폴리펩타이드 변이체의 제조를 위한 또 다른 방법에서, 문헌[미국 특허 제5,837,458호]에 기술된 바와 같은 반복적인 서열 재조합이 사용될 수 있다. 이러한 방법에서, 재조합 및 스크리닝의 반복적인 사이클 및 선택을 수행하여 예를 들면, 증강된 면역원성 활성을 갖는 본 발명의 개별적인 폴리뉴클레오타이드 변이체를 "진화"시킨다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오타이드 서열은 핵산 하이브리드화를 위한 프로브 또는 프라이머로서 유리하게 사용될 수 있다. 이와 같이, 동일한 서열을 갖거나 본원에서 기술된 15개 뉴클레오타이드 길이의 연속하는 서열에 상보적인 약 15개 이상의 뉴클레오타이드 길이의 연속하는 서열의 서열 영역을 포함하는 핵산 절편이 특히 유용할 것임을 의미한다. 보다 긴 연속하는 동일한 또는 상보적인 서열, 예를 들면, 약 20, 30, 40, 50, 100, 200,500, 1000개(이의 모든 중간체 길이 포함) 및 심지어 전체 길이 서열에 이르는 서열이 특정 구체적인 양태에서 또한 이용될 것이다.
관심 대상 서열에 특이적으로 하이브리드화되는 상기 핵산 프로브의 능력으로 인해, 상기 핵산 프로브는 제시된 샘플 중의 상보성 서열의 존재를 검출하는데 사용할 수 있다. 그러나, 다른 용도, 예를 들면, 돌연변이 종 프라이머의 제조를 위한 서열 정보의 사용, 또는 다른 유전자 작제물의 제조에서 사용되는 프라이머가 또한 고려된다.
본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열과 동일하거나 상보성인 10 내지 14, 15 내지 20, 30, 50, 또는 100 내지 200개 정도의 뉴클레오타이드(또한 중간체 길이를 포함)로 이루어진 서열 영역을 갖는 폴리뉴클레오타이드 분자가 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅에서 사용하기 위한 하이브리드화 프로브로서 특히 고려된다. 이는 유전자 생성물 또는 이의 단편이 다양한 세포 유형 및 다양한 세균 세포 모두에서 분석하는 것을 가능하게 한다. 단편의 전체 크기 뿐만 아니라 상보성 신장물(들)의 크기는 궁극적으로 특정 핵산 절편의 의도된 용도 또는 적용에 의존할 것이다. 보다 작은 단편이 일반적으로 하이브리드화 양태에서 용도를 가지며, 이때, 연속적인 상보성 영역의 길이는 약 15 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 정도로 다양할 수 있지만, 보다 큰 연속적인 상보성 신장물이 검출하고자 하는 상보성 서열의 길이에 따라서 사용될 수 있다.
약 15 내지 25개 뉴클레오타이드 길이의 하이브리드화 프로브의 사용으로 안정하고 선택적인 이합체 분자를 형성시키는 것이 가능하다. 15개 염기 길이 이상의 신장물 이상의 연속적인 상보성 서열을 갖는 분자가 일반적으로 하이브리드의 안정성과 선택성을 증가시키는데 바람직하며, 이로써 수득되는 특정 하이브리드 분자의 품질 및 수준을 개선시킨다. 일반적으로, 15 내지 25개의 연속적인 뉴클레오타이드, 또는 바람직한 경우 보다 긴 유전자-상보성 서열을 갖는 핵산 분자를 디자인하는 것이 바람직할 것이다.
하이브리드화 프로브는 본원에 기술된 서열 중 하나의 임의의 일부분으로부터 선택될 수 있다. 필요한 것은 프로브 또는 프라이머로 사용하고자 하는, 본원에 제시된 서열, 또는 약 15 내지 25개 뉴클레오타이드 내지 전체 길이의 서열을 포함하는 길이의 서열의 임의의 연속적인 서열을 검토하는 것이다. 프로브 및 프라이머 서열의 선택은 다양한 변수에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 전체 서열의 말단으로부터의 프라이머를 사용할 수 있다.
작은 폴리뉴클레오타이드 절편 또는 단편은, 예를 들면, 자동화 올리고뉴클레오타이드 합성기를 사용하여 통상 실시되는 바와 같이, 화학적 방법에 의해 단편을 직접적으로 합성함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 또한, 단편은 문헌[미국 특허 제4,683,202호, 본원에 참조로 도입됨]의 PCRTM기술 같은 핵산 재생 기술을 적용함으로써, 선택된 서열을 재조합 생성을 위한 재조합 벡터내로 도입함으로써, 및 분자생물학 분야의 숙련자에게 일반적으로 공지된 재조합 DNA 기술에 의해 수득될 수 있다.
본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 관심 대상의 전체 유전자 또는 유전자 단편의 상보적 신장물과 선택적으로 이합체 분자를 형성하는 이의 능력으로 인해 사용될 수 있다. 의도된 적용에 따라서, 전형적으로 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 선택도를 달성하기 위해서 다양한 하이브리드화 조건을 사용할 것이다. 높은 선택성을 요구하는 적용을 위해서, 전형적으로는 하이브리드를 형성하는 상대적으로 엄격한 조건을 사용할 것이며, 예를 들면, 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02M 내지 약 0.15M 염의 염 농도로 제공되는 바와 같이, 상대적으로 저 염 및/또는 고온 조건을 선택할 것이다. 상기 선택 조건은 프로브와 주형 또는 표적 쇄 사이의 불일치를 거의 허용하지 않으며, 특히 관련 서열을 분리하는데 적합할 것이다.
물론, 특정 적용을 위해서, 예를 들면, 기본적인 주형에 하이브리드화된 돌연변이 프라이머 쇄를 사용하여 돌연변이체를 제조하고자 하는 경우, 보다 덜 엄격한(감소된 엄격함) 하이브리드화 조건이 이종이합체의 형성을 허용하는데 전형적으로 필요할 것이다. 이러한 환경에서, 약 20℃ 내지 약 55℃의 온도에서 약 0.15M 내지 약 0.9M 염의 조건 같은 염 조건을 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 교차-하이브리드화 종은 이로써 대조군 하이브리드화에 대해서 포지티브 하이브리드화 시그날로서 용이하게 확인될 수 있다. 임의의 경우, 일반적으로, 포름아미드의 증가량을 부가함으로써 조건을 보다 엄격하게 할 수 있으며, 이는 온도 상승과 동일한 방식으로 하이브리드 이합체를 불안정화시키는 것으로 이해된다. 따라서, 하이브리드화 조건은 용이하게 조절될 수 있으며, 따라서 일반적으로 목적하는 결과에 따른 선택 방법이 될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 따라서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 조성물이 제공된다. 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 단백질 합성의 효과적으로 표적화된 억제제로 입증되어졌으며, 결과적으로 질환에 관여하는 단백질의 합성을 억제시킴으로써 치료할 수 있는 질환에 대한 치료 방법을 제공한다. 단백질 합성을 억제하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 효능은 잘 확립되어져 있다. 예를 들면, 폴리갈락타우로나제 및 무스카린 제2형 아세틸콜린 수용체의 합성은 이들 각각의 mRNA 서열에 대해 지시된 안티센스 올리고뉴클레오타이드에 의해 억제된다[미국 특허 제5,739,119호 및 미국 특허 제5,759,829호]. 추가로, 안티센스 억제의 예는 핵 단백질 사이클린, 다중 약제 내성 유전자(MDG1), ICAM-1, E-셀렉틴, STK-1, 선조체 GABAA수용체 및 사람 EGF에서 입증되어져 왔다[Jaskulski et al., Science. 1988 Jun 10; 240(4858): 1544-6; Vasantahkumar and Ahmed, Cancer Commun. 1989; 1(4): 225-32; Peris et al., Brain Res Mol Brain Res. 1998 Jun 15; 57(2): 310-20; 미국 특허 제5,801,154호; 미국 특허 제5,789,573호; 미국 특허 제5,178,709호 및 미국 특허 제5,610,288호]. 안티센스 작제물은 또한 다양한 비정상적인 세포 증식, 예를 들면, 암을 억제하고 이를 치료하는데 사용될 수 있는 것으로 기술되어져 왔다[미국 특허 제5,747,470호; 미국 특허 제5,591,317호 및 미국 특허 제5,783,683호].
따라서, 특정 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 상보체에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 서열의 전부 또는 일부분을포함하는 올리고뉴클레오타이드 서열을 제공한다. 한 가지 구체적인 양태에서, 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 DNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 또 다른 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 RNA 또는 이의 유도체를 포함한다. 제3의 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트화 변형된 골격을 포함하는 변형된 DNA를 포함한다. 제4의 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드 서열은 펩타이드 핵산 또는 이의 유도체를 포함한다. 각각의 경우, 바람직한 조성물은 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드의 하나 이상의 부분에 대해 상보적인, 및 보다 바람직하게는 실질적으로 상보적인, 및 보다 더 바람직하게는 완전히 상보적인 서열 영역을 포함한다. 제시된 유전자 서열에 특이적인 안티센스 조성물의 선택은 선택된 표적 서열에 대한 분석 및 2차 구조, Tm, 결합 에너지 및 상대적인 안정성에 대한 측정에 기초한다. 안티센스 조성물은 숙주 세포에서 표적 mRNA에 대한 특이적인 결합을 감소시키거나 억제하는 이합체, 헤어핀 또는 다른 이차 구조를 형성하지 않는 이의 능력에 기초하여 선택될 수 있다. mRNA의 보다 바람직한 표적 영역은 해독 개시 코돈 AUG에 위치하거나 인접하는 영역 및 mRNA의 5' 영역에 실질적으로 상보적인 서열 영역이다. 이러한 2차 구조 분석 및 표적 부위 선택 고려사항은 예를 들면, OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 v.4 및/또는 BLASTIN 2.0.5 알고리듬 소프트웨어[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 1997, 25(17): 3389-402]를 사용하여 수행할 수 있다.
MPG(27 잔기)로 명명된 짧은 펩타이드 벡터를 사용하는 안티센스 전달 방법을 사용하는 것이 또한 고려된다. MPG 펩타이드는 HIV gp41의 융합 서열로부터 유도된 소수성 도메인 및 SV40 T-항원의 핵 국재화 서열로부터의 친수성 도메인을 함유한다[Morris et al., Nucleic Acids Res. 1997 Jul 15; 25(14): 2730-6]. MPG 펩타이드의 수 개의 분자는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 피복시키며 상대적으로 높은 효율(90%)로 1시간 이내에 배양된 포유동물 세포내로 전달되는 것으로 입증되었다. 또한, MPG와의 상호작용은 상기 올리고뉴클레오타이드의 뉴클레아제에 대한 안정성 및 세포막을 가로지르는 능력 모두를 강력하게 증가시킨다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 따라서, 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드 조성물은 종양 세포에서 본 발명의 종양 폴리펩타이드 및 단백질의 발현을 억제시키기 위한 리보자임 분자의 디자인 및 제조에 사용된다. 리보자임은 부위-특이적인 방식으로 핵산을 절단시키는 RNA-단백질 복합체이다. 리보자임은 엔도뉴클레아제 활성을 갖는 특이적인 촉매 도메인을 갖는다[Kim and Cech, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987 Dec; 84(24): 8788-92; Forster and Symons, Cell. 1987 Apr 24; 49(2): 211-20]. 예를 들면, 수 많은 리보자임이 종종 올리고뉴클레오타이드 기질 중 수 개의 포스포에스테르 중 단지 하나만을 절단시키면서, 높은 특이성으로 포스포에스테르 전달 반응을 가속화시킨다[Cech et al., Cell. 1981 Dec; 27(30 Pt 2): 487-96; Michel and Westhof, J. Mol. Biol. 1990 Dec 5; 216(3): 585-610; Reinhold-Hurek and Shub, Nature 1992 May 14; 357 (6374): 173-6]. 이러한 특이성은 화학적 반응에 앞서 리보자임의 내부 가이드 서열("IGS")에 특이적 염기쌍 상호작용을 통해 기질이 결합해야 한다는 필요조건에 기인한 것이다.
천연 효소적 RNA의 6개 기본적인 종류가 현재 공지되어져 있다. 각각은 생리학적 조건하에서 트랜스적으로 RNA 포스포디에스테르의 가수분해를 촉매할 수 있으며 결과적으로 다른 RNA 분자를 절단시킬 수 있다. 일반적으로, 효소적 핵산은 우선 표적 RNA에 결합함으로써 작용한다. 상기 결합은 표적 RNA를 절단시키는 작용을 하는 효소적 핵산 분자의 효소 부분에 매우 인접하여 존재하는 효소적 핵산의 표적 결합 부분을 통해서 일어난다. 따라서, 효소적 핵산은 우선 상보적인 염기쌍을 통해서 표적 RNA를 인식한 후 이에 결합하며, 일단 정확한 결합 부위에 결합되면, 표적 RNA를 효소적으로 절단한다. 상기 표적 RNA의 전략적 절단은 상기 RNA의 암호화된 단백질의 직접적인 합성 능력을 파괴시킬 것이다. 효소적 핵산이 이의 RNA 표적에 결합하여 이를 절단시킨 후, 이는 상기 RNA로부터 분리되어 또 다른 표적을 찾아내어 새로운 표적에 반복적으로 결합하여 이를 절단시킬 수 있다.
리보자임의 효소적 특성은, 치료학적 치료에 필요한 리보자임의 농도가 안티센스 올리고뉴클레오타이드 보다 더 적기 때문에, 안티센스 기술(이때, 핵산 분자는 단순히 핵산 표적에 결합하여 이의 해독을 차단한다) 같은 수 많은 기술들에 비해 유리하다. 이러한 장점은 리보자임이 효소적으로 작용하는 능력을 반영한다. 즉, 단일 리보자임 분자는 수 많은 표적 RNA 분자를 절단시킬 수 있다. 또한, 리보자임은 표적 RNA에 결합하는 염기쌍 형성 메카니즘 뿐만 아니라 표적 RNA 절단 메카니즘에 따라서 억제 특이성을 갖는, 고도로 특이적인 억제제이다. 절단 부위 인접 위치에서 단일 불일치 또는 염기 치환은 리보자임의 촉매적 활성을 완전히 제거시킬 수 있다. 안티센스 분자에서의 유사한 불일치는 이의 작용을 방해하지 못한다[Woolf et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992 Aug 15; 89(16): 7305-9]. 따라서, 리보자임의 작용 특이성은 동일한 RNA 부위에 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오타이드의 작용 특이성 보다 더 크다.
효소적 핵산 분자는 해머헤드, 헤어핀, 간염 δ 바이러스, 그룹 I형 인트론 또는 RNaseP RNA(RNA 가이드 서열과 결합되어) 또는 뉴로스포라 VS RNA 모티프에서 형성될 수 있다. 해머헤드 모티프의 예는 문헌[Rossi et al. Nucleic Acids Res. 1992 Sep 11; 20(17): 4559-65]에 기술되어져 있다. 헤어핀 모티프의 예는 문헌[Hampel et al. Eur. Pat. Appl. No. EP 0360257; Hampel and Tritz, Biochemistry 1989 Jun 13; 28(12): 4929-33; Hampel et al., Nucleic Acids Res. 1990 Jan 25; 18(2): 299-304 and U.S. Patent 5,631,359]에 기술되어져 있다. 간염 δ바이러스 모티프의 예는 문헌[Perrotta and Been, Biochemistry. 1992 Dec 1; 31(47): 11843-52]에 기술되어져 있다. RNaseP 모티프의 예는 문헌[Guerrier-Takada et al., Cell. 1983 Dec; 35(3 Pt 2): 849-57]에 기술되어져 있다. 뉴로스포라 VS RNA 리보자임 모티프는 문헌[Saville and Collins, Cell. 1990 May 18; 61(4): 685-96; Saville and Collins, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991 Oct 1; 88(19): 8826-30; Collins and Olive, Biochemstry. 1993 Mar 23; 32(11): 2795-9]에 기술되어져 있다. 그룹 I형 인트론의 예는 문헌[미국 특허 제4,987,071호]에 기술되어져 있다. 본 발명의 효소적 핵산 분자에서 중요한 것은 표적 유전자 RNA 영역 중 하나 이상에 상보적인 특이적인 기질 결합 부위를 가지며, 기질 결합 부위내 또는 이의 주변에서 상기 분자에 RNA 절단 활성을 부여하는 핵산 서열을 갖는다는 것이다. 따라서, 리보자임 작제물은 본원에서 언급된 특정 모티프에 제한되지는 않는다.
리보자임은 문헌[국제특허공개공보 WO 제93/23569호 및 WO 제94/02595호, 각각은 참조로 본원에 구체적으로 도입된다]에 기술된 바와 같이 디자인하여 기술된 바와 같이 합성하여 시험관내 및 생체내에서 시험할 수 있다. 상기 리보자임은 또한 전달을 위해서 최적화될 수 있다. 특정예가 제공되지만, 당해 분야의 숙련자는 다른 종에서의 등가의 RNA 표적을 필요한 경우 사용할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
리보자임 활성은 리보자임 결합 암(arm)의 길이를 변형시키거나, 혈청 리보뉴클레아제에 의한 이들의 분해를 예방하는 변형[참조: 예를 들면, 국제특허공개공보 WO 제92/07065호; WO 제93/15187호; WO 제91/03162호; 유럽특허공개공보 제92110298.4호; 미국 특허 제5,334,711호 및 국제특허공개공보 WO 제94/13688호, 이들은 효소적 RNA 분자의 당 잔기에서 수행될 수 있는 다양한 화학적 변형들을 기술한다], 세포내에서의 이들의 효율을 증강시키는 변형, 및 RNA 합성 시간을 단축하고 화학적 요구조건을 감소시키기 위한 스템(stem) II 염기들의 제거와 함께 리보자임을 화학적으로 합성함으로써 최적화시킬 수 있다.
문헌[Sullivan et al. 국제특허공개공보 WO 제94/02595호]는 효소적 RNA 분자의 일반적인 전달 방법을 기술한다. 리보자임은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 방법으로 세포에 투여될 수 있으며, 이는 리포좀내 포획화, 이온 영동에 의해, 또는 다른 비히클, 예를 들면, 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생분해성 나노캡슐 및 생부착성 미세구내로의 도입에 의한 것을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 특정 징후에 대해서는, 리보자임은 전술한 비히클의 존재 또는 부재하에서 생체외 세포 또는 조직내로 직접 전달될 수도 있다. 대안으로, RNA/비히클 혼합물은 직접적인 흡입에 의해서, 직접적인 주입 또는 카테테르, 흡입 펌프 또는 스텐트의 사용에 의해서 국부적으로 전달될 수 있다. 전달의 다른 경로는 정맥내, 근육내, 피하내 또는 관절 주사, 에어로졸 흡입, 경구(정제 또는 환제형), 국부적, 전신계, 안내, 복막내 및/또는 초내(intrathecal) 전달을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 리보자임 전달 및 투여에 대한 보다 상세한 기술은 문헌[국제특허공개공보 WO 94/02595호 및 WO 제93/23569호, 각각은 참조로 본원에 구체적으로 도입된다]에서 제공된다.
세포내에 리보자임(들)을 높은 농도로 축적시키는 또 다른 방법은 DNA 발현 벡터내로 리보자임-암호화 서열을 도입시키는 것이다. 리보자임 서열의 전사는 진핵생물 RNA 폴리머라제 I(pol I), RNA 폴리머라제 II(pol II), 또는 RNA 폴리머라제 III(pol III)의 프로모터에 의해 구동된다. pol II 또는 pol III 프로모터로부터의 전사는 모든 세포에서 높은 수준으로 발현될 것이며, 제시된 세포 유형에서 pol II 프로모터의 수준은 인접하여 존재하는 유전자 조절 서열(인핸서, 사일런서 등)의 특성에 따를 것이다. 원핵생물 RNA 폴리머라제 프로모터가 또한 사용될 수 있으며, 단 원핵생물 RNA 폴리머라제 효소는 적합한 세포내에서 발현된다. 상기 프로모터로부터 발현된 리보자임은 포유동물 세포에서도 기능을 나타내었다. 상기 전사 단위체를 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터(예를 들면, 아데노바이러스 또는 아데노-관련 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터(예를 들면, 레트로바이러스 셈리키 포레스트 바이러스, 신드비스 바이러스 벡터)를 포함하지만 이에 제한되지는 않는, 포유동물 세포내로 도입하기 위한 다양한 벡터내로 도입시킬 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 펩타이드 핵산(PNA) 조성물이 제공된다. PNA는 뉴클레오염기가 슈도펩타이드 골격에 부착된 DNA 모사체이다[Good and Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1997 7(4) 431-37]. PNA는 전통적으로 RNA 또는 DNA를 사용해 온 수 많은 방법들에서 사용될 수 있다. 종종 PNA 서열은 상응하는 RNA 또는 DNA 서열 보다 기술들에서 더 우수하게 수행되며 RNA 또는 DNA가 갖추지 못한 유용성을 갖는다. PNA 제조 방법, 사용 특성 및 사용 방법을 포함하는 PNA에 대한 개관은 문헌[Corey, Trends Biotechnol. 1997 Jun; 15(6): 224-9]에서 제공된다. 이와 같이, 특정 구체적인 양태에서, ACE mRNA 서열의 하나 이상의 부분들에 상보적인 PNA 서열을 제조할 수 있으며, 상기 PNA 조성물을 사용하여 ACE-특이적인 mRNA를 조절하고, 변화시키고, 감퇴시키거나 감소시킬 수 있으며, 이로써 상기 PNA 조성물이 투여된 숙주 세포내에서 ACE 활성 수준을 변화시킬 수 있다.
PNA는 DNA의 정상적인 포스포디에스테르 골격을 대체하는 2-아미노에틸-글리신 결합을 갖는다[Nielsen et al., Science 1991 Dec 6; 254(5037): 1497-500; Hanvey et al., Science. 1992 Nov. 27; 258(5087): 1481-5; Hyrup and Nielsen, Bioorg Med Chem. 1996 Jan; 4(1): 5-23]. 이러한 화학은 세 가지 중요한 결과를 야기한다: 첫째, DNA 또는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드와 반대로,PNA는 중성 분자이며; 둘째, PNA는 비키랄성이며 스테레오선택적 합성을 개발할 필요가 없으며; 셋째, 변형된 메리필드 방법을 포함하는 다른 방법들이 사용되어져 왔지만, PNA 합성은 고체상 펩타이드 합성을 위한 표준 Boc 또는 Fmoc 프로토콜을 사용한다.
PNA 단량체 또는 기성품 올리고머가 제조원(PerSeptive Biosystems, Framingham, MA)으로부터 시판중이다. Boc 또는 Fmoc 프로토콜에 의한 PNA 합성은 수동 또는 자동 프로토콜을 사용하여 수월하게 진행된다[Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr; 3(4): 437-45]. 수동 프로토콜은 화학적으로 변형된 PNA의 제조 또는 밀관된 PNA의 패밀리의 동시 합성에 사용된다.
펩타이드 합성과 마찬가지로, 특정 PNA 합성의 성공은 선택된 서열의 특성에 따라 결정될 것이다. 예를 들면, 이론적으로, PNA는 뉴클레오타이드 염기의 임의의 혼합물을 도입시킬 수 있지만, 인접 푸린의 존재는 생성물에서 하나 이상의 잔기 결실을 초래할 수 있다. 이러한 난제가 예견되어, 인접 푸린을 사용한 PNA 제조에서는, 비효율적으로 부가될 것 같은 잔기의 커플링을 반복하도록 제안된다. 이후, 역상 고압 액체 크로마토그래피에 의해 PNA를 정제하여, 펩타이드 합성 동안 관찰되는 것과 유사한 생성물의 수율 및 순도를 제공한다.
제시된 적용을 위한 PNA의 변형은 고체상 합성 동안 아미노산을 커플링시킴으로써 또는 노출된 N-말단 아민에 카복실산 그룹을 함유하는 화합물을 부착시킴으로써 달성될 수 있다. 대안으로, PNA는 도입된 라이신 또는 시스테인에 커플링시킴으로써 합성 후 변형시킬 수 있다. PNA의 변형 용이성은 보다 우수한 용해도를위한 또는 특정 기능성 요구조건을 위한 최적화를 촉진시킨다. 일단 합성되면, PNA 및 이의 유도체의 확인은 질량 분광분석법에 의해서 확인될 수 있다. 수 개의 연구가 PNA의 변형을 수행하고 이를 사용해 왔다[예를 들면, Norton et al., Bioorg Med Chem. 1995 Apr; 3(4): 437-45; Petersen et al., J. Pept Sci. 1995 May-Jun; 1(3): 175-83l Orum et al., Biotechniques. 1995 Sep; 19(3): 472-80; Footer et al., Biochemistry. 1996 Aug 20; 35(33): 10673-9; Griffith et al., Nucleic Acids Res. 1995 Aug 11; 23(15): 3003-8; Pardrige et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Jun 6; 92(12): 5592-6; Boffa et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995 Mar 14; 92(6): 1901-5; Gambacorti-Passerini et al., Blood. 1996 Aug 15; 88(4): 1411-7; Armitage et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997 Nov. 11; 94(23): 12320-5; Seeger et al., Biotechniques. 1997 Sep; 23(3): 512-7]. 문헌[미국 특허 제5,700,922호]는 PNA-DNA-PNA 키메라 분자, 및 진단, 유기체내에서 단백질 조절, 및 치료제에 허용되는 치료 조건에서의 이의 용도를 논의하고 있다.
PNA의 안티센스 결합 특성을 특성화하는 방법은 문헌[Rose, Anal Chem. 1993 Dec 15; 65(24): 3545-9; and Jensen et al., Biochemistry. 1997 Apr. 22; 36(16): 5072-7]에 논의되어져 있다. Rose는 상대적인 결합 역학 및 화학량론을 측정하여, 상보성 올리고뉴클레오타이드에 대한 PNA의 결합을 측정하기 위해서 모세관 겔 전기영동을 사용하였다. 유사한 유형의 측정 방법들이 BIAcoreTM기술을사용하여 Jensen 등에 의해 수행되었다.
기술되어지고 당해 분야의 숙련자에게 명백한 PNA의 다른 적용은 DNA 쇄 침입, 안티센스 억제, 돌연변이 분석, 전사의 인핸서, 핵산 정제, 전사적으로 활성인 유전자의 분리, 전사 인자 결합의 차단, 게놈 절단, 생체센서, 원 위치 하이브리드화 등에서의 용도를 포함한다.
폴리뉴클레오타이드 확인, 특성화 및 발현
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물은 다양한 확립된 기술들 중 하나를 사용하여 확인하고, 제조하고/하거나 조작할 수 있다[예를 들면, 일반적으로, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989, 및 기타 동류의 참조 문헌들]. 예를 들면, 폴리뉴클레오타이드는 종양-연관된 발현(즉, 본원에 제공된 대표적인 분석법을 사용하여 측정된 바와 같이, 정상 조직에서 보다 2배 이상 더 많은 발현)에 대해서 cDNA의 마이크로어레이를 스크리닝하여 확인할 수 있다. 상기 스크리닝은 예를 들면 제조원의 지침(및 기본적으로 문헌[Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10641-10619, 1996 and Heller et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 1250-2155, 1997]에 기술된 바와 같이)에 따라 제조원(Affymetrix, Inc., Santa Clara, CA)의 마이크로어레이 기술을 사용하여 수행할 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드는 종양 세포와 같이, 본원에 기술된 단백질을 발현하는 세포로부터 제조된 cDNA로부터 증폭시킬 수 있다.
수 많은 주형 의존성 방법을 사용하여 샘플 중에 존재하는 관심 대상의 표적 서열을 증폭시킨다. 가장 공지된 증폭 방법 중 하나는 폴리머라제 연쇄 반응(PCRTM)이며, 이는 문헌[미국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호, 이들 각각은 이의 전체가 본원에 참조로 도입된다]에 상세히 기술되어져 있다. 간략하면, PCRTM에서, 표적 서열의 반대쪽 상보적인 쇄 상의 영역에 상보적인 두 개의 프라이머 서열이 제조된다. 과량의 데옥시뉴클레오사이드 트리포스페이트를 DNA 폴리머라제(예를 들면, Taq 폴리머라제)와 함께 반응 혼합물에 부가한다. 표적 서열이 샘플에 존재하는 경우, 프라이머는 표적에 결합하고 폴리머라제가 표적 서열을 따라 뉴클레오타이드를 부가시킴에 의해 신장될 것이다. 반응 혼합물의 온도를 승온 및 감온시킴으로써, 신장된 프라이머는 표적으로부터 해리되어 반응 생성물을 형성할 것이며, 과량의 프라이머가 표적 및 반응 생성물에 결합하여 과정이 반복될 것이다. 바람직하게는, 역 전사 및 PCRTM증폭 과정이 수행되어 증폭된 mRNA의 양을 정량화할 수 있다. 폴리머라제 연쇄 반응 방법은 당해 분야에 공지되어져 있다.
대다수가 PCRTM증폭 기술의 변형들인 수 많은 주형 의존성 과정 중 하나가 용이하게 공지되고 당해 분야에서 유용하다. 예시적으로, 특정 상기 방법은 예를 들면, 문헌[유럽특허공개공보 제320,308호 및 미국 특허 제4,883,750호]에 기술된 리가제 연쇄 반응(LCR로 인용됨); 문헌[PCT 국제특허공개공보 제PCT/US87/00880호]에 기술된 Qbeta 레플리카제; 쇄 전이 증폭(SDA) 및 회복 쇄 반응(RCP)를 포함한다. 또한 다른 증폭 방법이 문헌[영국특허원 제2 202 328호 및 PCT 국제특허공개공보 제PCT/US89/01025호]에 기술되어져 있다. 다른 핵산 증폭 과정들은 핵산 서열 기초 증폭 및 3SR을 포함하여, 전사 기초 증폭 시스템(TAS)[PCT 국제특허공개공보 제WO 88/10315호]를 포함한다. 문헌[유럽특허공개공보 제329 822호]는 순환적으로 합성하는 일본쇄 RNA("ssRNA") 및 이본쇄 DNA(dsDNA)와 관련된 핵산 증폭 과정을 기술한다. 문헌[PCT 국제특허공개공보 제WO 89/06700호]는 프로모터/프라이머 서열의 표적 일본쇄 DNA("ssDNA")에 대한 하이브리드화 이후 서열의 수 많은 RNA 복사체의 전사에 기초하는 핵산 서열 증폭 체계를 기술한다. "RACE"[Frohman, 1990] 같은 다른 증폭 방법, 및 "한방향 PCR"[Ohara, 1989] 같은 다른 증폭 방법들이 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드의 증폭된 부분들은 공지된 기술들을 사용하여 적합한 라이브러리(예를 들면, 종양 cDNA 라이브러리)로부터 전체 길이 유전자를 분리하는데 사용할 수 있다. 상기 기술내에서, 라이브러리(cDNA 또는 게놈성)는 증폭에 적합한 폴리뉴클레오타이드 또는 프라이머 하나 이상을 사용하여 스크리닝된다. 바람직하게는, 라이브러리는 보다 큰 분자를 포함하도록 크기-선택된다. 랜덤 프라임된 라이브러리가 또한 유전자의 5' 및 상류 영역을 확인하는데 바람직하다. 게놈성 라이브러리는 인트론 및 신장하는 5' 서열을 수득하는데 바람직하다.
하이브리드화 기술을 위해서, 부분적인 서열을 공지된 기술을 사용하여 표지할 수 있다(예를 들면,32P를 사용한 닉-해독 또는 말단-표지). 이후, 세균성 또는 박테리오파아지 라이브러리를 일반적으로 변성된 세균 콜로니(또는 파아지 플라크를 함유하는 빈공간(lawn))을 함유하는 필터를 표지된 프로브로 하이브리드화시켜 스크리닝한다[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]. 하이브리드화하는 콜로니 또는 플라크가 선택되어 신장되며, DNA는 추가의 분석을 위해서 분리된다. cDNA 클론은 예를 들면, 부분적인 서열로부터의 프라이머 및 벡터로부터의 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 부가적인 서열의 양을 측정하기 위해서 분석할 수 있다. 제한 맵 및 부분적인 서열을 생성시켜 하나 이상의 중복성 클론을 확인할 수 있다. 이후, 완전한 서열은 표준 기술을 사용하여 측정할 수 있으며, 이는 일련의 결실 클론을 생성시키는 것과 관련될 수 있다. 이후, 수득되는 중복성 서열은 하나의 연속적인 서열로 중복될 수 있다. 전체 길이 cDNA 분자는 공지된 기술을 사용하여 적합한 단편을 연결시킴으로써 생성될 수 있다.
대안으로, 상기 기술된 바와 같은 증폭 기술은 부분적인 cDNA 서열로부터 전체 길이 암호화 서열을 수득하는데 유용할 수 있다. 한 가지 상기 증폭 기술은 역 PCR[참조: Triglia et al., Nucl. Acids Res. 16: 8186, 1988]이며, 이는 유전자의 공지된 영역에서 단편을 생성시키기 위해서 제한 효소를 사용한다. 이후, 상기 단편을 분자내 결합으로 폐환시키고 공지된 영역으로부터 유도된 다양한 프라이머를 사용한 PCR을 위한 주형으로서 사용한다. 다른 방법에서는, 부분적인 서열에 인접하는 서열을 프라이머를 사용한 증폭에 의해 링커 서열 및 공지된 영역에 특이적인 프라이머로 회수할 수 있다. 증폭된 서열은 전형적으로 동일한 링커 프라이머 및 공지된 영역에 특이적인 제2 프라이머로 2차 증폭 과정을 수행한다. 공지된 서열로부터 반대 방향으로 신장을 개시하는 두 개의 프라이머를 사용하는, 이러한 과정에서의 변형은 문헌[WO 제 96/38591호]에 기술되어져 있다. 또 다른 상기 기술은 "cDNA 말단의 신속한 증폭" 또는 "RACE"로 공지되어져 있다. 상기 기술은 폴리A 영역 또는 벡터 서열에 하이브리드화하는 내부 프라이머 및 외부 프라이머의 사용하여 공지된 서열의 5' 및 3'의 서열을 확인하는 것과 관련된다. 부가적인 기술은 캡쳐 PCR[Lagerstrom et al., PCR Methods Applic. 1: 111-19, 1991] 및 워킹 PCR[Parker et al., Nucl. Acids Res. 19: 3055-60, 1991]을 포함한다. 증폭을 사용하는 다른 방법을 또한 사용하여 전체 길이 cDNA 서열을 수득할 수 있다.
특정예에서, GenBank로부터 이용가능한 바와 같이, 발현된 서열 태그(EST) 데이터베이스내에서 제공된 서열 분석에 의해 전체 길이 cDNA 서열을 수득하는 것이 가능하다. 중복성 EST에 대한 조사는 일반적으로 공지된 프로그램(예를 들면, NCBI BLAST 조사)을 사용하여 수행할 수 있으며, 상기 EST는 연속적인 전체 길이 서열을 생성하는데 사용할 수 있다. 전체 길이 DNA 서열은 또한 게놈성 단편의 분석에 의해 수득할 수 있다.
본 발명의 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 이의 단편, 또는 융합 단백질 또는 이의 기능성 등가물을 재조합 DNA 분자에서 사용하여 적합한 숙주 세포내에서 폴리펩타이드의 발현을 지시할 수 있다. 유전자 암호의 본질적인 축퇴성으로 인해, 동일하거나 기능적으로 등가인 아미노산 서열을 암호화하는 다른 DNA 서열을 생성시킬 수 있으며 이러한 서열들을 사용하여 제시된 폴리펩타이드를 클로닝하고 발현시킬 수 있다.
당해 분야의 숙련자에게 이해되는 바와 같이, 특정예에서는 비천연 코돈을 갖는 폴리펩타이드-암호화된 뉴클레오타이드 서열을 제조하는 것이 유리할 수 있다. 예를 들면, 특정 원핵 또는 진핵생물 숙주에 의해 선호되는 코돈을 선택하여 단백질 발현율을 증가시키거나 천연 서열로부터 생성된 전사체 반감기 보다 더 긴 반감기 같은 바람직한 특성을 갖는 재조합 RNA 전사체를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 일반적으로 공지된 방법을 사용하여 유전자 조작하여 다양한 이유로 폴리펩타이드 암호화 서열을 변형시킬 수 있으며, 이러한 변형은 유전자 생성물의 클로닝, 프로세싱 및/또는 발현을 변화시키는 변형을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, 랜덤 단편화에 의한 DNA 혼합(shuffling) 및 유전자 단편 및 합성 올리고뉴클레오타이드의 PCR 조합을 사용하여 뉴클레오타이드 서열을 유전자 조작할 수 있다. 또한, 부위-지시된 돌연변이유발을 사용하여 새로운 제한 부위를 삽입하고, 글리코실화 패턴을 변형시키고, 코돈 선호도를 변화시키고, 스플라이스 변이체를 제조하거나, 돌연변이 도입 등을 수행할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 천연, 변형된 또는 재조합 핵산 서열을 이종 서열에 연결하여 융합 단백질을 암호화할 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드 활성의 억제제에 대하여 펩타이드 라이브러리를 스크리닝하기 위해서, 시판중인 항체에 의해 인식될 수 있는 키메라 단백질을 암호화하는 것이 유용할 수 있다. 융합 단백질은 또한 폴리펩타이드-암호화 서열 및 이종 단백질 서열 사이에 위치한 절단 부위를 함유하도록 유전자 조작하여, 폴리펩타이드가 절단될 수 있고 이종 잔기로부터 분리되어 정제될 수 있다.
목적하는 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 당해 분야에 공지된 화학적 방법을 사용하여 전체를 또는 일부분을 합성할 수 있다[참조: Caruthers, M.H. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215-223, Horn, T. et al. (1980) Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225-232]. 대안으로, 단백질 그 자체는 화학적 방법을 사용하여 제조하여 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 또는 이의 일부분을 합성할 수 있다. 예를 들면, 펩타이드 합성은 다양한 고체상 기술을 사용하여 수행될 수 있으며[Roberge, J. Y. et al. (1995) Science 269: 202-204], 자동화 합성법은 예를 들면, ABI 431A 펩타이드 합성기를 사용하여 합성될 수 있다[Perkin Elmer, Palo Alto, CA].
신규 합성된 펩타이드는 예비 고성능 액체 크로마토그래피[예를 들면, Creighton, T. (1983) Proteins, Structures and Molecular Principles, WH Freeman and Co., New York, N.Y.] 또는 당해 분야에서 이용가능한 다른 비교할만한 기술을 사용하여 실질적으로 정제할 수 있다. 합성 펩타이드의 조성은 아미노산 분석 또는 서열분석(예를 들면, 에드만 분해 방법)으로 확인할 수 있다. 또한, 폴리펩타이드의 아미노산 서열, 또는 이의 일부분은 직접적인 합성 동안 변형될 수 있고/있거나 다른 단백질로부터의 서열 또는 이의 임의의 일부분을 사용한 화학적방법을 사용하여 변이체 폴리펩타이드를 제조할 수 있다.
바람직한 폴리펩타이드의 발현을 위해서, 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 이의 기능성 등가물을 적합한 발현 벡터, 즉 삽입된 암호화 서열의 전사 및 해독에 필요한 요소들을 함유하는 벡터내로 삽입시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련자에게 공지된 방법들을 사용하여 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열 및 적합한 전사 및 해독 조절 요소를 함유하는 발현 벡터를 작제할 수 있다. 이러한 방법은 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술, 및 생체내 유전자 재조합을 포함한다. 상기 기술들은 예를 들면, 문헌[Sambrook, J. et al. (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y., and Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y.]에 기술되어져 있다.
다양한 발현 벡터/숙주 시스템을 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하도록 사용할 수 있다. 이는 미생물, 예를 들면, 재조합 박테리오파아지, 플라스미드, 또는 코스미드 DNA 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 세균; 효모 발현 벡터를 사용하여 형질전환된 효모; 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 배큘로바이러스)를 사용하여 감염된 곤충 세포 시스템; 바이러스 발현 벡터(예를 들면, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV) 또는 세균 발현 벡터(예를 들면, Ti 또는 pBR322 플라스미드)를 사용하여 형질전환된 식물 세포 시스템; 또는 동물 세포 시스템을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
발현 벡터내에 존재하는 "조절 요소" 또는 "조절 서열"은 전사 및 해독을 수행하기 위한 숙주 세포 단백질과 상호작용하는 벡터의 비해독 영역(인핸서, 프로모터, 5' 및 3' 비해독 영역)이다. 상기 요소는 이의 강도 및 특이성에서 다양할 수 있다. 사용되는 벡터 시스템 및 숙주에 따라서, 구성성 및 유도성 프로모터를 포함하는, 임의의 수의 적합한 전사 및 해독 요소가 사용될 수 있다. 예를 들면, 세균 시스템에서 클로닝하는 경우, PBLUESCRIPT 파아지미드(제조원: Stratagene, La Jolla, Calif.) 또는 PSORT1 플라스미드(제조원: Gibco BRL, Gaithersburg, MD) 등의 하이브리드 lacZ 프로모터 같은 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 포유동물 세포 시스템에서, 포유동물 유전자 또는 포유동물 바이러스로부터의 프로모터가 일반적으로 바람직하다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 다중 복사체를 함유하는 세포주를 생성시키는 것이 필요한 경우, SV40 또는 EBV에 기초하는 벡터가 적합한 선택가능한 마커와 함께 유리하게 사용될 수 있다.
세균 시스템에서, 수 많은 발현 벡터 중 임의의 하나를 발현된 폴리펩타이드에 의도된 용도에 따라서 선택할 수 있다. 예를 들면, 대량이 필요한 경우, 예를 들면, 항체 유도의 경우, 용이하게 정제된 융합 단백질의 높은 수준의 발현을 지시하는 벡터가 사용될 수 있다. 상기 벡터는 다기능성 이. 콜라이 클로닝 및 발현 벡터, 예를 들면, 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열은 β-갈락토시다제의 아미노 말단 Met 및 후속하는 7개 잔기에 대한 서열과 함께 동일 프레임내에서 벡터내로 연결되어, 하이브리드 단백질이 생성될 수 있는 BLUESCRIPT(제조원: Stratagene); pNI 벡터[Van Heeke, G. and S. M. Schuster (1989) J. Biol. Chem. 264: 5503-5509] 등을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. pGEX 벡터(제조원:Promega, Madison, Wis.)를 또한 사용하여 글루타티온 S-트랜스퍼라제(GST)와 함께 융합 단백질로서 외래 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있다. 일반적으로, 상기 융합 단백질은 가용성이며 글루타티온-아가로오스 비드에 흡착시킨 후 유리 글루타티온의 존재하에서 용출시킴으로써 용해된 세포로부터 용이하게 정제시킬 수 있다. 상기 시스템에서 제조된 단백질은 헤파린, 트롬빈, 또는 인자 XA 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 디자인하여, 관심 대상의 클로닝된 폴리펩타이드가 GST 잔기로부터 자유자재로 방출될 수 있다.
효모, 사카로마이세스 세레비지애에서, 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 수 많은 벡터, 예를 들면, 알파 인자, 알콜 옥시다제, 및 PGH가 사용될 수 있다. 개관을 위해서는, 문헌 참조[Ausubel et al. (상기) 및 Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153: 516-544].
식물 발현 벡터가 사용되는 경우, 폴리펩타이드 암호화 서열의 발현은 수 많은 프로모터 중 임의의 하나에 의해 구동될 수 있다. 예를 들면, CaMV의 35S 및 19S 프로모터 같은 바이러스 프로모터가 단독으로 또는 TMV[Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6: 307-311]로부터의 오메가 리더 서열과 병용하여 사용될 수 있다. 또는, RUBISCO의 작은 서브유니트 또는 열 쇼크 프로모터 같은 식물 프로모터가 사용될 수 있다[Coruzzi, G. et al. (1984) EMBO J. 3: 1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224: 838-843; and Winter, J. et al. (1991) Results Probl. Cell Differ. 17: 85-105]. 이러한 작제물은 직접적인 DNA 형질전환 또는 병원체-매개된 형질감염에 의해서 식물 세포내로 도입될 수 있다. 상기 기술은 일반적으로 이용가능한 수 많은 개관들에서 기술되어져 있다[참조: 예를 들면, Hobbs, S. or Murry, L.E. in McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.,; pp. 191-196].
곤충 시스템은 또한 곤충 폴리펩타이드를 발현시키는데 사용할 수 있다. 예를 들면, 한 가지 그러한 시스템에서, 오토그라파 칼리포니카(Autographa californica) 핵 다각체병 바이러스(AcNPV)를 벡터로 사용하여 스포도프테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포 또는 트리코플러시아 라르배(Trichoplusia larvae)에서 외래 유전자를 발현시킬 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을바이러스의 비필수 영역, 예를 들면, 폴리헤드린 유전자내로 클로닝하고 폴리헤드린 프로모터의 조절하에 위치시킬 수 있다. 폴리펩타이드-암호화 서열의 성공적인 삽입은 폴리헤드린 유전자를 불활성화시키고 재조합 바이러스 결함 피복 단백질을 생성시킨다. 재조합 바이러스는 예를 들면, 에스. 프루기페르다 세포 또는 트리코플러시아 라르배를 감염시키는데 사용할 수 있으며, 이때, 관심 대상의 폴리펩타이드가 발현될 수 있다[Engelhard, E.K. et al., (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. 91: 3224-3227].
포유동물 숙주 세포에서, 수 많은 바이러스 기초 발현 시스템이 일반적으로 이용가능하다. 예를 들면, 아데노바이러스를 발현 벡터로 사용하는 경우, 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 후기 프로모터 및 삼합체 리더 서열로 이루어진 아데노바이러스 전사/해독 복합체내로 연결시킬 수 있다. 바이러스 게놈의 비필수 E1 또는 E3 영역내로의 삽입을 사용하여 감염된 숙주 세포내에서 폴리펩타이드를 발현시킬 수 있는 살아있는 바이러스를 수득할 수 있다[Logan, J. and Shenk, T. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. 81: 3655-3659]. 또한, 전사 인핸서, 예를 들면, 라우스 육종 바이러스(RSV) 인핸서를 사용하여 포유동물 숙주 세포에서 발현을 증가시킬 수 있다.
특정 개시 시그날을 또한 사용하여 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열의 보다 효과적인 전사를 달성할 수 있다. 상기 시그날은 ATG 개시 코돈 및 인접 서열들을 포함한다. 폴리펩타이드를 암호화하는 서열, 이의 개시 코돈, 및 상류 서열들이 적합한 발현 벡터내로 삽입되는 경우, 어떠한 부가적인 전사적 또는 해독적 조절 시그날도 필요하지 않을 수 있다. 그러나, 단지 암호화 서열, 또는 이의 일부만이 삽입되는 경우, ATG 개시 코돈을 포함하는 외인성 해독 조절 시그날이 제공되어야만 한다. 추가로, 개시 코돈은 전체 삽입물의 해독을 보장하기 위해서 정확한 판독 프레임내에 존재해야만 한다. 외인성 해독 요소 및 개시 코돈은 천연 및 합성 모두의 다양한 기원일 수 있다. 발현의 효율은 문헌[Scharf, D. et al. (1994) Results Probl. Cell Differ. 20: 125-162]에 기술된 바와 같이, 사용되는 특정 세포 시스템에 적합한 인핸서를 포함시켜 증강시킬 수 있다.
또한, 숙주 세포주는 삽입된 서열의 발현을 조절하거나 바람직한 방식으로 발현된 단백질을 가공하는 이의 능력에 대해서 선택될 수 있다. 상기 폴리펩타이드의 변형은 아세틸화, 카복실화, 글리코실화, 포스포릴화, 지질화 및 아실화를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 단백질의 "프리프로" 형태를 절단하는 해독 후 가공을 또한 사용하여 정확한 삽입, 폴딩 및/또는 기능을 촉진시킬 수 있다.상기 해독 후 활성에 대한 특정 세포 기관 및 특징적인 메카니즘을 갖는 CHO, COS, Hela, MDCK, HEK293, 및 WI38 같은 상이한 숙주 세포를 선택하여 외래 단백질의 정확한 변형 및 가공을 보장할 수 있다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해서, 안정한 발현이 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드를 안정하게 발현하는 세포주를 바이러스의 복제 오리진 및/또는 내인성 발현 요소 및 선태가능한 마커 유전자를 동일한 또는 개별적인 벡터로 함유할 수 있는 발현 벡터를 사용하여 형질전환시킬 수 있다. 벡터의 도입 후, 세포를 풍부한 배지 상에서 1 내지 2일 동안 성장시킨 후 선택 배지로 옮길 수 있다. 선택가능한 마커의 목적은 선택 내성을 부여하는 것이며, 이의 존재로 도입된 서열을 성공적으로 발현하는 세포의 성장 및 회수가 가능해 진다. 안정하게 형질전환된 세포의 내성 클론을 세포 유형에 적합한 조직 배양 기술을 사용하여 증식시킬 수 있다.
임의의 수의 선택 시스템을 사용하여 형질전환된 세포주를 회수할 수 있다. 이는 각각 tk.sup.- 또는 aprt.sup- 세포에서 사용할 수 있는 단순 포진 바이러스 티미딘 키나제[Wigler, M. et al. (1977) Cell 11: 223-32] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제[Lowy, I. et al. (1990) Cell 22: 817-23] 유전자를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 항대사산물, 항생제 또는 제초제 내성을 선택을 위한 기초로서 사용할 수 있으며, 예를 들면, 각각, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr[Wigler, M. et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 3567-70]; 아미노글리코사이드, 네오마이신 및 G-418에 내성을 부여하는 npt[Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150: 1-14]; 및 클로설푸론 및 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제에 내성을 부여하는 pat가 있다[Murry, 상기]. 부가적인 선택가능한 유전자가 기술되어져 있으며, 예를 들면, 세포가 트립토판 대신에 인돌을 사용할 수 있게 하는 trpB, 또는 세포가 히스티딘 대신에 히스티놀을 사용할 수 있게 하는 hisD가 있다[Hartman, S.C. and R.C. Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 8047-51]. 안토시아닌, 베타-글루쿠로니다제 및 이의 기질 GUS, 및 루시퍼라제 및 이의 기질 루시페린 같은 가시적인 마커의 사용이 인기를 얻고 있으며, 형질전환체의 확인 뿐만 아니라 특정 벡터 시스템에 기인할 수 있는 일시적인 또는 안정한 단백질 발현량을 정량화하는데 광범위하게 사용되고 있다[Rhodes, C.A. et al. (1995) Methods Mol. Biol. 55: 121-131].
마커 유전자 발현의 존재/부재가 관심 대상의 유전자가 또한 존재한다는 것을 제시하지만, 이의 존재 및 발현은 확인될 필요가 있을 수 있다. 예를 들면, 폴리펩타이드 암호화 서열이 마커 유전자 서열내로 삽입되는 경우, 서열을 함유하는 재조합 세포는 마커 유전자 기능의 부재로서 확인될 것이다. 대안으로, 마커 유전자는 단일 프로모터의 조절하에 폴리펩타이드 암호화 서열과 직렬로 위치할 수 있다. 유도 또는 선택에 대한 반응에서 마커 유전자의 발현은 일반적으로 또한 직렬 유전자의 발현을 나타낸다.
대안으로, 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유하고 발현하는 숙주 세포를 당해 분야에 공지된 다양한 방법으로 확인할 수 있다. 이러한 방법은 예를 들면, 핵산 또는 단백질의 검출 및/또는 정량화를 위한 막, 용액, 또는 칩-기초 기술을 포함하는, DNA-DNA, DNA-RNA 하이브리드화 및 단백질 생체분석법 또는 면역분석 기술을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다.
생성물에 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 사용하여, 폴리뉴클레오타이드 암호화된 생성물의 발현을 검출하고 측정하기 위한 다양한 프로토콜이 당해 분야에 공지되어져 있다. 예로는 효소-결합된 면역흡착 분석(ELISA), 방사능면역분석법(RIA) 및 형광 활성화된 세포 분류법(FACS)을 포함한다. 제시된 폴리펩타이드 상의 두 개의 비방해성 에피토프에 대해서 모노클로날 항체를 사용하는 두 부위, 모노클로날-기초한 면역분석법이 특정 적용에 바람직할 수 있지만, 경쟁 결합 분석이 또한 사용될 수 있다. 이러한 및 다른 분석법들은 특히 문헌[hampton, R. et al. 1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.; and Maddox, D.E. et al. 1983; J. Exp. Med. 158: 1211-1216]에 기술되어져 있다.
광범위하게 다양한 표지 및 접합 기술들이 당해 분야의 숙련자들에게 공지되어져 있으며 다양한 핵산 및 아미노산 분석법에 사용될 수 있다. 표지된 하이브리드화를 위한 방법 또는 폴리뉴클레오타이드와 관련된 서열을 검출하기 위한 PCR 프로브는 표지된 뉴클레오타이드를 사용하는 올리고표지화, 닉 해독, 말단 표지화 또는 PCR 증폭을 포함한다. 대안으로, 서열 또는 이의 임의의 일부분을 mRNA 프로브의 제조를 위해서 벡터내로 클로닝할 수 있다. 상기 벡터는 당해 분야에 공지되어져 있으며, 시판중이며, 이를 사용하여 T7, T3 또는 SP6 같은 적합한 RNA 폴리머라제 및 표지된 뉴클레오타이드를 부가시켜 시험관내에서 RNA 프로브를 합성할 수 있다. 이러한 과정들은 다양한 시판중인 키트를 사용하여 수행할 수 있다. 사용될 수 있는 적합한 리포터 분자 또는 표지는 방사성 핵종, 효소, 형광제, 화학발광제, 또는 발색제 뿐만 아니라 기질, 보조인자, 억제제, 자기성 입자 등을 포함한다.
관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 서열로 형질전환된 숙주 세포는 세포 배양물의 발현 및 세포 배양물로부터 회수에 적합한 조건하에서 배양시킬 수 있다. 재조합 세포에 의해 생성된 단백질은 사용되는 서열 및/또는 벡터에 따라서, 분비될 수 있거나 세포내에 함유될 수 있다. 또한, 당해 분야의 숙련자에게 이해될 수 있는 바와 같이, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터는 원핵생물 또는 진핵생물 세포막을 통해 암호화된 폴리펩타이드의 분비를 지시하는 시그날 서열을 함유하도록 디자인될 수 있다. 다른 재조합 작제법을 사용하여 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 서열을 가용성 단백질의 정제를 촉진시킬 수 있는 폴리펩타이드 도메인을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열에 결합시킬 수 있다. 상기 정제 촉진 도메인은 고정된 금속 상에서 정제를 가능하게 하는 히스티딘-트립토판 모듈 같은 금속 킬레이트화 펩타이드, 고정된 면역글로불린 상에서 정제를 가능하게 하는 단백질 A 도메인, 및 FLAGS 신장/친화도 정제 시스템(제조원: Immunex Corp., Seattle, Wash.)에서 사용되는 도메인을 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 정제 도메인 및 암호화된 폴리펩타이드 사이의 인자 XA 또는 엔테로키나제에 특이적인 것과 같은 절단가능한 링커 서열(제조원: Invitrogen, San Diego, Calif.)을 포함시켜 정제를 촉진시킬 수 있다. 한 가지 상기 발현 벡터는 관심 대상의 폴리펩타이드 및 티오레독신 또는 엔테로키나제 절단 부위에 앞서 6개 히스티딘 잔기를암호화하는 핵산을 함유하는 융합 단백질의 발현용으로 제공된다. 히스티딘 잔기는 문헌[Porath, J. et al., 1992, Prot. Exp. Prif. 3:263-281]에 기술된 바와 같은 IMIAC(고정된 금속 이온 친화도 크로마토그래피) 상에서의 정제를 촉진시키는 반면, 엔테로키나제 절단 부위는 융합 단백질로부터 목적하는 폴리펩타이드의 정제 방법을 제공한다. 융합 단백질을 함유하는 벡터에 대한 논의는 문헌[Kroll, D.J. et al., 1993; DNA Cell Biol. 12: 441-453]에서 제공된다.
재조합 생성 방법 이외에, 본 발명의 폴리펩타이드 또는 이의 단편은 고체상 기술[Merrifield J. (1963) J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2154]을 사용하는 직접적인 펩타이드 합성법으로 제조할 수 있다. 단백질 합성은 수동 기술 또는 자동화에 의해 수행할 수 있다. 자동화 합성법은 예를 들면, 장치(Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer, 제조원: Perkin Elmer)를 사용하여 달성할 수 있다. 대안으로, 다양한 단편을 개별적으로 화학적으로 합성시켜 화학적 방법으로 결합시켜 전체 분자를 제조할 수 있다.
항체 조성물, 이의 단편 및 다른 결합제
또 다른 양태에 따라서, 본 발명은 추가로 본원에 기술된 종양 폴리펩타이드 또는 이의 일부분, 이의 변이체 또는 유도체에 면역학적 결합을 나타내는 항체 및 이의 항원-결합 단편 같은 결합제를 제공한다. 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은 본 발명의 폴리펩타이드와 검출가능한 수준(예를 들면, ELISA 분석법에서)으로 반응하고 유사한 조건하에서 비관련된 폴리펩타이드와 검출가능하게 반응하지 않는경우, 본 발명의 폴리펩타이드와 "특이적으로 결합하는", "면역학적으로 결합하는" 및/또는 "면역학적으로 반응성인" 것이다.
이러한 내용에서 사용되는 바와 같이, 면역학적 결합은 일반적으로 면역글로불린 분자 및 면역글로불린이 특이적인 항원 사이에 일어나는 유형의 비공유결합성 상호작용을 의미한다. 면역학적 결합 상호작용의 강도 또는 친화도는 상호작용의 해리 상수(Kd)로 표현될 수 있으며, 이때, 보다 작은 Kd는 보다 큰 친화도를 나타낸다. 선택된 폴리펩타이드의 면역학적 결합 특성은 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 정량화할 수 있다. 상기 이러한 방법은 항원 결합 부위/항원 복합체 형성 및 해리율의 측정을 수반하며, 이때, 상기 비율은 복합체 상대의 농도, 상호작용의 친화도 및 양방향에서 상기 비율에 동등하게 영향을 미치는 기하학 변수들에 따른다. 따라서, "온 속도 상수"(Kon) 및 "오프 속도 상수"(Koff) 모두는 결합 및 해리의 농도 및 실질적인 속도의 산출에 의해 결정할 수 있다. Koff/Kon의 비율은 친화도와 관련되지 않은 모든 변수들의 삭제를 가능하게 하며, 따라서 해리 상수 Kd와 동일하게 된다. 문헌 참조[일반적으로, Davies et al. (1990) Annual Rev. Biochem. 59: 439-473].
항체의 "항원 결합 부위" 또는 "결합 부분"은 항원 결합에 참여하는 면역글로불린 분자의 일부를 의미한다. 항원 결합 부위는 중쇄("H") 및 경쇄("L")의 N-말단 가변("V") 영역의 아미노산 잔기에 의해 형성된다. 중쇄 및 경쇄의 V 영역의 세 개의 매우 상이한 신장물은 "골격 영역" 또는 "FR"로 공지된 보다 보존적인 플랭킹하는 신장물 사이에서 "초가변 영역"으로서 인용된다. 따라서, "FR"은 면역글로불린내 초가변 영역 사이 또는 이에 인접하여 천연적으로 발견되는 아미노산 서열을 의미한다. 항체 분자에서, 경쇄에서의 세 개의 초가변 영역 및 중쇄에서의 초가변 영역은 3차원 공간에서 서로에 대해서 적절히 배치되어 항원 결합 표면을 형성한다. 항원 결합 표면은 결합된 항원의 3차원 표면에 상보적이며 중쇄 및 경쇄 각각의 세 개의 초가변 영역은 "상보성 결정 영역" 또는 "CDR"로서 인용된다.
결합제는 추가로 본원에 제공된 대표적인 분석법들을 사용하여, 암, 예를 들면 유방암에 걸리거나 걸리지 않은 환자를 식별시켜 줄 수 있다. 예를 들면, 항체 또는 종양 단백질에 결합하는 다른 결합제는 바람직하게는 상기 질환 환자의 약 20% 이상, 및 보다 바람직하게는 환자의 약 30% 이상에서 암의 존재를 지시하는 시그날을 생성시킬 것이다. 대안으로 또는 추가로, 항체는 암에 걸리지 않은 개체의 약 90% 이상에서 상기 질환의 부재를 지시하는 네가티브 시그날을 생성시킬 것이다. 결합제가 이러한 필요조건을 충족시키는지를 결정하기 위해서, 암에 걸리거나 걸리지 않은 환자(표준 임상 시험을 사용하여 결정된 바와 같이)로부터의 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액, 혈청, 객담, 뇨 및/또는 종양 생검)을 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 존재에 대해서 본원에 기술된 바와 같이 분석할 수 있다. 바람직하게는, 상기 질환에 걸리거나 걸리지 않은 통계학적으로 유의한 수의 샘플을 분석할 것이다. 각각의 결합제는 상기 기준을 충족시켜야 하지만, 당해 분야의 숙련자는 결합제가 혼용되어 감수성을 개선시킬 수 있다는 것을 인식할 것이다.
상기 필요조건을 충족시키는 임의의 제제는 결합제일 수 있다. 예를 들면,결합제는 펩타이드 성분을 갖거나 갖지 않는 리보좀, RNA 분자 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 바람직한 구체적인 양태에서, 결합제는 항체 또는 이의 항원 결합 단편이다. 항체는 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 다양한 기술들 중 하나로 제조할 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, Harlow and lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 항체는 본원에 기술된 바와 같은 모노클로날 항체의 생성, 또는 적합한 세균 또는 포유동물 세포 숙주내로의 항체 유전자의 형질감염을 통해서와 같은 세포 배양 기술로 제조하여 재조합 항체의 생성을 가능하게 할 수 있다. 한 가지 기술에서, 폴리펩타이드를 포함하는 면역원은 광범위하게 다양한 포유동물(예를 들면, 마우스, 랫트, 토끼, 양 또는 염소) 중 하나내로 처음 주입된다. 이러한 단계에서, 본 발명의 폴리펩타이드는 변형없이 면역원으로서 작용할 수 있다. 대안으로, 특히 상대적으로 짧은 폴리펩타이드에 있어서, 폴리펩타이드가 담체 단백질, 예를 들면 소 혈청 알부민 또는 키홀 림펫 헤모시아닌에 결합되는 경우, 보다 우수한 면역 반응이 유발될 수 있다. 면역원은 바람직하게는 예정된 스케줄에 따라서 동물 숙주에 주입되고 한번 이상의 부스터 면역화를 병용하며, 상기 동물을 주기적으로 채혈한다. 이후, 폴리펩타이드에 특이적인 폴리클로날 항체를 상기 항혈청으로부터, 예를 들면, 적합한 고체 지지체에 결합된 폴리펩타이드를 사용하는 친화도 크로마토그래피에 의해 정제할 수 있다.
관심 대상의 항원성 폴리펩타이드에 특이적인 모노클로날 항체는 예를 들면, 문헌[Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976 및 이의 개선법들]의 기술을 사용하여 제조할 수 있다. 간략하면, 이러한 방법들은 목적하는 특이성(즉, 관심 대상의 폴리펩타이드와의 반응성)을 갖는 항체를 제조할 수 있는 불멸 세포주의 제조와 관련된다. 상기 세포주는 예를 들면, 상기 기술된 바와 같이 면역화된 동물로부터 수득된 비장 세포로부터 제조할 수 있다. 이후, 비장 세포를 예를 들면, 골수종 세포 융합 상대, 바람직하게는 면역화된 동물과 동계인 세포와 융합에 의해 불멸화시킨다. 다양한 융합 기술을 사용할 수 있다. 예를 들면, 비장 세포 및 골수종 세포를 수 분 동안 비이온성 세제에서 혼합한 후, 하이브리드 세포의 성장을 지지하지만 골수종 세포의 성장을 억제하는 선택 배지 상에서 저 밀도로 도말할 수 있다. 바람직한 선택 기술은 HAT(하이포크산틴, 아미노프테린, 티미딘)를 사용한다. 충분한 시간, 일반적으로 약 1 내지 2주 후, 하이브리드의 콜로니가 관찰된다. 단일 콜로니를 선택하여 폴리펩타이드에 대한 결합 활성에 대해서 이의 배양 상등액을 시험한다. 고 반응성 및 특이성을 갖는 하이브리도마가 바람직하다.
모노클로날 항체는 성장하는 하이브리도마 콜로니의 상등액으로부터 분리시킬 수 있다. 또한, 마우스 같은 적합한 척추동물 숙주의 복막강내로의 하이브리도마 세포의 주입 같은, 다양한 기술들을 사용하여 수율을 증가시킬 수 있다. 이후, 모노클로날 항체를 복수 또는 혈액으로부터 회수할 수 있다. 오염물을 통상적인 방법, 예를 들면, 크로마토그래피, 겔 여과, 침전, 및 추출 방법을 사용하여 항체로부터 제거할 수 있다. 본 발명의 폴리펩타이드는 정제 방법에서, 예를 들면, 친화도 크로마토그래피 단계에서 사용할 수 있다.
항체 분자의 면역학적 결합 특성을 나타낼 수 있는 항원-결합 부위를 포함하는 수 많은 치료학적으로 유용한 분자가 당해 분야에 공지되어져 있다. 단백질가수분해 효소 파파인은 우선적으로 IgG 분자를 절단하여 수 개의 단편을 생성하며, 이중 두 개("F(ab)" 단편) 각각은 온전한 항원-결합 부위를 포함하는 공유결합성 이종이량체를 포함한다. 효소 펩신은 IgG 분자를 절단하여 항원 결합 부위 모두를 포함하는 "F(ab')2" 단편을 포함하는 수 개의 단편을 제공한다. "Fv" 단편은 IgM의 우선적인 단백질가수분해 절단으로 생성되며, 드문 경우에 IgG 또는 IgA 면역글로불린 분자를 절단한다. 그러나, Fv 단편은 당해 분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여 보다 일반적으로 유도된다. Fv 단편은 천연 항체 분자의 항원 인식 및 결합 능력의 상당 부분을 함유하는 항원 결합 부위를 포함하는 비공유결합성 VH::VL이종이량체를 포함한다. 문헌 참조[Inbar et al. (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2659-2662; Hochman et al. (1976) Biochem 15: 2706-2710; and Ehrlich et al. (1980) Biochem 19: 4091-4096].
일본쇄 Fv("sFv") 폴리펩타이드는 펩타이드 암호화 링커에 의해 결합된 VH-VL-암호화 유전자를 포함하는 유전자 융합물로부터 발현되는 공유결합된 VH::VL이종이량체이다. 문헌 참조[Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85(16): 5879-5883]. 수 많은 방법들이 항체 V 영역으로부터 천연적으로 응집되어 있지만 화학적으로 분리된 경쇄 및 중쇄 폴리펩타이드 쇄를 항원 결합 부위의 구조와 실질적으로 유사한 3차원 구조로 폴딩될 sFv 분자로 전환시키기 위한 화학적 구조를 식별하기 위해서 기술되어져 왔다. 문헌 참조[예를 들면, 미국 특허 제5,091,513호 및 제5,132,405호, Huston et al.; 및 미국 특허 제4,946,778호, Lander et al.].
상기 기술된 분자 각각은 CDRS에 지지체를 제공하는 중쇄 및 경쇄 FR 세트 사이에 각각 분산된 중쇄 및 경쇄 CDR 세트를 포함하며 서로에 대해서 CDR의 공간적 상관관계를 정의한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "CDR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 세 개의 초가변 영역을 의미한다. 중쇄 또는 경쇄의 N-말단으로부터 시작하여, 세 개의 영역은 각각, "CDR1", "CDR2" 및 "CDR3"으로 명명된다. 따라서, 항원 결합 부위는 중쇄 및 경쇄 V 영역의 각각으로부터의 CDR 세트를 포함하여, 6개의 CDR을 포함한다. 단일 CDR(예를 들면, CDR1, CDR2 및 CDR3)을 포함하는 폴리펩타이드는 본원에서 "분자 인식 단위"로 인용된다. 수 많은 항원-항체 복합체에 대한 결정학적 분석은 CDR의 아미노산 잔기가 결합된 항원과 광범위한 접촉을 형성하며, 이때 가장 광범위한 항원 접촉은 중쇄 CDR3과 형성된다는 것을 입증하였다. 따라서, 분자 인식 단위는 항원 결합 부위에 대한 특이성에 주로 관여한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "FR 세트"는 중쇄 또는 경쇄 V 영역의 CDR 세트의 CDR을 구성하는 네 개의 플랭킹 아미노산 서열을 의미한다. 특정 FR 잔기는 결합하는 항원과 접촉할 수 있지만, FR은 V 영역을 항원 결합 부위로 폴딩시키는데 관여하며, 특히 FR 잔기를 CDR에 바로 인접하게 한다. FR내에서, 특정 아미노 잔기 및 특정 구조적 특성은 매우 보존적이다. 이와 관련하여, 모든 V 영역 서열은 약 90개 아미노산 잔기의 내부 이황화 루프를 함유한다. V 영역이 결합 부위로 폴딩되는 경우, CDR은 항원 결합 표면을 형성하는 돌출성 루프 모티프로서 나타난다. 정확한 CDR 아미노산 서열에 관계없이, 특정 "규범적인" 구조로의 CDR 루프의 폴딩된 형태에 영향을 미치는 FR의 보존적인 구조 영역이 존재하는 것으로 일반적으로 인식되고 있다. 추가로, 특정 FR 잔기는 항체 중쇄 및 경쇄의 상호작용을 안정화시키는 비공유성 도메인간 접촉에 관여하는 것으로 공지되어져 있다.
비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 항원 결합 부위를 포함하는 수 많은 "사람화된" 항체 분자가 기술되어져 왔으며, 사람 불변 도메인에 융합된 설치류 V 영역 및 이의 관련된 CDR을 갖는 키메라 항체[Winter et al. (1991) Nature 349: 293-299; Lobuglio et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 4220-4224; Shaw et al. (1987) J Immunol. 138: 4534-4538; and Brown et al. (1987) Cancer Res. 47: 3577-3583], 적합한 사람 항체 불변 영역에 융합되기 전에 사람 지지 FR에 그래프트된 설치류 CDR을 갖는 키메라 항체[Riechmann et al. (1988) Nature 332: 323-327; Verhoeyen et al. (1988) Science 239; 1534-1536; and Jones et al. (1986) Nature 321: 522-525], 및 재조합 처리된(recombinantly veneered) 설치류 FR에 의해 지지되는 설치류 CDR을 갖는 키메라 항체[유럽 특허원 제519,596호, 1992년 12월 23일 공개됨]가 포함된다. 이러한 "사람화된" 분자는 사람 수용체에서 상기 잔기들의 치료학적 적용의 지속성과 효과를 제한하는 설치류 항사람 항체 분자에 대한 바람직하지 않은 면역학적 반응을 최소화하기 위해서 디자인된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "처리된 FR" 및 "재조합 처리된 FR"은 실질적으로 모든 천연 FR 폴리펩타이드 폴딩 구조를 보유하는 항원 결합 부위를 포함하는 이종성 분자를 제공하기 위해서, 예를 들면, 설치류 중쇄 또는 경쇄 V 영역으로부터의 FR 잔기의 사람 FR 잔기로의 선택적인 대체를 의미한다. 처리 기술(Veneering technique)은 항원 결합 부위의 리간드 결합 특성은 항원 결합 표면내 중쇄 및 경쇄 CDR 세트의 구조 및 상대적인 배치에 의해 주로 결정된다는 이해에 기초한다. 문헌 참조[Davies et a. (1990) Ann. Rev. Biochem. 59: 439-473]. 따라서, 항원 결합 특이성은 CDR 구조, 서로의 상호작용 및 V 영역 도메인의 나머지 부분과의 이의 상호작용이 조심스럽게 유지되는 경우에만 사람 항체내에서 보존될 수 있다. 처리 기술을 사용함으로써, 면역계에 의해 용이하게 접촉하게 되는 외부(예를 들면, 용매-접근가능한) FR 잔기를 사람 잔기로 선택적으로 대체하여 약한 면역원성, 또는 실질적으로 비면역원성 처리된 표면을 포함하는 하이드리드 분자를 제공한다.
상기 처리 방법은 문헌[Kabat el al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th ed., (U.S. Dept. of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office, 1987)]에 축적된 사람 항체 가변 도메인에 대한 유용한 서열 데이터, Kabat 데이터베이스로의 업데이트, 및 기타 이용가능한 미국 및 외국 데이터베이스(핵산 및 단백질 모두)를 사용한다. V 영역 아미노산의 용매 접근용이성은 사람 및 쥐 항체 단편에 대한 공지된 3차원 구조로부터 유추할 수 있다. 쥐 항원 결합 부위를 처리하는 두 개의 일반적인 단계가 있다. 우선, 관심대상의 항체 분자의 가변 영역의 FR을 상기 확인된 공급원으로부터 수득된 사람 가변 도메인의 상응하는 FR 서열과 비교한다. 이후, 가장 상동성인 사람 V 영역을 상응하는 쥐 아미노산에 대해 잔기 대 잔기로 비교한다. 사람 대응물과 상이한 쥐 FR내 잔기를 당해 분야에 공지된 재조합 기술을 사용하여 사람 잔기로 제시된 잔기로 대체한다. 잔기 변환은 적어도 부분적으로 노출된(용매 접근용이한) 잔기로 수행되며, 프롤린, 글리신 및 하전된 아미노산 같은 V 영역 도메인의 3차 구조에 중요한 영향을 미칠 수 있는 아미노산 잔기의 대체에서 주의를 요한다.
이러한 방식으로, 수득된 "처리된" 쥐 항원 결합 부위가 쥐 CDR 잔기, CDR에 실질적으로 인접한 잔기, 내부에 덮히거나 거의 덮인 것으로 확인된(용매 접근불가능한) 잔기, 중쇄 및 경쇄 도메인 사이의 비공유결합성(예를 들면, 정전기적 및 소수성) 접촉에 참여하는 것으로 생각되는 잔기, 및 CDR 루프의 "규범적인" 3차 구조에 영향을 미치는 것으로 생각되는 FR의 보존적 구조 영역으로부터의 잔기를 보유하도록 디자인된다. 이후, 이러한 디자인 기준을 사용하여 쥐 항원 결합 부위의 중쇄 및 경쇄 모두의 CDR을 사람 FR내로 결합시킨 재조합 뉴클레오타이드 서열을 제조하며, 이는 쥐 항체 분자의 항원 특이성을 나타내는 재조합 사람 항체의 발현을 위해 포유동물 세포를 형질감염시키는데 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 모노클로날 항체를 하나 이상의 치료제에 커플링시킬 수 있다. 이와 관련된 적합한 제제는 방사성 핵종, 분화 유도제, 약제, 독소 및 이의 유도체를 포함한다. 바람직한 방사성 핵종은90Y,123I,125I,131I,186Re,188Re,211At 및212Bi를 포함한다. 바람직한 약제는 메토트렉세이트, 및 피리미딘 및 푸린 유사체를 포함한다. 바람직한 분화 유도체는 포르볼 에스테르 및 부티르산을 포함한다. 바람직한 독소는 리신, 아브린, 디프테리아 독소, 콜레라 독소, 겔로닌, 슈도모나스 외독소, 시겔라 독소 및 미국자리공 항바이러스 단백질을 포함한다.
치료제는 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들면, 링커 그룹을 통해) 적합한 모노클로날 항체에 커플링(예를 들면, 공유 결합)시킬 수 있다. 제제와 항체 각각이 서로와 반응할 수 있는 치환체를 갖는 경우 제제와 항체 사이의 직접적인 반응이 가능하다. 예를 들면, 한쪽에서 친핵성 그룹, 예를 들면 아미노 또는 설프히드릴 그룹이 다른쪽의 카보닐-함유 그룹, 예를 들면, 무수화물 또는 산 할라이드, 또는 우수한 이탈 그룹(예를 들면, 할라이드)를 함유하는 알킬 그룹과 반응할 수 있다.
대안으로, 치료제와 항체를 링커 그룹을 통해서 결합시키는 것이 바람직할 수 있다. 링커 그룹은 제제로부터 항체를 일정 간격으로 유지하는 스페이서로서 작용하여 결합 능력을 방해하지 않도록 할 수 있다. 링커 그룹은 또한 제제 또는 항체 상의 치환체의 화학적 반응성을 증가시키고 결과적으로 커플링 효능을 증가시키도록 작용할 수 있다. 화학적 반응성의 증가는 또한 제제의 사용, 또는 그밖의 경우 불가능한 제제 상의 기능성 그룹의 사용을 촉진시킬 수 있다.
동일- 또는 상이한-기능 모두의 이기능성 또는 다기능성 제제(예를 들면, 제조원: Pierce Chemical Co., Rockford, IL의 카탈로그에 기술된 것과 같음)가 링커 그룹으로서 사용될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자에게 명백할 것이다. 커플링은 예를 들면, 아미노 그룹, 카복실 그룹, 설프히드릴 그룹 또는 산화된 탄수화물 잔기를 통해서 수행될 수 있다. 상기 방법들을 기술하는 수 많은 참조 문헌[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호, Rodwell et al.]들이 있다.
본 발명의 면역접합체의 항체부분으로부터 유리되는 경우 치료제가 더욱 강력한 경우, 세포내로 국재화 동안 또는 국재화시 절단가능한 링커 그룹을 사용하는 것이 바람직할 것이다. 수 많은 상이한 절단가능한 링커 그룹이 기술되어져 왔다. 이러한 링커 그룹으로부터 제제의 세포내 방출을 위한 메카니즘은 이황화 결합의 환원[예를 들면, 미국 특허 제4,489,710호, Spitler], 광불안정성 결합의 광조사[예를 들면, 미국 특허 제4,625,014호, Senter et al.], 유도체화된 아미노산 측쇄의 가수분해[예를 들면, 미국 특허 제4,638,045호, Kohn et al.], 혈청 보체-매개된 가수분해[예를 들면, 미국 특허 제4,671,958호, Rodwell et al.], 및 산-촉매된 가수분해[예를 들면, 미국 특허 제4,569,789호, Blattler et al.]에 의한 절단을 포함한다.
하나 이상의 제제를 항체에 커플링시키는 것이 바람직할 수 있다. 한 가지 구체적인 양태에서, 제제의 다중 분자들을 항체 분자 하나에 결합시킨다. 또 다른 양태에서, 한 가지 유형 이상의 제제를 하나의 항체에 결합시킬 수 있다. 특정 구체적인 양태에 관계없이, 하나 이상의 제제와의 면역접합체가 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 제제를 항체 분자에 직접적으로 커플링시키거나 부착을 위한 다중 부위를 제공하는 링커를 사용할 수 있다. 대안으로, 담체를 사용할 수 있다.
담체는 직접적으로 또는 링커 그룹을 통해 공유 결합을 포함하는 다양한 방법으로 제제에 부착할 수 있다. 적합한 담체는 알부민 같은 단백질[예를 들면, 미국 특허 제4,507,234호, Kato et al.], 펩타이드 및 아미노덱스트란 같은 폴리사카라이드[미국 특허 제4,699,784호, Shih et al.]를 포함한다. 담체는 또한 비공유 결합에 의해 또는 리포좀 소포내 등의 포획화[예를 들면, 미국 특허 제4,429,008호 및 제4,873,088호]에 의해 제제에 결합된다. 방사성 핵종 제제에 특이적인 담체는 방사성할로겐화 소 분자 및 킬레이트화제를 포함한다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,735,792호]는 대표적인 방사성할로겐화 소 분자 및 이의 합성법을 기술한다. 방사성 핵종 킬레이트화제는 금속, 또는 금속 산화물, 방사성 핵종을 결합시키기 위한 공여체 원자로서 질소 및 황 원자를 함유하는 것들을 포함하는 킬레이트화 화합물로부터 형성시킬 수 있다. 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,673,562호, Davison et al.]는 대표적인 킬레이트화 화합물 및 이의 합성법을 기술한다.
T 세포 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 본원에 기술된 종양 폴리펩타이드, 이의 변이체 또는 유도체에 특이적인 T 세포를 제공한다. 상기 세포는 일반적으로 표준 방법을 사용하여, 시험관내 또는 생체외에서 제조할 수 있다. 예를 들면, T 세포는 환자의 골수, 말초 혈액 또는 골수나 말초 혈액의 분획으로부터 시판중인 세포 분리 시스템, 예를 들면, IsolexTM시스템[제조원: Nexell Therapeutics, Inc., Irvine, CA; 또한 참조: 미국 특허 제5,240,856호; 미국 특허 제5,215,926호; 제WO 89/06280호; 제WO 91/16116호 및 제WO 92/07243호]을 사용하여 분리시킬 수 있다. 대안으로, T 세포는 관련되거나 비관련된 사람, 비사람 포유동물, 세포주 또는 배양물로부터 유도될 수 있다.
T 세포는 폴리펩타이드, 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포(APC)로 자극시킬 수 있다. 상기 자극은 관심 대상의 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포의 생성을 허용하기에 충분한 조건 및 시간 동안 수행된다. 바람직하게는, 본 발명의 종양 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드는 다양한 전달 비히클, 예를 들면, 미세구내에 존재하여 특정 T 세포의 생성을 촉진시킨다.
T 세포가 본 발명의 폴리펩타이드로 피복되거나 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 발현하는 표적 세포를 특이적으로 증식시키고, 사이토킨을 분비하거나, 사멸시키는 경우, T 세포는 본 발명의 폴리펩타이드에 특이적인 것으로 생각된다. T 세포 특이성은 다양한 표준 기술 중 임의의 하나를 사용하여 평가할 수 있다. 예를 들면, 크로뮴 방출 분석 또는 증식 분석법에서, 네가티브 대조군에 비해 융해 및/또는 증식에서 2배 이상의 증가의 자극 지수는 T 세포의 특이성을 나타낸다. 상기 분석법은 예를 들면, 문헌[Chen et al., Cancer Res. 54: 1065-1070, 1994]에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 대안으로, T 세포 증식의 검출은 다양한 공지된 기술로 달성할 수 있다. 예를 들면, T 세포 증식은 DNA 합성의 증가율을 측정함으로써(예를 들면, 삼중수소화 티미딘으로 T 세포 배양물을 펄스 표지시키고 DNA내로 도입된 삼중수소화 티미딘의 양을측정함으로써) 검출할 수 있다. 3 내지 7일 동안 종양 폴리펩타이드(100ng/㎖ - 100㎍/㎖, 바람직하게는 200ng/㎖ 내지 25㎍/㎖)와의 접촉은 전형적으로 T 세포의 증식에서 2배 이상의 증가를 초래한다. 2 내지 3시간 동안의 상기와 같은 접촉은 표준 사이토킨 분석법을 사용하여 측정된 바와 같이 T 세포의 활성화를 초래하며, 사이토킨 분석법에서, 사이토킨(예를 들면, TNF 또는 IFN-γ) 방출 수준에서 2배의 증가는 T 세포 활성화의 지표이다[참조: Coligan et al., Current Protocols in Immunology, vol. 1, Wiley Interscience (Greene 1998)]. 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 발현 APC에 반응하여 활성화된 T 세포는 CD4+및/또는 CD8+일 수 있다. 종양 폴리펩타이드-특이적 T 세포는 표준 기술을 사용하여 증식될 수 있다. 바람직한 구체적인 양태에서, T 세포는 관련된 공여자 또는 비관련된 공여자인 환자로부터 유도되며, 자극 및 증식 후 환자에게 투여된다.
치료 목적을 위해서, 종양 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 또는 APC에 반응하여 증식하는 CD4+또는 CD8+T 세포는 시험관내 또는 생체내에서 숫자상 증식될 수 있다. 시험관내에서 상기 T 세포의 증식은 다양한 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들면, T 세포는 T 세포 성장 인자, 예를 들면, 인터루킨-2 및/또는 종양 폴리펩타이드를 합성하는 자극 세포의 존재 또는 부재하에서 종양 폴리펩타이드, 또는상기 폴리펩타이드의 면역원성 부분에 상응하는 짧은 펩타이드에 재노출시킬 수 있다. 대안으로, 종양 폴리펩타이드의 존재하에서 증식하는 하나 이상의 T 세포를 클로닝에 의해 숫자상 증식시킬 수 있다. 세포 클로닝 방법은 당해 분야에 공지되어져 있으며, 제한 희석을 포함한다.
약제학적 조성물
부가적인 구체적인 양태에서, 본 발명은 단독으로 또는 하나 이상의 치료 양태와 병용하여, 세포 또는 동물에 투여하기 위한 약제학적으로 허용되는 담체 중 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, T-세포 및/또는 항체 조성물 하나 이상의 제형에 관한 것이다.
바람직한 경우, 본원에 기술된 조성물은 예를 들면, 다른 단백질 또는 폴리펩타이드 또는 다양한 약제학적으로 활성인 제제 같은 다른 제제와 병용하여 투여될 수 있다. 사실, 부가적인 제제가 표적 세포 또는 숙주 조직과 접촉시 중요한 역효과를 야기하지 않는 한, 또한 포함될 수 있는 다른 성분에는 사실상 제한이 없다. 따라서, 조성물은 특정 예에서 필요한 바와 같은 다양한 다른 제제와 함께 전달될 수 있다. 상기 조성물은 숙주 세포 또는 다른 생물학적 공급원으로부터 정제될 수 있거나, 또는 본원에 기술된 바와 같이 화학적으로 합성될 수 있다. 마찬가지로, 상기 조성물은 추가로 치환되거나 유도체화된 RNA 또는 DNA 조성물을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에서, 생리학적으로 허용되는 담체와 병용하여 본원에 기술된 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체, 및/또는 T-세포 조성물 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 특정 바람직한 구체적인 양태에서, 본 발명의 약제학적 조성물은 예방 및 치료학적 백신 적용에서의 용도를 위한 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물을 포함한다. 백신 제제는 일반적으로, 예를 들면, 문헌[M.F. Powell and M.J. Newman, eds., "Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach)", Plenum Press (NY, 1995)]에 기술되어져 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 하나 이상의 면역자극제와 병행하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및/또는 폴리펩타이드 조성물 하나 이상을 포함할 것이다.
본원에 기술된 약제학적 조성물 중 임의의 하나는 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 약제학적으로 허용되는 염을 함유할 수 있다. 상기 염은 예를 들면, 유기 염기(예를 들면, 1급, 2급 및 3급 아민 및 염기성 아미노산) 및 무기 염기(예를 들면, 나트륨, 칼륨, 리튬, 암모늄, 칼슘 및 마그네슘 염)을 포함하여, 약제학적으로 허용되는 비독성 염기로부터 제조할 수 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 예시적인 면역원성 조성물, 예를 들면, 백신 조성물은 상기 기술된 바와 같은 폴리펩타이드 하나 이상을 암호화하는 DNA를 포함하여, 결과적으로 폴리펩타이드가 원 위치에서 생성된다. 상기 주지된 바와 같이, 폴리뉴클레오타이드는 당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 다양한 전달 시스템내에서 투여될 수 있다. 진정, 수 많은 유전자 전달 기술들이 당해 분야에 공지되어져 있으며, 예를 들면, 문헌[Rolland, Crit. Rev. Therap. DrugCarrier Systems 15:143-198, 1998 및 본원에 인용된 참조 문헌들]에 기술된 것들이다. 적합한 폴리뉴클레오타이드 발현 시스템은 물론 환자에서 발현을 위한 필수적인 조절성 DNA 조절 서열(예를 들면, 적합한 프로모터 및 종결 시그날)을 함유할 것이다. 대안으로, 세균 전달 시스템은 이의 세포 표면 상에서 폴리펩타이드의 면역원성 부분을 발현하고 상기 에피토프를 분비하는 세균(예를 들면, 바실러스-칼메테-구에린)의 투여와 관련될 수 있다.
따라서, 특정 구체적인 양태에서, 본원에 기술된 면역원성 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 수 많은 공지된 바이러스 기초 시스템 중 하나를 사용하여 적합한 포유동물 숙주 세포내로 도입시킨다. 한 가지 예시적인 구체적인 양태에서, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리하고 효과적인 플랫폼을 제공한다. 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 선택된 뉴클레오타이드 서열은 당해 분야에 공지된 기술들을 사용하여 벡터내로 삽입하여 레트로바이러스 입자내에 팩키징할 수 있다. 이후, 재조합 바이러스를 분리하여 환자에게 전달할 수 있다. 수 많은 예시적인 레트로바이러스 시스템이 기술되어져 있다[예를 들면, 미국 특허 제5,219,740호; Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7: 980-990; Miller, A.D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; and Boris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109].
또한, 수 많은 예시적인 아데노-기초 시스템이 또한 기술되어져 왔다. 숙주 게놈내로 통합되는 레트로바이러스와는 달리, 아데노바이러스는 염색체 외부에 존재하여, 삽입 돌연변이유발과 관련된 위험을 최소화시켜 준다[Haj-Ahmad and Graham (1986) J. Virol. 57: 267-274; Bett et al. (1993) J. Virol. 67:5911-5921; Mittereder et al. (1994) Human Gene Therapy 5: 717-729; Seth et al. (1994) J. Virol. 68:933-940; Barr et al. (1994) Gene Therapy 1: 51-58; Berkner, K.L. (1988) BioTechniques 6: 616-629; and Rich et al. (1993) Human Gene Therapy 4: 461-476].
다양한 아데노-연관된 바이러스(AAV) 벡터 시스템이 또한 폴리뉴클레오타이드 전달을 위해서 개발되어져 왔다. AAV 벡터는 당해 분야에 공지된 기술들을 사용하여 용이하게 작제할 수 있다. 문헌 참조[예를 들면, 미국 특허 제5,173,414호 및 제5,139,941호; 국제특허공개공보 제WO 92/01070호 및 제WO 93/03769호; Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al (1990) Vaccine 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B.J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; Therapy 1: 165-169; and Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 1867-1875].
유전자 전달에 의해 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 전달하는데 유용한 부가적인 바이러스 벡터는 백시니아 바이러스 및 조류 폭스바이러스 같은 바이러스의 폭스 패밀리로부터 유도된 것들을 포함한다. 예로써, 신규 분자를 발현하는 백시니아 바이러스 재조합체를 하기와 같이 작제할 수 있다. 폴리펩타이드를 암호화하는 DNA를 우선 적합한 벡터내로 삽입하여 티미딘키나제(TK)를 암호화하는 서열 같은 백시니아 프로모터 및 플랭킹 백시니아 DNA 서열에 인접하게 한다. 이후, 이러한 벡터를 사용하여 백시니아로 동시에 감염시킨 세포를 형질감염시킬 수 있다. 상동성 재조합으로 백시니아 프로모터 및 관심 대상의 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자를 바이러스 게놈내로 도입시킨다. 수득되는 TK.sup.(-) 재조합체를 5-브로모데옥시우리딘의 존재하에서 세포를 배양하고 이에 내성인 바이러스 플라크를 채집하여 선택할 수 있다.
백시니아-기초 감염/형질감염 시스템은 유기체의 숙주 세포내에서 본원에 기술된 하나 이상의 폴리펩타이드의 유도가능한 일시적인 발현 또는 공발현을 제공하는데 용이하게 사용할 수 있다. 이러한 특정 시스템에서, 세포는 우선 시험관내에서 박테리오파아지 T7 RNA 폴리머라제를 암호화하는 백시니아 바이러스 재조합체로 감염시킨다. 이러한 폴리머라제는 T7 프로모터를 갖는 주형만을 전사시키는 정교한 특이성을 나타낸다. 감염 이후, 세포를 T7 프로모터에 의해 구동되는 관심 대상의 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리뉴클레오타이드들로 형질감염시킨다. 백시니아 바이러스 재조합체로부터 세포질내에서 발현된 상기 폴리머라제는 형질감염된 DNA를 RNA로 전사시키고 이후, 이는 숙주 해독 기관에 의해 폴리펩타이드로 해독된다. 상기 방법은 다량의 RNA의 고수준의 일시적인 세포질내 생성 및 이의 해독 생성물을 제공한다. 문헌 참조[예를 들면, Elroy-Stein and Moss, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87: 6743-6747; Fuerst et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1986) 83: 8122-8126].
대안으로, 닭 폭스 및 카나리아 폭스 바이러스 같은 조류 폭스 바이러스를사용하여 관심 대상의 암호화 서열을 전달할 수 있다. 포유동물 병원으로부터의 면역원을 발현하는 재조합 조류 폭스 바이러스는 비조류 종에 투여되는 경우 보호성 면역을 제공하는 것으로 공지되어져 있다. 아비폭스(Avipox) 프로모터의 사용은 특히 사람 및 다른 포유동물 종에서 바람직할 수 있으며, 아비폭스 속의 구성원들은 감염되기 쉬운 조류 종에서 풍부하게 복제될 수 있으며 따라서 포유동물 세포에서 비감염성이기 때문이다. 재조합 아비폭스 바이러스를 생산하는 방법은 당해 분야에 공지되어져 있으며 백시니아 바이러스의 생산에 대해서 상기 기술된 바와 같이, 유전자 재조합을 사용한다. 문헌 참조[예를 들면, 제WO 91/12882호; 제WO 89/03429호 및 제WO 92/03545호].
수 많은 알파바이러스 벡터 중 임의의 하나를 또한 사용하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 조성물을 전달할 수 있으며, 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,843,723호; 제6,015,686호; 제6,008,035호 및 제6,015,694호]에 기술된 벡터들이 있다. 베네주엘란 말 뇌염(VEE)에 기초한 특정 벡터를 또한 사용할 수 있으며, 예시적인 예는 문헌[미국 특허 제5,505,947호 및 제5,643,576호]에서 확인할 수 있다.
또한, 문헌[Michael et al. J. Biol. Chem. (1993) 268: 6866-6869 and Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992) 89: 6099-6103]에 기술된 아데노바이러스 키메라 벡터 같은 분자 접합체 벡터를 또한 사용하여 본 발명하의 유전자를 전달할 수 있다.
이러한 및 다른 공지된 바이러스-기초 전달 시스템에 대한 부가적인 예시적인 정보는 예를 들면, 하기 문헌들에서 확인할 수 있다[Fisher-Hoch et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 317-321, 1989; Flexner et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 569: 86-103, 1989; Flexner et al., Vaccine 8: 17-21, 1990; 미국 특허 제4,603,112호, 제4,769,330호 및 제5,017,487호; 제WO 89/01973호; 미국 특허 제4,777,127호, 영국 특허 제2,200,651호; 유럽 특허 제0,345,242호; 제WO 91/02805호; Berkner, Biotechniques 6: 616-627, 1988; Rosenfeld et al., Science 252: 431-434, 1991; Kolls et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 215-219, 1994; kass-Eisler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11498-11502, 1993; Guzman et al., Circulation 88: 2838-2848, 1993; and Guzman et al., Cir. Res. 73: 1202-1207, 1993].
특정 구체적인 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 표적 세포의 게놈내로 통합될 수 있다. 이러한 통합은 상동성 재조합(유전자 대체)을 통해 특정 위치 및 배향으로 수행되거나 랜덤한 비특이적인 위치(유전자 증가)에서 통합될 수 있다. 추가의 구체적인 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 DNA의 개별적인 에피솜성 단편으로서 세포내에서 안정하게 유지될 수 있다. 상기 폴리뉴클레오타이드 절편 또는 "에피솜"은 숙주 세포 주기와 독립적이거나 이와 연동되어 유지 및 복제되기에 충분한 서열을 암호화한다. 발현 작제물이 세포내로 전달되고 세포내에서 폴리뉴클레오타이드가 유지되는 방식은 사용된 발현 작제물의 유형에 따른다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면, 문헌[Ulmer et al., Science 259: 1745-1749, 1993]에 기술되고 문헌[Cohen, Science259: 1691-1692, 1993]에서 개관된 바와 같이, "나출된" DNA로서 투여되고/전달된다. 나출된 DNA의 흡수는 DNA를 생분해성 비드에 피복시켜 증가될 수 있으며, 이는 세포내로 효과적으로 전달된다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본 발명의 조성물은 입자 충격 방법을 통해 전달될 수 있으며, 이러한 많은 방법들이 기술되어져 왔다. 한 가지 예시적인 예에서, 가스-구동된 입자 가속화는 제조원(Powderject Pharmaceuticals PLC, Oxford, UK) 및 제조원(Powderject Vaccines Inc., Madison, WI)에 의해 제조된 것들과 같은 장치를 사용하여 달성되며, 이중 특정예가 문헌[미국 특허 제5,846,796호; 제6,010,478호; 제5,865,796호; 제5,584,807호 및 유럽 특허 제0500799호]에 기술되어져 있다. 이러한 방법은 주사바늘-비사용 전달 방법을 제공하며, 이때, 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 입자 같은 미세한 입자의 무수 분말 제형이 수동 장치에 의해 생성된 헬륨 가스 분출물내에서 고속으로 가속되어, 입자를 관심 대상 표적 조직내로 추진시킨다.
관련 구체적인 양태에서, 본 발명의 조성물의 가스-구동된 주사바늘-비사용 주입에 유용할 수 있는 다른 장치 및 방법들은 제조원(Bioject, Inc., Portland, OR)에 의해 제공되는 것들을 포함하며, 이중 특정예는 문헌[미국 특허 제4,790,824호, 제5,064,413호, 제5,312,335호, 제5,383,851호, 제5,399,163호, 제5,520,639호 및 제5,993,412호]에 기술되어져 있다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 본 발명의 면역원성 폴리뉴클레오타이드, 폴리펩타이드, 항체, T-세포 및/또는 APC 조성물 이외에 면역자극제 하나 이상을 포함할 것이다. 면역자극제는 외인성 항원에 대한 면역 반응(항체 및/또는 세포-매개된)을 증강시키거나 강화시키는 본질적으로 모든 물질을 의미한다. 면역자극제의 한 가지 바람직한 유형은 애주번트이다. 수 많은 애주번트는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하기 위해서 디자인된 물질, 예를 들면, 알루미늄 하이드록사이드 또는 광유, 및 면역 반응 자극제, 예를 들면, 지질 A, 보르타델라 퍼르투시스(Bortadella pertussis) 또는 마이코박테리움 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 유도된 단백질을 함유한다. 특정 애주번트는 시판중이며, 예를 들면, 프로인트 불완전 보조제 및 완전 보조제(제조원: Difco Laboratories, Detroit, MI); 머크 애주번트 65(제조원: Merck and Company, Inc., Rahway, NJ), AS-2(SmithKline Beecham, Philadelphia, PA), 알루미늄 하이드록사이드 겔(알룸) 또는 알루미늄 포스페이트 같은 알루미늄 염, 칼슘, 철 또는 아연의 염, 아실화 티로신의 불용성 현탁액, 아실화 당, 양이온성 또는 음이온성 유도체화된 폴리사카라이드, 폴리포스파젠, 생분해성 미세구, 모노포스포릴 지질 A 및 퀼 A가 있다. 사이토킨, 예를 들면, GM-CSF, 인터루킨-2, -7, -12 및 기타 성장 인자들을 애주번트로서 또한 사용할 수 있다.
본 발명의 특정 구체적인 양태에서, 애주번트 조성물은 바람직하게는 Th1 유형의 면역 반응을 우수하게 유도하는 것이다. 높은 수준의 Th1-유형 사이토킨(예를 들면, IFN-γ, TNF-α, IL-2 및 IL-12)은 투여된 항원에 대한 세포 매개된 면역 반응의 유도에 유리한 경향이 있다. 반대로, 높은 수준의 Th2-유형 사이토킨(예를 들면, IL-4, IL-5, IL-6 및 IL-10)은 체액성 면역 반응의 유도에 유리한 경향이 있다. 본원에서 제공된 바와 같은 백신의 적용 후, 환자는 Th-1 및 Th-2 유형 반응을 포함하는 면역 반응을 지지할 것이다. 바람직한 구체적인 양태에서, 반응은 Th-1 유형이 우선적인 양태에서, Th1-유형 사이토킨의 수준은 Th2-유형 사이토킨의 수준 이상으로 더 증가할 것이다. 이러한 사이토킨의 수준은 표준 분석법을 사용하여 용이하게 평가할 수 있다. 사이토킨 패밀리의 개관을 위해서는 문헌 참조[Mosmann and Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7: 145-173, 1989].
Th1-유형 반응을 우선적으로 유발시키기 위한 특정 바람직한 애주번트는 예를 들면, 모노포스포릴 지질 A, 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A와 알루미늄 염과의 혼합물을 포함한다. MPL애주번트는 제조원(Corixa Corporation, Seattle, WA)[참조: 예를 들면, 미국 특허 제4,436,727호 제4,877,611호, 제4,866,034호 및 제4,912,094호]으로부터 시판중이다. CpG-함유 올리고뉴클레오타이드(이때, CpG 디뉴클레오타이드는 메틸화되지 않는다)는 또한 Th1 반응을 우선적으로 유도한다. 상기 올리고뉴클레오타이드는 당해 분야에 공지되어져 있으며 예를 들면, 문헌[제WO 96/02555호, 제WO 99/33488호 및 미국 특허 제6,008,200호 및 제5,856,462호]에 기술되어져 있다. 면역자극성 DNA 서열은 또한 예를 들면, 문헌[Sato et al., Science 273: 352, 1996]에 기술되어져 있다. 또 다른 바람직한 애주번트는 사포닌, 예를 들면, 퀼 A, 또는 QS21 및 QS7을 포함하는 이의 유도체(제조원: Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); 에스신(Escin), 디지토닌(Digitonin), 또는 깁소필라(Gypsophila) 또는 케노포듐 퀴노아(Chenopodium quinoa) 사포닌을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 본 발명의애주번트 혼합물 중 하나 이상의 사포닌, 예를 들면, QS21, QS7, 퀼 A, β-에스신 또는 디지토닌을 포함하는 그룹 중 2개 이상의 혼합물을 포함한다.
대안으로, 사포닌 제형은 키토산 또는 다른 폴리양이온성 중합체, 폴라락타이드 및 폴리락타이드-co-글리콜라이드 입자, 폴리-N-아세틸 글루코사민-기초 중합체 매트릭스, 폴리사카라이드 또는 화학적 변형된 폴리사카라이드로 이루어진 입자, 리포좀 및 지질-기초 입자, 글리세롤 모노에스테르로 이루어진 입자 등으로 이루어진 백신 비히클과 혼합될 수 있다. 사포닌은 또한 콜레스테롤의 존재하에서 리포좀 또는 ISCOM 같은 입자 구조를 형성할 수 있다. 추가로, 사포닌은 폴리옥시에틸렌 에테르 또는 에스테르와 함께 비-입자성 용액 또는 현탁액 중에서, 또는 포시라멜라형(paucilamellar) 리포좀 또는 ISCOM 같은 입자성 구조중에서 제형화될 수 있다. 사포닌은 또한 Carbopol같은 부형제와 함께 제형화되어 점도를 증가시키거나, 락토오스 같은 분말 부형제를 사용한 무수 분말 형태로 제형화될 수 있다.
한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 애주번트 시스템은 모노포스포릴 지질 A 및 사포닌 유도체의 혼합물, 예를 들면, 문헌[제WO 94/00153호]에 기술된 바와 같은 QS21 및 3D-MPL애주번트의 혼합물, 또는 문헌[제WO 96/33739호]에 기술된 바와 같은 QS21이 콜레스테롤로 퀀칭되는 보다 덜 반응성인 조성물을 포함한다. 다른 바람직한 제형은 수중유 유제 및 토코페롤을 포함한다. 수중유 유제 중 QS21, 3D-MPL애주번트 및 토코페롤을 사용하는 또 다른 특정 바람직한 애주번트제형이 문헌[제WO 95/17210호]에 기술되어져 있다.
또 다른 증강된 애주번트 시스템은 CpG-함유 올리고뉴클레오타이드 및 사포닌 유도체의 혼합물, 특히 CpG 및 QS21의 혼합물과 관련되며 문헌[제WO 00/09159호]에 기술되어져 있다. 바람직하게는, 상기 제형은 부가적으로 수중유 유제 및 토코페롤을 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물에서 사용하기 위한 또 다른 예시적인 애주번트는 문헌[계류중인 미국 특허원 제08/853,826호 및 제09/074,720호, 이의 내용은 이의 전체가 본원에 참조로 도입된다]에 기술된 몬타나이드 ISA 720(제조원: Seppic, France), SAF(제조원: Chiron, California, United States), ISCOM(제조원: CSL), MF-19(제조원: Chiron), 애주번트의 SBAS 시리즈(예를 들면, SBAS-2 또는 SBAS-4, 제조원: SmithKline Beecham, Rixensart, Belgium), Detox(Enhanzyn)(제조원: Corixa, Hamilton, MT), RC-529(제조원: Corixa, Hamilton, MT) 및 다른 아미노알킬 글루코사미나이드 4-포스페이트(AGP); 및 문헌[제WO 99/52549A1호]에 기술된 것과 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 애주번트를 포함한다.
다른 바람직한 애주번트는 화학식 I의 애주번트 분자를 포함한다.
HO(CH2CH2O)n-A-R
상기식에서,
n은 1 내지 50이고,
A는 결합 또는 -C(O)-이며,
R은 C1-50알킬 또는 페닐C1-50알킬이다.
본 발명의 한 가지 구체적인 양태는 n이 1 내지 50, 바람직하게는 4 내지 24, 가장 바람직하게는 9이고, R 성분이 C1-50, 바람직하게는 C4-C20알킬 및 가장 바람직하게는 C12알킬이며 A가 결합인 화학식 I의 폴리옥시에틸렌 에테르를 포함하는 백신 제형으로 이루어진다. 폴리옥시에틸렌 에테르의 농도는 0.1 내지 20%, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 및 가장 바람직하게는 0.1 내지 1%의 범위일 수 있다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-9-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-8-스테오릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르로부터 선택된다. 폴리옥시에틸렌 라우릴 에테르 같은 폴리옥시에틸렌 에테르는 Merck index(12thedition: entry 7717)에 기술된다. 이러한 애주번트 분자는 문헌[제WO 99/52549호]에 기술되어져 있다.
상기 화학식 I에 따른 폴리옥시에틸렌 에테르는 경우에 따라 또 다른 애주번트와 혼용될 수 있다. 예를 들면, 바람직한 애주번트 조성물은 바람직하게는 문헌[계류중인 영국 특허원 제GB 9820956.2호]에 기술된 바와 같은 CpG와의 혼합물이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에 따라서, 본원에 기술된 면역원성 조성물은 수상 세포, 대식세포, B 세포, 단핵구 및 조작되어 효과적인 항원 제시 세포(APC)가 될 수 있는 다른 세포 같은 APC를 통해 숙주내로 전달된다. 상기 세포는 유전자 조작되어 항원 제시 능력을 증가시키거나, T 세포 반응에 대한 활성화 및/또는 유지를 개선시키거나, 그 자체로 항암 효과를 갖고/갖거나 수용자와 면역학적으로 적합하도록 (즉, 일치된 HLA 반수체형)을 갖게 할 수 있지만, 필수적이지는 않다. APC는 일반적으로 종양 및 종양주변 조직을 포함하는 다양한 생물학적 유체 및 기관 중 하나로부터 분리할 수 있으며, 자가성, 타가성, 동계의 또는 이계의 세포일 수 있다.
본 발명의 특정 바람직한 구체적인 양태는 항원-제시 세포로서 수상 세포 또는 이의 선조 세포를 사용한다. 수상 세포는 매우 강력한 APC이며[Banchereau and Steinman, Nature 392: 245-251, 1998], 예방학적 또는 치료학적 항암 면역성을 나타내는 생리학적 애주번트로서 효과적인 것으로 나타났다[예를 들면, Timmerman and Levy, Ann. Rev. Med. 50: 507-529, 1999]. 일반적으로, 수상 세포는 이의 전형적인 형태(원 위치 방사상, 시험관내에서 가시적인 현저한 세포질 돌기(수상돌기)를 가짐), 높은 효율로 항원을 흡수, 가공 및 제시하는 능력, 및 천연 T 세포 반응을 활성화시키는 이의 능력에 기초하여 확인할 수 있다. 수상 세포는 물론, 유전자 조작되어 생체내 또는 생체외에서 수상 세포 상에서는 일반적으로 발견되지 않는 특정 세포-표면 수용체 또는 리간드를 발현하도록 할 수 있으며, 이러한 변형된 수상 세포는 본 발명에 포함된다. 수상 세포에 대한 대안으로서, 분비된 소포 항원-충전된 수상 세포(소위 엑소좀)을 백신에서 사용할 수 있다[참조: Zitvogelet al., Nature Med. 4: 594-600, 1998].
수상 세포 및 선조 세포는 말초 혈액, 골수, 종양 침투 세포, 종양주변 조직 침투 세포, 림프절, 비장, 피부, 제대 혈액 또는 임의의 다른 적합한 조직 또는 유체로부터 수득할 수 있다. 예를 들면, 수상 세포는 GM-CSF, Il-4, IL-13 및/또는 TNFα같은 사이토킨의 혼합물을 말초 혈액으로부터 수거한 단핵구에 부가함으로써 생체외에서 분화시킬 수 있다. 대안으로, 말초 혈액, 제대 혈액 또는 골수로부터 수거된 CD34 포지티브 세포를 GM-CSF, IL-3, TNFα, CD40 리간드, LPS, flt3 리간드 및/또는 수상 세포의 분화, 성숙 및 증식을 유도하는 다른 화합물(들)의 배양 배지 혼합물에 부가하여 수상 세포로 분화시킬 수 있다.
수상 세포는 "미성숙" 및 "성숙" 세포로서 용이하게 분류되며, 이는 두 개의 특성화된 표현형을 구분하는 단순한 방법을 가능하게 한다. 그러나, 이러한 명명법은 모든 가능한 분화의 중간 단계를 배제하고자 하는 것은 아니다. 미성숙 수상 세포는 항원 흡수 및 가공에 대한 높은 능력을 갖는 APC로서 특성화되며, 이는 Fcγ 수용체 및 만노오스 수용체의 높은 발현과 연관된다. 성숙 표현형은 전형적으로 이러한 마커의 보다 낮은 발현, 및 제I형 및 제II형 MHC, 부착 분자(예를 들면, CD54 및 CD11) 및 공자극 분자(예를 들면, CD40, CD80, CD86 및 4-1BB) 같은 T 세포 활성화에 관여하는 세포 표면 분자의 높은 발현으로 특성화된다.
APC는 일반적으로 본 발명의 폴리뉴클레오타이드(또는 이의 일부분 또는 다른 변이체)로 형질감염되어 암호화된 폴리펩타이드 또는 이의 면역원성 부분을 세포 표면에서 발현시킬 수 있다. 상기 형질감염은 생체외에서 수행될 수 있으며,따라서, 상기 형질감염된 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 본원에 기술된 바와 같이, 치료학적 목적으로 사용될 수 있다. 대안으로, 수상 세포 또는 다른 항원 제시 세포를 표적화하는 유전자 전달 비히클을 환자에게 투여하여, 생체내에서 일어나는 형질감염을 초래할 수 있다. 수상 세포의 생체내 및 생체외 형질감염은 일반적으로 문헌[제WO 97/24447호]에 기술된 바와 같은 당해 분야에 공지된 모든 방법, 또는 문헌[Mahvi et al., Immunology and cell Biology 75: 456-460, 1997]에 기술된 유전자 건 방법으로 수행할 수 있다. 수상 세포의 항원 충전은 수상 세포 또는 선조 세포를 종양 폴리펩타이드 DNA(나출된 또는 플라스미드 벡터내) 또는 RNA와 함께, 또는 항원-발현 재조합 세균 또는 바이러스(예를 들면, 백시니아, 닭 폭스, 아데노바이러스 또는 렌티바이러스)와 함께 배양시킴으로써 달성할 수 있다. 충전에 앞서, 상기 폴리펩타이드를 T 세포 조력을 제공하는 면역원성 상대(예를 들면, 담체 분자)에 공유적으로 접합시킬 수 있다. 대안으로, 수상 세포는 폴리펩타이드와는 개별적으로 또는 폴리펩타이드의 존재하에서 비접합된 면역학적 상대와 펄스시킬 수 있다.
당해 분야의 통상적인 숙련자에게 공지된 적합한 담체를 본 발명의 약제학적 조성물에서 사용할 수 있는 반면, 담체의 유형은 전형적으로 투여 형식에 따라 다양할 것이다. 본 발명의 조성물은 예를 들면, 국부적, 경구, 비내, 점막내, 정맥내, 두개골내, 복막내, 피해 및 근육내 투여를 포함하여, 모든 적합한 투여 방식으로 제형화될 수 있다.
상기 약제학적 조성물내에서 사용하기 위한 담체는 생체화합성이며 또한 생분해성일 수 있다. 특정 구체적인 양태에서, 상기 제형은 바람직하게는 활성 성분 방출의 상대적인 일정 수준을 제공한다. 그러나, 다른 구체적인 양태에서, 투여시 즉각적으로 신속한 방출 속도가 바람직할 수 있다. 상기 조성물의 제형은 공지된 기술을 사용하는 당해 분야의 통상적인 숙련자의 수준내에 있다. 이와 관련하여 유용한 예시적인 담체는 폴리(락타이드-co-글리콜라이드), 폴리아크릴레이트, 라텍스, 전분, 셀룰로오스, 덱스트란 등의 미세입자를 포함한다. 다른 예시적인 서방성 담체는 비-액체 친수성 핵(예를 들면, 가교 결합된 폴리사카라이드 또는 올리고사카라이드), 및 임의로 인지질 같은 양쪽성 화합물을 포함하는 외부층[참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,151,254호 및 PCT 출원 제WO 94/20078호, 제WO 94/23701호 및 제WO 96/06638호]을 포함하는 초분자 생체벡터를 포함한다. 서방성 제형내에 함유된 활성 화합물의 양은 이식 부위, 방출 속도 및 예견된 지속 시간, 처리 또는 예방된 상태의 특성에 따라 결정된다.
또 다른 예시적인 구체적인 양태에서, 생분해성 미세구(예를 들면, 폴리락테이트 폴리글리콜레이트)를 본 발명의 조성물의 담체로서 사용한다. 적합한 생분해성 미세구는 예를 들면, 문헌[미국 특허 제4,897,268호, 제5,075,109호, 제5,928,647호, 제5,811,128호, 제5,820,883호, 제5,853,763호, 제5,814,344호, 제5,407,609호 및 제5,942,252호]에 기술되어져 있다. 문헌[제WO 99/40934호]에 기술된 바와 같은 변형된 B형 간염 핵 단백질 담체 시스템 및 이에 인용된 참조 문헌들이 또한 수 많은 적용에 유용할 것이다. 또 다른 예시적인 담체/전달 시스템은 문헌[미국 특허 제5,928,647호]에 기술된 바와 같은, 숙주에서 I형 제한된 세포독성 T 임파구 반응을 유도할 수 있는 미립자-단백질 복합체를 포함하는 담체를 사용한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 종종 완충액(예를 들면, 중성 완충된 염수 또는 인산염 완충된 염수), 탄수화물(예를 들면, 글루코오스, 만노오스, 슈크로오스 또는 덱스트란), 만니톨, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 글리신 같은 아미노산, 항산화제, 세균억제제, EDTA 또는 글루타티온 같은 킬레이트화제, 애주번트(예를 들면, 수산화알루미늄), 수용자의 혈액과 함께 제형에 등장성, 저장성 또는 약한 고장성을 부여하는 용질, 현탁제, 증점제 및/또는 보존제 하나 이상을 포함할 것이다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 동결건조물로서 제형화될 수 있다.
본원에 기술된 약제학적 조성물은 밀봉된 앰풀 또는 바이알 같은 단위 투여형 또는 다중-투여형 용기내에 존재할 수 있다. 상기 용기는 전형적으로 상기 방식으로 밀봉되어 사용시까지 제형의 멸균성 및 안정성을 유지한다. 일반적으로, 제형은 오일성 또는 수성 비히클 중 현탁제, 용제 또는 유제로서 저장될 수 있다. 대안으로, 약제학적 조성물은 사용 직전에 멸균 액체성 담체의 부가만을 필요로 하는 동결 건조 상태로 저장될 수 있다.
예를 들면, 경구, 비경구, 정맥내, 비내 및 근육내 투여 및 제형을 포함하는 다양한 치료 섭생 중에서 본원에 기술된 특정 조성물을 사용하기 위한 적합한 투여 및 치료 섭생의 개발은 당해 분야에 공지되어져 있으며, 이중 일부는 예시의 일반적 목적으로 하기에 간략히 논의된다.
특정 적용에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 동물에게 경구 투여를 통해서 전달시킬 수 있다. 이와 같이, 이러한 조성물은 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체로 제형화될 수 있거나, 이는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 내포될 수 있거나, 이는 정제로 압축될 수 있거나, 이는 식용 식품과 직접적으로 혼입될 수 있다.
활성 화합물은 부형제와 혼입되어 섭취가능한 정제, 볼내 정제, 구내정, 캡슐, 엘릭서제, 현탁제, 시럽제, 웨이퍼제 등의 형태로 사용될 수 있다[참조: 예를 들면, Mathiowitz et al., Nature 1997 Mar 27; 386(6623): 410-4, Hwang et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst 1998; 15(3): 243-84; 미국 특허 제5,641,515호, 미국 특허 제5,580,579호 및 미국 특허 제5,792,451호]. 정제, 구내정, 환제, 캡슐제 등은 또한 임의의 다양한 부가적인 성분을 함유할 수 있으며, 예를 들면, 결합제, 예를 들면, 검 트라가칸트, 아카시아, 옥수수 전분, 또는 젤라틴; 부형제, 예를 들면, 인산이칼슘; 붕해제, 예를 들면, 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예를 들면, 마그네슘 스테아레이트; 및 감미제, 예를 들면, 슈크로오스, 락토오스 또는 사카로오스를 부가하거나, 향미제, 예를 들면, 박하, 동록유, 또는 체리 향미제를 부가할 수 있다. 투여형 단위형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 물질 이외에, 액체 담체를 함유할 수 있다. 다양한 다른 물질들이 제피제로서 존재할 수 있거나, 투여 단위의 물리적 형태를 변형시키기 위해서 존재할 수 있다. 예를 들면, 정제, 환제 또는 캡슐제는 셜락, 당 등으로 제피될 수 있다. 물론, 임의의 단위 형태를 제조하는데 사용되는 임의의 물질은 사용되는 양에서 약제학적으로 순수하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물은 서방성 제제 및제형내로 혼입될 수 있다.
전형적으로, 이러한 제형은 활성 성분 약 0.1% 이상을 함유하지만, 활성 성분의 퍼센트(%)는 물론 편리하게는 전체 제형의 중량 또는 용적의 약 1 또는 2% 및 약 60% 또는 70% 이상 정도일 수 있다. 당연히, 각각의 치료학적으로 유용한 조성물에서 활성 화합물(들)의 양은 상기 방식으로 제조되어 적합한 투여형이 화합물의 제시된 단위 투여형으로 수득되게 할 수 있다. 용해도, 생체이용가능성, 생물학적 반감기, 투여 경로, 생성물 저장 반감기 같은 인자들 뿐만 아니라 약제학적 고려사항들은 상기 약제학적 제형의 제조 분야의 숙련자에 의해 예견될 것이며 이와 같이, 다양한 투여형 및 치료 섭생이 바람직할 수 있다.
경구 투여에 있어서, 본 발명의 조성물은 대안으로 양치질 약, 크림 치약, 볼내 정제, 경구 스프레이, 또는 설하 경구 투여된 제형의 형태로 하나 이상의 부형제와 함께 혼입될 수 있다. 대안으로, 활성 성분들은 나트륨 보레이트, 글리세린 및 중탄산칼륨 같은 경구 용제내로 혼입되거나 크림 치약내에 분산되거나, 물, 결합제, 연마제, 향미제, 발포제, 및 습윤제를 포함할 수 있는 조성물내에 치료학적 유효량으로 부가될 수 있다. 대안으로, 조성물은 설하에 위치시키거나 그밖에 구내에서 용해시킬 수 있는 정제 또는 용제로 제조할 수 있다.
특정 상황하에서, 비경구적으로, 정맥내로, 근육내로, 또는 복막내로 본원에서 기술된 약제학적 조성물을 전달하는 것이 바람직할 것이다. 상기 접근법은 당해 분야에 공지되어져 있으며, 이중 일부는 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,543,158호, 미국 특허 제5,641,515호 및 미국 특허 제5,399,363호]에 추가로기술되어져 있다. 특정 구체적인 양태에서, 유리 염기 또는 약제학적으로 허용되는 염으로서 활성 화합물의 용액을 하이드록시프로필셀룰로오스 같은 계면활성제와 적합하게 혼합된 물에서 제조할 수 있다. 분산제는 또한, 글리세롤, 액체 폴리에틸렌 글리콜 및 이의 혼합물 중에서 및 유 중에서 제조할 수 있다. 통상적인 저장 및 사용 조건하에서, 이러한 제제는 일반적으로 미생물의 성장을 억제하기 위한 보존제를 함유할 것이다.
주사가능한 용도에 적합한 예시적인 약제학적 형태는 멸균 수성 용제 또는 분산제 및 멸균 주사가능한 용액 또는 분산액의 즉시 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다[예를 들면, 참조: 미국 특허 제5,466,468호]. 모든 경우에, 제형은 멸균되어야 하며, 용이하게 주사가능한 정도로 액화되어야 한다. 제조 및 저장 조건하에서 안정해야 하며 세균 및 진균 같은 미생물의 오염 작용으로부터 보호되어야 한다. 담체는 예를 들면, 물, 에탄올, 폴리올(예를 들면, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적합한 혼합물, 및/또는 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산액 매질일 수 있다. 적합한 유동성은 예를 들면, 레시틴 같은 제피제를 사용함으로써, 분산제의 경우 요구되는 입자 크기를 유지시킴으로써 및/또는 계면활성제를 사용함으로써 유지될 수 있다. 미생물 작용의 예방은 다양한 항세균제 및 항진균제, 예를 들면, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등으로 촉진시킬 수 있다. 수 많은 경우에, 등장성제, 예를 들면, 당 및 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능한 조성물의 연장된 흡수는 흡수를 지연시키는 제제의 조성물, 예를 들면, 알루미늄 모노스테아레이트 및젤라틴에서 사용함으로써 달성할 수 있다.
한 가지 구체적인 양태에서, 수성 용액 중 비경구 투여에 있어서, 용액은 경우에 따라 적합하게 완충되어져야 하며 우선 액체 희석제는 충분한 염수 또는 글루코오스로 등장성을 부여하여야 한다. 이러한 특정 수성 용액은 정맥내, 근육내, 피하내 및 복막내 투여에 특히 적합하다. 이와 관련하여, 사용할 수 있는 멸균 수성 매질은 본원 내용의 관점에서 당해 분야의 숙련자에게 공지되어 있을 것이다. 예를 들면, 하나의 투여형은 등장성 NaCl 용액 1㎖에 용해되어 대량피하주사액 1000㎖에 부가되거나 주입의 제시된 부위에 주사될 수 있다[참조: 예를 들면, "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580]. 투여형내 특정 변화는 치료하고자 하는 환자의 상태에 따라서 필수적으로 수행될 것이다. 또한, 사람 투여에 있어서, 제제는 물론 바람직하게는 FDA 사무국의 생물학적 표준(Biologics standard)의 규정에 따라서 멸균성, 발열성 및 일반적인 안전성 및 순도 표준에 부합할 것이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 양태에서, 본원에 기술된 조성물은 중성 또는 염 형태로 제형화될 수 있다. 예시적인 약제학적으로 허용되는 염은 산 부가염(단백질의 유리 아미노 그룹과 형성됨)을 포함하며, 이는 예를 들면, 염산 또는 인산 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 같은 유기산으로 형성된다. 유리 카복실 그룹과 형성된 염이 또한 예를 들면, 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 제이철 수산화물 같은 무기 염기, 또는 이소프로필아민, 트리메틸아민, 히스티딘, 프로카인 등의 유기 염기로부터 유도될 수 있다. 제형화시, 용액은 투여제형과 화합성이고 상기 양에서 치료학적으로 유효한 방식으로 투여될 것이다.
담체는 추가로 임의의 모든 용매, 분산 매질, 비히클, 제피제, 희석제, 항세균제 및 항진균제, 등장성 및 흡수 지연제, 완충제, 담체 용액, 현탁액, 콜로이드 등을 포함할 수 있다. 약제학적 활성 물질에 대한 상기 매질 및 제제는 당해 분야에 공지되어져 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 화합성이 아닌 경우를 제외하고는, 치료학적 조성물에서의 이의 사용이 예견된다. 추가의 활성 성분들이 또한 조성물내로 도입될 수 있다. 구 "약제학적으로 허용되는"이란 사람에게 투여되는 경우 알레르기성 또는 유사한 역반응을 야기하지 않는 분자 실체 및 조성물을 의미한다.
특정 구체적인 양태에서, 약제학적 조성물은 비내 분무, 흡입 및/또는 다른 에어로졸 전달 비히클로 전달시킬 수 있다.
비내 에어로졸 분무제를 통해 폐로 직접적으로 유전자, 핵산 및 펩타이드 조성물을 전달하는 방법은 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,756,353호 및 미국 특허 제5,804,212호]에 기술되어져 왔다. 마찬가지로, 비내 미세입자 수지[Takenaga et al., J Controlled Release 1988 Mar 2; 52(1-2): 81-7] 및 리소포스파티딜-글리세롤 화합물[미국 특허 제5,725,871호]를 사용한 약제의 전달은 약제학적 분야에 또한, 공지되어져 있다. 마찬가지로, 폴리테트라플루오로에틸렌 지지체 매트릭스 형태의 예시적인 점막을 통한 약제 전달이 문헌[미국 특허 제5,780,045호]에 기술되어져 있다.
특정 구체적인 양태에서, 리포좀, 나노캡슐, 미세입자, 지질 입자, 비히클등을 본 발명의 조성물을 적합한 숙주 세포/유기체내로 도입하는데 사용한다. 특히, 본 발명의 조성물은 지질 입자, 리포좀, 비히클, 나노구 또는 나노입자 내에 포획시켜 전달용으로 제형화시킬 수 있다. 대안으로, 본 발명의 조성물은 공유결합적으로 또는 비공유결합적으로 상기 담체 비히클의 표면에 결합시킬 수 있다.
잠재적인 약제 담체로서 리포좀 및 리포좀 유형 제제의 제형화 및 사용은 일반적으로 당해 분야의 숙련자에게 공지되어져 있다[참조: 예를 들면, Lasic, Trends Biotechnol 1998 Jul; 16(7): 307-21; Takakura, Nippon Rinsho 1998 Mar; 56(3) 691-5; Chandran et al., Indian J Exp Biol. 1997 Aug; 35(8): 801-9; Nargalit, Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1995; 12(2-3): 233-61; 미국 특허 제5,567,434호; 미국 특허 제5,552,157호; 미국 제5,565,213호; 미국 특허 제5,738,868호 및 미국 특허 제5,795,587호, 각각은 이의 전체가 본원에 참조로 구체적으로 도입된다].
리포좀은 T 세포 현탁액, 1차 간세포(hepatocyte) 배양물 및 PC12 세포를 포함하는 다른 방법에 의해 정상적으로 형질감염시키기 어려운 수 많은 세포 유형을 사용하여 성공적으로 사용되어져 왔다[Renneisen et al., J Biol Chem. 1990 Sep 25; 265(27): 16337-42; Muller et al., DNA Cell Biol. 1990 Apr; 9(3): 221-9]. 또한, 리포좀은 바이러스 기초 전달 시스템의 전형인 DNA 길이 제한으로부터 자유롭다. 리포좀을 사용하여 유전자, 다양한 약제, 방사성 치료제, 효소, 바이러스, 전사 인자, 알로스테릭 이펙터 등을 다양한 배양 세포주 및 동물에 효과적으로 도입시켜 왔다. 추가로, 리포좀의 사용은 전신계 전달 후 자가면역 반응 또는 허용되지 않는 독성과 관련되지 않는 것으로 보인다.
특정 구체적인 양태에서, 리포좀은 수성 매질에 분산된 인지질로부터 형성되며 동시에 다판 동심상 이층 소낭(또는 다판 소낭(MLV)로 불림)을 형성한다.
대안으로, 다른 구체적인 양태에서, 본 발명은 본 발명의 조성물의 약제학적으로 허용되는 나노캡슐 제형을 제공한다. 나노캡슐은 일반적으로 안정하고 재생가능한 방식으로 화합물을 포획할 수 있다[참조: 예를 들면, Quintanar-Guerrero et al., Drug Dev Ind Pharm. 1998 Dec; 24(12): 1113-28]. 세포내 중합체성 과적으로 인한 부작용을 피하기 위해서, 상기 초미세 입자(약 0.1㎛ 크기)를 생체내에서 분해될 수 있는 중합체를 사용하여 디자인할 수 있다. 상기 입자는 예를 들면, 문헌[Couvreur et al., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 1988;5(1): 1-20; zur Muhlen et al., Eur J Pharm Biopharm. 1998 Mar; 45(2): 149-55; Zambaux et al., J Controlled Release. 1998 Jan 2; 50(1-3): 31-40; and 미국 특허 제5,145,684호]에 기술된 바와 같이 제조할 수 있다.
암 치료 방법
본 발명의 추가의 양태에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 암의 치료, 특히 유방암의 면역치료에 사용될 수 있다. 상기 방법에서, 본원에 기술된 약제학적 조성물은 환자, 전형적으로 온혈동물, 바람직하게는 사람에게 투여된다. 환자는 암에 걸리거나 걸리지 않을 수 있다. 따라서, 상기 약제학적 조성물을 사용하여 암으로 진행하는 것을 예방하거나 암에 걸린 환자를 치료할 수 있다. 약제학적 조성물 및 백신은 1차 종양의 외과 제거 전 또는 후 및/또는 방사성 치료 또는 통상적인 화학요법용 약제의 투여 같은 치료 전 또는 후에 투여할 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 약제학적 조성물의 투여는 정맥내, 복막내, 근육내, 피하내, 비내, 경피, 항문내, 질내, 국부적 및 경구 경로로의 투여를 포함하여, 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있다.
특정 구체적인 양태에서, 면역치료는 능동 면역치료일 수 있으며, 이때, 치료는 면역 반응-변형제(예를 들면, 본원에서 제공되는 바와 같은 폴리펩타이드 및 폴리뉴클레오타이드)를 투여하여 종양에 대해 내인성 숙주 면역계의 생체내 자극과 관련된다.
다른 구체적인 양태에서, 면역치료는 수동 면역치료일 수 있으며, 이때, 치료는 직접적으로 또는 간접적으로 항암 효과를 매개하며 온전한 숙주 면역 시스템에 반드시 의존하지는 않는 확립된 종양-면역 반응성(예를 들면, 이펙터 세포 또는 항체)를 갖는 제제의 전달과 관련된다. 이펙터 세포의 예는 본원에 제공된 폴리펩타이드를 발현하는 상기 논의된 T 세포, T 임파구(예를 들면, CD8+세포독성 T 임파구 및 CD4+T-헬퍼 종양 침입 임파구), 킬러 세포(예를 들면, 천연 킬러 세포 및 림포카인-활성화 킬러 세포), B 세포 및 항원 제시 세포(예를 들면, 수상 세포 및 대식 세포)를 포함한다. 본원에 인용된 폴리펩타이드에 특이적인 T 세포 수용체 및 항체 수용체는 채택된 면역치료를 위한 다른 벡터 또는 이펙터 세포내로 클로닝시키고, 발현시키고 전달시킬 수 있다. 본원에 제공된 폴리펩타이드는 또한 수동 면역치료를 위한 항체 또는 항-이디오타입 항체[상기 및 미국 특허 제4,918,164호에 기술된 바와 같이]를 생성시키는데 사용될 수 있다.
이펙터 세포는 일반적으로 본원에 기술된 바와 같이, 시험관내 성장에 의해 채택된 면역치료를 위한 충분한 양으로 수득될 수 있다. 단일 항원 특이적 이펙터 세포를 생체내 항원 인식의 유지를 위한 수십억개로 증식시키기 위한 배양 조건은 당해 분야에 공지되어져 있다. 상기 시험관내 배양 조건은 전형적으로 종종 사이토킨(예를 들면, IL-12) 및 비분화성 공급 세포의 존재하에서 항원을 사용한 간헐적인 자극을 사용한다. 상기 주지된 바와 같이, 본원에서 제공된 바와 같은 면역반응성 폴리펩타이드는 신속하게 항원 특이적 T 세포 배양물을 증식시키는데 사용하여 면역치료에 충분한 수의 세포를 생성시킬 수 있다. 특히, 수상 세포, 대식세포, 단핵구, 섬유아세포 및/또는 B 세포 같은 항원 제시 세포를 면역반응성 폴리펩타이드로 펄스시키거나 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 하나 이상의 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 예를 들면, 항원 제시 세포는 재조합 바이러스 또는 다른 발현 시스템에서의 발현을 증가시키는데 적합한 프로모터를 갖는 폴리뉴클레오타이드로 형질감염시킬 수 있다. 치료에 사용하기 위한 배양된 이펙터 세포를 성장시키고 광범위하게 분포시키고 생체내에서 장기간 생존시킬 수 있어야만 한다. 연구 결과들은 배양된 이펙터 세포는 IL-12로 보충된 항원으로 반복적으로 자극함으로써 생체내에서 성장하도록 유도하고 상당한 수로 장기간 생존시킬 수 있다는 것을 나타내었다[참조: 예를 들면, Cheever et al., ImmunologicalReviews 157: 177, 1997].
대안으로, 본원에 인용된 폴리펩타이드를 발현하는 벡터를 환자로부터의 항원 제시 세포내로 도입시킬 수 있으며 생체외에서 클론적으로 증식시켜 동일한 환자에게 다시 이식시킬 수 있다. 형질감염된 세포를 당해 분야에 공지된 임의의 방식을 사용하여, 바람직하게는 멸균 형태로 정맥내, 공동내, 복막내 또는 종양내 투여하여 환자에게 재도입시킬 수 있다.
본원에 기술된 바와 같은 치료학적 조성물의 투여 경로 및 빈도, 뿐만 아니라 투여량은 개개인에 따라 다양할 것이며 표준 기술을 사용하여 용이하게 확립할 수 있다. 일반적으로, 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예를 들면, 경피로, 근육내, 정맥내 또는 피하로), 비내로(예를 들면, 흡인) 또는 경구적으로 투여할 수 있다. 바람직하게는, 1 내지 10 투여량 정도가 52주 기간 동안 투여될 수 있다. 바람직하게는, 6 투여량이 1달 간격으로 투여되며 부스터 백신화는 이후에 주기적으로 제공될 수 있다. 다른 프로토콜이 개별적인 환자에 대해서 적합할 수 있다. 적합한 투여량은 상기 기술된 바와 같이 투여되는 경우, 항암 면역 반응을 촉진시킬 수 있으며 기초(즉, 비처리된) 수준 보다 적어도 10 내지 50% 이상인 화합물의 양이다. 상기 반응은 환자에서 항암 항체를 측정하거나 시험관내에서 환자의 암 세포를 사멸시킬 수 있는 세포용해성 이펙터 세포의 백신-의존성 생성에 의해서 모니터링할 수 있다. 상기 백신은 또한 비백신화된 환자와 비교하여 백신화된 환자에서 개선된 임상적 결과(예를 들면, 보다 빈번한 경감, 완전한 또는 부분적인 또한 보다 긴 질환-비존재 생존)를 초래하는 면역 반응을 야기할 수 있어야 한다.일반적으로, 하나 이상의 폴리펩타이드를 포함하는 약제학적 조성물 및 백신에 있어서, 투여형내에 존재하는 각각의 폴리펩타이드의 양은 숙주 ㎏ 당 약 25㎍ 내지 5㎎ 정도의 범위이다. 적합한 투여량 크기는 환자의 크기에 따라 다양할 것이지만, 전형적으로는 약 0.1㎖ 내지 약 5㎖ 정도의 범위이다.
일반적으로, 적합한 투여량 및 치료 섭생은 치료학적 및/또는 예방학적 잇점을 제공하기에 충분한 양으로 활성 화합물(들)을 제공한다. 상기 반응은 비처리된 환자에 비해서 처리된 환자에서 개선된 임상적 결과(예를 들면, 보다 빈번한 경감, 완전한 또는 부분적인 또한 보다 긴 질환-비존재 생존)를 확립시킴으로써 모니터링할 수 있다. 종양 단백질에 대한 예비존재하는 면역 반응의 증가는 개선된 임상적 결과와 일반적으로 상호관련된다. 상기 면역반응은 일반적으로 표준 증식, 세포독성 또는 사이토킨 분석법을 사용하여 평가할 수 있으며, 이는 처리 전 및 후에 환자로부터 수득한 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
암 검출 및 진단학적 조성물, 방법 및 키트
일반적으로, 암은 환자로부터 수득된 생물학적 샘플(예를 들면, 혈액, 혈청, 객담, 뇨 및/또는 종양 생검) 중 하나 이상의 유방암 단백질 및/또는 상기 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재에 기초하여 환자에게서 검출할 수 있다. 즉, 상기 단백질은 유방암 같은 암의 존재 또는 부재를 지시하는 마커로서 사용할 수 있다. 또한, 상기 단백질은 다른 암의 검출에 유용할 수 있다. 본원에서 제공된 결합제는 일반적으로 생물학적 샘플 중 상기 제제에 결합하는 항원의 수준을 검출하는 것을 가능하게 한다. 폴리뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브를 사용하여 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출할 수 있으며, 이는 암의 존재 또는 부재의 지표가 된다. 일반적으로, 유방암 서열은 정상 조직보다 종양 조직에서 세배 이상 높은 수준으로 존재한다.
샘플 중에서 폴리펩타이드 마커를 검출하는데 결합제를 사용하기 위한 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다양한 분석 포맷이 존재한다. 문헌 참조[예를 들면, Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]. 일반적으로, 환자에서 암의 존재 또는 부재는 (a) 환자로부터 수득한 생물학적 샘플을 결합제와 접촉시키고, (b) 샘플 중에서 결합제에 결합한 폴리펩타이드의 수준을 검출하며 (c) 예정된 컷-오프 값으로 폴리펩타이드 수준을 비교함으로써 측정할 수 있다.
바람직한 구체적인 양태에서, 분석법은 샘플의 나머지 부분으로부터 폴리펩타이드를 결합시키거나 제거하기 위해 고체 지지체 상에 결합된 결합제를 사용하는 것과 관련된다. 이후, 결합된 폴리펩타이드를 리포터 그룹을 함유하며 결합제/폴리펩타이드 복합체 특이적으로 결합하는 검출제를 사용하여 검출할 수 있다. 상기 검출제는 예를 들면, 폴리펩타이드 또는 항체에 특이적으로 결합하는 결합제 또는 항면역글로불린, 단백질 G, 단백질 A 또는 렉틴 같은 결합제에 특이적으로 결합하는 다른 제제를 포함한다. 대안으로, 경쟁 분석법을 사용할 수 있으며, 이때, 폴리펩타이드를 리포터 그룹으로 표지한 후 샘플과 결합제를 항온처리한 후 고정된 결합제에 결합하도록 한다. 샘플의 성분이 결합제에 대한 표지된 폴리펩타이드의결합을 억제하는 정도가 고정된 결합제와 샘플의 반응성의 지표이다. 상기 분석법내에서 사용하기 위한 적합한 폴리펩타이드는 상기 기술된 바와 같이, 결합제가 결합하는 전체 길이 유방암 단백질 및 이의 폴리펩타이드 부분을 포함한다.
고체 지지체는 종양 단백질이 부착될 수 있는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 물질일 수 있다. 예를 들면, 고체 지지체는 미세역가 플레이트 상의 시험 웰 또는 니트로셀룰로오스 또는 다른 적합한 막일 수 있다. 대안으로, 지지체는 비드 또는 디스크, 예를 들면, 유리, 섬유유리, 라텍스, 또는 폴리스티렌 또는 폴리비닐클로라이드 같은 플라스틱 물질일 수 있다. 지지체는 또한 자기 입자 또는 예를 들면, 문헌[미국 특허 제5,359,681호]에 기술된 것과 같은 섬유 광학 센서일 수 있다. 결합제는 당해 분야에 공지된 다양한 기술들을 사용하여 고체 지지체 상에 고정될 수 있으며, 이는 특허 및 과학 문헌에 충분히 기술되어져 있다. 본 발명의 내용에서, 용어 "고정화"는 흡착 같은 비공유적 결합 및 공유적 결합(이는 제제 및 지지체 상의 기능성 그룹 사이의 직접적인 결합이거나 가교 결합제를 통한 결합일 수 있다) 둘 모두를 의미한다. 흡착에 의한 미세역가 플레이트 또는 막에 대한 고정화가 바람직하다. 상기 경우에, 흡착은 적합한 시간 동안, 적합한 완충액 중 결합제와 고체 지지체의 접촉에 의해서 달성될 수 있다. 접촉 시간은 온도에 따라 다양할 것이지만, 전형적으로 약 1시간 내지 약 1일이다. 일반적으로, 플라스틱 미세역가 플레이트의 웰을 약 10ng 내지 약 10㎍, 및 바람직하게는 약 100ng 내지 약 1㎍ 정도의 결합제 양과 접촉시키는 것이 결합제의 적당한 양을 고정시키는데 충분하다.
결합제의 고체 지지체에 대한 공유결합적 부착은 일반적으로, 지지체를 우선 지지체 및 결합제 상의 하이드록시 또는 아미노 그룹 같은 기능성 그룹 모두와 반응하는 이기능성 제제로 반응시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들면, 결합제는 벤조키논을 사용하거나 지지체 상의 알데하이드 그룹을 결합 상대 상의 아민 및 활성 수소와 축합시킴으로써 적합한 중합체 피복물을 갖는 지지체 상에 공유결합적으로 부착시킬 수 있다[참조: 예를 들면, Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, at A12-A13].
특정 구체적인 양태에서, 분석법은 두 개의 항체 샌드위치 분석법이다. 이러한 분석법은 우선 고체 지지체, 흔히 미세역가 플레이트의 웰 상에 고정된 항체를 샘플과 접촉시켜 샘플내 폴리펩타이드가 고정된 항체에 결합되게 한다. 이후, 비결합된 샘플을 고정된 폴리펩타이드-항체 복합체로부터 제거하고 리포터 그룹을 함유하는 검출제(바람직하게는, 폴리펩타이드의 상이한 부위에 결합될 수 있는 2차 항체)를 부가한다. 이후, 고체 지지체에 결합되어 유지되는 검출제의 양을 특정 리포터 그룹에 적합한 방법을 사용하여 검출한다.
보다 구체적으로는, 일단 항체가 상기 기술된 바와 같은 지지체 상에 고정된 후, 지지체 상에 잔류하는 단백질 결합 부위를 전형적으로 차단시킨다. 소 혈청 알부민 또는 트윈 20TM(제조원: Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) 같은 당해 분야의 숙련자에게 공지된 임의의 적합한 차단제를 사용한다. 이후, 고정된 항체를 샘플과 함께 항온처리하고 폴리펩타이드가 항체에 결합되게 한다. 샘플을 항온처리 전에 인산염-완충된 염수(PBS) 같은 적합한 희석제로 희석시킬 수 있다. 일반적으로, 적합한 접촉 시간(즉, 항온처리 시간)은 유방암에 걸린 개체로부터 수득된 샘플내에서 폴리펩타이드의 존재를 검출하기에 충분한 시간이다. 바람직하게는, 접촉 시간은 결합된 폴리펩타이드 및 비결합된 폴리펩타이드 사이에 결합제의 수준이 약 95% 이상의 평형이 달성되기에 충분한 시간이다. 당해 분야의 통상적인 숙련자는 평형을 달성하는데 필요한 시간은 시간 주기로 일어나는 결합 수준을 분석함으로써 용이하게 측정할 수 있다는 것을 인식할 것이다. 실온에서, 약 30분의 항온처리 시간이 일반적으로 충분하다.
이후, 비결합된 샘플은 고체 지지체를 0.1% 트윈20TM을 함유하는 PBS 같은 적합한 완충액으로 세척시킴으로써 제거할 수 있다. 리포터 그룹을 함유하는 2차 항체를 고체 지지체에 부가할 수 있다. 바람직한 리포터 그룹은 상기 인용된 그룹들을 포함한다.
이후, 검출제는 결합된 폴리펩타이드를 검출하는데 충분한 시간 동안 고정된 항체-폴리펩타이드 복합체로 항온처리한다. 적합한 시간의 양은 일반적으로 시간 주기 상에서 일어나는 결합 수준을 분석함으로서 측정할 수 있다. 이후, 비결합된 검출제는 제거하고 결합된 검출제를 리포터 그룹을 사용하여 검출한다. 리포터 그룹을 검출하는데 사용된 방법은 리포터 그룹의 특성에 따라 결정된다. 방사성 그룹인 경우, 신틸레이션 계수 또는 방사선 사진술이 일반적으로 적합하다. 분광광도법을 사용하여 염료, 발광 그룹 및 형광 그룹을 검출할 수 있다. 바이오틴은 상이한 리포터 그룹(일반적으로 방사성 또는 형광 그룹 또는 효소)에 결합된 아비딘을 사용하여 검출할 수 있다. 효소 리포터 그룹은 일반적으로 기질(일반적으로 특정 시간 동안)을 부가한 후 반응 생성물에 대한 분광광도 분석 또는 다른 분석으로 검출할 수 있다.
유방암 같은 암의 존재 또는 부재를 측정하기 위해서, 고체 지지체에 결합되어 잔류하는 리포터 그룹으로부터 검출된 시그날을 일반적으로 예정된 컷-오프 값과 상응하는 시그날과 비교한다. 한 가지 바람직한 구체적인 양태에서, 암 검출을 위한 컷-오프 값은 고정된 항체가 암에 걸리지 않은 환자로부터의 샘플과 항온처리하는 경우 수득되는 평균 시그날이다. 일반적으로, 예정된 컷-오프 값 이상의 세 개의 표준 편차인 시그날을 생성하는 샘플은 암에 포지티브인 것으로 고려된다. 선택적인 바람직한 구체적인 양태에서, 컷-오프 값은 문헌[Sackett et al., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., 1985, p. 106-7]에 따른 ROC(Receiver Operator Curve)를 사용하여 결정한다. 간략하면, 이러한 구체적인 양태에서, 컷-오프 값은 진단학적 시험 결과에 대해서 각각 가능한 컷-오프 값에 상응하는 진정한 포지티브 비율(즉, 감수성) 및 허위 포지티브 비율(100%-특이성) 쌍의 플롯으로부터 결정할 수 있다. 상단 좌측 구석에 가장 근접한 컷-오프 값(즉, 최대 영역을 포함하는 값)은 가장 정확한 컷-오프 값이며, 이러한 방식으로 측정된 컷-오프 값 이상의 높은 시그날을 생성하는 샘플은 포지티브로 고려될 수 있다. 또한, 컷-오프 값은 플롯을 따라 좌측으로 이동하여, 위 포지티브 비율을 최소화시키거나 우측으로 우동하여 위 네가티브 비율을 최소화시킬 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법으로 측정된 컷-오프 값 보다 더 큰 시그날을 생성하는 샘플은 암에 대해서 포지티브한 것으로 고려된다.
관련 구체적인 양태에서, 상기 분석법은 플로우-쓰루(flow-through) 또는 스트립 시험 포맷으로 수행되며, 이때, 결합제는 니트로셀룰로오스 같은 막 상에 고정된다. 플로우-쓰루 시험에서, 샘플내 폴리펩타이드는 샘플이 막을 통과하는 동안 고정된 결합제에 결합하게 된다. 이후, 2차 표지된 결합제가 2차 결합제가 함유된 용액이 막을 통과하여 흐르는 동안 결합제-폴리펩타이드 복합체에 결합한다. 이후, 결합된 2차 결합제의 검출은 상기 기술된 바와 같이 수행된다. 스트립 시험 포맷에서, 결합제가 결합된 막의 한쪽 말단을 샘플을 함유하는 용액에 침지시킨다. 샘플은 2차 결합제를 함유하는 영역을 통해 막을 따라 이동하여 고정된 결합제 영역까지 이동한다. 고정된 항체 영역에서의 2차 결합제의 농도는 암의 존재를 지시한다. 전형적으로, 상기 부위에서의 2차 결합제의 농도는 가시적으로 판독할 수 있는 선과 같은 패턴을 생성시킨다. 상기 패턴의 부재는 네가티브 결과를 나타낸다. 일반적으로, 막 상에 결합된 결합제의 양은 생물학적 샘플이 상기 논의된 포맷에서, 두 개의 항체 샌드위치 분석법에서 포지티브 시그날을 생성하기에 충분한 폴리펩타이드를 수준을 함유하는 경우, 가시적으로 식별할 수 있는 패턴을 생성하도록 선택된다. 상기 분석법에서 사용하기 위한 바람직한 결합제는 항체 및 이의 항원-결합 단편이다. 바람직하게는, 막 상에 고정된 항체의 양은 약 25ng 내지 약 1㎍, 및 보다 바람직하게는 약 50ng 내지 약 500ng의 범위이다. 상기 시험들은 전형적으로 극소량의 생물학적 샘플을 사용하여 수행할 수 있다.
물론, 본 발명의 종양 단백질 또는 결합제와 함께 사용하기에 적합한 수 많은 다른 분석 프로토콜들이 존재한다. 상기 기술들은 단지 예시적인 것으로 의도된다. 예를 들면, 상기 프로토콜들은 생물학적 샘플에서 상기 폴리펩타이드에 결합하는 항체를 검출하기 위해 종양 폴리펩타이드를 사용하기 위해서 용이하게 변형될 수 있다는 것은 당해 분야의 숙련자들에게 명백할 것이다. 상기 종양 단백질 특이적인 항체의 검출은 암의 존재와 상호관련될 수 있다.
암은 또한 또는 대안적으로, 생물학적 샘플 중의 종양 단백질과 특이적으로 반응하는 T 세포의 존재에 기초하여 검출될 수 있다. 특정 방법에서, 환자로부터 분리한 CD4+및/또는 CD8+T 세포를 포함하는 생물학적 샘플을 종양 폴리펩타이드, 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 및/또는 상기 폴리펩타이드의 적어도 면역원성 부분을 발현하는 APC와 함께 항온처리하고, T 세포의 특이적 활성화의 존재 또는 부재를 검출한다. 적합한 생물학적 샘플은 분리된 T 세포를 포함하지만, 이에 제한되지는 않는다. 예를 들면, T 세포는 통상적인 기술(예를 들면, 말초 혈액 임파구의 Ficoll/Hypaque 밀도 구배 원심분리)로 환자로부터 분리할 수 있다. T 세포는 폴리펩타이드와 함께 37℃에서 2 내지 9일(전형적으로 4일) 동안 시험관내에서 항온처리할 수 있다. 대조군으로 사용하기 위해서 종양 폴리펩타이드의 부재하에서 T 세포 샘플의 또 다른 분취액을 항온처리하는 것이 바람직할 것이다. CD4+T 세포에 있어서, 활성화는 바람직하게는 T 세포의 증식을 평가함으로써 검출된다. CD8+세포에 있어서, 활성화는 바람직하게는 세포독성 활성을 평가함으로써 검출한다. 질환에 걸리지 않은 환자에서 보다 적어도 2배 이상 큰 증식 수준 및 적어도 20% 이상 큰 세포독성 활성 수준은 환자에서 암의 존재를 나타낸다.
상기 주지된 바와 같이, 암은 또한 또는 선택적으로, 생물학적 샘플 중 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준에 기초하여 검출할 수 있다. 예를 들면, 2개 이상의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 폴리머라제 연쇄 반응(PCR) 기초 분석법에서 사용하여 생물학적 샘플로부터 유도된 종양 cDNA의 일부를 증폭시킬 수 있으며, 이때 올리고뉴클레오타이드 프라이머의 하나 이상은 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적이다(즉, 이에 하이브리드화한다). 이후, 증폭된 cDNA를 분리하고 겔 전기영동 같은 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 검출한다. 유사하게, 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 특이적으로 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 하이브리드화 분석법에서 사용하여 생물학적 샘플 중 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출할 수 있다.
분석법 조건하에서 하이브리드화를 수행하기 위해서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및 프로브는 10개 이상의 뉴클레오타이드 및 바람직하게는 20개 이상의 뉴클레오타이드 길이인 본 발명의 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 일부와 약 60% 이상, 바람직하게는 약 75% 이상, 및 보다 바람직하게는 약 90% 이상 동일한 올리고뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 상기 정의된 바와 같이, 중간 정도의 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화한다. 본원에서 기술된 진단 방법에서 유용하게 사용될 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프라이머 및/또는 프로브는 10 내지 40개 이상의 뉴클레오타이드 길이이다. 바람직한 구체적인 양태에서, 올리고뉴클레오타이드 프라이머는 본원에 기술된 바와 같은 서열을 갖는 DNA 분자의 10개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드, 보다 바람직하게는 15개 이상의 연속하는 뉴클레오타이드를 포함한다. PCR 기초 분석법 및 하이브리드화 분석법 모두의 기술들은 당해 분야에 공지되어져 있다[참조: 예를 들면, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51: 263, 1987; Erlich et al., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989].
한 가지 바람직한 분석법은 RT-PCR을 사용하며, 이때, PCR은 역전사와 관련하여 적용된다. 전형적으로, RNA는 생검 조직 같은 생물학적 샘플로부터 추출되며 역전사되어 cDNA 분자를 생성한다. 하나 이상의 특정 프라이머를 사용한 PCR 증폭으로 cDNA 분자를 생성시키며, 이는 예를 들면, 겔 전기영동을 사용하여 분리시키고 가시화시킬 수 있다. 증폭은 시험 환자 및 암에 걸리지 않은 개체로부터 수득된 생물학적 샘플에 대해서 수행된다. 증폭 반응은 2배량의 cDNA의 수 개의 희석물 상에서 수행할 수 있다. 암에 걸리지 않은 샘플의 동일 희석물과 비교하여 시험 환자 샘플의 수 개의 희석물에서 2배 이상의 발현 증가는 전형적으로 포지티브로 고려된다.
또 다른 구체적인 양태에서, 본원에서 기술된 조성물은 암의 진행에 대한 마커로서 사용할 수 있다. 이러한 구체적인 양태에서, 암의 진단을 위한 상기 기술된 바와 같은 분석법을 시간 경과에 따라서 수행할 수 있으며, 반응성 폴리펩타이드(들) 또는 폴리뉴클레오타이드(들)의 수준 변화를 평가한다. 예를 들면, 분석법을 6개월 내지 1년 동안 매 24 내지 72 시간 마다 수행할 수 있으며, 이후, 필요에 따라서 수행한다. 일반적으로, 암은 시간 경과에 따라 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 수준이 증가하는 환자에서 진행중인 것이다. 반대로, 암은 반응성 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드의 수준이 일정하게 유지되거나 시간 경과에 따라서 감소하는 경우 진행중이 아닌 것이다.
특정 생체내 진단 분석법을 종양에 대해서 직접적으로 수행할 수 있다. 상기 분석은 종양 세포를 결합제와 접촉시키는 것과 관련된다. 이후, 결합된 결합제는 직접적으로 또는 리포터 그룹을 통해 간접적으로 검출할 수 있다. 상기 결합제는 또한 조직학적 적용에서 사용할 수 있다. 대안으로, 폴리뉴클레오타이드 프로브는 상기 적용에서 사용할 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 감수성을 개선시키기 위해서, 다중 종양 단백질 마커를 제시된 샘플에서 분석할 수 있다. 본원에서 제공된 상이한 단백질에 특이적인 결합제를 단일 분석법에서 혼용할 수 있다. 추가로, 다중 프라이머 또는 프로브를 동시에 사용할 수 있다. 종양 단백질 마커의 선택은 최적 감수성을 초래하는 혼합물을 결정하기 위한 통상적인 실험에 기초할 수 있다. 또한, 또는 선택적으로, 본원에 제공된 종양 단백질에 대한 분석법은 다른 공지된 종양 항원에 대한 분석법과 혼용될 수 있다.
본 발명은 추가로 상기 진단학적 방법 중 하나에서 사용하기 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 전형적으로 진단학적 분석법을 수행하는데 필요한 두 개 이상의 성분들을 포함한다. 성분들은 화합물, 시약, 용기 및/또는 장치일 수 있다.예를 들면, 키트내 한 가지 용기는 종양 단백질에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 단편을 함유할 수 있다. 상기 항체 또는 단편은 상기 기술된 바와 같은 지지체 물질에 부착되어 제공될 수 있다. 하나 이상의 부가적인 용기들은 분석법에서 사용되는 시약 또는 완충액 같은 요소들을 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 또는 선택적으로 항체 결합의 직접적인 또는 간접적인 검출에 적합한 리포터 그룹을 함유하는 상기 기술된 바와 같은 검출 시약을 함유할 수 있다.
대안으로, 키트는 생물학적 샘플내 종양 단백질을 암호화하는 mRNA의 수준을 검출하도록 디자인할 수 있다. 상기 키트는 일반적으로, 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 상기 기술된 바와 같은 하나 이상의 올리고뉴클레오타이드 프로브 또는 프라이머를 포함한다. 상기 키트내에 존재할 수 있는 부가적인 성분들은 종양 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드의 검출을 촉진시키기 위한 2차 올리고뉴클레오타이드 및/또는 진단 시약 또는 용기를 포함한다.
하기 실시예는 예시를 위해서 제공되며 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1
차동 디스플레이 RT-PCR을 사용한 유방암 특이적인 cDNA의 제조
본 실시예는 차동 디스플레이 스크린을 사용한 유방 종양 특이적 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 분자의 제조를 예시한다.
A. B18Ag1 cDNA의 제조 및 mRNA 발현의 특성화
조직 샘플을 환자로부터 제거한 후 병인학에 의해 확인된 유방암에 걸린 환자의 유방암 및 정상 조직으로부터 제조한다. 정상 RNA 및 종양 RNA를 샘플로부터 추출하고 mRNA를 분리하여 (dT)12AG(서열 번호 130) 결합된 3' 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 이후, 차동 디스플레이 PCR를 랜덤하게 선택된 프라이머(CTTCAACCTC)(서열 번호 103)를 사용하여 실시하였다. 증폭 조건은 1.5mM MgCl2, 20pmol 프라이머, 500pmol dNTP, 및 Taq DNA 폴리머라제(제조원: Perkin-Elmer, Branchburg, NJ) 1유니트를 함유하는 표준 완충액이다. 증폭 40회 사이클을 94℃ 변성 30초, 42℃ 어닐링 1분, 및 72℃ 신장 30분을 사용하여 수행하였다. 76개 증폭된 생성물을 함유하는 RNA 핑거프린트를 수득하였다. 유방암 조직의 RNA 핑거프린트는 정상 유방 조직의 것과 98% 이상 동일하였지만, 하나의 밴드가 종양의 RNA 핑거프린트 패턴에 특이적인 것으로 반복적으로 관찰되었다. 이러한 밴드를 은 염색된 겔로부터 절단하여 T-벡터(제조원: Novagen, Madison, WI)내로 서브클로닝하여 서열 분석하였다.
B18Ag1으로 인용된 cDNA의 서열은 서열 번호 1에 제공된다. GENBANK 및 EMBL의 데이터베이스 조사 결과, 처음 클로닝된 B18Ag1 단편은 내인성 사람 레트로바이러스 요소 S71과 77% 동일하였으며, 이는 유인원 육종 바이러스(SSV)에 상동성인 말단절단된 레트로바이러스 요소이다. S71은 불완전한 gag 유전자, pol 유전자의 일부 및 3' 말단에서 LTR-유사 구조를 함유한다[참조: Werner et al., Virology 174: 225-238 (1990)]. B18Ag1은 또한 P30(gag) 좌위에 상응하는 영역에서 SSV와 64% 동일하다. B18Ag1은 포유동물을 감염시키는 레트로바이러스의 다양한 gag 단백질과 상당히 상동성을 공유하는 영역을 포함하는 세 개의 개별적인 불완전한 판독 프레임을 함유한다. 또한, S71에 대한 상동성은 gag 유전자에 국한되는 것이 아니라 LTR을 포함하는 수천개 염기 서열을 포함한다.
B18Ag1-특이적인 PCR 프라이머를 컴퓨터 분석 지침을 사용하여 합성하였다. RT-PCR 증폭(94℃에서 30초, 60℃에서 42℃ 30초, 72℃에서 30초의 40 사이클)으로 B18Ag1은 환자의 유방암 조직에서 상대적으로 높은 수준으로 존재하는 실질적인 mRNA 서열을 나타낸다는 것을 확인하였다. 증폭에 사용된 프라이머는 pH 8.5 및 3.5mM 마그네슘 농도 중 B18Ag1-1(CTG CCT GAG CCA CAA ATG)(서열 번호 128) 및 B18Ag1-4(CCG GAG GAG GAA GCT AGA GGA ATA)(서열 번호 129), 및 pH 9.5 및 2mM 마그네슘 농도 중 B18Ag1-2(ATG GCT ATT TTC GGG GCC TGA CA)(서열 번호 126) 및 B18Ag1-3(CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(서열 번호 127)이었다. 동일한 실험은 상기 환자의 정상 유방 조직에서 과도하게 적은 수준 내지 존재하지 않는 수준의 발현을 나타내었다(도 1 참조). 이후, RT-PCR 실험을 사용하여 B18Ag1 mRNA가 9개 다른 유방암 샘플(브라질 및 미국 환자로부터의)에서 존재하지만, 각각의 암 환자에 상응하는 비 유방 조직에서는 부재하거나 과도하게 낮은 수준으로 존재한다는 것을 나타내었다. RT-PCR 분석은 또한, B18Ag1 전사체가 다양한 정상 조직(림프절, 심근 및 간)에서는 존재하지 않으며 PBMC 및 폐 조직에서는 상대적으로 낮은수준으로 존재한다는 것을 나타낸다. 유방암 샘플에서 B18Ag1 mRNA의 존재, 및 정상 조직에서의 이의 부재는 도 2에 나타낸 바와 같이, 노던 블롯 분석법으로 확인되었다.
유방암 조직에서 B18Ag1의 상이한 발현은 또한 RNase 보호 분석법으로 확인되었다. 도 3은 네 개의 상이한 RNase 보호 분석법에서 측정된 바와 같이 다양한 조직 유형에서 B18Ag1 mRNA의 수준을 나타낸다. 레인 1 내지 12는 다양한 정상적인 유방 조직 샘플을 나타내며, 레인 13 내지 25는 다양한 유방암 샘플을 나타내고, 레인 26 및 27은 정상 전립선 샘플을 나타내고, 레인 28 및 29는 전립선 암 샘플을 나타내고, 레인 30 내지 32는 결장암 조직을 나타내고, 레인 33은 정상 동맥을 나타내고, 레인 34는 정상 소장을 나타내고, 레인 35는 정상 피부를 나타내고, 레인 36은 정상 림프절을 나타내고, 레인 37은 정상 난소를 나타내고, 레인 38은 정상 간을 나타내고, 레인 39는 정상 골격근을 나타내고, 레인 40은 제1 정상 위 샘플을 나타내고, 레인 41은 제2 정상 위 샘플을 나타내고, 레인 42는 정상 폐를 나타내고, 레인 43은 정상 신장을 나타내며, 레인 44는 정상 췌장을 나타낸다. 실험간 비교는 각각의 분석에서 풍부한 공지된 β-액틴 메세지의 포지티브 대조군 RNA를 포함하여 이러한 포지티브 대조군에 대해서 상이한 분석 결과들을 정상화시킴으로써 촉진하였다.
RT-PCR 및 서던 블롯 분석은 단일 복사체의 내인성 레트로바이러스 요소로서 사람 게놈 DNA에 존재하는 B18Ag1 좌위를 나타내었다. 대략 12 내지 18kb의 게놈성 클론을 프로브로서 처음 B18Ag1 서열을 사용하여 분리하였다. 네 개의 부가적인 서브클론을 XbaI 절단으로 분리하였다. 이러한 클론의 XbaI 절단물(도 4에 나타낸 것과 위치됨)의 말단으로부터 수득된 부가적인 레트로바이러스 서열은 서열 번호 3 내지 서열 번호 10에서 나타내며, 이때, 서열 번호 3은 도 4에에서 10 표지된 서열의 위치를 나타내고, 서열 번호 4는 11 내지 29 표지된 서열의 위치를 나타내고, 서열 번호 5는 3 표지된 서열의 위치를 나타내고, 서열 번호 6은 6 표지된 서열의 위치를 나타내고, 서열 번호 7은 12 표지된 서열의 위치를 나타내고, 서열 번호 8은 13 표지된 서열을 위치를 나타내고, 서열 번호 9는 14 표지된 서열의 위치를 나타내며 서열 번호 10은 11 내지 22 표지된 서열의 위치를 나타낸다.
후속적인 연구 결과, 12 내지 18kb 게놈성 클론이 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, 약 7.75kb의 레트로바이러스 요소를 함유한다는 것을 입증하였다. 이러한 레트로바이러스 요소의 서열은 서열 번호 141에 나타낸다. 도 5A의 상단에서 번호가 부여된 선은 레트로바이러스 게놈성 클론의 센스 쇄 서열을 나타낸다. 이러한 선 아래 박스는 선택된 제한 부위의 위치를 나타낸다. 화살표는 레트로바이러스 요소를 서열분석하는데 사용된 상이한 중복성 클론을 도시한다. 화살표의 방향은 단일-통과 서브클론 서열이 센스 쇄 또는 안티센스 쇄에 상응하는지를 나타낸다. 도 5B는 요소내 바이러스 유전자의 조직을 도시하는 B18Ag1을 함유하는 레트로바이러스 요소의 개략도이다. 흰색 박스는 상기 요소를 통해 발견되는, 메티오닌으로부터 개시되는 예견된 판독 프레임에 상응한다. 6개의 유사한 판독 프레임 각각이 박스의 좌측에 지시된 바와 같이 나타나며, 프레임 1 내지 3은 센스 쇄에서 확인되는 것과 상응하다.
프로브로서 서열 번호 1의 cDNA를 사용하여, 서열 번호 141에 나타낸 게놈성 서열과 비교하여 최소 뉴클레오타이드 차이점(1% 미만)을 함유하는 보다 긴 cDNA이 수득된다(서열 번호 227).
B. 상이한 유방암-특이적 폴리펩타이드를 암호화하는 cDNA 분자의 제조
정상 RNA 및 종양 RNA를 제조하고 mRNA를 분리한 후 상기 기술된 바와 같이, (dT)12AG 부착된 3' 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 이후, 차동 디스플레이 PCR을 서열 번호 87 내지 125의 랜덤하게 선택된 프라이머를 사용하여 수행하였다. 증폭 조건은 상기 주지된 바와 같으며 종양의 RNA 핑거프린트 패턴에 특이적인 것으로 관찰된 밴드를 은 염색된 겔로부터 절단하여, T-벡터(제조원: Novagen, Madison, WI) 또는 pCRII 벡터(제조원: Invitrogen, San Diego, CA) 중 하나에 서브클로닝하여 서열분석하였다. 상기 서열은 서열 번호 11 내지 서열 번호 86에 나타낸다. 분리된 79개 서열 중에서, 67개는 신규한 것(서열 번호 11 내지 26 및 28 내지 77)으로 확인되었다(도 6 내지 20 참조).
항원 B15Ag1(서열 번호 27에서 제공된 최초 확인된 부분적인 서열)에 대한 신장된 DNA 서열(서열 번호 290)을 추가의 연구에서 수득하였다. 서열 번호 290과 상기 기술된 바와 같은 유전자은행에서의 것들의 비교를 통해서, 공지된 사람 β-A 액티빈 유전자와의 상동성을 확인하였다. 추가의 연구로 항원 B21GT2(또한, B311D로서 인용됨; 서열 번호 56에서 제공된 최초 확인된 부분적인 cDNA 서열)에 대한전체 길이 cDNA 서열을 분리하였다. 전체 길이 서열은 서열 번호 307에 나타내며 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 308에 나타낸다. 추가의 연구로 B311D의 스플라이스 변이체를 분리하였다. 서열 번호 316의 B311D 클론을 서열분석하고 이러한 클론으로부터의 XhoI/NotI 단편을 겔 정제하고 추가의 스크리닝에서 프로브로서 사용하기 위해서 랜덤하게 프라이밍시켜 32P-cDTP 표지하여 부가적인 B311D 유전자 서열을 수득하였다. 사람 유방암 cDNA 세균 라이브러리의 두 개의 분획물을 표준 기술을 사용하여 스크리닝하였다. 이러한 방식으로 분리된 클론 중 하나는 폴리 A+ 꼬리를 포함하는 부가적인 서열을 생성하였다. 이러한 클론의 결정된 cDNA 서열(B311D_BT_1A로 인용됨)은 서열 번호 317에 나타낸다. 서열 번호 316 및 317의 서열은 464bp 영역 이상의 동일성을 공유하는 것으로 확인되었으며, 상기 서열은 서열 번호 317의 폴리 A+ 서열 인근까지 발산한다.
후속적인 연구는 부가적인 146개 서열(서열 번호 142 내지 289)을 확인하였으며, 이중 115개는 신규한 것(서열 번호 142, 143, 146 내지 152, 154 내지 166, 168 내지 176, 178 내지 192, 194 내지 198, 200 내지 204, 206, 207, 209 내지 214, 216, 218, 219, 221 내지 240, 243 내지 245, 247, 250, 251, 253, 255, 257 내지 266, 268, 269, 271 내지 273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 및 291)으로 나타났다. 본 발명자들의 지식의 범위내에서, 상기 확인된 서열들 중 어느 하나도 지금까지, 정상 유방 조직 보다 사람 유방암 조직에서 보다 높은 수준으로 발현되는 것으로 확인된 것은 없었다.
추가의 연구에서, 항원 B11Ag1(또한 B305D로 인용됨)의 수 개의 상이한 스플라이스 형태를 분리하고, 다양한 스플라이스 형태 중 각각은 B11Ag1 암호화 프레임의 약간 상이한 형태를 포함한다. 스플라이스 연접 서열은 개별적인 엑손을 정의하며, 이는 다양한 패턴 및 배열에서 다양한 스플라이스 형태를 만든다. 프라이머를 디자인하여 하기 기술되는 바와 같은 RT-PCR을 사용하여 엑손 각각의 발현 패턴을 시험하였다. 각각의 엑손은 최초 B11Ag1 클론과 동일한 발현 패턴을 나타내는 것으로 확인되었으며, 발현은 유방암-, 정상 전립선- 및 정상 정소-특이적이다. 분리된 단백질 암호화 엑손에 대한 결정된 cDNA 서열은 서열 번호 292 내지 298에 각각 제공된다. 서열 번호 292 및 298의 서열에 상응하는 예견된 아미노산 서열은 서열 번호 299 및 300에 나타낸다. cDNA 말단의 신속한 증폭(RACE), 상기 제공된 B11Ag1의 스플라이스 형태 중 하나에 대한 5' 특이적인 프라이머 및 유방 선암을 사용한 추가의 연구는 동형체 B11C-15, B11C-8 및 B11C-9,16으로서 인용된 세 개의 추가적인 연관된 스플라이스 형태의 분리를 초래하였다. 이러한 동형체에 대한 예정된 cDNA 서열은 서열 번호 301 내지 303에 제공되며, 상응하는 예견된 아미노산 서열은 서열 번호 304 내지 306에서 제공된다.
B11C-15(서열 번호 301, 또한 B305D 동형체 C로서 인용됨)의 단백질 암호화 영역을 Genbank DNA 데이터베이스의 BLASTN 조사에서 조회 서열로서 사용하였다. 염색체 21로부터의 게놈성 클론(승인 번호 AP001465)과 일치하는 것으로 확인되었다. BLASTN 결과에서 제공되는 쌍형식의 배열을 사용하여 B305D 서열에 상응하는 염색체 21의 잠재적인 엑손, 즉 암호화 서열을 확인하였다. BLASTN 쌍형식 배열에 기초하여, GenBank 기록 AP001465의 하기 단편을 함께 위치시킨다: 염기쌍 67978내지 68499, 72870 내지 72987, 73144 내지 73335, 76085 내지 76206, 77905 내지 78085, 80520 내지 80624, 87602 내지 87633. 이후, 이러한 서열을 DNA Star Seqman 프로그램을 사용하여 B305D 동형체 C 서열과 배열시키고 과량의 서열을 B305D와 가장 유사한 서열을 유지하도록 하는 방식으로 결실시켰다. 염색체 21 서열의 최종 편집된 형태는 B305D와 96.5% 동일성을 나타냈다. 이후, 염색체 21로부터의 이러한 수득된 편집된 서열을 해독시키고 B305D에 대한 것과 동일한 위치에서 최종 종결 코돈 이외에 어떠한 종결 코돈도 함유하지 않는다는 것을 확인하였다. B305D와 마찬가지로, 염색체 21 서열(서열 번호 325에 제공됨)은 384개 아미노산을 갖는 단백질(서열 번호 326)을 암호화한다. B305D 동형체 C 단백질(서열 번호 304)과 상기 단백질의 배열은 90%의 아미노산 동일성을 나타냈다.
B305D 동형체 C(서열 번호 301)의 cDNA 서열을 사용하여 High Throughput Genome Sequencing(HTGS) 데이터베이스(NCBI, National Institutes for Health, Bethesda, MD)를 조사하여 상동체를 확인하였다. 상동체는 염색체 2(클론 ID 983818), 염색체 10(클론 ID 10933022), 염색체 15(클론 ID 11560284) 상에서 확인되었다. 이러한 상동체는 핵산 수준에서 B305D 동형체 C와 90% 이상의 동일성을 공유하였다. 모든 이러한 세 가지 상동체는 서열 번호 304의 아미노산 서열과 90% 이상의 동일성을 공유하는 384개 아미노산 ORF을 암호화한다. 서열 번호 301의 서열과의 GenBank 데이터베이스의 추가의 조사는 염색체 22(클론 ID 5931507) 상의 부분적인 서열 상동체를 산출하였다. 염색체 2, 10, 15 및 22 상동체의 cDNA 서열은 B305D 동형체 C 및 인트론-엑손 연접부에서의 보존적인 서열과의 상동성에 기초하여 작제되었다. 염색체 22, 2, 15 및 10 상동체에 대한 cDNA 서열은 서열 번호 327 내지 330에 각각 나타내며, 상응하는 아미노산 서열은 서열 번호 331, 334, 333 및 332에 각각 나타낸다.
B305D 동형체 A(서열 번호 292에 제공된 cDNA 서열)에 대한 후속적인 연구에서, cDNA 서열(서열 번호 313에 제공됨)은 위치 884에서 부가적인 구아닌 잔기를 함유하는 것으로 확인되었으며, 이로써 개방 판독 프레임에서 프레임이동을 초래하였다. 상기 ORF의 결정된 DNA 서열은 서열 번호 314에 제공된다. 이러한 프레임이동은 B305D의 다른 동형체에 대해서도 일반적인 C-말단 도메인을 함유하지만 N-말단 영역에서는 상이한 293개 아미노산의 단백질 서열(서열 번호 315에 제공됨)을 생성한다.
실시예 2
사람 게놈성 DNA로부터의 B18Ag1 DNA의 제조
본 실시예는 사람 게놈성 DNA를 증폭시킴으로써 B18Ag1 DNA를 제조하는 것을 예시한다.
B18Ag1 DNA는 B18Ag1 특이적 프라이머 20pmol, dNTP 500pmol, 및 Taq DNA 폴리머라제(제조원: Perkin Elmer, Branchburg, NJ) 1유니트를 사용하여 하기 증폭 변수를 사용하여 사람 게놈성 DNA 250ng으로부터 제조할 수 있다: 94℃에서 30초 변성, 매 2회 사이클 마다 2℃ 증가 방식의 60℃ 내지 42℃에서 30초 터치다운 어닐링 및 72℃에서 30초 신장. 최종 증가(42℃ 어닐링 온도)는 사이클 25회째이다.프라이머는 컴퓨터 분석을 사용하여 선택하였다. 합성된 프라이머는 B18Ag1-1, B18Ag1-2, B18Ag1-3, 및 B18Ag1-4이었다. 사용될 수 있는 프라이머쌍은 1+3, 1+4, 2+3 및 2+4이다.
겔 전기영동 이후, B18Ag1 DNA에 상응하는 밴드를 절개하여 적합한 벡터내로 클로닝시킬 수 있다.
실시예 3
유방암 cDNA로부터의 B18Ag1 DNA의 제조
당해 실시예는 사람 유방암 cDNA로부터의 증폭에 의해 B18Ag1 DNA를 제조하는 것을 예시한다.
제1쇄 cDNA는 최종 용적 30㎕ 중 폴리 A+RNA 500ng, 프라이머 (T)12AG(즉, TTT TTT TTT TTT AG)(서열 번호 130) 200pmol, 1X 제1쇄 역 전사효소 완충액, DTT 6.7mM, dNTP 500mmol, 및 AMV 또는 MMLV 역 전사효소(모든 공급원으로부터, 예를 들면, Gibco-BRL, Grand Island, NY) 1유니트를 함유하는 반응 혼합물 중에서 사람 유방암 조직으로부터 제조된 RNA로부터 합성된다. 제1쇄 합성 후, cDNA를 약 25배 희석시키고 1㎕를 실시예 2에 기술된 바와 같이 증폭에 사용한다. 특정 프라이머쌍은 이종성 전사체 집단을 생성시킬 수 있지만, 프라이머 B18Ag1-2(5'ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(서열 번호 126) 및 B18Ag1-3(5'CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(서열 번호 127)은 단일 151bp 증폭 생성물을 산출한다.
실시예 4
B18Ag1의 B 세포 및 T 세포 에피토프의 확인
본 실시예는 B18Ag1 에피토프의 확인을 예시한다.
B18Ag1 서열은 다양한 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 스크리닝할 수 있다. B 세포 에피토프를 결정하기 위해서, 서열을 문헌[Hopp, Prog. Clin. Biol. Res. 172B: 367-77 (1985)]의 방법 또는 문헌[Cease et al., J. Exp. Med. 164: 1779-84 (1986) or Spouge et al., J. Immunol. 138: 204-12 (1987)]의 방법을 사용하여 소수성 및 친수성 값에 대해서 스크리닝할 수 있다. 부가적인 II형 MHC(항체 또는 B 세포) 에피토프는 AMPHI[예를 들면, Margalit et al., J. Immunol. 138: 2213(1987)] 같은 프로그램 또는 문헌[Rothbard and Taylor, EMBO J. 7: 93 (1988)]의 방법을 사용하여 예견할 수 있다.
일단 펩타이드(15 내지 20개 아미노산 길이)가 상기 기술을 사용하여 확인되면, 개별적인 펩타이드를 자동 펩타이드 합성 장치(예를 들면, Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA 같은 제조원으로부터 이용가능함) 및 메리필드 합성법 같은 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 합성 이후, 펩타이드를 사용하여 정상 또는 유방암 환자로부터 수거된 혈청을 스크리닝하여 유방암에 걸린 환자가 상기 펩타이드에 반응성인 항체를 갖고 있는지를 결정할 수 있다. 유방암 환자에서 상기 항체의 존재는 특이적인 당해 B 세포 에피토프의 면역원성을 확인시킬 것이다. 펩타이드를 또한 생체내에서 면역화 이후 동물(마우스, 랫트, 토끼, 침팬지 등)에서 혈청학적 또는 체액성 면역을 생성하는 이의 능력에대해서 시험할 수 있다. 상기 면역화 이후의 펩타이드 특이적 항혈청의 생성은 추가로 당해 특이적인 B 세포 에피포트의 면역원성을 확인시켜 준다.
T 세포 에피토프를 확인하기 위해서, B18Ag1 서열을 I형 HLA MHC 분자에 결합할 수 있는 B18Ag1 서열내 8 내지 10개 아미노산 모티프를 확인하는데 유용한 상이한 컴퓨터 알고리듬을 사용하여 스크리닝할 수 있다[참조: 예를 들면, Rammensee et al., Immunogenetics 41: 178-228 (1995)]. 합성 후, 상기 펩타이드를 표준 결합 분석법[예를 들면, Sette et al., J. Immunol. 153: 5586-92 (1994)]을 사용하여 I형 MHC에 결합하는 이의 능력을 시험할 수 있으며, 보다 중요하게는, 예를 들면, 문헌[Bakker et al., Cancer Res. 55: 5303-34 (1995); Visseren et al., J. Immunol. 154: 3991-98 (1995); Kawakami et al., J. Immunol. 154: 3961-68 (1995); and Kast et al., J. Immunol. 152: 3904-12 (1994)]의 방법을 사용하여 환자 또는 정상 말초 단핵구 세포의 시험관내 자극 후 항원 반응성 세포독성 T 세포를 생성시키는 이의 능력에 대해서 시험할 수 있다. 시험관내 펩타이드 자극 이후 자가(동일한 I형 MHC 분자를 갖는) 종양 세포를 사멸시킬 수 있는 T 세포의 성공적인 시험관내 생성은 B18Ag1 항원의 면역원성을 확인시켜 준다. 추가로, 상기 펩타이드를 사용하여 특정 사람 I형 MHC 반수체의 발현을 위해 형질전환된 마우스에서 생체내 면역화 이후 쥐 펩타이드 및 B18Ag1 반응성 세포독성 T 세포를 생성시킬 수 있다[Vitiello et al., J. Exp. Med. 173: 1007-15 (1991)].
예견된 I형 HLA MHC 결합 항원에 따라 분해된 예견된 B18Ag1 B 세포 및 T 세포 에피토프의 대표적인 리스트는 하기에 나타낸다:
예견된 Th 모티프(B 세포 에피토프)(서열 번호 131 내지 133)
SSGGRTFDDFHRYLLVGI
QGAAQKPINLSKXIEVVQGHDE
SPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA
예견된 HLA A2.1 모티프(T 세포 모티프)(서열 번호 134 내지 140)
YLLVGIQGA
GAAQKPINL
NLSKXIEVV
EVVQGHDES
HLQEAYRIY
NLAFVAQAA
FVAQAAPDS
실시예 5
B11Ag1의 T 세포 에피토프의 확인
본 실시예는 B11Ag1(또는 B305D로 인용됨) 에피토프의 확인을 예시한다. B11-8, B11-1, B11-5 및 B11-12(서열 번호 309 내지 312, 각각)로 인용되는 네 개의 펩타이드가 B11Ag1 유전자로부터 유도되었다.
사람 CD8 T 세포를 문헌[Van Tsai et al., Critical Reviews in Immunology18: 65-75, 1998]의 프로토콜에 따라서 수상 세포를 사용하여 펩타이드 B11-8에 대해 시험관내에서 프라이밍시켰다. 수득되는 CD8 T 세포 배양물을 B11-8 펩타이드 또는 B-LCL주, JY로 제시된 네가티브 대조군 펩타이드를 인식하는 이의 능력에 대해서 시험하였다. 간략하면, T 세포를 펩타이드 10㎍/㎖, IL-7 10ng/㎖ 및 IL-2 10㎍/㎖의 존재하에서 자가 단핵구와 함께 항온배양하고 표준 51-Cr 방출 분석법에서 표적 세포를 특이적으로 용해시키는 이의 능력에 대해서 분석한다. 도 22에 나타낸 바와 같이, 벌크 배양주들은 B11-8 펩타이드를 강력하게 인식하지만 펩타이드 B11-1은 보다 약하게 인식한다는 것을 입증하였다.
이러한 CTL주로부터의 클론을 모노클로날 항체 PKT3 및 사람 IL-2를 사용하여 신속하게 신장시킨 후 분리하였다. 도 23에 나타낸 바와 같이, 특정 펩타이드를 인식할 수 있는 이외에, 이러한 클론(A1로 인용됨)은 B11Ag1 유전자로 형질도입된 JY LCL을 인식하였다. 이러한 데이터는 B11-8이 B11Ag1 유전자의 천연 가공된 에피토프임을 입증한다. 또한, 이러한 T 세포는 추가로 HLA-A2 제한된 방식으로 B11Ag1을 천연적으로 발현하는 확립된 종양 세포주를 인식하여 용해시키는 것으로 확인되었다(도 24). T 세포는 HLA-A2로 형질도입된 B11Ag1을 천연적으로 발현하는 폐 선암종(LT-140-22) 뿐만 아니라 B11Ag1으로 형질도입된 A2+ 유방 암종(CAMA-1)을 강력하게 인식하지만, 비형질도입주 또는 다른 네가티브 종양주(SW620)는 인식하지 못한다.
이러한 데이터는 이러한 사람 T 세포가 B11-특이적인 펩타이드 뿐만 아니라 형질도입된 세포 및 천연적으로 발현하는 종양 세포주를 인식한다는 것을 명백히입증한다.
상기 기술된 과정을 사용하여 항원 B11-5 및 B11-12에 대해서 생성된 CTL주는 상응하는 펩타이드 피복된 표적을 인식하는 것으로 확인되었다.
실시예 6
차동 디스플레이 PCR에 의해 확인된 유방암 유전자의 특성화
차동 디스플레이 PCR에 의해 발견된 유방암 유전자의 특이성 및 감수성은 RT-PCR을 사용하여 측정하였다. 이러한 과정은 대량의 RNA를 사용하지 않고 반정량적으로 유방암 유전자 mRNA 발현을 신속히 평가할 수 있게 하였다. 유전자 특이적 프라이머를 사용하여, 다양한 조직에서의 mRNA 발현 수준을 시험하였으며, 8개 유방암, 5개 정상 유방, 2개의 전립선암, 2개의 결장암, 1개의 폐암 및 14개의 다른 정상 성인 조직, 즉 정상 전립선, 결장, 신장, 간, 폐, 난소, 췌장, 골격근, 피부, 위 및 정소를 포함하였다.
RT-PCR의 반정량적 특성을 보장하기 위해서, β-액틴을 시험된 조직 각각의 내부 대조군으로써 사용하였다. 제1쇄 cDNA의 일련의 희석물을 제조하고 RT-PCR 분석을 β-액틴 특이적인 프라이머를 사용하여 수행하였다. 이후, β-액틴 주형의 선형 증폭을 가능하게 하고 초기 카피수에서 상이함을 반영하기에 충분히 감수성인 희석물을 선택하였다. 이러한 조건하에서, β-액틴 수준은 각각의 조직으로부터 각각의 역 전사 반응에 대해서 측정하였다. DNA 오염은 역 전사효소를 부가하지 않고 제조된 제1쇄 cDNA를 사용하는 경우, DNase로 처리하고 네가티브 결과를 보증함으로써 최소화하였다.
유전자 특이적 프라이머를 사용하여, mRNA 발현 수준을 다양한 조직에서 측정하였다. 최근까지, 38개 유전자가 RT-PCR에 의해서 성공적으로 시험되었으며, 이중 5개는 유방암에 대한 우수한 특이성 및 감수성을 나타내었다(B15AG-1, B31GA1b, B38GA2a, B11A1a 및 B18AG1a). 도 21A 및 21B는 이러한 유전자 중 3개의 결과를 도시한다: B15AG-1(서열 번호 27), B31GA1b(서열 번호 148) 및 B38GA2a(서열 번호 157). 표 I은 정상 유방 조직 및 유방암, 및 다른 조직에서 시험된 모든 유전자의 발현 수준을 요약한다.
다양한 조직에서 발현된 유방암 항원의 백분율(%)
유방 조직 유방암에서 과발현됨 84%
정상 및 유방암에서 동등하게 발현됨 16%
다른 조직 유방암에서는 과발현되지만 모든 정상 조직에서는 발현되지 않음 9%
유방암에서는 과발현되지만 특정 정상 조직에서도 발현됨 30%
유방암에서는 과발현되지만 모든 다른 조직에서도 동등하게 발현됨 61%
실시예 7
유방암 폴리펩타이드에 대한 항체의 제조 및 특성화
유방암 항원 B305D에 대한 폴리클로날 항체는 하기와 같이 제조하였다.
이. 콜라이 재조합 발현 시스템에서 발현된 유방암 항원을 진탕 배양기에서 37℃에서 적합한 항생제와 함께 LB 브로쓰에서 밤새 성장시켰다. 다음날 아침, 밤새 배양물 10㎖를 2ℓ-배플된 에를렌마이어 플라스크내에서 2x YT + 적합한 항생제 500㎖에 부가하였다. 배양물의 광학밀도(560㎚)가 0.4 내지 0.6에 도달하는 경우,세포를 IPTG(1mM)로 유도하였다. IPTG로 유도 4시간 후, 세포를 원심분리시켜 수거하였다. 이후, 상기 세포를 인산염 완충된 염수로 세척하고 다시 원심분리하였다. 상등액을 폐기하고 세포를 미래의 사용을 위해서 동결시키거나 즉시 가공하였다. 융해 완충액 20㎖를 세포 펠렛에 부가하고 볼텍싱하였다. 이후, 이. 콜라이 세포를 파쇄시키기 위해서, 상기 혼합물을 16,000 psi의 압력에서 프렌치 프레스를 통해서 통과시켰다. 이후, 세포를 다시 원심분리하고 상등액 및 펠렛을 재조합 단백질의 분획화를 위해서 SDS-PAGE로 검사하였다. 세포 펠렛에 국재하는 단백질에 있어서, 펠렛을 10mM 트리스 pH 8.0, 1% CHAPS 중에 재현탁시키고 봉입체 펠렛을 세척하고 다시 원심분리시켰다. 상기 과정을 2회 더 반복하였다. 세척된 봉입체 펠렛을 10mM 트리스 pH 8.0 + 10mM 이미다졸을 함유하는 8M 우레아 또는 6M 구아니딘 HCl로 용해시켰다. 용해된 단백질을 니켈-킬레이트 수지(제조원: Qiagen) 5㎖에 부가하고 실온에서 지속적인 진탕과 함께 45분 내지 1시간 동안 항온처리하였다. 항온처리 후, 수지 및 단백질 혼합물을 1회용 컬럼에 붓고 플로우 쓰루를 수집하였다. 이후, 컬럼을 용해화 완충액 10 내지 20컬럼 용적으로 세척하였다. 이후, 항원을 8M 우레아, 10mM 트리스 pH 8.0 및 300mM 이미다졸을 사용하여 컬럼으로부터 용출시키고 3㎖ 분획물로 수집하였다. 추가 정제를 위해서, 모은 분획물들을 SDS-PAGE 겔을 통과시켰다.
최종 정제 단계로서, HiPrepQ(제조원: Biorad) 같은 강한 음이온 교환 수지를 적합한 완충액으로 평형시킨 후 상기로부터 모은 분획물을 컬럼에 충전시켰다. 항원을 염 구배를 증가시키면서 컬럼으로부터 용출시켰다. 분획들을 컬럼을 통과시켜 수거하고 또 다른 SDS-PAGE 겔을 통과시켜 컬럼으로부터 모은 분획들을 측정하였다. 모은 분획들을 10mM 트리스 pH 8.0에 대해서 투석하였다. 이후, 단백질을 0.22미크론 필터를 통해서 투석시키고 항원을 면역화에 필요할 때까지 동결시켰다.
B305D 항원 400㎍을 무르아밀디펩타이드(MDP) 100㎍과 혼합하였다. 매 4주 마다, 토끼를 동일한 용적의 불완전 프로인트 애주번트(IFA)로 혼합한 100㎍으로 부스팅시켰다. 각각의 부스트 이후 7일째, 동물에서 채혈하였다. 혈액을 4℃에서 12 내지 24시간 동안 항온처리한 후 원심분리시켜 혈청을 생성시켰다.
96웰 플레이트를 4℃에서 20시간 동안 재조합 단백질 50㎖(전형적으로 1㎍)와 함께 항온처리하여 B305D 항원을 피복시켰다. BSA 차단 완충액 250㎖를 웰에 부가하고 2시간 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBS/0.01% 트윈으로 6회 세척하였다. 토끼 혈청을 PBS에 희석시켰다. 희석된 혈청 5㎖를 각각의 웰에 부가하고 30분 동안 실온에서 항온처리하였다. 플레이트를 상기 기술된 바와 같이 세척한 후 1:10000 희석물로 염소 항-토끼 서양고추냉이 퍼옥시다제(HRP) 50㎖를 부가하고 실온에서 30분 동안 항온처리하였다. 플레이트를 다시 상기 기술된 바와 같이 세척하고 TMB 미세웰 퍼옥시다제 기질 100㎖를 각각의 웰에 부가하였다. 실온에서 암실에서 15분 동안 항온처리한 후, 비색계 반응을 1N H2SO4100㎖로 종결시키고 450㎚에서 즉시 판독하였다. 폴리클로날 항체는 B305D에 대해서 면역반응성을 나타내었다.
유방암 및 정상 조직 표본에서 B305D 발현에 대한 면역조직화학적(IHC) 분석은 하기와 같이 수행하였다. 파라핀-함침된 포르말 고정된 조직을 8미크론 절편으로 얇게 썰었다. 0.1M 시트르산나트륨 완충액(pH 6.0) 중 스팀 열 유도된 에피토프 복구(SHIER)을 최적 염색 조건으로 사용하였다. 절편들을 5분 동안 10% 혈청/PBS와 함께 항온처리하였다. 1차 항체를 지시된 농도로 25분 동안 각각의 절편에 부가하고 항-토끼 또는 항-마우스 바이오티닐화된 항체와 함께 25분 동안 항온처리하였다. 내인성 퍼옥시다제 활성을 과산화수소를 사용하여 1.5분 항온처리 3회로 차단하였다. 아비딘 바이오틴 복합체/서양고추냉이 퍼옥시다제(ABC/HRP) 시스템을 DAB 발색원(chromagen)과 함께 사용하여 항원 발현을 가시화시켰다. 슬라이드를 헤마톡실린으로 대염색시켰다. B305D 발현이 유방암 및 정상 유방 조직 모두에서 검출되었다. 그러나, 염색 강도는 유방 샘플에서 보다 정상 샘플에서 훨씬 낮았으며 B305D의 표면 발현은 단지 유방암 조직에서만 관찰되었다.
광범위한 정상 조직에서의 B305D 발현에 대한 실시간 PCR 및 면역조직화학적 분석의 요약은 하기 표 II에 나타낸다. 이러한 결과는 정소에서 최소한으로 B305D가 발현되고, 담낭에서는 불확실한 결과를 나타내며, 모든 시험된 다른 조직에서는 전혀 검출되지 않는다는 것을 입증한다.
mRNA IHC 염색 조직 유형 요약
중간정도의 포지티브 포지티브 정소 고환의 작은 소수가 핵 염색됨; 정자 네가티브; 시미노마(siminoma) 네가티브
네가티브 네가티브 흉선 발현 없음
N/A 네가티브 동맥 발현 없음
네가티브 네가티브 골격근 발현 없음
네가티브 포지티브(약한 염색) 소장 발현 없음
네가티브 포지티브(약한 염색) 난소 발현 없음
네가티브 뇌하수체 발현 없음
네가티브 포지티브(약한 염색) 위장 발현 없음
네가티브 네가티브 척수 발현 없음
네가티브 네가티브 비장 발현 없음
네가티브 네가티브 요관 발현 없음
N/A 네가티브 담낭 발현 없음
N/A 네가티브 태반 발현 없음
네가티브 네가티브 갑상선 발현 없음
네가티브 네가티브 심장 발현 없음
네가티브 네가티브 신장 발현 없음
네가티브 네가티브 간 발현 없음
네가티브 네가티브 뇌-소뇌 발현 없음
네가티브 네가티브 결장 발현 없음
네가티브 네가티브 피부 발현 없음
네가티브 네가티브 골수 발현 없음
N/A 네가티브 부갑상선 발현 없음
네가티브 네가티브 폐 발현 없음
네가티브 네가티브 식도 발현 없음
네가티브 포지티브(약한 염색) 자궁 발현 없음
네가티브 네가티브 부신 발현 없음
네가티브 네가티브 췌장 발현 없음
N/A 네가티브 림프절 발현 없음
네가티브 네가티브 뇌-피질 발현 없음
N/A 네가티브 난관 발현 없음
네가티브 포지티브(약한 염색) 방광 발현 없음
네가티브 N/A 뼈 발현 없음
네가티브 N/A 타액선 발현 없음
네가티브 N/A 활성화 PBMC 발현 없음
네가티브 N/A 휴지기 PBMC 발현 없음
네가티브 N/A 기관 발현 없음
네가티브 N/A 대정맥 발현 없음
네가티브 N/A 망막 발현 없음
네가티브 N/A 연골 발현 없음
실시예 8
유방암 항원의 단백질 발현
본 실시예는 이. 콜라이 및 포유동물 세포에서 유방암 항원 B305D의 발현 및 정제를 기술한다.
이. 콜라이에서 B305D 동형체 C-15(서열 번호 301; 384개 아미노산으로 해독됨)의 발현은 pET17b 중 엠. 투베르쿨로시스 항원 Ra12(서열 번호 318)의 처음 30개 아미노산의 하류의 B305D 동형체 C-15의 개방 판독 프레임을 클로닝시켜 달성하였다. 우선, B305D ORF내 내부 EcoRI 부위를 단백질 서열을 변화시키지 않으면서 돌연변이시켜 유전자가 EcoRI 부위에서 Ra12로 클로닝될 수 있다. 부위-지시된 돌연변이유발을 위해 사용된 PCR 프라이머는 서열 번호 319(AW012로 인용됨) 및 서열 번호 320(AW013으로 인용됨)에서 나타낸다. 이후, EcoRI 부위-변형된 B305D의 ORF를 프라이머 AW014(서열 번호 321) 및 AW015(서열 번호 322)를 사용한 PCR에 의해 증폭시켰다. PCR 생성물을 EcoRI으로 절단시키고 EcoRI 부위에서 Ra12/pET17b내로 연결시켰다. 수득되는 융합 작제물의 서열(Ra12mB11C)은 DNA 서열분석으로 확인하였다. 융합 작제물에 대해서 결정된 DNA 서열을 서열 번호 323에 제공하며 아미노산 서열은 서열 번호 324에 제공한다.
융합 작제물을 BL21(DE3)CodonPlus-RIL 이. 콜라이(제조원: Stratagene)내로 형질전환시키고 카나마이신과 함께 LB에서 밤새 성장시켰다. 수득된 배양물을 IPTG로 유도시켰다. 단백질을 PVDF 막으로 옮기고 5% 탈지유(PBS-트윈 완충액 중)로 차단하고, 3회 세척한 후 1시간 동안 마우스 항-His 태그 항체(제조원: Clontech)와 항온처리하였다. 상기 막을 3회 세척하고 HRP-단백질 A(제조원: Zymed)로 30분 동안 프로빙하였다. 최종적으로, 막을 3회 세척하고 ECL(제조원:Amersham)로 전개시켰다. 발현은 웨스턴 블롯으로 검출하였다.
포유동물에서 재조합 발현을 위해서, B305D 동형체 C-15(서열 번호 301; 384개 아미노산으로 해독됨)를 포유동물 발현 벡터 pCEP4 및 pcDNA31(제조원: Invitrogen)내로 서브클로닝시켰다. 이러한 작제물을 퓨진 6 시약(Fugene 6 reagent, 제조원: Roche)를 사용하여 HEK293 세포내로 형질감염시켰다. 간략하면, HEK 세포를 10% FBS(제조원: Hyclone)를 함유하는 DMEM(제조원: Gibco) 중 100,000세포/㎖의 밀도로 플레이팅시키고 밤새 성장시켰다. 다음날, 퓨진 6 시약 2㎕를 FBS 비함유 DMEM 100㎕에 부가하고 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 퓨진 6/DMEM 혼합물을 B305D/pCEP4 또는 B305D/pcDNA 플라스미드 DNA 1㎍에 부가한 후 실온에서 15분 동안 항온처리하였다. 이후, 퓨진/DNA 혼합물을 HEK293 세포내로 부가한 후 48 내지 72시간 동안 37℃에서 7% CO2와 함께 항온배양시켰다. 세포를 PBS로 세척하고, 원심분리시켜 수집 및 펠렛화시켰다.
웨스턴 블롯 분석을 위해서, 전체 세포 용해물을 빙상에서 30분 동안 트리톤-X100 함유 용해 완충액 중에서 세포를 항온처리시켜 생성시켰다. 이후, 용해물을 4℃에서 5분 동안 10,000rpm으로 원심분리시켜 청정화시켰다. 샘플을 베타-머캅토에탄올을 함유하는 SDS-PAGE 충전 완충액으로 희석시키고, 10분 동안 비등시킨 후 SDS-PAGE 겔에 로딩하였다. 단백질을 니트로셀룰로오스로 옮기고 1㎍/㎖의 농도로 단백질 A 정제된 항-B305D 토끼 폴리클로날 혈청(상기 기술된 바와 같이 제조됨)을 사용하여 프로빙하였다. 상기 블롯은 HRP에 커플링시킨 후 ECL기질에서 항온처리한 염소 항-토끼 Ig와 함께 나타났다. B305D의 발현은 B305D로 형질감염된 HEK293 용해물에서 검출되었지만, 벡터만으로 형질감염된 대조군 HEK293 세포에서는 검출되지 않았다.
FACS 분석에 있어서, 세포를 빙냉 염색 완충액으로 추가로 세척한 후 빙상에서 30분 동안 염소 항-토끼 Ig(H+L)-FITC 시약(제조원: Southern Biotechnology)의 1:100 희석물로 항온처리하였다. 3회 세척한 후, 세포를 투과성 세포를 확인할 수 있게 하는 중요한 염료인 프로피듐 요오다이드(PI)를 함유하는 염색 완충액으로 재현탁시키고, FACS로 분석하였다. FACS 분석은 B305D 단백질의 표면 발현을 나타냈다.
전술로부터, 본 발명의 특정 구체적인 양태들이 예시를 목적으로 본원에 기술되어졌지만, 다양한 변형들이 본 발명의 정신과 범위를 벗어나지 않고도 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구범위에 의해서만 제한된다.

Claims (17)

  1. (a) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열; (b) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열의 상보체; (c) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열의 20개 이상의 연속하는 잔기로 이루어진 서열; (d) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열에 중간 정도의 엄격한 조건하에서 하이브리드화하는 서열; (e) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열과 75% 이상의 동일성을 갖는 서열; (f) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및 (g) 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 제공된 서열의 축퇴성 변이체로 이루어진 그룹으로부터 선택된 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
  2. (a) 서열 번호 299, 300, 304 내지 306, 308 내지 312, 314, 326 및 331 내지 334; (b) 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열; (c) 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열과 70% 이상의 동일성을 갖는 서열; 및 (d) 제1항의 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화된 서열과 90% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩타이드.
  3. 발현 조절 서열에 작동적으로 결합된 제1항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
  4. 제3항에 따른 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포.
  5. 제2항의 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 분리된 항체, 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플을 제2항의 폴리펩타이드에 결합하는 결합제와 접촉시키는 단계; (c) 샘플 중에서 결합제에 결합하는 폴리펩타이드의 양을 검출하는 단계; 및 (d) 폴리펩타이드의 양을 예정된 컷-오프 값과 비교하여 환자에서 암의 존재를 결정하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 존재를 검출하는 방법.
  7. 제2항에 따른 폴리펩타이드 하나 이상을 포함하는 융합 단백질.
  8. 중간 정도의 엄격한 조건하에서 서열 번호 1, 3 내지 86, 142 내지 298, 301 내지 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 및 327 내지 330에 나타낸 서열과 하이브리드화하는 올리고뉴클레오타이드.
  9. T 세포의 자극 및/또는 증식을 허용하기에 충분한 조건하 및 시간 동안, T 세포를 (a) 제2항에 따른 폴리펩타이드; (b) 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드; 및 (c) 제2항에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 성분 하나 이상과 접촉시킴을 포함하여, 종양 단백질에 특이적인 T 세포를 자극하고/하거나 증식시키는 방법.
  10. 제9항의 방법에 따라 제조된 T 세포를 포함하는, 분리된 T 세포 집단.
  11. 생리학적으로 허용되는 담체 및 면역자극제로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제1 성분, 및 (a) 제2항에 따른 폴리펩타이드; (b) 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드; (c) 제5항에 따른 항체; (d) 제7항에 따른 융합 단백질; (e) 제10항에 따른 T 세포 집단; 및 (f) 제2항에 따른 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 제2 성분을 포함하는 조성물.
  12. 제11항의 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 면역 반응을 자극하는 방법.
  13. 제11항의 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자에서 암을 치료하는 방법.
  14. (a) 환자로부터 생물학적 샘플을 수득하는 단계; (b) 생물학적 샘플을 제8항에 따른 올리고뉴클레오타이드와 접촉시키는 단계; (c) 샘플 중에서 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 검출하는 단계; 및 (d) 올리고뉴클레오타이드에 하이브리드화하는 폴리뉴클레오타이드의 양을 예정된 컷-오프 값과 비교하여 환자에서 암의 존재를 측정하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 존재를 측정하는 방법.
  15. 제8항에 따른 올리고뉴클레오타이드 하나 이상을 포함하는 진단 키트.
  16. 제5항에 따른 항체 하나 이상 및 리포터 그룹을 포함하는 검출 시약을 포함하는 진단 키트.
  17. (a) 환자로부터 분리된 CD4+ 및/또는 CD8+ 세포를, (i) 제2항에 따른 폴리펩타이드; (ii) 제1항에 따른 폴리뉴클레오타이드; 및 (iii) 제2항의 폴리펩타이드를 발현하는 항원 제시 세포로 이루어진 그룹으로부터 선택된 성분 하나 이상과 함께항온배양하여 T 세포를 증식시키는 단계; 및 (b) 유효량의 증식된 T 세포를 환자에게 투여하여 환자에서 암의 진행을 억제하는 단계를 포함하여, 환자에서 암의 진행을 억제하는 방법.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7241876B2 (en) * 1996-01-11 2007-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US6656480B2 (en) * 1996-01-11 2003-12-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
US20030125536A1 (en) * 1996-01-11 2003-07-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
DE60033583T2 (de) * 1999-10-07 2007-09-13 Corixa Corp. CSC, Wilmington Eine mycobacterium tuberculosis kodierende sequenz zur expression von heterologen proteinen
ES2374620T3 (es) 2000-06-20 2012-02-20 Corixa Corporation Antígeno mtb32a de mycobacterium tuberculosis con el sitio activo inactivado y proteínas de fusión de los mismos.
WO2004016733A2 (en) 2002-08-16 2004-02-26 Agensys, Inc. Nucleic acid and corresponding protein entitled 251p5g2 useful in treatment and detection of cancer
WO2005080436A2 (en) * 2004-02-18 2005-09-01 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies that bind pote and uses thereof
KR100763902B1 (ko) * 2004-02-20 2007-10-05 삼성전자주식회사 유방암 특이적 단백질, 그를 코딩하는 유전자, 및 상기단백질 또는 유전자를 이용한 유방암의 진단 방법
CN101962405A (zh) * 2010-09-30 2011-02-02 南开大学 一种人源乳腺癌抗原及其抗体
EP3692158A4 (en) * 2017-10-03 2021-08-04 Prevail Therapeutics, Inc. GENE THERAPIES FOR LYSOSOMIAL DISORDERS
CN110132896A (zh) * 2019-05-06 2019-08-16 山西大学 一种快速检测血清中乳腺癌标志物的微型光纤生物传感器

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1575697A (en) * 1996-01-10 1997-08-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cancer
KR19990077146A (ko) * 1996-01-11 1999-10-25 길리스 스티브 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법
US6225054B1 (en) * 1996-01-11 2001-05-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
US20030125536A1 (en) * 1996-01-11 2003-07-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
ZA982968B (en) * 1997-04-09 1998-10-27 Corixa Corp Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
AU774824B2 (en) * 1999-04-09 2004-07-08 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer

Also Published As

Publication number Publication date
JP2004508812A (ja) 2004-03-25
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IL152847A0 (en) 2003-06-24
CN1443239A (zh) 2003-09-17
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WO2001090152A2 (en) 2001-11-29

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