ES2298467T3 - Deteccion de canceres invasivos inducidos por hpv y sus lesiones precursoras con potencial invasivo. - Google Patents
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Abstract
Método para la detección de cáncer invasivo inducido por HPV o lesiones precursoras de los mismos asociadas al supresor de tumor de cáncer de pulmón 1 (TSLC1) en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicho método la puesta en contacto ex vivo de un componente celular seleccionado del grupo que consiste en un ácido nucleico que codifica para el polipéptido TSLC1 y el polipéptido TSLC1 de una célula de prueba del sujeto con un reactivo que detecta el nivel de dicho componente en la célula de prueba y determinando una disminución en el nivel de expresión de dicho componente celular, comparado con una célula saludable comparable.
Description
Detección de cánceres invasivos inducidos por
HPV y sus lesiones precursoras con potencial invasivo.
La presente invención es del campo de la
medicina y se refiere a un marcador molecular para el diagnóstico
de cáncer invasivo inducido por el papilomavirus humano (HPV) y sus
lesiones precursoras, tales como cáncer invasivo cervical, lesiones
premalignas cervicales con potencial invasivo y cáncer no cervical
invasivo de alto riesgo inducido por el papilomavirus humano (HPV).
En particular, la presente invención se refiere al uso del gen
TSLC1 como marcador para el cáncer invasivo inducido por el
HPV y sus lesiones precursoras.
El cáncer del cérvix uterino es el segundo
cáncer más común en las mujeres en todo el mundo y es el responsable
de aproximadamente 250.000 muertes por cáncer cada año.
El desarrollo del cáncer cervical está
caracterizado por una secuencia de lesiones premalignas, denominada
neoplasia intraepitelial cervical (CIN), que está clasificada en
grados del I al III, refiriéndose a displasia leve (CIN I),
displasia moderada (CIN II) y displasia severa/carcinoma in
situ (CIN III).
En la década pasada estaba bien establecido que
la carcinogénesis cervical se iniciaba por una infección con
papilomavirus humano (HPV) de alto riego. La expresión de los
oncogenes virales E6 y E7, que alteraban la ruta de los supresores
de tumores p53 y Rb, respectivamente, ha mostrado ser esencial tanto
en el comienzo de la oncogénesis como en el mantenimiento de un
fenotipo maligno. Sin embargo, siguiendo el patrón de un proceso de
carcinogénesis multietapas, se requieren alteraciones adicionales en
el genoma de la célula huésped para la progresión de una célula
infectada por el hr-HVP a un carcinoma invasivo.
Conforme a los múltiples eventos inherentes a la
carcinogénesis cervical está la observación de que sólo una pequeña
proporción de mujeres infectadas con HPV de alto riesgo
desarrollarán lesiones cervicales premalignas de alto grado (CIN
III) o cáncer cervical, y en la mayoría de las mujeres con lesiones
cervicales premalignas, las lesiones remiten espontáneamente.
Sin embargo, en la actualidad no existen
marcadores para predecir que lesiones premalignas remitirán o en
última instancia progresarán a cáncer cervical. Por lo tanto, la
práctica médica general comprende el tratamiento de todas las
mujeres con CIN II y CIN III morfológicamente confirmado, con el
objetivo de prevenir el desarrollo de cáncer cervical. En
consecuencia, muchas mujeres son tratadas innecesariamente e
innecesariamente preocupadas.
Sorprendentemente se ha encontrado que el gen
supresor de tumor de cáncer de pulmón (TSLC1) está implicado
como gen supresor de tumor en la carcinogénesis cervical y que el
silenciamiento de TSLC1, o un bajo nivel de expresión del
gen TSLC1, es un determinante importante en la carcinogénesis
cervical. Comparado con su papel en el desarrollo de un subconjunto
carcinomas de pulmón, el silenciamiento de TSLC1 juega un
papel aún más predominante en la carcinogénesis cervical. Por lo
tanto, TSLC1 y los productos génicos del mismo proporcionan
marcadores moleculares valiosos para diagnosticar las lesiones
cervicales invasivas y/o predecir (mejor) que lesiones premalignas
tienen mayores posibilidades de progresar a cáncer cervical.
El cáncer cervical está casi exclusivamente
asociado con la infección con papilomavirus humano (HPV). El
papilomavirus humano constituye un grupo de más de 100 tipos de
virus, identificados por variaciones en la secuencia de ADN. Los
diversos HPVs causan una variedad de enfermedades cutáneas y
mucosales. Ciertos tipos pueden causar verrugas, o papilomas, que
son tumores benignos (no cancerosos). Se ha encontrado que otros
causan carcinoma invasivo del cérvix uterino.
Los HPVs están generalmente clasificados en
tipos de alto riesgo y de bajo riesgo, basados en su capacidad de
inducir cambios malignos en las células infectadas. Los HPVs de bajo
riesgo, tales como 1, 2, 4, 6, 11, 13 y 32, están asociados
principalmente con lesiones benignas o verrugas comunes, mientras
que los de alto riesgo, tales como 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59, 68, 73 y 82, están asociados principalmente con
lesiones epiteliales premalignas y malignas. Estos HPVs de alto
riesgo causan crecimientos que son usualmente planos y casi
invisibles, comparados con las verrugas causadas por los del tipo de
bajo riesgo, por ejemplo HPV-6 y
HPV-11.
Por lo tanto, la presente invención no es
adecuada solamente para detectar el cáncer cervical invasivo
asociado con el gen supresor de tumor de cáncer de pulmón 1
(TSLC1), sino también para otros cáncer invasivos que son
inducidos por HPV, particularmente de los del tipo de alto riesgo, y
proporciona un método para la estimación del riesgo de que las
lesiones premalignas se conviertan en invasivas.
Por consiguiente, la presente invención, como se
define en la reivindicación 1, da a conocer métodos de detección de
cáncer invasivo inducido por HPV y sus lesiones precursoras
asociadas al gen supresor de tumor de cáncer de pulmón
(TSLC1), en una persona que los necesite, comprendiendo dicho
método el contacto de un componente celular de una célula de prueba
del sujeto con un reactivo, que detecte los niveles del componente
celular en la célula de prueba y determine una modificación en el
nivel del componente celular en la célula de prueba, en comparación
con una célula comparable saludable, en el que el componente celular
indica el nivel de TSLC1 en la célula y la modificación
indica la presencia de cáncer invasivo inducido por HPV.
Los cánceres invasivos inducidos por HPV o las
lesiones precursoras de los mismos muy adecuados en el contexto de
la presente invención son cánceres cervicales invasivos y las
lesiones cervicales premalignas con potencial invasivo, pero
también cánceres invasivos y lesiones premalignas que son inducidas
por HPV en otros tejidos, tales como los de la cavidad oral,
orofaringe, ano, recto, pene, vulva, etc.
Una célula de prueba puede ser una célula
neoplásica, una célula de proliferación cervical o cualquier otra
célula en la que ha de ser detectada la presencia de un cáncer
invasivo inducido por HPV o una lesión precursora del mismo
asociada con el supresor de tumor de cáncer de pulmón 1.
En otra realización, la presente invención, como
se define en la reivindicación 1, da a conocer métodos de detección
de cánceres invasivos inducidos por HPV y sus lesiones precursoras
asociadas con el supresor de tumor de cáncer de pulmón 1
(TSLC1) en una persona que lo necesite, comprendiendo dicho
método el contacto de un componente celular determinado de una
célula de prueba con un reactivo que detecta TSLC1 y detecta
una reducción de TSLC1, en comparación con una célula
comparable normal, preferiblemente en dicha detección se determina
un aumento de la metilación del promotor TSLC1 en la célula
de prueba y/o una producción reducida de TSLC1 en la célula de
prueba, si se comprara con una célula comparable normal.
En otra realización, la presente invención da a
conocer métodos de tratamiento de cánceres invasivos inducidos por
HPV de alto riesgo y sus lesiones precursoras, asociados a la
modificación de la producción de TSLC1 en células de prueba en una
persona que lo necesite, comprendiendo dicho método el contacto de
células de un paciente que sufre de dicho cáncer con una cantidad
terapéuticamente efectiva de un reactivo que incrementa el nivel de
TSLC1 en las células de prueba.
En otro aspecto, la presente invención se
refiere al uso de marcadores moleculares para el diagnóstico, como
se define en la reivindicación 21, para la detección de cánceres
invasivos inducidos por HPV y sus lesiones precursoras, asociados
con el supresor de tumor de cáncer de pulmón 1 (TSLC1), en los que
dichos marcadores indican la metilación del promotor TSLC1,
la expresión de ARNm asociado con la producción del polipéptido
TALC1 y/o la pérdida alélica del cromosoma 11q23. Mediante dicho
uso, se puede determinar el riesgo de progresión a cáncer
invasivo.
invasivo.
La Figura 1 muestra la región regulatoria
5'TSLC1 (-894 a -1) y las secuencias codificante y transcrita
no codificante 3' (1 a 1456), derivadas de los códigos de acceso al
Genbank AP_003172 y NM_014333, respectivamente. Los codones de
inicio y parada se representan en cursiva y están subrayados.
"Expresión" se refiere a la transcripción
de un gen a ARN (ARNr, ARNt) estructural o ARN mensajero (ARNm) y,
si es aplicable, a la posterior traducción a proteína.
El término "cáncer invasivo inducido por
HPV" se refiere a un carcinoma inducido por un HPV de alto
riesgo, que invade el tejido circundante.
El término "cáncer cervical invasivo" se
refiere a un carcinoma cervical que invade el tejido
circundante.
Los términos "lesión premaligna" y
"lesión precursora" se refieren a un estado en la evolución
celular multietapas del cáncer con una posibilidad fuertemente
incrementada de progresar a carcinoma. Con la morfología clásica,
el patólogo es incapaz de predecir en el paciente individual cuál de
estas lesiones progresará o remitirá. La presente invención se
refiere a un método que puede predecir la progresión a cáncer
invasivo.
El término "potencial invasivo" se refiere
al potencial para invadir el tejido circundante y consecuentemente
convertirse en maligno.
El término "lesión premaligna cervical" se
refiere a un estado en la evolución celular multietapas a cáncer
cervical con una posibilidad fuertemente incrementada de progresar a
carcinoma cervical. Con la morfología clásica, el patólogo es
incapaz de predecir en el paciente individual cuál de estas lesiones
progresará o remitirá.
El término "capaz de hibridarse
específicamente a" se refiere a una secuencia de ácido nucleico
capaz de realizar un apareamiento específico con bases de una
secuencia complementaria de ácido nucleico y enlazarse a las mismas
para formar un ácido nucleico doble.
Un "complemento" o "secuencia
complementaria" es una secuencia de nucleótidos que forma un
puente de hidrógeno doble con otra secuencia de nucleótidos, según
las reglas de apareamiento de bases de Watson-Crick.
Por ejemplo, la secuencia de bases complementaria de
5'-AAGGCT-3'es
3'-TTCCGA-5'.
El término "condiciones severas de
hibridación" se refiere a condiciones de hibridación que afectan
la estabilidad de los híbridos, por ejemplo, temperatura,
concentración salina, pH, concentración de formamida y similares.
Estas condiciones son optimizadas empíricamente para maximizar las
uniones específicas y minimizar las uniones no específicas del
cebador o la sonda a su secuencia diana del ácido nucleico. El uso
de los términos incluye referencias a las condiciones bajo las que
una sonda o cebador se hibridará con su secuencia diana, en un
grado detectablemente mayor que otras secuencias (por ejemplo, al
menos 2 veces por encima del fondo). Las condiciones severas son
secuencias dependientes y serán diferentes en diferentes
circunstancias. Secuencias más largas hibridarán específicamente a
temperaturas mayores. Generalmente, las condiciones severas son
seleccionadas para que estén 5ºC por debajo del punto de fusión
térmica (Tm) para la secuencia específica a una fuerza iónica y pH
definidos. Tm es la temperatura (bajo fuerza iónica y pH definidos)
a la que el 50% de una secuencia diana complementaria híbrida con
una sonda o cebador coincidiendo perfectamente. Comúnmente, las
condiciones severas serán aquellas en las que la concentración de
sal es menor de aproximadamente 1,0 M de ión Na, comúnmente de
aproximadamente 0,01 a 1,0 M de concentración de ión Na (u otras
sales) a pH 7,0 a 8,3 y la temperatura es de al menos
aproximadamente 30ºC para sondas o cebadores pequeños (por ejemplo,
de 10 a 50 nucleótidos) y de al menos aproximadamente 60ºC para
sondas o cebadores grandes (por ejemplo, más de 50 nucleótidos).
Las condiciones severas pueden ser logradas también con la adición
de agentes desestabilizadores, tal como formamida. Condiciones
ejemplares de baja severidad o "condiciones de severidad
reducida" incluyen la hibridación con una solución tampón de 30%
de formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37ºC y un lavado en 2x SSC a 40ºC.
Condiciones ejemplares de alta severidad incluyen la hibridación en
50% formamida, 1M NaCl, 1% SDS a 37ºC, y un lavado en 0,1x SSC a
60ºC. Los procedimientos de hibridación son bien conocidos en el
estado de la técnica y se han descrito en, por ejemplo, Ausubel y
otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons
Inc., 1994.
El término "oligonucleótido" se refiere a
una secuencia corta de monómeros nucleotídicos (usualmente de 6 a
100 nucleótidos) unidos por enlaces de fósforo (por ejemplo,
fosfodiéster, alquil y aril fosfatos, fosforotioato), o por enlaces
no fosfóricos (por ejemplo, peptídico, sulfamato y otros). Un
oligonucleótido puede contener nucleótidos modificados que tengan
bases modificadas (por ejemplo, 5-metil citosina) y
grupos azúcares modificados (por ejemplo,
2'-O-metil ribosil,
2'-O-metoxietil ribosil,
2'-fluoro ribosil, 2'-amino ribosil
y similares). Los oligonucleótidos pueden ser moléculas naturales o
sintéticas de ADN de doble o simple cadena y ARN de doble o simple
cadena, con formas circulares, ramificadas o lineales e incluyen
opcionalmente dominios capaces de formar estructuras secundarias
estables (por ejemplo, estructuras de tallo-bucle y
bucle-tallo-bucle).
El término "cebador", tal como se usa en el
documento, se refiere a un oligonucleótido que es capaz de aparearse
con la diana de amplificación, permitiendo que una ADN polimerasa
se una, sirviendo de esta manera como un punto de iniciación de la
síntesis de ADN cuando se coloca bajo condiciones en la que es
inducida la síntesis del producto de extensión del cebador, que es
complementario con una cadena de ácido nucleico, es decir, en la
presencia de nucleótidos y un agente para la polimerización, tal
como ADN polimerasa, y a una temperatura y pH adecuados. El cebador
(de la amplificación) es preferiblemente de cadena simple para una
eficiencia máxima en la amplificación. Preferiblemente, el cebador
es un ribonucleótido oligodeoxi. El cebador tiene que ser lo
suficientemente largo para cebar la síntesis de los productos de
extensión en presencia del agente para la polimerización. Las
longitudes exactas de los cebadores dependerán de muchos factores,
incluyendo la temperatura y el origen del cebador. Un "par de
cebadores bidireccionales", como es usado en este documento, se
refiere a un cebador directo y a un cebador inverso, como es
comúnmente usado en el estado de la técnica de la amplificación de
ADN, tal como en la amplificación PCR.
El término "sonda" se refiere a una
secuencia de un oligonucleótido de cadena simple que reconocerá y
formará un doble enlace de hidrógeno con una secuencia
complementaria en una secuencia de ácido nucleico diana de un
analito o su ADNc derivado.
El gen TSLC1 (supresor de tumor de cáncer
de pulmón 1)(Código de acceso al GenBank NM_014333) ha sido
identificado como un gen supresor de tumor en la línea celular A549
de cáncer de pulmón mediante estudios funcionales de
complementación (Kuramochi y otros, 2001; Nature Genet 27,
427-430). Se mostró que la reexpresión de
TSLC1 en la línea celular A549 de cáncer de pulmón suprimió
la tumorigenicidad en ratones desnudos. Además, la pérdida o
supresión de la expresión de TSLC1 en otras líneas celulares
de cáncer de pulmón mostró estar correlacionada tanto con la
tumorigenicidad como con la metástasis de bazo a hígado en ratones
desnudos. Se encontró que la supresión de ARNm de TSLC1 en
estas líneas celulares correlacionó con la hipermetilación del
promotor de TSLC1.
Un análisis posterior de cánceres de células no
pequeñas de pulmón (NSCLC) reveló una pérdida alélica en 11q23.2,
el locus de TSLC1, en aproximadamente el 40% de los cánceres
de pulmón y dentro de este grupo de tumores con pérdida alélica
pudo ser detectada la hipermetilación del promotor del otro alelo en
un 85% de los casos.
TSLC1 codifica un miembro de la
superfamilia de inmunoglobulina de las moléculas de adhesión a
células (IgCAMs), que consisten en una amplia variedad de moléculas
de la superficie celular que están caracterizadas por una unidad de
inmunoglobulina. La proteína TSLC1 es una glicoproteína ligada a N
de 75 kDa, que está localizada en la membrana celular y está
involucrada en la adhesión intracelular a través de una
trans-interacción homofílica (Masuda y otros, 2002;
J Biol. Chem, 31014-31019).
Los presentes inventores han establecido que el
silenciamiento de TSLC1 es un evento frecuente en la líneas
celulares de cáncer cervical. Se ha descubierto que el
silenciamiento de TSLC1 es resultado de la hipermetilación
del promotor TSLC1, ya sea en combinación o no con una
pérdida alélica. Estudios in vitro mostraron una relación
funcional de la inactivación de TSLC1 tanto en el crecimiento
de anclaje independiente como en la tumorigenicidad de las células
de cáncer cervical, mientras que la inmortalidad y la proliferación
no se vieron afectadas. Esto apunta a una función del
silenciamiento de TSLC1 en la invasión del tumor en lugar de
en la proliferación. Se sabe que la pérdida de un gen putativo
supresor de tumor en el cromosoma 11 está involucrada en la
tumorigenicidad de células SiHa de cáncer cervical, y la pérdida
alélica en 11q22-23 ha sido detectada
frecuentemente en el carcinoma invasivo cervical. Estos resultados
indican que la inactivación de TSLC1 en 11q22-23
podría desempeñar un papel crucial en la invasión del cáncer
cervical.
El análisis de muestras de tejido cervical
reveló que la hipermetilación del promotor TSLC1 está
limitada a solamente un subconjunto de lesiones CIN de alto grado,
pero es detectable en hasta el 58% de los carcinomas cervicales
invasivos. Además, la hipermetilación del promotor TSLC1
puede ser detectada específicamente en frotis cervicales
provenientes de mujeres con cáncer cervical. El análisis de las
líneas celulares de cáncer cervical reveló que el silenciamiento de
la expresión de TSLC1 está presente en tanto como en el 91%
(10/11) de las líneas celulares. El silenciamiento de TSLC1
apareció no solamente asociado con la metilación del promotor, sino
también con la pérdida alélica en el locus TSLC1 y en eventos
aún desconocidos, sugiriendo que el porcentaje de cáncer cervical
que muestra la metilación del promotor TSLC1 es aún una
subestimación del porcentaje real de casos en los que el gen
TSLC1 es silenciado.
Por consiguiente, la presente invención da a
conocer, como se define en la reivindicación 1, métodos de detección
de cánceres invasivos inducidos por HPV y sus lesiones precursoras
asociadas con el supresor de tumor de cáncer de pulmón
(TSLC1) en un sujeto que lo necesite, o indicativo de los
mismos, comprendiendo dicho método el contacto de un componente
celular de una célula de prueba del sujeto con un reactivo que
detecta el nivel del componente celular en la célula de prueba y la
determinación de una modificación en el nivel del componente
celular en la célula de prueba, si se compara con una célula
comparable saludable, en el que el componente celular indica el
nivel de TSLC1 en la célula y la modificación indica la presencia de
cánceres invasivos inducidos por HPV y sus lesiones
precursoras.
precursoras.
La célula de prueba del sujeto puede comprender
una célula proveniente de una muestra de células de la piel (por
ejemplo, en el caso de verrugas y similares, presumiblemente
causadas por infecciones cutáneas de HPV), una muestra de células
mucosales, tales como las células cervicales y también otros
tejidos, tales como los de la cavidad oral, orofaringe, pene,
vulva, ano, recto y otros tejidos en los que serán detectado el
cáncer asociado con HPV. Todas estas muestras pueden ser utilizadas
como muestras en un método de la presente invención.
Preferiblemente, una muestra de células de un paciente comprende
células cervicales como células de prueba.
Un método de la presente invención es
particularmente adecuado para la detección de cánceres invasivos
inducidos por HPV y sus lesiones precursoras asociadas al supresor
de tumor de cáncer de pulmón 1 (TSLC1) que son inducidos por HPV de
alto riesgo. Un método de detección de cánceres invasivos inducidos
por HPV y sus lesiones precursoras asociadas al supresor de tumor
de cáncer de pulmón 1 (TSLC1), por consiguiente, puede estar
relacionado con la medición de la expresión de TSLC1, tal
como en la forma de medir los transcriptos del gen TSLC1 y/o
proteínas traducidas posteriormente por dichos transcriptos. También
un método de detección de cánceres invasivos inducidos por HPV y
sus lesiones precursoras puede comprender la medición de la
metilación del promotor TSLC1 como una indicación de la
capacidad de expresión de TSLC1 y/o de la capacidad de
producción de la proteína
TSLC1.
TSLC1.
La figura 1 muestra la región del promotor rica
en cg anterior al codón de inicio atg en el gen TSLC1 y la
región de codificación para la proteína TSLC1. La metilación de la
región del promotor rica en cg resultará en una disminución brusca
de la transcripción o incluso en un bloqueo completo de la
transcripción. Por lo tanto, la región del promotor proporciona una
secuencia marcadora positiva para la potencial expresión de este
gen. Alternativamente, la expresión del gen TSLC1 puede ser
detectada mediante la medición de los transcriptos del gen. Como
tal, la región codificante para la proteína TSLC1 en este gen
proporciona una secuencia marcadora para la detección de los
transcriptos de este gen. En otra alternativa, la expresión del gen
TSLC1 puede ser detectada mediante la medición de la
proteína TSLC1 directamente.
El componente de la célula de prueba con el que
se hace contacto puede así ser un ácido nucleico, tales como ADN o
ARN, preferiblemente ARN, o proteína. Cuando un componente celular
es proteína, el reactivo es comúnmente un anticuerpo
anti-TSLC1. Cuando el componente es un ácido
nucleico, el reactivo es comúnmente una sonda de ácido nucleico
(ADN o ARN) o un cebador (PCR). Usando dichas sondas o cebadores,
los productos de la expresión del gen, tales como ARNm, pueden, por
ejemplo, ser detectados. Alternativamente, cuando el componente
celular es un ácido nucleico, el reactivo puede ser también una
endonucleasa de restricción, preferiblemente una endonucleasa de
restricción sensible a la metilación para la detección de la
presencia de grupos metilo en el ácido nucleico de la célula de
prueba, siendo entonces dicho ácido nucleico de la célula de prueba
preferiblemente ADN.
El componente de la célula de prueba puede ser
detectado directamente in situ o puede ser aislado de otros
componentes celulares mediante métodos comunes conocidos para
alguien experto en la materia, antes de ponerse en contacto con el
reactivo (ver por ejemplo "Current Protocols in Molecular
Biology", Ausubel y otros 1995. 4th edition, John Wiley and
Sons; "A Laboratory Guide to RNA: Isolation, analysis and
synthesis", Krieg (ed.), 1996, Wiley-Liss;
"molecular Cloning: A laboratory manual", J. Sambrook, E.F.
Fritsch. 1989. 3 Vols, 2^{nd} edition, Cold Spring Harbor
Laboratory Press).
Los métodos de detección incluyen análisis,
tales como los análisis por transferencia "Southern" y
transferencia "Northern", protección a Rnasas, inmunoensayos,
hibridización in situ, PCR (Mullis 1987, Pat. U.S.A. No. 4
683 195, 4 683 202 y 4 800 159), LCR (Barany 1991, Proc. Natl. Acad.
Sci. U.S.A. 88:189-193; Solicitud EP No. 320 308),
3SR (Guatelli y otros, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
87:1874-1878), SDA (Pat. USA. Nos. 5 270 184 y 5
455 166), TAS (Kwoh y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86:1173-1177), Replicasa Q-Beta
(Lizardi y otros, 1988, Bio/Technology 6:1197), Amplificación en
Círculo Rodante (RCA) u otros métodos para la amplificación del
ADN. En un método alternativo, el ARN puede ser detectado por
métodos tales como NASBA (L. Malek y otros, 1994, Meth. Molec.
Biol. 28, Ch. 36, Isaac PG, ed., Humana Press, Inc. Totowa, N.J.) o
TMA.
Las sondas de ácido nucleico, cebadores y
anticuerpos pueden ser marcados de modo detectable, por ejemplo,
con un radioisótopo, un compuesto fluorescente, un compuesto
bioluminiscente, un compuesto quimioluminiscente, un metal quelante
o un enzima. Los expertos en la materia conocen otras marcas
adecuadas para unir a los reactivos o serán capaces de
determinarlos usando experimentación de rutina.
Otros métodos de detección incluyen análisis
tales como los que pueden ser realizados con conjuntos de ácidos
nucleicos (Ver, por ejemplo, Chee y otros, 1996, Science
274(5287):610-614). Por ejemplo, los
conjuntos de ADN pueden ser usados para la detección de ácidos
nucleicos según la presente invención. Tales conjuntos comprenden
oligonucleótidos con secuencias capaces de hibridizar bajo
condiciones severas con el componente ácido nucleico celular, del
que se detecta su nivel en un método de la presente invención.
Debido a que en la presente invención se muestra
que una disminución del nivel de la transcripción de TSLC1
es a menudo el resultado de la hipermetilación del gen TSLC1,
con frecuencia se desea determinar directamente si el gen
TSLC1 está hipermetilado. En particular, las áreas ricas en
citosina denominadas "islas CpG", que están en las regiones
reguladoras 5' de los genes, normalmente no están metiladas. El
término "hipermetilación" incluye cualquier metilación de
citosina en una posición en que está normalmente no metilada en la
secuencia del gen TSLC1 (por ejemplo, el promotor
TSLC1). La hipermetilación puede ser detectada, por ejemplo,
con tratamiento con endonucleasas de restricción del polinucleótido
(gen) TSLC1 y por análisis de transferencia "Southern". Por lo
tanto, en un método de la presente invención en el que el componente
celular detectado es ADN, el análisis con endonucleasas de
restricción es preferible para detectar la hipermetilación del gen
TSLC1. Se puede utilizar cualquier endonucleasa de
restricción que incluya CG como parte de su sitio de reconocimiento
y que esté inhibida cuando la C esté metilada. Endonucleasas de
restricción sensibles a la metilación, tales como BssHII, MspI,
NotI o HpaII, usadas solas o en combinación, son ejemplos de dichas
endonucleasas. Otras endonucleasas de restricción sensibles a la
metilación serán bien conocidas para un experto en la materia.
Otros métodos para la detección de
hipermetilación del promotor TSLC1 incluyen la modificación
de ADN por bisulfitos, en el que las citosinas no metiladas son
convertidas a un uracilo, mientras que las citosinas metiladas son
protegidas de la modificación química. La posterior amplificación
por PCR y secuenciación revelan si las citosinas en las islas CpG
son mantenidas, en caso de metilación, o sustituidas por un uracilo
en caso del estado no metilado. Otro método incluye el tratamiento
con endonucleasas de restricción, que incluyen CG como parte de su
sitio de reconocimiento, de un producto amplificado por PCR generado
a partir de ADN modificado por bisulfitos.
Un medio alternativo para analizar las
secuencias metiladas es un PCR específico para la metilación, que
está también basado en ADN modificado por bisulfitos, seguido de
reacciones PCR específicas que se dirigen a las secuencias ricas en
CpG objetivo.
Para el propósito de la invención, un anticuerpo
(es decir, un anticuerpo anti-TSLC1) o una sonda
específica de ácidos nucleicos para TSLC1 pueden ser usados para
detectar la presencia del polipéptido TSLC1 (usando anticuerpo) o
del polinucleótido TSLC1 (usando una sonda de ácidos
nucleicos) en fluidos biológicos o tejidos. Cebadores
oligonucleótidos basados en cualquier región de la secuencia
codificante y de la secuencia reguladora en la secuencia de
TSLC1 son útiles para la amplificación del ADN, por ejemplo,
por PCR.
Cuando se usan cebadores de PCR, sondas de
ácidos nucleicos o endonucleasas de restricción, se analizan la
región reguladora 5' y la secuencia codificante de la secuencia de
TSLC1.
Cualquier muestra que contenga una cantidad
detectable del polinucleótido TSLC1 o del antígeno
polipeptídico TSLC1 puede ser utilizada. El ácido nucleico también
puede ser analizado mediante métodos de ARN in situ que son
conocidos por los expertos en la materia, tales como la
hibridización in situ. Preferentemente, las muestras para
los análisis según los métodos de la presente invención incluyen
muestras, tales como frotis (cervical) y/o biopsias (cervicales) y
similares. Preferiblemente, frotis citológicamente anormales
(cervicales) y/o biopsias de lesiones (pre)malignas de alto
grado son usadas como muestras para el análisis. Aunque el sujeto
puede ser cualquier mamífero, preferiblemente el sujeto es un
humano.
Los métodos de la presente invención pueden
utilizar anticuerpos que inmunorreaccionan con el polipéptido
TSLC1, cuya secuencia de aminoácidos predicha está disponible en el
GenBank No de Acceso BAA75822, o fragmentos inmunorreactivos del
mismo. Pueden ser usados anticuerpos que consisten esencialmente en
una mezcla de anticuerpos monoclonales con diferentes
características epítopes, así como diferentes preparaciones de
anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales son
producidos, a partir un antígeno que contiene fragmentos de la
proteína, por métodos bien conocidos para un experto en la materia
(Kohler, y otros, Nature, 256: 495, 1975).
El término anticuerpo, tal como se utiliza en la
presente invención, tiene el propósito de incluir moléculas
intactas, así como fragmentos de los mismos, tales como Fab y F
(ab')2, que son capaces de enlazarse a un determinante epitópico de
TSLC1.
Pueden ser utilizados anticuerpos monoclonales
en los métodos de diagnóstico de la presente invención, por
ejemplo, en inmunoensayos en los que pueden ser utilizados en fase
líquida o enlazados a un transportador en fase sólida. Además, los
anticuerpos monoclonales en estos inmunoensayos pueden ser marcados
para ser detectados de diferentes maneras. Ejemplos de tipos de
inmunoensayos que pueden utilizar anticuerpos monoclonales de la
presente invención son inmunoensayos de competencia o no
competitivos, ya sea en formato directo o indirecto. Ejemplos de
dichos inmunoensayos son el radioinmunoensayo (RIA) y el ensayo
sándwich (inmunométrico). La detección de los antígenos utilizando
anticuerpos monoclonales de la presente invención puede ser
realizada utilizando inmunoensayos que pueden discurrir en modos
directo, inverso o simultáneo, incluyendo ensayos
inmunohistoquímicos en muestras fisiológicas. Un experto en la
materia sabrá, o podrá discernir fácilmente, otros formatos de
inmunoensayos sin una experimentación indebida.
Los anticuerpos monoclonales pueden ser
enlazados a diferentes transportadores y utilizados para detectar
la presencia de TSLC1. Ejemplos de transportadores muy conocidos son
el vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextran,
nailon, amilasas, celulosas naturales y modificadas,
poliacrilamidas, agarosas y magnetitas. La naturaleza del
transportador puede ser tanto soluble como insoluble para los
propósitos de la presente invención. Un experto en la materia
conocerá otros transportadores adecuados para unir a los anticuerpos
monoclonales, o será capaz de determinarlos usando experimentación
de rutina.
Cuando se realizan los ensayos puede ser
deseable incluir ciertos "bloqueadores" en el medio de
incubación (usualmente añadidos con el anticuerpo marcado soluble).
Los "bloqueadores" son añadidos para asegurar que proteínas no
específicas, proteasas o inmunoglobulinas antiheterofílicas contra
inmunoglobulinas anti-TSLC1, presentes en la
muestra experimental, no se enlacen de manera cruzada o destruyan
los anticuerpos sobre el soporte en fase sólida o el anticuerpo
indicador radiomarcado, para dar resultados falsos positivos o
falsos negativos. La selección de los "bloqueadores", por lo
tanto, puede sustancialmente agregar especificidad a los ensayos
descritos en la presente invención. Un número de anticuerpos no
relevantes (es decir, no específicos) de la misma clase o subclase
(isotipo), como los que se usan en los ensayos (por ejemplo, IgGI,
IgG2a, IgM, etc.) pueden ser usados como "bloqueadores". La
concentración de los "bloqueadores" (normalmente entre 1 y 100
g/\muL) puede ser importante, con el fin de mantener la
sensibilidad adecuada pero inhibiendo cualquier interferencia no
deseada al producirse proteínas reactivas cruzadas en la
muestra.
En la utilización de un anticuerpo monoclonal
para la detección in vivo de antígeno, el anticuerpo
monoclonal marcado para ser detectado se da en una dosis que es
diagnósticamente efectiva. El término "diagnósticamente
efectiva" significa que la cantidad de anticuerpo monoclonal
marcado para ser detectado es administrado en suficiente cantidad
para permitir la detección en el sitio que tiene el antígeno TSLC1
para el que el anticuerpo monoclonal es específico. La
concentración del anticuerpo monoclonal marcado para ser detectado
que es administrado debe ser suficiente, de tal manera que el
enlace a aquellas células que tengan TSLC1 sea detectable en
comparación con el fondo, dependiendo de las imágenes in
vivo o del método de detección empleado, tales como MRI, scan
CAT y similares. Además, es deseable que el anticuerpo monoclonal
marcado para ser detectado sea rápidamente eliminado del sistema
circulatorio con el fin de dar la mejor relación de la señal
diana/fondo.
Como regla, la dosis de anticuerpo monoclonal
marcado para ser detectado para el diagnóstico in vivo
variará en dependencia de factores tales como la edad, sexo y
extensión de la enfermedad del individuo. La dosis de anticuerpo
monoclonal puede variar desde aproximadamente 0,001 mg/m^{2} hasta
aproximadamente 500 mg/m^{2}, preferiblemente de 0,1 mg/m^{2}
hasta aproximadamente 200 mg/m^{2}, más preferiblemente de
aproximadamente 0,1 mg/m^{2} hasta aproximadamente 10 mg/m^{2}.
Dichas dosis pueden variar, por ejemplo, dependiendo de si se han
aplicado inyecciones múltiples, la carga del tumor y otros factores
conocidos por un experto en la materia.
Para el diagnóstico de imágenes in vivo,
el tipo de instrumento de detección disponible es un factor
principal en la selección de un radioisótopo determinado. El
radioisótopo escogido tiene que tener un tipo de desintegración que
sea detectable para un tipo de instrumento determinado. Otro factor
importante en la selección de un radioisótopo para el diagnóstico
in vivo es que la vida media del radioisótopo sea lo
suficientemente larga, de tal manera que sea aún detectable en el
momento de máxima absorción de la diana, pero suficientemente corta,
de tal manera que la radiación perjudicial con respecto al huésped
sea minimizada. Idealmente, un radioisótopo usado para el
diagnóstico in vivo carecerá de una emisión de partículas,
pero producirá un gran número de fotones en el rango de 140 a 250
keV, que puede ser fácilmente detectado por cámaras gamma
convencionales.
Para el diagnóstico in vivo, los
radioisótopos pueden enlazarse a las inmunoglobulinas ya sea directa
o indirectamente usando un grupo intermedio funcional. Los grupos
intermedios funcionales que son usados a menudo para enlazar
radioisótopos, que existen como iones metálicos, a inmunoglobulinas
son los agentes quelantes bifuncionales, tales como el ácido
dietilendiaminapentacético (DTPA) y el ácido
etilendiaminatetraacético (EDTA) y moléculas similares. Ejemplos
típicos de iones metálicos que pueden enlazarse a anticuerpos
monoclonales de la presente invención son ^{111}In, ^{97}Ru,
^{67}Ga, ^{68}Ga, ^{72}As, ^{89}Zr y ^{201}Tl.
Un anticuerpo monoclonal útil en los métodos de
la presente invención también puede ser marcado con un isótopo
paramagnético a los efectos del diagnóstico in vivo, tanto en
imágenes de resonancia magnética (MRI) o resonancia de espín
electrónico (ESR). En general, puede ser utilizado cualquier método
convencional para la visualización de imágenes para el diagnóstico.
Usualmente, son usados radioisótopos emisores de positrones y gamma
para imágenes de cámaras e isótopos paramagnéticos para MRI.
Elementos que son particularmente útiles en dichas técnicas
incluyen ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y
^{56}Fe.
Otros métodos diagnósticos, por ejemplo ex
vivo, para la detección de la producción de TSLC1, de la
expresión del gen TSLC1 o desórdenes en estos, incluyen
métodos en los que se proporciona una muestra para el análisis,
dicha muestra comprende una preparación celular del cérvix u otro
tejido. Preferiblemente dichas muestras son proporcionadas como
frotis. Con el fin de proporcionar esquemas de análisis eficientes,
son utilizados frotis citológicamente anormales (cervicales) y/o
biopsias de lesiones (pre)malignas de alto grado como
muestras para el análisis.
Una muestra de tejido obtenido de un mamífero,
preferiblemente un humano, es pretratada adecuadamente para
permitir el contacto entre un componente celular diana de una célula
de prueba, comprendida en dicha muestra, con un reactivo que
detecte TSLC1 y detectar una reducción en el TSLC1 en comparación
con la de una célula comparable normal. Las muestras pueden ser
montadas sobre un soporte adecuado para permitir la observación de
células individuales. Ejemplos de materiales de soporte bien
conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno,
policarbonato, poliuretano, opcionalmente dotados de capas para
mejorar la adhesión celular y la inmovilización de la muestra,
tales como capas de poli-L-lisina o
silano. Los frotis cervicales o biopsias pueden ser preparados, por
ejemplo, como para la prueba de Papanicolau (Pap) o cualquier
modificación adecuada de esta, conocida por un experto en la
materia, y puede ser fijada mediante procedimientos que permitan el
acceso adecuado del reactivo al componente diana. Si se requiere
almacenamiento, procedimientos de rutina utilizan formalina
tamponada para la fijación, seguida de una inclusión en parafina,
que proporciona una infraestructura tisular bien preservada. Con el
fin de permitir el teñido inmunohistoquímico o inmunofluorescente,
la antigenicidad del material de la muestra tiene que ser
recuperada o desenmascarada. Un método para recuperar la
antigenicidad de proteínas con enlaces cruzados con formaldehído
involucra el tratamiento de la muestra con enzimas proteolíticas.
Este método resulta en la digestión (parcial) del material y los
anticuerpos pueden acceder a simples fragmentos de las proteínas
originales.
Otro método para recuperar la inmunorreactividad
de anfígenos con enlaces cruzados con formaldehído involucra el
procesamiento térmico usando calor o alta energía en el tratamiento
de las muestras. Dicho método es descrito, por ejemplo, en la
Patente USA No. 5 244 787. Otro método para la recuperación de
antígenos de tejidos fijados con formaldehído es el uso de una olla
a presión, ya sea en combinación con un microondas o en la forma de
un autoclave, tal como es descrito por Norton, 1994. J. Pathol.
173(4):371-9 y Taylor y otros 1996. Biotech
Histochem 71(5):263-70.
Pueden ser utilizadas varias alternativas al
formaldehído, tales como etanol, metanol, methacarn o glioxal,
acetona citratada o pueden ser usados fijadores en combinación.
Alternativamente, la muestra puede ser secada por aire antes del
procesamiento posterior.
Con el fin de permitir la detección con sondas
de ácidos nucleicos, el material de muestra tiene que ser recuperado
o desenmascarado en el caso de un material fijado con formalina e
incluido en parafina. Un método involucra el tratamiento con
enzimas proteolíticas y una posterior fijación con paraformaldehído.
La digestión proteolítica puede ser precedida por un paso de
desnaturalización en HCl. Este método resulta en una digestión
(parcial) del material permitiendo la entrada de las sondas hacia
la diana. Procedimientos no específicos de desenmascaramiento son
requeridos en el caso de un material no fijado con formalina, por
ejemplo, material congelado. Antes de la hibridización las muestras
pueden ser acetiladas mediante un tratamiento con un tampón de
trietanolamina.
Las sondas de ácidos nucleicos o anticuerpos son
entonces puestas en contacto con el material de muestra en un
tampón adecuado y se le permite hibridizar específicamente o unirse
a su ácido nucleico o proteína diana. Después de la unión
específica de las sondas de ácido nucleico o anticuerpos a los
componentes dianas, las sondas conjugadas y/o los anticuerpos
pueden ser detectados mediante métodos tales como microscopía láser
confocal, microscopía de campo claro, citometría de flujo
opcionalmente en combinación con la clasificación de células
asociadas a la fluorescencia, o modificaciones de estas técnicas,
que son bien conocidas por un experto en la materia.
En una realización de un método de la presente
invención, un incremento en la metilación del promotor TSLC1
en la célula de prueba y/o reducción de la producción de TSLC1 en la
célula de prueba es detectado en comparación con una célula
comparable normal.
La presente invención también da a conocer
métodos para el tratamiento de un sujeto con cánceres invasivos
inducidos por HPV asociados con la modificación de la producción de
TSLC1, o indicativo de ello, que comprende la administración a un
sujeto con el cáncer de una cantidad terapéuticamente efectiva de un
reactivo que incremente la expresión de TSLC1. En los
cánceres invasivos inducidos por HPV asociados al supresor de tumor
de cáncer de pulmón 1 (TSLC1), la secuencia nucleotídica de
TSLC1 es subexpresada en comparación con la expresión de una
célula normal, por lo tanto, es posible diseñar técnicas
terapéuticas o de diagnóstico adecuadas dirigidas a esta secuencia.
Por lo tanto, las secuencias de ácidos nucleicos que incrementen la
expresión de TSLC1 a nivel transcripcional o traduccional
puede ser usado y, por ejemplo, secuencias de ácidos nucleicos que
codifiquen para TSLC1 (mismo sentido) podrían ser administradas al
sujeto con cáncer invasivo inducido por HPV, tal como el cáncer
cervical invasivo.
El término "cáncer cervical invasivo"
indica tanto poblaciones de células malignas como a premalignas, que
a menudo parecen diferenciarse del tejido circundante tanto
morfológicamente como genotípicamente. Estos desórdenes se han
encontrado que están asociados con la ausencia o la reducción de la
expresión de TSLC1. Esencialmente, cualquier anormalidad en
la célula de prueba que esté etiológicamente vinculada a la
expresión de TSLC1 podría ser considerada susceptible al
tratamiento usando los métodos de la presente invención que empleen
un reactivo para aumentar la expresión de TSLC1.
El aumento de la expresión de TSLC1 puede
ser logrado mediante la supresión de la metilación del
polinucleótido TSLC1 cuando TSLC1 esté subexpresado.
Cuando al diagnosticar según la presente invención, el cáncer
inducido por HPV detectado esté asociado con la expresión de TSLC1,
dichos reactivos supresores de la metilación, como
5-azacitadina, pueden ser introducidos en una
célula. Alternativamente, cuando al diagnosticar según la presente
invención, el cáncer cervical invasivo detectado esté asociado con
la subexpresión del polipéptido TSLC1, una secuencia polinucleótida
en el mismo sentido (la cadena de ADN codificante) que codifica para
el polipéptido TSLC1, o secuencias nucleotídicas reguladoras 5'(es
decir, promotor) de TSLC1 en un enlace operable con el
polinucleótido TSLC1 puede ser introducido en la célula.
Demetilasas conocidas en el estado de la técnica podrían también
ser utilizadas para eliminar la metilación.
La presente invención también da a conocer
terapia génica para el tratamiento del cáncer inducido por HPV
asociado con la modificación de la producción de TSLC1. Dicha
terapia puede lograr su efecto terapéutico mediante la introducción
del polinucleótido TSLC1 apropiado que contiene un gen TSLC1
estructural (mismo sentido), en células de sujetos que tienen
cáncer inducido por HPV. Los esquemas y el procedimiento para
efectuar el tratamiento terapéutico del gen son conocidos en el
estado de la técnica, por ejemplo en el documento WO 02/14557. La
entrega de las construcciones del polinucleótido TSLC1 en el
mismo sentido puede ser lograda usando un vector de expresión o
usando un sistema de dispersión coloidal, preferiblemente un vector
de expresión recombinante, siendo preferiblemente dicho vector de
expresión recombinante un plásmido, una partícula viral o un
fago.
Las secuencias de polinucleótidos utilizadas en
los métodos de la presente invención pueden ser secuencias nativas
no metiladas, o alternativamente, pueden ser una secuencia en la que
un análogo no metilable es sustituido en la secuencia.
Preferiblemente, el análogo es un análogo no metilable de citidina,
tal como 5-azacitadina. Otros análogos serán
conocidos por los expertos en la materia. Alternativamente, dichos
análogos no metilables pueden ser administrados a un sujeto como
terapia de drogas, sola o simultáneamente con un gen estructural en
el mismo sentido de TSLC1 o un promotor en el mismo sentido
de TSLC1 operablemente unido a un gen estructural de
TSLC1. Preferiblemente, el polinucleótido TSLC1
utilizado en los métodos de la presente invención es derivado de un
organismo mamífero y más preferiblemente de un humano.
La pérdida alélica del locus TSLC1 (o
LOH) puede ser detectada mediante amplificación PCR de secuencias
polimórficas que flanquean al gen TSLC1. Tanto el ADN de las
células de prueba como de las células saludables del mismo
individuo son amplificadas por PCR. Los dos fragmentos PCR que
representan a ambos alelos son separados en un gel de
poliacrilamida o por electroforesis capilar. Los productos PCR
derivados del ADN de células saludables y de células de prueba son
comparados, en los que la pérdida de uno de dos fragmentos PCR en
las células de prueba es indicativo de una pérdida
alélica/supresión genética del locus TSLC1.
La presente invención también da a conocer un
equipo ("kit") de piezas, como se define en la reivindicación
22, para usar en un método de detección de cánceres invasivos
inducidos por HPV y sus lesiones precursoras asociadas con el
supresor de tumor de cáncer de pulmón 1 (TSLC1) en células de
pruebas de un sujeto. Dicho equipo ("kit") puede comprender
adecuadamente un cepillo o espátula para tomar una raspadura
(cervical) junto con un recipiente lleno con medio de colección
para colectar las células de prueba. Alternativamente, un
dispositivo de muestreo que consiste en una jeringuilla de
irrigación, un catéter de orina femenino desechable y un recipiente
con fluido de irrigación estarán incluidos para colectar células
cervicales mediante un lavado vaginal.
Un equipo ("kit") según la presente
invención puede comprender cebadores y sondas para la detección de
la metilación del promotor TSLC1, para la detección de pérdidas
alélicas en el cromosoma 11q23.2 o para la detección de la
expresión del ARNm de TSLC1. En otra realización, un equipo
("kit") según la presente invención puede comprender
anticuerpos y reactivos para la detección de la proteína TSLC1 en
raspados cervicales o muestras de tejidos.
Un equipo ("kit") de piezas, según la
presente invención, comprende medios para la detección de la
metilación del promotor TSLC1 o la expresión de TSLC1, tales
como anticuerpos específicos de TSLC1, enzimas de restricción
sensibles a la metilación, o sondas o cebadores capaces de
hibridizarse con la secuencia de nucleótidos de la figura 1.
En otra realización alternativa de un equipo
("kit") de la presente invención, los medios para la detección
de la metilación del promotor TSLC1 o la expresión de
TSLC1 pueden estar combinados con medios para la detección
de la infección de HPV, preferiblemente para la detección de la
infección de HPV de alto riesgo. Dichos medios pueden comprender
cebadores o sondas específicas para HPV que son conocidas en el
estado de la técnica.
La presente invención será ilustrada mediante
los siguientes ejemplos no limitativos.
Los niveles de expresión de ARNm de TSLC1
fueron medidos en 11 líneas celulares de carcinoma cervical
mediante RT-PCR cuantitativo en tiempo real usando
la tecnología Lightcycler (Roche). Comparado con células
epiteliales primarias normales, el ARNm de TSLC1 fue
indetectable en 8 de las 11 líneas celulares y severamente reducido
en otras 2 líneas, mostrando que regulación por disminución de TSLC1
es aparente en el 91% (10/11) de las líneas celulares de carcinoma
cervical analizadas.
Por otra parte, la expresión de TSLC1 fue
todavía abundante en células de HPV inmortalizadas. Estas células
de HPV inmortalizadas no son aún tumorigénicas y habían mostrado
previamente ser representativas de lesiones cervicales premalignas
in vivo.
A continuación, fue llevado a cabo el análisis
de los mecanismos subyacentes en la regulación por disminución de
TSLC1. Además de los eventos genéticos, es decir, supresiones y
mutaciones de inactivación, los eventos epigenéticos pueden
resultar en el silenciamiento del gen, como ha sido descrito para
los cánceres de pulmón (Kuramochi y otros, 2001).
Para evaluar si un evento de metilación fue
esencial en el silenciamiento de TSLC1 en células de cáncer
cervical, las líneas celulares SiHa, HeLa y CaSki fueron tratadas
con el inhibidor de la metilación 5-aza citadina.
Los niveles de RNAm de TSLC1 fueron comparados con los niveles de
expresión en células epiteliales primarias, los que fueron fijados
a 100%. Después de 5 a 7 días de incubación con
5-azacitadina, los niveles de expresión de
TSLC1 fueron sobrerregulados desde 0% a 26% en células SiHa,
y desde 4% a 70% y desde 0% a 33% en células HeLa y CaSki,
respectivamente. Estos datos indican que en todas estas tres líneas
celulares la regulación por disminución de TSLC1 resulta, al menos
en parte, de un evento de metilación.
Después fue estudiada la metilación del promotor
TSLC1 mediante la secuenciación de bisulfito radioactivo. Se
encontró que todos los sitios (6) CpG secuenciados fueron metilados
en 9 de 11 líneas celulares de cáncer cervical. Con excepción de
una línea celular, no se detectaron secuencias de tipo salvaje en
estas líneas celulares, indicando que la metilación del promotor
TSLC1 fue clonal. En las restantes dos líneas celulares no
estaban metilados ninguno de los sitios CpG. Con excepción de una
línea celular, la metilación del promotor TSLC1 fue
correlacionada con una expresión de ARNm de TSLC1 reducida o
indetectable. Ninguna metilación del promotor TSLC1 fue
detectada en cuatro aislamientos de células epiteliales normales y
en células no tumorigénicas de HPV inmortalizadas.
Para analizar si una supresión cromosomal
atribuida al silenciamiento de TSLC1 se realizó un análisis
de pérdida de heterocigosidad (LOH) usando ocho marcadores
polimórficos que flanquean al gen TSLC1. Se dispuso de ADN normal
derivado tanto de linfoblastos como de fibroblastos de ocho líneas
celulares de carcinoma cervical. En tres (38%) de estas líneas
celulares fue aparente una pérdida alélica en 11q23.2. Estas tres
líneas revelaron una hipermetilación del promotor TSLC1 y
ausencia de ARNm de TSLC1 detectable, sugiriendo que la
supresión alélica combinada con la hipermetilación del promotor
provoca un silenciamiento completo del gen.
El análisis de las líneas celulares
inmortalizadas de HPV mostró un LOH en 11q23.2 en todos los pases de
inmortalización de una de las cuatro líneas celulares. Sin embargo,
la expresión de TSLC1 fue aún detectable en estos pases y no
se encontró ninguna metilación del promotor, indicando que el alelo
conservado era aún transcrito activamente. Ninguna pérdida alélica
en 11q23 fue detectada en las otras tres líneas celulares.
En su conjunto, estos datos muestran que el
silenciamiento de TSLC1 en células de cáncer cervical puede
resultar de 1) metilación del promotor de un alelo combinado con la
supresión del otro alelo, como se encontró en 3 de 8 líneas
celulares, 2) la metilación del promotor sin pérdida alélica,
sugiriendo tanto que ambos alelos están hipermetilados o que uno
esté mutado, como fue encontrado en dos líneas celulares, o 3) otros
mecanismos aún desconocidos, como fue encontrado en dos líneas
celulares.
La transformación maligna in vitro de
células epiteliales infectadas por hr-HPV se ha
demostrado para proceder de la posterior adquisición de 1) un
fenotipo inmortal y 2) un fenotipo de anclaje independiente, que
puede ser medido mediante el crecimiento de las células en agarosa
blanda.
Para analizar si el silenciamiento de TSLC1 está
funcionalmente relacionado con el desarrollo de cáncer cervical, la
secuencia que codifica para TSLC1 fue transfectada en la línea
celular de cáncer cervical SiHa, en la que la expresión de TSLC1
endógeno fue indetectable. La reexpresión de TSLC1 en estas
células SiHa negativas de ARNm de TSLC1 resultó en un crecimiento
altamente reducido en agarosa blanda, que es una medida del anclaje
independiente, mientras que el crecimiento en una monocapa normal no
fue afectado. Además, la reexpresión de TSLC1 en células
SiHa resultó en una supresión del crecimiento tumoral en ratones
desnudos en dos de cuatro transfectantes SiHa/TSLC1 y los tumores
que aparecieron en los transfectantes SiHa/TSLC1 crecieron más
lentamente que los controles.
En conclusión, estos resultados muestran que
TSLC1 puede suprimir tanto el anclaje independiente como el
crecimiento tumorigénico de células de cáncer cervical, sin afectar
la inmortalidad y la proliferación.
Para determinar en que estado durante la
carcinogénesis cervical ocurre el silenciamiento de TSLC1
in vivo, fue analizado el estado de la metilación del
promotor TSLC1 en muestras de tejido cervical.
Ya que las muestras de tejido consisten en una
mezcla de componentes estromales y células anormales, se determinó
la sensibilidad del ensayo para detectar islas CpG metiladas sobre
un fondo de ADN normal no metilado. Mediante el análisis de una
serie de diluciones del ADN de SiHa (promotor TSLC1 metilado)
en ADN derivado de queratinocitos primarios (promotor TSLC1
no metilado), se encontró que podría ser aún detectado con una alta
confiabilidad un valor tan bajo como 5% de ADN metilado en un fondo
de ADN no metilado, utilizando una secuenciación con bisulfito
radioactivo e un dispositivo Genomyx.
Utilizando este método, ninguna de las 15
biopsias epiteliales cervicales normales reveló metilación del
promotor TSLC1. Similarmente, la metilación del promotor
TSLC1 fue indetectable en todas las lesiones CIN de grado
bajo (n=10). De 30 lesiones CIN de grado alto un 35% mostró
metilación del promotor TSLC1. Además, fueron analizadas un
total de 50 secciones de células escamosas de carcinoma cervical, de
las que el 58% (29/50) mostró metilación del promotor TSLC1.
Por lo tanto, la metilación del promotor TSLC1 parece ser un
evento bastante frecuente en células escamosas de carcinoma cervical
y ocurre al final de la secuencia multietapa de la carcinogénesis.
Ya que, además de la hipermetilación del promotor TSLC1,
otras alteraciones, incluyendo la pérdida alélica en 11q23.2,
pueden contribuir al silenciamiento de TSLC1, el porcentaje
real de silenciamiento de TSLC1 en carcinomas cervicales es
probable que sea mayor de 58%.
En un pequeño estudio piloto se evaluó si la
detección de alteraciones de TSLC1 puede ser aplicada a frotis
cervicales y si como tal puede ser usada como marcador en programas
de cribaje de cáncer cervical.
Para ello, fue analizada la metilación del
promotor TSLC1 en frotis de archivo de mujeres que
desarrollaron cáncer cervical. Estos raspados se derivaron de casos
de control retrospectivos que fueron diseñados para determinar el
valor de hr-HPV para indicar frotis cervicales
falsos negativos en mujeres que desarrollaron cáncer cervical y
evaluar si hr-HPV está presente en frotis normales
antes del cáncer cervical (Zielinski y otros, 2001; Br J Cancer 85,
398-404). El análisis de 9 frotis indexados, es
decir, frotis tomados al momento del diagnóstico de cáncer cervical
y clasificados como Pap4 o Pap5 (es decir, sospechoso de carcinoma
in situ/cáncer invasivo), también como en 9 biopsias
asociadas a carcinoma cervical, mostró que la metilación del
promotor TSLC1 podría ser detectada en frotis de mujeres con
una biopsia de cáncer positiva a la metilación del promotor
TSLC1. No fue detectada ninguna metilación del promotor
TSLC1 en los controles de frotis (n=12).
Posteriormente se determinó si la detección de
la metilación del promotor TSLC1 no solamente proporciona un
marcador para el diagnóstico para detectar el cáncer cervical sino
que pudiera también proporcionar un marcador la evaluación del
riesgo de lesiones cervicales premalignas. Para esto, el mismo grupo
de pacientes fue estudiado, como se describió anteriormente y se
analizaron los frotis cervicales de archivo, que fueron tomados
entre 1 y 2 años antes del diagnóstico de cáncer cervical y fueron
clasificados en Pap3a2/3b, es decir, discariosis moderada a severa,
fueron analizados. En un paciente, la metilación del promotor
TSLC1 pudo ser detectada en un frotis anterior al cáncer que
fue tomado 1 año antes del diagnóstico de cáncer cervical.
<110> Stichting Researchfonds
Pathologie
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Detección de cánceres invasivos
inducidos por HPV y sus lesiones precursoras con potencial
invasivo
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P63729EP00
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 03075928.6
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<141>
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2351
\vskip0.400000\baselineskip
<212>ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213>Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Descripción de la molécula combinada
ADN/ARN: TSLC1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223>Descripción de la secuencia
artificial: TSLC1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (895)..(2223)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 442
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<223> Descripción de la secuencia
artificial: TSLC1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Método para la detección de cáncer invasivo
inducido por HPV o lesiones precursoras de los mismos asociadas al
supresor de tumor de cáncer de pulmón 1 (TSLC1) en un sujeto que lo
necesite, comprendiendo dicho método la puesta en contacto ex vivo
de un componente celular seleccionado del grupo que consiste en un
ácido nucleico que codifica para el polipéptido TSLC1 y el
polipéptido TSLC1 de una célula de prueba del sujeto con un reactivo
que detecta el nivel de dicho componente en la célula de prueba y
determinando una disminución en el nivel de expresión de dicho
componente celular, comparado con una célula saludable
comparable.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que
dicho cáncer invasivo inducido por HPV o la lesión precursora del
mismo es un cáncer cervical invasivo o una lesión cervical
premaligna con potencial invasivo.
3. Método, según las reivindicaciones 1 ó 2, en
el que dicho cáncer invasivo inducido por HPV es un cáncer invasivo
inducido por HPV de alto riesgo.
4. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el componente celular es un
ácido nucleico que codifica para el polipéptido TSLC1 y regiones
reguladoras y el reactivo fija como objetivo al ácido nucleico en
la célula de prueba.
5. Método, según la reivindicación 4, en el que
el ácido nucleico es ARN, preferiblemente ARNm.
6. Método, para la detección de cáncer invasivo
inducido por HPV o lesión precursora del mismo, según cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que en dicha detección un aumento
de la metilación del promotor TSLC1 en la célula de prueba
y/o una pérdida alélica del locus TSLC1 es determinada en
comparación con una célula comparable normal.
7. Método, según la reivindicación 6, en el que
el reactivo es una endonucleasa de restricción, preferiblemente una
endonucleasa de restricción sensible a la metilación.
8. Método, según las reivindicaciones 4 ó 5, en
el que el reactivo es una sonda de ácido nucleico o cebador que se
une al ácido nucleico.
9. Método, según la reivindicación 8, en el que
dicha sonda de ácido nucleico o cebador tiene un marcador
detectable.
10. Método, según las reivindicaciones 8 ó 9, en
el que la sonda de ácido nucleico tiene un secuencia nucleotídica
seleccionada del grupo consistente en:
- a)
- una secuencia polinucleotídica capaz de hibridizarse bajo condiciones severas a la región reguladora 5' o a la región codificante de la secuencia de TSLC1, como se establece en la Figura 1;
- b)
- un polinucleótido que sea al menos 70% idéntico que el polinucleótido de a);
- c)
- un polinucleótido complementario al polinucleótido de a); y
- d)
- un polinucleótido que comprenda al menos 15 bases consecutivas de un nucleótido de a) o b).
11. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente celular es un
polipéptido TSLC1.
12. Método, según la reivindicación 11, en el
que el reactivo es un anticuerpo anti-TSLC1.
13. Método, según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que el sujeto ha perdido
heterocigosidad en el cromosoma 11q23.
14. Uso, de una cantidad terapéuticamente
efectiva de un reactivo que incrementa los niveles de TSLC1 para la
preparación de un medicamento para el tratamiento de cánceres
invasivos inducidos por HPV y lesiones precursoras asociadas con la
producción de TSLC1 en células en un sujeto que lo necesite, en el
que dicho reactivo es seleccionado del grupo que consiste en un
polipéptido TSLC1, una secuencia nucleotídica que codifica para
TSLC1 y reactivos supresores de la metilación, tal como
5-azacitadina.
15. Uso, según la reivindicación 14, en el que
el reactivo es una secuencia polinucleotídica de TSLC1 en el mismo
sentido.
16. Uso, según la reivindicación 15, en el que
dicho polinucleótido es la secuencia de sentido nativa no metilada
TSLC1.
17. Uso, según la reivindicación 16, en el que
un análogo no metilable es sustituido por citidina en la secuencia
en el mismo sentido de TSLC1.
18. Uso, según la reivindicación 17, en el que
dicho análogo no metilable preferiblemente es
5-azacitadina.
19. Uso, según cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, en el que dicha secuencia polinucleótida
está contenida en un vector de expresión.
20. Uso, según la reivindicación 19, en el que
dicho vector de expresión preferiblemente es un plásmido, una
partícula viral o un fago.
21. Uso de un marcador molecular de diagnóstico
para la detección de cánceres invasivos inducidos por HPV y sus
lesiones precursoras asociadas con el supresor de tumor de cáncer de
pulmón 1 (TSLC1), en el que dicho marcador es la metilación del
promotor TSLC1 y/o la expresión de ARNm de TSLC1 o la
expresión del polipéptido TSLC1.
22. Equipo ("kit") de piezas para usar en
un método de detección de cánceres invasivos inducidos por HPV y
sus lesiones precursoras asociadas con el supresor de tumor de
cáncer de pulmón 1 (TSLC1) en células de prueba de un sujeto,
comprendiendo dicho equipo ("kit")
- -
- medios para la detección de la metilación del promotor TSLC1 o la expresión de TSLC1, en los que dichos medios comprenden sondas, cebadores y/o anticuerpos específicos para TSLC1 o específicos para una secuencia de nucleótidos que codifica para TSLC1 o un promotor de TSLC1; y
- -
- medios para la detección de la infección por HPV, en los que dichos medios comprenden sondas y cebadores específicos para HPV.
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