CN102605060A - 肺癌病变前期14-3-3thta水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与肺癌早期病理演变有密切相关的14-3-3thta基因的mRNA方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可在mRNA水平上检测14-3-3thta基因的表达量，比影像医学和现有的临床生化检测指标更早期，能实现真正的癌变前期mRNA水平筛查，同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于县区级医院推广应用。

Description

肺癌病变前期14-3-3thta水平原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用

技术领域

本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与肺癌病理演变mRNA表达改变(病理演变过程)的相关检测技术。    

背景技术

根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数260万，死亡人数近210万，患者700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800万，患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万（贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20万），700多万患者，每年的花费是1.4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，然后及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因水平癌症的治未病。

2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了一个年度报告，对1972年发起的抗癌大战进行回顾，报告认为人类在抗癌大战中是失败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞异质性（多态性）；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善（动物模型设计不科学）等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。

本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的早期诊断。依照现有的临床医学影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化（癌抗原、癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术）指标来诊断癌症，都是肿瘤形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止2亿个肿瘤细胞，从癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上（特殊病例除外），很难证实的是在这个病理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨（有些病例，在发现原发病灶时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中），其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这是导致癌症死亡率不降的真正原因。

随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能在基因的一级转录功能产物（mRNA水平）上做更精确的早期筛查和诊断，在癌变前期或癌细胞形成（单克隆）前,就可以做到早期预测和筛查。

美国弗雷德·哈钦森癌症研究中心研究人员在一年时间里，检验了170名吸烟或曾经吸烟者的血液样本，其中85人被诊断患有癌症，85人没有患癌症。结果发现，患有癌症的测试对象中，51%的人血液中含有annexin1、14-3 -3θ和LAMR1三种蛋白质。研究中心教授哈奈什说：“这是关键的一步，这说明，实际上，某些抗原确实在诊断出肺癌前就开始活跃。这时，主体还没有任何症状。”14-3-3 theta基因与lamr1和annexin-1基因一样对肺癌的早期病理演变预警有非常重要的临床意义。研究同时证明14-3-3基因在肝癌的早期预警也有重要的临床意义。研究人员用TRIzol一步法提取肝癌组织、硬化肝组织及正常肝组织的总RNA并纯化mRNA.逆转录合成荧光分子(Cy3/Cy5)标记的cDNA探针与含有14-3-3基因家族成员的基因芯片杂交,用GenePix Pro3.0图像分析软件分析不同病变肝组织中该基因家族成员的表达差异,行半定量RT-PCR对结果进行验证并探讨差异表达基因的临床意义.结果:在肝癌组织中14-3-3基因家族成员呈差异表达,其中14-3-3γ在肝癌组织中明显下调,与肿瘤包膜的完整性相关，14-3-3η在肝癌组织中明显上调,与肿瘤患者的临床分期相关，14-3-3γ与14-3-3ηmRNA的表达强度呈负相关(r=-0.403,P＜0.05).结论:14-3-3基因家族调控机制的紊乱参与肝癌的发生、发展,其中14-3-3γ和14-3-3η与肝癌的关系最为密切。

本发明人在实验研究中采用核酸原位杂交技术和组化免疫方法，对肺癌患者，癌症高危人群（烟龄20年以上）及正常对照组的14-3-3theta进行检测分析。发现14-3-3theta在各组中的表达量明显不同。将14-3-3theta作为早期筛查肺癌变前期有非常重要的临床诊断意义。14-3-3theta在肺癌变前期及癌变过程中高表达。它作于各种癌变前期筛查、及癌治疗后的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。

发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床诊治模式一定要改变，不能只停留现在治已病（发病后诊治），要做到预防性诊治，做到治已病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明人在开发和生产重大疾病的mRNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创新。特别是筛选临床标本（正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者），突破了正常组织与肿瘤组织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的mRNA水平，与癌症早期基因病理生理学演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标，将临床上肿瘤形成后诊治模式变成肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。

目前对14-3-3theta的研究都采用技术主要有Northern杂交、表达芯片、实时荧光定量PCR和Solexa测序等高通量基因芯片分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测mRNA比基因分析更科学（DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是功能性体现），比蛋白分析更可靠（mRNA与蛋白转录有时候不同步）。根据现有的文献资料14-3-3theta水平的检测技术及试剂盒未见报道。

本发明人在针对创新性发明的要求，设计了肺癌患者、高危人群（烟龄20年以上）、正常对照等不同数据例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上肺癌病人14-3-3theta高表达，高危人群有不同程度表达15-25%,正常对照都是低表达。表明14-3-3theta基因肺癌变前期筛查的重要标志物。

原位杂交技术（in situ hybridization）是将分子生物学与细胞化学技术结合起来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针），在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确该分子全部序列，但已知其针对何靶分子），探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的同位素标记物有³H、³⁵S、¹²⁵I和³²P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其灵敏的。

根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA, RNA-RNA杂交。但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（mRNA）和检测的靶mRNA是采用碱基互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没有影响（因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上）。

鉴于目前临床上癌症的诊断（影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的诊断）是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水平真正早期筛查的技术，为临床癌症的诊治争取时间和空间。

发明内容

本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交检测探针和标记物。

其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与各种癌变前期筛查及治疗后复发、转移早期预警相关的原位杂交检测方法。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下：

本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示序列，是14-3-3thetaCDS的互补序列，碱基长度从242开始到982bp，14-3-3theta序列号：NM_003405, 为序列表SEQ ID NO.2所示序列，核苷酸序列长度是1807bp，CDS是242……982bp，位于染色体22q12.3"上。在探针标记过程中如果基因序列太长，超过1000bp以上，我们会用CDS的序列来设计探针，如果CDS的序列也超过1000bp以上，会采用基因的中间一段碱基序列来合成探针（碱基序列不能少于500bp，探针合成后要做序列检测，并对功能进行临床意义的分析）。

本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。

本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。

本发明的癌变前期14-3-3theta筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水平，对肺癌变前期筛查，及癌变后或术后复发、转移、扩散发生预警，进一步配合临床治疗。

本发明还提供一种14-3-3theta原位杂交的检测方法，包括以下步骤： 

（1）在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自肺癌患者、肺癌高危人群、健康对照组。

本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的癌症高危人群、肺癌患者。

本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以14-3-3theta为检测对象，合成探针是14-3-3theta的序列中得CDS碱基序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织细胞的14-3-3theta基因的mRNA。原位杂交技术的显示方法能提供14-3-3theta的半定量或定量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常女性14-3-3theta低表达或不表达，即小量显色和不显色，高危人群有一定量的表达，14-3-3theta在肺癌病人和正常对照有显着差异，该基因的表达量比正常对照表达量都高。

本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括：

1).将待测标本放入反应槽中；

2).仪器自动弃去液体，自动加消化液； 

3).仪器自动弃去液体，自动后固定；

4).仪器自动弃去液体，自动预杂交（42℃）；

5).仪器自动弃去液体，自动清洗；

6).仪器自动弃去液体，自动杂交（42℃）；

7).仪器自动弃去液体，自动清洗；

8).仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养（室温）；

9).仪器自动弃去液体，自动清洗，显色；

10).取出封片镜检。

本发明的一个优选实施例的方案是：以14-3-3theta为目的基因合成的核酸探针用地高辛标记（地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点，还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点），将该杂交探针与人体血液白细胞的待测14-3-3theta基因的mRNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下观察mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的mRNA的表达量。

本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的14-3-3theta表达量，用来确定肺癌病理演变前期的mRNA变化量，预警肺癌变是否发生及肺癌患者术后是否复发、转移的预测。因为14-3-3thta在正常人中低表达，如果14-3-3thta表达量高，说明有患癌的风险，说明癌变已发生，或癌症病人术后已经复发、转移，从而获得癌症的诊断信息。一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。

本发明具有如下有益效果：

本发明的临床意义是更早期跟踪检测肺癌变发生和病理演变过程中14-3-3thta表达量的变化，预警肺癌发生、发展趋势。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测与癌症标志物，以及影像医学检查有显着不同。本发明可以在基因转录的一级功能产物mRNA水平检测14-3-3thta异常表达，在影像医学检查未发现占位性癌病灶复发之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿瘤之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床肺癌病患一个真正的早期预警以及治疗后转移复发及早预测。这样才有可能实施癌症的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治肺癌恶疾。

此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。

附图说明

图1是本发明14-3-3theta原位杂交技术流程图。

图2是本发明实施例中肺癌病人14-3-3theta基因的mRNA表达图片。

图3是高危人群14-3-3theta基因的mRNA图片。

图4是本发明实施例中正常人14-3-3theta基因的mRNA表达图片。

具体实施方式

下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明而非限定本发明内容，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。

实施例1

按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以14-3-3theta为检测目的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中：本实施例的探针标记物选用地高辛。

试剂盒杂交液组成：

消化液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
				保护液	100μL/管	1管/盒	无色透明液体
预杂交液	1300μL/管	2管/盒	无色透明液体
				正义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
反义杂交液	10μL/管	1管/盒	无色透明液体
				封闭液	1000μL/管	1管/盒	无色透明液体
碱性磷酸酶抗体	1μL/管	1管/盒	无色透明液体
				显色剂A	175μL/管	1管/盒	黄色液体
显色剂B	320μL/管	1管/盒	无色透明液体
				缓冲液Ⅰ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅱ	80mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				缓冲液Ⅲ	20mL/瓶	3瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
缓冲液Ⅳ	90mL/瓶	1瓶/盒	浅黄色或无色透明液体
				固定液	90mL/瓶	1瓶/盒	无色透明液体
阳性对照标本	6片/盒

配制试剂使用浓度

1).将10×缓冲液Ⅰ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅰ；

2).将20×缓冲液Ⅱ用三蒸水按1:10稀释成2×缓冲液Ⅱ；

按1:100稀释成0.2×缓冲液Ⅱ; 按1:200稀释成0.1×缓冲液Ⅱ；

3).将10×缓冲液Ⅲ用三蒸水按1:10稀释成1×缓冲液Ⅲ；

4).10×缓冲液Ⅳ用三蒸水按1:10稀释成×缓冲液 Ⅳ (取1#，2#，3#各10mL, 加水至100mL既可)。

实施例2

应用核酸原位杂交检测方法对各组血液标本14-3-3theta表达量的实施过程：

1).取待测标本两张；

2).在玻璃缸里加入消化液(消化液100μL加1×缓冲液Ⅰ99.9ml，即为使用浓度)50 ml，37℃水浴预热10min，放进16张玻片，37℃处理12 min, 再用1×缓冲液Ⅰ洗5min；

3).用0.2%的保护液(保护液1ml加1×缓冲液                                                

, 99ml即为使用浓度)洗10min, 三蒸水洗5min（以上过程都在玻璃缸进行），取出玻片，让其自然干燥；

4).将玻片放入保湿盒内, 加预杂交液25μL/片（加在有细胞的地方），盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中3h以上；

5).取出玻片,弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内,用70%、90%、95%的乙醇各洗2min，取出，自然干燥；

6).将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25μL/片，另一张加反义杂交液25μL/片，盖上盖玻片, 盖紧保湿盒，放在42℃恒温水浴箱中16-24h；

7).取出玻片,弃去盖玻片, 将玻片放入玻璃缸内：

  在42℃恒温水浴箱中用2×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

  在42℃恒温水浴箱中用0.2×缓冲液Ⅱ洗一次,每次15min； 

  在42℃恒温水浴箱中用0.1×缓冲液Ⅱ洗两次,每次15min；

8).用1×缓冲液Ⅲ洗30s,取出玻片,自然干燥；

9).将玻片放入保湿盒内,加0.5%封闭液（1ml封闭液加5ml 1×缓冲液Ⅲ）100μL/片, 盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）；

10).取出玻片,用1×缓冲液Ⅲ洗30s,自然干燥；

11).将玻片放入保湿盒内, 加X-AP抗体(取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1.8ml 1×缓冲液Ⅲ)100μL/片,盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假阳性（此步骤不需加盖玻片）；

12).取出玻片，用1×缓冲液Ⅲ洗3次, 每次15min；

13).用1×缓冲液Ⅳ洗2min，加显色剂(显色剂A73.3μL，显色剂B157.5μL加到30mL 1×缓冲液Ⅳ中,混匀)，室温避光16h到18h以上；

14).用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1×缓冲液Ⅰ混匀）封片镜检。

本发明的核酸原位杂交检测方法将目的RNA用地高辛标记，成为RNA核酸探针，将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下观察14-3-3theta基因mRNA的存在和定位,根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。

肺癌病人20名，高危（烟龄20年以上）20名，正常对照组20名。抽所有待检人的外周血3-5毫升（分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有癌症患者14-3-3thta表达量高，细胞深染；高危人群表达稍降低，小数染色；正常对照组14-3-3theta表达量低，细胞多数不染色，具体结果见图2、图3、图4。

肺癌症人数	表达量%	高危人数	表达量%	正常人数	表达量%
						1	88	1	20	1	0
2	74	2	21	2	0
						3	65	3	25	3	0
4	64	4	15	4	2
						5	76	5	20	5	0
6	82	6	26	6	0
						7	78	7	16	7	2
8	86	8	23	8	0
						9	74	9	24	9	0
10	84	10	28	10	0
						12	68	12	23	12	2
13	82	13	22	13	0
						14	86	14	16	14	3
15	80	15	19	15	2
						16	88	16	0	16	0
17	84	17	22	17	0
						18	76	18	20	18	0
19	72	19	15	19	0
						20	77	20	17	20	2

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SEQUENCE LISTING

 

<110>  芮屈生物技术（上海）有限公司

 

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<212>  DNA

<213>  Homo sapiens

 

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agaagcagga gaaggcaact gaagatcctt caggtcccct ggcccttcct tcacccacca     1020

 

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Claims (10)

1.一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针为序列表SEQ ID NO.1所示的序列。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。

5.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。

6.一种14-3-3thta基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和

（2）检测所述杂交复合体。

7.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为：核酸杂交的温度为42℃；核酸杂交的时间为16－24小时。

8.如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞标本。

9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述的血液标本选自癌症、高危人群、正常人标本。

10.14-3-3thta基因在制备检测肺癌病变原位杂交试剂盒中的应用。

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