KR100788241B1 - 백반증의 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다: (a) 백반증의 표피세포를 분리하여 이를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 표피세포에 백반증 예방 또는 치료제 후보물질을 접촉시키는 단계; (c) 상기 후보물질 접촉된 세포에서 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계. 본 발명에 의하면 백반증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 대량/고속(highthroughput) 방식으로 스크리닝할 수 있다.

백반증, 각질형성세포, 스크리닝 방법, I-κB, NF-κB, Akt, IKK

Description

백반증의 예방 또는 치료물질을 스크리닝하는 방법{Method for Screening Materials for Preventing or Treating Vitiligo}

도 1은 탈색소침착된(depigmented) 표피 및 정상색소침착된 표피에서의 TNF-γ 발현을 보여주는 사진이다. 탈색소침착된 흡입-발포(suction-blistered) 표피(L)에서의 TNF-γ의 발현 수준이 정상색소침착된 흡입-물집 표피(N)에서의 TNF-γ의 발현 수준에 비해 현저하게 증가하였다(패널 A). 탈색소침착된 표피에서의 TNF-γ의 발현 수준이 정상색소침착된 표피에서와 비교하여 통계학적으로 유의하게(p = 0.005)높았다(패널 B).

도 2는 탈색소침착된 표피와 정상색소침착된 표피에서의 TNF-γ항체로 면역형광염색한 것을 보여주는 사진이다. 염색하지 않은 것(패널 A, E); Hoechst 33258로 핵을 염색한 것(파랑)(패널 B, F); 항-FasL 항체로 염색한 것(초록)(패널 C, G); 항-FasL 항체로 염색한 것(초록) 및 Hoechst 33258로 핵을 대비 염색한 것(파랑)이다(패널 D, H). 정상색소침착된 흡입-물집 표피 샘플인데, 세포들이 항-TNF-γ 항체로 약하게 염색되었다(패널 A-D). 탈색소침착된 흡입-물집 표피 샘플인데, 정상색소침착된 샘플과 비교하여 현저하게 많은 세포들이 항-TNF-γ 항체로 염색되었다(패널 E-H). 강한 TNF-γ-양성 세포들은 주로 하부층에서 발견되었다.

도 3은 탈색소침착 및 정상색소침착된 표피에서의 FasL 및 TRAF2의 발현을 보여주는 사진이다. 정상색소침착된 표피에서보다 탈색소침착된 표피에서 더욱 증가된 FasL 발현이 관찰되었다(패널 A). FasL 발현의 수준이 정상색소침착된 표피에서보다 탈색소침착된 표피에서 통계학적으로 유의하게(p = 0.022) 증가하였다(패널 B). TRAF2 발현수준은 탈색소침착된 표피와 정상색소침착된 표피 사이에서 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않은 것(p = 0.27)으로서, 유사한 수준이었다(패널 C, D).

도 4는 탈색소침착된 표피와 정상색소침착된 표피에서 FasL 항체로 면역형광염색한 것을 보여주는 사진이다. 염색없는 것(패널 A, E); Hoechst 33258로 핵을 염색한 것(파랑)(패널 B, F); 항-FasL 항체로 염색한 것(초록)(패널 C, G); 항-FasL 항체로 염색한 것(초록)과 Hoechst 33258로 핵을 대비염색한 것(파랑)이다(패널 D, H). 패널 A-D는 정상색소침착된 흡입-물집 표피 샘플들인데, 일부 세포들은 항-FasL 항체로 균일하고 약하게 염색되었다. 패널 E-H는 흡입-물집 탈색소침착된 표피 샘플들인데, 세포들, 특히 기저층에 위치한 세포들은 항-FasL 항체에 대해 강한 양성을 보였다.

도 5는 탈색소침착된 표피 및 정상색소침착된 표피에서의 I-κB 및 NF-κB의 인산화를 보여주는 사진이다. 정상색소침착된 표피에서보다 탈색소침착된 표피에서 I-κB의 인산화가 감소되었다(패널 A). I-κB 인산화의 수준은 탈색소침착된 표피에서 통계학적으로 유의하게(p = 0.013) 더 낮았다(패널 B). p-I-κB와 유사하게, NF-κB의 인산화는 통계적으로 유의하게(p = 0.028) 탈색소침착된 표피에서 감소하였다(패널 C 및 D).

도 6은 탈색소침착된 표피와 정상색소침착된 표피에서의 Akt의 인산화 및 PTEN의 발현을 보여주는 사진이다. Akt의 인산화가 탈색소침착된 표피에서 감소하였다(패널 A). Akt의 인산화된 수준이 탈색소침착된 표피에서 통계학적으로 유의하게(p = 0.021) 낮았다(패널 B). 정상색소침착된 표피에서보다 탈색소침착된 표피에서 PTEN의 발현이 더욱 증가하였다(패널 C). 한쌍의 표피 샘플사이에서의 수준은 통계학적으로 유의한 것을 보인다(p = 0.017)(패널 D).

도 7a 및 도 7b는 PI3K 억제자의 존재 또는 부존재에서 TNF-γ-처리 배양된 각질형성세포에서의 웨스턴 블롯 분석 및 TUNEL 분석에 관한 결과사진이다. 도 7a에서, NF-κB 및 Akt의 인산화를 Wortmannin의 존재 또는 부존재시에 TNF-γ-처리 후에 1시간 및 4시간에서 처리하지 않은 대조군(C)과 비교하여 검사하였다. Akt 및 NF-κB의 인산화는 TNF-γ의 처리에 의해 명확하게 증가하였다. 그러나, NF-κB 인산화는 PI3K 억제자에 의해 현저하게 억제되었고 Akt 인산화도 억제되었다. 도 7b에서, Wortmannin이 부존재하는 경우, 매우 적은 수의 세포들만이 TNF-γ 처리에 의해 TUNEL 양성을 나타내었다. 그러나, Akt 인산화가 Wortmannin에 의해 억제되는 경우에 TUNEL 양성 세포들이 현저하게 증가하였다(p = 0.043).

본 발명은 백반증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

백반증(vitiligo)에서의 탈색소침착(depigmentation)은 멜라닌 세포의 파괴에 의해 발생된다. 멜라닌 세포 파괴 메카니즘을 설명하는 여러 가지 가설이 있지만, 정확한 메카니즘은 아직 명확히 밝혀지지 않았다. 표피의 멜라닌 세포는 각질형성세포(keratinocytes)와 함께 기능적 및 구조적 단위를 형성하고, 각질형성세포에서의 구조적 비정상(Moellmann et al, 1982; Bhawan and Bhutani, 1983)은 백반증 환자에 있어서 기능적 변화와 관련되어 있다(Maresca et al, 1997).

사이토카인이 백반증의 탈색소 침착 과정에서 매우 중요한 인자라는 증거들이 증가하고 있다.(Gordon et al, 1989; Moretti et al, 2002). 전(前)손상, 비손상 및 건강한 피부와 비교한 실험결과, 백반증 피부에서는 멜라닌 세포에 대한 미토겐(mitogen)인 GM-CSF(granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM- CSF), b-FGF(basic-fibroblast growth factor), 줄기세포 인자(stem cell factor, SCF)의 발현이 매우 낮은 반면, 멜라닌 세포 성장의 잠재적 억제자인 TNF-α, IL-1-α 및 IL-6는 매우 높게 발현된다고 보고되어 있다(Moretti et al, 2002; Birol et al, 2006). TNF-α 및 FasL의 발현의 증가는 백반증 환부의 멜라닌 세포 뿐만 아니라 인접하는 각질형성세포의 아폽토시스(apoptosis)에도 영향을 미칠 수 있다.

본 발명자들은 이전의 연구에서 정상적으로 색소 침착된 흡입-물집 표피세포와 비교하여 탈색소침착된 표피세포에서 매우 높은 TUNEL-양성 각질형성세포가 발생됨을 보였다(Lee et al, 2004).

TNF-α는 염증(imflammation)의 중요한 개시제이다. 그러나, 이의 조절불량(dysregulation)은 독소 쇼크 증후군(toxic shock syndrome), 류머티즘성 관절염, 염증장병(inflammatory bowel disease), 건선(psoriasis) 등을 포함하는 매우 다양한 질병을 일으킨다(McDermott, 2001). TNF-α는 TNF-α 수용체 1 및 2(TNF-R1 및 TNF-R2)를 통해 작용한다. TNF-α에 결합한 TNF-R1은 TNF-R1 연관 데스 도메인 단백질(TNF-R1-associated death domain protein, TRADD)을 모은다(Tartaglia et al, 1993). TRADD는 두개의 수용체와 결합하여 반대 신호 전달을 일으킨다.

Fas-연관 단백질과 데스 도메인(FADD)이 상호작용하여 케스파제-8을 모으고, 케스파제 케스케이드의 활성화를 중재한다. 반면에, TNF-R1-결합된 인자 2(TNF-R1-associated factor 2, TRAF2)는 NF-κB를 활성화시킨다(Wallach et al, 1998; Hsu et al, 1996). TNF-α가 이의 수용체에 결합하면 세포내부의 일련의 반응을 유도하여 NF-κB, CEBR-β 및 AP-1을 포함하는 전사인자(transcription factors)들 을 활성화 시킨다(Baud and Karin, 2001; Chen and Goeddel, 2002). 상이한 세포 반응과정이 특정의 신호전달 경로에 의해 상이하게 조절되는 것처럼 보인다. 예를 들어, 표피세포에서 NF-κB 활성화는 TNF-α에 의해 유도되는 아폽토시스를 억제하고, 반면, AP-1 활성화는 방해하지 않는다(Natoli et al, 1998). TNF-α는 I-κB 키나아제(IKKs)를 활성화시키고, I-κB를 인산화시켜 이의 분해를 유도하여, NF-κB를 활성화시키게 된다. IKK-α를 녹아웃시키면 불충분한 표피세포 분화를 갖는 심각한 피부 표현형질을 일으키는데, 이는 NF-κB가 피부에서 매우 중요한 역할을 갖는다는 것을 암시하는 것이다(Takeda et al, 1999). NF-κB 유도 키나아제외에도, Akt(apoptosis signal-regulating kinase)는 IKK-α 인산화를 통해 NF-κB의 TNF-α 활성화에 필수적이다(Ozes et al, 1999).

Akt는 종양형성에서 뿐만아니라 세포 생리학의 모든 부분에서 중요한 역할을 하는 세린/트레오닌 키나아제이다(Datta et al, 1999; Testa and Bellacosa 2001). 이 키나아제는 세포 증식, 아폽토시스 및 물질대사의 조절에 관련된 다수의 세포 기질들을 인산화시킨다. NF-κB 신호를 위한 이 분자의 역할은 최근에 입증되었는데, 항-아폽토시스에서 필수적일 수 있다. 활성화된 Akt는 IKK-α를 인산화시키고, 이는 I-κB를 인산화시키고, 이에 의해 NF-κB로부터 I-κB가 이탈하게 하여, 세포의 생존를 촉진한다(Bauerle and Baltimore 1996). 그러나, Akt에 의한 NF-κB의 활성화의 메카니즘은 분석되는 세포 타입에 의존적이어서 명확하지 않다(Gustin et al, 2001; Kane et al, 1999).

포스파티딜이노시톨 3-키나아제(PI3K) 기능을 억제하는 PTEN(염색체 10으로 부터 결손된 포스파타아제 및 tensin 동족체)은 IKK 활성에 대해 영향을 미치지 않고 NF-κB 활성화를 감소시키지만(Pianetti et al, 2001), PTEN은 Akt에 의한 TNF-α 활성화를 손상시켜서, IKK 및 NF-κB 활성화를 억제한다(Gustin et al, 2001). I-κB의 인산화에 의해 NF-κB가 핵내부로 이동하고, 세포 사멸로부터 세포를 보호하는 다수의 타겟 유전자들의 발현을 촉진한다(May and Ghosh, 1998). 백반증의 각질형성세포의 아폽토시스는 외인성 사멸 수용체 매개 경로(extrinsic death receptor-mediated pathway)를 통해서 유도될 수 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 백반증 표피세포에서 사이토카인이 아폽토시스를 어떠한 방식으로 유도하는지에 관한 메카니즘을 규명하기 위해, 탈색소침착된 표피세포와 정상적으로 색소침착된 표피세포 사이에서 사이토카인의 발현 및 신호전달 물질들의 인산화 정도를 비교한 결과 특정 사이토카인의 발현이 증가하고 신호전달물질의 인산화가 감소한다는 것을 확인하였는데, 이러한 결과가 백반증을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 스크리닝하는데 이용될 수 있음을 발견함으로써, 본 발명을 완성하였 다.

따라서, 본 발명의 목적은 백반증을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (a) 백반증의 표피세포를 분리하여 이를 배양하는 단계; (b) 상기 배양된 표피세포에 백반증 예방 또는 치료 후보물질을 접촉시키는 단계; (c) 상기 후보물질 접촉된 세포에서 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 측정하는 단계; 및 (d) 상기 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 증가시키는 후보 물질을 선별하는 단계.

본 발명자들은 백반증의 표피세포에서 사이토카인이 아폽토시스를 어떠한 방식으로 유도하는지에 관한 메카니즘을 규명하기 위해, 탈색소침착된 표피세포(백반증의 표피세포)와 정상적으로 색소침착된 표피세포 사이에서 사이토카인 TNF-α의 발현 및 신호전달 물질 I-κB, NF-κB, Akt, 및 IKK의 인산화의 정도를 비교한 결과, 백반증의 표피세포에서 TNF-α의 발현이 증가하고 I-κB, NF-κB, Akt 및 IKK 의 인산화가 감소한다는 것을 확인하였는데, 이러한 결과를 이용하면 백반증을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 개발할 수 있음을 발견하였다.

보다 상세하게는, 백반증의 표피세포에서는 TNF-α 및 PTEN의 발현이 증가하는 반면, 하부 신호전달물질인 I-κB, NF-κB, Akt 및 IKK의 인산화가 감소하는 것을 확인하였는데, 이러한 메카니즘에 의해 백반증의 표피세포의 아폽토시스에 대한 민감성이 증가하는 것으로 판단된다.

따라서, 본 발명은 백반증의 표피세포에서 상기 신호전달물질인 I-κB, NF-κB, Akt 및 IKK의 인산화를 증가시킬 수 있는 물질이 백반증의 치료 또는 예방에 사용될 수 있음을 인지한 것에 기초한다.

본 발명의 백반증의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법에 따르면, 우선 단계 (a)에서, 백반증의 표피세포를 분리하여 이를 배양한다.

이 단계에서 이용될 수 있는 세포는 동물세포, 바람직하게는 포유동물 세포, 보다 바람직하게는 인간 세포, 가장 바람직하게는 인간의 각질형성세포이다. 상기 세포로서, 다양한 형태의 세포가 이용될 수 있다. 예를 들어, 즉시 분리된 세포, 초기 배양(primary culture)된 세포 또는 암세포화된 세포주를 이용할 수 있다. 바람직하게는, 초기 배양된 세포, 예컨대, 초기 배양된 인간 표피의 각질형성 세포가 이용된다.

상기 배양된 표피세포에 백반증 예방 또는 치료제 후보물질을 접촉시키는 방법은 세포 배양액에 후보물질을 첨가하여 적합한 온도에서 항온배양(incubation)하여 실시할 수 있다.

이 단계에서 세포에 접촉시킬 수 있는 후보물질은, 저분자량 화합물, 고분자량 화합물, 핵산분자(예컨대, DNA, RNA, PNA 및 앱타머), 단백질, 당 및 지질 등을 포함한다.

이어서, 후보물질 접촉된 세포에서 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 측정하여, 상기 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 증가시키는 물질을 선별한다. 즉, 상기 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 증가시키는 물질이 본 발명이 타겟으로 하는 백반증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질이다.

I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화의 정도를 측정하는 것은 다음에 기술되는 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 방법에 따라 수행할 수 있다.

상기 면역분석 또는 면역염색 포맷은 방사능면역분석, 방사능면역침전, 면역침전, 웨스턴 블롯팅, ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay), 캡처-ELISA, 억제 또는 경쟁 분석, 샌드위치 분석, 유세포 분석(flow cytometry), 면역형광염색 및 면역친화성 정제를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 면역분석 또는 면역염색의 방법은 Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; Gaastra, W., Enzyme - linked immunosorbent assay ( ELISA ), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984; 및 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies:A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있으며, 상기 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

예를 들어, 본 발명에서 이용되는 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체를 인산화된 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 단백질의 양을 측정하는데 이용할 수 있다.

본 발명에서, 상기 인산화의 분석을 웨스턴 블롯팅 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (ⅰ) 세포 시료를 용해하는 단계; (ⅱ) 용해된 세포로부터 단백질을 수득하는 단계; (ⅲ) 수득된 단백질을 변성시키는 단계; (ⅳ) 변성된 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)하는 단계; (ⅴ) SDS-PAGE가 완료된 겔 상의 변성 단백질을 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅵ) NC 멤브레인상의 단백질과 일차 항체인 인산화된 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 단백질에 대한 항체를 반응시키는 단계; (ⅶ) 발색반응을 촉매하는 효소가 결합된 일차 항체와의 결합능을 갖는 이차 항체를 상기 일차 항체와 반응시키는 단계; (ⅷ) 이차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (ⅸ) 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 이용되는 방법이 ELISA 방식으로 실시되는 경우, 본 발명의 특정 실시예는 (i) 분석하고자 하는 세포 용해물을 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 일차항체로서 인산화된 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 단백질에 대한 항체와 상기 세포 용해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 효소가 결합된 이차항체와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 효소의 활성을 측정하는 단계를 포함한다. 상기 고체 기질로 적합한 것은 탄화수소 폴리머(예컨대, 폴리스틸 렌 및 폴리프로필렌), 유리, 금속 또는 젤이며, 가장 바람직하게는 마이크로타이터 플레이트이다.

상기 이차항체에 결합된 효소는 발색반응, 형광반응, 발광반응 또는 적외선 반응을 촉매하는 효소를 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 예를 들어, 알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제, 루시퍼라아제 및 사이토크롬 P₄₅₀을 포함한다. 상기 이차항체에 결합하는 효소로서 알칼린 포스파타아제가 이용되는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트(naphthol-AS-B1-phosphate) 및 ECF(enhanced chemifluorescence)와 같은 발색반응 기질이 이용되고, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제가 이용되는 경우에는 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, D-루시페린, 루시게닌(비스-N-메틸아크리디늄 니트레이트), 레소루핀 벤질 에테르, 루미놀, 암플렉스 레드 시약(10-아세틸-3,7-디하이드록시페녹사진),TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine), ABTS(2,2‘-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 및 o-페닐렌디아민(OPD)과 같은 기질이 이용될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 분석방법이 캡처-ELISA 방식으로 실시되는 경우, (i) 포획항체(capturing antibody)로서 인산화된 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 단백질에 대한 항체를 고체 기질의 표면에 코팅하는 단계; (ⅱ) 포획항체와 세포 용해물을 반응시키는 단계; (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)의 결과물을 시그널을 발생시키는 레이 블이 결합되어 있고, 인산화된 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 단백질에 특이적으로 반응하는 검출항체(detecting antibody)와 반응시키는 단계; 및 (ⅳ) 상기 레이블로부터 발생하는 시그널을 측정하는 단계를 포함한다.

상기 검출 항체는 검출 가능한 시그널을 발생시키는 레이블을 가지고 있다. 상기 레이블은 화학물질(예컨대, 바이오틴), 효소(알칼린 포스파타아제, β-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 퍼옥시다아제 및 사이토크롬 P₄₅₀), 방사능물질((예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵), 형광물질(예컨대, 플루오레신), 발광물질, 화학발광물질( chemiluminescent) 및 FRET(fluorescence resonance energy transfer)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 다양한 레이블 및 레이블링 방법은 Ed Harlow and David Lane, Using Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999에 기재되어 있다.

상기 ELISA 방법 및 캡처-ELISA 방법에서 최종적인 효소의 활성 측정 또는 시그널의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법에 따라 실시될 수 있다. 이러한 시그널이 검출은 세포 용해물에서 인산화된 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 단백질이 존재한다는 것을 가리키는 것이다. 만일, 레이블로서 바이오틴이 이용된 경우에는 스트렙타비딘으로, 루시퍼라아제가 이용된 경우에는 루시페린으로 시그널을 용이하게 검출할 수 있다.

한편, 본 발명의 스크리닝 방법에서 이용되는 항체는, 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있으며, 상기 문헌들은 본 명세서에 참조로서 삽입된다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 백반증의 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법에서 사용되는 표피세포는 각질형성세포이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(ⅰ) 본 발명은 신호전달 분자인 I-κB, NF-κB, Akt, 및 IKK의 인산화 정도를 비교하여 백반증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 스크리닝 한다.

(ⅱ) 본 발명의 방법에 따르면, 백반증을 예방 또는 치료할 수 있는 물질을 대량/고속(highthroughput) 방식으로 스크리닝 할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

환자

백반증으로 진단된 11 내지 54세(평균 28세)의 남자 5명 및 여자 5명 총 10명의 환자를 대상으로 본 발명의 연구를 행하였다. 켰다. 4명은 분절적(segmental)백반증, 5명은 전신적 백반증, 1명은 국소적 백반증이었다. 동의서를 받은 후에, 흡입-물집 처리를 이용하여 각 환자들로부터 표피 샘플을 얻었다.

직접적 비교를 위해 정상적으로 색소침착된 표피 및 탈색소침착된 표피를 하나의 쌍으로 하여 샘플을 채취하였다. 모든 환자들은 샘플링 시점에서 안정된 환부를 가지고 있었다. 태양-노출된 부위에서 발생되는 분절형의 2개의 샘플 및 전신형 및 국소형의 1개의 샘플로 하면서 탈색소침착된 환부 위치를 변화시켰다. 대조군 피부는 하부 복부에서 채취하였다. 흡입-물집을 생성시키기 위해서 정상 색 소침착된 피부와 탈색소침착된 피부에 200-250 mmHg의 음압(negative pressure)를 가하였다. 흡입-물집처리된 부위의 꼭지부분을 웨스턴 블롯팅 및 면역 조직 화학에 사용하였다.

정상 인간 표피 각질형성세포 배양

피부 샘플은 반복된 제왕절개수술부위 및 커플절제수술부위로부터 얻은 후, 이를 배양에 사용하였다. 2.4 U/㎖의 디스파아제(#295 825; Roche, Mannheim, Germany)로 1시간 동안 처리한 후에, 진피로부터 표피를 분리하였다. 각각의 표피 세포의 현탁액을 얻기 위해 표피 시트를 0.05% 트립신으로 10분간 처리하였다. 세포들을 소 뇌하수체 추출물(BPE), 소 인슐린, 히드로코르티손(hydrocortisone), 인간 성장 호르몬, 및 소 트랜스페린(#S-001-5; Cascade Biologics, Portland, OR)을 첨가한 EpiLife 배지(#M-EPI-500-CA; Cascade Biologics, Portland, OR)에 현탁하였다. 세포들이 컨플루언스(confluence)에 도달했을 때, 이들을 플라스크로부터 분리하여 다른 배양 플라스크로 시도하였다.

계대수 3 또는 4로부터 얻은 각질형성세포를 실험에 사용하였다. 첨가제 첨가된 EpiLife 배지를 TNF-α 또는 FasL로 처리하기전에 24시간 동안 첨가제 없는 배지로 만들었다. 이어서, 세포들을 100 ng/㎖의 인간 재조합 TNF-α(G524a ; Promega, Madison, WI) 또는 200 ng/㎖의 FasL (ab2441; Abcam, Cambridge, UK)로 1, 4, 24, 및 48 시간 동안 처리하였다. 5개의 세포주를 검사하였다. 억제 실험에서는, 100 nM의 Wortmannin (Calbiochem, La Jolla, CA)과 같은 PI3K 억제자를 포함하는 EpiLife 배지에서 TNF-α를 처리하기 전에 60분간 배양하였다.

웨스턴 블롯팅 분석

본 발명자들의 이전의 연구(Lee et al, 2004)에 기술된 방법에 따라 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 간략하게 설명하면, 탈색소침착된 표피 및 정상색소침착된 표피 및 배양된 세포를 50 mM Tris-염기 (pH 7.5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% 글리세롤, 10 mM NaF, 10 mM Na-파이로포스페이트, 및 단백질 저해제(0.1 mM 페닐메틸술포닐플루오라이드, 5 μg/㎖ 아프로티닌, 및 5 μg/㎖ 류펩틴)을 포함하는 아이스-콜드 균질화 버퍼에서 균질화시켰다. 추출한 단백질의 동일한 양(30 μg)을 8-12.5% SDS-PAGE을 사용하여 분리하고 니트로셀룰로오스막으로 옮겼다. 막을 Tris-버퍼 염수(TTBS; pH 7.6)에서 5% 비지방 분유를 사용하여 블록시킨후에, 항-인간 TNF-α (래빗 폴리클로날; Santa Cruz, CA), FasL (래빗 폴리클로날; Santa Cruz, CA), TRAF2 (래빗 폴리클로날; Santa Cruz, CA), phospho-I-κB-α, I-κB-α, phospho-NF-κB, NF-κB, phospho-Akt, Akt, 및 PTEN (래빗 폴리클로날; Cell Signaling Technology, Beverly, MA) 항체를 블로킹 용액에 1:1,000로 희석시켜 4 °C에서 밤샘 반응시켰다. 막을 항-래빗 또는 항-마우스 호오스 래디쉬 퍼옥시다아제-콘쥬게이트된 항체(Jackson Laboratories, West Grove, PA)로 추가 인큐베이트 하였다. 증강된 케미-일루미네슨스 용액(ECL kit; Amersham Life Science, Buckinghamshire, England)으로 막을 처리하고, 신호를 이미지 리더(LAS-3000; Fuji Photo Film, Tokyo, Japan)로 캡쳐하였다. 각각의 레인에 로딩되는 단백질의 양을 모니터링 하기 위해, 막을 박리 버퍼(stripping buffer)로 처리하고 β-액틴(Sigma, St. Louis, MO)에 대한 모노클로날 항체로 다시 프로브하였다. 단백질 밴드들을 밀도계(densitometry)로 분석하였다.

면역조직화학

TNF-α 및 FasL의 면역형광 염색을 위해, 고정된 탈색소침착 및 정상적으로 색소침착된 표피를 파라핀에 묻고 5 μm의 섹션으로 절단하였다. 또한, 생검한 샘플을 5 μm의 섹션으로 절단하였다. 섹션들을 파라핀을 제거하고 재수화시킨 후에, 핫 플레이트상에서 시트르산 용액(100 mM 시트레이트, pH 6.0)중에서 끓였다. 섹션들을 3%의 우혈청 알부민으로 실온에서 1시간 동안 전(前)인큐베이션 하고, 이어서, 연속적으로 1:100 항-TNF-α (래빗 폴리클로날; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 또는 FasL (래빗 폴리클로날; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 항체로 실온에서 1시간동안 반응시키고, 알렉사 플로어 고우트(Alexa fluor goat) 항- 래빗 IgG (488; Molecular probe, Eugene, Oregon)로 실온에서 1시간동안 반응시켰다. 섹션들을 항-K10 항체(마우스 모노클로날; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) 및 알렉사 플로어 고우트 항-마우스 IgG (594; Molecular probe, Eugene, OR)로 이중 염색하였다. 핵들을 Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO)로 대비염색하였다. 염색된 샘플을 이미지 분석 시스템(Dp Manager 2.1; Olympus Optical Co., Japan)을 이용하여 관찰하였다.

TUNEL

TUNEL 분석법은 아폽토틱 신호 케스케이드로부터 발생되는 DNA 프레그멘테이션(DNA fragmentation)을 검출하는 방법이다. 이 분석법은 DNA상의 닉(nick)이 존재하는 것에 의존하는데, 터미널 트랜스퍼라아제가 DNA상의 닉을 인지하여 2차 마커로 표지되는 dUTPs를 DNA상에 삽입하게 된다. 상기 분석법에 면역세포조직화학 또는 유세포분석과 조합하게 되면, 아폽토시시의 최종단계에 있는 세포들을 반복적으로 라벨링할 수 있다(Gavrieli Y, Sherman Y, Ben-Sasson SA. J Cell Biol. 1992 Nov;119(3):493-501.; Grasl-Kraupp B, Ruttkay-Nedecky B, Koudelka H, Bukowska K, Bursch W, Schulte-Hermann R. Hepatology. 1995 May;21(5):1465-8.; Negoescu A, Lorimier P, Labat-Moleur F, Drouet C, Robert C, Guillermet C, Brambilla C, Brambilla E. J Histochem Cytochem. 1996 Sep;44(9):959-68.; Negoescu A, Guillermet C, Lorimier P, Brambilla E, Labat-Moleur F. Biomed Pharmacother. 1998;52(6):252-8.)

TNF-α-처리된 배양 각질형성세포에서의 아폽토시스 세포를 TUNEL 분석(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUTP-digoxigenin nick end-labeling)키트(In situ cell death detection kit, Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 평가하였다. Wortmannin의 존재 또는 부존재하에서의 세포를 4% 파라포름알데히드내에서 고정한 후, 키트의 TUNEL 반응 혼합액내에서 37℃에서 1시간 동안 인큐베이트 하였다. 증류수로 세정한 후, 핵들을 Hoechst 33258 (Sigma, St. Louis, MO)로 대비 염색한 후에 형광현미경으로 관찰하였다.

아폽토시스의 정량적 분석을 위해서, 4개의 무작위 부분에 대해 사진을 찍고, 아폽토시스 세포 및 전체 세포를 카운팅하였다. 아폽토시스 세포의 수를 1000개의 전체 세포군에서의 수로서 표현하였다.

통계 분석

관련된 샘플에 대해 Wilcoxon signed ranks test를 이용하여, 탈색소침착된 샘플과 정상색소침착된 샘플사이에서의 차이점을 비교하였다. 0.05미만의 p값을 통계학적으로 유의한 값으로 간주하였다. 모든 결과들을 동일한 조건의 실험들로부터의 조합된 데이터의 평균± SD으로서 제시하였다.

실험결과

탈색소침착된 표피에서 TNF -α 및 FasL 의 고도 발현

백반증 환자의 환부 피부에서 TNF-α 수준이 증가한다고 보고되어 있다(Moretti et al, 2002; Birol et al, 2006). 탈색소침착된 표피에서 TNF-α의 고도의 발현을 확인하기 위해, 10명의 백반증 환자로부터 표피를 얻고 면역 블롯팅 분석을 행하였다. 탈색소침착된 표피(L)에서의 TNF-α발현의 수준이 정상색소침착된 표피(N)에서의 것과 비교하여 훨씬 높았는데(도 1의 패널 A), 이러한 결과는 통계학적으로 유효한(p = 0.005) 차이를 보이면서 모든 10개의 표본에서 검출되었다(도 1의 패널 B).

각질형성세포가 TNF-α를 생성하는지와 TNF-α 양성 세포의 부위가 어느 부위인지를 확인하기 위해서, 탈색소침착된 표피 샘플내에서 TNF-α의 면역세포화학적 염색 분석을 수행하였다. TNF-α-양성 세포들은 일반적으로 케라틴 10으로 이중염색되었는데(데이타 제시하지 않음), 이것은 TNF-α를 발현하는 세포들이 각질형성세포라는 것을 의미하는 것이다. 탈색소침착된 표피에서의 염색의 강도(도 2의 패널 E-H)는 정상색소침착된 것(도 2의 패널 A-D)과 비교하여 현저하게 강하였다. 강한 TNF-α-양성 세포는 주로 하부 층에서 발견되었다(도 2의 패널 G).

본 발명자들은 또 다른 사이토카인으로서, FasL이 백반증 환자의 환부 및 비환부 피부에서 어떠한 발현 형태를 보이는지 검사하였다. FasL의 발현은 정상색소침착된 표피 뿐만아니라 탈색소침착된 표피에서도 명확하게 관찰되었다(도 3의 패널 A). 발현의 수준은 정상색소침착된 표피(N)에서 보다도 탈색소침착된 표피(L)에서 더욱 높게 나타났는데, 이는 통계학적으로 유의한 것(p = 0.022)이었다(도 3의 패널 B).

면역세포화학 염색 분석법에 의하면, 정상색소침착된 표피(도 4의 패널 A -D)에서와 비교하여 탈색소침착된 표피(도 4의 패널 E-H)에서 FasL 단백질이 현저하게 더욱 강한 강도를 나타내는 것을 볼 수 있다.

FasL 이외에도, TRADD가 TRAF2 수용체와 결합하는데, 이는 NF-κB를 활성화시키고, TNF-α 고도 발현의 결과는 어느 경로가 유도되는지에 의존한다(Wallach et al, 1998; Hsu et al, 1996). 따라서, TRAF2의 발현수준을 검사하였다. TRAF2 는 양쪽의 쌍의 샘플에서 발현되었다(도 3의 패널 C). 그러나, 발현의 수준은 탈색소침착된 표피와 색소침착된 표피사이에서 크게 다르지 않았다(p = 0.27) (도 3의 패널 D).

탈색소침착된 표피에서의 NF -κB, I-κB 및 IKK 의 인산화의 감소

TNF-α및 FasL의 하부 신호분자를 찾기 위해, NFkB, I-κB 및 IKK의 활성을 탈색소 침착된 표피에서 항-인산화된 항체를 이용하여 검사하였다. 탈색소침착된 표피 샘플에서 I-κB의 인산화가 감소하였는데(도 5의 패널 A), 이는 통계적으로 유의한(p = 0.013)차이를 나타내는 것이다(도 5의 패널 B). NF-κB의 인산화는 I-κB의 인산화와 비슷한 형태를 나타내었는데(도 5의 패널 C), 이는 탈색소침착된 표피에서 통계적으로 유의한(p = 0.028)감소이다(도 5의 패널 D). IKK의 인산화는 탈색소침착된 표피에서 감소하였지만, 이는 오직 5개의 샘플에서만 행해진 것이다(데이타 제시하지 않음). 이러한 결과들은 TNF-α의 발현수준이 증가하였지만 탈색소침착된 표피에서 NF-κB 활성화가 손상될 수 있다는 것을 암시한다.

탈색소침착된 표피에서의 증가된 PTEN 및 손상된 Akt 활성화

손상된 NF-κB 활성화을 설명하기 위해서, 탈색소침착된 표피 및 정상색소침착된 표피에서 Akt 인산화 수준을 검사하였다. Akt 인산화는 탈색소침착된 표피에서 통계적으로 유의(p = 0.021)하게 감소한 반면(도 6의 패널 A 및 B), PTEN의 발현 수준은 정상 색소침착된 표피에서보다 탈색소침착된 표피에서 통계적으로 유 의(p = 0.017)하게 높았다(도 6의 패널 C 및 D).

상기 데이터들은 탈색소침착된 표피에서 TNF-α에 의한 손상된 NF-κB 활성화가 증가된 PTEN을 통한 Akt의 불활성화에 기인한 것일 수도 있다는 것을 암시한다.

PI3K 억제자인 Wortmannin 의 TNF -α-처리 배양된 각질형성세포에 대한 효과

배양된 정상 인간 각질형성세포에서 TNF-α로 처리하면 Akt 및 NF-κB의 인산화를 증가시켰다(도 7a). 그러나, PI3K 억제자인 Wortmannin으로 Akt 인산화를 억제하면, NF-κB의 인산화를 현저하게 감소시켰다(도 7a).

TNF-α-처리된 각질형성세포에서 PI3K/Akt 활성화를 억제하는 것에 의해 NF-κB 인산화가 덜 발생한다는 것은 TUNEL 분석법에 의해 명확하게 나타났는데, Wortmannin으로 처리한 경우 TUNEL 양성 각질형성세포가 Wortmannin 처리 없는 것과 비교하여 통계적으로 유의하게(p = 0.043) 나타났다(도 7b). 이는 TNF-α처리하여 배양한 각질형성세포에서 PI3K/Akt-매개 NF-κB 활성화를 억제하면 아폽토시스가 유도된다는 것을 의미하는 것으로 판단된다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 백반증을 치료 또는 예방할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면 백반증의 예방 또는 치료제를 대량/고속(highthroughput) 방식으로 스크리닝 할 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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Claims (2)

1. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예방 또는 치료 물질을 스크리닝하는 방법:

   (a) 백반증의 표피세포를 분리하여 이를 배양하는 단계;

   (b) 상기 배양된 표피세포에 백반증 예방 또는 치료제 후보물질을 접촉시키는 단계;

   (c) 상기 후보물질 접촉된 세포에서 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 측정하는 단계; 및

   (d) 상기 I-κB, NF-κB, Akt 또는 IKK의 인산화를 증가시키는 후보물질을 선별하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 백반증의 표피세포는 각질형성세포인 것을 특징으로 하는 백반증의 예방 또는 치료제를 스크리닝하는 방법.

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