CN102105595A - Hpv诱发的浸润性癌及其高度前期病变的分子诊断标志物mal - Google Patents

Abstract

本发明人开发了基于MAL改变，特别是基于MAL mRNA和蛋白表达降低以及MAL启动子超甲基化的(分子)诊断标志物，以鉴定通过刮擦、灌洗或通过其他工具获得的细胞材料和/或组织中人乳头瘤病毒(HPV)诱发的高度癌前病变，例如浸润性宫颈癌的恶性前宫颈病变，和高危型人乳头瘤病毒(HPV)诱发的非宫颈浸润性癌的前期病变。特别是，本发明涉及MAL基因(包括其启动子)及其基因产物作为HPV诱发的高度恶性前病变的标志物，从而可对个体患者提供早期检测和更好的治疗选择的用途。

Description

HPV诱发的浸润性癌及其高度前期病变的分子诊断标志物MAL

发明领域

本发明涉及癌症预防和医学诊断领域；并且涉及人乳头瘤病毒(HPV)诱发的浸润性癌及其高度前期病变，例如浸润性宫颈癌和恶性前宫颈病变的分子诊断标志物。特别是，本发明涉及MAL基因组和其调控序列或基因产物作为hrHPV诱发的具有浸润性潜能的恶性前病变和hrHPV诱发的浸润性癌的标志物的用途。

发明背景

宫颈癌是世界范围内女性中的第二常见癌症，并且每年造成约250,000例癌症死亡。

宫颈鳞状细胞癌的发展以连续恶性前病变即所谓的宫颈上皮内瘤变(CIN)为特征，宫颈上皮内瘤变分为1-3级，分别称为轻度异生(CIN1)、中度异生(CIN2)和重度异生/原位癌(CIN3)。CIN1也称为低度鳞状上皮内病变(LSIL)，而CIN2和CIN3一起称为高度鳞状上皮内病变(HSIL)。对于宫颈腺癌，原位腺癌(ACIS)是确定的前期病变。基本上，这些恶性前病变是可逆的，尽管病变越严重，自发消退的机会越低。由于恶性前阶段可以通过脱落细胞学检测，并且当需要时，相对容易地得到治疗而仅有较小的副作用，因此宫颈癌被认为是可预防的疾病。宫颈筛查目的在于早期诊断高度恶性前病变(即，CIN2/3和原位腺癌)和可治疗的癌性病变，从而降低浸润性宫颈癌的死亡率。一般的医学实践包括治疗所有具有形态学上确定的CIN2、CIN3和原位腺癌的女性，以预防宫颈癌的发展。

在过去的十年里，已经完全确认宫颈致癌是由高危型人乳头瘤病毒(hrHPV)感染开始的。已经证实，分别干扰p53和Rb肿瘤抑制途径的病毒致癌基因E6和E7的表达，对于肿瘤发生的发作和恶性表型的维持都是必要的。因此，hrHPV检测似乎为吸引人的、初步筛查手段。然而，与致癌作用的多步过程一致，hr-HPV感染的细胞发展为浸润性癌细胞需要宿主细胞基因组中的其他改变。仅很小比例的感染高危型HPV的女性会发展为高度恶性前宫颈病变(CIN2/3)，并且，如果没有得到治疗，则发展为宫颈癌。在大部分患有恶性前宫颈病变的女性中，病变自发消退。在参与基于群体筛查的女性中，约5-6％的女性具有阳性hrHPV检测(Bulkmans et al.，Int J Cancer 2004，110：94-101)。然而，仅仅最多20％的上述女性(1％的参与的女性)具有≥CIN2/3。因此，通过hrHPV检测进行初步筛查会伴随有大量多余的追踪程序和女性中不必要的焦虑，除非可将标志物应用于hrHPV阳性女性宫颈涂片，该标志物可以允许对hrHPV阳性女性的≥CIN2/3和≥原位腺癌风险进行归类。

主要的挑战是降低检测阳性女性与具有临床有意义的病变的女性的百分比。一个模式是对于hrHPV阳性女性使用细胞学作为第二(所谓的治疗类选法)检测。然而，这遗留了大量具有正常细胞学的hrHPV阳性女性(3.5％的筛查人群女性)，其中10％具有或获得≥CIN3。而且，细胞学不是可以在家中取得的自我取样的宫颈-阴道样本的选项，因为这些样本并不代表宫颈的细胞学状态(Brink et al.，2006，J.Clin.Microbiol.44：2518-2523)。因此，需要辅助的或可选的治疗类选法手段，将hrHPV阳性女性分类为具有和不具有≥CIN2/3和≥原位腺癌的女性。

发明概述

本发明人开发了基于MAL改变，特别是基于MAL mRNA和蛋白表达降低以及MAL启动子超甲基化的(分子)诊断标志物，以鉴定通过刮擦、灌洗或通过其他手段获得的细胞材料和/或组织中人乳头瘤病毒(HPV)诱发的高度癌前病变，例如浸润性宫颈癌的恶性前宫颈病变，以及高危型人乳头瘤病毒(HPV)诱发的非宫颈浸润性癌的前期病变。特别是，本发明涉及MAL基因(包括其启动子)及其基因产物作为HPV诱发的高度恶性前病变的标志物，从而允许对个体患者提供早期检测和更好的治疗选项的用途。细胞分化蛋白(还称为MAL；Genbank登录号NM_002371)的基因作为肿瘤抑制基因参与宫颈致癌作用，并且MAL基因的低表达水平主要由MAL启动子甲基化导致，是宫颈致癌作用的重要决定因素。因此，MAL基因组及其调控序列和其基因产物为诊断浸润性宫颈癌及其高度前期病变提供了有价值的标志物。特别是，当与CADM1(Genbank登录号 NM_014333.3)的甲基化分析组合时，实现对浸润性宫颈癌及其高度前期病变的高灵敏度，其超过以宫颈细胞学发现的灵敏度。另外，本发明适于诊断非宫颈hrHPV相关的浸润性癌及其高度前期病变。

宫颈癌几乎仅与人乳头瘤病毒(HPV)感染相关。人乳头瘤病毒构成超过100种病毒的群，这可通过DNA序列中的变异鉴定。各种HPV诱发多种皮肤和粘膜疾病。基于HPV在感染的细胞中诱发恶性变的能力，HPV被粗略地分为低危型和高危型。低危型HPV例如1、2、4、6、11、13和32，主要与良性病变或寻常疣相关，而高危型，例如16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66和68主要与恶性前和恶性上皮病变相关。与由诸如HPV-6和HPV-11的低危型HPV诱发的疣相比，这些高危型HPV通常诱发扁平的并且几乎不可见的增生。已发现高危型HPV造成宫颈的浸润性癌以及肛殖道和/或头颈区的其他处浸润性癌。因此，本发明不仅适于检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的浸润性宫颈癌及其前期阶段，也适于检测由HPV，特别是高危型HPV诱发的其他浸润性癌和相应的前期阶段。因此，本发明提供了对任何HPV诱发的高度恶性前病变或浸润性癌进行风险评估的方法。

因此，本发明提供了如权利要求1所定义的在有需要的个体中检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度前期病变和HPV诱发的浸润性癌的方法，所述方法包括将个体的受试细胞(test cell)的细胞组分与检测受试细胞中所述细胞组分水平的试剂接触，并且与可供比较的健康细胞相比，确定受试细胞中所述细胞组分水平的改变，其中所述细胞组分指示细胞中的MAL水平，并且所述改变指示HPV诱发的癌前病变或HPV诱发的浸润性癌的存在。

在本发明的语境中，十分适合的HPV诱发的前期病变和浸润性癌是宫颈癌前病变和浸润性宫颈癌，而且也是诸如口腔、口咽、肛门、直肠、阴茎、外阴和阴道等其他组织中高危型HPV诱发的前期病变和浸润性癌。

受试细胞可以是(前)赘生性细胞、增殖性宫颈细胞或任何其他细胞，其中检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白相关的HPV诱发的具有浸润性潜能的前期病变和HPV诱发的浸润性癌的存在。

在另一实施方案中，本发明提供了如权利要求1所定义的在所需个体中检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的具有浸润性潜能的前期病变或HPV诱发的浸润性癌的方法，所述方法包括将受试细胞的靶细胞组分与检测MAL的试剂接触，并且与可供比较的正常细胞的MAL相比检测MAL的改变，优选地在所述检测中，与可供比的正常细胞相比，确定受试细胞中MAL启动子和富CpG内含子序列的甲基化的增加和/或受试细胞中MAL产生的降低。

在另一方面，本公开涉及如权利要求13所定义的分子诊断标志物在检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度前期病变和HPV诱发的浸润性癌中的用途，其中所述标志物指示MAL启动子甲基化和/或与MAL多肽产生相关的mRNA表达。通过这类用途，可以预测高度癌前病变或浸润性癌的存在。

附图简要说明

图1示出MAL5’调控区、编码序列、第一内含子序列的富CpG部分和转录的3’非编码序列。

发明详述

“表达”是指基因转录为结构RNA(rRNA、tRNA)或信使RNA(mRNA)，以及如果适用，随后翻译为多肽或蛋白。

术语“HPV诱发的浸润性癌”是指由高危型HPV诱发的癌，其浸润周围组织。该术语包括相关器官例如，宫颈、口腔、口咽、肛门、直肠、阴茎、外阴和阴道等中所有HPV诱发的癌组织型(histotype)，即鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞癌和神经内分泌癌。

术语“浸润性宫颈癌”是指浸润周围组织的宫颈癌。该术语包括所有癌组织型，即鳞状细胞癌、腺癌、腺鳞细胞癌和神经内分泌癌。

术语“恶性前病变”和“前期病变(proceursor lesion)”是指细胞多步演变为癌症中的阶段，伴随发展成为癌的机会极大地增加。通过经典的形态学，病理学家不能预测个体患者中这些病变中哪些会发展或消退。本专利涉及可以预测浸润性癌或其高度前期病变的方法。

术语“高度恶性前宫颈病变”是指细胞多步演变为宫颈癌中的阶段，伴随发展成为宫颈癌的机会极大地增加。术语“能与……特异性杂交”是指核酸序列能与互补的核酸序列特异性碱基配对并且与其结合而形成核酸双链体。

“补体”或“互补序列”是根据沃森-克里克碱基配对法则与另一核苷酸序列形成氢键连接的双链体的核苷酸序列。例如，5’-AAGGCT-3’的互补碱基序列是3’-TTCCGA-5’。

术语“严紧杂交条件”是指影响杂合体稳定性的杂交条件，例如，温度、盐浓度、pH和甲酰胺浓度等。根据经验优化这些条件，使引物或探针与其靶核酸序列的特异结合最大化和非特异结合最小化。所用的术语包括这样的条件，即在该条件下，探针或引物会与其靶序列，比与其他序列，杂交达更高可检测的程度(例如，至少是背景的两倍)。严紧条件是序列依赖性的，并且在不同的情况下不同。更长的序列以更高的温度特异性杂交。通常，选择严紧条件为比在确定的离子强度和pH下特异序列的热熔点(TM)低约5℃。Tm是50％的互补的靶序列与完全匹配的探针或引物杂交的温度(在确定的离子强度和pH下)。通常，严紧条件是这些的条件，其中，在pH 7.0至8.3下，盐浓度低于约1.0M Na离子，通常为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，且温度对于短探针或引物(例如，10-50个核苷酸)为至少约30℃而对于长探针和引物(例如，大于50个核苷酸)为至少约60℃。严紧条件也可以通过加入去稳定剂例如甲酰胺来实现。示例性的低严紧条件或“严紧性降低的条件”包括以30％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液在37℃杂交，并在2×SSC中于40℃洗涤。示例性的高严紧性条件包括在50％的甲酰胺、1M NaCl、1％SDS的缓冲溶液中于37℃杂交，并在0.1×SSC中于60℃洗涤。杂交程序是领域内公知的并且描述于，例如，Ausubel et al，Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)，John Wiley & Sons Inc.，1994中。

术语“寡核苷酸”是指核苷酸单体通过磷键(例如，磷酸二酯键、烷基和芳基-磷酸酯、硫代磷酸酯)或非磷键(例如，肽、氨基磺酸和其他)连接而成的短序列(通常6-100个核苷酸)。寡核苷酸可以含有具有修饰的碱基(例如，5-甲基胞嘧啶)和修饰的糖基(例如，2’-O-甲基核糖基、2’-O-甲氧基核糖基、2’-氟代核糖基和2’-氨基核糖基等)的修饰的核苷酸。寡核苷酸可以是环状、分支或线性形式的双链及单链DNA和双链及单链RNA的天然存在的或合成的分子，并且任选地包括能形成稳定二级结构的结构域(例如，茎-环结构和环-茎-环结构)。

本文所用的术语“引物”是指寡核苷酸，当将其置于诱发与核酸链互补的引物延长产物合成的条件时，即在存在核苷酸和诸如DNA聚合酶的杂交试剂并且在合适的温度和pH时，其能与允许DNA聚合酶连接的扩增靶标退火，从而充当DNA合成的起点。为了使扩增效能最大化，(扩增)引物优选是单链的。优选地，所述引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长，以在聚合试剂存在的情况下引发延伸产物的合成。引物的精确长度取决于多种因素，包括温度和引物源。本文所用的“双向引物对”是指诸如聚合酶链式反应(PCR)扩增的DNA扩增领域内通常使用的一个正向引物和一个反向引物。

术语“探针”是指在靶核酸序列分析物或其cDNA衍生物中识别互补序列并与其形成氢键连接的双链体的单链寡核苷酸序列。

MAL(T淋巴细胞成熟相关蛋白)基因(Genbank登录号NM_002371)最初被鉴定为T细胞发育期间差异表达的基因(Alonso and Weisman 1987，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，1997-2001)。MAL编码17kDa整合膜蛋白并且是富糖脂膜微结构域或筏的组分(Kim et al.，1995，J.Neurosci.Res.，42，413-422)。MAL具有作为膜顶端转运的蛋白机制的组分和极化上皮细胞中分泌蛋白组分的重要功能(Cheong et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，6241-6248)。

MAL表达降低已在，包括食道癌、胃癌和结肠直肠癌在内的多种

MAL表达降低已在，包括食道癌、胃癌和结肠直肠癌在内的多种人癌症中检测到(Mimori et al.，2003，Oncogene，22，3463-3471；Mimori 2007 et al.，Ann.Surg.Oncol.，14，1670-1677)。

在结肠直肠癌中，MAL下调与启动子超甲基化相关(Mori et al，2006，Gastroenterology，131，797-808；Lind et al.，2007 Gastroenterology，132，1631-1632)。

通过在食道癌细胞中重新表达MAL基因，导致运动性、浸润性和致肿瘤性受到抑制而增强凋亡，表明MAL发挥肿瘤抑制基因的功能作用。

本发明人现已证实，MAL的改变，包括MAL启动子甲基化和MAL表达降低，是宫颈癌中鳞状细胞癌、腺鳞癌、腺癌和神经内分泌癌组织型及其癌高度前期病变的频发事件。体外研究揭示了MAL失活在宫颈癌发展中的功能性参与，因为在含有SiHa宫颈癌细胞系的HPV16细胞中，MAL超表达降低增殖并且抑制不依赖支持物的生长(anchroage independent growth)。最有趣的是，本发明人证明，不仅MAL启动子超甲基化，而且mRNA表达的显著降低，可以在宫颈刮片样品中检测到，并且预测高度CIN病变或浸润性癌的存在。另外，MAL启动子甲基化可以在自我取样的宫颈-阴道样本中检测到，并且发现其与潜在的高度CIN病变或浸润性宫颈癌相关。有趣的是，通过将MAL甲基化分析与一个最近选择的CADM1启动子区(Genbank登录号NM_014333.3)组合，达到超过细胞学灵敏度的高≥CIN2灵敏度。另外，与细胞学不同，对两种基因的甲基化分析可以成功地实施在自我取样的宫颈-阴道样本和外阴样本上。这些结果表明，在宫颈刮片和自我收集的宫颈-阴道样本中检测MAL启动子甲基化，与或不与MAL表达降低或CADM1启动子甲基化组合，可以预测高度CIN疾病或宫颈癌。

因此，本发明提供了如权利要求1所定义的在有需要的个体中检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度癌前病变和HPV诱发的浸润性癌或指示其的方法，所述方法包括将个体的受试细胞的细胞组分与检测受试细胞中所述细胞组分水平的试剂接触，并平的改变，其中所述细胞组分指示细胞中MAL水平，并且所述改变指示HPV诱发的具有浸润性潜能的前期病变或HPV诱发的浸润性癌的存在。

个体的受试细胞可以包括来自于诸如宫颈细胞的粘膜细胞，以及其他组织例如口腔、口咽、阴茎、外阴、肛门、直肠和待检测与HPV相关的前期病变或癌症的其他组织的样品中的细胞。所有这类样品可用作本发明的方法中的样品。优选地，患者细胞的样品包含宫颈细胞作为受试细胞。宫颈细胞可以，例如，作为组织学的或细胞学的样本呈现。细胞学样本包含常规宫颈涂片以及宫颈样本和通过自我取样收集的宫颈-阴道或阴道样本的薄层配制品。

本发明的方法特别适于检测由高危型HPV诱发的与T淋巴细胞成熟蛋白(MAL)相关的高度癌前病变和浸润性癌。检测与T淋巴细胞成熟蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度癌前病变和HPV诱发的浸润性癌的方法因此可以涉及MAL表达的测量，例如以测量MAL基因转录本和/或翻译自所述转录本的随后的蛋白的形式。检测HPV诱发的具有浸润性潜能的高度癌前病变和HPV诱发的浸润性癌的方法也可以包括测量MAL启动子甲基化，作为MAL表达能力和/或MAL蛋白产生能力的指示。

图1示出MAL基因的富CpG启动子区和富CpG第一内含子序列以及编码序列和转录的3’非编码序列。富CpG序列，特别是在启动子区中富CpG序列的甲基化，会导致转录急剧降低，乃至转录完全阻断。因此，启动子区为该基因表达潜能提供了阳性标志物序列。可选择地，MAL基因的表达可以通过测量基因转录本检测。同样，该基因中MAL蛋白的编码区为所述基因转录本的检测提供了标志物序列。仍然在另一可选方案中，MAL基因的表达可以通过直接测量MAL蛋白检测。

因此，所接触的受试细胞组分可以是诸如DNA或RNA，优选地mRNA的核酸，或蛋白。当细胞组分是蛋白时，试剂通常是抗MAL抗体。当所述组分是核酸时，试剂通常是核酸(DNA或RNA)探针或(PCR)引物。通过使用这类探针或引物，可以检测基因表达产物，例如mRNA。可选择地，当所述组分是核酸时，所述试剂也可以是限制性内切核酸酶，优选检测受试细胞核酸上甲基存在的甲基化敏感性限制性内切核酸酶，此时所述受试细胞核酸优选是DNA。

可以直接原位检测受试细胞组分，或者在将所述受试细胞组分与试剂接触之前，可以通过本领域技术人员已知的普通方法将所述受试细胞组分与其他细胞组分分离(参见，例如，″Current Protocols in Molecular Biology(现代分子生物学实验技术)″，Ausubel et al.995.4th edition，John Wiley and Sons；″A Laboratoty Guide to RNA：Isolation，analysis，and synthesis(RNA实验指南：分离、分析与合成)″，Krieg(ed.)，1996，Wiley-Liss；″Molecular Cloning：A laboratory manual(分子克隆：实验手册)″，J.Sambrook，E.F.Fritsch.1989.3 Vols，2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press)。

检测方法包括如同以下的分析：Southern和Northern印迹分析、RNA酶保护、免疫测定、原位杂交、PCR(Mullis 1987，美国专利第4,683,195号、第4,683,202号、第en 4,800,159号)、LCR(Barany 1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：189-193；欧洲专利申请第320,308号)、3SR(Guatelli et al.，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1874-1878)、SDA(美国专利第5,270,184号，第en 5,455,166号)、TAS(Kwoh et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：1173-1177)、Q-β复制酶(Lizardi et al.，1988，Bio/Technology 6：1197)、滚环扩增(RCA)或扩增DNA的其他方法。在可选择的方法中，RNA可以通过如NASBA(L.Malek et al.，1994，Meth.Molec.Biol.28，Ch.36，Isaac PG，ed.，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.)或TMA的这类方法检测。

可以可检测地标记核酸探针、引物和抗体，例如，用放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光的化合物、金属螯合剂、酶或生物学相关结合的结构例如生物素或地高辛。本领域技术人员应当了解与试剂结合的其他合适的标记，或通过常规试验可以确定这类标记。

其他检测方法包括那些可用核酸阵列实施的分析(参阅尤其是Chee et al.，1996，Science 274(5287)：610-614)。例如，DNA阵列可用于检测本发明的核酸。这类阵列包含具有在严紧条件下能与核酸细胞组分杂交的序列的寡核苷酸，所述核酸细胞组分的水平在本发明的方法中被检测。

由于本发明证明，MAL转录水平的降低经常是MAL基因超甲基化的结果，因此经常需要直接确定MAL基因是否超甲基化。特别是，主要位于该基因5’调控区的称为“CpG岛”的富胞嘧啶区，通常未甲基化。术语“超甲基化”包括任何在MAL基因序列中通常未甲基化的位置(例如，MAL启动子、第一外显子和第一内含子序列，参见图1)的胞嘧啶的甲基化。例如，超甲基化可以通过对MAL多核苷酸(基因)进行限制性内切核酸酶处理和Southern印迹分析检测。因此，在其中所检测的细胞组分是DNA的发明方法中，优选限制性内切核酸酶分析，来检测MAL基因的超甲基化。可以使用包括CG作为其部分识别位点并且当C甲基化时受到抑制的任何限制性内切核酸酶。单独或组合使用的甲基化敏感性限制性内切核酸酶，例如BssHII、MspI、NotI或HpaII，是这类内切核酸酶的实例。其他甲基化敏感性限制性内切核酸酶是本领域技术人员已知的。

检测MAL启动子超甲基化的其他方法涉及DNA的重亚硫酸盐修饰，其中未甲基化的胞嘧啶被转化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶受到保护而免于化学修饰。随后的PCR扩增和测序会揭示，CpG岛中的胞嘧啶，在甲基化的情况下是否得以保持，或者在未甲基化状态的情况下是否被尿嘧啶取代。另一方法涉及用包括CG作为其部分识别位点的限制性内切酶处理产生自重亚硫酸盐修饰的DNA的PCR扩增产物。

检测甲基化序列的可选方法是甲基化特异性PCR，其也是基于DNA的重亚硫酸盐修饰，随后是靶向富CpG序列的特异性PCR反应。

对于本发明的目的而言，也可以使用对MAL具有特异性的抗体(即，抗MAL抗体)或核酸探针检测生物流体或组织中MAL多肽(使用抗体)或MAL多核苷酸(使用核酸探针)的存在。基于MAL序列中任何编码序列区和调控序列区的寡核苷酸引物，可用于扩增DNA，例如通过PCR。

当使用PCR引物、核酸探针或限制性内切核酸酶时，分析MAL序列的5’调控区、第一内含子序列和编码区(如图1所示)。

可以使用含有可检测量的MAL多核苷酸或MAL多肽抗原的任何样本。也可以通过本领域技术人员已知的RNA原位方法，例如原位杂交，分析核酸。根据本发明的方法用于检测的优选样品包括如(宫颈或阴道)刮片、宫颈-阴道冲洗液或拭子和/或(宫颈)活组织检查等的这类样本。尽管所述个体可以是任何哺乳动物，但优选所述个体是人。

本发明的方法可以使用与MAL多肽免疫反应的抗体，其预测的氨基酸序列可作为GenBank登录号Np_002362.1获得，和3个可选择的转录本NP_071883.1、NP_071884.1、NP_071885.1或其免疫反应性片段。可以使用基本上由具有不同表位特异性的合并的单克隆抗体组成的抗体，以及不同的单克隆抗体制剂。单克隆抗体是通过本领域技术人员已知的方法从含有蛋白片段的抗原制备的(Kohler，et al.，Nature，256：495，1975)。

本发明所用的术语抗体意欲包括完整的分子以及其能与MAL上的表位决定簇结合的片段，例如Fab和F(ab’)2。本文所用的抗体也涉及具有抗原结合特异性的其他蛋白或非蛋白分子，例如微型抗体、拟肽类(peptidomimetics)和抗运载蛋白(anticalin)等。

单克隆抗体可用于本发明的诊断方法，例如，用于免疫测定中，其中它们以液相使用或与固相载体结合。另外，在这些免疫测定中的单克隆抗体可以用多种方法可检测地标记。可以使用本发明的单克隆抗体的免疫测定类型的实例，是直接或间接形式的竞争性或非竞争性免疫测定。这类免疫测定的实例是放射免疫测定(RIA)和夹心式(免疫)测定。使用本发明的单克隆抗体的抗原检测可以利用在正向、反向或同时模式运行的免疫测定进行，所述免疫测定包括生理学样品的免疫组织化学或免疫细胞化学测定。在不需要过多试验的情况下，本领域技术人员应当知道或容易地辨别其他免疫测定形式。

单克隆抗体可以与多种不同载体结合并用于检测MAL的存在。公知的抗体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙、淀粉酶、天然和变性纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁石。对于本发明的目的而言，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。本领域技术人员应当了解与单克隆抗体结合的其他合适的载体，或通过常规试验可以确定这类载体。

在进行测定时，需要在孵育液(incubation medium)中包含某些“阻断剂”(通常添加标记的可溶性抗体)。添加“阻断剂”以确保存在于试验样品中的非特异性蛋白、蛋白酶或抗MAL免疫球蛋白的抗异嗜性的免疫球蛋白不交联或不破坏固相支持物上的抗体或放射标记的指示剂抗体，产生假阳性或假阴性结果。因此，“阻断剂”的选择会基本上增加本发明所述测定的特异性。与测定中所用的那些抗体同类或同亚类(同种型)的许多非相关(即非特异性)抗体(例如，IgG1、IgG2a和IgM等)可用作“阻断剂”。为了保持适当的敏感度但仍然抑制任何由样本中互相存在的交叉反应蛋白产生的不需要的干扰，“阻断剂”的浓度(通常1-100μg/μL)是重要的。

检测MAL产生、MAL基因表达或因此的病症的诊断方法，包括提供用于检测的样品的方法，所述样品包含来自宫颈或其他组织的细胞制剂。优选地，以涂片或其他细胞学样品的形式，提供这类样品。

对从哺乳动物优选人获得的细胞或组织样品，适当地进行预处理，以允许包含于所述样品中的受试细胞的靶细胞组分与检测MAL的试剂接触，并且与可供比较的正常细胞相比，检测MAL的降低。可以将样品固定于合适的支持物上，以允许观察个体细胞。公知的支持材料的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚氨酯，任选地以层提供从而改善细胞粘附和样品的固定，例如聚-L-赖氨酸层或硅烷层。例如，可以将宫颈涂片或活组织检查制备成用于巴氏(Pap)检测或技术人员已知的任何适当修饰物，并且可以通过允许试剂与靶组分适当地接近的程序固定。在本发明的某些实施方案中，以常规涂片样品或宫颈细胞的薄层制剂或液基细胞学样品或本领域技术人员已知的任何其他种类制剂提供细胞学样本。如果需要贮藏，常规程序使用缓冲的福尔马林固定随后，石蜡包埋，该程序提供保存良好的组织基础结构。为了允许免疫组织化学或免疫荧光染色，样品材料的抗原性必须恢复或暴露。恢复甲醛交联蛋白抗原性的一个方法涉及使用蛋白水解酶处理样品。该方法导致该材料(部分地)消化，并且仅仅原始蛋白的片段可被抗体接近。

恢复甲醛交联抗原免疫反应性的另一方法涉及使用热的热处理或样品的高能处理。这类方法描述于例如，美国专利第5,244,787号。然而，从甲醛固定的组织恢复抗原的另一方法是使用压力锅，或与微波组合或以高压灭菌器的形式，例如描述于Norton，1994.J.Pathol.173(4)：371-9和Taylor et al.1996.Biotech Histochem 71(5)：263-70中。

可以使用甲醛的多个供选方案，例如乙醇、甲醇、丁醇、methacarn或乙二醛、柠檬酸丙酮，或可以组合使用固定剂。可选择地，可以在进一步处理之前风干样品。

为了允许用核酸探针检测，对于福尔马林固定和石蜡包埋的材料，必须恢复或暴露样品材料。一个方法涉及使用蛋白水解酶处理和使用多聚甲醛后固定。在盐酸中的变性步骤可以先于蛋白水解消化。该方法导致材料(部分地)消化，从而允许探针进入靶标。对于非福尔马林固定的材料，例如冷冻材料，不需要具体暴露程序。在杂交样品之前，可以通过三乙醇胺缓冲液处理乙酰化样品。

然后，将核酸探针或抗体与样品材料在合适的缓冲液中接触，并且允许其与它们的核酸或蛋白靶标特异性杂交或结合。当核酸探针或抗体与靶组分特异性结合后，标记的探针和/或抗体可以通过如下述方法的方法检测：激光扫描共聚焦显微镜、亮视野显微镜，任选地与荧光相关细胞分选组合的流式细胞仪或本领域技术人员公知的这些技术的改型。

在本发明方法的一个实施方案中，与可供比较的正常细胞相比，检测受试细胞中MAL启动子甲基化的增加和/或受试细胞中MAL产生的降低。

本发明还提供了如权利要求19所定义的组件试剂盒(kit of parts)，用于在个体的受试细胞中检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的具有浸润性潜能的HPV诱发的前期病变和HPV诱发的浸润性癌的方法。此类试剂盒可以适当地包含采集(宫颈)刮片的刷子和铲子以及填充有采集介质的容器以采集受试细胞。可选择地，会包括由灌洗器、一次性女性导尿管和具有灌洗液的容器组成的采样装置，以通过宫颈-阴道灌洗采集宫颈细胞。本发明的试剂盒可以包含用于检测MAL启动子甲基化或检测MALmRNA表达的引物和探针。在另一实施方案中，本发明的试剂盒可以包含用于检测宫颈刮片或组织样本中MAL蛋白表达的抗体和试剂。

本发明的组件试剂盒包含用于检测MAL启动子甲基化或MAL表达的工具，例如MAL特异性抗体、甲基化敏感的限制性酶或能与图1的核苷酸序列杂交的探针或引物。

仍然在本发明试剂盒的另一可选择的实施方案中，检测MAL启动子甲基化或MAL表达的工具可以与检测HPV感染，优选检测高危型HPV感染的工具组合。这类工具可以包含HPV特异性引物或探针、HPV感染的蛋白标志物甚至本领域已知的HPV感染的替代标志物。在本发明试剂盒的另一可选择的实施方案中，检测MAL启动子甲基化或MAL表达的工具可以与检测CADM1(Genbank登录号NM_014333.) 启动子甲基化的工具组合。使用类似于上文所述的用于检测MAL启动 子甲基化的那些方法进行CADM1启动子甲基化的检测。

现通过下列非限定性的实施例说明本发明。

实施例

实施例1.在宫颈癌和高度前期病变中的MAL沉默

通过对宫颈癌进行微阵列表达分析，将MAL鉴定为宫颈癌中与正常上皮对照样品相比最显著地下调的基因之一。

随后对宫颈癌的独立验证组进行的定量反转录酶PCR(qRT-PCR)分析证实了在这些肿瘤中MAL mRNA表达的下调。与8％的正常对照(n＝12)相比，在100％的宫颈癌和93％的高度CIN病变(n＝15)中检测到MAL mRNA表达降低。

体外研究揭示了MAL失活在宫颈癌发展中的功能性参与，因为MAL在含有宫颈癌细胞系SiHa的HPV16中的异常超表达，导致增殖降低并抑制不依赖支持物的生长。

实施例2：MAL基因沉默在宫颈致癌作用中的功能角色

为确定MAL在宫颈致癌作用中的潜在功能作用，我们用MAL表达载体(SiHa_MAL)或空对照载体(SiHa(-))稳定地转染了含有宫颈癌细胞系SiHa的HPV16细胞。通过RT-PCR证实了SiHa_MAL转染子中的异常MAL表达。检查两种转染子的增殖速率、迁移能力和在软琼脂糖中生长的能力。SiHa_MAL转染子与SiHa(-)细胞相比，表现出增殖速率下降43％，表明MAL的异常表达在体外具有抗增殖效果。使用刮片测定，我们发现，在SiHa_MAL转染子中，迁移受到强烈抑制。而且，与携带空载体的SiHa转染子相比，SiHa_MAL细胞表现出不依赖支持物的生长下降53％。

综上所述，这些数据表明，MAL基因沉默是宫颈癌发展中的基本生物事件，并且在宫颈癌细胞中，MAL的重新表达有效抑制肿瘤细胞的完全确立的生长特征，例如增殖、迁移和不依赖支持物的生长。

实施例3：启动子超甲基化导致的MAL沉默是高度CIN病变、 宫颈鳞状细胞癌、鳞状细胞腺癌、腺癌和神经内分泌癌中的频发事件。

MAL基因位于2q11-13，其是我们在宫颈癌中未发现周期性染色体缺失的区域，这一事实促使我们调查潜在的转录基因外调控。用甲基化和组蛋白去乙酰化抑制剂处理宫颈癌细胞系和HPV永生细胞系导致MAL mRNA表达的强烈上调，标示MAL下调确实依赖于基因外控制机制。

然后，我们通过靶向MAL启动子中两个区(即，相对于第一个ATG的-680至-573和-92至-7；分别称为M1和M2)的定量甲基化特异性PCR(qMSP)分析宫颈组织样本中MAL启动子甲基化。选择管家基因β肌动蛋白(ACTB)作为总DNA输入测量的参考。对于所有样本，将所测量的甲基化DNA的量除以ACTB的量，并且将具有高于预定界限(例如，平均比率正常对照+2.58x标准偏差)的比率的样品分类为阳性。

我们发现M1和M2区两者的甲基化，后文称为密集甲基化，在正常宫颈对照样品中检测不到(n＝22)，在32％的CIN1病变(n＝66)、80％的CIN3病变(n＝64)和94％的宫颈鳞状细胞癌(n＝94)中可检测到。

在宫颈鳞状细胞癌之后，我们也分析宫颈腺癌中MAL启动子甲基化。由于宫颈腺癌的发病率在具有全国宫颈筛查计划的国家里保持相同或甚至增长，占宫颈癌高达20％的腺癌是特别感兴趣的。这表示相同或甚至增长，占宫颈癌高达20％的腺癌是特别感兴趣的。这表示宫颈腺癌及其腺前期病变，即原位腺癌(ACIS)，经常被基于细胞学的筛查遗漏。基于宫颈鳞状细胞癌和宫颈腺癌间比较遗传学和表观遗传学研究，已经发现这两种肿瘤组织型通过不同的致癌途径发展(Dong et al.，2001，Kang et al.，2005，Wilting et al.，2006，Henken et al.，2007)。因此，能够检测宫颈鳞状细胞癌的大多数生物标志物不必检测宫颈腺癌。充分研究的实例是甲基化标志物CADM1，其在83％的鳞状细胞癌但仅在23％的腺癌中表现出甲基化(Overmeer et al.，2008)。另一实例来自对9个基因(APC、DAPK1、CDH1、HLTF、hMLH1、p16、RASSF1A、THBS1和TIMP3)的甲基化研究，表明CDH1和DAPK1在鳞状细胞癌中更频繁地甲基化，而HLTF、TIMP3、RASSF1A和APC在腺癌中更频繁地甲基化(Kang et al.，2005)。在分析p16、APC、HIC1、DAPK、MGMT和CDH1甲基化的研究中获得类似的结果，其中发现APC和HIC1在腺癌中显著更频繁地甲基化，而另一方面，p16和DAPK主要在鳞状细胞癌中甲基化(Dong et al.，2001)。

有趣地是，MAL启动子甲基化似乎是例外，因为与大多数抑制标志物相反，其以与鳞状细胞癌相似的频率检测宫颈腺癌；即93％(26/28)的腺癌在M1和M2区两者中表现出MAL启动子甲基化。对于宫颈腺鳞癌和神经内分泌癌，获得了相似的结果。

因此，MAL启动子甲基化似乎是所有宫颈癌组织型的通用甲基化标志物。

实施例4.宫颈刮片中MAL mRNA表达和MAL启动子甲基化降 低的检测

使用参与基于群体筛查试验的女性的嵌套病例对照设计(nested case-control design)，我们研究了，与在18个月的追踪期内诊断出至多CNI1的hrHPV阳性女性(即对照)相比，在18个月的追踪中诊断出≥CIN2(包括1例癌)的hrHPV阳性女性(即病例)的宫颈刮片。将这些女性的原始宫颈刮片采集于保存RNA和DNA的保存培养基中。

对分离自这些刮片的子集的RNA应用qRT-PCR表明，与28％的对照相比，在71％的病例中，MAL表达降低。另外，仅在13％(3/21)的具有hrHPV阴性刮片的女性中发现MAL表达降低。

据我们所知，我们最早证明在宫颈刮片中检测到mRNA下调。迄今为止，在宫颈刮片中的表达分析被限制在上调的基因并且大多数涉及蛋白表达分析而不是mRNA表达分析，因而p16是充分研究的实例。

接下来，对参与基于群体宫颈筛查的hrHPV GP5+/6+PCR阳性女性的一大系列宫颈刮片进行甲基化分析，在这些女性中，在18个月的追踪内诊断出≥CIN2(Bulkmans et al.，2007；Hesselink et al.2006)。在基线水平，这些女性包括原始具有非正常细胞学(即，接近核异常或更坏)和正常细胞学的女性，后者仅通过阳性hrHPV检测发现。另外，包括在18个月的追期内具有正常细胞学和CIN1或更好的hrHPV阳性对照女性。在一个或两个MAL区的甲基化从具有正常细胞学的hrHPV阳性对照女性中的31％和在基线水平分别具有正常细胞学和异常细胞学的≥CIN2女性的65％和84％之间变动。通过将后两组组合，在79％的具有≥CIN2的女性中发现MAL甲基化。

实施例5：在自我取样样本中MAL启动子甲基化

我们随后在前瞻研究过程中分析了使用VibaBrush(Rovers Medical Devices，Oss，the Netherlands)或Pantarhei采样器采集(Pantarhei Devices，Zeist，the Netherlands)采集的自我取样的宫颈-阴道样本，在所述研究中，将总计45,000份自我取样包发放给甚至在第二次提示后没有对定期宫颈筛查邀请回应的女性(参阅www.trialregister.nl，Trial no.NTR962(PROHTECT trial))。约三分之一的这些女性将自我取样样本返还给实验室。这些样品适于HPV PCR分析(即β球蛋白PCR阳性)，且通过hrHPV GP5+/6+PCR检测在该人群中产生与通过定期筛选在匹配的回应者女性人群中发现的至少一样多的≥CIN2病变(Bais et al.，Int J Cancer：2007，120：1505-1510)。

针对MAL M1和M2启动子区，通过qMSP，检测了总计186位在追踪中无临床有意义的疾病证据的hrHPV阳性女性和68位具有异常追踪涂片和潜在病变≥CIN3的女性。与28％的在追踪中无临床有意义的疾病证据的女性相比，随后被诊断为≥CIN3的62％的自我取样女性，检测为一个或两个MAL启动子区阳性。这些数据表明，对自我取样材料的MAL启动子甲基化分析是相当可行的并且会改善潜在的高度宫颈疾病的检测。

实施例6：在活组织宫颈刮片和自我取样的样本中，向MAL甲基 化分析加入CADM1启动子甲基化检测

以增加≥CIN2灵敏度为目标，我们分析了另一甲基化标志物即CADM1(Genbank登录号NM_144333；也参见实施例3)的附加值，前文表明其也功能性参与宫颈致癌作用(Steenbergen et al.，2004；Overmeer et al.，2008)。

通过将MAL的两个启动子区的甲基化分析与CADM1的一个启动子区组合，甲基化阳性高度CIN病变数量从80％增加到91％(如果至少一个这些区的结果是阳性，则评分为阳性)。相反，该CADM1区的增加分析(adding analysis)不影响正常宫颈和低度CIN病变的阳性。增加其他基因的甲基化数据不显著地增加灵敏度数字。因此，我们推断，该组合为≥CIN2/3提供最佳标志物组(marker panel)。

通过向宫颈刮片添加CADM1(Genbank登录号NM_014333)甲基 化分析，在具有异常细胞学的女性中检测出5％另外的≥CIN2病变，导致总体≥CIN2检出率为83％。

随后对自我取样样本进行的组合MAL和CADM1启动子甲基化分析，导致随后被诊断为≥CIN3的自我取样的hrHPV阳性女性中69％的阳性。相反地，只有约三分之一的在追踪中无临床有意义的疾病证据的hrHPV阳性女性表现出任一或二个标志物甲基化。

在将甲基化数据与hrHPV基因分型数据组合之后，看起来84％的诊断为≥CIN3的女性具有CADM1甲基化、MAL甲基化和/或存在HPV16，而在追踪中没有临床有意义的疾病证据的标志物阳性、hrHPV阳性女性的数量没有发生显著的变化。

Claims (16)

1.在有需要的个体中检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度癌前病变或HPV诱发的浸润性癌的方法，所述方法包括将所述个体的受试细胞的细胞组分与检测所述受试细胞的细胞组分的试剂离体接触，所述细胞组分选自编码MAL多肽的核酸和MAL多肽，并且与可供比较的健康细胞相比，确定所述受试细胞中所述细胞组分表达水平的降低。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括与所述可供比较的正常细胞相比，检测所述受试细胞中CADM1启动子和/或富CpG基因组序列甲基化的增加。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述HPV诱发的高度癌前病变或HPV诱发的浸润性癌是高度恶性前宫颈病变或浸润性宫颈癌。

4.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述HPV诱发的浸润性癌是高危型HPV诱发的浸润性癌。

5.如上述权利要求中任一项所述的方法，其中所述细胞组分是编码所述MAL多肽的核酸和调控区，并且所述试剂靶向所述受试细胞中的所述核酸。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述核酸是RNA，优选mRNA。

7.如权利要求1-3中任一项所述的检测HPV诱发的高度癌前病变或HPV诱发的浸润性癌的方法，其中所述检测是与所述可供比较的正常细胞相比，所述受试细胞中所述MAL启动子和/或富CpG基因组序列甲基化的增加。

8.如权利要求7所述的方法，其中所述方法还包括与所述可供比较的正常细胞相比，检测所述受试细胞中所述CADM1启动子和/或富CpG基因组序列甲基化的增加。

9.如权利要求7或8所述的方法，其中所述试剂是限制性内切核酸酶，优选甲基化敏感性限制性内切核酸酶。

10.如权利要求5或6所述的方法，其中所述试剂是与所述核酸结合的核酸探针或引物。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述核酸探针或引物具有可检测的标记。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中所述核酸探针具有选自以下的核苷酸序列：

a)能在严紧条件下与如图1所示的MAL序列的5’调控区或编码区和内含子区杂交的多核苷酸序列；

b)与a)的多核苷酸具有至少70％同一性的多核苷酸；

c)与a)的多核苷酸互补的多核苷酸；以及

d)包含a)或b)的核苷酸的至少15个碱基的多核苷酸。

13.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述细胞组分是MAL多肽。

14.如权利要求13所述的方法，其中所述试剂是抗MAL抗体。

15.分子诊断标志物在检测与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度癌前病变或HPV诱发的浸润性癌中的用途，其中所述标志物指示MAL启动子甲基化、CADM1启动子甲基化和/或MAL mRNA表达或MAL多肽表达。

16.用于检测个体的受试细胞中与T淋巴细胞成熟相关蛋白(MAL)相关的HPV诱发的高度癌前病变或HPV诱发的浸润性癌的方法中的组件试剂盒，所述试剂盒包含

检测MAL启动子甲基化或MAL表达的工具，其中所述工具包含探针、引物和/或对MAL具有特异性或对图1的MAL核苷酸序列具有特异性的抗体；和/或

检测CADM1启动子甲基化的工具；和/或

检测HPV感染的工具，其中所述工具包含对HPV具有特异性的探针和引物。

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