CN1443239A - 用于治疗和诊断乳腺癌的组合物和方法 - Google Patents

用于治疗和诊断乳腺癌的组合物和方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开用于治疗和诊断癌症，尤其是乳腺癌的组合物和方法。说明性组合物含有一种或多种乳腺肿瘤多肽、其免疫原性部分、编码这些多肽的多核苷酸、表达这些多肽的抗原递呈细胞，和对于表达这些多肽的细胞特异的T细胞。这些公开的组合物可以例如用于诊断、预防和/或治疗疾病，特别是乳腺癌。

Description

用于治疗和诊断乳腺癌的组合物和方法
技术领域
本发明一般涉及癌症(如乳腺癌)的治疗和诊断。本发明更具体地涉及至少含有乳腺肿瘤蛋白质的一部分的多肽，及编码这些多肽的多核苷酸。这些多肽和多核苷酸可在用于诊断和治疗乳腺癌的药用组合物(例如疫苗)和其它组合物中使用。发明背景
乳腺癌是美国和全球妇女的一个显著的健康问题。尽管在乳腺癌的检测和治疗方面已获得了进展，但该疾病仍是导致妇女的癌症相关死亡的第二大原因，在美国每年有180,000位以上的妇女患上乳腺癌。在北美，女性一生中患乳腺癌的机率为八分之一。
目前还没有可以用于预防或治疗乳腺癌的疫苗或其它普遍获得成功的方法。对该疾病的控制目前依赖于早期诊断(通过常规乳腺筛检方法)和主动治疗(其可以包括多种治疗方法如手术、放疗、化疗和激素疗法中的一种或多种)的结合。对于特定乳腺癌，往往根据多个诊断参数，包括特异肿瘤标记的分析结果来选择治疗方案。见如Porter-Jordan和Lippman，Breast Cancer 8：73-100(1994)。然而，已有标记的使用常导致难于解释的结果，而且在乳腺癌患者中观察到的高死亡率说明在该疾病的治疗、诊断和预防方面需要改进。
因此，本领域需要治疗和诊断乳腺癌的改良方法。本发明满足了这些需要并进而提供了其它相关优点。发明概述
一方面，本发明提供包含选自以下组的序列的多核苷酸组合物：
(a)SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列；
(b)SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列的互补序列；
(c)由SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列中的至少20个连续残基组成的序列；
(d)与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列在中等严紧条件下杂交的序列；
(e)与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列有至少75％一致性的序列；
(f)与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列有至少90％一致性的序列；和
(g)SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列的简并变体。
在一个优选实施方案中，本发明的多核苷酸组合物在至少约20％、更优选地至少约30％、最优选地至少约50％的被检测乳腺肿瘤样品中表达，其中的表达水平比在正常组织中的表达水平高至少约2倍，优选地至少约5倍，最优选地至少约10倍。
另一方面，本发明提供含有上述多核苷酸序列编码的氨基酸序列的多肽组合物。
本发明还提供包含选自如下序列的氨基酸序列的多肽组合物：SEQID NO：299、300、304-306、308-312、314、326和331-334中所示的序列。
在某些优选实施方案，本发明的多肽和/或多核苷酸是免疫原性的，即，能够引起免疫应答，特别是体液和/或细胞免疫应答，如此处进一步所述。
本发明还提供所公开的多肽和/或多核苷酸序列的片段、变体和/或衍生物，其中该片段、变体和/或衍生物优选地具有一定水平的免疫原活性，其活性水平为SEQ ID NO：299、300、304-306、308-312、314、326和331-334所示多肽序列或SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示多核苷酸序列编码的多肽序列的免疫原活性水平的至少约50％、优选至少约70％、更优选至少约90％。
本发明还提供编码上述多肽的多核苷酸、含有这些多核苷酸的表达载体，以及用这些表达载体转化或转染的宿主细胞。
在其它方面，本发明提供含有如上所述多肽或多核苷酸和生理学可接受的载体的药用组合物。
在本发明的有关方面，提供用于预防或治疗用途的药用组合物，例如疫苗组合物。这些组合物一般含有本发明的免疫原性多肽或多核苷酸和免疫刺激剂，如佐剂。
本发明还提供含有下列成分的药用组合物：(a)可与本发明的多肽或其片段特异结合的抗体或其抗原结合片段；和(b)生理学可接受的载体。
在其它方面，本发明提供含有下列成分的药用组合物：(a)表达如上所述的多肽的抗原递呈细胞，和(b)药学可接受的载体或赋形剂。说明性抗原递呈细胞包括树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和B细胞。
在相关方面，提供含有下列成分的药用组合物：(a)表达如上所述的多肽的抗原递呈细胞，和(b)免疫刺激剂。
在其它方面，本发明还提供含有至少一种如上所述多肽的融合蛋白，以及编码这种融合蛋白的多核苷酸，它们一般是药用组合物的形式，例如疫苗组合物，含有生理学可接受的载体和/或免疫刺激剂。融合蛋白可含有如此处所述的多个免疫原性多肽或其部分/变体，还可含有一种或多种便于多肽表达、纯化和/或提高免疫原性的多肽片段。
在其它方面，本发明提供刺激患者免疫应答，优选地刺激病人的T细胞应答的方法，包括施用此处所述的药用组合物。患者可能患有乳腺癌，在这种情况中该方法为该疾病提供治疗，或者可以预防性地治疗认为有患该病危险的患者。
在其它方面，本发明提供抑制患者中癌症发展的方法，包括给患者施用如上所述的药用组合物。患者可能患有乳腺癌，在这种情况中该方法为该疾病提供治疗，或者可以预防性地治疗认为有患该病危险的患者。
在其它方面，本发明还提供从生物样品中除去肿瘤细胞的方法，包括使生物样品接触可与本发明的多肽特异反应的T细胞，其中在足以从样品中去除表达该蛋白的细胞的条件下和时间内进行此接触步骤。
在有关方面，提供抑制患者中癌症发展的方法，包括给患者施用如上所述处理的生物样品。
在其它方面，还提供刺激和/或扩增对于本发明的多肽特异的T细胞的方法，包括在足以刺激和/或扩增T细胞的条件下和时间内，使T细胞接触一种或多种下列成分：(i)如上所述的多肽；(ii)编码这种多肽的多核苷酸；和/或(iii)表达这种多肽的抗原递呈细胞。也提供含有如上所述制备的T细胞的分离的T细胞群。
在其它方面，本发明提供用于抑制患者中癌症发展的方法，包括给患者施用有效量的上述T细胞群。
本发明还提供用于抑制患者中癌症发展的方法，包括步骤：(a)用以下一或多种物质与分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞一起孵育：(i)至少含有本文公开的多肽的免疫原性部分的多肽；(ii)编码该多肽的多核苷酸；和(iii)表达该多肽的抗原呈递细胞；和(b)给患者施用有效量的该增殖T细胞，并籍此抑制患者体内的癌症发展。在给患者施用之前，可以，但非必须，对增殖细胞进行克隆。
在其它方面，本发明提供确定患者是否患有癌症(优选乳腺癌)的方法，包括：(a)用与上述多肽结合的结合剂接触获自患者的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；和(c)将该多肽量和预先确定的截断值(cut-off value)进行比较，由此确定患者是否患有癌症。在优选的实施方案中，该结合剂是抗体，更优选的是单克隆抗体。
在其它方面，本发明还提供用于监测患者的癌症进展的方法。该方法包括步骤：(a)用与上述多肽结合的结合剂接触在第一时间点上从患者获得的生物样品；(b)检测样品中与该结合剂结合的多肽的量；(c)采用在随后的时间点上从该患者获得的生物样品，重复步骤(a)和(b)；和(d)将步骤(c)中检测到的多肽量和步骤(b)中检测到的量进行比较，并由此监测患者的癌症进展。
在其它方面，本发明还提供确定患者是否患有癌症的方法，包括步骤：(a)用与编码本发明多肽的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品；(b)检测该样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸，优选mRNA，的水平；和(c)将与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的水平与预先确定的截断值进行比较，由此确定该患者是否患有癌症。在某些实施方案中，采用例如至少一个与编码上述多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸引物，通过聚合酶链式反应，检测mRNA的量。在其它实施方案中，利用与编码上述多肽的多核苷酸或该多核苷酸的互补序列杂交的寡核苷酸探针，采用杂交技术，检测该mRNA的量。
在相关方面，本发明提供用于监测患者的癌症进展的方法，包括步骤：(a)用与编码本发明多肽的多核苷酸杂交的寡核苷酸接触获自患者的生物样品；(b)检测该样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；(c)采用在随后时间点从该患者获得的生物样品，重复步骤(a)和(b)；和(d)将步骤(c)中检测到的多核苷酸量与步骤(b)中检测到的量进行比较，由此监测患者的癌症进展。
在其它方面，本发明提供与上述多肽结合的抗体，例如单克隆抗体，以及含有这些抗体的诊断试剂盒。还提供含有一个或多个上述寡核苷酸探针或引物的诊断试剂盒。
参考以下详述和附图，本发明的这些和其它方面将是明了的。本文公开的所有文献特此以参考文献的形式完整地并入，如同每篇文献单独并入一样。附图简述
图1显示凝胶电泳分离的差异显示PCR产物，泳道1和2中的PCR产物来自从正常乳腺组织中制备的cDNA，泳道3和4中的PCR产物来自从相同患者的乳腺肿癌组织中制备的cDNA。箭头指示出相应于B18Ag1的条带。
图2是乳腺肿瘤组织(泳道1)与正常乳腺组织中的B18Ag1 mRNA水平相比较的northern印迹。
图3显示乳腺肿瘤组织与各种正常组织及非乳腺肿瘤组织中的B18Ag1 mRNA水平的比较，所述mRNA水平是通过RNase保护试验确定的。
图4是基因组克隆图谱，该图谱显示了从XbaI限制性消化物的末端得到的额外逆转录病毒序列(见SEQ ID NO：3至SEQ ID NO：10)相对于B18Ag1的位置。
图5A和5B显示含有逆转录病毒元件的B18Ag1的测序策略、基因组组织和预测的开放阅读框。
图6显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B18Ag1的核苷酸序列。
图7显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B17Ag1的核苷酸序列。
图8显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B17Ag2的核苷酸序列。
图9显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B13Ag2a的核苷酸序列。
图10显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B13Ag1b的核苷酸序列。
图11显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B13Ag1a的核苷酸序列。
图12显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B11Ag1的核苷酸序列。
图13显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B3CA3c的核苷酸序列。
图14显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B9CG1的核苷酸序列。
图15显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B9CG3的核苷酸序列。
图16显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B2CA2的核苷酸序列。
图17显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B3CA1的核苷酸序列。
图18显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B3CA2的核苷酸序列。
图19显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B3CA3的核苷酸序列。
图20显示代表性乳腺肿瘤特异性cDNA B4CA1的核苷酸序列。
图21A描述了在乳腺肿瘤组织(泳道1-8)和正常乳腺组织(泳道9-13)及水(泳道14)中进行的乳腺肿瘤基因的RT-PCR分析。
图21B描述了在前列腺肿瘤(泳道1，2)、结肠肿瘤(泳道3)、肺肿瘤(泳道4)、正常前列腺(泳道5)、正常结肠(泳道6)、正常肾脏(泳道7)、正常肝(泳道8)、正常肺(泳道9)、正常卵巢(泳道10、18)、正常胰腺(泳道11、12)、正常骨骼肌(泳道13)、正常皮肤(泳道14)、正常胃(泳道15)、正常睾丸(泳道16)、正常小肠(泳道17)、HBL-100(泳道19)、MCF-12A(泳道20)、乳腺肿瘤(泳道21-23)、水(泳道24)、及结肠肿瘤(泳道25)中进行的乳腺肿瘤基因的RT-PCR分析。
图22显示抗B11-8 CTL细胞系对B11Ag1肽(称作B11-8)的识别。
图23显示B11-8特异性克隆A1对用抗原B11Ag1转导的细胞系的识别。
图24显示B11-8特异性克隆A1对肺的腺癌细胞系(LT-140-22)和乳腺的腺癌细胞系(CAMA-1)的识别。发明详述
本发明一般涉及组合物及其在癌症(特别是乳腺癌)治疗和诊断中的应用。如下进一步所述，本发明的说明性组合物包含但不限于：多肽，特别是免疫原性多肽，编码这些多肽的多核苷酸，抗体和其它结合剂，抗原递呈细胞(APC)和免疫系统细胞(例如T细胞)。
除非有相反的特别指明，本发明的实施将使用本领域技术内的常规病毒学、免疫学、微生物学、分子生物学方法和重组DNA技术，为了举例说明其中许多在下面描述。这些技术在文献中有充分解释。参见，例如，Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》(第二版，1989)；Maniatis等人，《分子克隆：实验室指南》(1982)；《DNA克隆：实用手册》第I卷和第II卷(D.Glover编写)；《寡核苷酸合成》(N.Gait编写，1984)；《核酸杂交》(B.Hames和S.Higgins编写，1985)；《转录和翻译》(B.Hames和S.Higgins编写，1984)；《动物细胞培养》(R.Freshney编写，1986)；Perbal，《分子克隆实践指南》(1984)。
在上文和在下文引用的所有公开文本、专利和专利申请，在此均完整引用作为参考。
在本说明书和所附权利要求书中使用时，除非内容中清楚地指明，否则单数形式“一个”、“一种”和“这个”包括复数形式。多肽组合物
在此使用时，术语“多肽”为其普通含义，即，是一种氨基酸序列。多肽不限于特定长度的产物；因此，多肽的定义中包括肽、寡肽和蛋白质，这些术语在此可交换使用，除非另外特别指明。该术语也并非是指或排除多肽的表达后修饰，例如，糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域所知的其它修饰，这些修饰既可以是自然发生的也可以是非自然发生的。多肽可以是完整的蛋白质，或其亚序列。本发明中的特定目的多肽是含有表位(即主要负责多肽的免疫原性并且能引发免疫应答的抗原决定簇)的氨基酸亚序列。
本发明的具体说明性多肽包括SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330之任一个所示的多核苷酸序列，或者在中等严紧条件下或高度严紧条件下可与SEQID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330之任一个所示的多核苷酸序列杂交的序列编码的多肽。本发明的某些其它说明性多肽包含SEQ ID NO：299、300、304-306、308-312、314、326和331-334之任一个所示的氨基酸序列。
本发明的多肽在此有时称作乳腺肿瘤蛋白质或乳腺肿瘤多肽，表示它们的鉴定至少部分基于它们在乳腺肿瘤样品中的表达水平提高。因此，“乳腺肿瘤多肽”或“乳腺肿瘤蛋白质”一般是指本发明的多肽序列，或编码这种多肽的多核苷酸序列，它在相当大比例的乳腺肿瘤样品中表达，例如，优选地在超过约20％、更优选地超过约30％、最优选地超过约50％或更多的被检测乳腺肿瘤样品中表达，表达水平比在正常组织中的表达水平至少高2倍，优选地至少高5倍，这是利用此处所述的典型试验测定的。本发明的乳腺肿瘤多肽序列(基于其在肿瘤细胞中表达水平的提高)特别能用作为诊断标记和治疗靶标，如以下所述。
在某些优选实施方案中，本发明的多肽是免疫原性的，即，它们在免疫测定(如ELISA或T细胞刺激试验)中可与乳腺癌患者的抗血清和/或T细胞可检测地反应。对免疫原性的筛查可利用本领域技术人员周知的技术进行。例如，这些筛查能利用如Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室，1988所述的方法进行。在一个说明性实例中，多肽可固定于固体载体上，并与患者的血清接触，以使血清内的抗体与固定的多肽结合。然后除去未结合的血清，并利用例如125I一标记的蛋白A检测结合的抗体。
熟练技术人员应当知道，本发明也包括此处公开的多肽的免疫原性部分。正如此处所用，“免疫原性部分”是本发明的免疫原性多肽的片段，其本身对可识别该多肽的B细胞和/或T细胞表面抗原受体具有免疫学反应性(即，特异性结合)。免疫原性部分一般可以用众所周知的技术鉴定，如Paul，《基础免疫学》，第3版，243-247(RavenPress，1993)和此处引用的参考文献所概述的技术。这些技术包括根据与抗原特异性抗体、抗血清和/或T细胞系或克隆反应的能力筛查多肽。在此使用时，如果抗血清和抗体能与抗原特异性结合(即，它们在ELISA或其它免疫测定中能与该蛋白质反应，但与无关蛋白质没有可检测到的反应)，则它们是“抗原特异性的”。这些抗血清和抗体可以如此处所述及利用众所周知的技术制备。
在一个优选实施方案中，本发明的多肽的免疫原性部分是可与抗血清和/或T细胞以基本上不低于全长多肽反应性的水平(例如在ELISA和/或T细胞反应性测定中)反应的部分。优选地，免疫原性部分的免疫原性水平为全长多肽的免疫原性的至少约50％、优选地至少约70％、最优选地超过约90％。有时，鉴定优选的免疫原性部分，它们比相应全长多肽具有更高的免疫原性水平，例如高于约100％或150％或更高的免疫原性。
在某些其它实施方案中，说明性免疫原性部分可包括N端前导序列和/或跨膜域已经缺失的肽。其它说明性免疫原性部分相对于成熟蛋白质可含有小的N-和/或C-末端缺失(例如，1-30个氨基酸，优选地5-15个氨基酸)。
在另一个实施方案中，本发明的多肽组合物也可以含有一种或多种可与抗本发明多肽产生的T细胞和/或抗体发生免疫学反应的多肽，特别是具有此处公开的氨基酸序列的多肽，或其免疫原性片段或变体。
在本发明的另一个实施方案中，提供多肽，其包含能诱发可与如下多肽发生免疫学反应的T细胞和/或抗体的一种或多种多肽，或其免疫原性片段或变体：此处公开的一种或多种多肽，或由此处公开的多核苷酸序列或在中度到高度严紧条件下可以与这些序列一种或多种杂交的一种或多种核酸序列中包含的连续核酸序列编码的一种或多种多肽。
本发明另一方面提供这样的多肽片段：它们含有此处所述多肽组合物(如SEQ ID NO：299、300、304-306、308-312、314、326和331-334所示的那些，或SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示多核苷酸序列编码的那些)的至少约5、10、15、20、25、50或100个连续氨基酸，或者更多，包括所有中间长度。
另一方面，本发明提供此处所述多肽组合物的变体。本发明一般包括的多肽变体典型地显示出在全长范围内，与此处所述的多肽序列有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的一致性(如下所述测定)。
在一个优选实施方案中，本发明提供的多肽片段和变体对于可与此处具体描述的全长多肽反应的抗体和/或T细胞有免疫学反应性。
在另一个优选实施方案中，与此处具体描述的全长多肽序列的免疫原性水平相比，本发明提供的多肽片段和变体显示至少约50％、优选地至少约70％、最优选地至少约90％或更高的免疫原性水平。
当在此使用该术语时，多肽“变体”是典型地由于一个或多个置换、缺失、添加和/或插入而不同于此处具体公开的多肽的多肽。这些变体可以是自然存在的，或者可以是合成产生的，例如，通过修饰一种或多种本发明的上述多肽序列，并如此处所述和/或利用本领域众所周知的许多技术评价其免疫原性而产生。
例如，本发明的多肽的某些说明性变体包括已去除一个或多个部分(如N端前导序列或跨膜域)的变体。其它说明性变体包括已从成熟蛋白质的N端和/或C端除去一小部分(例如，1-30个氨基酸，优选地5-15个氨基酸)的变体。
在许多情况中，变体含有保守置换。“保守置换”是将一种氨基酸置换为具有类似性质的另一种氨基酸的置换，这样，肽化学领域的技术人员能预料到多肽的二级结构和亲水性基本不变。如上所述，可以对本发明的多核苷酸和多肽的结构进行修饰，而仍获得编码具有希望特征(如免疫原性特征)的变体或衍生多肽的功能性分子。当希望改变多肽的氨基酸序列产生免疫原性相当乃至提高的本发明多肽的变体或部分时，本领域技术人员一般根据表1改变编码DNA序列的一个或多个密码子。
例如，可以将蛋白质结构中的某些氨基酸置换为其它氨基酸，而不会致使与抗体的抗原结合区或底物分子上的结合部位等结构的相互作用结合能力明显丧失。由于蛋白质的相互作用能力和性质确定了蛋白质的生物学功能活性，故能在蛋白质序列和(当然)其DNA编码序列中进行某些氨基酸序列置换，而仍然获得具有类似性质的蛋白质。因此预料可以在公开的组合物的肽序列中，或在编码该肽的相应DNA序列中进行许多改变，而它们的生物用途或活性没有明显丧失。
                      表1
        氨基酸             密码子
丙氨酸 Ala  A  GCA  GCC  GCG  GCU
半胱氨酸 Cys  C  UGC  UGU
天冬氨酸 Asp  D  GAC  GAU
谷氨酸 Glu  E  GAA  GAG
苯丙氨酸 Phe  F  UUC  UUU
甘氨酸 Gly  G  GGA  GGC  GGG  GGU
组氨酸 His  H  CAC  CAU
异亮氨酸 Ile  I  AUA  AUC  AUU
赖氨酸 Lys  K  AAA  AAG
亮氨酸 Leu  L  UUA  UUG  CUA  CUC  CUG  CUU
甲硫氨酸 Met  M  AUG
天冬酰胺 Asn  N  AAC  AAU
脯氨酸 Pro  P  CCA  CCC  CCG  CCU
谷氨酰胺 Gln  Q  CAA  CAG
精氨酸 Arg  R  AGA  AGG  CGA  CGC  CGG  CGU
丝氨酸 Ser  S  AGC  AGU  UCA  UCC  UCG  UCU
苏氨酸 Thr  T  ACA  ACC  ACG  ACU
缬氨酸 Val  V  GUA  GUC  GUG  GUU
色氨酸 Trp  W  UGG
酪氨酸 Tyr  Y  UAC  UAU
在进行这些改变时，可以考虑氨基酸的亲水性指数。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质相互作用生物功能中的重要性在本领域中周知(Kyte和Doolittle，1982，在此引用作为参考)。公认氨基酸的相对亲水性对产生的蛋白质的二级结构有作用，这又确定了蛋白质与其它分子(如，酶、底物、受体、DNA、抗体、抗原等)的相互作用。每种氨基酸根据其疏水性和电荷特征具有一定的亲水性指数(Kyte和Doolittle，1982)。这些值是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)和精氨酸(-4.5)。
本领域周知，一些氨基酸可以置换为具有类似亲水性指数或得分的其它氨基酸，而仍产生具有类似生物活性的蛋白质，即仍获得生物功能相当的蛋白质。在进行这些改变时，亲水性指数在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内是特别优选的，在±0.5之内是更加优选的。本领域也周知，能根据亲水性有效地进行类似氨基酸的置换。美国专利4,554,101(在此完整引用作为参考)指出，蛋白质的最大局部平均亲水性受到其相邻氨基酸亲水性的控制，其与该蛋白质的生物学性质相关。
如美国专利4,554,101详述的，分配给氨基酸残基下列亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+3.0)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；甲硫氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。应当理解，一种氨基酸能置换为具有相似亲水性值的另一种氨基酸，而仍能获得生物学相当的，特别是免疫学相当的蛋白质。在这些改变中，亲水性值在±2之内的氨基酸的置换是优选的，在±1之内是特别优选的，在±0.5之内是更加优选的。
如上所述，氨基酸置换一般是基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。考虑到上述多种特征的典型置换为本领域技术人员所周知，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。
另外，还可以进一步修饰任一多核苷酸，以提高其体内稳定性。可能的修饰包括但不限于：在5’和/或3’端添加侧翼序列；在主链中使用硫代磷酸酯或2’O-甲基而不是磷酸二酯酶连接；和/或含有非传统碱基，如肌苷、queosine和wybutosine，以及腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶的乙酰基-、甲基-、硫代-及其它修饰形式。
可以根据残基的极性、电荷、溶解度、疏水性、亲水性和/或两性性质的相似性进一步进行氨基酸置换。例如，带负电的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；具有类似亲水性值、含有不带电极性头基团的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸；甘氨酸和丙氨酸；天冬酰胺和谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。代表保守性改变的其它氨基酸类别包括：(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr；(2)cys、ser、tyr、thr；(3)val、ile、leu、met、ala、phe；(4)lys、arg、his；和(5)phe、tyr、trp、his。一种变体还可以，或者是可以含有非保守性改变。在一个优选实施方案中，变体多肽由于5个或更少氨基酸的置换、缺失或添加而不同于原始序列。还可以(或者可备择地)通过例如缺失或添加对多肽的免疫原性、二级结构和亲水性有最小影响的氨基酸来修饰(如缺失或添加)这些变体。
如上所述，多肽可以在蛋白质的N端含有信号(或前导)序列，该序列在翻译时或在翻译后引导该蛋白质的转移。多肽也可以与接头或其它序列偶联，以便于多肽的合成、纯化或鉴定(例如聚-His)，或增强该多肽与固体载体的结合。例如，多肽可以与免疫球蛋白Fc区偶联。
当比较多肽序列时，如果按如下所述进行比对达到最大相应性时两种序列的氨基酸序列相同，则称这两种序列“一致”。两种序列的比较一般通过在比较窗口中比较序列来进行，以鉴定和比较局部区域的序列相似性。在此使用时，“比较窗口”是指具有至少约20个，通常30至约75个，40至约50个连续位点的片段，在该片段中可以在一个序列和具有相同数目连续位置的参考序列最佳比对后对这两个序列进行比较。
为了序列比较，可以采用Lasergene生物信息软件包中的Megalign程序(DNASTAR公司，Madison，WI)，利用默认参数进行序列的最佳比对。该程序体现了以下文献中所述的几个比对策略：Dayhoff，M.O. 1978)蛋白质的进化改变模型-检测远缘关系的矩阵，见Dayhoff，M.O.(编)《蛋白质序列和结构图集》(Atlas of ProteinSequence and Structure)，国立生物化学研究基金会，Washington DC，第5卷，增刊3，第345-358页；Hein J.(1990)比对和系统发生的统一方法，第626-645页，《酶学方法》(Methods in Enzymology)第183卷，Academic Press公司，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《数值分类学-数值分类学的原理和实践》(Numerical Taxonomy-the Principles and Practiceof Numerical Taxonomy)，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)80：726-730。
或者，为了序列比较，可以利用以下方法进行序列的最佳比对：Smith和Waterman的局部一致性算法((1982)Add.APL.Math 2：482)；Needleman和Wunsch的一致性比对算法((1970)J.Mol.Biol.48：443)；Pearson和Lipman的相似性查询方法((1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444)；这些算法的计算机执行程序(Wisconsin遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA，GeneticsComputer Group(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)；或目测。
适合于确定序列一致性和序列相似性百分数的算法的一个优选例子是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述在Altschul等(1977)Nucl.Acid.Res.25：3389-3402和Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403-410。采用例如本文所述参数，BLAST和BLAST 2.0可以用于确定本发明的多核苷酸和多肽的序列一致性百分数。执行BLAST分析的软件可以通过国立生物技术信息中心为公众所获得。对于氨基酸序列，可以采用评分矩阵计算累积分。当：该比对累积分从其最大获得值降低了量X；由于积累一或多个负分残基比对，该累积分达到零或更低；或任一序列达到末端时，终止每个方向上字符采样数(word hits)的延伸。BLAST算法的参数W、T和X确定了比对的敏感度和速度。
优选地，“序列一致性百分数”通过在至少有20个位置的比较窗中比较两个最佳比对的序列来确定，其中为了获得两个序列的最佳比对，与参考序列(不含有插入或缺失)相比，比较窗中的该多核苷酸或多肽序列部分可以含有20％或更少，通常5-15％，或10-12％的插入或缺失(即间隔区)。该百分数的计算方法是：确定这两个序列中出现一致氨基酸残基的位置的数目以获得匹配位置数，用该匹配位置数除以参考序列的总位置数(即窗的大小)，然后将所获结果乘以100以产生该序列一致性百分数。
在其它说明性实施方案中，多肽可以是融合多肽，其含有如此处所述的多种多肽，或者含有至少一种此处所述的多肽和一种无关序列，如已知的肿瘤蛋白。例如，融合配偶体可以帮助提供T辅助细胞表位(免疫学融合配偶体)，优选地可被人体识别的T辅助细胞表位，或者可以有助于以高于原始重组蛋白的产量表达该蛋白质(表达增强子)。某些优选的融合配偶体既是免疫学的又是增强表达的融合配偶体。可以选择其它融合配偶体，以提高多肽的溶解度，或使蛋白质能导向希望的胞内区室。再有其它融合配偶体包括有利于多肽纯化的亲和标签。
融合多肽一般可以利用包括化学偶联在内的标准技术制备。优选地，融合多肽表达为一种重组多肽，使得在表达系统中的生产水平高于非融合多肽。简言之，编码多肽成分的DNA序列可以分开装配，并连接到合适的表达载体中。编码一种多肽成分的DNA序列的3’端在有或没有肽接头的情况下与编码第二多肽成分的DNA序列的5’端连接，使序列的阅读框同步。这导致翻译为保留了两种成分多肽的生物活性的一种融合多肽。
可以采用肽接头序列将该第一和第二多肽成分分开一段足够长的距离，以保证每一个多肽都折叠成其二级和三级结构。该多肽接头序列可以采用本领域熟知的标准技术并入融合蛋白中。适合的肽接头序列可以基于以下因素进行选择：(1)其能够采取柔性伸展构象；(2)不能采取能与该第一和第二多肽上的功能性表位相互作用的二级结构；和(3)缺乏可以和该多肽的功能性表位反应的疏水或带电荷残基。优选的肽接头序列含有Gly、Asn和Ser残基。其它近中性氨基酸，例如Thr和Ala也可以用于该接头序列中。可以用作接头的有用氨基酸序列包括那些公开于如下文献中的序列：Maratea等，基因(Gene)40：39-46，1985；Murphy等，美国国家科学院院刊83：8258-8262，1986；美国专利4,935,233和美国专利4,751,180。接头序列一般可以长1-约50个氨基酸。当该第一和第二多肽具有能够用以分开这些功能域并防止空间干扰的非必需N端氨基酸区域时，则无需接头序列。
将这些相连的DNA序列可操作地与适当的转录或翻译调节元件连接在一起。负责DNA表达的调节元件仅置于编码该第一多肽的DNA序列的5’端。同样，终止翻译所必需的终止密码子和转录终止信号仅存在于编码该第二多肽的DNA序列的3’端。
融合多肽能含有如此处所述的多肽和无关免疫原性蛋白质，如一种能引发回忆反应的免疫原性蛋白质。这类蛋白质的例子包括破伤风、结核和肝炎蛋白(参见，例如，Stoute等人，New Engl.J.Med.336：86-91，1997)。
在一个优选实施方案中，免疫融合配偶体来源于分枝杆菌属的种，如来自结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的Ra12片段。美国专利申请60/158,585描述了Ra12组合物和方法提高异源多核苷酸/多肽序列的表达和/或免疫原性的用途，其公开内容在此完整引用作为参考。简言之，Ra12是指一个多核苷酸区，它是结核分枝杆菌MTB32A核酸的亚序列。MTB32A是一种分子量为32KD的丝氨酸蛋白酶，由结核分枝杆菌的毒力株和无毒力株的基因编码。MTB32A的核苷酸序列和氨基酸序列已经描述(例如，美国专利申请60/158,585；参见Skeiky等人，Infection and Immun.(1999)67：3998-4007，在此引用作为参考)。MTB32A编码序列的C端片段高水平表达，在纯化过程中保持为可溶性多肽。而且，Ra12可以提高与之融合的异源免疫原性多肽的免疫原性。一种优选的Ra12融合多肽含有对应于MTB32A的氨基酸残基192-323的14KD的C端片段。其它优选的Ra12多核苷酸一般含有编码Ra12多肽之一部分的至少约15个连续核苷酸，至少约30个核苷酸，至少约60个核苷酸，至少约100个核苷酸，至少约200个核苷酸，或至少约300个核苷酸。Ra12多核苷酸可以含有一种原始序列(即，编码Ra12多肽或其部分的内源序列)，或者可以含有该序列的变体。Ra12多核苷酸变体可以含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，使得编码的融合多肽的生物活性基本上不低于含有原始Ra12多肽的融合多肽。这些变体优选地显示与编码原始Ra12多肽或其部分的多核苷酸序列有至少约70％的一致性，更优选地至少约80％的一致性，最优选地至少约90％的一致性。
在其它优选实施方案中，免疫融合配偶体来源于蛋白D——革兰氏阴性菌B型流感嗜血菌(Haemophilus influenza B)的一种表面蛋白(WO 91/18926)。优选地，一种蛋白D衍生物含有该蛋白质的大约前三分之一(例如，N端前100-110个氨基酸)，蛋白D衍生物可以脂化。在某些优选实施方案中，在N端含有脂蛋白D融合配偶体的前109个残基，以产生含有附加外源T细胞表位的多肽，并提高在大肠杆菌中的表达水平(从而作为表达增强子)。脂质尾确保抗原向抗原递呈细胞最佳递呈。其它融合配偶体包括来源于流感病毒的非结构蛋白NS1(血凝素)。一般使用N端81个氨基酸，但也可使用含有T辅助表位的不同片段。
在另一个实施方案中，免疫融合配偶体是被称作LYTA的蛋白质或其部分(优选地C端部分)。LYTA来源于肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)，该菌合成一种N-乙酰-L-丙氨酸酰胺酶，被称作酰胺酶LYTA(由LytA基因编码；Gene 43：265-292，1986)。LYTA是一种自溶素，可特异性降解肽聚糖主链中的某些键。LYTA蛋白的C端域负责与胆碱或某些胆碱类似物(如DEAE)的亲和力。这种性质已用于发展用于融合蛋白表达的大肠杆菌C-LYTA表达质粒。在氨基端含C-LYTA片段的杂种蛋白的纯化已有描述(参见，Biotechnology10：795-798，1992)。在一个优选实施方案中，LYTA的重复部分可以掺入融合蛋白中。在C端区中发现一个开始于残基178的重复部分。一个特别优选的重复部分含有残基188-305。
另一个说明性实施方案涉及融合多肽，和编码它们的多核苷酸，其中融合配偶体含有能将多肽导向内体/溶酶体区室的导向信号，如美国专利号5,633,234所述。本发明的免疫原性多肽当与这种导向信号融合时，将更有效地与MHC II类分子结合，从而使该多肽特异的CD4+T细胞的体内刺激增强。
本发明的多肽利用本领域周知的多种合成和/或重组技术制备，后者在下面有进一步的描述。一般少于约150个氨基酸的多肽、部分和其它变体能利用本领域技术人员周知的技术通过合成法产生。在一个说明性实施例中，利用可商业获得的固相技术，如Merrifield固相合成法合成这些多肽，其中向延长的氨基酸链中连续添加氨基酸。参见Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85：2149-2146，1963。多肽自动合成装置可购自供应商，如Perkin Elmer/Applied BioSystemsDivision(Foster City，CA)，可以按照使用说明书操作。
本发明的多肽组合物(包括融合多肽)通常是分离的。“分离的”多肽是从其原始环境中分离出的多肽。例如，如果将一种自然存在的蛋白质与自然系统中的一些或全部共存物质分开，则该蛋白质是分离的。优选地，这些多肽也是纯化的，例如，纯度至少约90％，更优选地至少约95％，最优选地至少约99％。多核苷酸组合物
在其它方面，本发明提供多核苷酸组合物。术语“DNA”和“多核苷酸”在此基本上可交换使用，是指已经分离不含特定物种的总基因组DNA的DNA分子。“分离的”在此使用时是指多核苷酸基本上不含其它编码序列，而且DNA分子不含无关编码DNA的较大部分(如大染色体片段或其它功能基因或多肽编码区)。当然，这是指最初分离的DNA分子，不排除后来人工加到该片段中的基因或编码区。
本领域技术人员应当理解，本发明的多核苷酸组合物能包含基因组序列、基因组外和质粒编码的序列，和较小的工程基因片段，它们表达或者可能适合于表达蛋白质、多肽、肽等。这些片段可以是自然分离的，或是人工合成修饰的。
熟练技术人员也应当认识到，本发明的多核苷酸可以是单链(编码链或反义链)或双链的，可以是DNA(基因组DNA、cDNA或合成DNA)或RNA分子。RNA分子可包括含有内含子并一一对应于DNA分子的HnRNA分子，和不含内含子的mRNA分子。本发明的多核苷酸中可以但不必须存在其它编码或非编码序列，多核苷酸可以但不必须与其它分子和/或支持材料连接。
多核苷酸可以含有原始序列(即，编码本发明的多肽/蛋白质或其部分的内源序列)，或可以含有编码该序列的变体或衍生物(优选地是一种免疫原性变体或衍生物)的序列。
因此，根据本发明的另一方面，提供含有部分或全部的下列多核苷酸序列的多核苷酸组合物：SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330之任一个所示的多核苷酸序列，SEQ ID N0：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330之任一个所示多核苷酸序列的互补序列，SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330之任一个所示多核苷酸序列的简并变体。在某些优选实施方案中，此处所述的多核苷酸序列编码如上所述的免疫原性多肽。
在其它有关实施方案中，本发明提供与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330公开的序列基本相同的多核苷酸变体，例如，通过用此处所述的方法(例如使用标准参数的BLAST分析，如下所述)与本发明的多核苷酸序列比较，具有至少70％的序列一致性，优选地至少75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更高的序列一致性的那些。本领域技术人员将认识到，可以适当地调节这些值，以便在考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等之后，确定两种核苷酸序列编码的蛋白质的相应一致性。
多核苷酸变体一般含有一个或多个置换、添加、缺失和/或插入，优选地使变体多核苷酸编码的多肽的免疫原性基本上不低于此处所述的多核苷酸序列编码的多肽。术语“变体”应当也包括异种来源的同源基因。
在其它实施方案中，本发明提供含有与此处公开的一种或多种序列相同或互补的序列不同长度的连续序列段的多核苷酸片段。例如，本发明提供这样的多核苷酸：它们含有此处公开的一种或多种序列的至少约10、15、20、30、40、50、75、100、150、200、300、400、500或1000个或更多连续核苷酸，以及所有中间长度。应当理解，“中间长度”在本文中是指介于所述值之间的任何长度，如16、17、18、19等；21、22、23等；30、31、32等；50、51、52、53等；100、101、102、103等；150、151、152、153等；包括200-500、500-1000等等之间的所有整数。
在本发明的另一个实施方案中，提供在中度到高度严紧条件下能与此处所述多核苷酸序列或其片段或其互补序列杂交的多核苷酸组合物。杂交技术在分子生物学领域众所周知。为了举例说明，用于检测本发明的多核苷酸与其它多核苷酸杂交的合适的中等严紧条件包括：用5×SSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH8.0)溶液预洗；在50-65℃下在5×SSC中杂交过夜；随后用含0.1％SDS的2×、0.5×和0.2×SSC在65℃下各洗涤两次20分钟。本领域技术人员应当理解，能容易地操作杂交严紧性，如改变杂交溶液的含盐量和/或杂交温度。例如，在另一个实施方案中，合适的高度严紧杂交条件包括上述条件，不同之处在于杂交温度升高到例如60-65℃或65-70℃。
在某些优选实施方案中，上述多核苷酸，如多核苷酸变体、片段和杂交序列，编码与此处具体描述的多肽序列有免疫学交叉反应性的多肽。在其它优选实施方案中，这些多核苷酸编码免疫原性水平为此处具体所述多肽序列的至少约50％、优选地至少约70％、更优选地至少约90％的多肽。
本发明的多核苷酸或其片段，无论编码序列本身的长度如何，都可以与其它DNA序列(如启动子、聚腺苷酸化信号、其它限制酶位点、多克隆位点、其它编码片段等)结合，使其总长度可能大大改变。因此预期可以使用几乎任何长度的核酸片段，总长度优选地受限于制备的容易程度和在预期重组DNA方案中的应用。例如，总长度为约10000、约5000、约3000、约2000、约1000、约500、约200、约100、约50个碱基对的说明性多核苷酸片段预计可用于本发明许多实施方案中。
当比较多核苷酸序列时，如果在如下所述比对最大对应性时两种序列的核苷酸序列相同，则称这两种序列“一致”。两种序列的比较一般通过在比较窗口中比较序列进行，鉴定和比较局部区域的序列相似性。在此使用时，“比较窗口”是指至少约20个，通常30至约75个，优选地40至约50个连续位点的片段，其中可以在最佳比对两种序列后将一种序列与连续位点数量相同的参照序列相比较。
序列的最佳比对可以利用Lasergene生物信息学软件包(DNASTAR，Inc.，Madison，WI)中的Megalign程序进行，使用缺省参数。该程序包括下列参考文献中所述的几种比对方案：Dayhoff，MO(1978)“蛋白质的进化改变模型-用于检测运缘关系的矩阵”，在Dayhoff，M.O.编写的《蛋白质序列与结构图谱》中，国家生物医学研究基金会，华盛顿特区，第5卷，增3，345-358；Hein J.(1990)“比对与系统发生的统一方法”，626-645，《酶学方法》，183卷，学院出版社，San Diego，CA；Higgins，D.G.和Sharp，P.M.(1989)CABIOS 5：151-153；Myers，E.W.和Muller W.(1988)CABIOS 4：11-17；Robinson，E.D.(1971)Comb.Theor.11：105；Santou，N.Nes，M.(1987)Mol.Biol.Evol.4：406-425；Sneath，P.H.A.和Sokal，R.R.(1973)《数学分类学——数学分类学原理与实践》，Freeman Press，San Francisco，CA；Wilbur，W.J.和Lipman，D.J.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 80：726-730。
或者，序列的最佳对比也可以如下进行：利用Smith和Waterman(1981)Add.APL.Math 2：482的局部一致性算法、利用Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的一致性比对算法、利用Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：2444的相似性检索法、通过这些算法的计算机实现方法(GAP，BESTFIT，BLAST，FASTA和TFASTA，Wisconsin遗传学软件包，遗传学计算机组(GCG)，575 Science Dr.，Madison，WI)，或通过观察。
适于确定百分序列一致性和序列相似性的算法的一个优选实例是BLAST和BLAST 2.0算法，分别在Altschul等人(1977)Nucl.AcidsRes.25：3389-3402和Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410描述。例如能以此处所述的参数使用BLAST和BLAST 2.0，确定本发明的多核苷酸的百分序列一致性。进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心公开获得。在一个说明性实施例中，对于核苷酸序列，能用参数M(一对匹配残基的奖分＞0)和N(错配残基的罚分；总是＜0)计算累积得分。在下列情况时每个方向的字段延伸停止：累积比对得分从获得的最大值降低数值X时；由于一个或多个负分残基比对的积累，累积得分为0或更低时；或到达每个序列的末端时。BLAST算法参数W、T和X决定该算法的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用11的字长(W)、10的预期(E)，BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对，(B)为50，预期(E)为10，M＝5，N＝-4，比较两条链。
优选地，通过在至少20个位点的比较窗口上比较两种最佳比对的序列测定“序列一致性百分数”，其中与用于最佳比对两种序列的参照序列(不含添加或缺失)相比，比较窗口中多核苷酸序列的部分可含有20％或更低、通常5％-15％或10％-12％的添加或缺失(即缺口)。此百分数的计算方法是：测定在两种序列中存在相同核酸碱基的位点数，得到匹配的位点数，匹配位点数除以参照序列中的位点总数(即窗口大小)，结果乘以100，得到序列一致性百分数。
本领域技术人员应当理解，由于遗传密码的简并性，存在许多编码此处所述的多肽的核苷酸序列。其中一些与任一天然基因的核苷酸序列有最小同源性。但是，本发明特别涉及由于密码子使用的差异而不同的多核苷酸。另外，含有此处所述多核苷酸序列的等位基因也在本发明的范围之内。等位基因是由于核苷酸的一个或多个突变(如核苷酸的缺失、添加或置换)而改变的内源基因。得到的mRNA和蛋白质可能，但不必须具有改变的结构或功能。等位基因可用标准技术(如杂交、扩增和/或数据库序列比较)鉴定。
因此，在本发明的另一个实施方案中，利用诱变法(如定点诱变)制备此处所述多肽的免疫原性变体和/或衍生物。使用该方法，能通过诱变编码多肽的多核苷酸进行多肽序列的特异修饰。这些技术提供制备和检测序列变体的直接方法，例如，通过向多核苷酸中引入一个或多个核苷酸序列改变，掺入前述一个或多个考虑。
定点诱变可产生突变体，这是通过使用编码希望突变的DNA序列的特异性寡核苷酸序列，以及足够量的相邻核苷酸，提供足够大小的序列和序列复杂性的引物，在横越的缺失连接处两侧形成稳定的双链。可以在选择的多核苷酸序列中应用突变，以提高、改变、降低、修饰或以其它方式改变多核苷酸本身的性质，和/或改变编码的多肽的性质、活性、组成、稳定性或一级序列。
在本发明的某些实施方案中，发明人想利用诱变公开的多核苷酸序列改变编码的多肽的一种或多种性质，如多肽疫苗的免疫原性。定点诱变技术在本领域中众所周知，广泛用于产生多肽和多核苷酸的变体。例如，定点诱变通常用于改变DNA分子的特定部分。在这些实施方案中，使用一般含有大约14-25个核苷酸的引物，待改变序列连接处两侧有约5-10个残基。
本领域技术人员应当理解，定点诱变技术通常使用存在单链和双链形式的噬菌体载体。在定点诱变中有用的典型载体包括载体，如M13噬菌体。这些噬菌体易于购得，它们的使用为本领域技术人员所周知。在定点诱变中也常使用双链质粒，这省去了从质粒向噬菌体转移目的基因的步骤。
此处所述的定点诱变通常如下进行：首先获得单链载体，或者解开双链载体的两条链，在载体的序列中包含编码希望的多肽的DNA序列。制备(通常合成)含有希望的突变序列的寡核苷酸引物。该引物然后与单链载体退火，DNA聚合酶(如大肠杆菌聚合酶I Klenow片段)反应，以完成含突变链的合成。于是形成异源双链，其中一条链编码原始的未突变序列，第二条链含有希望的突变。然后用该异源双链载体转化合适的细胞，如大肠杆菌细胞，选择包含具有突变序列排列的重组载体的克隆。
利用定点诱变制备选择的肽编码DNA片段的序列变体提供了一种产生可能有用的种类的方法，并非意在限制，因为存在获得肽的序列变体和编码它们的DNA序列的其它方法。例如，可以用诱变剂(如羟胺)处理编码希望的肽序列的重组载体，获得序列变体。关于这些方法和方案的具体细节见Maloy等人，1994；Segal，1976；Prokop和Bajpai，1991；Kuby，1994；Maniatis等人，1982所述，在此均引用作为参考。
在此使用时，术语“寡核苷酸指导的诱变法”是指模板依赖的方法和载体介导的增殖，它导致特异核酸分子的浓度比最初的浓度提高，或者可检测信号的浓度提高(如扩增)。在此使用时，术语“寡核苷酸指导的诱变法”是指包括引物分子依赖模板延长的方法。术语依赖模板的方法是指RNA或DNA分子的核酸合成，其中新合成的核酸链的序列按照众所周知的互补碱基配对原则规定(参见，例如，Watson，1987)。载体介导的方法一般包括向DNA或RNA载体中导入核酸片段，载体的克隆扩增，扩增的核酸片段的回收。美国专利号4,237,224中给出了这些方法的实例，在此完整引用作为参考。
在制备本发明的多肽变体的另一种方法中，如美国专利号5,837,458所述，可以使用循环序列重组(recursive sequencerecombination)。在该方法中，进行重组和筛选或选择的重复循环，以“进化”本发明的多核苷酸变体，它们具有例如提高的免疫原性。
在本发明的其它实施方案中，此处所述的多核苷酸序列能方便地用作核酸杂交的探针或引物。因而，含有至少约15个连续核苷酸的序列区(与此处公开的15个核苷酸长的连续序列有相同序列或与之互补)的核酸片段预计将特别有用。更长的相同或互补的连续序列，例如约20、30、40、50、100、200、500、1000(包括所有中间长度)、甚至可达全长的序列，在某些实施方案中也是有用的。
这些核酸探针与目的序列特异性杂交的能力将使它们能用于检测特定样品中互补序列的存在。然而，也可设想有其它用途，如序列信息的应用，用于制备突变种引物，或用于制备其它遗传构建体的引物。
具有由与此处公开的多核苷酸序列相同或互补的大约10-14、15-20、30、50乃至100-200个核苷酸的连续核苷酸段(也包括中间长度)组成的序列区的多核苷酸分子特别可用作杂交探针，例如用于Southern和Northern印迹。这将能分析基因产物或其片段，无论是在各种细胞类型中还是在各种细菌细胞中。片段的总大小以及互补延伸片段的大小最终取决于特定核酸片段的预期用途或应用。较小的片段一般用于杂交实施方案，其中连续互补区的长度可能不同，如约15-100个核苷酸，但是也可以根据希望检测的互补序列的长度，使用较大的连续互补延伸区段。
利用长度约为15-25个核苷酸的杂交探针能形成即稳定又具选择性的双链分子。但通常优选在长度超过15个碱基的延伸片段上含有连续互补序列的分子，以提高杂合体的稳定性和选择性，从而提高获得的特异杂种分子的质量和程度。通常优选设计含有15-25个连续核苷酸乃至更长(希望时)的基因互补延伸区段的核酸分子。
杂交探针可以选自此处公开的任一序列的任一部分。所需要的只是检查希望用作探针或引物的此处所述的序列，或者这些序列的连续部分，长度从约15-25个核苷酸到包括全长序列。探针和引物序列的选择可取决于多种因素。例如，可能希望使用朝向总序列末端的引物。
例如可以通过化学法直接合成片段，容易地制备小的多核苷酸片段，通常应用自动寡核苷酸合成仪。也可通过应用核酸增殖技术，如美国专利4,683,202(在此引用作为参考)的PCRTM技术，通过向用于重组生产的重组载体中导入选择的序列，及通过分子生物学领域技术人员公知的其它重组DNA技术，获得这些片段。
可以根据与完整基因或目的基因片段的互补片段选择性形成双链分子的能力，使用本发明的核苷酸序列。根据目的用途，通常希望采用变化的杂交条件以实现探针对靶序列的不同程度的选择性。对于需要高选择性的应用，一般希望使用相对严紧的条件形成杂合体，例如，选择相对低盐和/或高温的条件，如约0.02M-约0.15M的盐浓度和约50℃-约70℃的温度。这种选择性条件允许极少的(如果有的话)探针与模板或靶链之间的错配，特别适用于分离有关序列。
当然，对于某些用途，例如，在希望利用可与模板杂交的突变引物链制备突变体时，一般需要较低的严紧(严紧性降低)杂交条件形成异源双链。在这些情况中，可能希望使用例如约0.15M-约0.9M的盐浓度和约20℃-约55℃的温度。从而能把交叉杂交种容易地确定为相对于对照杂交的阳性杂交信号。在任何情况下，一般认为，通过添加含量提高的甲酰胺——用来以与温度升高相同的方式使杂合双链去稳定，能使条件更加严紧。因此，杂交条件能容易地操作，一般是根据希望的结果选择的方法。
根据本发明的另一个实施方案，提供含有反义寡核苷酸的多核苷酸组合物。反义寡核苷酸已经证明是蛋白质合成的有效和针对性的抑制剂，因此提供了一种治疗方法，可通过抑制引起疾病的蛋白质的合成治疗疾病。反义寡核苷酸抑制蛋白质合成的效能十分明确。例如，针对各自mRNA序列的反义寡核苷酸抑制多聚半乳糖醛酸酶和蕈毒碱2型乙酰胆碱受体的合成(美国专利5,739,119和美国专利5,759,829)。此外，利用核蛋白细胞周期蛋白、多药抗药基因(MDGI)、ICAM-1、E-选择素、STK-1、纹状GABAA受体和人EGF(Jaskulski等人，Science1988 Jun 10；240(4858)：1544-6；Vasanthakumar和Ahmed，CancerCommun.1989；1(4)：225-32；Peris等人，Brain Res Mol Brain Res.1998 Jun 15；57(2)：310-20；美国专利5,801,154；美国专利5,789,573；美国专利5,718,709和美国专利5,610,288)已经展示了反义抑制的实例。已经描述了抑制并能用来治疗多种异常细胞增殖(例如癌症)的反义构建体(美国专利5,747,470；美国专利5,591,317和美国专利5,783,683)。
因此，在某些实施方案中，本发明提供这样的寡核苷酸序列：它们含有能与此处所述多核苷酸序列或其互补序列特异性结合的任一序列的全部或一部分。在一个实施方案中，反义寡核苷酸含有DNA或其衍生物。在另一个实施方案中，寡核苷酸含有RNA或其衍生物。在第三个实施方案中，寡核苷酸是修饰的DNA，含有硫代磷酸酯化的修饰主链。在第四个实施方案中，寡核苷酸序列含有肽核酸或其衍生物。在每种情况中，优选的组合物均含有这样的序列区，该区与此处公开的多核苷酸的一个或多个部分互补，更优选地基本上互补，再更优选地完全互补。特定基因序列特异的反义组合物的选择基于对所选靶序列的分析和二级结构、Tm、结合能量和相对稳定性的确定。可以根据不能形成二聚体、发夹或其它二级结构(它们将降低或阻止与宿主细胞中靶mRNA的特异结合)的相对能力选择反义组合物。特别优选的mRNA靶区是位于或接近AUG翻译起始密码子的序列，和与mRNA的5’区基本上互补的序列。这些二级结构的分析和靶位点的选择能利用OLIGO引物分析软件v.4和/或BLASTN 2.0.5算法软件(Altschul等人，Nucleic Acids Res.1997，25(17)：3389-402)进行。
也涉及利用短肽载体(称为MPG(27个残基))的反义输送方法的用途。MPG肽含有一个来自HIV gp41的融合序列的疏水域，和一个来自SV40 T-抗原的核定位序列的亲水域(Morris等人，Nucleic AcidsRes.1997 Jul 15；25(14)：2730-6)。已经证明MPG肽的几种分子包被反义寡核苷酸，并且能在不到1小时的时间内相对高效(90％)地输送到培养的哺乳动物细胞中。此外，与MPG的相互作用强烈提高寡核苷酸对抗核酶的稳定性和穿过质膜的能力。
根据本发明的另一个实施方案，此处所述的多核苷酸组合物用于设计和制备核酶分子，用来抑制本发明的肿瘤多肽和蛋白质在肿瘤细胞中的表达。核酶是可以位点特异的方式切割核酸的RNA-蛋白质复合物。核酶含有具有内切核酸酶活性的特异催化域(Kim和Cech，ProcNatl Acad Sci USA 1987 Dec；84(24)：8788-92；Forster和Symons，Cell.1987 Apr 24；49(2)：211-20)。例如，许多核酶可高度特异性地加速磷酯转移反应，通常只切割寡核苷酸底物中几种磷酯之一(Cech等人，Cell.1981 Dec；27(3 pt 2)：487-96；Michel和Westof，J Mol Biol.1990 Dec 5；216(3)：585-610；Reinhold-Hurek和Shub，Nature.1992 May 14；357(6374)：173-6)。这种特异性归因于在化学反应之前底物需要通过特异碱基配对作用与核酶的内部引导序列(“IGS”)结合。
目前已知自然存在的酶性RNA有6种基本变体。每种都能在生理条件下催化RNA磷酸二酯键的反式水解(因而能切割其它RNA分子)。酶核酸通常通过首先与靶RNA结合起作用。这种结合通过酶核酸的靶结合部分发生，该部分紧邻该分子用来切割靶RNA的酶部分。因此，酶核酸首先识别然后通过互补碱基配对结合靶RNA，一旦与正确位点结合，即酶促切割靶RNA。这种靶RNA的切割将破坏它指导编码的蛋白质合成的能力。在酶性核酸结合并切割RNA靶后，它从该RNA上释放，寻找另一个靶标，能重复结合和切割新的靶标。
核酶的酶性质优于许多技术，如反义技术(其中核酸分子简单地结合核酸靶，阻断其翻译)，因为实现治疗所需的核酶浓度低于反义寡核苷酸。这一优点反映了核酶酶促作用的能力。因此，一个核酶分子能够切割多个靶RNA分子。另外，核酶是高特异性的抑制剂，抑制特异性不仅取决于与靶RNA结合的碱基配对机制，而且取决于靶RNA的切割机制。接近切割位点的一个错配或碱基置换能完全消除核酶的催化活性。反义分子中类似的错配不阻止它们的作用(Woolf等人，Proc Natl Acad Sci USA.1992 Aug 15；89(16)：7305-9)。因此，核酶作用的特异性高于可结合同一RNA位点的反义寡核苷酸的特异性。
酶核酸分子可以形成锤头、发夹、肝炎δ病毒、I组内含子或RNasePRNA(与RNA引导序列结合)或脉孢菌VS RNA基序。Rossi等人，NucleicAcids Res.1992 Sep 11；20(17)：4559-65叙述了锤头基序的例子。Hampel等人(欧洲专利申请公开号EP 0360257)；Hampel和Tritz，Biochemistry 1989 Jun 13；28(12)：4929-33；Hampel等人，NucleicAcids Res.1990 Jan 25；18(2)：299-304和美国专利5,631,359叙述了发夹基序的例子。Perrotta和Been，Biochemistry.1992 Dec1；31(47)：11483-52叙述了肝炎δ病毒基序的一个例子；Guerrier-Takada等人，Cell.1983 Dec；35(3 Pt 2)：849-57叙述了RNaseP基序的一个例子；Collins(Saville和Collins，Cell.1990May 18；61(4)：685-96；Saville和Collins，Proc Natl Acad Sci USA.1991 Oct 1；88(19)：8826-30；Collins和Olive，Biochemistry 1993Mar 23；32(11)：2795-9)叙述了脉孢菌VS RNA核酶基序；美国专利4,987,071叙述了I组内含子的一个例子。本发明的酶核酸分子中重要的是它具有与一个或多个靶基因RNA区互补的特异性底物结合位点，且它在底物结合位点内或周围具有赋予该分子RNA切割活性的核苷酸序列。因而核酶结构不必限于此处所述的具体基序。
可以如国际专利申请公开号WO 93/23569和国际专利申请公开号WO 94/02595(均在此引用作为参考)所述设计核酶，并如述合成，在体外和体内检测。也能为输送优化这些核酶。虽然提供了具体实例，但本领域技术人员应当认识到，必要时能使用其它种的相当的RNA靶。
核酶活性能如下优化：改变核酶结合臂的长度，或化学合成具有防止其被血清核糖核酸酶降解的修饰的核酶(参见，例如，国际专利申请公开号WO 92/07065；国际专利申请公开号WO 93/15187；国际专利申请公开号WO 91/03162；欧洲专利申请公开号92110298.4；美国专利5,334,711；国际专利申请公开号WO 94/13688，它们描述了对酶RNA分子的糖部分进行的多种化学修饰)，提高其在细胞中效能的修饰，和除去茎II碱基以缩短RNA合成时间并减少化学要求。
Sullivan等人(国际专利申请公开号WO 94/02595)描述了输送酶性RNA分子的普通方法。可以利用本领域技术人员熟知的多种方法向细胞施用核酶，包括但不限于：包封于脂质体中，离子电渗，或掺入其它载体中，如水凝胶、环糊精、可生物降解纳米胶囊和生物附着性小球体。有时，可以在有或没有上述载体的情况下直接向细胞或组织离体输送核酶。此外，也可以通过直接吸入、直接注射或使用导管、输液泵或支架(stent)局部输送RNA/载体组合。其它输送途径包括但不限于：血管内、肌肉内、皮下或关节注射、气雾吸入、经口(片剂或丸剂形式)、局部、全身、眼部、腹膜内和/或鞘内输送。关于核酶输送和施用的更详细描述见国际专利申请公开号WO 94/02595和国际专利申请公开号WO 93/23569，在此均引用作为参考。
在细胞内积累高浓度核酶的另一种方法是将核酶编码序列掺入DNA表达载体中。核酶序列的转录由真核RNA聚合酶I(Pol I)、RNA聚合酶II(Pol II)或RNA聚合酶III(Pol III)的启动子驱动。由Pol II和Pol III启动子起始的转录物将在所有细胞中高水平表达；特定细胞类型中特定Pol II启动子的水平取决于附近存在的基因调节序列的性质(增强子、沉默子等)。也可以使用原核RNA聚合酶启动子，只要原核RNA聚合酶在合适的细胞中表达。由这些启动子表达的核酶已经显示在哺乳动物细胞中起作用。这些转录单位能掺入多种载体，用于导入哺乳动物细胞中，包括但不限于：质粒DNA载体、病毒DNA载体(如腺病毒或腺伴随载体)或病毒RNA载体(如逆转录病毒、塞姆利基森林病毒、辛德毕斯病毒载体)。
在本发明的另一个实施方案中，提供了肽核酸(PNA)组合物。PNA是一种DNA模拟物，其中核酸碱基附着于假肽(pseudopeptide)主链(Good和Nielsen，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.1997 7(4)431-37)。PNA能够在传统上使用RNA或DNA的许多方法中使用。PNA序列在这些方法中通常比相应的RNA或DNA序列表现更佳，并且具有RNA或DNA所没有的用途。Corey(Trends Biotechnol 1997 Jun；15(6)：224-9)描述了关于PNA的综述，包括制备方法、特征和使用方法。这样，在某些实施方案中，可以制备与ACE mRNA序列的一个或多个部分互补的PNA序列，这些PNA组合物可用来调节、改变、降低或减少ACE特异的mRNA的翻译，从而改变ACE在施用了这些PNA组合物的宿主细胞中的活性水平。
PNA用2-氨乙基-甘氨酸键代替DNA的正常的磷酸二酯主链(Nielsen等人，Science 1991 Dec 6；254(5037)：1497-500；Hanvey等人，Science.1992 Nov 27；258(5087)：1481-5；Hyrup和Nielsen，Bioorg Med Chem.1996 Jan；4(1)：5-23)。这种化学结构有3个重要的结果：第一，与DNA或硫代磷酸酯寡核苷酸不同，PNA是中性分子；第二，PNA是非手性的，不需要发展立体选择性合成；第三，PNA合成使用固相肽合成的标准Boc或Fmoc方案，尽管也可用其它方法，包括改良Merrifield法。
PNA单体或现成的寡聚体可购自PerSeptive Biosystems(Framingham，MA)。利用Boc或Fmoc方案的PNA合成直接使用手工或自动方法(Norton等人，Bioorg Med Chem.1995 Apr；3(4)：437-45)。手工方法可生产化学修饰的PNA或同时合成紧密相关的PNA家族。
如同肽合成一样，特定PNA合成的成功取决于所选序列的性质。例如，理论上PNA能掺入任意组合的核苷酸碱基，但相邻嘌呤的存在能使产物中缺失一个或多个残基。由于这种困难，建议在生产含有相邻嘌呤的PNA过程中，应当重复偶联有可能无效加入的残基。如果产物的产量和纯度类似于肽合成过程中所发现的，随后应当通过反相高压液相层析纯化PNA。
特定用途的PNA的修饰可以通过在固相合成中偶联氨基酸或将含有羧酸基团的化合物与暴露的N端胺结合而实现。或者，也能在修饰后通过与导入的赖氨酸或半胱氨酸偶联修饰PNA。PNA易于修饰将有利于为了更好的溶解度或特殊功能的需要优化。合成后，可通过质谱法证实PNA及其衍生物的身份。几种研究已经进行并利用PNA的修饰(例如，Norton等人，Bioorg Med Chem.1995 Apr；3(4)：437-45；Petersen等人，J Pept Sci.1995 May-Jun；1(3)：175-183；Orum等人，Biotechniques.1995 Sep；19(3)：472-80；Footer等人，Biochemistry.1996 Aug 20；35(33)：10673-9；Griffith等人，Nucleic Acids Res.1995 Aug 11；23(15)：3003-8；Pardridge等人，Proc Natl Acad SciUSA.1995 Jun 6；92(12)：5592-6；Boffa等人，Proc Natl Acad SciUSA.1995 Mar 14；92(6)：1901-5；Gambacorti-Passerini等人，Blood.1996 Aug 15；88(4)：1411-7；Armitage等人，Proc Natl Acad Sci USA.1997 Nov 11；94(23)：12320-5；Seeger等人，Biotechniques.1997Sep；23(3)：512-7)。美国专利号5,700,922讨论了PNA-DNA-PNA嵌合分子及其在诊断、调节生物中的蛋白质和治疗对此治疗剂易感的病症中的应用。
Rose(Anal Chem.1993 Dec 15；65(24)：3545-9)和Jensen等人(Biochemi stry.1997 Apr 22；36(16)：5072-7)讨论了表征PNA的反义结合性质的方法。Rose利用毛细管凝胶电泳检测了PNA与其互补寡核苷酸的结合，测量了相对结合动力学和化学计量学。Jensen等人利用BIAcoreTM技术进行了类似的测量。
已经描述并且本领域技术人员所知的PNA的其它用途包括：用于DNA链侵入、反义抑制、突变分析、转录增强子、核酸纯化、转录活性基因的分离、转录因子结合的阻断、基因组切割、生物传感器、原位杂交等。多核苷酸的鉴定、表征和表达
可以利用多种成熟的技术鉴定、制备和/或操作本发明的多核苷酸组合物(参见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室，冷泉港，NY，1989，及其它参考文献)。例如，如下详述，通过筛查cDNA微阵列的肿瘤相关表达(即，用此处所述典型测定法测定，在肿瘤中的表达比在正常组织中至少高2倍)，可鉴定多核苷酸。例如，这些筛查可以使用Affymetrix，Inc.的微阵列技术(SantaClara，CA)按照使用说明书进行(基本如Schena等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：10614-10619，1996和Heller等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94：2150-2155，1997所述)。或者，也可由用表达此处所述蛋白质的细胞(如肿瘤细胞)制备的cDNA扩增多核苷酸。
许多依赖模板的方法可用来扩增样品中存在的靶序列。最著名的扩增方法之一是聚合酶链反应(PCRTM)，在美国专利号4,683,195、4,683,202、4,800,159中有详细描述，均在此引用作为参考。简言之，在PCRTM中，制备两条与靶序列相对互补链上的区域互补的引物序列。向反应混合物中加入过量的脱氧核苷三磷酸以及DNA聚合酶(例如Taq聚合酶)。如果样品中存在靶序列，引物将与靶序列结合，聚合酶将通过加入核苷酸使引物沿靶序列延伸。提高和降低反应混合物的温度，延伸的引物就可从靶序列上分离下来，形成反应产物，过量的引物将与靶序列和反应产物结合，该过程重复进行。为了确定扩增的mRNA的量，优选地可以进行反转录和PCRTM扩增过程。聚合酶链反应方法在本领域众所周知。
其它许多依赖模板的方法在本领域已知并可使用，其中许多是PCRTM扩增技术的变型。例如，这些方法包括：连接酶链反应(称为LCR)，如欧洲专利申请公开号320,308和美国专利号4,883,750所述；Qβ复制酶，如PCT国际专利申请公开号PCT/US87/00880所述；链置换扩增(SDA)和修复链反应(RCR)。英国专利申请号2 202 328和PCT国际专利申请公开号PCT/US89/01025还描述了其它扩增方法。其它核酸扩增方法包括基于转录的扩增系统(TAS)(PCT国际专利申请公开号WO 88/10315)，包括基于核酸序列的扩增(NASBA)和3SR。欧洲专利申请公开号329,822描述了一种核酸扩增方法，它包括循环合成单链RNA(“ssRNA”)、ssDNA和双链DNA(dsDNA)。PCT国际专利申请公开号WO 89/06700描述了一种核酸序列扩增方法，它是基于启动子/引物序列与单链靶DNA(“ssRNA”)杂交，随后该序列的许多RNA拷贝转录。其它扩增方法如“RACE”(Frohman，1990)和“单向PCR”(Ohara，1989)也为本领域技术人员所周知。
本发明的多核苷酸的扩增部分可用来利用众所周知的技术从适当的文库(例如肿瘤cDNA文库)中分离全长基因。在这些技术中，用一种或多种多核苷酸探针或适于扩增的引物筛查文库(cDNA或基因组文库)。优选地，按大小选择文库，使之包含较大的分子。为了鉴定基因的5’和上游区，也优选随机引物文库。为了获得内含子和延伸的5’序列，优选基因组文库。
对于杂交技术，部分序列可以用众所周知的技术标记(例如通过切口平移或用32P末端标记)。通过用标记探针与含有变性菌落(或含有噬斑的菌苔)的滤纸杂交，筛查细菌或噬菌体文库(参见，Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室，冷泉港，NY，1989)。筛选并扩增杂交菌落或噬斑，分离DNA进一步分析。例如，可以使用来自部分序列的引物或来自载体的引物进行PCR，分析cDNA克隆，确定其它序列的量。可产生限制酶切图谱和部分序列，鉴定一种或多种重叠克隆。然后可利用标准技术确定完整序列，这可能包括产生一系列缺失克隆。然后将产生的重叠序列装配为一个连续序列。利用众所周知的技术，通过连接合适的片段，可产生全长cDNA分子。
或者，还能利用如上所述的扩增技术由部分cDNA序列获得全长编码序列。一种这样的扩增技术是反向PCR(参见，Triglia等人，Nucl.Acids Res.16：8186，1988)，它使用限制酶产生已知基因区中的一条片段。然后通过分子内连接环化该片段，在使用来源于已知区的趋异引物的PCR中用作模板。在一种备选方法中，通过利用连接序列的引物和对已知区域特异的引物扩增，可得到与部分序列相邻的序列。通常利用相同的接头引物和已知区域特异的第二条引物，对扩增的序列进行第二轮扩增。WO 96/38591描述了该方法的一种变型，它使用两条引物，起始从已知序列以相反方向延伸。另一种这样的技术被称为“快速cDNA末端扩增”或RACE。该技术包括利用可与polyA区或载体序列杂交的内部引物和外部引物鉴定位于已知序列5’和3’的序列。其它技术包括捕获PCR(Lagerstrom等人，PCR Methods Applic.1：111-19，1991)和步移PCR(Parker等人，Nucl.Acids Res.19：3055-60，1991)。也可利用其它扩增方法获得全长cDNA序列。
在某些情况中，通过分析已表达序列标签(EST)数据库(如从GenBank数据库获得的)中提供的序列能获得全长cDNA序列。对重叠EST的检索一般可用众所周知的程序(例如，NCBI BLAST检索)进行，可利用这些EST产生连续的全长序列。也可通过基因组片段分析获得全长DNA序列。
在本发明的其它实施方案中，可以在重组DNA分子中使用编码本发明的多肽或融合蛋白或其功能等同物的多核苷酸序列或其片段，指导该多肽在适当宿主细胞中表达。由于遗传密码固有的简并性，可能产生编码基本上相同或功能相当的氨基酸序列的其它DNA序列，这些序列可用来克隆和表达特定多肽。
本领域技术人员应当理解，在某些情况下产生含有非自然存在的密码子的多肽编码核苷酸序列是有利的。例如，能选择根据特定原核或真核宿主优选的密码子，来提高蛋白质表达的速度，或产生具有希望的特性(如半衰期长于由自然存在的序列产生的转录物)的重组RNA转录物。
而且，也能利用本领域周知的方法改造本发明的多核苷酸序列，以期为了多种原因改变多肽编码序列，包括但不限于：基因产物克隆、加工和/或表达的改变。例如，可以利用通过随机片段化和基因片段与合成寡核苷酸的PCR再装配进行的DNA改组改造核苷酸序列。另外，也可利用定点诱变插入新的限制位点，改变糖基化模式，改变密码子偏倚性，产生剪接变体或引入突变，等等。
在本发明的另一个实施方案中，天然、修饰或重组的核酸序列可以与异源序列连接，使之编码一种融合蛋白。例如，为了多肽活性的抑制剂筛查肽库，可有利地编码能被购得的抗体识别的嵌合蛋白。也可构建一种融合蛋白，使之在多肽编码序列与异源蛋白质序列之间含有一个酶切位点，以便将该多肽从异源部分上切下并纯化。
可以利用本领域众所周知的化学方法整个或部分地合成编码希望的多肽的序列(参见，Caruthers，M.H.等人，(1980)Nucl.AcidsRes.Symp.Ser.215-223，Horn，T.等人，(1980)Nucl.Acids Res.Symp.Ser.225-232)。或者，利用化学方法合成多肽的氨基酸序列或其一部分也可产生蛋白质本身。例如，肽合成能用多种固相技术进行(Roberge，J.Y.等人(1995)Science 269：202-204)，自动合成例如可用ABI 43A肽合成仪(Perkin Elmer，Palo Alto，CA)完成。
一种新合成的肽可以用制备型高效液相层析(例如Creighton，T.(1983)《蛋白质，结构和分子原理》WH Freeman与同事，纽约，N.Y.)或本领域使用的其它类似技术充分纯化。合成肽的组成可通过氨基酸分析或测序(例如Edman降解法)证实。此外，在直接合成过程中也可改变多肽的氨基酸序列或其任一部分，和/或利用化学方法与其它蛋白质的序列或其任一部分组合，产生一种变异多肽。
为了表达希望的多肽，编码多肽或功能相当物的核苷酸序列可以插入适当的表达载体中，即，含有插入的编码序列转录和翻译所需元件的载体。可以利用本领域技术人员周知的方法构建含有编码目的多肽的序列和适当转录和翻译控制元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。例如，Sambrook，J.等人，(1989)《分子克隆：实验室指南》，冷泉港实验室，Plainview，NY，和Ausubel，F.M.等人(1989)《现代分子生物学方法》，John Wiley &Sons，纽约，N.Y.描述了这些技术。
可利用大量表达载体/宿主系统含有和表达多核苷酸序列。这些包括但不限于：微生物，如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)转化的昆虫细胞；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)或细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。
表达载体中存在的“控制元件”或“调节序列”是载体的非翻译区——增强子、启动子、5’和3’非翻译区——它们与宿主细胞蛋白质相互作用，实现转录和翻译。这些元件的强度和特异性可能不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适当转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。例如，当克隆于细菌系统中时，可以使用诱导型启动子，如PBLUESCRIPT噬粒(Stratagene，La Jolla，Calif.)或PSPORT1质粒(Gibco BRI，Gaithersburg，MD)等的杂合lacZ启动子。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。如果必须产生含有多个拷贝的多肽编码序列的细胞系，可以方便地使用含有适当选择性标记、基于SV40或EBV的载体。
在细菌系统中，可以根据表达的多肽的目的用途选择许多表达载体。例如，当需要大量时，例如为了诱生抗体，可以使用指导易于纯化的融合蛋白高水平表达的载体。这些载体包括但不限于：多功能大肠杆菌克隆和表达载体，如BLUESCRIPT(Stratagene)，其中编码目的多肽的序列可以与氨基端Met的序列和随后的β-半乳糖苷酶的7个残基连接于载体中，产生杂种蛋白；pIN载体(van Heeke，G和S.M.Schuster(1989)J.Biol.Chem.264：5503-5509)；等等。也可以利用pGEX载体(Promega，Madison，Wis.)表达外源多肽，作为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。这些融合蛋白通常是可溶的，通过吸附于谷胱甘肽-琼脂糖珠，随后在谷胱甘肽存在下洗脱，易于从裂解的细胞中纯化。这些系统产生的蛋白质可设计为包含肝素、凝血酶或因子XA蛋白酶切割位点，以便能随意从GST部分释放克隆的目的多肽。
对于酵母，酿酒酵母，可以使用许多含有组成型或诱导型启动子(如α因子、醇氧化酶和PGH)的载体。综述见Ausubel等人(见上文)和Grant等人(1987)Methods Enzymol.153：516-544。
在使用植物表达载体时，编码多肽的序列的表达可以由大量启动子中的任一种驱动。例如，可以单独使用病毒启动子，如CaMV的35S和19S启动子，或与TMV的ω前导序列组合使用(Takamatsu，N.(1987)EMBO J.6：307-311)。或者，也可使用植物启动子，如RUBISCO的小亚基或热休克启动子(Coruzzi，G.等人(1984)EMBO J.3：1671-1680；Broglie，R.等人(1984)Science 224：838-843；Winter，J.等人(1991)Results Probl.Cell Differ.17：85-105)。这些构建体能通过直接DNA转化或病原体介导的转染导入植物细胞中。这些技术在大量综述中有描述(参见，例如，Hobbs，S.或Murry，L.E.《McGraw Hill科学技术年鉴》(1992)McGraw Hill，纽约，N.Y.；191-196页)。
也可以利用昆虫系统表达目的多肽。例如，在这样一种系统中，用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞或夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。编码该多肽的序列可以克隆到病毒的非必需区，如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子控制下。多肽编码序列的成功插入将使多角体蛋白基因失活，产生缺乏外壳蛋白的重组病毒。然后可用该重组病毒感染如草地夜蛾细胞或夜蛾幼虫，其中可以表达目的多肽(Engelhard，E.K.等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：3224-3227)。
在哺乳动物宿主细胞中，通常可以使用多种基于病毒的表达系统。例如，在使用腺病毒作为表达载体时，编码目的多肽的序列可以连接到由晚期启动子和三联前导序列组成的腺病毒/转录翻译复合物中。在非必需E1或E3区中插入病毒基因组可以用来获得能在感染的宿主细胞中表达该多肽的活病毒(Logan，J.和Shenk，T.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.81：3655-3659)。另外，也可利用转录增强子如劳斯肉瘤病毒(RSV)增强子增强在哺乳动物宿主细胞中的表达。
也可用特定起始信号实现编码目的多肽的序列的更有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入适当表达载体中时，可不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只插入编码序列或其部分时，应当使用外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应当在正确的阅读框内，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是不同来源的，是自然的和合成的。含有适于所用特定细胞系统的增强子，如文献中所述的增强子(Scharf，D.等人(1994)ResultsProbl.Cell Differ.20：125-162)，可提高表达效率。
另外，也可以根据调节插入序列表达或以希望的方式加工表达蛋白的能力，选择宿主细胞株。多肽的这类修饰包括但不限于：乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。也可以利用切割蛋白质的“前原”(prepro)形式的翻译后加工促进正确的插入、折叠和/或功能。可以选择不同的宿主细胞，如CHO、COS、HeLa、MDCK、HEK293和WI38，它们具有翻译后活性的特殊细胞机器和特有机制，来确保外源蛋白质的正确修饰和加工。
为了长期、高产量地生产重组蛋白，通常优选稳定的表达。例如，可以用在同一或不同载体上含有病毒来源的复制和/或内源表达元件和选择性标记基因的表达载体转化稳定表达目的多核苷酸的细胞系。在载体导入后，细胞在富集培养基中培养1-2天，然后转移到选择性培养基中。选择性标记的目的在于提供对选择的抗性，它的存在允许培养和回收成功表达导入序列的细胞。稳定转化的细胞的抗性克隆可以用适于该细胞类型的组织培养技术增殖。
许多筛选系统可用来回收转化的细胞系。包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler，M.等人(1977)Cell 11：223-32)和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy，I.等人(1990)Cell 22：817-23)基因，它们分别能在tk.sup-或aprt.sup.-细胞中使用。抗代谢物、抗生素或除草剂抗性能用作选择根据；例如，赋予氨甲喋呤抗性的dhfr(Wigler，M.等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.77：3567-70)；赋予氨基糖苷类、新霉素和G-418抗性的npt(Colbere-Garapin，F.等人(1981)J.Mol.Biol.150：1-4)；和分别赋予chlorsulfuron和膦丝菌素乙酰转移酶抗性的als或pat(Murry，同上文)。也描述了其它选择性基因，例如trpB，它使细胞利用吲哚代替色氨酸，或hisD，它使细胞利用组氨醇代替组氨酸(Hartman，S.C.和R.C.Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：8047-51)。应用可见标记已很常见，花色素苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS、萤光素酶及其底物萤光素等标记不仅广泛用于鉴定转化子，而且用于定量由特定载体系统引起的瞬时或稳定蛋白质表达的量(Rhodes，C.A.等人(1995)Methods Mol.Biol.55：121-131)。
尽管标记基因表达的存在/不存在提示也存在目的基因，但是它的存在和表达可能需要证实。例如，如果在标记基因序列中插入编码多肽的序列，能根据标记基因功能的缺乏鉴定含有这些序列的重组细胞。或者，标记基因也能与多肽编码序列串联置于一个启动子控制下。由诱导或选择引起的标记基因的表达通常也表明串联基因的表达。
或者，含有并表达希望的多核苷酸序列的宿主细胞可用本领域技术人员周知的多种方法鉴定。这些方法包括但不限于：DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，包括如基于膜、溶液或芯片的技术，用于核酸或蛋白质的检测和/或定量。
利用产物特异的多克隆或单克隆抗体检测和测定多核苷酸编码产物的多种方法在本领域周知。例子包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)和荧光激活细胞分选(FACS)。利用与特定多肽上两个不干扰表位有反应性的单克隆抗体、基于双位点单克隆的免疫测定法对于某些用途可能是优选的，但是也可使用竞争结合测定。Hampton，R.等人(1990；《血清学方法，实验室手册》，APS出版社，St Paul.Minn.)和Maddox，D.E.等人(1983；J.Exp.Med.158：1211-1216)等描述了这些及其它测定法。
许多标记和结合技术为本领域技术人员所知，可以在多种核酸和氨基酸测定中使用。为检测多核苷酸相关序列产生标记的杂交或PCR探针的方法包括寡聚物标记、切口平移、末端标记或使用标记核苷酸的PCR扩增。或者，这些序列或其任一部分也可克隆到载体中，用于产生mRNA探针。这些载体在本领域周知，可商品获得，并且可以用来通过加入适当RNA聚合酶(如T7、T3或SP6)和标记的核苷酸在体外合成RNA探针。这些方法可以用多种商品试剂盒进行。可以应用的合适的报道分子或标记物包括：放射性核素、酶、荧光、化学发光或发色剂，以及底物、辅因子、抑制剂、磁性颗粒等。
用目的多核苷酸序列转化的宿主细胞可以在适于从细胞培养物中表达和回收蛋白质的条件下培养。根据序列和/或所用的载体，重组细胞产生的蛋白质可以分泌或包含于细胞内。本领域技术人员应当理解，含有本发明的多核苷酸的表达载体可以设计为含有信号序列，该信号序列引导编码的多肽通过原核或真核细胞膜分泌。其它重组构建可用来将编码目的多肽的序列与编码有助于可溶性蛋白质纯化的多肽域的核苷酸序列连接。这些便于纯化的结构域包括但不限于：金属螯合肽，如允许在固定金属上纯化的组氨酸-色氨酸分子，允许在固定免疫球蛋白上纯化的蛋白A域，在FLAGS延伸/亲和纯化系统(ImmunexCorp.，Seattle，Wash.)中使用的域。在纯化域与编码的多肽之间含有可切割的连接序列(如因子XA或肠激酶(Invitrogen.San Diego，Calif.)特异序列)有利于纯化。一种这样的表达载体用于表达在硫氧还蛋白或肠激酶酶切位点之前含有目的多肽和编码6组氨酸残基的核酸的融合蛋白。组氨酸残基有利于在如Porath，J.等人(1992，Prot.Exp.Purif.3：263-281)所述的IMIAC(固定金属离子亲和层析)上纯化，而肠激酶酶切位点提供了从融合蛋白中纯化希望的多肽的方法。Kroll，D.J.等人(1993；DNA Cell Biol.12：441-453)描述了含有融合蛋白的载体。
除了重组生产方法外，还可以利用固相技术通过直接肽合成产生本发明的多肽及其片段(Merrifield J.(1963)J.Am.Chem.Soc.85：2149-2154)。蛋白质合成可以利用手工技术或自动进行。自动合成可以用例如Applied Biosystems 431A肽合成仪(Perkin Elmer)实现。或者，也可以利用化学法分别化学合成不同片段，然后组合，产生全长的分子。抗体组合物、其片段及其它结合剂
根据另一方面，本发明还提供结合剂，如抗体及其抗原结合片段，它们显示与此处公开的肿瘤多肽或与其部分、变体或衍生物免疫学结合。如果一种抗体或其抗原结合片段与本发明的多肽以可检测的水平反应(例如ELISA测定)，而在类似条件下不与无关多肽可检测地反应，则称其可与该多肽“特异结合”、“免疫学结合”和/或是“免疫反应性的”。
在此使用时，免疫结合通常是指在免疫球蛋白分子与免疫球蛋白特异的抗原之间发生的非共价相互作用。免疫结合作用的强度或亲和力能根据相互作用的解离常数(Kd)表示，其中较小的Kd表示较大的亲和力。选择的多肽的免疫结合性质能用本领域周知的方法定量。一种这样的方法需要测定抗原结合位点/抗原复合物形成和解离的速率，其中这些速率取决于复合物配偶体的浓度、相互作用的亲和力和在两个方向同样影响该速率的几何参数。因此，通过计算浓度及结合和解离的实际速率能确定“形成速率常数(on rate constant)”(Kon)“解离速率常数(off rate constant)”(Koff)。Koff/Kon之比能消除与亲和力无关的所有参数，因而等同于解离常数Kd。一般参见Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59：439-473。
抗体的“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重链(“H”)和轻链(“L”)N端可变(“V”)区的氨基酸残基形成。重链和轻链V区内的三个非常趋异的区段被称为“超变区”，它们介于被称为“构架区”或“FR”的多个保守侧翼区段之间。因此术语“FR”是指在免疫球蛋白超变区之间和与之相邻处自然发现的氨基酸序列。在抗体分子中，轻链的三个超变区和重链的三个超变区在三维空间上彼此相对排列，形成一个抗原结合表面。该抗原结合表面互补于结合的抗原的三维表面，每个重链和轻链的三个超变区被称为“互补决定区”或“CDR”。
利用此处所述的典型测定法，结合剂还能区分患有或未患癌症(如乳腺癌)的患者。例如，可与肿瘤蛋白结合的抗体或其它结合剂优选地在至少约20％的疾病患者中，更优选地在至少约30％的患者中产生表明存在癌症的信号。或者，或此外，该抗体将在至少约90％的无癌症个体中产生表明未患病的阴性信号。为了确定一种结合剂是否满足这一要求，可以如此处所述测定患有或未患癌症的患者(用标准临床试验确定)的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检)中是否存在能与该结合剂结合的多肽。优选地，应当测定统计学显著数量的患有或未患疾病的样品。每种结合剂都应满足以上标准；然而，本领域技术人员应当认识到，为了提高灵敏度，可组合使用结合剂。
满足以上要求的任何试剂都可以是结合剂。例如，结合剂可以是含或不含肽成分的核糖体，RNA分子或多肽。在一个优选实施方案中，结合剂是一种抗体或其抗原结合片段。抗体可用本领域技术人员所知的多种技术制备。参见，例如，Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室，1988。通常能用细胞培养技术产生抗体，包括此处所述的单克隆抗体的产生方法，或通过抗体基因转染合适的细菌和哺乳动物细胞宿主，产生重组抗体。在一种技术中，首先用含所述多肽的免疫原注射任一种哺乳动物(例如小鼠、大鼠、兔、绵羊或山羊)中。在该步骤中，本发明的多肽可作为未加修饰的免疫原。或者，特别是对于相对较短的多肽，如果多肽与一种载体蛋白(如牛血清白蛋白或匙孔血蓝蛋白)连接，可引发较强的免疫应答。优选地按照包括一次或多次加强免疫的预定方案，对动物宿主注射免疫原，并且定期对动物采血。然后利用例如与适当固体载体偶联的所述多肽，通过亲和层析法，从这些抗血清中纯化该多肽特异的多克隆抗体。
目的抗原性多肽特异的单克隆抗体可用Kohler和Milstein，Eur，J.Immunol.6：511-519，1976的技术及其改进方法制备。简言之，这些方法包括制备能产生具有希望特异性(即与目的多肽的反应性)的抗体的无限增殖化细胞系。例如，可以用从如上所述免疫的动物中获得的脾细胞产生这些细胞系。然后通过例如与骨髓瘤细胞融合配偶体融合，优选地与免疫动物同源的骨髓瘤细胞融合配偶体融合，使脾细胞无限增殖化。可以使用多种融合技术。例如，脾细胞和骨髓瘤细胞可以与非离子型去污剂结合几分钟，然后以低密度接种于支持杂种细胞生长但不支持骨髓瘤细胞生长的选择性培养基中。一种优选的筛选技术使用HAT(次黄嘌呤、氨喋呤、胸苷)筛选。经足够的时间后，通常1至2周，观察到杂种集落。选择单集落，检测其培养上清液对多肽的结合活性。优选具有高反应性和特异性的杂交瘤。
可从生长的杂交瘤集落的上清液中分离单克隆抗体。另外，也可以利用多种技术提高产量，如向合适的脊椎动物宿主(如小鼠)的腹膜腔中注射杂交瘤细胞系。然后从腹水或血液中收集单克隆抗体。可以利用常规技术，如层析、凝胶过滤、沉淀和抽提，从抗体中除去污染物。本发明的多肽可在纯化方法(如亲和层析步骤)中使用。
许多治疗上有用的分子在本领域已知，它们含有能显示抗体分子的免疫结合性质的抗原结合位点。蛋白水解酶木瓜蛋白酶优先切割IgG分子，产生几个片段，其中两个(“F(ab)”片段)均含有一个含有完整抗原结合位点的共价异二聚体。胃蛋白酶能切割IgG分子，产生几个片段，包括含有两个抗原结合位点的“F(ab’)2”片段。“Fv”片段能通过优先蛋白水解切割IgM、在极少数情况中切割IgG或IgA免疫球蛋白分子产生。然而，Fv片段更常见地是利用本领域周知的重组技术产生。Fv片段包含非共价VH∷VL异二聚体，它含有抗原结合位点，保留原始抗体分子的许多抗原识别和结合能力。Inbar等人(1972)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：2659-2662；Hochman等人(1976)Biochem 15：2706-2710；Ehrlich等人(1980)Biochem 19：4091-4096。
单链Fv(“sFv”)多肽是一种共价连接的VH∷VL异二聚体，它由含有以肽编码接头连接的VH-和VL-编码基因的基因融合体表达。Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(16)：5879-5883。曾经描述了大量辨别化学结构的方法，用于将自然聚集的——但化学上分开的——多肽轻链和重链由抗体V区转变为sFv分子，它将折叠为基本上类似于抗原结合位点结构的三维结构。参见，例如，授予Huston等人的美国专利号5,091,513和5,132,405和授予Ladner等人的美国专利号4,946,778。
上述每一种分子都含有重链和轻链CDR组，分别插在重链与轻链FR组之间，后者提供对CDRS的支持，并确定CDR相对于彼此的空间联系。在此使用时，术语“CDR组”是指重链或轻链V区的三个超变区。从重链或轻链的N端前行，这些区域分别被称为“CDR1”、“CDR2”和“CDR3”。因此，抗原结合位点包含6个CDR，含有来自每个重链和轻链V区的CDR组。含有一个CDR(例如CDR1、CDR2或CDR3)的多肽在此被称为“分子识别单位”。对大量抗原-抗体复合物的结晶分析证明，CDR的氨基酸残基形成与结合抗原的广泛接触，其中最广泛的抗原接触是与重链CDR3。因此，分子识别单位主要负责抗原结合位点的特异性。
在此使用时，术语“FR组”是指4种侧翼氨基酸序列，它们构造重链或轻链V区的CDR组的CDR。某些FR残基可接触结合抗原；然而，FR主要负责将V区折叠为抗原结合位点，特别是直接与CDRS相邻的FR残基。在FR内，某些氨基酸残基和某些结构特征非常保守。在这点上，所有V区序列都含有一个约90个氨基酸残基的内部二硫环。当V区折叠为结合位点时，CDR表现为凸出的环形基序，形成抗原结合表面。一般认为存在保守的FR结构区，影响CDR环折叠为某些“典型”结构，而无论确切的CDR氨基酸序列如何。另外，已知某些FR残基参与非共价域间接触，这稳定了抗体重链和轻链的相互作用。
已经描述了含有来自非人类免疫球蛋白的抗原结合位点的大量“人源化”抗体分子，包括嵌合抗体，其含有与人类恒定域融合的啮齿动物V区和相关CDR(Winter等人(1991)Nature 349：293-299；Lobuglio等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：4220-4224；Shaw等人(1987)J Immunol.138：4534-4538；Brown等人(1987)Cancer Res.47：3577-3583)，在与适当人类抗体恒定域融合之前嫁接到人支持FR中的啮齿动物CDR(Riechmann等人(1988)Nature332：323-327；Verhoeyen等人(1988)Science 239：1534-1536；Jones等人(1986)Nature 321：522-525)和重组镶饰啮齿动物FR支持的啮齿动物CDR(1992年12月23日公布的欧洲专利申请号519,596)。这些“人源化”分子设计为使对啮齿动物抗人抗体分子的不希望的免疫应答降至最低，这种应答限制这些部分在人类受体中的治疗用途的持续时间和有效性。
在此使用时，术语“镶饰FR(veneered FRs)”和“重组镶饰FR”是指将例如啮齿动物重链或轻链V区的FR残基选择性置换为人类FR，以期产生含有抗原结合位点、基本上保留全部天然FR多肽折叠结构的异种分子。镶饰(veneering)技术基于这一认识：抗原结合位点的配体结合特征主要由抗原结合表面内重链和轻链CDR组的结构和相对位置决定。Davies等人(1990)Annual Rev.Biochem.59：439-473。因此，抗原结合特异性只能在谨慎保留CDR结构、彼此之间的相互作用和与其余V区结构域的相互作用时保持在人源化抗体中。利用镶饰技术将免疫系统容易遇到的外部(例如溶剂可达的)FR残基选择性替换为人类残基，产生含有弱免疫原性或基本上无免疫原性的镶饰表面的杂种分子。
镶饰方法利用可获得的人类抗体可变域的序列数据库(Kabat等人汇编，《具有免疫学意义的蛋白质的序列》第4版(美国卫生与人类部，美国政府印刷所，1987))，Kabat数据库的更新版和其它可获得的美国和国外数据库(核酸和蛋白质数据库)。V区氨基酸的溶剂可及性能由人和鼠抗体片段的已知三维结构推断。镶饰鼠抗原结合位点一般包括两个步骤。首先，将目的抗体分子可变域的FR与由上述来源获得的人可变域的相应FR序列相比较。然后将最同源的人类V区与相应的鼠氨基酸逐个残基地比较。利用本领域周知的重组技术将鼠FR中不同于人类相应残基的残基替换为人类部分中存在的残基。只对至少部分暴露(溶剂可及)的部分进行残基变换，在替换对V区结构域的三级结构可能有明显影响的氨基酸残基(如脯氨酸、甘氨酸和带电氨基酸)时加以注意。
这样，产生的“镶饰”鼠抗原结合位点保留鼠CDR残基，与CDR基本相邻的残基，确定为掩盖或大部分掩盖(溶剂不可及)的残基，认为参与重链与轻链域非共价(例如静电和疏水)接触的残基，和被认为影响CDR环“典型”三级结构的FR保守结构区的残基。这些设计标准用来制备重组核苷酸序列，将鼠抗原结合位点的重链和轻链的CDR组合至类似人类的FRs中，该序列能用来转染哺乳动物细胞，用于表达显示鼠抗体分子的抗原特异性的重组人类抗体。
在本发明的另一个实施方案中，本发明的单克隆抗体可与一种或多种治疗剂偶联。就此而言，合适的治疗剂包括放射性核素、分化诱导剂、药物、毒素及其衍生物。优选的放射性核素包括90Y、123I、125I、131I、186Re、188Re、211At和212Bi。优选的药物包括氨甲喋呤和嘧啶和嘌呤类似物。优选的分化诱导剂包括佛波醇酯和丁酸。优选的毒素包括篦麻毒素、相思豆毒素、白喉毒素、霍乱毒素、gelonin、假单胞菌内毒素、志贺氏毒素和美洲商陆抗病毒蛋白。
治疗剂可与合适的单克隆抗体直接或间接(例如通过连接基团)偶联(例如共价键合)。当治疗剂和抗体均含有能彼此反应的取代基时，它们的直接反应是可能的。例如，一个上的亲核基团，如氨基或巯基，能与另一个上的含羰基基团(如酐或酰基卤)，或含有容易离去基团(如卤化物)的烷基反应。
或者，希望通过连接基团偶联治疗剂与抗体。连接基团能作为间隔区使抗体远离治疗剂，以避免对结合能力的干扰。连接基团也能用来提高治疗剂或抗体上取代基的化学反应性，从而提高偶联效率。化学反应性的提高也可促进治疗剂或治疗剂官能团的应用，否则这是不可能的。
本领域技术人员应当明白，许多相同及不同功能的双功能或多功能试剂(如Pirece Chemical Co.，Rockford，IL目录所述)可用作连接基团。例如，通过氨基、羧基、巯基或氧化的碳水化合物残基可实现偶联。有大量参考文献描述了这些方法，如授予Rodwell等人的美国专利号4,671,958。
当不含本发明的免疫偶联物的抗体部分时，治疗剂更加有效，此时希望使用一种在细胞内化期间或之后能被切割的连接基团。曾经描述了大量不同的可切割连接基团。从这些连接基团胞内释放治疗剂的机制包括：通过二硫键还原(例如，授予Spitler的美国专利号4,489,710)、通过照射光不稳定键(例如，授予Senter等人的美国专利号4,625,014)、通过衍生的氨基酸侧链的水解(例如，授予Kohn等人的美国专利号4,638,045)、通过血清补体介导的水解(例如，授予Rodwell等人的美国专利号4,671,958)和酸催化的水解(参见，授予Blattler等人的美国专利号4,569,789)切割。
将一种以上的试剂与一种抗体偶联可能是希望的。在一个实施方案中，一种试剂的多个分子与一个抗体分子偶联。在另一个实施方案中，一种以上的试剂与一个抗体偶联。无论特定实施方案如何，可用多种方法制备含一个以上试剂的免疫偶联物。例如，一个以上的试剂可直接与抗体分子偶联，或者能使用提供多个连接位点的接头。或者也能使用载体。
载体可能以多种方式携带试剂，包括直接或通过连接基团共价键合。合适的载体包括蛋白质如白蛋白(例如，授予Kato等人的美国专利号4,507,234)、肽和多糖如氨基葡聚糖(例如，授予Shih等人的美国专利号4,699,784)。载体也可通过非共价结合或通过包封于如脂质体囊中携带试剂(例如，美国专利号4,429,008和4,873,088)。放射性核素试剂特异的载体包括放射性卤化小分子和螯合剂。例如，美国专利号4,735,792公开了代表性的放射性卤化小分子及其合成。放射性核素螯合物可由螯合剂形成，包括含有氮及硫原子作为供体原子的螯合剂，用于结合金属或金属氧化物、放射性核素。例如，授予Davison等人的美国专利号4,673,562公开了代表性螯合剂及其合成。T细胞组合物
另一方面，本发明提供对于此处公开的肿瘤多肽或其变体或衍生物特异的T细胞。这些细胞一般可用标准方法在体外或离体制备。例如，可用购得的细胞分离系统，如可购自Nexell Therapeutics，Inc.的IsolexTM系统(Irvine，CA；参见美国专利号5,240,856；美国专利号5,215,926；WO 89/06280；WO 91/16116和WO 92/07243)，从患者的骨髓、外周血或骨髓或外周血级分中分离T细胞。或者，也可由有关和无关的人、非人类哺乳动物、细胞系或培养物产生T细胞。
可以用多肽、编码多肽的多核苷酸和/或表达这种多肽的抗原递呈细胞(APC)刺激T细胞。这种刺激在足以产生目的多肽特异的T细胞的条件下和时间内进行。优选地，本发明的肿瘤多肽或多核苷酸存在于输送载体(如小球体)中，以促进特异性T细胞的产生。
如果T细胞特异增殖、分泌细胞因子或杀伤由多肽包被的或表达编码该多肽的基因的靶细胞，则认为这种T细胞对于本发明的多肽是特异的。T细胞特异性可以用多种标准技术评价。例如，在铬释放测定或增殖测定中，裂解和/或增殖比阴性对照提高两倍以上的刺激指数表明T细胞特异性。这些测定可如Chen等人，Cancer Res.54：1065-1070，1994所述进行。或者，对T细胞增殖的检测也可利用多种已知技术进行。例如，通过测定DNA合成速率的提高(例如，通过用氚化胸苷脉冲标记T细胞培养物，并测定掺入DNA中的氚化胸苷的量)，能检测T细胞的增殖。与肿瘤多肽(100ng/ml-100μg/ml，优选地200ng/ml-25μg/ml)接触3-7天一般将导致T细胞增殖至少提高2倍。如上所述接触2-3小时将导致T细胞激活，如用标准细胞因子测定所测，其中细胞因子释放(例如TNF或IFN-γ)水平提高2倍表明T细胞激活(参见Coligan等人，《现代免疫学方法》，第一卷，Wiley Interscience(Greene 1998))。由肿瘤多肽、多核苷酸或表达多肽的APC激活的T细胞可以是CD4+和/或CD8+。肿瘤多肽特异的T细胞可用标准技术扩充。在优选实施方案中，T细胞来自患者、有关或无关供体，在刺激和扩充后对患者施用。
为了治疗目的，响应肿瘤多肽、多核苷酸或APC增殖的CD4+或CD8+T细胞能在体外或体内大量扩充。这些T细胞的体外增殖可用多种方法实现。例如，可使T细胞重复暴露于肿瘤多肽，或对应于这种多肽免疫原性部分的短肽，加入或不加T细胞生长因子，如白介素-2，和/或可合成肿瘤多肽的刺激细胞。或者，也能通过克隆大量扩增在肿瘤多肽存在下增殖的一种或多种T细胞。克隆细胞的方法在本领域众所周知，包括有限稀释法。药用组合物
在其它实施方案中，本发明涉及此处公开的一种或多种多核苷酸、多肽、T细胞和/或抗体组合物在药学可接受的载体中的制剂，用于单独或与一种或多种其它治疗形式组合对细胞或动物施用。
应当理解，希望时，此处公开的组合物也可以与其它试剂(如其它蛋白质或多肽或不同的药学活性剂)组合施用。实际上，如果其它试剂在接触靶细胞或宿主组织后不引起明显的负面影响，则对可能包含的其它成分没有限制。因此在特定情况需要时，这些组合物可与其它不同的试剂一起施用。这些组合物可从宿主细胞或其它生物来源纯化，或者也可如此处所述化学合成。这些组合物也可能进一步包括取代的或衍生的RNA或DNA组合物。
因此，本发明另一方面提供药用组合物，其含有一种或多种此处所述的多核苷酸、多肽、抗体和/或T细胞组合物，以及生理学可接受的载体。在某些优选实施方案中，本发明的药用组合物含有本发明的免疫原性多核苷酸和/或多肽组合物，用于预防和治疗疫苗用途。疫苗的制备如M.F.Powell和M.J.Newman编著的《疫苗设计(亚单位和佐剂方法)》，Plenum出版社(NY，1995)所概述。这些组合物通常含有一种或多种本发明的多核苷酸和/或多肽组合物以及一种或多种免疫刺激剂。
显然此处所述的任何药用组合物可含有本发明的多核苷酸和多肽的药学可接受的盐。这些盐能由药学可接受的无毒碱制备，包括有机碱(例如伯胺、肿胺和叔胺和碱性氨基酸的盐)和无机碱(例如钠、钾、锂、铵、钙和镁盐)。
在另一个实施方案中，本发明的说明性免疫原性组合物(如疫苗组合物)含有编码一种或多种上述多肽的DNA，使得多肽原位产生。如上所述，该多核苷酸可以在本领域技术人员周知的任一种输送系统内施用。的确，大量基因输送技术在本领域众所周知，如Rolland，Crit.Rev.Therap.Drug Carrier Systems 15：143-198，1998和此处引用的参考文献所述。合适的多核苷酸表达系统当然含有在患者中表达所必需的DNA调节序列(如合适的启动子和终止信号)。或者，细菌输送系统还包括施用在细胞表面表达多肽免疫原性部分或分泌这种表位的细菌(如卡介苗)。
因此，在某些实施方案中，利用周知的多种基于病毒的系统之一，将编码此处所述免疫原性多肽的多核苷酸导入适当哺乳动物宿主细胞中表达。在一个说明性实施方案中，逆转录病毒提供了一种方便、有效的基因输送系统平台。能利用本领域周知的技术将选择的编码本发明的多肽的核苷酸序列插入载体并包装于逆转录病毒颗粒中。然后能分离重组病毒并对患者施用。曾经描述了大量说明性逆转录病毒系统(例如美国专利号5,219,740；Miller和Rosman(1989)BioTechniques 7：980-990；Miller，A.D.(1990)Human Gene Therapy1：5-14；Scarpa等人(1991)Virology 180：849-852；Burns等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：8033-8037；Boris-Lawrie和Temin(1993)Cur.Opin.Genet.Develop.3：102-109)。
另外也描述了许多基于腺病毒的说明性系统。与整合到宿主基因组中的逆转录病毒不同，腺病毒存在于染色体外，从而使得与插入诱变有关的危险最小(Haj-Ahmad和Graham(1986)J.Virol.57：267-274；Bett等人(1993)J.Virol.67：5911-5921；Mittereder等人(1994)Human Gene Therapy 5：717-729；Seth等人(1993)J.Virol.68：933-940；Barr等人(1994)Gene Therapy 1：51-58；Berkner，K.L.(1998)BioTechniques 6：616-629；Rich等人(1993)Human GeneTherapy 4：461-476)。
也发展了用于多核苷酸输送的多种腺伴随病毒(AAV)载体系统。AAV载体能用本领域众所周知的技术容易地构建。参见，例如，美国专利号5,173,414和5,139,941；国际公开号WO 92/01070和WO93/03769；Lebkowski等人(1988)Molec.Cell.Biol.8：3988-3996；Vincent等人(1990)Vaccines 90(冷泉港实验室出版社)；Carter，B.J.(1992)Current Opinion in Biotechnology 3：533-539；Muzyczka，N.(1992)Current Topics in Microbiol.and Immunol.158：97-129；Kotin，R.M.(1994)Human Gene Therapy 5：793-801；Shelling和Smith(1994)Gene Therapy 1：165-169；Zhou等人(1994)J.Exp.Med.179：1867-1875。
可用于通过基因转移输送编码本发明的多肽的多核苷酸的其它病毒载体包括来自痘病毒家族的载体，如痘苗病毒和禽痘病毒。例如，表达该新分子的痘苗病毒重组体能如下构建。首先将编码多肽的DNA插入适当载体中，使它与痘苗启动子和侧翼痘苗DNA序列(如编码胸苷激酶(TK)的序列)相邻。然后用该载体转染同时用痘苗感染的细胞。利用同源重组向病毒基因组中插入痘苗启动子加编码目的多肽的基因。通过在5-溴脱氧尿苷存在下培养细胞并挑取对它有抗性的病毒噬斑，筛选产生的TK.sup.(-)重组体。
以痘苗为基础的感染/转染系统能方便地用于引起此处所述的一种或多种多肽在生物宿主细胞中诱导型、瞬时表达或共表达。在这种特定系统中，首先用编码噬菌体T7 RNA聚合酶的痘苗病毒重组体体外感染细胞。该聚合酶显示强烈的特异性，因为它只转录含有T7启动子的模板。在感染后，用T7启动子驱动的目的多核苷酸转染细胞。痘苗病毒重组体在细胞质中表达的聚合酶把转染的DNA转录为RNA，然后由宿主翻译机器翻译为多肽。该方法可导致大量RNA及其翻译产物的高水平、瞬时、细胞质的产生。参见，例如，Elroy-Stein和Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1990)87：6743-6747；Fuerst等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)83：8122-8126。
或者，也能利用禽痘病毒(如禽痘和金丝雀痘病毒)输送目的编码序列。表达哺乳动物病原体的免疫原的重组禽痘病毒据认为在对非禽类物种施用时可引起保护性免疫。在人和其它哺乳动物种中使用禽痘病毒载体是特别希望的，因为禽痘属的成员只能在易感禽类种中生产性复制，因此不感染哺乳动物细胞。产生重组禽痘病毒的方法在本领域周知，使用遗传重组，如上对于痘苗病毒的产生所述。参见，例如，WO 91/12882；WO 89/03429；WO 92/03545。
许多甲病毒也能用于输送本发明的多核苷酸组合物，如美国专利号5,843,723；6,015,686；6,008,035和6,015,694所述的载体。也能使用某些基于委内瑞拉马脑炎(VEE)的载体，其说明性例子见美国专利号5,505,947和5,643,576。
此外，分子偶联载体，如Michael等人，J.Biol.Chem.(1993)268：6866-6869和Wanger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1992)89：6099-6103所述的腺病毒嵌合载体也能用于本发明的基因输送。
关于这些和其它基于病毒的已知输送系统的其它说明性信息可见于，例如：Fisher-Hoch等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：317-321，1989；Flexner等人，Ann.N.Y.Acad.Sci.569：86-103，1989；Flexner等人，Vaccine 8：17-21，1990；美国专利号4,603,112、4,769,330和5,017,487；WO 89/01973；美国专利号4,777,127；GB2,200,651；EP 0,345,242；WO 91/02805；Berkner，Biotechniques6：616-627，1988；Rosenfeld等人，Science 252：431-434，1991；Kolls等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：215-219，1994；Kass-Eisler等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：11498-11502，1993；Guzman等人，Circulation 88：2838-2848，1993；Guzman等人，Cir.Res.73：1202-1207，1993。
在某些实施方案中，多核苷酸可以整合到靶细胞的基因组中。这种整合可以以特定位置和方向同源重组(基因置换)，或者可以非特定位置地随机整合(基因扩增)。在其它实施方案中，多核苷酸在细胞中可稳定保持为分开的附加型DNA片段。这些多核苷酸片段或“附加体”编码足以不依赖于宿主细胞周期或与之同步保持和复制的序列。向细胞输送表达构建体和细胞中多核苷酸保持的方式取决于所使用的表达构建体的类型。
在本发明的另一个实施方案中，如Ulmer等人，Science259：1745-1749，1993所述，如Cohen，Science 259：1691-1692，1993所综述，多核苷酸也可以作为“裸露的”DNA施用/输送。将DNA包被于可生物降解的珠上可提高裸露DNA的摄取，它能被有效地输送到细胞内。
在另一实施方案中，本发明的组合物能通过粒子轰击法输送，其中许多已经描述。在一个说明性实例中，能用如PowderjectPharmaceuticals PLC(Oxford，UK)和Powderject Vaccines Inc.(Madison，WI)制造的装置实现气体驱动的粒子加速，美国专利号5,846,796；6,010,478；5,865,796；5,584,807；欧洲专利号0500 799描述了其中一些实例。该方法提出一种无针输送法，其中用手持式装置产生的氦气气流将显微颗粒(如多核苷酸或多肽颗粒)的干粉制剂加速到高速，推动颗粒进入靶组织。
在有关实施方案中，可用于气体驱动无针注射本发明的组合物的其它装置和方法包括Bioject，Inc.(Portland，OR)所提供的那些，美国专利号4,790,824；5,064,413；5,312,335；5,383,851；5,399,163；5,520,639和5,993,412中描述了其中一些实例。
根据另一个实施方案，此处所述的药用组合物除本发明的免疫原性多核苷酸、多肽、抗体、T细胞和/或APC组合物外还含有一种或多种免疫刺激剂。免疫刺激剂是指增强对外源抗原的免疫应答(抗体和/或细胞介导的)的基本上所有的物质。一种优选的免疫刺激剂含有佐剂。许多佐剂含有用来保护抗原免于快速分解代谢的物质，如氢氧化铝或矿物油，和免疫应答的刺激物，如脂质A、Bortadella pertussis或结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)衍生的蛋白质。某些佐剂可以购得，如弗氏不完全佐剂和完全佐剂(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Merck佐剂65(Merck and Company，Inc.，Rahway，NJ)；AS-2(SmithKline Beecham，Philadelphia，PA)；铝盐，如氢氧化铝胶体(明矾)或磷酸铝；钙、铁或锌盐；酰化酪氨酸的不可溶悬液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生的多糖；聚磷腈；可生物降解的小球体；单磷酰脂类A和quil A。细胞因子如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可用作佐剂。
在本发明的某些实施方案中，佐剂组合物优选地诱导以Th1型为主的免疫应答。高水平的Th1型细胞因子(例如IFN-γ、TNFα、IL-2和IL-12)倾向于诱导针对施用抗原的细胞介导的免疫应答。相反，高水平的Th2型细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6和IL-10)倾向于诱导体液免疫应答。在施用此处所述的疫苗后，患者将支持包括Th1型和Th2型应答的免疫应答。在一个优选实施方案中，其中应答主要是Th1型，Th1型细胞因子的水平将增加到比Th2型细胞因子水平更高的程度。这些细胞因子的水平可用标准测定法评价。关于细胞因子家族的综述参见Mosmann和Coffman，Ann.Rev.Immunol.7：145-173，1989。
用于引发以Th1型为主的应答的某些优选佐剂包括，例如，单磷酰脂类A(优选地3-脱-O-酰化单磷酰脂类A)与铝盐的组合。MPL佐剂可从Corixa公司(Seattle，WA)获得(参见，例如，美国专利号4,436,727；4,877,611；4,866,034和4,912,094)。含CpG的寡核苷酸(其中CpG二核苷酸未甲基化)也诱导以Th1为主的应答。这些寡核苷酸众所周知，例如在WO 96/02555、WO 99/33488和美国专利号6,008,200和5,856,462中描述。例如，Sato等人，Science 273：352，1996也描述了免疫刺激性DNA序列。另一种优选佐剂含有皂角苷，如Quil A或其衍生物，包括QS21和QS7(Aquila BiopharmaceuticalsInc.，Framingham，MA)、七叶皂苷、毛地黄皂苷或Gypsophila或Chenopodium quinoa皂角苷。其它优选的制剂包括在本发明的佐剂组合中的一种以上的皂角苷，例如QS21、QS7、Quil A、β-七叶皂苷或毛地黄皂苷中的至少两种的组合。
或者，皂角苷制剂也可与疫苗载体组合，这些载体包含壳聚糖或其它聚阳离子聚合物、聚交酯和聚交酯-共-乙交酯颗粒、基于聚-N-乙酰葡糖胺的聚合基质、由多糖或化学修饰的多糖组成的颗粒、脂质体和基于脂类的颗粒、由甘油单酯组成的颗粒等。皂角苷也可在胆固醇存在下配制，以形成颗粒结构如脂质体或ISCOM。此外，皂角苷也可与聚氧乙烯醚或酯在非颗粒溶液或悬液中配制，或为颗粒结构如少层(paucilamelar)脂质体或ISCOM。皂角苷也可与赋形剂(如CarbopolR)配制以提高粘度，或者可以以干粉形式与粉末赋形剂(如乳糖)配制。
在一个优选实施方案中，佐剂系统包括单磷酰脂类A和皂角苷衍生物的组合，如QS21和3D-MPL佐剂的组合，如WO 96/00153所述，或用胆固醇淬灭QS21的低反应性组合物，如WO 96/33739所述。其它优选制剂含有水包油乳剂和生育酚。在WO 95/17210中描述了在水包油乳剂中应用QS21、3D-MPL佐剂和生育酚的一种特别优选的佐剂制剂。
另一种增强的佐剂系统包括含CpG寡核苷酸与皂角苷衍生物的组合，特别是WO 00/09159中公开的CpG与QS21的组合。优选地，该制剂还含有水包油乳剂和生育酚。
用于本发明的药用组合物的其它说明性佐剂包括Montanide ISA720(Seppic，法国)、SAF(Chiron，加利福尼亚，美国)、ISCOMS(CSL)、MF-59(Chiron)、SBAS系列佐剂(例如SBAS-2或SBAS-4，可获自SmithKline Beecham，Rixensart，比利时)、Detox(Enhanzyn；Corixa，Hamilton，MT)、RC-529(Corixa，Hamilton，MT)和其它氨基烷基氨基葡糖苷4-磷酸(AGP)，如未决的美国专利申请系列号08/853,826和09/074,720所述，其公开内容在此引用作为参考，和如WO 99/52549A1所述的聚氧乙烯醚佐剂。
其它优选佐剂包括通式(I)：HO(CH2CH2O)n-A-R的佐剂分子，其中n是1-50，A是一个键或-C(O)-，R是C1-50烷基或苯基C1-50烷基。
本发明的一个实施方案包括含有通式(I)的聚氧乙烯醚的疫苗制剂，其中n是1-50，优选地是4-24，最优选地是9；R成分是C1-50，优选地是C4-C20烷基，最优选地是C12烷基，A是一个键。聚氧乙烯醚的浓度应当为0.1-20％，优选地0.1-10％，最优选地0.1-1％。优选的聚氧乙烯醚选自：聚氧乙烯-9-月桂基醚、聚氧乙烯-9-硬脂基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂基醚、聚氧乙烯-4-月桂基醚、聚氧乙烯-35-月桂基醚和聚氧乙烯-23-月桂基醚。Merck目录(第12版：条目7717)描述了聚氧乙烯醚，如聚氧乙烯月桂醚。WO 99/52549中描述了这些佐剂分子。根据通式(I)的聚氧乙烯醚希望时可与另一种佐剂组合。例如，优选的佐剂组合是优选地与如未决的英国专利申请GB9820956.2所述的CpG组合。
根据本发明的另一个实施方案，通过抗原递呈细胞(APC)向宿主输送此处所述的免疫原性组合物，APC如树突细胞、巨噬细胞、B细胞、单核细胞和可改造为有效APC的其它细胞。这些细胞可以但不是必须遗传修饰来提高递呈抗原的能力，促进T细胞应答的激活和/或保持，本身具有抗肿瘤作用，和/或与受体免疫学相容(即匹配的HLA单倍型)。APC一般可从多种生物液体和器官(包括肿瘤和肿瘤周围组织)中分离，可以是自体、异体、同源或异种的细胞。
本发明的某些优选实施方案使用树突细胞或其祖细胞作为抗原递呈细胞。树突细胞是十分有效的APC(Banchereau和Steinman，Nature 392：245-251，1998)，作为生理佐剂可有效地引发预防或治疗性抗肿瘤免疫(参见Timmerman和Levy，Ann.Rev.Med.50：507-529，1999)。通常可根据典型形状(原位星形，在体外可见的明显的胞质突起(树突))、高效摄取、加工和递呈抗原的能力及其激活幼稚T细胞应答的能力鉴定树突细胞。当然可以改造树突细胞，使之表达在体内或离体的树突细胞上不常见到的特异性细胞表面受体或配体，本发明涉及这些修饰的树突细胞。作为树突细胞的一个备选，在疫苗中可使用分泌的载有囊泡抗原的树突细胞(称为外来体)(参见Zitvogel等人，Nature Med.4：594-600，1998)。
树突细胞及其祖细胞可从外周血、骨髓、肿瘤浸润细胞、肿瘤周围组织浸润细胞、淋巴结、脾脏、皮肤、脐带血或其它任何合适的组织或液体中获得。例如，通过向从外周血中收集的单核细胞的培养物中加入细胞因子，如GM-CSF、IL-4、IL-13和/或TNFα的组合，树突细胞可以离体分化。此外，通过向培养基中加入GM-CSF、IL-3、TNFα、CD40配体、LPS、flt3配体和/或可诱导树突细胞分化、成熟和增殖的其它化合物的组合，从外周血、脐带血或骨髓中收集的CD34阳性细胞也可分化为树突细胞。
树突细胞常规分类为“未成熟”和“成熟”的细胞，这是区别两种明确表征的表型的一种简单方法。然而，这种命名法不应被视为排除分化中所有可能的中间阶段。未成熟树突细胞被表征为具有高抗原摄取和加工能力的APC，这与Fcγ受体和甘露糖受体的高表达有关。成熟表型的特征一般在于这些标记的表达较低，但负责T细胞激活的细胞表面分子如I类和II类MHC、粘附分子(例如，CD54和CD11)和共刺激分子(例如CD40、CD80、CD86和4-1BB)高表达。
通常可以用本发明的多核苷酸(或其部分或其它变体)转染APC，使得编码的多肽或其免疫原性部分在细胞表面表达。如此处所述，这种转染可以离体发生，含有这些转染细胞的药用组合物可用于治疗目的。此外，也可以向患者施用导向树突或其它抗原递呈细胞的基因输送载体，引发在体内发生的转染。例如，树突细胞的体内和离体转染通常可用本领域周知的任何方法进行，如WO 97/24447所述的方法，或Mahvi等人，Immunology and Cell Biology 75：456-460，1997所述的基因枪法。树突细胞负载抗原可如下实现：将树突细胞或祖细胞与肿瘤多肽、(裸露的或质粒载体内的)DNA或RNA或与表达抗原的重组细菌或病毒(例如，痘苗、禽痘、腺病毒或慢病毒载体)温育。在负载前，多肽可与提供T细胞帮助的免疫配偶体(例如载体分子)共价结合。或者，树突细胞也可以用未结合的免疫配偶体单独地或在多肽存在下脉冲。
尽管在本发明的药用组合物中可以使用本领域技术人员所知的任何适当载体，但载体的类型一般因施用方式而不同。可为了任何合适的施用方式配制本发明的组合物，包括，例如，局部、口服、鼻、粘膜、静脉内、颅骨内、腹膜内、皮下和肌内施用。
这些药用组合物中使用的载体是生物相容的，也可以是可生物降解的。在某些实施方案中，该制剂优选地引起相对恒定水平的活性成分释放。然而在其它实施方案中，施用后更快的释放速度可能是希望的。这些组合物的配制为本领域技术人员所熟知。在这方面有用的说明性载体包括聚(丙交酯-共-乙交酯)、聚丙烯酸酯、胶乳、淀粉、纤维素、葡聚糖等的微粒。其它说明性缓释载体包括超分子生物载体，它含有非脂亲水性核心(例如交联的多糖或寡糖)，和任选的含有两亲性化合物(如磷脂)的外层(参见，例如，美国专利号5,151,254和PCT申请WO 94/20078、WO 94/23701和WO 96/06638)。缓释制剂中所含的活性成分的量取决于植入部位、释放速度和预期的持续时间和将要治疗或预防的病情。
在另一个说明性实施方案中，用可生物降解的小球体(例如polylactate polyglycolate)作为本发明的组合物的载体。例如，美国专利号4,897,268；5,075,109；5,928,647；5,811,128；5,820,883；5,853,763；5,814,344；5,407,609和5,942,252中公开了合适的可生物降解的小球体。修饰的乙型肝炎核心蛋白载体系统，如WO 99/40934和此处引用的参考文献所述，也可用于多种用途。另一种说明性载体/输送系统使用一种含有颗粒-蛋白质复合物的载体，如美国专利号5,928,647所述，它能在宿主中诱发I类限制的细胞毒性T淋巴细胞应答。
本发明的药用组合物通常还含有一种或多种缓冲液(例如，中性缓冲盐水或磷酸缓冲盐溶液)、碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖)、甘露醇、蛋白质、多肽或氨基酸(如甘氨酸)、抗氧化剂、抑菌剂、螯合剂(如EDTA)或谷胱甘肽、佐剂(如氢氧化铝)、使制剂相对于受体血液等渗、低渗或弱高渗的溶质、悬浮剂、增稠剂和/或防腐剂。或者，本发明的组合物也可配制为冻干品。
此处所述的药用组合物可存在于单剂量或多剂量的容器中，如密封的安瓿或小瓶中。这些容器一般密封，以在使用前保持制剂的无菌和稳定性。制剂通常可贮存为油状或水状载体中的悬液、溶液或乳液。此外，药用组合物也可在冻干条件下贮存，在使用前只需加入无菌液体载体。
为了在多种治疗方案中使用此处所述的特定组合物，发展适当给药和治疗方案，包括例如：口服、肠胃外、静脉内、鼻内和肌内施用和配制，为本领域众所周知，为便于说明，其中一些在下面简要描述。
在某些用途中，可以通过口服向动物施用此处公开的药用组合物。这样，这些组合物可以用惰性稀释剂或可吸收的食用载体配制，或者可以包封于硬壳或软壳的明胶胶囊中，或者可以压制成片剂，或者可以直接掺入食物中。
活性化合物中甚至可以掺入赋形剂，并以可摄入的片剂、颊含片、锭剂、胶囊、酏剂、悬液、糖浆、薄膜等的形式使用(参见，例如，Mathiowitz等人，Nature 1997 Mar 27；386(6623)：410-4；Hwang等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst 1998；15(3)：243-84；美国专利5,641,515；美国专利5,580,579；美国专利5,792,451)。片剂、锭剂、丸剂、胶囊等也可含有多种其它成分，例如，粘合剂，如黄蓍树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂，如磷酸二钙；崩解剂，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂，如硬脂酸镁；甜味剂，如可以加入蔗糖、乳糖或糖精，或增香剂，如薄荷、冬青油或樱桃香料。当单位剂型是胶囊时，除上述材料之外还可含有液体载体。各种其它材料可以是包衣或另外修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊可以用紫胶、糖或其两者包被。当然，在制备任何单位剂型中使用的任何材料都应当是药物纯的，并且所使用的量基本上无毒。另外，也可以向缓释制剂中掺入活性化合物。
这些制剂一般含有至少约0.1％的活性化合物或更多，尽管活性成分的百分数肯定会变化，通常为总制剂重量或体积的约1或2％到约60％或70％或更多。一般按照在给定单位剂量的化合物中获得适当剂量，准备每种治疗上有用的组合物中活性化合物的量。制备这些药用制剂的技术人员应当考虑溶解度、生物利用性、生物半衰期、施用途径、产品保存期及其它药理学因素，因此，多种剂量和治疗方案可能是希望的。
对于经口施用，本发明的组合物在替代方案中可以与一种或多种赋形剂结合，为漱口药、洁齿剂、颊含片、喷口剂或舌下经口施用制剂的形式。或者，活性成分也可以掺入口服溶液(如含有硼酸钠、甘油和碳酸氢钾的溶液)中，或分散于洁齿剂中，或以治疗有效的量加入至可含有水、粘合剂、研磨剂、增香剂、发泡剂和湿润剂的组合物中。或者，组合物也可制成可置于舌下或以其它方式溶解于口中的片剂或溶液形式。
在某些情况下，希望经肠胃外、静脉内、肌内乃至腹膜内施用此处公开的药用组合物。这些方法为本领域技术人员所周知，其中一些例如在美国专利5,543,158；美国专利5,641,515和美国专利5,399,363中进一步描述。在某些实施方案中，活性化合物作为游离成分或药理学可接受的盐的溶液可以在与表面活性剂(如羟丙基纤维素)适当混合的水中制备。也可以在甘油、液体聚乙二醇及其混合物和油中制备分散液。在普通贮存和使用条件下，这些制剂通常含有防腐剂防止微生物生长。
适于注射用的说明性药物形式包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末(例如，参见美国专利5,466,468)。在所有情况中，该形式必须是无菌的，必须是易注射的液体。在生产和贮存条件下必须稳定，必须能防止微生物(如细菌和真菌)的污染作用。载体可以是溶剂或分散基质，例如含有水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们的适当混合液和/或植物油。例如，利用包被，如卵磷脂，在分散时保持需要的颗粒大小，和/或利用表面活性剂，可以保持适当的流动性。利用不同抗细菌剂和抗真菌剂，例如paraben、氯代丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等，有利于防止微生物的作用。在许多情况中，优选地含有等渗剂，如糖或氯化钠。在组合物中使用延缓吸收的试剂，如单硬脂酸铝和明胶，能使注射组合物的吸收延长。
在一个实施方案中，对于水溶液的肠胃外施用，必要时溶液应当适当地缓冲，首先用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些水溶液特别适用于静脉内、肌肉内、皮下和腹膜内施用。就此而言，根据本公开内容，本领域技术人员可了解能够使用的无菌水介质。例如，一剂量可溶解于1ml等渗NaCl溶液中，并加入1000ml皮下灌输液中或在所述注射部位注射(参见，例如，《Remington药物学》第15版，1035-1038和1570-1580页)。根据治疗的患者病情，必须进行剂量上的某些改变。此外，对于人体施用，制品必须优选地满足FDA生物标准所需的无菌、致热性和一般安全性和纯度标准。
在本发明的另一个实施方案中，此处公开的组合物可配制为中性或盐形式。药学可接受的盐包括酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，以及与无机酸(如盐酸或磷酸)或有机酸(如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等)形成的盐。与游离羧基形成的盐也能来自于无机碱，如氢氧化钠、钾、铵、钙或铁，和有机碱，如异丙胺、三甲胺、组胺、普鲁卡因等。在配制后，以与剂量制剂相容的方式并以治疗有效的量施用该溶液。
载体还能含有任一种和所有溶剂、分散介质、载体、包衣、稀释剂、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂、缓冲液、载体溶液、悬液、胶体等。这些介质和试剂用于药学活性物质的应用在本领域众所周知。除了与活性成分不相容的情况，考虑任何常规介质和试剂在治疗组合物中的使用。补充的活性成分也能加入组合物中。术语“药学可接受的”是指在对人体施用时不引起过敏或类似的不利反应的分子体和组合物。
在某些实施方案中，可以通过鼻内喷雾、吸入和/或其它气溶胶输送载体施用药用组合物。例如，美国专利5,756,353和美国专利5,804,212中描述了通过经鼻喷雾直接向肺输送基因、核酸和肽组合物的方法。利用鼻内微粒树脂(Takenaga等人，J Controlled Release1998 Mar 2；52(1-2)：81-7)和溶血磷脂酰甘油(美国专利5,725,871)输送药物在制药领域也是众所周知的。美国专利5,780,045也描述了聚四氟乙烯支持基质形式的说明性穿粘膜药物输送。
在某些实施方案中，利用脂质体、纳米胶囊(nanocapsules)、微粒、液体颗粒、囊泡等向合适的宿主细胞/生物导入本发明的组合物。特别是，为了输送可以配制包封于液体颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中的本发明的组合物。此外，本发明的组合物也能与载体表面共价或非共价结合。
脂质体和脂质体样制品的形成及作为可能的药物载体的应用为本领域技术人员所周知(参见，例如，Lasic，Trends Biotechnol 1998Jul；16(7)：307-21；Takakura，Nippon Rinsho 1998Mar；56(3)：691-5；Chandran等人，Indian J Exp Biol.1997Aug；35(8)：801-9；Margalit，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1995；12(2-3)：233-61；美国专利5,567,434；美国专利5,552,157；美国专利5,565,213；美国专利5,738,868和美国专利5,795,587，均在此引用作为参考)。
脂质体已经成功地用于通常难以用其它方法转染的大量细胞类型，包括T细胞悬液、原代肝细胞培养物和PC 12细胞(Renneisen等人，J Biol Chem.1990 Sep 25；265(27)：16337-42；Muller等人，DNA Cell Biol.1990 Apr；9(3)：221-9)。另外，脂质体没有基于病毒的输送系统所具有的DNA长度限制。脂质体已经有效地用于向多种培养细胞系和动物中导入基因、各种药物、放疗剂、酶、病毒、转录因子、变构效应物等。此外，脂质体的应用似乎与全身施用后的自身免疫反应或无法接受的毒性无关。
在某些实施方案中，由分散于水介质中的磷脂形成脂质体，并且自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。
或者，在其它实施方案中，本发明提供本发明的组合物的药学可接受的纳米胶囊制剂。纳米胶囊通常能以稳定和可重复的方式包封化合物(参见，例如，Quintanar-Guerrero等人，Drug Dev Ind Pharm.1998 Dec；24(12)：1113-28)。为了避免胞内聚合物过载引起的副作用，可以利用能在体内降解的聚合物设计这些超细颗粒(大小约为0.1μm)。能如Couvreur等人，Crit Rev Ther Drug Carrier Syst.1988；5(1)：1-20；zur Muhlen等人，Eur J Pharm Biopharm.1998Mar；45(2)：149-55；Zambaux等人，J Controlled Release 1998 Jan2；50(1-3)：31-40；和美国专利5,145,684所述制备这种颗粒。癌症治疗方法
在本发明的其它方面，此处所述的药用组合物可用于癌症的治疗，特别是乳腺癌的免疫治疗。在这些方法中，对患者，一般是温血动物，优选地是人，施用此处所述的药用组合物。患者可患有或未患癌症。因此，上述药用组合物可用于防止癌症的发展或治疗癌症患者。药用组合物和疫苗可在手术切除原发肿瘤和/或治疗(如施以放疗或常规化疗药物)之前或之后施用。如上所述，药用组合物可以通过静脉内、腹膜内、肌内、皮下、鼻内、真皮内、肛门、阴道、局部和口服途径施用。
在某些实施方案中，免疫治疗可以是主动免疫治疗，其中治疗依赖于施用免疫应答调节剂(如此处所述的多肽和多核苷酸)体内刺激内源宿主免疫系统，使之对肿瘤反应。
在其它实施方案中，免疫治疗也可以是被动免疫治疗，其中治疗包括施用具有明确的肿瘤免疫反应性的试剂(如效应细胞或抗体)，它们能直接或间接地介导抗肿瘤作用，而不必依赖完整的宿主免疫系统。效应细胞的例子包括如上所述的T细胞、T淋巴细胞(例如CD8+细胞毒性T淋巴细胞和CD4+T辅助肿瘤浸润淋巴细胞)、杀伤细胞(如自然杀伤细胞和淋巴因子活化的杀伤细胞)、B细胞或和表达此处所述的多肽的抗原递呈细胞(如树突细胞和巨噬细胞)。可以克隆、表达对于此处所述多肽特异的T细胞受体和抗体受体，并转移到其它载体或效应细胞中，进行过继免疫治疗。也可以利用此处所述的多肽产生抗体或抗独特型抗体(如美国专利号4,918,164所述)进行被动免疫治疗。
如此处所述，通过在体外生长，一般能获得足以进行过继免疫治疗的效应细胞。使单个抗原特异性效应细胞扩充为几十亿个而保留体内抗原识别能力的培养条件在本领域中周知。这些体外培养条件一般在细胞因子(如IL-2)和不分裂的饲养细胞存在下用抗原断续刺激。如上所述，此处所述的免疫反应性多肽可用来快速扩充抗原特异性T细胞培养物，以产生足以进行免疫治疗的细胞。特别是，抗原递呈细胞，如树突细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和/或B细胞，可以利用本领域周知的多种标准技术，用免疫反应性多肽脉冲，或用一种或多种多核苷酸转染。例如，抗原递呈细胞可用多核苷酸转染，该多核苷酸含有适于增强在重组病毒或其它表达系统中表达的启动子。在治疗中使用的培养的效应细胞必须能够生长且广泛分布，并能在体内长期存活。研究表明，通过用补充有IL-2的抗原重复刺激，能诱导培养的T细胞在体内生长，并且能大量地长期存活(参见，例如，CheeVer，M.等人，Immunological Reviews 157：177，1997)。
或者，也可将表达此处所述多肽的载体导入取自患者的抗原递呈细胞中，并离体克隆性繁殖，用于移植回同一患者。可以利用本领域周知的任何方法将转染细胞重新导入患者中，优选地以无菌形式通过静脉内、腔内、腹腔内或肿瘤内施用。
此处所述的治疗组合物的施用途径和频率以及剂量因个体而异，可用标准技术确定。药用组合物和疫苗通常通过注射(例如，皮内、肌内、静脉内或皮下)、鼻内(例如吸入)或经口施用。优选地，可在52周内施用1-10次。优选地，以1个月的间隔施用6次，之后可定期进行加强接种。备选方法可能适于个体患者。一种合适的剂量是，当如上所述施用时，能增强抗肿瘤免疫应答，并且比基础(即未处理)水平至少高10-50％的化合物的量。这种应答可如下监测：测量患者中的抗肿瘤抗体，或能在体外杀伤患者肿瘤细胞的溶细胞效应细胞的疫苗依赖的产生。这些疫苗应该也能引起免疫应答，致使接种患者的临床后果比未接种患者改善(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病存活)。通常，对于含有一种或多种多肽的药用组合物和疫苗，剂量中所含的每种多肽的量约为每kg宿主约25μg至5mg。合适的剂量大小因患者体重而异，但一般为约0.1mL至约5mL。
合适的剂量和治疗方案一般提供足以提供治疗和/或预防益处的量的活性化合物。通过确定治疗患者比未治疗患者改善的临床后果(例如，更频繁的缓解，完全或部分或更长的无病存活)，能监测这种反应。预先存在的对肿瘤蛋白免疫应答的增强一般与改善的临床结果相关。这些免疫应答一般可用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定法评价，这些方法可用治疗前和治疗后从患者中获得的样品进行。癌症检测和诊断组合物、方法和试剂盒
通常可根据在患者的生物样品(例如血液、血清、痰、尿和/或肿瘤活检)中存在一种或多种乳腺肿瘤蛋白和/或编码这些蛋白质的多核苷酸，检测患者的癌症。换言之，这些蛋白质可用作标志，表明癌症(如乳腺癌)的存在与否。另外，这些蛋白质也可用于检测其它癌症。此处所述的结合剂一般允许检测生物样品中可与该试剂结合的抗原水平。可以利用多核苷酸引物和探针检测编码肿瘤蛋白的mRNA水平，这也表明癌症的存在与否。乳腺肿瘤序列在肿瘤组织中的水平一般比正常组织中至少高3倍。
本领域技术人员已知多种测定法，利用结合剂检测样品中的多肽标志。参见，例如，Harlow和Lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室，1988。患者中癌症的存在与否通常如下确定：(a)将从患者中获得的生物样品与结合剂接触；(b)检测样品中可与该结合剂结合的多肽的水平；(c)将多肽水平与预定的截断值相比较。
在一个优选实施方案中，该测定法包括用固定于固体载体上的结合剂结合并从剩余的样品中除去多肽。然后可用一种含有报道基团并可与结合剂/多肽复合物特异结合的检测试剂检测结合的多肽。这些检测试剂可包括，例如，可与该多肽特异结合的结合剂，或可与结合剂特异结合的抗体或其它试剂，如抗免疫球蛋白、蛋白G、蛋白A或凝集素。或者，也可使用竞争测定法，其中多肽用报道基团标记，并在结合剂与样品温育后使之与固定的结合剂结合。样品成分抑制标记多肽与结合剂结合的程度表明样品对固定的结合剂的反应性。在这些测定法中使用的合适的多肽包括全长乳腺肿瘤蛋白，和如上所述可与结合剂结合的多肽部分。
固体载体可以是本领域技术人员所知的、肿瘤蛋白可以附着的任何材料。例如，固体载体可以是微量板中的检测孔，或硝酸纤维素或其它合适的膜。或者，载体也可以是珠或盘，如玻璃、玻璃纤维、胶乳或塑料材料，如聚苯乙烯或聚氯乙烯。载体也可以是磁粉或光纤传感器，如美国专利号5,359,681所公开的。可以利用专利和科学文献中详述的、本领域技术人员周知的多种技术将结合剂固定于固体载体上。在本发明中，术语“固定”是指非共价结合如吸附和共价结合(可以是试剂与载体上功能基团之间的直接键接，或者可以是通过交联剂的键接)。通过吸附固定于微量板孔或膜上是优选的。在这些情况中，可通过使适当缓冲液中的结合剂与固体载体接触适当时间实现这种吸附。接触时间因温度而异，但典型为约1小时至约1天。塑料微量板孔(如聚苯乙烯或聚氯乙烯)与约10ng至约10μg、优选地约100ng至约1μg的结合剂接触通常足以固定足量的结合剂。
结合剂与固体载体共价结合一般可如下实现：首先使载体与可与载体和结合剂的功能基团(如羟基或氨基)反应的双功能试剂反应。例如，用苯醌包被适当的聚合物，或通过载体上的醛基与结合配偶体上的氨和活性氢缩合，结合剂可与载体共价结合(参见，例如，Pierce免疫技术目录和手册，1991，A12-A13)。
在某些实施方案中，测定法是双抗体夹心测定。这种测定法可如下进行：首先使固定于固体载体(通常是微量板孔)上的抗体与样品接触，使样品中的多肽与固定的抗体结合。然后从固定的多肽-抗体复合物中除去未结合的样品，加入含有报道基团的检测试剂(优选地是能与该多肽上不同部位结合的第二抗体)。然后利用适于特定报道基团的方法测定结合于固体载体上的检测试剂的量。
更具体而言，一旦抗体固定于如上所述的载体上，一般就封闭载体上其余的蛋白质结合位点。可使用本领域技术人员周知的任何合适的封闭剂，如牛血清白蛋白或吐温20TM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)。然后使固定的抗体与样品一起温育，使多肽与抗体结合。在温育前样品可用合适的稀释剂如磷酸缓冲液(PBS)稀释。适当的接触时间(即温育时间)一般为足以检测到取自乳腺癌患者的样品中多肽存在的时间。优选地，接触时间足以实现一定水平的结合，至少为结合与未结合多肽之间平衡时所达到的水平的95％。本领域技术人员应认识到，通过测定一段时间中发生的结合水平可轻易地确定达到平衡所需的时间。在室温下，约30分钟的温育时间一般足够。
然后可利用合适的缓冲液(如含有0.1％吐温20TM的PBS)洗涤固体载体，去除未结合的样品。然后向固体载体上加入含有报道基团的第二抗体。优选的报道基团包括以上所述的基团。
然后将检测试剂与固定的抗体-多肽复合物温育，持续足以检测到结合多肽的一段时间。适当的时间长度一般可通过测定一段时间中发生的结合水平确定。然后去除未结合的检测试剂，并用报道基团检测结合的检测试剂。用于检测报道基团的方法取决于报道基团的性质。对于放射性基团，闪烁计数或放射自显影法一般是合适的。分光法可用来检测染料、发光基团和荧光基团。生物素可以用与不同报道基团(通常是放射性或荧光基团或酶)偶联的亲和素检测。酶报道基团一般可通过加入底物(一般经过特定的一段时间)，随后对反应产物进行分光光度分析或其它分析来检测。
为了确定癌症(如乳腺癌)的存在与否，通常将与固体载体结合的报道基团的检测信号与对应于预定的截断值的信号相比较。在一个优选实施方案中，检测癌症的截断值是当固定抗体与来自非癌症患者的样品温育后获得的平均信号。通常，产生的信号比预定截断值高三个标准差的样品被认为是癌症阳性。在另一个优选实施方案中，按照Sackett等人，《临床流行病学：临床医学基础科学》，Little Brownand Co.，1985，106-107的方法，用接收工作曲线(Receiver OperatorCurve)确定截断值。简言之，在该实施方案中，根据对应于诊断检查结果的每一可能截断值的成对真阳性率(即敏感度)和假阳性率(100％特异性)的图，可确定截断值。图上最接近左上角的截断值(即，包围最大面积的值)是最精确的截断值，产生的信号高于用该方法所确定的截断值的样品被认为是阳性。或者，截断值也可沿曲线左移，使假阳性率最低，或右移，使假阴性率最低。产生的信号高于用该方法确定的截断值的样品通常被认为是癌症阳性。
在一个相关实施方案中，以流通或条形试验形式进行测定，其中结合剂固定于膜(如硝酸纤维素)上。在流通试验中，当样品通过膜时，样品中的多肽与固定的结合剂结合。然后当含有第二结合剂的溶液流经该膜时，标记的第二结合剂与结合剂-多肽复合物结合。然后可如上所述对结合的第二结合剂进行检测。在条形试验中，与结合剂结合的膜的一端浸于含有样品的溶液中。样品沿膜迁移，通过含有第二结合剂的区域到达固定的结合剂区。固定抗体区域中第二结合剂的浓度表明癌症的存在。典型地，该部位中第二结合剂的浓度产生一种可目测的模式，如一条线。没有这种模式表明为阴性结果。一般选择固定于膜上的结合剂的含量，使得当生物样品含有足以在上述形式的双抗体夹心测定中产生阳性信号的多肽水平时，能产生可目视辨别的模式。在这些测定中使用的优选结合剂是抗体及其抗原结合片段。优选地，固定于膜上的抗体的量约25ng至约1μg，更优选地约50ng至约500ng。这些试验一般可用极少量的生物样品进行。
当然，存在大量其它测定方法适用本发明的肿瘤蛋白或结合剂。以上叙述只是旨在举例。例如，本领域技术人员应当明白，可容易地修改上述方法，利用肿瘤多肽检测生物样品中可与这些多肽结合的抗体。这些肿瘤蛋白特异性抗体的检测可能与癌症的存在有关。
也可或作为替代方案根据生物样品中存在与肿瘤蛋白特异反应的T细胞检测癌症。在某些方法中，从患者中分离的含有CD4+和/或CD8+T细胞的生物样品与肿瘤多肽、编码该多肽的多核苷酸和/或表达该多肽的至少一种免疫原性部分的APC温育，检测是否存在T细胞的特异激活。合适的生物样品包括但不限于分离的T细胞。例如，可用常规技术(如Ficoll/Hypaque密度梯度离心外周血淋巴细胞)从患者中分离T细胞。T细胞可在37℃下与多肽(例如5-25μg/ml)体外温育2-9天(一般4天)。可在不含肿瘤多肽的情况下温育另一等份T细胞样品，作为对照。对于CD4+T细胞，优选地通过评价T细胞增殖检测其激活。对于CD8+T细胞，优选地通过评价溶细胞活性检测其激活。增殖水平比无病患者至少高2倍和/或溶细胞活性至少高20％表明患者患有癌症。
如上所述，也可或作为替代方案根据生物样品中编码肿瘤蛋白的mRNA水平检测癌症。例如，在基于聚合酶链反应(PCR)的测定中可利用至少两条寡核苷酸引物扩增来源于生物样品的肿瘤cDNA的一部分，其中至少一条寡核酸引物对于编码肿瘤蛋白的多核苷酸特异(即，可与之杂交)。然后用本领域周知的技术(如凝胶电泳)分离并检测扩增的cDNA。类似地，在杂交测定中可以利用可与编码肿瘤蛋白的多核苷酸特异杂交的寡核苷酸探针检测生物样品中是否存在编码该肿瘤蛋白的多核苷酸。
为了可在测定条件下杂交，寡核苷酸引物和探针应当含有一种寡核苷酸序列，该序列与编码本发明的肿瘤蛋白的多核苷酸的一部分(长度至少为10个核苷酸，优选地至少20个核苷酸)有至少约60％、优选地至少约75％、更优选地至少约90％的一致性。优选地，在如上所述的中等严紧条件下，寡核苷酸引物和/或探针可与编码此处所述多肽的多核苷酸杂交。在此处所述的诊断方法中有用的寡核苷酸引物和/或探针长度优选地为至少10-40个核苷酸。在一个优选实施方案中，寡核苷酸引物含有具有此处公开序列的DNA分子的至少10个连续核苷酸，更优选地至少15个连续核苷酸。基于PCR的测定和杂交测定技术在本领域周知(参见，例如Mullis等人，Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.51：263，1987；Erlich编写，《PCR技术》，Stockton出版社，NY，1989)。
一种优选的测定使用RT-PCR，其中PCR与反转录联合使用。一般从生物样品(如活检组织)中提取RNA，并反转录产生cDNA分子。应用至少一条特异引物的PCR扩增可产生cDNA分子，它可利用如凝胶电泳分离并显示。可以对来自受试患者和未患癌症的患者的生物样品进行扩增。可以对横跨两个数量级的几个稀释度的cDNA进行扩增反应。受试患者样品的几个稀释度中的表达比非癌样品相同稀释度中的表达高两倍或以上一般认为是阳性。
在另一个实施方案中，此处所述的组合物可用作癌症进展的标志。在该实施方案中，如上所述用于癌症诊断的测定可以在一段时间内进行，并评价反应性多肽或多核苷酸水平的改变。例如，可以在6个月到1年时间内，每24-72小时进行测定，之后在需要时进行。在检测到多肽或多核苷酸水平随时间提高的患者中，癌症通常发展。相反，当反应性多肽或多核苷酸水平经一段时间仍恒定或降低时，癌症未发展。
可直接对肿瘤进行某些体内诊断测定。一种这样的测定包括使肿瘤细胞接触结合剂。然后可通过报道基团直接或间接检测结合的结合剂。这类结合剂也可用于组织学用途。此外，在这些用途中也可使用多核苷酸探针。
如上所述，为了提高灵敏度，可以测定一种给定样品中的多种肿瘤蛋白标志。显然，在一种测定中可以组合使用对于此处所述不同蛋白质特异的多种结合剂。而且，可以同时使用多种引物或探针。肿瘤蛋白标志的选择可基于常规实验以确定产生最佳灵敏度的组合。另外，测定此处所述的肿瘤蛋白可与测定其它已知肿瘤抗原相结合。
本发明还提供可在上述任何诊断方法中使用的试剂盒。这些试剂盒一般含有两种或多种进行诊断测定所必需的成分。这些成分可以是化合物、试剂、容器和/或装置。例如，试剂盒中的一个容器可含有一种可与肿瘤蛋白特异结合的单克隆抗体或其片段。这些抗体或片段可以与如上所述的支持材料结合。另外一个或多个容器可包封将在测定中使用的成分，如试剂或缓冲液。这些试剂盒也可含有如上所述的检测试剂，该试剂含有适于直接或间接检测抗体结合的报道基团。
或者，一种试剂盒可设计用来检测生物样品中编码肿瘤蛋白的mRNA的水平。这些试剂盒一般含有至少一种如上所述的寡核苷酸探针或引物，它可与编码肿瘤蛋白的多核苷酸杂交。这种寡核苷酸例如可在PCR或杂交测定中使用。这些试剂盒内可能含有的其它成分包括第二种寡核苷酸和/或诊断试剂或容器，以利于检测编码肿瘤蛋白的多核苷酸。
下列实施例只是为了说明，绝非意在限制。
                     实施例1
      使用差异显示RT-PCR制备乳腺肿瘤特异性cDNA
本实施例举例说明通过使用差异显示筛选方法制备编码乳腺肿瘤特异性多肽的cDNA分子。A.B18Ag1 cDNA的制备和mRNA表达的表征
从乳腺癌患者的乳腺肿瘤和正常组织中制备组织样品，其中所述乳腺癌患者是通过对从患者体内取出的乳腺组织进行病理学研究证实的。从样品中提取出正常RNA和肿瘤RNA，然后分离mRNA并使用3’锚定引物(dT)12AG(SEQ ID NO：130)将其转化成cDNA。然后使用随机选择的引物(CTTCAACCTC)(SEQ ID NO：103)进行差异显示PCR。扩增条件是含有1.5mM MgCl2的标准缓冲液、20pmol引物、500pmol dNTP和1单位Taq DNA聚合酶(Perkin-Elmer，Branchburg，NJ)。使用94℃变性30秒、42℃退火1分钟、72℃延伸30秒进行40个循环的扩增。获得含有76个扩增产物的RNA指纹。尽管乳腺肿瘤组织的RNA指纹与正常乳腺组织的RNA指纹有超过98％的是相同的，但特异于肿瘤的RNA指纹图谱的条带可重复观察到。将此条带从银染凝胶上切下，亚克隆至T载体(Novagen，Madison，WI)中并测序。
称作B18Ag1的cDNA的序列见SEQ ID NO：1。GENBANK和EMBL数据库检索说明，此初次克隆的B18Ag1片断与内源性人逆转录病毒元件S71有77％一致性，S71是与猿猴肉瘤病毒(SSV)同源的截短的逆转录病毒元件。S71含有不完全的gag基因、部分pol基因并在3’端有LTR样结构(见Werner等，Virology，174：225-238(1990))。B18Ag1也与SSV在相应于P30(gag)座位的区域中有64％一致性。B18Ag1含有三个分离的不完全的阅读框，其中包括了与多种感染哺乳动物的逆转录病毒的gag蛋白有相当大程度同源性的区域。此外，与S71的同源性不仅仅是在gag基因内，而是横跨几kb序列，包括LTR。
B18Ag1特异性PCR引物使用计算机分析指南合成。RT-PCR扩增(94℃，30秒；60℃→42℃，30秒；72℃，30秒；40个循环)证实B18Ag1代表在患者乳腺肿瘤组织中以相对高水平存在的真实mRNA序列。扩增所用引物在3.5mM镁浓度和pH8.5下是B18Ag1-1(CTG CCT GAG CCACAA ATG)(SEQ ID NO：128)和B18Ag1-4(CCG GAG GAG GAA GCT AGAGGA ATA)(SEQ ID NO：129)，而在2mM镁浓度和pH9.5下是B18Ag1-2(ATG GCT ATT TTC GGG GCC TGA CA)(SEQ ID NO：126)和B18Ag1-3(CCGGTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQ ID NO：127)。相同的实验显示在该患者的正常乳腺组织中表达水平从非常的低至不存在(见图1)。然后使用RT-PCR实验证明B18Ag1 mRNA存在于另9个乳腺肿瘤样品(来自巴西和美国患者)中，但在各癌症患者的相应正常乳腺组织中不存在或存在的水平非常低。RT-PCR分析还显示在多种正常组织(包括淋巴结、心肌和肝脏)中不存在B18Ag1转录本，在PBMC和肺组织中存在相对低水平的B18Ag1转录本。Northern印迹分析证实乳腺肿瘤样品中存在B18Ag1 mRNA而在正常乳腺组织中不存在B18Ag1 mRNA，见图2。
B18Ag1在乳腺肿瘤组织中的差异表达也通过RNase保护试验得以证实。图3显示了通过四个不同的RNase保护试验确定的B18Ag1mRNA在各种类型组织中的水平。泳道1-12表示各种正常乳腺组织样品，泳道13-25表示各种乳腺肿瘤样品；泳道26-27表示正常前列腺样品；泳道28-29表示前列腺肿瘤样品；泳道30-32表示结肠肿瘤样品；泳道33表示正常主动脉；泳道34表示正常小肠；泳道35表示正常皮肤；泳道36表示正常淋巴结；泳道37表示正常卵巢；泳道38表示正常肝脏；泳道39表示正常骨骼肌；泳道40表示第一正常胃样品；泳道41表示第二正常胃样品；泳道42表示正常肺；泳道43表示正常肾；泳道44表示正常胰腺。在每个试验中包括阳性对照RNA(已知的β肌动蛋白信息丰度)并相对此阳性对照标化不同试验的结果，从而便于实验间的比较。
RT-PCR和Southern印迹分析显示B18Ag1座位以单拷贝内源性逆转录病毒元件的形式存在于人基因组DNA中。使用此最初的B18Ag1序列作为探针分离到大约12-18kb的基因组克隆。通过XbaI消化还分离到4个额外的亚克隆。从这些克隆的XbaI消化物的末端得到的另外逆转录病毒序列(位置显示在图4中)显示在SEQ ID NO：3至SEQ IDNO：10中，其中SEQ ID NO：3显示了在图4中标记为10的位置的序列，SEQ ID NO：4显示了标记为11-29的位置的序列，SEQ ID NO：5显示了标记为3的位置的序列，SEQ ID NO：6显示了标记为6的位置的序列，SEQ ID NO：7显示了标记为12的位置的序列，SEQ ID NO：8显示了标记为13的位置的序列，SEQ ID NO：9显示了标记为14的位置的序列，SEQ ID NO：10显示了标记为11-22的位置的序列。
随后的研究证实此12-18kb的基因组克隆中含有约7.75kb的逆转录病毒元件，见图5A和5B。此逆转录病毒元件的序列显示在SEQID NO：141中。图5A顶端的带数字的线表示此逆转录病毒基因组克隆的有义链序列。该线下方的框显示了所选限制性位点的位置。箭头指示用于对此逆转录病毒元件进行测序的不同重叠克隆。箭头方向显示此单向(single-pass)亚克隆序列是相应于有义还是反义链。图5B是含有B18Ag1的逆转录病毒元件的示意图，其中描述了病毒基因在此元件中的组织。空白框相应于在此整个元件中寻找到的预测的阅读框，其起始于甲硫氨酸。6个可能的阅读框均被显示出来，表示在框的左侧，阅读框1-3相应于有义链上发现的那些阅读框。
使用SEQ ID NO：1的cDNA作为探针，得到更长的cDNA，与SEQ IDNO；141所示基因组序列相比其含有微小的核苷酸差异(小于1％)。B.编码其它乳腺肿瘤特异性多肽的cDNA分子的制备
按上述方法，制备正常RNA和肿瘤RNA，分离mRNA并使用(dT)12AG3’锚定引物将其转化成cDNA。然后使用随机选择的引物SEQ IDNO：87-125进行差异显示PCR。扩增条件见上，将所观察到的特异于肿瘤RNA指纹图谱的条带从银染凝胶上切下，亚克隆至T载体(Novagen，Madison，WI)或pCRII载体(Invitrogen，San Diego，CA)中并测序。序列提供在SEQ ID NO：11至SEQ ID NO：86。分离的79个序列中，67个被发现是新的(SEQ ID NO：11-26及28-77)(也参见图6-20)。
在其它的研究中得到抗原B15Ag1(SEQ ID NO：27中提供了最初鉴定的部分序列)的延长的DNA序列(SEQ ID NO：290)。SEQ ID NO：290序列与上述Genebank中的序列的比较显示了与已知人β-A活化素基因的同源性。进一步研究导致分离到抗原B21GT2(又称作B311D；SEQ IDNO：56中显示了最初鉴定的部分cDNA序列)的全长cDNA序列。此全长序列见SEQ ID NO：307，相应的氨基酸序列提供在SEQ ID NP：308中。其它研究导致分离到B311D的拼接变体。对SEQ ID NO：316的B311D克隆进行了测序，从该克隆中凝胶纯化XhoI/NotI片断，通过随机引发标记上32P-cDTP，然后用作探针以进一步筛选获得其它B311D基因序列。使用标准技术筛选了人乳腺肿瘤cDNA细菌文库的两个部分。以此方式分离到的其中一个克隆产生包括poly A+尾的其它序列。测定的此克隆的cDNA序列(称作B311D_BT1_1A)见SEQ ID NO：317。SEQ IDNO；316和317序列被发现在一个464bp的区域中有一致性，而在SEQ IDNO：317的poly A+序列附近序列开始不同。
随后的研究鉴定到另外的146个序列(SEQ ID NO；142-289)，其中115个序列似乎是新的(SEQ ID NO：142，143，146-152，154-166，168-176，178-192，194-198，200-204，206，207，209-214，216，218，219，221-240，243-245，247，250，251，253，255，257-266，268，269，271-273，275，276，278，280，281，284，288和291)。就本发明人所知，此前尚没有先前鉴定到的序列在人乳腺肿瘤组织中比在正常乳腺组织中表达水平高。
在其它研究中，分离到抗原B11Ag1(又称作B305D)的几种不同的拼接形式，各拼接形式都含有稍微不同版本的B11Ag1编码框。拼接的接头序列确定了各个外显子，它们以不同的方式和排列构成了不同的拼接形式。我们设计了引物，通过RT-PCR检验各个外显子的表达方式，见下文。所有的外显子均被发现表现出与最初的B11Ag1克隆相同的表达方式，表达是乳腺肿瘤、正常前列腺和正常睾丸特异的。此分离到的蛋白质编码外显子的确定的cDNA序列分别提供在SEQ IDNO：292-298中。相应于SEQ ID NO：292和298序列的预测的氨基酸序列提供在SEQ ID NO：299和300。使用cDNA末端的快速扩增(RACE)、针对上述的一个B11Ag1拼接形式的5’特异引物和乳腺癌进行的其它研究导致分离到三个其它的相关拼接形式，称作同工型B11C-15、B11C-8和B11C-9，16。这些同工型的确定的cDNA序列提供在SEQ IDNO：301-303中，相应的预测氨基酸序列提供在SEQ ID NO：304-306中。
将B11C-15的蛋白质编码区域(SEQ ID NO；301；又称作B305D同工型C)用作查询序列，在Genbank DNA数据库中进行BLASTN检索。发现与来自21号染色体(登录号AP001465)的基因组克隆匹配。使用BLASTN输出结果中提供的两两比对来确定相应于B305D序列的21号染色体序列中的推测的外显子，或编码序列。基于BlastB的两两比对，将GeneBank记录AP001465的以下片断装配在一起：碱基对第67978-68499位、第72870-72987位、第73144-73335位、第76085-76206位、第77905-78085位、第80520-80624位、第87602-87633位。然后使用DNA Star Seqman程序对此序列与B305D同工型C序列进行比对，并以一定方式删除多余的序列以便保持与B305D最相似的序列。21号染色体序列的此最后编辑形式与B305D有96.5％一致性。然后翻译从21号染色体得到的此编辑序列，发现除了在与B305D的终止密码子的相同位置含有最终的终止密码子外，其不含终止密码子。与B305D相同，21号染色体序列(见SEQ ID NO：325)编码具有384个氨基酸的蛋白质(SEQ ID NO：326)。该蛋白质与B305D同工型C蛋白质(SEQ ID NO：304)的比对显示出90％的氨基酸一致性。
通过检索高通量基因组序列(HTGS)数据库(NCBI，NationalInstitutes for Health，Bethesda，MD)，使用B305D同工型C的cDNA序列(SEQ ID NO：301)鉴定同系物。在2号染色体(克隆ID 9838181)、10号染色体(克隆ID 10933022)、15号染色体(克隆ID 11560284)上鉴定到同系物。这些同系物在核酸水平上与B305D同工型C有大于90％的一致性。所有这3个同系物均编码384个氨基酸的ORF，这些ORF与SEQ ID NO：304的氨基酸序列有大于90％的一致性。使用SEQ IDNO：301对Genebank数据库进行的其它检索在22号染色体(克隆ID5931507)上得到一个部分序列同系物。根据与B305D同工型C的同源性以及内含子-外显子接头处的保守序列，我们构建了2、10、15和22号染色体同系物的cDNA序列。22、2、15和10号染色体同系物的cDNA序列分别提供在SEQ ID NO：327-330中，相应的氨基酸序列分别提供在SEQ ID NO：331、334、333和332中。
在随后对B305D同工型A(cDNA序列见SEQ ID NO：292)的研究中，发现cDNA序列(见SEQ ID NO：313)在第884位含有一个额外鸟嘌呤残基，导致在开放式阅读框中发生移框。此ORF的确定的DNA序列见SEQ ID NO：314。此移框产生了一个具有293个氨基酸的蛋白质序列(见SEQ ID NO：315)，其含有与B305D的其它同工型相同的C端域，但不同的N端域。
                      实施例2
            从人基因组DNA制备B18Ag1 DNA
本实施例举例说明了通过扩增从人基因组DNA制备B18Ag1 DNA。
可以使用20pmol B18Ag1特异的引物、500pmol dNTP和1单位的Taq DNA聚合酶(Perkin Elmer，Branchburg，NJ)，以及以下扩增参数从250ng人基因组DNA制备B18Ag1 DNA：94℃变性30秒，60℃至42℃降落退火(touchdown annealing)30秒(每两个循环变化2℃)，和72℃延伸30秒。达到最后增量(42℃退火温度)后，应循环25次。使用计算机分析选择引物。合成的引物是B18Ag1-1、B18Ag1-2、B18Ag1-3和B18Ag1-4。可以使用的引物对是1+3、1+4、2+3和2+4。
凝胶电泳后，可以将相应于B18Ag1 DNA的条带切下，并克隆至适宜的载体中。
                      实施例3
           从乳腺肿瘤cDNA中制备B18Ag1 DNA
本实施例举例说明从人乳腺肿瘤cDNA中通过扩增制备B18Ag1DNA。
在如下反应混合物中从来自人乳腺肿瘤组织的RNA合成第一链cDNA，所述反应混合物含有500ng polyA+RNA、200pmol引物(T)12AG(即TTT TTT TTT TTT AG)(SEQ ID NO：130)、1×第一链逆转录酶缓冲液、6.7mM DTT、500mmol dNTP和1单位AMV或MMLV逆转录酶(可来自供应商，如Gibco-BRL(Grand Island，NY))，终体积30μl。第一链合成后，将cDNA稀释约25倍，使用1μl按实施例2所述进行扩增。尽管某些引物对会导致不均一的转录本群体，但引物B18Ag1-2(5’ATG GCT ATT TTC GGG GGC TGA CA)(SEQ ID NO：126)和B18Ag1-3(5’CCG GTA TCT CCT CGT GGG TAT T)(SEQ ID NO：127)产生单一的151bp扩增产物。
                     实施例4
           鉴定B18Ag1的B细胞和T细胞表位
本实施例举例说明了B18Ag1表位的鉴定。
可以使用多种计算机算法筛选B18Ag1序列。为了确定B细胞表位，可以使用Hopp，Prog.Clin.Biol.Res.172B：367-77(1985)的方法或者另一方案，Cease等，J.Exp.Med.164：1779-84(1986)或Spouge等，J.Immunol.138：204-12(1987)的方法，根据疏水性和亲水性值筛选序列。其它的II型MHC(抗体或B细胞)表位可以使用程序如AMPH(例如，Margalit等，J.Immunol.138：2213(1987))或Rothbard和Taylor(例如，EMBO J.7：93(1988))的方法进行预测。
一旦使用这些技术鉴定到肽(长15-20个氨基酸)，即可以使用自动肽合成装置(来自厂商如Perkin Elmer/Applied BiosystemsDivision，Foster City，CA)和诸如Merrifield合成等方法合成各肽。合成后，可以使用这些肽筛选从正常或乳腺癌患者收获的血清，以确定乳腺癌患者是否具有与这些肽反应的抗体。该抗体在乳腺癌患者中的存在将证实所述特异性B细胞表位的免疫原性。还可以测试这些肽在进行体内免疫后在动物(小鼠、大鼠、兔、黑猩猩)体内引起血清学或体液免疫的能力。免疫后肽特异性抗血清的产生将进一步证实所述特异性B细胞表位的免疫原性。
为了鉴定T细胞表位，可以使用不同的计算机算法筛选B18Ag1序列，所述算法可用于鉴定B18Ag1序列中能够与HLA I型MHC分子结合的8-10个氨基酸基序。(见如Rammensee等，Immunogenetics41：178-228(1995))。合成后，可以使用标准结合试验(例如Sette等，J.Immunol.153：5586-92(1994))测试这些肽结合I型MHC的能力，更重要的是可以使用如Bakker等，Cancer Res.55：5330-34(1995)；Visseren等，J.Immunol.154：3991-98(1995)；Kawakami等，J.Immunol.154：3961-68(1995)和Kast等，J.Immunol.152：3904-12(1994)的方法，在体外刺激患者或正常外周单个核细胞后测试这些肽产生抗原反应性细胞毒T细胞的能力。体外肽刺激后，能够杀死自体(带有相同的I型MHC分子)肿瘤细胞的T细胞在体外的成功产生进一步证实了B18Ag1抗原的免疫原性。而且，这些肽可以用于制备鼠源肽和在对小鼠(带有表达特定人I型MHC单倍型的转基因)(Vitiello等，J.Exp.Med.173：1007-15(1991))进行体内免疫后产生B18Ag1反应性细胞毒T细胞。
根据预测的HLA I型MHC结合抗原划分，以下显示了预测的B18Ag1 B细胞和T细胞表位的代表性列表：
预测的Th基序(B细胞表位)(SEQ ID NO：131-133)
          SSGGRTFDDFHRYLLVGI
          QGAAQKPINLSKXIEVVQGHDE
          SPGVFLEHLQEAYRIYTPFDLSA
预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)(SEQ ID NO：134-140)
          YLLVGIQGA
          GAAQKPINL
          NLSKXIEVV
          EVVQGHDES
          HLQEAYRIY
          NLAFVAQAA
          FVAQAAPDS
                       实施例5
               鉴定B11Ag1的T细胞表位
本实施例举例说明B11Ag1(又称作B305D)表位的鉴定。从B11Ag1基因得到4个肽，称作B11-8、B11-1、B11-5和B11-12(分别是SEQID NO：309-312)。
根据Van Tsai等(Critical Review in Immunology 18：65-75，1998)的操作方法，使用树突细胞体外使人CD8 T细胞接触抗原肽B11-8。测试所获CD8 T细胞培养物识别B11-8肽或阴性对照肽(通过B-LCL JY系呈递)的能力。简而言之，将T细胞与自体单核细胞在10μg/ml肽、10ng/ml Il-7和10μg/ml IL-2存在时一起孵育，然后在标准51-Cr释放试验中分析它们特异裂解靶细胞的能力。正如图22所示，大量的培养细胞系证实对B11-8肽的识别强，对肽B11-1的识别较弱。
在使用单克隆抗体OKT3和人IL-2进行快速扩充后，分离来自此CTL系的克隆。正如图23所示，该克隆(又称A1)除了能够识别特异肽外，还识别转导了B11Ag1基因的JY LCL。此数据说明，B11-8是B11Ag1基因的天然加工产生的表位。此外，这些T细胞还被发现可以以HLA-A2限制性方式识别和裂解天然表达B11Ag1的确立肿瘤细胞系(图24)。该T细胞对天然表达B11Ag1并转导了HLA-A2的肺腺癌(LT-140-22)、及转导了B11Ag1的A2+乳腺癌(CAMA-1)有强的识别，但不识别未转导的细胞系和另一阴性肿瘤细胞系(SW620)。
这些数据清楚地表明，这些人T细胞不仅识别B11特异性肽且识别转导的细胞，以及天然表达的肿瘤细胞系。
使用上述方法针对抗原B11-5和B11-12产生CTL系，发现该CTL系识别相应肽包被的靶标。
                    实施例6
       表征通过差异显示PCR发现的乳腺肿瘤基因
使用RT-PCR确定通过差异显示PCR发现的乳腺肿瘤基因的特异性和灵敏性。该方法使得不需使用大量的RNA可以快速地半定量评价乳腺肿瘤基因mRNA的表达。使用基因特异引物，检测mRNA在多种组织中的表达水平，包括8个乳腺肿瘤、5个正常乳腺、2个前列腺肿瘤、2个结肠肿瘤、1个肺肿瘤，和14个其它的正常成年人组织，包括正常前列腺、结肠、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰腺、骨骼肌、皮肤、胃和睾丸。
为了确保RT-PCR的半定量性质，使用β-肌动蛋白作为所有测试组织的内对照。制备第一链cDNA的系列稀释物，使用β-肌动蛋白特异引物进行RT-PCR分析。然后选择能够在线性范围扩增β-肌动蛋白模板、并足够灵敏以能反映最初拷贝数差异的稀释物。使用此条件，确定每个组织的每个逆转录反应中β-肌动蛋白的水平。通过DNase处理、以及通过确保使用不加逆转录酶的情况下制备的第一链cDNA时得到阴性结果，使DNA污染达到最小。
使用基因特异引物，在多种组织中确定mRNA表达水平。至今，已经成功地通过RT-PCR测定了38个基因，其中5个表现出对乳腺肿瘤有良好的特异性和灵敏性(B15AG-1，B13GA1b，B38GA2a，B11A1a和B18AG1a)。图21A和21B描述了其中3个基因的结果：B15AG-1(SEQ IDNO：27)、B13GA1b(SEQ ID NO：148)和B38GA2a(SEQ ID NO：157)。表I总结了所有测试基因在正常乳腺组织和乳腺肿瘤中，以及在其它组织中的表达水平。
                      表I
      在多种组织中表达的乳腺癌抗原的百分数
乳腺组织     乳腺肿瘤中超量表达     84％
    正常组织和肿瘤中等同表达     16％
其它组织     在乳腺肿瘤中超量表达但在所有正常组织中均无表达     9％
    在乳腺肿瘤中超量表达但在某些正常组织中表达 30％
    在乳腺肿瘤中超量表达但在所有其它组织中等同表达 61％
                      实施例7
           制备和表征抗乳腺肿瘤多肽的抗体
按如下制备抗乳腺肿瘤抗原B305D的多克隆抗体。
摇动温箱中37℃下在带有适当抗生素的LB液体培养基中过夜培养表达乳腺肿瘤抗原的大肠杆菌(E.coli)重组表达系统。第二日早上，向2L带档板的三角瓶内的500ml加有适当抗生素的2×YT中加入10ml过夜培养物。在培养物的光密度(560nm)达到0.4-0.6时，用IPTG(1mM)诱导细胞。用IPTG诱导后4小时，通过离心收获细胞。然后用磷酸缓冲盐水洗涤细胞并再次离心。丢弃上清液，将细胞冷冻以便将来使用，或立即处理细胞。向细胞沉淀加入20ml裂解缓冲液，并涡旋振荡。为了破裂大肠杆菌细胞，然后在16,000psi压力下使此混合物通过French Press。然后再次离心细胞，通过SDS-PAGE检测上清液和沉淀以区分重组蛋白。对于定位于细胞沉淀中的蛋白质，将沉淀重悬在10mM Tris pH8.0，1％CHAPS中，此包含体沉淀并再次离心。重复此过程两次以上。使用含有8M尿素或6M盐酸胍并含有10mM咪唑的10mM Tris pH8.0，溶解洗涤的包含体。将溶解的蛋白质加入5ml镍螯合树脂(Qiagen)中，室温连续搅动下孵育45分钟至1小时。孵育后，使树脂和蛋白质混合物流过一次性柱，收集流过物。然后用10-20倍柱体积的增溶缓冲液洗涤柱子。然后使用8M尿素、10mMTris pH8.0和300mM咪唑从柱子中将抗原洗脱下来，收集在3ml的组分中。进行SDS-PAGE凝胶电泳以确定将哪些组分汇合用于进一步纯化。
作为最后的纯化步骤，使用适当的缓冲液平衡强阴离子交换树脂如HiPrepA(Biorad)，将来自上面的汇合的组分上柱。用递增的盐梯度将抗原从柱子上洗脱下来。在过柱时收集组分，再次进行SDS-PAGE凝胶电泳以确定将来自柱子的哪些组分汇合在一起。将汇合的组分对10mM Tris pH8.0透析。然后通过0.22微米滤器过滤后将蛋白质装入小瓶，并将抗原冷冻直到需要进行免疫时为止。
将400μg B305D抗原和100μg胞壁酰二肽(MDP)合并。每隔4周用混合了等体积弗氏不完全佐剂(IFA)的100μg抗原加强免疫兔。每次加强后7天，采集动物血液。通过4℃孵育血液12-24小时，之后离心制备血清。
通过4℃与50μl(典型地1μg)重组蛋白孵育20小时，用B305D抗原包被96孔板。向孔中加入250μl BSA封闭缓冲液，并室温孵育2小时。用PBS/0.01％Tween洗涤板子6次。将兔血清稀释在PBS中。向每孔中加入50μl稀释的血清，并室温孵育30分钟。按上述洗涤板子，之后加入1∶10000稀释的50μl山羊抗兔辣根过氧化物酶(HRP)，并室温孵育30分钟。再次按上述洗涤板子，向每孔加入100μl TMB微孔过氧化物酶底物。室温暗处孵育15分钟后，用100μl 1N H2SO4终止显色反应，立即在450nm读数。多克隆抗体显示对B305D的免疫反应性。
按以下对B305D在乳腺癌和正常乳腺样品中的表达进行免疫组织化学(IHC)分析。将石蜡包埋甲醛固定的组织切成8μm切片。对于最佳染色条件，使用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH6.0)中的蒸汽热诱导的表位挽救(Steam heat induced epitope retrieval，SHIER)。切片与10％血清/PBS一起孵育5分钟。向每个切片中加入一抗至指定浓度，孵育25分钟，之后与抗兔或抗鼠生物素酰化的抗体一起孵育25分钟。通过与过氧化氢一起孵育1.5分钟3次，封闭内源性过氧化物酶的活性。使用亲和素生物素复合物/辣根过氧化物酶(ABC/HRP)系统以及DAB生色原(chromagen)以显现抗原表达。用苏木精对切片进行复染。在乳腺肿瘤和正常乳腺组织均检测到B305D的表达。然而，染色强度在正常样品中比在肿瘤样品中低得多，而且，仅在乳腺肿瘤组织中观察到B305D的表面表达。
在多种正常组织中对B305D表达的实时PCR和免疫组织化学分析结果总结在下表II中。这些结果说明在睾丸中B305D的表达很少，在胆囊中没有得到结论性的结果，而在检测的所有其它组织中均没有检测到B305D的表达。
                                  表II
    mRNA    IHC染色     组织类型     总结
    中等阳性     阳性     睾丸     少数精子细胞的细胞核染色；精子阴性；siminoma阴性
    阴性     阴性     胸腺     无表达
    N/A     阴性     动脉     无表达
    阴性     阴性     骨骼肌     无表达
    阴性     阳性(弱染色)     小肠     无表达
    阴性     阳性(弱染色)     卵巢     无表达
    阴性     垂体     无表达
    阴性     阳性(弱染色)     胃     无表达
    阴性     阴性     脊髓     无表达
    阴性     阴性     脾脏     无表达
    阴性     阴性     输尿管     无表达
    N/A     阴性     胆囊     不确定
    N/A     阴性     胎盘     无表达
    阴性     阴性     甲状腺     无表达
    阴性     阴性     心脏     无表达
    阴性     阴性     肾脏     无表达
    阴性     阴性     肝脏     无表达
    阴性     阴性     脑-小脑     无表达
    阴性     阴性     结肠     无表达
    阴性     阴性     皮肤     无表达
    阴性     阴性     骨髓     无表达
    N/A     阴性     甲状旁腺     无表达
    阴性     阴性     肺     无表达
    阴性     阴性     食道     无表达
    阴性     阳性(弱染色)     子宫     无表达
    阴性     阴性     肾上腺     无表达
    阴性     阴性     胰腺     无表达
    N/A     阴性     淋巴结     无表达
    阴性     阴性     脑-皮层     无表达
    N/A     阴性     输卵管     无表达
    阴性     阳性(弱染色)     膀胱     无表达
    阴性     N/A     骨骼     无表达
    阴性     N/A     唾液腺     无表达
    阴性     N/A     激活的PBMC     无表达
    阴性     N/A     静息PBMC     无表达
    阴性     N/A     气管     无表达
    阴性     N/A     腔静脉     无表达
    阴性     N/A     视网膜     无表达
    阴性     N/A     软骨     无表达
                      实施例8
              乳腺肿瘤抗原的蛋白质表达
本实施例描述了乳腺肿瘤抗原B305D在大肠杆菌和哺乳动物细胞中的表达和纯化。
通过将B305D同工型C-15的开放式阅读框克隆在pET17b中位于M.tuberculosis抗原Ra12(SEQ ID NO：318)头30个氨基酸的下游，在大肠杆菌中实现B305D同工型C-15(SEQ ID NO：301；翻译成384个氨基酸)的表达。首先，将B305D ORF中的内部EcoRI位点突变但不改变蛋白质序列，以便能够将该基因和Ra12克隆在EcoRI位点。用于定点诱变的PCR引物显示在SEQ ID NO：319(又称作AW012)和SEQ IDNO：320(又称作AW013)。然后通过PCR使用引物AW014(SEQ ID NO：321)和AWO15(SEQ ID NO：322)扩增EcoRI位点经修饰的B305D的ORF。用EcoRI消化PCR产物，将其连接至Ra12/Pet17b载体的EcoRI位点中。所获融合结构(又称作Ra12mB11C)的序列通过DNA测序得以证实。测定的融合结构的cDNA序列提供在SEQ ID NO：323中，氨基酸序列提供在SEQ ID NO：324中。
将融合结构转化至BL21(DE3)CodonPlus-RIL大肠杆菌(Stratagene)中，在含有卡那霉素的LB液体培养基中培养过夜。用IPTG诱导所获培养物。将蛋白质转移至PVDF膜上并用5％脱脂奶(在PBS-Tween缓冲液中)封闭，洗涤三次后与小鼠抗His标签抗体(Clontech)孵育1小时。洗涤该膜3次，并用HRP-蛋白A(Zymed)探测30分钟。最后，洗膜3次并用ECL(Amersham)显色。通过Western印迹检测到表达。
对于哺乳动物细胞中的重组表达，将B305D同工型C-15(SEQ IDNO：301；翻译为384个氨基酸)亚克隆至哺乳动物表达载体pCEP4和pcDNA3.1(Invitrogen)中。使用Fugene 6试剂(Roche)将这些结果转染至HEK293细胞(ATCC)中。简而言之，以100,000个细胞/ml的密度将HEK细胞接种在含有10％FBS(Hyclone)的DMEM(Gibco)中，并培养过夜。第二日，将2μl Fugene 6加入不含FBS的100μl DMEM中，室温孵育15分钟。将Fugene 6/DMEM混合物加入1μg B305D/pCEP4或B305D/pcDNA质粒DNA中，室温孵育15分钟。然后将Fugene/DNA混合物加入HEK293细胞中，37℃在7％CO2中孵育48至72小时。用PBS洗涤细胞，通过离心收集沉淀。
对于Western印迹分析，通过在含有Triton-X100的裂解缓冲液中冰上孵育细胞30分钟，制备全细胞裂解物。然后通过10,000rpm下4℃离心5分钟澄清裂解物。用含有β-巯基乙醇的SDS-PAGE上样缓冲液稀释样品，并在上SDS-PAGE凝胶前将其煮沸10分钟。将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上并用以蛋白A纯化的1μg/ml浓度的抗B305D兔多克隆血清(按上述制备)进行探测。用HRP偶联的山羊抗兔Ig显示该印迹，之后在ECL底物中孵育。在用B305D转染的HEK293裂解物中检测到B305D的表达，但在用单纯载体转染的对照HEK293细胞中未见表达。
对于FACS分析，用冰冷的染色缓冲液进一步洗涤细胞，然后与1∶100稀释的山羊抗兔Ig(H+L)-FITC试剂(Southern Biotechnology)在冰上孵育30分钟。3次洗涤后，将细胞重悬在含有碘化丙锭(PI)(一种允许鉴定可通透细胞的活性染料)的染色缓冲液中，然后通过FACS进行分析。FACS分析显示B305D蛋白质的表面表达。
从上述，应当理解，尽管为了举例说明的目的本文中描述了本发明的特定实施方案，但可以进行多种修饰而不偏离本发明的精神和范围。因此，本发明仅受所附权利要求书的限制。
              序列表
                           序列表
<110>Corixa Corporation
     Frudakis，Tony N.
     Reed，Steven G.
     Smith，John M.
     Misher，Linda E.
     Dillon，Davin C.
     Retter，Marc W.
     Wang，Aijun
     Skeiky，Yasir A.W.
     Harlocker，Susan L.
     Day，Craig H.
<120>用于治疗和诊断乳腺癌的组合物和方法
<130>210121.41930PC
<140>PCT
<141>2001-05-22
<160>334
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>363
<212>DNA
<213>人(Homo sapien)
<400>1ttagagaccc aattgggacc taattgggac ccaaatttct caagtggagg gagaactttt     60gacgatttcc accggtatct cctcgtgggt attcagggag ctgcccagaa acctataaac    120ttgtctaagg cgattgaagt cgtccagggg catgatgagt caccaggagt gtttttagag    180cacctccagg aggcttatcg gatttacacc ccttttgacc tggcagcccc cgaaaatagc    240catgctctta atttggcatt tgtggctcag gcagccccag atagtaaaag gaaactccaa    300aaactagagg gattttgctg gaatgaatac cagtcagctt ttagagatag cctaaaaggt    360ttt                                                                  363
<210>2
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>2Leu Glu Thr Gln Leu Gly Pro Asn Trp Asp Pro Asn Phe Ser Ser Gly1               5                  10                  15Gly Arg Thr Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln
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<222>(1)…(321)
<223>n＝A，T，C或G
<400>73gcactgagag gaacttcaga gagagagaga gagttccacc ctgtacttgg ggagagaaac     60agaaggtgag aaagtctttg gttctgaagc agcttctaag atcttttcat ttgcttcatt    120tcaaagttcc catgctgcca aagtgccatc ctttggggta ctgttttctg agctccagtg    180ataactcatt tatacaaggg agatacccag aaaaaaagtg agcaaatctt aaaaaggtgg    240cttgagttca gccttaaata ccatcttgaa atgacacaga gaaagaanga tgttgggtgg    300gagtggatag agaccctaac g                                              321
<210>74
<211>321
<212>DNA
<213>人
<400>74gcactgagag gaacttcaga gagagagaga gagttccacc ctgtacttgg ggagagaaac     60agaaggtgag aaagtctttg gttctgaagc agcttctaag atcttttcat ttgcttcatt    120tcaaagttcc catgctgcca aagtgccatc ctttggggta ctgttttctg agctccagtg    180ataactcatt tatacaaggg agatacccag aaaaaaagtg agcaaatctt aaaaaggtgg    240cttgagttca gycttaaata ccatcttgaa atgamacaga gaaagaagga tgttgggtgg    300gagtggatag agaccctaac g                                              321
<210>75
<211>317
<212>DNA
<213>人
<400>75gcactgagag gaacttccac atgcactgag aaatgcatgt tcacaaggac tgaagtctgg     60aactcagttt ctcagttcca atcctgattc aggtgtttac cagctacaca accttaagca    120agtcagataa ccttagcttc ctcatatgca aaatgagaat gaaaagtact catcgctgaa    180ttgttttgag gattagaaaa acatctggca tgcagtagaa attcaattag tattcatttt    240cattcttcta aattaaacaa ataggatttt tagtggtgga acttcagaca ccagaaatgg    300gagtggatag agaccct                                                   317
<210>76
<211>244
<212>DNA
<213>人
<400>76cgttagggtc tctatccact cccactactg atcaaactct atttatttaa ttatttttat     60catactttaa gttctgggat acacgtgcag catgcgcagg tttgttgcat aggtatacac    120ttgccatggt ggtttgctgc acccatcagt ccatcatcta cattaggtat ttctcctaat    180gctatccctc ccctagcccc ttacaccccc aacaggctct agtgtgtgaa gttcctctca    240gtgc                                                                 244
<210>77
<211>254
<212>DNA
<213>人
<400>77cgttagggtc tctatccact gaaatctgaa gcacaggagg aagagaagca gtyctagtga     60gatggcaagt tcwtttacca cactctttaa catttygttt agttttaacc tttatttatg    120gataataaag gttaatatta ataatgattt attttaaggc attcccraat ttgcataatt    180ctccttttgg agataccctt ttatctccag tgcaagtctg gatcaaagtg atasamagaa    240gttcctctca gtgc                                                      254
<210>78
<211>355
<212>DNA
<213>人
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)…(355)
<223>n＝A，T，C或G
<400>78ttcgatacag gcaaacatga actgcaggag ggtggtgacg atcatgatgt tgccgatggt     60ccggatggnc acgaagacgc actggancac gtgcttacgt ccttttgctc tgttgatggc    120cctgagggga cgcaggaccc ttatgaccct cagaatcttc acaacgggag atggcactgg    180attgantccc antgacacca gagacacccc aaccaccagn atatcantat attgatgtag    240ttcctgtaga nggccccctt gtggaggaaa gctccatnag ttggtcatct tcaacaggat    300ctcaacagtt tccgatggct gtgatgggca tagtcatant taaccntgtn tcgaa         355
<210>79
<211>406
<212>DNA
<213>人
<400>79taagagggta ccagcagaaa ggttagtatc atcagatagc atcttatacg agtaatatgc     60ctgctatttg aagtgtaatt gagaaggaaa attttagcgt gctcactgac ctgcctgtag    120ccccagtgac agctaggatg tgcattctcc agccatcaag agactgagtc aagttgttcc    180ttaagtcaga acagcagact cagctctgac attctgattc gaatgacact gttcaggaat    240cggaatcctg tcgattagac tggacagctt gtggcaagtg aatttgcctg taacaagcca    300gattttttaa aatttatatt gtaaataatg tgtgtgtgtg tgtgtgtata tatatatata    360tgtacagtta tctaagttaa tttaaaagtt gtttggtacc ctctta                   406
<210>80
<211>327
<212>DNA
<213>人
<400>80tttttttttt tttactcggc tcagtctaat cctttttgta gtcactcata ggccagactt     60agggctagga tgatgattaa taagagggat gacataacta ttagtggcag gttagttgtt    120tgtagggctc atggtagggg taaaaggagg gcaatttcta gatcaaataa taagaaggta    180atagctacta agaagaattt tatggagaaa gggacgcggg cgggggatat agggtcgaag    240ccgcactcgt aaggggtgga tttttctatg tagccgttga gttgtggtag tcaaaatgta    300ataattatta gtagtaagcc taggaga                                        327
<210>81
<211>318
<212>DNA
<213>人
<400>81tagtctatgc ggttgattcg gcaatccatt atttgctgga ttttgtcatg tgttttgcca     60attgcattca taatttatta tgcatttatg cttgtatctc ctaagtcatg gtatataatc    120catgcttttt atgttttgtc tgacataaac tcttatcaga gccctttgca cacagggatt    180caataaatat taacacagtc tacatttatt tggtgaatat tgcatatctg ctgtactgaa    240agcacattaa gtaacaaagg caagtgagaa gaatgaaaag cactactcac aacagttatc    300atgattgcgc atagacta                                                  318
<210>82
<211>338
<212>DNA
<213>人
<400>82tcttcaacct ctactcccac taatagcttt ttgatgactt ctagcaagcc tcgctaacct     60cgccttaccc cccactatta acctactggg agaactctct gtgctagtaa ccacgttctc    120ctgatcaaat atcactctcc tacttacagg actcaacata ctagtcacag ccctatactc    180cctctacata tttaccacaa cacaatgggg ctcactcacc caccacatta acaacataaa    240accctcattc acacgagaaa acaccctcat gttcatacac ctatccccca ttctcctcct    300atccctcaac cccgacatca ttaccgggtt ttcctctt                            338
<210>83
<211>111
<212>DNA
<213>人
<400>83agccatttac cacccatcca caaaaaaaaa aaaaaaaaag aaaaatatca aggaataaaa    60atagactttg aacaaaaagg aacatttgct ggcctgagga ggcatcaccc g            111
<210>84
<211>224
<212>DNA
<213>人
<400>84tcgggtgatg cctcctcagg ccaagaagat aaagcttcag acccctaaca catttccaaa     60aaggaagaaa ggagaaaaaa gggcatcatc cccgttccga agggtcaggg aggaggaaat    120tgaggtggat tcacgagttg cggacaactc ctttgatgcc aagcgaggtg cagccggaga    180ctggggagag cgagccaatc aggttttgaa gttcctctca gtgc                     224
<210>85
<211>348
<212>DNA
<213>人
<400>85gcactgagag gaacttcgtt ggaaacgggt ttttttcatg taaggctaga cagaagaatt    60ctcagtaact tccttgtgtt gtgtgtattc aactcacasa gttgaacgat cctttacaca    120gagcagactt gtaacactct twttgtggaa tttgcaagtg gagatttcag scgctttgaa    180gtsaaaggta gaaaaggaaa tatcttccta taaaaactag acagaatgat tctcagaaac    240tcctttgtga tgtgtgcgtt caactcacag agtttaacct ttcwtttcat agaagcagtt    300aggaaacact ctgtttgtaa agtctgcaag tggatagaga ccctaacg                 348
<210>86
<211>293
<212>DNA
<213>人
<400>86gcactgagag gaacttcytt gtgwtgtktg yattcaactc acagagttga asswtsmttt     60acabagwkca ggcttkcaaa cactcttttt gtmgaatytg caagwggaka tttsrrccrc    120tttgwggycw wysktmgaaw mggrwatatc ttcwyatmra amctagacag aaksattctc    180akaawstyyy ytgtgawgws tgcrttcaac tcacagagkt kaacmwtyct kytsatrgag    240cagttwkgaa actctmtttc tttggattct gcaagtggat agagacccta acg           293
<210>87
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>87ctcctaggct                                                           10
<210>88
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>88agtagttgcc                                                           10
<210>89
<211>11
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>89ttccgttatg c                                                        11
<210>90
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>90tggtaaaggg                                                           10
<210>91
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>91tcggtcatag                                                          10
<210>92
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>92tacaacgagg                                                         10
<210>93
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>93tggattggtc                                                        10
<210>94
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>94ctttctaccc                                                        10
<210>95
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>95ttttggctcc                                                       10
<210>96
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>96ggaaccaatc                                                           10
<210>97
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>97tcgatacagg                                                          10
<210>98
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>98ggtactaagg                                                         10
<210>99
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>99agtctatgcg                                                        10
<210>100
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>100ctatccatgg                                                       10
<210>101
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>101tctgtccaca                                                         10
<210>102
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>102aagagggtac                                                        10
<210>103
<211>10
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>103cttcaacctc                                                       10
<210>104
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>104gctcctcttg ccttaccaac                                           20
<210>105
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>105gtaagtcgag cagtgtgatg                                          20
<210>106
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>106gtaagtcgag cagtctgatg                                                20
<210>107
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>107gacttagtgg aaagaatgta                                               20
<210>108
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>108gtaattccgc caaccgtagt                                              20
<210>109
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>109atggttgatc gatagtggaa                                             20
<210>110
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>110acggggaccc ctgcattgag                                            20
<210>111
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>111tattctagac cattcgctac                                                20
<210>112
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>112acataaccac tttagcgttc                                               20
<210>113
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>113cgggtgatgc ctcctcaggc                                              20
<210>114
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>114agcatgttga gcccagacac                                              20
<210>115
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>115gacaccttgt ccagcatctg                                             20
<210>116
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>116tacgctgcaa cactgtggag                                            20
<210>117
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>117cgttagggtc tctatccact                                               20
<210>118
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>118agactgactc atgtccccta                                              20
<210>119
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>119tcatcgctcg gtgactcaag                                             20
<210>120
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>120caagattcca taggctgacc                                            20
<210>121
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>121acgtactggt cttgaaggtc                                           20
<210>122
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>122gacgcttggc cacttgacac                                                20
<210>123
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>123gtatcgacgt agtggtctcc                                               20
<210>124
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<4D0>124tagtgacatt acgacgctgg                                              20
<210>125
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>125cgggtgatgc ctcctcaggc                                             20
<210>126
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>126atggctattt tcgggggctg aca                                       23
<210>127
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>127ccggtatctc ctcgtgggta tt                                             22
<210>128
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>128ctgcctgagc cacaaatg                                                 18
<210>129
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>用于从乳腺肿瘤cDNA扩增的引物
<400>129ccggaggagg aagctagagg aata                                         24
<210>130
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>130tttttttttt ttag                                                   14
<210>131
<211>18
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的Th基序(B细胞表位)
<400>131Ser Ser Gly Gly Arg Thr  Phe Asp Asp Phe His Arg Tyr Leu Leu Val1               5                   10                  15Gly Ile
<210>132
<211>22
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的Th基序(B细胞表位)
<221>VARIANT
<222>(1)…(22)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>132Gln Gly Ala Ala Gln Lys  Pro Ile Asn Leu Ser Lys Xaa Ile Glu Val1               5                  10                   15Val Gln Gly His Asp Glu
        20
<210>133
<211>23
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的Th基序(B细胞表位)
<400>133Ser Pro Gly Val Phe Leu Glu His Leu Gln Glu Ala Tyr Arg Ile Tyr1               5                  10                  15Thr Pro Phe Asp Leu Ser Ala
        20
<210>134
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<400>134Tyr Leu Leu Val Gly Ile Gln Gly Ala1               5
<210>135
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<400>135Gly Ala Ala Gln Lys Pro Ile Asn Leu1               5
<210>136
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<221>VARIANT
<222>(1)…(9)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>136Asn Leu Ser Lys Xaa Ile Glu Val Val1               5
<210>137
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<400>137Glu Val Val Gln Gly His Asp Glu Ser1               5
<210>138
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<400>138His Leu Gln Glu Ala Tyr Arg Ile Tyr1               5
<210>139
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<400>139Asn Leu Ala Phe Val Ala Gln Ala Ala1               5
<210>140
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>预测的HLA A2.1基序(T细胞表位)
<400>140Phe Val Ala Gln Ala Ala Pro Asp Ser1               5
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<212>DNA
<213>人
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<222>(1)…(579)
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<400>299Met Asp Ile Val Val Ser Gly Ser His Pro Leu Trp Val Asp Ser Phe1               5                  10                  15Leu His Leu Ala Gly Ser Asp Leu Leu Ser Arg Ser Leu Met Ala Glu
        20                  25                  30Glu Tyr Thr Ile Val His Ala Ser Phe Ile Ser Cys Ile Ser Ser Ser
    35                  40                  45Leu Asp Gly Gln Gly Glu Arg Gln Glu Gln Arg Gly His Phe Trp Arg
50                  55                  60Pro Gln Arg Leu Leu Cys Glu Asp Ala Trp Glu Gln Glu Val Gln Val65                  70                  75                  80Val Leu Pro Leu Leu Pro Leu Leu Gln Gly Ser Gly Lys Ser Asn Val
            85                  90                  95Val Ala Trp Gly Asp Tyr Asp Asp Ser Ala Phe Met Asp Pro Arg Tyr
        100                 105                 110His Val His Gly Glu Asp Leu Asp Lys Leu His Arg Ala Ala Trp Trp
    115                 120                 125Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met Leu Arg Asp Thr Asp
130                 135                 140Val Asn Lys Arg Asp Lys Gln Lys Arg Thr Ala Leu His Leu Ala Ser145                 150                 155                 160Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Lys Leu Val Leu Asp Arg Arg Cys
            165                 170                 175Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr Ala Leu Thr Lys Ala
        180                 185                 190Val Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Ala Leu Met Leu Leu Glu His Gly
    195                 200                 205Thr Asp Pro Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn Thr Thr Leu His Tyr
210                 215                 220Ala Val Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys Ala Leu Leu Leu Tyr225                 230                 235                 240Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys His Gly Leu Thr Pro Leu Leu
            245                 250                 255Leu Gly Ile His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val Lys Phe Leu Ile Lys
        260                 265                 270Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp Arg Tyr Gly Arg Thr Ala Leu
    275                 280                 285Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile Val Ser Pro Leu Leu
290                 295                 300Glu Gln Asn Val Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu Glu Arg Arg Pro Glu305                 310                 315                 320Ser Met Leu Phe Leu Val Ile Ile Met
            325
<210>300
<211>148
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)…(148)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>300Met Thr Xaa Pro Ser Trp Ser Pro Gly Thr Thr Ser Val Glu Lys Ile1               5                  10                  15Trp Thr Ser Ser Thr Glu Leu Pro Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys
        20                  25                  30Asp Leu Ile Val Met Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Xaa Asp Lys
    35                  40                  45Gln Lys Arg Thr Ala Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu
50                  55                  60Val Val Lys Leu Xaa Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp65                  70                  75                  80Asn Lys Lys Arg Thr Ala Leu Xaa Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu Asp
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        100                 105                 110Asp Glu Tyr Gly Asn Thr Thr Leu His Tyr Ala Xaa Tyr Asn Glu Asp
    115                 120                 125Lys Leu Met Ala Lys Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser
130                 135                 140Lys Asn Lys Val145
<210>301
<211>1155
<212>DNA
<213>人
<400>301atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc     60aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag    120agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag    180atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg    240ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag    300tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcggca agagcaaggt gggcgcttgg    360ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg    420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg    480ctcagggaca ctgacgtgaa caagaaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc    540tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat    600gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa    660tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat    720accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta    780tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta    840catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaatcaaga aaaaagcgaa tttaaatgca    900ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata    960gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg   1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac   1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga   1140accagaaata aataa                                                    1155
<210>302
<211>2000
<212>DNA
<213>人
<400>302atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc      60aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag     120agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag     180atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg     240ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag     300tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcggca agagcaaggt gggcgcttgg     360ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg     420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg     480ctcagggaca ctgacgtgaa caagaaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc     540tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat     600gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa     660tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat     720accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta     780tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta     840catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaatcaaga aaaaagcgaa tttaaatgca     900ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata     960gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg    1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac    1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaca agacttaaag    1140ctgacatcag aggaagagtc acaaaggttc aaaggcagtg aaaatagcca gccagagaaa    1200atgtctcaag aaccagaaat aaataaggat ggtgatagag aggttgaaga agaaatgaag    1260aagcatgaaa gtaataatgt gggattacta gaaaacctga ctaatggtgt cactgctggc    1320aatggtgata atggattaat tcctcaaagg aagagcagaa cacctgaaaa tcagcaattt    1380cctgacaacg aaagtgaaga gtatcacaga atttgcgaat tagtttctga ctacaaagaa    1440aaacagatgc caaaatactc ttctgaaaac agcaacccag aacaagactt aaagctgaca    1500tcagaggaag agtcacaaag gcttgagggc agtgaaaatg gccagccaga gctagaaaat    1560tttatggcta tcgaagaaat gaagaagcac ggaagtactc atgtcggatt cccagaaaac    1620ctgactaatg gtgccactgc tggcaatggt gatgatggat taattcctcc aaggaagagc    1680agaacacctg aaagccagca atttcctgac actgagaatg aagagtatca cagtgacgaa    1740caaaatgata ctcagaagca attttgtgaa gaacagaaca ctggaatatt acacgatgag    1800attctgattc atgaagaaaa gcagatagaa gtggttgaaa aaatgaattc tgagctttct    1860cttagttgta agaaagaaaa agacatcttg catgaaaata gtacgttgcg ggaagaaatt    1920gccatgctaa gactggagct agacacaatg aaacatcaga gccagctaaa aaaaaaaaaa    1980aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa                                                2000
<210>303
<211>2040
<212>DNA
<213>人
<400>303atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc     60aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag    120agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag    180atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg    240ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag    300tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcggca agagcaaggt gggcgcttgg    360ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg    420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg    480ctcagggaca ctgacgtgaa caagaaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc    540tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat    600gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa    660tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat    720accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta    780tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta    840catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaatcaaga aaaaagcgaa tttaaatgca    900ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata    960gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg    1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac    1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaca agacttaaag    1140ctgacatcag aggaagagtc acaaaggttc aaaggcagtg aaaatagcca gccagagaaa    1200atgtctcaag aaccagaaat aaataaggat ggtgatagag aggttgaaga agaaatgaag    1260aagcatgaaa gtaataatgt gggattacta gaaaacctga ctaatggtgt cactgctggc    1320aatggtgata atggattaat tcctcaaagg aagagcagaa cacctgaaaa tcagcaattt    1380cctgacaacg aaagtgaaga gtatcacaga atttgcgaat tagtttctga ctacaaagaa    1440aaacagatgc caaaatactc ttctgaaaac agcaacccag aacaagactt aaagctgaca    1500tcagaggaag agtcacaaag gcttgagggc agtgaaaatg gccagccaga gaaaagatct    1560caagaaccag aaataaataa ggatggtgat agagagctag aaaattttat ggctatcgaa    1620gaaatgaaga agcacggaag tactcatgtc ggattcccag aaaacctgac taatggtgcc    1680actgctggca atggtgatga tggattaatt cctccaagga agagcagaac acctgaaagc    1740cagcaatttc ctgacactga gaatgaagag tatcacagtg acgaacaaaa tgatactcag    1800aagcaatttt gtgaagaaca gaacactgga atattacacg atgagattct gattcatgaa    1860gaaaagcaga tagaagtggt tgaaaaaatg aattctgagc tttctcttag ttgtaagaaa    1920gaaaaagaca tcttgcatga aaatagtacg ttgcgggaag aaattgccat gctaagactg    1980gagctagaca caatgaaaca tcagagccag ctaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa    2040
<210>304
<211>384
<212>PRT
<213>人
<400>304Met Val Val Glu Val Asp Ser Met Pro Ala Ala Ser Ser Val Lys Lys1               5                  10                  15Pro Phe Gly Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys Arg Cys Phe
        20                  25                  30Pro Cys Cys Arg Glu Ser Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asp
    35                  40                  45His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp
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130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Lys Asp Lys Gln Lys Arg Thr Ala
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210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Thr Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
            245                 250                 255Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys His Gly
        260                 265             270Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val
    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile305                 310                 315                 320Val Ser Leu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
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370                 375                 380
<210>305
<211>656
<212>PRT
<213>人
<400>305Met Val Val Glu Val Asp Ser Met Pro Ala Ala Ser Ser Val Lys Lysl               5                  10                  15Pro Phe Gly Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys Arg Cys Phe
        20                  25                  30Pro Cys Cys Arg Glu Ser Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asp
    35                  40                  45His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp
50                  55                  60Cys Arg His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Val65                  70                  75                  80Gly Ala Ser Gly Asp His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Asn
            85                  90                  95Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser
       100                  105                 110Gly Lys Ser Lys Val Gly Ala Trp Gly Asp Tyr Asp Asp Ser Ala Phe
    115                 120                125Met Glu Pro Arg Tyr His Val Arg Gly Glu Asp Leu Asp Lys Leu His
130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Lys Asp Lys Gln Lys Arg Thr Ala
            165                 170                 175Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Lys Leu Leu
        180                 185                 190Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr
    195                 200                 205Ala Leu Ile Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Ala Leu Met
210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Thr Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
            245                 250                 255Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys His Gly
        260                 265                 270Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val
    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile305                 310                 315                 320Val Ser Leu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
            325                 330                 335Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser His His His Val
        340                 345                 350Ile Cys Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Met Leu Lys Ile
    355                 360                 365Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Gln Asp Leu Lys Leu Thr Ser Glu
370                 375                 380Glu Glu Ser Gln Arg Phe Lys Gly Ser Glu Asn Ser Gln Pro Glu Lys385                 390                 395                 400Met Ser Gln Glu Pro Glu Ile Asn Lys Asp Gly Asp Arg Glu Val Glu
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610                 615                 620Lys Glu Lys Asp Ile Leu His Glu Asn Ser Thr Leu Arg Glu Glu Ile625                 630                 635                 640Ala Met Leu Arg Leu Glu Leu Asp Thr Met Lys His Gln Ser Gln Leu
            645                 650                 655
<210>306
<211>671
<212>PRT
<213>人
<400>306Met Val Val Glu Val Asp Ser Met Pro Ala Ala Ser Ser Val Lys Lys1               5                  l0                  15Pro Phe Gly Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys Arg Cys Phe
        20                  25                  30Pro Cys Cys Arg Glu Ser Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asp
    35                  40                  45His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp
50                  55                  60Cys Arg His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Val65                  70                  75                  80Gly Ala Ser Gly Asp His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Asn
            85                  90                  95Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser
        100                 105                 110Gly Lys Ser Lys Val Gly Ala Trp Gly Asp Tyr Asp Asp Ser Ala Phe
    115                 120                 125Met Glu Pro Arg Tyr His Val Arg Gly Glu Asp Leu Asp Lys Leu His
130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Lys Asp Lys Gln Lys Arg Thr Ala
            165                 170                 175Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Lys Leu Leu
        180                 185                 190Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr
    195                 200                 205Ala Leu Ile Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Ala Leu Met
210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Thr Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
            245                 250                 255Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys His Gly
        260                 265                 270Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val
    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile305                 310                 315                 320Val Ser Leu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
            325                 330                 335Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser His His His Val
        340                 345                 350Ile Cys Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Met Leu Lys Ile
    355                 360                 365Ser Ser Glu Asn Sgr Asn Pro Glu Gln Asp Leu Lys Leu Thr Ser Glu
370                 375                 380Glu Glu Ser Gln Arg Phe Lys Gly Ser Glu Asn Ser Gln Pro Glu Lys385                 390                 395                 400Met Ser Gln Glu Pro Glu Ile Asn Lys Asp Gly Asp Arg Glu Val Glu
            405                 410                 415Glu Glu Met Lys Lys His Glu Ser Asn Asn Val Gly Leu Leu Glu Asn
        420                 425                 430Leu Thr Asn Gly Val Thr Ala Gly Asn Gly Asp Asn Gly Leu Ile Pro
    435                 440                 445Gln Arg Lys Ser Arg Thr Pro Glu Asn Gln Gln Phe Pro Asp Asn Glu
450                 455                 460Ser Glu Glu Tyr His Arg Ile Cys Glu Leu Val Ser Asp Tyr Lys Glu465                 470                 475                 480Lys Gln Met Pro Lys Tyr Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Gln Asp
            485                 490                 495Leu Lys Leu Thr Ser Glu Glu Glu Ser Gln Arg Leu Glu Gly Ser Glu
        500                 505                 510Asn Gly Gln Pro Glu Lys Arg Ser Gln Glu Pro Glu Ile Asn Lys Asp
    515                 520                 525Gly Asp Arg Glu Leu Glu Asn Phe Met Ala Ile Glu Glu Met Lys Lys
530                 535                 540His Gly Ser Thr His Val Gly Phe Pro Glu Asn Leu Thr Asn Gly Ala545                 550                 555                 560Thr Ala Gly Asn Gly Asp Asp Gly Leu Ile Pro Pro Arg Lys Ser Arg
            565                 570                 575Thr Pro Glu Ser Gln Gln Phe Pro Asp Thr Glu Asn Glu Glu Tyr His
        580                 585                 590Ser Asp Glu Gln Asn Asp Thr Gln Lys Gln Phe Cys Glu Glu Gln Asn
    595                 600                 605Thr Gly Ile Leu His Asp Glu Ile Leu Ile His Glu Glu Lys Gln Ile
610                 615                 620Glu Val Val Glu Lys Met Asn Ser Glu Leu Ser Leu Ser Cys Lys Lys625                 630                 635                 640Glu Lys Asp Ile Leu His Glu Asn Ser Thr Leu Arg Glu Glu Ile Ala
            645                 650                 655Met Leu Arg Leu Glu Leu Asp Thr Met Lys His Gln Ser Gln Leu
        660                 665                 670
<210>307
<211>800
<212>DNA
<213>人
<400>307atkagcttcc gcttctgaca acactagaga tccctcccct ccctcagggt atggccctcc     60acttcatttt tggtacataa catctttata ggacaggggt aaaatcccaa tactaacagg    120agaatgctta ggactctaac aggtttttga gaatgtgttg gtaagggcca ctcaatccaa    180tttttcttgg tcctccttgt ggtctaggag gacaggcaag ggtgcagatt ttcaagaatg    240catcagtaag ggccactaaa tccgaccttc ctcgttcctc cttgtggtct gggaggaaaa    300ctagtgtttc tgttgctgtg tcagtgagca caactattcc gatcagcagg gtccagggac    360cactgcaggt tcttgggcag ggggagaaac aaaacaaacc aaaaccatgg gcrgttttgt    420ctttcagatg ggaaacactc aggcatcaac aggctcacct ttgaaatgca tcctaagcca    480atgggacaaa tttgacccac aaaccctgga aaaagaggtg gctcattttt tttgcactat    540ggcttggccc caacattctc tctctgatgg ggaaaaatgg ccacctgagg gaagtacaga    600ttacaatact atcctgcagc ttgacctttt ctgtaagagg gaaggcaaat ggagtgaaat    660accttatgtc caagctttct tttcattgaa ggagaataca ctatgcaaag cttgaaattt    720acatcccaca ggaggacctc tcagcttacc cccatatcct agcctcccta tagctcccct    780tcctattagt gataagcctc                                                800
<210>308
<211>102
<212>PRT
<213>人
<220>
<221>VARIANT
<222>(1)…(102)
<223>Xaa＝任何氨基酸
<400>308Met Gly Xaa Phe Val Phe Gln Met Gly Asn Thr Gln Ala Ser Thr Gly1               5                  10                  15Ser Pro Leu Lys Cys Ile Leu Ser Gln Trp Asp Lys Phe Asp Pro Gln
        20                  25                  30Thr Leu Glu Lys Glu Val Ala His Phe Phe Cys Thr Met Ala Trp Pro
    35                  40                  45Gln His Ser Leu Ser Asp Gly Glu Lys Trp Pro Pro Glu Gly Ser Thr
50                  55                  60Asp Tyr Asn Thr Ile Leu Gln Leu Asp Leu Phe Cys Lys Arg Glu Gly65                  70                  75                  80Lys Trp Ser Glu Ile Pro Tyr Val Gln Ala Phe Phe Ser Leu Lys Glu
            85                  90                  95Asn Thr Leu Cys Lys Ala
        l00
<210>309
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实验室制
<400>309Leu Met Ala Glu Glu Tyr Thr Ile Val1               5
<210>310
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实验室制
<400>310Lys Leu Met Ala Lys Ala Leu Leu Leu1               5
<210>311
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实验室制
<400>311Gly Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Ilel               5
<210>312
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>实验室制
<400>312Lys Leu Val Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu1               5                  10<210>313<211>1852<212>DNA<213>人<400>313ggcacgagaa ttaaaaccct cagcaaaaca ggcatagaag ggacatacct taaagtaata 60aaaaccacct atgacaagcc cacagccaac ataatactaa atggggaaaa gttagaagca 120tttcctctga gaactgcaac aataaataca aggatgctgg attttgtcaa atgccttttc l80tgtgtctgtt gagatgctta tgtgactttg cttttaattc tgtttatgtg attatcacat 240ttattgactt gcctgtgtta gaccggaaga gctggggtgt ttctcaggag ccaccgtgtg 300ctgcggcagc ttcgggataa cttgaggctg catcactggg gaagaaacac aytcctgtcc 360gtggcgctga tggctgagga cagagcttca gtgtggcttc tctgcgactg gcttcttcgg 420ggagttcttc cttcatagtt catccatatg gctccagagg aaaattatat tattttgtta 480tggatgaaga gtattacgtt gtgcagatat actgcagtgt cttcatctct tgatgtgtga 540ttgggtaggt tccaccatgt tgccgcagat gacatgattt cagtacctgt gtctggctga 600aaagtgtttg tttgtgaatg gatattgtgg tttctggatc tcatcctctg tgggtggaca 660gctttctcca ccttgctgga agtgacctgc tgtccagaag tttgatggct gaggagtata 720ccatcgtgca tgcatctttc atttcctgca tttcttcctc cctggatgga cagggggagc 780ggcaagagca acgtgggcac ttctggagac cacaacgact cctctgtgaa gacgcttggg 840agcaagaggt gcaagtggtg ctgccactgc ttcccctgct gcagggggag cggcaagagc 900aacgtggtcg cttggggaga ctacgatgac agcgccttca tggatcccag gtaccacgtc 960catggagaag atctggacaa gctccacaga gctgcctggt ggggtaaagt ccccagaaag 1020gatctcatcg tcatgctcag ggacacggat gtgaacaaga gggacaagca aaagaggact 1080gctctacatc tggcctctgc caatgggaat tcagaagtag taaaactcgt gctggacaga 1140cgatgtcaac ttaatgtcct tgacaacaaa aagaggacag ctctgacaaa ggccgtacaa 1200tgccaggaag atgaatgtgc gttaatgttg ctggaacatg gcactgatcc aaatattcca 1260gatgagtatg gaaataccac tctacactat gctgtctaca atgaagataa attaatggcc 1320aaagcactgc tcttatacgg tgctgatatc gaatcaaaaa acaagcatgg cctcacacca 1380ctgctacttg gtatacatga gcaaaaacag caagtggtga aatttttaat caagaaaaaa 1440gcgaatttaa atgcgctgga tagatatgga agaactgctc tcatacttgc tgtatgttgt 1500ggatcagcaa gtatagtcag ccctctactt gagcaaaatg ttgatgtatc ttctcaagat 1560ctggaaagac ggccagagag tatgctgttt ctagtcatca tcatgtaatt tgccagttac 1620tttctgacta caaagaaaaa cagatgttaa aaatctcttc tgaaaacagc aatccagaac 1680aagacttaaa gctgacatca gaggaagagt cacaaaggct taaaggaagt gaaaacagcc 1740agccagagct agaagattta tggctattga agaagaatga agaacacgga agtactcatg 1800tgggattccc agaaaacctg actaacggtg ccgctgctgg caatggtgat ga         1852<210>314<211>879<212>DNA<213>人<400>314atgcatcttt catttcctgc atttcttcct ccctggatgg acagggggag cggcaagagc 60aacgtgggca cttctggaga ccacaacgac tcctctgtga agacgcttgg gagcaagagg 120tgcaagtggt gctgccactg cttcccctgc tgcaggggga gcggcaagag caacgtggtc 180gcttggggag actacgatga cagcgccttc atggatccca ggtaccacgt ccatggagaa 240gatctggaca agctccacag agctgcctgg tggggtaaag tccccagaaa ggatctcatc 300gtcatgctca gggacacgga tgtgaacaag agggacaagc aaaagaggac tgctctacat 360ctggcctctg ccaatgggaa ttcagaagta gtaaaactcg tgctggacag acgatgtcaa 420cttaatgtcc ttgacaacaa aaagaggaca gctctgacaa aggccgtaca atgccaggaa 480gatgaatgtg cgttaatgtt gctggaacat ggcactgatc caaatattcc agatgagtat 540ggaaatacca ctctacacta tgctgtctac aatgaagata aattaatggc caaagcactg 600ctcttatacg gtgctgatat cgaatcaaaa aacaagcatg gcctcacacc actgctactt 660ggtatacatg agcaaaaaca gcaagtggtg aaatttttaa tcaagaaaaa agcgaattta 720aatgcgctgg atagatatgg aagaactgct ctcatacttg ctgtatgttg tggatcagca 780agtatagtca gccctctact tgagcaaaat gttgatgtat cttctcaaga tctggaaaga 840cggccagaga gtatgctgtt tctagtcatc atcatgtaa                        879<210>315<211>292<212>PRT<213>人<400>315Met His Leu Ser Phe Pro A1a Phe Leu Pro Pro Trp Met Asp Arg Gly
              5                  10                  15Ser Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asp His Asn Asp Ser Ser
         20                  25                  30Val Lys Thr Leu Gly Ser Lys Arg Cys Lys Trp Cys Cys His Cys Phe
     35                  40                  45Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Val Val Ala Trp Gly Asp
 50                  55                  60Tyr Asp Asp Ser Ala Phe Met Asp Pro Arg Tyr His Val His Gly Glu65                  70                  75                  80Asp Leu Asp Lys Leu His Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg
             85                  90                  95Lys Asp Leu Ile Val Met Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Arg Asp
        100                 105                 110Lys Gln Lys Arg Thr Ala Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser
    115                 120                 125Glu Val Val Lys Leu Val Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu
130                 135                 140Asp Asn Lys Lys Arg Thr Ala Leu Thr Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu145                 150                 155                 160Asp Glu Cys Ala Leu Met Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile
            165                 170                 175Pro Asp Glu Tyr Gly Asn Thr Thr Leu His Tyr Ala Val Tyr Asn Glu
        180                 185                 190Asp Lys Leu Met Ala Lys Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu
    195                 200                 205Ser Lys Asn Lys His Gly Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Ile His Glu
210                 215                 220Gln Lys Gln Gln Val Val Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu225                 230                 235                 240Asn Ala Leu Asp Arg Tyr Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys
            245                 250                 255Cys Gly Ser Ala Ser Ile Val Ser Pro Leu Leu Glu Gln Asn Val Asp
        260                 265                 270Val Ser Ser Gln Asp Leu Glu Arg Arg Pro Glu Ser Met Leu Phe Leu
    275                 280                 285Val Ile Ile Met
290<210>316<211>584<212>DNA<213>人<400>316agttgggcca aattcccctc cccctacagc ttgaagggga cataaccaat agcctggggt 60ttttttgtgg tcctttggag atttctttgc ttattttctt ctgggtgggg gtgattagag 120gaggcttatc actaatagga aggggagcta tagggaggct aggatatggg ggtaagctga 180gaggtcctcc tgtgggatgt aaatttcaag ctttgcatag tgtattctcc ttcaatgaaa 240agaaagcttg gacataaggt atttcactcc atttgccttc cctcttacag aaaaggtcaa 300gctgcaggat agtattgtaa tctgtacttc cctcaggtgg ccatttttcc ccatcagaga 360gagaatgttg gggccaagcc atagtgcaga aaaaaaaatg agccacctct ttttccaggg 420tttgtgggtc aaatttgtcc cattggctta ggatgcattt caaaggtgag cctgttgatg 480cctgagtgtt tcccatctga aagacaaaac tgcccatggt tttggtttgt tttgtttctc 540cccctgccca agaactatca aactcctgag ccaacaacta aaaa                  584<210>317<211>829<212>DNA<213>人<400>317attagcttcc gcttctgaca acactagaga tccctcccct ccctcagggt atggccctcc 60acttcatttt tggtacataa catctttata ggacaggggt aaaatcccaa tactaacagg 120agaatgctta ggactctaac aggtttttga gaatgtgttg gtaagggcca ctcaatccaa 180tttttcttgg tcctccttgt ggtctaggag gacaggcaag ggtgcagatt ttcaagaatg 240catcagtaag ggccactaaa tccgaccttc ctcgttcctc cttgtggtct gggaggaaaa 300ctagtgtttc tgttgctgtg tcagtgagca caactattcc gatcagcagg gtccagggac 360cactgcaggt tcttgggcag ggggagaaac aaaacaaacc aaaaccatgg gcagttttgt 420ctttcagatg ggaaacactc aggcatcaac aggctcacct ttgaaatgca tcctaagcca 480atgggacaaa tttgacccac aaaccctgga aaaagaggtg gctcattttt tttgcactat 540ggcttggccc caacattctc tctctgatgg ggaaaaatgg ccacctgagg gaagtacaga 600ttacaatact atcctgcagc ttgacctttt ctgtaagagg gaaggcaaat ggagtgaaat 660accttatgtc caagctttct tttcattgaa ggagaataca ctatgcaaag cttgaaattt 720acatcccaca ggaggacctc tcagcttacc cccatatcct agcctcccta tagctcccct 780tcctattagt gataagcctc ctctaatcac ccccacccag aagaaaata             829<210>318<211>30<212>PRT<213>人<400>318Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly Phe1               5                   10                  15Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile
        20                  25                  30<210>319<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>319ggcctctgcc aatgggaact cagaagtagt aaaactcctg c                    41<210>320<211>41<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>320gcaggagttt tactacttct gagttcccat tggcagaggc c                    41<210>321<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>321ggggaattcc cgctggtgcc gcgcggcagc cctatggtgg ttgaggttga           50ttccatgccg                                                       60<210>322<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>PCR引物<400>322cccgaattct tatttatttc tggttcttga gacattttct gg                   42<210>323<211>1590<212>DNA<213>人<400>323atgcatcacc atcaccatca cacggccgcg tccgataact tccagctgtc ccagggtggg 60cagggattcg ccattccgat cgggcaggcg atggcgatcg cgggccagat caagcttccc 120accgttcata tcgggcctac cgccttcctc ggcttgggtg ttgtcgacaa caacggcaac 180ggcgcacgag tccaacgcgt ggtcgggagc gctccggcgg caagtctcgg catctccacc 240ggcgacgtga tcaccgcggt cgacggcgct ccgatcaact cggccaccgc gatggcggac 300gcgcttaacg ggcatcatcc cggtgacgtc atctcggtga cctggcaaac caagtcgggc 360ggcacgcgta cagggaacgt gacattggcc gagggacccc cggccgaatt cccgctggtg 420ccgcgcggca gccctatggt ggttgaggtt gattccatgc cggctgcttc ttctgtgaag 480aagccatttg gtctcaggag caagatgggc aagtggtgct gccgttgctt cccctgctgc 540agggagagcg gcaagagcaa cgtgggcact tctggagacc acgacgactc tgctatgaag 600acactcagga gcaagatggg caagtggtgc cgccactgct tcccctgctg cagggggagt 660ggcaagagca acgtgggcgc ttctggagac cacgacgact ctgctatgaa gacactcagg 720aacaagatgg gcaagtggtg ctgccactgc ttcccctgct gcagggggag cggcaagagc 780aaggtgggcg cttggggaga ctacgatgac agygccttca tggagcccag gtaccacgtc 840cgtggagaag atctggacaa gctccacaga gctgcctggt ggggtaaagt ccccagaaag 900gatctcatcg tcatgctcag ggacactgac gtgaacaaga aggacaagca aaagaggact 960gctctacatc tggcctctgc caatgggaat tcagaagtag taaaactcct gctggacaga 1020cgatgtcaac ttaatgtcct tgacaacaaa aagaggacag ctctgataaa ggccgtacaa 1080tgccaggaag atgaatgtgc gttaatgttg ctggaacatg gcactgatcc aaatattcca 1140gatgagtatg gaaataccac tctgcactac gctatctata atgaagataa attaatggcc 1200aaagcactgc tcttatatgg tgctgatatc gaatcaaaaa acaagcatgg cctcacacca 1260ctgttacttg gtgtacatga gcaaaaacag caagtcgtga aatttttaat caagaaaaaa 1320gcgaatttaa atgcactgga tagatatgga aggactgctc tcatacttgc tgtatgttgt 1380ggatcagcaa gtatagtcag ccttctactt gagcaaaata ttgatgtatc ttctcaagat 1440ctatctggac agacggccag agagtatgct gtttctagtc atcatcatgt aatttgccag 1500ttactttctg actacaaaga aaaacagatg ctaaaaatct cttctgaaaa cagcaatcca 1560gaaaatgtct caagaaccag aaataaataa                                  1590<210>324<211>529<212>PRT<213>人<400>324Met His His His His His His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu
              5                  10                  15Ser Gln Gly Gly Gln Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala
         20                  25                  30Ile Ala Gly Gln Ile Lys Leu Pro Thr Val His Ile Gly Prb Thr Ala
     35                  40                  45Phe Leu Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val
 50                  55                  60Gln Arg Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr65                  70                  75                  80Gly Asp Val Ile Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr
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    115                 120                 125Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Pro Leu Val Pro Arg Gly Ser
130                 135                 140Pro Met Val Val Glu Val Asp Ser Met Pro Ala Ala Ser Sar Val Lys145                 150                 155                 160Lys Pro Phe Gly Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp cys Cys Arg Cys
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        180                 185                 190Asp His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys
    195                 200                 205Trp Cys Arg His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn
210                 215                 220Val Gly Ala Ser Gly Asp His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg225                 230                 235                 240Asn Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly
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    275                 280                 285His Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val
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450                 455                 460Ile Val Ser Leu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Val Ser Ser Gln Asp465                 470                 475                 480Leu Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser His His His
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        500                 505                 510Ile Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Asn Val Ser Arg Thr Arg Asn
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 50                  55                  60Cys Arg His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Thr Ser Asn Val65                  70                  75                  80Gly Thr Ser Gly Asp His Glu Asn Ser Phe Met Lys Met Leu Arg Ser
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130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Met Asn Lys Arg Asp Lys Glu Lys Arg Thr Ala
            165                 170                 175Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Gln Leu Leu
        180                 185                 190Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr
    195                 200                 205Ala Leu Ile Lys Ala Ile Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Val Leu Met
210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Ala Asp Arg Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Ala Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
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    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Val Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Iie305                310                 315                 320Val Asn Leu Leu Leu Glu Gln Asn Val Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
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        340                 345                 350Ile Cys Glu Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Met Leu Lys Ile
    355                 360                 365Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Asn Val Ser Arg Thr Arg Asn Lys
370                 375                 380<210>327<211>634<212>DNA<213>人<400>327gactgctcta catctggcct ctgccaatgg aaattcagaa gtagtaaaac tcctgctgga  60cagacgatgt caacttaata tccttgacaa caaaaagagg acagctctga caaaggccgt  120acaatgccag gaagatgaat gtgcgttaat gttgctggaa catggcactg atccgaatat  180tccagatgag tatggaaata ccgctctaca ctatgctatc tacaatgaag ataaattaat  240ggccaaagca ctgctcttat acggtgctga tatcgaatca aaaaacaagc atggcctcac  300accactgtta cttggtgtac atgagcaaaa acagcaagtg gtgaaatttt taatcaagaa  360aaaagcaaat ttaaatgcac tggatagata tggaagaact gctctcatac ttgctgtatg  420ttgtggatcg gcaagtatag tcagccttct acttgagcaa aacattgatg tatcttctca  480agatctatct ggacagacgg ccagagagta tgctgtttct agtcgtcata atgtaatttg  540ccagttactt tctgactaca aagaaaaaca gatactaaaa gtctcttctg aaaacagcaa  600tccaggaaat gtctcaagaa ccagaaataa ataa                              634<210>328<211>1155<212>DNA<213>人<400>328atggtggttg aggttgattc catgccggct gcctcttctg tgaagaagcc atttggtctc  60aggagcaaga tgggcaagtg gtgctgccgt tgcttcccct gctgcaggga gagcggcaag  120agcaacgtgg gcacttctgg agaccacgac gactctgcta tgaagacact caggagcaag  180atgggcaagt ggtgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagtggcaa gagcaacgtg  240ggcgcttctg gagaccacga cgactctgct atgaagacac tcaggaacaa gatgggcaag  300tggtgctgcc actgcttccc ctgctgcagg gggagcagca agagcaaggt gggcgcttgg  360ggagactacg atgacagtgc cttcatggag cccaggtacc acgtccgtgg agaagatctg  420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg  480ctcagggaca ctgacgtgaa caagcaggac aagcaaaaga ggactgctct acatctggcc  540tctgccaatg ggaattcaga agtagtaaaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat  600gtccttgaca acaaaaagag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa  660tgtgcgttaa tgttgctgga acatggcact gatccaaata ttccagatga gtatggaaat  720accactctgc actacgctat ctataatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta  780tatggtgctg atatcgaatc aaaaaacaag catggcctca caccactgtt acttggtgta  840catgagcaaa aacagcaagt cgtgaaattt ttaattaaga aaaaagcgaa tttaaatgca  900ctggatagat atggaaggac tgctctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata  960gtcagccttc tacttgagca aaatattgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg  1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gccagttact ttctgactac  1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga  1140accagaaata aataa                                                   1155<210>329<21l>1155<212>DNA<213>人<400>329atggtggctg aggtttgttc aatgcccgct gcctctgctg tgaagaagcc atttgatctc 60aggagcaaga tgggcaagtg gtgccaccac cgcttcccct gctgcagggg gagcggcaag 120agcaacatgg gcacttctgg agaccacgac gactccttta tgaagacgct caggagcaag 180atgggcaagt gttgccacca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagcggcac gagcaatgtg 240ggcacttctg gagaccatga caactccttt atgaagacac tcaggagcaa gatgggcaag 300tggtgctgtc actgcttccc ctgctgcagg gggagcggca agagcaacgt gggcacttgg 360ggagactacg acgacagcgc cttcatggag ccgaggtacc acgtccgtcg agaagatctg 420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg 480ctcagggaca ctgacatgaa caagagggac aagcaaaaga ggactgctct acatttggcc 540tctgccaatg gaaattcaga agtagtacaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaac 600gtccttgaca acaaaaaaag gacagctctg ataaaggccg tacaatgcca ggaagatgaa 660tgtgtgttaa tgttgctgga acatggcgct gatggaaata ttcaagatga gtatggaaat 720accgctctac actatgctat ctacaatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta 780tatggtgctg atattgaatc aaaaaacaag tgtggcctca caccactttt gcttggcgta 840catgaacaaa aacagcaagt ggtgaaattt ttaatcaaga aaaaagctaa tttaaatgca 900cttgatagat atggaagaac tgccctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata 960gtcaatcttc tacttgagca aaatgttgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gtgaattact ttctgactat 1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140accagaaata aataa                                                  1155<210>330<211>1155<212>DNA<213>人<400>330atggtggctg aggtttgttc aatgcccact gcctctactg tgaagaagcc atttgatctc 60aggagcaaga tgggcaagtg gtgccaccac cgcttcccct gctgcagggg gagcggcaag 120agcaacatgg gcacttctgg agaccacgac gactccttta tgaagatgct caggagcaag 180atgggcaagt gttgccgcca ctgcttcccc tgctgcaggg ggagcggcac gagcaacgtg 240ggcacttctg gagaccatga aaactccttt atgaagatgc tcaggagcaa gatgggcaag 300tggtgctgtc actgcttccc ctgctgcagg gggagcggca agagcaacgt gggcgcttgg 360ggagactacg accacagcgc cttcatggag ccgaggtacc acatccgtcg agaagatctg 420gacaagctcc acagagctgc ctggtggggt aaagtcccca gaaaggatct catcgtcatg 480ctcagggaca ctgacatgaa caagagggac aaggaaaaga ggactgctct acatttggcc 540tctgccaatg gaaattcaga agtagtacaa ctcctgctgg acagacgatg tcaacttaat 600gtccttgaca acaaaaaaag gacagctctg ataaaggcca tacaatgcca ggaagatgaa 660tgtgtgttaa tgttgctgga acatggcgct gatcgaaata ttccagatga gtatggaaat 720accgctctac actatgctat ctacaatgaa gataaattaa tggccaaagc actgctctta 780tatggtgctg atattgaatc aaaaaacaag tgtggcctca caccactttt gcttggcgta 840catgaacaaa aacagcaagt ggtgaaattt ttaatcaaga aaaaagctaa tttaaatgta 900cttgatagat atggaagaac tgccctcata cttgctgtat gttgtggatc agcaagtata 960gtcaatcttc tacttgagca aaatgttgat gtatcttctc aagatctatc tggacagacg 1020gccagagagt atgctgtttc tagtcatcat catgtaattt gtgaattact ttctgactat 1080aaagaaaaac agatgctaaa aatctcttct gaaaacagca atccagaaaa tgtctcaaga 1140accagaaata aataa                                                  1155<210>331<211>210<212>PRT<213>人<400>33lThr Ala Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Lys
              5                  10                  15Leu Leu Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Ile Leu Asp Asn Lys Lys
         20                  25                  30Arg Thr Ala Leu Thr Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Ala
     35                  40                  45Leu Met Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Pro Asp Glu Tyr
 50                  55                  60Gly Asn Thr Ala Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met65                  70                 75                  80Ala Lys Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys
             85                  90                  95His Gly Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln
        100                 105                 110Val Val Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp
    115                 120                 125Arg Tyr Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala
130                 135                 140Ser Ile Val Ser Leu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Val Ser Ser Gln145                 150                 155                 160Asp Leu Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser Arg His
            165                 170                 175Asn Val Ile Cys Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Ile Leu
        180                 185                 190Lys Val Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Gly Asn Val Ser Arg Thr Arg
    195                 200                 205Asn Lys
210<210>332<211>384<212>PRT<213>人<400>332Met Val Ala Glu Val Cys Ser Met Pro Thr Ala Ser Thr Val Lys Lys
              5                  10                  15Pro Phe Asp Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp Cys His His Arg Phe
         20                  25                  30Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Met Gly Thr Ser Gly Asp
     35                  40                  45His Asp Asp Ser Phe Met Lys Met Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Cys
 50                  55                  60Cys Arg His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Thr Ser Asn Val65                  70                  75                  80Gly Thr Ser Gly Asp His Glu Asn Ser Phe Met Lys Met Leu Arg Ser
             85                  90                  95Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser
        100                 105                 110Gly Lys Ser Asn Val Gly Ala Trp Gly Asp Tyr Asp His Ser Ala Phe
    115                 120                 125Met Glu Pro Arg Tyr His Ile Arg Arg Glu Asp Leu Asp Lys Leu His
130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Met Asn Lys Arg Asp Lys Glu Lys Arg Thr Ala
            165                 170                 175Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Gln Leu Leu
        180                 185                 190Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr
    195                 200                 205Ala Leu Ile Lys Ala Ile Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Val Leu Met
210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Ala Asp Arg Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Ala Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
            245                 250                 255Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys Cys Gly
        260                 265                 270Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val
    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Val Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile305                 310                 315                 320Val Asn Leu Leu Leu Glu Gln Asn Val Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
            325                 330                 335Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser His His His Val
        340                 345                 350Ile Cys Glu Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Met Leu Lys Ile
    355                 360                 365Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Asn Val Ser Arg Thr Arg Asn Lys
370                 375                 380<210>333<21l>384<212>PRT<213>人<400>333Met Val Ala Glu Val Cys Ser Met Pro Ala Ala Ser Ala Val Lys Lys
              5                  10                 15Pro Phe Asp Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp Cys His His Arg Phe
         20                  25                  30Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Met Gly Thr Ser Gly Asp
     35                  40                  45His Asp Asp Ser Phe Met Lys Thr Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Cys
 50                  55                  60Cys His His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Thr Ser Asn Val65                  70                  75                 80Gly Thr Ser Gly Asp His Asp Asn Ser Phe Met Lys Thr Leu Arg Ser
             85                  90                  95Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser
        100                 105                 110Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Trp Gly Asp Tyr Asp Asp Ser Ala Phe
    115                 120                 125Met Glu Pro Arg Tyr His Val Arg Arg Glu Asp Leu Asp Lys Leu His
130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Met Asn Lys Arg Asp Lys Gln Lys Arg Thr Ala
            165                 170                 175Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Gln Leu Leu
        180                 185                 190Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr
    195                 200                 205Ala Leu Ile Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Val Leu Met
210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Ala Asp Gly Asn Ile Gln Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Ala Le uHis Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
            245                 250                 255Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys Cys Gly
        260                 265                 270Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val
    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile305                 310                 315                 320Val Asn Leu Leu Leu Glu Gln Asn Val Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
            325                 330                 335Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser His His His Val
        340                 345                 350Ile Cys Glu Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Met Leu Lys Ile
    355                 360                 365Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Asn Val Ser Arg Thr Arg Asn Lys
 370                375                 380<210>334<211>384<212>PRT<213>人<400>334Met Val Val Glu Val Asp Ser Met Pro Ala Ala Ser Ser Val Lys Lys
              5                  10                  15Pro Phe Gly Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys Arg Cys Phe
         20                  25                  30Pro Cys Cys Arg Glu Ser Gly Lys Ser Asn Val Gly Thr Ser Gly Asp
     35                  40                  45His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Ser Lys Met Gly Lys Trp
 50                  55                  60Cys Arg His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser Gly Lys Ser Asn Val65                  70                  75                  80Gly Ala Ser Gly Asp His Asp Asp Ser Ala Met Lys Thr Leu Arg Asn
             85                  90                  95Lys Met Gly Lys Trp Cys Cys His Cys Phe Pro Cys Cys Arg Gly Ser
        100                 105                 110Ser Lys Ser Lys Val Gly Ala Trp Gly Asp Tyr Asp Asp Ser Ala Phe
    115                 120                 125Met Glu Pro Arg Tyr His Val Arg Gly Glu Asp Leu Asp Lys Leu His
130                 135                 140Arg Ala Ala Trp Trp Gly Lys Val Pro Arg Lys Asp Leu Ile Val Met145                 150                 155                 160Leu Arg Asp Thr Asp Val Asn Lys Gln Asp Lys Gln Lys Arg Thr Ala
            165                 170                 175Leu His Leu Ala Ser Ala Asn Gly Asn Ser Glu Val Val Lys Leu Leu
        180                 l85                 190Leu Asp Arg Arg Cys Gln Leu Asn Val Leu Asp Asn Lys Lys Arg Thr
    195                 200                 205Ala Leu Ile Lys Ala Val Gln Cys Gln Glu Asp Glu Cys Ala Leu Met
210                 215                 220Leu Leu Glu His Gly Thr Asp Pro Asn Ile Pro Asp Glu Tyr Gly Asn225                 230                 235                 240Thr Thr Leu His Tyr Ala Ile Tyr Asn Glu Asp Lys Leu Met Ala Lys
            245                 250                 255Ala Leu Leu Leu Tyr Gly Ala Asp Ile Glu Ser Lys Asn Lys His Gly
        260                 265                 270Leu Thr Pro Leu Leu Leu Gly Val His Glu Gln Lys Gln Gln Val Val
    275                 280                 285Lys Phe Leu Ile Lys Lys Lys Ala Asn Leu Asn Ala Leu Asp Arg Tyr
290                 295                 300Gly Arg Thr Ala Leu Ile Leu Ala Val Cys Cys Gly Ser Ala Ser Ile305                 310                 315                 320Val Ser Leu Leu Leu Glu Gln Asn Ile Asp Val Ser Ser Gln Asp Leu
            325                 330                 335Ser Gly Gln Thr Ala Arg Glu Tyr Ala Val Ser Ser His His His Val
        340                 345                 350Ile Cys Gln Leu Leu Ser Asp Tyr Lys Glu Lys Gln Met Leu Lys Ile
    355                 360                 365Ser Ser Glu Asn Ser Asn Pro Glu Asn Val Ser Arg Thr Arg Asn Lys
370                 375                 380

Claims (17)

1.分离的多核苷酸，其含有选自以下序列的序列：
(a)SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示的序列；
(b)SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列的互补序列；
(c)由SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列的至少20个连续残基组成的序列；
(d)在中等严紧条件下可与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列杂交的序列；
(e)与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列有至少75％一致性的序列；
(f)与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列有至少90％一致性的序列；和
(g)SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列的简并变体。
2.分离的多肽，其含有选自下列序列的氨基酸序列：
(a)SEQ ID NO：299、300、304-306、308-312、314、326和331-334；
(b)权利要求1的多核苷酸编码的序列；
(c)与权利要求1的多核苷酸编码的序列有至少70％一致性的序列；和
(d)与权利要求1的多核苷酸编码的序列有至少90％一致性的序列；
3.表达载体，包含可操作地与表达控制序列连接的权利要求1的多核苷酸。
4.用根据权利要求3的表达载体转化或转染的宿主细胞。
5.特异地与权利要求2的多肽结合的分离的抗体、或其抗原结合片断。
6.检测患者是否患有癌症的方法，包括步骤：
(a)从患者得到生物学样品；
(b)用可结合权利要求2的多肽的结合剂接触此生物学样品；
(c)检测此样品中与该结合剂结合的多肽的量；和
(d)将此多肽量与预先确定的截断值进行比较，由此确定患者是否患有癌症。
7.包含至少一种根据权利要求2的多肽的融合蛋白。
8.寡核苷酸，其在中等严紧条件下与SEQ ID NO：1、3-86、142-298、301-303、307、313、314、316、317、325和327-330所示序列杂交。
9.刺激和/或扩充特异针对肿瘤蛋白的T细胞的方法，包括在足以允许T细胞得到刺激和/或扩充的条件和时间下用至少一个选自下列的成分接触T细胞：
(a)权利要求2的多肽；
(b)权利要求1的多核苷酸；和
(c)表达权利要求2的多肽的抗原呈递细胞。
10.分离的T细胞群，包含根据权利要求9的方法制备的T细胞。
11.组合物，包含选自生理学可接受的载体和免疫刺激剂的第一成分，和选自如下的第二成分；
(a)权利要求2的多肽；
(b)权利要求1的多核苷酸；
(c)权利要求5的抗体；
(d)权利要求7的融合蛋白；
(e)权利要求10的T细胞群；和
(f)表达权利要求2的多肽的抗原呈递细胞。
12.刺激患者体内免疫应答的方法，包括给患者施用权利要求11的组合物。
13.为患者治疗癌症的方法，包括给患者施用权利要求11的组合物。
14.确定患者是否患有癌症的方法，包括步骤：
(a)从患者得到生物学样品；
(b)用权利要求8的寡核苷酸接触此生物学样品；
(c)检测此样品中与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量；和
(d)将与该寡核苷酸杂交的多核苷酸的量与预先确定的截断值进行比较，由此确定患者是否患有癌症。
15.包含至少一种根据权利要求8的寡核苷酸的诊断试剂盒。
16.包含至少一种根据权利要求5的抗体和检测试剂的诊断试剂盒，其中该检测试剂包含报道基团。
17.抑制患者体内癌症发展的方法，包括步骤：
(a)将分离自患者的CD4+和/或CD8+T细胞与至少一种选自如下的成分一起孵育：(i)权利要求2的多肽；(ii)权利要求1的多核苷酸；和(iii)表达权利要求2的多肽的抗原呈递细胞，使得T细胞增殖；
(b)给患者施用有效量的此增殖的T细胞，和
由此抑制患者体内癌症的发展。
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