CN100429320C - 用于癌症检测的血浆或血清标记及方法 - Google Patents

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Abstract

一方面，本文提供了用于检测患者的非临床诊断的癌症的方法。在一个实施方案中，所述方法包括从患者抽取血清或血浆，然后检测血清或血浆中的β-连环蛋白(beta-catenin)RNA。另外，在该实施方案中，所述方法包括基于检测出的β-连环蛋白RNA确定癌症的存在。另一方面，本文提供了用于检测患者的非临床诊断的癌症的方法的另一个实施方案。在该实施方案中，所述方法包括从患者抽取血清或血浆，然后检测血清或血浆中的β-连环蛋白DNA。另外，在该实施方案中，所述方法包括基于检测出的β-连环蛋白DNA确定癌症的存在。还公开了用于检测患者的非临床诊断的癌症的相关方法，包括检测血清或血浆中β-连环蛋白相关基因RNA以及β-连环蛋白相关基因DNA。

Description

用于癌症检测的血浆或血清标记及方法
相关申请交叉参考
本非临时国际专利申请要求美国临时申请系列号No.60/392,191的优先权，其递交于2002年6月28日，名称为“用于癌症检测的血浆或血清标记及方法”，其与本申请的所有人相同并特此并入作为任何意义上的参考。
发明领域
本发明涉及基于PCR的方法，检测血浆或血清标记，用于癌症的诊断、早期检测、监测和群筛，更具体地，是对于结肠直肠癌的血浆或血清中β-连环蛋白(catenin)RNA和DNA的检测。
发明背景
结肠直肠癌(CRC)是世界上最常见的恶性肿瘤之一。CRC新病例的数目自1975年以来一直在增加。大于70％的CRC病例是由散发性腺瘤或腺瘤状息肉发展而来。早期检测和手术切除息肉据信是防止良性息肉发展为恶性肿瘤从而降低CRC所致的死亡率的最有效的方法。
结肠直肠癌传统的筛选方法包括乙状结肠镜检、粪隐血试验、结肠镜检及双对照钡剂灌肠。然而，这些传统方法饱受限制，并且是侵入性的、花费高、预测值低或者造成低检出率。例如，WO0142504(特此将其教导并入作为参考)公开了用于检测血浆或血清中与胞外肿瘤相关的核酸的多步反应方法。需要进一步的改进。
β-连环蛋白最初是通过其与钙粘着蛋白的相互作用鉴定的。最近证据表明其作为转录因子发挥作用，并在Wnt-信号传导路径中起着关键作用(Willert & Nusse，1998)。已经证明胞浆和核β-连环蛋白信号传导的累积与广泛种类肿瘤的生成密切相关(Morin，1999)。
已经发现利用免疫组织化学染色核β-连环蛋白的水平与结肠直肠肿瘤发生中假设的后续阶段高度相关，其中阳染在正常组织中为0％、息肉为8％、腺瘤为92％，而癌瘤为100％。还已发现核β-连环蛋白信号似乎清楚地将息肉(非腺瘤状息肉)与腺瘤(腺瘤状息肉)区分开来。这将是CRC临床诊断或早期检测的有用标记，其中腺瘤被当作危险因素的终点。不过，基于核β-连环蛋白评价的这种诊断方法需要结肠镜检操作，随后手术切除可疑组织。
因此，急需用于癌症早期检测的有效、更少侵入性、更为准确的测试。本发明满足了这种需要。
发明概述
本发明提供了基于PCR(聚合酶链式反应)的方法或操作，检测与β-连环蛋白相关的血清或血浆标记RNA和DNA，以提供有效、更少侵入性且更为准确的测试，用于结肠直肠及其它癌症类型的诊断、早期检测、监测和群筛。应当理解，这种检测血清中β-连环蛋白RNA和DNA的方法可应用于编码β-连环蛋白相关蛋白的其它血浆和血清RNA和DNA。在一个实施方案中，所述RNA或DNA来自基因编码的β-连环蛋白、α-连环蛋白、E-catherin及其它β连环蛋白相关蛋白。
本发明的方法包括检测来自人类或动物的血清或血浆RNA或/和DNA作为诊断、早期检测、监测、治疗和群筛处于不同进程和临床阶段的肿瘤疾病的工具。本发明的一个优势在于该方法非侵入性的性质，而第二优势在于提高的样品收集的方便性和灵敏度。
本发明多个实施方案的细节列于下文。这些实施方案仅用于举例说明的目的，而且本发明的原理可以其它实施方案来实施。本发明的其它特点和优势将由以下的说明和实施例而变得清楚。
附图说明
为更全面地理解发明，现在就参考以下结合附图所进行的详细说明。在此强调为清楚讨论起见，某些要素可能不予举例说明。现在就参考以下结合附图所进行的详细说明，其中：
图1a、图1b和图1c图解说明了利用RT-PCR对来自结肠直肠癌瘤患者血浆的β-连环蛋白RNA的检测。
图2a和图2b图解说明了利用RT-PCR对来自患者的血液β-连环蛋白RNA进行结肠直肠腺瘤的检测。
图2c图解说明了利用RT-PCR对来自患者的血液β-肌动蛋白RNA进行结肠直肠腺瘤的检测。
图3a、图3b、图3c、图3d和图3e图解说明了对来自腺瘤或癌瘤患者以及正常对照的血清β-连环蛋白DNA的检测。
发明详述
本发明披露了对用于结肠直肠癌早期检测的灵敏且特异性的生物标记的研究。对解释结肠直肠癌肿瘤发生的分子机制的超前理解有助于鉴定为数不多的致癌基因和肿瘤抑制剂作为潜在的结肠直肠癌形成和早期检测的临床生物标记。这些包括k-ras、APC、p53、MCC、DCC基因。然而，没有一个候选标记能够单独提供满意的检出率。最近对癌症患者血样中k-ras、APC和p53突变的基于PCR的检测的确极大地提高了样品收集的方便性。不过，检出率通常低于由原发性肿瘤所观察到的检出率。例如，在对14个结肠直肠癌患者的研究中，其中有7个证实了k-ras突变，同一突变见于6个患者的血清。血清阳性率为86％(Anker 1997)。另一个研究表明杂合性丢失(LOH)、微卫星不稳定、k-ras及p53突变的血清阳性率分别为0、0、19和70％(Hibi 1998)。已在其它类型的癌症中获得相似结果，其中见于血清DNA(脱氧核糖核酸)的遗传变化倾向于比见于原发性肿瘤的遗传变化更低(Kopreski 2001；Sozzi 1999；von Knobloch 2001)。
与其它相关研究相比，本发明利用血清β-连环蛋白DNA早期检测结肠直肠癌可满足作为早期检测标记的标准：1.该标记差异性地存在于正常及癌变前或肿瘤携带患者的血液中；2.该方法具有检测直径小至4mm的腺瘤状息肉的能力；3.该方法简便，具有高准确度；4.所需血样量小(2-5ml)，并且样品收集是通过非侵入性的正常抽血操作。从而，本发明提示血清或血浆中β-连环蛋白DNA水平，连同β-连环蛋白RNA水平，可为利用早已存在的仪器和试剂对结肠直肠癌进行有效准确测试的探索提供一种解决方法，因此适于对这种日益增长的常见癌症的大范围群筛、早期检测以及疾病监测。
实施例
以下实施例旨在举例说明，而并非限制本文所述发明的实施方案。具体地，在如下的讨论中，列举了众多具体的细节，以为本发明公开提供透彻的理解。不过，本领域技术人员将会理解文中的有些技术无需此类具体细节就可能实施。在其它情况下，公知的要素或具体细节已被精简或完全省略，这是因为对这些特征的详细讨论被认为对于获得对本发明公开的完整理解不是必要的，并且被认为是在相关技术领域普通技术人员的理解范围之内的。
实施例1
*在结肠直肠癌瘤患者的所有血浆样品中检测到β-连环蛋白RNA
为检测血浆β-连环蛋白的存在，利用将产生224bp基因外显子3区的引物#1对来自癌瘤患者的两份血样进行RT-PCR(反转录聚合酶链式反应)。由表达高水平β-连环蛋白的癌瘤提取的RNA样品作为阳性对照包括在内。结果表明当反应中存在反转录酶(RT)时，两份血浆和阳性对照RNA样品中都产生224bp条带，但不存在反转录酶则没有条带(图1a)。利用内含子跨接引物(引物#2，表1)对其它10份血浆RNA样品进行了RT-PCR分析。
数据显示在所有10份患者血浆样品中清楚地检测到250bp的片断(图1a，泳道1-10)，提示β-连环蛋白RNA于癌瘤患者循环血中的存在。数据也证明所述反应是RT-依赖性的(图1b，泳道12)。基因组DNA样品作为PCR反应的阳性对照包括在内，并且如期出现450bp的条带(图1b，泳道11)。
为证明所述250bp条带来自血浆中的RNA而非DNA模板，对未经DNase I事先处理的三份剩余血浆RNA样品进行测试。
凝胶上出现了两种PCR产物：由RNA扩增的250bp条带，以及由DNA污染的血浆RNA提取物扩增的450bp条带。所有三份样品在存在RT时均产生250和450bp的条带(图1b，泳道13-15)，而RNase处理的DNA样品在不存在RT时观察到单一的450bp条带(图1b，泳道1)。
利用上文所述的三种稍有区别的实验设置对15个患者进行了癌瘤测试，并且数据显示15个患者中有15个清楚地为血浆β-连环蛋白阳性。
实施例2
*血浆RNA高比率地存在于癌瘤患者中，但不存在于健康个体中
对来自具有可疑腺瘤个体的17份血浆样品进行β-连环蛋白RNA的筛选。在来自具有可疑腺瘤个体的这17份血浆样品中，通过250bp RT-PCR产物的存在表明其中11份是血浆阳性的；有6份发现是阴性的(图2a，泳道1-11；图2b，泳道1-6)。利用β-肌动蛋白序列特异性的引物对所述6份阴性样品进行了RT-PCR测定(表1，引物#3)。在所有6份血浆样品中检测到β-肌动蛋白RNA(图2c，泳道1-6)，说明这6份血浆RNA提取物具有可扩增级质量。在具有阴性β-连环蛋白信号的6个患者(表2，患者#10、14和16)中，后来的活组织检查证实三人被诊断为腺瘤，两人具有肉芽组织，而另一人具有扩张的淋巴间隙(表2，患者#1-3)。腺瘤患者中检出百分率为79％(14人中的11人)。对10个健康受试者进行了平行的RT-PCR分析。10个健康对照中有9人表现出阴性血浆β-连环蛋白信号，但所有人都表现出阳性β-肌动蛋白RNA信号(图2d和2e，泳道1-10)。他们中间只有1人具有相当弱的阳性信号(图2d，泳道10)。
总结起来，利用RT-PCR分析对证实为癌瘤或腺瘤的32个患者的血浆进行了β-连环蛋白存在的检查。结果显示100％(15人中的15人)的癌瘤患者、79％(14人中的11人)的腺瘤患者和10％(10人中的1人)的健康志愿者在其循环血中携带β-连环蛋白RNA。值得一提的是，具有微量血浆β-连环蛋白RNA、看似健康的受试者长期饱受结肠直肠不适之苦，偶尔伴有便血和腹泻，尽管在内窥镜检查中未检测到异常或溃疡性结肠炎。具有可疑腺瘤的三个患者经同意也进行了血浆β-连环蛋白测试。所有后来经活组织检查证实未患腺瘤的三个患者都是血浆信号阴性的。
已证明游离DNA存在于生理失调及癌症患者的循环血中，且该DNA可利用PCR测定检测。
此外，已有报道证明特定基因序列的遗传变化能够在癌症患者的血清中检测得到(Anker P 1997；Hibi K 1998；Kopreski MS2001；Sozzi G 1999；von Knobloch R 2001)。除血浆DNA之外，已在癌变而非健康个体中利用RT-PCR分析检测到序列特异性RNA(Kopreski MS 1999；Lo KW 1999；Chen XQ 2000)。检测血浆和血清DNA或RNA的PCR方法是否能够实施用于癌症的诊断和预后，将主要地有赖于数据能够如何良好地验证肿瘤状态或者甚至是癌变前的病变。例如，癌胚抗原(CEA)广泛地在多种癌症以及在某些正常组织包括结肠组织中表达。与糖类抗原19-9(CA 19-9)一起，这些是CRC患者处理中两个最常见的肿瘤标记。一般而言，通过蛋白含量的常规免疫化学测定，CEA标记产生从40到60％范围的阳性检出率。利用RT-PCR进行血清CEA RNA检测已将检测率从35％提高到约70％(Guadagni，2001)，另一个最近的研究证明酪氨酸mRNA存在于60％(6人中的4人)恶性黑色素瘤患者的血清之中，但不存在于任何正常对照血清之中(Kopreski 1999)。在我们目前的研究中，CRC检测的阳性率对癌瘤患者而言为100％，而对腺瘤患者为79％。因而，血浆β-连环蛋白RNA似乎是CRC检测有效的血清标记。
眼下，唯一非侵入性的CRC筛选方法是粪隐血试验(FOBT)。若干研究发现在普通和高危患者中用FOBT筛选使死亡率降低16％。然而，这种测试的局限性在于低预测率(小于20％)。用于CRC筛选，尤其是腺瘤早期检测的其它方法是柔性乙状结肠镜检，在为数不多的病例对照研究中，它据称使死亡率降低70％(综述参见Scotiniotis I，1999)。这种测试灵敏并且是特异性的；不过，它在本质上是侵入性的。就这点而言，用于血清β-连环蛋白检测的基于RT-PCR的方法可能确实提供了理想的用于普通和高危个体CRC筛选的工具。该方法可用于监测术后和化疗患者。由于已知β-连环蛋白也与其它类型的癌症有关，我们目前用于检测血清或血浆β-连环蛋白的发明可扩展至用于检测、监测、筛选具有不同组织起源的癌症。这是首次报道并提示血浆β-连环蛋白RNA的存在具有诊断价值。
实施例3
*腺瘤和癌瘤组织核β-连环蛋白信号的免疫化学染色
在检查的200多个病例中，92％的腺瘤和100％的癌瘤，但没有一个正常组织表现出升高的核β-连环蛋白。为测定由来源于实施例1和2的患者获得的腺瘤和癌瘤的核β-连环蛋白信号，对石蜡包埋的32个患者的腺瘤和癌瘤组织块切片并进行核β-连环蛋白检查。根据强度和阳性细胞百分比对免疫组织化学染色进行评分。表2显示在所有组织样本中观察到β-连环蛋白的核易位。
实施例4
*利用实时RT-PCR技术对健康个体和腺瘤或癌瘤患者的血液β-连环蛋白RNA进行定量
利用实时反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)研究了腺瘤和癌瘤患者之间血浆β-连环蛋白的定量差异。结果表明β-连环蛋白mRNA的平均拷贝数与正常个体(n＝14；均值36；范围从0到169)相比，腺瘤患者(n＝12；3个阴性；8个阳性；均值1.1×103；范围从0.69×103到1.80×103)高30倍，而癌瘤患者(n＝18；均值2.2×104；范围从0.67×104到4.4×104)高598倍。癌瘤患者的β-连环蛋白mRNA拷贝数比腺瘤患者高19倍。这些定量分析提供了清楚的证据：血浆β-连环蛋白mRNA是差异性存在的、并且可作为诊断工具来区分健康受试者、腺瘤和癌瘤患者。
实施例5
*结肠直肠腺瘤和癌瘤患者血清中β-连环蛋白DNA的检测
首先用从结肠直肠癌瘤患者提取的血清DNA样品进行PCR分析。结果显示在所有15份血清DNA样品中观察到359bp的条带(图3a，泳道1-16)。对确认患有从轻度到重度异常增生的腺瘤的10个患者进行了测试。在10个患者的9人中检测到阳性条带(图3b，泳道1-11)。检出率为90％。唯一的阴性病例(图3b，泳道8)是可扩增的，因为在用RET特异性引物扩增后，它产生阳性156bp的条带(图3d，图表下部，泳道13)。也对10个健康志愿者对照进行了β-连环蛋白的PCR扩增。没有一个血清样品表现出β-连环蛋白阳性信号，而利用RET特异性引物清楚地检测到阳性信号(图3c，泳道1-10和1D，泳道1-11)。另外，平行进行了已知为阳性的癌瘤血清样品，并且在琼脂糖凝胶上显示出典型的359bp条带(图3c，泳道11)。图3c和图3d的泳道12为PCR反应的阴性对照。
数据首次表明，血清β-连环蛋白DNA在所有的结肠直肠癌瘤患者中以及在10个结肠直肠腺瘤患者的9人中可检测到，而所有10个健康个体不含血清β-连环蛋白DNA。该结果提示血液中β-连环蛋白DNA的存在与处于肿瘤形成前及恶性期的癌症的存在显著相关，这也提示循环的β-连环蛋白来源于患者的腺瘤或癌瘤组织。本例的10个腺瘤患者中，血清β-连环蛋白阴性的个体(患者#9，表4)具有最小的腺瘤(直径3.5mm，48mm3)。具有倒数第二小腺瘤(63mm3)的患者血液中表现出可扩增的β-连环蛋白DNA，提示本法的灵敏度将允许我们检测至少小至63mm3的恶化前的腺瘤状息肉。建议利用实时PCR分析对样品中β-连环蛋白DNA的拷贝数进行定量。所述发现表明测量血液中β-连环蛋白DNA的水平为结肠直肠癌早期检测提供了高度灵敏而非侵入性的方法。该方法可扩展至不同组织起源的癌症。
现在参照附图，图1总体上显示了利用RT-PCR对结肠直肠癌瘤患者血浆的β-连环蛋白RNA的检测。更具体地，图1a显示了利用β-连环蛋白外显子引物对β-连环蛋白的RT-PCR扩增。泳道1-4，分离自两个癌瘤患者的血液RNA样品在存在(泳道1和3)和不存在(泳道2和4)RT酶时的RT-PCR反应；泳道5，作为阳性对照的由表达β-连环蛋白的癌瘤样本提取的mRNA；泳道6，缓冲液对照。M：RNA标记。图1b显示了利用β-连环蛋白内含子跨接引物对β-连环蛋白的RT-PCR扩增。泳道1-10，分离自十个癌瘤患者的DNAasa处理的血浆RNA；泳道11，作为PCR反应阳性对照的基因组DNA；泳道12，缓冲液对照。泳道13-17，分别来自泳道8-12而未经DNAase事先处理的样品。图1c显示泳道1～3，用内含子跨接引物通过RT-PCR由三个患者分离的未经DNAase处理的β-连环蛋白RNA(250bp)；泳道4，阳性DNA对照；泳道5，阴性缓冲液对照。M：DNA标记。
图2显示了利用RT-PCR对疑为结肠直肠腺瘤患者(图2a-2c)的血液β-连环蛋白(图2a和图2b)和β-肌动蛋白(图2c)RNA的检测。A.泳道1-17，分离自17个患者的血浆RNA；泳道18，阳性DNA对照；泳道19，阴性对照。对来自10个健康对象(泳道1-10)血浆的血液β-连环蛋白(图2d)和β-肌动蛋白(图2e)RNA的检测。泳道11，阳性DNA对照，泳道12，阴性缓冲液对照。
图3显示了对腺瘤或癌瘤患者及正常对照血清β-连环蛋白DNA的检测。图3a、图3b和图3c显示利用β-连环蛋白特异性引物对分离自结肠直肠癌瘤患者的血清样品进行PCR分析：图3a，泳道1-15；对结肠直肠腺瘤患者的分析：图3b，泳道1-10；对健康个体的分析：图3c，泳道1-10。图3d：利用RET特异性引物对具有阴性β-连环蛋白信号的血清样品进行PCR反应。泳道1-10，如图3c所示相同的健康个体的血清样品；图3d，泳道13：如图表图3b，泳道8所示相同的血清样品。分离自癌瘤的阳性对照基因组DNA：图3a，泳道16；图3b，泳道11；图3c，泳道11；图3d，泳道11。阴性无细胞对照：图3a，泳道17；图3b，泳道12；图3c，泳道12；图3d，泳道12。M：Hae IIIλDNA标记。
所应用的技术：
血样和RNA提取
通过经皮针从每个患者收集6-ml血样到含乙二胺四乙酸锂肝素的8-ml真空容器(Vacutaniners)中。血样以4800rpm离心8分钟。将血浆等分装入聚丙烯管并贮存于-80℃，稍后用于RNA提取。RNA利用TRIZOL试剂盒(Life Technologies，USA)由血浆样品提取，然后利用RNeasy柱(Qiagen，Germany)根据制造商的手册纯化。简单讲，将2ml各血浆样品与1.6ml TRIZOL和0.4ml氯仿混合，以12,000rpm于4℃离心15分钟。收集水相，利用RNeasy柱提取RNA。将分离的RNA溶于15μl DEPC处理过的水中。所述RNA样品进一步用PCR级的脱氧核糖核酸酶I(DNase I)(LifeTechnologies)处理。在反应中，向15μl RNA样品中各添加1μl的10×DNase I反应缓冲液和DNase I，并于室温下温育15分钟，紧接着通过添加1μl 15mM EDTA并于65℃加热5分钟使DNase I失活，然后冰上冷却备用RT-PCR反应。
血液RNA样品的引物和RT-PCR反应
血浆β-连环蛋白的检测是由包括跨接在β-连环蛋白基因外显子3和4之间的内含子序列在内的引物集合(表1)利用RT-PCR测定进行的。为比较起见，在有些PCR反应中也掺入了位于β-连环蛋白基因外显子3之内的另外的引物序列集合。反转录反应根据制造商的指南(Qiagen，Germany)进行。PCR利用GeneAmp DNA扩增试剂盒中提供的试剂利用AmpliTaq Gold作为聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Foster City，CA)进行。PCR所用参数为40个循环，其中95℃初始变性10分钟，紧接着94℃1分15秒、59℃(β-连环蛋白)1分30秒、72℃1分30秒，最终的延伸步骤为72℃10分钟。PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析。每个RT-PCR测定中包括阴性(水)对照。对所有具有阴性结果的样品利用内含子跨接引物(表3)进行β-连环蛋白的RT-PCR测定，作为血浆提取的RNA可扩增性的对照。
DNA提取
从凝结的血样上清中取出血清，并以4800rpm离心8分钟，紧接着小心地将血清等分装入聚丙烯管并贮存于-20℃，稍后用于DNA提取。利用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen，HildenGermany)根据制造商的方案从200μl血清中分离DNA。所述DNA样品用50μl dd H2O洗脱。
血液DNA样品的引物和PCR反应
β-连环蛋白的检测是由侧接β-连环蛋白基因第二和第三内含子的引物集合(表3)利用PCR测定进行的。PCR利用GeneAmpDNA扩增试剂盒中提供的试剂利用AmpliTaq Gold作为聚合酶(Perkin-Elmer Corp.，Foster City，CA)进行。PCR所用参数为40个循环，其中95℃初始变性10分钟，紧接着94℃1分15秒、57℃(β-连环蛋白)及69℃(RET)1分30秒、72℃1分30秒，最终的延伸步骤为72℃10分钟。PCR产物通过1.5％琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析。PCR产物通过直接的DNA测序证实。每个PCR测定中包括阴性(水)对照。对所有具有阴性结果的样品进行RET基因的PCR测定，作为血清DNA样品可扩增级质量的对照。编码受体酪氨酸激酶的RET基因序列正常地存在于健康个体的循环血中(Matisa-Guiu 1998)。
免疫组织化学染色和评价
β-连环蛋白的单克隆抗体(C19220)购自于TransductionLaboratoried(U.S.A.)。该抗体是针对小鼠β-连环蛋白的C-端(a.a.571-581)制备的，并对人类、大鼠和小鼠物种的β-连环蛋白具反应性。将4μm厚的组织切片置于硅烷涂敷的(Sigma Chemicals，St.Louis，MO)玻璃载片上，过夜风干，并由二甲苯和梯度乙醇再水合。抗原探寻和免疫化学染色在Ventana-ES自动免疫染色仪(Ventana，Tucson，Az)中按照说明进行。切片用Harris苏木精复染，并在梯度乙醇中再水合后由封盖胶(permount)封固。阴性对照通过用TBS替换β-连环蛋白抗体进行。阳性信号在光学显微镜下以10×40的放大倍数在4个视野中进行评价，而不知晓临床结果。结果通过两个独立的观察者手工评价，并且根据Remmele和Schicketanz并稍加改动(Remmele & Schicketanz，1993；Wong等，2001)，将数据表达为通过用“染色强度”乘以“阳性细胞百分比”获得的IHC评分。在本研究中，所述IHC评分如下表示：“-”＝无表达，1+＝弱表达，2+＝中等表达，3+＝强表达，而4+＝极强表达。
通过实时RT-PCR对血浆β-连环蛋白RNA的定量分析
血浆β-连环蛋白RNA的拷贝数利用TagMan检测系统(Heid等，1996)通过实时RT-PCR测量。PCR指数期内任何给定循环中荧光产物的含量与模板拷贝的初始数目成正比。记录反应并利用配备有96-孔热循环仪的ABI Prism 7700序列检测仪(Perkin-ElmerApplied Biosystems，UK)分析。简要地，将RNA样品(50-100ng)与0.01单位的尿嘧啶N-糖基化酶温育(50℃2分钟)，并在25-μl寡聚(dT)-引物反应(体系)中于60℃进行30分钟反转录。然后在正向和反向引物的存在下进行40个PCR循环(每个循环92℃20秒以及62℃1分钟)之前，对cDNA模板进行5分钟的92℃初始变性，然后用荧光淬灭基团6-羧基荧光素在5’端和荧光淬灭分子在3’端进行标记。
表1：PCR反应中所用引物的序列
Figure C0381522800161
表2：结肠直肠腺瘤和癌瘤患者的血浆β-连环蛋白RNA与其各自病变处核β-连环蛋白表达(IHC评分)的关联
Figure C0381522800171
dys：异常增生；N.A.：不适用；N.D.：未测。
表3：PCR反应中所用的引物
Figure C0381522800181
表4.患者记录
Figure C0381522800182
dys：异常增生；N.A.：不适用；N.D.：未测。
尽管文中公开了多种实施方案，应当理解它们仅作为实施例提供，而不用于限制。因此，本发明的广度和范围不应当局限于上述示例性的实施方案，而只应当根据如下权利要求及其等同体限定。而且，上述优势和特征在所述实施方案中起作用，但不应当将权利要求的应用局限于实现任何或所用上述优势的操作和构造。此外，特此将来自下列参考文献的教导并入，作为任何意义上的参考：
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另外，文中的章节标题是为与法条37 CFR 1.77的提示相一致而提供的，或者是提供组织线索。这些标题不应当限制或描述可由本发明公开产生的在任何权利要求中所列的发明的特征。具体地，并且作为实例，尽管标题涉及“发明的技术领域”，权利要求不应当受限于该标题之下为描述所谓的发明领域所选的语言。再有，在“发明背景”中的技术描述不应当解释为承认所述技术为本发明公开中任一发明的现有技术。“发明概述”也不能当作是对文中所列权利要求中陈述的发明的描述。此外，这些标题或本发明公开别处提及的单数形式的“发明”不应当用来证明本发明公开所主张的只有一个发明点。根据本发明公开所附多个权利要求的限制，可列举多个发明，因此权利要求及其等同体限定了由此保护的发明。在所有情况下，权利要求的范围应当参照说明书根据其自身来考虑，而不应当局限于文中所列标题。

Claims (1)

1.在检测离体血清或血浆中编码β-连环蛋白的RNA或DNA的存在及拷贝数的方法中使用的引物对，所述引物对为对于β-连环蛋白具有特异性的由TGATTTGATGGAGTTGGACAT和CATTGCATACTGTCCATCAAT组成的引物对。
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