CN105385765A - 实时荧光绝对定量检测家禽beta连环蛋白的试剂盒及应用 - Google Patents

实时荧光绝对定量检测家禽beta连环蛋白的试剂盒及应用 Download PDF

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秦爱建
张�杰
张丹阳
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石亚运
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邵红霞
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Abstract

实时荧光绝对定量检测家禽beta连环蛋白的试剂盒及应用，属于分析检测领域，检测试剂盒包含上游引物β-cateninF：SEQIDN0.1，下游引物β-cateninR:SEQIDN0.2，以及TaqMan探针β-cateninP:5‘-FAM-aagctgacttgatggagttgga-TAMRA-3ˊ。本发明可以精确定量检测标本中禽家β-catenin的mRNA表达量。该试剂盒可以用于鸡体内各组织脏器中禽家β-catenin的表达分析，也可以用于检测不同状态下细胞中禽家β-catenin表达水平的变化，具有高灵敏度、高特异性、高重复性的优点。

Description

实时荧光绝对定量检测家禽beta连环蛋白的试剂盒及应用
技术领域
本发明属于生物分析检测技术领域，具体涉及家禽beta连环蛋白β-catenin的测定。
背景技术
beta连环蛋白（β-catenin）最初作为哺乳动物细胞粘附的一个复杂组件于1990年代初被发现，后来发现果蝇中参与调节无翅的基因与哺乳动物的β-catenin在结构上和功能上都是同源的。β-catenin由CTNNB1基因编码，由781个氨基酸组成，相对分子量约为92kDa，在人类定位于染色体3p21上。β-catenin含12个Armadillo（arm）重复区及独特的N末端和C末端，其中12个arm重复区可形成一种超螺旋结构，在与钙黏蛋白（cadherin）、APC、Axin、TCF/LEF等的结合中起重要作用；羧基端由100个氨基酸组成，负责激活靶基因的转录；氨基端有130个氨基酸，富含Ser/Thr残基位点，控制分子的稳定性。
β-catenin是一种多功能蛋白，在调控生理平衡中起中心作用，正常状态下，β-catenin受胞外因素刺激后可调控一些基因的转录，或作为粘附因子保持上皮细胞的完整性。其异常表达可导致多种疾病，包括癌症。HerenciaC、HeiserPW等研究表明β-catenin的异常表达可导致正常细胞恶性转化，还可造成一个适合癌症发展的肿瘤微环境。作为致癌基因和转录调控基因，β-catenin可控制癌症的发生、发展和复发。近年来国内外研究表明在肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌、恶性黑色素瘤等肿瘤形成中β-catenin出现突变以及核转移，从而活化信号通路。β-catenin作为信号通路的关键分子，在癌症中的异常表达和功能可能使其成为未来癌症治疗的靶点。然而在家禽肿瘤性疾病中β-catenin的生物学功能还未见报道。
目前对于家禽β-catenin的研究还处于起始阶段，各种检测家禽β-catenin表达的方法还很欠缺。随着分子生物学技术的飞速发展及其在医学研究中的广泛应用，通过实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-timePCR）技术检测蛋白基因表达已成为可能。Real-timePCR方法有着比ELISA等传统方法无法比拟的高灵敏度及相对的高特异性，而且可以精确定量。因此运用Real-timePCR技术对家禽β-catenin进行实时的定量检测，为深入研究家禽β-catenin具有重要作用。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种用于家禽beta连环蛋白检测的RT-PCR试剂盒。
本发明试剂盒包括：
1）上游引物β-cateninF：5’-ACAGCAAGGAACATGGCAAC-3’；
2）下游引物β-cateninR：5’-CACTCAAAGAGGGAGCAGT-3’；
3）TaqMan探针β-cateninP：5‘-FAM-aagctgacttgatggagttgga-TAMRA-3'；
4）标准品模板：102，103，104，105，106，107，108，109拷贝/uL的β-catenin基因阳性质粒；所述β-catenin基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体，在出发载体的EcoRI位点插入家禽β-catenin基因片段。
本发明试剂盒可方便地对样品的家禽β-catenin进行测试，也可以用于检测不同状态下细胞中禽家β-catenin表达水平的变化，具有高灵敏度、高特异性、搞重复性的优点。
本发明的另一目的是提供该试剂盒的应用，即对家禽β-catenin进行测试。
方法是：先将各标准品模板分别与试剂盒中上、下游引物、TaqMan探针β-cateninP和无菌去离子水组成反应体系进行PCR扩增，其中上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L，TaqMan探针β-cateninP在体系中的终浓度为0.5μmol/L，PCR仪中的反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃1min，共40个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃，取得实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
再取待测家禽组织脏器的cDNA与试剂盖中上、下游引物、TaqMan探针β-cateninP和无菌去离子水组成反应体系进行PCR扩增，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L，TaqMan探针β-cateninP在体系中的终浓度为0.5μmol/L，PCR仪中的反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃1min，共40个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃，取得待测家禽组织脏器目的基因扩增循环数Ct值；通过所述实时荧光定量RT-PCR标准曲线，得出待测家禽组织脏器β-catenin基因的拷贝数。
本发明利用已知起始拷贝数的标准品制作标准曲线，只要获得检测样品的CT值，即可从标准曲线上计算出该样品的拷贝数。本发明最大的特点和优点在于，通过一次RealtimePCR反应，就可以精确定量检测标本中家禽beta连环蛋白（β-catenin）的基因拷贝数。
附图说明
图1为实时荧光定量RT-PCR标准品扩增动力学曲线。
图2为实时荧光定量RT-PCR标准曲线。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例作进一步说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
一、获取荧光定量RT-PCR法检测家禽β-catenin的标准曲线：
1、材料：
DNaseⅠ购自Fermentas公司。反转录试剂盒等购自大连TaKaRa公司。T载体连接酶购自Promega公司。dNTP购自上海生工生物工程有限公司。总RNA提取试剂盒为杭州Axygen产品。TaqManUniversalPCRMasterMix（即TaqMan探针β-cateninP：5‘-FAM-aagctgacttgatggagttgga-TAMRA-3'）为美国ABI公司产品。其它为国产分析纯试剂。
2、引物及探针设计与合成：
以家禽β-catenin全长cDNA序列(GenBank登录号NM_205081.1)为模板，使用PrimerExpressTM(V3.0，美国ABI公司)软件分析和设计引物，并根据同时考虑家禽β-catenin基因组DNA序列情况，从中选择最佳引物及探针序列。
检测用PCR上游引物β-cateninF：5’-ACAGCAAGGAACATGGCAAC-3’(SEQIDN0.1)，下游引物β-cateninR：5’-CACTCAAAGAGGGAGCAGT-3’(SEQIDN0.2)，以及TaqMan探针β-cateninP：5‘-FAM-aagctgacttgatggagttgga-TAMRA-3'(SEQIDN0.3)均由美国ABI公司合成。
3、检测标准品制备：
以新鲜制备的家禽β-catenin全长cDNA为模板进行家禽β-catenin基因的扩增，反应体系为50μL：cDNA模板1μL，上、下游β-catenin引物各1μL（10nM），dNTP4μL，10×buffer（含MgCl2）5μL，LATaqDNA聚合酶0.5μL，ddw37.5μL。PCR反应的循环参数：95℃5min、95℃30s、60℃（退火温度根据不同基因有所调整）30s、72℃30s，经30个循环；72℃延伸10min。反应结束后进行电泳，凝胶浓度1%上样量5μL。胶回收上样50μL电泳，按照胶回收试剂盒回收PCR产物，即得家禽β-catenin目的基因片段，于-20℃保存备用。
将家禽β-catenin目的基因片段与pGEM-TEasy载体（购于美国Promega公司）按说明书要求以3:1的摩尔比在16℃水浴中连接过夜（连接体系10μL：5×ligationbuffer2μL，pGEM-T载体3μL，目的片段3μL，T4连接酶1μL，ddw1μL），取得连接产物，连接产物是在pGEM-TEasy载体的EcoRI位点插入了家禽β-catenin目的基因片段。
取连接产物5μL加入DH5α大肠杆菌感受态细胞，将转化后的感受态细胞均匀涂布于LB-Amp平板（添加X-Gal和IPTG），37℃过夜培养。挑取白色菌落进行培养，按常规方法提取质粒，用进行EcoR单酶切鉴定（酶切体系10μL：Buffer1μL，EcoR0.5μL，质粒3μL，ddw5.5μL），筛选阳性质粒。
采用筛选的方式，从质料中筛选出重组的质料的DNA序列条带长度为155bp作为荧光定量PCR的家禽β-catenin标准品质粒使用：
acagcaaggaacatggcaacccaagctgacttgatggagttggatatggccatggagcca60
gacagaaaagctgcagtcagtcattggcagcagcagtcatatctggactctggtatccat120
tccggtgccacgacaactgctccctctttgagtgg。
并将具有以上DNA序列特征的阳性重组质粒的阳性克隆进行扩增并冻存菌种。同时对家禽β-catenin标准品质粒用紫外分光光度计测定DNA浓度。
4、标准品曲线的制作：
将以上家禽β-catenin标准品质粒分别以无菌去离子水稀释至102，103，104，105，106，107，108，109拷贝/μL作为标准品模板，进行标准品曲线的扩增。
具体步骤如下：进入RealtimePCR仪的标准品模板的反应体系为25μL：其中TaqManUniversalPCRMasterMix（即TaqMan探针β-cateninP）加入量为12.5μL，标准品模板加入量为3μL，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L，TaqMan探针β-cateninP在体系中的终浓度为0.5μmol/L，其余为无菌去离子水；其中上游引物β-cateninF：5’-ACAGCAAGGAACATGGCAAC-3’(SEQIDN0.1)，下游引物β-cateninR：5’-CACTCAAAGAGGGAGCAGT-3’(SEQIDN0.2)，TaqMan探针β-cateninP：5‘-FAM-aagctgacttgatggagttgga-TAMRA-3'(SEQIDN0.3)。PCR仪中的反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃1min，共40个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃。
检测结束，根据噪音情况设定和调整基线及阈值并利用随机软件进行分析，建立标准曲线。得到的标准品扩增动力学曲线见图1，扩增得到的检测标准曲线见图2。
从图1可见：标准品扩增动力学曲线与梯度稀释的标准品一一对应，呈良好的倍数关系。
从图2可见：不同拷贝数质粒的扩增与Ct值存在良好的线性相关，可用于目的基因片段的定量分析。
二、应用：
1、标本检测：
取1日龄雏鸡各组织脏器分别经液氮研磨后用Axgen总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA。分别取各组织脏器1μgRNA，在20μL总反应体积内Oligo(dT)15-18为引物对其进行逆转录，取得各cDNA待测样品。
采用试剂盖中上、下游引物及TaqMan探针β-cateninP，在ABI公司7500型荧光定量PCR仪上进行PCR扩增，反应体系为25μL：其中TaqManUniversalPCRMasterMix（即TaqMan探针β-cateninP）加入量为12.5μL，cDNA待测样品加入量为3μL，其中上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L，TaqMan探针β-cateninP在体系中的终浓度为0.5μmol/L，其余为无菌去离子水。条件为95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃1min，共40个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃。同时加标准品检测作标准曲线。荧光信号的收集及数据的采集定在60℃。
测定结果经软件处理根据标准曲线计算出检测标本的家禽β-catenin表达量。
二、荧光定量RT-PCR法检测1日龄雏鸡组织脏器中家禽β-catenin的表达检测结果：
在图1的实时荧光定量RT-PCR标准曲线图上，通过测出的循环数Ct值即可相应地查找对应的待检样品中的β-catenin的拷贝数。
1日龄雏鸡组织脏器组织标本检测结果如上表。
<110>扬州大学
<120>实时荧光绝对定量检测家禽beta连环蛋白的试剂盒及应用
<160>4
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
acagcaaggaacatggcaac
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
cactcaaagagggagcagt
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>Taqman探针β-catenin
<400>3
aagctgacttgatggagttgga
<210>4
<211>155
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
acagcaaggaacatggcaacccaagctgacttgatggagttggatatggccatggagcca60
gacagaaaagctgcagtcagtcattggcagcagcagtcatatctggactctggtatccat120
tccggtgccacgacaactgctccctctttgagtgg

Claims (2)

1.一种用于家禽beta连环蛋白检测的实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其特征在于试剂盒包括：
1）上游引物β-cateninF：5’-ACAGCAAGGAACATGGCAAC-3’；
2）下游引物β-cateninR：5’-CACTCAAAGAGGGAGCAGT-3’；
3）TaqMan探针β-cateninP：5‘-FAM-aagctgacttgatggagttgga-TAMRA-3'；
4）标准品模板：102，103，104，105，106，107，108，109拷贝/uL的β-catenin基因阳性质粒；所述β-catenin基因阳性质粒是以pGEM-T载体为出发载体，在出发载体的EcoRI位点插入家禽β-catenin基因片段。
2.如权利要求1所述试剂盒的应用，其特征在于：
将各标准品模板分别与试剂盒中上、下游引物、TaqMan探针β-cateninP和无菌去离子水组成反应体系进行PCR扩增，其中上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L，TaqMan探针β-cateninP在体系中的终浓度为0.5μmol/L，PCR仪中的反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃1min，共40个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃，取得实时荧光定量RT-PCR标准曲线；
取待测家禽组织脏器的cDNA与试剂盒中上、下游引物、TaqMan探针β-cateninP和无菌去离子水组成反应体系进行PCR扩增，上游引物和下游引物在体系中的终浓度均为0.5μmol/L，TaqMan探针β-cateninP在体系中的终浓度为0.5μmol/L，PCR仪中的反应程序为：95℃预变性5min，然后95℃15s，60℃1min，共40个循环；荧光信号的收集及数据的采集定在60℃，取得待测家禽组织脏器目的基因扩增循环数Ct值；通过所述实时荧光定量RT-PCR标准曲线，得出待测家禽组织脏器β-catenin基因的拷贝数。
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