CN101392291A - 癌细胞存在与否的判断方法及其装置 - Google Patents

癌细胞存在与否的判断方法及其装置 Download PDF

Info

Publication number
CN101392291A
CN101392291A CNA2008101612461A CN200810161246A CN101392291A CN 101392291 A CN101392291 A CN 101392291A CN A2008101612461 A CNA2008101612461 A CN A2008101612461A CN 200810161246 A CN200810161246 A CN 200810161246A CN 101392291 A CN101392291 A CN 101392291A
Authority
CN
China
Prior art keywords
value
expression amount
sample
gene expression
cancer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CNA2008101612461A
Other languages
English (en)
Inventor
大友泰裕
中林一树
庄司佳代
高田英基
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sysmex Corp
Original Assignee
Sysmex Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sysmex Corp filed Critical Sysmex Corp
Publication of CN101392291A publication Critical patent/CN101392291A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/10—Gene or protein expression profiling; Expression-ratio estimation or normalisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

本发明提供一种判断有无癌细胞的方法及用该方法判断有无癌细胞的装置。该方法包括以下步骤：测定步骤，测定含采自患者的细胞的试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；标准化步骤，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值进行标准化处理；第二比较步骤，比较标准化步骤所得标准化值和第二阈值；及判断步骤，根据第一比较步骤和第二比较步骤所获得的比较结果，判断试样中有无癌细胞。

Description

癌细胞存在与否的判断方法及其装置
技术领域：
本发明涉及一种判断含有采自患者特别是疑为癌转移患者的细胞的试样中有无癌细胞的方法及仪器。
背景技术：
检查从患者身上采集的试样中有无癌细胞可以作为判断癌细胞是否向该试样采集的组织和器官转移的指标。为了判断试样中是否存在癌细胞，过去多采用巴氏染色法等组织细胞诊断法。然而，这种方法存在诊断结果因作诊断者经验而各异、检查时间长等问题。
最近，使用LAMP(loop-mediated isothermal amplificationmethod)法和PCR(聚合酶链反应，polymerase chain reaction)法等进行癌分子病理检查的研究日渐盛行。这种分子病理检查可以通过检测组织和细胞等所含癌标志基因(比如可以在癌细胞特异表达的蛋白质的mRNA等(以下也简称为癌标志物))进行。比如，众所周知，作为诊断乳腺癌淋巴结转移的癌标志基因，细胞角蛋白19(CK19)和癌胚抗原(CEA)的mRNA很有用。人们都知道作为判断胃癌转移的癌标志物CEA非常有用。这些癌标志物是公认在正常试样中的癌标志物表达量和在有转移癌细胞的试样中的癌标志物表达量之间具有有效差异的分子。
根据癌标志物表达量得出的有无癌细胞的判断结果可以作为比如医生诊断患者有无癌细胞向特定组织转移的指标。
过去，进行这种分子检查时，由于每个试样所含细胞数量不同，都将待分析癌标志物的表达量换算为平均每个细胞的表达量(标准化)。然后，将试样中的癌标志物的标准化表达量与阈值比较，来判断有无癌细胞。具体而言，比如用管家基因(据说在多数组织和细胞中都有一定表达的基因)的表达量除癌标志基因的表达量，换算为每个管家基因表达量的癌标志物数量，以此进行标准化处理(M.Inokuchi等著，英国癌症杂志(2003)89，1750-1756)。
美国公报第2007264635号发表了一个获得预测胃癌复发信息的方法，即进行一定基因的PCR扩增反应，测定其扩增产物。更具体地公开了各不相同的实施例：用β-肌动蛋白对测定结果进行标准化处理判断胃癌复发的实施例4和未进行标准化处理进行复发判断的实施例5。
发明内容：
本发明的范围只由后附权利要求书所规定，在任何程度上都不受这一节发明内容的陈述所限。
然而，根据进行标准化处理的结果作出判断的方法是以细胞为均一系细胞(作为分析对象的标本中所有细胞实质上为同一种细胞)为前提考虑的。比如，当试样中既有正常细胞又有癌细胞时，用管家基因表达量除癌标志物表达量进行标准化处理的值因正常细胞和癌细胞的比率而变化。因此，判断结果会被试样中的正常细胞和癌细胞的比率而左右。
即，基于标准化结果的判断方法当在研究级别使用诸如培养细胞等均质化细胞为试样时，是有效的方法。但是，在临床标本那种从患者采集的试样中往往混入正常细胞。因此，在采自患者的试样中，运用基于标准化结果的判断方法出现了问题。特别是为判断癌转移所采集的试样是尚不知道是否存在癌细胞的试样，很难运用基于标准化结果的判断方法。
与此相反，采用不进行标准化而根据癌标志物表达量判断的方法，只要从患者采集的试样中癌标志物表达量达到一定水平，就可以检测出癌细胞。因此，可以解决在上述标准化中的问题。另一方面，用此方法要求用于癌标志物表达量测定的试样数量达到一定量以上。然而，实际上从患者采集的试样往往并不是以良好的状态供测定癌标志物表达量之用。比如，在腹腔冲洗液中，有时无法取得足够量的细胞。还会出现腹腔冲洗液中的细胞损伤或被破坏的情况。因此，即使细胞量本身可以采集到一定量，也会有细胞所含DNA和RNA等核酸分解，待测癌标志基因的绝对量减少的情况。
于是，本发明者发现，将试样中所含癌标志基因表达量与阈值的比较结果同用管家基因表达量对癌标志基因表达量进行标准化处理所得标准化值与阈值的比较结果组合起来，可以更准确地判断有无癌细胞，进而判断癌的转移。从而完成了本项发明。
即，本发明提供：
一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的方法，包括：
测定步骤，测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值进行标准化处理；
第二比较步骤，比较在标准化步骤所得标准化值和第二阈值；及
判断步骤，根据第一比较步骤和第二比较步骤所获得的比较结果，判断试样中有无癌细胞。
所述方法中判断步骤，用于当癌标志基因表达量的值大于第一阈值时、及/或标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
所述判断步骤包括：
根据第一比较步骤中所得比较结果判断试样中有无癌细胞的第一判断步骤；
根据第二比较步骤中所得比较结果判断试样中有无癌细胞的第二判断步骤。
所述方法中第一判断步骤当癌标志基因表达量的值大于第一阈值时，判断试样中存在癌细胞。
所述方法中第二判断步骤当标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
所述方法中判断步骤，用于当第一判断步骤和第二判断步骤中至少一个步骤判断试样中存在癌细胞时，作出试样中存在癌细胞的判断。
所述方法中从患者身上采集的细胞是淋巴结组织、血液或体腔清洗液中所含细胞。
所述方法中有关癌标志基因表达量的值为测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值；
有关管家基因表达量的值是测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值。
所述方法中癌标志基因是细胞角蛋白、癌胚抗原、MUC1粘蛋白或乳腺球蛋白基因。
所述方法中管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶、亲环蛋白、β-肌动蛋白或α-微管蛋白基因。
本发明还提供一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的方法，包括：
测定步骤，测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，当在第一比较步骤中，有关癌标志基因表达量的值小于第一阈值时，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值进行标准化处理；
第二比较步骤，比较在标准化步骤所得标准化值和第二阈值；及
判断步骤，根据第一比较步骤或第二比较步骤所获得的比较结果，判断试样中有无癌细胞。
前述方法中从患者身上采集的细胞是淋巴结组织、血液或体腔清洗液中所含细胞。
有关癌标志基因表达量的值为测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值；
有关管家基因表达量的值是测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值。
癌标志基因是细胞角蛋白、癌胚抗原、MUC1粘蛋白或乳腺球蛋白的基因。
管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶、亲环蛋白、β-肌动蛋白或α-微管蛋白的基因。
本发明另提供一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的仪器，包括：
测定装置，用于测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；及
计算机系统，用于根据测定装置获得的测定结果判断试样中有无癌细胞；
其中，计算机系统含有在处理器控制下的存储器，存储器储存有可使处理器进行以下处理的命令：
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值标准化；
第二比较步骤，比较标准化步骤所得标准化值与第二阈值；
判断步骤，根据第一比较步骤和第二比较步骤所得比较结果，判断试样中有无癌细胞；及
输出步骤，输出判断步骤所得出的判断结果。
所述仪器中判断步骤，用于当有关癌标志基因表达量的值大于第一阈值时、及/或标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
所述仪器中测定装置通过测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获取有关癌标志基因表达量的值，通过测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获得有关管家基因表达量的值。
本发明再提高一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的仪器，包括：
测定装置，用于测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；及
计算机系统，用于根据测定装置获得的测定结果判断试样中有无癌细胞；
其中，计算机系统含有在处理器控制下的存储器，存储器储存着可使处理器进行以下处理的命令：
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，当在第一比较步骤中有关癌标志基因表达量的值小于第一阈值时，根据有关管家基因表达量的值使有关癌标志基因表达量的值标准化；
第二比较步骤，比较标准化步骤所得标准化值与第二阈值；
判断步骤，根据第一比较步骤或第二比较步骤所得比较结果，判断试样中有无癌细胞；及
输出步骤，输出判断步骤所得出的判断结果。
前述仪器中测定装置通过测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获取有关癌标志基因表达量的值，通过测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获得有关管家基因表达量的值。
运用本项发明的判断有无癌细胞的方法及其仪器可以将含采自患者的细胞的试样状态所带来的影响缩小到最低限度，从而更正确地判断癌细胞的有无。因此，可以为医生判断患者癌转移提供更正确的指标。
附图说明：
[图1]为本发明一实施方式的判断仪器的整体结构的斜视图。
[图2]为作为图1所示判断仪器中的测定装置的核酸扩增测定装置整体结构斜视图。
[图3]为图2所示核酸扩增测定装置的平面略图。
[图4]为本发明一实施方式的判断仪器的框图。
[图5]为本发明一实施方式的判断仪器的处理流程图。
[图6]为本发明一实施方式的判断仪器的处理流程图。
[图7]为本发明判断仪器的显示器的显示例示图。
[图8]为实施例结果的显示图表。
具体实施方式：
本实施方式是判断含从患者采集的细胞的试样中有无癌细胞的方法。该患者最好是以判断有无癌细胞为目的的患者、特别是以判断癌转移为目的的患者。从该患者采集的细胞以淋巴结细胞、血液和体腔清洗液中所含细胞为宜。
特别是体腔清洗液有试样状态不好的情况。而且，体腔清洗液往往采集后过一段时间才用于测定，试样状态更加恶化。因此，本实施方式的方法作为判断体腔清洗液是否含癌细胞的方法是有用的。
上述所谓体腔清洗液一般是为检查有无癌转移而用生理盐水冲洗癌病灶周围的体腔内部所得的液体。作为来自患者的体腔清洗液可以是腹腔清洗液和胸腔清洗液等。其中腹腔清洗液有肝下面清洗液、左横隔膜下清洗液和Douglas窝(直肠子宫陷凹)清洗液等。
上述标本最好进一步处理，以获得供测定用的测定试样。
当上述标本为淋巴结组织时，上述测定试样可以通过用处理液处理淋巴结组织获得。该处理液最好含有DMSO(二甲亚砜)。该处理液中的DMSO浓度以约5～30容量％为宜，约10～25容量％更好。
当上述标本为体腔清洗液时，可以从浓缩了体腔清洗液所含细胞的细胞悬浊液中获得核酸提取物，以此作为测定试样。细胞悬浊液可通过离心分离等方法浓缩体腔清洗液中的细胞。核酸提取物可通过在该技术领域周知的核酸抽取法处理细胞悬浊液获得。也可用经处理液处理细胞悬浊液生成的试样作为测定试样。另外，体腔清洗液往往标本中的核酸已被破坏，因此最好使用核酸提取物作为测定试样。
上述处理液除DMSO外，还可根据需要含有缓冲剂和表面活性剂等。
该缓冲剂只要使该处理液的pH保持在2.5～5.0即可，如甘氨酸盐酸缓冲剂等。缓冲剂的浓度只要能保持该处理液的pH在上述范围内即可，无特别限定。
上述表面活性剂是该领域常用的表面活性剂即可，无特别限定，但以非离子型表面活性剂为宜，聚氧乙烯类非离子型表面活性剂更好。特别以以下通式表示的聚氧乙烯类非离子型表面活性剂最为合适：
R1-R2-(CH2CH2O)n-H
(在此，R1是碳原子数10～22的烷基、链烯基、炔基或异辛基；R2是-O-或-(C6H6)-O-；n为8～120的整数。)
比如有：聚氧乙烯月桂醚(Polyoxyethylene Lauryl Ether)、聚氧乙烯鲸蜡醚(Polyoxyethylene Cetyl Ether)、聚氧乙烯油基醚(Polyoxyethylene Oleyl Ether)、聚氧乙烯肉豆蔻基醚(Polyoxyethylenemyristyl Ether)、聚氧乙烯硬脂醚(Polyoxyethylene Stearyl Ether)、壬基酚聚氧乙烯醚(Polyoxyethylene Nonylphenyl Ether)和聚氧乙烯异辛苯酚醚(Polyoxyethylene Isooctyl phenol Ether)等。具体而言，尤以Brij35(聚氧乙烯(35)月桂醚)等比较适宜。表面活性剂的浓度为该领域中常用的浓度即可，无特别限定，如为处理液的0.1～6容量％为宜，1～5容量％更好。
上述处理液与淋巴结组织、细胞悬浊液的混合比例无特别限定。比如，可以在1mg淋巴结组织中添加0.0001～0.005mL左右的处理液加以混合。上述混合方法无特别限定，比如可以在室温进行至淋巴结组织与处理液充分混合为止。
含上述DMSO的处理液和淋巴结组织混合后，最好破碎淋巴结组织。破碎的方法可以用注射器反复吸吐均化、均化器均化或冻结融化等方法。作为均化器，在该领域常用的即可，比如：韦林氏搅切器、Potter-Elvehjem型均化器、Polytron型均化器和杜恩斯均化器、弗氏压碎器和超声波破碎机等。破碎条件根据使用方法和装置适当设定，该领域常用的条件即可。
用上述方法破碎的破碎液可以通过离心分离、过滤器过滤、柱层析等常用的提纯方法进行初提纯。也可根据检出的癌标志基因种类，用核酸提取法等方法进行再提纯。
在本实施方式的方法的测定步骤中，测定试样中癌标志基因和管家基因各表达量的相关值。
在本说明书中，所谓“癌标志基因”指在癌细胞中表达量比在正常细胞中表达量有意义地多的分子标志基因。因此，癌标志基因最好是mRNA、DNA等核酸，mRNA更好。
上述癌标志基因最好是CK18、CK19、CK20等细胞角蛋白(CK)、癌胚抗原(CEA)、MUC1粘蛋白和乳腺球蛋白(MMG)等蛋白质基因。
上述管家基因只要是已知在多数细胞中均有一定量表达的基因即可，无特别限定。上述管家基因最好是3-磷酸甘油醛脱氢酶基因、亲环蛋白基因、β-肌动蛋白基因或α-微管蛋白基因。
在上述测定步骤中测定的有关癌标志基因和管家基因各自的表达量的值是根据各基因表达量测定法适当选择的值。有关上述癌标志基因和管家基因表达量的值最好是关于各自基因的mRNA量的值。上述关于癌标志基因和管家基因表达量的值以用核酸扩幅法扩增该mRNA再测定的值为宜。此时，有关癌标志基因和管家基因表达量的值可以是用一定引物对mRNA或对应的cDNA进行一定时间扩增所测定的荧光强度、浊度、吸光度等，或用一定引物扩增mRNA或相应cDNA时荧光强度、浊度、吸光度等达到某一一定值所需的时间或PCR循环数等光学测定的值。
上述核酸扩增可以按照该领域常用的方法进行。特别以基于LAMP(环介导等温扩增法)和PCR(聚合酶链反应)法的核酸扩增法为宜。当用核酸扩增法扩增癌标志基因和管家基因的mRNA时，可以使用在核酸扩增反应前含逆转录反应的核酸扩增法(如RT-PCR法、RT-LAMP法等)。
上述核酸扩增法具体而言，可以在上述试样中添加用于扩增癌标志基因或管家基因的相应cDNA的引物、RNA依赖型DNA聚合酶(逆转录酶)和DNA依赖型DNA聚合酶(以下也称为DNA聚合酶)等制备反应液，进行核酸扩增，测定经扩增的cDNA的相关值。
上述逆转录反应和核酸扩增反应可根据作为铸模的癌标记基因和管家基因物的序列和引物的序列适当改变条件。逆转录反应和核酸扩增反应的条件，可以使用比如由纽约冷泉港实验室出版的J.萨姆布鲁克等著(1989)的分子克隆：实验室手册(第二版)上记载的条件。
用于扩增与上述癌标记基因和管家基因相应的cDNA的引物序列可以根据癌标记基因和管家基因的序列适当选择。引物的长度可以是5～100核甙酸，10～50核甙酸更好。引物可以用在该技术中周知的核酸合成法制造。
用于扩增上述癌标志基因和管家基因的相应cDNA的引物比较理想的如以下表1所示。
[表1]
Figure A200810161246D00191
上述引物序列不限于表1所示引物，专业人士可以从这些全部基因的已知序列中选择适当引物。
上述引物也可以用在该技术领域常用的技术进行修饰。上述引物的标记可以用放射活性元素或无放射活性分子进行。所用放射活性同位素可以列举出32P、33P、35S、3H或125I。无放射活性物质可以从生物素、抗生生物素蛋白、链霉亲和素或诸如地谷新配质那样的配体、半抗原、色素和诸如放射线发光性、化学发光性、生物发光性、荧光或磷光性试剂那样的发光性试剂中选择。
有逆转录活性的酶和DNA聚合酶可以使用在该技术领域众所周知的东西。作为具有逆转录活性的酶如有AMV(AvianMyeloblastosis Virus)逆转录酶和M-MLV(Molony MurineLeudemia Virus)逆转录酶等。作为DNA聚合酶可以使用TaqDNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶、T4DNA聚合酶和Bst DNA聚合酶等。
通过测定有关上述核酸扩增生成的核酸扩增产物的值，即可测定癌标志基因和管家基因表达量的相关值。当癌标志基因和管家基因表达量的相关值为该基因的mRNA量时，推荐采用定量RT-PCR(Quantitative Reverse Transcription-PCR)和定量RT-LAMP(Quantitative Reverse Transcription-LAMP)等方法。采用这些方法，随着核酸(cDNA)的扩增，反应液的光学状态(浊度、吸光度、荧光强度等)会发生变化，因此，实时测定之，即可测定癌标志基因和管家基因表达量的相关值。
作为RT-PCR的具体例子可以举出SYBR Green法(嵌合荧光法)：预先在核酸扩增反应前的反应液中添加SYBR Green，实时测定扩增反应中随着cDNA的扩增而增强的荧光强度；及Taqman(注册商标)法：添加Taqman(注册商标)探针进行扩增反应，实时测定随着cDNA的扩增而增强的荧光强度。癌标志基因和管家基因表达量的相关值也可以作为反应液的荧光强度达到一定值所需的循环数测定。
使用定量RT-LAMP时，随着cDNA的扩增，作为副产品生成大量焦磷酸镁。此焦磷酸镁为非溶性，反应液会随焦磷酸镁的增加而变浊。因此，通过实时对反应液的浊度(或吸光度)进行光学测定也可以测定癌标志基因和管家基因表达量的相关值。另外，在RT-LAMP法中也可使用上述SYBR Green法。癌标志基因和管家基因表达量的相关值也可以作为反应液的浊度、吸光度、荧光强度等达到一定值所需时间加以测定。
本实施方式的方法包括第一比较步骤，即将上述测定步骤获得的有关癌标志基因表达量的值与第一阈值进行比较。该第一阈值是根据癌标志基因种类和测定步骤中所用方法、特别是核酸扩增法种类适当设定的值。该第一阈值可以设定为小于已确认含有癌细胞的试样、特别是已确认癌转移的试样(阳性试样)中所含癌标志基因的表达量相关值，而大于已确认不含癌细胞的试样、特别是已确认无癌转移的试样(阴性试样)中所含癌标志基因的表达量相关值。该第一阈值最好测定若干阳性试样的癌标志基因的表达量相关值和若干阴性试样的癌标志基因的表达量相关值，设定为能最准确地区分阳性试样和阴性试样的值。
本实施方式的方法的某种形式包括标准化步骤，即根据上述测定步骤中获得的癌标志基因的表达量相关值，对癌标志基因的表达量相关值进行标准化处理。
在本说明书，所谓“标准化”指以管家基因的表达量相关值为标准，将癌标志基因的表达量相关值换算为相应的值。作为更具体的例子就是：用管家基因的表达量相关值除癌标志基因的表达量相关值。
本实施方式的方法包括比较上述标准化步骤所得标准化值与第二阈值的第二比较步骤。
上述第二阈值是根据癌标志基因种类、管家基因种类和测定步骤中所用方法、特别是核酸扩增法种类适当设定的值。该第二阈值可以设定为小于根据该阳性试样中的管家基因的表达量相关值对已确认含有癌细胞的试样、特别是已确认癌转移的试样(阳性试样)中所含癌标志基因的表达量相关值进行标准化处理所得标准化值，而大于根据该阴性试样中的管家基因的表达量相关值对已确认不含癌细胞的试样、特别是已确认无癌转移的试样(阴性试样)中所含癌标志基因的表达量相关值进行标准化所得的标准化值。该第二阈值最好测出若干阳性试样的癌标志基因表达量相关值的标准化值和若干阴性试样的癌标志基因表达量相关值的标准化值，设定为能最准确地区分阳性试样和阴性试样的值。
本实施方式的方法包括根据上述第一比较步骤和第二比较步骤所得比较结果，判断试样中有无癌细胞的判断步骤。
该判断步骤当在第一比较步骤中癌标志基因的表达量相关值大于第一阈值时，及/或在第二比较步骤中的标准化值大于第二阈值时，判断试样存在癌细胞。
即无论比较结果为以下哪种情况，都判断为试样中存在癌细胞：
(A)当第一比较步骤的比较结果为
(癌标志基因的表达量相关值)≥(第一阈值)，
而第二比较步骤的比较结果为
(标准化值)<(第二阈值)时
(B)当第一比较步骤的比较结果为
(癌标志基因的表达量相关值)<(第一阈值)，
而第二比较步骤的比较结果为
(标准化值)≥(第二阈值)时
(C)当第一比较步骤的比较结果为
(癌标志基因的表达量相关值)≥(第一阈值)，
第二比较步骤的比较结果为
(标准化值)≥(第二阈值)时。
在本实施方式的其他某种形态中，上述判断步骤包括根据第一比较步骤所得比较结果判断试样中有无癌细胞的第一判断步骤，和根据第二比较步骤所得比较结果判断试样中有无癌细胞的第二判断步骤。
上述第一判断步骤当第一比较步骤中的癌标志基因表达量相关值大于第一阈值时，判断试样中存在癌细胞。
上述第二判断步骤当第二比较步骤中的标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
在本实施方式的另一其他形式中，当上述第一比较步骤中癌标志基因表达量相关值小于第一阈值时，进行上述标准化步骤和第二比较步骤。在此形式中，当在上述第一比较步骤中癌标志基因的表达量大于第一阈值时，可以断定试样中存在癌细胞，因此，不进行标准化步骤和用标准化值进行第二比较步骤。
实施上述有无癌细胞的判断方法来判断有无癌细胞的仪器也是本实施方式之一。图4为本实施方式的仪器的框图。
本实施方式的仪器如图4所示，包括：
测定装置100，测定含采自患者的细胞的试样中癌标志基因和管家基因的表达量相关值；
第一比较单元200，比较上述测定装置测得的癌标志基因表达量相关值和第一阈值；
标准化单元300，根据上述测定装置测得的管家基因表达量相关值对癌标志基因表达量进行标准化处理；
第二比较单元400比较上述标准化单元所得标准化值和第二阈值；
判断单元500，根据第一比较单元和第二比较单元得出的比较结果，判断试样中有无癌细胞；及
输出单元600，输出上述判断单元得出的判断结果。
上述测定装置100只要能测定癌标志基因表达量相关值和管家基因表达量相关值即可，无特别限定。但最好使用能测定经上述核酸扩增法、如LAMP法和PCR法等扩增的核酸的核酸扩增测定仪。尤以光学测定用引物和核酸扩增酶扩增试样中癌标志基因和管家基因所得核酸扩增产物的核酸扩增测定仪为宜。
第一比较单元200、标准化单元300、第二比较单元400、判断单元500和输出单元600可由连接到测定装置100的个人电脑(PC)102构成。此时，个人电脑(PC)102在控制测定装置100的同时，还能够比较测定装置100所测得的癌标志基因表达量和第一阈值，根据测定装置测得的管家基因表达量相关值对癌标志基因表达量进行标准化处理，比较所得标准化值和第二阈值，根据这些比较结果判断试样中有无癌细胞。
输出单元600只要能输出判断单元500得出的判断结果即可，无特别限定，可以是印刷设备、显示器和音频输出设备等。具体而言，输出单元可以是与判断单元连接的监视器、打印机、扬声器等，最好是监视器。
本实施方式的仪器还可以配备调制上述测定试样的制样器。作为该制样器最好有浓缩试样所含细胞的细胞浓缩器、如离心分离器、从细胞抽取核酸的核酸提取器和浓缩所得核酸的核酸浓缩器等。
本实施方式的癌转移判断仪器的一实施形式如图1～3所示。图1为本发明一实施方式的判断仪器的整体结构斜视图。图2为图1所示作为测定装置的核酸扩增测定装置的整体结构斜视图。图3为图2所示核酸扩增测定装置的平面略图。
本发明某实施方式的判断仪器1如图1所示，可由核酸扩增测定装置101和与该核酸扩增测定装置连接、能进行有线或无线通信的个人电脑(PC)102组成。个人电脑(PC)102发挥第一比较单元200、第二比较单元400、标准化单元300、判断单元500和输出单元600的功能。
核酸扩增测定装置101如图2所示，包括：分装器件10、加样器20、吸头放置器30、吸头废弃器40、由5个反应检测块50a构成的反应检测部分50和用于向X方向和Y方向移动分装器件10的移送器60。
分装器件10如图2所示，包括被移送器60向X方向和Y方向(水平方向)移动的臂11和与臂11相对可各自独立向Z方向(垂直方向)移动的一对(二支)注射器12。
如图2和图3所示，加样器20从装置眼前开始依次有10个试样管插孔21a～21j、一个酶试剂管插孔21k和两个引物试剂管插孔211和21m。10个试样管插孔21a～21j分5行2列排列。试样管插孔21c和21d、试样管插孔21e和21f、试样管插孔21g和21h、试样管插孔21i和21j分别从装置里面向外依次置于加样位置1、加样位置2、加样位置3和加样位置4。
本实施方式中，正面左侧的试样管插孔21c、21e、21g和21i用于插装有预先对淋巴结组织和腹腔清洗液等标本进行处理制备的测定试样的试样管22，正面右侧的试样管插孔21d、21f、21h和21j插装有上述测定试样稀释到10倍的稀释试样的试样管23。
试样管插孔21a用于放置阳性质控品的容器24，该阳性质控品用于确认应该扩增的核酸正常扩增；而试样管插孔21b用于放置装有阴性质控品的容器25，该阴性质控品用于确认不该扩增的核酸正常未扩增。
酶试剂管插孔21k放置装有用于扩增核酸的核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26，引物试剂管插孔211放置引物试剂容器27，其中装有用于扩增与癌胚抗原(以下也简称为CEA)mRNA相应的cDNA的引物试剂。引物试剂管插孔21m放置引物试剂容器28，该容器28装有扩增β-肌动蛋白mRNA相应的cDNA的引物试剂。
反应检测部分50的各反应检测块50a如图2和图3所示，由反应区51、二个浊度检测器52和闭合器件53(参照图2)构成。设置于各反应检测块50a的反应区51如图3所示，有二个用于放置检测池54的检测池孔51a。各反应检测块50a从装置里侧向外依次排列于池位1、池位2、池位3、池位4和池位5。
浊度检测器52由置于反应区51一侧底板55a上的由有465nm波长的兰色发光二极管组成的发光二极管光源52a和配置于反应区51另一侧底板55b上的光电二极管集光器52b构成。各反应检测块50a各配置有两组由一个发光二极管光源52a和一个光电二极管集光器52b组成为一组的浊度检测器52。
检测池54有装测定试样的2个池54a和盖2个池54a的2个池盖54b。
移送器60如图2所示，有向Y方向移送分装器件10的直行向导61和球型螺杆62、驱动球型螺杆62的步进式电机63、向X方向移送分装器件10的直行向导64和球型螺杆65、驱动球型螺杆65的步进式电机66。向X方向和Y方向移送分装器件10是靠步进式电机63和步进式电机66分别转动球型螺杆62和65实现的。
个人电脑(PC)102如图1所示包括：输入设备键盘102a和鼠标102b、由监视器组成的显示器102c以及比较、标准化及判断试样测定结果的CPU(中央处理器)102d。CPU102d根据个人电脑(PC)102中的存储器存储的命令，发挥第一比较单元200、第二比较单元400、标准化单元300和判断单元500的功能。在CPU 102d获得的判断结果输出到显示器102c。即个人电脑(PC)102作为计算机系统发挥根据作为测定装置的核酸扩增测定装置的测定结果、判断测定试样中有无癌细胞、并输出该判断结果的功能。
上述实施方式的判断仪器由核酸扩增测定装置101、与核酸扩增测定装置101连接的个人电脑(PC)102构成，但是个人电脑(PC)102的功能也可以装入核酸扩增测定装置101。
图5为本实施方式的判断仪器1的处理流程图。下面根据图5就本实施方式的判断仪器1的运行过程进行说明。在此，就能实现以下操作的装置进行说明：1)用LAMP法对在胃癌手术中清洗患者腹腔内部所得腹腔清洗液中存在的癌标志基因(CEA)和管家基因(β-肌动蛋白)进行扩增，2)通过测定随扩增产生的焦磷酸镁所形成的白色沉淀物引起的浊度变化，来测定CEA和β-肌动蛋白的表达量相关值，3)将上述相关值与阈值比较，判断腹腔清洗液中有无癌细胞，4)提供帮助胃癌转移判断的信息。在以下叙述中，主要就装置测定癌标志基因表达量相关值的处理过程进行说明，装置测定管家基因表达量相关值的处理过程也同样。
首先如图2和图3所示，将装有对腹腔清洗液进行预处理(浓缩、抽取核酸等)制备的测定试样的试样管22，插入试样管插孔21c～21j(步骤S1)。将装有阳性质控品的容器24和装有阴性质控品的容器25分别插入试样管插孔21a和21b(参照图3)(步骤S2)。在酶试剂管插孔21k、引物试剂管插孔211和引物试剂管插孔21m分别插入装有核酸扩增用核酸扩增酶试剂的酶试剂容器26、装有CEA扩增用引物试剂(CEA的引物试剂)的引物试剂容器27和装有β-肌动蛋白扩增用引物试剂(β-肌动蛋白的引物试剂)的引物试剂容器28(步骤S3)。吸头放置器30设置2个各自收纳36个一次性吸移管吸头31的托盘32(步骤S4)。
核酸扩增测定装置101一启动(步骤S5)，首先，分装器件10的臂11被图2所示移送器60从初始位置移到吸头放置器30后，分装器件10的二个注射器12在吸头放置器30处向下移动。于是，二个注射器12的嘴部顶端压入二个吸移管吸头31的上部开口处，从而自动装上吸移管吸头31(步骤S6)。当二个注射器12向上移动之后，分装器件10的臂11向X方向移动，移向装有CEA引物试剂的引物试剂容器27的上方。位于引物试剂容器27上方的一个注射器12向下移动，吸移CEA引物试剂后向上移动(步骤S7)。分装器件10的臂11被移送器60向Y方向移动，使另一个注射器12同样位于引物试剂容器27的上方。然后另一个注射器12向下移动，同样从引物试剂容器27吸移CEA引物试剂后向上移动(步骤S8)。如此，引物试剂容器27内的CEA引物试剂被安装在注射器12上的二个吸移管吸头31吸移。
二个注射器12吸移了CEA引物试剂，向上移动后，分装器件10的臂11被移送器60移向位于最里面(正对装置的里侧)池位1的反应检测块50a上方。在最里面的反应检测块50a，二个注射器12向下移动，使装在二个注射器12的二个吸移管吸头31分别插入检测池54的二个池54a中，再用注射器12将CEA引物试剂分别注入二个池54a中(步骤S9)。
CEA引物试剂吐出后，二个注射器12向上移动，分装器件10的臂11被移送器60向X方向移动，移到吸头废弃器40的上方。在吸头废弃器40的上方，吸移管吸头31被丢弃(步骤S10)。具体而言，二个注射器12向下移动，使吸移管吸头31插入吸头废弃器40的二个吸头废弃孔40a(参照图3)。在此状态下，分装器件10的臂11被移送器60向Y方向移动，使吸移管吸头31移到槽40b下面，然后向上移动二个注射器12，吸移管吸头31上部的边缘卡在槽40b下面，从其下面受到向下的力，从而吸移管吸头31自动从二个注射器12的嘴部脱落。这样，吸移管吸头31就被丢弃在吸头废弃器40。
接下来，以同样的动作酶试剂从酶试剂容器26注入上述池54a(步骤S11)，再以同样的动作将试样从试样管22和试样管23注入上述池54a(步骤S12)。
CEA引物试剂、酶试剂和试样向上述池54a的吸移动作完成后，关闭检测池54的池盖54b(步骤S13)。当此关闭动作完成后，将检测池54内的液温从约20℃加温到约65℃，通过RT—LAMP反应对与癌标志基因CEA的mRNA对应的cDNA进行扩增(步骤S14)。随扩增生成的焦磷酸镁形成白色沉淀物，用比浊法检测该白色沉淀物。具体而言，用图3所示LED光源52a和光电二极管集光器52b检测(监测)扩增反应过程中检测池54内的浊度，检出浊度数据A(步骤S15)。
以与上述处理同样步骤，检出关于管家基因β-肌动蛋白表达量的浊度数据B(步骤S16)。
所得浊度数据从核酸扩增测定装置101实时传送到个人电脑(PC)102。个人电脑(PC)102的CPU102d将癌标志基因的浊度数据A与预设的第一阈值C1进行比较(步骤S17)，根据管家基因的浊度数据B对癌标志基因的浊度数据A进行标准化处理(步骤S18)，将所得标准化值D与预设的第二阈值C2进行比较(步骤S19)，根据所得比较结果判断有无癌细胞(步骤S20)，并输出判断结果(步骤S21)。根据输出结果，比如医生可以判断有无癌转移。
在此，步骤S20关于有无癌细胞的判断可以按上述本实施方式的方法中的判断步骤同样进行。即，当在步骤S17癌标志基因浊度数据A大于第一阈值C1时，及/或在步骤S19标准化值D大于第二阈值C2时，可以判断测定试样中存在癌细胞。
更具体地说，当出现以下情况时都可在步骤S20判断测定试样中有癌细胞：
(A)当在步骤S17的比较结果为
(浊度数据A)≥(第一阈值C1)，
而在步骤S19的比较结果为
(标准化值D)<(第二阈值C2)时
(B)当步骤S17的比较结果为
(浊度数据A)<(第一阈值C1)，
而步骤S19的比较结果为
(标准化值D)≥(第二阈值C2)时
(C)当步骤S17的比较结果为
(浊度数据A)≥(第一阈值C1)，
步骤S19的比较结果为
(标准化值D)≥(第二阈值C2)时。
图7为图1所示显示器102c的显示例。在图7中，显示区111、112和113分别为显示实施帮助功能等各种功能按钮的工具栏、显示测定试样各种信息的测定试样信息区和显示测定试样信息区112上的测定试样的测定结果的测定结果显示区。
显示测定试样信息区112设有标本号显示栏112a、标本种类显示栏112b、部位显示栏112c、注释显示栏112d、测定日显示栏112e和测定时间显示栏112f。标本号显示栏112a上显示用作测定试样的标本号。标本种类显示栏112b上显示从患者采集的试样种类。作为从患者采集的试样种类比如有淋巴结组织、血液、腹腔清洗液或胸腔清洗液等。部位显示栏112c上显示有关从患者采集的试样的采集部位信息。比如，在图7中部位显示栏112c上显示左横隔膜下。由此可以知道此测定试样是由左横隔膜下的腹腔清洗液制备的测定试样。注释显示栏112d上显示可用于癌转移诊断的其他测定试样的相关信息。测定日显示栏112e和测定时间显示栏112f上分别显示测定试样所测定的日期(画面中为“2005/09/26”)和时间(画面中为“12：53：06”)。
显示测定结果显示区113设有图区113a、第一测定结果显示栏113b、第二测定结果显示栏113c、标准化值显示栏113d、第一判断结果显示栏113e、第二判断结果显示栏113f和综合判断结果显示栏113g。图区113a上用于显示图，该图表示显示测定试样信息显示区112所显示的测定试样其癌标志基因表达量相关值与第一阈值、根据管家基因表达量相关值对癌标志基因表达量相关值进行标准化处理所得的值(标准化值)与第二阈值的关系。在图7的图区113a上，横轴显示癌标志基因表达量相关值与第一阈值的关系，纵轴显示标准化值与第二阈值的关系。第一测定结果显示栏113b上显示有关癌标志基因表达量的值。在图7中，第一测定结果显示栏113b作为有关癌标志基因表达量的值显示了CEA的mRNA量(copy/μL)。第二测定结果显示栏113c上显示有关管家基因表达量的值。在图7中，第二测定结果显示栏113c作为有关管家基因表达量的值显示了β-肌动蛋白的mRNA量(copy/μL)。标准化值显示栏113d上显示标准化值。在图7中，113d作为标准化值显示了用β-肌动蛋白的mRNA量除CEA的mRNA量所得的值。第一判断结果显示栏113e上显示根据癌标志基因表达量的相关值与第一阈值的比较结果判断测定试样中有无癌细胞的判断结果(第一判断结果)信息。在图7中，第一判断结果显示栏113e的第一判断结果显示为“—”。在此，“—”表示测定试样中没有癌细胞。第二判断结果显示栏113f显示根据标准化值与第二阈值的比较结果判断测定试样中有无癌细胞的判断结果(第二判断结果)信息。在图7中，第二判断结果显示栏113f显示“+”。在此，“+”表示测定试样中有癌细胞存在。综合判断结果显示栏113g显示根据上述第一判断结果和第二判断结果判断测定试样中有无癌细胞的综合性判断结果信息。在图7中，综合判断结果显示栏113g上作为综合性判断结果信息显示“+”。
举例
[实施例]
下面以实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明不受以下实施例所限。
(1)腹腔清洗液的采集与试样制备
为50名胃癌患者做手术时，采集腹腔清洗液，用于胃癌转移的检查。具体而言，剖腹后，向腹腔内(肝下面、左横隔膜下及/或douglas窝)注入100mL生理盐水冲洗，回收此液。以3,000×g离心分离回收的腹腔清洗液10分钟，去上清，得约50～100μL试样。
这50名患者由细胞组织诊断为胃癌转移的患者17人和未诊断为转移的患者33人组成。
(2)RT-PCR
用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN公司制)按照生产厂家的使用说明对(1)制备的试样进行处理，获得50μL纯净RNA溶液。
针对所得纯净RNA溶液，用以下引物以下述成份制备反应液，用定量RT-PCR法(
Figure A200810161246D0034150323QIETU
 RT-PCR)分别测定作为癌标志基因的CEA和作为管家基因的β-肌动蛋白的mRNA量。
扩增CEA的mRNA用引物：
上游引物：5’-agacaatcacagtctctgcgga-3’(序列号1)
下游引物：5’-atccttgtcctccacgggtt-3’(序列号2)
TaqMan探针：5’-FAM-agctgcccaagccct-TAMRA-3’(序列号17)
扩增β-肌动蛋白的mRNA用引物：
上游引物：5’-ccacactgtgcccatctacg-3’(序列号13)
下游引物：5’-aggatcttcatgaggtagtcagtcag-3’(序列号14)
TaqMan探针：5’-FAM-atgccctcccccatgccatcctgcgt-TAMRA-3’(序列号18)
RT-PCR反应液成份：
1×One-step TaqMan(注册商标)RT—PCR Master mix(应用生物系统公司制)
上游引物：300nM
下游引物：300nM
TaqMan探针：250nM
纯净RNA溶液：1μL
合计：25μL
用PRISM7700(应用生物系统公司制)以50℃下30分钟，95℃下15分钟的条件对上述反应液进行逆转录，扩增cDNA后，反复进行40次PCR反应(以95℃下30秒、72℃下30秒为一周期)，测定荧光强度。
预先以从培养细胞中克隆各基因并在体外转录制备的已知量mRNA溶液为标准，对荧光强度绘制标准曲线，根据该标准曲线，定量试样中的CEA和β-肌动蛋白的mRNA量。单位为mRNA拷贝数/μL。
将所得CEA的mRNA量作为“CEA绝对值”如表2表示。以阈值(第一阈值)为20拷贝数/μL，将该值与阈值比较。对于mRNA量超过阈值的试样判断为阳性“+”，对于mRNA量低于阈值的试样判断为阴性“—”，判断结果作为“绝对值判断”显示在表2中。
求用β-肌动蛋白的mRNA量除所得CEA的mRNA量所得值(标准化值)，以此为“CEA/肌动蛋白标准化值”显示在表2。设阈值(第二阈值)为1×10-5，将此值与阈值比较。对于标准化值大于阈值的试样判断为阳性“+”，对于标准化值小于阈值的试样判断为阴性“—”。判断结果作为“标准化值判断”显示在表2。
对于上述绝对值判断和标准化值判断的至少其中之一为阳性的试样判断试样中有癌细胞，为阳性“+”，在表2作为“综合判断”显示。
将表2的结果以横轴为“CEA绝对值”，以纵轴为“CEA/肌动蛋白标准化值”绘制成图，结果如图8所示。
[表2]
 
No. 标本种类 部位 组织诊断结果 CEA绝对值      肌动蛋白绝对值   CEA/肌动蛋白标准化值 绝对值判断   标准化值判断 综合判断 注
1 腹腔清洗液 左横隔膜下 + 1.5E+01 5.0E+05 2.9E-05 - + +
2 腹腔清洗液 Douglas窝 + 7.1E+02 8.1E+05 8.8E-04 + + +
3 腹腔清洗液 左横隔膜下 + 1.3E+02 7.6E+05 1.7E-04 + + +
4 腹腔清洗液 Douglas窝 + 5.2E+02 3.9E+06 1.3E-04 + + +
5 腹腔清洗液 Douglas窝 + 4.7E+04 4.5E+06 1.0E-02 + + +
6 腹腔清洗液 Douglas窝 + 3.7E+03 8.9E+07 4.1E-05 + + +
7 腹腔清洗液 肝下面 + 1.7E+02 3.0E+07 5.6E-06 + - +
8 腹腔清洗液 肝下面 + 2.4E+01 2.4E+05 9.9E-05 + + +
9 腹腔清洗液 肝下面 + 3.0E+03 3.0E+06 1.0E-03 + + +
10 腹腔清洗液 左横隔膜下 + 4.7E+01 1.5E+06 3.2E-05 + + +
11 腹腔清洗液 Douglas窝 + 2.7E+04 3.1E+07 8.9E-04 + + +
12 腹腔清洗液 Douglas窝 + 1.5E+05 7.0E+06 2.2E-02 + + +
13 腹腔清洗液 Douglas窝 + 1.0E+01 1.9E+05 5.2E-05 - + +
14 腹腔清洗液 Douglas窝 + 6.5E+03 3.1E+08 2.1E-05 + + +
15 腹腔清洗液 Douglas窝 + 9.6E+03 7.6E+07 1.3E-04 + + +
16 腹腔清洗液 Douglas窝 + 1.1E+03 3.6E+07 3.1E-05 + + +
17 腹腔清洗液 Douglas窝 ± 2.9E+01 3.6E+07 7.9E-07 + - +
 
No. 标本种类 部位 组织诊断结果 CEA绝对值 肌动蛋白绝对值   CEA/肌动蛋白标准化值         绝对值判断   标准化值判断 综合判断 注
18 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 8.9E+05 - - - -
 
19 腹腔清洗液 左横隔膜下 - ND 8.1E+05 - - - -
20 腹腔清洗液 左横隔膜下 - 7.7E+01 1.6E+07 4.7E-06 + - + 腹膜复发
21 腹腔清洗液 肝下面 - 1.8E+01 5.7E+05 3.1E-05 - + + Douglas窝阳性    
22 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 1.2E+05 - - - -
23 腹腔清洗液 左横隔膜下 - ND 9.2E+05 - - - -
24 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 5.8E+05 - - - -
25 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 9.7E+07 - - - -
26 腹腔清洗液 左横隔膜下 - ND 1.7E+07 - - - -
27 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 3.7E+07 - - - -
28 腹腔清洗液 Douglas窝 - 1.9E+02 1.1E+07 1.7E-05 + + + 胃壁浸润度高        
29 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 7.4E+05 - - - -
30 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 2.2E+06 - - - -
31 腹腔清洗液 Douglas窝 - 6.7E+01 2.1E+07 3.3E-06 + - +
32 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 7.5E+06 - - -
33 腹腔清洗液 Douglas窝 - 1.3E+00 1.8E+05 7.4E-06 - - -
34 腹腔清洗液 左横隔膜下 - ND 2.5E+05 - - - -
35 腹腔清洗液 左横隔膜下 - 9.4E+01 1.4E+07 6.9E-06 + - + Douglas窝阳性    
36 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 4.8E+06 - - - -
37 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 1.2E+08 - - - -
38 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 6.0E+05 - - - -
39 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 1.0E+07 - - - -
40 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 5.1E+07 - - - -
41 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 5.3E+05 - - - -
42 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 5.3E+05 - - - -
43 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 6.5E+06 - - - -
44 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 2.3E+06 - - - -
45 腹腔清洗液 Douglas窝 - ND 2.6E+06 - - - -
46 腹腔清洗液 - ND 4.5E+06 - - - -
47 腹腔清洗液 - ND 1.5E+05 - - - -
48 腹腔清洗液 Douglas窝 - 1.1E+01 4.9E+06 2.3E-06 - - -
49 腹腔清洗液 - 2.8E+00 2.2E+05 1.2E-05 - + + 腹膜复发
 
50 腹腔清洗液 - 1.1E+02 3.8E+07 2.8E-06 + - + Douglas窝阳性    
从表2的结果得知，在组织诊断对有癌细胞却判断为阴性的试样中，试样号20、21、28、31、35、49和50的试样被本发明的方法判断为有癌细胞。这些试样中除试样号31外的6个标本都来自在作为试样使用的腹腔清洗液以外的部位采集的其他腹腔清洗液中被诊断为癌细胞存在为阳性、或胃癌的胃壁浸润度高、或腹膜有癌复发之一的患者。即，尽管在组织诊断中诊断为没有癌细胞、即胃癌转移阴性，用本发明的方法也可以检测出微量癌细胞的存在，更准确地判断有无癌细胞，进而可以提供对判断胃癌转移更有效的信息。
前述的详细说明及附图是通过文字解释和图示来进行的，其目的不在于限定权利要求的保护范围。本说明书中的具体实施方式的各个变种对于普通技术人员来说显而易见，并处于权利要求及其等同技术的保护范围内。
序列表
<110>希森美康株式会社
<120>癌细胞存在与否的判断方法及其装置
<160>18
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>1
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>2
Figure A200810161246D00392
<210>3
<211>14
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>3
Figure A200810161246D00393
<210>4
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>4
Figure A200810161246D00394
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>5
Figure A200810161246D00395
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>6
Figure A200810161246D00401
<210>7
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>7
Figure A200810161246D00402
<210>8
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>8
Figure A200810161246D00403
<210>9
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>9
Figure A200810161246D00404
<210>10
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>10
Figure A200810161246D00405
<210>11
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>11
Figure A200810161246D00411
<210>12
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>12
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>13
Figure A200810161246D00413
<210>14
<211>216
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>14
Figure A200810161246D00414
<210>15
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>15
<210>16
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物
<400>16
Figure A200810161246D00416
<210>17
<211>15
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TaqMan-探针
<400>17
Figure A200810161246D00421
<210>18
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>TaqMan-探针
<400>18
Figure A200810161246D00422

Claims (20)

1.一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的方法，包括：
测定步骤，测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值进行标准化处理；
第二比较步骤，比较在标准化步骤所得标准化值和第二阈值；及
判断步骤，根据第一比较步骤和第二比较步骤所获得的比较结果，判断试样中有无癌细胞。
2.权利要求1所述方法，其特征在于：判断步骤，用于当癌标志基因表达量的值大于第一阈值时、及/或标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
3.权利要求1所述方法，其特征在于：判断步骤包括：
根据第一比较步骤中所得比较结果判断试样中有无癌细胞的第一判断步骤；
根据第二比较步骤中所得比较结果判断试样中有无癌细胞的第二判断步骤。
4.权利要求3所述方法，其特征在于：第一判断步骤当癌标志基因表达量的值大于第一阈值时，判断试样中存在癌细胞。
5.权利要求3所述方法，其特征在于：第二判断步骤当标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
6.权利要求3所述方法，其特征在于：判断步骤，用于当第一判断步骤和第二判断步骤中至少一个步骤判断试样中存在癌细胞时，作出试样中存在癌细胞的判断。
7.权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于：从患者身上采集的细胞是淋巴结组织、血液或体腔清洗液中所含细胞。
8.权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于：有关癌标志基因表达量的值为测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值；
有关管家基因表达量的值是测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值。
9.权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于：癌标志基因是细胞角蛋白、癌胚抗原、MUC1粘蛋白或乳腺球蛋白的基因。
10.权利要求1～6中任意一项所述的方法，其特征在于：管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶、亲环蛋白、β-肌动蛋白或α-微管蛋白的基因。
11.一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的方法，包括：
测定步骤，测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，当在第一比较步骤中，有关癌标志基因表达量的值小于第一阈值时，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值进行标准化处理；
第二比较步骤，比较在标准化步骤所得标准化值和第二阈值；及
判断步骤，根据第一比较步骤或第二比较步骤所获得的比较结果，判断试样中有无癌细胞。
12.权利要求11所述方法，其特征在于：从患者身上采集的细胞是淋巴结组织、血液或体腔清洗液中所含细胞。
13.权利要求11所述方法，其特征在于：有关癌标志基因表达量的值为测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值；
有关管家基因表达量的值是测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物所获得的值。
14.权利要求11所述方法，其特征在于：癌标志基因是细胞角蛋白、癌胚抗原、MUC1粘蛋白或乳腺球蛋白的基因。
15.权利要求11所述方法，其特征在于：管家基因是3-磷酸甘油醛脱氢酶、亲环蛋白、β-肌动蛋白或α-微管蛋白的基因。
16.一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的仪器，包括：
测定装置，用于测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；及
计算机系统，用于根据测定装置获得的测定结果判断试样中有无癌细胞；
其中，计算机系统含有在处理器控制下的存储器，存储器储存着可使处理器进行以下处理的命令：
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，根据有关管家基因表达量的值对有关癌标志基因表达量的值标准化；
第二比较步骤，比较标准化步骤所得标准化值与第二阈值；
判断步骤，根据第一比较步骤和第二比较步骤所得比较结果，判断试样中有无癌细胞；及
输出步骤，输出判断步骤所得出的判断结果。
17.权利要求16所述仪器，其特征在于：判断步骤，用于当有关癌标志基因表达量的值大于第一阈值时、及/或标准化值大于第二阈值时，判断试样中存在癌细胞。
18.权利要求16或17所述仪器，其特征在于：测定装置通过测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获取有关癌标志基因表达量的值，通过测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获得有关管家基因表达量的值。
19.一种判断含采自患者的细胞的试样中有无癌细胞的仪器，包括：
测定装置，用于测定试样中有关癌标志基因表达量的值和有关管家基因表达量的值；及
计算机系统，用于根据测定装置获得的测定结果判断试样中有无癌细胞；
其中，计算机系统含有在处理器控制下的存储器，存储器储存着可使处理器进行以下处理的命令：
第一比较步骤，比较有关癌标志基因表达量的值和第一阈值；
标准化步骤，当在第一比较步骤中有关癌标志基因表达量的值小于第一阈值时，根据有关管家基因表达量的值使有关癌标志基因表达量的值标准化；
第二比较步骤，比较标准化步骤所得标准化值与第二阈值；
判断步骤，根据第一比较步骤或第二比较步骤所得比较结果，判断试样中有无癌细胞；及
输出步骤，输出判断步骤所得出的判断结果。
20.权利要求19所述仪器，其特征在于：测定装置通过测定以癌标志基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获取有关癌标志基因表达量的值，通过测定以管家基因的mRNA为铸模进行核酸扩增所产生的扩增产物，获得有关管家基因表达量的值。
CNA2008101612461A 2007-09-20 2008-09-18 癌细胞存在与否的判断方法及其装置 Pending CN101392291A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2007243989 2007-09-20
JP2007243989A JP5303132B2 (ja) 2007-09-20 2007-09-20 がん細胞の存否を判定する方法及び装置

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN101392291A true CN101392291A (zh) 2009-03-25

Family

ID=40048962

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNA2008101612461A Pending CN101392291A (zh) 2007-09-20 2008-09-18 癌细胞存在与否的判断方法及其装置

Country Status (6)

Country Link
US (1) US8053193B2 (zh)
EP (1) EP2039782B1 (zh)
JP (1) JP5303132B2 (zh)
CN (1) CN101392291A (zh)
AT (1) ATE531821T1 (zh)
ES (1) ES2375399T3 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102947468A (zh) * 2010-06-16 2013-02-27 国立大学法人浜松医科大学 大肠肿瘤的检测方法
CN104862309A (zh) * 2015-04-22 2015-08-26 复旦大学 一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法
CN105242034A (zh) * 2011-07-22 2016-01-13 希森美康株式会社 癌变信息提供方法及癌变信息提供装置
CN114107492A (zh) * 2021-01-07 2022-03-01 首都医科大学附属北京胸科医院 一种用于肿瘤分子分型、治疗用药评估的分子标志物及其检测引物和试剂盒

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105247074A (zh) * 2013-05-07 2016-01-13 国立研究开发法人国立癌症研究中心 预测胃癌的复发的方法
KR102507489B1 (ko) * 2020-12-24 2023-03-08 가톨릭대학교 산학협력단 진단 분류 장치 및 방법

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5637687A (en) 1993-08-31 1997-06-10 Wiggins; James C. Methods and compositions for isolating nucleic acids
DK1410011T3 (da) 2001-06-18 2011-07-18 Netherlands Cancer Inst Diagnose og prognose for brystcancerpatienter
AU2002322280A1 (en) 2001-06-21 2003-01-21 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Compositions, kits, and methods for identification, assessment, prevention, and therapy of breast cancer
US20030143572A1 (en) 2001-08-13 2003-07-31 Lu Mou-Ying Fu Molecular diagnostic and computerized decision support system for selecting the optimum treatment for human cancer
EP1540002A2 (en) 2002-09-12 2005-06-15 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Method for detection of micro-metastasis
US20050042138A1 (en) 2003-08-20 2005-02-24 Sysmex Corporation Sample analyzer, nucleic acid detector and nucleic acid detection method
US7871769B2 (en) * 2004-04-09 2011-01-18 Genomic Health, Inc. Gene expression markers for predicting response to chemotherapy
JP4719455B2 (ja) 2004-12-07 2011-07-06 シスメックス株式会社 直接核酸増幅方法用生体試料処理液および直接核酸増幅方法
US8535914B2 (en) 2005-01-21 2013-09-17 Canon Kabushiki Kaisha Probe, probe set and information acquisition method using the same
JP2007175021A (ja) 2005-12-28 2007-07-12 Sysmex Corp 大腸がんのリンパ節転移マーカー
JP5102450B2 (ja) 2006-01-27 2012-12-19 シスメックス株式会社 核酸増幅分析装置

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102947468A (zh) * 2010-06-16 2013-02-27 国立大学法人浜松医科大学 大肠肿瘤的检测方法
CN102947468B (zh) * 2010-06-16 2014-03-19 国立大学法人浜松医科大学 大肠肿瘤的检测方法
CN105242034A (zh) * 2011-07-22 2016-01-13 希森美康株式会社 癌变信息提供方法及癌变信息提供装置
CN105242034B (zh) * 2011-07-22 2019-02-05 希森美康株式会社 癌变信息提供方法及癌变信息提供装置
CN104862309A (zh) * 2015-04-22 2015-08-26 复旦大学 一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法
CN104862309B (zh) * 2015-04-22 2018-08-07 复旦大学 一种特异性检测肿瘤标志物mucin 1的LAMP方法
CN114107492A (zh) * 2021-01-07 2022-03-01 首都医科大学附属北京胸科医院 一种用于肿瘤分子分型、治疗用药评估的分子标志物及其检测引物和试剂盒
CN114107492B (zh) * 2021-01-07 2024-04-26 首都医科大学附属北京胸科医院 一种用于肿瘤分子分型、治疗用药评估的分子标志物及其检测引物和试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
EP2039782A3 (en) 2009-06-17
ATE531821T1 (de) 2011-11-15
JP2009072111A (ja) 2009-04-09
US20090081671A1 (en) 2009-03-26
ES2375399T3 (es) 2012-02-29
EP2039782B1 (en) 2011-11-02
JP5303132B2 (ja) 2013-10-02
US8053193B2 (en) 2011-11-08
EP2039782A2 (en) 2009-03-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bubendorf et al. Nonsmall cell lung carcinoma: Diagnostic difficulties in small biopsies and cytological specimens: Number 2 in the Series “Pathology for the clinician” Edited by Peter Dorfmüller and Alberto Cavazza
Voduc et al. Tissue microarrays in clinical oncology
Treece et al. FNA smears as a potential source of DNA for targeted next‐generation sequencing of lung adenocarcinomas
EP3043718B1 (en) Biological fluid filtration assembly
Sheikine et al. Clinical and technical aspects of genomic diagnostics for precision oncology
Fassan Molecular diagnostics in pathology: time for a next-generation pathologist?
Pisapia et al. Next generation sequencing in cytopathology: focus on non-small cell lung cancer
CN101392291A (zh) 癌细胞存在与否的判断方法及其装置
CN101089197B (zh) 癌转移检测装置
CA2905620A1 (en) Neuroendocrine tumors
Guseva et al. Simultaneous detection of single‐nucleotide variant, deletion/insertion, and fusion in lung and thyroid carcinoma using cytology specimen and an RNA‐based next‐generation sequencing assay
CN108949961A (zh) 用于检测腺病毒肺炎的试剂盒及其筛选
Strauss et al. Analysis of tumor template from multiple compartments in a blood sample provides complementary access to peripheral tumor biomarkers
CN101260428B (zh) 胃癌淋巴结转移的判断装置
CN107653322A (zh) 一种宫颈高级别病变及宫颈癌相关基因甲基化检测试剂盒及方法
CN105648075A (zh) 一种肝癌诊断组合及含有该组合的试剂盒
CN107641649B (zh) 检测微卫星nr27位点稳定性的引物对、试剂盒及方法
Ghigna et al. Endobronchial ultrasound-guided fine-needle aspiration for pulmonary carcinomas genotyping: experience with 398 cases including rapid EGFR/KRAS analysis in 43 cases
KR101403803B1 (ko) 암 전이의 판정 방법 및 장치
CN111020710A (zh) 造血及淋巴组织肿瘤的ctDNA高通量检测
CN101365800B (zh) 用于确定ck19表达的组合物和方法
CN109251980A (zh) 膀胱癌组织t细胞图谱模型及其构建方法和构建系统
CN100429320C (zh) 用于癌症检测的血浆或血清标记及方法
Lüsebrink et al. Pre-clinical validation of a next generation sequencing testing panel
Van Paemel et al. Minimally invasive classification of pediatric solid tumors using reduced representation bisulfite sequencing of cell-free DNA: a proof-of-principle study

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C12 Rejection of a patent application after its publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20090325