CN117568481A - 一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一组血浆外泌体tsRNAs作为肝癌诊断的标志物及其应用，属于分子生物学领域。一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物，所述的血浆外泌体tsRNAs标志物为以下序列中的任意一种或组合：tRF5‑Ser‑AGA‑1‑1‑030、tRF5‑Val‑CAC‑3‑1‑019、tRF5‑Val‑TAC‑1‑1‑029、tRF5‑Val‑CAC‑3‑1‑030、tRF5‑iMet‑CAT‑1‑1‑030。本发明筛选出的血浆外泌体tsRNAs标志物能够显著指示肝癌的发生，很好的提高肝癌诊断的准确性。该标志物可用于肝癌诊断检测试剂盒的开发，以及肝癌的辅助早期诊断。

Description

一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物及其应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，涉及一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物及其应用。
背景技术
肝癌是全球及我国恶性肿瘤死亡的主要原因之一，其中90%以上为肝细胞癌。最新肿瘤数据报告显示，我国肝癌的发病率仍然很高，肝癌已成为危害国民健康的一大公共疾病。
外泌体（exosome）是由细胞分泌的直径约为50~150nm，具有膜结构的微囊泡，其内含物包括蛋白质、脂质和核酸等多种生物活性成分，参与介导体内细胞间远程通讯。肿瘤患者在血液中分泌大量肿瘤特异性的外泌体，通过捕获这些外泌体便可以对患者的肿瘤进程进行一个评估。同时，现在肿瘤早筛领域中主流的液体活检的关键技术原理之一就是通过检测肿瘤相关外泌体的表达来进行肿瘤的早期诊断。
非编码RNA是外泌体内含物中的一种关键组成成分，也是近年来肿瘤分子生物学研究领域的热点。RNA高通量测序技术的发展使具有结构的RNA测序成为可能，因此研究者对非编码小RNA的类型和表达水平有了更加明确和清晰的认识。其中一类来源于tRNA的小RNA（tRNA-drived small RNAs， tsRNAs），长约18-40nt，来源于tRNA成熟体或前体，参与调节多种生理、病理功能，与肿瘤发生发展密切相关，已有报道发现tsRNAs在肺癌、乳腺癌和卵巢癌等多种肿瘤患者中异常表达。这提示tsRNAs具有成为肿瘤诊断标志物的潜力。
tsRNAs的表达与肝癌之间存在密切联系，tsRNAs在肝癌患者、肝癌细胞系、肝癌动物模型中存在异常表达谱，并且通过多种途经参与肝癌的发生发展。与常规肿瘤诊断方法相比，外泌体tsRNAs检测具有取样简便，检测成本低等优势，在肿瘤诊断生物标志物方面具有广阔的开发及应用前景。如果能够通过筛选到肝癌中异常表达的血浆外泌体tsRNAs作为生物标志物，并研发相应的诊断试剂、试剂盒，对肝癌的诊断现状将会有大大的推动。
发明内容
本发明的主要目的是针对肝癌临床无创诊断中出现的问题，提出一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物，以及该组血浆tsRNAs标志物在制备肝癌诊断试剂、试剂盒中的应用。
为实现上述目的，本发明提供一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物，所述的血浆外泌体tsRNAs标志物为以下序列中的任意一种或组合：
tRF5-Ser-AGA-1-1-030：序列如SEQ ID No.1所示;
tRF5-Val-CAC-3-1-019：序列如SEQ ID No.2所示;
tRF5-Val-TAC-1-1-029：序列如SEQ ID No.3所示;
tRF5-Val-CAC-3-1-030：序列如SEQ ID No.4所示;
tRF5-iMet-CAT-1-1-030：序列如SEQ ID No.5所示。
本发明还提供检测上述tsRNAs标志物的试剂的应用，包括下列任一应用：
（1）在用于制备早期筛查或辅助筛查肝癌产品的应用；
（2）在用于制备早期诊断或辅助诊断肝癌产品的应用；
（3）在用于制备评估肝癌患者患病风险的产品的应用；
（4）在用于制备评估肝癌患者预后效果的产品的应用；
（5）在用于制备预测治疗肝癌药物效果的产品的应用。
进一步的技术方案，所述的试剂包括用于检测tsRNAs表达水平的试剂，所述的tsRNAs包括tRF5-Ser-AGA-1-1-030、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-019、和/或tRF5-Val-TAC-1-1-029、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-030、和/或tRF5-iMet-CAT-1-1-030。
本发明还提供检测上述tsRNAs的试剂盒的应用，包括下列任一应用：
（1）在用于制备早期筛查或辅助筛查肝癌产品的应用；
（2）在用于制备早期诊断或辅助诊断肝癌产品的应用；
（3）在用于制备评估肝癌患者患病风险的产品的应用；
（4）在用于制备评估肝癌患者预后效果的产品的应用；
（5）在用于制备预测治疗肝癌药物效果的产品的应用。
进一步的技术方案，所述的试剂盒包括用于检测生物标志物表达水平的探针，所述的tsRNAs包括tRF5-Ser-AGA-1-1-030、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-019、和/或tRF5-Val-TAC-1-1-029、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-030、和/或tRF5-iMet-CAT-1-1-030。
进一步的技术方案，所述的试剂盒包括PCR反应常用的试剂和酶、dNTP/AMV逆转录酶、缓冲液、MgCl2、DEPC水和Taq酶。
进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括外泌体分离试剂。
有益效果
本发明提供的血浆外泌体tsRNAs作为肝癌诊断的标志物的优势在于：
(1) 与传统蛋白生物标志物不同，血浆tsRNAs是一种新型生物标志物，表达稳定、微创、易于检测，且定量精确，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，有助于肝癌的辅助诊断，为其他疾病生物标志物的研制提供参考。
(2) 本发明系统的研究了血浆外泌体tsRNAs在肝癌疾病进程中的作用，本发明筛选了一组tsRNAs标志物：tRF5-Ser-AGA-1-1-030、tRF5-Val-CAC-3-1-019、tRF5-Val-TAC-1-1-029、tRF5-Val-CAC-3-1-030、tRF5-iMet-CAT-1-1-030，具有高敏感性和特异性，可用于肝癌筛查、诊断和预后治疗等，且这5种tsRNAs标志物组合使用，敏感性和特异性更高，效果更好。通过血浆外泌体tsRNAs 生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得肝癌的诊断更加方便易行，为临床治疗提供基础，并为发现具有潜在治疗价值的新型小分子药物靶标提供帮助。
(3)血浆外泌体tsRNAs 试剂盒是一种全面系统的诊断和监测试剂盒，结合了外泌体技术用于肝癌的辅助早期筛查的安全、准确、无创等优势，同时采用本发明的标志物使得肝癌的诊断灵敏度、准确性均升高，更有助于肝癌患者的疾病状态的反应，也为临床治疗提供更好的支持。
（4）本发明采用严密的设计和评价体系，初期采用高通量测序技术对血浆外泌体进行直接测序，并通过qRT-PCR 对大量多种来源样本进行了多阶段验证，采用了两种不同分析方法(绝对定量和相对定量) 进行验证；保证了血浆外泌体tsRNAs 生物标志物和诊断试剂盒的应用，也为其他疾病生物标志物的研制提供方法和策略上的借鉴。
附图说明
图1（a）为本发明实施例中肝癌患者的血浆外泌体的透射电镜图；
图1（b）为本发明实施例中肝癌患者的血浆外泌体的Nanosight图；
图1（c）为本发明实施例中肝癌患者的血浆外泌体的Western Blot图。
图2（a）为本发明肝癌患者组相对健康组血浆外泌体中tsRNAs表达谱；
图2（b）为本发明实施例中肝癌患者与健康对照组血浆中表达差异最显著的9种tsRNAs的测序聚类热图。
图3 为本发明实施例中采用QRT-PCR法检测肝癌患者血液中5种tsRNAs的表达情况。
图4 为本发明实施例中采用QRT-PCR法检测肝癌患者组织中5种tsRNAs的表达情况。
图5 为本发明实施例中5种tsRNAs单独使用与CA19-9、CEA分别进行肝癌诊断的ROC图。
图6 为本发明实施例中5种tsRNAs组合使用、与CA19-9、CEA分别进行肝癌诊断的ROC图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例
本发明首先分离了肝癌病人及病人年龄、性别等信息匹配的健康对照的血浆外泌体样本，提取RNA进行小RNA高通量测序分析，经过初步筛选后通过大样本进行验证，进而筛选出一组与肝癌高度相关的且具有较高敏感性和特异性的tsRNAs，并基于此研发出可应用于肝癌临床诊断的试剂盒，为肝癌的筛查和早期诊断提供基础。
具体的技术方案包括：
(1)以标准操作程序(SOP) 采集符合标准的血样，系统收集完整的临床病例信息资料。
(2) 血浆外泌体tsRNAs差异表达谱筛选分析：筛选肝癌患者、与肝癌患者年龄性别相匹配的健康人对照，分离血浆外泌体，通过测序分析血浆外泌体tsRNAs表达谱，筛选出差异表达的tsRNAs并通过大样本进行多阶段验证。
(3) 对前面筛选到的差异表达的血浆外泌体tsRNAs进行定量分析，明确与肝癌发病相关的血浆外泌体tsRNAs。
(4) 基于以上筛选到的血浆tsRNAs，研发诊断试剂盒。
本发明按照SOP收集符合标准的血样，收集完整的病理学资料(包括年龄、性别、病理类型、WHO分级、TMN分期等)，接着采用小RNA高通量测序、Real-time PCR等方法进行检测。
具体来说包括以下几个部分：
（1）收集病人样本：①经影像学诊断、病理学确认的肝癌病例；②所有样本为术前，未经放化疗和新辅助治疗的；③健康对照为与病人年龄性别匹配的正常人。本研究共采用100例符合标准的肝癌病人血浆样本进行研究。
（2）使用Total Exosome Isolation Kit（from plasma）（Invitrogen ThermosFisher）试剂盒分离血浆样本中的外泌体。
（3）外泌体质量检测：通过透射电镜、Nanosight、Western Blot，对血浆外泌体进行鉴定。
（4）使用Trizol（Invitrogen Life Technologies）法提取血浆外泌体总RNA。
（5）RNA质量检测：通过变性琼脂糖凝胶电泳检测28S和18S核糖体RNA条带。
（6）小RNA高通量测序：
①将以上提取的总RNA 进行PAGE 电泳回收；
② tsRNAs存在大量的RNA修饰，会干扰小RNA seq文库的构建。在对总RNA样本进行文库准备之前，先进行以下处理：将链接引物(adaptor prime) 酶联在小RNA 分子的3′与5′端：所有sRNA文库构建和深度测序均由Aksomics(中国上海)完成。测序文库的大小选择用于RNA生物类型测序使用自动凝胶切割器。利用安捷伦生物分析仪2100对这些文库进行了严格的定量分析。根据安捷伦生物分析仪2100构建sRNA文库。Illumina NextSeq仪器标准小RNA测序，测序类型为50bp单读。
③ 进行RT-PCR 反应后进行测序
④ 数据分析与处理
（7）qRT-PCR方法：
① 提取血浆外泌体总RNA，通过RNA 逆转录反应得到cDNA 样品；
② 使用Applied Biosystems 公司的TaqMan tsRNAs茎环引物进行逆转，合成cDNA；
③ 使用Applied Biosystems 公司的TaqMan tsRNAs荧光探针进行PCR反应；
④ 检测比较肝癌患者与健康正常对照血浆外泌体样本中tsRNAs 的表达变化。
（8）制备肝癌tsRNAs诊断试剂盒
① 前期通过小RNA高通量测序检测肝癌患者和正常对照之间的拷贝差异和表达差异的tsRNAs，通过qRT-PCR 技术进一步对肝癌患者和健康对照中差异较显著的血浆外泌体tsRNAs进行检测，作为辅助肝癌诊断的指标。最后筛选到与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs组成诊断标志物(tRF5-Ser-AGA-1-1-030、tRF5-Val-CAC-3-1-019、tRF5-Val-TAC-1-1-029、tRF5-Val-CAC-3-1-030、tRF5-iMet-CAT-1-1-030。) 在此基础上研发肝癌诊断试剂盒，该试剂盒包括5种tsRNAs的探针，及AMV逆转录酶、Taq 酶、MgCl2，DEPC 水和dNTP 等试剂。
（9）数据分析
所有统计检验均使用GraphPad Prism软件7(圣地亚哥，CA)进行。数据以平均值±SEMs表示。P<0.05为差异有统计学意义。组间样本的正态性和等方差分别用Shapiro-Wilk检验和Brown-Forsythe检验进行评估。当样本组间达到正态性和方差相等时，采用单因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)、双因素方差分析(随后采用Bonferroni多重比较检验)或t检验。
以下是本发明进一步的说明：
首先，对提取的肝癌患者的血浆外泌体进行鉴定，通过透射电镜观察外泌体形态，如图1（a）所示；Nanosight对外泌体进行粒径分析，如图1（b）所示；Western Blot检测外泌体表明标志蛋白，如图1（c）所示；可以看出提取出的外泌体形态、大小、生化指标均符合测试研究标准。
在探索阶段，收集肝癌患者血浆外泌体和健康对照血浆外泌体，运用小RNA高通量测序，通过筛选发现主要显著变化的非编码小RNA是tsRNAs。相比于健康组血浆外泌体，肝癌患者血浆外泌体中存在186种上调，下调174种tsRNAs，如图2（a）所示。
根据测序结果，发明人选择了在肝癌患者血浆外泌体样本中发生显著变化（变化倍数>10），并且表达显著升高的tsRNAs（升高倍数>10）进行分析，考虑长度等限制因素，综合得到共9种符合要求，这 9种tsRNAs的聚类热图如图2（b）所示。
对筛选出的9种tsRNAs运用Applied Biosystems公司定制合成相应的TaqMan探针进行检测，包括：tRF5-Ser-AGA-1-1-030、tRF3-Val-AAC-1-1-030、tRF3-Ile-AAT-1-1-030、tRF5-Val-CAC-3-1-019、tRF5-Val-TAC-1-1-029、tRF5-Val-CAC-3-1-030、tRF5-Ala-CGC-3-1-027、tRF5-Gly-CCC-2-1-030、tRF5-iMet-CAT-1-1-030。
分别采用两种分析方法对以上9种tsRNAs进行检测，基于以下两种方法，对有统计学显著差异的tsRNAs在另外100例肝癌病例和100例对照的血浆样本中进行进一步一一验证，进而观察本研究结果的稳定程度。
(1) 绝对定量分析:合成相应的tsRNAs标准品，制作标准曲线，分别提取100uL血浆样本中的外泌体RNA，通过QRT-PCR检测，得到样本CT 值，通过标曲计算得到绝对浓度。
(2) 相对定量分析：在每一个血浆样本（100uL）提取时加入植物来源的MIR2911作为外参，tsRNAs检测的表达水平以2-ΔCt表示，其中ΔCt ＝ CT 样本-CT 外参，计算相对表达量。
绝对定量法和相对定量分析方法结果显示，同时满足上述两种筛选条件的tsRNAs包括五种： tRF5-Ser-AGA-1-1-030，序列如SEQ ID No.1所示；tRF5-Val-CAC-3-1-019，序列如SEQ ID No.2所示；tRF5-Val-TAC-1-1-029，序列如SEQ ID No.3所示；tRF5-Val-CAC-3-1-030，序列如SEQ ID No.4所示；tRF5-iMet-CAT-1-1-030，序列如SEQ ID No.5所示，这5种tsRNAs在肝癌病例组和健康对照组中的表达存在显著差异，这5种标志物的序列如表1所示。
表1：5种tsRNAs标志物
AccID 标志物序列
SEQ ID No.1 GUAGUCGUGGCCGAGUGGUUAAGGCGAUGG
SEQ ID No.2 GUUUCCGUAGUGUAGCGGU
SEQ ID No.3 GGUUCCAUAGUGUAGUGGUUAUCACGUCU
SEQ ID No.4 GUUUCCGUAGUGUAGCGGUUAUCACAUUCG
SEQ ID No.5 AGCAGAGUGGCGCAGCGGAAGCGUGCUGGG
根据以上结果，接着在另外32例健康对照和32例肝癌患者血浆中对上述5种tsRNAs进行进一步检测验证，结果显示，tRF5-Ser-AGA-1-1-030、tRF5-Val-CAC-3-1-019、tRF5-Val-TAC-1-1-029、tRF5-Val-CAC-3-1-030、tRF5-iMet-CAT-1-1-030在肝癌样本中均显著升高，结果如图3所示。
根据以上结果，接着在20例肝癌患者组织的肿瘤区域及对应的癌旁区域中提取RNA，对上述5种tsRNAs进行进一步检测验证，结果显示，tRF5-Ser-AGA-1-1-030、tRF5-Val-CAC-3-1-019、tRF5-Val-TAC-1-1-029、tRF5-Val-CAC-3-1-030、tRF5-iMet-CAT-1-1-030在肝癌组织样本中均显著升高，结果如图4所示。
进一步在另外100名肝癌患者和110名健康对照中分析上述5种tsRNAs用于肝癌诊断的效果，和与现有的肝癌诊断标志物CEA和CA19-9进行诊断的对比分析，结果如图5所示，ROC曲线（Receiver Operating Characteristic Curve, 受试者工作特征曲线）分析发现tRF5-Ser-AGA-1-1-030、tRF5-Val-CAC-3-1-019、tRF5-Val-TAC-1-1-029、tRF5-Val-CAC-3-1-030、tRF5-iMet-CAT-1-1-030相较于对现有技术中的CEA和CA19-9诊断具有更高的敏感性和特异性，这5种tsRNAs标志物可用于肝癌的诊断筛查和预后监测。
进一步在上述100名肝癌患者和110名健康对照中分析上述5种tsRNAs标志物组合使用对于肝癌诊断的效果，结果如图6所示，结果显示上述5种tsRNAs标志物组合使用对肝癌发病诊断的AUC（Area Under the ROC Curve, ROC曲线下面积）与这5种tsRNAs标志物单独使用相比，有明显增加，具有更高的敏感性和特异性，说明这5种tsRNAs标志物组合使用效果更好。

Claims (6)

1.一组与肝癌相关的血浆外泌体tsRNAs标志物，其特征在于，所述的血浆外泌体tsRNAs标志物为以下序列中的任意一种或组合：
tRF5-Ser-AGA-1-1-030：序列如SEQ ID No.1所示;
tRF5-Val-CAC-3-1-019：序列如SEQ ID No.2所示;
tRF5-Val-TAC-1-1-029：序列如SEQ ID No.3所示;
tRF5-Val-CAC-3-1-030：序列如SEQ ID No.4所示;
tRF5-iMet-CAT-1-1-030：序列如SEQ ID No.5所示。
2.检测权利要求1中tsRNAs标志物的产品的应用，包括下列任一应用：
（1）在用于制备早期筛查或辅助筛查肝癌产品的应用；
（2）在用于制备早期诊断或辅助诊断肝癌产品的应用；
（3）在用于制备评估肝癌患者患病风险的产品的应用；
（4）在用于制备评估肝癌患者预后效果的产品的应用；
（5）在用于制备预测治疗肝癌药物效果的产品的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的产品为试剂、试剂盒。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括用于检测tsRNAs表达水平的试剂，所述的tsRNAs包括tRF5-Ser-AGA-1-1-030、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-019、和/或tRF5-Val-TAC-1-1-029、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-030、和/或tRF5-iMet-CAT-1-1-030。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括用于检测生物标志物表达水平的探针，所述的tsRNAs包括tRF5-Ser-AGA-1-1-030、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-019、和/或tRF5-Val-TAC-1-1-029、和/或tRF5-Val-CAC-3-1-030、和/或tRF5-iMet-CAT-1-1-030。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒包括dNTP/AMV逆转录酶、缓冲液、MgCl2、DEPC水和Taq酶。
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