CZ20024213A3 - Prostředky a způsoby léčení a diagnostiky rakoviny prsu - Google Patents

Prostředky a způsoby léčení a diagnostiky rakoviny prsu Download PDF

Info

Publication number
CZ20024213A3
CZ20024213A3 CZ20024213A CZ20024213A CZ20024213A3 CZ 20024213 A3 CZ20024213 A3 CZ 20024213A3 CZ 20024213 A CZ20024213 A CZ 20024213A CZ 20024213 A CZ20024213 A CZ 20024213A CZ 20024213 A3 CZ20024213 A3 CZ 20024213A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
polypeptide
sequence
sequences
cells
patient
Prior art date
Application number
CZ20024213A
Other languages
English (en)
Inventor
Tony N. Frudakis
Steven G. Reed
John M. Smith
Lynda E. Misher
Davin C. Dillon
Marc W. Retter
Aijun Wang
Yasir A. W. Skeiky
Susan L. Harlocker
Craig H. Day
Original Assignee
Corixa Corporation
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US09/699,295 external-priority patent/US6828431B1/en
Application filed by Corixa Corporation filed Critical Corixa Corporation
Publication of CZ20024213A3 publication Critical patent/CZ20024213A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4615—Dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/462—Cellular immunotherapy characterized by the effect or the function of the cells
    • A61K39/4622—Antigen presenting cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/464—Cellular immunotherapy characterised by the antigen targeted or presented
    • A61K39/4643—Vertebrate antigens
    • A61K39/4644—Cancer antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/53—DNA (RNA) vaccination
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/57—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the type of response, e.g. Th1, Th2
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2239/00—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46
    • A61K2239/46—Indexing codes associated with cellular immunotherapy of group A61K39/46 characterised by the cancer treated
    • A61K2239/49—Breast
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/10022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

Oblast techniky
Tento vynález se všeobecně týká léčby a diagnostiky rakoviny, jako je rakovina prsu. Tento vynález se zvláště týká polypeptidů, zahrnujících nejméně část proteinu tumoru prsu a polynukletidů kódujících tyto polypeptidy. Tyto polypeptidy a polynukleotidy lze použít ve farmaceutických prostředcích, například vakcínách a jiných prostředcích pro diagnostiku a léčení rakoviny prsu.
Dosavadní stav techniky
Rakovina prsu je významným zdravotním problémem u žen ve Spojených státech a na celém světě. Ačkoli došlo k pokrokům při zjištování a léčení nemoci, zůstává rakovina prsu druhou nejčastější příčinou smrti spojené s rakovinou u žen, postihující každoročně více než 180 000 žen ve Spojených státech. U žen v severní Americe jsou v současnosti vyhlídky na onemocnění rakovinou prsu v průběhu života jedna ku osmi.
V současné době není dostupná žádná vakcína ani jiný univerzálně úspěšný způsob prevence nebo léčení rakoviny prsu. Léčení nemoci je v současné době založeno na kombinaci včasné diagnózy (pomocí rutinních způsobů screeningu) a agresivního léčení, které může zahrnovat jeden nebo více způsobů léčení, jako je operace, radioterapie, chemoterapie a hormonální terapie. Způsob léčení konkrétní rakoviny prsu je často zvolen na základě řady prognostických ukazatelů, včetně analýzy specifických markérů tumoru. Srovnej například Porter-Jordan a Lippman, Breast Cancer, 8, 73 - 2
100 (1994). Použití zavedených markérů nicméně často vede k obtížně interpretovatelným výsledkům a vysoká mortalita u pacientek s rakovinou prsu ukazuje, že jsou nutná zlepšení v léčení, diagnostice a prevenci nemoci.
Proto je potřeba zlepšených způsobů léčení a diagnostiky rakoviny prsu. Tento vynález odpovídá těmto potřebám a dále poskytuje jiné související výhody.
Podstata vynálezu
V jednom aspektu tento vynález poskytuje polynukleotidové prostředky zahrnující sekvenci zvolenou ze skupiny sestávající z:
(a) sekvencí poskytnutých v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 , (b) komplementů sekvencí poskytnutých v SEQ ID NO:
1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (c) sekvencí skládajících se z nejméně 20 sousedních zbytků sekvencí poskytnutých v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (d) sekvencí, které hybridizují na sekvence poskytnuté v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 za středně přísných podmínek, (e) sekvencí, které mají nejméně 75% identitu se • · · · sekvencemi poskytnutými v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (f) sekvencí, které mají nejméně 90% identitu se sekvencemi poskytnutými v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 a (g) degenerativní varianty sekvencí, poskytnutých
V SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330.
V jednom výhodném ztělesnění jsou polynukleotidové prostředky podle tohoto vynálezu exprimovány nejméně v přibližně 20 %, výhodněji nejméně v přibližně 30 % a velmi výhodně nejméně v přibližně 50 % testovaných vzorků tumorů prsu v hladině nejméně přibližně dvojnásobně, výhodně nejméně přibližně pětinásobně a velmi výhodně nejméně přibližně desetinásobně vyšší než je hladina u normálních tkání.
V dalším aspektu poskytuje tento vynález polypeptidové prostředky obsahující sekvenci aminokyselin, která je kódována sekvencí polynukleotidů popsanou výše.
Tento vynález dále poskytuje polypeptidové prostředky obsahující sekvenci aminokyselin zvolenou ze skupiny sestávající ze sekvencí uvedených v SEQ ID NO: 299, 300, 304 až 306, 308 až 312, 314, 326 a 331 až 334.
V určitém výhodném ztělesnění jsou polypeptidy a/nebo polynukleotidy podle tohoto vynálezu imunogenní, to znamená, že jsou schopny vyvolat imunitní odpověď, zejména humorální a/nebo buněčnou imunitní odpověď, jak je zde dále popsáno.
• · · · · · · ···· • · · · · · • · * «· ·
Tento vynález dále poskytuje fragmenty, varianty a/nebo deriváty popsaných sekvencí polypeptidů a/nebo polynukleotidů, ve kterých fragmenty, varianty a/nebo deriváty mají výhodně hladinu imunogenní aktivity nejméně přibližně 50 %, výhodně nejméně přibližně 70 % a velmi výhodně nejméně 90 % hladiny imunogenní aktivity sekvence polypeptidů uvedené v SEQ ID NO: 299, 300, 304 až 306, 308 až 312, 314, 326 a 331 až 334 nebo sekvence polypeptidů kódované sekvencí polynukleotidů uvedené v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330.
Tento vynález dále poskytuje polynukleotidy, které kódují polypeptid popsaný výše, expresní vektory zahrnující takové polynukleotidy a hostitelské buňky transformované nebo transfektované těmito expresními vektory.
V jiných aspektech poskytuje tento vynález farmaceutické prostředky obsahující polypeptid nebo polynukleotid, jak je popsán výše, spolu s fyziologicky vhodným nosičem.
V rámci souvisejícího aspektu tohoto vynálezu jsou poskytnuty farmaceutické prostředky, například vakcínové prostředky, pro profylaktické nebo léčebné podání. Takové prostředky celkově obsahují imunogenní polypeptid nebo polynukleotid podle tohoto vynálezu a imunostimulancium, jako je adjuvans.
Tento vynález dále poskytuje farmaceutické prostředky, které obsahují: (a) protilátku nebo jeho fragment vážící antigen, který se specificky váže na polypeptid podle tohoto • · » · • · · • · · · vynálezu nebo jeho fragment a (b) fyziologicky vhodný nosič.
Tento vynález dále poskytuje farmaceutické prostředky, které obsahují: (a) antigen prezentující buňku, která exprimuje polypeptid, jak je popsán výše a (b) farmaceuticky vhodný nosič nebo excipiencium. Ilustrativní antigen prezentující buňky zahrnují dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a B-buňky.
V rámci souvisejících aspektů jsou poskytnuty farmaceutické prostředky, zahrnující: (a) antigen prezentující buňku, která exprimuje polypeptid, jak je popsán výše a (b) imunostimulans.
Tento vynález ve svých jiných aspektech dále poskytuje fuzní proteiny, které zahrnují nejméně jeden polypeptid, jak je popsán výše, stejně jako polynukleotidy kódující takové fuzní proteiny, obvykle ve formě farmaceutických prostředků, například vakcínových prostředků, obsahujících fyziologicky vhodný nosič a/nebo imunostimulans. Fuzní proteiny mohou zahrnovat rozmanité imunogenní polypeptidy nebo jejich části/varianty, jak je zde popsáno a mohou dále zahrnovat jeden nebo více polypeptidových segmentů pro usnadnění exprese, čištění a/nebo imunogenicity polypeptidu nebo polypeptidů.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby stimulace imunitní odpovědi u pacienta, výhodně odpovědi T-buněk u lidského pacienta, zahrnující podání farmaceutického prostředku zde popsaného. Pacient může být postižen rakovinou prsu a v takovém případě způsoby poskytují léčení nemoci nebo může být pacient, u kterého existuje nebezpečí takové nemoci, léčen profylakticky.
• · · ·
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, zahrnující podání farmaceutického prostředku popsaného výše. Pacient může být postižen rakovinou prsu a v takovém případě způsoby poskytují léčení nemoci nebo může být pacient, u kterého existuje nebezpečí takové nemoci, léčen profylakticky.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby odstranění tumoru z biologického vzorku, zahrnující kontakt biologického vzorku s T-buňkami, které specificky reagují s polypeptidem podle tohoto vynálezu, ve kterých je stupeň, ve kterém dochází ke kontaktu, uskutečněn za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se ze vzorku odstranily buňky exprimující protein.
V rámci souvisejících aspektů jsou poskytnuty způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, zahrnující podání biologického vzorku ošetřeného, jak je popsáno výše, pacientovi.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby stimulace a/nebo expanze T-buněk specifických pro polypeptid podle tohoto vynálezu, zahrnující kontaktování T-buněk s jedním nebo více z: (i) polypeptidů, jak jsou popsány výše, (ii) polynukleotidů kódujících takový polypeptid, a/nebo (iii) antigen prezentujících buněk, které exprimují takový polypeptid, za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se umožnila stimulace a/nebo expanze T-buněk. Izolované populace T-buněk zahrnující T-buňky připravené, jak je popsáno výše, jsou rovněž poskytnuty.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje • · · · ···» • ·
způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, zahrnující podání účinného množství populace T-buněk, jak jsou popsány výše.
Tento vynález dále poskytuje způsoby inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, zahrnující kroky: (a) inkubace CD4+ a/nebo CD8+ T-buněk izolovaných z pacienta s jedním nebo více z: (i) polypeptidů, zahrnujících alespoň imunogenní část polypeptidů, jak je zde popsáno, (ii) polynukleotidů kódujících takový polypeptid, a (iii) antigen prezentujících buněk, které exprimují takový polypeptid, a (b) podání pacientovi účinného množství proliferovaných T-buněk a tím inhibici rozvoje rakoviny u tohoto pacienta. Proliferované buňky mohou, ale nemusí být klonovány před podáním pacientovi.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby určení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny, výhodně rakoviny prsu, u pacienta, zahrnující: (a) kontakt biologického vzorku získaného od pacienta s vázajícím činidlem, které váže polypeptid, jak je popsán výše, (b) detekci množství polypeptidů ve vzorku, které se váže k vázajícímu činidlu a (c) porovnání množství polypeptidů s předem určenou mezní hodnotou, a tím stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny u pacienta. V rámci výhodných ztělesnění je vázajícím činidlem protilátka, výhodněji monoklonální protilátka.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby monitorování progrese rakoviny u pacienta. Tyto způsoby zahrnují: (a) kontakt biologického vzorku získaného od pacienta při prvním odběru s vázajícím činidlem, které váže polypeptid, jak je popsán výše, (b) detekci množství • · » · • » · • ·· · polypeptidu ve vzorku, které se váže k vázajícímu činidlu, (c) opakování kroků (a) a (b) za použití biologického vzorku získaného od pacienta při následném odběru a (d) porovnání množství polypeptidu detekovaného v kroku (c) s množstvím detekovaným v kroku (b), a tím určení progrese rakoviny u pacienta.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje způsoby určení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny, zahrnující následující kroky: (a) kontakt biologického vzorku, získaného od pacienta, s oligonukleotidem, který hybridizuje na polynukleotid, který kóduje polypeptid podle tohoto vynálezu, (b) detekci hladiny polynukleotidu ve vzorku, výhodně mRNA, který hybridizuje na tento oligonukleotid a (c) porovnání hladiny polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid, s předem určenou mezní hodnotou a tím určení přítomnosti nebo nepřítomnosti rakoviny u pacienta. V rámci určitých ztělesnění se množství mRNA detekuje způsobem reakce polymerasového řetězce za použití například nejméně jednoho oligonukletidového primeru, který hybridizuje na polynukleotid kódující polypeptid, jak je popsán výše, nebo komplement takového polynukleotidu. V rámci jiných ztělesnění se množství mRNA detekuje za použití hybridizačního způsobu s použitím oligonukleotidové sondy, která hybridizuje na polynukleotid kódující polypeptid, jak je popsán výše, nebo komplement takového polynukleotidu.
V rámci souvisejících aspektů jsou poskytnuty způsoby monitorování progrese rakoviny u pacienta, zahrnující tyto kroky: (a) kontakt biologického vzorku získaného od pacienta s oligonukleotidem, který hybridizuje na polynukleotid, který kóduje polypeptid podle tohoto vynálezu, (b) detekci • ·· · • · 9 ·
99 9
množství polynukleotidu ve vzorku, který hybridizuje na daný oligonukleotid, (c) opakování kroků (a) a (b) za použití biologického vzorku získaného od pacienta při následném odběru a (d) porovnání množství polynukleotidu detekovaného v kroku (c) s množstvím detekovaným v kroku (b), a tím určení progrese rakoviny u pacienta.
V rámci dalších aspektů tento vynález poskytuje protilátky, jako jsou monoklonální protilátky, které se váží na polypeptidy, jak jsou popsány výše, stejně jako diagnostické kity obsahující takové protilátky. Rovněž jsou poskytnuty diagnostické kity, které obsahují jeden nebo více oligonukleotidových sond nebo primerů, jak je popsáno výše.
Tyto a další aspekty tohoto vynálezu jsou zřejmé v odkazech k následujícímu podrobnému popisu a přiložených výkresech. Všechny odkazy zde uvedené jsou tímto zahrnuty svými odkazy ve své úplnosti, jako kdyby každý z nich byl uveden jednotlivě.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. 1 ukazuje produkty diferenční zobrazovací PCR, separované elektroforézou na gelu, získané z cDNA připravené z normální tkáně prsu (linie 1 a 2) a z cDNA připravené z tkáně tumoru prsu od téhož pacienta (linie 3 a 4). Šipka ukazuje pás odpovídající B18Agl.
Obr. 2 je northern blot porovnávající hladinu B18Agl mRNA v tkáni tumoru prsu (linie 1) s hladinou v normální tkáni prsu.
Obr. 3 ukazuje hladinu B18Agl mRNA v tkáni tumoru prsu • ·· ·
ve srovnání s touto hladinou v různých normálních tkáních a tkáních bez tumoru prsu, jak se určily zkouškami ochrany RNázy.
Obr. 4 je mapa genomového klonu, ukazující lokalizaci doplňkových retrovirových sekvencí získaných z konců Xbal restrikční digesce (poskytnutých v SEQ ID NO:3 až SEQ ID NO:10) příbuzných s BISAgl.
Obr. 5A a 5B ukazují strategii sekvenování, organizaci genomu a předpokládaný otevřený čtecí rámec pro retrovirový element obsahující BISAgl.
Obr. 6 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA BISAgl specifickou pro tumor prsu.
Obr. 7 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B17Agl specifickou pro tumor prsu.
Obr. 8 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B17Ag2 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 9 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B13Ag2a specifickou pro tumor prsu.
Obr. 10 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B13Aglb specifickou pro tumor prsu.
Obr. 11 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B13Agla specifickou pro tumor prsu.
Obr. 12 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA BllAgl specifickou pro tumor prsu.
• 00 · ·· 0 00·
Obr. 13 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B3CA3c specifickou pro tumor prsu.
Obr. 14 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B9CG1 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 15 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B9CG3 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 16 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B2CA2 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 17 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B3CA1 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 18 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B3CA2 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 19 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B3CA3 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 20 ukazuje sekvenci nukleotidů představující cDNA B4CA1 specifickou pro tumor prsu.
Obr. 21A ukazuje analýzu RT-PCR genů tumoru prsu ve tkáních tumoru prsu (linie 1 až 8) a v normálních tkáních prsu (linie 9 až 13) a vody (linie 14).
Obr. 21B ukazuje analýzu RT-PCR genů tumoru prsu v tumorech prostaty (linie 1,2), tumorech tračníku (linie 3), tumorech plic (linie 4), normální prostatě (linie 5), normálním tračníku (linie 6), normální ledvině (linie 7), • · ♦· · · ···· • * * · • « · · • · · · « • · · ♦ > • · · »» normálních játrech (linie 8), normálních plicích (linie 9), normálním vaječníku (linie 10, 18), normálním pankreatu (linie 11, 12), normálním kosterním svalu (linie 13), normální kůži (linie 14), normálním žaludku (linie 15), normálních varlatech (linie 16), normálním tenkém střevě (linie 17), HBL-100 (linie 19), MCF-12A (linie 20), tumorech prsu (linie 21 až 23), vodě (linie 24) a tumoru tračníku (linie 25).
Obr. 22 ukazuje rekognici peptidu BllAgl (uváděn jako Bll-8) pomocí anti-Bll-8 CTL linie.
Obr. 23 ukazuje rekognici buněčné linie transdukované antigenem BllAgl pomocí specifického klonu Al Bll-8.
Obr. 24 ukazuje rekognici linie plicního adenokarcinomu (LT-140-22) a linie prsního adenokarcinomu (CAMA-1) pomocí specifického klonu Al Bll-8.
Podrobný popis vynálezu
Tento vynález je obecně zaměřen na prostředky a jejich použití v léčení a diagnostice rakoviny, zejména rakoviny prsu. Jak je popsáno dále, ilustrativní prostředky podle tohoto vynálezu zahrnují polypeptidy, zejména imunogenní polypeptidy, polynukleotidy kódující takové polypeptidy, protilátky a jiná vazebná činidla, antigen prezentující buňky (APCs) a buňky imunitního systému (například T-buňky), ale jejich výčet není na ně omezen.
V praktickém využití tento vynález používá obvyklé způsoby ve virologii, imunologii, mikrobiologii, molekulární biologii a způsoby rekombinace DNA, známé v oboru, z nichž ··«« • · « · * A • 9 «Α • ·· · *· mnohé jsou popsány dále za účelem ilustrace, není-li výslovně uveden opak. Tyto způsoby jsou plně popsány v literatuře. Viz např. Sambrook a kol., Molecular Cloning:
A Laboratory Manual (2. vydání, 1989), Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982), DNA Cloning:
A Practical Approach, svazek I a II (D. Glover, vyd.), Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, vyd. 1984), Nucleic Acid Hybridization (B. Hames a S. Higgins, vyd. 1985), Transcription and Translation (B. Hames a S. Higgins, vyd. 1984), Animal Cell Culture (R. Freshney, vyd., 1986),
Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984).
Všechny publikace, patenty a patentové přihlášky zde citované, ať již výše nebo dále, jsou tímto začleněny odkazem v jejich úplnosti.
Jak se používá v této přihlášce a přiložených patentových nárocích, jednotná čísla zahrnují rovněž odkazy v množném čísle, pokud z obsahu jasně nevyplývá opak.
Polypeptidové prostředky
Pojem polypeptid se zde používá ve svém obvyklém významu, tedy jako sekvence aminokyselin. Polypeptidy nejsou omezeny na určitou délku produktu, takže definice polypeptidů zahrnuje peptidy, oligopeptidy a proteiny a tyto pojmy zde mohou být použity záměnné, pokud není výslovně uveden opak. Tento pojem se rovněž nevztahuje na modifikace po exprimaci polypeptidů, ani je nevylučuje, například na glykosylace, acetylace, fosforyláce a podobně, stejně jako na jiné modifikace známé v oboru, jak přirozeně se vyskytující, tak ty, které se nevyskytují přirozeně. Polypeptid může být úplný nebo subsekvnční. Polypeptidy,
4 4 •
444 •44 4 • 4 4 4
4 44 které jsou předmětem zvláštního zájmu tohoto vynálezu, jsou subsekvence aminokyselin zahrnující epitopy, t. j. antigenní determinanty v podstatě odpovědné za imunogenní vlastnosti polypeptidů a schopné vyvolat imunitní odpověď.
Zvláště ilustrativní polypeptidy podle tohoto vynálezu zahrnují ty polypeptidy, které jsou kódované kteroukoli sekvencí polynukleotidů z těch sekvencí, uvedených v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, nebo sekvencí, která hybridizuje za středně přísných podmínek, nebo alternativně za vysoce přísných podmínek, na kteroukoli jednotlivou sekvenci polynukleotidů z těch sekvencí, uvedených v SEQ ID NO: 1, až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317,
325 a 327 až 330. Určité jiné ilustrativní polypeptidy podle tohoto vynálezu zahrnují kteroukoli jednotlivou sekvenci polynukleotidů z těch sekvencí, uvedených v SEQ ID NO: 299, 300, 304 až 306, 308 až 312, 314, 326 a 331 až 334.
Polypeptidy podle tohoto vynálezu jsou zde někdy zahrnuty odkazem jako proteiny tumoru prsu nebo polypeptidy tumoru prsu, což ukazuje, že jejich identifikace je založena nejméně zčásti na tom, že u vzorků tumoru prsu dochází ke zvýšeným hladinám exprese. Tak se pojmy polypeptid tumoru prsu nebo protein tumoru prsu obecně vztahují na sekvenci polypeptidů podle tohoto vynálezu nebo na sekvenci polynukleotidů kódující takový polypeptid, která je exprimována u podstatné části vzorků tumoru prsu, například výhodně u více než asi 20 %, výhodněji u více než asi 30 % a velmi výhodně u více než asi 50 % nebo více v hladinách, které jsou nejméně dvojnásobně a výhodně nejméně pětinásobně vyšší než hladiny exprese u normálních tkání, jak se určí za použití reprezentativní zkoušky zde poskytnuté. Sekvence ·* «·*· ·· ·*· · • ·· polypeptidu tumoru prsu podle tohoto vynálezu, založená na zvýšené hladině exprese v buňkách tumoru, má význam zejména jako diagnostický markér stejně jako cílové místo pro léčení, jak je dále popsáno.
V určitých výhodných ztělesněních jsou polypeptidy podle tohoto vynálezu imunogenní, tedy detekovatelně reagují ve zkoušce imunity (jako je ELISA nebo zkouška stimulace T-buněk) s antisérem a/nebo T-buňkami od pacienta s rakovinou prsu. Screening imunogenní aktivity lze uskutečnit za použití způsobů známých odborníkovi v oboru. Například lze takový screening uskutečnit za použití způsobů, jako jsou způsoby, popsané v Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). V jednom ilustrativním příkladě lze polypeptid imobilizovat na pevný podklad a uvést do kontaktu se sérem pacienta, aby se navázala protilátka ze séra na imobilizovaný polypeptid. Nenavázané sérum lze potom odstranit a navázané protilátky detekovat za použití například proteinu A značeného 125I.
Jak je známo odborníkovi v oboru, imunogenní části polypeptidů uvedených zde jsou rovněž zahrnuty do tohoto vynálezu. Pojem imunogenní část zde představuje fragment imunogenního polypeptidu podle tohoto vynálezu, který je sám o sobě imunologicky reaktivní (tedy specificky váže) s B-buňkami a/nebo povrchovými antigenními receptory T-buněk, které rozpoznají daný polypeptid. Imunogenní části lze obecně identifikovat za použití dobře známých způsobů, jako jsou způsoby, sumarizované v Paul, Fundamental Imunology, 3. vyd., 243 - 247 (Raven Press, 1993) a způsoby, na které je zde odkazováno v citacích. Takové způsoby zahrnují screening polypeptidů s ohledem na jejich schopnost reagovat s antigen-specifickými protilátkami, antisérem ·· ··«· ♦ * » · «··
- 16 • ♦ ♦ · ·*
Pojmy antisérum a a/nebo liniemi T-buněk nebo klony protilátky, které se zde používají, jsou antigen-specifické, pokud se specificky váží na antigen (tedy reagují s proteinem ve zkoušce ELISA nebo jiné imunozkoušce a nereagují detekovatelně s nepříbuznými proteiny). Taková antiséra a protilátky lze připravit, jak je zde popsáno a za použití dobře známých způsobů.
V jednom výhodném ztělesnění je imunogenní část polypeptidu podle tohoto vynálezu ta část, která reaguje s antisérem a/nebo T-buňkami na úrovni, která není podstatně nižší než reaktivita polypeptidu o plné délce řetězce (například ve zkoušce ELISA nebo zkoušce reaktivity T-buněk). Výhodně je hladina imunogenní aktivity imunogenní části nejméně přibližně 50 %, výhodně nejméně přibližně 70 % a velmi výhodně více než přibližně 90 % imunogenicity polypeptidu o plné délce řetězce. V některých případech se určí, že výhodné imunogenní části mají vyšší úroveň imunogenní aktivity než polypeptidy o plné délce řetězce, například že mají přibližně 100% nebo 150% nebo větší imunogenní aktivitu.
V určitých jiných ztělesněních mohou ilustrativní imunogenní části zahrnovat peptidy, u kterých byla odstraněna N-koncová vedoucí sekvence a/nebo transmembránová doména. Jiné ilustrativní imunogenní části obsahují malé delece N- a/nebo C-konce (například 1 až 30 aminokyselin, výhodně 5 až 15 aminokyselin) vzhledem k původnímu proteinu.
V jiném ztělesnění může polypeptidový prostředek podle tohoto vynálezu rovněž zahrnovat jeden nebo více polypeptidů, které jsou imunologicky reaktivní s T-buňkami a/nebo protilátkami vytvořenými proti polypeptidu podle • 000 ·0·0 • 0 ·0 0 ·
0 0 0 0 0 0 00 00 tohoto vynálezu, zejména polypeptidu, který má sekvenci aminokyselin, jak je zde popsána, nebo proti jeho imunogennímu fragmentu nebo variantě.
V jiném ztělesněni tohoto vynálezu jsou poskytnuty polypeptidy, které zahrnují jeden nebo více polypeptidů, které jsou schopny dát vznik T-buňkám a/nebo protilátkám, které jsou imunologicky reaktivní s jedním nebo více polypeptidy zde popsanými, nebo s jedním nebo více polypeptidy kódovanými sekvencemi sousedících nukleových kyselin zahrnutých v sekvencích polynukleotidů zde popsaných, nebo jejich fragmenty nebo variantami, nebo jednou nebo více sekvencemi nukleových kyselin, které hybridizují na jednu nebo více těchto sekvencí za podmínek střední až vysoké přísnosti.
Tento vynález v jiném aspektu poskytuje fragmenty polypeptidů, zahrnující nejméně přibližně 5, 10, 15, 20, 25, 50 nebo 100 sousedících aminokyselin nebo více, včetně všech mezilehlých délek, polypeptidových prostředků zde uvedených, jako jsou ty sekvence, uvedené v SEQ ID NO: 299, 300, 304 až 306, 308 až 312, 314, 326 a 331 až 334 nebo ty sekvence uvedené v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330.
V jiném aspektu poskytuje tento vynález varianty polypeptidových prostředků zde popsaných. Polypeptidové varianty obecně zahrnuté do tohoto vynálezu obvykle vykazují nejméně asi 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%,
95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% nebo vyšší identitu (určenou, jak je popsáno dále), spolu s délkou, se sekvencemi polypeptidů uvedených zde.
·· ···« • · ♦ • · · ♦ · * · ·» ·«
V jednom výhodném ztělesnění jsou polypeptidové fragmenty a varianty poskytnuté tímto vynálezem imunologicky reaktivní s protilátkou a/nebo T-buňkou, která reaguje s polypeptidem o plné délce řetězce, specificky popsaným zde.
V jiném výhodném ztělesnění vykazují polypeptidové fragmenty a varianty poskytnuté tímto vynálezem úroveň imunogenní aktivity nejméně přibližně 50 %, výhodně nejméně přibližně 70 % a velmi výhodně nejméně přibližně 90 % nebo více té úrovně, kterou vykazuje sekvence polypeptidu s plnou délkou, specificky popsaná zde.
Pojem polypeptidové varianta, který je zde používán, znamená polypeptid, který se obvykle liší od polypeptidu specificky popsaného zde jednou nebo více substitucemi, delecemi, adicemi a/nebo inzercemi. Takové varianty se mohou přirozeně vyskytovat nebo mohou být připraveny synteticky, například modifikací jedné nebo více sekvencí polypeptidů podle tohoto vynálezu, uvedených výše a zhodnocením jejich imunogenní aktivity, jak je zde popsáno a/nebo použitím kteréhokoli z řady způsobů, dobře známých v oboru.
Například určité ilustrativní varianty polypeptidů podle tohoto vynálezu zahrnují ty varianty, u kterých byla odstraněna jedna nebo více částí, jako je N-koncová vedoucí sekvence nebo transmembrální doména. Jiné ilustrativní varianty zahrnují ty varianty, u kterých byla odstraněna malá část (např. 1 až 30 aminokyselin, výhodně 5 až 15 aminokyselin) z N- a/nebo C-konce původního proteinu.
V mnoha případech zahrnuje varianta konzervativní substituci. Konzervativní substituce je taková substituce, * ·· · ·· ·· · · • · * « ♦·· · « · při které je jedna aminokyselina nahrazena jinou aminokyselinou s podobnými vlastnostmi, u které odborník se znalostmi v oboru peptidové chemie očekává, že sekundární struktura a hydropatická povaha polypeptidu se zásadně nezmění. Jak je popsáno výše, modifikaci lze provést ve struktuře polynukleotidů a polypeptidů podle tohoto vynálezu, při které se získá funkční molekula, která kóduje variantu nebo derivát polypeptidu s požadovanými vlastnostmi, např. s imunogenními vlastnostmi. Pokud je žádoucí změnit sekvenci aminokyselin polypeptidu proto, aby se vytvořila ekvivalentní nebo dokonce zlepšená imunogenní varianta nebo část polypeptidu podle tohoto vynálezu, odborník v oboru obvykle změní jeden nebo více kodónů kódující sekvence DNA podle tabulky 1.
Například určité aminokyseliny lze substituovat jinými aminokyselinami ve struktuře proteinu bez toho, aby se významně ztratila vazebná kapacita se strukturami, jako jsou antigen-vážící oblasti protilátek nebo vazebná místa na molekulách substrátu. Protože je to interaktivní kapacita a povaha proteinu, které definují biologickou funkční aktivitu proteinu, určité substituce v sekvenci aminokyselin lze provést v sekvenci proteinu a samozřejmě ve vlastní sekvenci kódující DNA a stejně získat protein s podobnými vlastnostmi. Takto se předpokládá, že lze provést různé změny v sekvencích peptidů popsaných prostředků nebo v příslušných sekvencích DNA, které kódují uvedené peptidy bez toho, aby došlo k významné ztrátě jejich biologické funkčnosti nebo aktivity.
φφφφ φφ «φφφ φφ φ «φ ·
• Φ · · · φφφ Φ • Φφφ φφ φ φφ φ
— 20 - • φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φ φφ φφ
Tab. 1
Aminokyseliny Kodóny
Alanin Ala A GCA GCC GCG GCU
Cystein Cys C UGC UGU
Kyselina asparagová Asp D GAC GAU
Kyselina glutamová Glu E GAA GAG
Fenylalanin Phe F UUC UUU
Glycin Gly G GGA GGC GGG GGU
Histidin His H CAC CAU
Isoleucin Ile I AUA AUC AUU
Lysin Lys K AAA AAG
Leucin Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Methionin Met M AUG
Asparagin Asn N AAC AAU
Prolin Pro P CCA CCC CCG CCU
Glutamin Gin Q CAA CAG
Arginin Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Serin Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Threonin Thr T ACA ACC ACG ACU
Valin Val V GUA GUC GUG GUU
Tryptofan Trp W UGG
Tyrosin Tyr Y UAC UAU
Při provádění takových změn je možno vzít do úvahy hydropatický index aminokyselin. Důležitost hydropatického indexu aminokyseliny pro zachování interaktivní biologické funkce proteinu se obecně uznává v oboru (Kyte a Doolittle, 1982, zahrnuto zde odkazem). Uznává se, že relativní hydropatický charakter aminokyseliny přispívá k sekundární struktuře výsledného proteinu, a tato struktura naopak určuje interakci proteinu s jinými molekulami, například
4444 *» 44*4 ·«*·
«·
4 4 4 *»
Μ »44 ·«« enzymy, substráty, receptory, DNA, protilátkami, antigeny a podobně. U každé aminokyseliny se určí hydropatický index na základě jejích vlastností hydrofobních a jejího náboje (Kyte a Doolittle, 1982). Tyto hodnoty jsou: isoleucin (+4,5), valin (+4,2), leucin (+3,8), fenylalanin (+2,8), cystein/cystin (+2,5), methionin (+1,9), alanin (+1,8), glycin (-0,4), threonin (-0,7), serin (-0,8), tryptofan (-0,9), tyrosin (-1,3), prolin (-1,6), histidin (-3,2), glutamát (-3,5), glutamin (-3,5), aspartát (-3,5), asparagin (-3,5), lysin (-3,9) a arginin (-4,5).
V oboru je známo, že určité aminokyseliny lze substituovat jinými aminokyselinami, které mají podobný hydropatický index nebo skóre a výsledkem této substituce může být protein s podobnou biologickou aktivitou, tedy získat biologický funkčně ekvivalentní protein. Při provádění takových změn je výhodná substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ±2, zvláště výhodná je substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ±1 a ještě výhodnější je substituce aminokyselin, jejichž hydropatické indexy jsou v rozmezí ±0,5. V oboru je rovněž známo, že substituce podobných aminokyselin může být provedena efektivně na základě hydrofility. US patent č. 4 554 101 (je zde specificky zahrnut ve své úplnosti) ukazuje, že nejvyšší místní průměrná hydrofilita proteinu, jak je dána hydrofilitou přilehlých aminokyselin, koreluje s biologickými vlastnostmi proteinu.
Jak je podrobně uvedeno v US patentu č. 4 554 101, pro zbytky aminokyselin jsou určeny následující hodnoty hydrofility: arginin (+3,0), lysin (+3,0), aspartát (+3,0 ± l), glutamát (+3,0 ± 1), serin (+0,3), asparagin (+0,2), • «»9 *9 «·«· ·· ·«··
glutamin (+0,2), glycin (0), threonin (-0,4), proline (-0,5 ±1), alanin (-0,5), histidin (-0,5), cystein (-1,0), methionin (-1,3), valin (-1,5), leucin (-1,8), isoleucin (-1,8), tyrosin (-2,3), fenylalanin (-2,5), tryptofan (-3,4). Je znáno, že aminokyselina může být substituována jinou aminokyselinou, která má podobnou hodnotu hydrofility a výsledkem této substituce může být protein biologicky ekvivalentní, zejména imunologicky ekvivalentní. Při provádění takových změn je výhodná substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rozmezí ±2, zvláště výhodná je substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rozmezí ±1 a ještě výhodnější je substituce aminokyselin, jejichž hodnoty hydrofility jsou v rozmezí ±0,5.
Jak je zdůrazněno výše, substituce aminokyselin je proto obecně založena na relativní podobnosti substituentů postranních řetězců aminokyselin, například jejich hydrofobnosti, hydrofilitě, náboji, velikosti a podobně. Příkladné substituce, při kterých se bere v potaz řada vlastností, jsou dobře známy odborníkovi v oboru a zahrnují: arginin a lysin, glutamát a aspartát, serin a threonin, glutamin a asparagin a valin, leucin a isoleucin.
Kromě toho mohou být polynukleotidy dále modifikovány, aby se zvýšila jejich stabilita in vivo. Možné modifikace zahrnují, ale nejsou omezeny na adici bočních sekvencí na 5' a/nebo 3' koncích, použití fosfothioátu nebo
2'-O-methylu spíše než fosfodiesterázových vazeb na základním řetěci a/nebo začlení netradičních baží, jako je inosin, kveosin a wybutosin, stejně jako acetyl-, methyl-, thio- a jiných modifikovaných forem adeninu, cytidinu, guaninu, thyminu a uridinu.
• ··»· ·♦ · • ·<·»
9 9 ··« ···
9 1
9 9
9 9
9 9
9
9999
9 * • ♦ * * 9 · · • · · · ' 99
Substituce aminokyselin lze dále provést na základě podobnosti v polaritě, náboji, rozpustnosti, hydrofobnosti, hydrofilitě a/nebo amfipatické povaze zbytků. Například aminokyseliny s negativním nábojem, zahrnující asparagovou kyselinu a glutamovou kyselinu; aminokyseliny s pozitivním nábojem, zahrnující lysin a arginin; a aminokyseliny s polárními skupinami bez náboje mají podobné hodnoty hydrofility, zahrnují leucin, isoleucin a valin; glycin a alanin; asparagin a glutamin; a serin, threonin, fenylalanin a tyrosin. Dalšími skupinami aminokyselin, u kterých lze provést konzervativní změny, zahrnují: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr, (2) cys, ser, tyr, thr, (3) val, ile, leu, met, ala, fen, (4) lys, arg, his a (5) fen, tyr, trp, his. Varianta může také, nebo popřípadě obsahovat nekonzervativní změny. Ve výhodném ztělesnění se liší varianta polypeptidů od přirozené sekvence substitucí, delecí nebo adicí pěti nebo méně aminokyselin. Varianty mohou také (nebo popřípadě) být modifikovány například delecí nebo adicí aminokyselin, která má minimální vliv na imunogenicitu, sekundární strukturu a hydropatickou povahu polypeptidů.
Jak je uvedeno výše, polypeptidy mohou zahrnovat signální (nebo vedoucí) sekvenci na N-konci proteinu, která ko-translačně nebo post-translačně řídí přenos proteinu. Polypeptid může být rovněž konjugován s linkerem nebo jinou sekvencí pro usnadnění syntézy, čištění nebo identifikace polypeptidů (například poly-His), nebo ke zvýšení vazby polypeptidů na pevný podklad. Například může být polypeptid konjugován s oblastí Fc imunoglobulinu.
Když se porovnávají sekvence polypeptidů, mají být dvě ·· ···· »· ··«· • ··»· '· · • ··· • 4» • ·
sekvence identické, pokud sekvence aminokyselin u dvou sekvencí je shodná, když se seřadí pro maximální shodu, jak je popsáno výše. Srovnání mezi dvěma sekvencemi se obvykle provádí porovnáváním sekvencí přes srovnávací okno, aby se identifikovaly a srovnaly místní regiony co do podobnosti sekvencí. Pojem srovnávací okno, jak je zde používán, se vztahuje k segmentu nejméně asi 20 sousedních pozicí, obvykle 30 až přibližně 75, 40 až přibližně 50, ve kterých lze sekvenci srovnávat s referenční sekvencí stejného počtu sousedních pozicí poté, co se dané dvě sekvence optimálně seřadí.
Optimální seřazení sekvencí pro srovnání lze provést za použití programu Megalign v Lasergene suitě bioinformatics software (DNASTAR, lne., Madison, WI) za použití defaultních parametrů. Tento program zahrnuje několik seřaďovacích schémat, které jsou popsány v těchto odkazech: Dayhoff M. 0., A Model of evolutionary change in proteins - Matrices for detecting distant relationships, v Dayhoff M. 0. (vyd.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, 5, dodatek 3, str. 345 - 358 (1987), Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, str. 626
- 645 (1990), Methods in Enzymology, 183, Academie Press, lne., San Diego, CA, Higgins D. G. a Sharp P. M. , CABIOS 5, 151 - 153 (1989), Myers E. W. a Muller W., CABIOS 4, 11
- 17 (1988), Robinson E. D. , Comb. Theor. 13., 105 (1971), Santou N., Nes M., Mol. Biol. Evol., 4, 406 - 425 (1987), Sneath P. H. A. a Sokal R. R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973), Wilbur W. J. a Lipman D.
J., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 726 - 730 (1983).
····
Popřípadě lze optimální seřazení sekvencí pro srovnání provést algoritmem místní identity podle Smitha a Watermana Add. APL. Math. 2, 482 (1981), algoritmem identity seřazení podle Needlemana a Wunsche, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), způsoby vyhledávání podobnosti podle Pearsona a Lipmana, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 2444 (1988) pomocí počítačových implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) nebo pomocí inspekce.
Jedním výhodným příkladem algoritmů, které jsou vhodné pro určení procentuální identity sekvencí a podobnosti sekvencí, jsou algoritmy BLAST a BLAST 2.0, které jsou popsány v Altschul a kol., Nucl. Acids Res. 25., 3389 - 3402 (1977) a Altschul a kol., J. Mol. Biol. 215, 403 - 410 (1990). BLAST a BLAST 2.0 lze například použít s parametry zde popsanými, aby se určila procentuální identita sekvencí u polynukleotidů a polypeptidů podle tohoto vynálezu. Software pro provedení analýz BLAST je veřejně dostupný prostřednictvím National Center for Biotechnology Information. Pro sekvence aminokyselin lze použít skórovací matice pro výpočet kumulativního skóre. Rozšiřování správného řešení v každém směru se zastaví, když znaménko kumulativního seskupení podle počtu X klesne ze své maximálně dosažené hodnoty, nebo když znaménko kumulativního seskupení se blíží nule nebo klesne do záporných hodnot v důsledku nahromadění jedné nebo více takových zbytkových komponent, které posouvají kumulativní znaménko do záporných hodnot nebo se dosáhne konec každé ze sekvencí. Algoritmus BLAST parametrů W, T, a X určuje citlivost a rychlost procesu seskupování.
» · · · k
» ··
V jednom výhodném přístupu se procento identity sekvencí určí porovnáním dvou popřípadě seřazených sekvencí přes srovnávací okno nejméně 20 pozicí, ve kterých část sekvence polypeptidu ve srovnávacím oknu může zahrnovat adice nebo delece (tedy rozdíly) 20 % nebo méně, obvykle 5 až 15 %, nebo 10 až 12 % ve srovnání s referenčními sekvencemi (které nezahrnují adice nebo delece) pro optimální seřazení dvou sekvencí. Procentuální podíl se vypočítá určením počtu pozicí, na kterých se vyskytuje identický zbytek aminokyseliny v obou sekvencích, aby se dostal počet odpovídajících pozicí a vydělením počtu odpovídajících pozicí celkovým počtem pozicí u referenční sekvence (tedy velikostí okna) a vynásobením těchto výsledků číslem 100, aby se dostalo procento identity sekvencí.
V jiném ilustrativním ztělesnění může polypeptidem být fuzní polypeptid, který zahrnuje mnohočetné polypeptidy, jak je zde popsáno, nebo které zahrnují nejméně jeden polypeptid, jak je popsáno zde a nesouvisející sekvenci, jako je známý protein tumoru. Fuzní protějšek může například pomáhat při získávání T-helperových epitopů (imunologický fuzní protějšek), výhodně T-helperových epitopů rozpoznaných lidskými buňkami, nebo může pomáhat při expresi proteinu (zesilovač exprese) s větším výtěžkem než u nativního rekombinantního proteinu. Určité výhodné fuzní protějšky jsou fuzní protějšky, které zvyšují jak imunologické vlastnosti, tak expresi. Další fuzní protějšky lze zvolit tak, aby se zvýšila rozpustnost polypeptidu nebo se umožnilo to, aby byl polypeptid zacílen do požadovaných buněčných kompartmentů. Další fuzní protějšky zahrnují afinitní smyčky, které usnadňují čištění polypeptidu.
Fuzní polypeptidy mohou být obecně připraveny za • ·· · • · • · · · • · · · · · · • · · · · · · · · • «-· · použití standardních způsobů včetně chemické konjugace.
Fuzní polypeptid je výhodně exprimován jako rekombinantní polypeptid, což umožňuje produkci vyšších hladin ve srovnání s nefuzním polypeptidem, v systému exprimace. Ve zkratce, sekvence DNA kódující polypeptidové komponenty lze shromáždit odděleně a ligovat do vhodného expresního vektoru. 3'-konec sekvence DNA kódující jednu polypeptidovou komponentu se podrobí ligaci, s nebo bez peptidového linkeru, k 5'-konci sekvence DNA kódující druhou polypeptidovou komponentu tak, že čtecí rámce sekvencí jsou ve fázi. To umožní translaci na jednoduchý fuzní polypeptid, který si ponechá biologickou aktivitu obou komponent polypeptidů.
Sekvence peptidového linkeru může být použita k oddělení první a druhé polypeptidové komponenty ve vzdálenosti dostatečné k tomu, aby se zajistilo, že se u každého polypeptidů vytvoří jeho sekundární a terciární struktury. Taková sekvence linkerového polypeptidů se začlení do fuzního polypeptidů za použití standardních způsobů dobře známých v oboru. Vhodné sekvence peptidového linkeru lze zvolit na základě těchto faktorů: (1) jejich schopnosti přijmout flexibilně rozšířenou konformaci, (2) jejich neschopnosti přijmout sekundární strukturu, která by mohla interagovat s funkčními epitopy na prvním a druhém polypeptidů a (3) absence hydrofobních nebo nabitých zbytků, které by mohly reagovat s polypeptidovými funkčími epitopy. Výhodné sekvence peptidového linkeru obsahují Gly, Asn a Ser zbytky. Jiné blízké neutrální aminokyseliny, jako je Thr a Ala lze rovněž použít v sekvenci linkeru. Sekvence aminokyselin, které lze výhodně použít jako linkery, zahrnují ty sekvence, které popsal Maratea a kol., Gene 40, 39 - 46 (1985), Murphy a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA • ·· · ·· ·« • · • ·
83. 8258 - 8262 (1986), US patent č. 4 935 233 a US patent č. 4 751 180. Sekvence linkeru může být obecně o délce od 1 do asi 50 aminokyselin. Sekvence linkerů se nepožadují tehdy, když první a druhý polypeptid mají neesenciální N-koncové aminokyselinové regiony, které lze použít k separaci funkčních domén a k zabránění sterické interference.
Ligované sekvence DNA se operativně spojí s vhodnými elementy regulace transkripce nebo translace. Regulační elementy odpovídající za expresi DNA jsou lokalizovány pouze na 5'-konci sekvence DNA kódující první polypeptidy. Podobně stop kodóny nutné k ukončení terminálních signálů translace a transkripce jsou přítomny pouze na 3'-konci sekvence DNA kódující druhý polypeptid.
Fuzní polypeptid může zahrnovat polypeptid zde popsaný spolu s nesouvisejícím imunogenním proteinem, jako je imunogenní protein schopný vyvolat zpětnou reakci. Příklady takových proteinů zahrnují proteiny tetanu, tuberkulózy a hepatitidy (viz například Stoute a kol., New Engl. J. Med., 336, 86 - 91 (1997)).
V jednom výhodném ztělesnění imunologický fuzní protějšek je odvozen z rodu Mycobacterium, jako je Mycobacerium tuberculosis-odvozený Ral2 fragment. Ral2 prostředky a způsoby pro jejich použití ke zvýšení exprese a/nebo imunogenicity heterologních polynukleotidových / polypeptidových sekvencí jsou popsány v US patentové přihlášce 60/158585, jejíž poznatky jsou zde zahrnuty v úplnosti odkazem. Uvedeno v krátkosti, Ral2 se vztahuje na polynukleotidový region, který je subsekvencí nukleových kyselin Mycobacterium tuberculosis MTB32A. MTB32A je • · · · • · · · · · • · · · •·· · · · serinová proteasa o molekulové hmotnosti 32 kDa, kódovaná genem u virulentních a avirulentních kmenů M. tuberculosis. Sekvence nukleotidů a aminokyselin MTB32A je popsána (např. US patentová přihláška 60/158585, viz také Skeiky a kol., Infection and Immun. 67, 3998 - 4007 (1999), zahrnuté zde odkazem). C-koncové fragmenty MTB32A kódující sekvence exprimují ve vysokých hladinách a zůstávají jako rozpustné polypeptidy během čistících postupů. Navíc může Ral2 zvýšit imunogenicitu heterologních imunogenních polypeptidů se kterými je fúzován. Jeden výhodný Ral2 fuzní polypeptid zahrnuje 14 kDa C-koncový fragment odpovídající reziduím aminokyselin 192 až 323 MTB32A. Jiné výhodné Ral2 polynukleotidy obecně zahrnují nejméně 15 po sobě jdoucích nukleotidů, nejméně asi 30 nukleotidů, nejméně asi 60 nukleotidů, nejméně asi 100 nukleotidů, nejméně asi 200 nukleotidů nebo nejméně asi 300 nukleotidů, které kódují část polypeptidů Ral2. Polynukleotidy Ral2 mohou zahrnovat nativní sekvenci (t. j. endogenní sekvenci, která kóduje polypeptid Ral2 nebo jeho část) nebo mohou zahrnovat variantu takové sekvence. Varianty polynukleotidu Ral2 mohou obsahovat jednu nebo více substitucí, adicí, delecí a/nebo inzercí, tak aby biologická aktivita příslušného kódovaného fuzního polypeptidů nebyla podstatně snížena, vztaženo k fuznímu polypeptidů zahrnujícímu nativní polypeptid Ral2. Varianty výhodně vykazují nejméně asi 70% identitu, výhodněji nejméně asi 80% identitu a velmi výhodně nejméně asi 90% identitu s polynukleotidovou sekvencí, která kóduje nativní polypeptid Ral2 nebo jeho část.
V rámci dalších výhodných ztělesnění je imunologický fuzní protějšek odvozen od proteinu D, povrchového proteinu gramnegativní bakterie Haemophilus influenzae B (WO 91/18926). Výhodně zahrnuje derivát proteinu D přibližně
- 3® • · • · · ·
první třetinu proteinu (např. prvních 100 až 110 aminokyselin od N-konce) a protein D může být lipidován. V rámci určitých výhodných ztělesnění je prvních 109 zbytků fuzního protějšku lipoproteinu D začleněno na N-konci, aby se získal polypeptid s dalšími exogenními T-buněčnými epitopy a zvýšila se hladina exprese u E. coli (takto působící jako zvětšovač exprese). Lipidový konec zajištuje optimální prezentaci antigenu u antigen prezentujících buněk. Jiné fuzní protějšky zahrnují nestrukturní proteiny z viru influenzy, NS1 (hemaglutinin). Typicky se používá 81 aminokyselin z N-konce, ačkoli lze použít rozličné fragmenty, které zahrnují T-helperové epitopy.
V jiném ztělesnění je imunologickým fuzním protějškem protein známý jako LYTA nebo jeho část (výhodně C-koncová část). LYTA je odvozen od Streptococcus pneumoniae, který syntetizuje N-acetyl-L-alaninovou amidasu, známou jako amidasa LYTA (kódovaná genem LytA, Gene 43 , 265 - 292 (1986)). LYTA je autolysin, který specificky degraduje určité vazby v peptidoglykanovém základním řetězci.
C-koncová doména proteinu LYTA odpovídá za afinitu k cholinu nebo k některým analogům cholinu, jako je DEAE. Tato vlastnost je využita při vývoji E. coli C-LYTA expresujících plasmidů využívaných k expresi fuzních proteinů. Je popsáno čištění hybridních proteinů obsahujících fragment C-LYTA na aminovém konci (viz Biotechnology 10, 795 - 798 (1992)).
V rámci výhodného ztělesnění může být opakovaná část LYTA začleněna do fuzního polypeptidu. Opakovanou část lze nalézt na C-koncovém regionu s počátkem od zbytku 178. Zvláště výhodná opakovaná část zahrnuje zbytky 188 - 305.
Další ilustrativní ztělesnění zahrnuje fuzní polypeptidy a polynukleotidy, které je kódují, ve kterých ··»·
3ϊ·· «-*· fuzní protějšek zahrnuje cílový signál schopný zaměřit polypeptid k endozomálnímu/lysozomálnímu kompartmentu, jak popisuje US patent č. 5 633 234. Imunogenní polypeptid podle tohoto vynálezu, když je fúzován s cílovým signálem, se spojí efektivněji s molekulami MHC třídy II a tak způsobí zvýšenou stimulaci CD4+ T-buněk in vivo specifickou pro tento polypeptid.
Polypeptidy podle tohoto vynálezu lze připravit za použití řady dobře známých syntetických a/nebo rekombinantních způsobů, z nichž rekombinantní jsou popsány dále. Polypeptidy, části a další varianty s obecně méně než přibližně 150 aminokyselinami lze vytvořit syntetickými prostředky za použití způsobů dobře známých odborníkovi v oboru. V jednom ilustrativním příkladě se takové polypeptidy syntetizují jakýmikoli komerčně dostupnými způsoby v pevné fázi, jako je Merrifieldův způsob syntézy v pevné fázi, ve kterém se aminokyseliny sekvenčně přidávají k rostoucímu aminokyselinovému řetězci. Viz Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 - 2146 (1963). Vybavení pro automatizovanou syntézu polypeptidů je komerčně dostupné od dodavatelů, jako je Perkin Elmer/Applied BioSystems Division (Foster City, CA) a lze s ním zacházet podle pokynů výrobce.
Obecně řečeno jsou polypeptidové prostředky (včetně fuzních polypeptidů) podle tohoto vynálezu izolované. Izolovaný polypeptid je polypeptid, který je přemístěn ze svého původního prostředí. Například přirozeně se vyskytující protein nebo polypeptid je izolován, pokud je separován od některých nebo všech souběžně existujících materiálů v přirozeném systému. Výhodně jsou takové polypeptidy rovněž čištěny, například jsou nejméně přibližně • · · · ·4·4 • · · ·
2···*·
90% čisté, výhodněji nejméně přibližně 95% čisté a velmi výhodně nejméně přibližně 99% čisté.
Polynukleotidové prostředky
Tento vynález v dalších aspektech poskytuje polynukleotidové prostředky. Pojmy DNA a polynukleotid se zde používají zásadně jako záměnné a vztahují se na molekulu DNA, která byla izolována z celkové genomické DNA určitého druhu. Pojem izolovaná zde znamená, že polynukleotid je zásadně odloučen od ostatních kódujících sekvencí a že molekula DNA neobsahuje velké části nesouvisející kódující DNA, jako jsou velké chromozomální fragmenty nebo jiné funkční geny nebo regiony kódující polypeptidy. Samozřejmě se tento pojem vztahuje na molekulu DNA jako původně izolovanou a nevylučuje geny nebo kódující regiony později přidané do segmentu lidskou rukou.
Jak je známo odborníkovi v oboru, polypeptidové prostředky podle tohoto vynálezu mohou zahrnovat genomické sekvence, extra-genomické a plasmidy-kódující sekvence a menší genovým inženýrstvím vytvořené genové segmenty, které exprimují nebo mohou být adaptovány na expresi proteinů, polypeptidů, peptidů a podobně. Takové segmenty mohou být přirozeně izolované nebo modifikované synteticky lidskou rukou.
Jak je známo odborníkovi v oboru, polynukleotidy podle tohoto vynálezu mohou být jednovláknové (kódujcí nebo negativní) nebo dvouvláknové a mohou to být molekuly DNA (genomické, cDNA nebo syntetické) nebo RNA. Molekuly RNA mohou zahrnovat molekuly HnRNA, které obsahují introny a odpovídají molekule DNA se vzájemně odpovídajícími zbytky
0000 00 0*0 00
0 0 0 0 0
0 0 a molekuly mRNA, které neobsahují introny. Další kódující nebo nekódující sekvence mohou, ale nemusí být přítomny v rámci polynukleotidu podle tohoto vynálezu a polynukleotid může, ale nemusí být spojen s jinými molekulami a/nebo podpůrnými materiály.
Polynukleotidy mohou zahrnovat nativní sekvenci (t.j. endogenní sekvenci, která kóduje polypeptid/protein podle tohoto vynálezu nebo jeho část) nebo může zahrnovat sekvenci, která kóduje variantu nebo derivát, výhodně imunogenní variantu nebo derivát takové sekvence.
Proto jsou podle dalšího aspektu tohoto vynálezu poskytnuty polynukleotidové prostředky, které zahrnují některé nebo všechny sekvence polynukleotidu uvedené v kterékoli ze sekvencí v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, komplementy sekvence polynukleotidů uvedených v kterékoli ze sekvencí V SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 a degenerativní varianty sekvence polynukleotidů uvedených v kterékoli ze sekvencí V SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330. V určitých výhodných ztělesněních kódují sekvence polynukleotidů zde uvedené imunogenní polypeptidy, jak je popsáno výše.
V jiných souvisejících ztělesněních tento vynález poskytuje polynukleotidové varianty, které mají zásadní identitu se sekvencemi popsanými zde v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, například ty sekvence, které mají nejméně 70% identitu sekvence, výhodně nejméně 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% nebo 99% nebo větší identitu sekvence ve »··· * ·4 4 srovnání se sekvencí polynukleotidů podle tohoto vynálezu za použití způsobů zde popsaných (např. analýzy BLAST za použití standardních parametrů, jak je popsáno dále). Odborník v oboru pozná, že tyto hodnoty mohou být přibližně upraveny, aby se určila odpovídající identita proteinů kódovaných dvěmi nukleotidovými sekvencemi, přičemž se vezme v úvahu degenerace kodónu, podobnost aminokyselin, pozice čtecího rámce a podobně.
Polynukleotidové varianty obvykle obsahují jednu nebo více substitucí, adicí, delecí a/nebo inzercí, výhodně tak, aby imunogenicita polypeptidu kódovaného danou polynukleotidovou variantou nebyla podstatně snížena vzhledem k polypeptidu kódovaného sekvencí polynukleotidů specificky zde uvedenou. Pod pojem varianty je nutno rovněž zahrnout homologní geny xenogenního původu.
V dalších ztělesněních tento vynález poskytuje polynukleotidové fragmenty zahrnující různé délky sousedících úseků sekvence identické s nebo komplementární k jedné nebo více sekvencím zde popsaným. Například jsou tímto vynálezem poskytnuty polynukleotidy, které obsahují nejméně přibližně 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150,
200, 300, 400, 500 nebo 1000 nebo více sousedících nukleotidů z jedné nebo více sekvencí zde popsaných stejně jako mezilehlé délky mezi těmito hodnotami. V tomto kontextu znamená pojem mezilehlé délky jakoukoli délku mezi uvedenými hodnotami, jako je 16, 17, 18, 19 atd., 21, 22,
23, atd., 30, 31, 32 atd., 50, 51, 52, 53, atd., 100, 101, 102, 103 atd., 150, 151, 152, 153 atd. včetně všech celých čísel mezi 200 až 500, 500 až 1000 a podobně.
V dalším ztělesnění jsou poskytnuty polynukleotidové • · A · ··· • W' prostředky, které jsou schopné hybridizace za středně až vysoce přísných podmínek na sekvenci polynukleotidů zde poskytnutou nebo její fragment nebo její komplementární sekvenci. Způsoby hybridizace jsou dobře známé v oboru molekulární biologie. Pro účely ilustrace vhodné středně přísné podmínky pro testování hybridizace polynukleotidů podle tohoto vynálezu s jinými polynukleotidy zahrnují předběžné promytí v roztoku 5 X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0), hybridizaci při 50 °C až 60 °C, 5 X SSC přes noc, následuje dvakrát promytí při 65 °C po dobu 20 minut vždy 2 X, 0,5Xa0,2X SSC s obsahem 0,1% SDS. Odborníkovi v oboru je známo, že podmínky přísnosti hybridizace lze přímo měnit, jako například změnou obsahu solí v hybridizačním roztoku a/nebo teploty, při které se hybridizace provádí. Například při jiném ztělesnění zahrnují vhodné vysoce přísné podmínky hybridizace ty podmínky, které jsou popsány výše, s tím rozdílem, že se zvýší teplota hybridizace, například na 60 až 65 °C nebo na 65 až 70 °C.
V určitých výhodných ztělesněních polynukleotidy popsané výše zahrnují například polynukleotidové varianty, fragmenty a hybridizující sekvence kódují polypeptidy, které jsou imunologicky zkříženě reaktivní se sekvencí polypeptidů specificky zde uvedenou. V jiných výhodných ztělesněních takové polynukleotidy kódují polypeptidy, které mají úroveň imunogenní aktivity nejméně přibližně 50%, výhodně nejméně přibližně 70% a výhodněji nejméně přibližně 90% ve srovnání s hodnotou pro polypeptidovou sekvenci zde specificky uvedenou.
Polynukleotidy podle tohoto vynálezu nebo jejich fragmenty, bez ohledu na délku jejich kódující sekvence, mohou být kombinovány s jinými sekvencemi DNA, jako jsou • · · · *· ···· ·· · * · ·
- 3 6» promotory, signály polyadenylace, místa enzymu adiční restrikce, místa vícečetného klonování, jiné kódující segmenty a podobně, takže jejich celková délka se může podstatně lišit. Proto se předpokládá, že lze použít fragment nukleových kyselin o téměř jakékoli délce s celkovou délkou, která je výhodně limitována pro usnadnění přípravy a použití v zamýšleném protokolu rekombinantní DNA. Například se předpokládá, že ilustrativní segmenty polynukleotidů o celkové délce přibližně 10000, přibližně 5000, přibližně 3000, přibližně 2000, přibližně 1000, přibližně 500, přibližně 200, přibližně 100, přibližně 50 párů baží a podobně (včetně všech délek meziproduktů) mohou být využity v mnoha provedeních tohoto vynálezu.
Když se porovnávají sekvence polynukleotidů, jsou dvě sekvence identické, jestliže sekvence nukleotidů u dvou sekvencí jsou stejné, když jsou seřazeny tak, aby si maximálně odpovídaly, jak je popsáno dále. Srovnání mezi dvěma sekvencemi se obvykle provádí porovnáváním sekvencí přes srovnávací okno, aby se identifikovaly a srovnaly místní regiony co do podobnosti sekvencí. Pojem srovnávací okno je zde používán ve významu segmentu nejméně asi 20 sousedních pozicí, obvykle 30 až přibližně 75, 40 až přibližně 50, ve kterých lze sekvenci srovnávat s referenční sekvencí stejného počtu sousedních pozicí poté, co se dané dvě sekvence optimálně seřadí.
Optimální seřazení sekvencí pro srovnání lze provést za použití programu Megalign v Lasergene suitě bioinformatics software (DNASTAR, lne., Madison, WI) za použití defaultních parametrů. Tento program vyjadřuje několik seřaďovacích schémat, které jsou popsány v těchto odkazech: Dayhoff M. 0., A model of evolutionary change in • · ·· · • · « • 999 • ♦ ·
37··· ♦·· ·· ···· • · « ♦ · 9 • · · · · 9 · ♦ · ·
9999
9 9
9 9
9 9 9 • · ♦ 9
99 proteins - Matrices for detecting distant relationships, v Dayhoff M. O. (vyd.), Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, 5, dodatek 3, str. 345 - 358 (1987), Hein J., Unified Approach to Alignment and Phylogenes, str. 626 645 (1990), Methods in Enzymology, 183, Academie Press, lne., San Diego, CA, Higgins D. G. a Sharp P. M. , CABIOS 5, 151 - 153 (1989), Myers E. W. a Muller W., CABIOS 4, 11 - 17 (1988), Robinson E. D., Comb. Theor. 11, 105 (1971), Santou N., Nes M. , Mol. Biol. Evol., 4, 406 - 425 (1987), Sneath P.
H. A. a Sokal R. R., Numerical Taxonomy - the Principles and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA (1973), Wilbur W. J. a Lipman D. J., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80, 726 - 730 (1983).
Popřípadě lze optimální seřazení sekvencí pro srovnání provést algoritmem místní identity podle Smitha a Watermana, Add. APL. Math. 2, 482 (1981), algoritmem identity seřazení podle Needlemana a Wunsche, J. Mol. Biol. 48, 443 (1970), způsoby vyhledávání podobnosti podle Pearsona a Lipmana, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 2444 (1988) pomocí počítačových implementací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA a TFASTA ve Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) nebo pomocí inspekce.
Jedním výhodným příkladem algoritmů, které jsou vhodné pro určení procentuální identity sekvencí a podobnosti sekvencí, jsou algoritmy BLAST a BLAST 2.0, které jsou popsány podle pořadí v Altschul a kol., Nucl. Acids Res.
25, 3389 - 3402 (1990) a Altschul a kol., J. Mol. Biol.
215. 403 - 410 (1990). BLAST a BLAST 2.0 lze například použít s parametry zde popsanými, aby se určila procentuální • »··· ΦΦ Φ • ·♦· • φ
38···*··* • · · · φ · • · · φ φ Φ ·· 9 9 9 9 9 ·· · ΦΦ ΦΦ ·· φφφφ
ΦΦ 999 · identita sekvencí u polynukleotidů podle tohoto vynálezu. Software pro provedení analýz BLAST je veřejně dostupný prostřednictvím National Center for Biotechnology Information. V jednom ilustrativním příkladu lze kumulativní skóre počítat pro sekvence nukleotidů za použití parametrů M (reward skóre pro pár vzájemně si odpovídajících zbytků, vždy větší než 0) a N (penalty skóre pro vzájemně si neodpovídající zbytky, vždy menší než 0). Rozšiřování správného řešení v každém směru se zastaví, když znaménko kumulativního seskupení podle počtu X klesne ze své maximálně dosažené hodnoty, nebo když znaménko kumulativního seskupení se blíží nule nebo klesne do záporných hodnot v důsledku nahromadění jedné nebo více takových zbytkových komponent, které posouvají kumulativní znaménko do záporných hodnot nebo se dosáhne konec každé ze sekvencí. Algoritmus BLAST parametrů W, T, a X určuje citlivost a rychlost procesu seskupování. Program BLASTN (pro sekvence nukleotidů) považuje za nedodržení podmínek, když délka vzorce W dosáhne hodnoty 11 a očekávání (E) hodnoty 10 a znaménko matice BLOSUM62 (viz Henikoff a Henikoff, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89, 10915 (1985)) seskupení (B) hodnoty 50 a očekávání (E) hodnoty 10, M = 5, N = -4 a porovnání obou vláken.
Výhodně se procento identity sekvencí určí porovnáním dvou popřípadě seřazených sekvencí přes srovnávací okno nejméně 20 pozicí, ve kterých část sekvence polynukleotidu ve srovnávacím oknu může zahrnovat adice nebo delece (t. j. rozdíly) 20 % nebo méně, obvykle 5 až 15 %, nebo 10 až 12 % ve srovnání s referenčními sekvencemi (které nezahrnují adice nebo delece) pro optimální seřazení dvou sekvencí. Procentuální podíl se vypočítá určením počtu pozicí, na kterých se vyskytuje identická baze nukleové ♦ 444· ·* 4
4
4
kyseliny v obou sekvencích, aby se dostal počet odpovídajících pozicí a vydělením počtu odpovídajících pozicí celkovým počtem pozicí u referenční sekvence (tedy velikostí okna) a vynásobením těchto výsledků číslem 100, aby se dostalo procento identity sekvencí.
Odborník v oboru ocení, že v důsledku degenerace genetického kódu existuje mnoho sekvencí nukleotidů, které kódují polypeptid, jak je zde popsáno. Některé z těchto polynukleotidů nesou minimální homologii se sekvencí nukleotidů jakéhokoli nativního genu. Nicméně polynukleotidy, které se liší v důsledku rozdílů v použití kodónu jsou specificky zamýšleny tímto vynálezem. Dále jsou v rozsahu tohoto vynálezu alely genů zahrnující sekvence polynukleotidů zde poskytnutých. Alely jsou endogenní geny, které jsou změněny v důsledku jedné nebo více mutací, jako jsou delece, adice a/nebo substituce nukleotidů. Výsledná mRNA a protein mohou, ale nemusí, mít změněnou strukturu nebo funkci. Alely lze identifikovat za použití standardních způsobů (jako je hybridizace, amplifikace a/nebo porovnání databáze sekvencí).
Proto v dalším ztělesnění tohoto vynálezu se používá postup mutageneze, jako je místně specifická mutageneze, pro přípravu imunogenních variant a/nebo derivátů polypeptidů zde popsaných. Tímto postupem lze připravit specifické modifikace sekvence polypeptidů pomocí mutageneze základních polynukleotidů, které je kódují. Tyto způsoby představují přímý postup pro přípravu a testování variant sekvence, například začlenění jedné nebo více dříve zmíněných úvah tím, že se provede jedna nebo více změn sekvence nukleotidů v polynukleotidů.
• *··· ·· *»»· ♦ · ····
• · « ♦ • · · · · • · · « » • ·· ·*
Místně specifická mutageneze umožňuje tvorbu mutantů prostřednictvím použití specifických oligonukleotidových sekvencí, které kódují sekvenci DNA požadované mutace, stejně jako dostatečný počet sousedících nukleotidů, aby se získala sekvence primeru o dostatečné velikosti a komplexnosti sekvence, aby se vytvořil stabilní duplex na obou stranách příčného spojení delece. Mutace lze využít u vybrané sekvence polynukleotidů ke zlepšení, změně, snížení, modifikaci nebo jiné změně vlastností samotného polynukleotidů a/nebo změně vlastností, aktivity, složení, stability nebo primární sekvence kódovaného polypeptidů.
V určitém ztělesnění tohoto vynálezu původci zamýšlejí mutagenezi popsaných sekvencí polynukleotidů, aby se změnila jedna nebo více vlastností kódovaného polypeptidů, jako je imunogenicita polypeptidové vakcíny. Způsoby místně specifické mutageneze jsou dobře známé v oboru a široce se používají pro vytvoření variant jak polypeptidů, tak polynukleotidů. Například je místně specifická mutageneze často používaná, aby se změnila specifická část molekuly DNA. V takových ztělesněních se používá primer s délkou obvykle zahrnující přibližně 14 až přibližně 25 nukleotidů nebo podobně s přibližně 5 až přibližně 10 zbytky na obou stranách spojení sekvence, která se změnila.
Odborník v oboru porozumí tomu, že způsoby místně specifické mutageneze často využívají fágový vektor, který existuje jak v jednovláknové, tak dvouvláknové formě.
Typické vektory použitelné v místně zaměřené mutagenezi zahrnují vektory, jako je fág Ml3. Tyto fágy jsou přímo komerčně dostupné a jejich použití je obecně dobře známé odborníkovi v oboru. Dvouvláknové plasmidy se rovněž rutinně používají v místně zaměřené mutagenezi, která eliminuje krok ,·!· • 999
9999 • 4 • 1 • · · 9 99
41*··-* • · 9 ♦ 9 ·
9 9
9 9 9
99 přenosu genu, který je předmětem zájmu, z plasmidu do fágu.
Celkově řečeno, místně zaměřená mutageneze souladu s tímto vynálezem se provede nejdříve získáním jednovláknového vektoru nebo oddělením dvou vláken dvouvláknového vektoru, který v rámci své sekvence zahrnuje sekvenci DNA, která kóduje požadovaný peptid. Oligonukleotidový primer, který nese požadovanou mutovanou sekvenci, se připraví obecně synteticky. Tento primer se potom zesílí jednovláknovým vektorem a podrobí se působení DNA polymerizujících enzymů, jako je Klenowův fragment polymerasy I E. coli, aby se zkompletovala syntéza vlákna, které nese mutaci. Takto se vytvoří heteroduplex, ve kterém jedno vlákno kóduje původní nemutovanou sekvenci a druhé vlákno nese požadovanou mutaci. Tento heteroduplexní vektor se potom použije, aby transformoval vhodné buňky, jako jsou buňky E. coli a selektují se klony, které zahrnují rekombinantní vektory nesoucí uspořádání mutované sekvence.
Příprava variant sekvence zvolených segmentů DNA kódujících peptid za použití místně zaměřené mutageneze představuje způsob produkce potenciálně užitečných druhů a není zamýšlena jako omezující, protože existují další způsoby, kterými lze získat varianty sekvencí peptidu a sekvence DNA je kódující. Například rekombinantní vektory kódující požadovanou sekvenci peptidu lze vystavit působení mutagenních látek, jako je hydroxylamin, aby se získaly varianty sekvence. Specifické podrobnosti o těchto způsobech a protokoly lze pro tento účel nalézt v učebnicích Maloy a kol., 1994, Segal, 1976, Prokop a Bajpai, 1991, Kuby,
1994 a Maniatis a kol., 1982, každá z nich je zde začleněna odkazem.
• Φ ·*.·*
- 42*
4·· • 44 • · φ • < · • » 4 • · · 4 ·· 44
Pojem způsob mutageneze zaměřené na oligonukleotid, jak se zde používá, se vztahuje na způsoby závislé na templátech a propagaci zprostředkovanou vektorem, jejichž výsledkem je zvýšení koncentrace specifické molekuly nukleových kyselin ve srovnání s její počáteční koncentrací nebo zvýšení koncentrace detekovatelného signálu, jako je amplifikace. Pojem způsob mutageneze zaměřené na oligonukleotid, jak se zde používá, se vztahuje na způsoby, které zahrnují zvětšení molekuly primeru závislé na templátech. Pojem způsoby závislé na templátech, jak se zde používá, se vztahuje na syntézu nukleové kyseliny molekuly RNA nebo DNA, ve které je sekvence nově syntetizovaného vlákna nukleových kyselin určována dobře známými pravidly párování komplementárních baží (viz například Watson,
1987). Typicky zahrnují vektorem zprostředkované způsoby zavedení fragmentu nukleových kyselin do vektoru DNA nebo RNA, klonální amplifikaci vektoru a obnovu amplifikovaného fragmentu nukleových kyselin. Příklady takových způsobů jsou poskytnuty v US patentu č. 4 237 224, který je zde začleněn odkazem v úplném znění.
V jiném postupu pro tvorbu variant polypeptidů podle tohoto vynálezu lze využít rekurzivní sekvenční rekombinaci, jak je popsána v US patentu č. 5 837 458. V tomto postupu se provádějí opakované cykly rekombinace a screeningu nebo selekce, aby se vyvinuly individuální varianty polynukleotidu podle tohoto vynálezu, které mají například zvýšenou imunogenní aktivitu.
V jiných ztělesněních tohoto vynálezu lze výhodně použít sekvence polynukleotidu zde poskytnuté jako sondy nebo primery pro hybridizaci nukleových kyselin. Tak se předpokládá, že velké využití najdou segmenty nukleových ♦ ·*·· <·»·
ft kyselin, které zahrnují sekvenční region se sekvencí o délce nejméně přibližně 15 sousedících nukleotidů, která má stejnou sekvenci nebo je komplementární k sekvenci o délce nejméně přibližně 15 sousedících nukleotidů, popsané zde. Delší sousedící identické nebo komplementární sekvence, například ty sekvence s přibližně 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 nukleotidy (včetně všech mezilehlých délek) a dokonce až do plné délky sekvencí lze rovněž použít v určitých ztělesněních.
Schopnost takových sond nukleových kyselin specificky hybridizovat na požadovanou sekvenci umožňuje, aby se použily při detekci přítomnosti komplementárních sekvencí v daném vzorku. Nicméně se předvídají další použití, jako je použití informace v sekvenci pro přípravu mutantních druhových primerů nebo primerů pro použití při přípravě jiných genetických konstrukcí.
Molekuly polynukleotidů, které mají regiony sekvencí sestávající z vláken sousedících nukleotidů s 10 až 14, 15 až 20, 30, 50, nebo dokonce 100 až 200 nukleotidy (včetně mezilehlých délek), identických nebo komplementárních k sekvenci polynukleotidů zde popsané, jsou zejména zamýšleny jako hybridizačni sondy, například v Southern a northern blotting. To umožní, aby se analyzoval genový produkt nebo jeho fragment, jak v rozmanitých typech buněk, tak také v různých bakteriálních buňkách. Celková velikost fragmentu, stejně jako velikost komplementárního vlákna (vláken), závisí zásadně na zamýšleném použití nebo podání příslušného segmentu nukleových kyselin. Menší fragmenty zásadně nacházejí použití v hybridizačních ztělesněních, ve kterých může být měněna délka sousedícího komplementárního regionu, jako je mezi přibližně 15 a přibližně 100 nukleotidy, ale *0 ···«· • ···· ·· · • ··· • · • · • · · · · • · · ·
44·*· ·.·· ·· • 0 *· 9
9 9
9 9 9 • 9 9 9
99 ·*·· lze rovněž použít větší vlákna sousedící komplementarity, podle délky komplementárních sekvencí, které je potřeba detekovat.
Použití hybridizační sondy o délce přibližně 15 až 25 nukleotidů umožňuje vytvoření duplexní molekuly, která je jak stabilní, tak selektivní. Molekuly, které mají sousedící komplementární sekvence přes vlákna větší než 15 baží na délku jsou obecně výhodné, aby se zvýšila stabilita a selektvita hybridu, a tím se zlepšila kvalita a stupeň specificity získaných hybridních molekul. Obecně se preferuje navržení molekul nukleových kyselin, které mají genově-komplementární vlákna o 15 až 25 sousedících nukleotidech nebo dokonce delších, pokud je to žádoucí.
Hybridizační sondy mohou být selektovány z kterékoli části kterékoli sekvence zde popsané. Vše, co je nutné, je zopakovat sekvence zde uvedené nebo kteroukoli souvislou část těchto sekvencí od délky přibližně 15 až 25 nukleotidů výše včetně sekvence o plné délce podle požadavku na využití sekvence jako sondy nebo primeru. Volba sekvence sondy nebo primeru může záviset na různých faktorech. Například může být žádoucí využít primery na koncích celkové sekvence.
Malé segmenty nebo fragmenty polynukleotidu lze přímo připravit například přímou syntézou fragmentu chemickými způsoby, jak se běžně provádí za využití automatických syntetizátorů oligonukleotidů. Fragmenty lze také získat použitím způsobu reprodukce nukleových kyselin, jako je způsob PCR™ podle US patentu č. 4 683 202 (který je zde začleněn odkazem) zavedením zvolených sekvencí do rekombinantních vektorů pro rekombinantní tvorbu a jinými způsoby rekombinantní DNA, které jsou obecně známé • · odborníkovi v oboru molekulární biologie.
Sekvence nukleotidů podle tohoto vynálezu lze využít pro jejich schopnost selektivně tvořit duplexní molekuly s komplementárními vlákny celistvých genů nebo genových fragmentů, které jsou požadovány. V závislosti na zamýšleném použití se obvykle používají různé podmínky hybridizace, aby se dosáhlo různých stupňů selektivity sondy vůči cílové sekvenci. Pro použití vyžadující vysokou selektivitu se obvykle požaduje použít relativně přísné podmínky pro tvorbu hybridů, například zvolit podmínky s relativně nízkým obsahem solí a/nebo vysokou teplotou, jako jsou koncentrace solí od přibližné 0,02 M do přibližně 0,15 M při teplotách od přibližně 50 °C do přibližně 70 °C. Takové selektivní podmínky tolerují málo, pokud vůbec, nevhodné spojení sondy a templátu nebo cílového vlákna a jsou zvláště vhodné pro izolaci souvisejících sekvencí.
Pro některá použití, například pokud je žádoucí připravit mutant za použití vlákna mutantního primeru hybridizovaného na základní templát, samozřejmě vyžadují méně přísné podmínky (omezenou přísnost) hybridizace, aby se umožnila tvorba heteroduplexu. Za těchto okolností je žádoucí použít podmínky koncentrace solí od přibližně 0,15 M do přibližně 0,9 M při teplotách v rozmezí od přibližně 20 °C do přibližně 55 °C. Zkříženě hybridizovaný druh může být takto přímo identifikován ve formě pozitivně hybridizujících signálů s ohledem na kontrolní hybridizace. V každém případě se obecně uznává, že podmínky hybridizace lze upravit na přísnější přidáním rostoucího množství formamidu, který slouží k destabilizaci hybridního duplexu stejným způsobem jako zvýšená teplota. Takto lze hybridizační podmínky přímo měnit a to je obecně metodou volby
- 46 · v závislosti na požadovaných výsledcích.
Podle dalšího ztělesnění tohoto vynálezu jsou poskytnuty polynukleotidové prostředky zahrnující protismyslné oligonukleotidy. Ukázalo se, že protismyslné oligonukleotidy jsou účinné a cílené inhibitory syntézy proteinů a v důsledku toho představují způsob léčení, kterým lze léčit nemoc inhibici syntézy proteinů, které přispívají k nemoci. Účinnost protismyslných oligonukleotidů na inhibici syntézy proteinů je dobře zjištěna. Například syntéza polygalaktauronasy a acetylcholínových receptorů muskarinového typu 2 je inhibována protismyslnými oligonukleotidy, zaměřenými na jejich příslušné sekvence mRNA (US patent č. 5 739 119 a US patent č. 5 759 829). Dále se ukázaly příklady protismyslné inhibice na jaderném proteinovém cyklinu, genu vícečetné lékové rezistence (MDG1), ICAM-1, E-selektinu, STK-1, striatálním GABA^ receptorů a lidském EGF (Jaskulski a kol., Science 10, 240(4858), 1544 - 1546 (1998), Vasanthakumar a Ahmed, Cancer Commun. 1(4), 225 -232 (1989), Peris a kol., Brain Res. Mol. Brain Res. 57(2) , 310 - 320 (1998), US patent č. 5 801 154, US patent č. 5 789 573, US patent č. 5 718 709 a US patent č. 5 610 288). Je rovněž popsáno, že protismyslné konstrukty inhibují řadu abnormálních buněčných proliferací a lze je použít k léčení například rakoviny (US patent č. 5 747 470, US patent č. 5 591 317 a US patent č. 5 783 683).
Proto v určitých ztělesněních poskytuje tento vynález oligonukleotidovou sekvenci, která zahrnuje kteroukoli celou sekvenci nebo její část, která je schopna specificky se vázat na sekvenci polynukleotidu, jak je zde popsána nebo na její komplement. V jednom ztělesnění protismyslné oligonukleotidy zahrnují DNA nebo její deriváty. V jiném ···ztělesnění zahrnují oligonukleotidy RNA nebo její deriváty. Ve třetím ztělesnění jsou oligonukleotidy modifikovány DNA, zahrnujícími fosfothioátem modifikovaný můstek. Ve čtvrtém ztělesnění zahrnuje oligonukleotidová sekvence nukleové kyseliny pro peptid nebo jejich deriváty. Ve všech případech zahrnují výhodné prostředky sekvenční region, který je komplementární a výhodněji zásadně komplementární a ještě výhodněji úplné komplementární k jedné nebo více částem polynukleotidů, jak jsou zde popsány. Výběr protismyslných prostředků specifických pro danou genovou sekvenci je založen na analýze zvolené cílové sekvence a určení sekundární struktury, Tm, vazebné energie a relativní stability. Protismyslné prostředky lze vybrat na základě jejich relativní neschopnosti tvořit dimery, vlásenky nebo jiné sekundární struktury, které snižují nebo brání specifické vazbě na cílovou mRNA v hostitelské buňce. Velice výhodné cílové regiony mRNA jsou ty regiony, které jsou na nebo blízko AUG iniciačního kodónu pro translaci a ty regiony, které jsou zásadně komplementární k 5' regionům mRNA. Tyto analýzy sekundární struktury a úvahy o selekci cílového místa lze uskutečnit například za použití verze 4 software pro analýzu primerů OLIGO a/nebo BLASTN 2.0.5 algorithm software (Altschul a kol., Nucleic Acids Res., 25(17) , 3389 - 3402 (1997)).
Zamýšlí se rovněž použití způsobů protismyslného dodání, využívajícího krátkého peptidového vektoru, označovaného MPG (27 zbytků). MPG peptid obsahuje hydrofobní doménu odvozenou od fuzní sekvence HIV gp41 a hydrofilní doménu z jaderné lokalizace sekvence SV40 T-antigenu (Morris a kol., Nucleic Acid Res., 25(14), 2730 - 2736 (15. července
1997)). Ukázalo se, že několik molekul peptidu MPG pokrývá protismyslné oligonukleotidy a lze je dodat do kultivovaných ·· ···· • · · ·
48' savčích buněk za méně než 1 hodinu s relativně vysokou účinností (90%). Dále interakce s MPG silně zvyšuje jak stabilitu oligonukleotidu vůči nukleaze, tak schopnost prostupovat plasmatickou membránou.
Podle dalšího ztělesnění tohoto vynálezu se polynukleotidové prostředky zde popsané používají při navrhování a přípravě ribozymálních molekul pro inhibici exprese tumorových polypeptidů a proteinů podle tohoto vynálezu v buňkách tumoru. Ribozymy jsou RNA-proteinové komplexy, které štěpí nukleové kyseliny místně specifickým způsobem. Ribozymy mají specifické katalytické domény, které vykazují endonukleasovou aktivitu (Kim a Cech, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84(24), 8788 - 8792 (prosinec 1987), Foster a Symons, Cell 49(2), 211 - 220 (24. dubna 1987)). Například velké množství ribozymů urychluje reakce s přenosem fosfoesterů s vysokým stupněm specificity, často štěpící pouze jeden z několika fosfoesterů v oligonukleotidovém substrátu (Cech a kol., Cell, 27(3 Pt 2), 487 - 496 (prosinec 1981), Michel a Westhof, J. Mol. Biol., 216(3) ,
585 - 610 (5. prosince 1990), Reinbold-Hurek a Shub, Nátuře, 357(6374 ) , 173 - 176 (14. květnal992)). Tato specifita je spojena s požadavkem, aby se substrát vázal pomocí specifických interakcí párujících baze na vnitřní vodící sekvenci (IGS) ribozymů před chemickou reakcí.
V současné době je známo šest základních druhů přirozeně se vyskytujících enzymatických RNAs. Každý z nich může za fyziologických podmínek katalyzovat hydrolýzu fosfodiesterázových vazeb RNA v poloze trans (a tak může odštěpovat jiné molekuly RNA). Celkově řečeno, enzymatické nukleové kyseliny působí tak, že se nejprve naváží na cílovou RNA. Taková vazba se vyskytuje přes cílovou vaznou
49···• · · · · · část enzymatické nukleové kyseliny, která má blízkou příbuznost s enzymatickou částí molekuly, která štěpí cílovou RNA. Takto enzymatická nukleová kyselina nejdříve rozpozná a potom naváže cílovou RNA prostřednictvím párování komplementárních baží a poté, co je navázaná na správném místě, působí enzymaticky tak, že štěpí cílovou RNA. Strategické štěpení takové cílové RNA znemožní její schopnost přímé syntézy kódovaného proteinu. Potom, co se enzymatická nukleová kyselina naváže na cílovou RNA a odštěpí jí, se z ní uvolní, aby vyhledala jiný cíl a může se opakovaně vázat na nové cíle a štěpit je.
Enzymatická povaha ribozymu je výhodná v mnoha způsobech, jako jsou protismyslné technologie (ve kterém se molekula nukleové kyseliny jednoduše váže na cílovou nukleovou kyselinu, aby blokovala její translaci), protože koncentrace ribozymu nutná k ovlivnění teraputikéo působení je nižší než hladina protismyslného oligonukleotidu. Tato výhoda odráží schopnost ribozymu působit enzymaticky. Takto je jedna molekula ribozymu schopna štěpit mnoho molekul cílové RNA. Navíc je ribozym vysoce specifický inhibitor se specificitou inhibice, která závisí nejen na způsobu párování baží vážících se na cílovou RNA, ale také na způsobu štěpení cílové RNA. Jednoduchá chybná spojení nebo substituce baží blízko místa štěpení mohou úplně zastavit katalytickou aktivitu ribozymu. Podobná chybná spojení v protismyslných molekulách nebrání jejich působení (Woolf a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89(16), 7305 - 7309 (15. srpna 1992)). Takto je specificita účinku ribozymu vyšší než specificita účinku protismyslného oligonukleotidu navázaného na stejné místo RNA.
Molekula enzymatické nukleové kyseliny se může
- 50·
4···
4« 444· vytvořit ve žraloku, vlásence, viru hepatitidy S, intronu skupiny I nebo RNázeP RNA (ve spojení s RNA vedoucí sekvencí) nebo motivu Neurospora VS RNA. Příklady žraločích motivů jsou popsány Rossim a kol., Nucleic Acid Res.,
20(17), 4559 - 4565 (11. září 1992). Příklady vlásenkové motivy jsou popsány Hampelem a kol., (evropská patentová přihláška, publikační číslo EP 0 360 257), Hampelem a Tritzem, Biochemistry 28(12), 4929 - 4933 (13. června 1989), Hampelem a kol., Nucleic Acids Res. 18(2), 299 - 304 (25. ledna 1990) a v US patentu č. 5 631 359. Příklad motivu viru hepatitidy δ popsal Perotta a Been, Biochemistry,
31(47) , 11843 - 11852 (1. prosince 1992), příklad motivu RNázyP popsal Guerrier-Takada a kol., Cell., 35(3 Pt 2),
849 - 857 (prosinec 1983), motiv ribozymu Neurospora VS RNA popsal Collins (Saville a Collins, Cell., 61(4) , 685 - 696 (18. května 1990), Saville a Collins, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88(19), 8826 - 8830 (1.října 1991), Collins a Olivě, Biochemistry, 32(11), 2795 - 2799 (23. března 1993)) a příklad intronu skupiny I je popsán v US patentu č. 4 987 071. Podstatné v molekule enzymatické nukleové kyseliny podle tohoto vynálezu je to, že má specifické místo, které váže substrát a které je komplementární k jednomu nebo více regionům cílového RNA genu, a že má sekvence nukleotidů v rámci nebo v sousedství tohoto místa vážícího substrát, které zodpovídá za aktivitu štěpící RNA této molekuly. Tak ribozymové konstrukty nemusí být omezeny na specifické motivy, které jsou zde uvedené.
Ribozymy mohou být navrženy tak, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla WO 93/23569 a mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla WO 94/02595 (každá z nich je zde specificky zahrnuta odkazem) a syntetizovány, aby se testovaly in vitro a in ·· ·♦· · ···· vivo, jak je zde popsáno. Takové ribozymy lze rovněž optimalizovat pro distribuci. Zatímco jsou zde poskytnuty specifické příklady, odborníkovi v oboru bude zřejmé, že ekvivalentní cílové RNA u jiných druhů lze použít, pokud je to nutné.
Aktivita ribozymů může být optimalizována změnou délky ramen, která váží ribozymy, nebo chemicky syntézou ribozymů s modifikacemi, které zabraňují jejich degradaci sérovými ribonukleázami (viz například mezinárodní patentová přihláška publikačního čísla WO 92/07065, mezinárodní patentová přihláška publikačního čísla WO 93/15187, mezinárodní patentová přihláška publikačního čísla WO 03162, evropská patentová přihláška publikačního čísla 92110298.4, US patent č. 5 334 711 a mezinárodní patentová přihláška publikačního čísla WO 94/13688, které popisují různé chemické modifikace, které lze uskutečnit v sacharidových částech molekul enzymatické RNA), modifikacemi, které zvyšují jejich účinnost v buňkách a odstraněním baží II. stupně, aby se zkrátila doba syntézy RNA a snížily chemické požadavky.
Sulivan a kol. (mezinárodní patentová přihláška publikačního čísla WO 94/02595) popisují obecné způsoby podání enzymatických molekul RNA. Ribozymy lze podat do buněk řadou způsobů známých odborníkovi v oboru, přičemž mezi tyto způsoby patří, ale jejich výčet na ně není omezen, enkapsulace v lipozomech, iontoforéza, zahrnutí do jiných vehikul, jako jsou hydrogely, cyklodextriny, biodegradovatelné nanokapsle a bioadhezivní mikrokuličky.
Pro určité indikace mohou být ribozymy přímo dodávány ex vivo do buněk nebo tkání spolu s výše uvedenými vehikuly nebo bez nich. Popřípadě mohou být kombinace RNA/vehikulum ·« ···· «· ·«·· — 52···-··· místně dodány přímou inhalací, přímou injekcí nebo za použití katetru, infuzní pumpy nebo stentu. Jiné cesty podání zahrnují, ale nejsou omezeny na intravaskulární, intramuskulární, subkutánní nebo kloubní injekci, inhalaci aerosolu, perorální (forma tablet nebo pilulek), místní, systémové, oční, intraperitoneální a/nebo intrathekální podání. Podrobnější popisy dodání a podání ribozymů jsou poskytnuty v mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla WO 94/02595 a mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla WO 93/23569, každá z nich je zde výslovně zahrnuta odkazem.
Jiným způsobem akumulace vysokých koncentrací ribozymů nebo ribozymů v buňkách je zahrnout sekvence kódující ribozymy do DNA expresního vektoru. Transkripce sekvencí ribozymů se řídí od promotoru pro eukaryotické RNA polymerasy I (pol I), RNA polymerasy II (pol II) nebo RNA polymerasy III (pol III). Transkripty od pol II nebo pol III promotorů se exprimují ve vysokých hladinách ve všech buňkách, hladiny daného pol II promotoru v daném buněčném typu závisí na povaze genových regulačních sekvencí (enhancerů, silencerů atd.) přítomných v jejich blízkosti. Prokaryotické promotory RNA polymerasy lze rovněž použít za předpokladu, že prokaryotický RNA enzym polymerasa se exprimuje ve vhodných buňkách. Ukázalo se, že ribozymy exprimované z takových promotorů účinkují v savčích buňkách. Takové jednotky transkripce lze zahrnout do řady vektorů pro zavedení do savčích buněk, včetně plasmidových DNA vektorů, virových DNA vektorů (jako jsou adenovirové nebo adenoasociované vektory) nebo virových RNA vektorů (jako jsou vektory retrovirové, vektory semliki forest viru, vektory sindbis viru), ale tento výčet není omezující.
·«*♦ ····
V jiném ztělesnění tohoto vynálezu jsou poskytnuty prostředky peptidových nukleových kyselin (PNAs). PNA je DNA mimika, ve které jsou nukleové baze připojeny k pseudopeptidovému základnímu řetězci (Good a Nielse, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 7(4). 431 - 437 (1997)).
PNA je možno využít v řadě způsobů, které tradičně využívají RNA nebo DNA. Často představují sekvence PNA lepší možnost než odpovídající sekvence RNA nebo DNA a mají využití, které nemají RNA nebo DNA. Přehled PNA včetně způsobů jejich přípravy, vlastností a způsobu použití poskytl Corey (Trends Biotechnol., 15(6). 224 - 229 (červen 1997)). Tak lze v určitých ztělesněních připravit sekvence PNA, které jsou komplementární k jedné nebo více částem ACE mRNA sekvence a takové protředky PNA lze použít pro regulaci, změně, snížení nebo omezení translace ACE-specifické RNA a tím změnit úroveň aktivity ACE v hostitelské buňce, do které se takové prostředky PNA podaly.
PNAs mají 2-aminoethylglycinová spojení nahrazující normální fosfodiesterové můstky DNA (Nielsen a kol., Science 254(5037), 1497 - 1500 (6. prosince 1991), Hanvey a kol., Science 258(5087), 1481 - 1485 (27. listopadu 1992), Hyrup a Nielsen, Bioorg. Med. Chem., 4(1), 5-23 (leden 1996)). Toto chemické uspořádání má tři významné následky: za prvé na rozdíl od DNA nebo fosforothioatových oligonukleotidů jsou PNAs neutrální molekuly, za druhé PNAs jsou achirální, a proto není nutno vyvíjet stereoselektivní syntézu a za třetí syntéza PNA využívá standardní protokoly Boc nebo Fmoc pro syntézu peptidů v pevné fázi, ačkoli se používají další způsoby včetně modifikované Merrifieldovy metody.
PNA monomery nebo hotové oligomery jsou komerčně dostupné od PerSeptive Biosystems (Framingham, MA). Syntézy «· «*·· • · « · 4
PNA podle buď Boc nebo Fmoc protokolů jsou jasné za použití manuálního nebo automatizovaného protokolu (Norton a kol., Bioorg. Med. Chem., 3(4), 437 - 445 (duben 1995)). Manuální protokol se sám hodí pro vytváření chemicky modifikovaných PNAs nebo pro simultánní syntézu tříd blízce příbuzných PNAs.
Jako u peptidové syntézy závisí úspěch syntézy určité PNA na vlastnostech zvolené sekvence. Například zatímco v teorii mohou PNAs zahrnout jakoukoli kombinaci nukleotidových baží, může přítomnost sousedících purinů vést k delecím jednoho nebo více zbytků v produktu. S ohledem na tuto obtíž se předpokládá, že při tvorbě PNAs se sousedícími puriny by se mělo opakovat spojování zbytků, které se pravděpodobně přidávaly neúčinně. Po tomto kroku by mělo následovat čištění PNAs pomocí kapalinové chromatografie za vysokého tlaku na reverzní fázi, kterou se dostane produkt s podobným výtěžkem a čistotou, jaké se pozorují u syntézy peptidů.
Modifikace PNAs pro dané použití se provede spojováním aminokyselin v průběhu syntézy v pevné fázi nebo připojováním sloučenin, které obsahují karboxylovou skupinu k odkrytému N-koncovému aminu. Popřípadě lze PNAs modifikovat po syntéze spojováním zavedeného lysinu nebo cysteinu. Snadnost, se kterou lze modifikovat PNAs, usnadňuje optimalizaci pro zlepšení rozpustnosti nebo pro specifické funkční požadavky. Po syntéze lze identitu PNAs a jejich derivátů potvrdit hmotnostní spektrometrií.
V několika studiích se připravily a využily modifikace PNAs (například Norton a kol., Bioorg. Med. Chem., 3(4), 437 - 445 (duben 1995), Petersen a kol., J. Pept. Sci., 1(3),
175 - 183 (květen - červen 1995), Orum a kol., ·<··
Μ · • 9 99 )·Α· *· ·>·♦ • 9 · • « · · · * • · ♦ · ·· ··
Biotechniques, 19(3), 472 - 480 (září 1995), Footer a kol., Biochemistry, 35(33), 10673 - 10679 (20. srpna 1996), Griffith a kol., Nucleic Acids Res., 23(15), 3003 - 3008 (11. srpna 1995), Pardridge a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92(12) , 5592 - 5596 (6. června 1995), Boffa a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92(6) , 1901 - 1905 (14. března 1995), Gambacorti-Passerini a kol., Blood, 88(4), 1411
- 1417 (15. srpna 1996), Armitage a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 94(23), 12320 - 12325 (11. listopadu 1997), Seeger a kol., Biotechniques, 23(3), 512 - 517 (září 1997)). US patent č. 5 700 922 diskutuje PNA-DNA-PNA chimérické molekuly a jejich použití v diagnostice, modulaci proteinu v organizmech a léčení stavů ovlivnitelných léčebnými prostředky.
Způsoby charakterizace protismyslných vazebných vlastností PNAs diskutuje Rose (Anal. Chem. 65(24), 3545
- 3549 (15. prosince 1993) a Jensen a kol. (Biochemistry, 36(16), 5072 - 5077 (22. dubna 1997)). Rose použil kapilární gelovou elektroforézu, aby určil vazbu PNAs na jejich komplementární oligonukleotid měřením relativní vazebné kinetiky a stechiometrie. Podobné typy měření provedl Jensen a kol. za použiti technologie BIAcorex .
Jiná využití PNAs, která jsou popsána a jsou zřejmá odborníkovi v oboru, zahrnují použití v invazi vlákna DNA, protismyslné inhibici, analýze mutant, enhancerů transkripce, pro čištění nukleových kyselin, izolaci transkripčně aktivních genů, blokování vazby transkripčních faktorů, genomové štěpení, biosenzorů, pro hybridizaci in šitu a podobně.
Identifikace, charakterizace a exprese polynukleotidů • ·· ·
Polynukleotidové prostředky podle tohoto vynálezu lze identifikovat, připravit a/nebo zacházet s nimi za použití řady dobře zavedených způsobů (viz obecně Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 a další podobné odkazy). Například lze polynukleotid identifikovat screeningem a microarray cDNA pro expresi spojenou s tumorem (t.j. expresi, která je nejméně dvojnásobně větší v tumoru než v normální tkáni, jak se určí za použití reprezentativní zkoušky, která je zde poskytnuta). Takový screening lze provést například za použití technologie microarray od Affymetrixu, lne. (Santa Clara, CA) podle pokynů výrobce (a v zásadě tak, jak popsal Schena a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 93, 10614 - 10619 (1996) a Heller a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94, 2150 - 2155 (1997)). Popřípadě lze polynukleotidy amplifikovat z cDNA připravené z buněk, které exprimují proteiny, které jsou zde popsány, jako jsou tumorové buňky.
Existuje mnoho dostupných způsobů závislých na templátech pro amplifikaci cílových sekvencí, které jsou předmětem zájmu a jsou přítomny ve vzorku. Jedním z nejlépe známých způsobů amplifikace je polymerasová řetězová reakce (PCR™), která je podrobně popsána v US patentech č. 4 683 195, 4 683 202 a 4 800 159, z nichž každý je zde zahrnut ve své úplnosti odkazem. V krátkosti, v PCR™ se připraví dvě sekvence primeru, které jsou komplementární k regionům na protějších komplementárních vláknech cílové sekvence. Do reakční směsi se přidá přebytek deoxynukleosidtrifosfátů spolu s polymerasou DNA (například polymerasou Tag). Pokud je cílová sekvence přítomna ve vzorku, primery se naváží na cíl a polymerasa způsobí, že se primery rozšíří podél cílové
- 57 .
• · · · · • · · · · ··· ·· ·· · • · · · · · «~· · · · · · · · sekvence přidáním k nukleotidům. Zvýšením a snížením teploty reakční směsi se rozšířené primery oddělí od cíle, aby se vytvořily reakční produkty, nadbytečné primery se naváží na cíl a na reakční produkt a proces se opakuje. Výhodně lze využít způsob reversní transkripce a PCR™ amplifikace, aby se kvantifikovalo množství amplifikované mRNA. Metodologie polymerasové řetězové reakce jsou dobře známy odborníkovi v oboru.
Kterýkoli z dalších způsobů, závisejících na templátech, z nichž mnoho je variacemi PCR™ amplifikačního způsobu, je přímo znám a dostupný v oboru. Pro ilustraci, některé způsoby zahrnují ligázovou řetězovou reakci (zde uváděnou jako LCR), popsanou například v evropské patentové přihlášce publikačního čísla 320308 a US patentu č. 4 883 750, Qbeta replikázu, popsanou v PCT mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla PCT/US87/00880, amplifikaci s posunutím vláken (strand displacement amplification - SDA) a reakci opravy řetězce (repair Chain reaction - RCR). Další způsoby amplifikace jsou popsány v GB patentové přihlášce 2202328 a v PCT mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla PCT/US89/01025. Další způsoby amplifikace nukleových kyselin zahrnují amplifikační systémy založené na transkripci (TAS) (PCT mezinárodní patentové přihlášce publikačního čísla WO 88/10315, včetně amplifikace založené na sekvenci nukleových kyselin (NASBA) a 3SR. Evropská patentová přihláška publikačního čísla 329822 popisuje způsoby amplifikace nukleových kyselin, zahrnující cyklickou syntézu jednovláknové RNA (ssRNA), ssDNA a dvouvláknové DNA (dsDNA). PCT mezinárodní patentová přihláška publikačního čísla WO 89/06700 popisuje schéma amplifikace sekvence nukleových kyselin založené na hybidizaci sekvence promotor/primer na cílovou jednovláknovou DNA (ssDNA), po ·· · · • · · ·
- 58 ··<které následuje transkripce řady RNA kopií sekvence. Další způsoby amplifikace, jako je RACE (Frohman, 1990) a jednostranná PCR (Ohara, 1989) jsou rovněž dobře známy odborníkovi v oboru.
Amplifikovanou část polynukleotidů podle tohoto vynálezu lze použít pro izolaci genu o celé délce z vhodné knihovny (například z tumorové cDNA knihovny) za použití dobře známých způsobů. V rámci těchto způsobů se provádí screening knihovny (cDNA nebo genomové) za použití jedné nebo více polynucleotidových sond nebo primerů vhodných pro amplifikaci. Výhodně je knihovna zvolená s ohledem na velikost, aby zahrnovala větší molekuly. Knihovny náhodné primerizace mohou být rovněž výhodné pro identifikaci 5' a upstream regionů genů. Genomové knihovny jsou výhodné pro získání intronů a rozšíření 5' sekvencí.
Pro hybridizační způsoby může být určitá sekvence značena (například nick-translací nebo koncovým značením o o
P) za použiti dobře známých způsobů. Bakteriální nebo bakteriofágová knihovna je potom obecně podrobena screeningu hybridizačními filtry s obsahem denaturovaných bakteriálních kolonií (nebo lawns obsahujících fágové plotny) se značenou sondou (viz Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989). Hybridizační kolonie nebo plotny se selektují a rozšíří a DNA se izoluje pro další analýzy. Klony cDNA lze analyzovat, aby se určilo množství další sekvence, například PCR za použití primerů z parciální sekvence a primerů z vektoru. Restrikční mapy a parciální sekvence lze vytvořit, aby se identifikoval jeden nebo více překrývajících se klonů. Úplné sekvence lze potom určit za použití standardních způsobů, které mohou zahrnovat ···· • ·· ·
vytvoření sérií delečních klonů. Výsledné překrývající se sekvence lže potom shromáždit do jednoduché sousedící sekvence. Molekula s plnou délku cDNA může být vytvořena ligací vhodných fragmentů za použití dobře známých způsobů.
Popřípadě mohou být způsoby amplifikace, jako jsou ty, které jsou popsány výše, užitečné pro získání kódující sekvence o plné délce z parciální sekvence DNA. Jedním takovým způsobem amplifikace je inversní PCR (viz Triglia a kol., Nucl. Acids Res., 16, 8186 (1998)), která využívá restrikční enzymy k vytvoření fragmentu na známém regionu genu. Fragment se potom cirkularizuje intramolekulární ligací a použije jako templát pro PCR s odlišujícími se primery odvozenými od známého regionu. V rámci alternativního přístupu se mohou sekvence sousedící s určitou sekvencí zachránit amplifikaci s primerem na sekvenci linkeru a na primer specifický pro známý region. Amplifikované sekvence se obvykle podrobí druhému kolu amplifikace se stejným linkerovým primerem a druhým primerem, specifickým pro známý region. Variace tohoto způsobu, která využívá dva primery, které iniciují rozšiřování na opačné směry od známé sekvence, je popsána ve WO 96/38591. Jiný takový způsob je známý jako rychlá amplifikace konců cDNA neboli RACE. Tento způsob zahrnuje použití vnitřního primeru a vnějšího primeru, který hybridizuje na sekvenci polyA regionu nebo vektoru, aby se identifikovaly sekvence, které jsou 3' a 5' známé sekvence. Další způsoby zahrnují capture PCR (Lagerstrom a kol., PCR Methods Applic., 1, 111 - 119 (1991)) a walking PCR (Parker a kol., Nucl. Acids Res., 19, 3055 - 3060 (1991)). Lze rovněž použít další způsoby zahrnující amplifikaci, aby se získala sekvence cDNA o plné délce.
- 60.
• · ··
V určitých případech je možno získat sekvenci cDNA o plné délce analýzou sekvencí poskytnutých v databázi sekvencí exprimovaných smyček (EST), jako je databáze dostupná od GenBank. Vyhledání překrývajících se ESTs lze obecně uskutečnit za použití dobře známých programů (například NCBI BLAST vyhledávání) a takové ESTs lze použít pro vytvoření sousedící sekvence o plné délce. Sekvence DNA o plné délce lze rovněž získat analýzou genomových fragmentů.
V jiných ztělesněních tohoto vynálezu lze využít sekvence polynukleotidů nebo jejich fragmenty, které kódují polypeptidy podle tohoto vynálezu nebo fuzní proteiny nebo jejich funkční ekvivalenty v rekombinantních molekulách DNA k přímé expresi polypeptidů ve vhodných hostitelských buňkách. Díky zásadní degeneraci genetického kódu mohou být vytvářeny další sekvence DNA, které kódují v zásadě stejnou nebo funkčně ekvivalentní sekvenci aminokyselin a tyto sekvence lze použít ke klonování a expresi daného polypeptidů.
Jak je známo odborníkovi v oboru, v některých případech může být výhodné vytvářet sekvence nukleotidů kódující polypeptid, které mají kodóny, nevyskytující se přirozeně. Například mohou být vybrány kodóny preferované určitým prokaryotickým nebo eukaryotickým hostitelem, aby se zvýšil podíl exprese proteinu nebo aby se vytvářel rekombinantní RNA transkript, který má požadované vlastnosti, jako je biologický poločas, který je delší než poločas transkriptu, vytvořeného z přirozeně se vyskytující sekvence.
Navíc lze vytvořit polynukleotidové sekvence podle •9 9999
9 9 9
- 61.
tohoto vynálezu za použití způsobů obecně známých v oboru, aby se změnily sekvence kódující polypeptid z řady důvodů, které zahrnují, ale jejich výčet není na ně omezen, změny, které modifikují klonování, zpracování a/nebo expresi genového produktu. Například lze použít zpřeházení DNA náhodnou fragmentací a opětovným shromážděním pomocí PCR genových fragmentů a syntetické oligonukleotidy lze použít k přípravě sekvencí nukleotidů. Navíc lze použít místně zaměřené mutageneze pro vložení nových restrikčních míst, změnu vzorků glykosylace, změnu kodónové preference, vytvoření střihových variant nebo zavedení mutací a podobně.
V jiném ztělesnění tohoto vynálezu lze ligovat nativní, modifikované nebo rekombinantní sekvence nukleových kyselin k heterologní sekvenci, aby se kódoval fuzní protein. Například ke screeningu knihoven peptidů pro inhibitory polypeptidové aktivity může být účelné kódovat chimérický protein, který lze rozpoznat komerčně dostupnou protilátkou. Fuzní protein lze rovněž zpracovat, aby obsahoval místo štěpení lokalizované mezi sekvencí kódující polypeptid a sekvencí heterologního proteinu tak, aby bylo možno polypeptid odštěpit a vyčistit z heterologního podílu.
Sekvence kódující požadovaný polypeptid lze syntetizovat celé nebo zčásti za použití chemických způsobů dobře známých v oboru (viz Caruthers Μ. H. a kol., Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 215 - 223 (1980), Horn T. a kol.,
Nucl. Acids Res. Symp. Ser. 225 - 232 (1980)). Popřípadě se může sám protein vytvářet za použití chemických způsobů, aby se syntetizovala sekvence aminokyselin polypeptidu nebo její část. Například lze peptidovou syntézu uskutečnit za použití různých způsobů v pevné fázi (Roberge J. Y. a kol., Science, 269, 202 - 204 (1995)) a automatizované syntézy lze • ·· · ····
— 62 ···-··» dosáhnout například za použití ABI 431A peptidového syntetizátoru (Perkin Elmer, Palo Alto, CA).
Nově syntetizovaný peptid lze podstatně čistit preparativní vysoce účinnou kapalinovou chromatografíí (například Creihton T., Proteins, Structures and Molecular Priciples, WH Freeman and Co., New York, Ν. Y. (1983)) nebo jinými srovnatelnými způsoby, které jsou dostupné v oboru. Složení syntetických peptidů lze potvrdit analýzou aminokyselin nebo sekvenováním (například Edmanovou degradační procedurou). Navíc lze sekvenci aminokyselin polypeptidu nebo její část změnit během přímé syntézy a/nebo za kombinovaného použití chemických způsobů se sekvenováním od jiných proteinů nebo jejich částí, aby se vytvořila varianta polypeptidu.
Aby se exprimoval požadovaný polypeptid, lze sekvence nukleotidů kódující tento polypeptid nebo funkční ekvivalenty vložit do vhodného expresního vektoru, t. j. vektoru, který obsahuje nutné prvky pro transkripci a translaci vložené kódující sekvence. Způsoby, které jsou dobře známé odborníkovi v oboru lze použít ke konstrukci expresních vektorů, které obsahují sekvence kódující požadovaný polypeptid a vhodné transkripční a translační kontrolní prvky. Tyto způsoby zahrnují rekombinantní DNA způsoby in vitro, syntetické způsoby a genetické rekombinace in vivo. Takové způsoby jsou popsány například v Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989), Plainview, Ν. Y. a Ausubel F. M. a kol., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, Ν. Y. (1989).
Řadu systémů expresní vektor/hostitel lze použít, aby ·· ···· ····
- 63· ·-··· ·· ·
obsahovaly a exprimovaly polynukleotidové sekvence. Tyto systémy zahrnují mikroorganismy, jako jsou bakterie transformované rekombinantním bakteriofágem, plasmidové nebo kosmidové DNA expresní vektory, kvasinky transformované kvasinkovými expresními vektory, systémy hmyzích buněk infikované virovými expresními vektory (například bakulovirem), systémy rostlinných buněk transformovně virovými expresními vektory (například květákovým mozaikovým virem CaMV, tabákovým mozaikovým virem TMV) nebo bakteriální expresní vektory (například Ti nebo pBR322 plasmidy) nebo zvířecí buněčné systémy, ale jejich výčet není na ně omezen.
Kontrolní prvky nebo regulační sekvence přítomné v expresním vektoru jsou ty regiony vektoru, u nichž neproběhla translace - enhancery, promotory, 5' a 3' regiony, u nichž neproběhla translace, které interagují s hostitelskými buněčnými proteiny, aby proběhla transkripce a translace. Takové prvky se mohou lišit ve své síle a specifitě. V závislosti na použitém vektorovém systému a hostiteli lze použít jakékoli množství vhodných transkripčních a translačních prvků, včetně konstitutivních a induktabilních promotorů. Například při klonování v bakteriálním systému lze použít induktabilní promotory jako je hybrid lacZ promotor fagemidu PBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) nebo plasmid PSP0RT1 (Gibco BRL,
Gaithersburg, MD) a podobně. U savčích buněčných systémů jsou obecně výhodné promotory ze savčích genů nebo savčích virů. Pokud je nutno vytvořit buněčnou linii, která obsahuje vícečetné kopie sekvence kódující polypeptid, lze výhodně použít vektory založené na SV40 nebo EBV s vhodným volitelným markérem.
V bakteriálních systémech lze vybrat jakýkoli počet • 4 4444
- 64' expresních vektorů v závislosti na zamýšlené použití polypeptidu. Například pokud je potřeba velkého množství polypeptidu, například pro indukci protilátek, lze použít vektory, které řídí vysokou úroveň exprese fuzních proteinů, které lze přímo čistit. Takové vektory zahrnují, ale jejich výčet není na ně omezen, multifunkční klonující a expresní vektory E. coli, jako je BLUESCRIPT (Stratagene), ve kterém lze sekvenci kódující požadovaný polypeptid ligovat do vektoru v rámci se sekvencemi pro amino-terminální Met a následných 7 zbytků beta-galaktosidázy, tak aby se vytvářel hybridní protein, pIN vektory (Van Heeke G. a Schuster S. M., J. Biol. Chem., 264, 5503 - 5509 (1989)) a podobně. Vektory pGEX (Promega, Madison, Wis.) lze rovněž použít k expresi cizích polypeptidů, jako jsou fuzní proteiny s glutathion S-transferázou (GST). Celkově řečeno, takové fuzní proteiny jsou rozpustné a mohou být snadno čištěny od lyžovaných buněk adsorpcí na glutathion-agarózové kuličky, po které následuje promytí za přítomnosti volného glutathionu.
Proteiny vyrobené v takových systémech mohou být navrženy pro zahrnutí proteázovému štěpení míst na heparinu, thrombinu nebo faktoru XA, tak aby se klonovaný požadovaný polypeptid mohl uvolnit z podílu GST podle toho, jak se požaduje.
U kvasinek Saccharomyces cerevisiae lze použít řadu vektorů obsahujících konstitutivní nebo induktabilní promotory, jako je faktor alfa, alkoholoxidáza nebo PGH.
Pro přehledy viz Ausubel a kol. (viz výše) a Grant a kol., Methods Enzymol. 153, 516 - 544 (1987).
V případech, kdy se používá rostlinný vektor, lze řídit expresi sekvencí kódujících polypeptidy kterýmkoli z řady promotorů. Například lze použít virové promotory, jako ·· ···· • · · · · - 65···-··· ·· * jsou 35S a 19S promotory CaMV samotné nebo v kombinaci s omega vedoucí sekvencí z TMV (Takamatsu Ν., EMBO J., 6, 307 - 311 (1987)). Popřípadě lze použít rostlinné promotory, jako je malá podjednotka RUBISCO nebo promotory tepelného šoku (Coruzzi G. a kol., EMBO J., 3, 1671 - 1680 (1984), Broglie R. a kol., Science, 224, 838 - 843 (1984) a Winter J. a kol., Results Probl. Cell Differ., 17, 85 - 105 (1991)). Tyto konstrukty mohou být zavedeny do rostlinných buněk přímou transformací DNA nebo patogenem zprostředkovanou transfekcí. Takové způsoby jsou popsány v řadě obecně dostupných přehledů (viz například Hobbs S. nebo Murry L. E. v McGraw Hill Yearbook of Science and Technology, McGraw Hill, New York, Ν. Y., 191 - 196 (1992)).
Rovněž hmyzí systém lze použít pro expresi požadovaného polypeptidu. Například jeden takový systém, Autographa california jaderný polyhedrosis virus (AcNPV) se používá jako vektor pro expresi cizích genů u buněk Spodoptera frugiperda nebo larev Trichoplusia. Sekvence kódující polypeptid mohou být klonovány do neesenciálního regionu viru, jako je polyhedrin gen a umístit pod kontrolu polyhedrin promotoru. Úspěšná inzerce sekvence kódující polypeptid vyžaduje inaktivní polyhedrin gen a vytváří rekombinantní virus, který není pokryt proteinem. Rekombinantní viry lze potom použít například pro infikování buněk S. frugiperda nebo larev Trichoplusia, ve kterých může být požadovaný polypeptid exprimován (Engelhard E. K. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci., 91, 3224 - 3227 (1994)).
U savčích hostitelských buněk je obecně dostupná řada expresních systémů založených na virech. Například v případech, kde se používá adenovirus jako expresní vektor, mohou být sekvence kódující požadovaný polypeptid ligovány k • «
• ··♦· • * 9
999
adenovirovému komplexu transkripce/translace sestávajícím z pozdního promotoru a trojdílné vedoucí sekvence. Inzerce u neesenciálního El nebo E3 regionu virového genomu lze použít, aby se získal životaschopný virus, který je schopný exprese polypeptidu v infikovaných hostitelských buňkách (Logan J. a Shenk T. , Proč. Nati. Acad. Sci., 81, 3655 3659 (1984)). Navíc lze použít enhancery transkripce, jako je enhancer Rous sarcoma viru (RSV) ke zvýšení exprese u savčích hostitelských buněk.
Specifické iniciační signály lze rovněž použít k tomu, aby se dosáhlo účinnější translace sekvence, kódující požadovaný polypeptid. Takové signály zahrnují ATG iniciační kodón a sousedící sekvence. V případech, kdy se sekvence kódující polypeptid, její iniciační kodón a sekvence směrem k počátku vloží do vhodného expresního vektoru, nemusí být potřebné žádné další kontrolní signály transkripce a translace. Nicméně v případech, kdy se vloží pouze kódující sekvence nebo její část, měly by se poskytnout také exogenní kontrolní signály translace, včetně iniciačního ATG kodónu. Navíc by iniciační kodón měl být ve správném čtecím rámci, aby se zajistila translace celé vložené části. Exogenní translaóní prvky a iniciační kodóny mohou být různého původu, jak přírodního, tak syntetického. Účinnost exprese lze zvýšit začleněním enhancerů, které jsou vhodné pro určitý buněčný systém, který se použije, jako jsou enhancery popsané v literatuře (Scharf D. a kol., Results Probl. Cell Differ., 20, 125 - 162 (1994)).
Navíc lze kmen hostitelské buňky zvolit pro jeho schopnost modulovat expresi vložených sekvencí nebo zahájit expresi proteinu požadovaným způsobem. Takové modifikace polypeptidu zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, acetalaci, · · «·«· ··· karboxylaci, glykosylaci, fosforylaci, lipidaci a acylaci. Posttranslační zpracování, které štěpí prepro formy proteinu, lze rovněž použít, aby se usnadnila oprava inzerce, skládání a/nebo funkce. Lze zvolit rozdílné hostitelské buňky, jako jsou CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 a WI38, které mají specifický buněčný aparát a charakteristické mechamismy pro takové posttranslační aktivity, aby se zajistila oprava modifikace a zpracování daného cizího proteinu.
Pro dlouhodobou tvorbu rekombinantních proteinů s vysokým výtěžkem je obecně výhodná stabilní exprese. Například lze transformovat buněčné linie, které stabilně exprimují požadovaný polynukleotid, za použití expresních vektorů, které mohou obsahovat prvky replikace virového původu a/nebo prvky endogenní exprese a selektabilní markerový gen na tomtéž nebo na samostatném vektoru. Po introdukci vektorů se mohou buňky nechat růst po dobu 1 až 2 dnů v obohaceném mediu předtím, než jsou přeneseny do selektivního media. Účelem selektabilního markéru je dosáhnout rezistenci k selekcei, a jeho přítomnost umožňuje růst a obnovu buněk, které s úspěchem exprimují introdukované sekvence. Rezistentní klony stabilně transformovaných buněk lze proliferovat za použití způsobů tkáňových kultur, které jsou vhodné pro daný buněčný typ.
Lze použít jakýkoli počet selekčních systémů, aby se obnovily transformované buněčné linie. Tyto systémy zahrnují geny thymidinové kinázy viru herpes simplex (Wigler M. a kol., Cell, 11, 223 - 232 (1977)) a adeninfosforibosyltransferázy (Lowy I. a kol., Cell, 22, 817 - 823 (1990)), které lze využít u tk. sup. nebo aprt. sup. buněk, ale nejsou na ně omezeny. Také lze použít antimetabolitové, «««· • * · · • · ♦ · · — 68 **· ··♦ ·* * antibiotické nebo herbicidní rezistence jako základ pro selekci, například dhfr, který přináší rezistenci na methotrexát (Wigler M. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. 77, 3567 - 3570 (1980)), npt, který přináší rezistenci na aminoglykosidy, neomycin a G-418 (Colbere-Garapin F. a kol. J. Mol. Biol., 150, 1-14 (1981)) a ais nebo pat, které přinášejí rezistenci na chlorsulfuronovou nebo fosfinotricinovou acetyltransferázu (Murry, viz výše). Jsou popsány další selektabilní geny, například trpB, který umožňuje buňkám, aby využívaly indol místo tryptofanu, nebo hisD, který umožňuje buňkám, aby využívaly histinol místo histidinu (Hartman S. C. a Mulligan R. C., Proč. Nati. Acad Sci, 85., 8047 - 8051 (1988)). Použití viditelných markérů získalo popularitu u takových markérů, jako jsou anthokyanin, beta-glukuronidasa a její substrát GUS, luciferasa a její substrát luciferin, které se široce používají nejen k identifikaci transformantů, ale také ke kvantifikaci množství proměnlivé nebo stabilní exprese proteinu, přináležející ke specifickému vektorovému systému (Rhodes C. A. a kol., Methods Mol. Biol., 55, 121 - 131 (1995) ) .
Ačkoli přítomnost/absence markéru genové exprese naznačuje, že požadovaný gen je rovněž přítomen, jeho přítomnost a exprese může vyžadovat potvrzení. Například pokud je sekvence kódující polypeptid vložena v sekvenci markerového genu, lze rekombinantní buňky obsahující sekvence identifikovat pomocí toho, že chybí funkce markerového genu. Popřípadě může být markerový gen umístěn v tandemu se sekvencí kódující polypeptid za kontroly jednoduchého promotoru. Exprese markerového genu v odpovědi na indukci nebo selekci obvykle také indikuje expresi tandemového genu.
> · ♦ « ·· ·*
- 69 .-5 ♦ **· ·· • ♦
Popřípadě lze identifikovat hostitelské buňky, které obsahují a exprimují požadovanou polynukleotidovou sekvenci řadou způsobů známých odborníkovi v oboru. Tyto způsoby zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, DNA-DNA nebo DNA-RNA hybridizace a způsoby proteinových biozkoušek nebo imunozkoušek, které zahrnují například způsoby, založené na membráně, roztoku nebo čipové technologii pro detekci a/nebo kvantifikaci nukleové kyseliny nebo proteinu.
V oboru je známa řada protokolů pro detekci a měření exprese produktů kódovaných polynukleotidy, které používají buď polyklonální nebo monoklonální protilátky specifické pro produkt. Příklady zahrnují enzymovou imunoanalýzu (ELISA), radioimunoanalýzu (RIA) a fluorescencí aktivované třídění buněk (FACS). Dvojstranná enzymová imunoanalýza založená na monoklonálních protilátkách reaktivních vůči dvěma neinterferujícím epitopům na daném polypeptidů může být výhodná pro některá využití, ale rovněž lze využít zkoušku kompetitivní vaznosti. Tyto a další zkoušky jsou, kromě dalších míst, popsány v Hamptom R. a kol. (Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St. Paul, Minn. (1990)) a Maddox D. E. a kol. (J. Exp. Med., 158, 1211 1216 (1983)).
Odborníkovi v oboru je známa celá řada způsobů značení a konjugace a mnoho z nich lze použít v různých zkouškách nukleových kyselin a aminokyselin. Způsoby tvorby značené hybridizace nebo PCR sondy pro detekci sekvencí souvisejících s polynukleotidy zahrnují oligoznačení, nick translaci, koncové značení nebo PCR amplifikaci, používající značený nukleotid. Popřípadě lze sekvence nebo jejich části klonovat do vektoru pro tvorbu mRNA sondy. Takové vektory *
• · * * ·· jsou známy v oboru, jsou komerčně dostupné a lze je použít pro syntézu RNA sondy in vitro dodáním vhodné RNA polymerasy, jako je T7, T3 nebo SP6 a značených nukleotidů. Tyto způsoby lze uskutečnit za použití řady komerčně dostupných kitů. Vhodné reportérové molekuly nebo značení, které lze použít, zahrnují radionuklidy, enzymy, fluorescenční činidla, chemiluminiscenční činidla nebo chromogenní činidla, stejně jako substráty, kofaktory, inhibitory, magnetické částice a podobně.
Hostitelské buňky transformované požadovanou polynukleotidovou sekvencí lze kultivovat za podmínek vhodných pro expresi a obnovu proteinu z buněčné kultury. Protein, který je vytvářen rekombinantní buňkou, může být sekretován nebo může být přítomen intracelulárně v závislosti na použité sekvenci a/nebo vektoru. Jak je zřejmé odborníkovi v oboru, expresní vektory obsahující polynukleotidy podle tohoto vynálezu lze navrhnout tak, aby obsahoval signální sekvence, které řídí sekreci kódovaného polypeptidů přes buněčnou membránu prokaryont nebo eukaryont Lze použít jiné rekombinantní konstrukty ke spojení sekvencí kódujících požadovaný polypeptid se sekvencí nukleotidů kódující polypeptidovou doménu, která usnadní čištění rozpustných proteinů. Takové domény usnadňující čištění zahrnují, ale nejsou na ně omezeny, peptidy chelátující kovy, jako jsou histidin-tryptofanové moduly, které umožňují čištění imobilizovaných kovů, domény proteinu A, které umožňují čištění na imobilizovaném imunoglobulinu a další doménu využívanou v čistícím systému FLAGS extenze/afinita (Immunex Corp., Seattle, Wash.). Začlenění štěpitelných linkerových sekvencí, jako jsou sekvence specifické pro faktor XA nebo enterokinázu (Invitrogen, San Diego, Kalif.) mezi doménu čištění a kódovaný polypeptid lze využít, aby se ·· ·*··
• *··· »· · • «·· • · • ·
9Λ· ··« ·* ·»·· ·· · · • · · • · · • · · · ·· ·· usnadnilo čištění. Jeden takový expresní vektor poskytuje pro expresi fuzní protein obsahující požadovaný polypeptid a nukleové kyseliny kódující 6 histidinových zbytků před thioredoxinovým nebo enterokinázovým místem štěpení. Histidinové zbytky usnadňují čištění na IMIAC (afinitní chromatografie s imobilizovaným iontem kovu), jak je popsáno v Porah J. a kol. (Prot. Exp. Purif., 3, 263 - 281 (1992)), zatímco místo štěpení enterokinázou poskytuje způsob čištění požadovaného polypeptidu od fuzního proteinu. Pojednání o vektorech, které obsahují fuzní proteiny, je poskytnuto v Kroll D. J. a kol. (DNA Cell Biol., 12, 441 - 453 (1993)).
Kromě rekombinantních způsobů tvorby lze polypeptidy podle tohoto vynálezu a jejich fragmenty vytvářet přímou peptidovou syntézou za použití způsobů v pevné fázi (Merrifield J., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149 - 2154 (1963)). Syntézu proteinů lze uskutečnit za použití manuálních způsobů nebo automatizovaně. Automatizované syntézy lze dosáhnout například za použití peptidového syntetizeru Applied Biosystems 431A (Perkin Elmer). Popřípadě lze různé fragmenty chemicky syntetizovat odděleně a kombinovat je za použití chemických způsobů, aby se vytvářela molekula o plné délce.
Protilátkové prostředky, jejich fragmenty a jiná vazebná činidla
Podle jiného aspektu, tento vynález dále poskytuje vazebná činidla, jako jsou protilátky a jejich fragmenty, které vážou antigen, které vykazují imunologickou vazbu na tumorový polypeptid, který je zde popsán nebo na jeho část, variantu nebo derivát. Protilátka nebo její fragment, který váže antigen, je označen jako specificky vazebný,
- 72 -i imunologicky vazebný a/nebo je imunologicky reaktivní s polypeptidem podle tohoto vynálezu, pokud reaguje na detekovatelné úrovni (v rámci například analýzy ELISA) s daným polypeptidem a nereaguje detekovatelné s nepříbuznými polypeptidy za podobných podmínek.
Imunologická vazba zde v kontextu odkazuje na nekovalentní interakce toho typu, který se vyskytuje mezi molekulou imunoglobulinu a antigenem, vůči kterému je imunoglobulin specifický. Síla nebo afinita imunologických vazebných interakcí může být vyjádřena jako disociační konstanta (¾) interakce, ve které menší představuje větší afinitu. Imunologické vazebné vlastnosti zvolených polypeptidů lze kvantifikovat za použití způsobů dobře známých v oboru. Jedna taková metoda spočívá v měření rychlosti tvorby a disociace komplexu místa vážícího antigen s antigenem, ve které tyto rychlosti závisí na koncentraci partnerů tohoto komplexu, afinitě interakce a geometrických parametrech, které stejně ovlivňují rychlost v obou směrech. Takto lze určit jak konstantu rychlosti asociace (Kon), tak konstantu rychlosti disociace (KQ^^) pomocí výpočtu koncentrací a skutečných rychlostí asociace a disociace. Poměr Koff/Kon umožňuje vyloučení všech parametrů, které se netýkají afinity a je roven disociační konstantě K^. Obecně viz Davies a kol., Annual Rev.
Biochem., 59, 439 - 473 (1990).
Místo vážící antigen nebo vazebná část protilátky se vztahuje na část molekuly imunoglobulinu, která se účastní na vazbě antigenu. Toto místo vážící antigen je tvořeno zbytky aminokyselin na N-koncových variabilních (V) regionech těžkých (H) a lehkých (L) řetězců. Na tři vysoce odlišné úseky v rámci V regionů těžkého a lehkého • · · · řetězce se odkazuje jako na hypervariabilní regiony, které jsou vloženy mezi více zachované přilehlé úseky, známé jako rámcové regiony neboli FRs. Tak se pojem FR vztahuje na sekvence aminokyselin, které se nacházejí přirozeně mezi a v sousedství hypervariabilních regionů v imunoglobulinech. V molekule protilátky jsou umístěny tři hypervariabilní regiony lehkého řetězce a tři hypervariabilní regiony těžkého řetězce vzájemně k sobě v třírozměrném prostoru, aby se vytvořil povrch, který váže antigen. Povrch vážící antigen je komplementární k třírozměrnému povrchu navázaného antigenu a tři hypervariabilní regiony jak lehkého, tak těžkého řetězce se označují jako regiony určující komplementaritu neboli CDRs.
Vazebná činidla mohou být dále schopna rozlišit mezi pacienty, kteří mají a kteří nemají rakovinu, jako je rakovina prsu, za použití reprezentativních zkoušek, které jsou zde poskytnuty. Například protilátky nebo jiná vazebná činidla, která se váží na tumorový protein, tvoří výhodně signál, indikující přítomnost rakoviny nejméně u přibližně 20 % pacientů s nemocí, výhodněji nejméně u přibližně 30 % pacientů. Popřípadě, nebo kromě toho, protilátka tvoří výhodně negativní signál, indikující nepřítomnost rakoviny nejméně u přibližně 90 % osob, které nemají rakovinu. Aby se určilo, zda vazebné činidlo splňuje tyto požadavky, lze zkoušet biologické vzorky (například krev, sérum, sputum, moč a/nebo tumorové biopsie) od pacientů, kteří mají a kteří nemají rakovinu (jak se určí standardními klinickými testy), jak je zde popsáno pro přítomnost polypeptidů, které se vážou na vazebné činidlo. Výhodně se zkouší statisticky významný počet vzorků s nemocí a bez ní. Každé vazebné činidlo by mělo splňovat kriteria uvedená výše, nicméně odborníkovi v oboru bude zřejmé, že vazebná činidla lze • · · · • · · · ·· ·· používat v kombinaci, aby se zlepšila citlivost.
Každé činidlo, které splňuje požadavky, uvedené výše, může být vazebným činidlem. Například vazebným činidlem může být ribozom s nebo bez peptidové složky, molekula RNA nebo polypeptid. Ve výhodném ztělesnění je vazebným činidlem protilátka nebo její fragment, který váže antigen.
Protilátky lze připravit kterýmkoli z řady způsobů, známých odborníkovi v oboru. Viz například Harlow a Lané, Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Obecně řečeno, protilátky mohou být vytvářeny způsoby buněčných kultur, včetně tvorby monoklonálních protilátek, jak je zde popsáno, nebo cestou transfekce protilátkových genů do vhodných hostitelských bakteriálních nebo savčích buněk, aby se umožnila tvorba rekombinantních protilátek. V jednom způsobu se iniciálně vpraví injekčně imunogen, který obsahuje polypeptid do kteréhokoli z řady savců (například do myší, krys, králíků, ovcí nebo koz). V tomto kroku mohou polypeptidy podle tohoto vynálezu sloužit jako imunogeny bez modifikace. Popřípadě, zejména u relativně krátkých polypeptidů, lze lepší imunitní odpovědi dosáhnout, pokud se polypeptid spojí s nosným proteinem, jako je bovinní sérový albumin nebo keyhole limpet hemokyanin. Imunogen se vpraví injekčně do zvířecího hostitele, výhodně podle předem určeného plánu, který zahrnuje jednu nebo více opakovaných imunizací a zvířatům se periodicky odebírá krev.
Polyklonální protilátky specifické pro polypeptid lze potom čistit od takového antisera pomocí například afinitní chromatografie za použití polypeptidů navázaného na vhodný pevný substrát.
Monoklonální protilátky specifické pro požadovaný antigenní polypeptid lze připravit například za použití ···· ···· způsobu Kohlera a Milsteina, Eur. J. Immunol. 6, 511 - 519 (1976) a jeho zlepšení. Stručně řečeno, tyto způsoby zahrnují preparaci imortálních buněčných linií, které jsou schopny tvorby protilátek, které mají požadovanou specificitu (t. j. reaktivitu s požadovaným polypeptidem). Takové buněčné linie mohou být vytvářeny například z buněk sleziny získaných ze zvířete imunizovaného tak, jak je popsáno výše. Buňky ze sleziny se poté imortalizují například fúzí s myelomatickým buněčným fuzním protějškem, výhodně s tím, který je syngenní s imunizovaným zvířetem.
Lze využít řadu způsobů fuze. Například lze kombinovat slezinné buňky a myelomové buňky s neionickým detergentem po dobu několika minut a potom naplotnovat při nízké denzitě na selektivní medium, které podporuje růst hybridních buněk, ale nikoli myelomových buněk. Výhodné selekční způsoby používají selekci HAT (hypoxanthin, aminopterin, thymidin). Po uplynutí dostatečné doby, obvykle přibližně 1 až 2 týdnů, se pozorují kolonie hybridů. Jednoduché kolonie se selektují a supernatanty jejich kultur se testují na vazebnou aktivitu vůči polypeptidu. Hybridomy, které mají vysokou reaktivitu a specifitu, jsou výhodné.
Monoklonální protilátky lze izolovat ze supernatantů rostoucích kolonií hybridomů. Kromě toho lze využít různé způsoby, aby se zvýšil výtěžek, jako je injekce buněčných linií hybridomů do peritoneální dutiny vhodného obratlovce, jako je myš. Monoklonální protilátky lze potom dostat z tekutiny ascitu nebo z krve. Kontaminující látky lze odstranit z protilátky obvyklými způsoby, jako je chromatografie, gelová filtrace, precipitace a extrakce. Polypeptidy podle tohoto vynálezu lze použít v čistícím procesu například v kroku afinitní chromatografie.
·· ····
V oboru je známa řada terapeuticky použitelných molekul, které zahrnují místa vážící antigen, které jsou schopny vykázat imunologické vazebné vlastnosti molekuly protilátky. Proteolytický enzym papain přednostně štěpí molekuly IgG, aby se dostalo několik fragmentů, z nichž jsou dva fragmenty (F(ab) fragmenty), u kterých každý z nich zahrnuje kovalentní heterodimer, který obsahuje intaktní místo, které váže antigen. Enzym pepsin je schopný štěpit molekuly IgG, aby se dostalo několik fragmentů včetně F(ab)2 fragmentu, který zahrnuje obě místa vážící antigen. Fv fragment může být tvořen přednostním proteolytickým štěpením molekuly IgM a ve vzácných příležitostech molekuly IgG nebo IgA. Fv fragmenty jsou nicméně častěji odvozeny za použití rekombinantních způsobů známých v oboru. Fv fragment zahrnuje nekovalentní V^::VL heterodimer včetně místa vážícího antigen, které si udržuje mnoho ze schopnosti přírodní molekuly protilátky rozpoznat a vázat antigen.
Inbar a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA 69, 2659 - 2662 (1972), Hochman a kol., Biochem., 15, 2706 - 2710 (1976), Ehrlich a kol., Biochem., 19, 4091 - 4096 (1980).
Polypeptid o jednom řetězci FV (sFV) je kovalentně spojen s V^::VL heterodimerem, který je exprimován z fuzního genu včetně VH~ a VL~ kódujících genů spojených linkerem, kódujícím peptid. Huston a kol., Proč Nat. Acad. Sci. USA 85(16) , 5879 - 5883 (1988). Mnoho způsobů je popsáno proto, aby se rozeznaly chemické struktury pro konvertující přirozeně agregované, ale chemicky oddělené lehké a těžké polypeptidové řetězce od regionu V protilátky v molekule sFv, který se skládá do třírozměrné struktury v zásadě podobné struktuře místa, které váže antigen. Viz například US patenty č. 5 091 513 a 5 132 405, Houston a kol., a US patent č. 4 946 778 a Ladner a kol.).
• ·
Každá z molekul, které jsou popsány výše, zahrnuje CDR set s těžkým a lehkým řetězcem, vložený mezi FR set s těžkým a lehkým řetězcem, který poskytuje podporu CDRS a definuje prostorový vztah CDRs ve vztahu jednoho k druhému. Pojem CDR set se zde používá pro označení tří hypervariabilních regionů V regionu těžkého nebo lehkého řetězce. Postupně od N-konce těžkého nebo lehkého řetězce se tyto regiony označují jako CDR1, CDR2 a CDDR3 v tomto pořadí. Proto místo, které váže antigen, zahrnuje šest CDRs, které zahrnují CDR set od každého V regionu těžkého a lehkého řetězce. Polypeptid, který zahrnuje samotný CDR (například CDR1, CDR2 nebo CDR3) se zde označuje jako molekulární rozpoznávací jednotka. Krystalografická analýza řady komplexů antigenu s protilátkou ukazuje, že zbytky aminokyselin CDRs tvoří silný kontakt s navázaným antigenem, ve kterém je nej silnější antigenní kontakt s těžkým řetězcem CDR3. Tak jsou molekulární rozpoznávací jednotky primárně zodpovědné za specificitu místa, které váže antigen.
Pojem FR set je zde používán pro označení čtyř přilehlých sekvencí aminokyselin, které rámcují CDRs CDR setu V regionu těžkého nebo lehkého řetězce. Některé zbytky FR mohou kontaktovat navázaný antigen, nicméně FRs jsou primárně odpovědné za skládání V regionu do místa, které váže antigen, zejména zbytky FR přímo sousedící s CDRs.
V rámci FRs jsou určité zbytky aminokyselin a určité strukturní prvky velmi vysoce zachované. V tomto ohledu obsahují všechny sekvence V regionů vnitřní disulfidické kličky o přibližně 90 aminkyselinových zbytcích. Když se
V regiony složí do místa, které váže antigen, CDRs se zobrazí jako projektivní kličkové motivy, které tvoří povrch, který váže antigen. Obecně se uznává, že existují
- 78 zachované strukturní regiony FRs, které ovlivňují složený tvar CDR kliček do určitých kanonických struktur, bez ohledu na přesnou sekvenci aminokyselin CDR. Dále je známo, že se určité FR zbytky účastní nekovalentních mezidoménových kontaktů, které stabilizují interakci těžkých a lehkých řetězců protilátky.
Je popsána řada molekul humanizovaných protilátek, které zahrnují místo, které váže antigen, odvozených od nehumánních imunoglobulinů, včetně chimérických protilátek, které mají hlodavčí V regiony a jejich asociované CDRs fúzované s lidskými konstantními doménami (Winter a kol., Nátuře, 349, 293 - 299 (1991), Lobuglio a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 86, 4220 - 4224 (1989), Shaw a kol., J. Immunol., 138, 4534 - 4538 (1987) a Brown a kol., Cancer Res. 47, 3577 - 3583 (1987)), hlodavci CDRs vštěpené do lidských podpůrných FR předtím, než se fuzují s vhodnou lidskou protilátkovou konstantní doménou (Riechmann a kol., Nátuře, 332, 323 - 327 (1988), Verhoeyen a kol., Science,
239, 1534 - 1536 (1988) a Jones a kol., Nátuře, 321, 522 525 (1986)) a hlodavčí CDRs podporované rekombinantně zamaskovanými hlodavčími FRs (evropská patentová přihláška publikačního čísla 519 596, publikovaná 23. 12. 1992). Tyto humanizované molekuly se navrhují, aby se minimalizovala nežádoucí imunologická odpověď na hlodavčí molekuly protilidských protilátek, které limitují trvání a účinnost léčebného podání těchto podílů u lidských příjemců.
Pojem maskované FRs a rekombinantně maskované FRs zde označuje selektivní náhradu zbytků FR od například hlodavčího V regionu těžkého nebo lehkého řetězce za lidské FR zbytky, aby se dostala xenogenní molekula, která zahrnuje místo, které váže antigen, které si zachovává v zásadě • ·*·· ·· ···· ·· ···· • · · ·· ··· · ···· · · · · · · ·· ·· všechny nativní FR polypeptidové skládací struktury.
Maskovací způsoby jsou založeny na pochopení, že vlastnosti, vážící ligand místa, které váže antigen, jsou primárně určeny strukturou a relativním rozmístěním CDR setů těžkého a lehkého řetězce v rámci povrchu, který váže antigen.
Davies a kol., Ann. Rev. Biochem., 59, 439 - 473 (1990). Tak může být zachována antigen vážící specificita u humanizované protilátky pouze tam, kde jsou CDR struktury, jejich vzájemné interakce a jejich interakce s doménami zbytku V regionu pečlivě zachovány. Použitím maskovacích způsobů jsou vnější (například ty, které jsou přístupné rozpouštědlu) FR zbytky, které se přímo setkávají s imunitním systémem, selektivně nahrazeny lidskými zbytky, aby se dostala hybridní molekula, která zahrnuje buď slabě imunogenní nebo v zásadě neimunogenní maskovaný povrch.
Při způsobu maskování se používají dostupná sekvenční data pro variabilní domény lidských protilátek, sestavených Rabatem a kol., v Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vyd. (U.S. Dept. of Health and Human Services, U. S. Government Printing Office, 1987), aktualizovaném do Rabatový databáze a jiné přístupné databáze v USA a jiných státech (jak nukleových kyselin, tak proteinů). Přístupnost rozpouštědla k aminokyselinám V regionu lze dedukovat ze známé trojrozměrné struktury lidských a myších fragmentů protilátek. Existují dva obecné kroky při maskování myšího místa, které váže antigen. Iniciálně se srovnají FRs variabilních domén požadované molekuly protilátky s odpovídajícími FR sekvencemi lidských variabilních domén, získaných ze zdrojů, které jsou uvedeny výše. Nejvíce homologní lidské V regiony se potom srovnají zbytek po zbytku s odpovídajícími myšími aminokyselinami. Zbytky u myší FR, které se liší od lidských protějšků, se nahradí
4444 4« ···· • · · 4 · 4 4 4 4 • 4 4 4 ··· 44 ·
4 zbytky přítomnými v lidském podílu za použití rekombinantních způsobů, které jsou dobře známé v oboru. Záměna zbytků se provádí pouze u podílů, které jsou alespoň částečně vystaveny (přístupné rozpouštědlu) a péče se věnuje náhradě aminokyselinových zbytků, které mohou mít významný efekt na terciární strukturu domén V regionu, jako jsou prolin, glycin a aminokyseliny s nábojem.
Tímto způsobem se výsledná maskovaná myší místa, která váží antigen navrhnou tak, aby si zachovala myší CDR zbytky, zbytky zásadně sousedící s CDRs, zbytky identifikované jako skryté nebo z větší části skryté (nepřístupné rozpouštědlu), zbytky, u kterých se má za to, že se účastní nekovalentních (například elektrostatických nebo hydrofobních) kontaktů mezi doménami těžkého a lehkého řetězce a zbytky ze zachovaných strukturních regionů FRs, o kterých se má za to, že mají vliv na kanonické terciární struktury CDR kliček. Tato kriteria pro navrhování se potom použijí, aby se připravily rekombinantní nukleotidové sekvence, které spojují CDRs jak těžkého, tak lehkého řetězce myšího místa, které váže antigen na lidsky vypadající FRs, které lze použít k transfekci savčích buněk po expresi rekombinantních lidských protilátek, které vykazují antigenní specificitu molekuly myší protilátky.
V jiném ztělesnění tohoto vynálezu lze spojovat monoklonální protilátky podle tohoto vynálezu s jednou nebo více terapeutickými látkami. Vhodné látky v tomto ohledu zahrnují radionuklidy, induktory diferenciace, léčiva, toxiny a jejich deriváty. Výhodné radionuklidy zahrnují 90Y, 123Iř 125-J-, 131If 186Re, 188Re, 211At a 212Bi. Výhodná léčiva zahrnují methotrexat a analoga pyrimidinu a purinu. Výhodné induktory diferenciace zahrnují estery forbolu a ·· ··· · ···· ···
• · · ·· kyseliny máselné. Výhodné toxiny zahrnují ricin, abrin, difteriový toxin, cholerový toxin, gelonin, pseudomonádový exotoxin, shigelový toxin a antivirový protein z líčidla amerického.
Terapeutické látky lze spojovat (například kovalentně vázat) s vhodnou monoklonální protilátkou buď přímo nebo nepřímo (například přes linkerovou skupinu). Přímá reakce mezi látkou a protilátkou je možná, pokud každá z nich obsahuje substituent, který je schopný reagovat s druhým substituentem. Například nukleofilní skupina, jako je aminoskupina nebo merkaptoskupina na jedné straně může být schopna reakce se skupinou, obsahující karbonyl, jako je anhydrid nebo halogenid kyseliny, nebo s alkylovou skupinou, obsahující dobře odstupující skupinu (například halogenid) na straně druhé.
Popřípadě může být žádoucí spojit terapeutickou látku a protilátku prostřednictvím linkerové skupiny. Linkerová skupina může fungovat jako vložka pro udržení odstupu protilátky od činidla, aby nedošlo k interferenci s vazebnými schopnostmi. Linkerová skupina může rovněž sloužit ke zvýšení chemické reaktivity substituentu na činidle nebo na protilátce a tak zvýšit vazebnou účinnost. Vzestup chemické reaktivity může rovněž usnadnit použití činidel nebo funkčních skupin činidel, které by jinak nebylo možné.
Odborníkovi v oboru bude zřejmé, že lze použít řadu bifunkčních nebo polyfunkčních reagencií, jak homofunkčních tak heterofunkčních (jako jsou ta reagencia, která jsou popsána v katalogu Pierce Chemical Co., Rockford, IL) jako linkerovou skupinu. Spojení může být uskutečněno například ·· ···· • ·· · •4 ···· ·· · · · ··· · · • · · · · · • · · · · _>····« ·· ♦ přes aminoskupiny, karboxylové skupiny, merkaptoskupiny nebo oxidované sacharidové zbytky. Existuje řada odkazů, které popisují takové způsoby, například US patent č. 4 671 958 Rodwella a kol.
Pokud je terapeutická látka účinnější, je-li nespojená s částí protilátky imunokonjugátů podle tohoto vynálezu, může být žádoucí použít linkerovou skupinu, která je odštěpitelná během toho, co se dostane dovnitř buňky nebo na ni. Je popsána řada odštěpitelných linkerových skupin. Mechanismy intracelulárního uvolnění látky od linkerových skupin zahrnuj i odštěpení prostřednictvím redukce disulfidových vazeb (například US patent č. 4 489 710 Spitlera), ozáření fotolabilních můstků (například US patent č. 4 625 014 Sentera a kol.), hydrolýzu derivatizovaných aminokyselinových postranních řetězců (například US patent č. 4 638 045 Kohna a kol.), sérovou komplementem zprostředkovanou hydrolýzu (například US patent č. 4 671 958 Rodwella a kol.) a hydrolýzu katalyzovanou kyselinou (například US patent č. 4 569 789 Blattera a kol.).
Může být žádoucí spojit více než jedno činidlo s protilátkou. V jednom ztělesnění se spojují vícečetné molekuly činidla s jednou molekulou protilátky. V jiném ztělesnění může být spojeno více než jeden druh činidla s jednou protilátkou. Bez ohledu na určité ztělesnění mohou být imunokonjugáty s více než jedním činidlem připraveny řadou způsobů. Například více než jedno činidlo může být spojeno přímo s molekulou protilátky nebo se může použít linker, který má vícečetná místa pro připojení. Popřípadě lze použít nosič.
Nosič může nést činidla řadou způsobů, včetně
- 83 -* • 000
0000
0000 í 0 · 4 • 0 0· kovalentního spojení buď přímo nebo přes linkerovou skupinu. Vhodné nosiče zahrnují proteiny, jako jsou albuminy (například US patent č. 4 507 234 Kato a kol.), peptidy a polysacharidy, jako je aminodextran (například US patent č. 4 699 784 Shiha a kol.). Nosič může rovněž nést látku nekovalentní vazbou nebo enkapsulací, jako je uvnitř lipozomového vesikula (například US patenty č. 4 429 008 a 4 873 088). Nosiče specifické pro radionuklidy zahrnují malé molekuly a chelátotvorné látky značené atomem radioaktivního halogenu a chelátotvorné látky. Například US patent č. 4 735 792 popisuje reprezentativní malé molekuly značené atomem radioaktivního halogenu a jejich syntézu. Radionuklidové cheláty lze vytvořit z chelátotvorných sloučenin, které zahrnují ty látky, obsahující atomy dusíku nebo síry jako donory pro vazbu kovového radionuklidu nebo kovového radionuklidu ve formě oxidu. Například US patent č. 4 673 562 Davisona a kol. popisuje reprezentativní chelátující látky a jejich syntézu.
Prostředky T-buněk
Tento vynález poskytuje v dalším aspektu T-buňky specifické pro tumorový polypeptid, který je zde popsán nebo pro jeho variantu nebo derivát. Takové buňky lze obecně připravit in vítro nebo ex vivo za použití standardních způsobů. Například T-buňky mohou být izolovány z kostní dřeně, periferní krve nebo frakce kostní dřeně nebo periferní krve pacienta za použití komerčně dostupného systému separace buněk, jako je Isolex ™ systém, dostupný od Nexell Therapeutics, lne. (Irvine, CA, viz také US patent č. 5 240 856, US patent č. 5 215 926, WO 89/06280, WO 91/16116 a WO 92/07243). Alternativně mohou být T-buňky odvozeny od příbuzných nebo nepříbuzných lidských nebo
4·«· ·«« • ·*· «
« 4 · 4 44 «
• 44 • 4
nehumánních savčích buněčných linií nebo kultur.
T-buňky lze stimulovat polypeptidem, polynukleotidem kódujícím polypeptid a/nebo antigen prezentující buňkou (APC), která exprimuje takový polypeptid. Taková stimulace se uskutečňuje za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se umožnilo vytvoření T-buněk, které jsou specifické pro požadovaný polypeptid. Výhodně je tumorový polypeptid nebo polynukleotid podle tohoto vynálezu přítomen uvnitř vehikula, ve kterém je podán, jako je mikrokulička, aby se usnadnilo vytvoření specifických T-buněk.
T-buňky se považují za specifické pro polypeptid podle tohoto vynálezu, pokud T-buňky specificky proliferují, sekretují cytokiny nebo zabíjejí cílové buňky, pokryté polypeptidem nebo exprimující gen kódující polypeptid. T-buněčná specificita se může hodnotit za použití kteréhokoli ze standardních způsobů. Například v rámci zkoušky uvolňování chrómu nebo zkoušky proliferace indikuje specificitu T-buněk index stimulace, který ukazuje více než dvojnásobný nárůst lýzy a/nebo proliferace ve srovnání s negativní kontrolou. Takové zkoušky lze provést například, jak je popsáno v Chen a kol., Cancer Res., 54, 1065 - 1070 (1994). Jinak se může detekce proliferace T-buněk uskutečnit řadou známých způsobů. Například lze proliferaci T-buněk detekovat měřením vzrůstu rychlosti syntézy DNA (například pulzním značením kultur T-buněk thymidinem, značeným triciem a měřením množství thymidinu, značeného triciem, který je inkorporován do DNA). Kontakt s tumorovým polypeptidem (100 ng/ml až 100 ^g/ml, výhodně 200 ng/ml až 25 p,g/ml) po dobu 3 až 7 dnů má obvykle za následek dvojnásobný nárůst proliferace T-buněk. Kontakt, jak je popsáno výše, po dobu 2 až 3 hodin by měl mít za následek aktivaci T-buněk, jak se ·» ···· * * · • » ®
«·*· • · * · • · · · měří za použití standardních cytokinových zkoušek, v nichž dvojnásobný nárůst hladin uvolňování cytokinů (například TNF nebo IFN-gama) indikuje aktivaci T-buněk (viz Coligan a kol., Current Protocols in Immunology, svazek 1, Wiley Intercsience (Greene 1998)). T-buňky, které byly aktivovány v odpovědi na tumorový polypeptid, polynukleotid nebo APC exprimující polypeptid mohou být CD4+ a/nebo CD8+.
Specifické T-buňky na tumorový polypeptid se mohou rozšiřovat za použití standardních způsobů. V rámci výhodných ztělesnění jsou T-buňky odvozeny od pacienta, příbuzného dárce nebo nepříbuzného dárce a podají se pacientovi po stimulaci a rozšíření.
Pro terapeutické účely lze CD4+ nebo CD8+ T-buňky, které proliferují v odpovědi na tumorový polypeptid, polynukleotid nebo APC rozmnožit buď in vitro nebo in vivo. Proliferaci takových T-buněk in vitro lze uskutečnit řadou způsobů. Například mohou být T-buňky opětovně vystaveny tumorovému polypeptidu nebo krátkému peptidu odpovídajícímu imunogenní části takového polypeptidu, s přidáním nebo bez přidání T-buněčných růstových faktorů, jako je interleukin-2 a/nebo stimulačních buněk, které syntetizují tumorový polypeptid. Alternativně může být jedna nebo více T-buněk, které proliferují v přítomnosti tumorového polypeptidu, rozmnožena klonováním. Způsoby klonování buněk jsou dobře známy v oboru a zahrnují limitní ředění.
Farmaceutické prostředky
V dalších ztělesněních se tento vynález zaměřuje na přípravu prostředků s jedním nebo více polynukleotidy, polypeptidy, T-buňkami a/nebo protilátkami, které jsou zde popsány ve farmaceuticky vhodných nosičích pro podání do • ·· buňky nebo zvířeti buď samotných nebo v kombinaci s jedním nebo více prostředky léčení.
Je zřejmé, že pokud je to žádoucí, prostředek, jak je zde popsán, může být podán v kombinaci s jinými látkami, jako jsou například jiné proteiny nebo polypeptidy nebo různé farmaceuticky účinné látky. Ve skutečnosti neexistuje v podstatě žádné omezení, co se týče dalších složek, které lze rovněž zahrnout za předpokladu, že další činidlo nepůsobí významný vedlejší účinek po kontaktu s cílovými buňkami nebo hostitelskými tkáněmi. Prostředky tak lze podávat spolu s různými jinými činidly, jak se za určitých okolností požaduje. Takové prostředky mohou být čištěny od hostitelských buněk nebo jiných biologických zdrojů nebo je lze popřípadě chemicky syntetizovat, jak je zde popsáno. Podobně mohou takové prostředky dále obsahovat substituované nebo derivatizované RNA nebo DNA prostředky.
Proto jsou v jiném aspektu tohoto vynálezu poskytnuty farmaceutické prostředky obsahující jeden nebo více polynukleotidových, polypeptidových, protilátkových a/nebo T-buněčných prostředků, které jsou zde popsány, v kombinaci s fyziologicky vhodným nosičem. V určitých výhodných ztělesněních zahrnují farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu imunogenní polynukleotidové a/nebo polypeptidové prostředky podle tohoto vynálezu pro použití v profylaktických a léčebných vakcínových prostředcích. Vakcínový prostředek je obecně popsán například v Powell M.
F. a Newman M. J. (vyd.), Vaccine Design (the subunit and adjuvant approach), Plenům Press (NY, 1995). Obecně řečeno, takové prostředky zahrnují jeden nebo více polynukleotidových a/nebo polypeptidových prostředků podle tohoto vynálezu v kombinaci s jedním nebo více ···· ·· ···· ·· ···· • ······ • · · · · · ·· · imunostimulancii.
Je zřejmé, že kterýkoli z farmaceutických prostředků, které jsou zde popsány, může obsahovat farmaceuticky vhodné soli polynukleotidů a polypeptidů podle tohoto vynálezu. Takové soli lze připravit například z farmaceuticky vhodných netoxických baží, včetně organických baží (například soli primárních, sekundárních nebo terciárních aminů a bazických aminokyselin) a anorganických baží (například solí sodíku, draslíku, litia, amonniových solí, solí vápníku a hořčíku).
V jiném ztělesnění ilustrativní imunogenní prostředky, například vakcínové prostředky podle tohoto vynálezu zahrnují DNA kódující jeden nebo více polypeptidů, jak je popsáno výše, tak že polypeptid se vytváří in šitu. Jak je uvedeno výše, polynukleotid lze podat v rámci kteréhokoli z řady systémů podání, které jsou známé odborníkvi v oboru. Samozřejmě je řada způsobů dodání genů dobře známa v oboru,, jako jsou způsoby, které popsal Rolland, Crit. Rev. Therap. Drug Carrier Systems, 15, 143 - 198 (1998) a odkazy zde citované. Vhodný polynukleotidový expresní systém samozřejmě obsahuje nutné regulatorní sekvence regulatorní DNA pro expresi u pacienta (jako je vhodný promotor a terminační signál). Jinak mohou bakteriální systémy dodání zahrnovat podání bakterie (jako je Bacillus-Calmette-Guerrin), která exprimuje imunogenní část polypeptidu na svém buněčném povrchu nebo sekretuje takový epitop.
Proto se v určitých ztělesněních zavádějí polynukleotidy kódující imunogenní polypeptidy, které jsou zde popsány, do vhodných savčích hostitelských buněk pro expresi za použití kteréhokoli z řady známých systémů, založených na virech. V jednom ilustrativním ztělesnění ···· · · ···· ··
poskytují retroviry pohodlnou a účinnoou platformu pro systémy dodání genů. Zvolenou sekvenci nukleotidů, kódující polypeptid podle tohoto vynálezu lze vložit do vektoru a zabalit do retrovirových částic za použití způsobů, známých v oboru. Rekombinantní virus se potom izoluje a dodá do subjektu. Je popsána řada ilustrativních retrovirových systémů (například US patent č. 5 219 740, Miller a Rosman, Bio Techniques 7, 980 - 990 (1989), Miller A. D., Human Gene Therapy, 1, 5-14 (1990), Scarpa a kol., Virology 180, 849
- 852 (1991), Burns a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 8033 - 8037 (1993) a Boris-Lawrie a Temin, Cur. Opin. Genet. Develop., 3, 102 - 109 (1993)).
Kromě toho je popsána řada ilustrativních systémů, založených na adenovirech. Na rozdíl od retrovirů, které se integrují do hostitelského genomu, adenoviry perzistují extrachromozomálně a tak se minimalizuje nebezpečí, spojené s inzerční mutagenezí (Haj-Ahmad a Graham, J. Virol., 57, 267
- 274 (1986), Bett a kol., J. Virol., 67, 5911 - 5921 (1993), Mittereder a kol., Human Gene Therapy, 5, 717 - 729 (1994), Seth a kol., J. Virol., 6.8, 933 - 940 (1994), Barr a kol., Gene Therapy 1, 51 - 58 (1994), Berkner K. L.,
BioTechniques, 6., 616 - 629 (1988) a Rich a kol., Human Gene Therapy, 4, 461 - 476 (1993)).
Rovněž jsou vyvinuty různé vektorové systémy adenoasociovaného viru (AAV) pro dodání polynukleotidů. AAV vektory lze přímo konstruovat za použití způsobů dobře známých v oboru. Viz například US patenty č. 5 173 414 a 5 139 941, mezinárodní patentové přihlášky publikačních čísel WO 92/01070 a WO 93/03769, Lebkowski a kol., Molec. Cell. Biol., 8, 3988 - 3996 (1988), Vincent a kol., Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press) (1990), Carter B. J.,
Current Opinion in Biotechnology, 3, 533 - 539 (1992), Muzyczka N., Current Topics in Microbiol. and Immunol.,
158, 97 - 129 (1992), Kotin R.M., Human Gene Therapy, 5, 793 - 801 (1994), Shelling a Smith, Gene Therapy, 1, 165 - 169 (1994) a Zhou a kol., J. Exp. Med., 179, 1867 - 1875 (1994).
Další virové vektory, které jsou použitelné pro dodání polynukleotidů kódujících polypeptidy podle tohoto vynálezu přenosem genu zahrnují ty vektory, které jsou odvozené od rodiny virů neštovic, jako je virus vakcinie (neštovic) nebo virus ptačích neštovic. Například rekombinanty viru vakcinie, které exprimují nové molekuly, lze připravit, jak je popsáno dále. DNA kódující polypeptid se nejdříve vloží do vhodného vektoru, aby byl v sousedství promotoru vakcinie a přilehlých DNA sekvencí vakcinie, jako je sekvence kódující thymidinkinázu (TK). Tento vektor se potom použije k transfekci buněk, které jsou současně infikovány vakcinií. Homologní rekombinace slouží k tomu, aby se vložily promotor vakcinie plus gen, kódující požadovaný polypeptid do virového genomu. Výsledný TK.sup.(-) rekombinant lze selektovat kultivací buněk za přítomnosti 5-bromdeoxyuridinu a sběrem virových plaků rezistentních na ně.
Systém infekce/transfekce, založený na vakcinii, lze obvykle použít, aby se dosáhlo induktabilní proměnlivé exprese nebo koexprese jednoho nebo více polypeptidů, které jsou zde popsány, v hostitelských buňkách organismu. V tomto konkrétním systému se buňky nejprve infikují in vitro rekombinantem viru vakcinie, který kóduje bakteriofágovou T7 RNA polymerasu. Tato polymerasa vykazuje výbornou specificitu v tom, že pouze transkribuje templáty nesoucí T7 promotory. Po infikování se provede transfekce buněk ···· »· ···· ·· ···· • ······
s požadovaným polynukleotidem nebo polynukleotidy, která se řídí promotorem T7. Polymerasa exprimovaná v cytoplasmě z rekombinantu viru vakcinie transkribuje transfektovanou DNA na RNA, která se poté podrobuje translaci na polypeptid hostitelským translačním aparátem. Způsob poskytuje vysokou hladinu proměnlivé cytoplasmatické tvorby velkých množství RNA a jejích translačních produktů. Viz například Elroy-Stein a Moss, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, 6743 - 6747 (1990), Fuerst a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA,
83, 8122 - 8126 (1986).
Popřípadě lze rovněž použít viry ptačích neštovic, jako jsou viry slepičích neštovic a neštovic karárů, aby se dodaly požadované kódující sekvence. Je známo, že rekombinantní viry ptačích neštovic, exprimující imunogeny ze savčích patogenů, dodávají ochrannou imunitu, pokud se podají neptačím druhům. Použití viru ptačích neštovic je zvláště vhodné u lidí a dalších druhů savců, protože členy genu ptačích neštovic lze účinně replikovat pouze u citlivých ptačích druhů a proto nejsou infekční v savčích buňkách. Způsoby tvorby rekombinantních virů ptačích neštovic jsou známy v oboru a zahrnují rekombinaci genů, jak je popsána výše s ohledem na tvorbu virů vakcinie. Viz například WO 91/12882, WO 89/03429 a WO 92/03545.
Kterýkoli z řady alfavirových vektorů lze použít pro dodání polynukleotidových prostředků podle tohoto vynálezu, jako jsou ty vektory, které jsou popsány v US patentech č.
843 723, 6 015 686, 6 008 035 a 6 015 694. Rovněž lze použít určité viry založené na venezuelské koňské encefalitidě (VEE), jejichž ilustrativní příklady lze najít v US patentech č. 5 505 947 a 5 643 576.
• · · ·
Navíc lze použít rovněž molekulární konjugátové vektory, jako jsou adenovirové chimérické vektory, které jsou popsány v Michael a kol., J. Biol. Chem. 268, 6866 6869 (1993) a Wagner a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89, 6099 - 6103 (1992) pro dodání genu podle tohoto vynálezu.
Další ilustrativní informace o těchto a dalších systémech dodání, založených na virech, lze najít například ve Fischer-Hoch a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86/ 317
- 321 (1989), Flexner a kol., Ann. N. Y. Acad. Sci. 569. 86
- 103 (19989), Flexner a kol., Vaccine, 8, 17 - 21 (1990), US patentech č. 4 603 112, 4 769 330 a 5 017 487, WO 89/01973, US patentu č. 4 777 127, GB patentu č. 2 200651, EP patentu č. 0 345 242, WO 91/02805, Berkner,
Biotechniques, 6, 616 - 627 (1988), Rosenfeld a kol., Science, 252, 431 - 434 (1991, Kolls a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91, 215 - 219 (1994), Kass-Eisler a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90, 11498 - 11502 (1993), Guzman a kol., Circulation 88, 2838 - 2848 (1993) a Guzman a kol., Cir. Res., 73, 1202 - 1207 (1993).
V určitých ztělesněních může být polynukleotid integrován do genomu cílové buňky. Tato integrace může být na specifickém místě a orientaci cestou homologní rekombinace (náhrady genu) nebo může jít o náhodné nespecifické místo (genová augmentace). V dalších ztělesněních může být polynukleotid stabilně zachováván v buňce jako separátní, epizomální segment DNA. Takové polynukleotidové segmenty nebo epizomy kódují sekvence, které jsou dostatečné k tomu, aby se umožnilo zachování a replikace nezávislá na nebo v synchronizaci s cyklem hostitelské buňky. Způsob, jakým se konstrukt exprese dodá do buňky a jakým polynukleotid zůstává v buňce závisí na • *
typu použitého konstruktu exprese.
V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se podává/dodává polynukleotid jako holá DNA, například jak je popáno v Ulmer a kol., Science 259, 1745 - 1749 (1993) a přezkoumáno Cohenem a kol., Science 259, 1691 - 1692 (1993). Vychytávání holé DNA lze zvýšit potažením DNA na biodegradovatelné kuličky, které se účinně transportují do buněk.
V dalším ztělesnění tohoto vynálezu se prostředek podle tohoto vynálezu může dodat prostřednictvím bombardování částicemi a mnoho takových způsobů je popsáno.
V jednom ilustrativním příkladu lze dosáhnout plynem řízeného zrychlení částic prostředky, jako jsou ty, vyráběné Powderject Pharmaceuticals PLC (Oxford, UK) a Powderject Vaccines lne. (Madison, WI), jejichž některé příklady jsou popsány v US patentech č. 5 846 796, 6 010 478, 5 865 796,
584 807 a EP patentu č. 0 500 799. Tento způsob nabízí dodání bez použití jehly, ve kterém je prostředek ve formě suchého prášku mikroskopických částeček, jako jsou částečky polynukleotidu nebo polypeptidů a tyto částečky se zrychlují na velkou rychlost plynným heliem, vytvořeným ručním prostředkem, který částice vhání do požadované cílové tkáně.
V příbuzném ztělesnění mohou být jiné prostředky a způsoby užitečné pro plynem řízenou injekci prostředků podle tohoto vynálezu bez použití jehly, včetně těch prostředků, poskytovaných výrobcem Bioject, lne. (Portland, OR) , jejichž některé příklady jsou popsány v US patentech č. 4 790 824,
064 413, 5 312 335, 5 383 851, 5 399 163, 5 520 639 a 5 993 412.
Podle dalšího ztělesnění zahrnují farmaceutické • ···· ·· ··♦· ·· ···· ··· ·· ··· ·
prostředky zde popsané jedno nebo více imunostimulancií vedle prostředků s imunogenním polynukleotidem, polypeptidem, protilátkou, T-buňkami a/nebo APC podle tohoto vynálezu. Imunostimulans se vztahuje v zásadě na každou látku, která zvyšuje nebo potencuje imunitní odpověď (zprostředkovanou protilátkově a/nebo buněčně) na exogenní antigen. Jeden výhodný typ imunostimulancia zahrnuje adjuvans. Mnoho adjuvancií obsahuje látky, navržené k ochraně antigenu před rychlým katabolismem, jako je hydroxid hlinitý nebo minerální olej a stimulátor imunitních odpovědí, jako je lipid A, proteiny odvozené od Bortadella pertussis nebo Mycobacterium tuberculosis. Určitá adjuvancia jsou komerčně dostupná, jako například Freundovo nekompletní adjuvans nebo kompletní adjuvans (Difco Laboratories, Detroit, MI), Merckovo adjuvans 65 (Merck and Company, lne., Rahway, NJ), AS-2 (SmithKline Beecham, Philadelphia, PA), soli hliníku, jako je gel hydroxidu hlinitého (alum) nebo fosforečnan hlinitý, soli vápníku, železa nebo zinku, nerozpustná suspenze acylovaného tyrosinu, acylované cukry, kationicky nebo anionicky derivatizované polysacharidy, polyfosfazeny, biodegradovatelné mikrokuličky, monofosforyllipid A a quil A. Cytokiny, jako je GM-CSF, interleukin-2, -7, -12 a jiné podobné růstové faktory lze rovněž použít jako adjuvancia.
V rámci určitých ztělesnění tohoto vynálezu je adjuvantní prostředek výhodně takový, který indukuje imunitní odpověď převážně typu Th-1. Vysoké hladiny cytokinů typu Th-1 (například IFN-gama, TNFalfa, IL-2 a IL-12) směřují k podpoře indukce buňkami zprostředkovaným imunitním odpovědím na podaný antigen. Naproti tomu vysoké hladiny cytokinů typu Th-2 (například IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10) směřují k podpoře humorálních imunitních odpovědí. Po podání ·*·· ·♦ ···· «· ···« vakcíny, jak je zde poskytnuta, dochází u pacienta k podpoře imunitní odpovědi, která zahrnuje odpovědi typu Th-1 a Th-2. V rámci výhodného ztělesnění, v němž je imunitní odpověď převážně typu Th-1, vzrůstá hladina cytokinů typu Th-1 ve větší míře než hladina cytokinů typu Th-2. Hladiny těchto cytokinů lze přímo stanovovat za použití standardních zkoušek. Pro přehled druhů cytokinů viz Mosmann a Coffman, Ann. Rev. Immunol., Ί_, 145 - 173 (1989).
Určitá výhodná adjuvancia pro dosažení imunitní odpovědi převážně typu Th-1 zahrnují například kombinaci monofosforyllipidu A, výhodně 3-de-0-acylovaného monofosforyllipidu A spolu se solí hliníku. Adjuvans MPLR je dostupné od Corixa Corporation (Seattle, WA, viz například US patenty č. 4 436 727, 4 877 611, 4 866 034 a 4 912 094). Oligonukleotidy obsahující CpG (v nichž je CpG dinukleotid nemethylovaný) rovněž indukují převážně odpověď Th-1. Takové oligonukleotidy jsou dobře známy a jsou popsány například ve WO 96/02555, WO 99/33488 a US patentech č. 6 008 200 a 5 856 462. Imunostimulační sekvence DNA rovněž popsal například Sáto a kol., Science, 273, 352 (1996). Jiné výhodné adjuvans obsahuje saponin, jako je Quil A nebo jeho deriváty včetně QS21 a QS7 (Aquila Biopharmaceuticals lne., Framingham, MA), escin, digitonin nebo saponiny z Gypsophila nebo Chenopodium quinoa. Jiné výhodné prostředky zahrnují více než jeden saponin v kombinacích adjuvancií podle tohoto vynálezu, například kombinace nejméně dvou adjuvancií z následující skupiny, která zahrnuje QS21, QS7, Quil A, beta-escin nebo digitonin.
Popřípadě lze saponinové prostředky kombinovat s vakcínovými vehikuly, které se skládají z chitosanu nebo jiných polykationických polymerů, polylaktidových ·«·· • · ··· · ·· ··* · a polylaktid-ko-glykolidových částic, polymerové matrice založené na poly-N-acetylovaném glukosaminu, částic skládajících se z polysacharidů nebo chemicky modifikovaných polysacharidů, lipozomů a částic založených na lipidech, částic skládájích se z monoesterů glycerolu atd. Saponiny lze rovněž připravovat za přítomnosti cholesterolu, aby se vytvořily částicové struktury, jako jsou lipozomy nebo ISCOMy. Kromě toho lze saponiny připravovat spolu s etherem nebo esterem polyoxyethylenu, buď v roztoku bez částic nebo v suspenzi nebo v částicové struktuře, jako je paucilamelární lipozom nebo ISCOM. Saponiny lze rovněž připravit s excipiencn, jako je Carbopol, aby se zvýšila viskozita, nebo je lze připravit ve formě suchého prášku s práškovým excipienciem, jako je laktóza.
V jednom výhodném ztělesnění zahrnuje systém adjuvancií kombinaci monofosforyllipidu A a derivátu saponinu, jako je kombinace QS21 a adjuvancia 3D-MPL, jak je popsáno ve WO 94/00153 nebo méně reaktivní prostředek, ve kterém je QS21 zmírněn cholesterolem, jak je popsáno ve WO 96/33739. Další výhodné prostředky zahrnují emulzi olej ve vodě a tokoferol. Jiný zvláště výhodný adjuvantní prostředek, který využívá QS21, adjuvans 3D-MPL a tokoferol v emulzi typu olej ve vodě je popsán ve WO 95/17210.
Jiný zlepšený systém adjuvancií zahrnuje kombinaci oligonukleotidu, obsahujícího CpG a derivát saponinu, zejména kombinaci CpG a QS21, která je popsána ve WO 00/09159. Výhodně tato kombinace dále zahrnuje emulzi typu olej ve vodě a tokoferol.
Další ilustrativní adjuvancia pro použití ve farmaceutických prostředcích podle tohoto vynálezu zahrnují • ··· ·· ···· •9 9999
Montanide ISA 720 (Seppic, Francie), SAF (Chiron,
Kalifornie, Spojené Státy), ISCOMS (CSL), MF-59 (Chiron), serie adjuvancií SBAS (například SBAS-2 nebo SBAS-4, dostupné od SmithKline Beecham, Rixensart, Belgie), Detox (EnhanzymR) (Corixa, Hamilton, MT), RC-529 (Corixa, Hamilton, MT) a jiné aminoalkylglukosaminid-4-fosfáty (AGPs), jako jsou ty, které jsou popsány v dosud projednávaných patentových přihláškách USA sériových čísel 08/853826 a 09/074720, jejichž poznatky jsou zde zahrnuty v jejich úplnosti odkazem, a adjuvancia polyoxyethylenetheru, jako jsou ty, které jsou popsány ve WO 99/52549 Al.
Další výhodná adjuvancia zahrnují molekuly adjuvancia obecného vzorce:
HO(CH2CH2O)n-A-R, (I) ve kterém n je číslo 1 až 50,
A je vazba nebo -C(0)- a
R je alkylová skupina s 1 až 50 atomy uhlíku nebo fenylalkylová skupina s 1 až 50 atomy uhlíku v alkyiové části.
Jedno ztělesnění tohoto vynálezu sestává z vakcínového prostředku, který obsahuje polyoxyethyleneter obecného vzorce (I), ve kterém n je číslo mezi 1 a 50, výhodně 4 až 24, velmi výhodně 9, R je alkylová skupina s 1 až 50 atomy uhlíku, výhodně alkylová skupina se 4 až 20 atomy uhlíku a velmi výhodně alkylová skupina s 12 atomy uhlíku a A je vazba. Koncentrace polyoxyethylenetherů by měla být v rozmezí 0,1 až 20 %, výhodně 0,1 až 10% a velmi výhodně ·· 9 99 9
9 9 9 9 9 9
A A A 99 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9
9 99 9 9 A AA AA v rozmezí 0,1 až 1 %. Výhodné polyoxyethylenethery jsou zvoleny z následující skupiny: polyoxyethylen-9-lauryleter, polyoxyethylen-9-steoryleter, polyoxyethylen-8-steoryleter, polyoxyethylen-4-lauryleter, polyoxyethylen-35-lauryleter a polyoxyethylen-23-lauryleter. Polyoxyethylenetery, jako je polyoxyethylenlauryleter, jsou popsány v Merck index (12. vydání, záznam 7717). Tyto adjuvantní molekuly jsou popsány ve WO 99/52549.
Polyoxyethylenethery obecného vzorce (I), který je popsán výše, lze kombinovat, pokud je to žádoucí, s jiným adjuvanciem. Například výhodná adjuvantní kombinace je výhodně s CpG, jak je popsáno v dosud projednávané GB patentové přihlášce 9820956.2.
Podle dalšího ztělesnění tohoto vynálezu je imunogenní prostředek, který je zde popsán, dodáván do hostile pomocí antigen prezentujících buněk (APCs), jako jsou dendritické buňky, makrofágy, B-buňky, monocyty a další buňky, které lze navrhnout tak, aby byly efektivními APCs. Takové buňky mohou, ale nemusí, být geneticky modifikované, aby se zvýšila jejich schopnost prezentovat antigen, aby se zlepšila aktivace a/nebo doba trvání odpovědi T-buněk, aby měly antitumorové účinky samy o sobě a/nebo aby byly imunologicky kompatibilní s příjemcem (t. j. měly odpovídající HLA haplotyp). APCs mohou být obecně izolovány z kterékoli z řady biologických tekutin a orgánů, včetně tumorových a peritumorových tkání a mohou to být buňky autologní, allogenní, syngenní nebo xenogenní.
Určitá výhodná ztělesnění tohoto vynálezu používají dendritické buňky nebo jejich progenitory jako antigen prezentující buňky. Dendritické buňky jsou vysoce potentní
0000 ·· 0 00 0 ··· 0 0 · · 0 0 0 000 00 0 00 0 • 00000 000 0 0 0 000 00 0 0 000 ·00 00 0 00 00
APCs (Banchereau a Steinman, Nátuře, 392, 245 - 251 (1998)) a ukázalo se, že jsou účinné jako biologické adjuvans pro dosažení profylaktické nebo terapeutické antitumorové aktivity (viz Timmerman a Levý, Ann. Rev. Med., 50, 507 529 (1999)). Obecně řečeno, dendritické buňky lze identifikovat na základě jejich typického tvaru (stelát in sítu s rozpoznatelnými cytoplasmatickými výběžky (dendrity) viditelnými in vitro), jejich schopnosti vstřebat, zpracovat a prezentovat antigeny s vysokou účinností a jejich schopnosti aktivovat nativní odpovědi T-buněk. Dendritické buňky lze samozřejmě zpracovány tak, aby exprimovaly specifické receptory buněčného povrchu nebo ligandy, které se obvykle nenacházejí na dendritických buňkách in vivo nebo ex vivo a takto modifikované dendritické buňky jsou zamýšleny tímto vynálezem. Jako alternativa k dendritickým buňkám lze v rámci vakcíny použít dendritické buňky s náloží secernovaných vezikul s antigenem (nazývané exosomy) (viz Zitvogel a kol., Nátuře Med., 4, 594 - 600 (1998)).
Dendritické buňky a progenitory lze získat z periferní krve, kostní dřeně, buněk infiltrujících tumory, buněk infiltrujících peritumorální tkáně, lymfatických uzlin, sleziny, kůže, krve z pupeční šňůry nebo jakékoli jiné vhodné tkáně nebo tekutiny. Například mohou být dendritické buňky diferencovány ex vivo přidáním kombinace cytokinů, jako je GM-CSF, IL-4, IL-13 a/nebo TNFalfa ke kulturám monocytů získaných z periferní krve. Alternativně CD34 pozitivní buňky získané z periferní krve, krve z pupeční šňůry nebo kostní dřeně lze diferencovat na dendritické buňky přidáním kombinací GM-CSF, IL-3, TNFalfa, ligandu CD40, LPS, ligandu flt3 a/nebo jiných sloučenin, které indukují diferenciaci, maturaci a proliferaci dendritických buněk do kultivačního media.
Dendritické buňky se vhodně kategorizují jako nezralé a zralé buňky, což umožňuje jednoduchý způsob, jak rozeznat dva dobře charakterizované fenotypy. Nicméně tato nomenklatura není tvořena proto, aby vyloučila všechny možné přechodné fáze diferenciace. Nezralé dendritické buňky se charakterizují jako APC s vysokou schopností vychytávat a zpracovávat antigen, což je v souladu s vysokou expresí Fcgama receptoru a mannosového receptoru. Zralý fenotyp je obvykle charakterizován nižší expresí těchto markérů, avšak vysokou expresí molekul na buněčném povrchu, které odpovídají za aktivaci T-buněk, jako jsou adhezní molekuly MHC třídy I a třídy II (například CD54 a CDU) a kostimulační molekuly (například CD40, CD80, CD86 a 4-1BB).
APCs mohou být obecně podrobeny transfekci s polynukleotidem podle tohoto vynálezu (nebo jeho částí nebo jinou variantou) tak, že kódovaný polypeptid nebo jeho imunogenní část se exprimuje na povrchu buňky. Taková transfekce se může uskutečnit ex vivo a farmaceutický prostředek, zahrnující buňky takto podrobené transfekci, se může použít pro terapeutické účely, jak je zde popsáno. Popřípadě lze podat vehikulum, dodávající geny, které je cíleno na dendritické nebo jiné antigen prezentující buňky pacientovi a výsledkem tohoto podání je transfekce, která se vyskytuje in vivo. In vivo a ex vivo transfekce dendritických buněk se může například obecně provést za použití kteréhokoli způsobu známého v oboru, jako jsou způsoby popsané ve WO 97/24447, nebo genová pistole, která je popsána Mahvim a kol., Immunology and Cell Biology, 75, 456 - 460 (1997). Nasání antigenu dendritickými buňkami lze dosáhnout inkubací dendritických buněk nebo • ·1· ·· *·· · ·· ♦·*·
- 100
progenitorových buněk s tumorovým polypeptidem, DNA (holou nebo v rámci plasmidového vektoru) nebo RNA, nebo s antigen-exprimující rekombinantní bakterií nebo viry (například vektory vakcinie, viru drůbežích neštovic, adenoviru nebo lentiviru). Před nasátím se může polypeptid kovalentně konjugovat na imunologický protějšek, který poskytne pomoc T-buněk (například molekula nosiče).
Popřípadě lze dendritickou buňku zpracovat s nekonjugovaným imunologickým protějškem, odděleně nebo v přítomnosti polypeptidu.
Zatímco lze ve farmaceutických prostředcích podle tohoto vynálezu použít jakýkoli vhodný nosič, známý odborníkovi v oboru, typ nosiče se obvykle liší v závislosti na způsobu podání. Prostředky podle tohoto vynálezu lze připravit pro jakýkoli vhodný způsob podání, včetně například místního, perorálního, nasálního, mukosálního, intravenózního, intrakraniálního, intraperitoneálního, subkutánního a intramuskulárního podání.
Nosiče pro použití v rámci takových farmaceutických prostředků jsou biokompatibilní a mohou být rovněž biologicky odbrouratelné. V určitých ztělesněních prostředek přednostně zajišťuje relativně stálou hladinu uvolňování účinné látky. Nicméně v jiných ztělesněních může být žádoucí rychlejší uvolňování ihned po podání. Příprava takového prostředku je v rozsahu běžných znalostí v oboru za použití známých způsobů. Ilustrativní nosiče použitelné v tomto ohledu zahrnují mikročástice poly(laktid-ko-glykolid)u, polyakrylát, latex, škrob, celulózu, dextran a podobně. Jiné ilustrativní nosiče s prodloženým uvolňováním zahrnují vysokomolekulární biovektory, které zahrnují netekuté hydrofilní jádro (například zkříženě spojené polysacharidy
9· »···
9999 «· 9 · · 9 9 9 9 • · 99 99 9 99 9 nebo oligosacharidy) a popřípadě vnější vrstvu zahrnující amfifilní sloučeninu, jako je fosfolipid (viz například US patent č. 5 151 254 a PCT přihlášky WO 94/20078, WO 94/23701 a WO 96/06638). Množství účinné látky obsažené v prostředku s řízeným uvolňováním závisí na místě implantace, rychlosti a předpokládané délce uvolňování a povaze onemocnění, které je léčeno nebo vůči kterému směřuje prevence.
V jiném ilustrativním ztělesnění se používají jako nosiče biologicky odbouratelné mikročástice (například polylaktat-polyglykolat) pro prostředky podle tohoto vynálezu. Vhodné biologicky odbouratelné mikročástice jsou popsány například v US patentech č. 4 897 268, 5 075 109,
928 647, 5 811 128, 5 820 883, 5 853 763, 5 814 344, 5 407 609 a 5 942 252. Pro mnoho použití jsou rovněž vhodné modifikované systémy nosiče jaderného proteinu hepatitidy B, jako jsou ty, které jsou popsány ve WO 99/40934 a ve zde uvedených odkazech. Jiný ilustrativní systém nosiče a dodání využívá nosič, který obsahuje komplexy částic proteinu, jako jsou ty, popsané v US patentu č. 5 928 647, který je schopen indukovat u hostitele cytotoxické T-lymfocytární odpovědi omezené na třídu I.
Farmaceutické prostředky podle tohoto vynálezu často dále obsahují jeden nebo více pufrů (například neutrální pufrovaný fyziologický roztok nebo fosfátem pufrovaný fyziologický roztok), sacharidy (například glukózu, mannózu, sacharózu nebo dextran), mannitol, proteiny, polypeptidy nebo aminokyseliny, jako je glycin, antioxidanty, bakteriostatické látky, chelátotvorné látky, jako je EDTA nebo glutathion, adjuvancia (například hydroxid hlinitý), rozpuštěné látky, které činí prostředek izotonickým, • ·»·· ·· · • ···
- 102 hypotonickým nebo slabě hypertonickým vůči krvi příjemce, suspendující látky, zahušťující látky a/nebo konzervancia.
Jinak lze prostředky podle tohoto vynálezu připravit jako lyofilizáty.
— »»» ··« ··** • · · • * « *· ···« • » e • · · • · · ·♦ · • · » · ·· ··
Farmaceutické prostředky, které jsou zde popsány, lze dát do jednodávkových nebo vícedávkových obalů, jako jsou uzavřené ampule nebo lahvičky. Takové obaly jsou obvykle uzavřené takovým způsobem, aby se uchovala sterilita a stabilita prostředku až do použití. Obecně řečeno, prostředky lze uchovávat jako suspenze, roztoky nebo emulze v olejových nebo vodných vehikulech. Jinak lze farmaceutický prostředek uchovávat za podmínek lyofilizace, což vyžaduje pouze přidání sterilního kapalného nosiče těsně před použitím.
Vývoj vhodných dávkových a léčebných režimů pro použití zvláštních prostředků, které jsou zde popsány, v řadě léčebných režimů, včetně například perorálního, parenterálního, intravenózního, intanasálního a intramuskulárního podání a prostředku, je dobře znám v oboru a některé z těchto režimů jsou v krátkosti diskutovány dále za obecným účelem ilustrace.
V určitých ztělesněních lze farmaceutické prostředky, které jsou zde popsány, dodat perorální cestou živičichovi. Jako takové lze tyto prosředky připravit s inertním ředidlem nebo s asimilovatelným jedlým nosičem nebo je lze upravit do formy tvrdé nebo měkké želatinové kapsle nebo je lze slisovat do tablet nebo mohou být zahrnuty přímo do potravy při dietě.
Účinné sloučeniny lze spojit s excipiencii a použít • · • · · ·
- 103
pro vytvoření polykacích tablet, bukálních tablet, pastilek, kapslí, elixírů, suspenzí, sirupů, oplatek a podobně (viz například Mathiowitz a kol., Nátuře, 386(6623) , 410 - 414 (27. března 1997), Hwang a kol., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 15(3), 243 - 284 (1998), US patenty č. 5 641 515, 5 580 579 a 5 792 451). Tablety, pastilky, pilulky, kapsle a podobně mohou rovněž obsahovat jakoukoli z řady dalších složek, například lze přidat pojivo, jako je tragantová guma, akácie, kukuřičný škrob nebo želatina, excipiciencia, jako je dihydrogenfosfát vápenatý, rozvolňovadlo, jako je kukuřičný škrob, bramborový škrob, kyselina alginová a podobné, mazadlo, jako je magneziumstearát a sladidlo, jako je sacharóza, laktóza nebo sacharin nebo příchuť, jako je peprmintová příchuť, olej libavky nebo třešňová příchuť. Pokud je lékovou formou kapsle, může obsahovat kromě látek uvedených výše kapalný nosič. Řada dalších látek může být přítomna jako potahovací látky nebo za tím účelem, aby jinak modifikovaly fyzikální formu lékové formy. Například tablety, pilulky nebo kapsle lze potáhnout šelakem, cukrem nebo obojím. Samozřejmě by každá látka, která se používá při přípravě jakékoli lékové formy, měla být farmaceuticky čistá a zásadně netoxická v množstvích, které se použijí. Kromě toho mohou být účinné látky začleněny do přípravků a prostředků s řízeným uvolňováním.
Prostředky obvykle obsahují nejméně asi 0,1 % účinné látky nebo více, ačkoli procentuální zastoupení účinné látky (účinných látek) se samozřejmě může lišit a může být vhodně mezi přibližně 1 % nebo 2 % a přibližně 60 % nebo 70 % nebo více hmotnosti nebo objemu celkového prostředku. Množství účinné látky (látek) v každém terapeuticky užitečném prostředku může být připraveno takovým způsobem, že se • · · · • · · ·
dosáhne vhodné dávky v jakékoli podané jednotkové dávce sloučeniny. Faktory, jako je rozpustnost, biologická dostupnost, biologický poločas, cesta podání, doba použitelnosti produktu, stejně jako další farmakologické úvahy vezme v potaz odborník v oboru při přípravě takových farmaceutických prostředků a tak může být žádoucí řada dávek a léčebných režimů.
Pro perorální podání mohou být popřípadě prostředky podle tohoto vynálezu začleněny s jedním nebo více excipiencii ve formě ústní vody, prostředku pro čištění zubů, bukální tablety, orálního spreje nebo sublingválního prostředku pro orální podání. Jinak lze účinnou látku začlenit do perorálního roztoku, jako je roztok, obsahující boritan sodný, glycerin a hydrogenuhličitan draselný, nebo dispergovat v prostředku pro čištění zubů nebo přidat v terapeuticky účinném množství do prostředku, který může zahrnovat vodu, pojivá, zdrsňovadla, příchutě, pěnící látky a zvlhčovadla. Alternativně lze prostředky upravit do formy tablety nebo roztoku, který lze podat pod jazyk nebo jinak rozpustit v ústech.
Za určitých okolností může být žádoucí podat farmaceutické prostředky, které jsou zde popsány, parenterálně, intravenózně, intramuskulárně nebo dokonce intraperitoneálně. Takové přístupy jsou dobře známy odborníkovi v oboru a některé z nich jsou dále popsány například V US patentech č 5 543 158, 5 641 515 a 5 399 363. V určitých ztělesněních se mohou roztoky účinných sloučenin jako volných bází nebo farmaceuticky přijatelných solí připravit ve vodě vhodně smíchané se surfaktantem, jako je hydroxypropylcelulóza. Disperze lze rovněž připravit v glycerolu, kapalných polyethylenglykolech a jejich směsích • ·
- ·>Θ5·· a v olejích. Za běžných podmínek uchovávání a použití tyto prostředky obecně obsahují konzervační látku, aby se zabránilo růstu mikroorganismů.
Ilustrativní farmaceutické formy vhodné pro injekční podání zahrnují sterilní vodné roztoky nebo disperze a sterilní prášky pro magistraliter přípravu sterilních injekčních roztoků nebo disperzí (viz například US patent č. 5 466 468). Ve všech případech musí být forma sterilní a musí být tekutá v té míře, aby se zajistilo snadné vstříknutí injekční stříkačkou. Musí být stabilní za podmínek výroby a uchovávání a musí se chránit před znečišťujícím působením mikroorganismů, jako jsou bakterie a plísně. Nosič může být rozpouštědlo nebo disperzní medium obsahující například vodu, ethanol, polyol (například glycerol, propylenglykol a kapalný polyethylenglykol a podobně), jejich vhodné směsi a/nebo rostlinné oleje. Vhodnou tekutost lze zachovat například použitím potažení, například lecithinu, zachováním požadované velikosti částic v případě disperze a/nebo použitím surfaktantů. Ochranu před působením mikroorganismů lze usnadnit řadou antibakteriálních a antifungálních látek, například parabeny, chlorbutanolem, fenolem, kyselinou sorbovou, thiomerosalem a podobně. V řadě případů je výhodné zahrnout izotonizující látky, například sacharidy nebo chlorid sodný. Prodloužené absorpce injekčních prostředků lze dosáhnout použitím látek zpožďujících absorpci, například monostearátu hlinitého a želatiny, v prostředku.
V jednom ztělesnění pro parenterální podání ve vodném roztoku by se měl roztok vhodně pufrovat, pokud je to potřebné a kapalné ředidlo by se mělo nejprve izotonizovat dostatečným množstvím roztoku chloridu sodného nebo glukózy.
• · · ·
- ·1·©6·· Tyto vodné roztoky jsou zvláště vhodné pro intravenózní, intramuskulární, subkutánní a intraperitoneální podání.
V této souvislosti je sterilní vodné medium, které lze použít, známé odborníkovi v oboru ve světle poskytnutých poznatků. Například lze jednu dávku rozpustit v 1 ml izotonického roztoku chloridu sodného a buď přidat do 1000 ml hypodermoklytické tekutiny nebo podat injekčně do předpokládaného místa infuze (viz například Remington's Pharmaceutical Sciences, 15. vydání, str. 1035 - 1038 a 1570 - 1580). Určité rozdíly v dávce jsou nezbytné v závislosti na podmínkách toho subjektu, který je léčen. Navíc při podání lidem prostředky samozřejmě přednostně splňují požadavky sterility, pyrogenity a celkové bezpečnosti a čistoty, jak jsou požadovány v biologických standardech úřadu FDA.
V jiném ztělesnění tohoto vynálezu lze připravit prostředky, které jsou zde popsány, v neutrální formě nebo ve formě solí. Ilustrativní farmaceuticky vhodné soli zahrnují adiční soli s kyselinou (vytvořené s volnou aminoskupinou proteinu) a soli, které se vytvoří s anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo s takovými organickými kyselinami, jako je kyselina octová, štavelová, vinná, mandlová a podobně. Soli vytvořené s volnými karboxylovými skupinami lze rovněž odvodit od anorganických bází, jako je například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý a od takových organických bází, jako je isopropylamin, trimethylamin, histidin, prokain a podobně. Podle daného prostředku se roztoky podávají způsobem kompatibilním s dávkovou formou a v množství, které je terapeuticky účinné.
• · · · • ·
- ·Ι07·· Nosiče mohou dále zahrnovat jakákoli rozpouštědla, disperzní média, vehikula, potahovací látky, ředidla, antibakteriální a antifungální látky, izotonizující látky a látky zpožďující absorpci, pufry, nosné roztoky, suspenze, koloidy a podobně. Použití takových médií a látek u farmaceuticky účinných látek je dobře známé v oboru. S výjimkou toho, když je kterékoli obvyklé médium nebo látka inkompatibilní s účinnou látkou, je použití takových médií a látek ve farmaceutických prostředcích zamýšleno. Doplňkové účinné látky lze rovněž začlenit do prostředků. Výraz farmaceuticky vhodný se týká molekul a prostředků, které nepůsobí alergickou nebo podobnou nežádoucí reakci při podání člověku.
V určitém ztělesnění lze farmaceutické prostředky podat intranasálními spreji, inhalačně a/nebo jinými aerosolovými vehikuly. Způsoby podání genů, nukleových kyselin a peptidových prostředků přímo do plic cestou nasálních aerosolových sprejů jsou popsány například v US patentech č. 5 756 353 a 5 804 212. Podobně podání léčiv za použití intranasálních mikročásticových pryskyřic (Takenaga a kol., J. Controlled Release, 52(1-2), 81 - 87 (2. března
1998) a sloučenin lysofosfatidylglycerolu (US patent č. 5 725 871) je rovněž dobře známé v oboru farmacie. Podobně ilustrativní transmukosální podání léčiv ve formě polytetrafluorethylenové podpůrné matrice je popsáno v US patentu č. 5 780 045.
V určitých ztělesněních se používají lipozomy, nanokapsle, mikročástice, lipidové částice, vezikuly a podobně k zavedení prostředků podle tohoto vynálezu do vhodných hostitelských buněk/organismů. Zejména lze připravit prostředky podle tohoto vynálezu pro podání buď • · · · • · · ·
- ίο»·· - ··
enkapslované v lipidové částici, lipozomu, vezikulu, nanokuličce nebo nanočástici a podobně. Jinak mohou být prostředky podle tohoto vynálezu vázány, buď kovalentně nebo nekovalentně na povrch takových nosných vehikul.
Příprava a použití lipozomálních a lipozomům podobných prostředků jako potenciálních nosičů léčiv je obecně známá odborníkovi v oboru (viz například Lasic, Trends
Biotechnol., 16(7), 307 - 321 (červenec 1998), Takakura,
Nippon Rinsho, 56(3), 691 - 695 (1998), Chandran a kol.,
Indián J. Exp. Biol., 35(8), 801 - 809 (1997), Margalit,
Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 12(2-3) , 233 - 261 (1995), US patenty č. 5 567 434, 5 552 157, 5 565 213, 5 738 868 a 5 795 587, z nichž každý je zde zahrnut odkazem ve své úplnosti).
Lipozomy se s úspěchem používají u řady buněčných typů, které se normálně obtížně podrobují transfekci jinými způsoby, včetně suspenzí T-buněk, kultur primárních hepatocytů a buněk PC 12 (Renneisen a kol., J. Biol. Chem., 265(27) , 16337 - 16342 (25. září 1990), Muller a kol., DNA Cell Biol., 9(3), 221 - 229 (duben 1990)). Kromě toho lipozomy neobsahují kontrainty DNA řetězce, které jsou typické pro systémy dodání, založené na virech. Lipozomy se efektivně používají k zavedení genů, různých léčiv, radiofarmak, enzymů, virů, transkripčních faktorů, alosterických efektorů a podobně do řady kultivovaných buněčných linií a zvířat.
Navíc se nezdá, že by použití lipozomů bylo spojeno s autominitními odpověďmi nebo nepřijatelnou toxicitou po systémovém podání.
V určitých ztělesněních se lipozomy tvoří z fosfolipidů, které se dispergují ve vodném médiu a spontánně ·· 4 4
4· 4
- Ϊ05** tvoří multilamelární koncentrické dvouvrstvé vezikuly (rovněž nazývané multilamelární vezikuly (MLVs)).
Alternativně v jiných ztělesněních poskytuje tento vynález farmaceuticky vhodné nanokapslové prostředky pro prostředky podle tohoto vynálezu. Nanokapsle mohou obecně zachycovat sloučeniny stabilním a reprodukovatelným způsobem (viz naapříklad Quintanar-Guerrero a kol., Drug Dev. Ind. Pharm., 24(12), 1113 - 1128 (prosinec 1998)). Aby se zabránilo vedlejším účinkům v důsledku přetížení intracelulárními polymery, lze takové velmi malé částice (o velikosti přibližně 0,1 μπι) navrhnout za použití polymerů, které jsou schopny odbourání in vivo. Takové částice lze připravit, jak popsali například Couvreur a kol., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 5(1), 1-20 (1988), Muhlen a kol., Eur. J. Pharm. Biopharm., 45(2) , 149 - 155 (březen 1998), Zambaux a kol., J. Controlled Release, 50(1-3), 31 - 40 (2. ledna 1998) a US patent č. 5 145 684.
Způsoby léčení rakoviny
V dalších aspektech tohoto vynálezu lze použít farmaceutické prostředky, které jsou zde popsány, pro léčení rakoviny, zejména pro imunoterapii rakoviny prsu. V rámci takových způsobů se farmaceutické prostředky, které jsou zde popsány, podávají pacientovi, obvykle teplokrevnému živočichovi, výhodně člověku. Pacient může nebo nemusí být postižen rakovinou. Ve shodě s tím lze farmaceutické prostředky, které jsou popsány výše, použít pro prevenci rozvoje rakoviny nebo pro léčení pacienta postiženého rakovinou. Farmaceutické prostředky a vakcíny lze podat buď před nebo po chirurgickém odstranění primárního tumoru a/nebo léčení, jako je aplikace radioterapie nebo • ··· ···· • ·· ·
- ττσ
konvenčních chemoterapeutických léčiv. Jak je diskutováno výše, podání farmaceutických prostředků se může uskutečnit jakýmkoli vhodným způsobem, včetně podání cestou intravenózní, intraperitoneální, intramuskulární, subkutánní, intranasální, intradermální, rektální, vaginální, místní a perorální.
V rámci určitých ztělesnění může být imunoterapie aktivní imunoterapií, při které léčení spoléhá na stimulaci in vivo endogenního hostitelského imunitního systému pro reakci proti tumorům podáním činidla, modifikujícího imunitní odpověď (jako jsou polypeptidy a polynukleotidy, jak jsou zde poskytnuty).
V rámci určitých ztělesnění může být imunoterapie pasivní imunoterapií, při které léčení zahrnuje podání činidel se zajištěnou imunitní reaktivitou vůči tumorům (jako jsou efektorové buňky nebo protilátky), které mohou přímo nebo nepřímo zprostředkovat protitumorové účinky a nutně nezávisí na intaktním hostitelském imunitním systému. Příklady efektorových buněk zahrnují T-buňky, jak je diskutováno výše, T-lymfocyty (jako jsou CD8+ cytotoxické T-lymfocyty a CD4+ T-helperové tumor infiltrující lymfocyty), zabíječové buňky (jako jsou přírodní zabíječové buňky a zabíječové buňky aktivované lymfokiny), B-buňky a antigen prezentující buňky (jako jsou dendritické buňky a makrofágy), exprimující polypeptid, který je zde poskytnut. Receptory T-buněk a protilátkové receptory specifické vůči polypeptidům zde citovaným lze klonovat, exprimovat a přenést do jiných vektorů nebo efektorových buněk pro adoptivní imunoterapií. Polypeptidy, které jsou zde poskytnuty, lze rovněž použít pro vytvoření protilátek nebo protilátek proti idiotypům (jak je popsáno výše a v US ···· • · · ·
- 111·· patentu č. 4 918 164) pro pasivní imunoterapii.
Efektorové buňky lze obecně získat v dostatečných množstvích pro adoptivní imunoterapii růstem in vitro, jak je zde popsáno. Podmínky kultivace pro rozšíření jednoduchých efektorových buněk specifických na antigen na počet několika miliard s retencí schopnosti rozpoznat antigen in vivo jsou dobře známé v oboru. Takové in vitro kultivační podmínky obvykle využívají intermitentní stimulace antigenem, často za přítomnosti cytokinů (jako je IL-2) a nedělících se vyživovacích buněk. Jak je uvedeno výše, imunoreaktivní polypeptidy, jak jsou zde poskytnuty, lze použít k rychlému rozšíření kultur T-buněk specifických na antigen, aby se vytvořil dostatečný počet buněk pro imunoterapii. Zejména antigen prezentující buňky, jako jsou dendritické buňky, makrofágy, monocyty, fibroblasty a/nebo B-buňky se mohou vystavit působení imunoreaktivních polypeptidů nebo se mohou podrobit transfekci s jedním nebo více polynukleotidů za použití standardních způsobů, dobře známých v oboru. Například antigen prezentující buňky lze podrobit transfekci s polynukleotidem, který má promotor vhodný pro zvýšení exprese u rekombinantního viru nebo jiného expresního systému. Kultivované efektorové buňky pro použití v léčení musí být schopny významného růstu a distribuce a musí dlouhodobě přežívat za podmínek in vivo Ve studiích se prokázalo, že kultivované efektorové buňky lze indukovat, aby rostly in vivo a dlouhodobě přežívaly ve významném množství pomocí opakovaných stimulací antigenem doplněným IL-2 (viz například Cheever a kol., Immunological Reviews, 157, 177 (1997)).
Popřípadě lze indukovat vektor, který exprimuje polypeptid uvedený zde do antigen prezentujících buněk,
4444 • 4 4
4 44 • 4
- 1TC2··* ·· 4 4
odebraných od pacienta a klonově propagovaných ex vivo pro trasplantaci zpět stejnému pacientovi. Buňky, podrobené transfekci se zavedou zpět pacientovi za použití kteréhokoli způsobu známého v oboru, výhodně ve sterilní formě intravenózním, intrakavitárním, intraperitoneálním nebo intratumorovým podáním.
Způsoby a frekvence podání terapeutikých prostředků, které jsou zde popsány, stejně jako dávky, se liší od jedince k jedinci a lze je přímo určit za použití standardních způsobů. Obecně řečeno, farmaceutické prostředky lze podat injekčně (například intrakutánně, intramuskulárně, intravenózně nebo subkutánně), intranasálně (například vdechováním) nebo perorálně. Výhodně lze podat mezi 1 a 10 dávkami během období 52 týdnů. Výhodně se podá 6 dávek v intervalech 1 měsíce a potom lze podávat periodicky podpůrné vakcinace. Pro jednotlivé pacienty mohou být vhodné alternativní protokoly. Vhodná dávka je množství sloučeniny, které, pokud je podáno, jak je popsáno výše, je schopné zvýšit protitumorovou imunitní odpověď nejméně o 10 až 50 % nad bazální hladinu (t. j. hladinu, která je bez podání sloučeniny). Takovou odpověď lze monitorovat měřením protitumorových protilátek u pacienta nebo tvorbou cytolytických efektorových buněk, schopných zabíjet tumorové buňky u pacienta za podmínek in vitro, která závisí na vakcinaci. Takové vakcíny mohou být rovněž schopny vyvolat imunitní odpověď, která vede ke zlepšenému klinickému výsledku (například častějším remisím, úplnému nebo částečnému nebo delšímu přežití bez nemoci) u vakcinovaných pacientů ve srovnání s nevakcinovanými pacienty. Obecně řečeno, u farmaceutických prostředků a vakcín, obsahujících jeden nebo více polypeptidů se množství každého polypeptidů, které je přítomno v dávce, pohybuje od přibližně 25 μ9 do ···· • · · · ·· ··«·
- 113·* ·· ·· mg na kg hostitele. Vhodné dávky se liší podle velikosti pacienta, ale obvykle se pohybují od přibližně 0,1 ml do přibližně 5 ml.
Obecně řečeno, vhodná dávka a léčebný režim poskytuje účinnou látku (účinné látky) v množství dostatečném k tomu, aby zajistila (zajistily) léčebný a/nebo profylaktický prospěch. Takovou odpověď lze monitorovat určením zlepšeného klinického výsledku (například častější remise, úplné nebo částečné nebo delší přežití bez nemoci) u léčených pacientů ve srovnání s neléčenými pacienty. Vzestup imunitních odpovědí, které existovaly již před podáním, na tumorový protein obecně koreluje se zlepšeným klinickým výsledkem. Takové imunitní odpovědi lze obecně hodnotit za použití standardních zkoušek proliferace, cytotoxicity nebo cytokinů, které lze provést za použití vzorků, získaných od pacienta před a po léčení.
Detekce rakoviny a diagnostické prostředky, způsoby a kity
Obecně řečeno, rakovinu lze detekovat u pacienta na základě přítomnosti jednoho nebo více proteinů tumoru prsu a/nebo polynukleotidů, kódujících tyto proteiny v biologickém vzorku (například krvi, séru, sputu, moči a/nebo tumorových biopsiích), získaném od pacienta. Jinými slovy, takové proteiny lze použít jako markéry, které indikují přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny, jako je rakovina prsu. Navíc mohou být takové proteiny užitečné v detekci jiných rakovin. Vazebná činidla, která jsou zde poskytnuta, obecně umožňují detekci hladiny antigenu, který se váže na činidlo v biologickém vzorku. Polynukleotidové primery a sondy lze použít k detekci hladiny mRNA, kódující protein tumoru, který je rovněž indikativní pro přítomnost ♦ ··· ·»··
- Ύ14·· • · · < ·· ♦· nebo nepřítomnost rakoviny. Obecně řečeno, sekvence tumoru prsu by měla být přítomna v hladině, která je nejméně třikrát vyšší ve tkáni tumoru než v normální tkáni.
Existuje řada zkušebních postupů, které jsou známy odborníkovi v oboru pro použití vazebných činidel, aby se detekovaly markéry polypeptidu ve vzorku. Viz například Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988). Obecně řečeno, přítomnost nebo nepřítomnost rakoviny u pacienta lze určit (a) kontaktováním biologického vzorku, získaného od pacienta s vazebným činidlem, (b) detekcí hladiny polypeptidu ve vzorku, které se váže na vazebné činidlo, a (c) porovnáním hladiny polypeptidu s předem určenou mezní hodnotou.
Ve výhodném ztělesnění zahrnuje zkouška použití vazebného činidla imobilizovaného na pevné podložce, aby se navázal a odstranil polypeptid ze zbytku vzorku. Navázaný polypeptid lze poté detekovat za použití detekčního činidla, které obsahuje reportérovou skupinu a které se specificky váže na komplex vazebného činidla s polypeptidem. Taková detekční činidla mohou zahrnovat například vazebné činidlo, které se specificky váže na polypeptid nebo protilátku nebo jinou látku, která se specificky váže na vazebné činidlo, jako anti-imunoglobulin, protein G, protein' A nebo lektin. Popřípadě lze použít kompetitivní zkoušku, ve které se polypeptid značí reportérovou skupinou a nechá se navázat na imobilizované vazebné činidlo po inkubaci vazebného činidla se vzorkem. Rozsah, ve kterém složky vzorku inhibují vázání značeného polypeptidu na vazebné činidlo, indikuje reaktivitu vzorku s imobilizovaným vazebným činidlem. Vhodné polypeptidy pro použití v rámci takových zkoušek zahrnují proteiny tumoru prsu s plnou délkou a jejich polypeptidové • ···· «* « • · ·· « · «
- iťř9··’-
části, na které se váže vazebné činidlo, jak je popsáno výše.
Pevnou podložkou může být materiál, který je známý odborníkovi v oboru, ke kterému lze připojit tumorový protein. Například může být pevnou podložkou testovací jamka na mikrotitrační destičce nebo nitrocelulózová nebo jiná vhodná membrána. Alternativně může být pevnou podložkou kulička nebo disk, jako je materiál ze skla, skleněných vláken, latexu nebo plastický materiál, jako je polystyren nebo polyvinylchlorid. Podložkou může rovněž být magnetická částice nebo vláknový optický senzor, jako jsou materiály, popsané například v US patentu č. 5 359 681. Vazebné činidlo lze imobilizovat na pevnou podložku řadou způsobů, které jsou známy odborníkovi v oboru, které jsou bohatě popsány v patentové a vědecké literatuře. V kontextu tohoto vynálezu se pojem imobilizace vztahuje jak na nekovalentní spojení, jako je adsorpce, tak na kovalentní připojení (které může být přímým spojením mezi činidlem a funkčními skupinami na podložce nebo může být spojením pomocí zesítovacího činidla). Imobilizace adsorpcí na jamku mikrotitrační destičky nebo na membránu je výhodná. V takových případech lze dosáhnout adsorpce kontaktováním vazebného činidla ve vhodném pufru s pevnou podložkou po vhodnou dobu trvání.
Doba kontaktu se liší podle teploty, ale je obvykle mezi přibližně 1 hodinou a přibližně 1 dnem. Obecně řečeno, kontaktování jamky plastické mikrotitrační destičky (jako je polystyrénová nebo polyvinylchloridová) s množstvím vazebného činidla, pohybujícím se v rozmezí od přibližně 10 ng do přibližně 10 μg a výhodně od přibližně 100 ng do přibližně 1 q,g je dostatečné k tomu, aby došlo k imobilizaci adekvátního množství vazebného činidla.
···· «··· ♦» ··*»
Kovalentního připojení vazebného činidla na pevnou podložku se obecně může dosáhnout nejprve reakcí podložky s bifunkčním reagenciem, které reaguje jak s podložkou, tak s funkční skupinou, jako je hydroxylová skupina nebo aminoskupina na vazebném činidle. Například může být vazebné činidlo kovalentně připojeno na podložky, které mají potažení vhodným polymerem za použití benzochinonu nebo kondenzací aldehydové skupiny na podložce s aminem nebo aktivním vodíkem na vazebném protějšku (viz například Pierce Immunotechnology Catalog and Handbook, 1991, A12 až A13).
V určitých ztělesněních je zkouška sendvičovou zkouškou se dvěma protilátkami. Tato zkouška se může uskutečnit nejprve kontaktováním protilátky, která byla imobilizována na pevnou podložku, obvykle jamku mikrotitraóní destičky, se vzorkem, tak aby se umožnilo navázání polypeptidů ze vzorku na imobilizovanou protilátku. Nenavázaný vzorek se poté odstraní z imobilizovaných komplexů polypeptidu s protilátkou a přidá se detekční činidlo (výhodně druhá protilátka, schopná vázat se na jiné místo polypeptidu), které obsahuje reportérovou skupinu. Množství detekčního činidla, které zůstává navázáno na pevnou podložku, se poté určí za použití způsobu vhodného pro specifickou reportérovou skupinu.
Specifičtěji, když se protilátka imobilizuje na podložku, jak je popsáno výše, zbývající místa, která váží protein na podložce se obvykle blokují. Lze použít jakoukoli vhodnou blokující látku, která je známa odborníkovi v oboru, jako je bovinní sérový albumin nebo Tween 20™ (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Imobilizovaná protilátka se potom inkubuje se vzorkem a umožní se navázání polypeptidu na protilátku. Vzorek lze zředit vhodným ředidlem, jako je • ·4· »· ·*<· «·«· fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) před inkubací. Obecně řečeno, vhodná kontaktní doba (t. j. inkubační doba) je časový úsek, který je dostatečný k tomu, aby se detekovala přítomnost polypeptidu ve vzorku, získaného z jedince s rakovinou prsu. Výhodně je kontaktní doba dostatečná k tomu, aby se dosáhlo hladiny, která je přibližně 95 % té hladiny, která se dosáhne při rovnováze mezi navázaným a nenavázaným polypeptidem. Odborníkovi v oboru je zřejmé, že dobu nutnou k dosažení rovnováhy lze přímo určit zkoušením úrovně vazby, která se vyskytuje za časové období. Při teplotě místnosti je obecně dostatečnou inkubační dobou přibližně 30 minut.
Nenavázaný vzorek lze potom odstranit promytím pevné podložky vhodným pufrem, jako je PBS s obsahem 0,1 % Tweenu 20 . Druha protilátka, která obsahuje reportérovou skupinu, může být potom přidána k pevné podložce. Vhodné reportérové skupiny zahrnují ty skupiny, které jsou uvedeny výše.
Detekční činidlo se potom inkubuje s imobilizovaným komplexem protilátky s polypeptidem po dobu dostečnou k tomu, aby se detekoval navázaný polypeptid. Vhodnou dobu lze obecně určit zkoušením úrovně vazby, která se vyskytuje za časové období. Nenavázané detekční činidlo se potom odstraní a navázané detekční činidlo se detekuje za využití reportérové skupiny. Způsob, který se použije pro detekci reportérové skupiny, závisí na povaze reportérové skupiny. Pro radioaktivní skupiny je obecně vhodné měření scintilace nebo autoradiografické způsoby. Spektroskopické způsoby lze použít k detekci barviv, luminiscenčních a fluorescenčních skupin. Biotin lze detekovat za použití avidinu, navázaného na odlišnou reportérovou skupinu (obvykle radioaktivní nebo fluorescenční skupinu nebo enzym). Enzymové reportérové • 9*99
F# 9
9 99 · ♦
- Φ18··*•9 999»
9 9
9 9 · 9
9*9
9 •9 9999 • · ·
9 9 · · • 9 9 · ·9 skupiny lze obecně detekovat přidáním substrátu (obecně po určité časové období), po kterém následuje spektroskopická nebo jiná analýza reakčních produktů.
Aby se určila přítomnost nebo absence rakoviny, jako je rakovina prsu, signál detekovaný z reportérové skupiny, která zůstává navázána na pevnou podložku se obecně porovnává se signálem, který odpovídá předem určené mezní hodnotě. V jednom výhodném ztělesnění je mezní hodnota pro detekci rakoviny průměrný střední signál, který se získá, když se imobilizovaná protilátka inkubuje se vzorky pacientů bez rakoviny. Obecně řečeno, vzorek, který vytváří signál, který je o tři směrodatné odchylky vyšší než předem určená mezní hodnota, se považuje za pozitivní s ohledem na rakovinu. V druhém výhodném ztělesnění se mezní hodnota určí za použití křivky operátoru přijímače, podle způsobu Sacketta a kol., Clinical Epidemiology: A Basic Science for Clinical Medicine, Little Brown and Co., str. 106 - 107 (1985). V krátkosti uvedeno, v tomto ztělesnění lze mezní hodnotu určit z diagramu párů reálných pozitivních hodnot (t. j. citlivosti) a falešně pozitivních hodnot (100% specificita), které odpovídají každé možné mezní hodnotě pro výsledek diagnostického testu. Mezní hodnota na diagramu, která je nejblíže hornímu levému rohu (t. j. ta hodnota, která vymezuje největší plochu) je nejpřesnější mezní hodnotou a vzorek, který vytváří signál, který je větší než mezní hodnota určená tímto způsobem, se považuje za pozitivní. Popřípadě se mezní hodnota může posunout doleva podle plata, aby se minimalizoval počet falešně pozitivních hodnot, nebo doprava, aby se minimalizoval počet falešně negativních hodnot. Obecně řečeno, vzorek který vytváří signál, který je větší než mezní hodnota určená tímto způsobem, se považuje za pozitivní, co se týče rakoviny.
»· ···« ·· ··«· • ·*·· ·· · • »*· • · ·> ·
• · ♦ · · • · ·« • · • 9 • · • · · ·· ·Φ
V souvisejícím ztělesnění se zkouška uskutečňuje průtokovém formátu nebo ve formátu proužkového testu, ve kterém se vazebné činidlo imobilizuje na membráně, jako je membrána z nitrocelulózy. V průtokové zkoušce se polypeptidy ve vzorku vážou na imobilizované vazebné činidlo, když vzorek prochází membránou. Druhé, značené vazebné činidlo se potom váže na komplex vazebného činidla s polypeptidem, jak roztok, který obsahuje druhé značené činidlo protéká přes membránu. Detekci navázaného druhého vazebného činidla lze potom uskutečnit, jak je popsáno výše. Ve formátu proužkového testu se jeden konec membrány, na kterou je navázáno vazebné činidlo, ponoří do roztoku, který obsahuje vzorek. Vzorek se pohybuje podél membrány přes oblast, která obsahuje druhé vazebné činidlo a do oblasti, kde je imobilizované vazebné činidlo. Koncentrace druhého vazebného činidla v oblasti imobilizované protilátky indikuje přítomnost rakoviny. Typicky vytváří koncentrace druhého vazebného činidla v daném místě vzor, jako je linie, kterou lze odečíst vizuálně. Absence takového vzoru indikuje negativní výsledek. Obecně řečeno, množství vazebného činidla imobilizovaného na membráně, se zvolí tak, aby se vytvořil vizuálně rozlišitelný vzor, pokud biologický vzorek obsahuje takovou hladinu polypeptidu, která je dostatečná k vytvoření pozitivního signálu v sendvičové zkoušce se dvěma protilátkami, ve formátu, který je uveden výše. Výhodnými vazebnými činidly pro použití v takových zkouškách jsou protilátky a jejich fragmenty, které váží antigen. Výhodně se množství protilátky imobilizované na membráně pohybuje v rozmezí od přibližně 25 ng do přibližně 1 μg a výhodněji od přibližně 50 ng do přibližně 500 ng. Takové testy lze obvykle provést s velmi malým množstvím biologického vzorku.
• · · · ·· · ·
- 120
Samozřejmě existuje řada dalších zkušebních protokolů, které jsou vhodné pro použití s tumorovými proteiny nebo vazebnými činidly podle tohoto vynálezu. Popisy, které jsou uvedeny výše, jsou zamýšleny pouze jako příkladné. Například je odborníkovi v oboru zřejmé, že protokoly, uvedené výše, lze přímo modifikovat pro použití polypeptidů tumoru k detekci protilátek, které se vážou na takové polypeptidy v biologickém vzorku. Detekce takových protilátek specifických vůči tumorovým polypeptidům může korelovat s přítomností rakoviny.
Rakovinu lze rovněž, nebo alternativně detekovat na základě přítomnosti T-buněk, které specificky reagují s tumorovým proteinem v biologickém vzorku. V rámci určitých způsobů se inkubuje biologický vzorek, obsahující CD4+ a/nebo CD8+ T-buňky izolované od pacienta s tumorovým polypeptidem, polynukleotidem, kódujícím takový polypeptid a/nebo APC, které expriraují alespoň imunogenní část takového polypeptidu a detekuje se přítomnost nebo absence specifické aktivace T-buněk. Vhodné biologické vzorky zahrnují izolované T-buňky, ale nejsou na ně omezeny. Například lze T-buňky izolovat od pacienta rutinními způsoby (jako Ficoll/Hypaque hustotně gradientovou centrifugací lymfocytů z periferní krve). T-buňky lze inkubovat in vitro po dobu 2 až 9 dnů (obvykle 4 dnů) při teplotě 37 °C s polypeptidem (například 5 až 25 μg/ml). Může být žádoucí inkubovat jiný vzorek, alikvotní co se týče T-buněk, za nepřítomnosti tumorového polypeptidu, který slouží jako kontrola. Pro CD4+ T-buňky se aktivace výhodně detekuje hodnocením proliferace T-buněk. Pro CD8+ T-buňky se aktivace výhodně detekuje hodnocením cytolytické aktivity. Úroveň proliferace, která je nejméně dvojnásobně vyšší a/nebo • · · · • · · · • · · ·
- 121 úroveň cytolytické aktivity, která je nejméně o 20 % vyšší než u pacientů, kteří nejsou nemocí postiženi, indikuje přítomnost rakoviny u pacienta.
Jak je uvedeno výše, rakovinu lze rovněž, nebo alternativně, detekovat na základě hladiny mRNA kódující tumorový protein v biologickém vzorku. Například nejméně dva oligonukleotidové primery mohou být zapojeny do zkoušky, založené na polymerázové řetězové reakci (PCR), aby se amplifikovala část tumorové cDNA odvozená z biologického vzorku, ve které je nejméně jeden z oligonukleotidových primerů specifický pro (t. j. hybridizuje na) polynukleotid, kódující tumorový protein. Amplifikovaná cDNA se potom separuje a detekuje za použití způsobů dobře známých v oboru, jako je elektroforéza v gelu. Podobně oligonukleotidové sondy, které specificky hybridizují na polynukleotid kódující tumorový protein, lze použít v hybridizační zkoušce, aby se detekovala přítomnost polynukleotidů, kódujícího tumorový protein v biologickém vzorku.
Aby se umožnila hybridizace za podmínek zkoušky, měly by oligonukleotidové primery a sondy zahrnovat sekvenci oligonukleotidů, která má nejméně 60%, výhodně nejméně 75% a výhodněji nejméně 90% identitu s částí polynukleotidů, kódující tumorový protein podle tohoto vynálezu, která má délku nejméně 10 nukleotidů a výhodné nejméně 20 nukleotidů. Výhodně hybridizuji oligonukleotidové primery a/nebo sondy na polynukleotid kódující polypeptid, který je zde popsán, za středně přísných podmínek, jak je definováno výše. Oligonukleotidové primery a/nebo sondy, které lze s užitkem použít v diagnostických způsobech, které jsou zde popsány, mají výhodně délku nejméně 10 až 40 oligonukleotidů. Ve • ·
- 122 výhodném ztělesnění oligonukleotidové primery zahrnují nejméně 10 sousedících nukleotidů, výhodněji nejméně 15 sousedících nukleotidů molekuly DNA, která má sekvenci, jak je zde popsána. Způsoby jak zkoušek založených na PCR, tak zkoušek založených na hybridizaci, jsou doře známé v oboru (viz například Mullis a kol., Cold Spring Harbor Symp.
Quant. Biol., 51, 263 (1987), Ehrlich vyd., PCR Technology, Stocton Press, NY (1989)).
Jedna výhodná zkouška využívá RT-PCR, ve které se PCR používá ve spojení s reverzní transkripcí. Typicky se RNA extrahuje z biologického vzorku, jako je tkáň z biopsie, a reverzně se transkribuje, aby vytvořila molekuly cDNA. PCR amplifikace, která používá nejméně jeden specifický primer, vytváří molekulu cDNA, kterou lze separovat a zviditelnit za použití například elektroforézy v gelu. Amplifikaci lze provést na biologických vzorcích, které se odeberou od testovaného pacienta a od jedince, který není postižen rakovinou. Amplifikační reakci lze provést na několika ředěních cDNA, měřících dvě pořadí velikosti. Dvojnásobný nebo větší nárůst exprese u několika ředění vzorku testovaného pacienta ve srovnání se stejnými ředěními vzorku bez rakoviny se obvykle považuje za pozitivní.
V jiném ztělesnění lze použít prostředky, které jsou zde popsány, jako markéry progrese rakoviny. V tomto ztělesnění lze zkoušky, jak jsou popsány výše pro diagnostiku rakoviny, provést během času a změnu hladiny reaktivního polypeptidů (polypeptidů) nebo polynukleotidu (polynukleotidů) lze hodnotit. Například lze zkoušky provádět každých 24 až 72 hodin po dobu 6 měsíců až 1 roku a potom podle potřeby. Obecně řečeno, rakovina progreduje u těch pacientů, u nichž detekovaná hladina polypeptidů nebo • · · · · ·
- 123 polynukleotidu vzrůstá během času. Naproti tomu rakovina neprogreduje, pokud hladina polypeptidu nebo polynukleotidu buď zůstává stejná nebo klesá během času.
Určité diagnostické zkoušky in vivo lze provést přímo na tumoru. Jedna taková zkouška zahrnuje kontaktování tumorových buněk s vazebným činidlem. Navázané vazebné činidlo se potom detekuje přímo nebo nepřímo pomocí reportérové skupiny. Taková vazebná činidla lze rovněž použít v histologických aplikacích. Popřípadě lze použít polynukleotidové sondy v rámci takových aplikací.
Jak je uvedeno výše, lze ke zlepšení citlivosti zkoušet vícečetné tumorové proteinové markéry v daném vzorku. Je zřejmé, že vazebná činidla specifická pro různé proteiny, které jsou zde poskytnuty, lze kombinovat v rámci jednoduché zkoušky. Dále lze souběžně použít vícečetné primery nebo sondy. Selekce tumorových proteinových markérů může být založena na rutinních pokusech, aby se určily kombinace, jejichž výsledkem je optimální citlivost. Navíc nebo alternativně lze kombinovat zkoušky tumorových proteinů, které jsou zde poskytnuty, se zkouškami jiných známých tumorových antigenů.
Tento vynález dále poskytuje kity pro použití v rámci kteréhokoli z diagnostických způsobů, uvedených výše. Takové kity obvykle zahrnují dvě nebo více složek, nutných pro provedení diagnostické zkoušky. Složkami mohou být sloučeniny, činidla, nádobky a/nebo zařízení. Například jedna nádobka v rámci kitu může obsahovat monoklonální protilátku nebo její fragment, který se specificky váže na tumorový protein. Takové protilátky nebo jejich fragmenty mohou být poskytnuty připojené k materiálu podložky, jak je
124 popsáno výše. Jedna nebo více doplňkových nádobek může obsahovat prvky, jako jsou činidla nebo pufry, které se použijí při zkoušce. Takové kity mohou rovněž nebo alternativně obsahovat detekční činidlo, jak je popsáno výše, které obsahuje reportérovou skupinu vhodnou pro přímou nebo nepřímou detekci navázání protilátky.
Jinak může být kit navržen tak, aby se detekovala hladina mRNA kódující tumorový protein v biologickém vzorku. Takové kity obecně zahrnují nejméně jednu oligonukleotidovou sondu nebo primer, jak je popsáno výše, které hybridizují na polynukleotid kódující tumorový protein. Takový oligonukleotid lze použít například v rámci zkoušek PCR nebo hybridizace. Další složky, které mohou být přítomny v takových kitech, zahrnují druhý oligonukleotid a/nebo diagnostické činidlo nebo nádobku pro usnadnění detekce polynukleotidu kódujícího tumorový protein.
Následující příklady jsou zde uvedeny pro ilustraci a neomezují rozsah tohoto vynálezu.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava cDNA specifické pro tumor prsu za použití diferenční zobrazovací RT-PCR
Tento příklad ilustruje přípravu molekul cDNA kódujících polypeptidy specifické pro tumor prsu za použití diferenčního zobrazovacího screeningu.
A. Příprava B18Agl cDNA a charakterizace exprese mRNA ·« ··♦ ·
- 125 -*
Připraví se vzorky tkání z tumoru prsu a normální tkáně u pacienta s rakovinou prsu, která byla potvrzena patologicky po odstranění z těla pacienta. Normální RNA a tumorová RNA se extrahuje ze vzorků a mRNA se izoluje a konvertuje na cDNA za použití (dT)12 AG (SEQ ID NO:130)
3'-ukotveného primeru. Potom se provede diferenční zobrazovací PCR za použití náhodně zvoleného primeru (CTTCAACCTC) (SEQ ID N0:103). Podmínkami amplifikace jsou standardní pufr, obsahující 1,5 mM chloridu hořečnatého, pmol primeru, 500 pmol dNTP a 1 jednotku Taq DNA polymerázy (Perkin-Elmer, Branchburg, NJ). Provede se čtyřicet cyklů amplifikace za využití denaturace při 94 °C po dobu 30 s, chlazení při 42 °C po dobu 1 min a extenze při 72 °C po dobu 30 s. Dostane se otisk prstu RNA, který obsahuje 76 amplifikovaných produktů. Ačkoli otisk prstu RNA tkáně tumoru prsu je více než z 98 % identický s otiskem prstu normální tkáně prsu, opakovaně se nachází pás, který je specifický vůči vzorku otisku prstu RNA tumoru. Tento pás se odřízne ze stříbřitě barevného gelu, subklonuje do T-vektoru (Novagen, Madison, WI) a sekvenuje.
Sekvence cDNA, označená jako B18Agl, je poskytnuta v SEQ ID NO:1. Vyhledáváním v databázích GENBANK a EMBL se zjistilo, že fragment B18Agl iniciálně klonovaný je 77% identický s endogenním humánním retrovirovým prvkem S71, který je zkrácený retrovirový prvek homologní se Simian Sarcoma Virus (SSV). S71 obsahuje neúplný gen gag, část genu pol a strukturu podobnou LTR na 3’-konci (viz Werner a kol., Virology, 174, 225 - 238 (1990)). B18Agl je rovněž 64% identický se SSV v regionu, odpovídájím loku P30 (gag). B18Agl obsahuje tři oddělené a nekompletní čtecí rámce, které pokrývají region, který sdílí významnou homologii s
- 126 a « · ·· ··«·
·· · ·· ···· rozsáhlou řadou gag proteinů retrovirů, které infikují savce. Navíc není homologie s S71 pouze v rámci genu gag, ale měří několik kb sekvence, zahrnující LTR.
B18Agl-specifické PCR primery se syntetizují za použití guidelinů počítačové analýzy. RT-PCR amplifikace (94 °C, 30 s, 60 °C až 42 °C, 30 s, 72 °C, 30 s po 40 cyklů) potvrzuje, že BISAgl představuje skutečnou sekvenci mRNA přítomnou v relativně vysokých hladinách ve tkáni tumoru prsu u pacienta. Primery použité při amplifikaci jsou B18Agl-l (CTG CCT GAG CCA CAA ATG) (SEQ ID NO:128) a B18Agl-4 (CCG GAG GAG GAA GCT AGA GGA ATA) (SEQ ID NO:129) při koncentraci hořčíku 3,5 mM a pH 8,5 a B18Agl-2 (ATG GCT ATT TTC GGG GCC TGA CA) (SEQ ID NO:126) a B18Agl-3 (CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T) (SEQ ID NO:127) při koncentraci hořčíku 2 mM a pH 9,5. Stejné pokusy ukazují velmi nízké hladiny až neexistenci exprese v normální prsní tkáni pacienta (viz obr. 1). Pokusy RT-PCR se potom použijí, aby se ukázalo, že BISAgl mRNA je přítomna v devíti jiných vzorcích tumoru prsu (od brazilských a amerických pacientů), avšak je nepřítomna nebo přítomna ve velmi nízkých hladinách v normální prsní tkáni, odpovídající každému pacientovi s rakovinou. Analýza RT-PCR rovněž ukazuje, že transkript B18Agl není přítomen v různých normálních tkáních (včetně lymfatické uzliny, myokardu a jater) a přítomen v relativně nízkých hladinách v PBMC a plicní tkáni. Přítomnost B18Agl mRNA ve vzorcích tumoru prsu a její absence u normální prsní tkáně se potvrzuje analýzou Northern blot, jak ukazuje obr.
2.
Diferenční exprese BISAgl v tkáni tumoru prsu se rovněž potvrzuje zkouškami RNázové ochrany. Obr. 3 ukazuje hladinu BISAgl mRNA v různých typech tkání, jak se určí ve
4*44 »4 *4*4 ·*·*
- 127 čtyřech různých zkouškách RNázové ochrany. Sloupce 1 až 12 představují různé vzorky normální prsní tkáně, sloupce 13 až 25 představují různé vzorky tkáně tumoru prsu, sloupce 26 a 27 představují vzorky normální prostaty, sloupce 28 a 29 představují vzorky tumoru prostaty, sloupce 30 až 32 představují vzorky tumoru tračníku, sloupec 33 představuje normální aortu, sloupec 34 představuje normální tenké střevo, sloupec 35 představuje normální kůži, sloupec 36 představuje normální lymfatickou uzlinu, sloupec 37 představuje normální vaječník, sloupec 38 představuje normální játra, sloupec 39 představuje normální kosterní sval, sloupec 40 představuje první vzorek normálního žaludku, sloupec 41 představuje druhý vzorek normálního žaludku, sloupec 42 představuje normální plíce, sloupec 43 představuje normální ledviny a sloupec 44 představuje normální pankreas. Srovnání mezi pokusy se usnadní zahrnutím pozitivní kontroly RNA nadbytku známého beta-aktinového signálu v každé zkoušce a normalizací výsledků různých zkoušek s ohledem na tuto pozitivní kontrolu.
Analýzy RT-PCR a Southern blot ukázaly, že lokus B18Agl je přítomen v lidské genomické DNA jako jednoduchá kopie endogenního retrovirového prvku. Genomový klon přibližně 12 až 18 kb se izoluje za použití iniciální sekvence B18Agl jako sondy. Pomocí Xbal digesce se rovněž izolují čtyři doplňkové subklony. Doplňkové retrovirové sekvence získané z konců produktů Xbal digesce těchto klonů (jejich lokace je ukázána na obr. 4) jsou ukázány jako SEQ ID NO:3 až SEQ ID NO:10, kde SEQ ID NO:3 ukazuje lokaci sekvence označené 10 v obr. 4, SEQ ID NO:4 ukazuje lokaci sekvence označené 11 až 29, SEQ ID NO:5 ukazuje lokaci sekvence označené 3, SEQ ID NO:6 ukazuje lokaci sekvence označené 6, SEQ ID NO:7 ukazuje lokaci sekvence označené
- 128 • ·«·· *· «··« ···· ·· * · » » Μ · * • 999 9 9 9 9 · 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 · • · · * 9 9 9 9 9 _f·· ·»* 9* 9 99 99
12, SEQ ID NO:8 ukazuje lokaci sekvence označené 13, SEQ ID NO:9 ukazuje lokaci sekvence označené 14 a SEQ ID NO:10 ukazuje lokaci sekvence označené 11 až 22.
Následné studie ukazují, že genomový klon 12 až 18 kb obsahuje retrovirový prvek přibližně 7,75 kb, jak ukazují obr. 5A a 5B. Sekvence tohoto retrovirového prvku je ukázána v SEQ ID NO:141. Číselná úsečka nahoře na obr. 5A představuje sekvenci DNA řetězce pozitivního retrovirového genomového klonu. Obdélníky pod touto úsečkou ukazují pozice zvolených restrikčních míst. Šipky zobrazují překrývající se klony, používané k sekvenování retrovirového prvku. Směr šipky ukazuje, zda sekvence jednoduchého subklonu odpovídá pozitivnímu nebo negativnímu vláknu. Obr. 5B je schematický diagram retrovirového prvku, který obsahuje Bl8Agl, zobrazující organizaci virových genů v rámci prvku. Otevřené obdélníky odpovídají předpokládaným čtecím rámcům, které začínají methioninem, které se nacházejí v prvku. Každý ze šesti pravděpodobných čtecích rámců je ukázán, jak je naznačeno v levé části obdélníků, s rámci 1 až 3, které odpovídají rámcům, které se nacházejí na pozitivním vláknu.
Za použití cDNA SEQ ID NO:1 jako sondy se získá delší cDNA (SEQ ID NO:227), která obsahuje malé rozdíly nukleotidů (méně než 1 %) ve srovnání s genomovou sekvencí, jak je ukázána v SEQ ID NO:141.
B. Příprava molekul cDNA kódujících další polypeptidy, specifické pro tumor prsu
Připraví se normální RNA a tumorová RNA a izoluje se mRNA a přemění se na cRNA za použití (dT)12 AG 3'-ukotveného primeru, jak je popsáno výše. Diferenční zobrazovací PCR se
129
potom provede za použití náhodně zvolených primerů ze SEQ ID NO:87 až 125. Podmínky amplifikace jsou takové, jak jsou popsány výše a pásy, u kterých se zjistilo, že jsou specifické pro vzorek otisku prstu RNA tumoru se odříznou ze stříbřitě barevného gelu, subklonují buď do T-vektoru (Novagen, Madison, WI) nebo do vektoru pCRII (Invitrogen,
San Diego, CA) a sekvenují. Sekvence jsou poskytnuty v SEQ ID NO:11 až SEQ ID NO:86. Ze 79 izolovaných sekvencí se zjistilo, že 67 je nových (SEQ ID NO:11 až 26 a 28 až 77) (viz rovněž obr. 6 až 20).
Rozšířená sekvence DNA (SEQ ID NO:290) pro antigen B15Agl (původně identifikovaná parciální sekvence poskytnutá v SEQ ID NO:27) se získá v dalších studiích. Srovnání sekvence v SEQ ID NO:290 se sekvencemi v genové bance, jak je popsáno výše, ukáže homologii se známým lidským genem beta-A aktivinu. Další studie vedou k izolaci sekvence cDNA o plné délce pro antigen B21GT2 (rovněž označovaný jako B311D, původně identifikovaná parciální sekvence cDNA poskytnutá v SEQ ID NO:56). Sekvence o plné délce je poskytnuta v SEQ ID NO:307 s odpovídající sekvencí aminokyselin, která je poskytnuta v SEQ ID NO:308. Další studie vedou k izolaci spojené varianty B311D. B311D klon sekvence SEQ ID NO:316 se sekvenuje a Xhol/Notl fragment z tohoto klonu se gelově čistí a značí 32P-CDTP náhodným primingem pro použití jako sonda pro další screening, aby se dostala doplňková B311D genová sekvence. Screenují se dvě frakce lidské bakteriální cDNA knihovny tumoru prsu za použití standardních způsobů. Jeden z klonů, izolovaných tímto způsobem, poskytuje výtěžek doplňkové sekvence, která zahrnuje póly A+ konec. Určená sekvence cDNA tohoto klonu (označovaná jako B311D_BT1_1A) je poskytnuta v SEQ ID NO:317. Zjistilo se, že sekvence SEQ ID NO:316 a SEQ ID • · · · • · · · • · · ·
- 130
NO:317 sdílejí identitu více než 464 bp regionu se sekvencemi, rozdělujícími se poblíž pely A+ sekvence SEQ ID NO:317.
Další studie identifikují 146 doplňových sekvencí (SEQ ID NO:142 až 289), z nichž se zdá, že 115 je nových (SEQ ID NO:142, 143, 146 až 152, 154 až 166, 168 až 176, 178 až 192, 194 až 198, 200 až 204, 206, 207, 209 až 214, 216, 218, 219, 221 až 240, 243 až 245, 247, 250, 251, 253, 255, 257 až 266, 268, 269, 271 až 273, 275, 276, 278, 280, 281, 284, 288 a 291). Podle znalostí původců tohoto vynálezu se neukázalo, že některá z dříve identifikovaných sekvencí exprimuje ve vyšší hladině ve tkáni lidského tumoru prsu než v normální prsní tkáni.
V dalších studiích se izoluje několik různých spojených forem antigenu BllAgl (rovněž označovaného jako B305D), z nichž každá z různých spojených forem obsahuje mírně odlišné verze BllAgl kódujícího rámce. Spojené spojovací sekvence definují individuální exony, které v různých vzorech a provedeních vytvářejí různé spojené formy. Primery se navrhnou tak, aby se vyzkoušel vzor exprese každého z exonů za použití RT-PCR, jak je popsáno výše. Ukázalo se, že každý exon ukazuje stejný vzorek exprese jako původní BllAgl klon s expresí, která je specifická pro tumor prsu, normální prostatu a normální varle. Určené sekvence cDNA pro izolované exony, kódující proteiny, jsou poskytnuty v SEQ ID NO:292 až 298. Předpokládané sekvence aminokyselin, které odpovídají sekvencím v SEQ ID NO:292 a 298 jsou poskytnuty v SEQ ID NO:299 a 300. Další studie, které používají rychlou amplifikaci cDNA konců (RACE),
5'-specifického primeru k jedné ze spojených forem BllAgl, které jsou poskytnuty výše a adenokarcinom prsu, vede • · · · • · · ·
- 131 k izolaci tří doplňkových odvozených spojených forem, označovaných jako izoformy B11C-15, B11C-8 a BllC-9,16. Určené sekvence cDNA pro tyto izoformy jsou poskytnuty v SEQ ID NO:301 až 303 s odpovídajícími předpokládanými sekvencemi aminokyselin, které jsou poskytnuty v SEQ ID N0:304 až 306.
Region B11C-15 (SEQ ID NO:301, rovněž označovaný jako B305D izoforma C) kódující protein se použije jako dotazovací sekvence ve vyhledávání BLASTN v databázi DNA Genbank. Bylo nalezeno odpovídající spojení s genomovým klonem z chromozomu 21 (Accesson č. AP001465). Párová seřazení poskytnutá ve výstupu z BLASTN se použijí k identifikaci putativního exonu nebo kódující sekvence chromozomální sekvence 21, která odpovídá sekvenci B305D. Na základě BLASTN párových seřazení se sestaví dohromady následující části záznamu GenBank AP001465: páry baží 67978 až 68499, 72870 až 72987, 73144 až 73335, 76085 až 76206, 77905 až 78085, 80520 až 80624, 87602 až 87633. Tato sekvence se potom seřadí se sekvencí B305D izoformy C za použití programu DNA Star Seqman a nadbytečná sekvence se odstraní takovým způsobem, aby se zachovala sekvence nejvíce podobná B305D. Konečná editovaná forma sekvence chromozomu 21 je 96,5% identická s B305D. Tato výsledná editovaná sekvence z chromozomu 21 se potom podrobí translaci a zjistilo se, že neobsahuje žádné stop kodóny jiné než konečný stop kodón ve stejné pozici, jako je kodón pro B305D. Stejně jako pro B305D sekvence chromozomu 21 (poskytnutá v SEQ ID NO:325) kóduje protein (SEQ ID NO:326), který má 384 aminokyselin. Seřazení tohoto proteinu s proteinem B305D izoformy C (SEQ ID NO:304) ukazuje 90% identitu aminokyselin.
Sekvence cDNA B305D izoformy C (SEQ ID NO:301) se • · · · • · · · • · · · · ·
- 132 ··· ·· ·· · · použije, aby se identifikovaly homology vyhledáváním v databázi High Throughput Genome Sequencing (HTGS) (NCBI, National Institutes for Health, Bethesda, MD). Homology se identifikují na chromozomu 2 (klon ID 9838181), chromozomu 10 (klon ID 10933022) a chromozomu 15 (klon ID 11560284). Tyto homology sdílejí více než 90% identitu s B305D izoformou C na úrovni nukleových kyselin. Všechny tři tyto homology kódují ORFs s 384 aminokyselinami, které sdílejí více než 90% identitu se sekvencí aminokyselin v SEQ ID NO:304. Dalším vyhledáváním v databázi GenBank sekvencí v SEQ ID NO: 301 se dostane výtěžek parciálního homologu sekvence na chromozomu 22 (klon ID 5931507). Sekvence cDNA pro homology chromozomů 2, 10, 15 a 22 se konstruují na základě homologie s B305D izoformou C a zachovaných sekvencí na spojeních intron-exon. Sekvence cDNA pro homology chromozomů 22, 2, 15 a 10 jsou poskytnuty v SEQ ID NO:327 až 330 a příslušné sekvence aminokyselin jsou poskytnuty v SEQ ID NO:331, 334, 333 a 332.
V následujících studiích na B305D izoformě A (sekvence cDNA poskytnuta v SEQ ID NO:292) se zjistilo, že sekvence cDNA (poskytnuta v SEQ ID NO:313) obsahuje doplňkový zbytek guaninu v pozici 884, vedoucí ke změně rámce v otevřeném čtecím rámci. Určená sekvence DNA této ORF je poskytnuta v SEQ ID NO:314. Změna rámce vytváří sekvenci proteinu (poskytnuta v SEQ ID NO:315) se 293 aminokyselinami, která obsahuje C-koncovou doménu společnou s jinými izoformami B305D, avšak lišící se v N-koncovém regionu.
Příklad 2
Příprava B18Agl DNA z lidské genomové DNA ···«
- 133
Tento příklad ilustruje přípravu B18Agl DNA amplifikací z lidské genomové DNA.
B18Agl DNA lze připravit z 250 ng lidské genomové DNA za použití 20 pmol B18Agl specifických primerů, 500 pmol dNTPS a 1 jednotky Taq DNA polymerůzy (Perkin Elmer, Branchburg, NJ) za následujících parametrů amplifikace: denaturace při 94 °C po dobu 30 s, chlazení z teploty 60 °C na 42 °C během doby 30 s, přírůstek 2 °C každé dva cykly a ponechání při 72 °C po dobu 30 s. Poslední zvýšení (chladící teplota 42 °C) se má cyklicky opakovat 25-krát. Primery se selektují za použití počítačové analýzy. Syntetizované primery jsou B18Agl-l, B18Agl-2, B18Agl-3 a B18Agl-4. Primerové páry, které lze použít, jsou 1+3,
1+4, 2+3 a 2+4.
Po elektroforéze v gelu lze vyříznout pás odpovídající B18Agl DNA a klonovat ho do vhodného vektoru.
Příklad 3
Příprava B18Agl DNA z cDNA tumoru prsu
Tento příklad ilustruje přípravu B18Agl DNA amplifikací z cDNA lidského tumoru prsu.
První vlákno cDNA se syntetizuje z RNA připravené z lidské tkáně tumoru prsu v reakční směsi, která obsahuje 500 ng póly A+ RNA, 200 pmol primeru (T)12AG (t. j. TTT TTT TTT TTT AG) (SEQ ID NO:130), IX pufru reverzní transkriptasy prvního vlákna, 6,7 mM DTT, 500 mmol dNTPs a 1 jednotky AMV nebo MMLV reverzní transkriptasy (od jakéhokoli dodavatele, jako je Gibco-BRL (Grand Island, NY)) v konečném objemu 30 • · · · • ·
- 134
μΐ. Po syntéze prvního vlákna se cDNA zředí přibližně 25 krát a 1 μΐ se použije pro amplifikaci, jak je popsáno v příkladu 2. Zatímco některé primerové páry mohou vytvořit heterogenní populaci transkriptů, primery B18Agl-2 (5'ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA) (SEQ ID NO:126) a B18Agl-3 (5' CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T) (SEQ ID NO:127) poskytnou výtěžek jednoduchého 151 bp produktu amplifikace.
Příklad 4
Identifikace epitopů B-buněk a T-buněk B18Agl
Tento příklad ilustruje identifikaci B18Agl epitopů.
Sekvenci B18Agl lze podrobit screeningu za použití řady počítačových algoritmů. Aby se určily epitopy B-buněk, lze sekvenci podrobit screeningu pro hodnoty hydrofobnosti a hydrofility za použití způsobu podle Hoppa, Prog. Clin.
Biol. Res., 172B, 367 - 377 (1985) nebo jinak podle Ceasea a kol., J. Exp. Med., 164, 1779 - 1784 (1986) nebo Spougea a kol., J. Immunol., 138, 204 - 212 (1987). Doplňkové epitopy třídy II MHC (protilátky nebo B-buňky) lze předvídat za použití programů, jako je AMPHI (např.
Margalit a kol., J. Immunol., 138, 2213 (1987)) nebo způsobů podle Rothbarda a Taylora (například EMBO J., 7, 93 (1988)).
Pokud jsou peptidy (o délce 15 až 20 aminokyselin) identifikovány za použití těchto způsobů, lze jednotlivé peptidy syntetizovat za použití zařízení pro automatizovanou syntézu peptidů (dostupného od výrobců, jako je Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) a způsobů, jako je Merrifieldova syntéza. Po syntéze lze peptidy použít ke screeningu séra, získaného od buď ···· •e ··«· • ·· ·
- 135 • · · · · · · ··· · · · · · · • · · · ···· •·♦ ·· · ·· ·· normálních pacientů nebo pacientů trpících rakovinou prsu, aby se určilo, jestli mají pacienti s rakovinou prsu protilátky reaktivní s peptidy. Přítomnost takových protilátek u pacienta s rakovinou prsu by potvrdila imunogenicitu specifického epitopu B-buněk, o který jde. Peptidy lze rovněž testovat ohledně jejich schopnosti vytvářet serologickou nebo humorální imunitní odpověď u zvířat (myš, krysa, králík, šimpanz atd.) po imunizaci in vivo. Vytváření antiséra specifického vůči peptidu po takové imunizaci dále potvrzuje imunogenicitu specifického epitopu B-buněk, o který jde.
Aby se identifikovaly epitopy T-buněk, lze sekvenci BISAgl podrobit screeningu za použití počítačových algoritmů, které jsou užitečné při identifikaci motivů o 8 až 10 aminokyselinách v rámci sekvence B18Agl, které jsou schopny vázat molekuly HLA třídy I MHC (viz například Rammensee a kol., Immunogenetics, 41, 178 - 228 (1995)). Po syntéze lze takové peptidy testovat na jejich schopnost vázat třídu I MHC za použití standardních vazebných zkoušek (například Sette a kol., J. Immunol., 153, 5586 - 5592 (1994)) a co je významnější, lze je testovat na jejich schopnost vytvářet cytotoxické T-buňky reaktivní na antigen po stimulaci in vitro pacientových nebo normálních periferních mononukleárních buněk za použití například způsobů podle Bakkera a kol., Cancer Res., 55, 5330 - 5334 (1995), Visserena a kol., J. Immunol. 154, 3991 - 3998 (1995), Kawakamiho a kol., J. Immunol., 154, 3961 - 3968 (1995) a Kasta a kol., J. Immunol., 152, 3904 - 3912 (1994). Úspěšná tvorba in vitro T-buněk schopných zabíjet autologní (nesoucí molekuly stejné třídy I MHC) tumorové buňky po stimulaci peptidem in vitro dále potvrzuje imunogenicitu antigenu B18Agl. Navíc lze takové peptidy
- 136
4444 ·* 4444 • 4 4 · • 44 · · 4 •4 ····
4 *
4 4 ·44 4444
4444 4· 4 4444 použít pro tvorbu myších cytotoxických T-buněk reaktivních na peptid a BISAgl po imunizaci in vivo u myší, které jsou transgenní pro expresi specifického lidského haplotypu MHC třídy I (Vitiello a kol., J. Exp. Med., 173, 1007 - 1015 (1991)).
Reprezentativní seznam předpokládaných epitopů BISAgl B-buněk a T-buněk, specifikovaných podle předpokládané HLA třídy I MHC vážící antigen je uveden dále:
Předpokládané Th motivy (epitopy B-buněk) (SEQ ID NO:131 až 133)
S S GGRTFDDFHRYLLVGI
QGAAQKPINLSKXIEWQGHDE
SPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA
Předpokládané HLA A2.1 motivy (epitopy T-buněk) (SEQ ID NO:134 až 140)
YLLVGIQGA
GAAQKPINL
NLSKXIEW
EWQGHDES
HLQEAYRIY
NLAFVAQAA
FVAQAAPDS
Příklad 5
Identifikace epitopů T-buněk BllAgl
Tento příklad ilustruje identifikaci BllAgl
Φ 4·*· • 4 4
4 · ·
4
Φ
Φ 4 4 4 Φ 4 ·«* 4 4 4 4 «» 4 « Φ Φ
4 4 4 4 φ • 4 4 4 4 »
4 4 * 4 4 4
4* 4 Φ» ΦΦ (označovaných rovněž jako B305D) epitopů. Čtyři peptidy, označované jako Bll-8, Bll-1, Bll-5 a Bll-12 (SEQ ID NO: 309 až 312) jsou odvozeny z genu BllAgl.
Lidské CD8 T-buňky se primerizují in vitro do peptidu Bll-8 za použití dendritických buněk podle protokolu Van Tsaie a kol., Critical Reviews in Immunology, 18, 65 - 75 (1998). Výsledné kultury CD8 T-buněk se testují na jejich schopnost rozpoznat peptid Bll-8 nebo peptid negativní kontroly, který prezenzuje linie B-LCL, JY. Ve stručnosti, T-buňky se inkubují s autologními monocyty za přítomnosti 10 μg/ml peptidu, 10 ng/ml IL-7 a 10 ^g/ml IL-2 a zkouší na jejich schopnost specificky lyžovat cílové buňky ve standardní zkoušce uvolňování 51-Cr. Jak ukazuje obr. 22, linie kultury vykazuje významnou schopnost rozpoznat peptid Bll-8 a slabší schopnost rozpoznat peptid Bll-1.
Klon z této CTL linie se izoluje po rychlé expanzi za použití monoklonální protilátky OKT3 a lidského IL-2. Jak ukazuje obr. 23, tento klon (označovaný jako Al) kromě toho, že je schopen rozpoznat specifický peptid, rozpozná JY LCL transdukovaný genem BllAgl. Tyto údaje ukazují, že Bll-8 je přirozeně se vytvářející epitop genu BllAgl. Navíc se zjistilo, že tyto T-buňky dále rozpoznají a lyžují v HLA-A2 restrikčním způsobu vytvořenou linii tumorových buněk přirozeně exprimujících BllAgl (obr. 24). Tyto T-buňky jasně rozpoznají linie plicního adenokarcinomu (LT-140-22) přirozeně exprimujících BllAgl transdukované s HLA-A2, stejně jako A2+ karcinomu prsu (CAMA-1) transdukované s BllAgl, avšak nikoli netransdukované linie nebo jinou negativní tumorovou linii (SW620).
Tyto údaje jasně ukazují, že tyto lidské T-buňky * 4··· 40 ··*· «· ··*· • · 4 4 4 4 4* 4 • »44 9 9 9 9 9 9
9 9 9 *9 9 9 9 9 * » · 4 4 4 4 4
Λ*9 999 99 9 99 *9 rozpoznají nejen Bll-specifické peptidy, ale také transdukované buňky, stejně jako přirozeně exprimující tumorové linie.
Zjistilo se, že CTL linie, u nichž se vytvořila reaktivita proti antigenům Bll-5 a Bll-12 za použití způsobů, které jsou popsány výše, rozpoznají odpovídající cílové struktury, které jsou potažené peptidem.
Příklad 6
Charakterizace genů tumoru prsu, zjištěných pomocí diferenční zobrazovací PCR
Specifita a citlivost genů tumoru prsu, nalezených pomocí diferenční zobrazovací PCR, se určí za použití RT-PCR. Tento způsob umožňuje rychlé zhodnocení exprese mRNA genu tumoru prsu semikvantitativně bez použití velkých množství RNA. Za použití genově specifických primerů se hodnotí hladiny exprese mRNA v různých tkáních, včetně 8 tumorů prsu, 5 normálních prsů, 2 tumorů prostaty, 2 tumorů tračníku, 1 tumoru plic a 14 dalších normálních lidských tkání, včetně normální prostaty, tračníku, ledviny, jater, plic, vaječníku, pankreatu, kosterního svalu, kůže, žaludku a varlete.
Aby se dosáhlo semikvantitativnosti RT-PCR, použije se beta-aktin jako interní kontrola pro každou zkoušenou tkáň. Připraví se sériová ředění cDNA prvního vlákna a provedou se zkoušky RT-PCR za použití primerů specifických na beta-aktin. Potom se zvolí ředění, které umožňuje lineárně řazenou amplifikaci beta-aktinového templátu a které je dostatečně citlivé, aby se odrazil rozdíl v čísle iniciální • ·· ·
kopie. Za použití těchto podmínek se určí hladiny beta-aktinu u každé reverzní transkripční reakce u každé tkáně. Znečištění DNA se minimalizuje ošetřením DNasou a zajištěním negativního výsledku, když se použije první vlákno cDNA, které se připraví bez přidání reverzní transkriptasy.
Za použití genových speciffických primerů se určí hladiny exprese mRNA v řadě tkání. Dosud se úspěšně vyzkoušelo 38 genů pomocí RT-PCR, z nichž pět vykazuje dobrou specificitu a citlivost pro tumory prsu (B15AG-1, B31GAlb, B38GA2a, BllAla a B18AGla). Obr. 21A a 21B ukazují výsledky pro tři z těchto genů: B15AG-1 (SEQ ID NO:27), B31GAlb (SEQ ID NO:148) a B38GA2a (SEQ ID NO:157). Tabulka I sumarizuje hladinu exprese všech testovaných genů v normální prsní tkáni a tumorech prsu a rovněž v jiných tkáních.
Tabulka I
Procento antigenů rakoviny prsu, které je exprimováno v různých tkáních nadměrně exprimováno u tumorů prsu 84 % prsní tkáně stejně exprimováno u normálních 16 % tkání a tumoru nadměrně exprimováno u tumorů prsu, avšak nikoli u kterékoli normální tkáně 9 % • · · · • · · ·
14®·· ·*· nadměrně exprimováno u tumorů prsu, jiné tkáně avšak exprimováno u některých normálních tkání 30 % nadměrně exprimováno u tumorů prsu, avšak stejně exprimováno u všech normálních tkání 61 %
Příklad 7
Příprava a charakterizace protilátek proti polypeptidům tumoru prsu
Připraví se polyklonální protilátky proti antigenu tumoru prsu B305D způsobem, uvedeným dále.
Antigen tumoru prsu, který je exprimován v expresním rekombinantním systému E. coli, se nechá přes noc růst v LB bujónu s vhodnými antibiotiky při teplotě 37 °C ve třepacím inkubátoru. Následující ráno se přidá 10 ml kultury z kultivace přes noc do 500 ml na 2x YT s vhodnými antibiotiky ve 2-litrové přepažené Erlenmeyerově baňce. Když optická denzita (při 560 nm) kultury dosáhne hodnoty 0,4 až 0,6, buňky se indukují s IPTG (1 mM). Za čtyři hodiny po indukci s IPTG se buňky zachytí odstřeďováním. Potom se buňky promyjí fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a opět odstřeďují. Supernatant se odstraní a buňky se buď zmrazí pro budoucí použití nebo ihned zpracují. 20 ml lyzátového pufru se přidá k buněčným peletám a směs se zvíří. Aby se porušily buňky E. coli, tato směs se potom vystaví působení Frenchova tlaku při tlaku 10 992 kPa. Buňky se potom opět centrifugují a supernatant a pelety se • · · ·
141·· ·-·· zkontrolují pomocí SDS-PAGE pro oddělení rekombinantního proteinu. Pro proteiny, které jsou lokalizovány v buněčné peletě, se peleta resuspenduje v 10 mM Tris, pH 8,0, 1 % CHAPS a sraženina pelet se promyje a opět odstředí. Tento postup se opakuje ještě dvakrát. Promytá sraženina pelet se solubilizuje buď v 8 M močoviny nebo 6 M hydrochloridu guanidinu, který obsahuje 10 mM Tris pH 8,0 plus 10 mM imidazolu. Solubilizovaný protein se přidá k 5 ml nikl-chelátové pryskyřice (Qiagen) a inkubuje po dobu 45 min až 1 h při teplotě místnosti za stálého míchání. Po inkubaci se směs pryskyřice a proteinu nechá protéct přes kolonu na jedno použití a filtrát se shromáždí. Kolona se potom promyje 10 až 20 objemy kolony solubilizačního pufru. Potom se antigen z kolony eluuje za použití 8 M močoviny, 10 mM Tris, pH 8,0 a 300 mM imidazolu a shromáždí ve frakcích o 3 ml. Použije se SDS-PAGE gel, aby se určilo, které frakce se spojí k dalšímu čištění.
Jako konečný stupeň čištění se ekvilibruje aniontoměničová pryskyřice, jako je HiPrepQ (Biorad) s vhodným pufrem a shromážděné frakce z předchozích stupňů se natáhnou do kolony. Antigen se eluuje z kolony zvyšujícím se gradientem soli. Frakce se shromáždí po průtoku kolonou a použije se jiný SDS-PAGE gel, aby se určilo, které frakce se spojí. Spojené frakce se dialyzují proti lOmM Tris, pH 8,0. Protein se získá po filtraci přes 0,22 mikrometrový filtr a antigeny se zmrazí do doby, než jsou potřebné pro imunizaci.
400 μg antigenu B305D se spojí s 100 μg muramyldipeptidu (MDP). Každé 4 týdny se králíkům injikuje 100 μg smíchaného se stejným množstvím nekompletního Freundova adjuvancia (IFA). Sedm dní po každé injekci se zvířeti • · · ·
- 142 odebere krev. Sérum se získá inkubací krve při teplotě 4 °C po dobu 12 až 24 hodin, po které následuje odstředění.
Destičky s 96 jamkami se potáhnou antigenem B305D inkubací s 50 μΐ (obvykle 1 μg) rekombinantního proteinu při teplotě 4 °C po dobu 20 hodin. Do jamek se přidá 250 μΐ BSA blokujícího pufru a inkubuje se při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Destičky se promyjí 6-krát PBS/0,01% Tweenem. Králičí sérum se zředí PBS. 50 μΐ zředěného sera se přidá do každé jamky a inkubuje se při teplotě místnosti po dobu 30 minut. Destičky se promyjí, jak je popsáno výše předtím, než se přidá 50 μΐ kozí protikráličí křenové peroxidasy ve zředění 1:10 000 a inkubuje při teplotě místnosti po dobu 30 min. Destičky se znovu promyjí, jak je popsáno výše a do každé jamky se přidá 100 μΐ TMB mikrojamkového peroxidasového substrátu. Po inkubaci po dobu 15 min v temnu při teplotě místnosti se kolorimetrická reakce zastaví 100 μΐ 1N kyseliny sírové a ihned se odečítá při 450 nm. Polyklonální protilátky vykazují imunoreaktivitu na B305D.
Provede se imunohistochemická analýza (IHC) exprese B305D ve vzorcích rakoviny prsu a normálního prsu, jak je popsáno dále. Parafinem obklopená fixovaná tkáň se rozdělí na sekce o 8 mikrometrech. Pro optimální podmínky barvení se použije parním zahříváním indukované získání epitopu (SHIER) v 0,1M pufru citrátu sodného (pH 6,0). Sekce se inkubují s 10 % sérem v PBS po dobu 5 min. Ke každé sekci se přidají primární protilátky v indikované koncentraci po dobu 25 min a potom následuje inkubace po dobu 25 min buď s protikráličí nebo protimyší biotinylovanou protilátkou. Aktivita endogenní peroxidasy se blokuje třemi inkubacemi peroxidem vodíku po dobu 1,5 min. Použijí se systémy komplex avidin s biotinem a křenová peroxidasa (ABC/HRP) spolu s DAB • · · · ·· · ·
- 143··**· chromagenem, aby se zviditelnila exprese antigenu. Plátky se protisměrně obarví hematoxylinem. Exprese B305D se detekuje jak v tumoru prsu, tak v normální prsní tkáni. Nicméně intenzita obarvení je mnohem nižší u normálních vzorků než u vzorků tumoru a povrchová exprese B305D se pozoruje pouze u tkání tumoru prsu.
Přehled PCR a imunohistochemických analýz v reálném čase exprese B305D na extenzivní plotně normálních tkání je ukázán v tabulce II dále. Tyto výsledky ukazují minimální expresi B305D ve varleti, neprůkazné výsledky u žlučníku a žádnou detekci u všech ostatních tkání.
Tabulka II
1 mRNA | obarvení IHC typ tkáně 1 1 |shrnutí | 1 I
mírně | pozitivní | pozitivní varle 1 1 |obarvení j ader| |malé menšiny | |spermatidů, | |spermatozoa | |negativní, | jsiminoma | |negativní | 1 I
negativní | negativní thymus 1 1 |žádná exprese | I I
N/A | negativní arterie 1 1 |žádná exprese | I I
negativní | L negativní _ kosterní sval _ 1| |žádná exprese | -1 1
4 4
- 144
Γ mRNA | L obarvení IHC 1 | typ tkáně J 1 1 |shrnutí 1
1 negativní | 1 1 L pozitivní (slabé obarvení) 1 | tenké střevo 1 1 I i Ί |žádná exprese 1 1 I
1 negativní | 1 1 L pozitivní (slabé obarvení) 1 | vaječník 1 1 i Π |žádná exprese 1 1 - 1
1 negativní | L 1 | hypofýza I . i |žádná exprese I
1 negativní | 1 1 1 pozitivní (slabé obarvení) 1 | žaludek 1 1 | |žádná exprese t 1 I
1 negativní | L negativní 1 | páteřní mícha 1 n |žádná exprese I
1 negativní | L negativní 1 | slezina j |žádná exprese 1
1 negativní | I negativní 1 | močovod I 1 |žádná exprese 1
1 N/A | I negativní 1 | žlučník I n |žádná exprese 1
1 N/A | I negativní 1 | placenta I 1 |žádná exprese 1
1 negativní ) I negativní 1 | štítná žláza I 1 |žádná exprese I
1 negativní | I negativní 1 | srdce I 1 |žádná exprese 1 -
1 negativní | 1_L negativní 1 | ledviny 1 1 |žádná exprese J
• · · · • · · ·
- 145
Γ mRNA | L obarvení IHC 1 | typ tkáně J 1 1 |shrnutí 1
1 negativní | L negativní 1 | játra ] |žádná exprese I
1 negativní | 1 L negativní 1 | mozek-malý | mozek I | |žádná exprese 1 1
1 negativní | L negativní 1 | tračník 1 |žádná I exprese
1 negativní | I negativní 1 | kůže 1 |žádná I exprese
1 negativní | L negativní 1 | kostní dřeň j 1 |žádná I exprese
1 N/A | 1 I negativní | příštítná | tělíska I 1 |žádná 1 I exprese
1 negativní | L negativní 1 | plíce ] 1 |žádná I exprese
1 negativní | L negativní 1 | jícen I 1 |žádná I exprese
1 negativní | 1 1 l pozitivní (slabé obarvení) 1 | děloha 1 1 1 |žádná 1 I I exprese
1 negativní | 1 negativní 1 | nadledvina I 1 |žádná I exprese
1 negativní | L negativní 1 | pankreas | 1 |žádná I exprese
1 N/A | 1 1_L negativní 1 | lymfatická | uzlina 1 1 |žádná 1 l exprese _
·· · ·· ·
- 146 • ··· ·· · · · · · • · ·· · · * 9 • » • ·->·
Γ mRNA 1 L obarvení IHC 1 | typ tkáně J —1-1 |shrnutí I
1 negativní | L negativní 1 | mozek-kůra I |žádná exprese I
1 N/A | L negativní 1 | vejcovod | |žádná exprese I
1 negativní | 1 1 L pozitivní (slabé obarvení) 1 | močový j měchýř 1 I |žádná exprese 1 1 |
1 negativní | I N/A 1 | kost I | |žádná exprese I
1 negativní | L N/A 1 | slinná žláza 1 | |žádná exprese I
1 negativní | 1 I N/A 1 | aktivovaná | PBMC l |žádná exprese 1 I
1 negativní | 1 I N/A 1 | restující | PBMC I | |žádná exprese 1 1
1 negativní | I N/A 1 | průdušnice I 1 |žádná exprese I
r negativní | .1 N/A 1 | dutá žíla 1 I |žádná exprese 1
1 negativní | 1 N/A 1 | sítnice I |žádná exprese I
1 negativní | 1_L N/A 1 | chrupavka l 1 |žádná exprese I
Příklad 8
Exprese proteinů antigenů tumoru prsu
4« ·
- 147 • 4 4 44 4 4
Tento příklad popisuje expresi a čištění antigenu B305D tumoru prsu u E. coli a v savčích buňkách.
Exprese B305D izoformy C-15 (SEQ ID NO:301, po translaci 384 aminokyselin) u E. coli se dosáhne klonováním otevřeného čtecího rámce B305D izoformy C-15 od počátku řetězce prvních 30 aminokyselin antigenu M. tuberculosis Ral2 (SEQ ID NO:318) v pET17b. Nejdříve se mutuje vnitřní EcoRI místo v B305D ORF beze změny proteinové sekvence, tak aby gen mohl být klonován na EcoRI místě Ral2. PCR primery, použité pro místně řízenou mutagenezi jsou ukázány v SEQ ID NO:319 (označované jako AW012) a SEQ ID NO:320 (označované jako AW013). ORF EcoRI místně modifikovaného B305D se potom amplifikuje pomocí PCR za použití primerů AW014 (SEQ ID NO:321) a AW015 (SEQ ID NO:322). Produkt PCR se vystaví působení EcoRI a liguje do vektoru Ral2/pET17b v místě EcoRI. Sekvence výsledného fuzního konstruktu (označovaného jako Ral2mBllc) se potvrdí sekvenováním DNA. Určená sekvence cDNA fuzního konstruktu je poskytnuta v SEQ ID NO:323 a sekvence aminokyselin v SEQ ID NO:324.
Fuzní konstrukt se transformuje do BL21(DE3)CodonPlus-RIL E. coli (Stratagene) a nechá přes noc růst na LB bujónu s kanamycinem. Výsledná kultura se indukuje IPTG. Protein se převede na membránu PVDF a blokuje 5% mlékem bez tuku (v pufru PBS-Tween), třikrát promyje a inkubuje myší anti-His smyčkovou protilátkou (Clontech) po dobu 1 h. Membrána se třikrát promyje a sonduje pomocí HRP-Proteinu A (Zymed) po dobu 30 min. Nakonec se membrána třikrát promyje a vyvíjí ECL (Amersham). Exprese se detekuje způsobem Western blot.
·· ···®
- 148*·**·
Pro rekombinantní expresi v savčích buňkách se B305D izoforma C-15 (SEQ ID NO:301 po translaci 384 aminokyselin) subklonuje do savčích expresních vektorů pCEP4 a pcDNA3.1 (Invitrogen). Tyto konstrukty se podrobí transfekci do buněk HEK293 (ATCC) za použití reagencia Fugene 6 (Roche). Krátce řečeno, buňky HEK se kultivují při denzitě 100 000 buněk na ml v DMEM (Gibco), obsahujícím 10% FBS (Hyclone) a nechají růst přes noc. Následujícího dne se přidá 2 μΐ Fugene 6 do 100 μΐ DMEM, neobsahujícího žádný FBS a inkubuje se při teplotě místnosti po dobu 15 min. Směs Fugene 6 a DMEM se přidá do 1 μ9 plasmidu DNA B305D/pCEP4 nebo B305D/pcDNA a inkubuje při teplotě místnosti po dobu 15 min. Směs Fugene a DNA se potom přidá k buňkám HEK293 a inkubuje při 37 °C po dobu 48 až 72 hodin se 7 % oxidu uhličitého. Buňky se promyj PBS, zachytí a peletují odstředěním.
Pro analýzu Western blot se připraví lyzáty celých buněk inkubací buněk v Triton-X100, který obsahuje lýzový pufr po dobu 30 min na ledu. Lyzáty se potom čistí odstřeďováním při frekvenci otáček 10 000 za minutu při teplotě 4 °C po dobu 5 minut. Vzorky se zředí SDS_PAGE plnícím pufrem s obsahem beta-merkaptoethanol a vaří po dobu 10 minut předtím, než se natáhnou na gel SDS_PAGE. Proteiny se převedou na nitrocelulózu a zkouší za použití proteinu A čištěného anti-B305D králičího polyklonálního séra (které se připraví, jak je popsáno výše) při koncentraci 1 μg na ml. Blot se vyvíjí kozím protikráličím Ig navázaným na HRP a potom inkubací v substrátu ECL. Exprese B305D se detekuje v lyzátech HEK2293, podrobených transfekci s B305D, ale nikoli u buněk HEK293, podrobených transfekci se samotným vektorem.
Pro analýzu FACS se buňky dále promyjí barvícím pufrem • · A A
- 149 ochlazeným na teplotu ledu a potom inkubují s kozím protikráličím Ig (H+L)-FITC reagenciem (Southern Biotechnology) při zředění 1:100 po dobu 30 min na ledu. Potom se buňky třikrát promyjí a resuspendují v barvicím pufru, který obsahuje propidiumjodid (PI), důležitým barvivém, které umožňuje identifikaci permeabilních buněk a poté se analyzují FACS. Analýza FACS ukazuje povrchovou expresi proteinu B305D.
Z výše uvedeného je zřejmé, že ačkoli jsou popsána specifická ztělesnění tohoto vynálezu pro ilustraci, lze uskutečnit řadu modifikací, aniž přitom dojde k odchýlení se od podstaty a rozsahu tohoto vynálezu. V souladu s tím není tento vynález omezen s výjimkou toho, jak je uvedeno v připojených patentových nárocích.

Claims (17)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaný polynukleotid, vyznačující se tím, že zahrnuje sekvenci, zvolenou ze skupiny sestávající z (a) sekvencí poskytnutých v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (b) komplementů sekvencí poskytnutých v SEQ ID NO:
    1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (c) sekvencí skládajících se z nejméně 20 sousedních zbytků sekvencí poskytnutých v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (d) sekvencí, které hybridizují na sekvence poskytnuté v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 za středně přísných podmínek, (e) sekvencí, které mají nejméně 75% identitu se sekvencemi poskytnutými v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330, (f) sekvencí, které mají nejméně 90% identitu se sekvencemi poskytnutými v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 a (g) degenerovaných variant sekvencí, poskytnutých v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313,
    314, 316, 317, 325 a 327 až 330.
    • ·· * ·· ·<·· ·· 9 90 9
  2. 2. Izolovaný polypeptid, vyznačující se tím, že zahrnuje sekvenci aminokyselin, zvolenou ze skupiny sestávající z (a) SEQ ID NO: 299, 300, 304 až 306, 308 až 312, 314, 326 a 331 až 334 (b) sekvencí kódovaných polynukleotidem podle nároku 1 (c) sekvencí, které mají nejméně 70% identitu se sekvencí kódovanou polynukleotidem podle nároku 1 a (d) sekvencí, které mají nejméně 90% identitu se sekvencí kódovanou polynukleotidem podle nároku 1.
  3. 3. Expresní vektor, zahrnující polynukleotid podle nároku
    1, který je operabilně spojený se sekvencí řízení exprese.
  4. 4. Hostitelská buňka, která je transformovaná nebo podrobena transfekci s expresním vektorem podle nároku 3.
  5. 5. Izolovaná protilátka nebo její fragment, který váže antigen, která se specificky váže na polypeptid podle nároku
    2.
  6. 6. Způsob detekce přítomnosti rakoviny u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) získání biologického vzorku od pacienta, (b) kontakt tohoto biologického vzorku s vazebným činidlem, které se váže na polypeptid podle nároku 2,
    - 152 • 99 9 •9 99·« ·· ·99«
    Φ 99 * · Φ · φ
    9 99 99 (c) detekci množství polypeptidu ve vzorku, které se váže na vazebné činidlo a (d) porovnání množství polypeptidu s předem určenou mezní hodnotou a tím stanovení přítomnosti rakoviny u pacienta.
  7. 7. Fuzní protein, který zahrnuje nejméně jeden polypeptid podle nároku 2.
  8. 8. Oligonukleotid, který hybridizuje na sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1, 3 až 86, 142 až 298, 301 až 303, 307, 313, 314, 316, 317, 325 a 327 až 330 za středně přísných podmínek.
  9. 9. Způsob stimulace a/nebo expanze T-buněk specifických pro protein tumoru, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování T-buněk nejméně s jednou složkou, zvolenou ze skupiny sestávající z:
    (a) polypeptidů podle nároku 2, (b) polynukleotidů podle nároku 1 a (c) antigen prezentujících buněk, které exprimují polypeptid podle nároku 2, za podmínek a po dobu dostatečnou k tomu, aby se umožnila stimulace a/nebo expanze T-buněk.
  10. 10. Izolovaná populace T-buněk, zahrnující T-buňky připravené způsobem podle nároku 9.
    - 153
    9999
    9 99
    9 9 9 • 9 99 »9 99»9 » · · ♦ « « • t 9
    9 9 9 ·* 9
    99 9999
    9 9 9
    9 9 9
    9 9 9 • 9 9 9
    99 99
  11. 11. Prostředek, vyznačující se tím, že zahrnuje jednu složku, zvolenou ze skupiny sestávající z fyziologicky vhodných nosičů a imunostimulancií a druhou složku, zvolenou ze skupiny sestávající z:
    (a) polypeptidů podle nároku 2, (b) polynukleotidů podle nároku 1 a (c) protilátek podle nároku 5, (d) fuzních proteinů podle nároku 7, (e) populací T-buněk podle nároku 10 a (f) antigen prezentujících buněk, které exprimují polypeptid podle nároku 2.
  12. 12. Způsob stimulace imunitní odpovědi u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje podání prostředku podle nároku 11 tomuto pacientovi.
  13. 13. Způsob léčení rakoviny u pacienta, vyznačuj í cí se tím, že zahrnuje podání prostředku podle nároku 11 tomuto pacientovi.
  14. 14. Způsob určení přítomnosti rakoviny u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) získání biologického vzorku od pacienta, (b) kontakt tohoto biologického vzorku s ·*·« * ·· <···* ·· ·«»» * · « • · · • · · * • * · · ·· *a ·····«
    - 154 oligonukleotidem podle nároku 8, (c) detekci množství polynukleotidu ve vzorku, který hybridizuje na oligonukleotid a (d) porovnání množství polynukleotidu, který hybridizuje na oligonukleotid s předem určenou mezní hodnotou a tím stanovení přítomnosti rakoviny u pacienta.
  15. 15. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jeden oligonukleotid podle nároku 8.
  16. 16. Diagnostický kit, vyznačující se tím, že obsahuje nejméně jednu protilátku podle nároku 5 a detekční reagens, přičemž detekční reagens obsahuje reportérovou skupinu.
  17. 17. Způsob inhibice rozvoje rakoviny u pacienta, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
    (a) inkubace CD4+ a/nebo CD8+ T-buněk izolovaných od pacienta, s nejméně jednou složkou zvolenou ze skupiny sestávající z: (i) polypeptidů podle nároku 2, (ii) polynukleotidů podle nároku 1 a (iii) antigen prezentujících buněk, které exprimují polypeptid podle nároku 2, tak, že T-buňky proliferují, (b) podání účinného množství proliferovaných T-buněk pacientovi, a tím inhibici rozvoje rakoviny u tohoto pacienta.
CZ20024213A 2000-05-24 2001-05-22 Prostředky a způsoby léčení a diagnostiky rakoviny prsu CZ20024213A3 (cs)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US57750500A 2000-05-24 2000-05-24
US59058300A 2000-06-08 2000-06-08
US09/699,295 US6828431B1 (en) 1999-04-09 2000-10-26 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US09/810,936 US20020068285A1 (en) 1996-01-11 2001-03-16 Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20024213A3 true CZ20024213A3 (cs) 2003-09-17

Family

ID=27504920

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20024213A CZ20024213A3 (cs) 2000-05-24 2001-05-22 Prostředky a způsoby léčení a diagnostiky rakoviny prsu

Country Status (15)

Country Link
US (1) US20020068285A1 (cs)
EP (2) EP1696028A3 (cs)
JP (1) JP2004508812A (cs)
KR (1) KR20030028474A (cs)
CN (1) CN1443239A (cs)
AU (1) AU2001264893A1 (cs)
BR (1) BR0111024A (cs)
CA (1) CA2409299A1 (cs)
CZ (1) CZ20024213A3 (cs)
HU (1) HUP0302566A2 (cs)
IL (1) IL152847A0 (cs)
MX (1) MXPA02011563A (cs)
NO (1) NO20025594L (cs)
PL (1) PL366066A1 (cs)
WO (1) WO2001090152A2 (cs)

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6656480B2 (en) * 1996-01-11 2003-12-02 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
US7241876B2 (en) * 1996-01-11 2007-07-10 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20030125536A1 (en) * 1996-01-11 2003-07-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
EP1517913B9 (en) * 1999-10-07 2007-08-29 Corixa Corporation A mycobacterium tuberculosis coding sequence for exression of heterologous proteins
AU6867801A (en) 2000-06-20 2002-01-02 Corixa Corp Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis
US20040081653A1 (en) 2002-08-16 2004-04-29 Raitano Arthur B. Nucleic acids and corresponding proteins entitled 251P5G2 useful in treatment and detection of cancer
WO2005080436A2 (en) * 2004-02-18 2005-09-01 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Antibodies that bind pote and uses thereof
KR100763902B1 (ko) * 2004-02-20 2007-10-05 삼성전자주식회사 유방암 특이적 단백질, 그를 코딩하는 유전자, 및 상기단백질 또는 유전자를 이용한 유방암의 진단 방법
CN101962405A (zh) * 2010-09-30 2011-02-02 南开大学 一种人源乳腺癌抗原及其抗体
KR20220015499A (ko) * 2017-10-03 2022-02-08 프리베일 테라퓨틱스, 인크. 리소좀 장애를 위한 유전자 요법
CN110132896A (zh) * 2019-05-06 2019-08-16 山西大学 一种快速检测血清中乳腺癌标志物的微型光纤生物传感器

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU1575697A (en) * 1996-01-10 1997-08-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of cancer
US6225054B1 (en) * 1996-01-11 2001-05-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
KR19990077146A (ko) * 1996-01-11 1999-10-25 길리스 스티브 유방암의 치료 및 진단용 조성물 및 방법
US20030125536A1 (en) * 1996-01-11 2003-07-03 Corixa Corporation Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
ZA982968B (en) * 1997-04-09 1998-10-27 Corixa Corp Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer
CA2365909A1 (en) * 1999-04-09 2000-10-19 Corixa Corporation Compositions and methods for the treatment and diagnosis of breast cancer

Also Published As

Publication number Publication date
NO20025594D0 (no) 2002-11-21
WO2001090152A3 (en) 2002-06-20
US20020068285A1 (en) 2002-06-06
BR0111024A (pt) 2004-06-22
PL366066A1 (en) 2005-01-24
IL152847A0 (en) 2003-06-24
CA2409299A1 (en) 2001-11-29
MXPA02011563A (es) 2003-06-06
CN1443239A (zh) 2003-09-17
EP1696028A2 (en) 2006-08-30
EP1283885A2 (en) 2003-02-19
JP2004508812A (ja) 2004-03-25
AU2001264893A1 (en) 2001-12-03
KR20030028474A (ko) 2003-04-08
WO2001090152A2 (en) 2001-11-29
EP1696028A3 (en) 2006-12-27
NO20025594L (no) 2003-01-21
HUP0302566A2 (hu) 2003-10-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US8182823B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20020193329A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of Her-2/neu-associated malignancies
JP2004526401A (ja) 肺癌の治療および診断のための組成物および方法
CZ2003537A3 (cs) Izolovaný polynukleotid
CA2411278A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of colon cancer
US20080219989A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
WO2002092001A2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
CZ20024213A3 (cs) Prostředky a způsoby léčení a diagnostiky rakoviny prsu
US6958361B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20110150919A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US7049063B2 (en) Methods for diagnosis of lung cancer
US7598226B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20060083749A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US7241876B2 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer
US20020110563A1 (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of lung cancer
ZA200209365B (en) Compositions and methods for the therapy and diagnosis of breast cancer.