KR20060087977A

KR20060087977A - 폐암 진단용 마커

Info

Publication number: KR20060087977A
Application number: KR1020050015045A
Authority: KR
Inventors: 윤정호; 김세년; 박종호; 김자은; 송영화; 김성한; 박동윤
Original assignee: 디지탈 지노믹스(주)
Priority date: 2005-01-31
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2006-08-03
Also published as: KR100690250B1

Abstract

본 발명은 폐암에 특이적인 진단 마커에 관한 것이다. 또한 상기 마커의 존재를 측정하는 제제를 포함하는 조성물, 키트 및 이를 사용하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

폐암 진단 마커

Description

폐암 진단용 마커{Markers for the diagnosis of lung cancer}

도 1은 유전자 발현 데이터를 이용하여 57개의 폐암 조직과 40개의 정상 조직을 군집화 (clustering)한 것이다. 폐암 조직은 Tumor (검은색 사각형)로 표시하였으며, 정상 폐조직은 Normal (하얀 사각형)로 표시하였다. 왼쪽의 하얀색 막대로 표시한 것은 대부분의 정상 폐조직이 모여있는 군집이고, 오른쪽의 검은색 막대로 표시한 것은, 폐암 조직이 모여있는 군집을 표시한 것이다.

도 2는 다차원 척도법으로 검체의 유전자 발현 양상을 3차원으로 시각화 한 것이다. 검은 원은 폐암 조직을 나타태고 회색 원은 정상 폐조직을 나타낸다. 3차원에서 거리가 가까운 점들은 유전자 발현 양상이 유사하다는 것을 나타낸다. 폐암 조직이 하나의 덩어리를 이루고, 정상 폐조직이 하나의 덩어리를 이루고 있어서, 폐암 조직과 정상 폐조직 각각이 특이적인 유전자 발현 양상을 가지고 있다는 것을 보여준다.

도 3은 폐암 조직과 정상 조직 사이에 발현 수준의 차이를 RT-PCR로 재검증한 것이다. 이들 유전자들은 폐암 조직에서만 발현이 확인되고, 정상 폐조직에서는 발현이 보이지 않는다.

폐암은전세계적으로 암으로 인한 사망 중 가장 큰 부분을 차지하는 질병이다. 전체 암사망자의 1/6 정도는 폐암으로 사망한다. 폐암은 소세포폐암 (small cell lung cancer)과 비소세포폐암 (nonsmall cell lung cancer)로 나누어진다. 그 중에서 비소세포페암은 폐암의 약 80%에 해당하는 가장 대표적인 암으로, 선암 (adenocarcinoma), 편평상피세포암 (squamous cell carcinoma), 대세포 폐암 (large cell carcinoma)으로 나누어진다. 폐암 종류에 따라 조직학적 특성이 차이가 날 뿐 아니라 예후와 치료방법에서도 차이가 보이므로 정확한 진단이 중요하다. 비소세포암의 경우, 최근의 암치료법의 발달에도 불구하고 10년 생존률이 10% 이하로 매우 낮다. 이는 대부분의 비소세포암이 발달 단계(advanced stage) 까지 진단이 어려운데 원인이 있다. 현재로서는 조기 진단이 환자의 생존 가능성을 높이는 가장 좋은 방법이다.

이에, 마커들을 이용하여 폐암을 진단하기 위한 다양한 시도들이 진행되었 다. 제한적인 숫자의 표적 유전자와 단백질의 발현을 조사함으로써 폐암 진단 마커를 발굴한 연구는 이미 보고되었으며(Hibi et al., Am. J. Pathol. 1999, 155: 711-715; Brechot et al. Eur. J. Cancer 1997, 33: 385-391; Pastor et al., Eur. Respir. J. 1997, 10: 603-609; Morita et al., Int. J. Cancer 1998, 78: 286-292). 마이크로어레이 기술을 이용하여 폐암 마커 유전자를 발굴한 연구도 보고도 있었다. 그러나, 현재까지 밝혀진 폐암 진단 마커들을 이용하여 폐암을 조기에 진단할 수 있다는 보고는 없다.

이러한 배경하에서, 본 발명자는 폐암을 간단하고 정확하게 구분하는 생물학적 마커를 개발하기 위하여, DNA 칩을 이용하여 폐암에서만 과다 발현을 보이는 유전자를 일차 스크리닝하고, RT-PCR을 실시하여 유의성이 높은 마커를 확인하였다. 그 결과, PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 유전자를 발굴하고, 실제 폐암 시료를 통하여 적용하였을 때, 폐암을 정확하게 진단할 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 PKP1 (plakophilin 1), ABCC5 (ATP-binding cassette, subfamily C (CFTR/MRP), member 5), KRT15 (keratin 15), KRT14 (keratin 14), TRIM29 (tripartite motif-containing 29), SERPINB5 (serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 5), TK1 (thymidine kinase 1,soluble), GPX2 (glutathione peroxidase 2), MMP1 (matrix metalloproteinase 1) 및 ITGB4 (integrin, beta 4) 중에서 선택되는 1개 이상의 폐암 진단 마커를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 이상의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 폐암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 이상의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 폐암을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 폐암 진단 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 폐암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "폐암 (lung cancer)"은 폐에 발생하는 악성종양을 의미하며 소세포폐암과 선암, 편평상피세포암, 대세포 폐암 등의 비소세포폐암을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 폐암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 폐암을 가진 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 폐암 진단 마커는 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB로 폐암 세포에서 발현이 증가하는 유전자들이다.

유의성 있는 진단 마커의 선택과 적용은 진단 결과의 신뢰도를 결정짓는다. 유의성 있는 진단 마커란, 진단하여 얻은 결과가 정확하여 타당도(validity)가 높고 반복 측정시에도 일관된 결과를 나타내도록 신뢰도가(reliability)가 높은 마커를 의미한다. 본 발명의 폐암 진단 마커는, 폐암의 발병과 함께 직접적 또는 간접 적 요인으로 발현이 항상 증가하는 유전자들로 반복된 실험에도 동일한 결과를 나타내며, 발현 수준의 차이가 대조군과 비교할 때 매우 커서 잘못된 결과를 내린 확률이 거의 없는 신뢰도가 높은 마커들이다. 그러므로 본 발명의 유의성 있는 진단 마커의 발현 정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 진단된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있다.

본 발명의 PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 유전자는 정상 폐조직의 세포에 비하여, 폐암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이므로, 폐암 진단 마커로 사용될 수 있다.

상기 유전자 모두 폐암 마커로 유용하나, 본 발명의 신속, 간편, 정확한 마커를 제공하고자 하는 본 발명의 목적상, 의학적 판단을 내리기에 충분한 정도의 과다하지 않는 수의 마커를 검출하는 것이 바람직하다. 이는 시간 및 자원의 낭비를 방지할 있다는 점에서도 경제적이다. PKP1 및 ABCC5는 폐암 세포에서만 특이적으로 발현되므로, 단독으로도 폐암을 진단할 수 있는 신뢰도가 매우 높은 마커이다. 그러므로 PKP1 또는 ABCC5를 단독으로 마커로 사용하거나 PKP1 및 ABCC5 모두를 마커로 사용하여 폐암을 진단하는 것이 바람직하다.

또한 추가로 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1 내지 8개의 유전자를 마커로 사용하여 폐암을 진단할 수 있다.

이 때, 정상 폐조직의 세포와 폐암 세포에서 거의 동일한 양으로 발현되는 유전자들, 예를 들어, DCK (deoxycytidine kinase), SEP15 (selenoprotein, 15-KD) 등을 정량 대조군으로 사용할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함할 수 있다.

생물학적 시료 중의 유전자의 발현 수준은 mRNA 또는 단백질의 양을 확인함으로써 알 수 있다.

본 발명에서 "mRNA 발현수준 측정"이란 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 폐암 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정한다. 이를 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "단백질 발현수준 측정"이란 폐암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서의 폐암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 검출용 키트는, 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치로 구성된다.

바람직하게는, RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 마커 검출용 키트에 관한 것이다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 각 마커 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오타이드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp 의 길이이다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 RT-PCR 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNAse, RNAse 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 실험 키트에 관한 것이다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴 클레오티드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 시험 키트에 관한 것이다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

폐암 마커 검출용 RT-PCR 키트는 PKP1, ABCC5 중에서 선택되는 1 내지 2개의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. 또한 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 유전자 중에서 선택되는 1개 내지 8개 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다.

폐암 마커 검출용 DNA 칩 키트는 PKP1, ABCC5 중에서 선택되는 1 내지 2개의 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드가 부착되어 있는 기판을 포함한다. 또한 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 유전자중에서 선택되는 1개 내지 8개 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 기판에 부착 및 고정할 수 있다.

폐암 마커 검출용 ELISA 키트는 PKP1, ABCC5 중에서 선택되는 1 내지 2개의 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 또한 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개 단백질에 대하여 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 단백질에 특이적인 프라이머를 포함하는 폐암 진단 마커 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개 단백질에 특이적인 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명의 프라이머는, 각 마커 유전자 특이적인 프라이머로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산이다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비제 한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다. 핵산은 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기, 예를 들면, 단백질(예: 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리-L-리신 등), 삽입제(예: 아크리딘, 프소랄렌 등), 킬레이트화제(예: 금속, 방사성 금속, 철, 산화성 금속 등), 및 알킬화제를 함유할 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 또한 검출 가능한 시그날을 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는 표지를 이용하여 변형시킬 수 있다. 표지의 예로는 방사성 동위원소, 형광성 분자, 바이오틴 등이 있다.

페암 진단 마커 검출용 조성물은, PKP1, ABCC5 중에서 선택되는 1 내지 2개의 유전자에 대하여 특이적인 각각의 프라이머 쌍을 포함한다. PKP1(서열번호 1)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 2 및 3로 기재되고, ABCC5(서열번호 4)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 5 및 6으로 기재된다. 또한 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 유전자 중에서 선택되는 1개 내지 8개 유전자에 대하여 특이적인 프라이머 쌍을 포함할 수 있다. KRT15(서열번호 7)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 8 및 9로 기재되고, KRT14(서열번호 10)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는서열번호 11 및 12로 기재되고, TRIM29(서열번호 13)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 14 및 15로 기재되고, SERPINB5(서열번호 16)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 17 및 18로 기재되고, TK1(서열번호 19)을 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 20 및 21로 기재되고, GPX2(서열번호 22)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 23 및 24로 기재되고, MMP1(서열번호 25)을 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 26 및 27로 기재되고, ITGB4(서열번호 28)를 증폭하기 위한 프라이머는 바람직하게는 서열번호 29 및 30로 기재되는 프라이머다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단 마커 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개 단백질에 특이적인 항체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에서, "항체"란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 폐암 마커 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.

다클론 항체는 상기한 폐암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다.

하이브리도마 방법은 폐암 진단 마커 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 폐암 진단오염 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관내에서 또는 생체내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.

파지 항체 라이브러리 방법은 세포내에 존재하는, 다양한 폐암 마커에 대한항체 유전자(Single chain fragmentvariable, scFv형태)를 획득하여 이를 파아지의 표면에 융합 단백질 형태로 발현함으로서 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 이 라이브러리로부터 폐암 단백질과 결합하는 모노크로날 항체를 분리, 제작하 는 방법이다.

상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전지영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리한다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

폐암 마커 검출용 조성물은 PKP1, ABCC5 중에서 선택되는 1 내지 2개의 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 또한, 상기 조성물은 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개 단백질에 대하여 특이적인 항체를 포함할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 폐암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA을 측정하는 단계 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 추가로, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 폐암을 진단할 수 있다.

생물학적 시료에서 mRNA를 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 mRNA 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

본 발명에서 용어 "생물학적 시료(biological sample)"이란 폐암 발명에 의해 폐암 마커의 유전자 발현 수준이 차이나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR , 실시간 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 검출 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 mRNA 발현량과 폐암 의심환자에서의 mRNA 발현량을 비교할 수 있고, 폐암 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여 폐암 의심 환자의 실제 폐암 환자 여부를 진단할 수 있다.

mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 폐암 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 RT-PCR법을 이용하는 것이다.

RT-PCR은 P. Seeburg(Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1986, Pt 1:669-677)에 의해 RNA를 분석하는데 도입된 방법으로, mRNA를 역전사하여 얻어진 cDNA를 PCR로 증폭하여 분석하게 된다. 이 때 증폭 단계에서 폐암 진단 마커에 특이적으로 제조된 프라이머 쌍을 사용하도록 한다. RT-PCR 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 폐암 진단 마커로 사용되는 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 대조군과 비교함으로써, 페암 발생 여부를 간편하게 진단할 수 있다.

달리는, 상기 폐암 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는 핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것이다. DNA 칩은 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하고, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 판독하여, 유전자의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 폐암 발병 여부를 진단할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 단백질에 특이적인 항체를 폐암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하여 폐암을 진단하는 방법에 관한 것이다.

상기 방법은 추가로, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 폐암을 진단할 수 있다.

생물학적 시료에서 단백질을 분리하는 과정은 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있으며 단백질 수준은 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 폐암 의심환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 폐암 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 폐암 의심 환자의 실제 폐암 환자 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 "항원-항체 복합체"란 폐암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다. 검출 라벨로서 효소가 사용되는 경우 이용 가능한 효소에는 -글루쿠로니다제, -D-글루코시다제, -D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, -라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되 지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄W(CN)₈, [Os(bpy)₃]²⁺, [RU(bpy)₃] ²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다. 방사선동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 포함되며 이로 제한되지 않는다.

단백질 발현수준 측정은 바람직하게는, ELISA법을 이용하는 것이다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지를 하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 보다 바람직하게는, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출한다. 폐암 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 폐암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 폐암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 폐암 발병 여부를 확인할 수 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 폐암 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하는 것이다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여, 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 폐암 발병 여부를 확인할 수 있다.

상기 검출 방법은 대조군에서의 마커 유전자의 발현량과 폐암이 발병한 세포에서의 마커 유전자의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. mRNA 또는 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대 강도) 차이로 나타낼 수 있다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 - 편평상피세포 폐암 세포와 정상 폐조직의 유전자 발현 분석

<1-1> 환자 검체에서의 RNA 분리

환자의 검체는 원자력병원으로부터 제공받았다. 편평상피세포 폐암 환자검체로부터의 RNA는 TriZol 시약(InVitrogen)을 이용하여 제조사에서 제시된 방법에 의해 추출되었다. 1cm³의 크기로 절단된 환자 검체 당 10 ml의 TriZol 시약을 사용하였다. 추출된 RNA는 스펙트로포토미터 (spectrophotometer)를 이용하여 양을 결정하였다.

<1-2> 마이크로어레이 (Microarray) 분석

디지털지노믹스(주)에서 판매하는 8K 사람 cDNA 마이크로어레이 (GenePlorer^TMTwinChip^TM human-8K set1)를 이용하여 검체의 유전자 발현 양상을 살펴보았다. 마이크로어레이는 8,170개의 탐침이 두 번 반복되어 존재하며, 정보는 http://annotation.digital-genomics.co.kr/excel/human8_2kset1.xls에서 찾아볼 수 있다. 97개의 샘플의 유전자 발현 양상을 비교하기 위하여, 각 검체의 유전자 발현을 공통 표준 샘플(common reference sample)과 비교하였다. 통 표준 샘플은 폐에서 기원한 여덟 개의 세포주에서 추출된 동량의 RNA를 섞어서 제조되었다. 사용된 세포주는 NCI-H23, NCI-H1299, NCI-H596, A-549, NCI-H358, NCI-H128, SK-LU-1, 및 Malme-3M이다.

하이브리드화를 위한 샘플은 20㎍의 RNA를 아미노알릴 (aminoallyl) 수식된 dUTP 존재하에 역전사한 후 화학적 방법으로 형광 염색약을 결합시켜서 제조하였다. 폐암 환자에게서 추출된 샘플을 Cy5 형광 염색약으로 표지하였고, 공통 표준 샘플 RNA를 Cy3 형광 염색약으로 표지하였다. 두 가지 형광 염색약으로 표지된 샘플을 혼합하여 마이크로어레이에 하이브리드화 하였다. 하이브리드화 후 비특이적 하이브리드화를 제거하기 위하여 SSC를 포함하는 세척 용액을 이용하여 DNA 칩을 세척하였다. 세척된 DNA 칩은 공촛점(confocal) 레이저 스캐너(Perkin Elmer, Scanarray Lite)를 이용하여 스캐닝하여 각 스팟에 존재하는 형광의 데이터를 얻어서 TIFF 형태의 이미지 파일로 저장하였다. TIFF 이미지 파일을 GenePix 3.0 (Axon Instruments)으로 정량하여 각 스팟의 형광값을 정량하였다. GenePix 3.0에서 얻어진 정량 결과는 Yang 등 (Nucleic Acids Res 2002, 30:e15)이 제안한 방법에 의해, S-plus 통계 패키지 (InSightful)에서 제공하는 'lowess' 기능을 이용하여 보정하였다.

<1-3> 마이크로어레이 결과 데이터의 전반적인 검토

8,000여개의 탐침이 올려진 cDNA (complementary DNA) 마이크로어레이의 분석을 통해 편평상피세포 폐암과 정상 폐조직의 유전자 발현 양상을 분석하였다. 편평상피세포 폐암의 전체적인 유전자 발현 양상을 살펴보기 위하여 군집화 분석(clustering analysis)과 다차원척도법 (multidimensional scaling)을 이용하였다. 군집화 분석 결과 편평상피세포 폐암 조직과 정상 폐조직은 두개의 커다란 군집으 로 나누어지는 것을 알 수 있었다 (도 1). 편평상피세포 폐암 조직과 정상 폐조직 사이에 나타나는 유전자 발현 양상의 차이는 다차원척도법에 의해서도 명확하게 알수 있었다 (도 2). 이러한 결과는 마이크로어레이 분석을 통해서 얻은 유전자 발현 결과가 편평상피세포 폐암을 진단할 수 있는 마커 유전자 선별을 위해 유용한 데이터임을 시사한다.

실시예 2 - 비소세포암과 정상 폐조직에서 발현 차이를 보이는 유전자의 선별

<2-1> t -검정을 통한 유전자 선별

편평상피세포 폐암과 정상 폐조직 사이에 발현이 유의하게 차이나는 유전자를 선별하기 위하여 p=10^-6의 유의수준에서 t-검정를 수행하였다. 이러한 유의수준에서 유전자를 선별하면, 백만번 검정을 수행하면 한번의 위양성 유전자가 나타날 것으로 기대되므로, 선별된 유전자는 모두 실제로 발현이 차이나는 유전자이다. t-검정에 의한 유전자 선별 결과 832개의 발현이 유의하게 차이나는 유전자를 선별하였고, 이중 319개의 유전자는 편평상피세포 페암 조직에서 발현이 높은 유전자이고, 513개의 유전자는 정상 폐조직에서 발현이 높은 유전자이다. 폐암의 진단을 위해서 필요한 유전자는 폐암에서 발현이 높게 나타나는 유전자이므로, 폐암에서 발현이 높은 319개의 유전자 중에서 진단 마커를 골라내고자 하였다.

<2-2> RT-PCR을 이용한 진단 마커의 검증

폐암 조기 진단 마커로서 유용성이 높은 유전자를 검증하기 위하여 RT-PCR 방법으로 유전자 발현 수준을 확인하였다. RT-PCR을 위해서는 8명의 편평상피세포 폐암으로부터 얻은 폐암 조직과 정상 조직을 사용하였다. RT-PCR 반응은 다음과 같은 방법으로 수행하였다. 5㎍의 RNA 시료를 취하여 20㎕ 반응부피에서 역전사시키고, 증류수를 첨가하여 100㎕ 로 희석하였다. 희석된 역전사 산물을 2㎕ 취하여 주형으로 이용하고, 각 유전자에 특이적인 프라이머 쌍 존재 하에 25㎕ 반응 부피에서 25 증폭 싸이클 PCR 반응을 수행하였다. PCR 반응 산물 중 8㎕를 취하여 0.5 ㎍/ml의 에티듐 브로마이드 존재하에 2% 아가로즈 젤에서 전기영동하여 밴드를 관찰하였다.

편평상피세포 폐암에서 높은 수준의 발현을 보이는 319개의 유전자 중, 발현 차이가 2배 이상인 39개의 유전자를 선별하여 (표 1), 발현 수준을 RT-PCR로 검증하였다.

t-검정에서 선별된 유전자 중 폐암 조직에서 발현 수준이 정상조직보다 2배 이상 차이를 보인 유전자

일련번호	발현 차이 (폐암/정상)	유전자 이름	GenBank Accession number	UniGen cluster ID	Gene Symbol
1	13	keratin 15	X07696	Hs.80342	KRT15
2	9.2	keratin 14 (epidermolysis bullosa simplex, Dowling-Meara, Koebner)	NM_000526	Hs.355214	KRT14
3	7	tripartite motif-containing 29	AA131550	Hs.82237	TRIM29
4	6.8	ubiquitin carboxyl-terminal esterase L1 (ubiquitin thiolesterase)	AI928978	Hs.76118	UCHL1
5	4.7	cystatin A (stefin A)	AI680589	Hs.412999	CSTA
6	4.2	serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B (ovalbumin), member 5	AI435384	Hs.55279	SERPINB5
7	3.6	BarH-like homeobox 2	AJ243512	Hs.167218	BARX2
8	3.5	collagen, type I, alpha 1	K01228	Hs.172928	COL1A1
9	3.3	small proline-rich protein 1B (cornifin)	M19888	Hs.1076	SPRR1B
10	3.2	plakophilin 1 (ectodermal dysplasia/skin fragility syndrome)	Z34974	Hs.313068	PKP1
11	3.2	thymidine kinase 1, soluble	K02581	Hs.164457	TK1
12	3.1	follistatin	NM_013409	Hs.9914	FST
13	2.6	Kruppel-like factor 5 (intestinal)	D14520	Hs.84728	KLF5
14	2.6	eukaryotic translation initiation factor 1A, Y-linked	AF000987	Hs.461178	EIF1AY
15	2.5	Similar to My016 protein (LOC339088), mRNA	AA398908	Hs.449815
16	2.5	ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 5	AB005659	Hs.34744	ABCC5
17	2.5	desmocollin 2	AI888282	Hs.95612	DSC2
18	2.4	non-metastatic cells 1, protein (NM23A) expressed in	AW024667	Hs.118638	NME1
19	2.4	flap structure-specific endonuclease 1	X76771	Hs.409065	FEN1
20	2.4	nuclear cap binding protein subunit 2, 20kDa	AI955092	Hs.240770	NCBP2
21	2.4	histone 1, H2ae	AA436989	Hs.121017	HIST1H2AE
22	2.4	procollagen-lysine, 2-oxoglutarate 5-dioxygenase (lysine hydroxylase) 2	U84573	Hs.41270	PLOD2
23	2.4	protein kinase, cAMP-dependent, catalytic, alpha	X07767	Hs.194350	PRKACA
24	2.3	vaccinia related kinase 1	AA312869	Hs.422662	VRK1
25	2.3	neurotrophic tyrosine kinase, receptor, type 2	U12140	Hs.439109	NTRK2
26	2.3	protein tyrosine phosphatase, receptor type, F	AI735029	Hs.75216	PTPRF
27	2.3	asparagine synthetase	NM_001673	Hs.446546	ASNS
28	2.3	jagged 1 (Alagille syndrome)	U61276	Hs.409202	JAG1
29	2.2	S-adenosylhomocysteine hydrolase	M61831	Hs.388004	AHCY
30	2.2	FK506 binding protein 4, 59kDa	M88279	Hs.848	FKBP4
31	2.2	glutathione peroxidase 2 (gastrointestinal)	X68314	Hs.2704	GPX2
32	2.2	matrix metalloproteinase 1 (interstitial collagenase)	M13509	Hs.83169	MMP1
33	2.2	integrin, beta 4	X51841	Hs.85266	ITGB4
34	2.1	nipsnap homolog 1 (C. elegans)	AJ001258	Hs.173878	NIPSNAP1
35	2.1	solute carrier family 7, (cationic amino acid transporter, y+ system) member 11	N35555	Hs.6682	SLC7A11
36	2.1	protein kinase, DNA-activated, catalytic polypeptide	U34994	Hs.415749	PRKDC
37	2.1	tumor protein D52	U18914	Hs.162089	TPD52
38	2.1	phosphatidic acid phosphatase type 2C	AF047760	Hs.24879	PPAP2C
39	2.1	proteasome (prosome, macropain) 26S subunit, non-ATPase, 14	U86782	Hs.178761	PSMD14

이중 10개의 유전자(PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4)는 정상 폐조직에서는 발현이 관찰되지 않고, 폐암조직에서만 발현이 관찰되었다 (도 3). 나머지 29개의 유전자는 폐암 조직에서 정상조직보다 높은 수준으로 발현되었으나, 정상조직에서도 발현이 관찰되었다. 이 결과에서 폐암 조직에서만 특이적으로 발현되는 10개의 마커 유전자 (PKP1, ABCC5, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4)는 폐암 진단을 위한 진단 마커로 사용될 수 있다.

본 발명의 폐암 마커의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준을 검출하여 폐암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있다.

<110> DIGTAL GENOMICS INC. <120> Markers for the diagnosis of lung cancer <150> PCT/KR2005000279 <151> 2005-01-31 <160> 30 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5451 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(5451) <223> PKP1 <400> 1 gggtggtgca gggcaggggt ggtatatcct gtctgacgga gggcgggcct cgccagtgcc 60 agagagggac gaaccagggt ggaagcgcca ggagcagctg cagggagccc tcacgcggac 120 ctcgcactct atggccgtag ggagccgctg agagcgagaa gagcacgctc ctgcccgccc 180 gctgcaccgc acctcgcctc gcctctctgc tctcctaggc cccggccgcg cgccacccgc 240 ctcccgccac catgaaccac tcgccgctca agaccgcctt ggcgtacgaa tgcttccagg 300 accaggacaa ctccacgttg gctttgccgt cggaccaaaa gatgaaaaca ggcacgtctg 360 gcaggcagcg cgtgcaggag caggtgatga tgaccgtcaa gcggcagaag tccaagtctt 420 cccagtcgtc caccctgagc cactccaatc gaggttccat gtatgatggc ttggctgaca 480 attacaacta tgggaccacc agcaggagca gctactactc caagttccag gcagggaatg 540 gctcatgggg atatccgatc tacaatggaa ccctcaagcg ggagcctgac aacaggcgct 600 tcagctccta cagccagatg gagaactgga gccggcacta cccccggggc 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gtacaggaca caggactacc cgtcggtgcc caccctggtg cgcctgctcg ccaagcacaa 1140 catcatcccc atctttgctg tcaccaacta ctcctatagc tactacgaga agcttcacac 1200 ctatttccct gtctcctcac tgggggtgct gcaggaggac tcgtccaaca tcgtggagct 1260 gctggaggag gccttcaatc ggatccgctc caacctggac atccgggccc tagacagccc 1320 ccgaggcctt cggacagagg tcacctccaa gatgttccag aagacgagga ctgggtcctt 1380 tcacatccgg cggggggaag tgggtatata ccaggtgcag ctgcgggccc ttgagcacgt 1440 ggatgggacg cacgtgtgcc agctgccgga ggaccagaag ggcaacatcc atctgaaacc 1500 ttccttctcc gacggcctca agatggacgc gggcatcatc tgtgatgtgt gcacctgcga 1560 gctgcaaaaa gaggtgcggt cagctcgctg cagcttcaac ggagacttcg tgtgcggaca 1620 gtgtgtgtgc agcgagggct ggagtggcca gacctgcaac tgctccaccg gctctctgag 1680 tgacattcag ccctgcctgc gggagggcga ggacaagccg tgctccggcc gtggggagtg 1740 ccagtgcggg cactgtgtgt gctacggcga aggccgctac gagggtcagt tctgcgagta 1800 tgacaacttc cagtgtcccc gcacttccgg gttcctctgc aatgaccgag gacgctgctc 1860 catgggccag tgtgtgtgtg agcctggttg gacaggccca agctgtgact gtcccctcag 1920 caatgccacc tgcatcgaca gcaatggggg catctgtaat ggacgtggcc actgtgagtg 1980 tggccgctgc cactgccacc agcagtcgct ctacacggac accatctgcg agatcaacta 2040 ctcggcgatc cacccgggcc tctgcgagga cctacgctcc tgcgtgcagt gccaggcgtg 2100 gggcaccggc gagaagaagg ggcgcacgtg tgaggaatgc aacttcaagg tcaagatggt 2160 ggacgagctt aagagagccg aggaggtggt ggtgcgctgc tccttccggg acgaggatga 2220 cgactgcacc tacagctaca ccatggaagg tgacggcgcc cctgggccca acagcactgt 2280 cctggtgcac aagaagaagg actgccctcc gggctccttc tggtggctca tccccctgct 2340 cctcctcctc ctgccgctcc tggccctgct actgctgcta tgctggaagt actgtgcctg 2400 ctgcaaggcc tgcctggcac ttctcccgtg ctgcaaccga ggtcacatgg tgggctttaa 2460 ggaagaccac tacatgctgc gggagaacct gatggcctct gaccacttgg acacgcccat 2520 gctgcgcagc gggaacctca agggccgtga cgtggtccgc tggaaggtca ccaacaacat 2580 gcagcggcct ggctttgcca ctcatgccgc cagcatcaac cccacagagc tggtgcccta 2640 cgggctgtcc ttgcgcctgg cccgcctttg caccgagaac ctgctgaagc ctgacactcg 2700 ggagtgcgcc cagctgcgcc aggaggtgga ggagaacctg aacgaggtct acaggcagat 2760 ctccggtgta cacaagctcc agcagaccaa gttccggcag cagcccaatg ccgggaaaaa 2820 gcaagaccac accattgtgg acacagtgct gatggcgccc cgctcggcca agccggccct 2880 gctgaagctt acagagaagc aggtggaaca gagggccttc cacgacctca aggtggcccc 2940 cggctactac accctcactg cagaccagga cgcccggggc atggtggagt tccaggaggg 3000 cgtggagctg gtggacgtac gggtgcccct ctttatccgg cctgaggatg acgacgagaa 3060 gcagctgctg gtggaggcca tcgacgtgcc cgcaggcact gccaccctcg gccgccgcct 3120 ggtaaacatc accatcatca aggagcaagc cagagacgtg gtgtcctttg agcagcctga 3180 gttctcggtc agccgcgggg accaggtggc ccgcatccct gtcatccggc gtgtcctgga 3240 cggcgggaag tcccaggtct cctaccgcac acaggatggc accgcgcagg gcaaccggga 3300 ctacatcccc gtggagggtg agctgctgtt ccagcctggg gaggcctgga aagagctgca 3360 ggtgaagctc ctggagctgc aagaagttga ctccctcctg cggggccgcc aggtccgccg 3420 tttccacgtc cagctcagca accctaagtt tggggcccac ctgggccagc cccactccac 3480 caccatcatc atcagggacc cagatgaact ggaccggagc ttcacgagtc agatgttgtc 3540 atcacagcca ccccctcacg gcgacctggg cgccccgcag aaccccaatg ctaaggccgc 3600 tgggtccagg aagatccatt tcaactggct gcccccttct ggcaagccaa tggggtacag 3660 ggtaaagtac tggattcagg gtgactccga atccgaagcc cacctgctcg acagcaaggt 3720 gccctcagtg gagctcacca acctgtaccc gtattgcgac tatgagatga aggtgtgcgc 3780 ctacggggct cagggcgagg gaccctacag ctccctggtg tcctgccgca cccaccagga 3840 agtgcccagc gagccagggc gtctggcctt caatgtcgtc tcctccacgg tgacccagct 3900 gagctgggct gagccggctg agaccaacgg tgagatcaca gcctacgagg tctgctatgg 3960 cctggtcaac gatgacaacc gacctattgg gcccatgaag aaagtgctgg ttgacaaccc 4020 taagaaccgg atgctgctta ttgagaacct tcgggagtcc cagccctacc gctacacggt 4080 gaaggcgcgc aacggggccg gctgggggcc tgagcgggag gccatcatca acctggccac 4140 ccagcccaag aggcccatgt ccatccccat catccctgac atccctatcg tggacgccca 4200 gagcggggag gactacgaca gcttccttat gtacagcgat gacgttctac gctctccatc 4260 gggcagccag aggcccagcg tctccgatga cactggctgc ggctggaagt tcgagcccct 4320 gctgggggag gagctggacc tgcggcgcgt cacgtggcgg ctgcccccgg agctcatccc 4380 gcgcctgtcg gccagcagcg ggcgctcctc cgacgccgag gcgccccacg ggcccccgga 4440 cgacggcggc gcgggcggga agggcggcag cctgccccgc agtgcgacac ccgggccccc 4500 cggagagcac ctggtgaatg gccggatgga ctttgccttc ccgggcagca ccaactccct 4560 gcacaggatg accacgacca gtgctgctgc ctatggcacc cacctgagcc cacacgtgcc 4620 ccaccgcgtg ctaagcacat cctccaccct cacacgggac tacaactcac tgacccgctc 4680 agaacactca cactcgacca cactgcccag ggactactcc accctcacct ccgtctcctc 4740 ccacgactct cgcctgactg ctggtgtgcc cgacacgccc acccgcctgg tgttctctgc 4800 cctggggccc acatctctca gagtgagctg gcaggagccg cggtgcgagc ggccgctgca 4860 gggctacagt gtggagtacc agctgctgaa cggcggtgag ctgcatcggc tcaacatccc 4920 caaccctgcc cagacctcgg tggtggtgga agacctcctg cccaaccact cctacgtgtt 4980 ccgcgtgcgg gcccagagcc aggaaggctg gggccgagag cgtgagggtg tcatcaccat 5040 tgaatcccag gtgcacccgc agagcccact gtgtcccctg ccaggctccg ccttcacttt 5100 gagcactccc agtgccccag gcccgctggt gttcactgcc ctgagcccag actcgctgca 5160 gctgagctgg gagcggccac ggaggcccaa tggggatatc gtcggctacc tggtgacctg 5220 tgagatggcc caaggaggag ggccagccac cgcattccgg gtggatggag acagccccga 5280 gagccggctg accgtgccgg gcctcagcga gaacgtgccc tacaagttca aggtgcaggc 5340 caggaccact gagggcttcg ggccagagcg cgagggcatc atcaccatag agtcccagga 5400 tggaggaccc ttcccgcagc tgggcagccg tgccgggctc ttccagcacc cgctgcaaag 5460 cgagtacagc agcatcacca ccacccacac cagcgccacc gagcccttcc tagtggatgg 5520 gctgaccctg ggggcccagc acctggaggc aggcggctcc ctcacccggc atgtgaccca 5580 ggagtttgtg agccggacac tgaccaccag cggaaccctt agcacccaca tggaccaaca 5640 gttcttccaa acttgaccgc accctgcccc acccccgcca cgtcccacta ggcgtcctcc 5700 cgactcctct cccggagcct cctcagctac tccatccttg cacccctggg ggcccagccc 5760 acccgcatgc acagagcagg ggctaggtgt ctcctgggag gcatgaaggg ggcaaggtcc 5820 gtcctctgtg ggcccaaacc tatttgtaac caaagagctg ggagcagcac aaggacccag 5880 cctttgttct gcacttaata aatggttttg ctactgctaa aaaaa 5925 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ITGB4 <400> 29 tgagccagct gagacca 17 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplification of ITGB4 <400> 30 ctgggactcc cgaagttctc 20

Claims

PKP1 (plakophilin 1) 및 ABCC5 (ATP-binding cassette, subfamily C (CFTR/MRP), member 5) 중에서 선택되는 1 또는 2개 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 키트.
제1항에 있어서, KRT15 (keratin 15), KRT14 (keratin 14), TRIM29 (tripartite motif-containing 29), SERPINB5 (serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade B(ovalbumin), member 5), TK1 (thymidine kinase 1,soluble), GPX2 (glutathione peroxidase 2), MMP1 (matrix metalloproteinase 1) 및 ITGB4 (integrin, beta 4) 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 키트.
제1항에 있어서, RT-PCR 검출, DNA 칩 또는 ELISA 검출용 키트.
PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 조성물.
제4항에 있어서, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 유전자에 특이적인 프라이머 쌍을 추가로 포함하는 조성물.
PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 폐암 진단 마커 검출용 조성물.
제6항에 있어서, KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 단백질에 특이적인 항체를 추가로 포함하는 조성물.
PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 폐암 의심 환자의 생물학적 시료로부터 mRNA을 측정하는 단계 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하여 폐암을 진단하는 방법.
제8항에 있어서, 추가로 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 유전자에 특이적인 프라이머를 사용하여 폐암을 진단하는 방법.
PKP1 및 ABCC5 중에서 선택되는 1 또는 2개 단백질에 특이적인 항체를 폐암 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계, 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하여 폐암을 진단하는 방법.
제10항에 있어서, 추가로 KRT15, KRT14, TRIM29, SERPINB5, TK1, GPX2, MMP1 및 ITGB4 중에서 선택되는 1개 내지 8개의 단백질에 특이적인 항체를 사용하여 폐암을 진단하는 방법.