KR102031858B1 - 노화 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 진단하는 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 피부 자연노화 마우스 및 사람과 대조군에서의 유전자 발현 수준을 비교하여, 피부 자연노화에 대해 바이오마커 역할을 수행할 수 있는 유전자들을 발굴하였고, 이러한 유전자와 상보적으로 결합할 수 있는 프로브를 통해 피부 자연노화의 예후 예측, 진단 및 노화 조절용 후보물질 스크리닝에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 노화를 진단할 수 있는 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
노화의 복잡한 생물학적 과정은 진핵생물의 다양한 시스템 내에서 유전자 발현, 미토콘드리아 기능장애, 산화스트레스, 말단소립자의 단축 등과 같은 생물학적 및 생리적 기능의 변화를 초래하였다. 축적된 연구 자료에 의하면 이러한 변화는 결국 심혈관 질환, 제2 형 당뇨, 암, 그리고 알츠하이머 질병을 포함한 노화 관련된 질병에 대한 가장 중요한 위험 요소이다. 이들 질병이 노인들의 사망률과 밀접한 상관관계가 있음을 감안할 때, 모든 노화와 관련된 질병들을 합쳐놓은 것이 가장 좋은 노화 관련 지표이다. 따라서 대부분의 노화 연구들은 다양한 발달된 분자생물학적, 생화학적 기술들을 이용하여 노화 관련 질병들과 관련된 지표들을 찾는 데 초점을 맞추고 있다.
허나 노화(senesence 또는 aging)는 나이가 들면서 일어나는 쇠퇴적인 현상으로써, 노화 관련 질병이 아닌 노화와 관련된 메커니즘을 좀 더 이해하고자, 세포, 조직, 혈액, 소변 등 생체 유기체 내에서 생체 대사과정의 최종 생성물인 저분자 대사물질들을 이용한 대사체학을 이용함으로써, 노화와 관련된 잠재적 지표들을 발굴한 바 있다(특허문헌 1). 이는 NMR 및 질량 분석기를 이용함으로써, C. elegans, 초파리, 설치류 동물, 인간, 그리고 다른 모델 생물의 노화 관련 대사체 분석연구를 통해 많은 대사물질들, 특히 간에서의 대사물질이 노화 수준을 측정할 수 있는 지표로 사용될 수 있음을 제안하고 있다. 허나 여전히 정확도가 높은 바이오마커를 개발할 필요가 있으며, 노화 진단을 위한 유전자 발현 신호 바이오마커(gene expression signature biomaker)를 개발하여, 노화의 수준을 높은 정확도와 간단한 과정을 통해 진단하려는 시도는 거의 없었으며, 특히 채취가 쉽고 간편한 피부로부터 노화 전후의 특이적 유전자 발현 신호들을 진단적 또는 예후 인자로 공식적으로 권장되는 표지자는 개시된 바 없다.
본 발명은 상술한 문제점을 해결함과 동시에, 노화 의심 개체로부터 쉽고 빠르게 노화를 진단할 수 있도록 하는 바이오마커를 개발하고자 노력한 바 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
상기와 같은 문제점을 감안하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 다수의 유전자 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하여, 이의 변화양상을 이용하여 간편하게 노화 여부를 구별할 수 있도록 하는 노화 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 노화 의심 개체의 생물학적 시료로부터 쉽고 간편하게 노화 진단이 가능한 진단용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 노화 진단에 필요한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 노화에 대한 유도 또는 억제용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 목적을 이루기 위하여, SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화 진단용 조성물을 제공한다.
상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3는 순서대로 서열번호 1 내지 8의 염기서열인 것을 특징으로 한다.
상기 유전자 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 유전자 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 노화 진단용 조성물은 피부 조직 또는 세포의 노화를 진단할 수 있는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 다른 목적을 이루기 위하여, 상기 노화 진단용 조성물을 포함하는 노화 진단용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, 생물학적 시료로부터 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출하여, 노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
상기 생물학적 시료로부터 검출된 수치를 대조군 시료로부터 검출된 수치와 비교하여 노화 여부를 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기 생물학적 시료로부터 검출된 수치가 대조군 시료로부터 검출된 수치보다 높거나 낮을 경우, 노화 개체로 판단하는 것을 특징으로 한다.
상기 생물학적 시료는 피부 조직 또는 세포인 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 또 다른 목적을 이루기 위하여, (a) 검체에 노화 조절용 후보물질을 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 검체로부터 생물학적 시료를 분리하고, 상기 분리된 생물학적 시료로부터 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 노화 조절용 후보물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 단백질 수준의 측정은 웨스턴블랏팅, 자석비드-항체면역침강법, ELISA, 면역화학조직염색 및 질량분석기에서 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것을 특징으로 한다.
상기 mRNA의 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 및 DNA 칩에서 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 노화 진단용 조성물은, SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함한다.
상기 유전자 또는 이의 단백질의 수준(발현량)이 노화된 개체에서 젊은 개체에 비해 증가 또는 감소되는 것을 확인하였으므로, 이의 수준을 측정하는 제제를 포함함으로써 노화 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
게다가 상술한 유전자 또는 단백질은 노화 의심 개체의 생물학적 시료로부터 노화 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있으므로, 채취부터 진단까지 신속하고 빠르게 이루어지도록 할 뿐만 아니라, 이를 이용하여 보다 효율적으로 노화 유도용 또는 억제용 물질을 개발할 수 있다.
또한 본 발명에 따른 노화 진단용 조성물은 노화된 개체와 젊은 개체의 분류에 있어서 정확도, 민감도 및 특이도가 매우 우수하다.
도 1은 대조군 마우스에 대한 자연노화 마우스의 피부 조직에서 유전체 발현 변화 양상 및 발현 변화 유전자 개수를 측정하여 나타낸 것으로, 도 1A는 대조군 마우스에 대하여 자연노화 마우스에서의 유전체 발현 양상 차이를 나타낸 scatter plot이고, 도 1B는 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스에서 mRNA 발현 양상이 변화한 유전자의 개수를 나타낸 그래프이다. 이때 적색은 유의하게 증가한 유전자를 나타낸 것이고, 청색은 유의하게 감소한 유전자를 나타낸 것이다.
도 2는 자연노화 마우스와 대조군 마우스의 피부 조직으로부터 노화 표적 유전자 후보들의 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2a는 ADAMTS15 유전자에 관한 것이고, 도 2b는 ATP12A 유전자에 관한 것이며, 도 2c는 SERPINH1 유전자에 관한 것이며, 도 2d는 LCN2 유전자에 관한 것이며, 도 2e는 SPARC 유전자에 관한 것이며, 도 2f는 TNC 유전자에 관한 것이며, 도 2g는 AXL 유전자에 관한 것이며, 도 2h는 CD248 유전자에 관한 것이며, 도 2i는 COCH 유전자에 관한 것이며, 도 2j는 HP 유전자에 관한 것이며, 도 2k는 PXDN 유전자에 관한 것이며, 도 2l는 RBP1 유전자에 관한 것이며, 도 2m는 TCHH 유전자에 관한 것이며, 도 2n는 TNN 유전자에 관한 것이며, 도 2o는 LRG1 유전자에 관한 것이며, 도 2p는 PCOLCE1 유전자에 관한 것이며, 도 2q는 BMP1 유전자에 관한 것이며, 도 2r은 SOD3 유전자에 관한 것이다.
도 3은 자연노화 마우스 및 대조군 마우스의 피부 조직에서 노화 표적 유전자 후보들의 단백질 발현을 분석한 웨스틴 블롯 결과 사진이다. 도 3a는 SERPINH1 단백질 발현을 관찰한 것이고, 도 3b는 SPARC 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3c는 RBP1 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3d는 TCHH 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3e는 SOD3 단백질 발현을 관찰한 것이다.
도 4는 자연노화 마우스(old) 및 대조군 마우스(young)의 피부 조직을 각 노화 표적 유전자 후보(SERPINH1, SPARC, LRG1)에 대한 단백질 항체로 IHC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(200 배율).
도 5는 자연노화 인체 모델(old) 및 대조군 인체 모델(young)의 피부 조직을 각 노화 표적 유전자 후보(SERPINH1, LCN2, TNC)에 대한 단백질 항체로 IHC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(200 배율).
도 2는 자연노화 마우스와 대조군 마우스의 피부 조직으로부터 노화 표적 유전자 후보들의 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2a는 ADAMTS15 유전자에 관한 것이고, 도 2b는 ATP12A 유전자에 관한 것이며, 도 2c는 SERPINH1 유전자에 관한 것이며, 도 2d는 LCN2 유전자에 관한 것이며, 도 2e는 SPARC 유전자에 관한 것이며, 도 2f는 TNC 유전자에 관한 것이며, 도 2g는 AXL 유전자에 관한 것이며, 도 2h는 CD248 유전자에 관한 것이며, 도 2i는 COCH 유전자에 관한 것이며, 도 2j는 HP 유전자에 관한 것이며, 도 2k는 PXDN 유전자에 관한 것이며, 도 2l는 RBP1 유전자에 관한 것이며, 도 2m는 TCHH 유전자에 관한 것이며, 도 2n는 TNN 유전자에 관한 것이며, 도 2o는 LRG1 유전자에 관한 것이며, 도 2p는 PCOLCE1 유전자에 관한 것이며, 도 2q는 BMP1 유전자에 관한 것이며, 도 2r은 SOD3 유전자에 관한 것이다.
도 3은 자연노화 마우스 및 대조군 마우스의 피부 조직에서 노화 표적 유전자 후보들의 단백질 발현을 분석한 웨스틴 블롯 결과 사진이다. 도 3a는 SERPINH1 단백질 발현을 관찰한 것이고, 도 3b는 SPARC 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3c는 RBP1 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3d는 TCHH 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3e는 SOD3 단백질 발현을 관찰한 것이다.
도 4는 자연노화 마우스(old) 및 대조군 마우스(young)의 피부 조직을 각 노화 표적 유전자 후보(SERPINH1, SPARC, LRG1)에 대한 단백질 항체로 IHC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(200 배율).
도 5는 자연노화 인체 모델(old) 및 대조군 인체 모델(young)의 피부 조직을 각 노화 표적 유전자 후보(SERPINH1, LCN2, TNC)에 대한 단백질 항체로 IHC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(200 배율).
이하에서, 본 발명의 여러 측면 및 다양한 구현예에 대해 더욱 구체적으로 살펴보도록 한다.
본 발명은 노화된 동물모델과 대조군의 전사체를 비교 분석을 통해, 노화 진단에 대한 특정 단일 또는 다중 유전자를 찾고, 이를 인체 실험 결과와 비교하였으며, 다양한 종래의 문헌을 통한 연구를 거듭한 끝에 완성하게 되었다.
본 발명의 일 측면은 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어 "바이오마커" 또는 "진단용 마커"란 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료반응을 예측할 수 있고 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 특히, 본 발명에서 노화와 관련해서는, 정상 대조군(노화되지 않은 개체 또는 군)에 비해 노화가 진행되었거나, 노화된 정도가 높은 개체 또는 집단에서 단백질 발현 수준 또는 유전자 발현 수준이 유의적으로 증가하거나 감소하는 양상을 보이는, 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 의미한다.
또한 "노화 진단용 조성물"이란 상기 바이오마커 또는 진단용 마커를 포함함으로써, 노화 정도를 판별하거나, 노화 정도를 진단할 수 있는 조성물을 의미한다.
본 발명에서 노화를 진단할 수 있는 바이오마커로 활용될 수 있는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자로, 이들은 24 개월 동안의 자연노화가 진행된 마우스 모델을 사용하여 자연노화에 의해 유도된 피부 조직에 포함되는 유전자 뿐만 아니라 자연노화가 발생한 인체 모델을 사용하여 자연노화에 의해 유도된 피부 조직에 포함되는 유전자 변화 및 공개된 피부 섬유아세포의 마이크로어레이 데이터 세트(GSE69391) 중 어느 하나 이상의 데이터베이스를 기준으로 조사한 결과, 통계적으로 가장 유의한 수준(p-value≤0.05)으로 유전자 발현이 증가하거나 감소하면서도 어느 하나 이상의 다른 데이터베이스에서 50% 이상의 같은 경향성을 보일 뿐만 아니라, 단백질 수준 변화도 일치한다.
앞서 언급한 바와 같이 다양한 기준을 이용하여 다양한 측면에서 노화 표적 유전자 후보를 선별하고, 동물 모델과 인체 모델의 피부 조직에서의 단백질 발현까지 확인한 결과, 가장 신뢰도 및 정확도가 우수한 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 및 이들의 단백질을 선별할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 유의성 있는 노화 진단 유전자 또는 이의 단백질의 발현정도를 측정하여 얻은 결과를 토대로 예후 예측된 결과는 타당하게 신뢰할 수 있음을 알 수 있다.
나아가, 이렇게 확인된 유전자들이 특정 자연노화가 진행된 환자군의 피부 조직에서 특이적으로 고발현 또는 저발현하는 것이라는 점을 감안한다면, 이 유전자들의 생리학적 기능은 노화 진행, 특히 상기 노화와 관련된 생리학적 기능에 직접적으로 관계된 것일 가능성이 있으며, 따라서 이 유전자들은 노화 진행의 메커니즘을 연구하거나 노화 억제 또는 유도용 물질의 개발을 위한 표적으로서도 유용하게 사용될 수 있다.
특히 본 발명의 노화 진단용 조성물은 종래 유래가 없는 정도의 다양한 데이터베이스를 통계적으로 비교 분석하여 발굴해낸 것이기 때문에, 극히 일부 인체 모델 또는 동물 모델의 피부 조직의 유전자 발현 프로파일에 기초하여 발굴된 종래의 노화 관련 마커들에 비하여 더욱 유의성이 있고 임상적으로 활용 가치가 높으며, 노화 수준 추정에 있어서 보다 정확한 예측력을 보유하는 것이다.
현재까지 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 노화의 진단 또는 노화 수준을 판별하기 위한 바이오마커로 사용된 예가 개시된 종래 기술은 전혀 알려진 바가 없다. 또한 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자에 상보적으로 결합하여, 이의 발현을 검출할 수 있는 프로브 또는 프라이머를 비롯하여, 이들의 단백질 수준을 검출할 수 있는 항체 또는 앱타머를 이용하여 노화를 진단할 수 있다는 예도 개시된 바 없다.
본 발명에서 "진단"은 노화 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하는 것으로, 본 발명의 목적 상 진단이라 함은 노화 상태 또는 노화 수준을 판별 및 확인하는 것이다.
하기 표 1에서는 본 발명의 노화 진단용 조성물에 포함되는, 노화로 판단되는 노화 의심 개체로부터 정상군에 비하여 발현이 저하되는 유전자(SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3)를 나타낸 것이다. 참고로 하기 표에서 GBAcc는 NBCI의 genebank의 accession ID를 의미한다.
| Gene symbol | Gene name | 서열번호 | GBAcc |
| SERPINH1 | Serpin family H member 1 | 서열번호 1 | NM_001235.3 |
| LCN2 | Lipocalin 2 | 서열번호 2 | NM_005564.4 |
| SPARC | Secreted protein acidic and cysteine rich glycoprotein | 서열번호 3 | NM_003118.3 |
| TNC | Tenascin-C | 서열번호 4 | NM_002160.3 |
| RBP1 | Retinol binding protein 1 | 서열번호 5 | NM_002899.3 |
| TCHH | Trichohyalin | 서열번호 6 | NM_007113.3 |
| LRG1 | Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1 | 서열번호 7 | NM_052972.2 |
| SOD3 | Superoxide dismutase 3 | 서열번호 8 | NM_003102.2 |
따라서 본 발명에 따른 상기 8종의 유전자들 중에서 어느 하나 이상의 유전자의 발현량 또는 이의 단백질의 발현량을 측정할 경우, 노화 의심 개체에 대한 노화 수준을 진단 또는 판별할 수 있다.
본 발명에서 자연적으로 노화가 진행된 동물 또는 인체 모델과 이들 각각에 대한 정상군(대조군; control)을 대상으로 유전자 발현수준 및 단백질 발현수준을 비교한 결과, 자연적으로 노화가 진행된 동물 또는 인체 모델에서 정상군에서보다 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1, SOD3 유전자의 발현이 가장 유의적(p-value<0.05)으로 감소하는 것을 확인하였다. 즉, 상기 8종의 선별된 유전자들 중에서 어느 하나 이상 유전자의 발현 수준을 확인함으로써, 노화 수준을 진단하거나 판별할 수 있는 것이다.
따라서 본 발명은 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자발현을 검출하여, 노화의 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 피부 조직 세포에서의 발현 정도를 분석하는 것이 바람직하다.
또한 본 발명의 일 실시예에 따르면 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 단독 또는 조합으로 사용할 수 있으나, 단독으로 사용하는 것보다 다중 유전자에 대한 mRNA 수준을 측정하는 제제를 포함하거나, 다중 유전자에 대한 단백질 수준을 측정하는 제제를 모두 포함하였을 때, 노화 진단 정확도나 신뢰도가 현저히 높아진다.
상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 서열은 각각 순서대로 서열번호 1 내지 8의 염기서열일 수 있다.
본 발명의 노화 진단용 조성물 포함되는 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제는, 상기 유전자에 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머이고, 상기 유전자 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머일 수 있다.
본 발명의 노화 진단용 조성물은 본 발명의 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제 이외에도, 상기 제제의 구조 또는 생리활성을 안정하게 유지시켜 주는 완충액 도는 반응액이 추가로 포함될 수 있으며, 안정성을 유지하기 위해 분말 상태 또는 적절한 완충액에 용해된 상태로 제공될 수 있다.
또한, 본 발명의 노화 진단용 조성물은 진단의 신속도 및 편리성을 높이기 위해, 적합한 담체 또는 지지체상에 공지된 다양한 방법을 이용하여 고정화된 상태로 제공될 수 있다(Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow & Lane; Cold Spring Harbor, 1988). 적합한 담체 또는 지지체의 예로는 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 유리, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 컵, 플랫 팩(flat packs) 등이 포함될 수 있다. 그 외의 다른 고체 기질로는 세포 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
본 명세서에서 상보적(complementary)이라는 용어는 어떤 특정한 혼성화 또는 어닐링 조건 하에서 본 발명에서 선별된 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 또는 이의 단백질에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도의 상보성을 갖는 것을 의미한다. 따라서 상보적이라는 용어는 완전 상보적(perfectly complementary)과는 다른 의미를 가지며, 본 발명의 프라이머 또는 프로브는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있을 정도이면, 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 프로브라는 용어는 자연의 또는 변형된 모노머 또는 연쇄(linkages)의 선형 올리고머를 의미하며, 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하고 타켓 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 혼성화할 수 있으며, 자연적으로 존재하거나 또는 인위적으로 합성된 것을 말한다. 본 발명에 따른 프로브는 단일쇄일 수 있으며, 바람직하게는 올리고디옥시리보뉴클레오티드일 수 있다. 본 발명의 프로브는 자연 dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 뉴클레오타이드 유사체 또는 유도체를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 프로브는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 프로브는 골격 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 펩타이드 핵산 (PNA) (M. Egholm et al., Nature, 365:566-568(1993)), 포스포로티오에이트 DNA, 포스포로디티오에이트 DNA, 포스포로아미데이트 DNA, 아마이드-연결된 DNA, MMI-연결된 DNA, 2'-O-메틸 RNA, 알파-DNA 및 메틸포스포네이트 DNA, 당 변형된 뉴클레오타이드 예컨대, 2'-O-메틸 RNA, 2'-플루오로 RNA, 2'-아미노 RNA, 2'-O-알킬 DNA, 2'-O-알릴 DNA, 2'-O-알카이닐 DNA, 헥소스 DNA, 피라노실 RNA 및 안히드로헥시톨 DNA, 및 염기 변형을 갖는 뉴클레오타이드 예컨대, C-5 치환된 피리미딘(치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 에티틸-, 프로피닐-, 알카이닐-, 티아졸릴-, 이미다졸릴-, 피리딜- 포함), C-7 치환기를 갖는 7-데아자퓨린 (치환기는 플루오로-, 브로모-, 클로로-, 아이오도-, 메틸-, 에틸-, 비닐-, 포르밀-, 알카이닐-, 알켄일-, 티아졸릴-, 이미다졸릴-, 피리딜-), 이노신 및 디아미노퓨린을 포함할 수 있다.
본 명세서에서, 프라이머란 용어는 적합한 온도 및 적합한 완충액 내에서 적합한 조건(즉, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 요소, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변화가 있을 수 있다. 또한, 프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 또한, 본 발명에 따른 프라이머는 유전자 증폭 반응에 이용될 수 있는 것이 바람직하다. 상기 증폭 반응은 핵산 분자를 증폭하는 반응을 말하며, 이러한 유전자 증폭 반응들에 대해서는 당업계에 잘 알려져 있고, 예컨대, 중합효소 연쇄반응(PCR), 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), 전자 중재 증폭(TMA), 핵산 염기서열 기판 증폭(NASBA) 등이 포함될 수 있다.
본 발명에서 용어 "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로, 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다, 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명에서 선별된 8종의 유전자가 코딩하는 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함한다. 상기한 바와 같이 본 발명의 유전자가 코딩하는 단백질이 규명되었으므로 이를 이용하여 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다.
다클론 항체는 상기 선별된 8종의 노화 표적 유전자 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 코딩하는 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 및 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.
단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다(Kohler 및 Milstein(1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조). 단클론 항체를 분비하는 "하이브리도마"를 만들기 위해 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 상기 선별된 8종의 노화 표적 유전자 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 코딩하는 단백질 항원을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 수득한 후, 마커 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다. 상기한 하이브리도마가 생산하는 단클론 항체는 정제하지 않고 사용할 수도 있으나, 최선의 결과를 얻기 위해서는 당업계에 널리 공지된 방법에 따라 고순도로 정제하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 사용하기 위한 항체의 정제 기술로는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등을 이용할 수 있다.
본 발명의 상기 선별된 8종의 노화 표적 유전자 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 코딩하는 단백질의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 노화 진단용 조성물 즉, SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 노화 진단용 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 노화 진단용 키트에 포함되는 노화 진단용 조성물에 대해서는 앞서 기술된 바와 같다.
상기 노화 진단용 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 또는 단백질 칩 키트일 수 있다.
상기 노화 진단용 키트가 만일 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는 본 발명의 키트는 선택적으로 PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus (Taq), Thermus thermophilus (Tth), Thermus filiformis, Thermisflavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus(Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있으며, 본 발명의 노화 진단용 키트가 면역 분석에 적용되는 경우, 본 발명의 키트는 선택적으로, 이차항체 및 표지의 기질을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징(packaging) 또는 컴파트먼트(compartment)로 제작될 수 있다.
나아가 본 발명의 키트는 마이크로어레이일 수 있는데, 상기 프로브 또는 프라이머는 혼성화 어레이 요소(hybridizable arrayelement)로서 이용되며, 기체(substrate) 상에 고정화된다. 바람직한 기체는 적합한 견고성 또는 반-견고성 지지체로서, 예컨대, 막, 필터, 칩, 슬라이드, 웨이퍼, 파이버, 자기성 비드 또는 비자기성 비드, 겔, 튜빙, 플레이트, 고분자, 미소입자 및 모세관을 포함할 수 있다. 상기 혼성화 어레이 요소는 상기 기체 상에 배열되고 고정화되며, 이와 같은 고정화는 화학적 결합 방법 또는 UV와 같은 공유 결합적 방법에 의해 수행될 수 있다.
예를 들어, 상기 혼성화 어레이 요소는 에폭시 화합물 또는 알데히드기를 포함하도록 변형된 글래스 표면에 결합될 수 있고, 또한 폴리라이신 코팅 표면에서 UV에 의해 결합될 수 있다. 또한, 상기 혼성화 어레이 요소는 링커(예: 에틸렌 글리콜 올리고머 및 디아민)를 통해 기체에 결합될 수 있다.
한편, 본 발명의 마이크로어레이에 적용되는 시료 DNA는 표지(labeling)되고, 마이크로어레이상의 어레이 요소와 혼성화 될 수 있다. 혼성화 조건은 다양할 수 있으며, 혼성화 정도의 검출 및 분석은 표지 물질에 따라 다양하게 실시될 수 있다.
본 발명의 키트는 노화 의심 개체에서 선택적으로 발현이 증가되거나 감소된 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 확인하여 검사 대상에게서 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 과다 또는 과소 발현 여부를 확인하고, 대조군에서 발현이 증가되거나 감소되는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현 수준을 확인하여 검사 대상에게서 상기 유전자의 mRNA 또는 단백질의 발현 여부를 확인함으로써 노화 상태 또는 노화 가능성을 예후 예측하거나 진단 또는 판별할 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 확인하기 위한 제제 외에 다른 구성성분, 용액 또는 장치가 더 포함될 수 있다.
바람직하게 상기 키트는 상기 자연노화와 관련된 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질을 측정하는 제제를 포함하는 것을 제외하고는 통상적인 키트의 구성을 포함하는 것이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.
상기 키트를 제조하는 방법 역시, 통상의 방법이라면 특별히 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 측면은 생물학적 시료로부터 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출하여, 노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 생물학적 시료는 노화가 의심되는 개체로부터 얻은 것으로, 혈액, 조직, 세포 등의 생물학적 시료일 수 있으나, 바람직하게는 피부 조직일 수 있다.
본 발명에 따른 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 검출할 수 있는 제제를 이용하여, 노화 의심 개체의 생물학적 시료로부터 노화의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있다.
상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질은 앞서 설명한 바와 같이, 다양한 실험을 통해, 노화 진단을 위한 바이오마커인지를 확인하였다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 발현이 증가하거나 감소된 경우에 상기 노화 의심 개체에 대하여 노화 개체 여부를 판단 즉, 진단하거나 나아가 정량적으로 노화 진행 정도(수준)까지도 판별할 수 있다.
상기 노화 의심 개체로부터 검출된 수치가 정상 대조군의 생물학적 시료로부터 검출된 수치보다 높거나 낮을 경우, 노화 개체로 판단할 수 있는데 구체적으로 대조군에 비하여 상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1, SOD3 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준은 감소하여야 노화 상태를 진단하거나 판별할 수 있다.
본 발명에서 "선택적으로 발현된 유전자(differentially expressed genes, DEGs)"는 대조군(control)에서의 발현에 비하여, 노화가 진행된 개체군에서 그 발현이 보다 높거나 보다 낮은 수준으로 활성화되는 유전자를 말하는 것으로써, 이 용어는 그 발현이 노화 개체군에 비하여 젊은 대조군에서 높거나 보다 낮은 수준으로 활성화되는 유전자를 의미한다. 이러한 유전자의 발현은 2 개 이상의 유전자 또는 이의 유전자 또는 단백질 산물 간의 발현을 비교하여 측정될 수 있다.
"differentially"란 노화 개체군과 젊은 대조군에서 주어진 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 발현 사이에 적어도 2배 이상 또는 1/2배 이하의 차이가 있을 때 존재하는 것으로 간주되는 것이다.
상기 노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 있어서, 노화 의심 개체의 생물학적 시료 특히, 피부 조직 세포로부터 측정이 가능하기 때문에, 노화 의심 개체로부터 쉽게 얻을 수 있고, 유전자 또는 단백질 발현의 검출과정도 편리하다는 장점을 갖는다.
상기 유전자 또는 이의 단백질은 노화 의심 개체의 생물학적 시료로부터 쉽게 측정이 가능하면서 노화와 상관성을 갖는 것으로, 보다 구체적인 정보는 앞선 노화 진단용 조성물의 내용과 같다.
노화와 상관성을 갖는 상술한 유전자들 중에서 어느 하나이상의 유전자의 mRNA 또는 단백질 발현을 검출할 수 있다면, 노화 의심 개체의 생물학적 시료로부터 노화의 진단에 필요한 정보를 제공할 수 있는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 유전자는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자일 수 있고, 이들은 각각 순서대로 서열번호 1 내지 8의 염기서열로 표시될 수 있다.
바람직하게 상기 8종의 유전자들의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 모두 측정하거나, 그 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자 조합들의 발현을 측정할 수 있는데, 구체적으로 상기 8종의 유전자들의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 모두 측정하는 것이 가장 우수한 정확도, 민감도, 특이도를 갖는 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 (a) 검체에 노화 조절용 후보물질을 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보물질이 처리된 검체로부터 생물학적 시료를 분리하고, 상기 분리된 생물학적 시료로부터 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 단계;를 포함하는 노화 조절용 후보물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
상기 검체는 노화에 따라 피부 탄력 저하 등의 증세를 나타내거나 나타낼 수 있는 모든 인간을 포함하는 쥐, 개, 고양이, 소 및 기타 가축 등을 포함하는 모든 동물을 포함한다.
상기 생물학적 시료란 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 피부 조직일 수 있다.
우선, (a) 검체에 노화 조절용 후보물질을 처리한다. 구체적으로 노화 조절용 후보물질을 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 검체에 투여할 수 있고, 바람직하게는 경구 또는 경피일 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 검체에 처리하였을 때, 노화 유도 또는 노화 억제 효과를 나타내는 양을 말한다.
본 발명에서 "노화 조절용 후보물질"이란 생물학적 시료 특히, 피부 조직 내에서 유의하게 일어나는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현량 변화를 간접적 또는 직접적으로 억제 또는 유도하는 물질을 의미한다.
이후, (b) 상기 후보물질이 처리된 검체로부터 생물학적 시료를 분리하고, 상기 분리된 생물학적 시료로부터 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정한다.
구체적으로 노화 조절용 후보물질의 존재 및 부재 하에서의, 상기 분리된 생물학적 시료로부터 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준의 증가 또는 감소를 비교하여 노화 상태 또는 노화 수준을 확인함으로써, 노화 조절용 후보물질을 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
상기 생물학적 시료란 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 피부 조직일 수 있다.
이후 본 발명의 스크리닝 방법은 후보물질의 존재 및 부재 하에서 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현량 증감을 측정함으로써 상기 검체 특히 검체의 피부 조직에서 시간에 따라 자연적으로 발생하는 노화를 억제 및 지연시키거나 촉진 및 유도할 수 있는 물질들을 선별해낼 수 있으며, 특별히 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질의 발현량을 증가시키는 물질을 선별함으로써, 노화를 효율적으로 억제하는 물질을 간편하게 스크리닝할 수 있다.
상기 스크리닝 방법으로 선별된 노화 억제용 후보물질 또는 노화 유도용 후보물질을 포함하는 약제학적 조성물은 노화 억제 또는 노화 유도에 이용할 수 있다.
상기 mRNA의 수준의 측정은 상기 8종 유전자 중에서 어느 하나이상의 유전자 mRNA 발현 정도를 측정하는데 이용되는 공지의 방법을 사용할 수 있으나, 바람직하게는 상기 유전자들의 서열에 기초하여 제작된 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하거나(RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 프로브를 이용한 혼성화 반응을 통하여 실시할 수 있으며, 노던 블랏팅을 이용하거나, DNA 칩을 사용하여 측정될 수 있다.
상기 단백질 수준의 측정은 상기 8종 유전자 중에서 어느 하나 이상의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체 또는 앱타머를 이용할 수 있고, 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip) 등을 통하여 정량적으로 또는 정성적으로 실시될 수 있다(Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980). 측정방법은 상술한 방법들에 의해 제한되지 않는다.
이하에서 실시예 등을 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 하며, 다만 이하에 실시예 등에 의해 본 발명의 범위와 내용이 축소되거나 제한되어 해석될 수 없다. 또한, 이하의 실시예를 포함한 본 발명의 개시 내용에 기초한다면, 구체적으로 실험 결과가 제시되지 않은 본 발명을 통상의 기술자가 용이하게 실시할 수 있음은 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연하다.
실시예 1. 동물 모델 및 시료
10 ~ 20 주령되는 헤어리스(hairless) 마우스를 오리엔트바이오로부터 입수하였다. 이를 서울대학교병원의 실험동물운영위원회 규정에 따라 사육 및 취급하였다.
자연노화 동물 모델을 제작하기 위하여, 상기 헤어리스 마우스를 생후 18~24 개월 동안 자연적으로 노화시켜, "자연노화 마우스"를 얻었다.
대조군 마우스는 상기와 같은 마우스를 자연노화 시키지 않은, 생후 2~3 개월된 마우스를 이용하였다. 상기 자연노화 마우스와 대조군 각 10 마리의 등으로부터 피부 조직을 채취하였다.
실시예 2. 자연노화 마우스 모델의 피부 조직에서의 발현 유전체 분석
상기 자연노화 마우스와 대조군 마우스로부터 채취한 피부 조직에서의 RNA 질을 유지하기 위하여 채취한 조직세포는 사용 전까지 -70 ℃에서 보관하였다. 또한 채취한 피부 조직으로부터 총 RNA를 추출하였으며 총 RNA 추출은 TRIzol reagent (Ambion)를 사용하였다.
추출된 총 RNA에서 poly A RNA를 분리하여 RNA-Seq 분석(Illumina HiSeq2500 Genome Analyzer®, Illumina, San Diego, CA)을 수행하였으며, 바이오인포매틱스 기법을 이용하여 노화에 따라 변화하는 유전자를 분석하였다. 발현 데이터에 대한 통계 수치는 폴드 체인지(fold change)를 사용하여 정하였다. 벤자민-호크버그 다중검정(Benjamini-Hochberg multiple testing)을 모든 차별 발현 유전자에게 적용하여 FDR(false discovery rate)을 5%로 최소화하여, 조정된 차별발현 유전자의 p-value를 정하였다.
그 결과 상기 데이터에서 유의하게 변화한 유전자(DEG)는 대조군에 비하여 2배 이상이거나 1/2배 이하이며 p-value가 0.05 이하인 것으로 정하였다. DEG 개수는 총 1,951개였고, 이 중 907개의 유전자 발현이 증가하였고 1,044개 유전자 발현이 감소하였을 확인하였다.
도 1은 대조군 마우스에 대한 자연노화 마우스의 피부 조직에서 유전체 발현 변화 양상 및 발현 변화 유전자 개수를 측정하여 나타낸 것으로, 도 1A는 대조군 마우스에 대하여 자연노화 마우스에서의 유전체 발현 양상 차이를 나타낸 scatter plot이고, 도 1B는 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스에서 mRNA 발현 양상이 변화한 유전자의 개수를 나타낸 그래프이다. 이때 적색은 유의하게 증가한 유전자를 나타낸 것이고, 청색은 유의하게 감소한 유전자를 나타낸 것이다.
표 2는 도 1A, B에서 측정된 유의적으로 증가한 상위 20개의 유전자를 나타낸 것이고, 표 3은 도 1A, B에서 측정된 유의적으로 감소한 상위 20 개의 유전자를 나타낸 것이다(n=4/group).
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value | q-value |
| Myh7 | 0.0125 | 11.9275 | 9.88 | 0.0046 | 0.0389 |
| Tnnc1 | 0.2525 | 21.3925 | 6.44 | 0.0001 | 0.0167 |
| gag-pro-pol | 0.1525 | 8.9525 | 5.96 | 0.0009 | 0.001 |
| Myl2 | 0.91 | 38.5275 | 5.43 | 0.0019 | 0.001 |
| Tnni1 | 0.3525 | 13.0575 | 5.21 | 0.0003 | 0.001 |
| XLOC_018174 | 0.4075 | 8.8275 | 4.5 | 0.0001 | 0.001 |
| Ankrd1 | 0.7775 | 14.8725 | 4.35 | 0.0018 | 0.001 |
| pol | 0.345 | 6.095 | 4.21 | 0.0001 | 0.001 |
| LV2A_MOUSE | 1.5125 | 28.46 | 4.14 | 0.0001 | 0.0398 |
| Mrgprx1 | 0.09 | 1.2375 | 3.82 | 0.0001 | 0.0096 |
| pol | 1.125 | 14.905 | 3.77 | 0.0048 | 0.0149 |
| Rpl7a-ps3 | 0.5125 | 5.415 | 3.41 | 0.0001 | 0.0042 |
| Ces1f | 0.395 | 4.02 | 3.38 | 0.0001 | 0.001 |
| Gm830 | 0.05 | 0.46 | 3.31 | 0.0037 | 0.0079 |
| Serpinb6d | 4.47 | 41.925 | 3.28 | 0.0001 | 0.001 |
| XLOC_023221 | 0.06 | 0.55 | 3.26 | 0.0003 | 0.0469 |
| XLOC_006050 | 0.0925 | 0.8425 | 3.25 | 0.0001 | 0.0067 |
| Lrtm2 | 0.06 | 0.5375 | 3.24 | 0.0001 | 0.0108 |
| Iglc2 | 1.785 | 15.67 | 3.09 | 0.0046 | 0.001 |
| Gm5619 | 3.435 | 28.8175 | 3.06 | 0.0001 | 0.001 |
Young은 대조군 마우스에서 FPKM 수치를 의미한다(n=4).
Old는 자연노화 마우스에서 FPKM 수치를 의미한다(n=4).
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value | q-value |
| Gm10229 | 21.425 | 0.3125 | -5.94 | 0.004 | 0.0427 |
| Saa3 | 191.935 | 4.51 | -5.4 | 0.0014 | 0.001 |
| Krtap22-2 | 68.9725 | 1.89 | -5.07 | 0.0001 | 0.0118 |
| Krtap4-1 | 6.8225 | 0.225 | -4.66 | 0.0001 | 0.0218 |
| Mmp10 | 2.0475 | 0.0775 | -4.66 | 0.0001 | 0.0048 |
| Mmp13 | 33.4525 | 1.285 | -4.63 | 0.0001 | 0.001 |
| Gm11568 | 7.7625 | 0.275 | -4.59 | 0.0001 | 0.0205 |
| Krt86 | 6.3775 | 0.25 | -4.51 | 0.0001 | 0.001 |
| Krt34 | 8.67 | 0.36 | -4.45 | 0.0042 | 0.001 |
| Krt42 | 3.0225 | 0.135 | -4.45 | 0.0007 | 0.001 |
| Krtap5-5 | 3.625 | 0.15 | -4.39 | 0.0012 | 0.0441 |
| Cxcl3 | 7.525 | 0.37 | -4.32 | 0.0003 | 0.001 |
| Krt31 | 5 | 0.2425 | -4.22 | 0.0001 | 0.001 |
| Gm11562 | 5.1275 | 0.2575 | -4.08 | 0.0006 | 0.036 |
| XLOC_006413 | 4.0625 | 0.2475 | -4.03 | 0.0001 | 0.001 |
| Ngp | 3.2425 | 0.1975 | -4.01 | 0.0052 | 0.0048 |
| Krt33b | 5.0075 | 0.285 | -3.99 | 0.0004 | 0.001 |
| Krtap8-1 | 65.15 | 3.56 | -3.99 | 0.0008 | 0.001 |
| Foxe1 | 0.9375 | 0.0575 | -3.97 | 0.0001 | 0.0427 |
| Krtap3-3 | 9.5975 | 0.5625 | -3.93 | 00001 | 0.001 |
Young은 대조군 마우스에서 FPKM 수치를 의미한다(n=4).
Old는 자연노화 마우스에서 FPKM 수치를 의미한다(n=4).
실시예 3. 자연노화 마우스 피부에서부터 RNA 마이크로어레이 분석.
실시예 1로부터 채취한 자연노화 마우스와 대조군 마우스의 피부에서 전체 RNA를 추출한 후 마이크로어레이(Affymetrix Gene Chip Mouse Genome 430 2.0 Array, Affymetrix)를 실행하였으며, MAS5.0 알고리즘으로 읽은 자연노화 마우스, 대조군 마우스 각각 4마리의 피부 RNA 샘플의 전사체 결과는 발현값을 기전으로 중간값(median value) 이하의 유전자는 제외하고 분석을 수행하였다. 4개의 샘플로 구성되어 있는 실험군 중, 특정 probe set이 MAS5.0 알고리즘에서 "absent call"로 결정된 샘플이 2개 이상인 경우 DEG 선정에서 제외하였다. 또한, 그룹간 비교에서 t test의 p value값이 0.05를 넘는 경우 DEG 선정에서 제외하였다.
실시예 4. 자연노화 인체 모델 및 이로부터 채취된 피부 조직으로부터 RNA 시퀀싱 분석.
서울대병원 의학연구윤리심의위원회(IRB) 승인 후 유전체 분석을 위한 자연노화 피부조직을 확보하기 위하여 젊은이(만 35세 이하)와 노인(만 75세 이상) 자원자를 모집하여 비노출부(엉덩이) 피부의 생검 조직을 얻었다. 피부과 전문의의 임상 경험을 토대로, 자원자의 과거력, 동반 질환, 치료력, 음주력, 흡연력 등을 반영하여 대표적인 젊은이와 노인 건강 자원자의 피부 조직을 확보하였으며, 이중 각 군 당 (남자 젊은이, 여자 젊은이, 남자 노인, 여자 노인) 6명을 대상으로 RNA를 추출하고, poly A RNA를 대상으로 RNA-Seq 분석(Illumina HiSeq2500 Genome Analyzer®, Illumina, San Diego, CA)을 수행하였으며, 바이오인포매틱스 기법을 이용하여 노화에 따라 변화하는 유전자를 분석하였다.
실시예 5. 자연노화 인체 모델 및 이로부터 채취된 피부 조직으로부터 RNA 마이크로어레이 분석.
남녀 각각 노인 자원자 4명 (78-82세), 젊은 자원자 4명 (19-22세)으로 총 16명의 대상자를 대상으로 서울대학교병원 IRB 규정에 따라 피부조직의 전사체 분석을 위한 임상자원자를 공모하였다. 자연노화조건을 위해 햇빛 노출이 없는 피부(엉덩이)의 생검조직으로부터 RNA를 추출하였다. 적출한 조직의 전체 RNA를 Trizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 분리하고 Qiagen RNeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA)를 사용하여 정제도를 높인 후, Human HG-U133Plus 2.0 GeneChip Array를 수행하고, 실시예 3와 같은 방법으로 분석하였다.
실시예 6. 생물정보학적 분석 등을 통해 22 종의 노화 표적 유전자 후보 선정.
1) 자연노화 마우스 피부로부터 RNA 시퀀싱 분석 결과를 기반으로 자연노화 마우스 피부로부터 마이크로어레이 데이터베이스와 인체 모델의 피부로부터 RNA 시퀀싱 및 마이크로어레이 데이터베이스를 비교하여 유전자 7종 선정.
실시예 2의 마우스 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과에서 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 발현이 2배 이상으로 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, p-value 및 q-value가 0.05 이하인 유전자들을 선별한 후, 선별된 유전자가 실시예 3의 마우스 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스와 비교하여 같은 경향성을 보이는 유전자들을 선정하였다. 상술한 선별된 유전자들을 대상으로 실시예 4의 인체 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과 및 실시예 5의 인페 피부 조직의 마이크로어레이 데이터베이스 결과의 50% 이상에서 발현 값이 같은 경향성으로 변화하는 유전자이며, 노화 관련 시스템 회로와의 연관성 등 피부 노화 과정에 영향을 미칠 가능성이 높은 유전자 총 7종을 선정하여 표 5에 나타내었다.
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value | q-value |
| Adamts15 | 6.56 | 1.78 | -1.88 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Atp12a | 10.7 | 5.18 | -1.05 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Serpinh1 | 151 | 67.2 | -1.17 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Lcn2 | 33.9 | 5.76 | -2.56 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Retn | 17.2 | 49.7 | 1.53 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Sparc | 873 | 257 | -1.76 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Tnc | 41.2 | 10.8 | -1.93 | 5.00E-05 | 0.001014 |
2) 자연노화 마우스 모델 피부로부터 RNA 시퀀싱 분석 결과를 기반으로 자연노화 마우스 피부로부터
마이크로어레이
데이터베이스를 비교하여 유전자 9종 선정.
실시예 2의 마우스 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과에서 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 발현이 2배 이상으로 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, p-value 및 q-value가 0.05 이하인 유전자들을 선별한 후, 선별된 유전자가 실시예 3의 마우스 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스와 비교하여 같은 경향성을 보이고, 노화 관련 시스템 회로와의 연관성 등 피부 노화 과정에 영향을 미칠 가능성이 높으며, 실시예 6의 1)에서 선정되지 않았던 유전자 9종을 선정하여 표 6에 나타내었다.
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value | q-value |
| Axl | 86.9525 | 42.905 | -1.01 | 0.0001 | 0.001 |
| Cd248 | 31.465 | 15.13 | -1.05 | 0.0001 | 0.001 |
| Coch | 28.8225 | 7.1675 | -1.97 | 0.0001 | 0.001 |
| Hp | 220.9125 | 38.8425 | -2.49 | 0.0001 | 0.001 |
| Pdk4 | 17.1 | 69.5 | 2.02 | 5.00E-05 | 0.001014 |
| Pxdn | 24.9275 | 10.5425 | -1.2 | 0.0001 | 0.001 |
| Rbp1 | 30.68 | 5.88 | -2.37 | 0.0001 | 0.001 |
| Tchh | 60.2775 | 11.6725 | -2.39 | 0.0001 | 0.001 |
| Tnn | 16.0825 | 1.56 | -3.34 | 0.0001 | 0.001 |
3) 자연노화 마우스 피부로부터 마이크로어레이 데이터베이스를 기반으로 자연노화 마우스 피부로부터 RNA 시퀀싱 결과와 자연노화 인체 모델의 피부로부터 RNA 시퀀싱 및 마이크로어레이 데이터베이스를 비교하여 유전자 2종 선정.
실시예 3의 마우스 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스에서 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 발현이 2배 이상으로 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, p-value 및 q-value가 0.05 이하인 유전자들을 선별한 후, 선별된 유전자가 실시예 2의 마우스 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과와 비교하여 같은 경향성을 보이는 유전자들을 선정하였다. 상술한 선별된 유전자들을 대상으로 실시예 4의 인체 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과 및 실시예 5의 인체 피부 조직의 마이크로어레이 데이터베이스 결과의 50% 이상에서 발현 값이 같은 경향성으로 변화하는 유전자이며, 노화 관련 시스템 회로와의 연관성 등 피부 노화 과정에 영향을 미칠 가능성이 높은 유전자 총 2종을 선정하여 표 7에 나타내었다.
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value |
| Lrg1 | 353.959 | 119.764 | -1.681 | 0.001 |
| Pcolce1 | 3278.131 | 2625.639 | -0.319 | 0.004 |
| 1511.277 | 514.178 | -1.592 | 0.000 |
4) 자연노화 마우스 피부로부터 RNA 마이크로어레이를 기반으로 자연노화 마우스 피부로부터 RNA 시퀀싱 분석 결과와 비교하여 유전자 1종 선정.
실시예 3의 마우스 피부 조직의 마이크로어레이 결과에서 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 발현이 2배 이상으로 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, p-value가 0.05 이하인 유전자들을 선별한 후, 선별된 유전자가 실시예 2의 마우스 피부 조직의 RNA 시퀀싱 데이터베이스와 같은 경향성을 보이면서, 노화 관련 시스템 회로와의 연관성 등 피부 노화 과정에 영향을 미칠 가능성이 높은 유전자 1종을 선정하여 표 8에 나타내었다.
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value |
| Fnip1 | 34.167 | 530.775 | 3.836 | 0.000 |
| 35.668 | 18.230 | -0.962 | 0.000 | |
| 566.493 | 1329.921 | 1.213 | 0.000 |
5) 자연노화 마우스의 RNA 시퀀싱 및 마이크로어레이 데이터베이스와 자연노화 인체 모델로부터 RNA 시퀀싱 및 마이크로어레이 데이터베이스뿐만 아니라 피부 섬유아세포 공개 데이터베이스(GSE69391)를 기반으로 유전자 1종 선정
실시예 2의 마우스 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과, 실시예 3의 마우스 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스, 실시예 4의 자연노화인체 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과 및 실시예 5의 자연노화 인체 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스 중에서 적어도 하나 이상에서 발현이 2배 이상으로 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, 각각의 데이터베이스에서 50% 이상 같은 경향성을 보이는 유전자들을 선별하였다. 상기 선별된 유전자들을 대상으로, 공개적으로 사용 가능한 피부 섬유아세포의 마이크로 어레이 데이터세트(GSE69391)와 비교 분석하였을 때, 전체 유전자 발현 값의 median 이상으로 발현되며, 노인 유래 피부 섬유아세포 대비 젊은 사람 유래 피부 섬유아세포의 발현 값이 2배 이상 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, 피부 노화와 연관성이 있을 것으로 예상되는 유전자 1종을 선정하여 표 9에 나타내었다.
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value | q-value |
| Stk32b | 0.392 | 0.874 | 1.16 | 0.00185 | 0.0208879 |
6) 자연노화 마우스의 RNA 시퀀싱 및 마이크로어레이 데이터베이스와 자연노화 인체 모델로부터 RNA 시퀀싱 및 마이크로어레이 데이터베이스를 기반으로 유전자 2종 선정
실시예 2의 마우스 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과, 실시예 3의 마우스 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스, 실시예 4의 자연노화인체 피부 조직의 RNA 시퀀싱 분석 결과 및 실시예 5의 자연노화인체 피부 조직의 RNA 마이크로어레이 데이터베이스 중에서 적어도 하나 이상에서 발현이 2배 이상으로 증가하거나 1/2배 이하로 감소하며, 각각의 데이터베이스에서 50% 이상 같은 경향성을 보이는 유전자들을 선별하였다.
상기 선별된 유전자들을 대상으로 노화 관련 시스템 회로와의 연관성과 문헌 조사를 통하여 BMP1과 SOD3가 선정되었다. BMP1은 procollagen I, II, III의 C-terminal propeptide를 절단해주는 역할을 하며, BMP1 knock-out 마우스에서 진피층 두께의 감소와 상처 치유 감소가 보고되었으나(Greenspan et al., 2016, BMP1-like proteinase are essential to the structure and wound healing of skin, Matrix Biol, 56: 114-131), 피부노화 과정에서 BMP1의 발현변화 및 기능에 대해서는 아직 알려진 바가 없었다. 또한 SOD3는 피부에서 주로 표피와 진피의 세포 외 기질에 존재하고, 세포 외부의 과산화 라디칼을 과산화수소로 변환시키는 항산화 작용을 하는 것으로 알려져 있으며, 항산화 작용으로 인하여 염증완화 효과, 건선 완화 효과 등을 보이고, VEGF, VEGFR의 발현을 증가시키는 효과가 있음이 알려져 있었으나(Fukai et al., 2011, Superoxide dismutases: role in redox signaling, vascular function, and diseases, Antioxid Redox Signal, 15(6): 1583-1606), 역시 피부 자연노화에 관한 연관성은 보고된 바가 없는 유전자였다. 따라서, 피부 자연노화에 영향을 미칠 가능성이 높은 유전자로 Bmp1과 Sod3의 2종을 선정하여 표 10에 나타내었다. 표 10의 내용은 실시예 3의 RNA 마이크로어레이 데이터이다.
| Gene symbol | Young | Old | Log2 ratio | p-value |
| Bmp1 | 434.4 | 163.9 | -1.443 | 0.00004 |
| Sod3 | 167.8 | 39 | -2.203 | 0.00015 |
7) 결론
자연노화 마우스로부터 채취된 피부 조직에서 발현 유전체 분석 결과와 자연노화 인체 모델로부터 채취된 피부 조직에서 발현 유전체 분석 결과 및 피부 섬유아 세포 공개 마이크로어레이 데이터베이스(GSE69391), 노화 관련 시스템 회로와 연관성 등을 다양하게 활용하여 총 22종의 자연노화 표적 유전자 후보들을 선정하였다.
실시예 7. RT-qPCR 분석을 통한 노화 표적 유전자 후보들의 검증
상기에서 선정된 22종의 노화 표적 유전자 후보들이 자연노화 마우스와 대조군 마우스에서 발현 유전체 데이터베이스와 같은 발현 양상을 나타내는지 분석하기 위하여 RT-qPCR 방법으로 세포 내의 mRNA 발현 양을 측정하였다.
구체적으로 자연노화 마우스와 대조군 마우스로부터 채취한 피부 조직으로부터 RNA를 추출, 분리하고, 이를 RT-qPCR을 수행하여, 도 2a 내지 도 2v에 나타내었다.
증폭 조건은 95℃에서 15분, 94℃에서 30초, 각 유전자의 서냉 온도에서 30초, 72℃에서 30초 동안으로 40회(실시예 7에서 선정한 22종의 유전자)로 하였다. 이때 사용한 프라이머를 아래 표 11에 기재하였다. 서냉 온도는 ADAMTS15 유전자의 경우 54.8도, ATP12A 유전자의 경우 54도, SERPINH1과 LCN2 유전자의 경우 55.1도, RETN 유전자의 경우 60도, SPARC 유전자의 경우 54.3도, TNC 유전자의 경우 52.5도, AXL 유전자의 경우 55.6도, CD248 유전자의 경우 55.1도, COCH 유전자의 경우 53.3도, HP 유전자의 경우 53.6도, PDK4 유전자의 경우 55.6도, PXDN 유전자의 경우 53.1도, RBP1 유전자의 경우 60도, TCHH 유전자의 경우 54.6도, TNN 유전자의 경우 54.8도, LRG1 유전자의 경우 54.1도, PCOLCE1 유전자의 경우 56.1도, FNIP1 유전자의 경우 57도, STK32B 유전자의 경우 53.9도, BMP1 유전자의 경우 55.7도, SOD3 유전자의 경우 54.6도로 하였다.
| 유전자 (GenBank number) |
프라이머 시퀀싱(5->3) | 위치 | 증폭산물 크기(bp) |
| ADAMTS15 (NM_001024139) |
forward(서열번호 9) 5-CTGACTCATGCCAGGTATCCACACTC-3 |
UTR (5334-5359) |
152 |
| reverse(서열번호 10) 5-TCTGCTCAGCACGGGTTGACAG-3 |
UTR (5464-5485) |
||
| ATP12A (NM_138652.2) |
forward primer(서열번호 11) 5-TCCTACGGTCTCGGGAGTGTCAC-3 |
CDS (3154-3176) |
125 |
| reverse primer(서열번호 12) 5-CTGATGAACAACTTCCGCATCTCG-3 |
CDS (3255-3278) |
||
| SERPINH1 (NM_009825.2) |
forward primer(서열번호 13) 5-CAAGGGAGACAAGATGCGAGATGAG-3 |
CDS (1625-1649) |
136 |
| reverse primer(서열번호 14) 5-CCGTGGAATATCCAGGGTTGGTG-3 |
UTR (1738-1760) |
||
| LCN2 (NM_008491.1) |
forward primer(서열번호 15) 5-TTTGTTCCAAGCTCCAGGGCTG-3 |
CDS (335-356) |
112 |
| reverse primer(서열번호 16) 5-TGGCGAACTGGTTGTAGTCCGTG-3 |
CDS (424-446) |
||
| RETN (NM_022984.4) |
forward primer(서열번호 17) 5-AGTCTCCTCCAGAGGGAAGTTGGC-3 |
CDS (255-278) |
145 |
| reverse primer(서열번호 18) 5-GGCTGCTGTCCAGTCTATCCTTGC-3 |
CDS (376-399) |
||
| SPARC (NM_009242.5) |
forward primer(서열번호 19) 5-TCCAGAGCTGTGGCACACATGAC-3 |
UTR (1774-1796) |
195 |
| reverse primer(서열번호 20) 5-TGAAACAGCCTCCCAGTGCCTAG-3 |
UTR (1946-1968) |
||
| TNC (NM_011607.3) |
forward primer(서열번호 21) 5-ACTGTCATCGTGTCAACCTGATGG-3 |
CDS (6289-6312) |
142 |
| reverse primer(서열번호 22) 5-TCCAGATTTCGGAAGTTGCTGG-3 |
CDS (6409-6430) |
||
| AXL (XM_006539989.3) |
forward primer(서열번호 23) 5-GCACGACTCTGAGATTCCAGGAC-3 |
UTR (3242-3264) |
170 |
| reverse primer(서열번호 24) 5-AGTATTCCAACATGAGCCCTAAACTG-3 |
UTR (3386-3411) |
||
| CD248 (NM_054042.2) |
forward primer(서열번호 25) 5-GGTGGCACTCCTGGTGCCAA-3 |
CDS (2136-2155) |
142 |
| reverse primer(서열번호 26) 5-CTTGTTCCCAGCATGTGTGACCC-3 |
CDS (2255-2277) |
||
| COCH (NM_007728.5) |
forward primer(서열번호 27) 5-ATCTTCTCTGTTGGTGTGGCTTGG-3 |
CDS (1775-1798) |
199 |
| reverse primer(서열번호 28) 5-GCACGTATTCCTTGAGTTGTCAGAGTATC-3 |
UTR (1973-1945) |
||
| HP (NM_017370.2) |
forward primer(서열번호 29) 5-TGTCGCTGAGTATGGTGTGTACGTG-3 |
CDS (1127-1151) |
163 |
| reverse primer(서열번호 30) 5-TCAGAGTATAGCCCAACCCTTCCAC-3 |
UTR (1289-1265) |
||
| PDK4 (NM_013743.2) |
forward primer(서열번호 31) 5-GTGGGTCTCCCTCTTACTAGACAAGG-3 |
UTR (2636-2661) |
111 |
| reverse primer(서열번호 32) 5-TTCAAACTCAACTGCGACTCAGG-3 |
UTR (2724-2746) |
||
| PXDN (NM_181395.2) |
forward primer(서열번호 33) 5-AGGGATATGTCTTGTGCCAAGGC-3 |
UTR (6233-6255) |
101 |
| reverse primer(서열번호 34) 5-GTAAATCACAGCCAGCCTCCCAC-3 |
UTR (6311-6333) |
||
| RBP1 (NM_011254.5) |
forward primer(서열번호 35) 5-GCATGACCACTGTGAGCTGGGA-3 |
CDS (2266-2287) |
134 |
| reverse primer(서열번호 36) 5-GCAGATCACACCCTCAGCTCTCATT-3 |
CDS (2375-2399) |
||
| TCHH (NM_001163098.1) |
forward primer(서열번호 37) 5-GATTCCATCAGCAGGCTGAAAC-3 |
UTR (5295-5316) |
199 |
| reverse primer(서열번호 38) 5-GACCACCTTGCTTTCACTTCATG-3 |
UTR (5471-5493) |
||
| TNN (NM_177839.3) |
forward primer(서열번호 39) 5-CAACCCGAATGGCAAATATGGG-3 |
CDS (4633-4654) |
139 |
| reverse primer(서열번호 40) 5-GCCAGAGAAACGGTCTCTGCTGTAA-3 |
CDS (2375-2399) |
||
| LRG1 (NM_029796.2) |
forward primer(서열번호 41) 5-AAGAACCTGGCGGACCTTTGC-3 |
CDS (952-972) |
126 |
| reverse primer(서열번호 42) 5-CAGCTCTGCCACGTCCAGCA-3 |
CDS (1058-1077) |
||
| PCOLCE1 (NM_008788.2) |
forward primer(서열번호 43) 5-CCCAGTGGCACCTCTCTGAAGTTG-3 |
CDS (1268-1291) |
130 |
| reverse primer(서열번호 44) 5-CGAAGCTCTCTGGAGGAAGGATGG-3 |
CDS (1374-1397) |
||
| FNIP1 (NM_173753.4) |
forward primer(서열번호 45) 5-TCCATCGGTAGCTGTCCTCTGAG-3 |
UTR (6098-6120) |
157 |
| reverse primer(서열번호 46) 5-TGCACAAATTTCCCCTAGAACTGG-3 |
UTR (6231-6254) |
||
| STK32B (NM_022416) |
forward primer(서열번호 47) 5-TCCAGTCAGCCTGTCATGCAAAG-3 |
UTR (23562378) |
174 |
| reverse primer(서열번호 48) 5-TCAGCATCCTCAGCTCAAGGGTC-3 |
UTR (25072529) |
||
| BMP1 (NM_009755.3) |
forward primer(서열번호 49) 5-GGCTGGAGATTCTGTCCTGGTGAAG-3 |
CDS (1268-1291) |
106 |
| reverse primer(서열번호 50) 5-GCTGTGGAGTGTGTCCTGGAACTTG-3 |
CDS (1374-1397) |
||
| SOD3 (NM_011435) |
forward primer(서열번호 51) 5-CTTCCACAGACCCAGATCCTTAATGC-3 |
UTR (13051329) |
142 |
| reverse primer(서열번호 52) 5-AGTATCTGAGCACATGCGATCTCTGG-3 |
UTR (14221447) |
도 2는 실시예 6에서 선정한 노화 표적 유전자 후보 22종에 대하여, 자연노화 마우스와 대조군 마우스의 피부 조직으로부터 상기 각 유전자 mRNA 수준의 발현을 분석하였을 때 데이터베이스와 같은 경향성을 보이는 18종에 대한 RT-qPCR 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 도 2a는 ADAMTS15 유전자에 관한 것이고, 도 2b는 ATP12A 유전자에 관한 것이며, 도 2c는 SERPINH1 유전자에 관한 것이며, 도 2d는 LCN2 유전자에 관한 것이며, 도 2e는 SPARC 유전자에 관한 것이며, 도 2f는 TNC 유전자에 관한 것이며, 도 2g는 AXL 유전자에 관한 것이며, 도 2h는 CD248 유전자에 관한 것이며, 도 2i는 COCH 유전자에 관한 것이며, 도 2j는 HP 유전자에 관한 것이며, 도 2k는 PXDN 유전자에 관한 것이며, 도 2l는 RBP1 유전자에 관한 것이며, 도 2m는 TCHH 유전자에 관한 것이며, 도 2n는 TNN 유전자에 관한 것이며, 도 2o는 LRG1 유전자에 관한 것이며, 도 2p는 PCOLCE1 유전자에 관한 것이며, 도 2q는 BMP1 유전자에 관한 것이며, 도 2r은 SOD3 유전자에 관한 것이다.
이때, 상기 각 그래프는 각 유전자들의 발현을 대조군 마우스(young)의 피부에서의 발현 값으로 평준화하여 표현한 것이다(*: p-value≤0.05, **: p-value≤0.01, ***: p-value≤0.001).
실시예 6의 1)으로부터 선정된 7종 유전자들에 대하여 mRNA 발현량을 분석하였다. 그 결과, ADAMTS15, ATP12A, SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC 유전자는 통계학적으로 의미있는 수준(p-value≤0.05)에서 피부의 자연노화에 따라 mRNA 발현이 감소하였음을 확인하였다(도 2a 내지 도 2f). 나머지 RETN 유전자의 mRNA 발현 변화는 통계학적으로 의미있는 수준으로 관찰되지 않았다.
실시예 6의 2)로부터 선정된 9종 유전자들 중에서 AXL, CD248, COCH, HP, PXDN, RBP1, TCHH, TNN 유전자는 통계학적으로 의미있는 수준에서 피부의 자연노화에 따라 mRNA 수준의 발현이 감소함을 확인하였다(도 2g 내지 도 2n). 그러나 PDK4 유전자의 mRNA 발현 변화는 통계학적으로 의미있는 수준이 아님을 확인하였다.
실시예 6의 3)로부터 선정된 2종의 유전자들 중에서 LRG1과 PCOLCE1 유전자는 통계학적으로 의미있는 수준(p-value≤0.05)에서 피부의 자연노화에 따라 mRNA 발현이 감소하였다(도 2o 내지 2p).
실시예 6의 4)로부터 선정된 1종의 FNIP1 유전자는 피부의 자연노화에 따른 mRNA 발현 변화가 통계학적으로 의미있는 수준이 아님을 확인하였다.
실시예 6의 5)로부터 선정된 1종의 STK32B 유전자는 피부의 자연노화에 따른 mRNA 발현 변화가 통계학적으로 의미있는 수준이 아님을 확인하였다.
실시예 6의 6)으로부터 선정된 2종의 BMP1과 SOD3 유전자는 통계학적으로 의미있는 수준(p-value≤0.05)에서 피부의 자연노화에 따라 mRNA 발현이 감소하였다(도 2q 내지 2r).
노화 표적 유전자 후보 22종을 대상으로 mRNA 발현량을 검증한 결과, 도 2에 보인 바와 같이 mRNA 수준에서 통계학적으로 유의하게 변한 유전자는 ADAMTS15, ATP12A, SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, AXL, CD248, COCH, HP, PXDN, RBP1, TCHH, TNN, LRG1, PCOLCE1, BMP1, SOD3의 18종임을 확인하였다.
실시예 8. 자연노화 마우스 및 대조군 마우스의 피부 조직에서 단백질 발현 분석
자연노화 마우스와 대조군 마우스의 등에서 피부 조직을 채취하였고(실시예 1 참조), 채취된 피부 조직에서 단백질을 추출하여 웨스턴 블롯(western blot)으로 단백질 발현 수준을 분석하였다.
mRNA 발현 분석으로 선별한 노화 표적 유전자 후보 18종 중에서 자연노화 마우스 및 대조군 마우스의 피부 조직에서 웨스턴 블롯에 의한 단백질 발현 수준이 mRNA 발현 수준과 부합하는 5종에 대한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3은 자연노화 마우스 및 대조군 마우스의 피부 조직에서 노화 표적 유전자 후보들의 단백질 발현을 분석한 웨스틴 블롯 결과 사진이다. 도 3a는 SERPINH1 단백질 발현을 관찰한 것이고, 도 3b는 SPARC 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3c는 RBP1 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3d는 TCHH 단백질 발현을 관찰한 것이며, 도 3e는 SOD3 단백질 발현을 관찰한 것이다.
데이터베이스 분석으로 선정한 22종의 노화 표적 유전자들 중에서 SERPINH1, SPARC, RBP1, TCHH 및 SOD3 유전자는 mRNA의 수준 변화와 이들의 단백질 발현 역시 동일한 경향성을 가지고 있음을 확인하였다(도 3a 내지 도 3e).
이에 반해 상기 22종의 유전자들 중에서 ATP12A, PCOLCE1, FNIP1 및 STK32B 유전자는 mRNA 수준 변화와 이들의 단백질 수준이 서로 다른 경향성을 보였고, ADAMTS15, LCN2, RETN, TNC, AXL, CD248, COCH, HP, PDK4, PXDN, TNN, LRG1 및 BMP1 유전자는 항체의 특이성이 매우 낮아서 웨스턴 블롯으로 분석할 수 없었다.
실시예 9. 자연노화 마우스 및 대조군 마우스의 피부 조직에서 면역조직화학 분석
자연노화 마우스와 대조군 마우스의 등에서 피부 조직을 채취하였고(실시예 1 참조), 채취된 피부 조직을 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 5 분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 세척하고, 실시예 9의 웨스턴 블롯에서 데이터베이스와 같은 경향성을 보인 SERPINH1, SPARC 및 TCHH 유전자를 대상으로 단백질 수준에서 재검증을 위해, 또한 항체가 마우스 단백질을 인식하는 것으로 알려져 있으나 웨스턴 블롯에서 항체 반응성이 낮아서 분석이 어려웠던 LCN2, TNC 및 LRG1 유전자를 대상으로 면역조직화학(IHC) 분석을 수행하였다.
도 4는 자연노화 마우스(old) 및 대조군 마우스(young)의 피부 조직을 각 노화 표적 유전자 후보에 대한 단백질 항체로 IHC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(200 배율).
도 4a에 나타난 바와 같이, 마우스 피부 조직에서 SERPINH1이 진피(dermis)의 섬유아세포(fibroblast)에서 발현된 것을 확인하였고, 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 SERPINH1을 발현하는 세포의 수가 적은 것을 확인하였다.
도 4b에 나타난 바와 같이, SPARC 항체의 경우 마우스의 피부 조직의 각질층과 섬유아세포에서 관찰되었고, 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 염색 된 세포의 수가 더 적은 것을 확인하였다.
도 4c에 나타난 바와 같이, LRG1 항체의 경우 마우스의 피부 조직 중 섬유아세포에서 관찰되었고, 대조군 마우스에 비하여 자연노화 마우스의 피부 조직에서 염색된 세포의 수가 더 적은 것을 확인하였다.
마우스 피부 조직에서 mRNA 발현과 웨스턴 블롯 분석으로 노화 표적 유전자로 확인이 된 SERPINH1과 SPARC 유전자는 IHC 분석에서도 재확인되었으며, 웨스턴 블롯에서 관찰되지 않았던 LRG1은 IHC 분석에서 mRNA 발현 변화와 일치하는 결과를 보여서 노화 표적 유전자로 확인할 수 있었다. 그러나, LCN2, TNC 및 TCHH 유전자의 경우에는 마우스 단백질에 대한 항체 특이성이 매우 낮아서 IHC 방법으로 분석할 수 없었다.
실시예 10. 자연노화 인체 모델과 대조군 인체 모델의 피부 조직에서 IHC 분석
실시예 9에서 분석한 유전자 중에서 마우스의 피부 조직을 대상으로 발현 유전체 데이터베이스와 IHC 분석에서 같은 경향성을 보인 SERPINH1 유전자와 웨스턴 블롯과 IHC 분석에서 항체가 마우스 단백질에 비특이적 반응을 보였던 LCN2와 TNC 유전자를 대상으로 자연노화 인체 모델과 대조군 인체 모델의 피부로부터 조직을 얻어(실시예 4 참조), 피부 조직을 PBS로 2번 세척하고 3% 포름알데히드로 실온에서 5분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 세척하고 각 항체로 염색하여, IHC 방법으로 분석하였다.
도 5는 자연노화 인체 모델(old) 및 대조군 인체 모델(young)의 피부 조직을 각 표적 유전자 후보(SERPINH1, LCN2, TNC)에 대한 단백질 항체로 IHC 분석한 결과를 나타낸 사진이다(200 배율).
도 5a에 나타난 바와 같이, 자연노화 인체 모델에서 SERPINH1 항체의 경우, 실시예 9에서의 자연노화 마우스에서의 결과와 유사하게 관찰되었다. 구체적으로 SERPINH1 항체는 인체 모델의 피부 조직에서 진피(dermis)의 섬유아세포(fibroblast)에서 진한 염색을 보였으며, 대조군 인체 모델에 비하여 자연노화 인체 모델의 피부 조직에서 SERPINH1을 발현하는 세포의 수가 더 적은 것을 확인하였다.
도 5b에 나타난 바와 같이, LCN2 항체의 경우 인체 피부 조직의 표피층에 진하게 염색된 것을 확인하였으며, 대조군 인체 모델에 비하여 자연노화 인체 모델의 피부 조직에서 LCN2를 발현하는 세포의 수가 더 적은 것을 확인하였다.
도 5c에 나타난 바와 같이, TNC 항체의 경우 인체 모델의 피부 조직에서 진피(dermis)의 섬유아세포(fibroblast)에서 진한 염색이 확인되었고, 대조군 인체 모델에 비하여 자연노화 인체 모델의 피부 조직에서 TNC를 발현하는 세포의 수가 더 적은 것을 확인하였다.
따라서, SERPINH1 유전자는 자연노화 마우스 피부 조직에서 mRNA 발현, 웨스턴 블롯, IHC 분석과 자연노화 인체 모델의 피부 조직에서 IHC 분석 결과가 모두 일치하였고, LCN2와 TNC 유전자는 자연노화 인체 모델의 피부 조직을 대상으로 한 IHC 분석에서 자연노화 마우스 피부 조직의 mRNA 발현 변화와 일치하는 결과를 보여서 노화 표적 유전자로 확인할 수 있었다.
종합하면, mRNA 발현과 단백질 수준 변화가 일치하는 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1, SOD3의 8종의 유전자 및 단백질은 자연노화에 의한 세포 특히 피부 세포의 노화의 바이오마커로 사용 가능하며 노화 기전 분석 및 노화 저해 표적 유전자로 활용 가능하다는 것을 확인하였다.
<110> Industry-Academic Cooperation Foundation, Yonsei University
Seoul National University Academic Corporation Foundation
seoul metropolitan boramae hospital
<120> composition for detecting senescence, kit containing the same and
method of detecting the same
<160> 52
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 2289
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of 1serpin family H member 1 (SERPINH1), transcript
variant 2
<400> 1
agtaggaccc aggggccggg aggcgccggc agagggaggg gccgggggcc ggggaggttt 60
tgagggaggt ctttggcttt ttttggcgga gctggggcgc cctccggaag cgtttccaac 120
tttccagaag tttctcggga cgggcaggag ggggtgggga ctgccatata tagatcccgg 180
gagcagggga gcgggctaag agtagaatcg tgtcgcggct cgagagcgag agtcacgtcc 240
cggcgctagc ccagcccgac ccaggcccac cgtggtgcac gcaaaccact tcctggccat 300
gcgctccctc ctgcttctca gcgccttctg cctcctggag gcggccctgg ccgccgaggt 360
gaagaaacct gcagccgcag cagctcctgg cactgcggag aagttgagcc ccaaggcggc 420
cacgcttgcc gagcgcagcg ccggcctggc cttcagcttg taccaggcca tggccaagga 480
ccaggcagtg gagaacatcc tggtgtcacc cgtggtggtg gcctcgtcgc tagggctcgt 540
gtcgctgggc ggcaaggcga ccacggcgtc gcaggccaag gcagtgctga gcgccgagca 600
gctgcgcgac gaggaggtgc acgccggcct gggcgagctg ctgcgctcac tcagcaactc 660
cacggcgcgc aacgtgacct ggaagctggg cagccgactg tacggaccca gctcagtgag 720
cttcgctgat gacttcgtgc gcagcagcaa gcagcactac aactgcgagc actccaagat 780
caacttccgc gacaagcgca gcgcgctgca gtccatcaac gagtgggccg cgcagaccac 840
cgacggcaag ctgcccgagg tcaccaagga cgtggagcgc acggacggcg ccctgctagt 900
caacgccatg ttcttcaagc cacactggga tgagaaattc caccacaaga tggtggacaa 960
ccgtggcttc atggtgactc ggtcctatac cgtgggtgtc atgatgatgc accggacagg 1020
cctctacaac tactacgacg acgagaagga aaagctgcaa atcgtggaga tgcccctggc 1080
ccacaagctc tccagcctca tcatcctcat gccccatcac gtggagcctc tcgagcgcct 1140
tgaaaagctg ctaaccaaag agcagctgaa gatctggatg gggaagatgc agaagaaggc 1200
tgttgccatc tccttgccca agggtgtggt ggaggtgacc catgacctgc agaaacacct 1260
ggctgggctg ggcctgactg aggccattga caagaacaag gccgacttgt cacgcatgtc 1320
aggcaagaag gacctgtacc tggccagcgt gttccacgcc accgcctttg agttggacac 1380
agatggcaac ccctttgacc aggacatcta cgggcgcgag gagctgcgca gccccaagct 1440
gttctacgcc gaccacccct tcatcttcct agtgcgggac acccaaagcg gctccctgct 1500
attcattggg cgcctggtcc ggcctaaggg tgacaagatg cgagacgagt tatagggcct 1560
cagggtgcac acaggatggc aggaggcatc caaaggctcc tgagacacat gggtgctatt 1620
ggggttgggg gggaggtgag gtaccagcct tggatactcc atggggtggg ggtggaaaaa 1680
cagaccgggg ttcccgtgtg cctgagcgga ccttcccagc tagaattcac tccacttgga 1740
catgggcccc agataccatg atgctgagcc cggaaactcc acatcctgtg ggacctgggc 1800
catagtcatt ctgcctgccc tgaaagtccc agatcaagcc tgcctcaatc agtattcata 1860
tttatagcca ggtaccttct cacctgtgag accaaattga gctagggggg tcagccagcc 1920
ctcttctgac actaaaacac ctcagctgcc tccccagctc tatcccaacc tctcccaact 1980
ataaaactag gtgctgcagc ccctgggacc aggcaccccc agaatgacct ggccgcagtg 2040
aggcggattg agaaggagct cccaggaggg gcttctgggc agactctggt caagaagcat 2100
cgtgtctggc gttgtgggga tgaacttttt gttttgtttc ttcctttttt agttcttcaa 2160
agatagggag ggaaggggga acatgagcct ttgttgctat caatccaaga acttatttgt 2220
acattttttt tttcaataaa acttttccaa tgacattttg ttggagcgtg gaagaaaaaa 2280
aaaaaaaaa 2289
<210> 2
<211> 863
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Homo sapiens lipocalin 2(LCN2)
<400> 2
agggccaccc aggtgagcct ctcactcgcc acctcctctt ccacccctgc caggcccagc 60
agccaccaca gcgcctgctt cctcggccct gaaatcatgc ccctaggtct cctgtggctg 120
ggcctagccc tgttgggggc tctgcatgcc caggcccagg actccacctc agacctgatc 180
ccagccccac ctctgagcaa ggtccctctg cagcagaact tccaggacaa ccaattccag 240
gggaagtggt atgtggtagg cctggcaggg aatgcaattc tcagagaaga caaagacccg 300
caaaagatgt atgccaccat ctatgagctg aaagaagaca agagctacaa tgtcacctcc 360
gtcctgttta ggaaaaagaa gtgtgactac tggatcagga cttttgttcc aggttgccag 420
cccggcgagt tcacgctggg caacattaag agttaccctg gattaacgag ttacctcgtc 480
cgagtggtga gcaccaacta caaccagcat gctatggtgt tcttcaagaa agtttctcaa 540
aacagggagt acttcaagat caccctctac gggagaacca aggagctgac ttcggaacta 600
aaggagaact tcatccgctt ctccaaatct ctgggcctcc ctgaaaacca catcgtcttc 660
cctgtcccaa tcgaccagtg tatcgacggc tgagtgcaca ggtgccgcca gctgccgcac 720
cagcccgaac accattgagg gagctgggag accctcccca cagtgccacc catgcagctg 780
ctccccaggc caccccgctg atggagcccc accttgtctg ctaaataaac atgtgccctc 840
aggccaaaaa aaaaaaaaaa aaa 863
<210> 3
<211> 3604
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Homo sapiens secreted protein acidic and cysteine
rich(SPARC)
<400> 3
gggagaagga ggaggccggg ggaaggagga gacaggagga ggagggacca cggggtggag 60
gggagataga cccagcccag agctctgagt ggtttcctgt tgcctgtctc taaacccctc 120
cacattcccg cggtccttca gactgcccgg agagcgcgct ctgcctgccg cctgcctgcc 180
tgccactgag ggttcccagc accatgaggg cctggatctt ctttctcctt tgcctggccg 240
ggagggcctt ggcagcccct cagcaagaag ccctgcctga tgagacagag gtggtggaag 300
aaactgtggc agaggtgact gaggtatctg tgggagctaa tcctgtccag gtggaagtag 360
gagaatttga tgatggtgca gaggaaaccg aagaggaggt ggtggcggaa aatccctgcc 420
agaaccacca ctgcaaacac ggcaaggtgt gcgagctgga tgagaacaac acccccatgt 480
gcgtgtgcca ggaccccacc agctgcccag cccccattgg cgagtttgag aaggtgtgca 540
gcaatgacaa caagaccttc gactcttcct gccacttctt tgccacaaag tgcaccctgg 600
agggcaccaa gaagggccac aagctccacc tggactacat cgggccttgc aaatacatcc 660
ccccttgcct ggactctgag ctgaccgaat tccccctgcg catgcgggac tggctcaaga 720
acgtcctggt caccctgtat gagagggatg aggacaacaa ccttctgact gagaagcaga 780
agctgcgggt gaagaagatc catgagaatg agaagcgcct ggaggcagga gaccaccccg 840
tggagctgct ggcccgggac ttcgagaaga actataacat gtacatcttc cctgtacact 900
ggcagttcgg ccagctggac cagcacccca ttgacgggta cctctcccac accgagctgg 960
ctccactgcg tgctcccctc atccccatgg agcattgcac cacccgcttt ttcgagacct 1020
gtgacctgga caatgacaag tacatcgccc tggatgagtg ggccggctgc ttcggcatca 1080
agcagaagga tatcgacaag gatcttgtga tctaaatcca ctccttccac agtaccggat 1140
tctctcttta accctcccct tcgtgtttcc cccaatgttt aaaatgtttg gatggtttgt 1200
tgttctgcct ggagacaagg tgctaacata gatttaagtg aatacattaa cggtgctaaa 1260
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ttggcacatg ggtggacacg gatctgctgg gctctgcctt aaacacacat tgcagcttca 1440
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ttcatttcag ggtcttggct gcctgtgggc ttccccaggt ggcctggagg tgggcaaagg 1560
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<213> Artificial Sequence
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<223> DNA sequence of Homo sapiens retinol binding protein 1(RBP1)
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<211> 6995
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Homo sapiens trichohyalin (TCHH)
<400> 6
gttacccagt acacttgcct gtggtgtcag caagcactgt cgacttcttc ctctggtgaa 60
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agcagcggct gaagcgcgag catgaggaag agaggcgcga gcaggagcta gctgaggagg 2160
agcaggaaca ggcccgggag cggattaaga gccgcatccc gaagtggcag tggcagctag 2220
aaagcgaggc cgacgcacgg caaagcaaag tctactcgag gccccgcaag caggaagggc 2280
agaggcgccg ccaagagcag gaggaaaaga ggcggcgccg ggagagtgag ctgcaatggc 2340
aggaggagga acgggctcac cggcagcagc aggaagagga gcagcgccgg gacttcacat 2400
ggcagtggca ggcggaggaa aagagcgaga ggggccgtca gaggctgtcg gccaggcccc 2460
cattgcggga gcagcgggag aggcagctga gggccgagga gcgccagcag cgggaacaac 2520
ggtttctccc ggaggaggag gagaaggagc agcggcgccg ccagcgacgc gagagggaga 2580
aagagctgca gttcctggag gaagaggagc agctccagcg gcgggagcgt gcccaacagc 2640
tccaggagga ggaggacggc ctccaggagg atcaggagag gaggcgaagc caggagcagc 2700
gccgcgacca aaaatggagg tggcaactag aagaagaaag gaagagacgc cgccacacgc 2760
tgtacgccaa gccagcccta caagagcagc tgaggaagga acagcagctg ctgcaggagg 2820
aggaggagga gctacagaga gaggagcgcg agaagagaag gcgccaagaa caggagagac 2880
aataccgcga ggaagagcag ctgcagcagg aggaagagca gctgctgaga gaggaacggg 2940
agaaaagaag acgccaggag cgggaaaggc aatatcggaa ggataagaag ctgcagcaga 3000
aggaagagca gctgctggga gaggaaccgg agaagagaag gcgccaggag cgggagaaaa 3060
aataccgcga ggaagaggag ttgcagcagg aggaagagca gctgctgaga gaggaacggg 3120
agaagagaag gcgccaggag tgggagaggc agtaccgcaa aaaagacgag ctgcagcagg 3180
aagaagagca gctgctgaga gaggaacggg agaaaagaag actccaggag cgggagaggc 3240
aatatcggga ggaagaggag ctgcagcagg aggaagagca gctgctggga gaggaacggg 3300
agacgagaag gcgccaggag ctggagaggc aatatcggaa ggaagaggag ctgcagcagg 3360
aggaagagca gctgctgaga gaggaaccgg agaagagaag gcgccaggag cgggagaggc 3420
aatgtcggga ggaagaggag ctgcagcagg aggaagagca gctgctgaga gaggaacggg 3480
agaagagaag gcgccaggag ctggagaggc aatatcggga ggaagaggag gtgcagcagg 3540
aggaagagca gctgctgaga gaggaaccgg agaagagaag gcgccaggag ctggagaggc 3600
aataccgcga ggaagaggag ctgcagcagg aggaagagca gctgctgaga gaggaacagg 3660
agaaaaggcg ccaggagcgg gagaggcagt atcgggagga ggaagagctt cagcgccaga 3720
aaaggaagca gcgataccgg gatgaggatc agcgcagtga tctgaaatgg cagtgggaac 3780
cagaaaaaga aaatgcagtt cgtgataaca aggtttactg caaaggcaga gagaatgaac 3840
agttccggca gttggaagat tcccagctgc gcgacagaca atcccagcaa gatctgcagc 3900
acctgctggg tgaacagcaa gagcgagatc gtgagcaaga gaggaggcgc tggcagcagc 3960
gcgacaggca tttcccagag gaagaacagc tggagcgaga agagcaaaag gaagccaaaa 4020
ggcgcgacag gaagtcccaa gaggaaaagc agttgctgag agaggaaaga gaagagaaga 4080
gacgccgtca agagacagac agaaaattcc gcgaggagga acagctgctc caggaaaggg 4140
aggaacagcc gctgcgccgc caagagcgtg acagaaaatt ccgcgaagag gaactgcgcc 4200
atcaggaaca agggagaaaa ttcctcgagg aggaacagcg gctgcgccgc caggaacggg 4260
agagaaaatt ccttaaggag gaacagcagc tgcgctgcca ggagcgcgag caacagctgc 4320
gtcaggaccg cgacagaaaa ttccgcgagg aggaacagca gctgagccgc caagagcgtg 4380
acagaaaatt ccgtgaagag gaacagcagg tgcgccgcca ggaacgagag agaaaattcc 4440
tggaggagga acagcagctg cgccaggagc gtcacagaaa attccgcgaa gaggaacagc 4500
tgctccagga aagggaagaa cagcagctgc accgccaaga gcgtgacaga aaattcctgg 4560
aggaggaaca acagctgcgc cgccaagagc gtgacagaaa attccgcgaa caggaactgc 4620
gcagtcagga accagagaga aaattcctcg aggaggaaca gcagctgcac cgccagcaac 4680
ggcagagaaa attcctccag gaggaacagc agctgcgccg ccaggagcgc gggcaacagc 4740
ggcgtcagga ccgtgacaga aaattccgcg aggaggaaca gctgcgccag gagagggagg 4800
aacagcagct gagccgccaa gagcgtgaca gaaaattccg tttagaggaa cagaaagtgc 4860
gccgccagga acaagagaga aaattcatgg aggacgaaca gcagctgcgc cgccaggagg 4920
gccaacaaca gctgcgccag gagcgcgaca gaaaattccg cgaagacgaa cagctgctcc 4980
aggaaaggga agaacagcag ctgcaccgcc aagagcgtga cagaaaattc ctcgaggagg 5040
aaccgcagct gcgccgccag gagcgcgaac aacagctgcg tcacgaccgc gacagaaaat 5100
tccgtgaaga ggaacagctg ctccaggaag gggaggaaca gcagctgcgc cgccaagagc 5160
gtgacagaaa attccgcgaa gaggaacagc agctccgccg tcaggaacga gagagaaaat 5220
tcctccagga ggaacagcag ctgcgccgcc aggaactgga gagaaaattc cgtgaggagg 5280
aacagctgcg ccaagaaacg gagcaagagc agctgcgccg ccaagaacgc tacagaaaaa 5340
tcctagagga agagcagctc cgtccggaaa gggaagaaca gcagctgcgc cgccaggagc 5400
gcgacagaaa attccgcgag gaggaacagc tccgccagga gagggaggaa cagcagctgc 5460
gcagccaaga gtctgacaga aaattccgcg aggaggaaca gctacgccag gagagggaag 5520
aacagcagct gcgcccccaa cagcgtgacg gaaagtatcg ctgggaagaa gagcagctcc 5580
aacttgagga acaagagcag aggctgcggc aggagcgaga ccggcagtac cgggcggagg 5640
agcagtttgc cacgcaggag aagagtcgtc gtgaggaaca agaactatgg caagaagagg 5700
agcagaaacg tcgccaggaa cgggaaagga aattacggga agaacacatc cgccgccagc 5760
agaaggagga acagaggcac cgccaagtcg gggagataaa atcccaagaa gggaagggcc 5820
atgggcggct tctggagccc ggcactcatc agtttgccag tgtcccagtg cgctccagcc 5880
ctctctatga gtacatccaa gagcagagat ctcaataccg cccttaagtg atgttgccaa 5940
tatcttgaca cctgccaaag cttcgagcac gggaaaatga gaaacactgg gtaccaagtg 6000
ataactcaga tgtttctggt tgtgggaaaa ctctctgata ttagaatgtc ttttcttcca 6060
aaatcttaaa ctacgctcat tttacgcact ttgtacttct gctttttatt cttcctcaag 6120
tagttcttta ctgcaagatg tctttctttt gctctttgat gcagatgtgg tgtgcattta 6180
aaaaaaatat aaatcattta atttgtttaa gaaattttgt ttgaggaaca tgttcattta 6240
ttgctttcag aagtaacaag agtaatagga tgatttgaga ttctaaacaa tgggtcggtt 6300
tgtttaatga ctgacccatc ttgtggaaag tgcagatact tttaatgttc aagttgctat 6360
ttcttcttga acctaaattg atcattgcct ccaaacagca tttcatcttt tgtggcatag 6420
ttagcacaaa ttccaggtaa ctaaattttt ataacccttg aatagtgcag ggggagtgac 6480
ctctgcataa aaacttcctg taaaatcagc ccattactgg aagaaatatc tgttaagaat 6540
aggtttagct ttgaagattt agaatttaaa ttagattttt tttaaactca actccactta 6600
aacacataat ctcatgaaga aataatgagg tgtttctcaa cttcagagtt caaattttaa 6660
aactgtgtct gttgtagtct atagtgttca ttctacttcc ccaagttttg atgagtttca 6720
gaatattatg aacctttgtt aattttagct tgttagaagg aagctgctca gaatcccata 6780
aacatctgtc ttactctagg gccaataaga gatcacatag agcatgttgg gggtgtaaaa 6840
gggaaaaatg tgtgaacata ggggcaaatt tctagaggcc ctttgacaag acccatttgc 6900
ccacaatcat ttgaggccta ttgataatac cttagatata ttcttgttga aataattgga 6960
ctgtgaaaaa ttaataataa atgtttggca agtaa 6995
<210> 7
<211> 1780
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Homo sapiens leucine rich alpha-2-glycoprotein 1
(LRG1)
<400> 7
gcagagctac catgtcctct tggagcagac agcgaccaaa aagcccaggg ggcattcaac 60
cccatgtttc tagaactctg ttcctgctgc tgctgttggc agcctcagcc tggggggtca 120
ccctgagccc caaagactgc caggtgttcc gctcagacca tggcagctcc atctcctgtc 180
aaccacctgc cgaaatcccc ggctacctgc cagccgacac cgtgcacctg gccgtggaat 240
tcttcaacct gacccacctg ccagccaacc tcctccaggg cgcctctaag ctccaagaat 300
tgcacctctc cagcaatggg ctggaaagcc tctcgcccga attcctgcgg ccagtgccgc 360
agctgagggt gctggatcta acccgaaacg ccctgaccgg gctgcccccg ggcctcttcc 420
aggcctcagc caccctggac accctggtat tgaaagaaaa ccagctggag gtcctggagg 480
tctcgtggct acacggcctg aaagctctgg ggcatctgga cctgtctggg aaccgcctcc 540
ggaaactgcc ccccgggctg ctggccaact tcaccctcct gcgcaccctt gaccttgggg 600
agaaccagtt ggagaccttg ccacctgacc tcctgagggg tccgctgcaa ttagaacggc 660
tacatctaga aggcaacaaa ttgcaagtac tgggaaaaga tctcctcttg ccgcagccgg 720
acctgcgcta cctcttcctg aacggcaaca agctggccag ggtggcagcc ggtgccttcc 780
agggcctgcg gcagctggac atgctggacc tctccaataa ctcactggcc agcgtgcccg 840
aggggctctg ggcatcccta gggcagccaa actgggacat gcgggatggc ttcgacatct 900
ccggcaaccc ctggatctgt gaccagaacc tgagcgacct ctatcgttgg cttcaggccc 960
aaaaagacaa gatgttttcc cagaatgaca cgcgctgtgc tgggcctgaa gccgtgaagg 1020
gccagacgct cctggcagtg gccaagtccc agtgagacca ggggcttggg ttgagggtgg 1080
ggggtctggt agaacactgc aacccgctta acaaataatc ctgcctttgg ccgggtgcgg 1140
gggctcacgc ctgtaatccc agcactttgg gaggcccagg tgggcggatc acgaggtcag 1200
gagatcgaga ccatcttggc taacatggtg aaaccctgtc tctactaaaa atataaaaaa 1260
ttagccaggc gtggtggtgg gcacctgtag tcccagcaac tcgggaggct gaggcaggag 1320
aatggcgtga acttgggagg cggagcttgc ggtgagccaa gatcgtgcca ctgcactcta 1380
gcctgggcga cagagcaaga ctgtctcaaa aaaattaaaa ttaaaattaa aaacaaataa 1440
tcctgccttt tacaggtgaa actcggggct gtccatagcg gctgggaccc cgtttcatcc 1500
atccatgctt cctagaacac acgatgggct ttccttaccc atgcccaagg tgtgccctcc 1560
gtctggaatg ccgttccctg tttcccagat ctcttgaact ctgggttctc ccagcccctt 1620
gtccttcctt ccagctgagc cctggccaca ctggggctgc ctttctctga ctctgtcttc 1680
cccaagtcag ggggctctct gagtgcaggg tctgatgctg agtcccactt agcttggggt 1740
cagaaccaag gggtttaata aataaccctt gaaaactgga 1780
<210> 8
<211> 1546
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA sequence of Homo sapiens superoxide dismutase 3,
extracellular (SOD3)
<400> 8
ggggaggtct ggcctgcttt tcctccctga actggcccaa tgactggctc cctcacgctg 60
accactcctc tgggctggcc tcctgcactc gcgctaacag cccaggctcc agggacagcc 120
tgcgttcctg ggctggctgg gtgcagctct cttttcagga gagaaagctc tcttggagga 180
gctggaaagg tgcccgactc cagccatgct ggcgctactg tgttcctgcc tgctcctggc 240
agccggtgcc tcggacgcct ggacgggcga ggactcggcg gagcccaact ctgactcggc 300
ggagtggatc cgagacatgt acgccaaggt cacggagatc tggcaggagg tcatgcagcg 360
gcgggacgac gacggcgcgc tccacgccgc ctgccaggtg cagccgtcgg ccacgctgga 420
cgccgcgcag ccccgggtga ccggcgtcgt cctcttccgg cagcttgcgc cccgcgccaa 480
gctcgacgcc ttcttcgccc tggagggctt cccgaccgag ccgaacagct ccagccgcgc 540
catccacgtg caccagttcg gggacctgag ccagggctgc gagtccaccg ggccccacta 600
caacccgctg gccgtgccgc acccgcagca cccgggcgac ttcggcaact tcgcggtccg 660
cgacggcagc ctctggaggt accgcgccgg cctggccgcc tcgctcgcgg gcccgcactc 720
catcgtgggc cgggccgtgg tcgtccacgc tggcgaggac gacctgggcc gcggcggcaa 780
ccaggccagc gtggagaacg ggaacgcggg ccggcggctg gcctgctgcg tggtgggcgt 840
gtgcgggccc gggctctggg agcgccaggc gcgggagcac tcagagcgca agaagcggcg 900
gcgcgagagc gagtgcaagg ccgcctgagc gcggccccca cccggcggcg gccagggacc 960
cccgaggccc ccctctgcct ttgagcttct cctctgctcc aacagacacc ctccactctg 1020
aggtctcacc ttcgcctttg ctgaagtctc cccgcagccc tctccaccca gaggtctccc 1080
tataccgaga cccaccatcc ttccatcctg aggaccgccc caaccctcgg agccccccac 1140
tcagtaggtc tgaaggcctc catttgtacc gaaacacccc gctcacgctg acagcctcct 1200
aggctccctg aggtaccttt ccacccagac cctccttccc caccccataa gccctgagac 1260
tcccgccttt gacctgacga tcttccccct tcccgccttc aggttcctcc taggcgctca 1320
gaggccgctc tggggggttg cctcgagtcc ccccacccct ccccacccac caccgctccc 1380
gcggcaagcc agcccgtgca acggaagcca ggccaactgc cccgcgtctt cagctgtttc 1440
gcatccaccg ccaccccact gagagctgct cctttggggg aatgtttggc aacctttgtg 1500
ttacagatta aaaattcagc aattcagtaa aaaaaaaaaa aaaaaa 1546
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of ADAMTS15
<400> 9
ctgactcatg ccaggtatcc acactc 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of ADAMTS15
<400> 10
tctgctcagc acgggttgac ag 22
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of ATP12A
<400> 11
tcctacggtc tcgggagtgt cac 23
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of ATP12A
<400> 12
ctgatgaaca acttccgcat ctcg 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of SERPINH1
<400> 13
caagggagac aagatgcgag atgag 25
<210> 14
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of SERPINH1
<400> 14
ccgtggaata tccagggttg gtg 23
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of LCN2
<400> 15
tttgttccaa gctccagggc tg 22
<210> 16
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of LCN2
<400> 16
tggcgaactg gttgtagtcc gtg 23
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of RETN
<400> 17
agtctcctcc agagggaagt tggc 24
<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of RETN
<400> 18
ggctgctgtc cagtctatcc ttgc 24
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of SPARC
<400> 19
tccagagctg tggcacacat gac 23
<210> 20
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of SPARC
<400> 20
tgaaacagcc tcccagtgcc tag 23
<210> 21
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of TNC
<400> 21
actgtcatcg tgtcaacctg atgg 24
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of TNC
<400> 22
tccagatttc ggaagttgct gg 22
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of AXL
<400> 23
gcacgactct gagattccag gac 23
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of AXL
<400> 24
agtattccaa catgagccct aaactg 26
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of CD248
<400> 25
ggtggcactc ctggtgccaa 20
<210> 26
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of CD248
<400> 26
cttgttccca gcatgtgtga ccc 23
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of COCH
<400> 27
atcttctctg ttggtgtggc ttgg 24
<210> 28
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of COCH
<400> 28
gcacgtattc cttgagttgt cagagtatc 29
<210> 29
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of HP
<400> 29
tgtcgctgag tatggtgtgt acgtg 25
<210> 30
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of HP
<400> 30
tcagagtata gcccaaccct tccac 25
<210> 31
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of PDK4
<400> 31
gtgggtctcc ctcttactag acaagg 26
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of PDK4
<400> 32
ttcaaactca actgcgactc agg 23
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of PXDN
<400> 33
agggatatgt cttgtgccaa ggc 23
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of PXDN
<400> 34
gtaaatcaca gccagcctcc cac 23
<210> 35
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of RBP1
<400> 35
gcatgaccac tgtgagctgg ga 22
<210> 36
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of RBP1
<400> 36
gcagatcaca ccctcagctc tcatt 25
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of TCHH
<400> 37
gattccatca gcaggctgaa ac 22
<210> 38
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of TCHH
<400> 38
gaccaccttg ctttcacttc atg 23
<210> 39
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of TNN
<400> 39
caacccgaat ggcaaatatg gg 22
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of TNN
<400> 40
gccagagaaa cggtctctgc tgtaa 25
<210> 41
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of LRG1
<400> 41
aagaacctgg cggacctttg c 21
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of LRG1
<400> 42
cagctctgcc acgtccagca 20
<210> 43
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of PCOLCE1
<400> 43
cccagtggca cctctctgaa gttg 24
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of PCOLCE1
<400> 44
cgaagctctc tggaggaagg atgg 24
<210> 45
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of FNIP1
<400> 45
tccatcggta gctgtcctct gag 23
<210> 46
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of FNIP1
<400> 46
tgcacaaatt tcccctagaa ctgg 24
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of STK32B
<400> 47
tccagtcagc ctgtcatgca aag 23
<210> 48
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of STK32B
<400> 48
tcagcatcct cagctcaagg gtc 23
<210> 49
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of HMP1
<400> 49
ggctggagat tctgtcctgg tgaag 25
<210> 50
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of HMP1
<400> 50
gctgtggagt gtgtcctgga acttg 25
<210> 51
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer sequence of SOD3
<400> 51
cttccacaga cccagatcct taatgc 26
<210> 52
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer sequence of SOD3
<400> 52
agtatctgag cacatgcgat ctctgg 26
Claims (14)
- SERPINH1(Serpin family H member 1 또는 Heat shock protein 47)와 SPARC(Secreted protein acidic and cysteine rich glycoprotein) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제; 및
TNC(Tenascin-C), RBP1(Retinol binding protein 1), TCHH(Trichohyalin), LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1), LCN2(Lipocalin 2) 및 SOD3(Superoxide dismutase 3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제;를 포함하는, 피부 조직의 자연노화 진단용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 SERPINH1, LCN2, SPARC, TNC, RBP1, TCHH, LRG1 및 SOD3은 순서대로 서열번호 1 내지 8의 염기서열인 것을 특징으로 하는 피부 조직의 자연노화 진단용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 mRNA 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 상보적인 서열을 갖는 프로브 또는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 조직의 자연노화 진단용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적인 항체 또는 앱타머를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 조직의 자연노화 진단용 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 피부 조직의 자연노화 진단용 조성물은 나이에 따른 자연노화를 진단하기 위한 것을 특징으로 하는 노화 진단용 조성물. - 상기 제1항의 피부 조직의 자연노화 진단용 조성물을 포함하는 피부 조직 자연노화 진단용 키트.
- 제6항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 피부 조직 자연노화 진단용 키트. - 검체로부터 분리한 피부 조직으로부터 SERPINH1(Serpin family H member 1 또는 Heat shock protein 47)와 SPARC(Secreted protein acidic and cysteine rich glycoprotein) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 및
TNC(Tenascin-C), RBP1(Retinol binding protein 1), TCHH(Trichohyalin), LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1), LCN2(Lipocalin 2) 및 SOD3(Superoxide dismutase 3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준;을 검출하여, 자연노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제8항에 있어서,
상기 피부 조직으로부터 검출된 수치를 대조군 시료로부터 검출된 수치와 비교하여 노화 여부를 판단하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 자연노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 제9항에 있어서,
상기 피부 조직으로부터 검출된 수치가 대조군의 피부 조직으로부터 검출된 수치보다 낮을 경우, 자연노화 개체로 판단하는 것을 특징으로 하는 자연노화 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법. - 삭제
- (a) 검체로부터 분리된 피부 조직에 노화 조절용 후보물질을 처리하는 단계 및
(b) 상기 후보물질이 처리된 피부 조직으로부터 SERPINH1(Serpin family H member 1 또는 Heat shock protein 47)와 SPARC(Secreted protein acidic and cysteine rich glycoprotein) 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준; 및 TNC(Tenascin-C), RBP1(Retinol binding protein 1), TCHH(Trichohyalin), LRG1(Leucine-rich alpha-2-glycoprotein 1), LCN2(Lipocalin 2) 및 SOD3(Superoxide dismutase 3)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자의 mRNA 또는 이의 단백질 수준;을 측정하는 단계를 포함하는 피부 조직의 자연노화 조절용 후보물질을 스크리닝하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 단백질 수준의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip)에서 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것을 특징으로 하는, 피부 조직의 자연노화 조절용 후보물질을 스크리닝하는 방법. - 제12항에 있어서,
상기 mRNA의 수준의 측정은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA: RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), 및 DNA 칩에서 선택된 하나 이상의 방법에 의한 것을 특징으로 하는, 피부 조직의 자연노화 조절용 후보물질을 스크리닝하는 방법.
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| KR1020170012891A KR102031858B1 (ko) | 2017-01-26 | 2017-01-26 | 노화 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 진단하는 방법 |
Applications Claiming Priority (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020170012891A KR102031858B1 (ko) | 2017-01-26 | 2017-01-26 | 노화 진단용 조성물, 이를 포함하는 키트 및 이를 진단하는 방법 |
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