KR101182974B1 - 림프종 진단 또는 예후 마커로서 Ｐｅｌｌｉｎｏ 1 - Google Patents

Abstract

본 발명은 림프종에 특이적인 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로 바이오마커인 Pellino 1 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 림프종의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커를 이용한 림프종의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공방법, 및 상기 마커를 이용한 림프종 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

Description

림프종 진단 또는 예후 마커로서 Ｐｅｌｌｉｎｏ 1{Pellino 1 as a marker for the diagnosis or prognosis of lymphoma}

본 발명은 림프종에 특이적인 바이오 마커에 관한 것으로, 보다 구체적으로 바이오마커인 Pellino 1 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 림프종의 진단 또는 예후 예측용 조성물을 포함하는 키트, 상기 마커를 이용한 림프종의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공방법, 및 상기 마커를 이용한 림프종 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

림프종(lymphoma)은 림프조직에 속하는 세포들(림프구 및 조직구)의 악성 림프종을 말하며 호즈킨림프종(Hodgkin's disease)과 비호즈킨림프종(non-Hodgkin's lymphoma)로 간략하게 구분할 수 있다. 우리나라는 비호즈킨림프종이 절대 다수를 차지하며 비호즈킨림프종의 95% 이상은 대부분 악성 림프종이고 호즈킨림프종은 악성 림프종의 약 5% 밖에 되지 않으며, 서구에서는 호즈킨림프종의 빈도가 악성 림프종의 약 40%를 차지한다.

비호즈킨림프종은 면역계의 림프종으로서 T 세포, B 세포, 또는 조직구에서 기원하나, 비호즈킨림프종의 대부분(80~90%)은 B 세포 기원이며 그 나머지는 T 혹은 NK 세포기원으로 조직구 기원은 매우 드물다고 알려져 있다. 비호즈킨림프종 중에서도 미만성 B 큰세포 림프종(Diffuse large B cell lymphoma, 소림프구 보다 4~5배 크며 핵에 균열이 있는 세포와 없는 세포가 섞여 있음)은 가장 흔한 유형으로 미국에서는 약 30% 우리나라에서는 약 40%을 차지한다.

림프구계 림프종의 일반적인 진단은 조직화학적 검색을 위한 헤마톡실린-에오신 염색이나 유세포 검사, 면역조직화학적 검사, 김자(Giemsa) 염색, 세포유전학적 검사 등을 필요에 따라서 시행한다. 림프종의 면역조직화학적 검사에서는 B 세포나 T 세포 등의 면역표현형(예, CD5, CD10, CD19, CD20 등)을 구분하고 세포유전학적 검사에서는 염색체 검사나 FISH(fluorescence in situ hybridization)를 이용한 BCL-2, c-Myc, ALK-1, BCL-6, MALT1-API2 등의 유전자의 전위(translocation)를 분석한다고 알려져 있다.

그렇지만, 앞에서의 검사법들은 대부분 특정 림프구계 림프종에 선택적이고 특이적인 검사 방법은 아니며, 진단을 위한 특정 유전자를 표적으로 한 효율적인 검사법은 아직 연구 단계에 있는 것으로 보고되고 있다.

예를 들면, 전체 백혈병의 15~20%을 차지하는 만성골수성 백혈병(chronic myelogenous leukemia, CML)에서와 같은 특정 유전자를 표적으로 하는 진단 및 치료는 가장 이상적이며 유일한 접근 방법이라고 할 수 있다. CML은 필라델피아 염색체와 관련이 있으며, 이는 9번 염색체의 BCR 유전자와 22번 염색체의 ABL 유전자가 상호전위한 것으로서, 결과적으로 BCR-ABL이라는 타이로신 인산화효소(tyrosine kinase) 활성을 갖는 새로운 융합단백질이 생성되는 것이다. CML에 선택적인 항암치료제인 글리벡(Gleevec)은 바로 BCR-ABL 융합 단백질을 표적으로 하여 인산화효소의 활성을 차단함으로서 CML의 성장과 분열을 억제하는 항암 화합물이다.

BubR1 (BUB1B)이라는 세린/쓰레오닌(serine/threonine) 인산화효소는 유사분열기를 조절/통제하는 세포주기의 핵심 체크포인트 단백질로 잘 알려져 있으며 본 발명자들은 BubR1 새로운 림프종억제 단백질로서의 기능을 규명하여 보고한 바 있다. 뿐만 아니라 해외의 많은 연구 그룹에 의해서 BubR1 단백질의 비정상적인 조절이나 유전적 또는 유전적 이외의 요인에 의해서 불활성화 되거나 기능의 결손에 의해서 암 발생, 노화의 촉진, 유전질환의 발생과 같은 인간의 치명적인 질병을 유발한 다는 것이 보고되고 있다. 또한 본 발명자들은 'yeast-two hybrid'라는 연구 기법을 이용하여 BubR1의 새로운 결합단백질을 발굴해 내었으며, 발굴된 단백질은 Pellino 1 (또는 Peli 1)이라는 유전자이다. Pellino 1 유전자에 대한 생체 내에서의 정확한 기능은 아직 거의 알려진 바 없으며, 최근에 두 편의 타 연구자에 의한 논문에서 염증 유발 사이토카인의 생성과 관련되어 있다는 내용이 발표되었을 뿐이다.

이와 같이, 특정 유전자를 표적으로 한 특정 림프구계 림프종에 선택적이고, 특이적인 진단 방법이 필요한 배경하에 본 발명자들은 이러한 유전자 마커를 찾기 위해 예의 노력한 결과, Pellino 1 단백질의 발현이 암의 병기와 악성도가 높아질수록 발현 빈도가 의미 있게 증가하는 것을 확인함과 동시에, Pellino 1을 발현하는 B 세포 림프종 환자와 Pellino 1을 발현하지 않는 B 세포 림프종 환자의 예후(치료후 누적 생존율)를 분석했을 때에 Pellino 1을 발현하는 B 세포 림프종 환자의 누적 생존율이 약 40% 정도 감소하는 중요한 결과를 도출하였다. 이에 본 발명자들은 Pellino 1 단백질이 림프종의 진단 마커’로서의 효능성 이외에도 림프종 환자의 예후’를 판단할 수 있는 마커로서 사용가능함을 실험을 통해 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 Pellino 1(Genbank ID : 57162) 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 림프종의 진단 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 포함하는 림프종의 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Pellino 1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 림프종 의심환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 림프종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 Pellino 1 단백질에 특이적인 항체를 림프종 의심환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 림프종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 목적은 a) 림프종 세포에 림프종 치료용 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 pellino 1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) pellino 1유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계를 포함하는, 림프종 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 Pellino 1(Genbank ID : 57162) 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 림프종 진단 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 림프종의 발병 여부를 확인하는 것이다. 본 발명에서 용어 "예후"란 림프종의 치료 후 해당 개체의 재발, 전이, 약물 반응성, 내성 등과 같은 여부를 판단하는 것을 의미한다. 바람직하게 본 발명의 항-Pellino 1 항체를 이용하는 경우, 개체의 시료로부터 Pellino 1 발현 수준을 확인함으로써 해당 개체의 림프종의 발병 여부 뿐만 아니라, 향후 해당 개체의 60개월 이상 생존 예후가 좋을 것인지 여부에 대해서 까지 예측이 가능하다.

본 발명에서 용어, "진단 또는 예후 예측용 마커, 진단 또는 예후를 예측하기 위한 마커"란 림프종 세포를 정상세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상세포에 비하여 림프종을 가진 환자에서 증가 양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA), 지질, 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등)등과 같은 유기 생체 분자들이다. 본 발명의 목적상 림프종의 진단 또는 예후 예측용 마커는 Pellino 1으로, 림프종에서 발현이 증가하는 유전자이다.

본 발명에서 용어 "Pellino 1"이란 세린/쓰레오닌 인산화 효소인 BubR1에 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자로서, 생체 내 기능에 대해서 잘 알려져 있지 않은 유전자로서, 본 발명자들에 의해 림프종과의 관계가 최초로 규명된 것이다. Pellino 1의 서열은 공지의 유전자 데이터베이스로부터 당업자가 자유롭게 획득할 수 있다. 바람직하게는 NCBI GenBank의 Gene ID 57162일 수 있다.

본 발명에서 용어 "림프종"이란 면역세포인 B-림프구, T-림프구, 자연살해세포, 림프구 또는 조직구에서 기원하는 림프세포 증식 질환을 의미하며, 그 예로 이에 제한되는 것은 아니나, 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종 또는 B세포 림프종일 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면 B세포 림프종에서 Pellino 1의 발현이 특이적으로 증가함을 확인하였고(표 1), Pellino 1 발현 양성 환자의 경우 생존률이 40% 감소한 것을 확인할 수 있었다(도 3). 아울러, 마우스 각 조직에서 Pellino 1의 mRNA 수준을 비교한 결과, 기관, 림프절, 흉선과 같이 면역세포가 많이 존재하는 조직에서 Pellino 1의 발현이 높은 것을 확인할 수 있었다(도 4). 이는 Pellino 1이 면역세포 유래의 상기 림프종의 진단 또는 예후 예측용 마커로 사용될 수 있음을 시사하는 것이다.

본 발명에서 용어, "mRNA 발현 수준 측정"은 림프종을 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석방법으로는 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(northern blotting), 또는 DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 본 발명에서 유전자의 mRNA 수준을 측정하는 제제는 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브이며, 상기 림프종의 마커로 사용되는 Pellino 1 유전자들의 핵산 서열이 유전자 은행에 등록되어 있어 밝혀져 있으므로 당업자는 상기 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.

본 발명에서 용어, "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서, 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브 유닛간 백본을 갖는 올리고머를 지칭한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다. 이 안티센스 올리고머는 mRNA의 번역을 차단 또는 저해하고 mRNA의 스플라이스 변이체를 생산하는 mRNA의 프로세싱 과정을 변화시킬 수 있다.

본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3`hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시할 수 있다. 본 발명에서는 상기 본 발명 마커 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 림프종 여부를 진단하거나 예후 예측이 가능하다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명에서 용어, "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 표지(Labelling)되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인 할 수 있다. 프로브는 올리고 뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 본 발명의 마커 폴리뉴클레오티드와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 림프종의 진단 또는 예후를 예측할 수 있다.적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 또는 프로브는 포스포르 아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미 데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명에서 용어, "단백질의 발현 수준을 측정하는 제제"는 림프종의 진단 또는 예후 예측을 위하여 생물학적 시료에서 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용해 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴블롯팅(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역 확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역 침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, "항체"란 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 마커에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩티드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 등의 특수항체도 포함된다. 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

바람직하게 본 발명에서는 Pellino 1 항체를 이용하여 미만성 대세포성 B세포 림프종 환자의 면역조직화학 염색 시 Pellino 1 항체에 의해 조직의 5%이상의 염색되는 경우, 상기 질환의 발병 개체로 판정하였으며(도 2), Pellino 1 단백질의 발현 양상이 증가할수록 발병 개체의 60 내지 70개월의 생존율이 약 40% 정도 감소하는 것을 확인하였다(도 3).

또 하나의 양태로서, 본 발명은 상기의 조성물을 포함하는 림프종 진단 또는 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

상기 림프종은 상기에서 설명한 종류의 질병을 포함할 수 있다.

본 발명의 키트는 마커 단백질에 해당하는 Pellino 1 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준을 확인하여 이를 검출함으로써 림프종의 진단 및 예후 예측을 할 수 있다. 본 발명의 마커 검출용 키트에는 림프종 진단 및 예후 예측을 위한 프라이머 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액, 또는 장치가 포함될 수 있다.

구체적인 일례로서, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 마이크로어레이 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 진단 마커 검출용 키트일 수 있다. 마이크로어레이 칩 키트는, 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있으며, 본 발명의 마커를 이용하여 당업계에서 통상적으로 사용되는 제조 방법에 의하여 용이하게 제조될 수 있다. 마이크로어레이 칩을 제작하기 위해서, 상기 탐색된 마커를 탐침 DNA 분자로 이용하여 DNA 칩의 기판상에 고정화시키기 위해 파이조일렉트릭(piezoelectric) 방식을 이용한 마이크로피펫팅(micropipetting)법 또는 핀(pin) 형태의 스폿터(spotter)를 이용한 방법 등을 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 마이크로어레이 칩의 기판은 아미노-실란(amino-silane), 폴리-L-라이신(poly-Llysine) 및 알데히드(aldehyde)로 이루어진 군에서 선택되는 활성기가 코팅된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판은 슬라이드 글래스, 플라스틱, 금속, 실리콘, 나일론 막 및 니트로셀룰로스 막(nitrocellulose membrane)으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 마커 유전자들의 코딩에 의해 발현된 단백질 발현 수준을 측정하기 위한 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 및 발색 기질 등을 포함할 수 있다. 상기에서 기질은 니트로셀룰로오스 막, 폴리비닐 수지로 합성된 96 웰 플레이트, 폴리스틸렌 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글라스 등이 이용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시다아제(peroxidase), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase) 등이 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2,2'-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)) 또는 OPD(o-페닐렌디아민), TMB(테트라메틸 벤지딘)가 사용될 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 Pellino 1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 림프종 의심환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및 상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 림프종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로는, 유전자의 발현을 mRNA 수준 또는 단백질 수준에서 검출할 수 있고, 생물학적 시료에서 mRNA 또는 단백질의 분리는 공지의 공정을 이용하여 수행할 수 있다.

mRNA 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 마이크로어레이 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출방법들을 통하여, 정상 대조군 개체와 림프종 의심개체에서의 mRNA 발현양을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 mRNA로의 유의한 발현량의 증감여부를 판단하여 림프종 의심개체의 실제 림프종 발병의 진단 및 예후를 확인할 수 있다. mRNA 발현수준 측정은 바람직하게는, 마커로 사용되는 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하는 역전사효소 중합효소반응법 또는 DNA 마이크로어레이 칩을 이용하는 것이다. 상기의 역전사효소 중합효소반응은 반응 후 전기영동하여 밴드 패턴과 밴드의 두께를 확인함으로써 림프종의 진단 및 예후 예측에 사용되는 마커 유전자의 mRNA 발현 여부와 정도를 확인 가능하고 이를 정상 대조군과 비교함으로써, 림프종 진단 및 예후 예측을 간편하게 할 수 있다.

한편, DNA 마이크로어레이 칩은 상기 마커 유전자 또는 그 단편에 해당하는핵산이 유리 같은 기판에 고밀도로 부착되어 있는 DNA 칩을 이용하는 것으로서, 시료에서 mRNA를 분리하고, 그 말단 또는 내부를 형광 물질로 표지된 cDNA 프로브를 조제하여, DNA 칩에 혼성화시킨 다음 림프종의 진단 및 예후를 예측할 수 있다. 보다 구체적으로 하기의 단계를 포함하여 수행될 수 있다; 개체의 시료로부터 림프종에서 특이적으로 발현되는 마커 유전자의 mRNA를 분리하는 단계; 상기 개체의 시료에서 분리한 mRNA와 정상대조군의 mRNA를 cDNA로 합성하면서 각기 다른 형광물질로 표지하는 단계; 상기 각기 다른 형광물질로 표지된 cDNA를 DNA 마이크로어레이 칩과 혼성화시키는 단계; 및 상기 혼성화된 DNA 마이크로어레이 칩을 분식하여 본원발명에서 개시된 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 정상 대조구의 시료의 해당 유전자의 mRNA 발현 수준과 비교하는 단계. 상기 형광물질은 Cy3, Cy5, FITC(poly L-lysinefluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate), 로다민(rhodamine)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자에게 알려진 형광물질은 모두 사용 가능하다. 또한, DNA 마이크로어레이 칩은 36 k Human V4.0 OpArray 올리고마이크로어레이(Operon, Germany) 또는 Whole human genome oligo microarray(Agilent, USA) 등을 사용할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니며, 본 발명에서 상기 공통적으로 과발현 또는 저발현 유전자가 탑재된 DNA 칩이라면 사용 가능하다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 Pellino 1 단밸질에 특이적인 항체를 림프종 의심 환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및 상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 림프종 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, "개체의 시료"란 마커 유전자의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이제 제한되지 않는다.

바람직하게 상기 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공방법에서 진단 또는 예후 예측을 위한 질병은 상기에서 설명한 바와 같이 림프종은 호지킨 림프종, 비호지킨 림프종, B세포 림프종일 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 상기 분석 방법들을 통하여, 림프종 의심 개체의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 마커 유전자에서 단백질로의 유의한 발현량의 증가여부를 판단하여, 림프종 의심 개체의 실제 림프종 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어, "항원-항체 복합체"란 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

단백질 발현수준 측정은 ELISA법을 이용할 수 있다. ELISA는 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 표지된 항체를 이용하는 직접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항원을 인지하는 항체의 복합체에서 포획 항체를 인지하는 표지된 항체를 이용하는 간접적 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 표지된 또 다른 항체를 이용하는 직접적 샌드위치 ELISA, 고체 지지체에 부착된 항체와 항원의 복합체에서 항원을 인지하는 또 다른 항체와 반응시킨 후 이 항체를 인지하는 표지된 2차 항체를 이용하는 간접적 샌드위치 ELISA 등 다양한 ELISA 방법을 포함한다. 예를 들어, 고체 지지체에 항체를 부착시키고 시료를 반응시킨 후 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 표지된 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키거나 항원-항체 복합체의 항원을 인지하는 항체에 대해 표지된 2차 항체를 부착시켜 효소적으로 발색시키는 샌드위치 ELISA 방법에 의해서 검출할 수 있다. 마커 단백질과 항체의 복합체 형성 정도를 확인하여, 림프종의 진단 또는 예후를 예측할 수 있다.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 웨스턴 블랏을 이용할 수 있다. 시료에서 전체 단백질을 분리하고, 이를 전기영동하여 단백질을 크기에 따라 분리한 다음, 니트로셀루로즈 막으로 이동시켜 항체와 반응시킨다. 생성된 항원-항체 복합체의 양을 표지된 항체를 이용하여 확인하는 방법으로 유전자의 발현에 의해 생성된 단백질의 양을 확인하여, 림프종의 진단 및 예후 예측을 할 수 있다. 상기 검출 방법은 정상 대조군에서의 마커 단백질의 발현량과 림프종 의심개체에서의 마커 단백질의 발현량을 조사하는 방법으로 이루어진다. 단백질 수준은 상기한 마커 단백질의 절대적(예: ㎍/㎖) 또는 상대적(예: 시그널의 상대강도) 차이로 나타낼 수 있다. 또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체를 이용한 면역 조직 염색을 실시할 수 있다. 림프종 의심개체의 조직을 채취 및 고정한 후, 당업계에서 널리 공지된 방법으로 파라핀 포매 블록을 제조한다. 이들을 수 μm 두께의 절편으로 만들어 유리 슬라이드에 붙인 후, 이와 상기의 항체 중 선택된 1개와 공지의 방법에 의하여 반응시킨다. 이후, 반응하지 못한 항체는 세척하고, 상기에 언급한 검출라벨 중의 하나로 표지하여 현미경 상에서 항체의 표지 여부를 판독한다.

또한, 상기 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용할 수 있다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 림프종 진단 및 예후 예측을 확인할 수 있다.

또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 (a) 림프종 세포에 림프종 치료용 후보물질을 처리하는 단계; (b) 상기 후보물질이 처리된 세포에서 pellino 1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현수준을 측정하는 단계; 및 (c) pellino 1 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 대조구와 비교하는 단계를 포함하는,림프종 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

상기 림프종은 이에 제한되는 것은 아니나, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종일 수 있다.

본 발명에서 용어 "대조구"란 림프종에 걸리지 않은 정상개체를 의미한다.

구체적으로, 림프종 치료 후보 물질의 존재 및 부재하에서 Pellino 1의 발현의 증가 또는 감소를 비교하는 방법으로 림프종 치료제를 스크리닝하는데 유용하게 사용할 수 있다. Pellino 1의 농도를 간접적으로 또는 직접적으로 감소시키는 물질은 본 발명에서 개시하고 있는 림프종의 치료제로서 선택할 수 있다. 즉, 림프종 치료 후보 물질의 부재하에 본 발명에서 개시된 림프종 세포에서의 본 발명의 마커 Pellino 1의 발현 수준을 특정하고, 또한 림프종 치료 후보 물질의 존재하에서 본 발명의 마커 Pellino 1의 발현 수준을 특정하여 양자를 비교한 후, 림프종 치료 후보 물질이 존재할 때의 본 발명의 마커의 발현 수준이 림프종 치료 후보 물질의 부재 하에서의 마커의 발현 수준보다 감소시키는 물질을 본 발명에서 개시된 림프종 의 치료제로 예측할 수 있는 것이다.

상기 치료제는 Pellino 1의 발현을 억제할 수 있는 물질은 제한없이 포함되나, 그 예로 화합물, siRNA, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 항체 등 일 수 있다. 본 발명의 일 구현예에 따르면, B 세포 림프종 환자 또는 생존 예후가 나쁜 군에서 Pellino 1의 발현이 높은 것을 확인하여 치료제의 타겟으로 이용될 수 있음을 확인하였다(도 2 및 도 3).

본 발명은 림프종의 진단 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커를 발굴하고 제공함으로써, 상기 림프종의 치료 및 예후관리에 유용한 자료의 지표로 사용될 수 있는 효과를 가진다. 아울러, 본 발명에 따른 림프종의 마커 Pellino 1을 사용하면 상기 림프종의 발병 유무를 정확하고 손쉽게 측정할 수 있으며, 림프종의 치료제 개발연구에 있어 특정 타겟으로 활용할 수 있고 나아가 상기 림프종 형성의 연구에 활용될 수 있다.

도 1은 Pellino 1과 대조군인 동원체(centromere) 유전자의 프로브를 제작하여, 5가지 세포주에서 Pellino 1의 염색체 상에 위치를 확인하기 위해 형광제자리부합법 (FISH)을 수행한 사진이다.
도 2는 미만성대세포성 B형림프종 환자의 조직에서 Pellino 1에 대한 면역조직화학염색 결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 Pellino 1발현 양상에 따른 미만성대세포성 B형 림프종 환자의 예후를 분석한 그래프이다.
도 4는 마우스의 각 조직과 세포에서 Pellino 1 mRNA발현을 비교한 그래프이다.

이하 본 발명을 하기 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

실시예 1: 웨스턴 블랏팅을 통한 Pellino 1의 단백질 발현 비교 분석

5가지 정상세포주와 다양한 암세포주에서 Pellino 1 단백질의 발현을 비교하기 위하여 웨스턴 블랏팅(western blotting)을 수행하였다. 배양된 다양한 세포를 용해 완충액 (lysis buffer;20mM HEPES pH7.6, 250mM NaCl, 1.5mM MgCl₂, 20% glycerol, 0.1% triton X-100, 1mM DTT, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail)을 이용하여 용해하고 원심 분리하여 상층액의 세포 추출물을 얻은 후 정량하였다. 250㎍ 세포 추출물을 8% SDS-PAGE에 전기 영동을 한 뒤 니트로셀룰로오즈 막 (nitrocell㎕ose membrane)으로 전이한 후 막을 5% skim milk가 섞인 TBS-T완충액 (100mM NaCl, 20mM Tris-HCl pH7.4, 0.05% Tween20)으로 1시간 상온에서 블로킹을 하였다. 3% BSA가 섞인 TBS-T완충액에 Pellino 1에 대한 항체를 1:1500으로 희석하여 4℃에서 12시간 이상 반응시킨 후 TBS-T완충액 10분간 3번씩 세척하였다. HRP (horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 블로킹 용액에 1:3000으로 희석하여 상온에서 2시간 동안 반응시키고 TBS-T완충액 10분간 3번씩 세척하였다. ECL 용액을 이용하여 peroxidase를 활성시켜 발색하고 X-ray필름에 감광하였다. 각 밴드 강도를 비교하여 상대적인 Pellino 1 단백질 발현 정도를 하기 표 1에 나타내었다.

웨스턴 블랏팅 (western blotting)으로 통상적인 경우에는 25-50㎍의 세포 추출물로 대부분의 단백질 발현을 확인/식별할 수 있으나, Pellino 1의 경우에는 250㎍의 세포 추출물에서도 많은 세포주에서 발현을 식별할 수 없었다. 단 Pellino 1을 과발현 하고 벡터를 (2㎍/60mm-dish) 세포주에 도입하였을 경우에는 약 10㎍의 세포 추출물에서도 도입된 Pellino 1 유전자의 발현 식별이 동일한 항체로 용이하게 확인되었다. 그렇지만, 세포 내 Pellino 1 단백질은 B세포 림프종 세포주들에서 발현을 식별할 수 있고 상대적으로 높은 수준의 발현을 보였다(표 1).

즉, Pellino 1 단백질이 B 세포 림프종에 특이적으로 발현함을 알 수 있었다.

실시예 2: 반정량 중합효소 연쇄반응( Semi - quantitive RT - PCR )을 통한 Pellino 1의 mRNA 발현 비교 분석

5가지 정상세포주와 다양한 암세포주에서 각각 RNA를 추출하였다. RNAeasy prep KIT (Qiagen)을 사용하여 RNA를 추출한 후 1.2㎍ RNA를 취해 cDNA synthesis kit (promega)를 이용하여 cDNA을 합성하였다. RT-PCR에 사용한 프라이머는 하기와 같다.

<Pellino 1>

정방향 프라이머 : TGTAGTAACTGACACGGTTCCT(서열번호 1)

역방향 프라이머 : TCCATCTGATGTCTTCCATTTGG(서열번호 2)

<GAPDH>

정방향 프라이머 : GGCATGGACTGTGGTCATGAG(서열번호 3)

역방향 프라이머 : TGCACCACCAACTGCTTAGC(서열번호 4)

cDNA를 주형으로 상기 프라이머를 사용하여 94℃ 에서 30초, 60℃ 에서 1분, 72℃ 1분 30초로 하여 28회의 반정량 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. PCR반응 산물 중 10㎕를 취하여 에티듐 브로마이드 존재 하에 12% 아가로즈 겔에서 전기 영동하여 밴드를 관찰하여 비교하였다.

그 결과를 정량화하여 상기 표 1에 나타내었다. 단백질 발현과 동일하게 Pellino 1의 mRNA발현 또한 B세포 림프종 세포주에서 상대적으로 높게 식별되었으며, 단백질 발현의 수준 비교와는 달리 거의 모든 세포주에서 Pellino 1의 mRNA발현을 확인할 수 있었다. 그렇지만, 다른 많은 유전자들과 비교해서는 Pellino 1의 mRNA발현도 현저하게 낮은 수준을 보였다(표 1).

실시예 3: 형광제자리부합법( Fluorescence in situ hybridization ; FISH )를 이용하여 염색체 상에 Pellino 1위치 확인

형광제자리부합법 (Fluorescence in situ hybridization; FISH)를 수행하기 위해 우선 L132, HeLa, amniocyte, 지방조직 유래 줄기세포(adipose-derived stem cell), Ramos인 각 세포주들에 colcemid를 넣고 1시간 동안 재배양 하였다. 배양액을 제거한 후 37℃ 로 예열해둔 저장액(hypotonic solution) (0.8% sodium citrate) 처리한 후 20분간 정치하였다. 세포를 떼어내고 원심분리 한 후 상등액을 제거하고 고정액을 처리하여 10분간 원심분리하였다. 그 후, 상등액을 제거하고 다시 고정액을 처리하여 4℃에서 30분 이상 정치하였다. 10분간 원심분리하고 상등액을 제거하고 고정액을 처리하여 10분간 원심분리하는 과정을 2번 반복한 후, 상등액을 제거하여 고정액을 0.5ml 넣고 슬라이드에 25㎕정도 떨어뜨려 슬라이드 건조기에서 밤새 건조시켰다. 실온에서 1주일 정도 된 슬라이드를 37℃, 2XSSC에 30분간 정치하고 70%, 85%, 100% 에탄올에 2분간 정치한 후 건조시켰다. Pellino 1 또는 동원체 프로브 10㎕을 떨어뜨리고 커버 글래스를 덮는다. 커버 글래스 가장자리를 따라 고무 접착제로 밀봉한 후 75℃에 5분간 정치하였다. 37℃ 밤새 혼성화한 후 커버 글래스를 제거하고 45℃ 50% 포름아마이드/2XSSC (중성)에 10분간 정치하였다. 이를 2회 더 반복한 후 45℃ 2XSSC 5분간 정치하고 45℃ 4XSSC/0.1% tween20에 15분간 정치하였다. 70%, 85%, 100% 에탄올에 1분간씩 정치한 후, 건조하여 DAPI 10㎕을 떨어뜨리고 커버 글래스를 덮고 건조 후 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, 수행한 5가지 세포주에서 염색체 2번에 위치하는 대조군인 동원체와 함께 Pellino 1이 염색체 2번 p13.3좌위에 정상적으로 위치하는 것을 확인하였으며, 어떠한 형태로의 염색체 구조적 이상은 관찰되지 않았다(도 1).

실시예 4: Pellino 1 항체를 이용한 미만성 대세포성 B세포 림프종 환자 검체의 면역조직화학염색 분석

미만성대세포성 B세포 림프종 (Diffuse large B cell lymphoma) 환자의 각 증례당 두 개의 TMA(tissue microarry) 블록을 제작하였다. TMA블록을 4 μm 두께로 박절하여 탈파라핀 과정을 거친 후 에틸 알코올로 단계적으로 함수하였고, 항원회복을 위해 조직 절편을 pH 9.0의 EDTA 완충액에 담가 95℃ 에서 18분간 열처리 하여 실온에서 식힌 후 3% 과산화수소수에 5분간 담갔다. Pellino 1 항체 (rabbit monoclonal, Proteintech, Chicago, IL, USA)를 1:50의 비율로 희석하여 상온에서 30분간 반응시킨 후 ENVISION Flex와 rabbit kit (DakoCytomation, Glostrup, Denmark)를 사용하여 반응시켰다. 5% 이상의 림프종세포의 핵이 갈색으로 염색되는 경우를 양성으로 판정하였다.

그 결과 미만성대세포성 B세포 림프종 환자의 조직에서 Pellino 1이 강하게 핵에 갈색으로 염색되는 것을 확인할 수 있었으며, Pellino 1을 발현하지 않은 대조군과는 현저한 차이를 보였다(도 2).

실시예 5: Pellino 1발현과 B세포 림프종 환자의 임상병리학적 특징의 상호연관성

2003년 2월부터 2008년 1월까지 서울대학교병원에서 미만성대세포성 B세포 림프종으로 진단받은 108명의 환자를 대상으로 하였다. 악성림프종의 진단은 2001년에 발표된 WHO 분류에 따랐으며, 두 명의 혈액 병리 전문의가 판독한 결과지를 참조하여 환자의 성별, 진단 당시 연령, Ann-Arbor병기, IPI(international performance index) 점수, 추적 관찰 기간, 사망 여부, EBV 제자리부합법 (in situ hybridization) 결과를 조사하였다. 이와 같은 임상 병리학적 특징과 Pellino 1의 면역조직화학 염색의 결과 (도 3)의 상관성을 분석하여 하기 표 2에 나타내었다.

그 결과, Pellino 1 발현 양성은 108증례의 환자 중에서 77증례에서 식별되었으며 31증례만이 Pellino 1 발현 음성으로 판정하였다. 특히 B세포 림프종의 병기와 악성도를 분류하는 Ann-Arbor병기와 IPI에서 B세포 림프종의 정도가 심할수록 Pellino 1 발현 양성 증례가 약 30%정도 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 이는 미만성대세포성 B세포 림프종이 악화될수록 Pellino 1 발현이 높음을 나타내는 것이다(표 2).

실시예 6: Pellino 1발현과 미만성대세포성 B세포 림프종 환자의 예후 상관관계분석

SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) 소프트웨어를 이용하여 통계적 분석을 수행하였다. 임상병리학적 요소들과 Pellino 1 발현의 관련성 비교는 각 변수를 범주화 시킨 후 카이제곱 검정과 Fisher's exact test를 이용하여 분석하였고, 생존 분석은 Kaplan-Meier 분석을 이용하였다. 양측성 검정에서 p- value가 0.05 미만인 경우를 통계적으로 유의한 것으로 판정하였다.

통계적 분석 결과를 통해 Pellino 1의 발현이 미만성대세포성 B세포 림프종 환자 예후의 불량도와 밀접한 관계가 있음을 확인하였다. 특히, Pellino 1 발현 음성 환자의 경우에 누적 생존 확률이 60개월까지 큰 변화 없이 유지되어온 반면에 Pellino 1 발현 양성 환자의 경우에는 60~70개월 생존율이 약 40%정도 감소한 것으로 분석되었다(도 3).

실시예 7: 실시간 중합효소 연쇄반응 ( Real - time PCR )을 이용하여 마우스 Pellino 1 mRNA 발현 비교

마우스 각 조직에서 Pellino 1의 mRNA레벨을 비교하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. PCR반응액은 7.5㎕ 2xSYBRGreen PCR Master Mix (Applied Biosystems), Pellino 1, GAPDH의 정방향과 역방향 프라이머 각각 25nM, 10ng cDNA를 넣고 멸균 증류수를 첨가하여 총 15㎕가 되게 하였다. ABI PRISM 7000 (AppliedBiosystems) 기기를 이용하여 50℃ 2분, 95℃ 10분 반응시킨 후 95℃ 15초 60℃ 1분의 2단계를 40주기 반복 반응하여 증폭시키고 역치 주기 값을 측정하여 2^ddCT방법으로 정량화하였다. 다양한 조직에서 Pellino 1의 mRNA발현을 비교해 본 결과 기관 (Trachea), 림프절 (Lymphnode), 흉선 (Thymus)과 같은 면역세포가 많이 존재하는 조직에서 mRNA 발현이 높았으며, 특히 CD8 T세포, CD4 T세포 그리고 LPS (Lipopolysaccharide)를 처리한 대식세포와 같은 면역세포에서 Pellino 1 mRNA 발현이 현저하게 높음을 확인 할 수 있었다. 이는 Pellino 1과 면역세포와의 연관성을 나타내는 것이다. 이 결과는 본 연구팀의 결과와 BioGPS싸이트 (http://biogps.gnf.org)의 자료를 병합한 자료이다(도 4).

<Pellino 1>

정방향 프라이머 TGTAGTAACTGACACGGTTCCT(서열번호 1)

역방향 프라이머 TCCATCTGATGTCTTCCATTTGG(서열번호 2)

<GAPDH>

정방향 프라이머 GGCATGGACTGTGGTCATGAG(서열번호 3)

역방향 프라이머 TGCACCACCAACTGCTTAGC(서열번호 4)

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. Pellino 1(Genbank ID : 57162) 유전자 mRNA 또는 이의 단백질 수준을 측정하는 제제를 포함하는 B세포 림프종의 진단 또는 예후 예측용 조성물.
   
2. 삭제
3. 제1항에 있어서, 상기 유전자의 mRNA의 발현수준을 측정하는 제제는 Pellino 1이 유전자에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머 쌍 또는 프로브를 포함하는 것인 조성물.
   
4. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 Pellino 1의 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 조성물.
   
5. 제1항, 제3항 및 제4항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는 B세포 림프종의 진단 또는 예후 예측용 키트.
   
6. 제5항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 마이크로어레이 칩 키트, DNA 키트 또는 단백질 칩 키트인 것인 키트.
   
7. Pellino 1 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머를 사용하여 B세포 림프종 의심환자의 생물학적 시료로부터 mRNA를 측정하는 단계; 및
   상기 mRNA 수준의 증가를 정상 대조구 시료의 mRNA 수준과 비교하는 단계를 포함하는 B세포 림프종의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법.
   
8. Pellino 1 단백질에 특이적인 항체를 B세포 림프종 의심환자의 생물학적 시료와 접촉시켜 항원-항체 복합체 형성으로 단백질 수준을 확인하는 단계; 및
   상기 단백질 형성량의 증가를 정상 대조구 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 B세포 림프종의 진단 또는 예후 예측을 위한 정보의 제공 방법.
   
9. 제7항 또는 제8항에 있어서, 상기 시료는 개체로부터 분리된 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 뇨, 객담, 림프액 및 세포로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 시료인 것인 방법.
   
10. 삭제
11. 제8항에 있어서, 항원-항체 반응 수준을 비교하는 방법은 웨스턴블롯팅, ELISA, 방사선면역분석, 방사면역확산법, 오우크테로니 면역확산법, 로케트 면역 전기 영동, 조직 면역 염색, 면역 침전 분석, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 중 어느 하나를 이용하는 것인 방법.
    
12. 삭제
13. 삭제

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