CN105779635B - 一种基于olfm1基因用于结直肠癌预后判断的试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种基于OLFM1基因用于结直肠癌预后判断的试剂盒，包括以下成分中的至少一种：检测OLFM1基因mRNA表达水平的引物对、检测OLFM1基因启动子甲基化水平的引物对和检测OLFM1蛋白含量的试剂。通过对结直肠正常组织和癌组织中的OLFM1基因mRNA及编码蛋白的表达水平检测，发现OLFM1在结直肠癌病人的肿瘤组织中表达显著下调，而此下调与基因启动子区域CpG岛高度甲基化密切相关。在肠癌细胞中敲低OLFM1发现癌细胞的增殖能力和迁移能力显著增加。基于以上发现开发得到一种用于结直肠癌预后判断的试剂盒，其对于结直肠癌患者风险评估和预后预测有极其重要的意义。

Description

一种基于OLFM1基因用于结直肠癌预后判断的试剂盒
技术领域
本发明属于分子检测领域，具体涉及一种基于OLFM1基因用于结直肠癌预后判断的试剂盒。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer,CRC)是目前世界上癌症相关主要死亡因素之一。结肠癌和直肠癌的五年生存率分别是65.4％和67.7％。
研究发现，有关基因(包括KRAS、TP53、APC)在结直肠癌肿瘤组织中发生突变或启动子高甲基化。结直肠癌的异常是连续被基因组新技术发现的，同时这些新技术有利于诊断甚至治疗。例如，RNA测序发现在10％的结肠癌中存在包括R-spondin家族成员RSPO2和RSPO3的重复基因融合，并且在PTPRK-RSPO3融合基因阳性的结直肠癌病人中进行抗-RSPO3治疗能够抑制肿瘤的增殖和促进分化。
在结直肠癌和子宫内膜癌中有18％的患者有RNF43突变；在粪便中进行KRAS突变、异常NDRG4和BMP3甲基化和β-actin基因定量检测，结合血红蛋白免疫检测，对于结直肠癌的筛查是很有价值的。因此，探索更多的诊断和治疗靶点以及阐述结直肠癌的生长和转移的分子机制是十分重要的。
含Olfactomedin域的蛋白家族包括至少13个成员，它们在神经发生、细胞间黏附、细胞周期调控以及肿瘤发生中发挥着重要作用。OLFM1是这个超家族中的一个成员，它有一个保守的250个氨基酸的olfactomedin域。OLFM1是一种高表达的神经糖蛋白，其对于神经系统和心脏的发展十分重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于OLFM1基因用于结直肠癌预后判断的试剂盒。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一种基于OLFM1基因用于结直肠癌预后判断的试剂盒，包括以下成分中的至少一种：
(1)检测OLFM1基因mRNA表达水平的引物对，即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；
(2)检测OLFM1基因启动子甲基化水平的引物对，即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，或者是SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；
(3)检测OLFM1蛋白含量的试剂，优选抗OLFM1蛋白的抗体；
所述的试剂盒还包括人正常的结直肠组织或细胞的总RNA或DNA，作为对照用，以判断基因表达水平和启动子甲基化水平的高低；
所述的试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs或荧光底物中的一种以上；
所述的荧光底物优选Syber Green或荧光标记的探针。
本发明使用Genesis软件分析Gene Expression Omnibus(GEO)数据库中编号为GSE32323的来自于结直肠癌患者的17对肿瘤组织和正常组织的芯片结果，汇总并比较含olfactomedin域的蛋白家族的13个成员的表达情况。发现在含olfactomedin域蛋白家族中的13个成员中，结直肠癌组织中OLFM1的表达水平显著低于癌旁正常组织，其统计差异最大。
接着，本发明通过荧光定量PCR方法检测19对CRC肿瘤组织及其正常对照组中的OLFM1的mRNA水平。发现OLFM1在CRC组织中表达明显低于正常组织，肿瘤组织中OLFM1低表达提示CRC病人不良预后，低表达OLFM1与淋巴结转移、远处转移以及较晚分期相关。
在184例有5年以上随访资料的CRC组织中使用免疫组织化学染色检测了OLFM1的蛋白表达水平，双尾χ2检验用来评估OLFM1水平与临床病理参数之间的相关性。Kaplan-Meier方法用于检测生存分析，而log-rank检测则用来比较生存曲线；COX风险回归模型用于进行无进展生存期(PFS)和总生存期(OS)的多因素分析。
采用甲基化特异性PCR和重亚硫酸盐直接测序实验(BSP)检测在CRC细胞株以及组织中OLFM1启动子区域的甲基化水平，发现在CRC组织和细胞中OLFM1启动子CpG岛高度甲基化。
综上可以看出，OLFM1基因启动子甲基化水平在人结直肠癌组织中明显升高，导致OLFM1的表达(包括mRNA水平和蛋白水平)在人结直肠癌组织中显著下调，其表达下调预示着患者缩短的生存期和不良的预后。因此，患者结直肠癌组织中OLFM1基因启动子甲基化水平明显升高，或者OLFM1基因mRNA表达水平显著降低，又或者患者结直肠癌组织中OLFM1基因蛋白表达水平显著降低，预示着患者的不良预后。所以，本发明的试剂盒可以用于预后判断。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过生物信息学分析，发现OLFM1是一个与结直肠癌密切相关的基因。通过对结直肠正常组织和癌组织中的OLFM1基因mRNA及编码蛋白的表达水平检测，发现OLFM1在结直肠癌病人的肿瘤组织中表达显著下调，而此下调与基因启动子区域CpG岛高度甲基化密切相关。在肠癌细胞中敲低OLFM1发现癌细胞的增殖能力和迁移能力显著增加。基于以上发现开发得到一种用于结直肠癌预后判断的试剂盒，其对于结直肠癌患者风险评估和预后预测有极其重要的意义。
附图说明
图1是在结直肠癌组织和癌旁组织中OLFM1蛋白的免疫组化染色图。
图2是在结直肠癌组织中OLFM1蛋白表达的分级标志图(免疫组织化学染色法检测)。
图3是OLFM1蛋白表达与预后关系的ROC曲线(用于判定OLFM1蛋白表达高低的界值为1.255)。
图4是通过Kaplan-Meier生存分析得到的晚期结直肠癌患者生存曲线(示OLFM1表达高低(界值为1.255)与患者生存率的关系)。
图5是在结直肠癌组织和对应的正常组织中OLFM1mRNA水平图(定量PCR法检测)。
图6是用Methprimer软件预测的OLFM1启动子区CpG岛示意图(灰色表示CpG岛)。
图7是结直肠癌细胞株和组织中OLFM1启动子甲基化特异PCR产物的电泳结果图(MSP示甲基化特异性PCR条带，USP示非甲基化特异的PCR条带)。
图8是用BSP法测定结直肠癌细胞株和组织中OLFM1启动子甲基化状态图(实心圆为甲基化，空心圆为非甲基化)。
图9是5-Aza处理前后CRC细胞中OLFM1启动子甲基化特异PCR产物的电泳结果图。
图10是5-Aza处理前后CRC细胞中OLFM1mRNA表达水平图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例中用到的材料其来源如下：
1、正常人结肠上皮细胞株NCM460购自上海弘顺生物科技有限公司；人胚肾上皮细胞株293T、CRC细胞株DLD1、SW1116、HCT116、HT29、SW480、SW620均购自美国模式培养物保藏委员会(American Type Culture Collection，ATCC)。
所有细胞株在37℃、5％二氧化碳的培养箱中培养。
2、细胞培养基：DMEM、RPMI1640、MyCoy5A、L-15及胎牛血清购于Gibco公司。
3、组织及细胞基因组DNA提取试剂盒PureLink Genome DNA Mini Kit、实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Green PCR试剂盒购自Invitrogen公司。
4、基因组DNA亚硫酸钠处理试剂盒EZ DNA Methylation-Gold KitTM、Zymo TapDNA Polymerase购自ZYMO Research公司。
5、RNA提取试剂TRIzol购于东盛生物公司。
6、RT-PCR相关试剂Rnase-Free Dnase、M-MLV逆转录酶、RNase inhibitor、OligodT Primer；以及双荧光素酶报告基因检测系统Dual-Luciferase Reporter AssaySystem购于Promega公司。
实施例中所用到的其它试剂均可通过公开途径购买到。
实施例1
临床样本收集
选取184例(中位年龄为64.5岁，男性为58.2％)于1999年5月至2010年7月在中山大学附属肿瘤医院行手术的各期结直肠癌患者作为研究对象。其术后标本用石蜡处理后室温保存，切取的白片于4℃冰箱保存。
入选病例的入选标准为：初诊，肿瘤单发，术前无放化疗，I、II、III期病人行根治术，同时包含肿瘤组织和癌旁正常组织(距肿瘤边缘>5cm的区域)。
纳入研究的所有病人根据AJCC标准(第七版)进行分级，病人相关资料来自病案报告，随访资料来源于随访科。收集的临床病理资料包括年龄，性别，肿瘤位置，肿瘤大小，病理类型，浸润深度，术中送检的淋巴结状态及病理结果，远处转移，AJCC/TNM分期，术前CA199和CEA水平，术后治疗方案等。
纳入研究的手术病人前两年每3个月随访一次，在第三和第四年则每6个月随访一次，术后第五年以后则每年随访一次。所有病人均通过电话或问卷来询问他们的健康状况，最后一次随访日期为2015年7月21日。没有随访资料的病人不纳入我们的研究中。每个病人都签订了知情同意书，并且我们的研究步骤得到了中山大学附属肿瘤医院伦理委员会的同意。
总生存期(Overall survival,OS)的计算方法是从病人手术日期到死亡日期为止；无进展生存期(Progression-free survival，PFS)的计算方法则从手术日期到病人复发、转移或最后一次随访为止。
实施例2
采用免疫组织化学染色法(简称免疫组化法)测定结直肠癌标本中OLFM1蛋白的含量，包括以下步骤：
取184例结直肠癌患者的石蜡切片白片，通过二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、0.3％过氧化氢去除组织过氧化物酶、柠檬酸盐溶液微波修复、Abgent公司anti-OLFM1(AP2719a)抗体(1:200)和相应种属二抗孵育、DAB和苏木素显色、盐酸酒精分化、梯度酒精脱水、二甲苯透明步骤后，中性树胶封片。
图1显示用免疫组化法检测OLFM1蛋白在结直肠癌患者肿瘤组织和对应正常粘膜组织中表达的典型图片(棕色示OLFM1表达阳性，颜色越深表示表达强，颜色浅或无表示OLFM1表达低)。
组织标本免疫组化染色后，标本的染色评估由两位对临床治疗未知的病理医生分别独立完成。组织标本的染色评估由200×倒置显微镜拍照，癌旁、癌组织各取5个视野/病例对图片进行分析。
图2是免疫组织化学染色后，OLFM1在结直肠癌组织中的评分标准。根据细胞浆中OLFM1的染色强度分为：阴性(0分)，弱阳性(1分)，中度阳性(2分)和强阳性(3分)四个等级。判断每个标本染色的最终指标为H-score(＝强度×阳性细胞百分率)。
根据总生存期(Overall survival,OS)和无进展生存期(Progression-freesurvival,PFS)的数据，描绘出ROC曲线(图3)，并选择特异性和灵敏度之和最高的点1.255为OLFM1表达高低(H-score)的临界值，将上述样本中OLFM1表达分为高表达和低表达两个等级。
实施例3
为了研究OLFM1表达与结直肠癌患者预后之间的关系，运用SPSS软件中Kaplan-Meier分析研究肿瘤组织中OLFM1表达情况与预后的相关性，结果显示，肿瘤组织中OLFM1高表达(H-score≥1.255)的病例的无进展生存期(PFS；P<0.001)和总生存期(OS；P<0.001)均显著长于肿瘤组织低表达OLFM1(H-score<1.255)的病例(图4)。
以上实验表明，OLFM1是一个与结直肠癌密切相关的基因。OLFM1的mRNA和蛋白表达水平在结直肠癌病人的肿瘤组织中显著下调，而该下调与基因启动子区域CpG碱基高度甲基化密切相关。同时，在结直肠癌病人中的预后分析发现，OLFM1在肿瘤细胞高水平表达指示良好预后。基于上述发现，我们开发了一种用于结直肠癌预后判断的试剂盒。
实施例4
用定量PCR法检测OLFM1在结直肠癌组织中mRNA表达水平，包括以下步骤：
1)查询NCBI的Gene数据库，得到OLFM1和β-actin(内参)的cDNA序列，根据序列设计PCR引物如下：
2)使用TRIZOL法提取19例结直肠癌组织及其正常对照的总RNA，分别取2μg总RNA逆转录为cDNA。
3)建立以下反应体系，每个样本设置三个反应复孔：
混匀以上组分，加入到8联管各孔，盖紧盖子后，离心使液体聚集到管底。根据以下条件进行PCR反应：95℃10min；95℃30s、60℃30s、72℃40s，40个循环；95℃1min，60℃30s，95℃30s。
根据得到的Ct值计算OLFM1的mRNA相对表达水平，公式为：OLFM1的mRNA相对水平＝2(Ctβ-actin-CtOFM1)。
结果如图5所示，在结直肠癌组织中OLFM1的mRNA水平明显低于正常组织中mRNA的表达水平，结果具有统计学意义。
实施例5
MSP(甲基化特异性PCR)法定性检测结直肠癌细胞株及组织中OLFM1启动子甲基化情况，包括以下步骤：
通过Pubmed查询、序列分析以及在线网站预测(http://www.genome.ucsc.edu/index.html)，发现在OLFM1的启动子区存在两个CpG岛(图6)。
1)提取4株结直肠癌细胞株、一株正常肠上皮细胞和4对肿瘤组织的DNA，测定浓度。随后使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO Research)对DNA进行亚硫酸氢盐处理，DNA经亚硫酸氢盐硫化处理后，DNA双链中的“C”转化为“U”，通过随后的PCR，将“U”转化为“T”，但亚硫酸氢盐不能使已发生了甲基化的DNA的“C”发生上述转化。
2)针对OLFM1启动子区域DNA模板甲基化(M)或未被甲基化(U)设计以下相应的引物，随后进行引物特异性MSP。
反应体系：
热循环条件：95℃10min；95℃30s、58℃35s、72℃30s，40个循环；72℃7min，4℃。
3)琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，若用针对甲基化DNA链的引物(MSP)能扩增出片段，则说明该被检测的位点存在甲基化；若用针对非甲基化DNA链的引物(USP)扩增出片段，则说明被检测的位点不存在甲基化。
结果如图7所示，与正常肠上皮细胞株NCM460比较，四株CRC细胞株OLFM1基因启动子均存在甲基化(程度高低有一定差异)；且4个患者的肿瘤组织中OLFM1基因启动子CpG岛甲基化程度均高于正常组织。
实施例6
BSP(重亚硫酸盐直接测序)法定量检测结直肠癌细胞株和组织中OLFM1启动子甲基化程度，包括以下步骤：
1)对重亚硫酸盐处理后的DNA(处理方法同实施例5)用以下引物进行OLFM1启动子区域PCR扩增：
2)对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳、切胶回收、连接至pMD19-T载体、转化DH5α感受态细胞、提取5-7个阳性单克隆质粒进行测序并且与未经处理的序列比较，判断其中CpG岛中C是否甲基化(未发生甲基化的胞嘧啶全部转化成胸腺嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变)。
结果如图8所示，OLFM1基因启动子区域的大部分CpG碱基在结直肠癌细胞及组织中比正常对照样本的甲基化程度高出许多。(空心圆代表没有甲基化，实心圆代表CpG甲基化)
实施例7
实验证实CRC细胞中OLFM1表达下调与基因启动子区域CpG碱基高度甲基化密切相关。具体方法如下：
以4株结直肠癌细胞株(DLD1、HCT116、CaCO2、HT29)为例，本实施例对这四株细胞进行去甲基化处理，包括以下步骤：
1)5-Aza-2’deoxycytidine(5-氮杂-2'-脱氧胞苷，简称5-Aza)配成浓度为10mM的工作母液，0.22μm滤膜除菌，使用时用DMEM稀释成10μM的工作液；
2)胰蛋白酶消化结直肠癌细胞成单细胞悬液，于显微镜下记数，按每孔1×105个细胞接种6孔板；
3)培养24h后加入5-Aza或空白对照，每24h重新更换含新鲜培养液的药液，连续处理3d；
4)弃去药液，用完全培养液继续培养1d，提取细胞的RNA和DNA，用以检测OLFM1启动子甲基化状态和OLFM1mRNA水平(方法分别见实施例5和实施例4)。
结果显示，5-Aza处理后CRC细胞中OLFM1启动子甲基化程度下降(图9)，相对应的其mRNA表达水平升高(图10)。
因此，可以说OLFM1在CRC细胞中表达下调是由于其启动子区的异常高甲基化引起的。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.试剂在制备用于结直肠癌预后判断的试剂盒中的应用，其特征在于：所述的试剂包括以下成分中的至少一种：
（1）检测OLFM1基因mRNA表达水平的引物对，即SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；
（2）检测OLFM1基因启动子甲基化水平的引物对，即SEQ ID No.5和SEQ ID No.6，或者是SEQ ID No.9和SEQ ID No.10；
（3）检测OLFM1蛋白含量的试剂。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述检测OLFM1蛋白含量的试剂是抗OLFM1蛋白的抗体。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括人正常的结直肠组织或细胞的总RNA或DNA。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的试剂盒还包括PCR酶、PCR缓冲液、dNTPs或荧光底物中的一种以上。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的荧光底物为Syber Green或荧光标记的探针。
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