CN102947468B - 大肠肿瘤的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的课题是提供以粪便中所含的成分作为指标，检测大肠肿瘤、特别是进行性腺瘤、早期癌的方法。一种大肠肿瘤的检测方法，其是使用标记基因检测大肠肿瘤的方法，其包括：(A)提取从受验者采集的粪便中所含的RNA的步骤、(B)测定所述步骤(A)中得到的RNA中的标记基因来源RNA的量的步骤、以及(C)对所述步骤(B)中测定的标记基因来源RNA的量、和按标记基因的种类预先设定的阈值进行比较的步骤；其中，所述标记基因是CKB(肌酸激酶B)基因。

Description

大肠肿瘤的检测方法
技术领域
本发明涉及使用标记基因进行的大肠肿瘤、特别是进行性腺瘤、早期癌的检测方法。更具体地涉及，以粪便中所含的标记基因来源RNA的量作为指标，检测被采集了该粪便的受验者是否患大肠肿瘤的方法。
本申请要求2010年6月16日在日本国提出的特愿2010-137460号的优先权，在此援引其内容。
背景技术
大肠癌引起的死亡者在增加。大肠癌引起的死亡者在所有癌引起的死亡者中，男性方面排在第4位，女性方面排在第1位，是一种死亡者多的癌(2005年度癌症死亡统计)。此外，在2020年的癌患者估计中，推测在男性中排第二位，在女性中排第一位。因此，强烈需要包含二次预防在内的综合性大肠癌对策。与其他癌相比，大肠癌在早期发现、并进行合适治疗的情况下的5年生存率非常高，因而大肠癌的群体筛查(mass screening)是最有效果的方法之一。
为了大肠癌的确诊，一般进行能够直接视觉确认大肠内的内视镜检查，再视需要进行患处的活体检查。然而，这些方法是侵袭性的，且需要高度的专业技术，因此不适合群体筛查这样的初筛。
为了群体筛查，简便且非侵袭性的检测方法是重要的。现在能够利用的唯一的非侵袭性方法是考察有无潜血的粪便检查、即便潜血检查，其作为大肠癌的群体筛查的标准方法被广泛采用。然而，就便潜血检查而言，粪便中出现血红蛋白并不是肿瘤特异性的，因此，缺点是灵敏度以及特异性低(灵敏度30~90%、特异性70~98%)，假阴性、假阳性相当多地存在。
非侵袭性检测大肠癌的方法，有以粪便中所含的成分作为指标的方法。粪便中包含从癌组织剥离的细胞，因而，可以认为粪便的组成能够反映消化道病变。因此，以正常组织中几乎不表达、但癌组织中高表达的基因作为生物标记，以粪便中该基因的mRNA量作为指标，将癌患者与健康正常人相区别。这样，通过用粪便作为分析物，不存在侵袭性，可以飞跃式地改善受验者的检查负担。
例如已经报告了检测粪便中的K-ras、p-53、APC基因突变、微卫星不稳定性等的利用DNA的方法(例如，参照非专利文献1~4)。此外，还开发出了检测粪便中的蛋白激酶C(PKC)等mRNA的方法(例如，参照非专利文献5~7)、考察粪便的细胞级分的CD44变体的表达的方法(例如，参照非专利文献8)、检测粪便中所含的基因组DNA的甲基化的有无的方法(例如，参照非专利文献9)等。
这样，报告了许多可作为生物标记利用的基因，可以以它们在粪便中的含量作为指标，来检测大肠癌。然而，存在的问题是：使用这些生物标记时的灵敏度基本上与便潜血法程度等同或者较之更低。特别是，在群体筛查中，早期癌、癌化可能性高的进行性腺瘤这样的可通过内视镜或手术切除治愈的肿瘤的检测是重要的，但上述任何生物标记对早期癌、进行性腺瘤的检测灵敏度均比便潜血法还要差。因此，强烈希望开发以粪便作为分析物高灵敏度地检测早期癌等的方法。
作为灵敏度高于便潜血法的大肠癌的检测方法，本发明人公开了以粪便中的COX-2(环加氯酶-2，Cyclooxygenase-2)基因的表达量作为指标的方法(例如，参照专利文献1~4。)。COX-2基因作为大肠癌的基因标记是非常优秀的，但还存在COX-2基因的表达量不增大的大肠癌(COX-2阴性大肠癌)，无法检测这样的案例。专利文献3也公开了MMP-7(基质金属蛋白酶-7)基因、Snail基因等可与COX-2基因组合使用的基因标记，但这些基因的表达量许多情况下显示与COX-2基因的表达量基本相同的行为，因此，即使在将这些基因标记组合使用的情况下，提高COX-2阴性大肠癌的检测灵敏度也是困难的。此外，COX-2基因、MMP-7基因、以及Snail基因存在依赖癌的进行性而粪便中的表达量增大的倾向，因而也存在与进行性癌相比，早期癌的检测灵敏度低的问题。
另一方面，有报告称，在大肠癌中，CKB(肌酸激酶B，Creatine kinase B)以及hnRNP F(异源核核糖核酸F，heterogeneous nuclear ribonucleoprotein F)的表达量及细胞内定位发生变化(例如，参照非专利文献10)。还有报告称，对于CKB，除此之外，子宫癌中的表达量也增大，血清中的CKB含量还可以用作子宫癌标记(例如，参照非专利文献11)。然而，关于粪便中的CKB含量作为大肠癌标记的利用可能性，目前完全没有报导。本领域技术人员应当理解的是，编码表达量的增减依赖于癌化的蛋白质的基因未必一定能够作为临床上有用的生物标记加以利用。
现有技术文献
专利文献
专利文献1专利第4134047号公报
专利文献2专利第4206425号公报
专利文献3国际公开第2007／018257号小册子
专利文献4国际公开第2008／093530号小册子
非专利文献
非专利文献1D.Sidransky，et al.，Science，1992年、第256卷、第102~105页。
非专利文献2S.M.Dong，et al.，Journal of the National Cancer Institute，2001年、第93卷、第11号、第858~865页。
非专利文献3G．Traverso，et al.，The New England Journal of Medicine，2002年、第346卷、第5号、第311~320页。
非专利文献4G．Traverso，et al.，The Lancet，2002年、第359卷、第403~404页。
非专利文献5L.A.Davidson，et al.，Carcinogenesis，1998年、第19卷、第2号、第253~257页。
非专利文献6R.J.Alexander and R.F.Raicht，Digestive Diseases and Sciences，1998年、第43卷、第12号、第2652~2658页。
非专利文献7T.Yamao et al.，Gastroenterology，1998年、第114卷、第6号、第1198~1205页。
非专利文献8H.Saito，Japanese Journal of Cancer Research，1996年、第87卷、第10号、第1011~1024页。
非专利文献9T.Nagasaka，et al.，Journal of the National Cancer Institute，2009年、第101卷、第18号、第1244~1258页。
非专利文献10M.Balasubramani，et al.，Cancer Research，2006年、第66卷、第2号、第763~769页。
非专利文献11H.G．Huddleston，et al.，Gynecologic Oncology，2005年、第96卷、第77~83页。
发明内容
发明所要解决的问题
本发明的目的是提供：以粪便中所含的成分作为指标，高灵敏度检测大肠肿瘤、特别是进行性腺瘤、早期癌的方法。
解决问题的方法
本发明人为解决上述问题进行了深入研究，结果在从大肠肿瘤患者提供的粪便提取RNA，并对该RNA中所含的人基因来源的RNA进行解析时，发现大肠肿瘤患者中，与大肠肿瘤非患者(大肠无特别疾病者)相比，粪便中所含的CKB(肌酸激酶B)基因来源RNA的量更多，从而完成了本发明。
即，本发明如下。
(1)大肠肿瘤的检测方法，其是使用标记基因检测大肠肿瘤的方法，其包括：
(A)提取从受验者采集的粪便中所含的RNA的步骤、
(B)测定所述步骤(A)中得到的RNA中的标记基因来源RNA的量的步骤、以及
(C)对所述步骤(B)中测定的标记基因来源RNA的量、与按标记基因的种类预先设定的阈值进行比较的步骤；
其中，
所述标记基因是CKB(肌酸激酶B)基因。
(2)所述(1)所述的大肠肿瘤的检测方法，其中，作为所述标记基因，还使用选自COX-2(环加氯酶-2)基因、MMP-7(基质金属蛋白酶-7，Matrixmetalloproteinase-7)基因、Snail基因、MMP-1(基质金属蛋白酶-1，Matrixmetalloproteinase-1)基因、以及B2M(β2微球蛋白，β2microglobulin)基因中的1种以上的基因。
(3)所述(1)所述的大肠肿瘤的检测方法，其中，作为所述标记基因还使用COX-2基因。
(4)所述(3)所述的大肠肿瘤的检测方法，其中，作为所述标记基因，还使用选自MMP-7基因、Snail基因、MMP-1基因、以及B2M基因中的1种以上的基因。
(5)所述(1)所述的大肠肿瘤的检测方法，其中，作为所述标记基因，还使用MMP-7基因。
(6)所述(3)~(5)中的任何一项所述的大肠肿瘤的检测方法，其检测大肠腺瘤或大肠早期癌。
(7)所述(1)~(5)中的任何一项所述的大肠肿瘤的检测方法，其中，
所述受验者有被诊断为患大肠肿瘤的经历，
对于从所述受验者随时间采集的粪便，分别进行所述步骤(A)~(C)，用于监测该受验者的大肠肿瘤的复发可能性。
(8)大肠肿瘤的基因标记，其由CKB(肌酸激酶B)基因组成。
(9)一种用于使用粪便检测大肠肿瘤的试剂盒，其包含：
用于提取粪便中所含的RNA的器械或试剂，
用于检测CKB(肌酸激酶B)基因来源RNA的探针或引物中的至少一个。
发明的效果
通过采用本发明的大肠肿瘤的检测方法，能够以从受验者采集的粪便作为分析物，提供用于判断该受验者是否患大肠肿瘤的有用信息。
附图说明
图1示出了将实施例1中得到的、粪便中的各标记基因来源RNA量用作大肠肿瘤的基因标记的情况下的ROC(接受者操作特征，ReceiverOperating Characteristic)解析结果。
发明的具体实施方式
在本发明以及本申请说明书中，大肠肿瘤是指发生于大肠的肿瘤，不论良性或恶性，包括大肠腺瘤与大肠癌这两者。
大肠癌的进行程度对确定治疗方法而言是重要因素。大肠癌一般分为临床病期0~IV期。在本发明以及本申请说明书中，各病期分别指以下的状态。
0期：癌止于粘膜内的状态。
I期：癌止于大肠壁内的状态。
II期：癌超越大肠壁的固有肌层、波及壁外的状态。
III期：癌转移至淋巴结的状态。
IV期：癌转移至远端脏器、淋巴结的状态。
大肠早期癌(early cancer)、进行性癌(advanced cancer)是通过壁侵入深度来规定的。早期癌是指:癌的进展部(先進部)局限在大肠壁的粘膜内或粘膜下层，未超出此范围，是临床病期中的0期和I期的一部分。进行性癌是指癌的进展部超出粘膜下层，到达比固有肌层更深处，是临床病期中的I期的一部分、II期、III期和IV期。这些在大肠癌操作规程第7版(大肠癌研究会，金原出版，2006年)中有定义。
大肠腺瘤(adenoma)也根据大小、异型度(異型度)分为小腺瘤和进行性腺瘤(advanced adenoma)。在大肠腺瘤中，有些与大肠早期癌、特别是粘膜癌(0期癌)难以鉴别。其中，超过10mm大小的进行性腺瘤作为与粘膜癌一样、存在将来进展至粘膜下层癌(I期癌)的可能性的肿瘤，被认为是癌。因此，在群体筛查等初筛中，像大肠早期癌一样，检测大肠腺瘤、特别是进行性腺瘤是重要的。
此外，在本发明以及本申请说明书中，“标记基因来源RNA”是指转录自标记基因的基因组DNA的全长或一部分的RNA，可以是该基因的mRNA，也可以是该mRNA的一部分(片段)。
在本发明以及本申请说明书中，“非患者”是指未患大肠肿瘤者，不仅包括健康正常人，还包括患大肠肿瘤以外的疾病者。
＜CKB基因＞
正如本发明人已经阐明的那样，粪便中的COX-2基因来源RNA量是用于检测大肠癌的非常有效的生物标记(参照专利文献1~4)。然而，仅以COX-2基因作为生物标记的情况下，无法检测COX-2阴性的大肠癌。因此，本发明人认为通过将能够检测COX-2阴性的大肠癌的标记基因与COX-2基因组合使用，能够在群体筛查等中以更好的灵敏度检测大肠肿瘤，并进行了这样的新的标记基因的探索。
具体地，从通过内视镜检查等确诊为大肠癌发病、且粪便中的COX-2基因来源RNA的量与健康正常人相比非常多的患者(COX-2强阳性大肠癌患者)，以及通过内视镜检查等确诊为大肠癌发病、但COX-2基因来源RNA的量仅与非患者程度等同的患者(COX-2阴性大肠癌患者)分别采集的粪便，从该粪便提取总RNA，用其进行各基因的表达解析。作为对照，对从健康正常人采集的粪便也同样进行。而且，从这些患者以及健康正常人事前得到了口头或书面形式的知情同意。此外，所采集的粪便的保存、RNA提取像后面的实施例1所述的方法那样进行。
各基因的表达解析通过使用GeneChip(注册商标)阵列的Agilent表达测定解析来进行(外包给AKARABio株式会社Dragon Genomics Center)。其结果，粪便中的COX-2基因来源RNA的量在COX-2强阳性大肠癌患者中是健康正常人的25.3倍，相比之下，在COX-2阴性大肠癌患者中仅为健康正常人的1.4倍。此外，MMP-7基因以及MMP-1基因的各基因来源RNA量也像COX-2基因那样，在COX-2强阳性大肠癌患者中多，但在COX-2阴性大肠癌患者中并未明显高于健康正常人。另一方面可知，CKB基因在COX-2阴性大肠癌患者中，与健康正常人相比，粪便中的表达量上升28.8倍。由这些结果可知：大肠肿瘤患者中，与非患者相比，存在粪便中的CKB基因来源RNA多的倾向；通过使用CKB基因作为大肠肿瘤的标记基因，不仅能够检测COX-2阳性的大肠肿瘤，还能检测COX-2阴性的大肠肿瘤。
＜大肠肿瘤的检测方法＞
本发明的大肠肿瘤的检测方法的特征是，作为大肠肿瘤的基因标记，使用了CKB基因。粪便中的CKB基因来源RNA的量存在在大肠肿瘤患者中比非患者多的倾向。因此，以粪便中的CKB基因来源RNA的量作为指标，能够检测大肠肿瘤的患的有无。即，本发明可以说是一种为了考察大肠肿瘤的患的有无，而使用CKB基因作为大肠肿瘤的基因标记，来检测粪便中的大肠肿瘤的基因标记来源RNA的方法。
在本发明的大肠肿瘤的检测方法中，作为大肠肿瘤的基因标记，可以组合使用CKB基因以外的其他标记基因。通过组合使用2种以上的基因，能够以更好的精度检测大肠肿瘤。对与CKB基因组合的其他标记基因没有特殊限制，是粪便中的该基因来源RNA量在大肠肿瘤患者群与非患者群中存在显著差异的基因即可。
在本发明中，作为与CKB基因组合使用的标记基因，优选使用选自COX-2基因、MMP-7基因、Snail基因、MMP-1基因、以及B2M基因中的1种以上的基因。
已经发现，CKB基因是粪便中的该基因来源RNA的量在COX-2阴性大肠癌患者(COX-2基因来源RNA的量仅为与非患者等同程度的大肠癌患者)中比非患者高的基因，因而能够作为大肠肿瘤的基因标记加以利用。因此，在本发明的大肠肿瘤的检测方法中，作为大肠肿瘤的标记基因，特别优选将CKB基因与COX-2基因组合使用。通过CKB基因与COX-2基因组合使用，能够进一步提高大肠腺瘤、早期癌的检测灵敏度。
作为本发明中使用的大肠肿瘤的标记基因的组合，具体地可以列举出，CKB基因与COX-2基因的组合、CKB基因与COX-2基因与MMP-7基因的组合、CKB基因与COX-2基因与Snail基因的组合、CKB基因与COX-2基因与MMP-1基因的组合、CKB基因与COX-2基因与B2M基因的组合、CKB基因与COX-2基因与MMP-7基因与B2M基因的组合、以及CKB基因与MMP-7基因的组合等。
例如，通过组合使用3个基因，通过CKB基因与COX-2基因与MMP-7基因的组合，与使用CKB基因与COX-2基因与Snail基因的组合、CKB基因与COX-2基因与MMP-1基因的组合、或CKB基因与COX-2基因与B2M基因的组合的情况相比，特别是更能够改善大肠腺瘤的检测灵敏度。此外，特别是，通过组合使用CKB基因与COX-2基因与MMP-7基因与B2M基因这4个基因，能够以非常高的精度且高的灵敏度检测大肠肿瘤。
本发明的大肠肿瘤的检测方法具体地具有下述步骤(A)~(C)。
(A)提取从受验者采集的粪便中所含的RNA的步骤、
(B)测定所述步骤(A)中得到的RNA中的标记基因来源RNA的量的步骤、以及
(C)对所述步骤(B)中测定的标记基因来源RNA的量、和按标记基因的种类预先设定的阈值进行比较的步骤。
以下，按步骤进行说明。
首先，作为步骤(A)，提取从受验者采集的粪便中所含的RNA。在本步骤中，提取的RNA可以按常规方法纯化。对从粪便提取、纯化RNA的方法没有特殊限制，可以采用该技术领域公知的任何方法，可以利用市售的纯化试剂盒等。而且，在转入下面的步骤前，可以预先测定步骤(A)中得到的RNA的量、浓度。对RNA的量、浓度的测定方法没有特殊限制，可以采用吸光度测定法等该技术领域中公知的任何方法。
在步骤(A)中供RNA提取的粪便没有特殊限制，是人来源的即可，例如，可以使用为定期健康检查、诊断等而采集的分析物等。此外，可以是刚排泄后的，也可以是采集后保存一定时间的。对粪便的保存方法没有特殊限制，可以采用临床检查等中对粪便采取的任何保存方法。例如，可以将冷冻保存、冷藏保存的粪便用于RNA提取，也可以使用以浸渍、悬浮的状态保存于各种保存液中的粪便。作为添加到粪便的保存液，优选例如，以水溶性醇类等作为有效成分的粪便试样制备用溶液(参照例如国际公开第2010－024251号小册子。)等、能够抑制粪便中的RNA的损伤而保存的溶液。
步骤(A)中提取的RNA可以直接用于步骤(B)，也可以保存一定时间后用于步骤(B)。RNA的保存可以采用任何方法进行，是能够抑制RNA的分解而保存的方法即可，例如，可以冷冻干燥后保存，也可以以溶解于纯化水中的溶液的状态来保存。
然后，作为步骤(B)，测定步骤(A)中得到的RNA中的标记基因来源RNA的量。对步骤(B)中的标记基因来源RNA的量的测定方法没有特殊限制，可以从通常测定具有特定的碱基序列的核酸的量时采用的公知方法中适宜选择。
而且，在本发明以及本申请说明书中，测定RNA的量不是指严格的定量，可以是半定量的，也可以是能够与指定阈值等进行定量比较的程度的测定。例如，可以采用该技术领域中的公知方法检测标记基因来源RNA，从所得检测结果基于由浓度已知的对照试样的检测结果制作的标准曲线计算得出。对标记基因来源RNA的检测方法没有特殊限制，可以采用该技术领域中公知的任何方法。例如，可以通过使用能够与标记基因来源RNA杂交的探针的杂交法进行检测，也可以通过利用使用能够与标记基因来源RNA杂交的引物和聚合酶的核酸扩增反应的方法进行检测。其他的，还可以利用市售的检测用试剂盒等。
步骤(B)中的测定，可以是对步骤(A)中得到的RNA中存在的标记基因来源RNA直接定量检测，也可以将该RNA中的标记基因来源RNA通过核酸扩增反应进行扩增后进行定量检测。例如，可以通过使用与标记基因来源RNA相邻杂交的2条探针，在杂交后利用连接酶反应进行结合，定量检测所得结合体的方法，使用标记的探针进行Northern印迹法、以标记作为指标定量检测通过杂交形成结合体的探针的量的方法等，直接检测标记基因来源RNA。
因为标记基因来源RNA的量是微量的，因而可以采用利用核酸扩增反应的方法来测定。例如，相对于步骤(A)中得到的RNA的总量或一部分，通过进行逆转录反应合成cDNA后，通过以所得cDNA作为模板进行核酸扩增，检测标记基因来源RNA，能够测定其量。作为以cDNA作为模板的核酸扩增法，通常进行PCR(聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction)，也可以采用LAMP(环介导的等温扩增，Loop-Mediated Isothermal Amplification)法、ICAN(等温和嵌合引物引发的核酸扩增，Isothermal and ChimericPrimer-initiated Amplification of Nucleic acids)法。此外，作为该核酸扩增，通过进行实时PCR等定量PCR，可以在标记基因来源RNA检测的同时简便地进行其定量。其他的，通过从RNA直接扩增RNA的NASBA(基于核酸序列的扩增，Nucleic Acid Sequence-Based Amplification)法，也可以扩增标记基因来源RNA。标记基因来源RNA的扩增产物可以采用该技术领域中的公知方法进行定量。例如，通过将该扩增产物适宜用凝胶、毛细管电泳等进行特异性分离后对其进行检测，能够定量地进行测定。
此外，标记基因来源RNA的检测可以利用Invader(注册商标)法等各种增敏方法。增敏法可以在对步骤(A)中得到的RNA中存在的标记基因来源RNA进行直接检测的情况、和在利用核酸扩增反应进行扩增后进行检测的情况中的任何情况下进行利用。
在作为标记基因组合使用CKB基因与其他基因的情况下，可以分别测定各标记基因来源RNA的量，也可以同时测定。例如，可以以从步骤(A)中得到的RNA的总量或一部分利用逆转录反应得到的cDNA作为模板，按基因的种类分别进行PCR得到扩增产物，也可以通过进行多重PCR等，在1个反应中得到多个基因的扩增产物。
步骤(B)后，作为步骤(C)，将步骤(B)中测定的标记基因来源RNA的量与按标记基因的种类预先设定的阈值进行比较。该阈值是用于识别大肠癌或进行性腺瘤患者群与非患者群的阈值。在测定的标记基因来源RNA量多于预先设定的阈值的情况下为阳性，少于该阈值的情况下为阴性。
步骤(C)中使用的阈值可以由本领域技术人员在考虑步骤(B)中的标记基因来源RNA量的测定方法的种类等的基础上、或通过进行必要的预备检查等，来适宜设定。例如，对于从根据内视镜检查等其他检查方法的结果可知未患大肠疾病的集团(非患者群)采集的粪便、与从根据内视镜检查等其他检查方法的结果可知患大肠癌或者大肠进行性腺瘤的集团(患者群)采集的粪便，通过采用与步骤(B)相同的测定方法求出标记基因来源RNA量，并比较两集团的测定值，能够适宜设定用于识别两个群的阈值。
在设定阈值时，还可以考虑希望的检测精度。在对于非患者群与患者群这两个群，粪便中的标记基因来源RNA量的分布已明确的情况下，可以对阈值进行设定，使得例如，从大肠癌或大肠进行性腺瘤的患者采集的粪便中的标记基因来源RNA量小于阈值的概率(即，判断为非患者的概率)在希望的范围内(例如，10%以下、优选5%以下、更优选2.5%以下、更优选1%以下、特别优选0%)。
此外，在仅对于非患者群，粪便中的标记基因来源RNA量的分布已明确的情况下，可以对阈值进行设定，使得例如在假定受验者为非患者的情况下，从该受验者采集的粪便中的标记基因来源RNA量以非患者的百分位数计为希望的值(例如，90%ile、优选95%ile、更优选97.5%ile、更优选99%ile、特别优选100%ile)。此外，可以对阈值进行设定，使得作为该从受验者采集的粪便中的标记基因来源RNA量小于阈值的显著概率(Ｐ值)为希望的值(例如，10%、优选5%、更优选1%、更优选0.1%)。而且，Ｐ值可以是双侧概率，也可以是单侧概率。在仅对于患者群，粪便中的标记基因来源RNA量的分布已明确的情况下，可以同样对阈值进行设定。而且，Ｐ值可以通过Mann Whitney氏U检验等统计学方法来求出。
具体地，在步骤(B)中测定的CKB基因来源RNA的量(以下称CKB来源RNA量)多于预先设定的阈值的情况下，判定所述受验者为CKB阳性；少于该阈值的情况下，判定所述受验者为CKB阴性。CKB来源RNA量存在在大肠肿瘤患者群中高于非患者群的倾向。因此，得到CKB阳性这个检测结果的受验者正在患大肠肿瘤的可能性高。因此，通过将本发明的大肠肿瘤的检测方法用于群体筛查等初筛，对于判断为CKB阳性的受验者进行内视镜检查等，可以进行确诊。这样，通过本发明的大肠肿瘤的检测方法所得检测结果作为用于大肠肿瘤的诊断的信息是有用的。即，通过本发明的大肠肿瘤的检测方法，能够提供用于大肠肿瘤的诊断的信息。
这样，粪便中的CKB来源RNA量依赖于有无大肠肿瘤的发病，存在大肠肿瘤发病的受验者群高于大肠肿瘤未发病的受验者群的倾向。因此，本发明的大肠肿瘤的检测方法能够用于大肠肿瘤的复发可能性的监测。具体地，从具有被诊断为患大肠肿瘤的经历的受验者随时间采集粪便。对于采集的各粪便，分别进行上述步骤(A)~(C)。例如，从通过外科处理等将已经发病的大肠肿瘤的病变部位切除的受验者，随时间测定粪便中的CKB来源RNA量的情况下，在所得测定值高于预先设定的阈值的情况下，可以判断：在采集该粪便的时间点上，该受验者中大肠肿瘤复发的可能性高。
本发明的大肠肿瘤的检测方法中的灵敏度、特异性可以根据设定的阈值适宜调整。例如，在希望得到充分高的灵敏度的情况下，即希望检测有患大肠肿瘤的情况下，优选设定阈值，使得从大肠肿瘤的患者采集的粪便中的标记基因来源RNA量小于阈值的概率(即，判断为非患者的概率)为1%以下、特别优选0%。另一方面，在用于健康诊断等初筛的情况下，优选特异性高，即便会多少牺牲灵敏度。因此，例如，可以设定阈值，使得从健康正常人采集的粪便中的标记基因来源RNA量超过阈值的概率(即，判断为患者的概率)变得充分小，例如为10%以下、优选5%以下。这样，在本发明的大肠肿瘤的检测方法中，可以兼顾希望的灵敏度、特异性，来设定阈值。
在作为标记基因组合使用CKB基因与其他基因的情况下，按标记基因分别与阈值进行比较，判断阳性或阴性。至少1个标记基因为阳性的受验者患有大肠肿瘤的可能性高。根据大肠肿瘤的类型，多存在多个大肠肿瘤标记中某标记基因为阳性但其他标记基因为阴性的情况。因此，通过将标记基因多种组合使用，能够提高大肠肿瘤检测的灵敏度。
此外，通过使用具备所述步骤(A)以及(B)中使用的试剂、器械等的试剂盒，能够简便地实施本发明的大肠肿瘤的检测方法。该试剂盒具体地包含用于提取粪便中所含的RNA的器械或试剂、以及、用于检测CKB基因来源RNA的探针或引物中的至少一个，可用于利用粪便检测大肠肿瘤。
作为用于提取粪便中所含的RNA的器械或试剂，可以列举出例如，用于将采集的粪便均质化、制备从该粪便所含的细胞提取核酸的悬浮物的悬浮用溶液，用于从所得悬浮物回收、纯化RNA的试剂等。作为该悬浮用溶液，可以在从粪便回收核酸时通常使用的溶液中适宜选择。作为该悬浮用溶液，具体地，可以列举出苯酚溶液、氯仿溶液等。此外，该悬浮用溶液优选包含硫氰酸胍、表面活性剂、螯合剂等RNA分解酶抑制剂。作为用于从悬浮物回收、纯化RNA的试剂等，可以列举出例如，乙醇溶液、二氧化硅等无机载体等。
此外，因为步骤(A)中可以利用市售的核酸纯化试剂盒等，故而将市售的核酸纯化试剂盒、与用于检测CKB基因来源RNA的探针或引物组合而成的制品，也可以作为本发明的试剂盒。
作为用于检测CKB基因来源RNA的探针或引物，可以使用能够与CKB基因来源RNA、或从该RNA得到的cDNA的一部分特异性杂交的寡核苷酸。而且，能够与CKB基因来源RNA等杂交的寡核苷酸可以采用该技术领域中公知的任何方法来设计、制作。
例如，在采用下述方法进行CKB基因来源RNA的检测的情况下，所述方法是以从粪便提取的RNA作为模板通过逆转录反应合成cDNA后、以所得cDNA作为模板使用用于检测CKB基因来源RNA的引物进行PCR等核酸扩增反应，并检测所得扩增产物的方法，本发明的试剂盒中可以包含用于逆转录反应的逆转录酶、随机引物、核苷酸、缓冲液等，用于PCR的聚合酶、标记核苷酸、非标记核苷酸、缓冲液、PCR装置等。
其他的，本发明的试剂盒中可以包含用于采集以人为代表的动物排泄的粪便的采便棒、采集容器等。
实施例
以下给出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受以下实施例的限制。
［实施例1］
＜粪便样品＞
由大肠小腺瘤(肿瘤的大小为5~9mm)患者10名、大肠进行性腺瘤(肿瘤的大小为10mm以上)患者24名、大肠癌患者111名(早期癌25名、进行性癌86名)、上消化道癌患者12名(胃肿瘤患者10名、食道癌患者2名)、以及健康正常人113名提供粪便。各患者是经内视镜、组织学确诊的患者。在本实施例中，大肠未确认肿瘤性病变(但不包含小于5mm的腺瘤性息肉、增生息肉)、明显的炎症性变化，且无出血性病变、全身性疾病以及进行性的癌的人作为健康正常人。此外，大肠癌患者111名中，病期0期11名，病期I期24名，病期II期37名，病期III期25名，病期IV期14名。而且，事先从这些患者以及健康正常人得到了口头或书面形式的知情同意。
分析物(粪便样品)于内视镜检查或活检2~4星期后、手术或内视镜切除前采集。采集的粪便样品先于4℃保存后，在保存开始后24小时以内移至－80℃保存，直至进行RNA提取处理。
＜从粪便样品提取、纯化RNA＞
在已灭菌的5mL管中加入约0.5ｇ的冷冻的粪便样品和3mL的Isogen(Nippongene公司制造)后，用匀浆器混合，使之均一化。将所得浆料以各约0.7mL分装于已灭菌的1.5mL管中后，12,000×g、4℃离心5分钟，将其上清分装在新的已灭菌的1.5mL管中。在各管中分别加入0.3mL的Isogen和0.3mL的氯仿，将管用涡旋搅拌器（Voltex）剧烈搅拌30秒后，12,000×g、4℃离心15分钟。从管上面回收所得水相，注意不要污染，移入新的1.5mL管中。加入等量的70%乙醇溶液后，将管用涡旋搅拌器剧烈搅拌30秒。从所得混合液使用RNeasy小提试剂盒(QIAGEN公司制造)提取并纯化RNA。将纯化的RNA用NanoDrop 1000(NanoDrop Wilmington公司制造)进行定量。将RNA保存于－80℃，直至用于以后的解析。
＜标记基因来源RNA量的测定＞
使用纯化的RNA、随机六聚体和逆转录酶M-MLV(RNAseH-;TAKARABio公司制造)，在最终容量20μL的反应液中按使用说明书合成cDNA。
通过以合成的cDNA作为模板进行定量实时PCR，针对该cDNA中的CKB基因、COX-2基因、MMP-7基因、Snail基因、MMP-1基因、以及B2M基因，对从粪便中的各基因来源RNA合成的cDNA的量进行了定量。用于检测这些标记基因的TaqMan(注册商标)引物或探针组分别使用了AppliedBiosystems公司的市售品。而且，这些组所含的探针是5’端侧用荧光物质FAM标记、3’端侧用消光物质标记的报告探针。具体地，在1μL的cDNA溶液和1μL的20×TaqMan引物与探针混合物（primers and probe mixture，Applied Biosystems公司制造)中加入已灭菌的纯化水，将最终容量制备为20μL，以此作为PCR反应溶液。对于按基因分别制备的PCR溶液，以95℃处理20秒后、将95℃3秒、62℃30秒进行60个循环的反应条件，使用7500快速实时PCR系统(Applied Biosystems公司制造)，一边实时测定荧光强度，一边进行核酸扩增(PCR)。作为计算拷贝数的对照试样(标准物质)，使用载入了各基因的cDNA的质粒，同时进行了扩增。
针对测定结果所得的标记基因来源RNA量(拷贝数)的统计学处理通过Mann Whitney氏U检验进行。此外，全部统计学处理采用双侧检验进行，Ｐ值＜0.05为统计上显著。
而且，标记基因来源RNA的大部分是该基因来源的mRNA，因而以下以mRNA记载。
＜免疫学便潜血检查(IFOBT(single))＞
对于与用于标记基因来源RNA量的测定的同一粪便，进行免疫学便潜血检查(MPA)法(1次)，检测了潜血的有无。免疫学便潜血检查使用市售的便潜血试剂盒“Magstream(注册商标)HemSp-N”(磁性粒子凝集反应药)(FuJiRebio公司制造，产品号：214794)按照附带的规程进行。
＜各标记基因的mRNA量的测定结果＞
各标记基因的mRNA的拷贝数如表1所示。表1中，上部的数值是平均值，下部是分布范围。此外，“其他癌症”显示的是上消化道癌患者的结果。由该结果可知，粪便中的CKB的mRNA量像COX-2等公知的大肠癌标记那样，在大肠癌、以及大肠进行性腺瘤的大肠肿瘤患者群中，显著多于健康正常人群。即，由这些结果可知，通过设定适当的阈值，以粪便中的CKB基因来源RNA量作为指标，能够检测大肠肿瘤。特别是，与COX-2等相比，CKB的mRNA量在大肠进行性腺瘤患者群中的拷贝数更加显著地多于健康正常人群，因此可以说能够更高灵敏度地检测大肠进行性腺瘤。
[表1]
Figure BDA00002577325500161
＜截留值的设定＞
为了设定各标记基因的用于识别大肠肿瘤患者与非患者的阈值(截留值)，对健康正常人群、大肠癌群、以及大肠进行性腺瘤群中各标记基因的拷贝数进行了解析。
表2中显示出了健康正常人群中的各标记基因的拷贝数的平均值、标准偏差(SD)、中位值、95百分位数值以及97.5百分位数值。此外，表3以及表4中示出了大肠癌群以及大肠进行性腺瘤群中的各标记基因的拷贝数的平均值、标准偏差(SD)、中位值以及25%值。根据这些结果，将CKB基因的截留值设定为1450、COX-2基因的截留值设定为58、MMP-7基因的截留值设定为5、Snail基因的截留值设定为9、MMP-1基因的截留值设定为37、B2M基因的截留值设定为21000。
[表2]
[表3]
Figure BDA00002577325500172
[表4]
Figure BDA00002577325500173
＜各标记基因的大肠癌检测的灵敏度以及特异性＞
使用上述设定的截留值，判断各样品的阳性、阴性，计算出大肠癌检测的灵敏度以及特异性，并与免疫学便潜血检查(IFOBT(single))的结果进行了比较。计算结果如表5所示。该结果显示，COX-2基因的灵敏度、特异性均优于免疫学便潜血检查，而CKB基因的特异性与免疫学便潜血检查等同，但灵敏度低于免疫学便潜血检查。表5中，“95%CI”是95%置信区间(%)。而且，针对后面的全部样品的灵敏度以及特异性的Ｐ值的计算均通过χ2检验(卡方检验，chi-square test)进行。此外，全部统计学处理均以双侧检验进行，Ｐ值＜0.05为统计上显著。
[表5]
Figure BDA00002577325500191
＜各标记基因的ROC解析＞
为了考察各标记基因作为大肠肿瘤检测用标记的性能，进行了ROC(Receiver Operating Characteristic，接受者操作特征)解析。ROC解析中使用PASW statistics ver.18(IBM制)进行作图。解析结果如表6以及图1所示。图1中以灵敏度为纵轴、1-特异性为横轴，作出了ROC曲线。
[表6]
曲线下的区域面积
Figure BDA00002577325500201
a.非参数假定下
b.零假设:真面积＝0．5
由其结果可知，CKB基因来源RNA量与COX-2基因来源RNA量、MMP-7基因来源RNA量、B2M基因来源RNA量、以及免疫学便潜血检查一样，曲线下区域的面积为0.5以上，作为用于检测大肠肿瘤的标记是良好的。
＜多标记基因组合情况下的大肠癌检测的灵敏度以及特异性＞
计算出CKB基因与其他标记基因组合的情况下大肠癌检测的灵敏度以及特异性，并进行了比较。计算结果如表7以及8所示。
[表7]
Figure BDA00002577325500211
[表8]
Figure BDA00002577325500212
结果是，在2种标记基因组合使用的情况下，CKB基因与COX-2基因的组合灵敏度最好。特别是，尽管单独使用时CKB基因的检测灵敏度低于MMP-1基因，CKB基因与COX-2基因的组合的灵敏度优于MMP-1基因与COX-2基因的组合。
＜各标记基因不同病期的大肠肿瘤检测灵敏度＞
使用上述设定的截留值，判断各样品的阳性、阴性，计算出不同病期大肠肿瘤的检测灵敏度以及特异性，并与免疫学便潜血检查(IFOBT(single))的结果进行了比较。计算结果如表9所示。表9中，“0_Ca”~“IV_Ca”分别表示大肠癌的病期0期~IV期。由该结果可知，CKB基因能够比免疫学便潜血检查灵敏度更高地检测0期的大肠癌。
[表9]
Figure BDA00002577325500221
＜多标记基因组合情况下不同病期的大肠肿瘤的检测灵敏度＞
计算出CKB基因与其他标记基因组合的情况下不同病期的大肠肿瘤的检测灵敏度，并进行了比较。计算结果如表10所示。由该结果可知，通过将CKB基因与其他的基因、特别是COX-2基因、MMP-7基因组合，能够提高单独时灵敏度低的大肠肿瘤的检测灵敏度。这其中，通过将CKB基因和COX-2基因进一步与MMP-7基因、Snail基因、MMP-1基因、或B2M基因组合，能够以非常高的灵敏度进行大肠进行性腺瘤、0期、I期的癌的检测。特别是，通过设定合适的截留值，能够以50%以上这样的非常高的灵敏度检测大肠进行性腺瘤。
[表10]
＜多标记基因组合时累积病期的大肠肿瘤的检测灵敏度＞
计算出CKB基因与其他标记基因组合时累积病期的大肠肿瘤的检测灵敏度，并与免疫学便潜血检查(IFOBT(single))的结果进行了比较。计算结果如表11所示。表11中，“Ad~0_Ca”~“Ad~IV_Ca”分别表示从大肠进行性腺瘤至大肠癌的各病期的累积病期。表11中，作为比较对象，示出了COX-2基因单独使用的情况、COX-2基因与MMP-1基因组合的情况。由这些结果也可知，通过将CKB基因与其他标记基因组合使用，能够以高灵敏度检测大肠肿瘤，而且通过与COX-2基因组合使用，特别是通过将COX-2基因与MMP-7基因组合使用，能够以非常高的灵敏度检测大肠肿瘤。
[表11]
Figure BDA00002577325500241
而且，计算出将CKB基因、COX-2基因、MMP-7基因和B2M基因这4个基因组合时大肠癌检测的灵敏度以及特异性、以及累积病期的大肠肿瘤的检测灵敏度，并与仅使用COX-2基因的情况、将COX-2基因与MMP-7基因组合使用的情况、将COX-2基因与B2M基因组合使用的情况、将COX-2基因与CKB基因组合使用的情况、以及免疫学便潜血检查(IFOBT(single))的结果进行了比较。计算结果如表12以及13所示。结果是，CKB基因、COX-2基因、MMP-7基因与B2M基因组合使用的情况下，具有最高灵敏度。特别是，提示这4个基因组合的情况下灵敏度在显著概率(Ｐ值)为非常小0.001以下、要求高精度的临床检查中，也十分有用。
[表12]
CRC的排泄物RNA检测与IFOBT的比较
[表13]
排泄物RNA检测与IFOBT按累积阶段的灵敏度
工业实用性
通过采用本发明的大肠肿瘤的检测方法，能够精度良好地检查大肠肿瘤、特别是大肠进行性腺瘤、0期和I期的癌的患的有无，因而，本发明的大肠肿瘤的检测方法能够用于使用粪便试样的临床检查等领域、特别是要求高可靠性和安全性的临床检查等领域。

Claims (5)

1.与标记基因来源的RNA分别进行杂交的探针或引物在制造进行大肠肿瘤的检测的检测诊断试剂中的应用，所述标记基因包括CKB(肌酸激酶B)基因、COX-2(环加氧酶-2)基因以及MMP-7基因，所述大肠肿瘤的检测具有下述步骤：
(A)提取从受验者采集的粪便中所含的RNA的步骤、
(B)使用所述探针或引物测定所述步骤(A)中得到的RNA中标记基因来源RNA的量的步骤、
(C)将所述步骤(B)中测定的标记基因来源RNA的量与按标记基因的种类预先设定的阈值进行比较的步骤、以及
在测定的标记基因来源RNA量多于预先设定的阈值的情况下判定为阳性的步骤。
2.权利要求1所述的探针或引物在制造进行大肠肿瘤的检测的检测诊断试剂中的应用，其中，作为所述标记基因，还使用选自Snail基因、MMP-1基因、以及B2M基因中的1种以上的基因。
3.权利要求1或2所述的探针或引物在制造进行大肠肿瘤的检测的检测诊断试剂中的应用，其中，检测的大肠肿瘤为大肠腺瘤或大肠早期癌。
4.权利要求1或2所述的探针或引物在制造进行大肠肿瘤的检测的检测诊断试剂中的应用，其中，所述受验者有被诊断为患大肠肿瘤的经历，
对于从所述受验者随时间采集的粪便，分别进行所述步骤(A)～(C)，用于监测该受验者复发大肠肿瘤的可能性。
5.用于利用粪便检测大肠肿瘤的试剂盒，其包含：
用于提取粪便中所含的RNA的器械或试剂，
用于检测CKB(肌酸激酶B)基因来源RNA的探针或引物中的至少一个；
用于检测COX-2(环加氧酶-2)基因来源RNA的探针或引物中的至少一个；
用于检测MMP-7基因来源RNA的探针或引物中的至少一个。
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Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6030367B2 (ja) * 2012-07-24 2016-11-24 日本光電工業株式会社 細胞解析方法および細胞解析装置
ES2941477T3 (es) 2012-08-13 2023-05-23 Univ Rockefeller Agonista de LXRbeta para el tratamiento de cáncer
WO2014071067A2 (en) 2012-10-31 2014-05-08 The Rockefeller University Treatment and diagnosis of colon cancer
WO2015106164A1 (en) 2014-01-10 2015-07-16 Rgenix, Inc. Lxr agonists and uses thereof
JP2015177745A (ja) * 2014-03-18 2015-10-08 愛知県 肺癌の検査方法
ES2813829T3 (es) * 2014-08-22 2021-03-25 Abbott Lab Métodos para la detección temprana del cáncer colorrectal
WO2019104062A1 (en) 2017-11-21 2019-05-31 Rgenix, Inc. Polymorphs and uses thereof
ES2982346T3 (es) 2019-12-13 2024-10-15 Inspirna Inc Sales metálicas y usos de las mismas
CN112226521B (zh) * 2020-12-10 2021-03-16 康妍葆(北京)干细胞科技有限公司 鉴定牙周膜干细胞的试剂盒及方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101233243A (zh) * 2005-08-10 2008-07-30 财团法人浜松科学技术研究振兴会 大肠癌标记的检测方法
CN101392291A (zh) * 2007-09-20 2009-03-25 希森美康株式会社 癌细胞存在与否的判断方法及其装置

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT1033364E (pt) * 1999-03-01 2005-07-29 Pfizer Prod Inc Ciano com acidos oxamicos e derivados como ligandos de receptores de tiroide
US7235358B2 (en) * 2001-06-08 2007-06-26 Expression Diagnostics, Inc. Methods and compositions for diagnosing and monitoring transplant rejection
US20060141493A1 (en) * 2001-11-09 2006-06-29 Duke University Office Of Science And Technology Atherosclerotic phenotype determinative genes and methods for using the same
US20090011413A1 (en) * 2005-12-14 2009-01-08 Canon Kabushiki Kaisha Method for screening colon cancer cells and gene set used for examination of colon cancer

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101233243A (zh) * 2005-08-10 2008-07-30 财团法人浜松科学技术研究振兴会 大肠癌标记的检测方法
CN101392291A (zh) * 2007-09-20 2009-03-25 希森美康株式会社 癌细胞存在与否的判断方法及其装置

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Clinical applications of microarray technology: creatine kinase B is an up-regulated gene in epithelial ovarian cancer and shows promise as a serum marker;HUDDLESTON HG. ET AL;《GYNECOLOGIC ONCOLOGY》;20050131;第96卷(第1期);77-83 *
Donald W. Mercer等.Multiple Markers of Malignancyin Sera of Patients with Colorectal Carcinoma: Preliminary Clinical Studies.《clinical chemistry》.1985,第31卷(第11期),第1824-1828页.
HUDDLESTON HG. ET AL.Clinical applications of microarray technology: creatine kinase B is an up-regulated gene in epithelial ovarian cancer and shows promise as a serum marker.《GYNECOLOGIC ONCOLOGY》.2005,第96卷(第1期),77-83.
Multiple Markers of Malignancyin Sera of Patients with Colorectal Carcinoma: Preliminary Clinical Studies;Donald W. Mercer等;《clinical chemistry》;19851130;第31卷(第11期);第1824-1828页 *

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