CN102586419A - 肝癌前期beta-catenin的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与肝癌早期病理演变有密切相关的信号通道（beta-catenin）基因的mRNA方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测beta-catenin基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。

Description

肝癌前期beta-catenin的mRNA水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与癌前变的mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。  

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万（贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万），700多万患者，每年的花费是1.4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性（多态性）；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善（动物模型设计不科学）等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化（癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术）指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上（特殊病例除外），很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨（有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中），其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平）上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成（单克隆）前，就可以做到早期预测和筛查。本发明采用核酸原位杂交技术，选择多组临床标本（肝癌病人、高危人群、正常对照），对JAGGED1基因与肝癌的早期预警进行检测分析。

发性肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是常见的恶性肿瘤，在全球恶性肿瘤死亡率中居第三位，每年引起数十万人死亡。我国是肝细胞癌高发区，发病率已上升到恶性肿瘤的第二位，年死亡率位于恶性肿瘤死亡率的第2～3位，近年来其发病率有增高的趋势。肝细胞癌现已成为严重危害人民生命安全的恶性肿瘤之一。目前肝癌的治疗主要有手术切除、化疗、放疗等。由于病人就诊时已多属晚期，上述治疗方法虽已取得很大的进展，但晚期肝癌病人的预后仍然极差。因此，阐明肿瘤的发生机制对于从源头上防止肿瘤的发生，进而最终战胜肿瘤是非常重要的，为此，全球的科学家正在进行不懈的努力。 Notch1基因发现于1919年，编码一个由2753个氨基酸组成的跨膜受体。近年来，从哺乳类动物中克隆了一系列Notch1受体的同源分子包括Notch1～4和5种配体，分别是DLL1、DLL3、DLL4、Jagged1和Jagged2。当Notch1受体与配体结合后，受体释放其胞内域NICD（Jagged1 Intracellular Domain），NICD转运到核内后，诱导靶基因的转录。Jagged1信号通路不但与细胞的增殖、分化密切相关，与肿瘤的发生发展都有密切的联系。1991年，Notch1在人类T淋巴母细胞白血病中被鉴定出来，提示其与肿瘤相关，随后的研究发现，染色体易位t（7；9）（q34；q34.3）导致位于9号染色体上的Notchl基因断裂，Jagged1胞外区丢失，其胞内区获得组成性活性而具有致痛作用。但是，Notch1在肿瘤发生发展的过程中，究竟是扮演癌基因还是抑癌基因角色？它在肿瘤发生的那个（些）环节起作用。目前均仍无定论。β—catenin在Wnt通路起核心分子作用，对肿瘤形成、分化、浸润及转移起重要作用。目前认为，Notch1和Wnt信号通路是相互联系并协调平衡的，它们之间存在着串话（cross—talking）。因此，研究者通过组织芯片技术，对大样本的肝癌标本进行Notch1，Jagged1和β—catenin的检测，观察并分析它们的表达差异，探讨Notch1、Jagged1、β—catenin信号通路在肝癌中的作用，探讨肝癌的发生机制。应用组织芯片技术，收集大样本的肝细胞癌，通过免疫组化方法检测Notch1/Jagged1和β—catenin的表达情况，探讨Notch1/Jagged1及β—catenin在肝细胞癌中的作用机制。同时对其阳性表达与肝细胞癌的临床病理特征进行分析，以期发现更多的信息。他们收集新鲜肝细胞癌及癌旁组织手术标本和培养肝细胞癌株HepG2和肝正常细胞株LO2，运用免疫组化和RT—PCR的方法，进一步检Notch1/Jagged1和β—catenin mRNA的表达，同时通过研究β—catenin表达与Notch1/Jagged1表达的相关性，初步探讨肝细胞癌中Notch1信号通路和Wnt信号通路之间的联系，旨在为进一步阐明肝癌的发生机制提供相关的理论依据。共收集711例手术切除病例的石蜡包埋标本，其中包括339例肝细胞癌、22例肝胆管细胞癌、82例转移性癌、174例癌旁肝组织、94例正常肝组织。运用组织芯片技术将上述标本制作成13个组织芯片蜡块，通过免疫组织化学技术检测Notch1/Jagged1和β—catenin抗体在各种病例的表达情况，分析抗体的阳性表达与肝细胞癌的临床病理特征之间的联系。同时提取37例新鲜肝细胞癌、37例癌旁肝组织和肝细胞癌株HepG2、肝正常细胞株LO2的RNA进行RT—PCR，进一步检测Notch1/Jagged1和β—catenin mRNA的表达。研究结果表明：（1） Notch1/Jagged1在肝细胞癌中低表达，在非肿瘤组织中高表达。Notch1/Jagged1表达水平显著性正相关。提示Notch1/Jagged1在肝细胞癌中可能相互作用，起着抑癌作用。 （2）Notch1在肝细胞癌中的表达与年龄、血清AFP浓度、肿瘤细胞分化程度显著相关；Jagged1的表达与肿瘤细胞分化程度显著相关。肝细胞癌中Notch1/Jagged1在分化好的细胞高表达，分化差的细胞低表达；提示Notch1/Jagged1信号通路可能对肿瘤细胞的分化起着重要的调控作用。（3）Notch1/Jagged1的表达与门静脉癌栓形成显著相关，提示Notch1/Jagged1与肝癌肝内播散有关。（4）β—catenin的胞质/核表达在肝细胞癌中高表达，在非肿瘤组织中低表达；β—catenin的胞质/核表达在分化好的细胞表达低，分化差的细胞表达高。提示β—catenin在肝细胞癌的发生发展过程中起着促癌的作用。（5）Notch1与β—catenin的表达水平存在显著性负相关，提示它们在肝细胞癌中相互拮抗，互为对方的调控者。（6）半定量RT—PCR结果显示肝细胞癌中Notch1/Jagged1表达低，β—catenin表达高，与它们的蛋白表达情况同步，提示Notch1/Jagged1在肝细胞癌中的表达下降，可能不是发生转录水平，而是由其它原因引起。

将beta-catenin基因的mRNA作为早期筛查肝癌变前期有非常重要的临床诊断意义。beta-catenin的mRNA在肝癌变前期及癌变过程中低表达。他作于肝癌癌变前期筛查、及肝癌术的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。

发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本（正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者），突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的mRNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。

目前对beta-catenin基因的研究都采用高通量基因芯片和蛋白谱分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测mRNA比基因分析更科学（DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性东西），比蛋白分析更可靠（mRNA与蛋白转录有时候不同步）。根据现有的文献资料beta-catenin基因mRNA水平的检测技术及试剂盒未见报道。

本发明人在针对创新性发明的要求，设计了（肝癌患者、高危人群、正常对照人）不同数据例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上肝癌病人beta-catenin基因高表达，高危人群有不同程度的表达15-25%，正常人都是低表达。表明beta-catenin基因肝癌癌变前期筛查的重要标志物。

原位杂交技术（in situ hybridization）是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（mRNA）和检测的靶mRNA是采用碱基互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处的残基对检测的结果没有影响（因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上）。

鉴于目前临床上癌症的诊断（影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断）是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床癌症的诊治争取时间和空间。

发明内容

本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。 

其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与肝癌癌变前期筛查及术复发、转移早期预警相关的原位杂交检测方法。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针如SEQ ID NO.1所示序列，是beta-catenin基因序列中一段碱基序列，从500到1300bp。beta-catenin序列号：NM_030877，序列如SEQ ID NO.2所示，基因的核苷酸序列长度是1897bp，CDS是92……1783bp，位于染色体20q11.23-q12"上。（在探针标记过程中如果基因序列太长，超过1000bp以上，我们会用CDS的序列来设计探针，如果CDS的序列也超过1000bp以上，会采用基因的中间一段碱基序列来合成探针，碱基序列不少于500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析）。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。

本发明的癌变前期beta-catenin基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水平，对肝癌变前期筛查，及癌变后或术后复发、转移、扩散发生预警，进一步配合临床治疗。

本发明还提供一种beta-catenin基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤： 

（1）在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自肝癌患者、肝癌高危人群、健康人。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的癌症高危人群、癌症好发家族、肝癌患者。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以beta-catenin基因的一级转录功能产物mRNA为检测对象，合成探针是beta-catenin基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供基因的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人beta-catenin基因低表达，即小量显色，基因在癌症beta-catenin病人和正常人有显着差异，该基因的表达量比正常人表达量都高。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液； 

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交（42℃）；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交（42℃）；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以beta-catenin基因为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记（地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的beta-catenin基因表达量，用来确定癌变前期的mRNA变化量，预警肝癌变是否发生及肝癌患者术后是否复发、转移的预测。因为beta-catenin基因在正常人中低表达，如果beta-catenin基因表达量高，说明有患癌的风险，说明癌变已发生，或癌症病人术后已经复发、转移，从而获得癌症的诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

如上所述，当检测到基因的表beta-catenin达量高于正常对照时，则可预测受试者为肝癌变病理过程已发生。

本发明具有如下有益效果：

本发明的临床意义是更早期跟踪检测肝癌变发生和病理演变过程中beta-catenin基因mRNA表达量的变化，预警肝癌发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与癌症标志物，以及影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因转录的一级功能产物mRNA水平检测基因异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床癌症病患一个真正的早期诊断以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治肝癌恶疾。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

附图说明

图1是本发明基因原位beta-catenin杂交技术流程图。

图2是本发明实施例中肝癌病人beta-catenin高表达图片。

图3是高危人群（肝硬化）图片。

图4是本发明实施例中正常人beta-catenin表达图片。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以beta-catenin基因为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：

本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成：

消化液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
				保护液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
预杂交液	1300μL/管	2管/盒	无色透明液体
				正义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
反义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
				封闭液	1000μL/管	1管/盒	无色透明液体
碱性磷酸酶抗体	1μL/管	1管/盒	无色透明液体
				显色剂A	175μL/管	1管/盒	黄色液体
显色剂B	320μL/管	1管/盒	无色透明液体
				缓冲液Ⅰ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅱ	80mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				缓冲液Ⅲ	20mL/瓶	3瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅳ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				固定液	90mL/瓶	1瓶/盒	无色透明液体
阳性对照标本	6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液Ⅰ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅰ；

2).将20×缓冲液Ⅱ用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液Ⅱ；

按1:100稀释成0.2×缓冲液Ⅱ; 按1:200稀释成0.1×缓冲液Ⅱ；

3).将10×缓冲液Ⅲ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅲ；

4).10×缓冲液Ⅳ用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液 Ⅳ (取1#，2#，3#各10mL，加水至100mL既可)。

实施例2

应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本beta-catenin基因表达量的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液Ⅰ99.9ml，即为使用浓度)50 ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12 min，再用1×缓冲液Ⅰ洗5min；

3).用0.2%的保护液(保护液1ml加1×缓冲液Ⅰ，99ml即为使用浓度)洗10min，三蒸水洗5min（以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25μL/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内：

  在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液Ⅱ洗两次，每次15min；

  在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液Ⅱ洗一次，每次15min； 

  在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液Ⅱ洗两次，每次15min；

8).用1×缓冲液Ⅲ洗30s，取出玻片，自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内，加0.5%封闭液（1ml封闭液加5ml 1×缓冲液Ⅲ）100μL/片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）；

10).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗30s，自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内，加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1×缓冲液Ⅲ)100μL/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）；

12).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗3次，每次15min；

13).用1×缓冲液Ⅳ洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液Ⅳ中，混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1×缓冲液Ⅰ混匀）封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

肝癌病人20名，高危人群（肝硬化）20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有癌症患者beta-catenin基因表达增高，细胞染色深；高危人群（肝硬化）表达稍增高，染色深度比正常人深；正常对照组beta-catenin基因表达低，细胞多数不染色具体结果见图2、图3、图4。

胰腺癌人数	表达量%	高危人数（肝硬化）	表达量%	正常人数	表达量%
						1	78	1	18	1	0
2	69	2	19	2	6
						3	66	3	22	3	2
4	80	4	12	4	0
						5	64	5	24	5	0
6	72	6	18	6	2
						7	70	7	15	7	0
8	82	8	16	8	2
						9	77	9	17	9	0
10	69	10	23	10	0
						12	86	12	18	12	0
13	90	13	20	13	0
						14	88	14	24	14	2
15	82	15	21	15	3
						16	76	16	20	16	0
17	75	17	18	17	8
						18	87	18	19	18	5
19	90	19	24	19	0
						20	78	20	28	20	3

。

SEQ ID NO：1（探针序列）

      501 tggtggagct gaatgctgta cagtcgcttc tcggcttgct

      541 cggacacgat aatacagatg tgtccatagc tgtggtcgat ttgcttcagg aattaacaga

      601 tatagacacc ctccatgaga gtgaagaggg agcagaagtg ctcatcgatg ctctggtgga

      661 tgggcaggtg gtagcactgc tggtacagaa tctggagcgc ctggatgagt ctgtgaaaga

      721 ggaggcagat ggcgtccaca acactctggc tattgtggaa aacatggctg agttccggcc

      781 tgagatgtgt acagagggtg cccagcaggg tcttctacag tggctgttga agaggctgaa

      841 ggcaaagatg ccttttgatg ccaacaaact gtattgcagt gaagtgctgg ccatattgct

      901 ccaggacaat gatgaaaaca gggaattgct tggggagctg gatggaatcg atgtgcttct

      961 tcagcagtta tccgtgttta aaagacacaa tcccagcacg gctgaggagc aggagatgat

     1021 ggagaatctg tttgattccc tctgctcctg tctaatgctt agttccaatc gtgagcgctt

     1081 cctgaagggc gagggtcttc agctgatgaa tctcatgctc agggaaaaga agatctcccg

     1141 gagcagtgcc ctgaaagtgc tggaccatgc catgattggc cccgaaggca cagacaactg

     1201 ccataagttt gttgacattc ttggcttacg aaccatcttt cccctcttta tgaaatctcc

     1261 caggaagatc aagaaagtgg gaaccactga gaaggaacat

 

SEQ ID NO：2 Beta-catenin基因序列及号：NM_030877

1 actttacggc agtgtggctg gagccgcggc tgacgggccc gcggtctggg cgtgagtgca

       61 gggaagtgga gtatttgctg ggccgggtac catggacgtg ggcgaacttc tgagctacca

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     1021 ggagaatctg tttgattccc tctgctcctg tctaatgctt agttccaatc gtgagcgctt

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     1141 gagcagtgcc ctgaaagtgc tggaccatgc catgattggc cccgaaggca cagacaactg

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Claims (10)

1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。

6.一种beta-catenin基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞标本。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液白细胞标本选自癌症、肝硬化高危人群、正常人标本。

10.beta-catenin基因在制备检测肝癌原位杂交试剂盒中的应用。

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