KR20050076690A - 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성을스크리닝하는 방법 및 백반증의 예후 판정방법 - Google Patents

백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성을스크리닝하는 방법 및 백반증의 예후 판정방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자, 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자 및 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자를 이용한 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법 및 키트, 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하는 방법 및 키트, 그리고 백반증의 예후 판정방법 및 예후 판정용 키트에 관한 것이다.

Description

백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법 및 백반증의 예후 판정방법{Method for Screening Responsiveness to Drugs Effective in Treatment or Prevention of Vitiligo and Method for Prognosis of Vitiligo}
본 발명은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법 및 키트, 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하는 방법 및 키트, 그리고 백반증의 예후 판정 방법 및 예후 판정용 키트에 관한 것이다.
레티노이드는 세포 분화 및 증식에 영향을 미친다. 레티노이드는 비타민 A의 대사 또는 합성 유도체이고, 비타민 A의 활성은 3종의 주 화합물, 레티놀, 레티닐 알데하이드 및 레티노산 (RA)에 의해 달성된다. 코르티코스테로이드-유도 피부 위축 (1-3)을 억제하기 위하여 국부적으로 코르티코스테로이드 및 올-트랜스-레티노산 (all-trans-retinoic acid, 트레티노인: ATRA)을 병용투여하면, 일반적인 백반의 유형으로 고통을 받는 특정 환자에서 매우 신속한 재색소화를 나타낸다. ATRA가 특정 환자에서 보다 우수한 효과를 나타내는 이유와, RA의 효과가 불일치를 나타내는 이유는 명확하지 않다.
각질세포 및 섬유아세포에 대한 RA의 효과는 연구되었으나, RA의 정상적인 인간 멜라닌세포에 대한 효과에 대한 연구는 거의 없다 (4). 정상적인 인간 멜라닌세포의 내재적인 (constitutive) 멜라닌 생성에 대한 RA의 역할은 모순되는 측면이 있다: RA는 멜라닌 생성에 영향을 미치지 않고 (5, 6), 멜라닌 생성을 억제하며 (7, 8) 또는 색소화를 증가시킨다 (9). 증가된 색소화를 나타내는 결과들은 마이크로피그 또는 마우스에서 얻어진 것이지만, 유사한 결과가 인간에서도 확인되었다 (9). RA 치료에 대한 반응성의 변이는, 멜라닌세포에 대한 RA의 작용을 규정하기 위하여 상이한 소스의 배양물로부터 다량의 샘플링을 요구한다 (7). 또한, 멜라닌세포 수에 대한 RA의 발표된 효과는 모순되는 경향이 있다. RA는 혈청-결여 배지에서 성장하는 정상적인 인간 멜라닌세포의 증식을 억제하지만 (5), RA는 내재적인 마우스 멜라닌세포 및 자외선 B-활성화 마우스 멜라닌세포의 수를 증가시킨다 (9).
멜라닌 생성에 대한 RA의 효과는 직접적일 수도 있고 (5, 7), 또는 멜라닌세포, 각질세포와 섬유아세포 사이의 세포-세포 상호작용에 의할 수도 있다 (6, 8). 각질세포에 대한 RA의 영향은 비교적 일치되어 있다. ATRA 및/또는 9-시스는 침수 배양 시스템에서 배양된 정상적인 인간 각질세포의 증식을 야기한다 (10). 레티노이드가 각질세포 증식을 조절하는 정확한 분자기전은 규명되어 있지 않지만, 성장인자의 EGF 군의 한 멤버인 헤파린-결합 EGF-유사 성장인자 (HB-EGF)가, 최소한 부분적으로 RA-유도 각질세포 증식 및 표피 과당형성을 중재하는 것으로 알려져 있다 (11).
본 발명자들은 백반증의 약물에 대한 반응성 (responsiveness)에 대한 표지 역할을 할 수 있는 생물학적 물질을 찾고자 예의 연구 노력한 결과, 3종의 유전자가 반응성에 따라 분별적으로 발현됨을 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 백반증의 치료에 이용되는 올-트랜스-레티노산 (ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성을 스크리닝하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성에 대한 생물학적 표지를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 백반증의 예후 판정(prognosis) 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 백반증의 예후 판정용 키트를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (a) 상기 약물에 의해 처치된 상기 피부 질환 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 총 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (c) (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머 세트와 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR하는 단계; (d) 상기 PCR 생성물을 전기영동하여 PCR 생성물의 밴드를 얻는 단계; 및 (e) 상기 전기영동 밴드 패턴이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 패턴을 나타내는 경우에는 상기 약물에 반응성이 있는 것으로 판정하는 단계.
본 발명자들은 eIF4A1, L13 및 MRT가 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 인체 반응성 (responsiveness)과 밀접한 상관관계가 있음을 발견하였다.
상기 단백질 중, eIF4A1에 대한 생물학적 기능은 잘 규명되어 있으나, L13과 MRT는 미지의 단백질이며, 다만 L13은 60S 라이보좀 서브유니트 단백질로서 mRNA 트랜스레이션의 연장 단계에 관여하는 것으로 알려져 있다 (12). eIF4A는 43S 전개시 복합체에 대한 mRNA의 결합에 관여하는 트랜스레이션 인자 중 하나이다 (13, 14). mRNA 트랜스레이션은 유전자 발현에서 주요한 조절점이다. 모든 진핵세포의 세포질 mRNA의 5'-말단에 있는 캡 구조에 대한 결합은 mRNA 트랜스레이션에서 주요한 조절 단계이다. eIF4A는 헤테로트리머 트랜스레이션 개시인자, eIF4F의 하나의 서브유니트로서 (15-17), 캡과 결합하는 단백질 중 하나이다 (13). eIF4A는 ATP-의존성 RNA 헬리카아제 활성을 갖고 있어서, mRNAs의 2차 구조를 풀어서 트랜스레이션을 촉진한다 (18, 19). eIF4A는 다른 캡-결합 단백질보다 풍부하게 존재하며, eIF4F 복합체의 일부분 및 유리 eIF4A로서 존재한다. eIF4F 복합체의 다른 성분들과는 상이하게, eIF4A 활성은 포유동물 세포에서 인산화에 의해 조절되지 않으며 (20), 주로 mRNA 양을 조절함으로써 조절된다 (21, 22). eIF4A는 두 개의 유전자 eIF4A1 및 IF4A2에 의해 암호화된다. eIF4A1 mRNA는 성장 세포에서 합성되고 가장 효율적으로 트랜스레이션되는 반면, eIF4A2 mRNA 합성 및 트랜스레이션은 성장-정지 상태와 선호적으로 관련되어 있다 (23).
이와 같은 생물학적 기능을 갖는 eIF4A1, L13 및 MRT는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 인체 반응성 (responsiveness)과 밀접한 상관관계가 있다.
본 발명은 백반증에 적용된다.
본 발명에 의해 검사되는 반응성은 코르티코스테로이드의 투여를 요구하는 피부 질환의 치료 또는 예방에 이용되는 약물이며, 바람직하게는 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 비타민 C, 트리클로로아세트산 및 칼시포트리올 (calcipotriol)로 구성된 군으로부터 선택된다. 가장 바람직하게는, ATRA이다.
본 발명의 방법에서, 총 RNA를 분리하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다 (참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol. Biol. Rep., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162:156(1987)). 예컨대, Trizol을 이용하여 용이하게 세포내의 총 RNA를 분리할 수 있다.
본 발명의 두 번째 단계는, 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계이다. 본 발명의 총 RNA는 인간의 표피 세포로부터 분리되는 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다 (참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).
본 발명의 PCR 단계에서 사용되는 프라이머 세트는 eIF4A1 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, L13 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, MRT 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 또는 이들 프라이머 세트의 조합이다. 가장 바람직하게는, 반응성과 가장 상관관계가 큰 eIF4A1 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트이다.
본 명세서에서 용어 "프라이머"는 적합한 온도에서 적합한 완충액 내에서 적합한 조건 (즉, 4종의 다른 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 중합반응 효소) 하에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오타이드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 다양한 인자, 예컨대, 온도와 프라이머의 용도에 따라 변이가 있지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 하이브리드 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다.
프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 갖을 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 갖으면 충분하다. 따라서, 본 발명에서의 프라이머 세트는 주형인 eIF4A1 유전자, L13 유전자 또는 MRT 유전자에 완벽하게 상보적인 서열을 갖을 필요는 없으며, 이들 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 갖으면 충분하다. 예를 들어, eIF4A1 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트는 서열목록 제 1 서열에 혼성화되는 프라이머 세트이고, L13 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트는 서열목록 제 2 서열에 혼성화되는 프라이머 세트이며, MRT 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트는 서열목록 제 3 서열에 혼성화되는 프라이머 세트이다. 본 명세서에서 용어 "프라이머 세트"는 전방향 프라이머 및 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍을 의미한다.
이러한 프라이머의 디자인은 주형의 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램 (예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.
PCR 과정에서 혼성화 (어닐링)는 일반적으로 프라이머와 타깃 서열 사이의 특이적 결합을 가능하게 하는 엄격한 (stringent) 조건하에서 실시된다. 이러한 엄격한 조건은 프라이머가 상보적인 서열에 특이적인 혼성화를 가능하게 하는데 적합한 완충액 농도 및 온도이다 (참조: M. Kanehisa, Nucleic Acids Res., 12:203 (1984)). 엄격한 조건은 서열-의존적이며, 환경에 따라 상이하다. 보다 긴 서열은 보다 높은 온도에서 특이적으로 혼성화한다. 일반적으로, 엄격한 조건은 특정 서열에 대한 멜팅 포인트 (Tm)보다 약 5?? 정도 낮은 온도로 선택된다.
본 발명에서의 PCR 과정은 통상적인 PCR 방법에 따라 실시될 수 있으며, 그 과정의 상세한 내용은 미합중국 특허 제 4,683,195 호, 제 4,683,202 호 및 제 4,800,159 호에 개시되어 있다. 예를 들어, Taq 중합효소, dNTPs, cDNA 주형, 프라이머 세트 및 MgCl2를 포함하는 적합한 완충액 내에서 일정한 온도 프로그램에 따라 실시된다.
PCR 과정을 통해 생성된 증폭물은 전기영동 과정을 거치게 되며, 형성된 밴드의 세기는 육안으로 관찰되거나 또는 덴시토미터로 정량화된다. 이렇게 관찰된 밴드 패턴이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 (positive) 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 패턴을 나타내는 경우에는 상기 약물에 반응성이 있는 것으로 판정한다. 상기 포지티브 대조군은 피부 질환이 없는 인체에서 분리된 표피를 대상으로 하며, 이 정상적인 시료에 대하여 상기 단계 (a)-(d)를 실시하여 전기영동 밴드 패턴을 얻게 된다. 상기 밴드의 실질적으로 동일한 패턴이라는 것은, 육안으로 비교하였을 때, 시료의 밴드와 정상 표피의 밴드의 세기가 실질적으로 동일하게 판정되거나, 덴시토미터로 정량화된 값을 비교했을 때, 실질적으로 동일한 양을 나타내는 경우를 의미한다. 덴시토미터로 정량화하는 경우, 내부 표준물 (internal standard)에 대한 상대적인 비율을 서로 비교하는 것이 바람직하며, 내부 표준물로서는 GAPDH (glyceraldehyder 3-phosphate dehydrogenase) 유전자이다.
본 발명의 보다 구체적인 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반 피부 질환의 치료에 이용되는 올-트랜스-레티노산 (ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (a) ATRA에 의해 처치된 백반 피부 질환 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 총 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (c) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트와 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR하는 단계; 및 (d) 상기 PCR 생성물을 전기영동하여 PCR 생성물의 밴드를 얻는 단계; (e) 상기 전기영동 밴드 패턴이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 패턴을 나타내는 경우에는 상기 약물에 반응성이 있는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머 세트를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 본 발명의 방법을 실시하기 위한 키트이다. 따라서, 본 발명의 방법과 키트에서 중복되는 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 키트는 DNA 증폭을 위한 시약을 추가적으로 포함할 수 있으며, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소, DNA 중합효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 상기 시약의 최적양은 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료에 이용되는 올-트랜스-레티노산(ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법: (a) ATRA에 의해 처치된 백반증 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 총 단백질을 포함하는 세포 균질액을 수득하는 단계; (b) 상기 균질액과 항-eIF4A1 항체를 반응시키는 단계; (c) 상기 균질액 내의 단백질과 상기 항-eIF4A1 항체 사이의 항원-항체 면역 반응 시그널을 검출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 시그널이 ATRA에 의해 처치되지 않은 백반증 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 얻은 네가티브 대조군과 비교하여 실질적으로 큰 세기를 나타내는 경우에는 ATRA에 반응성이 있는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항-eIF4A1 항체를 포함하는 올-트랜스-레티노산 (ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 방법은 상술한 바와 같이, mRNA 수준뿐만 아니라 단백질 수준에서도 실시될 수 있다. 단백질 수준에서 본 발명의 방법이 실시되는 경우에는, 기본적으로 항원-항체 면역반응(antigen-antibody immune reaction)이 이용된다.
본 발명의 방법에 있어서, 표피 세포로부터 총 단백질을 포함하는 세포 균질액을 수득하는 단계는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 다양하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 표피 세포를 액체질소에 함침시킨 다음 분쇄하여 얻은 분말을 프로테아제를 포함하는 완충액에 용해시켜 세포 균질액을 얻을 수 있다.
본 발명의 방법은 기본적으로, 항원-항체 반응을 이용하는 면역분석 (immunoassay) 방법 (예컨대, 방사능 면역분석 방법, 방사능 면역-침전 방법, 효소-결합 면역흡착 방법 (ELISA), 도트 블롯 분석, 웨스턴 블롯, 억제 또는 경쟁 분석 및 샌스위치 분석)에 따라 정량적으로 또는 정성적으로 실시된다 (참조: Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; 및 Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984).
예를 들어, 방사능 면역분석 방법을 따르는 경우에는, 방사능동위원소 (예: P32, S35)로 표지된 항-eIF4A1 항체를 이용하여, 시료 내의 항원 eIF4A1 단백질과 결합하여 형성된 면역 복합체의 생성을 측정하여, 시료 내의 eIF4A1 단백질을 정성적 또는 정량적으로(바람직하게는, 정량적으로) 검출할 수 있다.
또한, ELISA 방법에 따르는 경우에는, (ⅰ) 웰 플레이트에 항-eIF4A1 항체를 흡착시키는 단계; (ⅱ) 상기 웰 플레이트에 시료를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; (ⅲ) 발색효소 또는 형광물질이 결합된 항-eIF4A1 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (ⅵ) 발색효소 또는 형광물질이 결합된 항-eIF4A1 항체가 시료 내의 eIF4A1 단백질과 결합여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 실시된다.
상기 발색 효소는 알칼린 포스파타아제, ??-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제(HRP) 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), 나프톨-AS-B1-포스페이트 (naphthol-AS-B1-phosphate), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS (2,2'-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]), o-Phenylenediamine (OPD) 등이 이용된다.
한편, 본 발명을 웨스턴 블롯팅 방법에 따라 실시하면, 본 발명은 (ⅰ) 표피세포로부터 수득한 단백질을 변성시키는 단계 (예컨대, SDS 및 2-머르캅토에탄올을 이용하여 변성); (ⅱ) 변성된 단백질을 SDS-PAGE하는 단계; (ⅲ) SDS-PAGE가 완료된 젤 상의 변성 단백질을 NC 멤브레인으로 전이하는 단계; (ⅳ) NC 멤브레인상의 단백질과 1차 항체인 항-eIF4A1 항체를 반응시키는 단계; (ⅴ) 발색반응을 촉매하는 효소가 결합된 1차 항체와의 결합능을 갖는 2차 항체를 상기 1차 항체와 반응시키는 단계; (ⅵ) 2차 항체에 결합된 효소의 기질을 첨가하여 발색반응을 유도하는 단계; 및 (ⅶ) 발색반응에 의해 전개된 발색의 정도를 측정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에 따르면, 상기 단계 (c)의 시그널이 ATRA에 의해 처치되지 않은 백반증 환자로부터 분리된 표피세포로부터 얻은 네가티브 대조군과 비교하여 실질적으로 큰 세기를 나타내는 경우에는 ATRA에 반응성이 있는 것으로 판정하게 된다. 이러한 시그널 세기는 정성적으로(육안으로) 또는 정량적으로(예컨대, 덴시토미터 또는 스펙트로포토미터를 이용한 정량)으로 비교할 수 있다.
본 발명의 ATRA에 대한 반응성을 스크리닝하기 위한 키트에는, 항-eIF4A1 항체 이외에, 면역분석 방법에 따른 다른 성분들을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 ELISA 키트이고 발색효소로서 HRP가 이용되는 경우에는, 발색기질인 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS 또는 OPD 등이 포함될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 또는 그를 암호화하는 핵산 분자; (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 또는 그를 암호화하는 핵산 분자; 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 또는 그를 암호화하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 물질을 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)에 대한 생물학적 표지를 제공한다.
본 발명의 생물학적 표지는, 상기의 eIF4A1, L13 및 MRT를 암호화하는 핵산 분자의 신규한 용도에 관한 것이다. 본 발명의 생물학적 표지와 상술한 본 발명의 방법에서 중복되는 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명에서 용어, "핵산 분자"는 DNA (gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다 (Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분 (active ingredient)을 스크리닝하는 방법을 제공한다: (a) 시험 대상의 시료 화합물 또는 생물학적 분자를 상기 질환을 갖는 환자로부터 분리된 표피 세포에 처리하는 단계; (b) 상기 처리된 표피 세포에서 (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 유전자의 발현량을 조사하는 단계; 및 (c) 상기 조사된 발현량이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 발현량을 나타내는 경우에는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분으로 판정하는 단계.
본 발명은 상술한 본 발명의 생물학적 표지, 즉, eIF4A1, L13 및 MRT, 또는 이들 단백질을 암호화하는 핵산 분자의 신규한 용도에 관한 것이다. eIF4A1, L13 및 MRT는 특정 약물 후보물질에 대하여, 분별적으로 발현량의 차이가 있기 때문에, 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하는 데 이용할 수 있다.
본 발명의 스크리닝 방법과 상술한 본 발명의 반응성 스크리닝 방법에서 중복되는 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
eIF4A1, L13 및 MRT의 발현량을 조사하는 단계는 크게 뉴클레오타이드 수준 및 단백질 수준에서 실시할 수 있다.
만일, 뉴클레오타이드 수준에서 실시하는 경우에는, 발현량 분석은 상술한 RT-PCR 방법에 의해 실시할 수 있다.
만일, 단백질 수준에서 실시하는 경우에는, eIF4A1, L13 및 MRT 단백질에 대한 항체를 이용하여 실시된다. 이러한 항체 (폴리클론 항체 및 단일클론 항체)는 eIF4A1, L13 및 MRT 단백질을 항원으로 하여 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다 (Harlow, E. and Lane, D., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1988; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991). 바람직하게는, 본 발명에서 이용되는 항체는 단일클론 항체이다. 발현량 분석, 즉, 세포내 단백질양의 분석은 통상적인 면역분석 방법에 의해 정량적으로 또는 정성적으로 실시할 수 있다 (참조: Enzyme Immunoassay, E. T. Maggio, ed., CRC Press, Boca Raton, Florida, 1980; 및 Gaastra, W., Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), in Methods in Molecular Biology, Vol. 1, Walker, J.M. ed., Humana Press, NJ, 1984).
예를 들어, 방사능 면역분석 방법을 따르는 경우에는, 방사능동위원소 (예: P32, S35)로 표지된 본 발명의 항체를 이용하여, 시료 내의 항원, 즉 eIF4A1, L13 또는 MRT 단백질과 결합하여 형성된 면역 복합체의 생성을 측정하여, 시료 내의 상기 단백질을 정성적 또는 정량적으로 검출할 수 있다. 또한, ELISA 방법에 따르는 경우에는, (ⅰ) 웰 플레이트에 eIF4A1, L13 또는 MRT 단백질과 결합능을 갖는 항체를 흡착시키는 단계; (ⅱ) 상기 웰 플레이트에 시료를 첨가하여 반응시키고 세척하는 단계; (ⅲ) 본 발명의 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; (ⅳ) 상기 웰 플레이트를 세척한 후 발색효소 또는 형광물질이 결합된 2차 항체를 첨가하여 반응시키는 단계; 및 (ⅵ) 2차 항체의 결합여부를 측정하는 단계를 포함하는 방법으로 실시된다. 상기 발색 효소는 알칼린 포스파타아제, ??-갈락토시다아제, 호스 래디쉬 페록시다아제 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 알칼린 포스파타아제를 이용하는 경우에는, 기질로서 브로모클로로인돌일 포스페이트(BCIP), 니트로 블루 테트라졸리움(NBT), ECF 기질 등이 이용되고, 호스 래디쉬 페록시다아제를 이용하는 경우에는 기질로서 클로로나프톨, 아미노에틸카바졸, 디아미노벤지딘, 루미놀, ABTS (2,2ㅄ-Azine-di[3-ethylbenzthiazoline sulfonate]) 등이 이용된다.
최종적으로, 상기 과정에 의해 분석된 발현량이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 발현량을 나타내는 경우에는 유효성분으로 판정한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머 세트를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1)에 결합능을 갖는 항체, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13)에 결합능을 갖는 항체 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT)에 결합능을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 항체를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하기 위한 키트를 제공한다.
본 발명의 키트는 상술한 유효성분의 스크리닝 방법을 실시하기 위한 것으로서, 공통된 사항은 본 발명의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예후판정(prognosis) 방법을 제공한다: (a) 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포 또는 백반증 증세가 있는 병변 부위의 표피세포로부터 총 RNA를 분리하는 단계; (b) 상기 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계; (c) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트와 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR하는 단계; (d) 상기 PCR 생성물을 전기영동하여 PCR 생성물의 밴드를 얻는 단계; 및 (e) 상기 단계 (d)의 밴드 중에서 (ⅰ) 상기 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포에서 얻은 PCR 밴드가 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 감소된 밴드 세기를 나타내는 경우에는 상기 정상 피부 부위에서 백반증이 발병(development)될 가능성이 높은 것으로 판정하고 또는 (ⅱ) 상기 병변 부위의 표피세포에서 얻은 PCR 밴드가 전과 비교하여 증가된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 개선되는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예후판정(prognosis) 방법을 제공한다: (a) 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포 또는 백반증 증세가 있는 병변 부위의 표피세포로부터 총 단백질을 포함하는 세포 균질액을 수득하는 단계; (b) 상기 균질액과 항-eIF4A1 항체를 반응시키는 단계; (c) 상기 균질액 내의 단백질과 상기 항-eIF4A1 항체 사이의 항원-항체 면역 반응 시그널을 검출하는 단계; 및 (d) 상기 단계 (c)의 시그널 중에서 (ⅰ) 상기 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포에서 얻은 시그널이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 감소된 시그널 세기를 나타내는 경우에는 상기 정상 피부 부위에서 백반증이 발병(development)될 가능성이 높은 것으로 판정하고 또는 (ⅱ) 상기 병변 부위의 표피세포에서 얻은 시그널이 전과 비교하여 증가된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 개선되는 것으로 판정하는 단계.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트를 포함하는 백반증의 예후판정용 키트를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 항-eIF4A1 항체를 포함하는 백반증의 예후판정용 키트를 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "예후"는 백반증의 향후의 상태를 의미한다.
RNA 수준에서 실시되는 본 발명의 예후판정 방법에 따르면, 최종적으로 얻은 PCR 밴드를 분석하게 되는데, (ⅰ) 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포에서 얻은 PCR 밴드가 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군(즉, eIF4A1 유전자의 발현량이 큰 대조군)과 비교하여 감소된 밴드 세기를 나타내는 경우에는 상기 정상 피부 부위에서 백반증이 발병(development)될 가능성이 높은 것으로 판정된다. 즉, 이러한 밴드 세기 패턴을 나타내는 백반증 환자는 자신의 정상 피부 부위에로 백반증이 번질 가능성이 높은 것으로 판정될 수 있다.
또한, 최종적으로 얻은 PCR 밴드 중에서, (ⅱ) 백반증이 발병된 병변 부위의 표피세포에서 얻은 PCR 밴드가, 본 PCR 밴드를 얻기 전에 동일한 과정을 통하여 얻은 PCR 밴드와 비교하여 증가된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 개선되는 것으로 판정할 수 있고, 만일 감소된 밴드 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 악화되는 것으로 판정할 수 있다.
단백질 수준에서 실시되는 본 발명의 예후판정 방법에 따르면, 최종적으로 얻은 항원-항체 면역반응 시그널 중에서, (ⅰ) 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포에서 얻은 시그널이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 감소된 시그널 세기를 나타내는 경우에는 상기 정상 피부 부위에서 백반증이 발병될 가능성이 높은 것으로 판정할 수 있다.
또한, (ⅱ) 병변 부위의 표피세포에서 얻은 시그널이 본 시그널을 얻기 전에 동일한 과정을 통하여 얻은 시그널과 비교하여 증가된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 개선되는 것으로 판정할 수 있고, 감소된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 악화되는 것으로 판정할 수 있다.
본 발명의 방법에 따르면, 백반증의 예후를 비교적 정확하게 판정할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험 방법
백반 환자의 흡입-블리스터 표피로부터 RNA 분리
백반의 일반적 유형으로 진단된 6명의 환자 (두명의 남성과 네명의 여성)가 본 실험에 참여하였다. 이들 환자의 나이는 21 내지 52세 (평균 연령, 38세) 이었다. 환자들은 전달에 치료를 받지 않았다. ATRA와 부형제를 이용하여 위약-조절, 쌍-비교, 좌-우 연구를 3-6개월동안 실시하였다. 서면 동의서를 받은 다음, 표피 시료를 흡입으로 환자로부터 얻었다. 동일한 환자의 정상적인 색소화 표피는 대조군으로서 얻었다. ATRA 치료를 받거나 받지 않은 정상적인 색소화 표피 및 탈색소화 표피에 대해 200-250 mmHg의 네가티브 압력을 가하여 흡입 블리스터를 만들었다. 모든 환자의 흡입 블리스터의 루프를 RNA 분리에 이용하였다.
GeneFishing TM 역전사-중합 반응
상기 흡입-블리스터 표피로부터 Trizol (GibcoBRL, 15596-026, NY)을 이용하여 부드러운 균질화에 의해 총 RNAs를 분리하였다. 역전사반응은 다음과 같이 GeneFishingTM DEG 키트 (Seegene, DEK 3101 & 3104, 대한민국)를 이용하여 실시하였다: 분리된 RNAs 3 ㎍을 RNase-결여 증류수 및 10 ??M dT-ACP1을 함유하는 튜브 (최종 부피 9.5 ㎕)에 넣고, 이어 DNA Thermal Cycler 9600 (Perkin Elmer)에 튜브를 넣었다. 시료간에 분별적으로 발현되는 밴드를 동정하기 위하여, 동일한 양의 RNA를 비교하였다. 혼합물을 80??에서 3분동안 항온처리한 다음, 얼음 위에서 냉각시키고 간단히 스피닝하였다. 5x RT 완충액, 2 mM dNTP, RNase 억제제 및 M-MLV 역전사 효소 (Promega, M170B, WI)로 이루어진 반응 용액 20 ㎕를 상기 혼합물에 첨가하였다. 이어, 튜브를 42??에서 90분동안 항온처리하고, 94??에서 2분동안 가열한 다음, 얼음 위에서 냉각시키고 간단히 스피닝하였따. 합성된 최초 cDNA 가닥을 RNase-결여 증류수 80 ㎕로 희석하였다.
cDNA 시료는 사용할 때까지 -20??에서 보관하였다. MgCl2가 없는 10 x 완충액, 25 mM MgCl2, 5 ??M 아비트러리 ACPs, 10 ??M dT-ACP2, 2 mM dNTP, 2.5 U Taq DNA 중합효소 진크래프트 (Biotherm, GC-002-250, 프랑스) 및 50 ng 최초 cDNA 가닥으로 이루어진 반응 용액 50 ㎕에서 동일한 GeneFishingTM DEG 키트 (Seegene, DEK 3101 & 3104, 대한민국)를 이용하여 DNA Thermal Cycler 9600 (Perkin Elmer)에서 PCR 증폭을 실시하였다. 상기 각각의 키트는 20종의 서로 다른 아비트러리 어닐링 조절 프라이머 (ACPs)를 포함한다. 상기 열 순환기는 튜브를 장착하기 전에 94??에서 예열되었다. PCR 증폭의 프로그램은 다음과 같다: 94??에서 5분, 50??에서 3분 및 72??에서 1분으로 1 사이클, 94??에서 40초, 65??에서 40초 및 72??에서 40초로 40사이클하고, 최종 신장반응으로서 72??에서 5분. PCR에 의해 형성된 DNA 조각들을 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 분리하였다. 형성된 밴드는 에티듐 브로마이드로 염색한 다음, 자외선 하에서 폴라로이드를 필름을 이용하여 사진화하고, 덴시토미터 (Pharmacia)로 분석하였다.
클로닝 및 서열결정
분별적으로 발현된 밴드를 GENECLEAN Ⅱ 키트, GLASSMILK 젤 추출 키트(Q-BIOgene, #1001-400, UK)를 이용하여 상기 아가로서 젤로부터 추출하였다. 각각의 DNA 조각은 다음과 같이 TOPO TA 클로닝 키트를 이용하여 (Invitrogen, K4500-01, CA) 클로닝 되었다: 말단부에서 튀어나온 3 아데닌을 갖는 PCR 생성물을 pCR　2.1-TOPO　벡터에 삽입하고, 재조합 벡터를 유능한 E. coli에 형질전환하였다. 증폭된 DNA를 AccuPrep Plasmid 추출 키트 (Bioneer, #K-3030-1, 대한민국)를 이용하여 추출하였다. DNA의 서열결정은 Macrogen Company (대한민국)에서 실시하였다.
프라이머 서열
각각의 유전자의 DNA 서열을 비교하였고, GenBank (NIH, MD)에 공지된 서열과 비교하여 확인하였다. 각각의 유전자에 대한 프라이머 서열은 PRIMER 3 프로그램 (MIT, MA)을 이용하여 디자인하였다. 프라이머의 합성은 Bioneer Company (대한민국)에서 실시하였다.
반-정량 RT-PCT 분석
RT-PCR용 최초 cDNA 가닥 합성 키트 (AMV) (Boehringer Mannheim, 1483 188, 독일국)를 이용하여, 여섯명의 백반 환자중 다섯명으로부터 추출된 RNAs에 대하여 cDNA를 합성하였다. 센스 및 안티센스 프라이머는 서브클로닝된 cDNA 서열에 기초하여 디자인하였다 (참조: 도 1). 인간의 글리세르알데하이드 3-포스페이트 탈수소효소 (GAPDH)에 대한 프라이머는 내부 표준으로서 이용하였다. GAPDH 센스 프라이머는 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'이고, 안티센스 프라이머는 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'이며, 이들은 452-bp의 생성물을 생성한다.
PCR 증폭은 10 x 반응완충액, 2.5 mM MgCl2, 250 ??M dNTPs, 100 ng PCR 프라이머, 0.5 U Taq DNA 중합효소 및 DNA 2050 ng으로 이루어진 40 ㎕ 반응용액에서 DNA Thermal Cycler 9600 (Perkin Elmer)을 이용하여 실시하였다. 3종의 프라이머 세트 (3-1, 64-1 and 77-4)에 대한 PCR 증폭은 94??에서 1분, 55??에서 1분 및 72??에서 1분으로 25 사이클을 하였다. 14-1에 대한 프로그램은 94??에서 1분, 57??에서 1분 및 72??에서 1.5분으로 30 사이클이다. GAPDH에 대해서는 94에서 1분, 59??에서 1분 및 72??에서 1분으로 25 사이클로 실시되었다. PCR에 의해 제조된 DNA 조각은 2% 아가로스 젤에서 전기영동하여 분리하였다. 밴드는 에티듐 브로마이드 염색한 후 자외선 하에서 폴라로이드 필름을 이용하여 사진화하였다. 각각 밴드의 광학 밀도는 덴시토미터 (Pharmacia)로 분석하였다. mRNA의 상대적인 양은 GAPDH의 양에 대한 각각의 mRNA의 양의 비율을 계산하여 확인하였다.
실시간 (Real-Time) PCR
7명의 백반 환자로부터 분리한 총 RNAs를 이용하였다. First Strand cDNA Synthesis Kit (Boehringer Mannheim)를 이용하여 RNA로부터 cDNA를 합성하였다. TaqMan　 유니버설 PCR 마스터 믹스 키트 (Perkin Elmer)를 이용하여 TaqMan　PCR를 실시하였다. 올리고뉴클레오타이드 PCR 프라이머와 5' 리포터로서 FAM 및 3'??처로서 TAMRA를 가지는 TaqMan　프로브를 Primer-Express 프로그램 (Perkin Elmer)를 이용하여 디자인하였고, MuenBio Inc.(Baltimore, MD, USA)에서 합성하였다. 서열은 다음과 같다: eIF41 센스 프라이머, 5'-CTGGCCAGAGGCATTGATGT-3', eIF41 안티센스 프라이머, 5'-CCACACCTTTACGGCCAAAC-3' 및 eIF41 TaqMan　프로브, 5'-TTTCTTTAGTCATCAACTATGACCTTCCCACCAA-3'.
각각의 반응에 첨가되는 총 RNA 양의 차이 때문에, 내재성 대조군을 활성 표준물질로 이용하여 mRNA 타깃의 정량을 정규화 하였다. 인간 hu ??-액틴 (20X) 키트 (Perkin Elmer)를 이용하여 ??-액틴 mRNA를 평가하였다. 프라이머 및 TaqMan　형광생성 프로브를 각각 0.9 및 0.25 ??M이 되도록 첨가하였다. 총 PCR 부피는 20 ㎕이고, 여기에 1 ㎕의 cDNA가 포함되며 이는 50 ng의 총 RNA에 동일한 것이다. 각각의 시료 및 전사체에 대하여 3개의 반응 튜브를 세팅하였다. 튜브를 ABI Prism 7900HT System에 넣었고, 상기 시스템은 50??에서 2분, 95??에서 10분의 1 사이클에 이은 95??에서 15초, 60??에서 1분의 40 사이클로로 이루어진 40회의 연속 사이클로 프로그래밍 된 것이다. SDS 2.1 프로그램 (Perkin Elmer)을 이용하여 데이터를 분석하였다. 상대적 정량에 대한 동일한 결과를 얻기 위하여 비교 Ct 방법은 산술적 공식을 이용한다. 내재성 표준물질에 대해 정규화되고 조정자에 대한 상대적인 타깃의 양은 2-????CT로 주어진다.
Wilcoxon's Signed Ranks Test를 이용하여 3번의 반응들로부터 얻은 결과를 분석하여 ATRA-처리 및 부형제-처리 시료 사이의 차이를 조사하였다. 0.05 미만의 P-값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주된다.
항-rheIF4A1 항체의 제조
재조합 인간 eIF4A1 (rheIF4FA1)의 클로닝을 위하여, 인간 각질형성세포를 분리하였다 (Boyce ST., et al., J. Invest Dermatol 81:33s-40s(1983)). 총 RNA를 TRIZOL (Invitrogen) 방법으로 초기 배양된 인간 각질형성세포로부터 추출하였다. 올리고-dT 프라이머 및 MMLV RT-PCR 키트 (Promega)를 이용하여 cDNA를 제조하였다. 전방향 프라이머로서 5'-ATGTCTGCGAGCCAGGATTCC-3' 및 역방향 프라이머로서 5'-TCAGATGAGGTCAGCAACATTG-3'를 이용하여 PCR로 eIF4A1 cDNA를 증폭하였다. PCR 시 이용된 온도 사이클은 다음과 같다: 95??에서 10분, 그런 다음 95??에서 30초, 58??에서 30초 및 72??에서 1.5분의 35 사이클, 그리고 나서 72??에서 10분. PCR 산물은 PCR2.1-TOPO 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였다. 클로닝된 유전자를 서열결정하고, 인간 eIF4A1에 대한 공지된 서열 데이터 (GenBank accession no. BC009585)와 비교 확인하였다. 클로닝된 rheIF4F1 유전자를 이용하여 폴리클로날 항-eIF4A1 항체를 제조하였다 (Labfrontier Co., Korea).
eIF4A1에 대한 웨스턴 블롯팅 분석
표피 시료를 액체 질소에 함침시켜 냉동시켰다. 냉동된 조직을 그라운딩하여 분말로 만들고 얼음-냉장 균질화 완충액 [50 mM Tris-base (pH 7.4), 150 mM NaCl, 10 mM EDTA, 0.1% Tween-20 및 프로테아제 억제제 (0.1 mM 페닐메틸설포닐플루오라이드, 5 ㎍/㎖ 아프로티닌 및 5 ㎍/㎖ 류펩틴) 포함]에서 균질화시켰다. 균질액을 12,000 x g에서 30분 동안 원심분리하고 상등액을 수집하였다. 상등액의 단백질 농도는 DC 단백질 분석 키트 (Bio-Rad Laboratories, Inc. USA)를 이용하여 결정하였다. 단백질의 동일양 (20 ㎍)을 7% SDS-PAGE로 분리하고 니트로셀룰로오스막에 전이시켰다. 상기 막을 10 mM Tris (pH 7.6), 150 mM NaCl 및 0.1% Tween-20을 포함하는 Tris-buffered saline (TTBS)내의 비지방 건유의 블롯킹 용액에 실온에서 1시간 동안 넣어 두었다. 1:4000으로 희석된 토끼 폴리클로날 항-eIF4A1 항체와 상기 막을 블롯킹 용액에서 4??에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 반응 후, TTBS로 세척하고 1:2000으로 희석된 항-토끼 호스래디쉬 퍼옥시다아제-접합 항체 (Pharmingen, USA)와 상기 막을 블롯킹 용액에서 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. TTBS에서 막을 30분 동안 세척한 다음, 강화된 화학발광 용액 (ECL kit; Amersham Life Science, UK)으로 1분 동안 처리한 다음, X-선 필름 (Hyperfilm, Amersham)에 노출시켰다. 각각의 레인에 로딩된 단백질의 양을 모니터링하기 위하여, 막을 ??-액틴에 대한 항체로 처리하였다. 스트리핑 완충액 (0.1 M 글리신, pH 2.5)으로 막을 스트리핑한 다음, 1:5000으로 희석된 마우스 단일클론 항-액틴 항체 (Sigma, USA)와 막을 블롯킹 용액에서 1시간 동안 실온에서 반응시켰다. 그런 다음, 막을 상기와 동일한 방법으로 2차 항체와 반응시켰다. 즉시 필름에 노출시킨 다음, 단백질 밴드를 덴시토미터로 분석하였다.
백반증 환자의 병변과 정상부에서 eIF4A1 단백질 발현 비교
ATRA 치료에의 반응과 무관하게 백반증 자체의 병변과 정상부에서 eIF4A1 단백질의 발현량 차이를 분석하였다. 22명의 환자의 정상부와 병변부 표피를 시료로 이용하였고, 분석 방법은 상기 웨스턴 블롯팅 방법과 거의 동일하다. 내부 대조군으로서 ??-액틴을 이용하였다.
실험 결과
분별적으로 발현된 cDNA 증폭 산물
동일한 환자로부터 얻은 정상적인 색소화 표피, 부형제 처리 탈색소화 표피 및 ATRA 처리된 탈색소화 표피에 대한 특정 mRNAs의 발현량을 비교하였다. 대략 발현된 10종의 mRNAs의 발현량이, 정상적인 색소화 표피 및 탈색소화 표피에서 차이가 있었다. 발현량은 정상적인 색소화 표피보다 탈색소화 표피에서 낮게 나타났으며, 이러한 차이의 정도는 환자간에 차이가 있었다 (도 1). 정상의 색소화 표피와 비교하여 부형제-처리 표피에서 감소된 mRNA 발현량은 ATRA 처리 이후에 부분적으로 또는 완전히 회복되었고 (화살표), 다른 것들은 감소되었다 (화살표 머리) (도 1).
클로닝 및 서열결정으로부터 유전자의 검출
분명한 결과를 보여주는 밴드의 mRNAs를 TOPO TA 클로닝 키트 (Invitrogen, K4500-01, CA)를 이용하여 증폭하였다. 4개의 유전자의 서열은 공지된 유전자의 일부분에 해당된다. 이들은 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) (Figure 2), 라이보좀 단백질 L13 (L13), 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 및 라이보좀 포스포단백질 PO (PO) 유전자 서열과 일치되었다 (표 1).
백반에서 ATRA 처리에 의해 상승된 발현량을 나타내는 유전자 및 프라이머
클론 PCR 프라이머 증폭물 크기 (bp) mRNA 크기(kb) 유사성
3-1 3505'-AAGGTGGTCATGGCACTAGG-3' 5'-CTGGCCGTGTGTTTGATATG-3' 228 1.4 eIF4A1
AT15'-GTCTGCGAGCCAGGATTCC-3' 5'-CAATGTTGCTGACCTCATCT-3' 1217 - eIF4A1
14-1 975'-AAGCAGCTTGAGGCATCATT-3' 5'-TCCCTGACCATCTGAGAACC-3' 280 1.2 MRT
64-1 2275'-GTTCGGTACCACACGAAGGT-3' 5'-CAAACTCATCCTCTTCCCCA-3' 196 1.1 L13
77-4 7015'-AATGGCAGCATCTACAACCC-3' 5'-CTTGCTGAAAAGGTCAAGGC-3' 218 1.2 PO
RT-PCR 결과 및 임상 반응성과의 상관관계
탈색소화 표피에서 eIF4A1 mRNA 발현량은 정상적인 색소화 표피보다 낮았다. 프라이머의 두 종의 세트 (도 2)를 이용한 실험에서 결과는 유사하였고, 각각 전장의 서열 (약 1.3 kb)을 증폭하였다. ATRA에 대하여 선호적인 임상 반응성을 보이는 5명의 환자 중 3명 (환자 #1, #2, #3)에서 발현량이 부분적으로 회복되었다. 반면, ATRA에 대한 임상적 반응성과 부형제 처리에서의 반응성 사이의 차이가 없는 두 환자 (환자 #4, #5)에서 ATRA에 의한 eIF4A1 mRNA 발현량 차이는 나타나지 않았다 (도 3a 및 3b). L13, MRT, 및 PO mRNAs는, 각각 1, 1 및 2명의 환자에서 유사한 상관관계를 나타내었다 (도 3a 및 3b).
eIF4A1의 실시간 PCR 결과 및 웨스턴 블롯 분석
실시간 PCR를 7명의 백반증 환자에 대하여 실시하였다. 도 4에서, 1번, 2번, 4번 및 5번 환자는 ATRA에 대한 임상적 반응성이 좋은 환자이고, 6번, 7번 및 8번 환자는 ATRA에 대한 임상적 반응성이 없는 환자이다. 정상적 색소화 표피와 부형제-처리 탈색소화 표피에서 eIF4A1의 실시간 PCR로부터 얻은 결과들은 반-정량 RT-PCR으로부터 얻은 결과와 항상 일치하지는 않았다. ATRA-처리 및 부형제-처리 표피 사이의 차이는 반-정량 RT-PCR로부터 얻은 결과보다 상당히 컸다. ATRA에 대하여 좋은 반응성을 보이는 4명의 환자 (환자 번호 1, 2, 4 및 5)에서 eIF4A1 mRNA의 양은 ATRA-처리 표피가 부형제-처리 표피보다 높았고, 반면 다른 3명의 환자 (환자 번호 6, 7 및 8)에서는 낮거나 유사한 결과가 나왔다.
ATRA에 대한 임상적 반응성이 좋은 환자 (환자 번호 9) 및 반응성이 없는 환자 (환자 번호 10) 대하여 웨스턴 블롯을 실시하였다. 두 환자에서, 부형제 처리 정상적 색소화 표피는 부형제 처리 탈색소화 표피보다 eIF4A1 단백질의 높은 양을 나타내었다 (참조: 도 5). ATRA에 대한 임상적 반응성이 좋은 환자 (환자 번호 9)는 ATRA-처리 표피에서 47 kDa eIF4A1 단백질의 높은 양을 나타내었으나, ATRA에 대하여 반응성이 없는 환자 (환자 번호 10)에서는 eIF4A1 단백질의 발현이 유사한 양을 나타내었다.
백반증 환자의 병변과 정상부에서 eIF4A1 단백질 발현 비교
도 6에서 확인할 수 있듯이, 백반증이 발생한 표피보다 정상 표피에서 eIF4A1 단백질이 많이 발현되었다. 따라서, eIF4A1 단백질 발현량의 측정을 백반증의 예후 판정에 활용할 수 있음을 알 수 있다.
본 발명은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)을 스크리닝하는 방법 및 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성에 대한 생물학적 표지를 제공한다. 한편, 본 발명은 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하는 방법 및 키트를 제공한다. 또한, 본 발명은 백반증의 예후판정 방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따르면, 백반증에 대하여 반응성을 투여 전에 미리 분석할 수 있기 때문에, 맞춤식 (tailor-made) 약물 투여를 할 수 있고, 이에 가장 효과적인 약물 치료를 할 수 있는 방법을 제시할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 따르면, 신속하게 백반증에 유효한 약물의 후보물질을 스크리닝할 수 있다. 본 발명의 예후판정 방법에 따르면, 백반증의 향후 상태를 비교적 정확하게 예측할 수 있다.
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도 1은 ATRA-처리된 및 부형제-처리된 백반 (vitiligo) 표피 시료의 어닐링 조절 프라이머 (ACP)를 포함하는 키트를 이용한 분별 발현 양상을 보여주는 젤 사진이다. 정상 표피 (N) 및 부형제 처리된 표피 (V) 사이의 특정 mRNA 발현의 차이는 ATRA 처리 (A)에 의해 부분적으로 또는 완전히 회복되었다. 밴드 (화살표)와 그들의 발현량은 환자들간에 차이가 있었지만 (클론 3과 같이), 6명의 환자로부터 얻는 10개의 밴드는 ATRA 처리에 의해 정상적인 수준으로 발현이 회복되었음을 보여준다.
도 2는 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1)의 DNA 서열 및 프라이머 서열이다. ATRA 적용에 의해 회복된 발현량을 보여주는 mRNA 밴드 중 하나를 클로닝하였다. 서열 841번 내지 1261번 사이의 서열 (밑줄)은 eIF4A1과 99% 이상의 상동성을 나타내었고, 이의 크기는 대략 1.4 kb이다. RT-PCR을 위해 프라이머 세트를 디자인하였고, 이 중 하나는 대문자로 표시되어 있고, 다른 하나는 볼드체로 표시되어 있다.
도 3a은 반-정량 RT-PCR 분석 결과 및 임상적 반응성과의 관련성을 보여주는 젤 사진이다. 4개의 공지된 유전자, 즉, 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1), 라이보좀 단백질 L13 (L13), 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 및 라이보좀 포스포단백질 PO (PO) 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 5 환자의 시료를 이용하여 RT-PCR을 실시하였고, 이때 GAPDH를 내부 표준으로 하였다. 부형제-처리된 탈색소화 표피 (V)에서의 eIF4A1 mRNA 발현량은 정상적인 색소화 표피 (N)의 발현량보다 낮았다. ATRA 처리 (A)에 의해, ATRA에 대해 선호적인 임상적 반응성을 보이는 3명의 환자 (환자 #1, #2, #3)에서 eIF4A1 발현량이 정상 수준으로 상승하였다. 반면, ATRA 처리와 부형제 처리에서 임상적 반응성이 차이가 없는 다른 두 환자 (환자 #4, #5)에서는 eIF4A1 발현량이 차이가 없었다. L13, MRT 및 PO mRNAs도 특정 환자에서 유사한 상관관계를 나타내었다.
도 3b는 반-정량 RT-PCR 분석 결과 및 임상적 반응성과의 관련성을 보여주는 그래프이다. GAPDH의 양에 대한 각각의 mRNA 양의 비율을 계산하여 mRNA의 상대량을 얻었다. 탈색소화 표피 및 정상적인 색소화 표피 사이의 정규화된 덴시토미터 값의 비율을 부형제-처리된 시료 및 ATRA-처리된 시료에서 분석하였다. 상기 비율로부터 임상적 반응성과의 관련성을 조사하였고, 모든 5명의 환자에서 eIF4A1 mRNA와 상관관계가 있음이 규명되었다.
도 4는 eIF4A1의 실시간 PCR 결과를 보여주는 그래프이다.
도 5는 eIF4A1 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯팅 분석 결과를 보여주는 젤 사진이다. N은 정상적으로 색소화되고 부형제 처리된 표피세포이고, V는 부형제 처리된 탈색소화 표피세포이며, A는 ATRA 처리된 탈색소화 표피세포이다. 재조합 eIF4A1 단백질을 포지티브 대조군으로 이용하였다. ??-액틴을 내부 대조군으로 이용하였다.
도 6은 정상부와 병변부에서의 eIF4A1 단백질의 발현 패턴을 보여주는 웨스턴 블롯팅 분석 결과이다.
<110> School Foundation Eulji <120> Method for Screening Responsiveness to Drugs Effective in Treatment or Prevention of Vitiligo and Method for Prognosis of Vitiligo <150> KR10-2004-0004256 <151> 2004-01-20 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1411 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 agtttctaag gatcatgtct gcgagccagg attcccgatc cagagacaat ggccccgatg 60 ggatggagcc cgaaggcgtc atcgagagta actggaatga gattgttgac agctttgatg 120 acatgaacct ctcggagtcc cttctccgtg gcatctacgc ctatggtttt gagaagccct 180 ctgccatcca gcagcgagcc attctacctt gtatcaaggg ttatgatgtg attgctcaag 240 cccaatctgg gactgggaaa acggccacat ttgccatatc aattctgcag cagattgaat 300 tagatctaaa agccacccag gccttggtcc tagcacccac tcgagaattg gctcagcaga 360 tacagaaggt ggtcatggca ctaggagact acatgggcgc ctcctgtcac gcctgtatcg 420 ggggcaccaa cgtgcgtgct gaggtgcaga aactgcagat ggaagctccc cacatcatcg 480 tgggtacccc tggccgtgtg tttgatatgc ttaaccggag atacctgtcc cccaaataca 540 tcaagatgtt tgtactggat gaagctgacg aaatgttaag ccgtggattc aaggaccaga 600 tctatgacat attccaaaag ctcaacagca acacccaggt agttttgctg tcagccacaa 660 tgccttctga tgtgcttgag gtgaccaaga agttcatgag ggaccccatt cggattcttg 720 tcaagaagga agagttgacc ctggagggta tccgccagtt ctacatcaac gtggaacgag 780 aggagtggaa gctggacaca ctatgtgact tgtatgaaac cctgaccatc acccaggcag 840 tcatcttcat caacacccgg aggaaggtgg actggctcac cgagaagatg catgctcgag 900 atttcactgt atccgccatg catggagata tggaccaaaa ggaacgagac gtgattatga 960 gggagtttcg ttctggctct agcagagttt tgattaccac tgacctgctg gccagaggca 1020 ttgatgtgca gcaggtttct ttagtcatca actatgacct tcccaccaac agggaaaact 1080 atatccacag aatcggtcga ggtggacggt ttggccgtaa aggtgtggct attaacatgg 1140 tgacagaaga agacaagagg actcttcgag acattgagac cttctacaac acctccattg 1200 aggaaatgcc cctcaatgtt gctgacctca tctgaggggc tgtcctgcca cccagcccca 1260 gccagggctc aatctctggg ggctgaggag cagcaggagg ggggagggaa gggagccaag 1320 ggatggacat cttgtcattt tttttctttg aataaatgtc actttttgag gcaaaagaag 1380 gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1411 <210> 2 <211> 743 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 ctgttttcct gcgcaggagc cgcagggccg taggcagcca tggcgcccag ccggaatggc 60 atggtcttga agccccactt ccacaaggac tggcagcggc gcgtggccac gtggttcaac 120 cagccggccc gtaagatccg cagacgtaag gcccggcaag ccaaggcgcg ccgcatcgcc 180 ccgcgccccg cgtcgggtcc catccggccc atcgtgcgct gccccacggt tcggtaccac 240 acgaaggtgc gcgccggccg cggcttcagc ctggaggagc tcagggtggc cggcattcac 300 aagaaggtgg cccggaccat cggcatttct gtggatccga ggaggcggaa caagtccacg 360 gagtccctgc aggccaacgt gcagcggctg aaggagtacc gctccaaact catcctcttc 420 cccaggaagc cctcggcccc caagaaggga gacagttctg ctgaagaact gaaactggcc 480 acccagctga ccggaccggt catgcccgtc cggaacgtct ataagaagga gaaagctcga 540 gtcatcactg aggaagagaa gaatttcaaa gccttcgcta gtctccgtat ggcccgtgcc 600 aacgcccggc tcttcggcat acgggcaaaa agagccaagg aagccgcaga acaggatgtt 660 gaaaagaaaa aataaagccc tcctggggac ttggaatcaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 743 <210> 3 <211> 1208 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 cagccgcctc ggccgccgca atgcagccct cctttctatg tgtcatactc gtttatctgg 60 gtgaccaacc tgttcctatt ggtgcagaga gaggagaagc agcttgaggc atcattagat 120 gcactgctga gtcaagtggc tgatctgaag aactctctgg ggagtttcat ttgcaagttg 180 gagaacgagt atggccggct gacctgcttt gccttgcttt ctggacagct gaacactctg 240 aacaaggtct tgaagcatga aaaaacaccg ctgttccgta accaggtcat cattcctctg 300 gtgttgtctc cagaccgaga tgaagatctc atgcggcaga ctgaaggacg ggtgcctgtt 360 ttcagccatg aggtagtccc tgaccatctg agaaccaagc ctgaccctga agtggaagaa 420 caggagaagc aactgacgac agatgctgcc cgcattggtg cagatgcagc ccagaagcag 480 atccagagct tgaataaaat gtgttcaaac cttctggaga aaatcagcaa agaggagcga 540 gaatcagaga gtggaggtct ccggccgaac aagcagacct ttaaccctac agacactaat 600 gccttggtgg cagctgttgc ctttgggaaa ggactatcta attggagacc ttcaggcagc 660 agtggtcctg gccaggcagg ccagccagga gctgggacga tccttgcagg aacctcagga 720 ttacagcagg tgcagatggc aggagctcca agccagcagc agccaatgct cagtggggta 780 caaatggctc aggcaggtca accagggaaa atgccaagtg gaataaaaac caacatcaag 840 tcggcttcca tgcatcccta ccagcggtga gtgtggctgg caacctcgac tccctggtgc 900 tctttgcaga gttgggcagt gaaattacct tttgctcaag gctcacctag atgggtacaa 960 taaaaagaac atgggctttc agcagcagac aaatcccact tccaccactg actagctgtg 1020 tgaccttgga caagtgacct aatttttctg agcctgtttc tcatttgtaa atggtgataa 1080 tacctacctc atagggttgt tgtgaggatt aaaatgagga aatgaatgta aagcacttag 1140 tacagtatat gaaataatgg gtattcaata aatgatagtt tctacaaaaa aaaaaaaaaa 1200 aaaaaaaa 1208

Claims (22)

  1. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)을 스크리닝하는 방법:
    (a) 상기 약물에 의해 처치된 상기 백반증 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
    (c) (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머 세트와 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR하는 단계;
    (d) 상기 PCR 생성물을 전기영동하여 PCR 생성물의 밴드를 얻는 단계; 및
    (e) 상기 전기영동 밴드 패턴이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 패턴을 나타내는 경우에는 상기 약물에 반응성이 있는 것으로 판정하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 약물은 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 비타민 C, 트리클로로아세트산 및 칼시포트리올 (calcipotriol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 eIF4A1 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 (e)는 전기영동 밴드의 세기를 육안으로 비교하거나 또는 덴시토미터로 정량하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료에 이용되는 올-트랜스-레티노산 (ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법:
    (a) ATRA에 의해 처치된 백반증 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
    (c) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트와 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR하는 단계; 및
    (d) 상기 PCR 생성물을 전기영동하여 PCR 생성물의 밴드를 얻는 단계;
    (e) 상기 전기영동 밴드 패턴이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 패턴을 나타내는 경우에는 상기 약물에 반응성이 있는 것으로 판정하는 단계.
  6. (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머 세트를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)을 스크리닝하기 위한 키트.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 약물은 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 비타민 C, 트리클로로아세트산 및 칼시포트리올 (calcipotriol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 6 항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 eIF4A1 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 키트.
  9. (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 또는 그를 암호화하는 핵산 분자; (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 또는 그를 암호화하는 핵산 분자; 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 또는 그를 암호화하는 핵산 분자로 구성된 군으로부터 선택되는 생물학적 물질을 포함하는 코르티코스테로이드의 투여를 요구하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 약물에 대한 반응성 (responsiveness)에 대한 생물학적 표지.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 약물은 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 비타민 C, 트리클로로아세트산 및 칼시포트리올 (calcipotriol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 생물학적 표지.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 생물학적 표지는 eIF4A1 또는 그를 암호화하는 핵산 분자인 것을 특징으로 하는 생물학적 표지.
  12. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료에 이용되는 올-트랜스-레티노산 (ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하는 방법:
    (a) ATRA에 의해 처치된 백반증 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 총 단백질을 포함하는 세포 균질액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 균질액과 항-eIF4A1 항체를 반응시키는 단계;
    (c) 상기 균질액 내의 단백질과 상기 항-eIF4A1 항체 사이의 항원-항체 면역 반응 시그널을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 시그널이 ATRA에 의해 처치되지 않은 백반증 환자로부터 분리된 표피 세포로부터 얻은 네가티브 대조군과 비교하여 실질적으로 큰 세기를 나타내는 경우에는 ATRA에 반응성이 있는 것으로 판정하는 단계.
  13. 항-eIF4A1 항체를 포함하는 올-트랜스-레티노산 (ATRA)에 대한 반응성을 스크리닝하기 위한 키트.
  14. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하는 방법:
    (a) 시험 대상의 시료 화합물 또는 생물학적 분자를 상기 질환을 갖는 환자로부터 분리된 표피 세포에 처리하는 단계;
    (b) 상기 처리된 표피 세포에서 (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 유전자의 발현량을 조사하는 단계; 및
    (c) 상기 조사된 발현량이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 실질적으로 동일한 발현량을 나타내는 경우에는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분으로 판정하는 단계.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 약물은 올-트랜스-레티노산 (ATRA), 비타민 C, 트리클로로아세트산 및 칼시포트리올 (calcipotriol)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 14 항에 있어서, 상기 단계 (c)는 전기영동 밴드의 세기를 육안으로 비교하거나 또는 덴시토미터로 정량하여 실시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 프라이머 세트를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하기 위한 키트.
  18. (ⅰ) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1)에 결합능을 갖는 항체, (ⅱ) 라이보좀 단백질 L13 (L13)에 결합능을 갖는 항체 및 (ⅲ) 전사에 대한 RNA 중합효소의 중개자 (MRT)에 결합능을 갖는 항체로 구성된 군으로부터 선택되는 최소 1종의 항체를 포함하는 백반증의 치료 또는 예방에 유효한 유효성분을 스크리닝하기 위한 키트.
  19. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예후판정(prognosis) 방법:
    (a) 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포 또는 백반증 증세가 있는 병변 부위의 표피세포로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
    (b) 상기 분리된 총 RNA로부터 cDNA를 합성하는 단계;
    (c) 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트와 상기 합성된 cDNA를 주형으로 이용하여 PCR하는 단계;
    (d) 상기 PCR 생성물을 전기영동하여 PCR 생성물의 밴드를 얻는 단계; 및
    (e) 상기 단계 (d)의 밴드 중에서 (ⅰ) 상기 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포에서 얻은 PCR 밴드가 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 감소된 밴드 세기를 나타내는 경우에는 상기 정상 피부 부위에서 백반증이 발병(development)될 가능성이 높은 것으로 판정하고 또는 (ⅱ) 상기 병변 부위의 표피세포에서 얻은 PCR 밴드가 전과 비교하여 증가된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 개선되는 것으로 판정하는 단계.
  20. 다음의 단계를 포함하는 백반증의 예후판정(prognosis) 방법:
    (a) 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포 또는 백반증 증세가 있는 병변 부위의 표피세포로부터 총 단백질을 포함하는 세포 균질액을 수득하는 단계;
    (b) 상기 균질액과 항-eIF4A1 항체를 반응시키는 단계;
    (c) 상기 균질액 내의 단백질과 상기 항-eIF4A1 항체 사이의 항원-항체 면역 반응 시그널을 검출하는 단계; 및
    (d) 상기 단계 (c)의 시그널 중에서 (ⅰ) 상기 백반증 증세가 있는 환자의 정상 피부 부위의 표피세포에서 얻은 시그널이 정상적인 표피세포에서 얻은 포지티브 대조군과 비교하여 감소된 시그널 세기를 나타내는 경우에는 상기 정상 피부 부위에서 백반증이 발병(development)될 가능성이 높은 것으로 판정하고 또는 (ⅱ) 상기 병변 부위의 표피세포에서 얻은 시그널이 전과 비교하여 증가된 세기를 나타내는 경우에는 백반증이 개선되는 것으로 판정하는 단계.
  21. 진핵세포의 트랜스레이션 개시인자 4A1 (eIF4A1) 유전자에 혼성화되는 프라이머 세트를 포함하는 백반증의 예후판정용 키트.
  22. 항-eIF4A1 항체를 포함하는 백반증의 예후판정용 키트.
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