KR102116449B1 - Ofd1을 이용한 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 - Google Patents

Ofd1을 이용한 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 OFD1을 이용한 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 피부 탈색 질환의 치료제로 활용하기 위한 후보물질을 선별하는 도구로써 유용하게 활용될 수 있다.

Description

OFD1을 이용한 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법{Screening Method of Skin Depigmentation Disorder Therapeutic Composition Using OFD1}
본 발명은 OFD1을 이용한 백반증 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
피부 탈색 질환, 특히, 백반증(vitiligo, 白斑症)은 후천적으로 멜라닌 세포의 사멸에 의하여 피부색이 하얗게 변하는 질환으로, 인종과 성별에 차이가 없이 전 세계 인구의 약 1-2%에서 발생되는 비교적 흔한 질환이다. 얼굴이나 손과 같이 의복에 의해 가려지지 않는 부위, 사타구니나 겨드랑이 같이 피부가 접히는 부위, 팔꿈치, 무릎 및 손관절 같이 돌출한 뼈 위의 피부, 입이나 코 같이 신체의 구멍 주위에 주로 발생한다. 대개 좌우 대칭으로 나타나지만, 신경절을 따라 좌우 한쪽에만 발생하기도 하고, 한곳 또는 몇몇 부위에만 국한되는 경우도 있으며, 드물게는 피부의 거의 대부분이 하얗게 되기도 한다.
케라틴 세포는 전문화된 표피세포로, 이의 발달 및 항상성 유지에는 다중 시그널 경로가 필요하며, AKT의 활성이 케라틴 세포 말단 분화의 시작에 관여하고, PI3K(phosphoinositide 3-kinase)의 활성에 의해 그 분화가 진행된다는 것이 보고되어 있다.
백반증 환자의 정상적으로 색소가 침착된 표피 대비 색소가 감소한 표피에서 상당히 더 많은 케라틴 세포가 사멸되며, 그로 인해 멜라닌세포의 생존에 필요한 케라틴 세포 유래 인자의 합성이 감소하여 수동적으로 멜라닌 세포의 사멸이 초래되는 것으로 알려져 있다. 다만, 백반증과 같은 피부 탈색 질환이 발생하는 명확한 원인에 대해서는 현재까지 보고된 바가 없다. 따라서, 피부 탈색 질환의 치료를 위하여, 스테로이드 외용제, 광화학요법, 부신피질호르몬제 전신요법, 피부이식법 등의 다양한 방법이 적용되고 있으나, 치유 속도가 느리며, 대부분에서 완전 치유가 되지 않는 문제점이 존재한다.
이에, 본 발명자들은 피부 탈색 질환의 치료용 물질을 선별하기 위한 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.
대한민국 특허등록 제10-0788241호
본 발명의 하나의 목적은 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 상기 후보물질과 접촉된 세포의 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 OFD1의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 상기 후보물질과 접촉된 세포에서 형성된 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1) 단백질을 정량분석하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 단백질의 형성을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 상기 후보물질과 접촉된 세포의 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1)의 발현수준을 측정하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 OFD1의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 첫 번째 단계는 세포에 후보물질을 접촉시키는 것이다.
본 발명의 후보물질은 피부 탈색 질환 환자에 적용하여 피부 탈색 증상을 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하는 것으로, 이와 같은 특성을 나타내는 물질은 제한 없이 포함될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "피부 탈색 질환"은 피부에 존재하는 멜라닌 세포 및/또는 케라틴 세포의 감소에 따른 정상피부 대비 연한 피부색을 나타내는 질환을 말한다.
본 발명에서 사용되는 용어, "접촉"은 이의 일반적인 의미로, 하나 이상의 물질 및/또는 세포가 다른 물질 및/또는 세포에 영향을 줄 수 있을 정도로 가까운 거리에 위치하는 것을 의미한다. 접촉은 시험관 내(in vitro)에서 일어나는 것일 수 있으며, 예를 들어, 시험관 또는 다른 컨테이너에서 하나 이상의 물질과 세포를 합한 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포는 케라틴 세포 또는 멜라닌 세포일 수 있다.
본 발명에서, OFD1 유전자의 발현 수준은 케라틴 세포 또는 멜라닌 세포에서 평가될 수 있으며, 상기 케라틴 세포 및 상기 멜라닌 세포는 OFD1의 발현이 감소되어 있는 것, 예를 들어, 백반증 병반 유래인 것일 수 있다. OFD1의 감소에 의하여 케라틴 세포 및 멜라닌 세포에서, 일차 섬모의 손실, 세포 사멸, 팩실린을 통한 ECM에 대한 유착 감소가 나타나므로, 결과적으로, 피부 탈색 증상이 발생하는데, OFD1의 발현을 증가시키는 물질은 위와 같은 OFD1의 감소에 따른 피부 탈색을 개선할 수 있으므로, 피부 탈색 질환, 특히, 백반증 치료의 후보물질로써, 선별될 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 피부 탈색 질환은 백반증(vitiligo)일 수 있다.
백반증은 후천적으로 멜라닌 세포의 사멸에 의하여 피부색이 하얗게 변하는 질환으로, 케라틴 세포의 세포 사멸로 인하여, 멜라닌 세포의 생존에 필요한 케라틴 세포 유래 인자의 합성이 감소함으로써, 멜라닌 세포의 사멸이 발생한다. 따라서, 케라틴 세포 또는 멜라닌 세포에서 OFD1 유전자의 발현 수준을 평가함으로써, 백반증 치료를 위한 후보물질을 선별할 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 세포는 OFD1 유전자가 넉다운(knock-down)된 세포일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, "넉다운"은 유전자의 발현양을 상당량 줄여 유전자의 기능이 감소되도록 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용되는 OFD1 유전자가 넉다운된 세포는 OFD1 유전자에 대한 siRNA를 발현하는 재조합 벡터의 삽입에 의하여 제조될 수 있다. 상기 재조합 벡터에서 이용 가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
본 발명의 재조합 벡터의 제작은 당해 기술 분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용하여 수행될 수 있다.
상기 OFD1 유전자가 넉다운된 세포는 피부 탈색관련 질환의 치료, 예방, 진단 또는 그 분자적 기전에 관한 연구과정 및 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 등에 널리 활용될 수 있다.
본 발명의 두 번째 단계는 상기 후보물질과 접촉된 세포의 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1)의 발현수준을 측정하는 것이다.
OFD1의 발현수준을 측정하는 방법은 유전자의 발현을 측정하는데 사용되는 공지된 방법이면 제한 없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 실시간 중합효소연쇄반응(Real-time PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay; RPA), 마이크로어레이(microarray) 또는 노던 블롯 분석(northern blot assay)을 통하여 OFD1의 mRNA 발현수준을 측정할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 마지막 단계는 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 OFD1의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 질병 또는 장애의 개선을 지칭한다. 이에는 질병 또는 장애 및 이로부터 비롯된 증상의 완화, 치유 및 예방을 포함하며, 환자에 발생한 비정상적인 상태에 대한 전 스펙트럼의 치료를 포함한다.
후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 OFD1의 발현수준을 유의하게 증가시키는 후보물질을 피부 탈색 장애 치료용 물질로 선별할 수 있으나, OFD1의 발현수준을 음성 대조군에 비해 20% 이상 증가시키는 후보물질이 바람직하며, OFD1의 발현수준을 음성 대조군에 비해 40% 이상 증가시키는 후보물질이 가장 바람직하다.
본 발명의 다른 양상은 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계; 상기 후보물질과 접촉된 세포에서 형성된 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1) 단백질을 정량분석하는 단계; 및 상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 단백질의 형성을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계를 포함하는 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법에 있어서, 전술한 내용과 중복되는 부분은 전술한 의미와 동일한 의미로 사용될 수 있다.
OFD1 단백질을 정량분석하는 방법은 유전자의 발현을 측정하는데 사용되는 공지된 방법이면 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 웨스턴 블롯 분석(western blot array), 면역세포화학법(immunocytochemistry), 방사선면역분석법(radioimmunoassay; RIA), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 효소면역분석법(ELISA), 면역침강법(immunoprecipitation), 유세포분석법(flow cytometry), 면역형광염색법(immunofluorescence) 또는 공초점 현미경(confocal microscopy) 분석법을 통하여 OFD1 단백질을 정량할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 OFD1 단백질을 유의하게 증가시키는 후보물질을 피부 탈색 장애 치료용 물질로 선별할 수 있으나, OFD1 단백질을 음성 대조군에 비해 20% 이상 증가시키는 후보물질이 바람직하며, OFD1 단백질을 음성 대조군에 비해 40% 이상 증가시키는 후보물질이 가장 바람직하다.
OFD1을 이용한 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법에 따르면, 피부 탈색 질환의 치료제로 활용하기 위한 후보물질을 선별하는 도구로써 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 OFD1 mRNA의 수준이 정상 색소 표피(normal; N) 대비, 탈색 표피(lesion; L)에서 감소되어 있음을 나타낸 그래프이다.
도 2는 OFD1 단백질의 수준이 정상 색소 표피 대비, 탈색 표피에서 감소되어 있음을 확인한 결과이다.
도 3은 OFD1 단백질이 탈색 표피에서 감소되어 있음을 나타낸 공초점 현미경 사진이다. (a)는 항체로써, anti-OFD1 및 anti-acetylated α-tubulin을 사용한 것이고, (B)는 항체로써, anti-acetylated α-tubulin 및 anti-c-KIT을 사용한 것이다.
도 4는 일차 섬모를 갖는 세포가 탈색 표피에서 감소되어 있음을 나타낸 그래프이다.
도 5는 일차 섬모를 갖는 멜라닌 세포의 숫자가 탈색 표피 세포에서 상대적으로 감소되어 있음을 나타낸 공초점 현미경 사진이다.
도 6은 일차 섬모를 갖는 멜라닌 세포의 숫자가 탈색 표피 세포에서 상대적으로 감소되어 있음을 나타낸 그래프이다.
도 7은 케라틴 세포(A) 및 멜라닌 세포(B)에서, OFD1 넉다운에 의하여 OFD1 mRNA의 상대적 수준이 감소되었음을 나타낸 그래프이다.
도 8은 케라틴 세포(A) 및 멜라닌 세포(B)에서, OFD1 넉다운에 의하여 OFD1 단백질의 상대적 수준이 감소되었음을 확인한 결과이다.
도 9는 케라틴 세포(A) 및 멜라닌 세포(B)에서, OFD1 넉다운에 의하여 총 세포에 대한 생존 세포의 비율이 감소되었음을 나타낸 그래프이다.
도 10은 케라틴 세포 및 멜라닌 세포에서, OFD1 넉다운에 의하여 annexin V-양성/propidium iodide(PI)-음성 및 이중-양성 비율이 증가하였음을 나타낸 그래프이다.
도 11은 케라틴 세포(A) 및 멜라닌 세포(B)에서, OFD1 넉다운에 의하여 세포 사멸(apoptosis)이 증가하였음을 나타낸 그래프이다.
도 12는 케라틴 세포(A) 및 멜라닌 세포(B)에서, OFD1 넉다운에 의하여 BCL2와 인산화된 BCL2 관련 사망(pBAD) 단백질 수준의 상대적 비율은 감소되었으나, BAX 및 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 단백질의 수준은 증가되었음을 확인한 결과이다
도 13은 IFT88(A) 및 RPGRIP1L(B)의 넉다운에 의하여 일차 섬모를 갖는 멜라닌 세포의 상대적 수가 감소되었음을 나타낸 공초점 현미경 사진이다.
도 14는 IFT88(A) 및 RPGRIP1L(B)의 넉다운에 의하여 일차 섬모를 갖는 멜라닌 세포의 상대적 수가 감소되었음을 나타낸 그래프이다.
도 15는 총 세포에 대한 생존 세포의 상대적인 수는 IFT88 또는 RPGRIP1L의 넉다운에 의해 감소하지 않음을 나타낸 그래프이다.
도 16은 BCL2, pBAD, BAX 및 PARP 단백질 수준의 상대적인 비율은 IFT88(A) 또는 RPGRIP1L(B)의 넉다운에 의해 변하지 않음을 확인한 결과이다.
도 17은 OFD1(A), IFT88(B) 또는 RPGRIP1L(C) 넉다운 멜라닌 세포에서, hedgehog 신호 단백질인 patched1(PTCH1), 신경아 교종 관련 암 유전자 동족체 1(GLI1) 및 Smoothened(Smo)의 상대적 수준이 감소되었음을 확인한 결과이다.
도 18은 OFD1(A), IFT88(B) 또는 RPGRIP1L(C) 넉다운 멜라닌 세포에서, WNT3A, GSK3β 및 β-카테닌과 같은 Wnt 신호 단백질은 변하지 않음을 확인한 결과이다.
도 19는 OFD1(A), IFT88(B) 또는 RPGRIP1L(C) 넉다운 멜라닌 세포에서, 팩실린, FAK(focal adhesion kinase) 및 인테그린 β1의 상대적인 수준은 OFD1의 넉다운으로 감소된 반면, IFT88 또는 RPGRIP1L의 넉다운에서는 감소하지 않음을 확인한 결과이다.
도 20은 OFD1이 하향조절되는 탈색 표피에서, 팩실린, FAK 및 인테그린 β1의 수준이 감소되어 있음을 확인한 결과이다.
도 21은 OFD1 넉다운에 의하여 type IV 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴에 대한 멜라닌 세포의 유착이 억제됨을 나타낸 공초점 현미경 사진이다.
도 22는 OFD1 넉다운에 의하여 type IV 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴에 대한 멜라닌 세포의 유착이 억제됨을 나타낸 그래프이다.
도 23은 OFD1의 넉다운에 의하여 멜라닌 세포에서 결합 단백질(A) 및 결합 단백질의 발현(B)의 상대적인 수준의 감소를 통해, OFD1과 팩실린, 팩실린과 FAK 및 팩실린과 인테그린 β1 사이에 각각 결합이 존재한다는 것을 확인한 결과이다.
도 24는 OFD1 넉다운에 의한 ECM 성분에 대한 감소된 유착은 팩실린 과발현에 의해 유의적으로 회복되어, 인테그린 β1 단백질의 상대적 수준이 회복됨을 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 하나 이상의 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. OFD1 넉다운에 따른 활성 변화 분석 방법
1-1. 환자 및 표본 채취
백반증(vitiligo)으로 진단된 16명(남자 5명, 여자 11명)의 6 내지 52세(평균 28.6 세) 환자를 대상으로 본 연구를 진행하였다. 본 연구는 동국대 일산병원 임상 시험위원회(Institutional Review Board)의 승인을 득하였으며, 헬싱키 선언에 따라 수행되었다.
각 환자로부터 서면 동의를 얻은 후, 공초점 현미경 검사를 위하여, 4명의 환자로부터 탈색 및 정상 색소 피부 표본을 채취하였다. 실시간 PCR 및 웨스턴 블롯 분석을 위하여, 다른 12명의 환자에서, 흡입 수포(suction blister)의 천정부(roof)로부터 탈색 및 정상 색소 피부 표본을 채취하였다.
1-2. 정상 인간 피부 멜라닌 세포의 배양
실시예 1-1에서 환상 절제술(circumcision)로 수득한 성인 피부 표본을 멜라닌 세포(melanocyte) 배양에 사용하였다. 진피(dermis)에서 표피(epidermal)를 분리한 후, 각 표피 세포를 소 뇌하수체 추출물(bovine pituitary extract), 소태아혈청(fetal bovine serum), 소 인슐린(bovine insulin), 히드로코르티손(hydrocortisone), 염기성 섬유모세포성생인자(basic fibroblast growth factor), 소 트랜스페린(bovine transferrin), 헤파린(heparin) 및 포볼12-미리스테이트 13-아세트산(phorbol 12-myristate 13-acetate)(Invitrogen, Carlsbad, CA)이 보충된 254 배지(Invitrogen, Carlsbad, CA)에 현탁시켰다. 이후 실험에 15 내지 30의 계대 횟수(passage number)의 멜라닌 세포를 사용하였다.
1-3. OFD1 넉다운 및 팩실린 과발현
OFD1 넉다운(knock-down)을 위하여, Transit-siQUEST transfection reagent(Mirus, Madison, WI)를 제조사의 지시에 따라 사용하여, 인간 OFD1에 대한 50nM siRNA 또는 음성 대조군(ON-TARGETplus SMARTpool 또는 Non-targeting siRNA; Dharmacon, Research, Lafayette, CO)을 멜라닌 세포에 형질주입하였다.
팩실린(paxillin)의 과발현을 위하여, 팩실린 유전자를 포함하는 pmCherry 벡터(Addgene, Cambridge, MA)를 사용한 세포의 형질주입을 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000(Invitrogen)을 사용하여 수행하였다. 형질주입하고 24시간 후, 세포를 실험에 사용하였다.
1-4. 실시간 PCR 분석
실시간(real time: RT) PCR(Promega, Fitchburg, WI) 분석을 위하여, cDNA 합성 키트를 사용하여 총 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. 표적 mRNA의 양은 Light Cycler 실시간 PCR 기기(Roche, Penzberg, Germany)를 사용하여 실시간 PCR로 정량하였다.
mRNA의 상대적 양을 GAPDH(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)에 대한 각 표적의 상대적인 비율로 계산하였다. 실시간 PCR에 사용된 프라이머 서열은 하기 표 1과 같다.
프라이머 프라이머 염기서열(5'→3') 서열번호
OFD1 forward gaatctgcagggaacatgc 서열번호 1
reverse gcgtccacatgagacatatcc 서열번호 2
GAPDH forward tccactggcgtcttcacc 서열번호 3
reverse ggcagagatgatgacccttt 서열번호 4
1-5. 웨스턴 블롯(Western blot) 분석
균등한 양의 추출된 단백질 20㎍을 용해시킨 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인은 하기 표 2의 항체와 인큐베이션하였다.
항체명 구입처
rabbit polyclonal OFD1 Proteintech, Chicago, IL
rabbit polyclonal paxillin Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA
rabbit polyclonal FAK
rabbit polyclonal PTCH1
rabbit polyclonal GLI1
rabbit polyclonal PARP
rabbit polyclonal BCL2 Cell Signaling Technology, Beverly, MA
rabbit polyclonal p-BAD
rabbit polyclonal GSK-3β
rabbit polyclonal phospho-GSK-3β
rabbit polyclonal β-catenin
mouse monoclonal BAD Santa Cruz Biotechnology
mouse monoclonal BAX
mouse monoclonal WNT3a
rabbit polyclonal integrin β Bethyl Laboratories, TX
goat polyclonal Smo Santa Cruz Biotechnology
mouse monoclonal β-actin Sigma-Aldrich, St. Louis, MO
적절한 anti-rabbit 또는 anti-mouse horseradish 퍼옥시다아제-컨쥬게이션된 항체(Santa Cruz Biotechnology)와 인큐베이션한 후, 향상된 화학발광 용액(enhanced chemiluminescence solution)(Thermo Scientific, Waltham, MA)을 처리하고, 신호를 이미지 판독기(LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 획득하였다. 또한, 농도 측정법(densitometry)으로 단백질 밴드를 분석하였다.
1-6. 면역침강법(Immunoprecipitation)
세포 용해물의 상등액(supernatant)을 4℃에서 anti-OFD1, anti-paxillin, anti-FAK, 또는 anti-integrin β1 항체 및 Pierce™ Direct IP kit (Thermo Scientific)의 레진(resin)과 인큐베이션하였다. 용출된 레진-결합 단백질은 anti-paxillin, anti-FAK, anti-OFD1, 또는 anti- integrin β1 항체로 면역 블롯팅(immunoblotting)하여 분석하였다.
1-7. 공초점 현미경(Confocal microscopy) 분석
탈파라핀 및 재수화 후, 절편을 3% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)으로 예비인큐베이션하였다. 이 절편을 anti-acetylated α-tubulin(Mouse monoclonal; Sigma-Aldrich), anti-OFD1 및/또는 anti-c-KIT(rabbit polyclonal; DB Biotech, Kosice, Slovakia) 항체와 순차적으로 반응시켰다.
Alexa Fluor® 488-컨쥬게이션된 goat anti-rabbit IgG 및/또는 Alexa Fluor® 594-컨쥬게이션된 goat anti-mouse IgG(Molecular Probes, Eugene, OR)로 염색한 후, 핵을 Hoechst 33258(Sigma-Aldrich)로 대조염색하였다.
배양된 세포를 염색하기 위하여, 2% 파라포름알데히드에 세포를 고정시켰다. 고정된 세포는 anti-acetylated α-tubulin 및 anti-OFD1로 이중 염색 또는 삼중 염색한 후, Alexa Fluor® 594-컨쥬게이션된 goat anti-mouse IgG 및 Alexa Fluor® 488-컨쥬게이션된 goat anti-rabbit IgG로 염색하였다.
Hoechst 33258로 핵을 대조염색하였다. EZ-C1 공초점 현미경(EZ-C1, Nikon, Tokyo, Japan)을 사용하여 얻은 이미지를 NIS-Elements AR 3.2 소프트웨어(Nikon Instruments, Melville, NY)를 사용하여 분석하였다.
1-8. 세포 생존력(Cell viability) 분석
세포 생존력은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide) 환원법으로 평가하였다. 구체적으로, 세포를 MTT로 4시간 동안 염색하였다. 침전된 포르마잔(formazan)을 DMSO에 용해시키고, 광학 밀도를 분광 광도계(spectrophotometer)를 사용하여 630nm에서 배경 분리(background subtraction)로 570nm에서 측정하였다.
1-9. 형광-활성화 세포분류(Fluorescence-activated cell sorter: FACS) 분석
OFD1 넉다운 24시간 후, 세포를 수확하고, Annexin V Alexa FluorTM 488 & Propidium Iodide(Thermo Scientific)가 포함된 Dead Cell Apoptosis Kit를 사용하여 제조사의 지시에 따라 표지하였다. 표지된 세포를 Cytomics™ FC500 Flow Cytometry(Beckman Coulter, Indianapolis, IN)로 분석하였다.
1-10. 세포 유착 분석
세포 유착 분석을 위하여, 24-웰 배양 플레이트를 30㎍/㎖ type IV 콜라겐, 라미닌(laminin) 및 피브로넥틴(fibronectin)(Corning Life Sciences, Bedford, MA)으로 코팅하였다. 팩실린 과발현의 부재 또는 존재하에서, 정상 또는 OFD1 넉다운 멜라닌 세포(2×104)를 플레이팅한 후, 37℃에서 30분 동안 코팅된 표면에 접착시켰다.
4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정시키고 Hoechst 33258로 핵을 염색한 후, 표준 광학 현미경(DM LB microscope; Leica Microsystems, Wetzla, Germany)을 사용하여 고정된 영역에서 염색된 세포의 수를 계수하였다.
1-11. 통계분석
실험 데이터의 통계 분석은 Student's t-test를 사용하여 수행하였다. 결과는 평균±표준 편차(SD)로 나타내었다. 0.05 미만의 P 값은 통계적으로 유의하다고 간주하였다.
실시예 2. 백반증 환자의 탈색 표피에서의 OFD1 발현 감소 확인
백반증 환자의 탈색 표피에서, OFD1의 발현이 감소되는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 1-1의 탈색 및 정상 색소 표피 표본에 대해 실시예 1-4 내지 1-7을 수행하였다.
그 결과, OFD1 mRNA(도 1) 및 단백질 수준의 상대적 비율(도 2)은 정상 색소 표피 대비, 탈색 표피에서 감소되어 있음을 확인하였으며(P <0.05), 공초점 현미경 이미지 사진에서도 OFD1의 발현이 탈색 표피에서 감소되어 있음을 확인하였다(도 3 및 도 4).
실시예 3. 케라틴 세포 및 멜라닌 세포의 섬모발생 및 세포 생존에 대한 OFD1의 연관성 확인
anti-OFD1, anti-c-KIT 및 anti-acetylated α-tubulin 항체를 사용한 면역형광(Immunofluorescence) 염색에 따르면, 정상 색소 표피에서 케라틴 세포(keratinocyte)와 c-KIT-양성 멜라닌 세포는 일차 섬모를 갖는다는 것을 확인할 수 있다. 또한, 실시예 2에서 확인한 바와 같이, 탈색 표피에서 OFD1의 발현은 하향 조절되어 있다. 케라틴 세포 및 멜라닌 세포의 섬모발생 및 세포 생존에 대한 OFD1의 연관성 확인하기 위하여, 실시예 1-2 및 1-3의 세포에 대하여 실시예 1-4, 1-5 및 1-7 내지 1-9를 수행하였다.
그 결과, 탈색 표피 세포는 대부분 케라틴 세포로 확인되었으나, OFD1 넉다운에 의하여, 일차 섬모를 갖는 멜라닌 세포의 숫자가 상대적으로 감소하였음을 확인하였다(P <0.05, 도 5 및 도 6). 1차 배양된 정상 또는 OFD1 넉다운 성인 인간 케라틴 세포 및 멜라닌 세포를 사용한 MTT 분석 결과, OFD1 넉다운에 의한 OFD1 mRNA 및 단백질의 상대적 수준의 감소에 의하여(도 7 및 도 8), 총 세포에 대한 생존 세포의 비율이 감소되었음을 확인하였다(도 9). 또한, FACS 분석 결과, 케라틴 세포 및 멜라닌 세포에서, annexin V-양성/propidium iodide(PI)-음성 및 이중-양성 비율이 OFD1 넉다운에 의해 증가하였으며(P <0.05, 도 10), OFD1 넉다운에 의해 케라틴 세포 및 멜라닌 세포의 세포 사멸율이 증가하였음을 확인하였다(P <0.05, 도 11). OFD1 넉다운에 의하여, BCL2와 인산화된 BCL2 관련 사망(pBAD) 단백질 수준의 상대적 비율은 감소되었으나, BAX 및 poly(ADP-ribose) polymerase(PARP) 단백질의 수준은 증가되었음을 확인하였다(도 12).
실시예 4. IFT88 또는 RPGRIP1L 넉다운 세포의 섬모발생 억제 확인
세포 사멸(apoptosis)에서 OFD1의 역할이 섬모발생과 관련이 있는지를 확인하기 위하여, 멜라닌 세포의 세포사멸 및 섬모발생에 대한 다른 섬모발생 유전자인 IFT88 및 RPGRIP1L의 효과를 실시예 1-7을 수행하여 조사하였다.
그 결과, IFT88(도 13A 및 도 14A) 또는 RPGRIP1L(도 13B 및 도 14B)의 넉다운에 의하여 일차 섬모를 갖는 멜라닌 세포의 상대적 수가 감소되었음을 확인하였다(P <0.05).
실시예 5. IFT88 또는 RPGRIP1L 넉다운 세포의 세포 생존력 확인
IFT88 또는 RPGRIP1L 넉다운 세포의 세포 생존력을 확인하기 위하여, 실시예 1-4, 1-5 및 1-8을 수행하였다.
그 결과, 총 세포에 대한 생존 세포의 상대적인 수는 IFT88 또는 RPGRIP1L의 넉다운에 의해 감소하지 않음을 확인하였다(도 15). 또한, BCL2, pBAD, BAX 및 PARP 단백질 수준의 상대적인 비율 역시, IFT88 또는 RPGRIP1L의 넉다운에 의해 변하지 않음을 확인하였다(도 16).
실시예 6. 세포-ECM 상호작용에 관여하는 단백질의 수준 변화 확인
OFD1의 넉다운(실시예 3)과는 달리 IFT88이나 RPGRIP1L의 넉다운(실시예 5)은 멜라닌 세포의 세포사멸을 증가시키지 않음을 확인하였다. Hedgehog 및/또는 Wnt 신호 경로는 일차 섬모와 관련된 주요 신호 경로로 알려져 있다(Haycraft et al., 2005; Thoma et al., 2007). ECM(extracellular matrix)과의 직접 상호 작용에서의 일차 섬모의 역할 또한 밝혀졌다(Lu et al., 2008; McGlashan et al., 2006). 인테그린을 통한 ECM에 대한 유착은 멜라닌 세포의 생존을 조절한다(Scott et al., 1995; Pinon and Wehrle-Haller, 2011). 따라서, OFD1, IFT88 또는 RPGRIP1L 넉다운을 갖는 배양된 멜라닌 세포에서, hedgehog 신호, Wnt 신호 및 세포-ECM 상호 작용에 관여하는 단백질 수준을 실시예 1-4 및 1-5를 수행하여 분석하였다.
그 결과, OFD1, IFT88 또는 RPGRIP1L 넉다운 멜라닌 세포에서, hedgehog 신호 단백질인 patched1(PTCH1), 신경아 교종 관련 암 유전자 동족체 1(GLI1) 및 Smoothened(Smo)의 상대적 수준은 감소하였으나(P <0.05; 도 17), WNT3A, GSK3β 및 β-카테닌과 같은 Wnt 신호 단백질은 변하지 않음을 확인하였다(P <0.05, 도 18).
한편, 팩실린, FAK(focal adhesion kinase) 및 인테그린 β1의 상대적인 수준은 OFD1의 넉다운으로 감소된 반면, IFT88 또는 RPGRIP1L의 넉다운에서는 감소하지 않음을 확인하였다(P <0.05; 도 19). 팩실린, FAK 및 인테그린 β1의 수준 역시, OFD1이 하향조절되는 탈색 표피에서 감소하였음을 확인하였다(P <0.05, 도 20).
실시예 7. OFD1 넉다운에 따른 ECM에 대한 멜라닌 세포의 유착 감소 확인
세포-ECM 상호 작용에 관여하는 단백질의 상대적 수준은 OFD1에 의해 변화되었으며, 단백질 수준의 변화 양상은 IFT88 또는 RPGRIP1L 넉다운과는 다름을 실시예 6에서 확인하였다.
따라서, ECM에 대한 멜라닌 세포의 유착에 대한 OFD1의 영향을 조사하기 위하여, 실시예 1-6, 1-7 및 1-10을 수행하였다.
그 결과, OFD1 넉다운에 의하여 type IV 콜라겐, 라미닌 또는 피브로넥틴에 대한 멜라닌 세포의 유착이 억제됨을 확인하였다(P <0.05, 도 21 및 도 22). 또한, OFD1의 넉다운에 의하여, 멜라닌 세포에서 결합 단백질의 상대적인 수준의 감소를 통하여, OFD1과 팩실린, 팩실린과 FAK 및 팩실린과 인테그린 β1 사이에 각각 결합이 존재한다는 것을 확인하였다(P <0.05, 도 23). OFD1 넉다운에 의한 ECM 성분에 대한 감소된 유착은 팩실린 과발현(P <0.05, 도 21 및 도 22)에 의해 유의적으로 회복되어 인테그린 β1 단백질의 상대적 수준이 회복됨을 확인하였다(P <0.05, 도 24).
이와 같은 결과를 통하여, 탈색 세포에서는 OFD1의 발현이 감소하며, OFD1의 감소에 의하여 케라틴 세포 및 멜라닌 세포에서, 일차 섬모의 손실, 세포 사멸, 팩실린을 통한 ECM에 대한 유착 감소가 나타나므로, OFD1 발현의 증가에 의하여 백반증이 예방 및 치료될 수 있으며, OFD1의 발현을 증가시키는 물질이 백반증 치료의 후보물질이 될 수 있음을 확인하였다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Screening Method of Skin Depigmentation Disorder Therapeutic Composition Using OFD1 <130> PN180277 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OFD1_forward <400> 1 gaatctgcag ggaacatgc 19 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> OFD1_reverse <400> 2 gcgtccacat gagacatatc c 21 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_forward <400> 3 tccactggcg tcttcacc 18 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH_reverse <400> 4 ggcagagatg atgacccttt 20

Claims (5)

  1. 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법에 있어서,
    분리된 케라틴 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계;
    상기 후보물질과 접촉된 케라틴 세포의 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1)의 발현수준을 측정하는 단계; 및
    상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 OFD1의 발현수준을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계
    를 포함하고,
    상기 피부 탈색 질환은 백반증(vitiligo)인 것인
    피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  2. 피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법에 있어서,
    분리된 케라틴 세포에 후보물질을 접촉시키는 단계;
    상기 후보물질과 접촉된 케라틴 세포에서 형성된 OFD1(oral-facial-digital syndrome type 1) 단백질을 정량분석하는 단계; 및
    상기 후보물질을 처리하지 않은 음성 대조군과 비교하여 상기 단백질의 형성을 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계
    를 포함하 고,
    상기 피부 탈색 질환은 백반증(vitiligo)인 것인
    피부 탈색 질환 치료용 조성물 스크리닝 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항 또는 제 2항에 있어서, 상기 세포는 OFD1 유전자가 넉다운(knock-down)된 세포인 것인 피부 탈색 질환 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
  5. 삭제
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