CN102639711A

CN102639711A - Ir-a和ir-b的定量用于肿瘤分类

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Publication number: CN102639711A
Application number: CN2010800458931A
Authority: CN
Inventors: 黄家琪; C·莫尔豪斯; K·斯特雷彻; B·W·西格斯; 姚意弘; T·拉瓦尔
Original assignee: MedImmune LLC
Current assignee: MedImmune LLC
Priority date: 2009-10-12
Filing date: 2010-10-11
Publication date: 2012-08-15
Also published as: CN105861698A; MX2012004299A; JP5859970B2; AU2010307020A1; JP2013507144A; EP2488667A4; EP2488667A1; AU2010307020B2; WO2011046871A1; RU2012119469A; US9150927B2; US20120283121A1; BR112012008672A2; CA2777369A1; KR20120093956A

Abstract

不受限制地，本公开涉及用于检测和定量组织样本中胰岛素受体亚型A(IR-A)和/或胰岛素受体亚型B(IR-B)的表达的组合物和方法。本公开还涉及至少部分基于检测和定量组织样本中胰岛素受体亚型A(IR-A)和/或胰岛素受体亚型B(IR-B)的表达的诊断和分类方法。基于这种分类治疗受试者的方法在本文提出的公开的另外方面中。

Description

IR-A和IR-B的定量用于肿瘤分类

【相关申请案的交叉引用】

本申请要求2009年10月12日提交的美国临时申请No.61/250,780的优先权，其全部内容通过引用整体并入。

【序列表】

本申请含有以ASCII格式通过EFS-Web提交并且全部内容通过引用整体并入的序列表。2010年9月8日创建的所述ASCII拷贝命名为MED540.PCT.txt并且大小为48,948字节。

【I.背景】

【公开领域】

不受限制地，本公开涉及用于检测和定量样本(例如组织样本)中胰岛素受体亚型A(IR-A)和/或胰岛素受体亚型B(IR-B)的表达的组合物和方法。本公开还涉及至少部分基于检测和定量样本(例如组织样本)中胰岛素受体亚型A(IR-A)和/或胰岛素受体亚型B(IR-B)的表达的诊断和分类方法。基于这种分类治疗受试者的方法在本文提出的公开的另外方面中。

【相关技术的描述】

胰岛素受体(INSR)是能量代谢调节中牵涉的跨膜酪氨酸激酶受体。INSR包含由单个INSR基因表达的2个亚单位α和β。2种称为IR-A和IR-B的亚型是选择性mRNA剪接的结果。通过选择性剪接由INSR基因转录的mRNA以去除IR-B的mRNA中包含的外显子11产生IR-A(图1A-1B)。因此，IR-A与IR-B不同，因为IR-A在INSRα亚单位的羧基末端缺乏一段氨基酸残基。IR-A和IR-B高于99％相同(图2)。虽然2种亚型的表达谱不同，但是亚型在细胞中共同表达。通过发育阶段和组织特异性因子调节IR-A和IR-B的相对丰度。

例如，IR-A主要在胎儿细胞和癌细胞中表达，而IR-B主要在分化的胰岛素靶细胞中表达。IR-A对胰岛素表现出高亲和力，对IGF-II表现出中间亲和力并且对IGF-I表现出低亲和力。IGF-II以相似亲和力与IGF I型受体(IGF-IR)和IR-A结合。IR-B是胰岛素的高度特异性受体。

目前，缺乏有效且精确的检测方法妨碍了测定患者样本中IR-A和IR-B水平的方法。至今，Sciacca等(Oncogene 21(54)：8240-50；2002年11月28日)描述了具体测量IR-A表达的唯一可用方法。这种方法基于PCR和凝胶分离，然后定性测量所得的带。这种方法十分耗力且并非定量准确，这限制了这种方法用于高通量或临床环境下。

【简述】

需要可根据确定患者的组织是否表达药物的分子靶来预测患者对药物的反应的改进诊断试验。需要一种精确检测和/或定量IR-A和IR-B的表达的方法。能够检测和定量患者样本中每种亚型表达的能力对于为患者提供个人化治疗方案是有用的。这种个人化治疗方案为患者提供了最大化治疗益处的可能，同时将(例如)可能与替代性和低效治疗方案有关的副作用最小化。

本文公开了用于检测和/或定量生物材料样本是否含有表达IR-A和/或IR-B(包括人IR-A和/或IR-B)的细胞的方法和用于这种方法的试剂盒。所述方法部分基于特定寡核苷酸可用于测量组织样本中IR-A和/或IR-B的表达的发现。这些寡核苷酸可用于快速地和定量地区别样本中IR-A和/或IR-B表达的水平以致所述方法可用于高通量和临床环境下。这些组合物和方法可用于分类组织样本(例如肿瘤组织样本)的方法。这种方法的结果可用作分类肿瘤或癌症患者的因子，作为患者将如何对药物，例如INSR、IGF1R或IGF的拮抗剂或激动剂反应的指示。这些方法和所得的分类可用于选择候选者进行治疗的方法和治疗癌症患者的方法。

有用的寡核苷酸可包括可用于选择性扩增IR-A和/或IR-B的合成核酸。这种有用的寡核苷酸可包含含有10-30个连续核苷酸的合成核酸序列，其中公开了所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20个连续核苷酸：(i)SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列；(ii)SEQ ID NO：4、与之互补的序列(SEQ ID NO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列或其变体；(iii)SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列；或(iv)SEQ ID NO：6、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列。合成核酸序列可基本上由以下任一核酸序列组成：(i)SEQ ID NO：3(TGAGGATTACCTGCACAACG)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列或其变体；(ii)SEQ IDNO：4(GATGTTGGGAATGTGACGGT)、与之互补的序列(SEQ IDNO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列；(iii)SEQ ID NO：5(TTGAGGATTACCTGCACAACGT)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列或其变体；或(iv)SEQ ID NO：6(AAACGCAGGTCCCTTGGC)、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列或其变体。

有用的合成核酸序列可为SEQ ID NO：7、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：7或其互补序列杂交的序列或其变体，或SEQ ID NO：8、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：8或其互补序列杂交的序列或其变体。另一有用的合成核酸序列可基本上由SEQ ID NO：7、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：7或其互补序列杂交的序列或其变体，或SEQ ID NO：8、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：8或其互补序列杂交的序列或其变体组成。包含上述任何合成核酸序列的组合物也可用。

本文还公开了一种用于确定生物样本中靶人IR-A核酸序列存在或不存在的引物组，其中所述引物组包含选自包含以下至少一个的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列的至少一个合成核酸序列：(a)INSR基因外显子10的最后50个碱基(SEQ ID NO：1)或其互补核酸序列；和(b)INSR基因外显子12的前60个碱基(SEQ ID NO：2)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：8或其互补序列杂交的序列。合成核酸序列可能具有选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列；SEQ ID NO：4、与之互补的序列(SEQ ID NO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列；SEQ IDNO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列；和SEQ ID NO：6、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列。

本文还公开了一种用于确定生物样本中靶IR-A核酸序列存在或不存在的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本与如上述的引物组接触；和(b)检测和/或定量扩增的靶IR-A核酸序列。例如，生物样本可为组织样本(例如肿瘤样本)或包含源自组织或细胞样本的核酸的样本。

引物组可包括SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列；和SEQ ID NO：4、与之互补的序列(SEQ ID NO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列。在另一实例中，引物组可包括SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列；和SEQ ID NO：6、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列。在一个实例中，基于聚合酶的扩增为定量聚合酶链式反应(q-PCR)。

引物和探针组可包括：SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列或其变体；SEQID NO：4(SEQ ID NO：21)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列或其变体；和SEQ ID NO：7、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：7或其互补序列杂交的序列或其变体，其中所述序列还可包含可检测标记并且可进一步包含猝灭剂。在另一实例中，引物和探针组可包括：SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列或其变体；SEQ ID NO：6、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列或其变体；和SEQ ID NO：8、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：8或其互补序列杂交的序列或其变体，其中所述序列还可包括可检测标记并且可进一步包括猝灭剂。通常，扩增产物小于100个碱基。

有用的合成核酸序列可包含10-30个连续核苷酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20个连续核苷酸：SEQ ID NO：11、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列或其变体；或SEQ ID NO：12、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列或其变体。在一个实例中，核酸序列基本上由SEQ ID NO：11、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列或其变体；或SEQ ID NO：12、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列或其变体；SEQ IDNO：13、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：13或其互补序列杂交的序列或其变体；SEQ ID NO：14、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的序列或其变体或SEQ ID NO：15、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQID NO：15或其互补序列杂交的序列或其变体。包含以上任一或多个合成核酸序列的组合物也可用。

用于确定生物样本中IR-B存在或不存在的引物组可包含含有以下至少一个的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列：(a)INSR基因外显子10的最后50个碱基(SEQ ID NO：1)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的序列，和INSR基因外显子11的碱基(SEQ ID NO：9)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：9或其互补序列杂交的序列或其互补序列，或桥接INSR基因的外显子10和外显子11的序列、与之互补的序列或在严格条件下能够与所述序列或其互补序列杂交的序列；和(b)INSR基因外显子12的前50个碱基(SEQ ID NO：10)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：10或其互补序列杂交的序列或与之互补的序列。引物组可包括至少一个具有选自以下的核苷酸序列的合成核酸序列：SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：11或其互补序列杂交的序列；和SEQ ID NO：12、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列。

用于确定生物样本中靶IR-B核酸序列存在或不存在的方法可包括以下步骤：(c)在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本与以上的引物组接触；和(d)检测和/或定量扩增的靶IR-B核酸序列。例如，生物样本可为包含来自组织样本(例如肿瘤样本)的核酸的样本。在另一实例中，基于聚合酶的扩增可通过定量聚合酶链式反应。引物和探针组可包括：SEQ ID NO：11、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列；SEQ ID NO：12、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列；和SEQ ID NO：13、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：13或其互补序列杂交的序列，所述序列还可能包括可检测标记且可能进一步包括猝灭剂。在另一实例中，引物和探针组可包括：SEQ ID NO：11、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列；SEQ ID NO：12、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列；和SEQ ID NO：14、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的序列。

在另一实例中，引物组可包括：SEQ ID NO：11、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列；SEQ ID NO：12、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列；并且进一步包含SEQ ID NO：15、与之互补的序列、或在严格条件下能够与SEQ ID NO：15或其互补序列杂交的序列，所述序列还可能包括可检测标记且可能进一步包括猝灭剂。通常扩增产物小于100个碱基。

用于确定生物样本中靶IR-A和IR-B核酸存在或不存在的方法可包括以下步骤：在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本与上述的IR-A引物组接触；在适于通过聚合酶反应扩增的条件下使生物样本与上述的IR-B引物组接触；和检测和/或定量扩增的靶IR-A和IR-B核酸序列。所述方法可进一步包括计算IR-A和IR-B的相对表达水平。

用于确定生物样本中IR-A存在或不存在的试剂盒可包含至少一个上述的合成核酸序列和进行本文所述一种或多种方法的说明。在这种试剂盒中，所述至少一个合成核酸序列可具有选自本文公开的IR-A引物和探针或其任何组的核苷酸序列。试剂盒还可包括适合的PCR试剂；并且任选地，用于确定IR-A存在或不存在的阳性和/或阴性对照。

用于确定生物样本中IR-B存在或不存在的试剂盒可包含至少一个上述的合成核酸序列和进行本文所述一种或多种方法的说明。在这种试剂盒中的合成核酸序列可具有选自IR-B核酸的核苷酸序列。试剂盒还可包括适合的PCR试剂；并且任选地，用于确定IR-B存在或不存在的阳性和/或阴性对照。

用于选择对IGFI/II配体、INSR或IGFR1受体拮抗剂或激动剂反应的患者的方法可包括从患有或怀疑患有癌症的受试者获得生物样本；和检测和/或定量样本中IR-A的存在。IR-A的存在或不存在为关于是否应向受试者施用IGFI/II配体、INSR或IGFR1受体拮抗剂或激动剂的指标。因此，治疗患者的方法可包括检测和/或定量已从患者获得的患者中IR-A的存在和向患者施用IGFI/II配体、INSR或IGFR1受体拮抗剂或激动剂。例如，IGFI和II配体、INSR或IGFR1受体拮抗剂可为抗体。

可根据IR-A和/或IR-B的表达或按照IR-A和IR-B的相对量为肿瘤分类。用这种方式为肿瘤分类提供了鉴定具有过表达的IR-A和/或IR-B或改变了IR-A相对于IR-B的量或反之亦然的肿瘤的能力。为肿瘤分类的方法可包括定量肿瘤组织样本中IR-A和/或IR-B的表达或IR-A相对于IR-B的量或反之亦然，和根据定量指定分类。治疗患有肿瘤的患者的方法可包括通过定量肿瘤组织样本中IR-A和/或IR-B的表达或IR-A相对于IR-B的量或反之亦然为肿瘤分类；根据定量IR-A和/或IR-B的表达或IR-A相对于IR-B的量或反之亦然指定分类；和根据分类向患者施用IGFI/II配体或IGFR1受体拮抗剂或激动剂。

【附图说明】

图1A-1B说明了IR-A和IR-B。图1A示出了IR-A和IR-B的基因组结构。图1B呈现了INSR同型二聚体的α和β亚单位的示意图，左侧示出外显子位置，且右侧示出功能结构域。

图2示出了人IR-A(SEQ ID NO：16)和IR-B(SEQ ID NO：17)的序列比对，证明除了从IR-A去除了外显子11外，序列相同。

图3示出了IGF-1R/IR受体的示意图，说明了强弱配体相互作用。

图4示出了用于实例IR-A检测的引物和探针位置的示意图。

图5示出了用于实例IR-A检测的引物和探针位置的示意图。

图6示出了用于实例IR-B检测的引物和探针位置的示意图。

图7示出了用连续稀释约10⁷的10个拷贝的IR-A、IR-B质粒DNA或空载体对照进行的IR-A或IR-B qRT-PCR检测的结果。Y轴代表循环阈值(Ct)而X轴代表DNA拷贝数的对数。IR-A检测的标准稀释曲线的斜率和相关系数(r²值)分别为-3.259和0.9992。IR-B检测的标准稀释曲线的斜率和相关系数(r²值)分别为-3.155和0.9989。

图8示出了与正常乳腺组织相比，原发性乳腺癌中胰岛素受体及其亚型的相对mRNA表达水平。TaqMan基因表达检测确定了正常(n＝19)和肿瘤(n＝42)乳腺组织样本之间INSR(总)、IR-A和IR-B的相对量(RQ)差异(log₂-基本比率)。平均正常ΔCt值用于计算每种样本的倍数变化差异。双尾韦尔奇t检验分析(two-tailed Welch′s t-testanalysis)鉴定了对于INSR和IR-B而言正常和肿瘤样本之间的显著性差异(P＜0.001)，而对于IR-A而言未观察到差异(P＝0.45)。条形代表特定基因靶和组织类型组合中的中值log₂ RQ。

图9示出了匹配的正常乳腺和乳腺癌样本中IR-A表达的比例。通过2^(-ΔCt)计算确定样本中胰岛素受体亚型-A(IR-A)相对于总胰岛素受体组合物(即，IR-A+IR-B)的比例。成对样本t检验分析表明在匹配的正常和肿瘤样本之间的计算IR-A比例存在显著性差异(P＜0.001)。黑色条形代表正常(46.60±4.74，平均％±95％CI)和肿瘤(75.24±5.03，平均％±95％CI)组织中的中值IR-A比例(％)。

图10示出了原发性乳腺癌中IR-A∶IR-B比值增加。计算正常(n＝19)和肿瘤(n＝42)乳腺样本中胰岛素受体亚型IR-A和IR-B的ΔCt差异。为了归一化，利用样本内参考基因组(平均Ct)为所有样本计算ΔCt差异(IR-A ΔCt-IR-B ΔCt)值。双尾韦尔奇t检验分析鉴定了与观察到的IR-A∶IR-B ΔCt差异相关的正常和肿瘤样本之间有显著性差异(P＜0.001)。黑色条形代表特定组织类型中的IR-A∶IR-B ΔCt中值差异。

图11示出了来自qPCR cDNA阵列的乳腺癌样本中IR-A∶IR-B比值增加。计算正常(n＝15；来自10个独立供体的样本)、乳腺癌cDNA组(n＝165)和来自这些cDNA组的雌激素受体(ER)过表达＞2倍的乳腺肿瘤(n＝83)中胰岛素受体亚型IR-A和IR-B(Y轴)的ΔCt差异。为了归一化，利用样本内参考基因组(平均Ct)为所有样本计算ΔCt差异(IR-A ΔCt-IR-B ΔCt)值。双尾韦尔奇t检验分析鉴定了与观察到的IR-A∶IR-B ΔCt差异相关的正常和肿瘤样本之间有显著性差异(P＜0.001)。条形代表特定组织类型中的IR-A∶IR-B ΔCt平均差异。

图12示出了IR-A∶IR-B ΔCt差异与增殖基因表达的相关性。计算的IR-A∶IR-B ΔCt差异(Y轴)和增殖标记物(AURKA、BIRC5、CCNB1、KI67和MYBL2)的混合组(X轴)之间相关性的线性回归分析。通过取所有标记物的平均ΔCt为特定样本计算增殖组汇总值。呈现了正常和肿瘤样本的汇总结果。线性回归分析结果表明了两个汇总值之间的正相关性(调节R²＝0.595)。

图13(A和B)示出了ER+乳腺癌的亚型的IR-A∶IR-B ΔCt差异。通过基于缩小重心分类的方法(A)和双样本韦尔奇t检验分析(B)确定关于样本亚型(正常、管状A型或管状B型)分类的IR-A∶IR-B ΔCt计算差异的散点示意图。所有亚型成对比较显示显著性差异(双样本t检验，p＜0.001)。条形代表特定样本亚型中的IR-A∶IR-B ΔCt中值差异。

【发明详述】

本文提及以下引物和探针序列。

SEQ ID NO：1(TTTAGGAAGA CGTTTGAGGA TTACCTGCACAACGTGGTTT TCGTCCCCAG)INSR外显子10C端

SEQ ID NO：2(GCCATCTCGG AAACGCAGGTCCCTTGGCGA TGTTGGGAAT GTGACGGTGGCCGTGCCCAC)INSR外显子12N端

SEQ ID NO：3(TGAGGATTACCTGCACAACG)IR-A引物

SEQ ID NO：4(GATGTTGGGA ATGTGACGGT)IR-A引物(反向互补序列SEQ ID NO：21)

SEQ ID NO：5(TTGAGGATTA CCTGCACAACGT)IR-A引物

SEQ ID NO：6(AAACGCAGGTCCCTTGGC)IR-A引物(反向互补序列SEQ ID NO：22)

SEQ ID NO：7(TCCCCAGGCCATCT)IR-A探针

SEQ ID NO：8(TTTTCGTCCCCAGGCCA)IR-A探针

SEQ ID NO：9(AAAAACCTCT TCAGGCACTGGTGCCCAGGA CCCTAG)INSR外显子11

SEQ ID NO：10(GCCATCTCGG AAACGCAGGTCCCTTGGCGA TGTTGGGAAT GTGACGGTGG)INSR外显子12N端

SEQ ID NO：11(CGTCCCCAGAAAAACCTCTTC)IR-B引物

SEQ ID NO：12(GGACCTGCGTTTCCGAGAT)IR-B引物

SEQ ID NO：13(ACTGGTGCCGAGGAC)IR-B特异性探针

SEQ ID NO：14(CCGAGGACCCTAGGC)IR-B特异性探针

SEQ ID NO：15(TGCCGAGGACCCTAG)IR-B特异性探针

更多引物和探针序列包括表3和4中的序列。技术人员将能够从本文公开的引物中选择能够在PCR反应中扩增核酸序列(例如，与相反链退火并朝正确方向引发DNA合成)的引物对。技术人员将理解这种引物的互补序列可用作(例如)阴性对照。

尽管IR-A和IR-B之间具有高度序列同一性，但是这些核酸序列和本文所述的相关序列可用于检测以检测和定量样本中人IR-A和人IR-B的表达。因此，已经首次发现了确定样本中IR-A和/或IR-B的表达的快速且灵敏方法。使用这些序列的所述方法在定量上精确，允许将其用于高通量和临床环境下。

可用于鉴定试样中IR-A和/或IR-B的表达的合成核酸序列或寡核苷酸可为DNA、RNA、其嵌合混合物或衍生物或可在碱基部分、糖部分或骨架被修饰的修饰形式，并且可包括其它附加基团、标记或猝灭剂，只要它们仍然能够在所需反应中起作用。合成核酸序列可包含至少一个修饰的磷酸酯骨架-例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二氨基磷酸酯、甲基磷酸酯、烷基磷酸三酯及其formacetal或类似物。

(iv)IR-A核酸序列】

适合的IR-A合成核酸序列包括表3和4中出现的序列。

包含在INSR基因外显子10的最后50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQ ID NO：1)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的序列，和INSR基因外显子12的前60、55、50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQ ID NO：2)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：2或其互补序列杂交的序列中出现的IR-A核酸序列的合成核酸可用于基于聚合酶的扩增和检测，例如定量聚合酶链式反应(qPCR)(也称为实时PCR或动力学PCR)以确定样本中IR-A的表达水平。

包含IR-A序列的合成核酸可包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续核苷酸：

(iv)SEQ ID NO：3(TGAGGATTAC CTGCACAACG)、与之互

补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补

序列杂交的序列；

(ii)SEQ ID NO：4(GATGTTGGGA ATGTGACGGT)、与之互补的序列(SEQ ID NO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列；

(iii)SEQ ID NO：5(TTGAGGATTA CCTGCACAAC GT)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列；或

(iv)SEQ ID NO：6(AAACGCAGGT CCCTTGGC)、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列。

在一个实例中，用于确定生物样本中靶IR-A核酸序列存在或不存在的引物组可包含可能选自含以下至少一个的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列的至少一个合成核酸序列：(a)INSR基因外显子10的最后50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQ ID NO：1)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的序列；和(b)INSR基因外显子12的前60、55、50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQ ID NO：2)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：2或其互补序列杂交的序列。引物组可包括(i)SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列和SEQ ID NO：4、与之互补的序列(SEQ IDNO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列或(ii)SEQ ID NO：5或其互补序列和SEQ ID NO：6、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列。通常引物组用于PCR中以产生约50-150bp的产物。探针可包含SEQ ID NO：7或8或在严格条件下能够与SEQ ID NO：7或8或其互补序列杂交的序列，并且还可能包含适当的标记和猝灭剂组合。

例如，可用于定量聚合酶链式反应(qPCR)的引物组包括：

SEQ ID NO：3或与之互补的核酸序列；

SEQ ID NO：4或与之互补的核酸序列(SEQ ID NO：21)；和具有也可能包括猝灭剂的可检测标记的另外的合成核酸或探针。在一个实例中，另外的核酸为10-50个核苷酸之间的单链核酸序列并且设计为特异性结合SEQ ID NO：3和4的两个PCR引物之间的IR-A cDNA的DNA序列或其互补序列。另外的核酸通常具有在5’和3’末端共价连接的荧光报告子或荧光团(例如6-羧基荧光素(FAM)或四氯荧光素(TET))和猝灭剂(例如四甲基若丹明(TAMRA))。在该实例中，仅特异性PCR产物产生荧光信号。在该实例中，另外的核酸可为10-50个碱基并且包括SEQ ID NO：7或在严格条件下能够与SEQ ID NO：7或其互补序列杂交的序列的至少5-14个碱基。

在另一实例中，引物组包含：

SEQ ID NO：5或与之互补的核酸序列；

SEQ ID NO：6或与之互补的核酸序列(SEQ ID NO：22)；和具有也可能包括猝灭剂的可检测标记的另外的核酸。另外的核酸可为10-32个核苷酸之间的单链核酸序列并且设计为仅结合SEQ ID NO：5和6的两个PCR引物之间的IR-A cDNA的DNA序列或其互补序列。在该实例中，另外的核酸可为10-32个碱基并且包括SEQ ID NO：8或在严格条件下能够与SEQ ID NO：8或其互补序列杂交的序列的至少5-14个碱基。

【B.IR-B核酸序列】

适合的IR-B合成核酸序列包括表3和4中出现的序列。

在(a)外显子10的最后50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQID NO：1)或其互补序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的序列，和INSR基因外显子11(SEQ ID NO：9)或与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：9或其互补序列杂交的序列，或桥接外显子10和11的序列或在严格条件下能够与桥接外显子10和11的区域或其互补序列杂交的序列；和(b)INSR基因外显子12的前50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQ ID NO：2)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列中出现的IR-B核酸序列可用于本文公开的方法(特别是基于PCR的方法)以确定IR-B的表达水平。

在一个实例中，包含IR-B序列的合成核酸可包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个连续核苷酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个连续核苷酸：

(ii)SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列；或

(ii)SEQ ID NO：12、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：12或其互补序列杂交的序列。

在另一个实例中，用于确定生物样本中靶IR-B核酸序列存在或不存在的引物组可包含可能选自含以下至少一个的10-27个连续核苷酸的合成核酸序列的至少一个合成核酸序列：(a)INSR基因外显子10的最后50个碱基(SEQ ID NO：1)和外显子11的最后50个碱基(SEQ IDNO：9)中50、45、40、35、30、25或20个碱基或与之互补的序列；和(b)INSR基因外显子12的前50、45、40、35、30、25或20个碱基(SEQ ID NO：10)或与之互补的序列。引物组可包括选自以下的核苷酸序列：SEQ ID NO：11或与之互补的合成核酸序列；和SEQ ID NO：12或与之互补的合成核酸序列。

当引物组用于PCR(例如qPCR)时，引物组可包括SEQ ID NO：11或与之互补的合成核酸序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：11或其互补序列杂交的序列；SEQ ID NO：12或与之互补的合成核酸序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：12或其互补序列杂交的序列；和包含也可能包括猝灭剂的可检测标记的另外的核酸。另外的核酸可为10-27个核苷酸之间的单链核酸序列并且设计为特异性结合SEQ IDNO：11和12的两个PCR引物之间的IR-B cDNA的DNA序列或其互补序列，或在严格条件下能够与该区域或其互补序列杂交的序列。例如，另外的核酸可为10-27个碱基并且包括SEQ ID NO：13的或其互补序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：13或其互补序列杂交的序列的至少5-14个碱基。另外的核酸可为10-30个碱基并且包括SEQ IDNO：14的或其互补序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的序列的至少5-14个碱基。在又一实例中，另外的核酸可为10-30个碱基并且包括SEQ ID NO：15的或其互补序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：15或其互补序列杂交的序列的至少5-14个碱基。另外的核酸通常具有在5’和3’末端共价连接的荧光报告子或荧光团(例如6-羧基荧光素(FAM)或四氯荧光素(TET))和猝灭剂(例如四甲基若丹明(TAMRA))。

有用的合成核酸序列还包括上述公开序列的变体或与本文公开的核酸大体上相似的序列。变体包括由一个或多个碱基，例如2、3、4、5、6、7、8、9或10个碱基改变，但是仍然可与目标IR-A靶序列上的特异性位置退火的序列。当涉及退火或杂交使用时，术语“大体上相似”指合成核酸序列(例如引物)应充分互补以在严格条件下与各自的核酸杂交或退火。合成核酸序列不必反映其各自核酸的准确序列，并且事实上可为“简并序列”。非互补碱基或其它序列可散布于合成核酸序列中，条件是合成核酸序列与所述序列有充分互补性以允许杂交。因此，举例而言，可选择用于PCR扩增的引物与待扩增的特异性序列“大体上”互补。

如本文所使用的术语“杂交”指核酸链与互补链通过碱基配对连接的过程以及例如在PCR技术中进行的扩增过程。能够与指定核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列通常在功能上相当并且为了本文所述方法的目的可取代为该核苷酸序列。

因此，虽然本公开鉴定了已经发现特别灵敏且具特异性的特异性引物和探针，但是本领域的技术人员应了解有用的引物包括在与本文公开的示例性引物大约相同位置上可引发聚合酶反应的任何引物。即，引发INSR基因外显子10和外显子12的聚合反应的引物可用于扩增诊断序列。跨越IR-B序列中外显子10-外显子11的引物可用于特异性扩增IR-B序列。类似地，可合成区别IR-A和IR-B的另外的探针以特异性结合扩增的IR-A或IR-B靶序列。通常，包含更多互补残基的较长序列可含有更大变异。

“严格杂交条件”可为任何低严格性条件、中等严格条件和高度严格条件。通常，“低严格性条件”为(例如)：在32℃下在包含5xSSC、5xDenhart溶液、0.5％(w/v)SDS和50％(w/v)甲酰胺的溶液中杂交。“中等严格条件”为(例如)：在42℃下在包含5xSSC、5xDenhart溶液、0.5％(w/v)SDS和50％(w/v)甲酰胺的溶液中杂交。“高度严格条件”为(例如)：在50℃下在包含5xSSC、5xDenhart溶液、0.5％(w/v)SDS和50％(w/v)甲酰胺的溶液中杂交。杂交严格性受若干因素影响，例如温度、核酸浓度、核酸长度、离子强度、时间和盐浓度。这些只是将产生不同严格性水平的示例性条件。本领域的技术人员将能够通过适当调节杂交条件，包括在PCR反应中将这种条件调节为所需严格性而实现相似严格性。

可通过使用非特异性核酸裂解化学制品或酶或位点特异性限制性内切酶裂解较大核酸片段；或通过本领域中已知的标准方法，例如通过使用市售的自动化DNA合成器和标准的亚磷酰胺化学法合成来得到合成核酸序列。US 4,458,066中描述了一种在修饰的固体支持物上合成寡核苷酸的方法。

一旦合成了所需的合成核酸，就可通过本领域中已知的方法从合成和处理核酸的固体支持物上裂解合成核酸，以去除存在的任何保护基。然后可通过本领域中已知的任何方法纯化合成核酸，包括提取和凝胶纯化。可通过(例如)用HPLC检查丙烯酰胺凝胶上的寡核苷酸，或通过在260nm下用分光光度计测量光密度确定寡核苷酸的浓度和纯度。

本发明的合成核酸序列可用于用以确定IR-A和IR-B的表达的存在的任何检测中。在一个实例中，例如本文公开的分离核酸可用于扩增过程。扩增指增加体内核酸链的过程。示例性技术为以指数方式扩增核酸分子的PCR。US 4,683,195和US 4,683,202中描述了PCR。PCR广泛用于特异性检测和定量靶核酸序列多核苷酸并且是一种分子生物学的标准方法。PCR可用于确定试样中IR-A和/或IR-B的表达。所述方法使用与IR-A或IR-B分子上的特定位置特异性退火的一对分离核酸序列“引物”。使IR-A或IR-B DNA热变性并且使位于待扩增DNA相反链上的靶序列两侧的两个寡核苷酸杂交。这些寡核苷酸成为与DNA聚合酶一起使用的引物。通过引物延伸复制DNA以产生两条链的第二个拷贝。通过重复热变性、引物杂交和延伸的循环，在约2至4h内可扩增靶IR-A或IR-B DNA百万倍或更多。PCR是必须连同检测技术一起使用以确定扩增结果的分子生物学工具。PCR的优点在于通过在约4h内扩增靶DNA的量一百万倍至十亿倍而提高了灵敏性。

如以下讨论和实例中说明，使用IR-A引物和探针的有用方法为定量PCR。定量PCR指PCR反应与荧光化学法组合以使得能够使用荧光信号的检测实时监控扩增反应的方法。在一个实例中，所述方法使用序列非特异性荧光报告子染料，例如SYBR绿(Wittwer C T等，Biotechniques.1997年1月；22(1)：176-81)。在另一实例中，所述方法使用序列特异性荧光报告子，例如TAQMAN探针(Heid C A等，Genome Res.1996年10月；6(10)：986-94)。PCR循环程序执行期间，使用光源激发样本。在每个反应孔中使用光电探测器或CCD/CMOS相机监控指示生成的PCR扩增产物的量的荧光信号。通过在反应期间监控样本中的荧光，可进行精确的定量测量。基于探针的PCR方法被认为比SYBR绿方法更精确。通常在塑料96或384孔微量滴定板中进行PCR或qPCR，每次反应的体积依次为5-50μl。然而，可在非常小(nl)的体积下进行PCR。

如本文所使用的术语“引物”或“引物对”指用在PCR中以引发聚合反应的短的寡核苷酸(通常为10-30bp)。特异性引物可用于通过引发靶序列中特定位置处的聚合选择待扩增的IR-A或IR-B DNA序列。

本文所述方法提供了一种可重现且强效扩增少量含有IR-A和/或IR-B的DNA的方法。使用本文所述的核酸引物进行qPCR可特异性检测来自0.1pg DNA(1000个拷贝)或35个DNA拷贝的IR-A或IR-B。

生物样本可包含在所述方法的一些实施中首先转录为cDNA的RNA。可使用总细胞RNA、细胞质RNA或聚(A)+RNA。制备总RNA和聚(A)+RNA的方法众所周知并且通常在Sambrook等(1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual(第2版)，第1-3卷，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)和Ausubel 等编(1994，Current Protocols in Molecular Biology，第2卷，CurrentProtocols Publishing，New York)中有描述。优选地，通过Chirgwin等(1987)、Chomczynski & Sacchi(1987)、Sambrook等(1989)或FarrellJr.(1993)所述的技术制备总RNA，并且许多优质商业试剂盒也可用。更优选地，使用Chirgwin等(1987)的硫氰酸胍法制备总RNA。可使用本领域中已知的各种方法检查总RNA的完整性。举例而言，可使用RNA凝胶电泳(例如甲醛/琼脂糖凝胶)或Agilent LabChip分析RNA。对于哺乳动物总RNA而言，两条约4.5和1.9kb的条带应可见；这些条带分别代表28S和18S核糖体RNA，并且这些条带强度的比值通常应为1.5-2.5∶1。

可从许多商业供应商(例如Absolutely RNA^TM Nanoprep，Stratagene；PicoPureTM，Arcturus；Rneasy

Qiagen；RNAqueousTMMicrokit，Ambion)购买用于微量RNA制备的RNA纯化试剂盒。

在温度为约60℃和90℃之间，优选约70℃温度下于适合缓冲液中使用于第一条cDNA链合成的cDNA合成寡核苷酸与RNA杂交约5min，然后在加入逆转录酶之前冷却至约4℃。cDNA合成寡核苷酸与RNA杂交后，合成第一条cDNA链。优选通过逆转录的过程生成cDNA的第一条链，其中按照本领域的技术人员熟知的方法利用逆转录酶由RNA产生DNA。

任何逆转录酶均可用于将RNA转录为DNA，只要酶将脱氧核糖核苷酸加至延伸后的3’端(Varmus，Science 240：1427-1435(1988))并且酶缺乏核糖核酸酶H活性。优选地，逆转录酶缺乏核糖核酸酶H活性但是保持了野生型聚合酶活性，以致可合成较长cDNA。逆转录酶可为莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)逆转录酶或其突变体。逆转录酶可为PowerScript^TM逆转录酶(BD Biosciences Clontech)。逆转录酶可为SuperScript III^TM。

正如本领域的技术人员所了解，采用的逆转录酶的量可变化。通过在适当温度下用逆转录酶孵育(例如)约1h进行逆转录，所述适当温度必须在逆转录酶保持酶活性的温度范围内。可在37℃和55℃之间，优选在37℃和42℃之间进行反应。最优选地，在最佳酶活性，例如约42℃下进行反应。可通过将反应混合物加热至95℃保持约5min以使酶失活，任选地然后于冰上冷却来终止逆转录反应。

【C.IGF拮抗剂/激动剂】

本文所使用的IGF试剂指影响IGF-1R/IR信号转导途径的任何成员的表达或活性的试剂并且包括IGF-1R、IR、INSR或IGFI/II拮抗剂或激动剂。IGF-1R、IR、INSR或IGFI/II拮抗剂或激动剂可为拟肽类、蛋白质、肽、核酸、小分子、抗体或其它候选药物。IGF-R1拮抗剂的实例在本领域中众所周知并且包括拮抗IGF-1R的反义和核酸，例如在Wraight等，Nat.Biotech.，18：521-526(2000)；美国专利No.5,643,788；美国专利No.6,340,674；US 2003/0031658；美国专利No.6,340,674；美国专利No.5,456,612；美国专利No.5,643,788；美国专利No.6,071,891；WO 2002/101002；WO 1999/23259；WO2003/100059；US 2004/127446；US 2004/142895；US 2004/110296；US 2004/006035；US 2003/206887；US 2003/190635；US 2003/170891；US 2003/096769；美国专利No.5,929,040；美国专利No.6,284,741；US 2006/0234239和美国专利No.5,872,241中已描述。

进一步地，US 2005/0255493公开了通过使用短的双链RNA进行RNA干扰来减少IGF-1R表达。另外，已产生靶向IGF-1R在体外和体内具有抗增殖活性的抑制肽(Pietrzkowsk等，Cancer Res.，52：6447-6451(1992)；Haylor等，J.Am.Soc.Nephrol.，11：2027-2035(2000))。已证实IGF-1R的C端肽诱导细胞凋亡并且显著地抑制肿瘤生长(Reiss等，J.Cell.Phys.，181：124-135(1999))。同样，IGF-1R的可溶性形式抑制体内肿瘤生长(D′Ambrosio等，Cancer Res.，56：4013-4020(1996))。例如，在Garcia-Echeverria等，Cancer Cell，5：231-239(2004)；Mitsiades等，Cancer Cell，5：221-230(2004)；和Carboni等，Cancer Res，65：3781-3787(2005)中描述了IGF-1R的小分子抑制剂。

关于小分子抑制剂的公开的更多实例包括WO 2002/102804；WO2002/102805；WO 2004/55022；美国专利No.6,037,332；WO2003/48133；US 2004/053931；US 2003/125370；美国专利No.6,599,902；美国专利No.6,117,880；WO 2003/35619；WO 2003/35614；WO 2003/35616；WO 2003/35615；WO 1998/48831；美国专利No.6,337,338；US 2003/0064482；美国专利No.6,475,486；美国专利No.6,610,299；美国专利No.5,561,119；WO 2006/080450；WO 2006/094600和WO 2004/093781。同样参见WO 2007/099171(双环吡唑抑制剂)和WO 2007/099166(吡唑并吡啶衍生物抑制剂)。同样参见关于AbbottCorporation的分子A-928605(Hubbard等，AACR-NCI-EORTC IntConf Mol Targets Cancer Ther(10月22-26日，San Francisco)2007，Abst A227)。

IGF试剂的实例包括IGF-I/II激动剂或拮抗剂。特异性IGF-II拮抗剂也在本领域中已知并且包括结合IGF-I和/或IGF-II的抗体。WO 2007022172和EP 492552中公开了这种拮抗剂。结合IGF-I和IGF-II的抗体的实例包括WO2007070432、WO05/18671、WO03/093317、WO 05/027970和WO 05/028515中公开的抗体。

用作IGF拮抗剂的抗体的特定实例包括表1和2中列出的那些重链和轻链组分。通过引用整体并入本文的WO2007070432中公开了这些抗体。特定抗体包括称为7.159.1、7.158.1和7.34.1的抗体。以上公开的试剂和抗体整体并入本申请。

表1：抗IGF I/II抗体重链分析

^*井号(#)指种系的间隔并且用于显示表中所示抗体序列的正确比对。

^**上表所示种系序列用于比对目的，并且应认识到每个单独抗体区域存在于体内免疫球蛋白种系DNA片段的可变区内的自身位置上。

表2：抗IGF I/II抗体轻链分析

【D.检测和/或定量IR-A和IR-B表达的方法】

上述IR-A和IR-B合成核酸序列、引物和探针组可用于确定样本中IR-A或IR-B的水平。考虑到检测的灵敏性，本发明的分子可有许多用途。

优选的方法是使用实时聚合酶链式反应，也称为定量实时聚合酶链式反应(各种缩写为Q-PCR、qPCR、qrt-PCR或RTQ-PCR)或动力学聚合酶链式反应(KPCR)。常常，实时PCR与逆转录组合以定量细胞或组织中的信使RNA和非编码RNA。逆转录PCR允许从含有RNA的样本开始，无需预先制备cDNA。实时逆转录PCR常表示为qRT-PCR、RRT-PCR或RT-rt PCR。它使得能够检测和定量DNA样本中一个或多个特异性序列(当归一化为DNA输入或另外的归一化基因时为拷贝绝对数量或相对量)。

步骤按照聚合酶链式反应的一般过程。然而，当反应进展时实时检测扩增DNA。检测实时PCR产物的两种常用方法为：(1)插入任何双链DNA的非特异性荧光染料，和(2)由标记了仅允许在探针与其互补DNA靶杂交后检测的荧光报告子的寡核苷酸组成的序列特异性DNA探针。

荧光报告探针仅检测含有探针序列的DNA，因此使用报告探针显著地提高了特异性，并且使得能够甚至在非特异性DNA扩增存在下定量。荧光探针可用于多重检测-以基于具有不同颜色标记的特异性探针检测相同反应中的若干基因，条件是以相似效率扩增所有靶向基因。

所述方法通常使用在探针的一端具有荧光报告子而在相对端具有荧光猝灭剂的基于DNA的探针。报告子与猝灭剂紧密靠近妨碍了对其荧光的检测；通过聚合酶的5′至3′外切核酸酶活性破坏探针将报告子与猝灭剂分开，并且因此允许不终止发射荧光。因此，由于探针的破坏和报告子的释放，每次PCR循环时报告探针靶向的产物增多引起荧光成比例增强。

照常制备PCR样本，并加入报告探针。当反应开始时，在PCR的退火阶段，探针和引物均与DNA靶退火。

新DNA链的聚合由引物开始，并且一旦聚合酶到达探针，其5′-3′外切核酸酶降解探针，在物理上分离荧光报告子和猝灭剂，引起荧光增强。用实时PCR热循环仪检测和测量荧光，并且将与产物指数增长相对应的几何增长用于确定每个反应中的阈值循环(CT)。

可通过按对数尺度绘制荧光对循环次数的图(那么指数增长量将产生直线)来确定反应指数期存在的DNA相对浓度。确定用于检测背景以上荧光的阈值。来自样本的荧光超过阈值的循环称为循环阈值Ct。指数期每次循环DNA的量理论上加倍并且可计算DNA的相对量，例如Ct比另一样本早3次循环的样本具有2³＝8倍以上的模板。由于所有引物组作用并非同样好，所以必须首先计算反应效率。因此，通过将这作为基数和将循环差异C(t)作为指数，可将起始模板的差异计算为(2x％eff)^Ct。

然后可通过将结果与连续稀释(例如未稀释、1∶4、1∶16、1∶64)已知量的RNA或DNA的实时PCR产生的标准曲线比较来确定RNA或DNA的量。为准确定量基因表达，来自目标基因的RNA的测量量除以相同样本测量中来自管家基因的RNA的量以归一化不同样本之间RNA的数量和质量的可能变化。这种归一化允许准确比较不同样本之间目标基因的表达，条件是在所有样本中用于归一化的参考基因的表达非常相似。

还描述了基于机理的qPCR定量方法，例如MAK2。这些方法不需要定量的标准曲线。这些基于机理的方法使用关于聚合酶扩增过程的知识以产生对原样本浓度的估计。

实时PCR可用于确定相对量和绝对量。相对定量测量目标量的倍数差异(2X、3X等)。绝对定量通过与已知标准比较给出存在的靶分子的准确数量。

【E.肿瘤的诊断分类】

为肿瘤分类的方法可包括提供肿瘤样本；使样本与合成的IR-A特异性寡核苷酸接触；和检测或定量肿瘤中IR-A的量。肿瘤中IR-A的定量可与对照组织样本或正常组织的群体平均比较。例如，乳腺癌肿瘤样本可与来自相同患者的未受影响乳腺的样本或与未受影响的乳腺组织的群体平均比较。IR-A的表达增强表明肿瘤为IR-A表达肿瘤。

为肿瘤分类的方法可选地包括检测和/或定量与对照样本或群体平均相比肿瘤中IR-B的量。因此，为肿瘤分类的方法可包括提供肿瘤样本；使样本与合成的IR-B特异性寡核苷酸接触；和检测或定量肿瘤中IR-B的量。肿瘤中IR-B的定量可与对照组织样本或正常组织的群体平均比较。例如，乳腺癌肿瘤样本可与来自相同患者的未受影响乳腺的样本或与未受影响的乳腺组织的群体平均比较。IR-B的表达增强表明肿瘤为IR-B表达肿瘤。

为肿瘤分类的方法可包括确定IR-A和IR-B的相对表达水平。相对表达可描述为IR-A∶IR-B mRNA的比率或任一个与总IR mRNA的比例的百分比，例如％IR-A。也可用qPCR中阈值循环的差异，例如(IR-A ΔCt)-(IR-B ΔCt)＝ΔΔCt、样本中约等于2^-ΔΔCt的IR-A mRNA与IR-B mRNA的比值描述IR-A和IR-B的相对表达。对于ΔCt计算，可按照内部标准归一化实验Ct值。例如，基因表达组的样本内(即，从与IR-A和/或IR-B表达相同的样本获得的)Ct平均值，例如一个或多个管家基因的平均Ct可用于归一化IR-A和IR-B的Ct值以计算ΔCt值。

为了根据相对于总INSR表达的IR-A百分比为组织样本(例如肿瘤组织样本)分类，首先确定组织类型中IR-A百分比的平均值和标准偏差。在另一种方法中，在统计上确定预选置信区间，例如95％、97.5％、99％或99.9％置信的平均置信范围。然后在组织样本中确定相对于组织样本中总INSR表达的IR-A百分比。如果总INSR表达中IR-A的百分比高于平均值，则可以说组织的IR-A表达比例升高。如果总INSR表达中IR-A的百分比高于1-3个标准偏差，例如2个标准偏差，则可以说样本的IR-A的比例大体上升高。类似地，如果总INSR表达的IR-A百分比高于预选置信水平平均值的置信区间上限，则可以说组织的IR-A百分比异常高。可为组织样本分配分类，超过一类组织平均值的95％、97.5％、99％或99.9％置信区间1、2或3倍。

可选地，可为已知类别的肿瘤确定相对于总INSR mRNA的IR-AmRNA平均百分比和预选置信水平的置信区间。如果测量的组织样本的IR-A百分比属于置信区间，可以说测量与肿瘤分类一致。

例如，已确定95％置信度下正常乳腺组织含有总INSR mRNA中比例为46.6±4.7％的IR-A mRNA。已发现乳腺肿瘤组织相对于总INSR mRNA，含有75.24％IR-A，其中95％置信区间为±5％。已确定这些测量显著不同(p＜0.0001)。可以说高于46.6％的组织样本IR-A百分比表明高于平均的IR-A百分比。然而，将阈值设定为约60％，接近正常和肿瘤组织的平均值之间的中点并且远远超过各自的95％置信范围将使分类错误的样本数量减到最少。熟练的从业者可在47-75％范围内调节阈值，例如选择55％至65％范围内的阈值以促成更高或更低包容性的分类。

如另一实例，可为任何指定类型的正常组织确定IR-A和IR-BΔCt值。确定具有高于1、2、3或更多个低于平均值的标准偏差的(IR-AΔCt)-(IR-B ΔCt)差异的组织样本分类为IR-A表达水平相对于IR-B表达水平不成比例。相反，ΔCt正差异表示IR-B表达水平不成比例。为了说明，在正常和原发性肿瘤乳腺样本中确定IR-A∶IR-B ΔCt差异。对于正常样本(n＝19)而言，平均IR-A∶IR-B ΔΔCt±95％CI为0.20±0.23，而对于原发性肿瘤(n＝42)而言，平均IR-A∶IR-B ΔΔCt差异±95％CI为-1.81±0.27。因此，可以说IR-A∶IR-B ΔΔCt＜约0.2的组织样本具有高于平均的IR-A∶IR-B ΔΔCt，表示IR-A表达的比例高于平均。然而，将阈值设定为约-0.4、-0.6、-0.8、-1.0或-1.2将提供更高的置信水平。将阈值设定为近中点(在该实例中，IR-A∶IR-B ΔΔCt为约-0.7至-0.9)将使错误分类数量减到最少。当然，熟练的从业者可在平均值之间范围内的任何位置调节阈值以平衡对更高或更低包容性分类的需要。因此，将样本分类为IR-A∶IR-B ΔΔCt差异与IR-A相对于IR-B的量改变的乳腺肿瘤组织一致的样本的阈值可基于95％置信区间被设定在0.2至-1.8范围内，例如约0.4和约-1.54之间。

如另一实例，IR-A和IR-B的相对表达可用于为肿瘤亚型分类，例如管状A型和管状B型乳腺癌。例如，比较正常、管状A型和管状B中的IR-A∶IR-B ΔCt差异。在正常样本中(n＝15)平均IR-A∶IR-BΔΔCt±95％CI为0.27±0.30。在管状A型分类的乳腺癌(n＝13)中平均IR-A∶IR-B ΔΔCt±95％CI为-1.09±0.34。在管状B型分类的乳腺癌(n＝27)中平均IR-A∶IR-B ΔΔCt±95％CI为-2.12±0.34。所有亚型成对比较显示显著性差异(双样本t检验，p＜0.001)。因此，正常和管状A型肿瘤组织之间IR-A∶IR-B ΔΔCt分类的阈值可设定在约0.3至-1.4之间的范围内，例如约-0.2、约-0.4或约-0.6。管状A型和管状B型肿瘤组织之间IR-A∶IR-B ΔΔCt分类的阈值可设定在约-1.1至约-2.1之间的范围内，例如约-1.5至-1.75之间的范围或约-1.55、约-1.6、约-1.65或约-1.7。

使用基于GeneChip表达谱的正常、管状A型和管状B型的分类方案，比较正常、管状A型和管状B型分类的肿瘤样本中的IR-A∶IR-BΔCt差异。在正常样本(n＝15)中平均IR-A∶IR-B ΔΔCt±95％CI为0.32±0.25。在管状A型预测乳腺癌(n＝18)中平均IR-A∶IR-BΔΔCt±95％CI为-1.05±0.19。在管状B型预测乳腺癌(n＝22)中平均IR-A∶IR-B ΔΔCt±95％CI为-2.42±0.32。根据该方案，管状A型和管状B型肿瘤组织之间IR-A∶IR-B ΔΔCt分类的阈值可设定为约-1.1至约-2.4之间的范围内，例如在约-1.4至-2.1之间的范围内，或约-1.4、约-1.6、约-1.7、约-1.8或约-1.9。IR-A∶IR-B ΔΔCt可与其它表达谱组合以进一步优化亚型分类。

组织中相对IR-A和IR-B表达水平可用作癌症增殖的预测因子，尤其与癌症增殖的其它预测因子组合，(例如)以确定增殖评分。预测的增殖率可提供关于个体癌症预后和侵袭性的有用信息。以上数据说明IR-A∶IR-B ΔCt差异与增殖评分之间的正相关性。因此，为肿瘤组织评分的方法可包括确定IR-A和IR-B表达的相对比例和至少部分基于IR-A和IR-B的相对表达分配增殖评分。

使用这些方法分类的肿瘤样本可为任何适当的肿瘤样本，包括来自肺部、乳腺、前列腺、结肠、卵巢、胰腺、大脑、食道、子宫内膜、子宫颈、胃肠道或皮肤的样本。可从任何患者获得肿瘤样本，其中单独或部分通过细胞表面受体(例如IGF-R1/IR-A)介导肿瘤活性。例如，肿瘤可为非实体瘤，例如白血病、多发性骨髓瘤或淋巴瘤，或可为实体瘤，例如胆管肿瘤、骨肿瘤、膀胱肿瘤、大脑/CNS肿瘤、乳腺肿瘤、结肠直肠肿瘤、子宫颈肿瘤、子宫内膜肿瘤、胃肿瘤、头颈部肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、肌肉肿瘤、神经元肿瘤、食道肿瘤、卵巢肿瘤、胰腺肿瘤、胸膜/腹膜肿瘤、前列腺肿瘤、肾肿瘤、皮肤肿瘤、睾丸肿瘤、甲状腺肿瘤、子宫肿瘤和外阴肿瘤。在一个实例中，肿瘤为乳腺肿瘤。在另一实例中，肿瘤为膀胱肿瘤。在另一实例中，肿瘤为肝脏肿瘤。

可如本领域已知制备适当的肿瘤样本。例如，可通过针刺活组织检查获得肝脏肿瘤细胞，然后根据标准步骤在体内培养。可选地，可在吸入后立即固定肿瘤细胞，或去除肿瘤(全部或部分)并制备切片用于免疫组织学染色。

体外培养肿瘤细胞将使得能够在刺激后进行内化动力学测量，同时立即固定样本将引起对肿瘤内受体的静态位置进行检测。

【F.治疗方法】

IGF-1受体(IGF-IR)途径复杂并且包括多个参与者(参见图3)。IGF-1R可以并且确实与胰岛素受体(INSR)形成杂交受体。IGF配体、IGF-I和IGF-II主要通过与IGF-IR相互作用和激活各种细胞内信号级联发挥其各种作用。特别地，IGF-I主要通过激活IGF-IR起作用，而IGF-II可通过IGF-IR或通过IR-A亚型起作用。IGF-1R、其IGF配体和IR-A牵涉于许多癌症，包括乳腺癌和前列腺癌，并且已研发了用于癌症治疗的许多拮抗剂以靶向IGF-IR和IGF配体。

考虑到目前可用的靶向IGF途径的大量拮抗剂，需要选择患者有可能对其反应或反应增强的拮抗剂。例如，IGF-1R拮抗剂受到这些拮抗剂并不抑制IR-A途径的限制。考虑到文献表明当IR-A在癌症中过表达时IR-A是造成IGF-1R拮抗剂抗性的原因，人们期望施用不仅靶向IGF-1R，而且靶向IR-A的拮抗剂。抗体中这种拮抗剂的实例特异性靶向IGF-II并且可与IGF-I交叉反应。

IGF-I和II拮抗剂具有抑制IGF-IR和IR-A信号转导的能力，产生临床上比IGF-1R更广泛的活性和与小分子IGF-1R/IR-A/IR-B抑制剂相比更低的毒性。实例包括针对IGF-I和/或IGF-II的抗体，包括WO2007070432中公开的抗体。特别感兴趣的是具有杂交瘤7.159.1、7.158.1和7.34.1产生的抗体的氨基酸序列的抗体。

选择用IGF拮抗剂或激动剂治疗的候选者的患者以预测对特定IGF拮抗剂或激动剂的反应可能性升高的方法可包括使用以上任何方法定量IR-A和/或IR-B表达和选择相对于正常受试者或相对于癌症患者群体表达的IR-A和/或IR-B的量增加或减少的患者。也可根据IR-A与IR-B表达的相对量改变选择患者。

在一个具体实例中，从业者可根据确定肿瘤是否表达IR-A和/或IR-B预选特定IGF拮抗剂。鉴定已经确定过表达IR-A的肿瘤提供了选择对IGFI/II拮抗剂的反应性最有可能升高的患者的机会。

在一个实例中，拮抗剂为包含含有SEQ ID NO：45和53的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。在另一实例中，拮抗剂为包含如表1和2所示SEQ ID NO：45和53的CDR序列的抗体。在另一实例中，拮抗剂包括包含3个来自SEQ ID NO：45的CDR和轻链的抗体。在另一实例中，拮抗剂包括包含3个来自SEQ ID NO：53的CDR和重链的抗体。

所述方法还可用于确定IGF-1R或IGF的特定抑制剂是激活还是抑制胰岛素受体。例如，已知IGF-1R激酶的小分子抑制剂常常交叉抑制胰岛素受体。这可导致代谢并发症。在一个实例中，确定样本(例如肿瘤)中IR-A和/或IR-B的表达并且将它们的表达与对照比较的方法。如果与对照相比IR-B的表达减少并且与对照相比IR-A的表达增加，则可能需要替代性选择IGF拮抗剂，例如IGF-I/II拮抗剂。因此，治疗患者的方法可包括(例如)通过确定来自患者的组织样本的IR-A∶IR-B ΔCt差异来确定IR-A和IR-B的表达，以及如果IR-A相对于IR-B的比例低于阈值则施用IGF-I/II拮抗剂。

在另一实例中，方法允许癌症患者亚组的分类。目前已知IR-A可能在乳腺癌中过表达。选择患者亚组进行治疗的方法可包括鉴定过表达IR-A，或相对于IR-B不成比例表达IR-A和因此对IGF-I/II拮抗剂的反应很可能增强的乳腺癌患者的亚组。治疗对IGF-I/II拮抗剂的反应很可能提高的癌症患者的方法可包括测量肿瘤组织样本的IR-A∶IR-B ΔCt差异，以及如果肿瘤组织样本的IR-A∶IR-B ΔCt差异低于指示高于IR-A相对于IR-B的正常比例的阈值则施用有效剂量的IGF-I/II拮抗剂。拮抗剂的实例包括结合IGF-I和/或IGF-II的抗体。在一个实例中，拮抗剂为包含含有SEQ ID NO：45和53的氨基酸序列的氨基酸序列的抗体。在另一实例中，拮抗剂为包含如表1和2所示SEQ ID NO：45和53的CDR序列的抗体。在另一实例中，拮抗剂包括包含3个来自SEQ ID NO：45的CDR和轻链的抗体。在另一实例中，拮抗剂包括包含3个来自SEQ ID NO：53的CDR和重链的抗体。

所谓反应或反应器增强意味着在施用特定IGF试剂后患者将反应或更积极地反应。可通过根据国际抗癌联盟/世界卫生组织(UICC/WHO)标准测量目标肿瘤反应确定反应器或非反应器。标准分类如下：完全反应(CR)：在所有可评估损害中无残留肿瘤；部分反应(PR)：残留肿瘤，证据是在所有可测量损害总和中在基线以下化疗诱导50％或更多下降并且没有新的损害；稳定疾病(SD)：CR不合格的残留肿瘤；和进展性疾病(PD)：残留肿瘤，证据是在所有可测量损害总和中在基线以下升高25％或更多或出现新的损害。如本文所定义，非反应器为PD。所述方法对于确定为CR或PR的那些患者尤其有效。因此所述方法允许通过为个体患者匹配治疗并且由此更有效利用所述类型的可用IGF拮抗剂改善癌症患者的预后和生活质量。

【G.糖尿病】

用于筛选通过胰岛素受体去除和/或减少信号转导的物质/化合物的方法。确定样本中IR-A或IR-B的相对表达可用作鉴定选择性激活(例如)β细胞和外周组织中的IR-A或IR-B特异性信号级联的试剂(例如小分子化合物和/或胰岛素模拟物)的筛选工具。传统胰岛素靶组织中IR-B的显著表达表明了这些组织中IR-B信号级联的重要性。因此，选择性刺激IR-B信号级联的化合物将提高β细胞的功能(葡萄糖反应性并因此提高胰岛素分泌)，以及外周胰岛素靶组织的功能(葡萄糖摄取和利用、蛋白质合成、脂质合成)并因此可能提供包括非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM、II型糖尿病)的两种主要原因，即外周胰岛素抵抗和β细胞功能障碍的治疗。

因此，鉴定调节胰岛素信号转导的试剂的方法可包括使细胞与试验试剂接触和确定试验试剂是否引起IR-B表达增加或减少。鉴定试剂增加IR-B表达表明试剂可用于治疗II型糖尿病。

【H.试剂盒】

检测生物样本中IR-A或IR-B的存在的试剂盒可包含IR-A和/或IR-B探针或引物。用于本文所述方法的材料非常适合制备试剂盒。例如，试剂盒可包含如本文公开的能够检测肿瘤样本中IR-A或IR-B的核酸序列、对照样本和关于如何检测细胞表面受体的说明。这种试剂盒可包含容器，每个容器具有所述方法中利用的各种试剂的一种或多种(通常呈浓缩形式)，包括(例如)缓冲液、适当的核苷酸三磷酸酯(例如，dATP、dCTP、dGTP和dTTP；或rATP、rCTP、rGTP和UTP)、逆转录酶、DNA聚合酶、RNA聚合酶和一个或多个寡核苷酸。

容器中的寡核苷酸可呈任何形式，例如冻干或溶液形式(例如蒸馏水或缓冲溶液)等。准备好用于相同扩增反应的寡核苷酸可组合在单个容器中或可处于单独容器中。试剂盒任选地进一步包含与单独容器中的对RNA聚合酶启动子具有特异性的RNA聚合酶和/或PCR缓冲液和/或DNA聚合酶。试剂盒任选地进一步包含对照核酸。通常还包括一套说明。

除非另外注明，本文公开的方法采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均在本领域普通技术人员能力范围之内。文献中解释了这些技术。参见，例如，J.Sambrook、E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A LaboratoryManual，第2版，Books 1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995and periodic supplements；Current Protocolsin Molecular Biology，第9、13和16章，John Wiley & Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.C rabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley & Sons；M.J.Gait(编辑)，1984，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；和D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNAMethods in Enzymology，Academic Press。这些一般文本的每一个均通过引用整体并入本文。

以下实例意在用以帮助本领域中的普通技术人员实施本文所述的方法并非旨在以任何方式限制本公开的范围。

【I.示例性实施方案】

下列实施方案为示例性，并且决不限制本公开的范围。

1.一种包含10-30个连续核苷酸的合成核酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20个连续核苷酸：

(i)SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：3或其互补序列杂交的序列；

(ii)SEQ ID NO：4、与之互补的序列(SEQ ID NO：21)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：4或其互补序列杂交的序列；

(iii)SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：5或其互补序列杂交的序列；或

(iv)SEQ ID NO：6、与之互补的序列(SEQ ID NO：22)或在严格条件下能够与SEQ ID NO：6或其互补序列杂交的序列。

2.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由以下任一核酸序列组成的：

3.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO：7、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：7或其互补序列杂交的序列组成。

4.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO：8、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：8或其互补序列杂交的序列组成。

5.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案1-4中任一项所述的合成核酸序列。

6.一种用于检测和/或定量生物样本中IR-A核酸序列的引物组，其中所述引物组包含

(a)包含INSR基因外显子10的最后50个碱基(SEQ ID NO：1)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列；和

(b)包含INSR基因外显子12的前60个碱基(SEQ ID NO：2)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：2或其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列。

7.根据实施方案6所述的引物组，其中至少一个合成核酸序列具有选自以下的核苷酸序列

SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：3或其互补序列杂交的序列；

SEQ ID NO：21、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：21或其互补序列杂交的序列；

SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：5或其互补序列杂交的序列；和

SEQ ID NO：22、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：22或其互补序列杂交的序列。

8.一种用于检测和/或定量生物样本中IR-A核酸序列的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据实施方案6所述的引物组接触；和

(b)检测和/或定量扩增的靶IR-A核酸序列。

9.根据实施方案8所述的方法，其中由肿瘤样本制备所述生物样本。

10.根据实施方案8-9中任一项所述的方法，其中所述引物组包含SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列，和SEQ ID NO：21、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：21或其互补序列杂交的序列。

11.根据实施方案8所述的方法，其中所述引物组包含SEQ IDNO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列，和SEQ ID NO：22、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：22或其互补序列杂交的序列。

12.根据实施方案8-11中任一项所述的方法，其中所述基于聚合酶的扩增为定量聚合酶链式反应。

13.根据实施方案12所述的方法，其中所述引物组包含：

SEQ ID NO：21、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：21或其互补序列杂交的序列；和

SEQ ID NO：7、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：7或其互补序列杂交的序列，所述序列还具有可检测标记。

14.根据实施方案12所述的方法，其中所述引物组包含：

SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：5或其互补序列杂交的序列；

SEQ ID NO：22、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：22或其互补序列杂交的序列；和

SEQ ID NO：8、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：8或其互补序列杂交的序列，所述序列还具有可检测标记。

15.根据实施方案8-14中任一项所述的方法，其中所述扩增产物小于100个碱基。

16.一种包含10-30个连续核苷酸的合成核酸，其中所述合成核酸序列包含以下任一序列的至少10-20个连续核苷酸：

(i)SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：11或其互补序列杂交的序列；或

17.一种基本上由以下任一核酸序列组成的合成核酸序列：

18.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO：13、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：13或其互补序列杂交的序列组成。

19.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO：14、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：14或其互补序列杂交的序列组成。

20.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由SEQ ID NO：15、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：15或其互补序列杂交的序列组成。

21.一种组合物，所述组合物包含根据实施方案1-4和16-20中任一项所述的合成核酸序列。

22.一种用于检测和/或定量生物样本中IR-B核酸序列的引物组，其中所述引物组包含：

(a)(i)包含INSR基因外显子10的最后50个碱基(SEQ ID NO：1)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：1或其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列；

(a)(ii)包含INSR基因外显子11(SEQ ID NO：9)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：9或其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列；

(a)(iii)包含碱基桥接外显子10和11、与之互补的序列或在严格条件下能够与之杂交或其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列；和

(b)包含INSR基因外显子12的前50个碱基(SEQ ID NO：10)、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：10或其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列或与之互补的序列。

23.根据实施方案22所述的引物组，其中至少一个合成核酸序列具有选自以下的核苷酸序列

SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：11或其互补序列杂交的序列；和

SEQ ID NO：12、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：12或其互补序列杂交的序列。

24.一种用于检测和/或定量生物样本中IR-B核酸的方法，所述方法包括以下步骤：

(a)在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据实施方案22或23所述的引物组接触；和

(b)检测和/或定量扩增的靶IR-B核酸序列。

25.根据实施方案24所述的方法，其中所述生物样本是肿瘤样本。

24.根据实施方案24所述的方法，其中所述引物组包含：

和SEQ ID NO：12、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：12或其互补序列杂交的序列。

25.根据实施方案24所述的方法，其中所述基于聚合酶的扩增为定量聚合酶链式反应(q-PCR)。

26.根据实施方案25所述的方法，其中所述引物组包含：

SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：11或其互补序列杂交的序列；

SEQ ID NO：12、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：12或其互补序列杂交的序列；和

SEQ ID NO：13、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：13或其互补序列杂交的序列，所述序列还具有可检测标记。

27.根据实施方案25所述的方法，其中所述引物组包含：

SEQ ID NO：14、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：14或其互补序列杂交的序列，所述序列还具有可检测标记。

28.根据实施方案25所述的方法，其中所述引物组包含：

SEQ ID NO：12、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：12或其互补序列杂交的序列；并且进一步包含

SEQ ID NO：15、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：15或其互补序列杂交的序列，所述序列还具有可检测标记。

29.根据实施方案24-28中任一项所述的方法，其中所述扩增产物小于100个碱基。

30.一种用于确定生物样本中靶IR-A核酸序列和/或靶IR-B核酸序列存在或不存在的方法，所述方法包括：

在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸样本与用于检测/或定量生物样本中的IR-A核酸序列的引物组接触，其中所述引物组包括根据实施方案6所述的引物组，和/或在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸样本与用于检测/或定量生物样本中的IR-B核酸序列的引物组接触，其中所述引物组包括根据实施方案22所述的引物组，和

检测和/或定量扩增的靶IR-A或IR-B核酸序列。

31.一种用于确定生物样本中IR-A的存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个根据实施方案1-15中任一项所述的合成核酸序列和使用说明。

32.根据实施方案31所述的试剂盒，其中所述至少一个合成核酸序列具有选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6的核苷酸序列、与所述序列之一互补的序列或在严格条件下能够与所述序列之一或其互补序列杂交的序列。

33.根据实施方案31所述的试剂盒，其中所述合成核酸序列选自以下引物组：

(1)SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：3或其互补序列杂交的序列；

SEQ ID NO：7、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：7或其互补序列杂交的序列，所述序列还具有可检测标记；或

(2)SEQ ID NO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：5或其互补序列杂交的序列；

34.根据实施方案31所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适合的PCR试剂；并且任选地，用于确定IR-A存在或不存在的阳性和/或阴性对照。

35.一种用于确定生物样本中IR-B存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个根据实施方案16-23中任一项所述的合成核酸序列和使用说明。

36.根据实施方案35所述的试剂盒，其中所述合成核酸序列具有选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的核苷酸序列、与任何所述序列互补的序列或在严格条件下能够与任何所述序列或其互补序列杂交的序列。

37.根据实施方案35所述的试剂盒，其中所述合成核酸序列选自以下引物组：

(1)SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：11或其互补序列杂交的序列；

SEQ ID NO：13、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ IDNO：13或其互补序列杂交的序列，所述序列具有可检测标记；或

(2)SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：11或其互补序列杂交的序列；

具有可检测标记的SEQ ID NO：14；或

(3)SEQ ID NO：11、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：11或其互补序列杂交的序列；

38.根据实施方案35所述的试剂盒，其进一步包含适合的PCR试剂；并且任选地，用于确定IR-B存在或不存在的阳性和/或阴性对照。

39.一种用于选择对IGFI/II配体或IGFR1受体拮抗剂反应的患者的方法，所述方法包括：

根据实施方案8检测和/或定量样本中的IR-A表达

根据实施方案24检测和/或定量样本中的IR-B表达；和

其中所述IR-A和IR-B的表达表明了是否应向受试者施用IGFI/II配体或IGF1R受体拮抗剂。

40.根据实施方案39所述的方法，其中所述IGFI/II配体或IGFR1受体拮抗剂为抗体。

41.根据实施方案40所述的方法，其中所述抗体包含表1和表2中所列的序列组分。

42.一种用于确定生物样本中靶IR-A核酸序列和靶IR-B核酸序列的相对存在或不存在的方法，所述方法包括：

在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据实施方案6所述的引物组接触，

在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据实施方案22所述的引物组接触；

定量扩增的IR-A和IR-B核酸序列；并且

从而确定生物样本中IR-A与IR-B的相对表达。

43.一种为肿瘤分类的方法，所述方法包括：

通过实施方案42所述的方法确定肿瘤样本中IR-A与IR-B的相对表达，

按照包括IR-A和IR-B的相对表达的标准为肿瘤分类。

44.一种选择患者用IGF拮抗剂进行治疗的方法，所述方法包括：

通过实施方案42所述的方法确定患者组织中IR-A与IR-B的相对表达，

按照包括IR-A和IR-B的相对表达的标准为患者分类，从而预测患者对IGF拮抗剂的相对反应性。

45.根据实施方案39、43和44任一项所述的方法，其中IR-A相对于IR-B表达增加。

46.一种使用IGF拮抗剂治疗患者的方法，所述方法包括

通过实施方案42所述的方法确定组织样本中IR-A与IR-B的相对表达，

按照包括IR-A和IR-B的相对表达的标准为患者分类；和

根据分类施用IGF拮抗剂。

47.根据实施方案46所述的方法，其中IR-A相对于IR-B表达增加。

48.根据实施方案44或47所述的方法，其中所述IGF拮抗剂为抗体。

49.根据实施方案40、41和48中任一项所述的方法，其中所述抗体包含含有SEQ ID NO：45和53的氨基酸序列的氨基酸序列。

50.根据实施方案40、41和48中任一项所述的方法，其中所述抗体包含如表1和2所示的SEQ ID NO：45和53的CDR序列。

51.根据实施方案40、41和48中任一项所述的方法，其中所述抗体包含3个来自SEQ ID NO：45的CDR和轻链。

52.根据实施方案40、41和48中任一项所述的方法，其中所述抗体包含3个来自SEQ ID NO：53的CDR和重链。

53.根据实施方案45和47中任一项所述的方法，其中IR-A相对总胰岛素受体的百分比高于46.6％。

54.根据实施方案45和47中任一项所述的方法，其中IRA∶IR-BΔΔCt低于约0.2。

55.根据实施方案45和47中任一项所述的方法，其中对于IR-A的log2基本比率的平均相对量差异为约-.07±0.29，对于IR-B为约-2.08±0.25。

56.一种分类乳腺癌肿瘤亚型的方法，所述方法包括通过实施方案42所述的方法确定乳腺癌肿瘤样本中IR-A与IR-B的相对表达；并且，如果IR-A∶IR-B比例低于阈值将乳腺癌亚型分类为管状B型。

57.根据实施方案56所述的方法，所述方法进一步包括计算IR-A∶IR-B ΔΔCt，其中阈值为设定在约-1.1至约-2.4之间的范围内的IR-A∶IR-B ΔΔCt值。

58.根据实施方案54所述的方法，其中阈值在约-1.4至-2.1之间的范围内。

59.根据实施方案57所述的方法，其中确定IR-A∶IR-B ΔΔCt可与确定亚型分类中的其它表达谱组合。

60.一种确定肿瘤的增殖评分的方法，所述方法包括通过实施方案42所述的方法确定肿瘤样本中IR-A与IR-B的相对表达，和将较高的IR-A∶IR-B比例视为指示较高增殖评分的因子。

61.根据实施方案60所述的方法，所述方法进一步包括计算IR-A∶IR-B ΔΔCt和将较低的IR-A∶IR-B ΔΔCt值视为指示较高增殖评分的因子。

62.一种将乳腺癌样本分类为管状A型或管状B型的方法，所述方法包括确定样本中IR-A和IR-B的相对水平，其中IR-A相对于IR-B的量增加表明肿瘤为管状B型。

【II.实施例】

【实施例1：IR-A和IR-B引物和探针设计】

商业上购买的检测不能区别和定量IR-A和IR-B表达。因此，需要新型探针。从国家生物技术信息中心(NCBI)Entrez核苷酸数据库获得胰岛素受体(INSR)短(NM_001079817)和长(NM_000208)亚型的成熟mRNA转录序列。将INSR短亚型称为IR-A，而INSR长亚型称为IR-B。两种亚型的差异是在成熟转录物中外显子11(36个核苷酸区域)的存在(IR-B中)或不存在(IR-A中)。在成熟mRNA转录物中IR-A形式中不存在外显子11，而IR-B形式含有外显子11序列。对于对IR-AmRNA检测有特异性引物和探针的设计，使外显子10/12连接区靶向基因特异性探针。设计了分别位于外显子10或外显子12编码区内的若干引物对(正向和反向)。对于IR-B设计，使外显子11/12连接处和外显子11内部区域靶向基因特异性探针。设计了分别位于外显子10内或外显子10/11连接处和外显子12编码区内的若干引物对(正向和反向)。将所有引物/探针设计输入Primer Express(ABI)软件工具以确保用于TaqMan基因表达检测步骤的最佳设计。将所有探针设计为并入小沟结合(MGB)部分，并且用用于检测的荧光染料(FAM)和非荧光猝灭剂标记。表3和表4呈现了设计的所有引物/探针组合的序列。

表3：IR-A检测的引物和探针

IR-A引物探针设计：

表4：IR-B检测的引物和探针

【实施例2：引物和探针的特异性】

从OriGene Technologies，Inc.购买市售的含有INSR长(克隆SC311328)和短(克隆SC315880)转录物的全长cDNA克隆的质粒。进行每个INSR克隆的序列核查。在INSR长或短亚型克隆存在下，按各种拷贝数输入(102-107个拷贝)测试所有TaqMan基因表达检测设计的特异性和灵敏性。以384孔形式为所有引物/探针和模板组合进行标准TaqMan基因表达检测。反应由7.5μL TaqMan Universal MasterMix，1.5μL 10x基因表达检测混合物和6μL不同拷贝数量的INSR长或短形式cDNA克隆组成，384孔板的每孔的最终体积为15μL/孔。每种引物/探针和模板组合重复至少3次。使用标准设置(循环程序由95℃下孵育10min，然后在95℃下孵育15s和在60℃下孵育1min循环40次组成)在Applied Biosystems 7900HT检测系统上运行所有检测板。用SDS v2.0软件工具(ABI)从每次检测提取数据值(Ct值)。数据提取和分析后，确定为达到我们的目的以下引物和探针检测设计提供了充分的灵敏性和特异性，IR-A1、IR-A3、IR-B3、IR-B4和IR-B5。

IR-A1和IR-A3检测能够以约35个拷贝的拷贝数量阈值检测IR-A亚型序列。还确定这些检测对IR-A亚型有高度特异性，由于这些检测不能检测所用任何拷贝数量输入下的IR-B亚型的存在。可选地，IR-B3、IR-B4和IR-B5设计能够以约35个拷贝的拷贝数量阈值检测IR-B亚型序列。还确定这些检测对IR-B亚型有高度特异性，由于这些检测不能检测低于约35个拷贝阈值的IR-A亚型的存在并且不能检测所用任何拷贝数量输入下的IR-B亚型的存在。

利用BioMark^TM动态阵列(Fluidigm Corporation)微流体系统重复这些特异性实验进行实时PCR。这种系统允许高通量实时PCR(每块板可能进行2304次单独反应)，产生了可变性低和与常规RT-PCR紧密相关的优质数据。为采用这种技术，根据生产商的说明使用TaqMan Pre-Amp Master Mix预扩增cDNA样本。反应含有5μLcDNA、10μL Pre-Amp Master Mix和5μL 0.2X基因表达检测混合物(由所有待检测引物/探针组成)，最终体积为20μL。用推荐程序循环反应14次，然后用TE缓冲液稀释1∶5。立即利用预扩增的cDNA或保存在-20℃下直到需要为止。

为制备加载到48x48动态阵列芯片(Fluidigm)中的样本，反应混合物含有2.5μL 2X Universal Master Mix(Applied Biosystems)、0.25μL上样缓冲液(Fluidigm Corporation)和2.25μL预扩增cDNA。为制备引物/探针，反应混合物含有2.5μL 2X Taqman基因表达检测和2.5μL检测上样缓冲液(Fluidigm Corporation)。将样本和检测试剂加载到入口之前，于IFC控制器中引发芯片。将如所述制备的5μL样本加载到动态阵列芯片的每个样本入口，并且将5μL 10X基因表达阵列混合物装入每个检测器入口。将芯片置于IFC控制器上进行加载和混合。约1h后，将芯片加载BioMark^TM实时PCR系统进行热循环(95℃下10min，然后在95℃下15s并且在60℃下1min循环40次)。复制的次数和样本的组合物依据特定试验的不同而变化，但是决不少于三次重复。使用平均Ct值确定设计的探针的灵敏性和特异性。

使用Fluidigm系统确认使用常规实时PCR获得的结果。IR-A1、IR-A3、IR-B3、IR-B4和IR-B5对IR-A或IR-B有特异性并且能够以约35个拷贝拷贝数量阈值检测适当的受体亚型。

另外的分析还利用了来自已知过表达IR-A或IR-B或工程化为过表达IR-A的细胞系的cDNA模板。通过从靶基因的平均Ct中减去2个内源对照基因(GAPDH和ACTIN)的平均CT计算每种样本的Δ比较阈值(ΔCt)。结果表明这些引物/探针设计按使用cDNA克隆观察到的相同方式可重复和特异性检测细胞系中的IR-A或IR-B。同时，这些结果证实了Fluidigm技术用于cDNA或组织样本的进一步高通量分析的用途，以及确认了IR-A和IR-B引物/探针设计的特异性。定量多个引物/探针设计后，我们选择IR-A1和IR-B4以测量大量乳腺癌中IR-A和IR-B的表达状态。

通过从100pg的IR-A或IR-B模板储液(约10⁷个拷贝的DNA模板)开始进行IR-A或IR-B qRT-PCR检测确认探针灵敏性。连续稀释DNA至10^-4pg(约10个拷贝的DNA模板)。试验每种样本，一式两份。通过绘制循环阈值(Ct)作为log DNA拷贝数的函数确定标准模板稀释曲线的斜率。结果示于图7。对于用各自的匹配标准模板试验的每次检测，观察到log[浓度]和所得Ct值之间的强相关性。所有相关系数(r²值)为≥0.999(p≤0.0001)。在两次检测中在上述DNA浓度范围内保持了线性度，证明了广泛的动态范围并产生了精确的Ct值。结果表明IR-A和IR-B检测为灵敏性检测～35个拷贝的DNA的适当亚型。

还通过分别在IR-B DNA模板存在下试验IR-A检测或在IR-ADNA模板存在下试验IR-B检测评估检测的特异性。IR-A检测并不在10至10⁷个拷贝的IR-B DNA的试验范围内扩增IR-B DNA模板。同样，IR-B检测并不在试验范围内扩增IR-A DNA模板。

用两次检测的标准稀释曲线的斜率(图7)评估检测效率。对于IR-A斜率为-3.259，且对于IR-B斜率为-3.155。两个斜率非常相似，表明探针效率差异很小。

【实施例3：乳腺癌患者的表达谱】

【A.一般方法】

从ILSbio(Chestertown，MD)购买42级I至III浸润性乳腺导管癌。还获得了19个匹配的正常相邻乳腺组织样本。患者年龄范围为31岁至88岁。根据IHC所有乳腺癌样本为ER和PR阳性和HER2阴性。在开始任何治疗之前新鲜冷冻和收集所有样本。宏观解剖肿瘤样本以去除正常组织，并且宏观解剖正常样本以去除非腺性组织。宏观解剖之后，所有样本中肿瘤纯度高于85％。

从OriGene Technologies(Rockville，MD)购买4个乳腺癌组织qPCR cDNA阵列(BCRT101、BCRT102、BCRT103、BCRT104)。qPCR阵列含有来自15个正常乳腺组织(来自10个独特供体)和165个乳腺癌组织的cDNA。肿瘤阶段从阶段I变化为阶段IV，并且组织由50-90％肿瘤组成。

使用ZR RNA MicroPrep试剂盒(Zymo Research，Orange，CA)从速冻组织样本提取总RNA。用分光光度法(260/280＞1.9)确定RNA纯度和浓度。使用RNA 6000Nano LabChip

在Agilent 2100生物分析仪中评估RNA质量。

对于以下实例，用于IR-A检测的正向引物序列为5’-TGAGGATTACCTGCACAACG-3’(SEQ ID NO：3)，并且反向引物序列为5’-ACCGTCACATTCCCAACATC-3’(SEQ ID NO：4的互补序列)，并且探针为5’-TCCCCAGGCCATCT-3’(SEQ ID NO：7)。用于IR-B检测的正向引物序列为5’-CGTCCCCAGAAAAACCTCTTC-3’(SEQ ID NO：11)，并且反向引物序列为5’-GGACCTGCGTTTCCGAGAT-3’(SEQ ID NO：12)，并且探针序列为5’-CCGAGGACCCTAGGC-3’(SEQ ID NO：14)。

对于阳性和阴性对照，从OriGene Technologies，Inc(IR-A：SKU#.SC311328；IR-B：SKU# SC315880)购买市售的含有IR-A(在pCMV6-XL4中克隆)和IR-B(在pCMV6-XL5中克隆)的全长cDNA克隆的cDNA克隆。将pCMV6-XL4和pCMV6-XL5的空质粒分别用作IR-A和IR-B检测的阴性对照DNA。

以384孔形式为所有引物/探针和模板组合进行标准TaqMan基因表达检测。反应由5μL TaqMan Universal Master Mix，0.5μL 10x基因表达检测混合物和4.5μL不同拷贝数量的IR-B或IR-A cDNA克隆组成，384孔板的最终体积为10μL/孔。每种引物/探针和模板组合重复至少3次。使用标准设置(循环程序由95℃下孵育10min，然后在95℃下孵育15s和在60℃下孵育1min循环40次组成)在AppliedBiosystems 7900HT检测系统上运行所有检测板。用SDS v2.0软件工具(ABI)从每次检测运行提取数据值(循环阈值(Ct))。

为了评估其它基因的表达水平，从ABI(Forest city，CA)购买TaqMan基因表达检测。检测包括：INSR(检测ID：Hs00961554_m1)、ER(检测ID：Hs00174860_m1)、PR(检测ID：Hs01556707_m1)、ERBB2(HER2、检测ID：Hs01001580_m1)、肿瘤增殖基因(Pike S等2004)：BIRC5(检测ID：Hs00153353_m1)、AURKA(STK15、检测ID：Hs01582073_m1)、CCNB1(检测ID：Hs00259126_m1)、Ki67(检测ID：Hs01032443_m1)、MYBL2(检测ID：Hs00942543_m1)和参考或“管家”基因：ACTB(Hs99999903_m1)、GUSB(检测ID：Hs99999908_m1)、GAPDH(检测ID：Hs99999905_m1)、RPLP0(检测ID：Hs99999902_m1)、TFRC(检测ID：Hs99999911_m1)。

BioMark^TM Dynamic阵列(Fluidigm Corporation)微流体系统允许高通量实时PCR(每块板可能进行2304次单独反应)，产生了可变性低和与常规RT-PCR紧密相关的优质数据。使用SuperScript

IIIFirst-Strand Synthesis SuperMix(Invitrogen，Carlsbad，CA)由总RNA产生单链cDNA。根据生产商的说明使用TaqMan Pre-AmpMaster Mix预扩增cDNA样本。反应含有5μL cDNA、10μL Pre-AmpMaster Mix和5μL 0.2X基因表达检测混合物(由所有待检测引物/探针组成)，最终体积为20μL。用推荐程序循环反应14次，然后用TE缓冲液稀释1∶5。立即利用预扩增cDNA或保存在-20℃下直到需要为止。

为制备加载到48x48动态阵列芯片(Fluidigm)的样本，反应混合物含有2.5μL 2X Universal Master Mix(Applied Biosystems)，0.25μL上样缓冲液(Fluidigm Corporation)和2.25μL预扩增cDNA。为制备引物/探针，反应混合物含有2.5μL 2X Taqman基因表达检测和2.5μL检测上样缓冲液(Fluidigm Corporation)。将样本和检测试剂加载到入口之前，于IFC控制器中引发芯片。将如所述制备的5μL样本加载到动态阵列芯片的每个样本入口，并且将5μL 10X基因表达阵列混合物加载到每个检测器入口。将芯片置于IFC控制器上进行加载和混合。约1h后，将芯片加载到BioMark^TM实时PCR系统进行热循环(95℃下10min，然后在95℃下15s并且在60℃下1min循环40次)。复制次数和样本的组合物依据特定试验的不同而变化，但是决不少于三次重复。将平均Ct值用于确定设计的探针的灵敏性和特异性。将样本中所有可用参考基因检测的平均Ct值用于ΔCt计算。

用MessageAmp^TM主要RNA扩增试剂盒(Ambion，Austin，TX)实现由75ng总RNA产生生物素标记的扩增cRNA。用分光光度法确定cRNA产物的浓度和纯度。片段化15mg每种生物素标记的cRNA用于在Affymetrix Human Genome U133Plus 2.0 GeneChip

阵列上杂交。用Affymetrix标准实验进行所有GeneChip

洗涤、染色和扫描步骤。用基因芯片操作软件(GCOS)工具进行数据采集和初始阵列质量评估。将在所有样本中表现出信号强度＜25的任何探针排除在分析之外。

在Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 GeneChip

阵列上为亚组ER+、PR+和Her2原发性乳腺肿瘤(n＝40)和匹配的正常相邻乳腺组织样本(n＝15)构建图谱。由于RNA数量不足，未在基因芯片上加工在Fluidigm平台上分析的2个原发性乳腺样本和4个匹配的正常相邻乳腺组织样本。利用我们的全基因组阵列数据进行有关管状A亚型和管状B亚型的乳腺癌分子亚型分类。

执行确定假定样本分类的两种方法。为了样本分型目的(正常、基底样、HER2、管状A型或管状B型)，第一种分类方法利用公开的PAM50基因缩小重心分类法(Weigelt等，2010)。鉴于使用这种类型的成比例数据构建公开的分类法，将MAS5归一化基因芯片数据进行这种分析。根据史匹曼等级相关性为样本分类(50-基因强度载体与亚型重心分类法)，其中将相关性值最高的亚型分配为特定样本。第二种方法利用GC-RMA归一化基因芯片数据以通过双样本韦尔奇t检验鉴定差异性表达的转录物。进行统计分析之前，根据病理学评估将样本分为2组(正常或肿瘤)。显示出倍数变化差异＞3且p值＜1.0x10^-12的探针(n＝459个探针)用于无监督的层次聚类分析。根据转录物组组成的函数将鉴定的亚群分为正常、管状A型或管状B型。

【B.结果】

【乳腺癌中的IR-A和IR-B】

研究了乳腺癌、42ER和PR阳性和Her2阴性原发性乳腺组织样本和19个匹配的正常相邻乳腺组织中IR-A和IR-B的mRNA表达状态。预扩增随机六聚体引发的cDNA并通过TaqMan qPCR(Fluidigm)检测IR-A、IR-B和总胰岛素受体(INSR)转录物的表达水平。如上述将样本归一化为5个管家基因的平均值。结果示于图8。正常组织(n＝19)中INSR、IR-A和IR-B的平均相对量(RQ)差异(log₂-基本比率)±95％CI分别为1.03x10^-8±0.17、-7.37x10^-9±0.24和3.37x10^-8±0.18。肿瘤(n＝42)中INSR、IR-A和IR-B的平均相对量(RQ)差异(log₂-基本比率)±95％CI分别为-0.88±0.25、-0.07±0.29和-2.08±0.25。双尾韦尔奇t检验分析表明与正常乳腺组织相比在试验的乳腺肿瘤中，INSR和IR-B的mRNA水平显著较低(p＜0.0001)。可选地，当与正常组织相比，在乳腺癌中观察到IR-A的mRNA水平无显著差异(p＝0.4501)。

通过2^(-□Ct)针算在匹配的肿瘤和正常对中IR-A相对于总胰岛素受体组合物(即IR-A+IR-B)的比例。结果示于图9。正常组(n＝19)的平均IR-A转录物比例(％)±95％CI为46.60％±4.74％，而匹配肿瘤样本的平均IR-A转录物比例(％)±95％CI为75.24％±5.02。成对样本t检验分析表明与匹配正常组织相比时计算的肿瘤样本中IR-A比例显著升高(p＜0.0001)。结果表明肿瘤中显著降低的IR-B水平有助于与正常样本相比肿瘤样本中IR-A比例全面升高。

为了评估IR-A和IR-B的mRNA转录物比值，我们计算了正常和原发性肿瘤乳腺样本中IR-A和IR-B的ΔCt差异。为了归一化目的利用样本内参考基因(管家)组(平均Ct)为所有样本计算ΔCt差异(IR-AΔCt-IR-B ΔCt)值。对于正常样本(n＝19)，平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为0.20±0.23，并且在原发性肿瘤(n＝42)中，平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为-1.81±0.27。双尾韦尔奇t检验分析鉴定了与观察到的IR-A∶IR-BΔCt相关的正常和肿瘤样本之间的显著差异(p＜0.0001)(图10)。结果表明乳腺肿瘤中IR-A与IR-B的比值显著升高。

为进一步验证以上结果，我们评估了更多乳腺癌组织样本中IR-A和IR-B的mRNA表达比值。使用含有来自15个正常乳腺组织和165个乳腺癌组织的cDNA的PCR阵列。预扩增等量cDNA并通过Taqman qPCR(Fluidigm)检测IR-A、IR-B和ER的表达水平。为了归一化目的，利用样本内参考基因组(ACTB、GUSB、GAPDH)为所有样本计算ΔCt差异(IR-A ΔCt-IR-B ΔCt)值。结果示于图11。正常组织(n＝15)中平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为0.51±0.37。所有检查的乳腺癌(n＝165)的平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为-1.19±0.17。

然后我们将乳腺癌样本分为相对于正常乳腺组织展示出2倍的雌激素受体过表达的样本并且将它们的IR-A∶IR-B ΔCt差异与正常组织和所有乳腺癌样本比较。结果示于图11。在ER+乳腺癌(n＝83)中平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为-1.48±0.39，这与全部乳腺癌数据集中观察到的非常相似。双尾韦尔奇t检验分析鉴定了与观察到的IR-A∶IR-BΔCt差异相关的正常和肿瘤样本之间的显著差异(p＜0.0001)。

【乳腺癌增殖中涉及的基因相关的IR-A∶IR-B】

Ki67、STK15、Survivin、CCNB1、MYBL2为乳腺癌增殖中涉及的明确表征的基因。这些基因的复合表达评分已用于Oncotype DX并且是造成许多患者乳腺癌复发的重要因素。我们使用回归和相关性分析研究了原发性乳腺癌样本组中IR-A∶IR-B比值和增殖评分的相关性。进行线性回归分析定量计算的IR-A∶IR-B ΔCt差异和混合的增殖标记组(AURKA、BIRC5、CCNB1、KI67和MYBL2)之间的相关性。通过为特定样本的所有标记取平均ΔCt计算增殖组汇总值。呈现了正常和肿瘤样本的汇总结果。线性回归分析结果表明2个汇总值之间的正相关性(调节的r²＝0.595)(图12)。IR-A∶IR-B ΔCt差异显示出与增殖评分的正相关性(图12)。结果表明肿瘤中IR-B表达减少和IR-A比例表达增加可能有助于ER+PR+和Her-乳腺癌中肿瘤增殖。

【乳腺癌亚型的IR-A∶IR-B ΔCt差异】

乳腺癌是关于分子改变、细胞组成物和临床结果的异质性疾病。使用内在基因列表，可通过层次聚类分析进一步将ER阳性乳腺癌分为管状A亚型和管状B亚型(Perou CM，2000)。管状A型癌症在组织学上等级很低并且对新辅助内分泌治疗敏感(Creighton C等2008)。相反，管状B型癌症常常在组织学上等级很高并且对新辅助内分泌治疗敏感性低，对不良结果事件的时间较短(Creighton C等2008)。Creighton报道管状B型乳腺癌中显示了IGF-I特征并且这种特征与许多不良预后因子高度相关并且是疾病结果的最强指示之一。由于IR-A亚型是IGF信号转导中涉及的重要组分之一，我们调查当比较管状A型和管状B型乳腺癌时IR-A∶IR-B比值改变的假设是显然的。

为解决这个问题，我们对40个ER+PR+和Her2-阴性乳腺肿瘤和15个正常乳腺样本进行全基因组阵列分析。我们最初利用公开的PAM50-基因缩小重心分类法(Weigelt等，2010)。根据史匹曼等级相关性将样本分类为管状A型和管状B型，其中将相关性值最高的亚型分配为特定样本。比较正常、管状A型或管状B型的IR-A∶IR-B ΔCt差异。关于样本亚型(正常、管状A型或管状B型)的IR-A∶IR-B ΔCt计算差异的散点示意图示于图13A。正常样本(n＝15)中平均IR-A∶IR-BΔCt±95％CI为0.27±0.30。管状A型分类的乳腺癌(n＝13)中平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为-1.09±0.34。管状B型分类的乳腺癌(n＝27)中平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为-2.12±0.34。所有亚型成对比较显示显著性差异(双样本t检验，p＜0.001)。结果表明管状B型患者的IR-A∶IR-B比值变化比管状A型患者更剧烈。

除缩小重心分类法外，我们利用GC-RMA归一化基因芯片数据通过双样本韦尔奇t检验分析鉴定一组差异性表达的转录物。进行统计分析之前根据病理学评估将样本分为2组(正常或肿瘤)。根据转录物组组成的函数将通过无监督的层次聚类鉴定的亚群分为正常、管状A型或管状B型。比较了正常、管状A型和管状B型的IR-A∶IR-B ΔCt差异。结果示于图13B。正常样本(n＝15)中，平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为0.32±0.25。在预测管状A型乳腺癌(n＝18)中，平均IR-A∶IR-BΔCt±95％CI为-1.05±0.19。在预测管状B型乳腺癌(n＝22)中，平均IR-A∶IR-B ΔCt±95％CI为-2.42±0.32。所有亚型成对比较显示显著性差异(双样本t检验，p＜0.001)。

【参考文献】

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虽然已经参考其优选方面提供了以上公开，但是对于本领域的技术人员而言显然可在不背离公开和权利要求的范围前提下进行各种变化并采用等效物。引用的所有文件可通过引用整体并入。

Claims

(ii)SEQ ID NO：4、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：4或其互补序列杂交的序列；

(iv)SEQ ID NO：6、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQID NO：6或其互补序列杂交的序列。

2.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由以下任一核酸序列组成：

5.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求1-4中任一项所述的合成核酸序列。

7.根据权利要求6所述的引物组，其中至少一个合成核酸序列具有选自以下的核苷酸序列

(a)在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据权利要求6所述的引物组接触；和

(b)检测和/或定量扩增的靶IR-A核酸序列。

9.根据权利要求8所述的方法，其中由肿瘤样本制备所述生物样本。

10.根据权利要求8-9中任一项所述的方法，其中所述引物组包含SEQ ID NO：3、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：3或其互补序列杂交的序列，和SEQ ID NO：21、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：21或其互补序列杂交的序列。

11.根据权利要求8所述的方法，其中所述引物组包含SEQ IDNO：5、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：5或其互补序列杂交的序列，和SEQ ID NO：22、与之互补的序列或在严格条件下能够与SEQ ID NO：22或其互补序列杂交的序列。

12.根据权利要求8所述的方法，其中所述基于聚合酶的扩增为定量聚合酶链式反应。

13.根据权利要求12所述的方法，其中所述引物组包含：

14.根据权利要求12所述的方法，其中所述引物组包含：

15.根据权利要求8所述的方法，其中所述扩增产物小于100个碱基。

17.一种合成核酸序列，所述合成核酸序列基本上由以下任一核酸序列组成：

21.一种组合物，所述组合物包含根据权利要求16-20中任一项所述的合成核酸序列。

(a)(iii)包含碱基桥接外显子10和11、与之互补的序列或在严格条件下能够与之杂交或与其互补序列杂交的序列的10-30个连续核苷酸的合成核酸序列；和

23.根据权利要求22所述的引物组，其中至少一个合成核酸序列具有选自以下的核苷酸序列

(a)在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据权利要求22所述的引物组接触；和

(b)检测和/或定量扩增的靶IR-B核酸序列。

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述生物样本是肿瘤样本。

24.根据权利要求24所述的方法，其中所述引物组包含：

25.根据权利要求24所述的方法，其中所述基于聚合酶的扩增为定量聚合酶链式反应(q-PCR)。

26.根据权利要求24所述的方法，其中所述引物组包含：

27.根据权利要求24所述的方法，其中所述引物组包含：

28.根据权利要求24所述的方法，其中所述引物组包含：

29.根据权利要求24所述的方法，其中所述扩增产物小于100个碱基。

在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸样本与用于检测/或定量生物样本中的IR-A核酸序列的引物组接触，其中所述引物组包括根据权利要求6所述的引物组，和/或在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸样本与用于检测/或定量生物样本中的IR-B核酸序列的引物组接触，其中所述引物组包括根据权利要求22所述的引物组。

和

检测和/或定量扩增的靶IR-A或IR-B核酸序列。

31.一种用于确定生物样本中IR-A存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个根据权利要求1所述的合成核酸序列和使用说明。

32.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述至少一个合成核酸序列具有选自SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：6的核苷酸序列、与所述序列之一互补的序列或在严格条件下能够与所述序列之一或其互补序列杂交的序列。

33.根据权利要求31所述的试剂盒，其中所述合成核酸序列选自以下引物组：

34.根据权利要求31所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适合的PCR试剂；并且任选地，用于确定IR-A存在或不存在的阳性和/或阴性对照。

35.一种用于确定生物样本中IR-B存在或不存在的试剂盒，所述试剂盒包含至少一个根据权利要求16所述的合成核酸序列和使用说明。

36.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述合成核酸序列具有选自SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12的核苷酸序列、与任何所述序列互补的序列或在严格条件下能够与任何所述序列或其互补序列杂交的序列。

37.根据权利要求35所述的试剂盒，其中所述合成核酸序列选自以下引物组：

具有可检测标记的SEQ ID NO：14；或

38.根据权利要求35所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包含适合的PCR试剂；并且任选地，用于确定IR-B存在或不存在的阳性和/或阴性对照。

根据权利要求8检测和/或定量样本中的IR-A表达

根据权利要求24检测和/或定量样本中的IR-B表达；和

40.根据权利要求39所述的方法，其中所述IGFI/II配体或IGFR1受体拮抗剂为抗体。

41.根据权利要求40所述的方法，其中所述抗体包含表1和表2中所列的序列组分。

在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据权利要求6所述的引物组接触，

在适于基于聚合酶扩增的条件下使生物样本或由生物样本制备的核酸与根据权利要求22所述的引物组接触；

定量扩增的IR-A和IR-B核酸序列；并且

从而确定生物样本中IR-A与IR-B的相对表达。

43.一种为肿瘤分类的方法，所述方法包括：

通过权利要求42所述的方法确定肿瘤样本中IR-A与IR-B的相对表达，

按照包括IR-A和IR-B的相对表达的标准为肿瘤分类。

通过权利要求42所述的方法确定患者组织中IR-A与IR-B的相对表达，

45.根据权利要求44所述的方法，其中IR-A相对于IR-B表达增加。

46.一种使用IGF拮抗剂治疗患者的方法，所述方法包括

通过权利要求42所述的方法确定组织样本中IR-A与IR-B的相对表达，

按照包括IR-A和IR-B的相对表达的标准为患者分类；和

根据分类施用IGF拮抗剂。

47.根据权利要求46所述的方法，其中IR-A相对于IR-B表达增加。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述IGF拮抗剂为抗体。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗体包含含有SEQ IDNO：45和53的氨基酸序列的氨基酸序列。

50.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗体包含如表1和2所示的SEQ ID NO：45和53的CDR序列。

51.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗体包含3个来自SEQ ID NO：45的CDR和轻链。

52.根据权利要求48所述的方法，其中所述抗体包含3个来自SEQ ID NO：53的CDR和重链。

53.根据权利要求45和47中任一项所述的方法，其中IR-A相对总胰岛素受体的百分比高于46.6％。

54.根据权利要求45和47中任一项所述的方法，其中IRA∶IR-BΔΔCt低于约0.2。

55.根据权利要求45和47中任一项所述的方法，其中对于IR-A的log2-基本比率的平均相对量差异为约-.07±0.29，对于IR-B为约-2.08±0.25。

56.一种分类乳腺癌肿瘤亚型的方法，所述方法包括通过权利要求42所述的方法确定乳腺癌肿瘤样本中IR-A与IR-B的相对表达；并且，如果IR-A∶IR-B比例低于阈值将乳腺癌亚型分类为管状B型。

57.根据权利要求56所述的方法，所述方法进一步包括计算IR-A∶IR-B ΔΔCt，其中阈值为设定在约-1.1至约-2.4之间的范围内的IR-A∶IR-B ΔΔCt值。

58.根据权利要求54所述的方法，其中阈值在约-1.4至-2.1之间的范围内。

59.根据权利要求57所述的方法，其中确定IR-A∶IR-B ΔΔCt可与确定亚型分类中的其它表达谱组合。

60.一种确定肿瘤的增殖评分的方法，所述方法包括通过权利要求42所述的方法确定肿瘤样本中IR-A与IR-B的相对表达，和将较高的IR-A∶IR-B比例视为指示较高增殖评分的因子。

61.根据权利要求60所述的方法，所述方法进一步包括计算IR-A∶IR-B ΔΔCt和将较低的IR-A∶IR-B ΔΔCt值视为指示较高增殖评分的因子。