KR101930818B1

KR101930818B1 - 방광암의 비침습적 진단 방법

Info

Publication number: KR101930818B1
Application number: KR1020170048556A
Authority: KR
Inventors: 김원재; 윤석중; 박현미; 정필두
Original assignee: (주)비엠에스
Priority date: 2017-04-14
Filing date: 2017-04-14
Publication date: 2018-12-20
Also published as: KR20180116503A

Abstract

본 발명은 방광암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 방광암 진단 키트를 제공한다. 본 발명은 종래의 요세포검사 보다 우수한 민감도를 갖는 비침습적 방광암 진단 방법을 제공한다.

Description

방광암의 비침습적 진단 방법{Non-Invasive Diagnosis of Bladder Cancer}

본 발명은 방광암의 비침습적 진단 방법에 관한 것이다.

방광암은 비뇨기계 종양 중 전립선암 다음으로 높은 사망률을 보이는 악성종양이다. 방광암의 가장 주된 증상은 무통성 혈뇨로 환자의 85%에서 나타난다. 그러나 혈뇨는 종종 간헐적이어서 소변검사에서 음성이라 하여 방광암을 완전히 배제할 수는 없다. 또한 혈뇨의 정도는 암의 정도와 반드시 일치하지 않으므로 혈뇨가 발견되면 방광암을 의심하여야 한다. 하지만 혈뇨 환자 중 방광경 검사를 통하여 방광암이 실제로 발견되는 경우는 10% 정도 밖에 되지 않는다.

방광암 진단을 위한 종래기술로는 요세포검사 및 방광경 검사가 있다. 요세포검사는 방광암 진단에서 가장 많이 쓰이는 비침습적인 진단법으로 분화도가 불량하거나 상피내암에서 민감도가 높으나 분화도가 양호한 초기 방광암에서 민감도가 떨어지는 단점이 있다. 또한, 방광경 검사는 현재 방광암 진단의 표준검사로, 침습적인 검사방법으로서 환자분들이 심한 통증을 느끼며 검사 후 혈뇨가 나타날 수도 있고, 감염의 위험성도 있다.

따라서, 이러한 종래의 방광암 진단의 문제점을 극복하기 위해서는 비종양성 혈뇨와 방광암을 구별할 수 있는 비침습적인 진단법의 개발이 필요한 실정이다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 요세포검사에 의한 방광암 진단의 민감도가 낮은 문제를 개선하고자 이를 대체할 수 있는 비침습적 진단방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 소변 내 miR-6124 및 miR-4511의 발현양을 분석하여 높은 민감도를 갖는 방광암의 비침습적 진단 방법을 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 방광암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 방광암 진단 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 방광암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다:

(a) 객체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-6124 및 miR-4511의 발현양을 측정하는 단계; 및

(b) 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율을 비종양 객체의 대조군과 비교하는 단계로, 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율이 비종양성 객체의 대조군보다 상향조절 되는 경우 방광암으로 판정한다.

본 발명자는 요세포검사에 의한 방광암 진단의 민감도가 낮은 문제를 개선하고자 이를 대체할 수 있는 비침습적 진단방법을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 소변 내 miR-6124 및 miR-4511의 발현양을 분석하여 높은 민감도를 갖는 방광암의 비침습적 진단 방법을 개발하였다.

하기 본 발명의 방광암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 단계별로 설명한다:

단계 (a): miR-6124 및 miR-4511의 발현양 측정

먼저, 객체로부터 분리된 생물학적 시료를 준비한다.

구체적으로, 상기 객체는 혈뇨 환자이다. 보다 구체적으로, 상기 객체는 혈뇨, 농뇨 또는 혈농뇨 환자이다.

상기 혈뇨 환자로부터 분리된 생물학적 시료를 준비한다.

본 명세서에 기재된 용어 "생물학적 시료"는 핵산을 포함한 생물의 모든 물질을 말하는 것이며, 본 발명에 핵산증폭 반응에 사용할 수 있는 생물학적 시료는 바이러스, 박테리아, 조직, 세포, 모발, 구강 조직, 구강 세포, 혈액, 림프, 골수 액, 타액, 유즙, 소변, 분변, 안구 액, 정액, 뇌추출 액, 척수 액, 관절 액, 유선 액, 복수, 양막 액 또는 세포조직액이 포함하나 이에 한정되지 않는다. 생물학적 시료로서 혈액은 전혈, 혈장, 또는 혈청을 포함한다.

구체적으로는, 상기 생물학적 시료는 소변이다.

하기 실시예에서 확인할 수 있듯이, 객체로부터 소변을 채취하여 방광암 여부를 진단 할 수 있다.

다음, 상기 생물학적 시료 내 miR-6124 및 miR-4511의 발현양을 분석한다.

상기 miRNA의 발현양을 측정하는 수단은 적어도 하나의 miRNA를 검출 또는 증폭하는 올리고뉴클레오티드 프로브, 어레이-기반 방법, PCR-기반 방법, 서열분석-기반 방법에 기초하여 발현 수준을 측정하는 수단 또는 발현 수준을 측정하는 여타 적합한 수단을 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어, "miRNA(microRNA)"는 21 내지 25 뉴클레오티드(nt)의 단일 가닥 RNA 분자로써, 진핵생물의 유전자 발현을 제어하는 조절물질이다. miRNA는 표적 mRNA에 상보적으로 결합하여 전사 후 유전자 억압자(posttranscriptional gene suppressor)로써 작용하며, 번역 억제와 mRNA 불안정화를 유도하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

상기 miR-6124는 방광암 환자의 소변에서 상향-조절되는 miRNA로, 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 상기 miR-4511는 방광암 환자의 소변에서 하향-조절되는 miRNA로, 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명에서 용어, "발현양"은 핵산의 발현의 측정된 수준을 의미한다.

단계 (b): 방광암의 판정

다음, 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율을 비종양 객체의 대조군과 비교하는 단계로, 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율이 비종양성 객체의 대조군보다 상향조절(up-regulated) 되는 경우 방광암으로 판정한다. 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율이 일정 컷-오프(0.42) 이상일 경우 방광암으로 판정될 확률은 75% 이상이다.

상기 방광암은 비근육침윤성 방광암 및 근육침윤성 방광암을 포함한다.

본 발명의 명세서에서 용어 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)를 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 miR-6124에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 상기 miR-6124에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 및 이들의 조합; 및 (b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 miR-4511에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 상기 miR-4511에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 방광암 진단 키트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 "안티센스 뉴클레오타이드"란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해하는 작용을 한다. 안티센스 서열은 miR-6124 또는 miR-4511에 상보적이고 miR-6124 또는 miR-4511에 결합할 수 있는 DNA 또는 RNA 서열을 의미하고, miR-6124 또는 miR-4511의 번역, 세포질내로의 전위(translocation), 성숙(maturation) 또는 다른 모든 전체적인 생물학적 기능에 대한 필수적인 활성을 저해할 수 있다. 안티센스 핵산의 길이는 6 내지 100 염기이고, 바람직하게는 8 내지 60 염기이고, 보다 바람직하게는 10 내지 40 염기이다.

본 명세서에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 언급하면서 사용되는 용어 "상보적"은 소정의 혼성화 또는 어닐링 조건, 바람직하게는 생리학적 조건 하에서 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 miR-6124 또는 miR-4511에 선택적으로 혼성화 할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하는 것으로 하나 또는 그 이상의 미스매치(mismatch) 염기서열을 가질 수 있으며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다.

본 명세서에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 방광암의 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

본 명세서에서 용어, "프로브"는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 상기 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 방광 종양의 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

상기 프라이머 또는 프로브는 표적 분자, 예를 들어 검출 또는 정량하고자 하는 miRNA에 특이적으로 결합할 수 있도록, 검출 또는 정량하고자 하는 표적 서열의 영역과 동일하거나, 그에 상보적이거나, 그의 상동체이거나, 또는 그와 상동성인 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자를 의미한다. 본 발명에서 이해되는 바와 같이, 프라이머는 그 자체로 프로브로서 기능할 수 있다. 본 발명에서 이해되는 "프로브"는 다수의 시판 qPCR 방법에서 통상적인 바와 같이 예를 들어 프라이머 쌍과 내부-표지 프로브의 조합을 또한 포함할 수 있다.

구체적으로, 상기 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

구체적으로, 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.

본 발명의 키트는 상기한 성분 이외에도, 다른 성분들을 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 키트가 PCR 증폭 과정에 적용되는 경우에는, 본 발명의 키트는 선택적으로, PCR 증폭에 필요한 시약, 예컨대, 완충액, DNA 중합효소(예컨대, Thermus aquaticus(Taq), Thermus thermophilus(Tth), Thermus filiformis, Thermis flavus, Thermococcus literalis 또는 Pyrococcus furiosus (Pfu)로부터 수득한 열 안정성 DNA 중합효소), DNA 중합 효소 조인자 및 dNTPs를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 상기한 시약 성분을 포함하는 다수의 별도 패키징 또는 컴파트먼트로 제작될 수 있다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 키트는 유전자 증폭 키트이다.

본 발명의 키트 또는 방법에 의해 분석된 상기 miRNA의 발현양, 예컨대, RT(reverse transcriptase)-PCR 또는 실시간(real-time)-PCR 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 의해 측정된 발현양이 컷-오프 0.42보다 클 경우에는 분석 시료를 채취한 대상(subject)이 방광 종양을 가지고 있거나 발병 위험도가 높은 것으로 판정한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-6124에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 상기 miR-6124에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 또는 이들의 조합을 포함하는 방광암 진단용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 miR-6124의 발현양을 비종양 객체의 대조군과 비교하여 상기 miR-6124의 발현양이 비종양성 객체의 대조군보다 상향조절 되는 경우 방광암으로 판정한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 miR-4511에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브, 상기 miR-4511에 특이적으로 결합하는 항체, 앱타머 또는 이들의 조합을 포함하는 방광암 진단용 조성물을 제공한다.

구체적으로, 상기 miR-4511의 발현양을 비종양 객체의 대조군과 비교하여 상기 miR-4511의 발현양이 비종양성 객체의 대조군보다 하향조절 되는 경우 방광암으로 판정한다.

상기 방광암 진단용 조성물은 상기 방광암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 방광암 진단 키트의 miR-6124 과 miR-4511 (miR-6124/miR-4511)을 이용하므로, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 방광암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법 및 방광암 진단 키트를 제공한다.

(b) 본 발명은 종래의 요세포검사 보다 우수한 민감도를 갖는 비침습적 방광암 진단 방법을 제공한다.

도 1은 본 연구에 관한 개요이다.
도 2a 및 2b는 트레이닝 코호트(traning cohort)와 밸리데이션 코호트(validation cohort)의 방광암 환자와 육안적 혈뇨, 현미경적 혈뇨 및 농뇨만을 갖고 있는 환자 소변 내 miR-6124/miR-4511 발현양을 나타낸다.
도 3a 내지 3c는 트레이닝 코호트의 소변 내 miR-6124/miR-4511의 방광암 진단에 대한 민감도 및 특이도를 ROC 곡선(curve)로 나타낸다. 도 3a는 방광암 환자와 대조군(혈뇨와 농뇨 환자 모두 포함된 군)을 비교한 ROC 곡선이고, 도 3b는 방광암 환자와 혈뇨 환자(육안적 혈뇨와 현미경적 혈뇨 환자 모두 포함된 군)를 비교한 ROC 곡선이며, 도 3c는 방광암 환자와 육안적 혈뇨 환자를 비교한 ROC 곡선이다.
도 4a 내지 4c는 밸리데이션 코호트(validation cohort)의 소변 내 miR-6124/miR-4511의 방광암 진단에 대한 민감도 및 특이도를 ROC 곡선(curve)로 나타낸다. 도 4a는 방광암 환자와 대조군 환자를 비교한 ROC 곡선이고, 도 4 b는 비근육침윤성 방광암(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC) 환자와 대조군 환자를 비교한 ROC 곡선이고, 도 4c는 근육침윤성 방광암(muscle invasive bladder cancer, MIBC) 환자와 대조군 환자를 비교한 ROC 곡선이다. 대조군은 혈뇨와 농뇨를 모두 포함한 환자군, 혈뇨 환자군(육안적 혈뇨와 현미경적 혈뇨를 모두 포함) 및 육안적 혈뇨 환자 군으로 나누어 비교하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다

실시예

실험자재 및 방법

연구계획

워크플로우는 도1에서 간결하게 설명하였다. 방광암 진단에서의 후보 소변miRNA를 찾기 위하여, 스크리닝 코호트 (screening cohort)에서 소변 miRNA 마이크로어레이를 진행하였다(표 1). 결과, 27개의 소변 miRNA(그 중 16개는 방광암 환자 소변에서 상향 발현, 11개는 방광암 환자 소변에서 하향 발현된 miRNA이다)를 찾았고, 실시간 연쇄중합반응(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)을 진행하여 스크리닝 코호트에서 그들의 발현양을 확인하여 보았다. 방광암 진단에서 주목하여 할 점은, 혈뇨를 동반한 환자들 중에서 방광암과 비종양 혈뇨환자를 정확히 구별 하는 것이므로, 정상인의 소변을 제외 시킨 후 RT-PCR을 진행하였다. 스크리닝 결과, 두 개의 miRNA, hsa-miR-6124와 has-miR-4511가 선정되었고, 이후 트레이닝 코호트 (training cohort)에서의 발현 양을 RT-PCR을 통하여 확인하였고, 두개 miRNA의 방광암의 비침습적 진단 마커로서의 효용성을 밸리데이션 코호트(validation cohort)를 이용하여 2차적으로 재확인 작업을 진행하였다.

환자 임상정보

본 연구에서 사용된 환자들의 임상정보는 다음의 표 1과 같다. 표 1의 SD는 표준편차를 의미한다:

변수	스크리닝 코호트(Screening cohort)		트레이닝 코호트(training cohort)		밸리데이션 코호트(validation cohort)
변수	방광암 환자	대조군	방광암 환자	대조군	방광암 환자	대조군
수	35	6	84	86	215	200
평균 연령±SD	66.63±13.06	60±11.47	67.91±12.85	72.07±8.90	66.72±12.10	68.72±10.81
성별(%)	-
남성	29 (82.9)	4 (66.7)	72 (85.7)	85 (98.8)	169 (78.6)	170 (85.0)
여성	6 (17.1)	2 (33.3)	12 (14.3)	1 (1.2)	46 (21.4)	30 (15.0)
등급(%)	-
1	5 (14.3)	-	15 (17.9)	-	46 (21.4)	-
2	21 (60.0)	-	43 (51.2)	-	84 (39.1)	-
3	9 (25.7)	-	26 (30.9)	-	85 (39.5)	-
단계(%)	-
TaN0M0	8 (22.9)	-	56 (66.7)	-	60 (27.9)	-
T1N0M0	11 (31.4)	-	20 (23.8)	-	79 (36.7)	-
T2N0M0	4 (11.4)	-	4 (4.8)	-	35 (16.3)	-
T3N0M0	2 (5.7)	-	1 (1.2)	-	9 (4.2)	-
T≥4 or N≥1 or M1	10 (28.6)	-	3 (3.6)	-	32 (14.9)	-
요세포검사(%)	-
음성	11 (31.4)	-	37 (44.0)	-	61 (28.4)	-
비전형적 요로세포	19 (54.3)	-	12 (14.3)	-	86 (40.0)	-
양성	3 (8.6)	-	14 (16.7)	-	33 (15.3)	-
Not tested	2 (5.7)	-	21 (25.0)	-	35 (16.3)	-
농뇨 only (%)	-	2 (33.3)	-	12 (33.7)	-	34 (17.0)
혈뇨(%)	-	4 (66.7)	-	74 (66.3)	-	166 (83.0)
혈뇨 only	-	2	-	29	-	92
혈뇨+농뇨	-	2	-	45	-	74
현미경적 혈뇨	-	3	-	23	-	131
육안적 혈뇨	-	3	-	51	-	35

스크리닝 코호트에서는 35명의 방광암 환자와 6명의 대조군 환자(혈뇨 4명 및 농뇨 2명) 소변을 사용하였고, 방광암 환자 중 19명은 비근육침윤성 방광암 환자이고, 16명은 근육침윤성 방광암 환자이다. 트레이닝 코호트에서는 84명 방광암 환자 (비근육침윤성 방광암 76명 및 근육침윤성 방광암 8명)의 소변 샘플과 86명의 비종양 혈뇨 및 농뇨 샘플을 사용하였고, 그 중 혈뇨 샘플은 74시료, 농뇨는 12 시료였다. 방광암 환자 중, 방광암 등급이 1인 환자는 15명, 등급2인 환자는 43명, 등급3인 환자는 26명이다. 밸리데이션 코호트에서는 215명 방광암 환자(비근육침윤성 방광암 139명 및 근육침윤성 방광암 76명)의 소변 샘플과 200명 비종양 혈뇨 및 농뇨 샘플을 사용하였으며, 그 중 혈뇨 샘플은 145 시료, 농뇨는 55시료였다. 방광암 환자 중, 등급이 1인 환자는 46명, 등급2인 환자는 84명, 등급3인 환자는 85명이다(표 1). 소변 샘플은 아침에 채취 후 4℃ 냉장고에 보관하였다. 보관해 두었던 소변 샘플은 25,000 rpm에서 15분 동안 원심분리를 실시한 후, 상층액과 침전물은 따로 튜브에 분주 후 사용 전까지 -20℃에 보관하였다. 방광암 소변은 경뇨도적 방광종양 절제술(transurethral resection of bladder tumor, TURBT) 혹은 근치방광절제술 (radical cystectomy) 을 시행한 환자로부터 채취하였으며, 이들은 모두 병리학적으로 이행세포암으로 확인되었다. 분석시 교란요인을 줄이기 위하여 방광이행세포암으로 진단 전후에 기타 암 진단 내력이 있는 환자분들은 본 연구에서 제외하였다. 대조군 환자들의 소변 샘플은 전립선비대증, 요로결석, 요실금, 요로감염 등 비종양 혈뇨 환자들로부터 수집하였다. 소변 샘플의 수집과 분석은 충북대학교 의학연구윤리심의위원회(Institutional Review Board)의 승인(GR2010-12-010) 하에 진행되었으며, 모든 환자들로부터 인체자원기증동의서를 받았다.

마이크로어레이

각 샘플의 총 RNA는 miRNA Microarray System labeling kit(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 수득하였고, RNA 양과 추출 퀄리티는 RNA 6000 Pico Chip Kit(Agilent Technologies, Santa Clara, CA) 및 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하여 검증하였다. miRNA 프로파일링은 1,205 인체와 144 바이러스 miRNA를 포함하는 Agilent Human miRNA Microarray Release 16.0 platform으로 진행하였다(Takeshita N et al. Br J Cancer. 2013;108:644-652). 사용된 프로토콜은 공지된 논문을 참고하였다(Raitanen M-P et al. Eur Urol. 2002;41:284-289).

소변의 miRNA 추출

Genolution urine miRNA purification kit(Genolution Pharmaceuticals Inc., Seoul, Korea)를 사용하여 소변 샘플의 miRNA를 추출하였다. 각 소변 샘플의 상층액 500 ㎕를 Genolution proprietary miRNA separation solution이 들어있는 튜브에 넣은 후 20초 동안 흔들어서 혼합하였다. 다음 200 ㎕ 클로로포름을 넣고 10초 동안 흔들어 혼합한 후, 10분 동안 4℃에서 반응시켰다. 10분 후 4℃, 13000 rpm으로 10분 동안 원심분리를 실시하였다. 상층액 600 ㎕을 조심스럽게 취해서 이소프로판올 800 ㎕이 들어있는 1.5 ㎖ 튜브에 넣었다. 4℃, 15000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 실시하였다. RNA 펠렛만 남기고 조심스럽게 용액을 제거하였다. 70% EtOH 500 ㎕을 첨가한 후 4℃, 15000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 실시하였다. RNA 펠렛만 남기고 조심스럽게 용액을 제거한 후 4℃, 15000 rpm에서 3분 동안 원심분리를 실시하였다. EtOH를 완전히 제거한 후 RNase-free water 40 ㎕를 넣은 후 사용 전까지 -80℃에 보관하였다.

소변 miRNA의 cDNA 합성

Mir-XTM miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit(Clontech,TAKARA,Otsu,Japan)를 사용하여 소변에서 추출한 miRNA로 cDNA를 합성하였다. RNase-free 0.2 ㎖ 튜브에 mRQ 완충액(2×) 5 ㎕, miRNA 샘플 3.75 ㎕ 및 mRQ Enzyme 1.25 ㎕을 넣은 후 혼합하였다. 혼합액은 37℃에서 1시간, 85℃에서 5분 동안 항온반응 시킨 후 4℃에 보관하였다. ddH₂O 90 ㎕를 첨가하여 총 부피 100 ㎕이 되도록 희석하였다.

Real-time PCR

소변 miRNA을 증폭시키기 위해 Rotor Gene 6000 instrument(Qiagen, Hilden, Germany)를 이용하여 실시간 연쇄중합반응(Real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)을 실시하였다. SsoFast EvaGreen Supermix(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)가 들어있는 Microreaction tubes(Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하였다. miRNA 증폭에 사용된 정방향 프라이머의 서열을 다음과 같이 디자인하였다. MiR-6124: 5'-GGGAAAAGGAAGGGGGAGGA-3'(20 base pairs; 서열목록 제1서열). MiR-4511: 5'- GAAGAACUGUUGCAUUUGCCCU-3'(22 base pairs; 서열목록 제2서열). 2×QuantiTect SYBR Green PCR master mix 5 ㎕, 10×miScript universal primer 0.2 ㎕, 10 pmol 정방향 프라이머 0.2 ㎕, 주형 cDNA 2 ㎕ 및 RNase-free water 2.6 ㎕를 혼합하여 다음의 순서로 RT-PCR을 진행하였다: 95℃에서 3분, 60℃에서 20분을 45사이클, 95℃에서 60초를 1사이클, 55℃에서 30초 및 95℃에서 30초. 멜팅 프로그램은 70℃부터 99℃까지 5초당 1℃씩 가열하여 진행하였다. 스펙트럼 데이터는 Rotor-Gene Q software 2.3.1.49를 이용하여 분석하였다. 모든 실험의 샘플은 3배수로 진행하였다.

통계적 분석

R 패키지의 Robust Multiarray Average는 global correction, 양적 표준화 및 median polish summarization 을 수행하는 데 사용되었습니다. 비드 mRNA 신호 강도로부터 p- 값(t 테스트)을 계산 하였다[Irizarry RA, Hobbs B, Collin F, Beazer-Barclay YD, Antonellis KJ, Scherf U,Speed TP. Exploration, normalization, and summaries of high density oligonucleotide array probe level data. Biostatistics. 2003; 4:249-264.]. 카이제곱검정(Chi-squared test)을 통하여 방광암과 비종양 대조군 환자사이의 소변 miRNA의 발현양 차이의 확인 및 miRNA 마커와 요세포검사의 민감도 비교를 진행하였다. 방광암에서 소변 miRNA의 발현양은 Mann-Whitney U test를 통하여 검증하였다. 반응자 작용특성(Receiver operating characteristics; ROC) 곡선을 이용하여 방광암 진단에서 민감도 및 특이도의 합이 가장 높은 값으로 컷-오프 포인트를 설정하였다. 통계프로그램은 IBM SPSS Statistics ver. 20.0(IBM Co., Armonk, NY)을 사용하였으며, p<0.05는 통계적으로 유의한 값으로 간주되었다.

결과

방광암과 대조군 환자 소변에서 서로 다르게 발현되는 miRNA의 선정

실험자재와 방법에서 서술한 것과 같이 방광암과 대조군 환자 소변에서 서로 다른 발현양을 나타내는 miRNA를 선정하였다. P값, fold-change, flexible and adaptive test for gene sets (FLAGS)를 비교하여 방광암과 비종양 대조군 환자 소변에서 다르게 발현되는 109개 miRNA중에서 27개 (16개는 방광암 환자 소변에서 상향조절, 11개는 하향조절)의 후보 miRNA를 선택하였다(Huang J, Wang K, Wei P, Liu X, Liu X, Tan K, Boerwinkle E, Potash JB, Han S. FLAGS: A Flexible and Adaptive Association Test for Gene Sets Using Summary Statistics. Genetics. 2016; 202:919-929.). 최종적으로 27개 miRNA는 RT-PCR을 통하여 마이크로어레이 분석에서와 같은 결과를 보여주는 두개의 miRNA, miR-6124 (5'- UCCUCCCCCUUCCUUUUCCC-3' 서열목록 제3서열; 상향조절)와 miR-4511 (5'- AGGGCAAAUGCAACAGUUCUUC-3' 서열목록 제4서열; 하향조절)를 선정하여 밸리데이션을 진행하였다.

방광암-관련 소변 miRNA의 밸리데이션 결과

방광암 환자와 대조군 소변에서의 miRNA 비율(miR-6124/miR-4511) 결과는 도 2와 같다. 트레이닝 코호트에서 방광암 환자의 소변에서 miR-6124/miR-4511의 발현양은 육안적 혈뇨, 현미경적 혈뇨 및 농뇨보다 확연히 높은 것을 확인할 수 있었다(각 p<0.001)(도 2A). 밸리데이션 코호트에서 비근육침윤성 방광암과 근육침윤성 방광암 환자 소변에서 miR-6124/miR-4511의 발현양은 비슷한 트렌드를 보이고 있는데, 그 발현양은 모두 육안적 혈뇨, 현미경적 혈뇨 및 농뇨보다 확연히 높은 것을 확인할 수 있었다(각 p<0.001)(도 2B).

트레이닝 코호트에서 ROC 곡선분석 결과, 소변 miR-6124/miR-4511의 비종양 혈뇨 대조군에서 방광암을 선별할 수 있는 민감도 및 특이도는 각각 75% 및 71.6%였다(area under the curve, AUC 0.735, p<0.001). 또한, 육안적 혈뇨 대조군에서 방광암을 선별할 수 있는 민감도는 75%, 특이도는 72.5%였다(AUC 0.739, p<0.001)(표 2 및 도 3a 내지 3c). 밸리데이션 코호트에서, ROC 곡선분석 결과, 방광암과 비종양 혈뇨 환자군을 비교하였을 때, 방광암 진단의 민감도 및 특이도는 79.1% 및 71.7% (AUC 0.774, p<0.001)였으며, 육안적 혈뇨 환자군과 비교하였을 때, 그 민감도는 80.0% (p<0.001)에 달하였다. 육안적 혈뇨 대조군에서 근육침윤성 방광암을 선별할 수 있는 민감도는 82.9% (p<0.001)였다. (표 2 및 도 4a 내지 4c).

-		AUC	민감도 (%)	특이도 (%)	p-값	95% 신뢰구간	컷-오프
트레이닝코호트 (170)	방광암 vs.대조군	0.713	76.2	68.6	<0.001	0.634-0.792	0.42
	방광암 vs.혈뇨환자	0.735	75.0	71.6	<0.001	0.656-0.814	0.42
	방광암 vs.육안적혈뇨환자	0.739	75.0	72.5	<0.001	0.651-0.826	0.42
밸리데이션코호트 (415)	방광암 vs.대조군	0.768	79.1	69.5	<0.001	0.721-0.814	0.37
	방광암 vs.혈뇨환자	0.774	79.1	71.7	<0.001	0.726-0.822	0.37
	방광암 vs.육안적혈뇨환자	0.755	80.0	71.4	<0.001	0.664-0.846	0.33
	비근육침윤성 방광암 vs.대조군	0.765	78.4	69.0	<0.001	0.712-0.818	0.37
	비근육침윤성 방광암 vs.혈뇨환자	0.772	78.4	71.1	<0.001	0.717-0.826	0.37
	비근육침윤성 방광암 vs.육안적혈뇨환자	0.755	78.4	71.4	<0.001	0.664-0.849	0.33
	근육침윤성 방광암 vs.대조군	0.772	78.9	73.0	<0.001	0.704-0.840	0.44
	근육침윤성 방광암 vs.혈뇨환자	0.779	78.9	74.7	<0.001	0.709-0.848	0.44
	근육침윤성 방광암 vs.육안적혈뇨환자	0.755	82.9	71.4	<0.001	0.653-0.856	0.33

방광암 환자의 비침습적 진단마커로서의 소변 miR -6124/ miR -4511

트레이닝 코호트에서, 가장 높은 AUC에서 얻은 컷-오프 값은 0.42이고, 밸리데이션 코호트에서의 컷-오프 값은 0.37이였다. 새로운 진단방법이 임상에 사용되기 위해서는 임상상황에 맞는 컷-오프값이 필요하다. 두차례 실험결과를 종합하여, 가장 최적화된 컷-오프 값인 0.42을 산출하였다. 표 3은 0.42의 컷-오프 값을 이용하여 두번의 실험에서 방광암을 진단할 수 있는 민감도와 특이도를 보여주고 있다. 민감도와 특이도는 모든 그룹에서 70% 이상인 것을 확인할 수 있다.

컷-오프= 0.42		민감도 (%)	특이도 (%)	카이제곱검정 P값
트레이닝코호트 (170)	방광암 vs.대조군	75.0	68.6	<0.001
	방광암 vs.혈뇨환자	75.0	68.9	<0.001
	방광암 vs.육안적혈뇨환자	75.0	70.6	<0.001
밸리데이션코호트 (415)	방광암 vs.대조군	74.9	71.5	<0.001
	방광암 vs.혈뇨환자	74.9	72.9	<0.001
	방광암 vs.육안적혈뇨환자	74.9	71.4	<0.001
	비근육침윤성 방광암 vs.대조군	72.7	71.5	<0.001
	비근육침윤성 방광암 vs.혈뇨환자	72.7	72.9	<0.001
	비근육침윤성 방광암 vs.육안적혈뇨환자	72.7	71.4	<0.001
	근육침윤성 방광암 vs.대조군	78.9	71.5	<0.001
	근육침윤성 방광암 vs.혈뇨환자	78.9	72.9	<0.001
	근육침윤성 방광암 vs.육안적혈뇨환자	78.9	71.4	<0.001

두번의 실험 샘플에서 컷-오프 값 0.42인 miRNA 바이오마커와 기존 요세포 검사의 민감도를 비교해 본 결과, 요세포 검사는 종양 등급이 높아짐에 따라 방광암 진단 민감도만 높아지는 것을 확인할 수 있었으나, 그 민감도는 0-55%로 매우 낮았다(표 4). 이와 달리, 본 연구에서 발견한 소변 miRNA 바이오마커는 요세포 검사보다 방광암 진단에서 훨씬 높은 민감도를 나타내는 것을 확인 할 수 있었다. 그 민감도는 모두 70% 이상 이였으며, 종양 등급의 영향을 받지 않았다(p<0.001).

코호트		분류	요세포검사	MiR-6124/miR-4511
트레이닝코호트		Total	22.2%	75%
		Grade 1	0	73.3%
		Grade 2	10.0%	79.1%
		Grade 3	55.0%	69.2%
밸리데이션코호트	비근육침윤성 방광암	Total	14.8%	72.7%
		Grade 1	2.7%	65.9%
		Grade 2	11.9%	80.6%
		Grade 3	50.0%	60.9%
	근육침윤성 방광암	Total	25.9%	78.9%
		Grade 1	100%	100%
		Grade 2	20.0%	83.3%
		Grade 3	23.9%	77.4%

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Non-Invasive Diagnosis of Bladder Cancer <130> PN170068 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MiR-6124 primer <400> 1 gggaaaagga agggggagga 20 <210> 2 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MiR-4511 primer <400> 2 gaagaacugu ugcauuugcc cu 22 <210> 3 <211> 20 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 3 uccucccccu uccuuuuccc 20 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Homo sapiens <400> 4 agggcaaaug caacaguucu uc 22

Claims

다음의 단계를 포함하는 방광암의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법:
(a) 객체로부터 분리된 생물학적 시료에서 miR-6124 및 miR-4511의 발현양을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율을 비종양 객체의 대조군과 비교하는 단계로, 상기 miR-6124/miR-4511의 발현 비율이 비종양 객체의 대조군보다 상향조절 되는 경우 방광암으로 판정한다.
제 1 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 소변인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 miR-6124에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 이들의 조합; 및
(b) 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 miR-4511에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 이들의 조합;
을 포함하는 방광암 진단 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 서열목록 제4서열의 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머는 서열목록 제2서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
miR-6124에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 이들의 조합을 포함하는 방광암 진단용 조성물.
miR-4511에 특이적으로 결합하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 프라이머, 프로브 또는 이들의 조합을 포함하는 방광암 진단용 조성물.