CN102782151A - 作为用于前列腺癌诊断和分期的非侵入性标志物的循环miRNA - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的方法，所述方法包括(a)测定在来自所述患者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者前体分子的量和(b)将如此测定的量与参考量比较。此外，本发明涉及用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的方法，以及用于诊断前列腺癌的方法。本发明还涉及适合于实施本发明方法的试剂盒和装置。

Description

作为用于前列腺癌诊断和分期的非侵入性标志物的循环miRNA
本发明涉及用于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的方法，所述方法包括(a)在来自所述受试者的样品中测定选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者前体分子的量和(b)将如此测定的量与参考量比较。此外，本发明涉及用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的方法，以及用于诊断前列腺癌的方法。本发明还涉及适合于实施本发明方法的试剂盒和装置。 
在西方男性中，前列腺癌是最经常被诊断的恶性肿瘤，并占癌症相关死亡原因的第二位。因为癌症的发展和进展由分子改变驱动，分子特征的分析可以最终允许更好的预测个体癌症的行为。 
前列腺癌具有较高的发生率，但肿瘤侵占性和长期结果是可变的。用于治疗决定的高和低风险前列腺肿瘤的分离在临床情况中仍是未解决的问题。前列腺癌的常见分类基于临床和病理学参数，如术前前列腺特异性抗原(PSA)、直肠指检(DRE)、经直肠的超声检测，以及前列腺活组织检查的组织学分级(Gleason得分)。然而，所有这些参数在其预测能力方面都具有局限。 
对于PCA的检测，前列腺特异性抗原(PSA)的广泛使用导致越来越多的男性诊断为具有器官局限性、低Gleason-得分PCA，所述PCA是可能治愈的。然而，PSA测试的高灵敏性伴随着低特异性，造成许多患者经历不必要的活组织检查。具有正常前列腺病理的男性，在血液中通常具有低于4ng/ml的PSA水平。4ng/ml和10ng/ml之间(‘灰色区’)的PSA水平具有25％的几率具有前列腺癌。结果，在75％的病例中，在该灰色区内具有异常DRE和PSA的男性为阴性，或者似乎不需要进行活组织检查。 
PSA是前列腺体积的指示物，并因此显示出在辅助预测前列腺癌中的 局限性。因此，进行前列腺组织活检以确认诊断并评价肿瘤侵占性。使用Gleason得分(GS)系统根据其细胞分化状态分级肿瘤组织。目前，对于临床风险分层，GS是最可靠的预测标志物。然而，前列腺癌是多病灶疾病。因此，常常在进行活组织检查期间漏掉了肿瘤，并且不知道活组织检测内的肿瘤病灶是否是驱动癌症进展的肿瘤病灶。因此，不得不在根治性前列腺切除术后升级大部分肿瘤。这种升级可能影响治疗决定，因为具有高GS的肿瘤与术后生物化学复发和更差的存活相关。 
各个患者的治疗决定与该个体中存在的前列腺癌的阶段联系。美国泌尿科学协会(American Urological Association)(AUA)研发了前列腺癌扩散的常见分类。AUA系统将前列腺肿瘤分成4个阶段，A至D。将阶段A(前列腺内的微型癌)进一步细分成阶段A1和A2。亚阶段A1是局限于前列腺内一个位点的较好分化的癌。治疗通常是观察、根治性前列腺切除术或者放疗。亚阶段A2是在前列腺内多个位点处的中等至低分化癌。治疗是根治性前列腺切除术或者放疗。还将阶段B(前列腺内可触知的肿块)进一步细分成亚阶段B1和B2。在亚阶段B1中，癌症在前列腺的一叶中形成了小结节。在亚阶段B2中，癌症或者在前列腺的两叶中都形成或发生了大的或者多个结节。亚阶段B1和B2的治疗是根治性前列腺切除术或者放疗。阶段C是涉及大部分或者全部前列腺的较大癌症团块，并且还可以进一步细分成两个亚阶段。在亚阶段C1中，形成连续团块的癌症可能已经延伸至前列腺以外。在亚阶段C2中，癌症形成的连续团块侵入了周围组织。对这两种亚阶段的治疗都是放疗，使用用或不用针对癌症的药物。第四阶段，阶段D是转移性癌症，并也可以细分成两个亚阶段。在亚阶段D1中，癌症在骨盆的淋巴结中存在。在亚阶段D2中，癌症涉及淋巴结以外的组织。对这两种亚阶段的治疗是针对癌症以及疼痛的全身性药物。 
然而，当前的前列腺癌分期方法是有局限的。多至50％最初分期为A2、B或C的前列腺癌实际上是转移性的阶段D。转移瘤的发现是意义重大的，因为具有转移性癌症的患者具有较差的预后，并需要与那些具有局限性癌症的患者显著不同的疗法。具有局限性和转移性前列腺癌的患者的 五年存活率分别为93％和29％。 
miRNA是短RNA分子(19-26个核苷酸)，提示其为生物学功能的重要调节物(Bushati N，Cohen SM。microRNA functions。Annu Rev Cell Dev Biol 2007；23：175-205)。miRNA表达的改变可以影响重要的细胞过程，如细胞周期、增殖或凋亡，因而提供了与癌症发展和进展的直接联系(Calin GA，Croce CM。MicroRNA signatures in human cancer.Nat Rev Cancer2006；6(11)：857-66；Rosenfeld N，Aharonov R，Meiri E，等人。MicroRNAs accurately identifycancer tissue origin。Nat Biotechnol 2008；26(4)：462-9)。 
最近显示，可以在血清中提取并测量稳定的游离miRNA，并且其作为潜在的生物标志物的来源。Lawrie等人首先表明，在患B细胞淋巴瘤的患者的体液中存在miRNA(Lawrie CH，Gal S，Dunlop HM，等人。Detection of elevated levels of tumour-associated microRNAs in serum of patients with diffuse large B-cell lymphoma。Br J Haematol 2008；141(5)：672-5)。 
Mitchell等人用小鼠模型阐明，即使当起源于上皮癌类型时，肿瘤来源的miRNA也会进入循环。在该研究中，他们还显示，当与健康对照比较时，循环miRNA-141在转移性前列腺癌中是升高的(Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，等人。Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection。Proc Natl Acad Sci USA 2008；105(30)：10513-89)。 
在多种其它癌症疾病中，循环miRNA还显示出在肿瘤患者和健康对照之间以不同的水平存在(Tanaka M，Oikawa K，Takanashi M，等人，Down-regulation of miR-92 in human plasma is a novel marker for acute leukemia patients。PLoS ONE 2009；4(5)：e5532；Chen X，Ba Y，Ma L，等人，Characterization of microRNAs in serum：a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases。Cell Res 2008；18(10)：997-1006；Taylor DD，Gercel-Taylor C。MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer。Gynecol Oncol2008；110(1)：13-21)。然而，在上皮癌中的不同阶段之间还没有发现以不 同水平存在的无细胞miRNA(Resnick KE，Alder H，Hagan JP，Richardson DL，Croce CM，Cohn DE。The detection of differentially expressed microRNAs from the serum of ovarian cancer patients using a novel real-time PCR platform。Gynecol Oncol 2008；Ng EK，Chong WW，Jin H，等人，Differential expression of microRNAs in plasma of colorectal cancer patients：A potential marker for colorectal cancer screening。Gut 2009)。 
因此，存在极大的需求来鉴定反映肿瘤进展的新分子标记物，以增强前列腺癌的临床治疗。具体而言，需要允许容易且可靠分期前列腺癌的工具和方法，以及允许诊断前列腺癌的工具和方法，以及鉴定对目的在于治疗前列腺癌的疗法敏感的受试者。此类可靠的工具和方法还未有描述。 
本发明的技术困难可见为提供前述需求的工具和方法。通过权利要求和下文中所述的实施方案解决了技术问题。 
因此，本发明涉及患前列腺癌的受试者中前列腺癌分期的方法，包括 
a)测定来自所述受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量，或者所述至少一种miRNA的前体分子的量， 
b)将如在步骤a)中测定的所述至少一种miRNA或者所述前体分子的量与参考量(或多个参考量)比较，并 
c)基于在步骤b)中获得的信息对所述受试者中前列腺癌分期。 
本发明方法优选地是体外方法。此外，除上文明确描述的那些步骤外，其还可以包含另外的步骤。例如，另外的步骤可以涉及样品预处理或者评价通过该方法获得的结果。本发明方法优选地用于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌。然而，本发明方法还可以用于监测、确证和亚分类所述受试者。该方法可以手工实施或者通过自动化辅助实施。优选地，步骤(a)和(b)可以全部或者部分通过自动化辅助，例如，通过机器人和传感器设备用于步骤(a)中的测定，或者在步骤(b)中应用计算机实现的比较。 
如本领域技术人员所理解，前述分期通常并非意图对100％待分析的受试者都是正确的。然而，该术语要求该评估对于待分析受试者的统计学 显著部分是有效的。可以使用多种熟知的统计学评价工具，例如，置信区间测定、p值测定、斯氏t检验、Mann-Whitney检验等等，在不再另外费力的情况下，通过本领域技术人员测定该部分是否统计学显著。详细说明见于Dowdy和Wearden，Statistics for Research，John Wiley & Sons，New York 1983。优选的置信区间为至少90％、至少95％、至少97％、至少98％或者至少99％。p值优选地为0.1、0.05、0.01、0.005或者0.001。优选地，本发明所考虑的概率允许该分期对于给定群组的受试者的至少60％、至少70％、至少80％或者至少90％是正确的。 
如本文中所用，术语“受试者”指雄性动物，优选地雄性哺乳动物和，更优选地，男性人类。然而，设想根据本发明的前述方法，其涉及的受试者应当患前列腺癌。 
术语“前列腺癌”在本领域是已知的。如本文中所用，该术语优选地涉及前列腺的任意增殖性病变或者异常。因此，该术语优选地包括恶变前的病变、恶性病变以及实体肿瘤和转移性疾病(局限性转移和更广泛的转移二者)。 
如何评估受试者是否患前列腺癌是本领域熟知的。具有PCA的升高风险的男性的临床决定制定过程基于临床准则的证据确定。(Heidenreich A，Aus G，Bolla M，等人，EAU guidelines on prostate cancer。Eur Urol 2008；53：68-80)。 
如本文中所用，术语“分期前列腺癌”优选地指区分前列腺癌的多种阶段。前列腺肿瘤阶段的一般分类是本领域技术人员熟知的。简言之，最通常使用的分期方法是肿瘤，结节，转移(Tumour，Nodes，Metastasis)(TNM)系统，其考虑了局部肿瘤生长的4个阶段，从T1(偶发的)至T4(浸润邻近器官)。每一阶段都描述了肿瘤病理学发展的状态。T1表示“偶发”状态，其中肿瘤经尿道切除后由于偶然性检测到或者PSA测试后通过活组织检查检测到。在该阶段，通过触诊(DRE)或者超声不能检测到肿瘤，但可以通过本发明方法诊断。T4表示晚期疾病，其中肿瘤已经浸润了邻近器官。淋巴结阶段(N0-N1)和转移阶段(M0-M1C)分别反映疾病至淋巴结和远端位 点(转移)的临床扩散。分级系统可以评估肿瘤中细胞间变(大小、形态和染色特性的变化)和分化(细胞如何高度分化)的程度。Gleason分级系统基于肿瘤细胞排列成可识别的腺状结构的程度以及细胞分化的水平。Gleason系统鉴定了5种以上水平的增加的疾病侵占性，级别1是侵占性最低的癌和级别5以上是侵占性最高的癌。 
如本文中所用，术语“分期前列腺癌”，优选地指区分前列腺癌的轻微和严重形式。在本发明的上下文中，前列腺癌的轻微形式优选地是原发性前列腺癌。前列腺癌的严重形式优选地是转移性前列腺癌。因此，本发明的前述方法优选地允许区分原发性前列腺癌和转移性前列腺癌。 
在本发明方法的上下文中，术语“原发性前列腺癌”优选地涉及局限性前列腺癌(例如pT2或更低)。 
在本发明方法的上下文中，术语“转移性前列腺癌”优选地涉及具有转移性肿瘤，优选地骨转移肿瘤的前列腺癌(例如前列腺癌pN+、M+、全身性阶段)。 
在本发明方法的优选实施方案中，区分了高风险、中等风险和低风险。 
本发明方法的上下文中，处于“低风险”的受试者指患具有Gleason得分为6或者低于6的前列腺癌的受试者。 
本发明方法的上下文中，处于“中等风险”的受试者指患具有Gleason得分为7的前列腺癌的受试者。 
本发明方法的上下文中，处于“高风险”的受试者指患具有Gleason得分为8或者大于8的前列腺癌的受试者。 
术语“样品”指体液样品、分离的细胞样品或者来自组织或器官的样品。体液样品可以通过熟知的技术获得，并优选地包括血液、血浆、血清或者尿样品，更优选地，血液、血浆或血清样品。组织或器官样品可以通过例如，活组织检查获自任一组织或器官。优选的组织和器官样品获自前列腺，其可以通过熟知的方法获得，优选地通过针吸活组织检查。分离的细胞可以通过分离技术例如离心或细胞分选，获自体液或组织或者器官。在本发明方法的上下文中，优选的细胞是前列腺细胞。在本发明的上下文 中，最优选的样品是血液、血清或者血浆样品。 
在本发明方法的优选实施方案中，通过熟知的方法进一步处理样品，以进一步富集和/或纯化如本文中所述的miRNA分子或其前体分子。进一步处理取决于标志物的性质，即待测定的标志物是miRNA还是前体分子。优选地，如果标志物是miRNA，那么(获得样品后)通过本领域技术人员熟知的方法富集和/或纯化小RNA(例如18至24nt长度)。优选地，如果生物标志物是前体分子，(获得样品后)可以通过本领域熟知的方法富集和/或纯化所述总RNA。 
对于从样品中富集miRNA分子，可以在第一步从样品中纯化总RNA。在第二步中，可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总RNA。在第三步中，可以从聚丙烯酰胺凝胶中纯化小RNA部分(例如18-24个核苷酸长度)。在本发明的上下文中，还考虑从样品中分离miRNA。具体而言，可以将基于苯酚/胍的裂解和基于硅胶膜的纯化组合用于从血清样品中分离无细胞的RNA。 
此外，可以将多种miRNA模拟物(例如，来自线虫(c.elegans)的cel-miRNA-39、cel-miRNA-54、cel-miRNA-238，参见实施例)加入到样品中作为纯化效率的spike-in对照(Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，等人，Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection。Proc Natl Acad Sci USA 2008；105(30)：10513-89)。 
还考虑在获得RNA样品后实施反转录(特别地通过定量RT-PCR，以定量RNA，参见下文)。 
微RNA(miRNA)是大约21-23个核苷酸长度的单链RNA分子，其调节基因表达。通常还将所述miRNA称为成熟miRNA。miRNA是非编码RNA并，因此并不翻译成蛋白质。它们来源于初级转录物(pri-miRNA)，所述初级转录物在第一步中被加工成短茎-环(发夹)结构(pre-miRNA)，并然后成为功能性miRNA。成熟miRNA分子与对应的靶mRNA部分互补，并且该结合导致翻译抑制或者mRNA降解。 
在本发明的上下文中，应当在来自受试者的样品中测定选自 miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊或者它们的前体分子的至少一种miRNA的量。 
前述miRNA是单链RNA分子。miRNA-375的序列显示于SEQ ID NO：1中，miRNA-141的序列显示于SEQ ID NO：2中，miRNA-200b的序列显示于SEQ ID NO：3中，miRNA-516a-3p的序列显示于SEQ ID NO：4中，miRNA9＊显示于SEQ ID NO：5中。 
如本文中所用，短语“至少一种”优选地指“一种miRNA”或者“一种以上”，特别地，两种、三种、四种或者五种miRNA或者它们的前体。因此，考虑通过测定多种miRNA或者它们的前体的量分期前列腺癌。 
前述miRNA的前体分子优选地是对应的pri-miRNA和，更优选地对应的pre-miRNA。miRNA-375的pre-miRNA前体的序列显示于SEQ ID NO：6中，miRNA-141的pre-miRNA前体的序列显示于SEQ ID NO：7中，miRNA-200b的pre-miRNA前体的序列显示于SEQ ID NO：8中，和miRNA-516a-3p的pre-miRNA前体的序列显示于SEQ ID NO：9中，和miRNA9＊的pre-miRNA前体的序列显示于SEQ ID NO：10中。 
还考虑测定受试者的样品中任一多种前述SEQ ID No的量。优选地，此类变体具有与SEQ ID NO：1至10的任意一种至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或者至少99％同一性的核酸序列。优选地通过Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman 算法测定两个或者多个核酸序列之间的同一性程度(百分比，％)。为了实施序列比对，使用为GCG软件包(Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 5371，1991年版)的一部分的程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins 1989，CABIOS，5：151-153)或者程序Gap和BestFit(Needleman 1970，J.Mol.Biol.48；443-453和Smith 1981，Adv.Appl.Math.2；482-489)。优选地，使用程序GAP在整个序列区域用以下设定：空位权重(Gap Weight)：50，长度权重(Length Weight)：3，平均匹配(Average Match)：10.000和平均错配(Average Mismatch)：0.000测定上文所列举的以百分比(％)表示的序列同一性值， 除非另外说明，所述设定应当始终用作为序列比对的标准设定。 
应当理解，在本发明的上下文中，还可以通过测定一部分pre-miRNA的量来实施诊断/区分。例如，可以通过测定来自受试者的样品中，对应的miRNA＊分子的miRNA前体分子的环，即加工自相对于成熟miRNA的发夹臂的小RNA的量来实施诊断。 
测定miRNA分子或者其前体分子的量可以通过任一认为合适的方法进行。在实施例中描述了用于测定所述量的优选方法。Mitchell等人也描述了优选的方法，所述文献就其全部公开内容而言引入本文作为参考(Mitchell PS，Parkin RK，Kroh EM，等人，Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection。Proc Natl Acad Sci USA2008；105(30)：10513-89)。 
可以通过使用特异性检测待分析的miRNA或前体分子或者所述miRNA或所述前体的扩增产物的探针寡核苷酸，测定miRNA或者其前体分子的量(对于术语“扩增产物”的解释，参见下文)。 
通过特异性探针寡聚核苷酸来测定miRNA或者其前体分子的量，优选地包括用与转录物或者其扩增产物特异结合的探针寡核苷酸与miRNA或者其前体分子或者其扩增产物杂交。在本发明的上下文中，优选地，探针寡核苷酸是对所述miRNA或其前体分子特异的单链核酸分子，并优选地包含与靶特异性杂交的一段核苷酸，并因此与靶多核苷酸互补。所述一段核苷酸与靶多核苷酸包含的序列区优选地具有85％、90％、95％、99％或者更优选地具有100％的同一性。如果靶分子是miRNA，那么探针寡核苷酸与所述miRNA优选地具有85％、90％、95％、99％或者更优选地具有100％的同一性。优选地，通过Needleman和Wunsch或者Smith和Waterman的算法确定两个或多个核酸序列之间的同一性程度(百分比，％)。为了实施序列比对，使用为GCG软件包(Genetics Computer Group，575Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 5371，1991年版)的一部分的程序PileUp(J.Mol.Evolution.，25，351-360，1987，Higgins 1989，CABIOS，5：151-153)或者程序Gap和BestFit(Needleman 1970，J.Mol.Biol. 48；443-453和Smith 1981，Adv.Appl.Math.2；482-489)。优选地，使用程序GAP在整个序列区域用以下设定：空位权重(Gap Weight)：50，长度权重(Length Weight)：3，平均匹配(Average Match)：10.000和平均错配(Average Mismatch)：0.000确定上文所列举的以百分比(％)表示的序列同一性值，除非另外说明，所述设定应当始终用作为序列比对的标准设定。 
探针寡核苷酸可以是经标记的或者含有其他修饰，包括允许测定miRNA或者其前体分子(或者其扩增产物)的量的酶。标记可以通过本领域熟知的多种技术进行，并且取决于所使用的标记。优选的标记描述于本说明书的其他地方。 
在本发明方法的优选实施方案中，miRNA(或者其前体分子)的量的测定包括步骤：扩增样品所包含的miRNA(或者其前体分子)和测定因此产生的扩增产物的量。通过测定所述扩增产物的量，可以估计miRNA分子(或者其前体分子)的量。优选地，通过使用如上文中所述的探针寡核苷酸测定扩增产物的量。 
如果应当测定样品中miRNA的扩增产物的量，那么可以如由Mitchell等人所述扩增miRNA(同前文献，参见例如文件Mitchell的图1a)。在3’和5’端连接miRNA到单链寡核苷酸，该单链寡核苷酸含有用于反转录和PCR的通用序列。实施连接产物的反转录。反转录后，通过PCR扩增得到的产物。 
在本发明方法更优选的实施方案中，所述PCR是实时PCR(RT-PCR)。因此，优选地通过定量实时PCR测定miRNA的量。 
术语“实时PCR”是本领域已知的。当实施实时PCR时，将在PCR反应期间监测的从PCR测定中发出的信号作为每一PCR扩增循环期间扩增产物的量的指标，与常规PCR方法相反，其中在常规PCR方法中在PCR反应的终点监测扩增产物。实时PCR通常基于荧光报道分子的检测和定量。反应中，信号与PCR产物的量成比例增加。 
当实施实时PCR时，可以通过将结果与由连续稀释(例如未稀释的、1∶4、1∶16、1∶64、1∶128)所述标志物的预定量的实时PCR产生的标准曲线 比较，来测定miRNA或者其前体分子的量。此外，为了准确测定所述量，可以将所测量的量除以归一化RNA(或者DNA)的量，其允许归一化不同样品之间RNA量的可能变化。归一化RNA可以优选地是加入到样品中的RNA(或者DNA)(spike-in，参见实施例)。 
此外，考虑通过原位杂交，优选地在前列腺组织样品中测定本发明标志物的量。 
如本文中所用，术语“量”包括miRNA或者前体分子(或者其扩增产物)的绝对量、相对量或者其浓度，以及与其相关的任意值或参数。此类值或者参数包括通过直接测量获得的全部特定物理或化学性质的强度信号值，例如强度值。此外，还包括通过本说明书中其他地方说明的间接测量获得的全部值或者参数，例如，从生物读出系统中测定的表达水平。应当理解，与前述量或参数相关的值还可以通过全部的标准数学运算获得。如果实施实时PCR，那么特别优选地是测定Ct值(Ct：循环阈值)，其指出样品中待分析的标志物的相对量。如何测定Ct值是本领域熟知的。通常，样品中标志物的量越大，Ct值越低。 
如本文中所用，术语“比较”包括将待分析的样品中包含的miRNA、其前体分子(或者所述miRNA或者前体分子的扩增产物)的量与在本说明书中其他地方所述的合适参考源的量比较。应当理解，如本文中所用，比较指对应的参数或者值的比较，例如，将绝对量与绝对参考量比较，而将浓度与参考浓度比较，或者将获自测试样品的强度信号与参考样品的相同类型强度信号比较。可以通过手工或者计算机辅助实施本发明方法的步骤(b)中提及的比较。对于计算机辅助的比较，可以通过计算机程序，将测定量的值与存储在数据库中的对应的合适参考的值比较。计算机程序可以进一步评价比较的结果，即以合适的输出格式自动提供想要的评估。基于步骤a)中测定的量与参考量的比较，可以在来自患前列腺癌的受试者的样品中分期前列腺癌。 
术语“参考量”指允许在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的量。参考量可以来源于患不同阶段的前列腺癌的受试者的样品。 
例如，如果要区分原发性前列腺癌和转移性前列腺癌，那么参考量可以来源于(i)患原发性前列腺癌的受试者和/或(ii)患转移性前列腺癌的受试者的样品。 
例如，如果要区分低风险、中等风险和高风险，那么参考量可以来源于(i)处于低风险的受试者，(ii)处于中等风险的受试者，和/或(iii)处于高风险的受试者的样品。 
参考值还可以是获自一组此类样品的平均值或均值。优选地，所述参考值来自血液、血浆或血清样品。如果参考值获自活组织检查的组织样品，那么所述样品应当包含前列腺癌组织或者基本上由前列腺癌组织组成。 
可以通过应用本发明的方法获得参考结果。参考值还可以是获自一组前述样品的平均值或者中值。此外，还优选地，参考值可以是计算的参考值，最优选地，处于前列腺癌的多种阶段(优选地前述阶段)的个体的代表性群体，优选地，美国、亚洲或欧洲群体的本发明方法上下文中所述标志物的相对量或绝对量的平均值或中值。可以如在本文中其他地方所述，测定所述群体的个体的所述标志物的绝对量或相对量。如何计算合适的参考值，优选地平均值或中值是本领域熟知的。上文提及的受试者的群体应当包含多个受试者，优选地，至少5、10、50、100、1,000或10,000个受试者。应当理解，通过本发明方法诊断的受试者与所述多个受试者的受试者是同一物种。 
更优选地，“参考值”可以这样获得，通过测定一组参考受试者，例如一组患原发前列腺癌的受试者、一组患转移性前列腺癌的受试者、包含待研究的受试者的群体的至少一种特征性特性的值；并通过合适的统计学方法，包括那些在本文中其他地方提及的统计学方法，例如中值、平均值、分位数、PLS-DA、逻辑回归方法、随机森林分类(random forest classification)或者其他给出阈值的方法计算参考值。阈值应当考虑诊断和预后测试的灵敏性和特异性的希望的临床设定。 
可应用于个体受试者的参考量可以依据多种生理学参数，例如年龄或者亚群，以及用于测定本文中所提及的标志物的方法而改变。通过本发明 方法，可以从待分析的参考样品与(即同时地或者顺次地)测试样品一起测定合适的参考量。 
可以建立本文中提及的诊断标志物的参考量，并且可以将来自受试者的样品中的标志物的量简单地与参考量比较。诊断和/或预后测试的灵敏性和特异性不仅仅取决于测试的分析“质量”-它们还取决于对什么组成异常结果的定义。实际上，通常通过将变量的值对其在“正常”和“疾病”群体中的相对频率作图，来计算接受者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve)或者“ROC”曲线。对于任一具体的标志物，处于多种阶段前列腺癌的受试者的标志物水平的分布可以重叠。在该条件下，测试不能在100％准确的情况下绝对区分，并且重叠的面积表示测试不能区分正常和疾病。选定阈值，高于所述阈值(或者低于所述阈值，取决于标志物如何随疾病改变)认为该测试是异常的，并且低于所述阈值，认为该测试是正常的。ROC曲线下的面积是所理解的测量将允许正确鉴定疾病的概率的度量。甚至当测试结果并不需要给出准确数值时，也可以使用ROC曲线。只要可以排列结果，就可以创建ROC曲线。 
优选地，如果要区分原发性前列腺癌和转移性前列腺癌，并且如果参考结果获自(i)患原发性前列腺癌的受试者和(ii)患转移性前列腺癌的受试者，可以基于获自测试样品的测试结果与前述参考结果之间的同一性或相似性的程度，即基于至少一种miRNA标志物或者其前体分子的相同或相似的定性或定量组成，实施前列腺癌的分期。在定量测定的情况下，如果特征性特性的值和强度值是相同的，那么测试样品的结果和参考结果是相同的。如果特征性特性的值是相同的，但强度值是不同的，那么所述结果是类似的。优选地，该差异是不显著的，并且其特征在于强度的值至少在参考值的1％-99％、5％-95％、10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-60％之间的区间内，参考值的50％、60％、70％、80％、90％或者95％。 
优选地，如果要区分低风险、中等风险和高风险，并且参考结果获自(i)处于低风险的受试者，(ii)处于中等风险的受试者和(iii)处于高风险的 受试者，那么应用相同的方法。 
在本发明方法的上下文中，还考虑分期基于获自测试样品的测试结果和前述参考结果之间的差异，即至少一种标志物的定量组成的差异。如果使用上文所述的计算的参考值，那么应用相同的方法。优选地，差异应当是根据本发明的诊断标志物的绝对量或者相对量的增加。优选地，相对量或者绝对量的增加是显著的，即在参考值的45％-55％、40％-60％、30％-70％、20％-80％、10％-90％、5％-95％、1％-99％之间的区间之外。 
此外，还考虑将阈值量用作为参考量。可以将高于阈值量的测试样品中如本文中所提及的标志物的量用于指示前列腺癌的严重形式，其中将低于阈值量的量用于指示前列腺癌的轻微形式。 
有利地，在本发明上下文中实施的研究显示，测定来自所述受试者的血浆样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量，并因此将测定的量与参考量比较，允许在患前列腺癌的受试者中可靠地分期前列腺癌。特别地，进行了筛选研究，以通过在两个临床风险组中监测667个人类miRNA，鉴定在血清中与前列腺肿瘤进展相关的循环miRNA。当与原发性前列腺癌比较时，在来自患转移性前列腺癌的患者的血清中，miRNA-375、miRNA-9＊、miRNA-141、miRNA-200b和miRNA-516a-3p鉴定为高丰度的。 
此外，使用独立患者群组的血清样品，在前瞻性确认研究中分析鉴定的miRNA(miRNA-375、miRNA-9＊、miRNA-141、miRNA-200b和miRNA-516a-3p)(参见实施例)。确认研究证实，选定的循环miRNA与肿瘤进展显著相关。因此，已经显示，在前列腺癌中，循环miRNA与临床病理学终点相关。 
鉴定的miRNA与肿瘤进展相关，特别是miRNA-375，其与Gleason得分、淋巴结状态和pT阶段相关。在本发明的研究中，将循环miRNA-375与术前PSA值比较。显示与较低风险肿瘤比较，miRNA-375在患高风险肿瘤的患者(Gleason得分＞＝8或者具有转移性前列腺癌的患者)的血清中 显示出明显更高的水平。相反，对于Gleason 7和Gleason＞＝8肿瘤以及淋巴结状态之间的PSA水平的比较，没有检测到显著性差异。因此，相比PSA，miRNA-375允许更可靠的前列腺癌分期。 
miRNA-375在低、中等和高风险之间的三个逐组比较中表现出显著的差异。此外，miRNA-375在具有淋巴结阳性状态或者病理学阶段pT3的患者的血清中具有显著更高的丰度。为了评估PSA和miRNA-375对病理学终点的临床预后的影响，应用了ANOVA分析(参见实施例)。总的来说，ANOVA分析显示，miRNA-375是前列腺癌的另外的非侵入性标志物，如果应用，其有助于在临床背景中改进治疗决定。 
本发明方法是特别有利的，因为其可以用较小体积的血液、血清或血浆样品实施。因此，可以避免活组织检查。 
可以将上文给出的说明和定义就实际的情形应用于以下方法(除非另外指明)。 
此外，本发明涉及在患前列腺癌的受试者中诊断前列腺癌的方法，所述方法包括 
a)在来自所述受试者的血液、血清或者血浆样品中，测定选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量， 
b)将如在步骤a)中测定的所述至少一种miRNA或者所述前体分子的量与参考量比较，和 
c)基于步骤b)中获得的信息诊断所述受试者中的前列腺癌。 
在前述方法的上下文中的受试者应当疑似患前列腺癌。此外，还考虑，该受试者可能具有前列腺癌的倾向。 
如本文中所用，怀疑患前列腺癌或者具有其倾向的受试者指优选地，表现出指示前列腺癌的症状或者临床病征或者参数的受试者。然而，该术语还指明显的健康受试者，即并不表现出任一前述症状、临床病征或者参数的受试者。明显健康的受试者可以通过本发明方法研究作为预防性护理的度量或者用于群体筛查目的。 
如在前述方法中所用，术语“参考量”指允许在疑似患前列腺癌的受试者中诊断前列腺癌的量。参考量可以来源于(i)患前列腺癌的受试者或者(ii)来自已知未患前列腺癌的受试者的样品。 
参考值还可以是获自一组此类样品的平均值或者中值。可以应用本发明方法获得参考结果。备选地，但然而也是优选地，参考结果可以获自来自已知未患前列腺癌的受试者或者已知不具有其倾向的受试者的样品，即对于前列腺癌和更优选地，对于其他疾病，特别是癌症疾病而言健康的受试者。同样，如果参考值获自活组织检查组织样品，所述样品应当基本上由明显健康的前列腺组织组成。参考值还可以是获自一组此类样品的平均值或者中值。优选地，如果涉及活组织检查组织样品，参考样品和测试样品可以获自相同的受试者，即来自受前列腺癌明显影响的区域或者来自疑似受前列腺癌影响的区域。此外，参考值还优选地，可以是计算的参考值，更优选地，明显健康或者患前列腺癌的个体的代表性群体的如本文中所提及的标志物的相对论或绝对量的平均值或者中值，其中患前列腺癌的受试者在流行该疾病的给定群体内，优选地，美国、亚洲或者欧洲群体内。可以如本文中其他地方所述测定所述群体的个体的所述标志物的绝对量或相对量。如何计算合适的参考值，优选地，平均值或者中值是本领域熟知的。上文所提及的受试者的群体应当包括多个受试者，优选地，至少5、10、50、100、1,000或者10,000个受试者。应当理解，待通过本发明方法诊断的受试者与所述多个受试者的受试者是同一物种。 
更优选地，“参考值”可以这样获得，通过测定一组参考受试者，即一组已知患前列腺癌的受试者、一组已知未患前列腺癌的受试者、包含待研究的受试者的群体或者一组前列腺癌组织或明显健康的组织的活组织检查样品的至少一种特征性特性的值，并通过合适的统计学方法，包括那些在本文中其他地方所述的方法计算参考值。 
可应用于个体受试者的参考量可以依据多种生理学参数，例如年龄或者亚群，以及用于测定本文中所提及的标志物的方法而改变。通过本发明方法，可以从待分析的参考样品与(即同时地或者顺次地)测试样品一起测 定合适的参考量。 
可以建立本文中提及的诊断标志物的参考量，并且可以将来自受试者的样品中的标志物的量简单地与参考量比较。诊断和/或预后测试的灵敏性和特异性不仅仅取决于测试的分析“质量”-它们还取决于对什么组成异常结果的定义。实际上，通常通过将变量的值对其在“正常”和“疾病”群体中的相对频率作图，来计算接受者操作特征曲线(Receiver Operating Characteristic curve)或者“ROC”曲线(还参见上文)。 
在参考结果获自已知患前列腺癌的受试者或者群组的情况下，可以基于获自测试样品的测试结果与前述参考结果之间的同一性或者类似性的程度，即基于本文中所提及的至少一种标志物的相同或相似定性或定量组成，来诊断所述疾病。在定量测定的情况下，如果特征性特性的值和强度值是相同的，那么测试样品的结果和参考结果是相同的。如果特征性特性的值是相同的，但强度值是不同的，那么所述结果是类似的。优选地，该差异是不显著的，并且其特征在于强度的值至少在参考值的1％-99％、5％-95％、10％-90％、20％-80％、30％-70％、40％-60％之间的区间内，参考值的50％、60％、70％、80％、90％或者95％。 
在参考结果获自已知未患前列腺癌的受试者或群组的情况下，可以基于获自测试样品的测试结果与前述参考结果之间的差异，即本文中所提及的至少一种标志物的定性或定量组成的差异，来诊断所述疾病。如果使用如上文所述的计算参考值，那么应用相同的方法。优选地，差异应当是根据本发明的诊断标志物的绝对量或者相对量的增加。优选地，相对量或者绝对量的增加是显著的，即在参考值的45％-55％、40％-60％、30％-70％、20％-80％、10％-90％、5％-95％、1％-99％之间的区间之外。 
因此，参考值可以来源于已知患前列腺癌的受试者。优选地，测试样品和参考样品的相同或相似结果指示患者患前列腺癌。 
如上所述，参考值还可以来源于已知未患前列腺癌的受试者。根据本发明的诊断标志物的量大于所述参考值优选地指示患者患前列腺癌。 
此外，还考虑将阈值量用作为参考量。可以将高于阈值量的测试样品 中如本文中所提及的标志物的量用于指示受试者患前列腺癌，其中将低于阈值量的量用于指示患者未患前列腺癌。 
有利地，已经显示，与来自未患前列腺癌的受试者的样品比较，本文中所提及的标志物在来自患前列腺癌的受试者的样品中是增加的。因此，测定所述标志物允许在疑似患前列腺癌的受试者中可靠的诊断前列腺癌。如果在血液、血浆或血清样品中测定所述标志物的量，那么前述方法是特别有利的，因为可以容易地获得这些样品。 
如已在本文中其他地方所述，进展的分类和测定是重要的，以允许进行有效的和合适的治疗性干预。具体而言，希望在前列腺癌进展到转移发生阶段，例如阶段3a和3b之前，开始治疗性干预。 
多种miRNA(或者其前体分子)的测定允许可靠地分期前列腺癌(参见上文)。因为前列腺癌的治疗取决于前列腺癌的阶段，所以这些标志物的测定允许对患前列腺癌的患者的治疗做出决定。 
因此，本发明涉及鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的方法，所述方法包括 
a)测定在来自患前列腺癌的受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量， 
b)将如在步骤a)中测定的所述至少一种miRNA或者所述前体分子的量与参考量比较，和 
c)鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者。 
就实际的情况，可以将上文中做出的定义和说明应用于前述方法(除非另外指明)。 
前述方法允许鉴定受试者是否对前列腺癌治疗敏感，并因此测定患前列腺癌的受试者是否会受益于前列腺癌治疗。合适的前列腺癌治疗包括手术、放疗和更优选地，全身化疗。所述治疗是本领域熟知的，并例如描述于Heidenreich A，Aus G，Bolla M，等人，EAU guidelines on prostate cancer。Eur Urol 2008；53：68-80中或者NCCN Clinical Practice Guidelines in OncologtTM Prostate Cancer，第一版2008年中。 
应当理解，优选地，用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的前述方法的参考应当来源于已知经受患局限性晚期前列腺癌(pT2)或者全身性阶段前列腺癌(pN+、M+)的受试者的受试者。更优选地，测试样品和参考样品的相同或相似结果指示受试者在该情况下对前列腺癌治疗是敏感的。备选地，参考物优选地可以来源于已知未患局限性晚期前列腺癌(pT2)或者全身性阶段前列腺癌(pN+、M+)的受试者，并因此，例如来源于患局限性前列腺癌(pT2)的受试者。更优选地，与所述参考物比较，miRNA或者其前体的量增加(优选统计学显著增加)，表明受试者对前列腺癌治疗是敏感的。可以在无需另外费力的情况下，通过本领域技术人员测定增加是否是统计学显著的。 
本发明还涉及诊断前列腺癌的进展的方法，包括： 
a)测定在来自患前列腺癌的受试者的第一样品中，选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量，和 
b)测定在所述受试者的第二样品中至少一种miRNA或者所述至少一种miRNA的所述前体分子的量，和 
c)将所述第一样品中的量与所述第二样品中的所述量比较。 
与第一样品中的量比较，在第二样品中标志物的量优选增加，更优选地，统计学显著的增加，指示了进展性前列腺癌。 
术语“前列腺癌的进展”和“进展性前列腺癌”指前列腺癌从一个阶段转变到另一个阶段，优选地，转变到更晚期。优选地，由本发明方法所涉及的前列腺癌的进展是从局限性(pT2)进展到局限性晚期(pT3)或者全身性阶段(pN+、M+)。如已在本文中其他地方所述，进展的分类和测定是重要的，以允许进行有效的和合适的治疗性干预。 
优选地，第二样品在所述第一样品后4-6个月内、6-12个月内、12-24个月内，和更优选地，24-48个月内获得。 
如上所述，与所述第一样品中所述标志物的量比较，所述第二样品中 标志物的量的增加指示了前列腺癌的进展。优选地，所述增加是统计学显著的。可以在无需另外费力的情况下，通过本领域技术人员测定增加是否统计学显著。指示前列腺癌进展的优选的增加为20％、30％40％、50％和更优选地100％。 
此外，本发明考虑用于监测前列腺癌治疗或者针对进展性前列腺癌的治疗的成功的方法。该方法也包括本发明前述方法和基于诊断结果鉴定成功的治疗的步骤。应当理解，成功的治疗应当导致至少一种生物标志物从患病或者晚期阶段到健康或者更早期的疾病阶段的减少(优选地，显著减少)。 
此外，本发明还涉及适合于实施本发明方法的试剂盒和装置。 
因此，本发明涉及适合于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的装置，包括： 
a)分析单位，其包含用于选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子的检测试剂，其中所述分析单位适合于测定在由检测试剂检测的样品中所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量，和 
b)包含计算机的评价单位，其包含确定植入的计算机程序，所述程序编码用于实施获自分析单位的测定量与参考量的比较。 
此外，本发明涉及适合于在疑似患前列腺癌的受试者中诊断前列腺癌的装置，包括： 
a)分析单位，其包含用于选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子的检测试剂，其中所述分析单位适合于在由检测试剂检测的样品中测定所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量，和 
b)包含计算机的评价单位，其包含确定植入的计算机程序，所述程序编码用于实施获自分析单位的测定量与参考量的比较。 
此外，本发明涉及适合于鉴定对前列腺治疗敏感的受试者的装置，包括： 
a)分析单位，其包含选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子的检测试剂，其中所述分析单位适合于在由检测试剂检测的样品中测定所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量，和 
b)包含计算机的评价单位，其包含确定植入的计算机程序，所述程序编码用于实施获自分析单位的测定量与参考量的比较。 
如本文中所用，术语“装置”指至少包含相互有效连接以允许预测的前述工具的工具的系统。在本发明方法的情况下，上文公开了用于测定本文中所提及的标志物的量的优选工具和用于实施比较的工具。如何以有效方式连接工具取决于装置中包含的工具的类型。例如，如果应用自动测定所述标志物的量的工具，那么可以通过例如，计算机程序处理由所述自动运行工具获得的数据，以诊断或者区分本文中所提及的疾病。优选地，在该情况下，工具由单一装置包含。所述装置可以因此包含用于测量样品中标志物的量的分析单位和用于处理用于差别诊断的结果数据的计算机单位。在涉及以上本发明方法的实施方案的情况下，公开了用于检测的优选工具。在该情况下，工具是有效连接的，因为由于用户手册给出的说明和解释，系统的使用者会将量和其诊断值的测定结果放在一起。在该实施方案中，工具可以表现为分离的装置，并优选地包装在一起作为试剂盒。本领域技术人员知道如何在不需另外费力的情况下连接工具。优选的装置是那些不需要应用专业医师的具体知识的装置，例如，电子装置，其仅需要装载样品。结果可以给出为参数性诊断原始数据的输出，优选地，作为绝对量或者相对量。应当理解，这些数据需要由医师解释。然而，还设想专家系统装置，其中输出包括经处理的诊断原始数据，所述经处理的诊断原始数据的解释不需要专业医师。另外优选的装置包括根据本发明方法的上文所提及的分析单位/装置或者评价单位/装置。 
此外，本发明涉及适合于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的试剂盒，包括： 
a)用于选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p 和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子的检测试剂，和 
b)适合于测定由所述检测试剂检测的所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量的装置，其中所述装置还适合于实施所述量与参考量的比较。 
此外，本发明涉及适合于在疑似患前列腺癌的受试者中诊断前列腺癌的试剂盒，包括： 
a)用于选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子的检测试剂，和 
b)适合于测定由所述检测试剂检测的所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量的装置，其中所述装置还适合于实施所述量与参考量的比较。 
此外，本发明涉及用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的试剂盒，包括： 
a)用于选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子的检测试剂，和 
b)适合于测定由所述检测试剂检测的所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量的装置，其中所述装置还适合于实施所述量与参考量的比较。 
如本文中所用，术语“试剂盒”指优选地，以分离的或者在单一容器内提供的前述工具的集合。该容器还优选地包含用于实施本发明方法的说明书。因此，本发明涉及包含用于测量本文中所提及的标志物的工具或者试剂的试剂盒。已经在该说明书中给出了此类工具或者试剂及其使用方法的实例。该试剂盒优选地含有立即可用方式的前述工具或者试剂。优选地，该试剂盒可以额外包含说明书，例如，用于解释有关由本发明方法所提供的诊断的任一测定结果的用户手册。特别地，该手册可以包括将测定的标志物的量分配给诊断类型的信息。在该说明书中其他地方可以发现详细说明。另外地，该用户手册可以提供有关正确使用试剂盒的组分用于测定各个生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或者电子形式提供，例如 存储在CD或者CD ROM上。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任一方法中的用途。 
最后，本发明涉及来自患前列腺癌的受试者的样品中的选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子用于分期前列腺癌的用途。 
本发明还设想来自患前列腺癌的受试者的样品的选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的用途。 
最后，本发明涉及来自疑似患前列腺癌的受试者的血液、血清或者血浆样品的选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子在诊断前列腺癌中的用途。 
以上提及的全部参考文献就其全部公开内容以及在以上说明书中所明确提及的其特定公开内容并入本文作为参考。 
附图显示了： 
图1：在来自前列腺癌患者的血清中的循环miRNA水平。368种循环miRNA的MA图。红色，用Limma分析鉴定的69种miRNA(p＜0.05，没有多重检验)。 
图2：在取自患转移性PCa(n＝7)和原发性PCa(n＝13)的患者的血清样品中，循环miRNA-375的Ct值。fdr＝0.036(差异表达的检验；在多重检验调整后)。 
图3：基于5种循环miRNA的表达水平的45个血清样品的聚类。表达水平在热图(heatmap)用颜色标示。Gleason得分：黑色，≥8或者M+；深灰色，Gleason 7；浅灰色，Gleason 6；NM(淋巴结状态或者转移)：黑色，N1或者M+；浅灰色，N0；白色，NX；M(转移)：黑色，M+；浅灰色，MX。 
图4：miRNA-375在45个样品中的前验证。通过a)风险[9个高风险 肿瘤(Gleason≥8或者M+)，21个中等风险肿瘤(Gleason 7)和15个低风险肿瘤(Gleason 6)]；和b)淋巴结状态(12个肿瘤N1或者M+对21个肿瘤N0)分组血清样品中的miRNA-375Ct值。使用Wilcoxon检验测定统计学显著差异。 
图5：循环miRNA的确认。通过a)风险组[9个高风险肿瘤(Gleason≥8或者M+)，21个中等风险肿瘤(Gleason 7)和15个低风险肿瘤(Gleason6)]分组血清样品中的miRNA Ct值。 
现通过以下实施例说明本发明，其并不意图限定或者限制本发明的范围。 
实施例1： 
为了筛选与前列腺癌进展相关的循环miRNA，分析了21个血清样品。纯化RNA，并用低密度Taq-Man阵列测量667种miRNA。由于大量未测定值(768个中的610个)，将一个样品(IGPS-20)舍弃为异常值。当与那些具有原发性前列腺癌的患者比较时，在取自具有转移性肿瘤的患者的血清样品中，循环miRNA的整体丰度显示出显著更高水平的无细胞miRNA(p＝0.02，Wilcoxon检验)。Limma分析在该组中鉴定了69种具有更高丰度的miRNA(p＜0.05，在没有调整进行多重检验的情况下；图1)。miRNA-375是顶端的标志物，并且是在具有远端转移的患者的血清中具有显著更高的丰度的唯一循环miRNA(fdr＝0.036；图2)。具有转移性前列腺癌的患者和具有原发性癌的患者的血清之间的对数倍数改变相当高(～4Ct值)。全部样品都在可测量的范围内(Ct＜40；图1和2)。 
实施例2： 
从筛选研究中挑选了miRNA-375和4个另外的循环miRNA(miRNA-9＊、miRNA-141、miRNA-200b和miRNA-516a-3p)，用于在独立患者群组的45个血清样品中进行确认。分级聚类分析显示，5个患者表现出高水平的所选定的循环miRNA(图3)。这些患者的肿瘤以至少 一个不利的风险因子(高Gleason得分、淋巴结侵犯或者远端转移)为特征。相反，具有低风险谱(低等级的肿瘤、局限于器官的肿瘤)的患者显示出低水平的5种所选定的miRNA。在样品集合中，miRNA-141和miRNA-200b是高度相关的(Pearson；r＝0.8；95％CI＝0.66)。 
对于分析，根据患者的Gleason得分、淋巴结和pT状态分组全部血清样品。将来自具有远端转移的患者的血清样品包含在Gleason得分≥8肿瘤和淋巴结阳性患者组中。在具有Gleason得分6(低风险)、7(中等风险)和≥8(高风险；图5)肿瘤的患者中检测循环miRNA的不同水平。然而，在全部3个逐组比较中，只有miRNA-375显示出显著的差异(图4a)。此外，在具有淋巴结阳性状态(p＝0.034；图4b)或者病理学阶段pT3的患者的血清中，miRNA-375具有显著更高的丰度(p＝0.021)。具有骨转移的3个患者在那些在血清中具有4个最高丰度值的miRNA-375的患者中。 
在确认研究中，与PSA组合分析循环miRNA-375。在具有高风险肿瘤(Gleason得分≥8或者具有转移性前列腺癌的患者)的患者的血清中miRNA-375水平显著更高(图4a)。与此相比，PSA水平不能区分Gleason7和Gleason≥8肿瘤或者不同的淋巴结状态。然而，当与那些具有Gleason得分为7的肿瘤的患者比较，PSA水平在具有低风险肿瘤(Gleason得分3+3)的患者中显著更低。 
为了评估两种(miRNA-375和PSA)标志物对临床-病理学终点预测的影响，应用了ANOVA分析。PSA显著区分了Gleason 6和Gleason 7肿瘤(表1)，并且miRNA-375的添加进一步显著改进了预测准确性。与此相反，Gleason 7和Gleason≥8之间基于PSA的比较在ANOVA分析中并没有显示出显著的差异。然而，将miRNA-375引入到模型中导致预测能力的改进。此外，当加入到PSA预测模型时，miRNA-375改进了淋巴结和病理学状态的预测。 
表1：ANOVA分析 
在ANOVA模型中有助于显著性影响的参数的p值。 
第一行：PSA单独对区分不同病理学参数的影响。 
第二行：miRNA-375对已含PSA的模型的额外影响 
Figure BDA0000159529550000261
实施例3：确认 
我们收集了来自具有高风险肿瘤疾病(N1或者Gleason 8或者更大)的原发性前列腺癌患者的大量独立血清样品集(n=71)，以与具有中等风险的肿瘤(N0或者Gleason 7)比较，来进一步分析循环miRNA(miRNA-375、miRNA-141和miRNA-200b)的血清水平。与第一次确认研究比较，当将高风险肿瘤与中等风险前列腺癌比较时，循环miRNA-200b没有显示出血清丰度的显著差异(数据未显示)。然而，在具有高风险前列腺癌的患者中再次检测到了循环miRNA-375和miRNA-141的更高水平。在具有淋巴结阳性前列腺癌患者的血清中，miRNA-375和miRNA-141具有显著更高的丰度。 

Claims (14)

1.用于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的方法，包括
a)测定来自所述受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量，
b)将如在步骤a)中测定的所述至少一种miRNA或者所述前体分子的量与一种或多种参考量比较，并
c)基于在步骤b)中获得的信息对所述受试者中前列腺癌分期。
2.权利要求1的方法，其中所述样品是血液、血浆或血清样品。
3.权利要求1和2的方法，其中所述量通过定量实时PCR测定。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述分期包括区分原发性前列腺癌和转移性前列腺癌。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中所述至少一种miRNA或者其前体分子的量大于参考量表明所述受试者患转移性前列腺癌，并且其中所述至少一种miRNA或者其前体分子的量低于参考量表明所述受试者患原发性前列腺癌。
6.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述分期包括区分高风险、中等风险和低风险。
7.用于诊断前列腺癌的进展的方法，包括：
a)测定来自患前列腺癌的受试者的第一样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量，和
b)测定所述受试者的第二样品中至少一种miRNA或者所述至少一种miRNA的所述前体分子的量，和
c)将所述第一样品中的量与所述第二样品中的所述量比较。
8.用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的方法，所述方法包括
a)测定来自患前列腺癌的受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量，
b)将如在步骤a)中测定的所述至少一种miRNA或者所述前体分子的量与一种或多种参考量比较，和
c)鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者。
9.用于在患前列腺癌的受试者中诊断前列腺癌的方法，所述方法包括
a)测定来自所述受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA的量或者所述至少一种miRNA的前体分子的量，
b)将如在步骤a)中测定的所述至少一种miRNA或者所述前体分子的量与一种或多种参考量比较，和
c)基于步骤b)中获得的信息诊断所述受试者中的前列腺癌。
10.适合于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的装置，其包含：
a)分析单位，其包含如在权利要求1中所定义的至少一种miRNA分子或者其前体分子的检测试剂，其中所述分析单位适合于测定由所述检测试剂检测的样品中所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量，和
b)包含计算机的评价单位，其包含确实嵌入的计算机程序代码，所述程序代码用于执行获自所述分析单位的测定量的比较。
11.适合于在患前列腺癌的受试者中分期前列腺癌的试剂盒，其包含：
a)如在权利要求1中所定义的至少一种miRNA分子或者其前体分子的检测试剂，和
b)适合于测定由所述检测试剂检测的所述至少一种miRNA分子或者其前体分子的量的装置，其中所述装置还适合于实施如在权利要求1至6中所定义的所述量的比较。
12.来自患前列腺癌的受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子用于分期前列腺癌的用途。
13.来自患前列腺癌的受试者的样品中的选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子用于鉴定对前列腺癌治疗敏感的受试者的用途。
14.来自患疑似患前列腺癌的受试者的样品中选自miRNA-375、miRNA-141、miRNA-200b、miRNA-516a-3p和miRNA9＊的至少一种miRNA或者其前体分子用于诊断前列腺癌的用途。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103882118A (zh) * 2014-02-13 2014-06-25 绍兴市人民医院 用于检测前列腺癌的miRNAs

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5808349B2 (ja) 2010-03-01 2015-11-10 カリス ライフ サイエンシズ スウィッツァーランド ホールディングスゲーエムベーハー セラノーシスのためのバイオマーカー
BR112012025593A2 (pt) * 2010-04-06 2019-06-25 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings biomarcadores em circulação para doença
WO2013063454A1 (en) * 2011-10-27 2013-05-02 Nesher Technologies, Inc. Methods and compositions for multiplexed and ultrasensitive microrna detection
WO2014071226A1 (en) 2012-11-02 2014-05-08 The Regents Of The University Of California Methods and systems for determining a likelihood of adverse prostate cancer pathology
EP2860953A1 (en) * 2013-10-11 2015-04-15 Kwame Corporation Ltd. Sharing graphical content among mobile computer devices in a communication network
EP3800253A3 (en) * 2014-06-12 2021-07-28 Toray Industries, Inc. Prostate cancer detection kit or device, and detection method
CN107002132A (zh) 2014-11-14 2017-08-01 液体基因有限公司 循环无细胞rna用于诊断和/或监测癌症的用途
JP7075596B2 (ja) * 2016-11-29 2022-05-26 大塚製薬株式会社 検体中の特定のｐｓａの含有量に基づく、前立腺癌のグリーソンスコアの推定方法、病理病期分類の推定方法、および補助情報の取得方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009015357A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009097136A1 (en) * 2008-02-01 2009-08-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions relating to carcinoma stem cells
EP3112477A1 (en) * 2008-02-28 2017-01-04 The Ohio State University Research Foundation Microrna-based methods and compositions for the diagnosis, prognosis and treatment of prostate related disorders
CN102308004A (zh) * 2008-10-30 2012-01-04 卡里斯生命科学卢森堡控股有限责任公司 评价rna图案的方法
WO2010056337A2 (en) * 2008-11-12 2010-05-20 Caris Mpi, Inc. Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009015357A1 (en) * 2007-07-25 2009-01-29 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosome-associated microrna as a diagnostic marker

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CYRIELLE CLAPE， ET AL，: "miR-143 Interferes with ERK5 Signaling, and Abrogates Prostate Cancer Progression in Mice", 《PLOS ONE》, vol. 4, no. 10, 26 October 2009 (2009-10-26), pages 1 - 8, XP002559188, DOI: doi:10.1371/journal.pone.0007542 *
STEFAN AMBS，ET AL，: "Genomic Profiling of MicroRNA and Messenger RNA Reveals Deregulated MicroRNA Expression in Prostate Cancer", 《CANCER RES》, vol. 68, no. 15, 1 August 2008 (2008-08-01), pages 6162 - 6170, XP002547524, DOI: doi:10.1158/0008-5472.can-08-0144 *
XU-BAO SHI，ET AL: "microRNAs and prostate cancer", 《J. CELL. MOL. MED》, vol. 12, no. 5, 1 September 2008 (2008-09-01), pages 1456 - 1465 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103882118A (zh) * 2014-02-13 2014-06-25 绍兴市人民医院 用于检测前列腺癌的miRNAs

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