JP5031581B2 - Aml、b−allおよびt−allの診断用マーカー - Google Patents
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Description
T−ALLマーカー検出用DNAチップキットは、(i)TCF7遺伝子、または(ii)TCF7遺伝子とTRB、TRGC2、NK4およびCHC1Lの中から選択される一つ以上の遺伝子またはその断片に該当するcDNAが付着されている基板を含む。また、RRAGBおよび/またはDCK遺伝子またはその断片に該当するcDNAを基板に付着および固定することができる。
<1−1>骨髄細胞のRNA分離
本発明者らは、82名のAML患者、23名のB−ALL患者、および2名のT−ALL患者の骨髄試料からRNAを分離して実験に利用した。保管された骨髄試料からRNAを分離するために、1mLの骨髄試料に5mlのTriZol試薬(InVitrogen、Cat.No.15596−018)を添加して組織ホモジナイザーで1分間細胞を破壊させた。以後のRNA分離過程は、TriZol試薬の製造社から提供された実験方法によって行った。RNAを分離した後、純度をさらに高めるために、RNeasyキット(Qiagen、Cat.No.74106)用いて、製造社から提供された実験方法によってRNAを追加精製した。
<1−2>分離されたRNAの定量分析
分離されたRNAはスペクトロフォトメーター(spectrophotometer)を用いて260nm波長で吸光度を測定してRNAを定量した。
<1−3>参照RNAの製造
DNAチップとハイブリッド化の際に骨髄細胞から分離されたRNAと共にハイブリッド化する参照RNAは、血液細胞に起因した細胞株からRNAを分離して使用した。参照RNAを製造するために、HL−60、K−562、CCRF−CEM、CCRF−HSB−2、CEM−CM3、Molt−4、THP−1の7種の細胞株(韓国細胞株銀行(http;//cellbank.snu.ac.kr)から購入)から<1−1>の方法でRNAを分離した。分離されたRNAは<1−2>の方法で定量した後、同量を混ぜて参照RNAとして使用した。
<1−4>実験に使用されたDNAチップ
DNAチップは、15,972個のcDNAプローブを含む16KヒトcDNAチップ(16KヒトcDNAチップ)を用いた(Vivian G. Cheung et al., Nature Genetics, Making and reading microarrays, 1999 Jan 21: 15-19; Microarray Biochip Technology, Mark Schena, 2000, Eaton Publishing)。簡単に製作過程を説明すると、次の通りである。cDNAがクローニングされているプラスミドを含むバクテリアストックからプラスミドを分離し、分離されたプラスミドをテンプレートとしてPCRを行って増幅した。増幅されたcDNAは、プローブを使用するために、PCRクリーンアップキット(clean-up kit)を用いて不純物を除去した。精製されたcDNAを50%DMSO含有スポッティング溶液に100〜200ng/μlの濃度で溶かしてGAPSIIスライド(Corning、Cat.No.40006)にスポッティングした後、適量の紫外線照射によって固定させて本発明の16KヒトcDNAチップを製造した。
<1−5>チップ実験および遺伝子発現定量
10μgの骨髄試料から分離されたRNAと参照試料RNAをアミノアーリル−dUTPの存在下に逆転写してcDNAを製造した後、それぞれモノエステル−Cy5およびモノエステル−Cy3と反応させてCy5とCy3を標識した。標識付き試料は、PCRクリーンアップキットを用いて精製した後、DNAチップに16時間以上ハイブリッド化した。ハイブリッド化の後、非特異的ハイブリッド化を除去するために、SSC含有洗浄溶液を用いてDNAチップを洗浄した。洗浄されたDNAチップは、共焦点(confocal)をレーザースキャナ(Perkin Elmer、Scanarray Lite)を用いてスキャニングし、各スポットに存在する蛍光のデータを得てTIFF形態のイメージファイルとして格納した。TIFFイメージファイルをGenePix3.0(Axon Instruments)で定量して各スポットの蛍光値を定量した。GenePix3.0から得られた定量結果は、Yangなど(Nucleic Acids Res 2002, 30:e15)が提案した方法によって、S−plus統計パッケージ(InSightful)から提供する「lowess」機能を用いて補正した。
使用されたDNAチップに存在する15,972個のプローブに対し、AML試料、B−ALL、およびT−ALL試料における発現に差異がある遺伝子をp<10−6の有意水準でt−testによって選別した。この場合、15,972回のt−testを反復するので、p<10−6の有意水準では0.02回の偽陽性(flase positive)が発現するものと予想されるので、選別された遺伝子はいずれも実際発現に差異がある遺伝子である。t−test結果、268個の遺伝子が、AML、B−ALL、およびT−ALLにおける発現に差異があるものとして選別された。
実施例2で選別された診断マーカー候補遺伝子の発現差異を用いて実際にAMLとALLを区分し得るかを調査するために、4個のAML試料と2個のT−ALL試料、2個のB−ALL試料における遺伝子発現をRT−PCRによって調査した。RT−PCR反応は次の方法で行った。5μgのRNA試料を取って20μl反応体積で逆転写させ、蒸留水を添加して100μlに希釈した。希釈された逆転写産物2μlを取ってテンプレートとして用い、8個のマーカー遺伝子に特異的なプライマー対の存在下に25μl反応体積で25回のPCR反応を行った。PCR反応産物のうち8μlを取って0.5μg/mlのエチジウムブロマイドの存在下に2%アガロースゲルで電気泳動してバンドを観察した。遺伝子の中から、最もAML、B−ALL、およびT−ALLに特異的な遺伝子および全試料において一定の水準で発現する2個の対照群遺伝子を選別した。図1は選定された8個の遺伝子のRT−PCR結果を示す。
実施例3で選定された8個の診断用遺伝子の発現を追加的な41個のAML試料と16個のALL試料で調査した。急性白血病は、特徴的な染色体変異を持っているものと知られている。例えば、AMLはt(8;21)、t(15;17)、inv(16)などの染色体変異が最も頻繁に発生し、ALLはt(9;22)の染色体変異を持つ場合に予後がが良くないものと知られている。実施例4で選別された診断マーカー遺伝子が前述した様々な染色体変異を持つ急性白血病への適用が可能なのかを調査するために、様々な染色体変異を持つ試料で8個の診断マーカー遺伝子の発現を調査した。図2は正常的な染色体を持つAML試料で、図3はt(15;17)染色体変異を持つAML試料で、図4はt(8;21)の染色体変異を持つAML試料で、図5は正常的な染色体を持つB−ALL試料で、図6はt(9;22)染色体変異を持つB−ALL試料で、図7はT−ALL試料で8個の診断マーカー遺伝子の発現を調査したものである。
Claims (5)
- CITED2、MGST1、TCL1A、CD19、TCF7及びTRB遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセットを含む、AML、B−ALLおよび/またはT−ALLを区別するための診断マーカー検出用キット。
- (a)BIN2、RAB32、ICAM−3、PXN、PPGB及びTAF15の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセット;
(b)INSR、OFD1、AKR1B1、CD79B及びUHRF1の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセット;及び
(c)TRGC2、NK4及びCHC1Lの中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセットをさらに含む、請求項1に記載のキット。 - 検出用キットはDNAチップ又はRT−PCR検出用キットである、請求項1又は2に記載の検出用キット。
- CITED2、MGST1、TCL1A、CD19、TCF7及びTRB遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセットを含む、AML、B−ALLおよび/またはT−ALLを区別するための診断マーカー検出用組成物。
- (a)BIN2、RAB32、ICAM−3、PXN、PPGB及びTAF15の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセット;
(b)INSR、OFD1、AKR1B1、CD79B及びUHRF1の中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセット;及び
(c)TRGC2、NK4及びCHC1Lの中から選択される一つ以上の遺伝子に特異的なプローブセット又はプライマーセットをさらに含む、請求項4に記載の組成物。
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