JP5131946B2 - がんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 - Google Patents

がんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制のための方法、システムおよび組成物ならびに関連するスクリーニング方法 Download PDF

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本発明は、がんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制に関する。より詳細には、小細胞肺がんのような固形がんにおけるがんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制に関する。
がんの処置および予防は、未だに完全には解決していない問題であり、種々の局面からの解析がなされており、その解決方法に対しては未だに強い需要が存在する。
がんの診断は、適切な診断および予防をするために必要な工程であり、その診断には種々の手法およびマーカーが使用されている。
これに加え、がんの浸潤・転移は、がんが悪化して全身にその影響に及ぶという点で、その治療および予防に対しては強い需要があり、診断技術に対してもまた、強い需要が存在する。
がんの一種である小細胞肺がん（以下、ＳＣＬＣともいう）は、特徴的な初期転移を伴う侵襲性のがんである。最も有効な治療法でさえ、ＳＣＬＣ患者の全生存率は、初期の疾病で１２％、そして転移性疾病で２％のみである。転移性疾病は通常、ＳＣＬＣ患者の約３分の２で認められる。通常の転移部位は、肝臓、副腎、脳、骨、および骨髄を含む（非特許文献１＝Ｃｈｕｔｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１７９４−８０１；非特許文献２＝Ｃｈｕｔｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７２：９０１−１２；非特許文献３＝Ｓａｌｇｉａ，Ｒ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｏｎｃｏｌ．１２：８−１５）。ＳＣＬＣでのリンパ節および様々な器官への転移機序を理解することは、さらなる治療法を設計する際に重要である。
ＳＣＬＣは、いくつかの受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）の過剰発現を特徴とする。ＲＴＫのいくつかは、プロトオンコジーンであり、かつ細胞成長、分化、生存、および運動の鍵となる制御因子である。最近の研究により、該ＲＴＫを標的とするＳＣＬＣの新規治療薬剤が同定され始めた（非特許文献４＝Ｇｉｂｂｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｏｌｉｆｆ，Ａ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：１９３−８； 非特許文献５＝Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．ａｎｄ Ｇａｚｉｔ，Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１７８２−８）。ｃ−Ｍｅｔおよびｃ−Ｋｉｔ ＲＴＫが、ＳＣＬＣにおいて重要であると同定された。分子量１４５ｋＤａのプロトオンコジーン産物であるｃ−Ｋｉｔ受容体は、ｃ−Ｆｍｓ、Ｆｌｔ３、および血小 板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）に類似のクラスＩＩＩ ＲＴＫである。ＳＣＬＣ腫瘍標本の約７０％、および細胞株は、ｃ−Ｋｉｔおよびその天然のリガンドである幹細胞因子（ＳＣＦ）を共に発現する。ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ経路は、ＳＣＬＣでのオートクラインまたはパラクラインの機能である（非特許文献６＝Ｈｉｂｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：２２９１−６； 非特許文献７＝Ｙａｍａｎｉｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８７：５３４−４２など）。
ＳＣＬＣなどのがんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制の有効な技術は、未だに提供されておらず、あったとしても、より良好な、効率のよい技術の提供が要求されている。そこで、ＳＣＬＣなどのがんの診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移に関連する分子標的を同定する必要がある。
またがんの浸潤性の強度を識別することができるマーカーは提供されていない。特許文献１では、浸潤性については何ら記載も示唆もされておらず、癌マーカーと浸潤性のマーカーとの関連はいまだに知られていない。
さらに、TSLC１活性と遊走能との関連は知られていない。
Ｃｈｕｔｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．１７：１７９４−８０１ Ｃｈｕｔｅ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．７２：９０１−１２ Ｓａｌｇｉａ，Ｒ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｏｎｃｏｌ．１２：８−１５ Ｇｉｂｂｓ，Ｊ．Ｂ．ａｎｄ Ｏｌｉｆｆ，Ａ．（１９９４）Ｃｅｌｌ ７９：１９３−８ Ｌｅｖｉｔｚｋｉ，Ａ．ａｎｄ Ｇａｚｉｔ，Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６７：１７８２−８ Ｈｉｂｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：２２９１−６ Ｙａｍａｎｉｓｈｉ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．８７：５３４−４２ 特開２００５−１４７７９８
そこで、本発明は、全く新規な、がん（特に、小細胞肺がん）およびその浸潤性の診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制のための技術を提供することを課題とする。本発明はまた、細胞の遊走能を調べることによってTSLC1の活性を測定することができることを見出したことによって、上記課題を解決した。
上述した課題は、本発明者が鋭意検討した結果、ＴＳＬＣ１の分子経路が診断、処置および予防、および浸潤・転移の抑制に関連していることを見出したことによって、解決された。
従って、本発明は以下を包含する。
（１）がんの転移および／または浸潤の調節方法であって、
Ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する工程
を包含する、方法。
（２）上記調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含する、項１に記載の方法。
（３）上記ＴＳＬＣ１の分子経路における因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１および低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１からなる群より選択される因子を含む、項１に記載の方法。
（４）上記調節は、ＴＳＬＣ１の過剰発現を調節することを包含する、項１に記載の方法。
（５）上記調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子を調節する調節因子により達成される、項１に記載の方法。
（６）上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項５に記載の方法。
（７）上記調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の過剰発現をＲＮＡｉにより抑制することを包含する、項１に記載の方法。
（８）上記調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の過剰発現を抗体により抑制することを包含する、項１に記載の方法。
（９）上記調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の優性欠失改変により抑制することを包含する、項１に記載の方法。
（１０）上記がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫および他の固形がんからなる群より選択される、項１に記載の方法。
（１１）上記ＴＳＬＣ１の分子経路の調節は、低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１の活性化の抑制を包含する、項１に記載の方法。
（１２）上記ＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項３に記載の方法。
（１３）上記Ｔｉａｍ１は、配列番号３に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項３に記載の方法。
（１４）上記Ｒａｃ１は、配列番号５に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号６に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項３に記載の方法。
（１５）上記ＲＮＡｉは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉである、項７に記載の方法。
（１６）上記ＲＮＡｉは、配列番号７（5’-gtcaataagagtgacgact-3’）および配列番号
８（5’-gagtgacgactctgtgatt-3’）に示す配列を有するＴＳＬＣ１のＲＮＡｉである、
項７に記載の方法。
（１７）上記ＲＮＡｉは、Ｔｉａｍ１のＲＮＡｉである、項７に記載の方法。
（１８）上記ＲＮＡｉは、配列番号９（5’- CGG CGA GCU UUA AGA AGA ATT-3’(センス
配列)）および配列番号１０（ 5’- UUC UUC UUA AAG CUC GCC GTT -3’（アンチセンス
配列））に示す配列を有するＴｉａｍ１のＲＮＡｉである、項７に記載の方法。
（１９）上記ＲＮＡｉは、Ｒａｃ１のＲＮＡｉである、項７に記載の方法。
（２０）上記ＲＮＡｉは、配列番号５に示す配列に基づいて作製されるＲａｃ１のＲＮＡｉである、項７に記載の方法。
（２１）上記ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の優性欠失改変は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される少なくとも１つの因子の優性欠失の改変を含む、項９に記載の方法。
（２２）上記優性欠失改変は、Ｒａｃ１において（配列番号１２（核酸配列）および配列番号１３（アミノ酸配列）の配列を有することを特徴とする、項２１に記載の方法。（２３）がんの転移および／または浸潤の調節システムであって、
Ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する手段
を備える、システム。
（２４）がんの転移および／または浸潤の調節組成物であって、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する調節因子を含む、組成物。
（２５）上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項２４に記載の組成物。
（２６）上記調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子を調節する調節因子を含む、項２４に記載の組成物。
（２７）上記調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子のＲＮＡｉである、項２４に記載の組成物。
（２８）上記調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子に対する抗体である、項２４に記載の組成物。
（２９）上記調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子の優性欠失変異体またはその誘導因子である、項２４に記載の組成物。
（３０）上記がんは、小細胞肺がんである、項２４に記載の組成物。
（３１）がんの転移および／または浸潤の調節因子をスクリーニングする方法であって、
Ａ）候補物質を提供する工程、
Ｂ）上記候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；
Ｃ）上記候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、上記調節する因子を、がんの転移および／または浸潤の調節因子であると決定する工程
を包含する、方法。
（３２）上記がんは、小細胞肺がんであり、上記ＴＳＣＬ１の分子経路においてＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される少なくとも１つの調節が観察される、項３１に記載の方法。
（３３）上記候補物質は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項３１に記載の方法。
（３４）項３１に記載の方法によって同定された、がんの転移および／または浸潤の調節因子。
（３５）ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の優性欠失改変体。
（３６）上記改変体は、ゲノム、細胞、組織、臓器または個体の全部または一部である、項３５に記載の改変体。
（３７）がんの転移および／または浸潤の調節因子をスクリーニングする方法であって、
Ａ）候補物質を提供する工程、
Ｂ）上記候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；
Ｃ）上記候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、上記調節する因子を、がんの転移および／または浸潤の調節因子の候補であると決定する工程；
Ｄ）さらに、上記調節因子の候補を、がんの転移および／または浸潤のアッセイ系に供する工程；
Ｅ）上記調節因子の候補の内、がんの転移および／または浸潤を調節する因子を選択する工程
を包含する、方法。
（３８）上記がんは、小細胞肺がんであり、上記ＴＳＣＬ１の分子経路においてＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される少なくとも１つの調節が観察される、項３７に記載の方法。
（３９）上記候補物質は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項３７に記載の方法。
（４０）項３７に記載の方法によって同定された、がんの転移および／または浸潤の調節因子。
（４１）がんの診断方法であって、
Ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを測定する工程
を包含する、方法。
（４２）上記ＴＳＬＣ１の分子経路の因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子を含む、項４１に記載の方法。
（４３）上記レベルは、上記因子の特異的因子によって測定される、項４１に記載の方法。
（４４）上記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項４３に記載の方法。
（４５）上記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、項４３に記載の方法。
（４６）上記特異的因子は、配列番号５に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子である、項４３に記載の方法。
（４７）上記特異的因子は、配列番号６に示す配列のポリペプチドに対する抗体である、項４３に記載の方法。
（４８）上記がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫および他の固形がんからなる群より選択される、項４１に記載の方法。
（４９）上記がんは、小細胞肺がんである、項４１に記載の方法。
（５０）上記ＴＳＬＣ１の分子経路の因子はＲａｃ１であり、上記Ｒａｃ１の活性化の抑制は、がんの指標である、項４１に記載の方法。
（５１）上記測定は、細胞または血清におけるＲａｃ１遺伝子の転写産物またはＲａｃ１タンパク質の有無を検出することを含む、項４１に記載の方法。
（５２）
上記検出は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われる、項４１に記載の方法。
（５３）
上記検出は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われる、項４１に記載の方法。
（５４）
上記検出は、配列番号６に示す配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われる、項４１に記載の方法。
（５５）
上記検出は、活性化型Ｒａｃ１を特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われる、項４１に記載の方法。
（５６）がんの診断薬であって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを測定する手段を備える、診断薬。
（５７）上記ＴＳＬＣ１の分子経路の因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子を含む、項５６に記載の診断薬。
（５８）上記手段は、上記ＴＳＬＣ１の分子経路の因子の特異的因子である、項５６に記載の診断薬。
（５９）上記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項５８に記載の診断薬。
（６０）上記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、項５８に記載の診断薬。
（６１）上記特異的因子は、配列番号５に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子である、項５８に記載の診断薬。
（６２）上記特異的因子は、配列番号６に示す配列のポリペプチドに対する抗体である、項５８に記載の診断薬。
（６３）上記がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫および他の固形がんからなる群より選択される、項５６に記載の診断薬。
（６４）上記がんは、小細胞肺がんである、項５６に記載の診断薬。
（６５）上記ＴＳＬＣ１の分子経路の因子はＲａｃ１であり、上記手段は、上記Ｒａｃ１の活性化の抑制を同定する手段である、項５６に記載の診断薬。
（６６）上記手段は、細胞または血清においてＲａｃ１遺伝子の転写産物またはＲａｃ１タンパク質の有無を検出する手段である、項５６に記載の診断薬。
（６７）
上記手段は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む、項５６に記載の診断薬。
（６８）
上記手段は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む、項５６に記載の診断薬。
（６９）
上記手段は、配列番号６に示す配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む、項５６に記載の診断薬。
（７０）
上記手段は、活性化型Ｒａｃ１を特異的に認識する抗体を含む、項５６に記載の診断薬。
（７１）がんの処置または予防の方法であって、
Ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する工程
を包含する、方法。
（７２）上記調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含する、項７１に記載の方法。
（７３）上記ＴＳＬＣ１の分子経路における因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１および低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１からなる群より選択される因子を含む、項７１に記載の方法。（７４）上記調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子を調節する調節因子により達成される、項７１に記載の方法。
（７５）上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項７４に記載の方法。
（７６）上記調節因子は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子のＲＮＡｉ、抗体または優性欠失改変を誘導する因子である、項７１に記載の方法。
（７７）上記がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫およびその他の固形がんからなる群より選択される、項７１に記載の方法。
（７８）上記ＴＳＬＣ１の分子経路の調節は、低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１の活性化の抑制を包含する、項７１に記載の方法。
（７９）上記ＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項７３に記載の方法。
（８０）上記Ｔｉａｍ１は、配列番号３に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項７３に記載の方法。
（８１）上記Ｒａｃ１は、配列番号５に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号６に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項７３に記載の方法。
（８２）がんの処置または予防のシステムであって、
Ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する手段
を備える、システム。
（８３）がんの処置または予防のための組成物であって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する因子を含む、組成物。
（８４）上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項８３に記載の組成物。
（８５）上記調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子を調節する調節因子を含む、項８３に記載の組成物。
（８６）がんの処置または予防のための因子をスクリーニングする方法であって、
Ａ）候補物質を提供する工程、
Ｂ）上記候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；
Ｃ）上記候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、上記調節する因子を、がんの処置または予防のための因子であると決定する工程
を包含する、方法。
（８７）がんの処置または予防ための因子をスクリーニングする方法であって、
Ａ）候補物質を提供する工程、
Ｂ）上記候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；
Ｃ）上記候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、上記調節する因子を、がんの処置または予防のための因子であると決定する工程
Ｄ）さらに、上記調節因子の候補を、がんの処置または予防のためのアッセイ系に供する工程；
Ｅ）上記調節因子の候補の内、がんの処置または予防のための因子を選択する工程
を包含する、方法。
（８８）ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子の、がんの転移および／または浸潤の調節のための組成物の製造における、使用。
（８９）ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子の、がんの診断のための組成物の製造における、使用。
（９０）ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子の、がんの処置または予防のための組成物の製造における、使用。
（９１）上記因子は、Ｒａｃ１であり、および／または上記がんは小細胞肺がんを含む、項８８〜９０のいずれか１項に記載の使用。
（９２）がん細胞の浸潤性の程度を識別するための方法であって、上記がん細胞のTiam１の全長型およびTiam１の短縮型の発現のレベルを測定する工程を包含する、方法。
（９２Ａ）上記浸潤性は、蛍光標識色素（例えば、カルセインAM）などで染色し、基底細胞（例えば、NIH3T3細胞、ヒト由来血管内皮細胞など）の単層培養上に重層したときに、浸潤性のがん細胞では細胞形態が伸展し接着するのに対し、非浸潤性のがん細胞では、細胞が伸展せず接着の程度が弱いことを確認することによって判定される、項９２に記載の方法。
（９２Ｂ）上記浸潤性は、上記基底細胞に接着している上記がん細胞の量を、上記蛍光標識（例えば、カルセインAM）を指標として測定することをより判定される、項９２Ａに記載の方法。
（９２Ｃ）上記基底細胞は、全長TSLC1 cDNAが導入されており、上記全長ＴＳＬＣ１の発現条件下で上記測定を行うことにより上記浸潤性が判定される、項９２Ｂに記載の方法。
（９３）上記Ｔｉａｍ１は、配列番号３に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項９２に記載の方法。
（９４）上記Tiam１の短縮型は、エクソン１４−２９に対応するバリアントである、項９２に記載の方法。
（９５）上記レベルは、上記因子の特異的因子によって測定される、項９２に記載の方法。
（９６）上記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項９５に記載の方法。
（９７）上記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、項９５に記載の方法。
（９８）上記特異的因子は、配列番号５または配列番号２３に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子である、項９５に記載の方法。
（９９）上記特異的因子は、配列番号６または配列番号２４に示す配列のポリペプチドに対する抗体である、項９５に記載の方法。
（１００）上記がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫および他の固形がんからなる群より選択される、項９２に記載の方法。
（１０１）上記がんは、小細胞肺がんである、項９２に記載の方法。
（１０２）上記測定は、細胞または血清におけるTiam１タンパク質の全長型およびTiam１の短縮型の有無を検出することを含む、項９２に記載の方法。
（１０３）上記検出は、配列番号３および配列番号２３からなる群より選択される少なくとも１つの配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われる、項１０２に記載の方法。
（１０３Ａ）上記プライマーは、配列番号２１、２２、２５、２６、２８および２９からなる群より選択される配列またはその相補体である配列を含む核酸分子である、項１０３に記載の方法。
（１０４）上記検出は、配列番号３および配列番号２３からなる群より選択される少なくとも１つの配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われる、項１０２に記載の方法。
（１０４Ａ）上記プローブは、配列番号２３、２７および３０からなる群より選択される配列またはその相補体である配列を含む核酸分子である、項１０４に記載の方法。
（１０５）上記検出は、配列番号４および配列番号２４からなる群より選択される少なくとも１つの配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われる、項１０２に記載の方法。
（１０６）上記測定は、配列番号３と配列番号２３とを識別することができる因子を用いて行われる、項９２に記載の方法。
（１０７）上記測定は、配列番号４と配列番号２４とを識別することができる因子を用いて行われる、項９２に記載の方法。
（１０８）上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１０６または１０７に記載の方法。
（１０９）上記浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度と、それより弱い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む、項９２に記載の方法。
（１１０）上記浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度と、それより強い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む、項９２に記載の方法。
（１１１）上記浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度の浸潤性と、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度の浸潤性とを識別することを含む、項９２に記載の方法。
（１１２）がん細胞の浸潤性の程度を識別するためのシステムであって、Tiam１の全長型およびTiam１の短縮型の発現のレベルを測定する手段を包含する、システム。
（１１３）上記Ｔｉａｍ１は、配列番号３に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項１１２に記載のシステム。
（１１４）上記Tiam１の短縮型は、エクソン１４−２９に対応するバリアントである、項１１２に記載のシステム。
（１１５）上記レベルは、上記因子の特異的因子によって測定される、項１１２に記載のシステム。
（１１６）上記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１１５に記載のシステム。
（１１７）上記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、項１１５に記載のシステム。
（１１８）上記特異的因子は、配列番号５または配列番号２３に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子である、項１１５に記載のシステム。
（１１９）上記特異的因子は、配列番号６または配列番号２４に示す配列のポリペプチドに対する抗体である、項１１５に記載のシステム。
（１２０）上記がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫および他の固形がんからなる群より選択される、項１１２に記載のシステム。
（１２１）上記がんは、小細胞肺がんである、項１１２に記載のシステム。
（１２２）上記測定する手段は、細胞または血清におけるTiam１タンパク質の全長型およびTiam１の短縮型の有無を検出する手段を含む、項１１２に記載のシステム。
（１２３）上記手段は、配列番号３および配列番号２３からなる群より選択される少なくとも１つの配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を備える、項１２２に記載のシステム。
（１２４）上記手段は、配列番号３および配列番号２３からなる群より選択される少なくとも１つの配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を備える、項１２２に記載のシステム。
（１２５）上記手段は、配列番号４および配列番号２４からなる群より選択される少なくとも１つの配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬を備える、項１２２に記載のシステム。
（１２６）上記手段は、配列番号３と配列番号２３とを識別することができる因子を備える、項１１２に記載のシステム。
（１２７）上記手段は、配列番号４と配列番号２４とを識別することができる因子を備える、項１１２に記載のシステム。
（１２８）上記因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１２６または１２７に記載のシステム。
（１２９）上記浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度と、それより弱い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む、項１１２に記載のシステム。
（１３０）上記浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度と、それより強い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む、項１１２に記載のシステム。
（１３１）上記浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度の浸潤性と、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度の浸潤性とを識別することを含む、項１１２に記載のシステム。
（１３２）浸潤性の強いがん細胞の識別するための組成物であって、上記組成物は、Tiam1の短縮型を認識する因子を含む、組成物。
（１３３）上記浸潤性の強いがん細胞は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される、項１３２に記載の組成物。
（１３４）上記Tiam1の短縮型は、少なくとも配列番号２３の配列もしくはその改変体、またはその相補体を有する、項１３２に記載の組成物。
（１３５）エクソン１３−２９に対応するTiam１の短縮型。
（１３６）上記Tiam１バリアントは、少なくとも配列番号２３の配列もしくはその改変体、またはその相補体を有する、項１３５に記載のTiam１の短縮型。
（１３７）エクソン１３−２９に対応するTiam１の短縮型を認識する能力を有する因子。
（１３８）上記Tiam１バリアントは、少なくとも配列番号２３の配列もしくはその改変体、またはその相補体を有する、項１３７に記載の因子。（１３９）エクソン１３−２９に対応するTiam１の短縮型とTiamの全長型とを識別する能力を有する因子。
（１４０）上記Tiam１バリアントは、少なくとも配列番号２３の配列もしくはその改変体、またはその相補体を有する、項１３９に記載の因子。
（１４１）細胞の遊走能を測定する方法であって、
TSLC１活性のレベルを測定する工程を包含する、方法。
（１４２）上記レベルは、TSLC１の特異的因子によって測定される、項１４１に記載の方法。
（１４３）上記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１４２に記載の方法。
（１４４）上記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、項１４２に記載の方法。
（１４５）上記特異的因子は、配列番号１に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子である、項１４２に記載の方法。
（１４６）上記特異的因子は、配列番号２に示す配列のポリペプチドに対する抗体である、項１４２に記載の方法。
（１４７）上記細胞は、腎臓細胞である、項１４１に記載の方法。
（１４８）上記細胞は、MDCK細胞である、項１４１に記載の方法。
（１４９）上記遊走能は、E-カドヘリンおよびｂ−カテニンからなる群より選択される少なくとも１つの産物の発現の消失によって確認される、項１４１に記載の方法。
（１５０）上記遊走能は、ビメンチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、少なくとも１つの産物の発現の増加によって確認される、項１４１に記載の方法。
（１５１）細胞の遊走能を測定する試薬であって、
TSLC１活性のレベルを測定する因子を包含する、試薬。
（１５２）上記因子は、TSLC１の特異的因子である、項１５１に記載の試薬。
（１５３）上記特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１５２に記載の試薬。
（１５４）上記特異的因子は、標識されまたは標識され得る、項１５２に記載の試薬。
（１５５）上記特異的因子は、配列番号１に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子である、項１５２に記載の試薬。
（１５６）上記特異的因子は、配列番号２に示す配列のポリペプチドに対する抗体である、項１５２に記載の試薬。
（１５７）上記細胞は、腎臓細胞である、項１５２に記載の試薬。
（１５８）上記細胞は、MDCK細胞である、項１５２に記載の試薬。
（１５９）上記遊走能は、E-カドヘリンおよびｂ−カテニンからなる群より選択される少なくとも１つの産物の発現の消失によって確認される、項１５１に記載の試薬。
（１６０）上記遊走能は、ビメンチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、少なくとも１つの産物の発現の増加によって確認される、項１４１に記載の試薬。
（１６１）細胞中のTSLC1活性を測定する方法であって、
上記細胞の遊走能を測定する工程を包含する、方法。
（１６２）上記遊走能は、HGFによって惹起されたものである、項１６１に記載の方法。
（１６３）上記細胞は、腎臓細胞である、項１６１に記載の方法。
（１６４）上記細胞は、培養腎臓細胞である、項１６１に記載の方法。
（１６５）上記細胞は、MDCK細胞である、項１６１に記載の方法。
（１６６）細胞中のTSLC1活性を測定する試薬であって、上記細胞の遊走能を測定する因子を備える試薬。
（１６７）上記遊走能は、HGFによって惹起されたものである、項１６６に記載の試薬。
（１６８）上記細胞は、腎臓細胞である、項１６６に記載の試薬。
（１６９）上記細胞は、培養腎臓細胞である、項１６６に記載の試薬。
（１７０）上記細胞は、MDCK細胞である、項１６６に記載の試薬。
（１７１）細胞の遊走能を調節する方法であって、
細胞内のTSLC１活性を調節する工程を包含する、方法。
（１７２）上記調節は抑制である、項１７１に記載の方法。
（１７３）上記調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含する、項１７１に記載の方法。
（１７４）上記調節は、ＴＳＬＣ１の発現を調節することを包含する、項１７１に記載の方法。
（１７５）上記調節は、ＴＳＬＣ１を調節する調節因子により達成される、項１７１に記載の方法。
（１７６）上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１７５に記載の方法。
（１７７）上記調節は、ＴＳＬＣ１の発現をＲＮＡｉにより抑制することを包含する、項１７１に記載の方法。
（１７８）上記調節は、ＴＳＬＣ１の発現を抗体により抑制することを包含する、項１７１に記載の方法。
（１７９）上記調節は、ＴＳＬＣ１の優性欠失改変により抑制することを包含する、項１７１に記載の方法。
（１８０）上記ＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項１７１に記載の方法。
（１８１）上記ＲＮＡｉは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉである、項１７５に記載の方法。
（１８２）上記ＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列を有するＴＳＬＣ１のＲＮＡｉである、項１８１に記載の方法。
（１８３）上記TSLC１活性の調節は、上記細胞内においてTSLC１の発現をさせる工程を包含する、項１７１に記載の方法。
（１８４）上記TSLC１は、少なくとも細胞内ドメインを含む、項１８３に記載の方法。
（１８５）上記細胞は、腎臓細胞である、項１７１に記載の方法。
（１８６）上記細胞は、培養腎臓細胞である、項１７１に記載の方法。
（１８７）上記細胞は、MDCK細胞である、項１７１に記載の方法。
（１８８）細胞の遊走能を調節する試薬であって、細胞内のTSLC１活性を調節する因子を包含する、試薬。
（１８９）上記調節は抑制である、項１８８に記載の試薬。
（１９０）上記調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含する、項１８８に記載の試薬。
（１９１）上記調節は、ＴＳＬＣ１の発現を調節することを包含する、項１８８に記載の試薬。
（１９２）上記因子は、ＴＳＬＣ１を調節する調節因子を含む、項１８８に記載の試薬。
（１９３）上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、項１９２に記載の試薬。
（１９４）上記因子は、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉを包含する、項１８８に記載の試薬。
（１９５）上記因子は、ＴＳＬＣ１の抗体を包含する、項１８８に記載の試薬。
（１９６）上記因子は、ＴＳＬＣ１の優性欠失改変のための因子を包含する、項１８８に記載の試薬。
（１９７）上記ＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、項１８８に記載の試薬。
（１９８）上記ＲＮＡｉは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉである、項１９４に記載の試薬。
（１９９）上記ＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列を有するＴＳＬＣ１のＲＮＡｉである、項１８８に記載の試薬。
（２００）上記TSLC１活性の調節は、上記細胞内においてTSLC１の発現をさせる工程を包含する、項１８８に記載の試薬。
（２０１）上記TSLC１は、少なくとも細胞内ドメインを含む、項２００に記載の試薬。
（２０２）上記細胞は、腎臓細胞である、項１８８に記載の試薬。
（２０３）上記細胞は、培養腎臓細胞である、項１８８に記載の試薬。
（２０４）上記細胞は、MDCK細胞である、項１８８に記載の試薬。
以下に、本発明の好ましい実施形態を示すが、当業者は本発明の説明および当該分野における周知慣用技術からその実施形態などを適宜実施することができ、本発明が奏する作用および効果を容易に理解することが認識されるべきである。
本発明によれば、がん（特に、小細胞肺がんおよび関連するがんまたは新生物）およびその浸潤性の診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制のための技術が提供される。本発明により、細胞の遊走能を調べることによってTSLC1の活性を測定することができる。
以下、本発明を詳細に説明する。以下には、本発明が、必要に応じて、添付の図面を参照して例示の実施例により記載される。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
（定義）
以下に本明細書において特に使用される用語の定義を列挙する。
本明細書において「ＴＳＬＣ１」とは、肺非小細胞がんにおいてがん抑制遺伝子として報告された遺伝子である（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ Ｍ，Ｆｕｋｕｈａｒａ Ｈ，Ｎｏｂｕｋｕｎｉ Ｔ，ｅｔ ａｌ．TSLC1ｉｓ ａ ｔｕｍｏｒ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００１；２７：４２７−４３０）。また、ＴＳＬＣ１遺伝子は、多くの肺がんにおいて共通して欠失している染色体部分から単離された遺伝子であり、最近の研究から上皮細胞の接着機能に関与していると考えられている（Ｍａｓｕｄａ Ｍ，Ｙａｇｅｔａ Ｍ，Ｆｕｋｕｈａｒａ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ＴＳＬＣ１ ｉｓ ｉｎｖｏｌｖｅｄ ｉｎ ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ ａｄｈｅｓｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２００２；２７７：３１０１４−３１０１９）。肺がん等において、ＴＳＬＣ１遺伝子を含む染色体が欠失し、細胞接着能が低下することによって、がん細胞が他の臓器に転移しやすくなっていると考えられている。
形態学的形質変換は、がん細胞を正常な上皮細胞と区別するための基本的表現型である。ＴＳＬＣ１は、染色体フラグメント１１ｑ２３．２上にある腫瘍サプレッサー遺伝子であり、これは、機能的相補によって同定された（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｎｏｂｕｋｕｎｉ，Ｔ．，Ｋａｎｂｅ，Ｔ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｈ．Ｐ．，Ｐｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｍ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｙａ，Ｔ．，Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０．）。プロモーターのメチル化およびＴＳＬＣ１発現の喪失が、原発性肺がん、原発性食道がん、原発性膵臓がん、および種々の他のがんの進行期において頻繁に観察される（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｎｏｂｕｋｕｎｉ，Ｔ．，Ｋａｎｂｅ，Ｔ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｈ．Ｐ．，Ｐｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｍ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｙａ，Ｔ．，Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０．；Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００２）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１，６９３６−６９４８．）。ＴＳＬＣ１は、細胞間接着を媒介する免疫グロブリンスーパーファミリー分子をコードする（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｙａｇｅｔａ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｎｏｍｏｔｏ，Ａ．＆ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００２）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７７，３１０１４−３１０１９．）。ＴＳＬＣ１タンパク質の喪失は、原発性肺腺がんの浸潤性先端において主に見出された（Ｉｔｏ，Ａ．，Ｏｋａｄａ，Ｍ．，Ｕｃｈｉｎｏ，Ｋ．，Ｗａｋａｙａｍａ，Ｔ．，Ｋｏｍａ，Ｙ．，Ｉｓｅｋｉ，Ｓ．，Ｔｓｕｂｏｔａ，Ｎ．，Ｏｋｉｔａ，Ｙ．＆ Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｙ．（２００３ａ）．Ｌａｂ Ｉｎｖｅｓｔ，８３，１１７５−１１８３．）。従って、ＴＳＬＣ１は、上皮細胞接着に主に関与しているようであり、一方、ＴＳＬＣ１機能の喪失は、がん細胞が浸潤および／または転移するのをもたらし得る。最近、ＴＳＬＣ１は、上皮細胞接着においてのみならず、セルトーリ細胞への精子形成細胞の接着、線維芽細胞への肥満細胞の接着、および神経細胞のシナプス形成においても役割を有することが見出され、ＴＳＬＣ１／ＩＧＳＦ４／Ｎｅｃｌ−２／ＳｇＩＧＳＦ／ＲＡ１７５／ＳｙｎＣＡＭと呼ばれる（Ｂｉｅｄｅｒｅｒ，Ｔ．，Ｓａｒａ，Ｙ．，Ｍｏｚｈａｙｅｖａ，Ｍ．，Ａｔａｓｏｙ，Ｄ．，Ｌｉｕ，Ｘ．，Ｋａｖａｌａｌｉ，Ｅ．Ｔ．＆ Ｓｕｄｈｏｆ，Ｔ．Ｃ．（２００２）．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９７，１５２５−１５３１；Ｇｏｍｙｏ，Ｈ．，Ａｒａｉ，Ｙ．，Ｔａｎｉｇａｍｉ，Ａ．，Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．，Ｈａｔｔｏｒｉ，Ｍ．，Ｈｏｓｏｄａ，Ｆ．，Ａｒａｉ，Ｋ．，Ａｉｋａｗａ，Ｙ．，Ｔｓｕｄａ，Ｈ．，Ｈｉｒｏｈａｓｈｉ，Ｓ．，Ａｓａｋａｗａ，Ｓ．，Ｓｈｉｍｉｚｕ，Ｎ．，Ｓｏｅｄａ，Ｅ．，Ｓａｋａｋｉ，Ｙ．＆ Ｏｈｋｉ，Ｍ．（１９９９）．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，６２，１３９−１４６．； Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｎｏｂｕｋｕｎｉ，Ｔ．，Ｋａｎｂｅ，Ｔ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｇｈｏｓｈ，Ｈ．Ｐ．，Ｐｌｅｔｃｈｅｒ，Ｍ．，Ｉｓｏｍｕｒａ，Ｍ．，Ｏｎｉｚｕｋａ，Ｍ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．，Ｓｅｋｉｙａ，Ｔ．，Ｒｅｅｖｅｓ，Ｒ．Ｈ．，ａｎｄ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０．； Ｓｈｉｎｇａｉ，Ｔ．，Ｉｋｅｄａ，Ｗ．，Ｋａｋｕｎａｇａ，Ｓ．，Ｍｏｒｉｍｏｔｏ，Ｋ．，Ｔａｋｅｋｕｎｉ，Ｋ．，Ｉｔｏｈ，Ｓ．，Ｓａｔｏｈ，Ｋ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｍ．，Ｉｍａｉ，Ｔ．，Ｍｏｎｄｅｎ，Ｍ．＆ Ｔａｋａｉ，Ｙ．（２００３）．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７８，３５４２１−３５４２７．；Ｕｒａｓｅ，Ｋ．，Ｓｏｙａｍａ，Ａ．，Ｆｕｊｉｔａ，Ｅ．＆ Ｍｏｍｏｉ，Ｔ．（２００１）．Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ，１２，３２１７−２１．； Ｗａｋａｙａｍａ，Ｔ．，Ｏｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｍｉｚｕｎｏ，Ｋ．＆ Ｉｓｅｋｉ，Ｓ．（２００１）．Ｍｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ Ｄｅｖ，６０，１５８−１６４．）。
TSLC1の細胞質ドメインは、プロテイン４．１ファミリーの分子に対する結合モチーフを保有する。本発明者らは、ＴＳＬＣ１が、プロテイン４．１結合モチーフを介してＤＡＬ−１／４．１Ｂと結合することを以前に報告した（Ｙａｇｅｔａ，Ｍ．，Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｆｕｋａｍｉ，Ｔ．，Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．＆ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００２）．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６２，５１２９−５１３３．）。ＤＡＬ−１は、ＮＳＣＬＣ、髄膜腫、および乳がんにおける腫瘍サプレッサーの候補であり、プロテイン４．１ファミリー分子に属する。このプロテイン４．１ファミリー分子は、膜貫通タンパク質をアクチンおよびスペクトリンからなる細胞骨格に連結する（Ｓｕｎ，Ｃ．Ｘ．，Ｒｏｂｂ，Ｖ．Ａ．＆ Ｇｕｔｍａｎｎ，Ｄ．Ｈ．（２００２）．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ，１１５，３９９１−４０００．）。本発明者らはまた、ＴＳＬＣ１は、ＭＰＰ３（膜結合型グアニル酸キナーゼホモログ（ＭＡＧｕＫ）のメンバーである）に対して、ＴＳＬＣ１のカルボキシル末端にあるクラスＩＩ ＰＳＤ９５／Ｄｌｇ／ＺＯ−１（ＰＤＺ）ドメイン結合モチーフであるＥＹＦＩを介して結合することを示した（Ｆｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，Ｙａｇｅｔａ，Ｍ．，Ｆｕｋａｍｉ，Ｔ．，Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｔ．，Ｋｉｔａｍｕｒａ，Ｔ．＆ Ｍｕｒａｋａｍｉ，Ｙ．（２００３）．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２２，６１６０−６１６５．）。ＭＰＰ３のクラスＩＩ ＰＤＺドメインは、ＴＳＬＣ１との結合を担い、他の２つのＭＡＧｕＫタンパク質（ＭＰＰ１／ｐ５５およびＭＰＰ２／ＤＬＧ２）において保存されている（Ｍａｚｏｙｅｒ，Ｓ．，Ｇａｙｔｈｅｒ，Ｓ．Ａ．，Ｎａｇａｉ，Ｍ．Ａ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．Ａ．，Ｄｕｎｎｉｎｇ，Ａ．，ｖａｎ Ｒｅｎｓｂｕｒｇ，Ｅ．Ｊ．，Ａｌｂｅｒｔｓｅｎ，Ｈ．，Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．＆ Ｐｏｎｄｅｒ，Ｂ．Ａ．（１９９５）．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，２８，２５−３１．；Ｒｕｆｆ，Ｐ．，Ｓｐｅｉｃｈｅｒ，Ｄ．Ｗ．＆ Ｈｕｓａｉｎ−Ｃｈｉｓｈｔｉ，Ａ．（１９９１）．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，８８，６５９５−６５９９．）。ＭＰＰ１、ＭＰＰ２、およびＭＰＰ３は、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｓｔａｒｄｕｓｔ（Ｓｄｔ）のヒト対応物であると考えられ、細胞分極に関与する（Ｂａｃｈｍａｎｎ，Ａ．，Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｍ．，Ｔｈｅｉｌｅｎｂｅｒｇ，Ｅ．，Ｇｒａｗｅ，Ｆ．＆ Ｋｎｕｓｔ，Ｅ．（２００１）．Ｎａｔｕｒｅ，４１４，６３８−６４３．）。
本出願において、本発明者らは、ＤＬＡ−１およびＭＡＧｕＫが、互いに直接結合すること、そしてＴＳＬＣ１が、ＤＡＬ−１およびＭＡＧｕＫメンバーと３者結合タンパク質複合体を形成することを示す。ｓｉＲＮＡによるＴＳＬＣ１発現の抑制は、これらのタンパク質複合体が、成熟細胞接着を伴う上皮細胞構造の形成において重要な役割を果たすことを示す。
TSLC1／ＩＧＳＦ４Ａは、免疫グロブリンスーパーファミリーである細胞細胞接着分子（ＩｇＣＡＭ）（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３１０１４−３１０１９）のファミリーに属する単一の膜貫通型糖タンパク質をコードする、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）（Ｇｏｍｙｏ，Ｈ．，ら（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６２，１３９−１４６；およびＫｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，ら（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０）における腫瘍抑制遺伝子である。種々の組織におけるその多様な機能に起因して、ＴＳＬＣ１は、いくつかの異なる研究グループにより特徴付けられている。この遺伝子は、それゆえ、ＲＡ１７５（Ｆｕｊｉｔａ，Ｅ．，ら（２００３）Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２８７，５７−６６）、ＳｇＩＧＳＦ（Ｉｔｏ，Ａ．，ら（２００３）Ｂｌｏｏｄ １０１，２６０１−２６０８）、ＮｅｃＩ２（Ｓｈｉｎｇａｉ，Ｔ．，ら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３５４２１−３５４２７）およびＳｙｎＣＡＭ１（Ｂｉｅｄｅｒｅｒ，Ｔ．，ら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，１５２５−１５３１）としても知られている。原発性のＮＳＣＬＣにおいて、本発明者らは、Ｃ末端の１９アミノ酸残基の置き換えを生じるＴＳＬＣ１に２ ｂｐの欠失を発見し、このことは、ＴＳＬＣ１の細胞質ドメインが、腫瘍の抑制に重要であることを示している（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，ら（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０）。実際、細胞質ドメインは、ヌードマウスにおいて、ＴＳＬＣ１の腫瘍特性活性に必須であることが示された（Ｍａｏ，Ｘ．，ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，７９７９−７９８５）。ＴＳＬＣ１の細胞質テイルは、Ｃ末端に、プロテイン４．１（ｐｒｏｔｅｉｎ ４．１）と相互作用する傍膜配列（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ）（プロテイン４．１結合モチーフ：プロテイン４．１−ＢＭ）およびクラスＩＩ ＰＤＺ結合モチーフ（ＰＤＺ−ＢＭ）を含む。
本発明者らは、プロテイン４．１Ｂ／ＤＡＬ−１（プロテイン４．１ファミリーのメンバー）が、ＴＬＳＣ１をアクチン骨格に接続すること、そして、このそうご作用が、アクチンの再構築に関与することを実証した（Ｙａｇｅｔａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，５１２９−５１３３）。他の研究グループおよび本発明者らは、ＴＳＬＣ１がまた、そのクラスＩＩ ＰＤＺドメインを通して膜関連グアニル酸キナーゼホモログ（ＭＡＧｕＫ）と相互作用することを報告し（Ｓｈｉｎｇａｉ，Ｔ．，ら（２００３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８，３５４２１−３５４２７；Ｂｉｅｄｅｒｅｒ，Ｔ．，ら（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９７，１５２５−１５３１；およびＦｕｋｕｈａｒａ，Ｈ．，ら（２００３）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２２，６１６０−６１６５）、そして、ＴＳＬＣ１、プロテイン４．１およびＭＡＧｕＫが、３分子から構成される複合体を形成することを示唆した。ＴＳＬＣ１は、最初に、ヌードマウスにおいて、ヒト肺腺がんであるＡ５４９細胞のその腫瘍形成能に基づいて同定された（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，ら（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０）。Ａ５４９細胞におけるＴＳＬＣ１発現の回復は、脾臓から肝臓への転移を阻害した（Ｙａｇｅｔａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，５１２９−５１３３）。ＴＬＳＣ１の欠失は、進行した肺がんおよび多くの他のヒトがんにおいて高頻度で観察されている（Ｋｕｒａｍｏｃｈｉ，Ｍ．，ら（２００１）Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ ２７，４２７−４３０，１１）。これらの観察は、ＴＳＬＣ１のＣ末端モチーフが、腫瘍の浸潤および／または転移において重要な役割を演じることを強く示唆するが、なお、腫瘍抑制におけるこれらのモチーフの正確な役割は、不明瞭なままである。
該ｃ−Ｋｉｔ受容体は、新規チロシンキナーゼインヒビターであるメシル酸イマチニブ（ＳＴＩ５７１またはＧｌｅｅｖｅｃ［登録商標］としても言及される（Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５７：２２０３−８； Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６１：３６６０−８； Ｋｒｙｓｔａｌ，Ｇ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６：３３１９−２６； Ｔｕｖｅｓｏｎ，Ｄ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２０：５０５４−８； Ｗａｎｇ，Ｗ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ３５２１−８））を含む、様々なインヒビターで阻害され得る。化学名４−（４−メチルピペラジン−１−イルメチル）−Ｎ−［４−メチル−３−（４−ピリジン−３−イル）−ピリミジン−２−イルアミノ）−フェニル］−ベンズアミドを有するＳＴＩ５７１はさらに、ＥＰ ０ ５６４ ４０９で記載され、そして、メタンスルホン酸塩の形、特に、好ましいβ結晶形がＷＯ ９９／０３８５４に記載されている。
TSLC1の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
TSLC1のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号２に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号１に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号２に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
TSLC1の代表的な配列は、配列番号１（核酸配列）および配列番号２（アミノ酸配列）において示される。
TSLC1は、ヒトのほか、他の動物（例えば、哺乳動物）でもそのホモログ（本明細書において、「対応する」遺伝子などという）が知られている。従って、本明細書においてＴＳＬＣ１は、通常、特に言及しない場合は、ヒトのほか、生物一般において存在するＴＳＬＣ１を指す。
本明細書において「ＴＳＬＣ１の分子経路」とは、ＴＳＬＣ１が媒介するシグナル伝達経路をいい、本発明において、Ｔｉａｍ１および低分子量Ｇ共役タンパク質Ｒａｃ１が関与し、その因子であることが明らかになった。従って、本明細書では、ＴＳＬＣ１の分子経路というときには、ＴＳＬＣ１のほか、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１が因子として存在することが理解される。
本明細書において「TSLC1」の細胞内ドメインとは、配列番号２の３９７−４４２までのことをいう。細胞内ドメインを欠如させるとTSLC1の活性が消滅することが本発明において見出された。この活性としては、例えば、遊走能の抑制を挙げることができる。
本明細書において「Ｒａｃ１」とは、がん遺伝子のＲａｓサブファミリーの一つであり、Ｒａｓサブファミリーは、Ｒｈｏ，Ｒａｃ１およびＣｄｃ４２からなる。Ｒａｓは、様々なシグナル伝達経路を制御するＧＴＰａｓｅスーパーファミリーに属する。Ｒａｓは、細胞増殖および分化の制御に関与している （Ｂｏｇｕｓｋｉ．Ｍ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，６４３−６５４）。これらのサブファミリーは、細胞増殖の制御、特に細胞の形質転 換の制御、ならびに、細胞接着の形成の調節、および増殖因子刺激時のアクチン細胞骨格変化の調節に関与している（Ｃｏｓｏ．Ｏ．Ａ．， Ｃｈｉａｒｉｅｌｌｏ．Ｍ．，Ｙｕ．Ｊ．−Ｃ．，Ｔｅｒａｍｏｔｏ．Ｈ．，Ｃｒｅｓｐｏ．Ｐ．，Ｘｕ．Ｎｕ．，Ｍｉｋｉ．Ｔ．ａｎｄ Ｇｕｔｋｉｎｄ．Ｊ．Ｓ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，１１３７−１１４６：Ｈｉｌｌ．Ｃ．Ｓ．，Ｗｙｎｎｅ．Ｊ．ａｎｄ Ｔｒｅｉｓｍａｎ．Ｒ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，１１５９−１１７０：Ｋｏｚｍａ．Ｒ．，Ａｈｍｅｄ．Ｓ．，Ｂｅｓｔ．Ａ．ａｎｄ Ｌｉｍ．Ｌ．（１９９５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１５，１９４２−１９５２：Ｍｉｎｄｅｎ．Ａ．，Ｌｉｎ．Ａ．，Ｃｌａｒｅｔ．Ｆ．−Ｘ．， Ａｂｏ．Ａ．ａｎｄ Ｋａｒｉｎ．Ｍ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８１，１１４７−１１５７：Ｎｏｂｅｓ．Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｈａｌｌ．Ａ．（１９９５）Ｃｅｌｌ ８ｌ，５３−６２：Ｏｌｓｏｎ．Ｍ．Ｆ．，Ａｓｈｗｏｒｔｈ．Ａ．ａｎｄ Ｈａｌｌ．Ａ．（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６９，１２７０−１２７２）。しかし、小細胞肺がんなどがん、新生物などに関しては関連が知られていなかった。Ｒａｃ１は、葉状突起と呼ばれるアクチンに富んだ突起を形成することで細胞運動の際の駆動力を提供している。
Ｒａｓファミリーのタンパク質は、その全部に共通に、不活性（ＧＤＰ結合）状態と活性（ＧＴＰ結合）状態との間を転換する。従って、これらのＧＴＰａｓｅは、特定の経路を調節するために、分子スイッチとして働き、情報を処理し、そして伝達する。
ＧＴＰ状態とＧＤＰ状態との間を転換する性質に基づいて、ＲａｓおよびＲａｓ近縁ＧＴＰａｓｅのヌクレオチド状態を制御するタンパク質が同定および精製されて いる（Ｂｏｇｕｓｋｉ．Ｍ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，６４３−６５４）。ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解を検査することによって、多数のＲａｓファミリーのタンパク質において、そのＧＴＰａｓｅの活性化タンパク質（ＧＡＰ）が解析された（Ｂｏｇｕｓｋｉ．Ｍ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，６４３−６５４：Ｂａｒｆｏｄ．Ｅ．Ｔ．，Ｚｈｅｎｇ．Ｙ．，Ｋｕａｎｇ．Ｗ．−Ｊ．，Ｈａｒｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｅｖａｎｓ．Ｔ．，Ｃｅｒｉｏｎｅ．Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚ．Ａ．（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８，２６０５９−２６０６２：Ｌａｍａｒｃｈｅ．Ｎ．ａｎｄ Ｈａｌｌ．Ａ．（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１０，４３６−４４０：Ｃｅｒｉｏｎｅ．Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｚｈｅｎｇ．Ｙ．（１９９６）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ８，２１６−２２２）。最後の参考文献では、ＲａｓおよびＲａｓ近縁ＧＴＰａｓｅのグアニンヌクレオチド状態に影響するタンパク質の特性について良く考察さ れている。ＧＤＰの解離を抑制する性質に基づいて、グアニンヌクレオチド解離抑制因子（ＧＤＩ）が同定された。これらはＧＴＰ状態にも結合して、内因性及 びＧＡＰ刺激性のＧＴＰ加水分解を抑制することが見出された（Ｂｏｇｕｓｋｉ．Ｍ．Ｓ．ａｎｄ ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，Ｆ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，６４３−６５４）。一般に、ＧＡＰおよび効果器（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）は、ＧＴＰ結合状態に対して高い親和性を有する。一方、ＧＤＩタンパク質は、ＧＤＰ結合状態に最も強く結合する。この様な特性を利用して、Ｃｄｃ４２（Ｂａｇｒｏｄｉａ．Ｓ．，Ｔａｙｌｏｒ．Ｓ．Ｊ．，Ｃｒｅａｓｙ．Ｃ．Ｌ．， Ｃｈｅｒｎｏｆｆ．Ｊ．ａｎｄ Ｃｅｒｉｏｎｅ．Ｒ．Ａ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２２７３１−２２７３７：Ｍａｎｓｅｒ．Ｅ．，Ｌｅｕｎｇ．Ｔ．， Ｓａｌｉｈｕｄｄｉｎ．Ｈ．，Ｚｈａｏ．Ｚ．−ｓ．ａｎｄ Ｌｉｍ．Ｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３６７，４０−４６：Ｍａｒｔｉｎ．Ｇ．Ａ．，Ｂｏｌｌａｇ．Ｇ．，ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ．Ｆ．ａｎｄ Ａｂｏ．Ａ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４，１９７０−１９７８）、Ｒａｓ（Ｍｏｏｄｉｅ．Ｓ．Ａ．，Ｗｉｌｌｕｍｓｅｎ．Ｂ．Ｍ．，Ｗｅｂｅｒ．Ｍ．Ｊ．ａｎｄ Ｗｏｌｆｍａｎ．Ａ．（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０，１６５８−１６６１：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｖｉｃｉａｎａ．Ｐ．，Ｗａｒｎｅ．Ｐ．Ｈ．，Ｄｈａｎｄ．Ｒ．Ｖａｎｈａｅｓｅｂｒｏｅｃｋ．Ｂ．， Ｇｏｕｔ．Ｉ．，Ｆｒｙ．Ｍ．Ｊ．，Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ．Ｍ．Ｄ．ａｎｄ Ｄｏｗｎｗａｒｄ．Ｊ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ ３７０，５２７−５３２）およびＲｈｏ（Ｌｅｕｎｇ．Ｔ．，Ｍａｎｓｅｒ．Ｅ．，Ｔａｎ．Ｌ．ａｎｄ Ｌｉｍ．Ｌ．（１９９５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０，２９０５１−２９０５４：Ｗａｔａｎａｂｅ．Ｇ．，Ｓａｉｔｏ．Ｙ．，Ｍａｄａｕｌｅ．Ｐ．， Ｉｓｈｉｚａｋｉ．Ｔ．，Ｆｕｊｉｓａｗａ．Ｋ．，Ｍｏｒｉｉ．Ｎ．，Ｍｕｋａｉ．Ｈ．，Ｏｎｏ．Ｙ．，Ｋａｋｉｚｕｋｉ．Ａ．ａｎｄ Ｎａｒｕｍｉｙａ．Ｓ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７１，６４５−６４８）の効果器を精製した。Ｃｄｃ４２Ｈｓ−ＧＴＰを利用した親和的方法によって、Ｃｄｃ４２によって誘導される細胞骨格変化の潜在的 な仲介因子であるＩＱＧＡＰ１が解析された（Ｈａｒｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｃａｌｌｏｗ．Ｍ．，Ｓｏｕｚａ．Ｂ．ａｎｄ Ｐｏｌａｋｉｓ．Ｐ．（１９９６）ＥＭＢＯ Ｊ．１５，２９９７−３００５）。
この親和的方法の改法を用いて、グアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）を同定および精製することもできる。ヌクレオチド欠失状態のＧ−タンパク質に優先的に相 互作用する性質に基づいて、他の制御タンパク質から、ＧＥＦを識別することができる（Ｈａｒｔ．Ｍ．Ｊ．，Ｅｖａ．Ａ．，Ｚａｎｇｒｉｌｌｉ．Ｄ．， Ａａｒｏｎｓｏｎ．Ｓ．Ａ．，Ｅｖａｎｓ．Ｔ．，Ｃｅｒｉｏｎｅ．Ｒ．Ａ．ａｎｄ Ｚｈｅｎｇ．Ｙ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，６２−６５：Ｍｏｓｔｅｌｌｅｒ，Ｒ．Ｄ．，Ｈａｎ．Ｊ．ａｎｄ Ｂｒｏｅｋ．Ｄ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４，１１０４−１１１２）。Ｒａｓ類似タンパク質の活性化において、ＧＥＦは、ＧＤＰの解離とそれに続くＧＴＰの結合を促進することによって、重要な機能を果たす。例えば、増殖因子の刺激によって、Ｒａｓ特異的ＧＥＦであるＳｏｓが転移することによって、Ｒａｓは、ＧＴＰ結合型に転換する（Ｂｕｄａｙ．Ｌ．ａｎｄ Ｄｏｗｎｗａｒｄ．Ｊ．（１９９３）Ｃｅｌｌ ７３，６１１−６２０）。Ｒａｃ１ファミリーのタンパク質を特異的に活性化するＧＥＦを解析することによって、それらのＧＴＰａｓｅが関与するシグナル伝達経路が解明され、従って、、細胞増殖の分子機構がより良く理解されるだろう。更に、制御されない細胞増殖を原因とする疾患を予防および治療する薬を見出すことができる。Ｒａｃ１は、シグナル伝達および細胞増殖において中心的な機能を果たすので、現在、Ｒａｃ１−ＧＥＦの同定および解析は、科学上かなり注目されている。Ｒａｃ１−ＧＥＦの１つとして、Ｔｉａｍ１が知られている（Ｍｉｃｈｉｅｌｓ，Ｆ．，Ｈａｂｅｔｓ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｔａｍ，Ｊ．Ｃ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｋａｍｍｅｎ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｇ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７５，３３８−３４０．Ｓｅｅ ａｌｓｏ．Ｅｖａ．Ａ．ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ．Ｓ．Ａ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６，２７３−２７５：Ｔｏｋｓｏｚ．Ｄ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｄ．Ａ．（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９，６２１−６２８）。
ＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）としてこれまでに数１０種類のものが知られており、これらＧＥＦの中でも、Ｒａｃ１特異的なＧＥＦとして機能する分子として、胸腺腫細胞株の浸潤を規定するＴｉａｍ１，２（例えば、Ｃｅｌｌ，７７，５３７−５４９，１９９４、Ｎａｔｕｒｅ，３７５，３３８−３４０，１９９５参照。）や、Ｔ細胞受容体シグナルを制御するＶａｖ１（例えば、Ｎａｔｕｒｅ，３８５，１６９−１７２，１９９７参照。）の他Ｖａｖ２、Ｖａｖ３や、Ｔｒｉｏ（例えば、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１１３，７２９−７３９，２０００参照。）や、ＳＴＥＦ（例えば、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７，２８６０−２８６８，２００２参照。）や、Ｐ−Ｒｅｘ１（例 えば、非特許文献２１参照。）が知られており、これら５種類はいずれも共通のドメインをもっており、ＧＴＰをＲａｃ１に付与する機能を有している。
Ｒａｃ１の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号５に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
Ｒａｃ１のアミノ酸配列としては、
（ａ）配列番号６に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号６に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号５に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号６に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
Ｒａｃ１の代表的な配列は、配列番号５（核酸配列）および配列番号６（アミノ酸配列）において示される。
本明細書においてＴｉａｍ１とは、Ｒａｃ１特異的なＧＤＰ／ＧＴＰ交換因子（ＧＥＦ）として機能する分子として同定された分子をいう（Ｍｉｃｈｉｅｌｓ，Ｆ．，Ｈａｂｅｔｓ，Ｇ．Ｇ．，Ｓｔａｍ，Ｊ．Ｃ．，ｖａｎ ｄｅｒ Ｋａｍｍｅｎ，Ｒ．Ａ．，ａｎｄ Ｃｏｌｌａｒｄ，Ｊ．Ｇ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ ３７５，３３８−３４０．Ｓｅｅ ａｌｓｏ．Ｅｖａ．Ａ．ａｎｄ Ａａｒｏｎｓｏｎ．Ｓ．Ａ．（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ ３１６，２７３−２７５：Ｔｏｋｓｏｚ．Ｄ．ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ．Ｄ．Ａ．（１９９４）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ９，６２１−６２８）。
Ｔｉａｍ１の代表的なヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号３に記載の塩基配列またはそのフラグメント配列を有するポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドまたはそのフラグメントをコードするポリヌクレオチド；
（ｃ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｄ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体もしくは対立遺伝子変異体またはそのフラグメントである、ポリヌクレオチド；
（ｅ）配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドの種相同体またはそのフラグメントをコードする、ポリヌクレオチド；
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドにストリンジェント条件下でハイブリダイズし、かつ生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；または
（ｇ）（ａ）〜（ｅ）のいずれか１つのポリヌクレオチドまたはその相補配列に対する同一性が少なくとも７０％である塩基配列からなり、かつ、生物学的活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
であり得る。
Ｔｉａｍ１のアミノ酸配列は、
（ａ）配列番号４に記載のアミノ酸配列またはそのフラグメントからなる、ポリペプチド；
（ｂ）配列番号４に記載のアミノ酸配列において、１以上のアミノ酸が置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド；
（ｃ）配列番号３に記載の塩基配列のスプライス変異体または対立遺伝子変異体によってコードされる、ポリペプチド；
（ｄ）配列番号４に記載のアミノ酸配列の種相同体である、ポリペプチド；または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のいずれか１つのポリペプチドに対する同一性が少なくとも７０％であるアミノ酸配列を有し、かつ、生物学的活性を有する、ポリペプチド、
であり得る。
Ｔｉａｍ１の代表的な配列は、配列番号３（核酸配列）および配列番号４（アミノ酸配列）において示される。
本明細書において「Ｔｉａｍ１の短縮型」とは、上記Ｔｉａｍ１の全長よりも短い型の配列を有する核酸分子をいう。本発明では、代表的に、エクソン１４−２９に対応するバリアントを挙げることができるがこれに限定されない。本発明は、エクソン１４−２９に対応するバリアントまたは配列番号２３に示す配列またはその改変体（例えば、１以上（代表的には１または数個）の核酸が、置換、付加および欠失からなる群より選択される１つの変異を有する改変体ポリペプチドまたはそのフラグメントであって、生物学的活性を有する改変体ポリペプチドをコードする改変体、好ましくは、全長Ｔｉａｍ１とは異なる改変体である。）を有する核酸分子の発現が、がん細胞の浸潤性と密接な関連を有しており、診断薬として使用可能であることを見出した。そのようなエクソン１４−２９の検出のための手段としては、例えば、特異的に増幅させるプライマー（例えば、配列番号２１、２２、２５、２６、２８および２９からなる群より選択される配列またはその相補体を有する核酸分子）または特異的にハイブリダイズするプローブ（配列番号２３、２７および３０からなる群より選択される配列またはその相補体を有する核酸分子）等を挙げることができる。
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の要素（例えば、光、放射能、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、有機低分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリーで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）など）、これらの複合分子が挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
したがって、本明細書においてポリヌクレオチドまたはポリペプチドなどの生物学的因子に対して「特異的に相互作用する因子」とは、そのポリヌクレオチドまたはそのポリペプチドなどの生物学的因子に対する親和性が、他の無関連の（特に、同一性が３０％未満の）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対する親和性よりも、代表的には同等またはより高いか、好ましくは有意に（例えば、統計学的に有意に）高いものを包含する。そのような親和性は、例えば、ハイブリダイゼーションアッセイ、結合アッセイなどによって測定することができる。本明細書において第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」とは、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して、第二の物質または因子以外の物質または因子（特に、第二の物質または因子を含むサンプル中に存在する他の物質または因子）に対するよりも高い親和性で相互作用することをいう。物質または因子について特異的な相互作用としては、例えば、核酸におけるハイブリダイゼーション、タンパク質における抗原抗体反応、リガンド−レセプター反応、酵素−基質反応など、核酸およびタンパク質の両方が関係する場合、転写因子とその転写因子の結合部位との反応など、タンパク質−脂質相互作用、核酸−脂質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。従って、物質または因子がともに核酸である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、第一の物質または因子が、第二の物質または因子に対して少なくとも一部に相補性を有することが包含される。また例えば、物質または因子がともにタンパク質である場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」こととしては、例えば、抗原抗体反応による相互作用、レセプター−リガンド反応による相互作用、酵素−基質相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。２種類の物質または因子がタンパク質および核酸を含む場合、第一の物質または因子が第二の物質または因子に「特異的に相互作用する」ことには、転写因子と、その転写因子が対象とする核酸分子の結合領域との間の相互作用が包含される。
本明細書中で使用される「化合物」は、任意の識別可能な化学物質または分子を意味し、これらには、低分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチド、または核酸が挙げられるが、これらに限定されず、そしてこのような化合物は、天然物または合成物であり得る。
本明細書において「有機低分子」とは、有機分子であって、比較的分子量が小さなものをいう。通常有機低分子は、分子量が約１０００以下のものをいうが、それ以上のものであってもよい。有機低分子は、通常当該分野において公知の方法を用いるかそれらを組み合わせて合成することができる。そのような有機低分子は、生物に生産させてもよい。有機低分子としては、例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、有機低分子、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、医薬品として利用され得る低分子（例えば、低分子リガンドなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「リガンド」とは、あるタンパク質に特異的に結合する物質をいう。例えば，細胞膜上に存在する種々のレセプタータンパク質分子と特異的に結合するレクチン、抗原、抗体、ホルモン、神経伝達物質などがリガンドとして挙げられる。ＴＳＬＣ１の分子経路における因子がレセプターの場合は、その相手は、リガンドと称される。
本明細書において「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされた複合体をさし得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）などが挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変が包含される。特に言及する場合、本発明の「ポリペプチド」は、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）を指すこともある。
本明細書において「アミノ酸」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「誘導体アミノ酸」または「アミノ酸アナログ」とは、天然に存在するアミノ酸とは異なるがもとのアミノ酸と同様の機能を有するものをいう。そのような誘導体アミノ酸およびアミノ酸アナログは、当該分野において周知である。
本明細書において「天然のアミノ酸」とは、天然のアミノ酸のＬ−異性体を意味する。天然のアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリジンである。特に示されない限り、本明細書でいう全てのアミノ酸はＬ体である。
本明細書において「非天然アミノ酸」とは、タンパク質中で通常は天然に見出されないアミノ酸を意味する。非天然アミノ酸の例として、上述のＤ型アミノ酸、ノルロイシン、パラ−ニトロフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、パラ−フルオロフェニルアラニン、３−アミノ−２−ベンジルプロピオン酸、ホモアルギニンのＤ体またはＬ体およびＤ−フェニルアラニンが挙げられる。
本明細書において「アミノ酸アナログ」とは、アミノ酸ではないが、アミノ酸の物性および／または機能に類似する分子をいう。アミノ酸アナログとしては、例えば、エチオニン、カナバニン、２−メチルグルタミンなどが挙げられる。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と同様な様式で機能する化合物をいう。
アミノ酸は、その一般に公知の３文字記号か、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎにより推奨される１文字記号のいずれかにより、本明細書中で言及され得る。ヌクレオチドも同様に、一般に受け入れられた１文字コードにより言及され得る。
本明細書において「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書において同じ意味で使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ ８：９１−９８（１９９４））。
本明細書において「ヌクレオチド」は、天然のものでも非天然のものでもよい。「ヌクレオチド誘導体」または「ヌクレオチドアナログ」とは、天然に存在するヌクレオチドとは異なるがもとのヌクレオチドと同様の機能を有するものをいう。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログは、当該分野において周知である。そのようなヌクレオチド誘導体およびヌクレオチドアナログの例としては、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、２’−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド型核酸（ＰＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
用語「核酸」はまた、本明細書において、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと互換可能に使用される。特定の核酸配列はまた、「スプライス改変体」を包含する。同様に、核酸によりコードされた特定のタンパク質は、その核酸のスプライス改変体によりコードされる任意のタンパク質を暗黙に包含する。その名が示唆するように「スプライス改変体」は、遺伝子のオルタナティブスプライシングの産物である。転写後、最初の核酸転写物は、異なる（別の）核酸スプライス産物が異なるポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライス改変体の産生機構は変化するが、エキソンのオルタナティブスプライシングを含む。読み過し転写により同じ核酸に由来する別のポリペプチドもまた、この定義に包含される。スプライシング反応の任意の産物（組換え形態のスプライス産物を含む）がこの定義に含まれる。本発明において用いられる場合、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）はまた、この核酸形態をとり得る。
本明細書において「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいう。通常染色体上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定する遺伝子を構造遺伝子といい、その発現を左右する遺伝子を調節遺伝子という。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」および「核酸」ならびに／あるいは「タンパク質」「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」をさすことがある。
本明細書において遺伝子の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。
本明細書ではアミノ酸および塩基配列の類似性、相同性および同一性の比較は、配列分析用ツールであるＢＬＡＳＴを用いてデフォルトパラメータを用いて算出される。同一性の検索は例えば、ＮＣＢＩのＢＬＡＳＴ ２．２．９ （２００４．５．１２ 発行）を用いて行うことができる。本明細書における同一性の値は通常は上記ＢＬＡＳＴを用い、デフォルトの条件でアラインした際の値をいう。ただし、パラメーターの変更により、より高い値が出る場合は、最も高い値を同一性の値とする。複数の領域で同一性が評価される場合はそのうちの最も高い値を同一性の値とする。
本明細書において「対応する」アミノ酸または核酸とは、あるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸またはヌクレオチドと同様の作用を有するか、または有することが予測されるアミノ酸またはヌクレオチドをいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、アンチセンス分子であれば、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分であり得る。また、本発明の活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）では、対応するアミノ酸は、例えば、リン酸化される部位であり得る。別の実施形態では、本発明の活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）では、対応するアミノ酸は、二量体化を担うアミノ酸であり得る。このような「対応する」アミノ酸または核酸は、一定範囲にわたる領域またはドメインであってもよい。従って、そのような場合、本明細書において「対応する」領域またはドメインと称される。
本明細書において「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子（例えば、ポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子）をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子に対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスのＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）Ａ、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）Ｂなどの遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物（ヒト、ラット、ブタ、ウシなど）においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスのＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）Ａ、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）Ｂなどの遺伝子）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
本明細書において「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。
本明細書において「ストリンジェントな条件でハイブリダイズするポリヌクレオチド」とは、当該分野で慣用される周知の条件をいう。本発明のポリヌクレオチド中から選択されたポリヌクレオチドをプローブとして、コロニー・ハイブリダイゼーション法、プラーク・ハイブリダイゼーション法あるいはサザンブロットハイブリダイゼーション法などを用いることにより、そのようなポリヌクレオチドを得ることができる。具体的には、コロニーあるいはプラーク由来のＤＮＡを固定化したフィルターを用いて、０．７〜１．０ＭのＮａＣｌ存在下、６５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１〜２倍濃度のＳＳＣ（ｓａｌｉｎｅ−ｓｏｄｉｕｍ ｃｉｔｒａｔｅ）溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１５ｍＭ クエン酸ナトリウムである）を用い、６５℃条件下でフィルターを洗浄することにより同定できるポリヌクレオチドを意味する。ハイブリダイゼーションは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ １〜３８、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ １：Ｃｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）などの実験書に記載されている方法に準じて行うことができる。ここで、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列からは、好ましくは、Ａ配列のみまたはＴ配列のみを含む配列が除外される。従って、本発明において使用されるポリペプチド（例えば、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）には、本発明で特に記載されたポリペプチドをコードする核酸分子に対して、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸分子によってコードされるポリペプチドも包含される。
本明細書において「ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチド」とは、上記ハイブリダイズ条件下で別のポリヌクレオチドにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドをいう。ハイブリダイズ可能なポリヌクレオチドとして具体的には、配列番号２、４、６などで表されるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列と少なくとも６０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、好ましくは８０％以上の相同性を有するポリヌクレオチド、さらに好ましくは９５％以上の相同性を有するポリヌクレオチドを挙げることができる。核酸配列の相同性は、たとえばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−４１０（１９９０））が開発したアルゴリズムを使用した検索プログラムＢＬＡＳＴを用いることにより、ｓｃｏｒｅで類似度が示される。
本明細書において「高度にストリンジェントな条件」は、核酸配列において高度の相補性を有するＤＮＡ鎖のハイブリダイゼーションを可能にし、そしてミスマッチを有意に有するＤＮＡのハイブリダイゼーションを除外するように設計された条件をいう。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、主に、温度、イオン強度、およびホルムアミドのような変性剤の条件によって決定される。このようなハイブリダイゼーションおよび洗浄に関する「高度にストリンジェントな条件」の例は、０．００１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、６５〜６８℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および５０％ ホルムアミド、４２℃である。このような高度にストリンジェントな条件については、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔ ａｌ．，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ，Ｙ．１９８９）；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＶ、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）．Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄを参照のこと。必要により、よりストリンジェントな条件（例えば、より高い温度、より低いイオン強度、より高いホルムアミド、または他の変性剤）を、使用してもよい。他の薬剤が、非特異的なハイブリダイゼーションおよび／またはバックグラウンドのハイブリダイゼーションを減少する目的で、ハイブリダイゼーション緩衝液および洗浄緩衝液に含まれ得る。そのような他の薬剤の例としては、０．１％ウシ血清アルブミン、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％ピロリン酸ナトリウム、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＮａＤｏｄＳＯ４またはＳＤＳ）、Ｆｉｃｏｌｌ、Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理されたサケ精子ＤＮＡ（または別の非相補的ＤＮＡ）および硫酸デキストランであるが、他の適切な薬剤もまた、使用され得る。これらの添加物の濃度および型は、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに実質的に影響を与えることなく変更され得る。ハイブリダイゼーション実験は、通常、ｐＨ６．８〜７．４で実施されるが；代表的なイオン強度条件において、ハイブリダイゼーションの速度は、ほとんどｐＨ独立である。Ａｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ ＡｃｉｄＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、第４章、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を参照のこと。
ＤＮＡ二重鎖の安定性に影響を与える因子としては、塩基の組成、長さおよび塩基対不一致の程度が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、当業者によって調整され得、これらの変数を適用させ、そして異なる配列関連性のＤＮＡがハイブリッドを形成するのを可能にする。完全に一致したＤＮＡ二重鎖の融解温度は、以下の式によって概算され得る。
Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ［Ｎａ＋］）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−６００／Ｎ−０．７２（％ホルムアミド）
ここで、Ｎは、形成される二重鎖の長さであり、［Ｎａ＋］は、ハイブリダイゼーション溶液または洗浄溶液中のナトリウムイオンのモル濃度であり、％Ｇ＋Ｃは、ハイブリッド中の（グアニン＋シトシン）塩基のパーセンテージである。不完全に一致したハイブリッドに関して、融解温度は、各１％不一致（ミスマッチ）に対して約１℃ずつ減少する。
本明細書において「中程度にストリンジェントな条件」とは、「高度にストリンジェントな条件」下で生じ得るよりも高い程度の塩基対不一致を有するＤＮＡ二重鎖が、形成し得る条件をいう。代表的な「中程度にストリンジェントな条件」の例は、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム、０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム、５０〜６５℃、または０．０１５Ｍ 塩化ナトリウム、０．００１５Ｍ クエン酸ナトリウム、および２０％ホルムアミド、３７〜５０℃である。例として、０．０１５Ｍナトリウムイオン中、５０℃の「中程度にストリンジェントな」条件は、約２１％の不一致を許容する。
本明細書において「高度」にストリンジェントな条件と「中程度」にストリンジェントな条件との間に完全な区別は存在しないことがあり得ることが、当業者によって理解される。例えば、０．０１５Ｍナトリウムイオン（ホルムアミドなし）において、完全に一致した長いＤＮＡの融解温度は、約７１℃である。６５℃（同じイオン強度）での洗浄において、これは、約６％不一致を許容にする。より離れた関連する配列を捕獲するために、当業者は、単に温度を低下させ得るか、またはイオン強度を上昇し得る。
約２０ヌクレオチドまでのオリゴヌクレオチドプローブについて、１ＭＮａＣｌにおける融解温度の適切な概算は、
Ｔｍ＝（１つのＡ−Ｔ塩基につき２℃）＋（１つのＧ−Ｃ塩基対につき４℃）
によって提供される。なお、６×クエン酸ナトリウム塩（ＳＳＣ）におけるナトリウムイオン濃度は、１Ｍである（Ｓｕｇｇｓら、ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌＢｉｏｌｏｇｙＵｓｉｎｇ Ｐｕｒｉｆｉｅｄ Ｇｅｎｅｓ、６８３頁、ＢｒｏｗｎおよびＦｏｘ（編）（１９８１）を参照のこと）。
本明細書において「単離された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子が天然に存在する生物体の細胞内の他の生物学的因子（例えば、核酸である場合、核酸以外の因子および目的とする核酸以外の核酸配列を含む核酸；タンパク質である場合、タンパク質以外の因子および目的とするタンパク質以外のアミノ酸配列を含むタンパク質など）から実質的に分離または精製されたものをいう。「単離された」核酸およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製された核酸およびタンパク質が含まれる。したがって、単離された核酸およびタンパク質は、化学的に合成した核酸およびタンパク質を包含する。
本明細書において「精製された」生物学的因子（例えば、核酸またはタンパク質など）とは、その生物学的因子に天然に随伴する因子の少なくとも一部が除去されたものをいう。したがって、通常、精製された生物学的因子におけるその生物学的因子の純度は、その生物学的因子が通常存在する状態よりも高い（すなわち濃縮されている）。
本明細書中で使用される用語「精製された」および「単離された」は、好ましくは少なくとも７５重量％、より好ましくは少なくとも８５重量％、よりさらに好ましくは少なくとも９５重量％、そして最も好ましくは少なくとも９８重量％の、同型の生物学的因子が存在することを意味する。
本明細書において遺伝子、ポリヌクレオチド、ポリペプチドなどの「発現」とは、その遺伝子などがインビボで一定の作用を受けて、別の形態になることをいう。好ましくは、遺伝子、ポリヌクレオチドなどが、転写および翻訳されて、ポリペプチドの形態になることをいうが、転写されてｍＲＮＡが作製されることもまた発現の一態様であり得る。より好ましくは、そのようなポリペプチドの形態は、翻訳後プロセシングを受けたものであり得る。好ましい実施形態では、そのような発現されたポリペプチドは、恒常的または一過的に活性化されたＲａｃ１であり得る。
本明細書においてポリペプチド発現の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。
本明細書において「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。そのような発現量としては、本発明の抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明ポリペプチドのタンパク質レベルでの発現量、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのｍＲＮＡレベルでの発現量が挙げられる。「発現量の変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明において使用されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
本明細書中で使用される用語「結合」は、２つのタンパク質もしくは化合物または関連するタンパク質もしくは化合物の間、あるいはそれらの組み合わせの間での、物理的相互作用または化学的相互作用を意味する。結合には、イオン結合、非イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性相互作用などが含まれる。物理的相互作用（結合）は、直接的または間接的であり得、間接的なものは、別のタンパク質または化合物の効果を介するかまたは起因する。直接的な結合とは、別のタンパク質または化合物の効果を介してもまたはそれらに起因しても起こらず、他の実質的な化学中間体を伴わない、相互作用をいう。
本明細書中で使用される用語「調節する（ｍｏｄｕｌａｔｅ）」または「改変する（ｍｏｄｉｆｙ）」は、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または減少あるいは維持を意味する。
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「減少」または「抑制」とは、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における減少、または減少させる活性をいう。
本明細書において、活性、発現産物（例えば、タンパク質、転写物（ＲＮＡなど））の「増加」または「活性化」とは、特定の活性、転写物またはタンパク質の量、質または効果における増加または増加させる活性をいう。
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボなどのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれに限定されない。
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同なまたは相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
本明細書において「検索」とは、電子的にまたは生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ ＆ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントハイブリダイゼーション、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよびｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、本発明において使用されるＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）などには、このような電子的検索、生物学的検索によって同定された対応遺伝子も含まれるべきであることが意図される。
本明細書において配列（アミノ酸または核酸など）の「同一性」、「相同性」および「類似性」のパーセンテージは、比較ウィンドウで最適な状態に整列された配列２つを比較することによって求められる。ここで、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の比較ウィンドウ内の部分には、２つの配列の最適なアライメントについての基準配列(他
の配列に付加が含まれていればギャップが生じることもあるが、ここでの基準配列は付加も欠失もないものとする)と比較したときに、付加または欠失(すなわちギャップ)が含ま
れる場合がある。同一の核酸塩基またはアミノ酸残基がどちらの配列にも認められる位置の数を求めることによって、マッチ位置の数を求め、マッチ位置の数を比較ウィンドウ内の総位置数で割り、得られた結果に１００を掛けて同一性のパーセンテージを算出する。検索において使用される場合、相同性については、従来技術において周知のさまざまな配列比較アルゴリズムおよびプログラムの中から、適当なものを用いて評価する。このようなアルゴリズムおよびプログラムとしては、ＴＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＰ、ＦＡＳＴＡ、ＴＦＡＳＴＡおよびＣＬＵＳＴＡＬＷ（Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５（８）：２４４４−２４４８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２（２）：４６７３−４６８０、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：３８３−４０２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（３）：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２）があげられるが、何らこれに限定されるものではない。特に好ましい実施形態では、従来技術において周知のＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ （ＢＬＡＳＴ）（たとえば、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ３：２６６−２７２、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２を参照のこと）を用いてタンパク質および核酸配列の相同性を評価する。特に、５つの専用ＢＬＡＳＴプログラムを用いて以下の作業を実施することによって比較または検索が達成され得る。
（１）ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴ３でアミノ酸のクエリ配列をタンパク質配列データベースと比較；
（２）ＢＬＡＳＴＮでヌクレオチドのクエリ配列をヌクレオチド配列データベースと比較；
（３）ＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列（両方の鎖）を６つの読み枠で変換した概念的翻訳産物をタンパク質配列データベースと比較；
（４）ＴＢＬＡＳＴＮでタンパク質のクエリ配列を６つの読み枠（両方の鎖）すべてで変換したヌクレオチド配列データベースと比較；
（５）ＴＢＬＡＳＴＸでヌクレオチドのクエリ配列を６つの読み枠で変換したものを、６つの読み枠で変換したヌクレオチド配列データベースと比較。
ＢＬＡＳＴプログラムは、アミノ酸のクエリ配列または核酸のクエリ配列と、好ましくはタンパク質配列データベースまたは核酸配列データベースから得られた被検配列との間で、「ハイスコアセグメント対」と呼ばれる類似のセグメントを特定することによって相同配列を同定するものである。ハイスコアセグメント対は、多くのものが従来技術において周知のスコアリングマトリックスによって同定（すなわち整列化）されると好ましい。好ましくは、スコアリングマトリックスとしてＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（Ｇｏｎｎｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３−１４４５、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９９３，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １７：４９−６１）を使用する。このマトリックスほど好ましいものではないが、ＰＡＭまたはＰＡＭ２５０マトリックスも使用できる（たとえば、Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，１９７８，Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ Ｄｉｓｔａｎｃｅ Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ：Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎを参照のこと）。ＢＬＡＳＴプログラムは、同定されたすべてのハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価し、好ましくはユーザー固有の相同率などのユーザーが独自に定める有意性の閾値レベルを満たすセグメントを選択する。統計的な有意性を求めるＫａｒｌｉｎの式を用いてハイスコアセグメント対の統計的な有意性を評価すると好ましい（Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６７−２２６８参照のこと）。
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８の連続するヌクレオチド長の核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９の連続するヌクレオチド長の、より好ましくは少なくとも１０の連続するヌクレオチド長の、さらに好ましくは少なくとも１１の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１２の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１３の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１４の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１６の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１７の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１８の連続するヌクレオチド長の、少なくとも１９の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも２５の連続するヌクレオチド長の、少なくとも３０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも４０の連続するヌクレオチド長の、少なくとも５０の連続するヌクレオチド長の、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
本明細書中で使用される「接触（させる）」とは、化合物を、直接的または間接的のいずれかで、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して物理的に近接させることを意味する。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、多くの緩衝液、塩、溶液などに存在し得る。接触とは、核酸分子またはそのフラグメントをコードするポリペプチドを含む、例えば、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、遺伝子チップ）などに化合物を置くことが挙げられる。
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリペプチドまたはタンパク質）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子がリガンドである場合、その生物学的活性は、そのリガンドが対応するレセプターに結合する活性を包含する。本発明の活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）の場合は、その生物学的活性は、少なくともＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）が有する活性の少なくとも１つ（核内への移行能、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）コンセンサス配列への結合能など）を包含する。別の実施形態では、生物学的活性としては、転写因子としての活性（例えば、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）のコンセンサス配列への結合能）が挙げられる。
本明細書において生物学的活性をアッセイする方法としては、（例えば、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）を判定するためのアッセイ）を利用したアッセイが挙げられるがそれらに限定されない。具体的には、以下が挙げられる。
（細胞におけるＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）遺伝子転写産物の検出）
診断対象から採取した細胞におけるＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）の遺伝子転写産物を検出する手法としては、特に限定されないが、以下の方法を採用することができる。
（ＲＴ−ＰＣＲ）
ＲＴ−ＰＣＲを適用する際には、例えば、先ず、診断対象の患者よりヘパリン化末梢血を採取する。このヘパリン化末梢血を比重遠心分離にかけ単核球を分離する。分離 した単核球を患者検体とする。一方、コントロール検体としては、健常人のＣＤ４陽性Ｔリンパ球を使用する。健常人のＣＤ４陽性Ｔリンパ球は、健常人より採 取したヘパリン化末梢血をＣＤ８化、抗体混合物を用いて不要な細胞を沈降させた後、分離することができる。
この患者検体、コントロール検体に対してトリゾール液を用いて細胞可溶化し、ＲＮＡと、ＤＮＡ・タンパク質・その他分画とに分離する。分離したＲＮＡを用いて、オリゴｄＴプライマーを用い、逆転写酵素により一本鎖ｃＤＮＡを合成する。次に、合成したｃＤＮＡを鋳型として、ＴＳＬＣ１特異的プライマーにより、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼを用いてサーマルサイクラーによるＤＮＡ合成を行う。
具体的に、ＴＳＬＣ１特異的プライマーとしては以下の配列からなる一対のオリゴヌクレオチドを使用することができる。
プライマー１；ＡＴＧＡＴＣＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＣＴ（配列番号１８）
プライマー２；ＧＴＡＣＴＴＣＴＡＧＡＴＡＣＣＧＣＴＧＧＧ（配列番号１９）
なお、TSLC1特異的プライマーは、上述の配列からなるオリゴヌクレオチドに限定され
ず、TSLC1遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができ る。例えば、配列番号２に示したTSLC1遺伝子の塩基配列において、445〜721番目の領域を増幅できるようにTSLC1特異的プライマーを設計することが好ましい。445〜721番目の領域を増幅する場合には、非特異的な核酸断片の増幅を防ぐことができるために好ましい。また、他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）もまた、同様にしてプライマーを設計することができる。
また、上述したDNA合成に際してサーマルサイクラーの条件としては、特に限定されな
いが、例えば、94℃5分１サイクル、94℃30秒、60℃30秒および72℃1分30サイクル、72℃5分1サイクルとすることができる。
次に、合成したDNA溶液を、例えばアガロースゲル電気泳動法により分離し、DNA染色によって可視化し、DNA撮影装置を用いて発現量を検討することが できる。このとき、患者検体におけるTSLC1遺伝子転写産物量と、コントロール検体におけるTSLC1遺伝子転写産物量との比が３倍以上、好ましくは５倍以上である場合、患者ががんを発症していると診断することができる。
（リアルタイム（Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ）ＰＣＲ）
上記「ＲＴ−ＰＣＲ」と同様の方法により、患者検体、コントロール検体を採取し、同様にＲＮＡを分離、ｃＤＮＡを合成する。蛍光ラベルした特異的合成オリゴヌクレオチドにより、同様にＲｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ装置によりＤＮＡ合成を行う。
具体的に、特異的合成オリゴヌクレオチドとしては、限定されないが、以下の配列からなるものを使用することができる。
特異的合成オリゴヌクレオチド；ＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡ（配列番号２０）
なお、特異的合成オリゴヌクレオチドは、上述の配列からなるものに限定されず、ＴＳＬＣ１遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。例えば、配列番号２に示したＴＳＬＣ１遺伝子の塩基配列において、１１５９−１１８０番目の領域とハイブリダイズするように特異的合成オリゴヌクレオチドを設計することが好ましい。１１５９−１１８０番目の領域とハイブリダイズする場合には、特異的合成オリゴヌクレオチドの非特異的なハイブリダイズを防ぐことができるために好ましい。ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）についてもまた、同様に任意の設計することができることが理解される。
Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置におけるＤＮＡ合成の条件としては、特に限定されないが、例えば９４℃５分１サイクル、９４℃３０秒および６０℃１分４０サイクルとすることができる。
そして、Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置に備わる分光蛍光光度計によって、合成の回数に応じたＤＮＡ量が蛍光発色により定量する。このとき、コントロールとしてアクチン遺伝子等を同時 に測定し、アクチン遺伝子発現量によってＴＳＬＣ１遺伝子転写産物量を平均化して定量することもできる。
Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ装置によれば、先ず電気泳動による増幅ＤＮＡ断片の分離が必要でないため、非常に簡易に且つ迅速に解析を行うことができる。また、Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ装置によれば、増幅が指数関数的に起こる領域で産物量を比較できるため、より正確に定量的に解析することができる。
（ハイブリダイゼーション法）
診断対象から採取した細胞におけるＴＳＬＣ１遺伝子転写産物を検出する手法としては、上記「ＲＴ−ＰＣＲ」と同様の方法により、患者検体、コントロール検体を採取し、同様にＲＮＡを分離した後、ＴＳＬＣ１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイ ズするオリゴヌクレオチドを用いて、ＴＳＬＣ１遺伝子転写産物を検出してもよい。また、上記「ＲＴ−ＰＣＲ」と同様の方法によりＲＮＡを分離してｃＤＮＡを合成し、合成したｃＤＮＡに特異的にハイブリダイズするプローブを用いて、ＴＳＬＣ１遺伝子転写産物を検出してもよい。
ここで、プローブとしては、特に限定されないが、例えば、ＴＳＬＣ１遺伝子の４１１〜１３７１番目と相補的な配列を有する核酸断片を使用することができる。なお、プローブは、上述の配列からなるものに限定されず、ＴＳＬＣ１遺伝子の塩基配列に基づいて適宜設計することができる。例えば、配列番号２に示したＴＳＬＣ１遺伝子の塩基配列において、４１１〜１３７１番目の領域とハイブリダイズするようにプローブを設計することが好ましい。４１１〜１３７１番目の領域とハイブリダイズする場合には、プローブの非特異的なハイブリダイズを防ぐことができるために好ましい。他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）についても、同様にプローブを設計することができることが理解される。
（細胞または血清におけるＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）のタンパク質の検出）
細胞または血清に含まれるＴＳＬＣ１タンパク質を検出する際には、ＴＳＬＣ１タンパク質を特異的に認識する抗体（以下、ＴＳＬＣ１抗体と呼ぶ）を作製する。ＴＳＬＣ１抗体は、従来公知の手法を用いて作製することができる。なお、ＴＳＬＣ１抗体は、モノクローナル抗体であっても、ポリクローナル抗体であっても良い。他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）についても、同様に抗体を作製することができる。
一例として、ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体の調製方法を以下に記載する。ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体は、抗原で免疫した動物から得られる抗体産生細胞と、ミエローマ細胞との細胞融合によりハイブリドーマを調製し、得られるハイブリドーマからＴＳＬＣ１活性を特異的に阻害する抗体を産生するクローンを選択することにより調製することができる。
動物の免疫に抗原として用いるＴＳＬＣ１タンパク質としては、組換えＤＮＡ法または化学合成により調製したＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列の全部若しくは一部のペプチドが挙げられる。例えば、配列番号１に示したＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列における、４３１〜４４２番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として使用することができる。また、細胞表面に存在するＴＳＬＣ１タンパク質を特異的に検出するためのＴＳＬＣ１モノクローナル抗体としては、配列番号１に示したＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列における２３２〜２４７番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。一方、血中に存在する可溶化ＴＳＬＣ１タンパク質を特異的に検出するためのＴＳＬＣ１モノクローナル抗体としては、配列番号１に示したＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列における３１５〜３３１番目（可溶型特異領域を含む）のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として使用することが好ましい。他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）についても同様に抗原を設計することができる。
得られた抗原用ＴＳＬＣ１をキャリアータンパク質（例えばサイログロブリン）に結合させた後、アジュバントを添加する。アジュバントとしては、フロイント完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント等が挙げられ、これらの何れのものを混合してもよい。
上記のようにして得られた抗原を哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウマ、サル、ウサギ、ヤギ、ヒツジなどの哺乳動物に投与する。免疫は、既存の方法であれば何れの方法をも用いることができるが、主として静脈内注射、皮下注射、腹腔内注射などにより行う。また、免疫の間隔は特に限定されず、数日から数週間間隔で、好ましくは４〜２１日間隔で免疫する。
最終の免疫日から２〜３日後に抗体産生細胞を採集する。抗体産生細胞としては、脾臓細胞、リンパ節細胞、末梢血細胞が挙げられるが、一般に脾臓細胞が用いられる。抗原の免疫量は１回にマウス１匹当たり、例えば１００μｇ用いられる。
免疫した動物の免疫応答レベルを確認し、また、細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選択するため、免疫した動物の血中抗体価、または抗体産生細胞の培養上清中の抗体価を測定する。抗体検出の方法としては、公知技術、例えばＥＩＡ（エンザイムイムノアッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）、ＥＬＩＳＡ（酵素連結イムノソルベントアッセイ）等が挙げられる。
抗体産生細胞と融合させるミエローマ（骨髄腫）細胞として、マウス、ラット、ヒトなど種々の動物に由来し、当業者が一般に入手可能な株化細胞を使用する。使用する細胞株としては、薬剤抵抗性を有し、未融合の状態では選択培地（例えばＨＡＴ培地）で生存できず、融合した状態でのみ生存できる性質を有するものが用いられる。一般的に８−アザグアニン耐性株が用いられ、この細胞株は、ヒポキサンチン−グアニン−ホスホリボシルトランスフェラーゼを欠損し、ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジン（ＨＡＴ）培地に生育できないものである。
ミエローマ細胞は、既に公知の種々の細胞株、例えば、Ｐ３（Ｐ３ｘ６３Ａｇ８．６５３）（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７９）１２３：１５４８−１５５０）、Ｐ３ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８）８１：１−７）、ＮＳ−１（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９７６）６：５１１−５１９）、ＭＰＣ−１１（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｄ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ （１９７６）８：４０５−４１５）、ＳＰ２／０（Ｓｈｕｌｍａｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８）２７６：２６９−２７０）、ＦＯ（ｄｅ Ｓｔ．Ｇｒｏｔｈ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ（１９８０）３５：１−２１）、Ｓ１９４（Ｔｒｏｗｂｒｉｄｇｅ，Ｉ．Ｓ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．（１９７８）１４８：３１３−３２３）、Ｒ２１０（Ｇａｌｆｒｅ，Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２７７：１３１−１３３）等が好適に使用される。
抗体産生細胞は、脾臓細胞、リンパ節細胞などから得られる。すなわち、前記各種動物から脾臓、リンパ節等を摘出または採取し、これら組織を破砕する。得られる破砕物をＰＢＳ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ１６４０等の培地または緩衝液に懸濁し、ステンレスメッシュ等で濾過後、遠心分離を行うことにより目的とする抗体産生細胞を調製する。
次に、上記ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを細胞融合させる。細胞融合は、ＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＥ−１６４０培地などの動物細胞培養用培地中で、ミエローマ細胞と抗体産生細胞とを、混合比１：１〜１：１０で融合促進剤の存在下、３０〜３７℃で１〜１５分間接触させることによって行われる。細胞融合を促進させるためには、平均分子量１，０００〜６，０００のポリエチレングリコール、ポリビニルアルコールまたはセンダイウイルスなどの融合促進剤や融合ウイルスを使用することができる。また、電気刺激（例えばエレクトロポレーション）を利用した市販の細胞融合装置を用いて抗体産生細胞とミエローマ細胞とを融合させることもできる。
細胞融合処理後の細胞から目的とするハイブリドーマを選別する。その方法として、選択培地における細胞の選択的増殖を利用する方法等が挙げられる。すなわち、細胞懸濁液を適切な培地で希釈後、マイクロタイタープレート上にまき、各ウェルに選択培地（ＨＡＴ培地など）を加え、以後適当に選択培地を交換して培養を行う。その結果、生育してくる細胞をハイブリドーマとして得ることができる。
ハイブリドーマのスクリーニングは、限界希釈法、蛍光励起セルソーター法等により行い、最終的にモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを取得する。取得したハイブリドーマからモノクローナル抗体を採取する方法としては、通常の細胞培養法や腹水形成法等が挙げられる。細胞培養法においては、ハイブリドーマを１０〜２０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地、ＭＥＭ培地、または無血清培地等の動物細胞培養培地中で、通常の培養条件（例えば３７℃，５％ＣＯ２濃度）で２〜１４日間培養し、その培養上清から抗体を取得する。腹水形成法においては、ミエローマ細胞由来の哺乳動物と同種の動物の腹腔内にハイブリドーマを投与し、ハイブリドーマを大量に増殖させる。そして、１〜４週間後に腹水または血清を採取する。
上記抗体の採取方法において、抗体の精製が必要とされる場合は、硫安塩析法、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの公知の方法を適宜に選択して、またはこれらを組み合わせることにより精製する。
本明細書において「抗原」とは、抗体と結合し、またはＢリンパ球、Ｔリンパ球などの特異的レセプターに結合して、抗体産生および／または細胞障害などの免疫反応をひきおこす物質（例えば、タンパク質、脂質、糖などが挙げられるがそれらに限定されない）をいう。抗体またはリンパ球レセプターとの結合性を、「抗原性」（ａｎｔｉｇｅｃｉｔｙ）という。抗体産生などの免疫応答を誘導する特性を「免疫原性」（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）という。抗原として使用される物質は、例えば、その目的とする物質（例えば、タンパク質）を少なくとも１つ含む。含まれる物質は、全長が好ましいが、免疫を惹起し得るエピトープを少なくとも一つ含んでいれば、部分配列でもよい。本明細書において「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体またはリンパ球レセプターが結合する抗原分子中の部位をいう。エピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
エピトープは、必ずしもその正確な位置および構造が判明していないとしても使用することができる。従って、エピトープには特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは線状であってもコンフォメーション形態であってもよい。
高分子構造（例えば、ポリペプチド構造）は種々のレベルの構成に関して記述され得る。この構成の一般的な議論については、例えば、Ａｌｂｅｒｔｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｃｅｌｌ（第３版、１９９４）、ならびに、ＣａｎｔｏｒおよびＳｃｈｉｍｍｅｌ、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｐａｒｔ Ｉ：Ｔｈｅ Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ（１９８０）を参照。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列をいう。「二次構造」とは、ポリペプチド内の局所的に配置された三次元構造をいう。これらの構造はドメインとして一般に公知である。ドメインは、ポリペプチドの緻密単位を形成し、そして代表的には５０〜３５０アミノ酸長であるそのポリペプチドの部分である。代表的なドメインは、βシート（βストランドなど）およびα−ヘリックスのストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）のような、部分から作られる。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造をいう。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有的会合により形成される三次元構造をいう。異方性に関する用語は、エネルギー分野において知られる用語と同様に使用される。したがって、本発明において使用されるポリペプチドは、活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）と同等の能力を有するような高次構造を有する限り、どのようなアミノ酸配列のポリペプチドをも包含し得る。
（ＦＡＣＳスキャンを用いた白血病細胞表面抗原の同定）
以上のように調製したＴＳＬＣ１モノクローナル抗体を用いて、診断対象の細胞の表面に存在するＴＳＬＣ１タンパク質の有無をＦＡＣＳスキャンにより検出することができる。この方法では、ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体としては、配列番号１に示したＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列における２３２〜２４７番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として使用して得られたものを使用する。他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）についても、同様に抗原を設計することができる。
この場合、先ず、患者から採取した患者末梢血より、比重遠心法により単核球分画を単離する。次に、上述したように得られたＴＳＬＣ１モノクローナル抗体を蛍光ラベルした蛍光化ＴＳＬＣ１抗体と単核球分画とを３０〜６０分混合する。反応後にＦＡＣＳスキャン装置によって蛍光強度を測定して、測定した蛍光強度に基づいて細胞数を測定する。また、ソーティング装置付ＦＡＣＳを用いることで、蛍光標識された細胞を分離し、分離した細胞におけるＴＳＬＣ１遺伝子または他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）の発現の解析を行ってもよい。
この方法によれば、ＨＴＬＶ−１キャリアにおいて、ＴＳＬＣ１陽性細胞を染め分け、詳細な感染細胞を数えることができる。さらに、後述するように、血中に 含まれる可溶化ＴＳＬＣ１タンパク質量を測定することにより、がんの発症予測が可能となる。さらに、この方法によれば、ＨＴＬＶ−１感染細胞を分離し、感染細胞における遺伝子発現異常を同定できるようになるため、発症予測がより正確にできるようになる。
（可溶性ＴＳＬＣ１タンパク質の血中濃度測定）
また、以上のように調製したＴＳＬＣ１モノクローナル抗体を用いて、診断対象の血中に存在するＴＳＬＣ１タンパク質を検出することができる。この方法で は、ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体としては、配列番号１に示したＴＳＬＣ１タンパク質のアミノ酸配列における３１５〜３３１番目のアミノ酸配列からなるペプチドを抗原として使用して得られたものを使用する。他のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）についても可溶性形態がある場合は、同様に抗原を設計することができることが理解される。
この場合、先ず、ＴＳＬＣ１モノクローナル抗体を固相プレートに吸着させ、その後、プレートにＢＳＡなどのタンパク質を作用させ、非特異結合をブロックしておく。患者もしくは健常人血清を添加し、洗浄した後、異種由来ＴＳＬＣ１抗体を添加、さらに酵素標識抗種特異的免疫グロブリン抗体を添加する。加えてその酵素に対する酵素基質溶液を加え酵素反応の発色により、発現量を測定する。
以上、「細胞におけるＴＳＬＣ１遺伝子転写産物の検出」および「細胞または血清におけるＴＳＬＣ１タンパク質の検出」に従えば、診断対象の患者から採取した細胞あるいは血清を用いて、ＴＳＬＣ１遺伝子の発現を検出することができる。言い換えると、「細胞におけるＴＳＬＣ１遺伝子転写産物の検出」に記載したようなＴＳＬＣ１特異的プライマー、特異的合成オリゴヌクレオチドまたはプローブを含む試薬によって、全く新規ながん診断薬を提供することができる。また、「細胞または血清におけるＴＳＬＣ１タンパク質の検出」に記載したようなＴＳＬＣ１抗体を含む試薬によって、全く新規ながん診断薬を提供することができる。
（改変体）
あるアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のようなタンパク質構造において他のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力および性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡコード配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的有用性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードする対応するＤＮＡにおいて行われ得る。
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。
親水性指数もまた、本発明のアミノ酸配列を改変するのに有用である。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のものに置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
本発明において、「保存的置換」とは、アミノ酸置換において、元のアミノ酸と置換されるアミノ酸との親水性指数または／および疎水性指数が上記のように類似している置換をいう。保存的置換の例は、当業者に周知であり、例えば、次の各グループ内での置換：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン、およびイソロイシン、などが挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において「改変体」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの物質に対して、一部が変更されているものをいう。そのような改変体としては、置換改変体、付加改変体、欠失改変体、短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）改変体、対立遺伝子変異体などが挙げられる。対立遺伝子（ａｌｌｅｌｅ）とは、同一遺伝子座に属し、互いに区別される遺伝的改変体のことをいう。従って、「対立遺伝子変異体」とは、ある遺伝子に対して、対立遺伝子の関係にある改変体をいう。「種相同体またはホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）」とは、ある種の中で、ある遺伝子とアミノ酸レベルまたはヌクレオチドレベルで、相同性（好ましくは、６０％以上の相同性、より好ましくは、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上の相同性）を有するものをいう。そのような種相同体を取得する方法は、本明細書の記載から明らかである。「オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇ）」とは、オルソロガス遺伝子（ｏｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ ｇｅｎｅ）ともいい、二つの遺伝子がある共通祖先からの種分化に由来する遺伝子をいう。例えば、多重遺伝子構造をもつヘモグロビン遺伝子ファミリーを例にとると、ヒトとマウスのαヘモグロビン遺伝子はオルソログであるが，ヒトのαヘモグロビン遺伝子とβヘモグロビン遺伝子はパラログ（遺伝子重複で生じた遺伝子）である。オルソログは、分子系統樹の推定に有用であることから、本発明のＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）のオルソログもまた、本発明において有用であり得る。
「保存的（に改変された）改変体」は、アミノ酸配列および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された改変体とは、同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸をいい、核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一な配列をいう。遺伝コードの縮重のため、多数の機能的に同一な核酸が任意の所定のタンパク質をコードする。例えば、コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵはすべて、アミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより特定される全ての位置で、そのコドンは、コードされたポリペプチドを変更することなく、記載された対応するコドンの任意のものに変更され得る。このような核酸の変動は、保存的に改変された変異の１つの種である「サイレント改変（変異）」である。ポリペプチドをコードする本明細書中のすべての核酸配列はまた、その核酸の可能なすべてのサイレント変異を記載する。当該分野において、核酸中の各コドン（通常メチオニンのための唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンのための唯一のコドンであるＴＧＧを除く）が、機能的に同一な分子を産生するために改変され得ることが理解される。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、記載された各配列において暗黙に含まれる。好ましくは、そのような改変は、ポリペプチドの高次構造に多大な影響を与えるアミノ酸であるシステインの置換を回避するようになされ得る。
本明細書中において、機能的に等価なポリペプチドを作製するために、アミノ酸の置換のほかに、アミノ酸の付加、欠失、または修飾もまた行うことができる。アミノ酸の置換とは、もとのペプチドを１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸で置換することをいう。アミノ酸の付加とは、もとのペプチド鎖に１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を付加することをいう。アミノ酸の欠失とは、もとのペプチドから１つ以上、例えば、１〜１０個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個のアミノ酸を欠失させることをいう。アミノ酸修飾は、アミド化、カルボキシル化、硫酸化、ハロゲン化、アルキル化、グリコシル化、リン酸化、水酸化、アシル化（例えば、アセチル化）などを含むが、これらに限定されない。置換、または付加されるアミノ酸は、天然のアミノ酸であってもよく、非天然のアミノ酸、またはアミノ酸アナログでもよい。天然のアミノ酸が好ましい。
本明細書において「ペプチドアナログ」とは、ペプチドとは異なる化合物であるが、ペプチドと少なくとも１つの化学的機能または生物学的機能が等価であるものをいう。したがって、ペプチドアナログには、もとのペプチドに対して、１つ以上のアミノ酸アナログが付加または置換されているものが含まれる。ペプチドアナログは、その機能が、もとのペプチドの機能（例えば、ｐＫａ値が類似していること、官能基が類似していること、他の分子との結合様式が類似していること、水溶性が類似していることなど）と実質的に同様であるように、このような付加または置換がされている。そのようなペプチドアナログは、当該分野において周知の技術を用いて作製することができる。したがって、ペプチドアナログは、アミノ酸アナログを含むポリマーであり得る。
本発明のポリペプチドがポリマーに結合している、化学修飾されたポリペプチド組成物は、本発明の範囲に包含される。このポリマーは、水溶性であり得、水溶性環境（例えば、生理学的環境）でこのタンパク質の沈澱を防止し得る。適切な水性ポリマーは、例えば、以下からなる群より選択され得る：ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、セルロース、または他の炭水化物に基づくポリマー、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールホモポリマー、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）およびポリビニルアルコール。この選択されたポリマーは、通常は改変され、単一の反応性基（例えば、アシル化のための活性エステルまたはアルキル化のためのアルデヒド）を有し、その結果、重合度は制御され得る。ポリマーは、任意の分子量であり得、そして、このポリマーは分枝状でも分枝状でなくてもよく、そしてこのようなポリマーの混合物はまた、使用され得る。この化学修飾された本発明のポリマーは、治療用途に決定付けられる場合、薬学的に受容可能なポリマーが使用するために選択される。
このポリマーがアシル化反応によって改変される場合、このポリマーは、単一の反応性エステル基を有するべきである。あるいは、このポリマーが還元アルキル化によって改変される場合、このポリマーは単一の反応性アルデヒド基を有するべきである。好ましい反応性アルデヒドは、ポリエチレングリコール、プロピオンアルデヒド（このプロピオンアルデヒドは、水溶性である）または、そのモノＣ１〜Ｃ１０の、アルコキシ誘導体もしくはアリールオキシ誘導体である（例えば、米国特許第５，２５２，７１４号（これは、本明細書中で全体が参考として援用される）を参照のこと）。
本発明のポリペプチドのＰＥＧ化（Ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）は、例えば、以下の参考文献に記載されるような、当該分野で公知の、任意のＰＥＧ化反応によって実施され得る：Ｆｏｃｕｓ ｏｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ３，４−１０（１９９２）；ＥＰ ０ １５４ ３１６；およびＥＰ ０ ４０１ ３８４（これらの各々は、本明細書中で、全体が参考として援用される）。好ましくは、このＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子（または、類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応またはアルキル化反応を介して実施される。本発明のポリペプチド（例えば、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）またはその活性型あるいはその活性化因子など）のＰＥＧ化のための好ましい水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。本明細書中で使用される場合、「ポリエチレングリコール」は、ＰＥＧの任意の形態の包含することを意味し、ここで、このＰＥＧは、他のタンパク質（例えば、モノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アルコキシポリエチレングリコールまたはモノ（Ｃ１〜Ｃ１０）アリールオキシポリエチレングリコール）を誘導体するために使用される。
本発明のポリペプチドの化学誘導体化を、生物学的に活性な物質を活性化したポリマー分子と反応させるのに使用される適切な条件下で、実施され得る。ＰＥＧ化した本発明のポリペプチドを調製するための方法は、一般に以下の工程を包含する：（ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）またはその活性型あるいはその活性化因子が１以上のＰＥＧ基に結合するような条件下で、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧの、反応性エステルまたはアルデヒド誘導体）とこのポリペプチドを反応させる工程および（ｂ）この反応生成物を得る工程。公知のパラメータおよび所望の結果に基づいて、最適な反応条件またはアシル化反応を選択することは当業者に容易である。
ＰＥＧ化されたポリペプチドは、一般に、本明細書中に記載のポリペプチドを投与することによって、緩和または調節され得る状態を処置するために使用され得るが、しかし、本明細書中で開示された、化学誘導体化された本発明のポリペプチド分子は、それらの非誘導体分子と比較して、さらなる活性、増大された生物活性もしくは減少した生物活性、または他の特徴（例えば、増大された半減期または減少した半減期）を有し得る。本発明のポリペプチド、それらのフラグメント、改変体および誘導体は、単独で、併用して、または他の薬学的組成物を組み合わせて使用され得る。
このような核酸は、周知のＰＣＲ法により得ることができ、化学的に合成することもできる。これらの方法に、例えば、部位特異的変位誘発法、ハイブリダイゼーション法などを組み合わせてもよい。
本明細書において、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの「置換、付加または欠失」とは、もとのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに対して、それぞれアミノ酸もしくはその代替物、またはヌクレオチドもしくはその代替物が、置き換わること、付け加わることまたは取り除かれることをいう。このような置換、付加または欠失の技術は、当該分野において周知であり、そのような技術の例としては、部位特異的変異誘発技術などが挙げられる。置換、付加または欠失は、１つ以上であれば任意の数でよく、そのような数は、その置換、付加または欠失を有する改変体において目的とする機能（例えば、がんマーカー、神経疾患マーカーなど）が保持される限り、多くすることができる。例えば、そのような数は、１または数個であり得、そして好ましくは、全体の長さの２０％以内、１０％以内、または１００個以下、５０個以下、２５個以下などであり得る。
本発明において使用されるポリペプチドは、任意の生物由来であり得る。好ましくは、その生物は、脊椎動物（例えば、哺乳動物、爬虫類、両生類、魚類、鳥類など）であり、より好ましくは、哺乳動物（例えば、齧歯類（マウス、ラットなど）、霊長類（ヒトなど）など）であり得る。本発明において使用されるポリペプチドは、所望の効果を発揮するかぎり、合成されたものでもよい。そのようなポリペプチドは、当該分野において周知の合成方法によって合成され得る。例えば、自動固相ペプチド合成機を用いた合成方法は、Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｊ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９８４）．Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．；Ｇｒａｎｔ，Ｇ．Ａ．（１９９２）．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ： Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ Ｇｕｉｄｅ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．（１９９３）．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｔｈｅ ＰＲａｃ１ｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ，Ｍ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｆｉｅｌｄｓ，Ｇ．Ｂ．（１９９７）．Ｓｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓにおいて記載されている。
（一般技術）
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ ａｎｎｕａｌ ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬＰｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ ＰＲａｃ１ｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ｉｎ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
（遺伝子工学）
本発明において用いられるＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）などならびにそのフラグメントおよび改変体は、遺伝子工学技術を用いて生産することができる。
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるものをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能であるか、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。本明細書において、ベクターはプラスミドであり得る。
本明細書において「ウイルスベクター」とは、ベクターのうち、ウイルス由来のものをいう。本明細書において「ウイルス」とは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかをゲノムとして有する、感染細胞内だけで増殖する感染性の微小構造体をいう。ウイルスとしては、レトロウイルス科、トガウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、パラミクソウイルス科、オルトミクソウイルス科、ブニヤウイルス科、ラブドウイルス科、ポックスウイルス科、ヘルペスウイルス科、バキュロウイルス科およびヘパドナウイルス科からなる群より選択される科に属するウイルスが挙げられる。本明細書において「レトロウイルス」とは、ＲＮＡの形で遺伝情報を有し、逆転写酵素によってＲＮＡの情報からＤＮＡを合成するウイルスをいう。
本明細書において「レトロウイルスベクター」とは、レトロウイルスを遺伝子の担い手（ベクター）として使用した形態をいう。本発明において使用される「レトロウイルスベクター」としては、例えば、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｖｉｒｕｓ（ＭＭＬＶ）、Ｍｕｒｉｎｅ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｖｉｒｕｓ（ＭＳＣＶ）にもとづいたレトロウイルス型発現ベクターなどが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、レトロウイルスベクターとしては、ｐＧｅｎ−、ｐＭＳＣＶなどが挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「発現ベクター」は、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。生物（例えば、動物）の発現ベクターのタイプおよび使用される調節エレメントの種類が、宿主細胞に応じて変わり得ることは、当業者に周知の事項である。ヒトの場合、本発明に用いる発現ベクターはさらにｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−９（１９９１））を含み得る。
本明細書において「組換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させることができるベクターをいう。そのようなベクターとしては、動物個体などの宿主細胞において自律複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。
本明細書において、動物細胞に対する「組換えベクター」としては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７（特開平３−２２９７９、Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３，１３３（１９９０））、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７））、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３））、ｐＣＡＧＧＳ（Ｎｉｗａ Ｈ ｅｔ ａｌ，Ｇｅｎｅ；１０８：１９３−９（１９９１））などが例示される。
本明細書において「ターミネーター」は、遺伝子のタンパク質をコードする領域の下流に位置し、ＤＮＡがｍＲＮＡに転写される際の転写の終結、ポリＡ配列の付加に関与する配列である。ターミネーターは、ｍＲＮＡの安定性に関与して遺伝子の発現量に影響を及ぼすことが知られている。ターミネーターとしては、哺乳動物由来のターミネーターのほかに、ＣａＭＶ３５Ｓターミネーター、ノパリン合成酵素遺伝子のターミネーター（Ｔｎｏｓ）、タバコＰＲ１ａ遺伝子のターミネーターが挙げられるが、これに限定されない。
本明細書において「プロモーター」とは、遺伝子の転写の開始部位を決定し、またその頻度を直接的に調節するＤＮＡ上の領域をいい、ＲＮＡポリメラーゼが結合して転写を始める塩基配列である。プロモーターの領域は、通常、推定タンパク質コード領域の第１エキソンの上流約２ｋｂｐ以内の領域であることが多いので、ＤＮＡ解析用ソフトウエアを用いてゲノム塩基配列中のタンパク質コード領域を予測すれば、プロモータ領域を推定することはできる。推定プロモーター領域は、構造遺伝子ごとに変動するが、通常構造遺伝子の上流にあるが、これらに限定されず、構造遺伝子の下流にもあり得る。好ましくは、推定プロモーター領域は、第一エキソン翻訳開始点から上流約２ｋｂｐ以内に存在する。
本明細書において、遺伝子の発現について用いられる場合、一般に、「部位特異性」とは、生物（例えば、動物）の部位（例えば、動物の場合、心臓、心筋細胞など）におけるその遺伝子の発現の特異性をいう。「時期特異性」とは、生物（たとえば、動物）の特定の段階（例えば、発作時など）に応じたその遺伝子の発現の特異性をいう。そのような特異性は、適切なプロモーターを選択することによって、所望の生物に導入することができる。
本明細書において、本発明のプロモーターの発現が「構成的」であるとは、生物のすべての組織において、その生物の生長の幼若期または成熟期のいずれにあってもほぼ一定の量で発現される性質をいう。具体的には、本明細書の実施例と同様の条件でノーザンブロット分析したとき、例えば、任意の時点で（例えば、２点以上の同一または対応する部位のいずれにおいても実質的に発現がみられるとき、本発明の定義上、発現が構成的であるという。構成的プロモーターは、通常の生育環境にある生物の恒常性維持に役割を果たしていると考えられる。本発明のプロモーターの発現が「ストレス応答性」であるとは、少なくとも１つのストレス（例えば、分化刺激など）が生物体に与えられたとき、その発現量が変化する性質をいう。特に、発現量が増加する性質を「ストレス誘導性」といい、発現量が減少する性質を「ストレス減少性」という。「ストレス減少性」の発現は、正常時において、発現が見られることを前提としているので、「構成的」な発現と重複する概念である。これらの性質は、生物の任意の部分からＲＮＡを抽出してノーザンブロット分析またはＲＴ−ＰＣＲで発現量を分析することまたは発現されたタンパク質をウェスタンブロットにより定量することにより決定することができる。ストレス誘導性のプロモーターを本発明において使用されるポリペプチドをコードする核酸とともに組み込んだベクターで形質転換された動物または動物の一部（特定の細胞、組織など）は、そのプロモーターの誘導活性をもつ刺激因子を用いることにより、ある条件（例えば、分化刺激時）下での本発明において使用されるポリペプチドの発現を行うことができる。
本明細書において「エンハンサー」は、目的遺伝子の発現効率を高めるために用いられ得る。植物において使用する場合、エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前初期エンハンサー（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ−ｅａｒｌｙ ｅｎｈａｎｃｅｒ）の上流側の配列を含むエンハンサー領域が好ましい。エンハンサーは複数個用いられ得るが１個用いられてもよいし、用いなくともよい。
本明細書において「作動可能に連結された（る）」とは、所望の配列の発現（作動）がある転写翻訳調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）または翻訳調節配列の制御下に配置されることをいう。プロモーターが遺伝子に作動可能に連結されるためには、通常、その遺伝子のすぐ上流にプロモーターが配置されるが、必ずしも隣接して配置される必要はない。
本発明は、任意の動物において利用され得る。そのような動物における利用のための技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。
本明細書において「形質転換体」とは、形質転換によって作製された細胞などの生命体の全部または一部をいう。形質転換体としては、動物細胞などが例示される。形質転換体は、その対象に依存して、形質転換細胞、形質転換組織、形質転換宿主などともいわれ、本明細書においてそれらの形態をすべて包含するが、特定の文脈において特定の形態を指し得る。
本明細書において「動物」は、当該分野において最も広義で用いられ、脊椎動物および無脊椎動物を含む。動物としては、哺乳綱、鳥綱、爬虫綱、両生綱、魚綱、昆虫綱、蠕虫綱などが挙げられるがそれらに限定されない。好ましくは、動物は、哺乳動物を含む。
本発明において使用されるポリペプチド、核酸、キット、システム、組成物および方法は、哺乳動物だけでなく他の動物を含む動物全体において機能することが企図される。なぜなら、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）に対応するリガンドは、哺乳動物以外の生物においても存在することが知られているからである。
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。
本明細書において細胞の「遊走能」とは、動物の体内を能動的に移動する能力をいう。細胞の遊走能を物理的指標とは別のマーカーで検出することができる。例えば、遊走能は、E-カドヘリンおよびｂ−カテニンからなる群より選択される少なくとも１つの産物の発現の消失によって確認することができる。あるいは、遊走能は、ビメンチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、少なくとも１つの産物の発現の増加によって確認することができる。細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞のような培養腎臓細胞）の遊走能は、例えば、肝実質細胞増殖因子（HGF）によって惹起することができる。
本明細書において、生物の「組織」とは、細胞の集団であって、その集団において一定の同様の作用を有するものをいう。従って、組織は、臓器（器官）の一部であり得る。臓器（器官）内では、同じ働きを有する細胞を有することが多いが、微妙に異なる働きを有するものが混在することもあることから、本明細書において組織は、一定の特性を共有する限り、種々の細胞を混在して有していてもよい。
本明細書において「器官（臓器）」とは、１つ独立した形態をもち、１種以上の組織が組み合わさって特定の機能を営む構造体を形成したものをいう。動物では、胃、肝臓、腸、膵臓、肺、気管、鼻、心臓、動脈、静脈、リンパ節（リンパ管系）、胸腺、卵層、眼、耳、舌、皮膚等が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「トランスジェニック」とは、特定の遺伝子がある生物に組み込むことまたは組み込まれた生物（例えば、動物（マウスなど）または植物を含む）をいう。
本発明においてトランスジェニック生物が利用される場合、そのようなトランスジェニック生物は、マイクロインジェクション法（微量注入法）、ウイルスベクター法、ＥＳ細胞法（胚性幹細胞法）、精子ベクター法、染色体断片を導入する方法（トランスゾミック法）、エピゾーム法などを利用したトランスジェニック動物の作製技術を使用して作製することができる。そのようなトランスジェニック動物の作成技術は当該分野において周知である。
（スクリーニング）
本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。スクリーニングは、インビトロ、インビボなど実在物質を用いた系を使用してもよく、インシリコ（コンピュータを用いた系）の系を用いて生成されたライブラリーを用いてもよい。本発明では、所望の活性を有するスクリーニングによって得られた化合物もまた、本発明の範囲内に包含されることが理解される。また本発明では、本発明の開示をもとに、コンピュータモデリングによる薬物が提供されることも企図される。
１実施形態において、本発明は、本発明のタンパク質または本発明のポリペプチド、あるいはその生物学的に活性な部分に結合するか、またはこれらの活性を調節する、候補化合物もしくは試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供する。本発明の試験化合物は、当該分野において公知のコンビナトリアルライブラリー法における多数のアプローチの任意のものを使用して得られ得、これには、以下が挙げられる：生物学的ライブラリー；空間的にアクセス可能な平行固相もしくは溶液相ライブラリー；逆重畳を要する合成ライブラリー法；「１ビーズ１化合物」ライブラリー法；およびアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法。生物学的ライブラリーアプローチはペプチドライブラリーに限定されるが、他の４つのアプローチは、ペプチド、非ペプチドオリゴマーもしくは化合物の低分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ（１９９７）Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓ．１２：１４５）。
分子ライブラリーの合成のための方法の例は、当該分野において、例えば以下に見出され得る：ＤｅＷｉｔｔら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６９０９；Ｅｒｂら（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
９１：１１４２２；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：２６７８；Ｃｈｏら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３０３；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０５９；Ｃａｒｒｅｌｌら（１９９４）Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：２０６１；およびＧａｌｌｏｐら（１９９４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ ３７：１２３３。
化合物のライブラリーは、溶液中で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（１９９２）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：４１２〜４２１）、あるいはビーズ上（Ｌａｍ（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２〜８４）、チップ上（Ｆｏｄｏｒ（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６４：５５５〜５５６）、細菌（Ｌａｄｎｅｒ 米国特許第５，２２３，４０９号）、胞子（Ｌａｄｎｅｒ、上記）、プラスミド（Ｃｕｌｌら（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１８６５〜１８６９）またはファージ上（ＳｃｏｔｔおよびＳｍｉｔｈ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６〜３９０；Ｄｅｖｌｉｎ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：４０４〜４０６；Ｃｗｉｒｌａら（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：６３７８〜６３８２；Ｆｅｌｉｃｉ（１９９１）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２２：３０１〜３１０；Ｌａｄｎｅｒ上記）において示され得る。
本発明は、他の実施形態において、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸）と同等に有効な因子をスクリーニングするための道具として、コンピュータによる定量的構造活性相関（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ＝ＱＳＡＲ）モデル化技術を使用して得られる化合物もまた、本発明に包含される。ここで、コンピューター技術は、いくつかのコンピュータによって作成した基質鋳型、ファーマコフォア、ならびに本発明の活性部位の相同モデルの作製などを包含する。一般に、インビトロで得られたデータから、ある物質に対する相互作用物質の通常の特性基をモデル化することに対する方法は、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭ ファーマコフォア法（Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ，９：４７７〜４８９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２８８：２１〜２９，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９０：４２９〜４３８，１９９９；Ｅｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．＆ Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，２９１：４２４〜４３３，１９９９）および比較分子電界分析（ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｆｉｅｌｄ ａｎａｌｙｓｉｓ；ＣｏＭＦＡ）（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．、Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ＆ Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ，２４：１〜６，１９９６）などを使用して示されている。本発明において、コンピュータモデリングは、分子モデル化ソフトウェア（例えば、ＣＡＴＡＬＹＳＴＴＭバージョン４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）など）を使用して行われ得る。
活性部位に対する化合物のフィッティングは、当該分野で公知の種々のコンピュータモデリング技術のいずれかを使用してで行うことができる。視覚による検査および活性部位に対する化合物のマニュアルによる操作は、ＱＵＡＮＴＡ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，１９９２）、ＳＹＢＹＬ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，１９９２）、ＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：７６５−７８４，１９８４）、ＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｃｈｅｍ．，４：１８７〜２１７，１９８３）などのようなプログラムを使用して行うことができる。これに加え、ＣＨＡＲＭＭ、ＡＭＢＥＲなどのような標準的な力の場を使用してエネルギーの最小化を行うこともできる。他のさらに特殊化されたコンピュータモデリングは、ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２８：８４９〜８５７，１９８５）、ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｋａｒｐｌｕｓ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１１：２９〜３４，１９９１）、ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ
ａｎｄ Ｏｌｓｅｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓ ｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，８：１９５〜２０２，１９９０）、ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６１：２６９〜２８８，（１９８２））などを含む。さらなる構造の化合物は、空白の活性部位、既知の低分子化合物における活性部位などに、ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６：６１〜７８，１９９２）、ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ ａｎｄ Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，４７：８９８５，１９９１）、ＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）などのようなコンピュータープログラムを使用して新規に構築することもできる。このようなモデリングは、当該分野において周知慣用されており、当業者は、本明細書の開示に従って、適宜本発明の範囲に入る化合物（例えば、活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）の等価物）を設計することができる。
（投与・注入・医薬）
本発明の因子によって調製された細胞（例えば、幹細胞、それから分化した細胞（例えば、肺細胞））または細胞組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与経路としては経口投与、非経口投与、患部への直接投与などが挙げられる。
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。
１つの実施形態において、本発明の因子（例えば、活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）またはそれをコードする核酸など）は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
本発明の組成物またはキットはまた、さらに生体親和性材料を含み得る。この生体親和性材料は、例えば、シリコーン、コラーゲン、ゼラチン、グリコール酸・乳酸の共重合体、エチレンビニル酢酸共重合体、ポリウレタン、ポリエチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリレート、ポリメタクリレートからなる群より選択される少なくとも１つを含み得る。成型が容易であることからシリコーンが好ましい。生分解性高分子の例としては、コラーゲン、ゼラチン、α−ヒロドキシカルボン酸類（例えば、グリコール酸、乳酸、ヒドロキシ酪酸など）、ヒドロキシジカルボン酸類（例えば、リンゴ酸など）およびヒドロキシトリカルボン酸（例えば、クエン酸など）からなる群より選択される１種以上から無触媒脱水重縮合により合成された重合体、共重合体またはこれらの混合物、ポリ−α−シアノアクリル酸エステル、ポリアミノ酸（例えば、ポリ−γ−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸など）、無水マレイン酸系共重合体（例えば、スチレン−マレイン酸共重合体など）のポリ酸無水物などが挙げられる。重合の形式は、ランダム、ブロック、グラフトのいずれでもよく、α−ヒドロキシカルボン酸類、ヒドロキシジカルボン酸類、ヒドロキシトリカルボン酸類が分子内に光学活性中心を有する場合、Ｄ−体、Ｌ−体、ＤＬ−体のいずれでも用いることが可能である。好ましくは、グリコール酸・乳酸の共重合体が使用され得る。
核酸分子を含む本発明の組成物を投与する場合、核酸分子は、非ウイルスベクター形態またはウイルスベクター形態による投与、またはｎａｋｅｄ ＤＮＡでの直接投与の形態などで投与され得る。このような投与形態は、当該分野において周知であり、例えば、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに詳説されている。
特定の実施形態において、本発明の正常な遺伝子の核酸配列、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、本発明のポリペプチドの異常な発現および／または活性に関連した疾患または障害を処置、阻害または予防するために、遺伝子治療の目的で投与される。遺伝子治療とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
したがって、本発明では、ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）またはその改変体もしくはフラグメントなどをコードする核酸分子を用いた遺伝子治療が有用であり得る。
非ウイルスベクター形態の場合、リポソームを用いて核酸分子を導入する方法（リポソーム法、ＨＶＪ−リポソーム法、カチオニックリポソーム法、リポフェクチン法、リポフェクトアミン法など）、マイクロインジェクション法、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ）でキャリア（金属粒子）とともに核酸分子を細胞に移入する方法などが利用され得る。発現ベクターとしては、例えば、ｐＣＡＧＧＳ（Ｇｅｎｅ １０８：１９３−９、Ｎｉｗａ Ｈ，Ｙａｍａｍｕｒａ Ｋ，Ｍｉｙａｚａｋｉ Ｊ（１９９１））、ｐＢＪ−ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＺｅｏＳＶ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅなどから入手可能である）などが挙げられる。
ＨＶＪ−リポソーム法は、脂質二重膜で作製されたリポソーム中に核酸分子を封入し、このリポソームと不活化したセンダイウイルス（Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｏｆ Ｊａｐａｎ、ＨＶＪ）とを融合させることを包含する。このＨＶＪ−リポソーム法は、従来のリポソーム法よりも、細胞膜との融合活性が非常に高いことを特徴とする。ＨＶＪ−リポソーム調製法は、別冊実験医学「遺伝子治療の基礎技術」羊土社、１９９６；別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７に詳述されている。ＨＶＪとしては、任意の株が利用可能であり（例えば、ＡＴＣＣ ＶＲ−９０７、ＡＴＣＣ ＶＲ−１０５など）、Ｚ株が好ましい。
本発明の組成物は、ウイルスベクターの核酸形態で提供される場合、組換えアデノウイルス、レトロウイルスなどのウイルスベクターが利用される。無毒化したレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、ポリオウイルス、シンドビスウイルス、センダイウイルス、ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）などのＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスに、活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）をコードする核酸またはＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）をコードする核酸を導入し、細胞または組織にこの組換えウイルスを感染させることにより、細胞または組織内に遺伝子を導入することができる。これらウイルスベクターでは、アデノウイルスの感染効率が他のウイルスベクターによる効率よりも遙かに高いことから、アデノウイルスベクター系を用いることが好ましい。
Ｎａｋｅｄ ＤＮＡ法の場合、上述の非ウイルスベクターである発現プラスミドを生理食塩水などに溶解し、そのまま投与する。例えば、Ｔｓｕｒｕｍｉ Ｙ，Ｋｅａｒｎｅｙ Ｍ，Ｃｈｅｎ Ｄ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｍ，Ｔａｋｅｓｈｉｔａ Ｓ，Ｙａｎｇ Ｊ，Ｓｙｍｅｓ ＪＦ，Ｉｓｎｅｒ ＪＭ．、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ ９８（Ｓｕｐｐｌ．ＩＩ）、３８２−３８８（１９９７）に記載される方法により、生物の器官の組織などに直接注入することができる。
従って、本発明の組成物およびキットにおいて含まれる活性成分としてのポリペプチド（例えば、活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）など）の量は、例えば、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０００ｍｇ、好ましくは約５μｇ〜約１００ｍｇであり得る。このポリペプチドの量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約１ｍｇの間の任意の数値であり得る。このポリペプチドの量の範囲の上限は、例えば、約１０００ｍｇ、約９００ｍｇ、約８００ｍｇ、約７００ｍｇ、約６００ｍｇ、約５００ｍｇ、約４００ｍｇ、約３００ｍｇ、約２００ｍｇ、約１００ｍｇ、約７５ｍｇ、約５０ｍｇ、約２５ｍｇ、約１０ｍｇ、約５ｍｇなど、約１０００ｍｇ〜約１ｍｇの任意の数値であり得る。
本発明の活性成分が核酸形態（例えば、活性型ＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）をコードする核酸またはＴＳＬＣ１の分子経路における任意の因子（例えば、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１など）をコードする核酸など）の場合、成人（体重約６０ｋｇ）の場合、約１μｇ〜約１０ｍｇ、好ましくは約１μｇ〜約１０００μｇ、より好ましくは約５μｇ〜約４００μｇであり得る。この核酸の量の範囲の下限は、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約３μｇ、約４μｇ、約５μｇ、約６μｇ、約７μｇ、約８μｇ、約９μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇなど、約１μｇ〜約２０μｇの間の任意の数値であり得る。この核酸の量の範囲の上限は、例えば、約１０ｍｇ、約９ｍｇ、約８ｍｇ、約７ｍｇ、約６ｍｇ、約５ｍｇ、約４ｍｇ、約３ｍｇ、約２ｍｇ、約１ｍｇ、約７５０μｇ、約５００μｇ、約２５０μｇ、約１００μｇなど、約１０ｍｇ〜約１０μｇの任意の数値であり得る。２種類以上の細胞生理活性物質（ＳＣＦなど）が含まれる場合も、上記の量が個々に適用される。ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターとして投与される場合は、通常、０．０００１〜１００ｍｇ、好ましくは０．００１〜１０ｍｇ、より好ましくは０．０１〜１ｍｇである。投与頻度としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。
本明細書において「指示書」は、本発明の医薬などを投与する方法を医師、患者など投与を行う人に対する説明を記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを心筋梗塞発作直後（例えば、４８時間以内、３６時間以内、２４時間以内、１２時間以内、好ましくは６時間以内など）に投与することを指示する文言が記載されている。また、指示書には、投与部位として、骨格筋に投与（例えば、注射などによる）することを指示する文言が記載されていてもよい。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
本明細書において「レシピエント」（受容者）とは、移植片または移植体を受け取る個体といい、「宿主」とも呼ばれる。これに対し、移植片または移植体を提供する個体は、「ドナー」（供与者）という。
本明細書において「生体内」または「インビボ」（ｉｎ ｖｉｖｏ）とは、生体の内部をいう。特定の文脈において、「生体内」は、目的とする組織または器官が配置されるべき位置をいう。
本明細書において「インビトロ」とは、種々の研究目的のために生体の一部分が「生体外に」（例えば、試験管内に）摘出または遊離されている状態をいう。インビボと対照をなす用語である。
本明細書において「エキソビボ」とは、遺伝子導入を行うための標的細胞を被験体より抽出し、インビトロで治療遺伝子または因子を導入した後に、再び同一被験体に戻す場合、一連の動作をエキソビボという。
本発明において使用されるポリペプチド、核酸、医薬ならびにそのようなポリペプチドまたは核酸によって調製された組成物は、生物への移入に適した形態であれば、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。投与方法は、経口投与、非経口投与（例えば、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、粘膜投与、直腸内投与、膣内投与、患部への局所投与、皮膚投与など）、患部への直接投与などが挙げられる。そのような投与のための処方物は、任意の製剤形態で提供され得る。そのような製剤形態としては、例えば、液剤、注射剤、徐放剤が挙げられる。本発明の組成物および医薬は、全身投与されるとき、発熱物質を含ない、経口的に受容可能な水溶液の形態であり得る。そのような薬学的に受容可能なタンパク質溶液の調製は、ｐＨ、等張性、安定性などに相当な注意を払うことを条件として、当業者の技術範囲内である。
本発明において医薬の処方のために使用される溶媒は、水性または非水性のいずれかの性質を有し得る。さらに、そのビヒクルは、処方物の、ｐＨ、容量オスモル濃度、粘性、明澄性、色、滅菌性、安定性、等張性、崩壊速度、または臭いを改変または維持するための他の処方物材料を含み得る。同様に、本発明の組成物は、有効成分の放出速度を改変または維持するため、または有効成分の吸収もしくは透過を促進するための他の処方物材料を含み得る。
本発明は、医薬または医薬組成物として処方される場合、必要に応じて生理学的に受容可能なキャリア、賦型剤または安定化剤（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）と、所望の程度の純度を有する選択された組成物とを混合することによって、凍結乾燥されたケーキまたは水溶液の形態で、保存のために調製され得る。
そのような適切な薬学的に受容可能な因子としては、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。代表的には、本発明の医薬は、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸など）を、１つ以上の生理的に受容可能なキャリア、賦形剤または希釈剤とともに組成物の形態で投与され得る。例えば、適切なビヒクルは、注射用水、生理的溶液、または人工脳脊髄液であり得、これらには、非経口送達のための組成物に一般的な他の物質を補充することが可能である。そのような受容可能なキャリア、賦形剤または安定化剤は、レシピエントに対して非毒性であり、そして好ましくは、使用される投薬量および濃度において不活性であり、そして以下が挙げられる：リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）；低分子量ポリペプチド；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン）；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；モノサッカリド、ジサッカリドおよび他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）；ならびに／あるいは非イオン性表面活性化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ、プルロニック（ｐｌｕｒｏｎｉｃ）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ））。
注射剤は当該分野において周知の方法により調製することができる。例えば、適切な溶剤（生理食塩水、ＰＢＳのような緩衝液、滅菌水など）に溶解した後、フィルターなどで濾過滅菌し、次いで無菌容器（例えば、アンプルなど）に充填することにより注射剤を調製することができる。この注射剤には、必要に応じて、慣用の薬学的キャリアを含めてもよい。非侵襲的なカテーテルを用いる投与方法も使用され得る。例示の適切なキャリアとしては、中性緩衝化生理食塩水、または血清アルブミンと混合された生理食塩水が挙げられる。好ましくは、本発明の医薬は、適切な賦形剤（例えば、スクロース）を用いて凍結乾燥剤として処方される。他の標準的なキャリア、希釈剤および賦形剤は所望に応じて含まれ得る。他の例示的な組成物は、ｐＨ７．０−８．５のＴｒｉｓ緩衝剤またはｐＨ４．０−５．５の酢酸緩衝剤を含み、これらは、さらに、ソルビトールまたはその適切な代替物を含み得る。その溶液のｐＨはまた、種々のｐＨにおいて、本発明の活性成分（例えば、ポリペプチドまたは核酸など）の相対的溶解度に基づいて選択されるべきである。
本発明の製剤の処方手順は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方、他の国の薬局方などに記載されている。従って、当業者は、本明細書の記載があれば、過度な実験を行うことなく、投与すべきポリペプチド量および細胞量を決定することができる。
１つの実施形態において、本発明の組成物および医薬は、徐放性形態で提供され得る。徐放性形態で投与される場合、活性成分（例えば、核酸またはポリペプチド）は、徐々に放出されるので、長期にわたり薬効が期待される場合に有効である。徐放性形態の剤型は、本発明において使用され得る限り、当該分野で公知の任意の形態であり得る。そのような形態としては、例えば、ロッド状（ペレット状、シリンダー状、針状など）、錠剤形態、ディスク状、球状、シート状のような製剤であり得る。徐放性形態を調製する方法は、当該分野において公知であり、例えば、日本薬局方、米国薬局方および他の国の薬局方などに記載されている。徐放剤（持続性投与剤）を製造する方法としては、例えば、複合体から薬物の解離を利用する方法、水性懸濁注射液とする方法、油性注射液または油性懸濁注射液とする方法、乳濁製注射液（ｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型の乳濁製注射液など）とする方法などが挙げられる。
別の実施形態では、本発明では、さらに他の薬剤もまた投与することも企図される。そのような薬剤は、当該分野において公知の任意の医薬であり得、例えば、そのような薬剤は、薬学において公知の任意の薬剤（例えば、抗生物質など）であり得る。当然、そのような薬剤は、２種類以上の他の薬剤であり得る。そのような薬剤としては、例えば、日本薬局方最新版、米国薬局方最新版、他の国の薬局方の最新版において掲載されているものなどが挙げられる。
他の実施形態において、本発明の方法によって調製された細胞は２種類以上の細胞を含み得る。２種類以上の細胞を使用する場合、類似の性質または由来の細胞を使用してもよく、異なる性質または由来の細胞を使用してもよい。
本発明の方法において使用されるポリペプチド、核酸、組成物、医薬および細胞の量は、使用目的、対象物の齢、サイズ、性別、既往歴、ポリペプチド、核酸、組成物、医薬もしくは細胞の形態または種類、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。
本発明の組成物を対象物に対して与える頻度もまた、使用目的、対象物の齢、サイズ、性別、既往歴、および処置経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度としては、例えば、一日に１回〜数回、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
本発明が対象とする疾患は、がんである。本明細書において「がん」とは、悪性腫瘍一般をいう。本発明が特に対象とするがんは、固形がん（特に、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫および他の固形がん）などを挙げることができる。従って、本発明が対象とする疾患は、「小細胞肺がん」であり得る。「がん」は、通常、異型性が強く、増殖が正常細胞より速く、周囲組織に破壊性に浸潤し得あるいは転移をおこし得る悪性腫瘍またはそのような悪性腫瘍が存在する状態をいう。本発明においては、がんは固形がんおよび造血器腫瘍を含むがそれらに限定されない。
本明細書において「固形がん」は、固形の形状があるがんをいい、白血病などの造血器腫瘍とは対峙する概念である。そのような固形がんとしては、例えば、乳がん、肝がん、胃がん、肺がん、頭頸部がん、子宮頸部がん、前立腺がん、網膜芽細胞腫、悪性リンパ腫、食道がん、脳腫瘍、骨腫瘍が挙げられるがそれらに限定されない。
本明細書において「肺がん」とは、肺のがんをいう。肺がんは固形がんの一種である。肺がんは気管、気管支、肺胞の細胞が正常の機能を失い、無秩序に増えることにより発生する。がんは周囲の組織や器官を破壊して増殖しながら他の臓器に拡がり、多くの場合、腫瘤（しゅりゅう）を形成する。肺がんになる人は世界的に増加傾向にある。２０１５年には、我が国での肺がんの１年間の新患者数は男性１１万人、女性３万７千人になると予想されている。５０歳以上に多く、男女比は約３：１である。１９９９年の肺がんによる年間死亡者数は約５万２千人であり（がんで亡くなった方は約２９万人、うち胃がん約５万人）、１９９３年からは肺がんは男性のがん死亡率の第１位となり、女性では胃がんに次いで第２位となっている。肺がんの５年生存率（治療開始から５年間生存している割合）は２５〜３０％といわれている。
肺がんは、小細胞がんと非小細胞がんの２つの型に大きく分類される。非小細胞肺がんは、さらに腺がん、扁平上皮がん、大細胞がん、腺扁平上皮がんなどの組織型に分類される。肺がんの発生しやすい部位、進行形式と速度、症状などの臨床像は多彩ですが、これも多くの異なる組織型があるためである。腺がんは、我が国で最も発生頻度が高く、男性の肺がんの４０％、女性の肺がんの７０％以上を占めている。肺がんの中でも他の組織型に比べ臨床像は多彩で、進行の速いものから進行の遅いものまでいろいろある。次に多い扁平上皮がんは、男性の肺がんの ４０％、女性の肺がんの１５％を占めている。気管支が肺に入った近くに発生する肺門型と呼ばれるがんの頻度が、腺がんに比べて高くなる。大細胞がんは、一般に増殖が速く、肺がんと診断された時には大きながんであることが多くみられる。
本明細書において、小細胞がんは、顕微鏡で見るとリンパ球に似た比較的小さな細胞からなっており、燕麦（えんばく）のような小型の細胞に見えることより、燕麦細胞がんとも呼ばれている。小細胞がんは肺がんの約１５〜２０％を占め、増殖が速く、脳・リンパ節・肝臓・副腎・骨などに転移しやすい悪性度の高いがんである。非小細胞肺がんと異なり、抗がん剤や放射線治療が比較的効きやすいタイプのがんであることから、他のがんにおける知見が何ら役に立たないという特殊な性質を有する。約８０％以上では、がん細胞が種々のホルモンを産生している。そのため、まれに副腎皮質刺激ホルモンによるクッシング症候群と呼ばれる身体の中心部を主体とした肥満、満月のような丸い顔貌、全身の皮膚の色が黒くなる、血圧が高くなる、血糖値が高くなる、血液中のカリウム値が低くなるなどの症候があらわれることもある。その他、まれに抗利尿ホルモンの産生による水利尿不全にともない、血液中のナトリウム値が低くなり、食欲不振などの消化器症状や神経症状・意識障害が出現することがある。大細胞がんでは、細胞の増殖を増やす因子の産生による白血球増多症や発熱、肝腫大などがあらわれることがあり、その形態ごとに、病態は全く異なるのが特徴である。
肺がんの診断は、通常、気管支鏡検査、穿刺吸引細胞診、ＣＴガイド下肺針生検、胸膜生検、リンパ節生検などによって行われている。一般的には、胎児性タンパクのＣＥＡが検査されるが、小細胞がんでは、がん細胞が神経内分泌系細胞の特徴も有していることから、神経内分泌系細胞のマーカーであるＮＳＥまたはＰｒｏＧＲＰの検査も行われているが、その決め手にかいている。
病期に分類すると、小細胞肺がんでは、潜伏がん、０、Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ期などの分類以外に、限局型、進展型に大別する方法も使われている。限局型で放射線療法と化学療法の合併療法を受けた場合、２年、３年、５年生存率はそれぞれ約５０、３０、２５％といわれている。進展型で化学療法を受けた場合、３年生存率は約１０％といわれている（以上、国立がんセンター、ウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃ．ｇｏ．ｊｐ／ｊｐ／ｎｃｃ−ｃｉｓ／ｐｕｂ／ｃａｎｃｅｒ／０１０２０２．ｈｔｍｌより）。
本明細書においてがんまたは細胞の「浸潤」とは、白血球・リンパ球・癌細胞などの遊走細胞が組織内に侵入し，一般に境界の固定されていない病巣を示す病理的現象をいう。特に、新生物の細胞の移動または侵入をいう。
本明細書においてがんの「浸潤性」とは、「浸潤」の性質をいう。本明細書では、代表的に、そのような浸潤の「程度」は、蛍光標識色素カルセインＡＭなどで染色したがん細胞を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞またはヒト由来血管内皮細胞などの基底細胞の単層培養上に重層した場合の、細胞形態の伸展性、並びに接着強度を指標として記載する。ＮＩＨ３Ｔ３細胞は、ＴＳＬＣ１を導入、発現させたものを用いることが有利である。反応がより明確になるからである。より有利には、本明細書では、浸潤性は、基底細胞に接着しているがん細胞の量を、蛍光標識（例えば、カルセインＡＭ）を指標として測定することをより判定される。強い弱いの一般的な分類法としては、例えば、上記重層ののち、細胞の接着が維持されたか剥離したかによって分類する方法を挙げることができるが、それに限定されない。そのような浸潤性の程度としては、ＡＴＬ細胞およびＨＴＬＶ−１感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度であるとか、ＡＴＬ細胞およびＨＴＬＶ−１感染細胞以外のＡＬＬ細胞と同程度であるなどと記載することもできる。ＡＴＬ細胞およびＨＴＬＶ−１感染細胞からなる群より選択される細胞は比較的強い浸潤性を有しているとされており、ＡＴＬ細胞およびＨＴＬＶ−１感染細胞以外のＡＬＬ細胞は比較的弱い浸潤性を有しているとされる。
本明細書において「抗がん剤」とは、がん（腫瘍）細胞の増殖を選択的に抑制し、がんの薬剤および放射線治療の両方を包含する。そのような抗がん剤は当該分野において周知であり、例えば、抗がん剤マニュアル第２版 塚越茂他編 中外医学社；Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｉｎｃ．に記載されている。
本明細書において「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができるような任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子」に対して「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡ）であり得る。
理論に束縛されないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものを、ＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
また、理論に束縛されることを希望しないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こす因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
本発明のＲＮＡｉを引き起こす因子としてはまた、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の処置方法および組成物において有用である。
以下により詳細なＲＮＡｉの設計方法の説明を記載する。
本発明において用いられるＲＮＡｉとしては、標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するDNAとRNAからなる２本鎖ポリヌクレオチドを、細胞、組織、あるいは個体に導入することを特徴とする標的遺伝子の発現阻害方法を用いることができる。ここで、２本鎖ポリヌクレオチドが、自己相補性を有する１本鎖からなるものを用いることができる。あるいは、この２本鎖ポリヌクレオチドは、DNA鎖とRNA鎖のハイブリッドであってもよい。好ましくは、使用されるDNA鎖とRNA鎖のハイブリッドは、センス鎖がDNAで、アンチセンス鎖がRNAであり得る。あるいは、使用される２本鎖ポリヌクレオチドは、DNAとRNAのキメラであってもよい。１つの実施形態では、使用される２本鎖ポリヌクレオチドが、該ポリヌクレオチドのうち、少なくとも上流側の一部はRNAであってもよい。１つの実施形態では、使用されるヌクレオチドの上流側の一部は、９〜１３ヌクレオチドからなり得る。
１つの実施形態では、使用される２本鎖ポリヌクレオチドは、１９〜２５ヌクレオチドからなり、該ポリヌクレオチドのうち、少なくとも上流約１／２がＲＮＡであり得る。
ＲＮＡｉ技術では、標的遺伝子は、複数であってもよい。ＲＮＡｉ技術による標的遺伝子の発現阻害の結果、該細胞、組織、あるいは個体に現れる表現型の変化を解析することにより効果確認を行うことができる。
ＲＮＡｉ技術を用いれば、標的遺伝子の発現の阻害により、細胞、組織、あるいは個体に特定の性質を付与することができる。
ＲＮＡｉ法におけるＲＮＡの機能部位は、以下の工程を包含する方法により同定することができる：（ｉ）標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有する２本鎖ポリヌクレオチドであってＤＮＡとＲＮＡのキメラからなるものを作製し、（ｉｉ）該２本鎖ポリヌクレオチドを細胞、組織、あるいは個体に導入し、（ｉｉｉ）該細胞、組織、あるいは個体中の標的遺伝子の発現阻害度を測定し、（ｉｖ）標的遺伝子の発現阻害にＲＮＡであることが必要とされる配列を特定すること。この方法では、使用される２本鎖ポリヌクレオチドが、その２本鎖のどちらか一方がＲＮＡ鎖であってもよい。
本明細書においてＲＮＡｉ技術で使用される「標的遺伝子」とは、これを導入する細胞、組織、あるいは個体（以下これを「被導入体」と称することがある）にｍＲＮＡ、および任意にタンパク質を産出するように翻訳され得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、導入する対象物の内在性のものでも、また外来性のものでもよい。また、染色体上に存在する遺伝子でも、染色体外のものでもよい。外来性のものとしては、例えば、被導入体に感染可能なウィルス、細菌、真菌または原生動物のような病原体由来のもの等が挙げられる。その機能については、既知のものでも、未知のものでもよく、また、他生物の細胞内では機能が既知であるが、被導入体内では機能が未知のもの等でもよい。
これらの遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチド（以下、これを「二本鎖ポリヌクレオチド」と称することがある）とは、標的遺伝子の塩基配列のうち、いずれの部分でもよい２０ヌクレオチド以上の配列と実質的に同一な配列からなるものである。ここで、実質的に同一とは、標的遺伝子の配列と５０％以上、好ましくは７０％以上、さらに好ましくは８０％以上の相同性を有することを意味する。ヌクレオチドの鎖長は１９ヌクレオチドから標的遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の全長までの如何なる長さでもよいが、１９〜５００ヌクレオチドの鎖長を有するものが好ましく用いられる。ただし、哺乳類動物由来の細胞においては、３０ヌクレオチド以上の鎖長を有する二本鎖ＲＮＡに反応して活性化するシグナル伝達系の存在が知られている。これはインターフェロン反応と呼ばれており（Ｍａｒｅｕｓ，Ｐ．Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，５，１１５−１８０（１９８３））、該二本鎖ＲＮＡが細胞内に侵入すると、ＰＫＲ（ｄｓＲＮＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｋｉｎａｓｅ：Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介して多くの遺伝子の翻訳開始が非特異的に阻害され、それと同時に２’、５’ｏｌｉｇｏａｄｅｎｙｌａｔｅ ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ（Ｂａｓｓ，Ｂ．Ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，４２８−４２９（２００１））を介してＲＮａｓｅＬの活性化が起こり、細胞内のＲＮＡの非特異的な分解が惹起される。これらの非特異的な反応のために、標的遺伝子の特異的反応が隠蔽されてしまう。従って哺乳類動物、または該動物由来の細胞、あるいは組織を被導入体として用いる場合には１９〜２５、好ましくは１９〜２３、さらに好ましくは１９〜２１ヌクレオチドからなる二本鎖ポリヌクレオチドが用いられる。本発明の二本鎖ポリヌクレオチドは、その全体が２本鎖である必要はなく、５’、または３’末端が一部突出したものも含み、その突出末端は１〜５ヌクレオチド、好ましくは１〜３ヌクレオチド、さらに好ましくは２ヌクレオチドである。また、最も好ましい例としては、各ポリヌクレオチド鎖の３’末端が２ヌクレオチドずつ突出している構造を有するものが挙げられる。二本鎖ポリヌクレオチドは、相補性を有する部分が二本鎖となっているポリヌクレオチドを意味するが、自己相補正を有する１本鎖ポリヌクレオチドが自己アニーリングしたものでもよい。自己相補正を有する１本鎖ポリヌクレオチドとしては、例えば、逆方向反復配列を有するもの等が挙げられる。
さらに、ＤＮＡとＲＮＡの混合については、ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリッド型や、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ型等が用いられる。ＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖のハイブリッドは、それを被導入体に導入した際に、標的遺伝子の発現が阻害される活性を有するものである限り如何なるものであってもよいが、好ましくは、センス鎖がＤＮＡであり、アンチセンス鎖がＲＮＡであるものが用いられる。また、ＤＮＡとＲＮＡのキメラ型では、それを被導入体に導入した際に、標的遺伝子の発現が阻害される活性を有するものである限り如何なるものであってもよい。二本鎖ポリヌクレオチドの安定性を高めるためにはＤＮＡをできるだけ多く含むことが好ましいが、本発明のキメラ型二本鎖ポリヌクレオチドのうち、ＲＮＡであることが標的遺伝子の発現阻害に必要な配列については、後述する標的遺伝子の発現阻害度の解析を行いながら発現阻害の起こる範囲で適宜決定していくことが望ましい。これにより、ＲＮＡｉ法におけるＲＮＡの機能部位を同定することもできる。このように決定されたキメラ型の好ましい例としては、例えば、二本鎖ポリヌクレオチドの上流側の一部がＲＮＡであるものが挙げられる。ここで、上流側とは、センス鎖の５’側およびアンチセンス鎖の３’側を意味する。上流側の一部とは、上記二本鎖ポリヌクレオチドの上流の末端から９〜１３ヌクレオチドの部分が好ましく挙げられる。また、このようなキメラ型二本鎖ポリヌクレオチドとして好ましい例としては、ポリヌクレオチドの鎖長がそれぞれ１９〜２１ポリヌクレオチドからなり、該ポリヌクレオチドのうち、少なくとも上流側１／２がＲＮＡで、それ以外がＤＮＡである二本鎖ポリヌクレオチドが挙げられる。また、このような二本鎖ポリヌクレオチドのうち、アンチセンス鎖が全てＲＮＡのものは標的遺伝子の発現阻害効果がさらに高い。
二本鎖ポリヌクレオチドの調製方法としては、特に制限はないが、それ自体 既知の化学合成方法を用いることが好ましい。化学合成は、相補性を有する１本鎖ポリヌクレオチドを別個に合成し、これを適当な方法で会合させることにより二本鎖とすることができる。会合の方法として具体的には、例えば、合成した１本鎖ポリヌクレオチドを好ましくは少なくとも約３：７のモル比で、より好ましくは約４：６のモル比で、そして最も好ましくは本質的に同モル量（すなわち約５：５のモル比）で混合し、二本鎖が解離する温度にまで加熱し、その後徐々に冷却する方法等が挙げられる。会合した二本鎖ポリヌクレオチドは、必要に応じてそれ自体公知の通常用いられる方法により精製される。精製方法としては、例えばアガロースゲル等を用いて確認し、任意に残存する１本鎖ポリヌクレオチドを適当な酵素により分解する等して除去する方法を用いることができる。また、自己相補正を有する１本鎖ポリヌクレオチドとして、逆方向反復配列を有するものを調製する場合には、該ポリヌクレオチドを化学合成等の方法で作製した後に上記と同様の方法で自己相補性を有する配列を会合させることにより調製する。
（二本鎖ポリヌクレオチドの細胞、組織、あるいは個体への導入、および標的遺伝子の発現阻害）
このようにして調製した二本鎖ポリヌクレオチドを導入する被導入体としては、標的遺伝子がその細胞内でＲＮＡに転写、またはタンパク質に翻訳され得るものであれば如何なるものであってもよい。具体的には、本発明で用いる被導入体は、細胞、組織、あるいは個体を意味する。本発明に用いられる細胞としては、生殖系列細胞、体性細胞、分化全能細胞、多分化能細胞、分割細胞、非分割細胞、実質組織細胞、上皮細胞、不滅化細胞、または形質転換細胞等何れのものであってもよい。具体的には、例えば、幹細胞のような未分化細胞、器官または組織由来の細胞あるいはその分化細胞等が挙げられる。組織としては、単一細胞胚または構成性細胞、または多重細胞胚、胎児組織等を含む。また、上記分化細胞としては、例えば、脂肪細胞、繊維芽細胞、筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、神経細胞、グリア、血液細胞、巨核球、リンパ球、マクロファージ、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、白血球、顆粒球、ケラチン生成細胞、軟骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、肝細胞および内分泌線または外分泌腺の細胞等が挙げられる。このような細胞の具体例としては、ＣＨＯ−ＫＩ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，２７，３５３−３６５（１９７２））、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、あるいはヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等が好ましく用いられる。さらに、本発明で被導入体として用いられる個体として、具体的には、植物、動物、原生動物、ウイルス、細菌、または真菌種に属するもの等が挙げられる。植物は単子葉植物、双子葉植物または裸子植物であってよく、動物は、脊椎動物または無脊椎動物であってよい。本発明の被導入体として好ましい微生物は、農業で、または工業によって使用されるものであり、そして植物または動物に対して病原性のものである。真菌には、カビおよび酵母形態両方での生物体が含まれる。脊椎動物の例には、魚類、ウシ、ヤギ、ブタ、ヒツジ、ハムスター、マウス、ラット、サルおよびヒトを含む哺乳動物が含まれ、無脊椎動物には、線虫類および他の虫類、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、および他の昆虫が含まれる。上記培養細胞として、具体的には、例えば、ＣＨＯ−ＫＩ細胞（ＲＩＫＥＮ Ｃｅｌｌ ｂａｎｋ）、ショウジョウバエＳ２細胞（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｍｂｒｙｏｌ．Ｅｘｐ．Ｍｏｒｐｈ．，２７，３５３−３６５（１９７２））、ヒトＨｅＬａ細胞（ＡＴＣＣ：ＣＣＬ−２）、あるいはヒトＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−１５７３）等が好ましく用いられる。
被導入体への二本鎖ポリヌクレオチドの導入法としては、被導入体が細胞、あるいは組織の場合は、カルシウムフォスフェート 法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、ウイルス感染、二本鎖ポリヌクレオチド溶液への浸漬、あるいは形質転換法等が用いられる。また、胚に導入する方法としては、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション法、あるいはウィスル感染等が挙げられる。被導入体が植物の場合には、植物体の体腔または間質細胞等への注入または灌流、あるいは噴霧による方法が用いられる。また、動物個体の場合には、経口、局所、（皮下、筋肉内および静脈内投与を含む）非経口、経膣、経直腸、経鼻、経眼、腹膜内投与等によって全身的に導入する方法、あるいはエレクトロポレーション法またはウイルス感染等が用いられる。経口導入のための方法には、二本鎖ポリヌクレオチドを生物の食物と直接混合することができる。さらに、個体に導入する場合には、例えば埋め込み長期放出製剤等として投与することや、二本鎖ポリヌクレオチドを導入した導入体を摂取させることにより行うこともできる。
導入する二本鎖ポリヌクレオチドの量は、導入体や、標的遺伝子によって適宜選択することができるが、細胞あたり少なくとも１コピー導入されるに充分量を導入することが好ましい。具体的には、例えば、被導入体がヒト培養細胞で、カルシウムフォスフェート法により二本鎖ポリヌクレオチドを導入する場合、０．１〜１０００nMが好ましい。
ここで、二本鎖ポリヌクレオチドは、２種類以上のものを同時に導入することもできる。この場合、該ポリ ヌクレオチドの導入を受けた細胞、組織、あるいは個体（以下これを「導入体」と称することがある）においては、２種類以上の標的遺伝子の発現阻害が期待さ れる。本発明において、標的遺伝子の発現阻害とは、その発現を完全に阻害することだけでなく、ｍ−ＲＮＡ、もしくはタンパク質の発現量として２０％以上の阻害を意味する。標的遺伝子の発現阻害度は、標的遺伝子のＲＮＡの蓄積、または標的遺伝子によってコードされるタンパク質の産出量を、二本鎖ポリヌクレオチドの導入体と非導入体において比較することにより測定することができる。ｍＲＮＡ量は、それ自体既知の通常用いられる方法により測定することができる。具体的には、例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的リバーストランスフェレースＰＣＲ、あるいはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション等を用いて行うことができる。また、タンパク質の産生量は、標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッティング法や、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定すること等により測定することができる。
（ＲＮＡｉ技術におけるポリヌクレオチドの導入）
（ＲＮＡｉ技術を用いた体内の遺伝子の発現阻害による遺伝子機能解析方法）
本発明の二本鎖ポリヌクレオチドによる導入体内の遺伝子の発現阻害の結果、該導入体に現れる表現型の変化を解析することにより導入した二本鎖ポリヌクレオチドが標的とする遺伝子の機能を同定することができる。
ここで、標的遺伝子はその機能が既知であっても、被導入体内での機能が未知のものであってもよい。該標的遺伝子に対応する二本鎖ポリヌクレオチドは上記のとおり調製され、被導入体に同様にして導入する。導入体でその変化を解析すべき表現型は特に制限はされないが、例えば導入体の形態、導入体内物質量、導入体が分泌する物質量、導入体内物質の動態、導入体間接着、導入体の運動、あるいは導入体の寿命等の生命体行動が挙げられる。標的遺伝子の機能が、他の被導入体において既知の場合には、その機能に連関する表現型について解析することが好ましい。表現型の変化を解析する手段としては、導入体の形態の変化を解析する場合には、顕微鏡、あるいは肉眼的に検出する方法を用いることができる。また、導入体内の物質として、例えばｍＲＮＡの場合には、その量の解析方法として、ノーザンハイブリダイゼーション、定量的リバーストランスフェレースＰＣＲ、あるいはインサイチュ（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション等が挙げられる。タンパク質の場合には、その量の解析方法として、標的遺伝子がコードするタンパク質を抗原とする抗体によるウェスタンブロッティング法や、標的遺伝子がコードするタンパク質が有する酵素活性を測定する方法等が挙げられる。このようにして解析した、導入体にのみ現れる表現型の変化は、標的遺伝子の発現阻害の結果生じているものであるので、これを標的遺伝子の機能として同定することができる。
（二本鎖ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子発現阻害により細胞、組織、あるいは個体に特定の性質を付与する方法）
本発明の二本鎖ポリヌクレオチドを用いた標的遺伝子の発現阻害により、細胞、組織、あるいは個体に特定の性質を付与することができる。特定の性質とは、標的遺伝子の発現阻害の結果、該導入体に現れるものをさす。ここでの標的遺伝子としては、その発現の阻害が導入体に与える性質がすでに判明しているものでもよいし、機能、もしくは導入体内での機能が未知のものでもよい。機能が未知の標的遺伝子については、これに対する二本鎖ポリヌクレオチドを導入した後に、該導入体が示す表現型のうち所望のものを選択することにより、該導入体に所望の性質を付与することができる。
被導入体に付与するべき所望の性質として、具体的には、例えば、細胞内生産機能、細胞外分泌を阻害する機能、細胞やＤＮＡに対する障害の修復機能、特定の疾患に対する耐性機能等が挙げられる。具体的には、被導入体が植物個体等の場合、標的遺伝子としては、果実熟成に関連する酵素、植物構造タンパク質、若しくは病原性に関連する遺伝子等が挙げられる。標的遺伝子の発現阻害が、特定の疾患に対する耐性機能を有する場合としては、特定のタンパク質の発現の上昇が特定の疾患の原因となる場合で、標的遺伝子は、上記タンパク質をコードする遺伝子や、上記タンパク質の発現を制御する機能を有するタンパク質をコードする遺伝子等が挙げられる。具体的例としては、標的遺伝子ががん化／腫瘍化表現型の保持に必要である遺伝子であり、被導入体ががん性細胞、または腫瘍組織等である。
このような標的遺伝子に対する二本鎖ポリヌクレオチドは、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を阻害することから、標的遺伝子が関連する疾患の治療または予防薬として用いることができる。二本鎖ポリヌクレオチドを上記薬剤の有効成分として用いる場合には、該ポリヌクレオチドを単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
このような遺伝子を標的とする二本鎖ポリヌクレオチドが導入された導入体は、その遺伝子発現阻害に付随すると予測される表現型によって選択される。また、導入する二本鎖ヌクレオチドにおいて、特定の遺伝標識、例えば蛍光タンパク質等をコードする配列を連結しておけば、被導入体に該二本鎖ポリヌクレオチドと共に導入した蛍光タンパク質の発現阻害度に基づいて選択することも可能である。このうち、例えばガン抑制に機能する遺伝子を標的遺伝子とした場合、選択されるべき細胞の形質としては、増殖能の亢進の程度、細胞接着能の低下、あるいは運動（転移）能の亢進等、悪性腫瘍の形質等が挙げられる。また、生体リズムを調製する遺伝子を標的遺伝子とした場合、選択されるべき細胞の形質としては、細胞固有の慨日リズムの消失等が挙げられる。さらには、環境変異原によるDNA損傷の修復等に関与する遺伝子を標的遺伝子とした場合、選択されるべき細胞の形質としては、変異原に対して感受性を示すこと等が挙げられる。
選択された導入体は、それぞれに適したそれ自体既知のクローン化技術により系として樹立、取得することができる。具体的には、被導入体が細胞である場合に は、導入体は通常の培養細胞における細胞株樹立法である、限界希釈法、薬剤耐性マーカーによる方法等により細胞株として樹立、取得することができる。本発明で取得された特定の機能を付与された導入体は、有用物質の産生あるいは分泌効率が上昇した細胞株、細胞あるいはＤＮＡ等に対する障害を与える環境要因に対して高感受性を示す細胞株、疾病に付随する形質を示し、疾病治療のモデルとして使用することができる。
このうち、疾病治療のモデルとなる細胞株の取得方法を、本発明のさらなる具体的な適用例として説明する。標的遺伝子としては、その発現量の低下、または欠如が疾病の原因となる遺伝子が挙げられる。具体的には、小細胞肺がんにおけるＴＳＬＣ１の分子経路の因子（ＴＳＬＣ１、Ｒａｃ１、Ｔｉａｍ１など）遺伝子等が挙げられる。
これらのヒト遺伝子等の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチドを、例えばヒト由来の培養細胞に導入することにより、ヒト型の疾病モデル細胞を取得することができる。さらにこの特定の性質を付与された細胞、組織、あるいは個体に被検物質を接触させて、その遺伝子が関与する疾病の症状、あるいは形質に変化が現れるか否かを解析することによれば、上記疾病の治療剤、および／または予防剤のスクリーニングを行うことも可能である。
このようなスクリーニングにより選択された物質を上記薬剤の有効成分として用いる場合には、該物質を単独で用いることも可能であるが、薬学的に許容され得る担体と配合して医薬品組成物として用いることもできる。この時の有効成分の担体に対する割合は、１〜９０重量％の間で変動され得る。また、かかる薬剤は種々の形態で投与することができ、それらの投与形態としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、あるいはシロップ剤等による経口投与、または注射剤、点滴剤、リポソーム剤、坐薬剤等による非経口投与を挙げることができる。また、その投与量は、症状、年齢、体重等によって適宜選択することができる。
（指標遺伝子の発現阻害度を指標とした一次選択を用いる方法）
本明細書において上記したＲＮＡｉ技術は、被導入体に標的遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するＤＮＡとＲＮＡとからなる二本鎖ポリヌクレオチドを導入する方法である。この方法では、さらに（ａ）指標タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクター、（ｂ）該指標タンパク質をコードする塩基配列の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチドを導入し、該指標タンパク質から発せられる信号量を指標として導入体を一次スクリーニングすることにより、導入体内での遺伝子の発現阻害がかかった導入体のみを解析することができ、効率的な解析を行うことができる。
ＲＮＡｉ技術のさらに具体的な例として、被導入体を脊椎動物由来の培養細胞とし、指標タンパク質を蛍光タンパク質とした場合を説明する。脊椎動物由来の培養細胞に蛍光タンパク質をコードするＤＮＡを含む発現ベクターを導入して培養し、該指標タンパク質から発せられる蛍光量が、特定の強さ以上の細胞を選択する。ここで選択された細胞に、さらに指標タンパク質をコードするＤＮＡの少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するＤＮＡとＲＮＡとからなる二本鎖ポリヌクレオチドを導入して培養して、指標遺伝子の発現の阻害度を、該指標タンパク質から発せられる蛍光量の減弱度により解析することができる。
このような一次スクリーニングは、いずれも被導入体への二本鎖ポリヌクレオチドの導入が行われたことや、該導入体内で標的遺伝子の発現阻害が起こっていることを確認するものであるので、指標タンパク質は、そのタンパク質量とそれが発する信号量とが相関するものである必要がある。このようなタンパク質の具体例としては、ルシフェラーゼタンパク質が挙げられる。
さらには、標的遺伝子発現の阻害度を測定する場合に、指標タンパク質の発現量を基準として、標的遺伝子がコードするタンパク質量を算出することもできる。
（ＲＮＡｉ技術に用いられるキット）
本明細書において記載したＲＮＡｉ技術実施するためのキットとしては、二本鎖ポリヌクレオチド、指標タンパク質をコードするＤＮＡを含むベクター、指標遺伝子の少なくとも一部の塩基配列と実質的に同一の配列を有するＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖ポリヌクレオチド、酵素、バッファー等の試薬類、ポリヌクレオチオド導入のための試薬類等が含まれる。本発明のキットは、これら全ての試薬類等を含む必要はなく、上記した本発明の方法に用いられるキットであればいかなる試薬類等の組み合わせであってもよい。
ＲＮＡｉ技術を用いた場合に、ＲＮＡｉ効果の発現が弱い細胞であっても、特にＲＮＡｉ効果の高く発現している細胞を一次スクリーニングして、より強いものを利用すればよい。
上述のような例示のＤＮＡとＲＮＡとからなるポリヌクレオチド、具体的にはＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖からなるハイブリッドポリヌクレオチド、またはＤＮＡ−ＲＮＡキメラポリヌクレオチドを用いることによって導入するポリヌクレオチドの物質としての安定性を高め、製造費用を低減することが可能である。このことから、ＲＮＡｉ技術を用いて、導入するポリヌクレオチド自体を、がん治療を目的とした製剤として開発することができる。また、ＤＮＡはＲＮＡと比較して蛍光標識、ビオチン標識、アミン化、リン酸化、チオール化等の修飾をより多種にわたり容易に行うことができる。従って、医薬品あるいは試薬として使用する場合に、このような化学的修飾を行うことによって目的に応じた機能を付加することができる。
（好ましい実施形態）
以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。
１つの局面において、本発明は、がんの転移および／または浸潤の調節方法であって、Ａ）ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する工程を包含する、方法を提供する。この方法では、好ましくは、調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含する。ＴＳＬＣ１の分子経路における因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１および低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１、プロテイン４．１Ｂ，プロテイン４．１Ｎ、ＭＰＰ３、プロテインＰａｌｓ２、プロテインＣＡＳＫを含み得る。本発明の転移・浸潤の調節方法では、ＴＳＬＣ１の過剰発現を調節することを包含し得る。理論に束縛されることを望まないが、ＴＳＬＣ１の過剰発現により、転移・浸潤が亢進し得ることが明らかになったからである。
１つの実施形態において、本発明の転移・浸潤の調節方法では、ＴＳＬＣ１の分子経路の調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子を調節する調節因子により達成される。このような調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子などであってもよい。
１つの実施形態では、ＴＳＬＣ１の分子経路は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の過剰発現をＲＮＡｉにより抑制され得る。あるいは、別の実施形態では、ＴＳＬＣ１の分子経路は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の過剰発現を抗体により抑制され得る。他の実施形態では、ＴＳＬＣ１の分子経路は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の優性欠失改変により抑制され得る。
本発明のがんの転移および／または浸潤の調節方法では、がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫などの他の固形がん等であり得る。これらのがんは、白血病とは違い、転移・浸潤については、白血病の知見からは予測不可能である。
１つの実施形態では、本発明において実施されるＴＳＬＣ１の分子経路の調節は、Ｒａｃ１の活性化の抑制であってもよい。理論に束縛されることを望まないが、本発明では、がんにおいてＲａｃ１が予想外に活性化していることを見出したことから、Ｒａｃ１の活性化ががんの指標であることをみいだすとともに、これを抑制することによって、がんの浸潤および／または転移を抑制することができるとともに、がんの処置または予防を行うことができることを見出した。
１つの実施形態では、本発明において対象となるＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、ＴＳＬＣ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴＳＬＣ１のＲＮＡｉであってもよい。ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）に示す配列を有し得る。
１つの実施形態では、本発明において対象となるＴｉａｍ１は、配列番号３に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、Ｔｉａｍ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴｉａｍ１のＲＮＡｉであってもよい。Ｔｉａｍ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、Ｔｉａｍ１のＲＮＡｉは、配列番号９および配列番号１０に示す配列（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）に示す配列を有し得る。
１つの実施形態では、本発明において対象となるＲａｃ１は、配列番号５に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号６に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、Ｒａｃ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＲａｃ１のＲＮＡｉであってもよい。Ｒａｃ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、Ｒａｃ１のＲＮＡｉは、配列番号５に示す配列に基づいて設計され得る。
別の実施形態では、本発明において、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の優性欠失改変は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される少なくとも１つの因子の優性欠失の改変を含んでいてもよい。ここで、より好ましくは、優性欠失改変は、Ｒａｃ１の配列（配列番号５）に基づいて設計された配列を使用することによって達成される。
別の局面において、本発明は、がんの転移および／または浸潤の調節システムであって、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する手段を備える、システムを提供する。このような調節システムにおいて使用される調節手段は、本発明において説明される任意の調節手段が使用されることが理解される。
他の局面において、本発明は、がんの転移および／または浸潤の調節組成物であって、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する調節因子を含む、組成物を提供する。このような調節組成物において使用される調節因子は、本発明において説明される任意の調節因子が使用されることが理解される。
１つの実施形態では、上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよい。
具体的な実施形態では、本発明の組成物において含有される調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子を調節する調節因子を含み得る。ここで、より具体的には、使用され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子のＲＮＡｉであり得る。ＲＮＡｉの具体的な設計方法は、本明細書において詳述されたとおりであり得る。
別の具体的な実施形態では、含有され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子に対する抗体であり得る。
他の具体的な実施形態では、含有され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子の優性欠失変異体またはその誘導因子であり得る。
本発明の組成物が対象とするがんは、小細胞肺がんであり得る。
（がんの転移および／または浸潤の調節因子のスクリーニング）
別の局面において、本発明は、がんの転移および／または浸潤の調節因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、Ａ）候補物質を提供する工程、Ｂ）該候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；Ｃ）該候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、該調節する因子を、がんの転移および／または浸潤の調節因子であると決定する工程を包含する。ここで、対象となるがんは、小細胞肺がんであり得る。１つの実施形態では、小細胞肺がんでは、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子は、ＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１であってもよい。
１つの実施形態では、本発明において使用される候補物質は、どのような物質であってもよいが、例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であり得る。ここで、ＴＳＣＬ１の分子経路を調節する因子の同定は、その分子経路中の因子の活性化または不活化、あるいは、発現量の増減、リン酸化量の増減、分子量の増減などを観察することによって行うことができる。ここでは、例えば、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の優性欠失改変体を用いてもよい。
より好ましい局面では、本発明のがんの転移および／または浸潤の調節因子をスクリーニングする方法は、Ａ）候補物質を提供する工程、Ｂ）該候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；Ｃ）該候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、該調節する因子を、がんの転移および／または浸潤の調節因子の候補であると決定する工程；Ｄ）さらに、該調節因子の候補を、がんの転移および／または浸潤のアッセイ系に供する工程；Ｅ）該調節因子の候補の内、がんの転移および／または浸潤を調節する因子を選択する工程を包含してもよい。
別の局面において、本発明は、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の優性欠失改変体を提供する。ここで、本発明の改変体は、ゲノム、細胞、組織、臓器または個体の全部または一部であってもよい。好ましくは、個体であり得、この場合は、例えば、本発明のがんの転移および／または浸潤のための、モデル動物として薬物のスクリーニングに使用することができる。
別の局面では、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって、同定されたがんの転移および／または浸潤の調節因子を提供する。この調節分子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよく、このような分子は、周知のコンビナトリアルケミストリー技術を用いて製造することができる。
（がん診断）
別の局面において、本発明は、がんの診断方法であって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを測定する工程を包含する、方法を提供する。ここで、対象となるＴＳＬＣ１の分子経路の因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１であってもよい。ここで、因子のレベルは、その因子に対する特異的因子によって測定され得る。ここで、特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよい。ここで、この特異的因子は、標識されまたは標識され得る。例えば、そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。
１つの具体的な実施形態では、使用される特異的因子は、配列番号５に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子であり得る。ここで、この特異的因子は、配列番号６に示す配列のポリペプチドに対する抗体であり得る。
１つの実施形態では、本発明において対象となるがんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫などの固形がんであり得、好ましくは、小細胞肺がんであり得る。小細胞肺がんについては、ＴＳＬＣ１の分子経路との関連について、これまで何ら解析が行われておらず、従って、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子が小細胞肺がんの診断に使用できるとは予測されていなかったことから、本発明は予想外の診断を可能にしたという意味で重要である。
好ましい実施形態では、本発明が対象とするＴＳＬＣ１の分子経路の因子はＲａｃ１であり、ここで、Ｒａｃ１の活性化の抑制は、がんの指標である。
本発明では、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルの測定は、細胞または血清におけるＲａｃ１遺伝子の転写産物またはＲａｃ１タンパク質の有無を検出することによって達成され得る。
１つの実施形態では、上記検出は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われ得る。このようなプライマーは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
別の実施形態では、上記検出は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われ得る。このようなプローブは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
別の実施形態では、上記検出は、配列番号６に示す配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われ得る。このような抗体は、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法における検出は、活性化型Ｒａｃ１を特異的に認識する抗体または他の認識手段を含む試薬を用いて行われ得る。
（がんの診断薬）
別の局面において、本発明は、がんの診断薬であって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを測定する手段を備える、診断薬を提供する。本発明のがんの診断薬では、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１、Ｒａｃ１などであり得る。
１つの実施形態では、本発明において使用されるＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを測定する手段は、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子の特異的因子であり得る。このような特異的因子は、いったんＴＳＬＣ１の分子経路の因子が特定されたならば、本明細書の記載に従って、適宜設計可能であることが理解される。具体的には、このような特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子、それらの複合分子などであり得る。ここで、この特異的因子は、標識されまたは標識され得る。例えば、そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。このような場合、標識を検出するための検出手段もまた、本発明において利用され得、キット、システムとして構成される場合は、検出手段もまた、その構成要件であり得る。
具体的な実施形態では、本発明の診断薬において使用される特異的因子は、配列番号５に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子であり得る。ここで、この特異的因子は、配列番号６に示す配列のポリペプチドに対する抗体であり得る。
１つの実施形態では、本発明の診断薬において対象となるがんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫および他の固形がんであり得、好ましくは、小細胞肺がんであり得る。小細胞肺がんについては、ＴＳＬＣ１の分子経路との関連について、これまで何ら解析が行われておらず、従って、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子が小細胞肺がんの診断に使用できるとは予測されていなかったことから、予想外の顕著な効果を本発明の診断薬は達成し得る。
好ましい実施形態では、本発明が対象とするＴＳＬＣ１の分子経路の因子はＲａｃ１であり、ここで、Ｒａｃ１の活性化の抑制は、がんの指標である。
本発明では、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルの測定は、細胞または血清におけるＲａｃ１遺伝子の転写産物またはＲａｃ１タンパク質の有無を検出することによって達成され得る。
１つの実施形態では、本発明の診断薬は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含み得る。このようなプライマーは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。プライマーによる増幅の検出は、予測される産物のサイズを確認することによって行うことができる。
別の実施形態では、本発明の診断薬は、配列番号５に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含み得る。このようなプローブは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。プローブによる検出は、対象のサイズまたは標識を利用することによって行うことができる。
別の実施形態では、本発明の診断薬は、配列番号６に示す配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含み得る。このような抗体は、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。ここで、本発明において使用される抗体は、配列番号６に示す配列のポリペプチドのみを検出する能力を必要とするのではない。むしろ、何らかの方法で、配列番号６に示す配列のポリペプチドを検出することができ、擬陽性が減じられるかぎり、どのような特異性の抗体を用いても良いことが理解される。従って、本発明において用いられる抗体は、ポリクローナル抗体であってもよく、モノクローナル抗体であってもよい。
特定の実施形態では、本発明の診断薬は、活性化型Ｒａｃ１を特異的に認識する抗体を含み得る。このような抗体は、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
（がんの浸潤の診断）
１つの局面において、本発明は、がん細胞の浸潤性の程度を識別するための方法であって、そのがん細胞のTiam１の全長型およびTiam１の短縮型の発現のレベルを測定する工程を包含する、方法を提供する。従来、「浸潤性」は、実際にがん細胞を別の細胞と共培養することによってのみ測定されてきた。具体的には、がん細胞を蛍光標識色素カルセインAMなどで染色し、NIH3T3細胞やヒト由来血管内皮細胞の単層培養上に重層すると、浸潤性のがん細胞では細胞形態が伸展し接着するのに対し、非浸潤性のがん細胞では、細胞の伸展が認められず、また接着の程度が弱いことから、これを洗浄したのち、NIH3T3細胞に接着しているがん細胞の量をカルセインの蛍光標識を指標として測定する。この方法で、ATL細胞とT-ALL細胞を識別することができる。さらにNIH3T3細胞に全長TSLC1cDNAを導入、発現して同様の実験を行なうことにより、識別能をより高めることができる。
従って、ここで、がん細胞の浸潤性の程度は、蛍光標識色素カルセインＡＭなどで染色したがん細胞を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（好ましくは、ＴＳＬＣ１を導入、発現させたＮＩＨ３Ｔ３細胞）またはヒト由来血管内皮細胞の単層培養上に重層した場合の、細胞形態の伸展性、並びに接着強度を指標として記載され、このような指標を用いることにより評価され得る。ここで、因子のレベルは、その因子に対する特異的因子によって測定され得る。ここで、特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよい。ここで、この特異的因子は、標識されまたは標識され得る。例えば、そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。
１つの具体的な実施形態では、使用される特異的因子は、配列番号３に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子であり得る。ここで、この特異的因子は、配列番号４に示す配列のポリペプチドに対する抗体であり得る。配列番号３および４は、Ｔｉａｍ１の全長型に対応する。全長型は、浸潤性の弱い細胞に多く発現するようであることが本発明において見出された。
配列番号２３および２４は、Ｔｉａｍ１のイントロン１３を一部含むエクソン１４−２９に対応するバリアントに対応する。この短縮型は、浸潤性の強い細胞において多く発現するようであることが本発明において見出された。
１つの実施形態では、本発明において対象となるがんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫などの固形がんであり得、好ましくは、小細胞肺がんであり得る。がん細胞の浸潤性の程度については、ＴＳＬＣ１の分子経路との関連について、これまで何ら解析が行われておらず、従って、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子ががん細胞の浸潤性の程度の診断に使用できるとは予測されていなかったことから、本発明は予想外の診断を可能にしたという意味で重要である。
本発明では、Ｔｉａｍ１の全長型または短縮型のレベルの測定は、細胞または血清におけるＴｉａｍ１の全長型または短縮型の遺伝子の転写産物またはＴｉａｍ１タンパク質の全長型または短縮型のの有無を検出することによって達成され得る。
特定の実施形態では、測定は、配列番号３と配列番号２３とを識別することができる因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される）を用いて行われる。
特定の実施形態では、測定は、配列番号４と配列番号２４とを識別することができる因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される）を用いて行われる。
１つの実施形態では、上記検出は、配列番号３または２３に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われ得る。このようなプライマーは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。配列番号３と配列番号２３とを識別するためのプライマーとしては、例えば、配列番号２３のイントロン１３の部分に対応する配列を少なくとも一部含むものを挙げることができるが、それに限定されない。そのようなプライマーの一例としては、例えば、配列番号２１、配列番号２５および配列番号２８、ならびに配列番号２２、配列番号２６および配列番号２９に、それぞれフォワードおよびリバースとして示される配列を挙げることができるがそれらに限定されない。
別の実施形態では、上記検出は、配列番号３または２３に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われ得る。そのようなプローブの一例としては、例えば、配列番号２３、配列番号２７および配列番号３０に示す配列を含む核酸分子等を挙げることができる。このようなプローブは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
別の実施形態では、上記検出は、配列番号４または２４に示す配列のポリペプチドあるいはその特異的断片（すなわち、配列番号４または２４のいずれか一方にのみ存在する部分を有する断片）を特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われ得る。このような抗体は、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法における検出は、Ｔｉａｍ１の短縮型（好ましくはエクソン１４−２９に対応する型）を特異的に認識する抗体または他の認識手段を含む試薬を用いて行われ得る。この測定は、細胞または血清におけるTiam１タンパク質の全長型およびTiam１の短縮型の有無を検出することを含み得る。
特定の実施形態では、浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度と、それより弱い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む。好ましくは、浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度と、それより強い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む。あるいは、浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度の浸潤性と、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度の浸潤性とを識別することを含む。
（がんの浸潤の診断薬）
別の局面において、本発明は、がん細胞の浸潤性の程度を識別するためのシステムであって、Tiam１の全長型およびTiam１の短縮型の発現のレベルを測定する手段を包含する、システムを提供する。
１つの実施形態では、本発明において使用されるTiam１の全長型および／またはTiam１の短縮型の発現のレベルを測定する手段は、Tiam１の全長型および／またはTiam１の短縮型の特異的因子であり得る。このような特異的因子は、いったんTiam１の全長型および／またはTiam１の短縮型が特定されたならば、本明細書の記載に従って、適宜設計可能であることが理解される。具体的には、このような特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子、それらの複合分子などであり得る。ここで、この特異的因子は、標識されまたは標識され得る。例えば、そのように標識がされている場合、本発明の因子によって測定することができる種々の状態を直接および／または容易に測定することができる。そのような標識は、識別可能に標識される限り、どのような標識でもよく、例えば、蛍光、リン光、化学発光、放射能、酵素基質反応および抗原抗体反応などの技法が挙げられるがそれらに限定されない。あるいは、その因子が抗体などの免疫反応を利用して相互作用する場合、ビオチン−ストレプトアビジンのような免疫反応においてよく利用される系を用いてもよい。このような場合、標識を検出するための検出手段もまた、本発明において利用され得、キット、システムとして構成される場合は、検出手段もまた、その構成要件であり得る。
具体的な実施形態では、本発明の診断薬において使用される特異的因子は、配列番号３または２３に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子であり得る。ここで、この特異的因子は、配列番号４または２４に示す配列のポリペプチドに対する抗体であり得る。
配列番号３と配列番号２３とを識別するためのプライマーとしては、例えば、配列番号２３のイントロン１３の部分に対応する配列を少なくとも一部含むものを挙げることができるが、それに限定されない。そのようなプライマーの一例としては、例えば、配列番号２１、配列番号２５および配列番号２８、ならびに配列番号２２、配列番号２６および配列番号２９に、それぞれフォワードおよびリバースとして示される配列を挙げることができるがそれらに限定されない。
別の実施形態では、配列番号３または２３に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブの一例としては、例えば、配列番号２３、配列番号２７および配列番号３０に示す配列を含む核酸分子等を挙げることができる。このようなプローブは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
したがって、これらの特異的なプライマーまたはプライマーセット、およびプローブ等は、本発明において初めて提供されたものであり、１つの局面において、それら自体も本発明の範囲内にあり、本発明は、それら特異的プライマーおよびプローブを提供することにも留意すべきである。
１つの実施形態では、本発明のシステムが対象とするがんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫などの固形がんであり得、好ましくは、小細胞肺がんであり得る。がん細胞の浸潤性の程度については、ＴＳＬＣ１の分子経路との関連について、これまで何ら解析が行われておらず、従って、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子ががん細胞の浸潤性の程度の診断に使用できるとは予測されていなかったことから、本発明は予想外の診断を可能にしたという意味で重要である。
本発明では、Ｔｉａｍ１の全長型または短縮型のレベルの測定は、細胞または血清におけるＴｉａｍ１の全長型または短縮型の遺伝子の転写産物またはＴｉａｍ１タンパク質の全長型または短縮型のの有無を検出することによって達成され得る。
特定の実施形態では、測定は、配列番号３と配列番号２３とを識別することができる因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される）を用いて行われる。
特定の実施形態では、測定は、配列番号４と配列番号２４とを識別することができる因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される）を用いて行われる。
１つの実施形態では、上記検出は、配列番号３または２３に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む試薬を用いて行われ得る。このようなプライマーは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
別の実施形態では、上記検出は、配列番号３または２３に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む試薬を用いて行われ得る。このようなプローブは、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
別の実施形態では、上記検出は、配列番号４または２４に示す配列のポリペプチドを特異的に認識する抗体を含む試薬を用いて行われ得る。このような抗体は、本明細書において別の場所に記載される任意の方法によって調製することができる。
特定の実施形態では、本発明の方法における検出は、Ｔｉａｍ１の短縮型（好ましくはエクソン１３−２９に対応する型）を特異的に認識する抗体または他の認識手段を含む試薬を用いて行われ得る。
前記測定は、細胞または血清におけるTiam１タンパク質の全長型およびTiam１の短縮型の有無を検出することを含む。
特定の実施形態では、浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度と、それより弱い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む。好ましくは、浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度と、それより強い浸潤性を有する細胞とを識別することを含む。あるいは、浸潤の程度の識別は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される細胞と同程度の浸潤性と、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞以外のALL細胞と同程度の浸潤性とを識別することを含む。
１つの局面において、本発明はまた、浸潤性の強いがん細胞の識別するための組成物であって、該組成物は、Tiam1の短縮型を認識する因子を含む、組成物を提供する。ここで、好ましくは、浸潤性の強いがん細胞は、ATL細胞およびHTLV-1感染細胞からなる群より選択される。また、短いＴｉａｍ１は、少なくとも配列番号２３という配列もしくはその改変体、またはその相補体を有していてもよい
別の局面において、本発明は、エクソン１３−２９に対応するTiam１の短縮型を提供する。このTiam１バリアントは、好ましくは、少なくとも配列番号２３という配列もしくはその改変体、またはその相補体を有するがこれに限定されない。
あるいは、本発明は、エクソン１３−２９に対応するTiam１の短縮型を認識する能力を有する因子を提供する。ここで、Tiam１バリアントは、少なくとも配列番号２３という配列もしくはその改変体、またはその相補体を有していてもよい。
別の局面において、本発明は、エクソン１３−２９に対応するTiam１の短縮型とTiamの全長型とを識別する能力を有する因子を提供する。ここで、Tiam１バリアントは、少なくとも配列番号２３という配列もしくはその改変体、またはその相補体を有していてもよい。
（がんの処置または予防）
別の局面において、本発明は、がん（特に、小細胞肺がん）の処置または予防の方法であって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する工程を包含する、方法を提供する。この方法では、好ましくは、調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含する。ＴＳＬＣ１の分子経路における因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１、プロテイン４．１Ｂ，プロテイン４．１Ｎ、ＭＰＰ３、プロテインＰａｌｓ２、プロテインＣＡＳＫを含み得る。本発明のがんの処置または予防の方法では、ＴＳＬＣ１の分子経路が特に、小細胞肺がんおよびそれに関連するがんにおいて重要な役割を果たすことが示されており、そのようながんの処置および予防に使用できることが予想外に見出されたことから、本発明は、予想外に顕著な効果を奏するといえる。
１つの実施形態において、本発明のがんの処置または予防の方法では、ＴＳＬＣ１の分子経路の調節は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子を調節する調節因子により達成される。このような調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子などであってもよい。
１つの実施形態では、ＴＳＬＣ１の分子経路は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の過剰発現をＲＮＡｉにより抑制され得る。あるいは、別の実施形態では、ＴＳＬＣ１の分子経路は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の過剰発現を抗体により抑制され得る。他の実施形態では、ＴＳＬＣ１の分子経路は、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の優性欠失改変により抑制され得る。
１つの実施形態において、本発明のがんの処置または予防の方法では、がんは、小細胞肺がん、大腸がん、卵巣がん、骨肉腫、軟部組織肉腫などの他の固形がん等であり得る。
１つの実施形態において、本発明のがんの処置または予防の方法では、本発明において実施されるＴＳＬＣ１の分子経路の調節は、Ｒａｃ１の活性化の抑制であってもよい。理論に束縛されることを望まないが、本発明では、がんにおいてＲａｃ１が予想外に活性化していることを見出したことから、Ｒａｃ１の活性化ががんの指標であることをみいだしたからである。ここで、本発明では、Ｒａｃ１は浸潤および転移にも関与しているようであることが見出されたことから、がんの処置または予防とともに、転移・浸潤の予防も行うことができるという二重の効果を奏することが理解され得る。
１つの実施形態では、本発明のがんの処置または予防の方法では、本発明において対象となるＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、ＴＳＬＣ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴＳＬＣ１のＲＮＡｉであってもよい。ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）を有し得る。
１つの実施形態では、本発明のがんの処置または予防の方法では、本発明において対象となるＴｉａｍ１は、配列番号３に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号４に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、Ｔｉａｍ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴｉａｍ１のＲＮＡｉであってもよい。Ｔｉａｍ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、Ｔｉａｍ１のＲＮＡｉは、配列番号９および配列番号１０に示す配列（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）を有し得る。
１つの実施形態では、本発明のがんの処置または予防の方法では、本発明において対象となるＲａｃ１は、配列番号５に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号６に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、Ｒａｃ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＲａｃ１のＲＮＡｉであってもよい。Ｒａｃ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、Ｒａｃ１のＲＮＡｉは、配列番号５に示す核酸配列に基づいて設計される配列を有する。
別の実施形態では、本発明のがんの処置または予防の方法では、ＴＳＬＣ１の分子経路における因子の優性欠失改変は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される少なくとも１つの因子の優性欠失の改変、およびそれを実現する遺伝子治療を含んでいてもよい。ここで、より好ましくは、優性欠失改変は、Ｒａｃ１において配列番号１２（核酸配列）、配列番号１３（アミノ酸配列）という配列を使用することによって達成され得る。
別の局面では、本発明は、がんの処置または予防のシステムであって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する手段を備える、システムを提供する。ここでは、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する手段としては、本明細書において説明される任意の手段を利用することができることが理解される。
他の局面では、本発明は、がんの処置または予防のための組成物であって、ＴＳＬＣ１の分子経路の因子のレベルを調節する調節因子を含む、組成物を提供する。このような調節組成物において使用される調節因子は、本発明において説明される任意の調節因子が使用されることが理解される。
１つの実施形態では、上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよい。
具体的な実施形態では、本発明の組成物において含有される調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子を調節する調節因子を含み得る。ここで、より具体的には、使用され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子のＲＮＡｉであり得る。ＲＮＡｉの具体的な設計方法は、本明細書において詳述されたとおりであり得る。
別の具体的な実施形態では、含有され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子に対する抗体であり得る。
他の具体的な実施形態では、含有され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１からなる群より選択される因子の優性欠失変異体またはその誘導因子であり得る。
本発明の組成物が対象とするがんは、小細胞肺がんであり得る。
（がんの処置または予防のための因子のスクリーニング）
別の局面において、本発明は、がんの処置または予防のための因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、Ａ）候補物質を提供する工程、Ｂ）該候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；Ｃ）該候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、該調節する因子を、がんの処置または予防のための因子であると決定する工程
を包含し得る。ここで、対象となるがんは、小細胞肺がんであり得る。１つの実施形態では、小細胞肺がんでは、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子は、ＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１であってもよい。
１つの実施形態では、本発明において使用される候補物質は、どのような物質であってもよいが、例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であり得る。ここで、ＴＳＣＬ１の分子経路を調節する因子の同定は、その分子経路中の因子の活性化または不活化、あるいは、発現量の増減、リン酸化量の増減、分子量の増減などを観察することによって行うことができる。ここでは、例えば、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の優性欠失改変体を用いてもよい。
他の好ましい局面において、本発明は、がんの処置または予防ための因子をスクリーニングする方法を提供する。この方法は、Ａ）候補物質を提供する工程、Ｂ）該候補物質をＴＳＣＬ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；Ｃ）該候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子を同定し、該調節する因子を、がんの処置または予防のための因子であると決定する工程；Ｄ）さらに、該調節因子の候補を、がんの処置または予防のためのアッセイ系に供する工程；Ｅ）該調節因子の候補の内、がんの処置または予防のための因子を選択する工程を包含し得る。
別の局面において、本発明は、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の優性欠失改変体を提供する。ここで、本発明の改変体は、ゲノム、細胞、組織、臓器または個体の全部または一部であってもよい。好ましくは、個体であり得、この場合は、がんの処置または予防ためのモデル動物として薬物のスクリーニングに使用することができる。
別の局面では、本発明は、本発明のスクリーニング方法によって、同定されたがんの処置または予防ための因子を提供する。この調節分子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよく、このような分子は、周知のコンビナトリアルケミストリー技術を用いて製造することができる。
（遊走能の測定）
別の局面において、本発明はまた、細胞の遊走能を測定する方法であって、TSLC１活性のレベルを測定する工程を包含する、方法を提供する。この方法では、代表的に、レベルは、TSLC１の特異的因子（例えば、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される）によって測定される。特異的因子は、標識されていてもよく、またはその後に標識されうる能力を有していてもよい。
１つの実施形態では、本発明の細胞の遊走能を測定する方法では、本発明において対象となるＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、ＴＳＬＣ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴＳＬＣ１のＲＮＡｉであってもよい。ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）を有し得る。
１つの実施形態では、上記調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子であってもよい。
具体的な実施形態では、本発明では、ＴＳＬＣ１を調節する調節因子を含み得る。ここで、より具体的には、使用され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉであり得る。ＲＮＡｉの具体的な設計方法は、本明細書において詳述されたとおりであり得る。
別の具体的な実施形態では、含有され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１に対する抗体であり得る。
他の具体的な実施形態では、含有され得る調節因子は、ＴＳＬＣ１の優性欠失変異体またはその誘導因子であり得る。
本発明の遊走能を測定する方法において、使用される細胞は腎臓細胞であり得る。好ましくは、培養腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ細胞）であり得る。
遊走能は代表的には、E-カドヘリンおよびｂ−カテニンからなる群より選択される少なくとも１つの産物の発現の消失によって確認される。あるいは、遊走能は、ビメンチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、少なくとも１つの産物の発現の増加によって確認される。
別の局面において、本発明は、細胞の遊走能を測定する試薬であって、TSLC１活性のレベルを測定する因子を包含する、試薬を提供する。この因子は、TSLC１の特異的因子であり、この特異的因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択され得る。
別の実施形態では、特異的因子は、標識されまたは標識され得る因子である。
別の実施形態では、特異的因子は、配列番号１に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子であり得る。
別の実施形態では、特異的因子は、配列番号２に示す配列のポリペプチドに対する抗体であり得る。
１つの実施形態では、細胞は、腎臓細胞であり、好ましくは、MDCK細胞のような培養腎臓細胞である。ここで、これらの細胞の遊走能は、E-カドヘリンおよびｂ−カテニンからなる群より選択される少なくとも１つの産物の発現の消失によって確認されるか、あるいは、ビメンチンおよびフィブロネクチンからなる群より選択される、少なくとも１つの産物の発現の増加によって確認される。
別の局面では、本発明は、細胞中のTSLC1活性を測定する方法であって、該細胞の遊走能を測定する工程を包含する、方法を提供する。代表的には、遊走能は、HGFによって惹起されたものである。１つの実施形態では、細胞は、腎臓細胞であり、好ましくは、MDCK細胞のような培養腎臓細胞である。
さらに別の局面では、本発明は、細胞中のTSLC1活性を測定する試薬であって、該細胞の遊走能を測定する因子を備える試薬を提供する。代表的には、遊走能は、HGFによって惹起されたものである。１つの実施形態では、細胞は、腎臓細胞であり、好ましくは、MDCK細胞のような培養腎臓細胞である。
（遊走能の調節）
別の局面では、本発明は、細胞の遊走能を調節する方法であって、細胞内のTSLC１活性を調節する工程を包含する、方法を提供する。細胞の遊走能の調節は、増加または抑制であり得る。あるいは、細胞内のTSLC１活性の調節は、細胞内のTSLC１活性の増加または抑制であり得る。この調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含し得る。
ある実施形態において、調節は、ＴＳＬＣ１の発現を調節することを包含する。
別の実施形態において、調節は、ＴＳＬＣ１を調節する調節因子により達成されるこのような調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子などであってもよい。
別の実施形態では、調節は、ＴＳＬＣ１の発現をＲＮＡｉにより抑制することを包含する。あるいは、別の実施形態では、ＴＳＬＣ１の発現を抗体により抑制され得る。他の実施形態では、ＴＳＬＣ１の優性欠失改変により抑制され得る。
１つの実施形態では、本発明の遊走能の調節方法では、本発明において対象となるＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、ＴＳＬＣ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴＳＬＣ１のＲＮＡｉであってもよい。ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）を有し得る。
別の実施形態では、TSLC１活性の調節は、細胞内においてTSLC１の発現をさせることによって達成され得る。ここで、好ましくは、TSLC１は、少なくとも細胞内ドメインを含む。１つの実施形態では、細胞は、腎臓細胞であり、好ましくは、MDCK細胞のような培養腎臓細胞である。
（細胞の遊走能調節薬）
別の局面では、本発明は、細胞の遊走能を調節する試薬であって、細胞内のTSLC１活性を調節する因子を包含する、試薬を提供する。細胞の遊走能の調節は、増加または抑制であり得る。あるいは、細胞内のTSLC１活性の調節は、細胞内のTSLC１活性の増加または抑制であり得る。１つの実施形態では、調節は、ＴＳＬＣ１を抑制することを包含してもよい。
ある実施形態において、調節は、ＴＳＬＣ１の発現を調節することを包含する。
別の実施形態において、調節は、ＴＳＬＣ１を調節する調節因子により達成されるこのような調節因子は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子などであってもよい。
別の実施形態では、調節は、ＴＳＬＣ１の発現をＲＮＡｉにより抑制することを包含する。あるいは、別の実施形態では、ＴＳＬＣ１の発現を抗体により抑制され得る。他の実施形態では、ＴＳＬＣ１の優性欠失改変により抑制され得る。
１つの実施形態では、本発明の遊走能の調節方法では、本発明において対象となるＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有していてもよい。ここで、ＴＳＬＣ１の改変体とは、本明細書において定義され、例示される任意の改変体の形態であってもよいが、特に言及する場合は、生体内に天然に存在するものであることが好ましく、いわゆるＴＳＬＣ１のＲＮＡｉであってもよい。ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、その遺伝子情報に基づいて、上記される詳細な設計方法によって作製することができる。好ましくは、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列（それぞれ、センス配列、アンチセンス配列）を有し得る。
別の実施形態では、ＴＳＬＣ１活性の調節は、細胞内においてＴＳＬＣ１の発現をさせることによって達成され得る。ここで、好ましくは、ＴＳＬＣ１は、少なくとも細胞内ドメインを含む。１つの実施形態では、細胞は、腎臓細胞であり、好ましくは、ＭＤＣＫ細胞のような培養腎臓細胞である。
（使用）
別の局面において、本発明は、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子の、がんの転移および／または浸潤の調節のための組成物の製造における、使用を提供する。ここで、対象となるがんは、小細胞肺がんであり得る。１つの実施形態では、小細胞肺がんでは、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子は、ＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１であってもよい。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
別の局面において、本発明は、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子の、がんの診断のための組成物の製造における、使用を提供する。ここで、対象となるがんは、小細胞肺がんであり得る。１つの実施形態では、小細胞肺がんでは、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子は、ＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１であってもよい。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
他の局面において、本発明は、ＴＳＬＣ１の分子経路を調節する因子の、がんの処置または予防のための組成物の製造における、使用を提供する。ここで、対象となるがんは、小細胞肺がんであり得る。１つの実施形態では、小細胞肺がんでは、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子は、ＴＳＣＬ１、Ｔｉａｍ１およびＲａｃ１であってもよい。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
他の局面において、本発明は、がん細胞の浸潤性の診断薬の製造における、Ｔｉａｍ１の全長型およびＴｉａｍ１の短縮型の発現のレベルを測定する因子の使用を提供する。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
他の局面において、本発明は、細胞の遊走能を測定する試薬の製造における、ＴＳＬＣ１活性のレベルを測定する因子の使用を提供する。他の好ましい実施形態では、本明細書において上記組成物、方法、システムにおいて説明されるのと同様の任意の好ましい形態を採ることができることが理解される。
本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ）、和光純薬（大阪、日本）、などから市販されるものを用いた。動物実験は、政府が示す基準に則って行った。ヒト患者に対する処置においては、厚生労働省などにおいて規定される規準を遵守して行い、必要に応じて、インフォームド・コンセントを行った後の患者に対して行う。
（実施例１：TSLC1の過剰発現により、がん細胞は浸潤形質を示す。）
（TSLC1発現誘導がん細胞の樹立）
Ｔｅｔ−Ｏｆｆコントロールを有する細胞株を構築し、イーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。この最小培地には、０．１ｍＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ Ｔｅｔ ｓｙｓｔｅｍ ａｐｐｒｏｖｅｄ ＦＢＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００単位／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が、添加されていた。その関連遺伝子の発現を抑制するために、１００μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を、この培地に添加した。
（がん細胞のインビトロ増殖アッセイ：細胞増殖アッセイ）
製造業者のプロトコルに従って、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用するＭＴＳアッセイによって、細胞増殖を調べた。
（がん細胞の運動性のインビトロアッセイ：細胞運動性アッセイ）
運動性を、マイクロポアチャンバアッセイによって決定した。細胞（４×１０５）を、８μｍポアを有する６ウェルサイズのマイクロポアポリカーボネートメンブレンフィルタ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｌｉｎｃｏｌｎ Ｐａｒｋ，ＮＪ）の頂部チャンバに播いた。そして、その底部チャンバは、化学誘引物質として２％のウシ胎仔血清を含む、ＲＰＭＩ１６４０およびＨａｍ’ｓ Ｆ１２の混合培地で満たした。３７℃のインキュベーションの１６時間後に、そのメンブレンを固定して、そして、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｋ試薬（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）で染色して、そして、そのメンブレンを通過して移動した細胞の全てを、光学顕微鏡で計数した。各実験は、三連のウェルで、実施し、３回反復した。
（がん細胞の浸潤性インビトロアッセイ：細胞浸潤性アッセイ）
その浸潤能力を、浸潤チャンバアッセイによって決定した。細胞（３×１０４）を、８μｍポアを有する１４ウェルサイズのＭａｔｒｉｇｅｌ被覆マイクロポアメンブレンフィルタ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ｌａｂｗａｒｅ）の底部チャンバに播き、そして、その底部チャンバを、化学誘引物質として２％のウシ胎仔血清を含む、ＲＰＭＩ１６４０およびＨａｍ’ｓ Ｆ１２の混合培地で満たした。３７℃のインキュベーションの２２時間後に、そのメンブレンを固定して、そして、Ｄｉｆｆ Ｑｕｉｋ試薬（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅａｇｅｎｔｓ，Ｉｎｃ，Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）で染色した。次いで、そのメンブレンを介して浸潤した細胞の全てを、光学顕微鏡のもとで計数した。実験の各々は、三連で実行し、そして、３回反復した。
（ＳＣＩＤ マウスを用いた転移抑制アッセイ）
（動物）
雄性ＳＣＤマウス（６〜８週齢）を、ＣＬＥＡ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）から得て、そして、この研究を通して、特定の病原体を含まない条件下で維持した。
（試薬）
ＦＢＳを、Ｍ．Ａ．Ｂｉｏｐｏｄｕｃｔｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入した。抗アシアロＧＭ１血清を、Ｗａｋｏ（Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）から取得した。
（試験的転移実験）
ＴＭ−β１ Ａｂ（１ｍｇ／０．３ｍｌ ＰＢＳ／マウス）また抗アシアロＧＭ１血清（２０μｌ／０．３ｍｌ ＰＢＳ／マウス）を、腫瘍接種の２日前にＳＣＩＤの側尾静脈に注入した。腫瘍細胞を、Ｃａ２＋およびＭｇ２＋を含まないＰＢＳで洗浄して、そして、所望の細胞濃度でそれと同じ溶液中に懸濁した。トリパンブルー排除法によって決定される細胞の生存率は、９０％を超えるものであった。体積にして０．３ｍｌの腫瘍細胞懸濁液を、麻酔をかけていない側尾静脈に注入した。示した期間の後に、そのマウスを屠殺し、そして、転移性のリンパ節の数を、計数した。それらの肝臓および腎臓における小瘤を、解剖顕微鏡を用いて計数した。
結果を図１に示す。図１は、ＴＳＬＣ１によるがん細胞の浸潤性形質の誘導を示す。TSLC1発現の欠如したがん細胞をＮＩＨ３Ｔ３単層細胞上へ重層培養し、ドキシサイクリンによりＴＳＬＣ１の発現を誘導した。ＴＳＬＣ１は抗ＴＳＬＣ１抗体と二次抗体（青）で、アクチン分子はファロイジン（赤）で染色した。示されるように、ＴＳＬＣ１の過剰発現により、がん細胞は浸潤形質を示した。
（実施例２：ＴＳＬＣ１の発現をＲＮＡｉによって抑制すると、小細胞肺がんの浸潤、転移能が抑制される。）
（ｓｉＲＮＡ導入法）
内因性ＴＳＬＣ１の発現を阻害するために、本発明者らは、２−ヌクレオチド（２’−デオキシチミジン）３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。ＴＳＬＣ１を標的化したｓｉＲＮＡ配列は、第１位にある開始コドンの第１のアデニンに対して、＋１９６〜＋２１４（ｓ１）および＋２０４〜＋２２２（ｓ２）であった。コントロールのｓｉＲＮＡ（５’−ＵＣＡＧＣＡＧＵＧＡＧＡＡＵＡＡＣＵＧ−３’）（配列番号１１）を、その対応するＤＮＡが、哺乳動物における既知のゲノム配列に一致しないように設計した。ついで、一本鎖オリゴヌクレオチドの対を、アニーリングさせ、製造者のプロトコルに従ってオリゴフェクタミン試薬（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションした。使用した配列は以下の通りである。
TSLC1ｓｉＲＮＡ 配列 ｓ１（＋１９６〜＋２１４）：５’−ｇｔｃａａｔａａｇａｇｔｇａｃｇａｃｔ−３’（配列番号８）
TSLC1ｓｉＲＮＡ 配列 ｓ２（＋２０４〜＋２２２）：５’−ｇａｇｔｇａｃｇａｃｔｃｔｇｔｇａｔｔ−３’（配列番号９）
結果を図２に示す。図２は、ＲＮＡｉによりＴＳＬＣ１の発現抑制によるするがん細胞の浸潤性の阻害を示す。ＴＳＬＣ１を高発現するがん細胞をＮＩＨ３Ｔ３単層細胞上へ重層培養し、ｄｏｘｙｃｙｃｌｉｎｅによりＴＳＬＣ１の発現を誘導した。ＴＳＬＣ１は抗TSLC1抗体と二次抗体（緑）で、アクチン分子はファロイジン（青）で染色した。
示されるように、ＴＳＬＣ１の発現をＲＮＡｉによって抑制すると、小細胞肺がんの浸潤、転移能が抑制された。
（実施例３：ＴＳＬＣ１の分子経路を抑制することにより、小細胞肺がんの浸潤、転移を抑制することができる。）
ドミナントネガティブ変異体：ＴＳＬＣ１優性欠失変異体TSLC1（配列番号１２）発現ベクターＴＳＬＣ１タンパク質の第１７番目のアミノ酸をアスパラギンに置換したTSLC1Ｎ変異体は、Ｒａｃ１の優性欠失変異体である。TSLC1Ｎ変異体を発現する ｐＥＸＶ−Ｒａｃ１Ｎ１７発現ベクターである。TSLC1の分子経路の抑制が小細胞肺がんの浸潤、転移の抑制に適用可能であるかどうか実験する。その結果、ＴＳＬＣ１の分子経路を抑制することにより、小細胞肺がんの浸潤、転移を抑制することができることが分かる。
（実施例４：TSLC1タンパク質は細胞内でＴｉａｍ１タンパク質と結合する。（上皮組織、がん細胞および成人Ｔ細胞白血病細胞（ＡＴＬ）で））
（免疫沈降、免疫ブロット法：免疫沈降ウエスタンブロティング）
トランスフェクションの２４時間、６０ｍｍディッシュ中の細胞を洗浄し、そして、氷上で１０分間に亘って、５００μｌの溶解溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ５、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））で処理した。上清を、４℃での１５分間に亘る遠心分離を行った後に単離し、そして、そのタンパク質含量、タンパク質アッセイ試薬（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｌａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して決定した。次いで、１μｇの抗体を、５００μｇの細胞溶解物に添加して、４℃にて一晩にでインキュベートした。３０μｌの、プロテインＡ−セファロース ６ＭＢの５０％懸濁液（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、添加して、そして、室温で、１時間に亘ってインキュベートした。インキュベーション後に、ビーズを、５回、５００μｌの溶解緩衝液で洗浄し、そして、ＮｕＰＡＧＥサンプル緩衝液中に再懸濁した。サンプルを、４〜１２％ＮｕＰＡＧＥｍｉｎｉｇｅｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動して、そして、ＸＣｅｌｌ ＳｕｒｅＬｏｃｋ Ｍｉｎｉ−Ｃｅｌｌ ａｐｐａｒａｔｕｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ポリビニレンジスルフィド（ＰＶＤＦ）メンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）に移した。３０分間に亘って、１％Ｔｗｅｅｎ ２０および５％スキムミルクを含むＴＢＳでブロッキングした後に、これらのフィルターを、１時間に亘って一次抗体とともにインキュベートし、洗浄し、そして、適切なＨＲＰ標識二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）とともにインキュベートした。特異的なタンパク質を、増強化学発光システム（Ｌｕｍｉ−ＬｉｇｈｔＰＬＵＳ； Ｒｏｃｈｅ）を用いて検出した。
（抗体）
ＫＬＨと融合したＴＳＬＣ１のカルボキシル末端の１８アミノ酸の合成ポリペプチドＮ−ＩＮＡＥＧＧＱＮＮＳＥＥＫＫＥＹＦＩ−Ｃ（配列番号１４）を、免疫原として使用して、ウサギ抗ＴＳＬＣ１ポリクローナル抗体である、ＣＣ２を惹起した。ＴＳＬＣ１（ＣＣ２）のＣ末端またはＴＳＬＣ１のエクトドメイン（ＥＣ）に対するウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）は、周知の手段により調製され得る。
ウサギ抗血球凝集素（ＨＡ）ｐＡｂ（ｓｃ−８０５）およびマウス抗ＨＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン１２ＣＡ５を、それぞれ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。β−カテニンに対するマウスｍＡｂである、Ｅ−カドヘリン（クローン３６）、およびフィブロネクチンを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから取得した。使用した他のマウスｍＡｂは、ＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびビメンチン（クローンＶ９，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に対して特異的である。免疫ブロッティングおよび免疫蛍光染色のための二次抗体は、それぞれ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）およびＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から得た。
Ｒａｃ１およびＲｈｏの活性アッセイのために使用される抗体は、それぞれ、マウス抗Ｒａｃ１ ｍＡｂである、クローン２３Ａ８（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）、およびウサギ抗Ｒｈｏ ｐＡｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ）である（ＭＭ／ＣＲ）。
（プラスミドの細胞への導入：トランスフェクション）
安定に、ＴＳＬＣ１−ＧＦＰ（ＭＤＣＫ／ＴＳＬＣ１−ＧＦＰ）を発現する癌細胞を調製する為に、ＭＤＣＫ細胞を、製造業者のプロトコ−ルに従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ Ｐｌｕｓ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ｐＴＳＬＣ１−ＧＦＰでトランスフェクションした。安定なクローンを、５００ mｇ／ｍｌのＧｅｎｅｔｉｃｉｎ（Ｇ４１８）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地中で選択した。安定にトランスフェクションされたクローンを、３００ mｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で維持した。癌細胞を、上述のように、ｐＴＳＬＣ１−ＧＦＰおよび／またはｐＴＳＬＣ１−ＨＡを用いて、一過的にトランスフェクトした。
（ＧＳＴ結合タンパク質とのインビトロ結合アッセイ：ＧＳＴプルダウン）
Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現されるＧＳＴ−ＴＳＬＣ１融合タンパク質を、製造者のプロトコルに従ってグルタチオンセファロース４Ｂ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して精製した。［３５Ｓ］メチオニン標識ＭＰＰｓ−ＨＡタンパク質を、ＴＮＴ Ｔ７ Ｑｕｉｃｋ Ｃｏｕｐｌｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して合成した。ＧＳＴ融合タンパク質に対する放射性標識したＭＰＰの結合は、以前に記載されている（Ｙａｇｅｔａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。結合タンパク質のシグナル強度およびＧＳＴ融合タンパク質の量を、ソフトウェアＮＩＨ Ｉｍａｇｅ ｖｅｒｓｉｏｎ １．６２を使用して定量化し、そして、その結合親和性を、ＧＳＴ融合タンパク質の量に関して調節した。
（免疫染色、共焦点顕微鏡解析）
それらの２次元極性実験について、細胞を、２４ｍｍ Ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ−ＣＯＬコラーゲン被覆フィルター不活性体（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）につき１０５細胞の密度で播いた。そして、５〜６日間に亘ってコンフルエンスになるまで増殖させた。これらの細胞を、固定し、免疫染色し、そして、上述のように、共焦点顕微鏡によって調べた。核ＤＮＡを染色する際に、ＴＯＴＯ−３ ｉｏｄｉｄｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）これ全体で商品名を、二次抗体を含む溶液に添加した。コラーゲンＩ型ゲル中のシストの免疫蛍光染色を、前掲したよう実施した。
（免疫染色および共焦顕微鏡）
ＢＩＯＣＯＡＴコラーゲン被覆した８ウェルの培養スライド（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に播いて、その２日後に固定した。極性実験のために、ＭＤＣＫ／ＴＳＬＣ１−ＧＦＰ細胞またはＣａｃｏ−２細胞を、Ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ−ＣＯＬコラーゲン被覆フィルター不活性体（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）につき１０５細胞の密度で播いて、そして、コンフルエンスになるまで３〜４日間に亘って増殖させた。これらの細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で２回洗浄して、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間に亘って、室温で固定した。
ＨＥＫ２９３細胞またはＣａｃｏ−２細胞の反射型蛍光顕微鏡検査のために、細胞を、上述のように播いて、そして、固定した。次いで、固定した細胞を、５分間に亘ってＰＢＳ中の０．１％Ｔｒｉｔｏｎで透過性にして、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳ中の５％正常ロバ血清（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）で３０分間に亘ってブロックし、そして、室温で一晩に亘って、１％正常ロバ血清中に上述の一次抗体で染色した。ＰＢＳで、３回洗浄した後に、発蛍光団を結合体化させた二次抗体を、室温において１時間に亘って適用して、ＰＢＳで洗浄した。これらのスライドを、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ ａｎｔｉｆａｄｅ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｖａｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いてマウントして、そして、ガラスカバースリップで覆って、そして、４８８／５１４ｎｍアルゴンレーザーおよび５４３ｎｍヘリウムネオンレーザーを備えた共焦点走査システムである、Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０またはＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００で調べた。そのＸ−Ｚ垂直方向切片を、０．２−mｍモーターステップで作製した。各イメージは、単一の平均化した（１６ラインスキャン）のイメージの代表例である。
結果を図３〜６に示す。図３は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳して作成したＴｉａｍ１タンパク質、ならびに部分断片と、大腸菌にてＧＳＴ融合タンパク質として作成したＴＳＬＣ１細胞内断片（ＧＳＴ−Ｃ）ならびにそのＣ端９アミノ酸を欠失した断片とをＧＳＴカラム上で結合させ、溶出断片を検出した。右端は合成したＴｉａｍ１ならびにその部分断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて検出した。
図４および図５は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を示す。培養がん細胞にＶ５タグ配列をつけたＴｉａｍ１タンパク質を導入、発現させ、抗Ｖ５抗体、またはマウスＩｇＧ（図４）、あるいは抗ＴＳＬＣ１抗体、またはマウスＩｇＧ（図５）で免疫沈降し、沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗ＴＳＬＣ１抗体（図４）、ならびに抗Ｔｉａｍ１抗体（図５）にて検出した（ウェスタン・ブロット法）。対照として、細胞溶解物を抗ＴＳＬＣ１抗体、ならびに抗Ｖ５抗体で検出し（図４）、あるいは細胞溶解物と免疫沈降物を抗Ｖ５抗体で検出（図５）した。
図６は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質との共局在を示す。培養がん細胞でＴＳＬＣ１タンパク質の発現をドキシサイクリンにて誘導し、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質との局在を、それぞれ抗ＴＳＬＣ１抗体、ならびに抗Ｔｉａｍ１抗体にて検出した。右端は両シグナルを合成した画像である。
従って、TSLC1タンパク質は細胞内で（上皮組織、がん細胞および成人Ｔ細胞白血病細胞（ＡＴＬ）で）Ｔｉａｍ１タンパク質と結合する。ことが示された。
（浸潤性の強弱レベルを判定する技術の開発）
次に、浸潤性の強いがん細胞（例えば、ＡＴＬ細胞、ＨＴＬＶ−１感染細胞など）と、浸潤性の弱いがん細胞（例えば、それ以外のＡＬＬ細胞（例えば、T-ALL)等）とを識別するためのマーカーを探索した。このようなマーカーは、がん細胞を見出したときにその浸潤性をも検出することによって適切ながん治療を施すことができることから有用である。
（方法）
細胞溶解液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗 Tiam1抗体にて検出した（ウェスタン・ブロット法）。その具体的な詳細な方法は以下のとおりである。
（Ｔｉａｍ−１の免疫ブロット解析）
全細胞溶解液は、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ ｍＭ ＮａＣｌ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００，２０ ｍＭ ＥＤＴＡ，プロテアーゼ阻害剤混合物（Ｃａｌｉｂｉｏｃｈｅｍ社）を用いて調製した。この細胞溶解液を毎分１２，０００回転、１分、４℃で遠心分離して不溶性分画を除き、上清を回収した。各サンプルの蛋白質の濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社の蛋白アッセイ染色試薬にて計測した。各サンプル５μｇを４−１２％の密度勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて分画し、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のフッ化ポリビニリデン・メンブレンに転写し、抗Ｔｉａｍ−１単クローン抗体と反応させた。一次抗体の結合は、Ｒｏｃｈｅ社のＬｉｍｉ−Ｌｉｇｈｔ ＰＬＵＳウエスタン・ブロット基質を用いて検出した。各シグナルの分子量の指標は、図５Ｂの左側に示したとおりである。具体的には、大きい方から、２１０ｋＤａ，１１１ｋＤａ，７１ｋＤａおよび５５ｋＤａである。Ｔｉａｍ−１蛋白質は、米国ＳａｎｔａＣｒｕｚ社の抗Ｔｉａｍ−１抗体（Ｔｉａｍ−１ Ｃ−１６）を用いた。各レーンは１．Ｊｕｒｋａｔ； ２．Ｍｏｌｔ−４；３．ＣＣＲＦ−ＣＥＭ；４．ＭＴ−２；５Ｃ９１／ＰＬ；６．Ｃ８２６６；７．ＭＴ−４；８．ＡＴＮ１；９．ＡＴＬ−３Ｉである。
（結果）
図５Ｂに浸潤性の強いがん細胞で特徴的に認められる短いＴｉａｍ１分子を示す。浸潤性の強いがん細胞であるATL細胞（４−８）では、浸潤性の弱いがん細胞であるＴ−ＡＬＬ細胞（１−３）と比較して、ＴＳＬＣ１について、短いＴｉａｍ１断片が特徴的に認められる。青矢印で示す分子量約１４０キロダルトンのシグナルは全長Ｔｉａｍ１に相当し、一方、赤矢印で示す分子量約６５キロダルトンのシグナルはＡＴＬ細胞にのみ特異的に検出される低分子量Ｔｉａｍ１であり、エクソン１４−２９を含む。分子量約７０キロダルトン付近の２つのシグナルは全長Ｔｉａｍ１の分解産物、あるいはスプライシング・バリアント、または非特異的シグナルに相当すると考えられる。細胞溶解液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗Ｔｉａｍ１抗体にて検出した（ウエスタン・ブロット法）。この短いＴｉａｍ断片は、エクソン１４−２９に対応する新規のスプライシング・バリアントと考えられる。
なお、この低分子量Ｔｉａｍ１分子は５’非翻訳領域としてイントロン１3を特異的に含むスプライシング・バリアントであり、下記のプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲにより特異的に増幅する２７１６塩基対の断片として検出することができる。
プライマー ｓｓＴｉａｍ１−Ｆ： ５’−ＴＧＡ ＡＣＴ ＴＴＴ ＴＧＡ ＡＴＧ ＧＡＡ ＧＣＡ−３’（配列番号２１）
プライマー ｓｓＴｉａｍ１−Ｒ： ５’−ＡＣＡ ＴＴＣ ＴＣＴ ＡＣＧ ＧＧＧ ＣＡＧ ＧＴ−３’（配列番号２２）
これらのプライマーを用いて増幅された配列は、配列番号２３として示す。そのアミノ酸コード配列は、配列番号２４として示される。
Ｔｉａｍ１のこの短縮型断片を特異的に増幅するRT-PCR のさらなる塩基配列２対として以下が挙げられる。
（例２）
Ｅ１３Ｂ２−５’ ＣＡＧＡＣＡＧＡＧＴＧＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡ（配列番号２５）
Ｅ１５−１６−３’ ＣＴＧＣＴＴＴＣＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＴＧ（配列番号２６）
増幅断片４１８塩基対（配列番号２７）。
例３の結果を図５Ｃに示す。図５Ｃでは、低分子量Ｔｉａｍ１ に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によるＡＴＬの低分子量Ｔｉａｍ１ ＲＮＡの検出が示される。特異的ＡＴＬ細胞（４−８）では４１８塩基対の特異的Ｔｉａｍ１ＲＮＡに由来する増幅断片が検出されるが、ＡＬＬ細胞（１−３）や他の細胞ではこのＲＮＡは検出されない。
（例３）
Ｅ１３Ｂ−５’ ＧＡＧＧＡＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＡＧＴＴ（配列番号２８）
Ｅ１５−３’ ＣＧＴＡＣＡＧＣＣＴＴＣＧＡＡＴＡＣＣＡ（配列番号２９）
増幅断片３１５塩基対（配列番号３０）。
（実施例５：Ｔｉａｍ１の発現をＲＮＡｉによって抑制すると、小細胞肺がん、ＡＴＬの浸潤、転移が抑制される）
（ｓｉＲＮＡ導入法）
内因性Ｔｉａｍ１の発現を阻害するために、本発明者らは、２−ヌクレオチド（２’−デオキシチミジン）３’オーバーハングを有するｓｉＲＮＡ二重鎖を設計した。Ｔｉａｍ１を標的化したｓｉＲＮＡ配列は、下記のようにセンス配列およびアンチセンス配列の両方を作製した。コントロールのｓｉＲＮＡ（５’−ＵＣＡＧＣＡＧＵＧＡＧＡＡＵＡＡＣＵＧ−３’）（配列番号１１）を、その対応するＤＮＡが、哺乳動物における既知のゲノム配列に一致しないように設計した。ついで、一本鎖オリゴヌクレオチドの対を、アニーリングさせ、製造者のプロトコルに従ってオリゴフェクタミン試薬（Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｒｅａｇｅｎｔ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションした。使用した配列は以下の通りである。
Ｔｉａｍ１ ｓｉＲＮＡ 配列（センス配列）：
５’− ＣＧＧ ＣＧＡ ＧＣＵ ＵＵＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＴＴ−３’（配列番号９）
Ｔｉａｍ１ ｓｉＲＮＡ 配列（アンチセンス配列）：
５’− ＵＵＣ ＵＵＣ ＵＵＡ ＡＡＧ ＣＵＣ ＧＣＣ ＧＴＴ −３’（配列番号１０）。
結果をみると、ＴＳＬＣ１分子と同様に、Ｔｉａｍ１でもがんの抑制および浸潤・転移の抑制が起こっていることがわかる。
（実施例６：Ｔｉａｍ１の分子経路を抑制することにより、小細胞肺がんの浸潤、転移を抑制することができる）
ドミナントネガティブ変異体：Ｔｉａｍ１優性欠失変異体 Ｔｉａｍ１発現ベクター
Ｔｉａｍ１タンパク質の１つのアミノ酸をアスパラギンに置換したＴｉａｍ１ Ｎ変異体は、Ｒａｃ１の優性欠失変異体である。Ｔｉａｍ１ Ｎ変異体を発現する ｐＥＸＶ−Ｒａｃ１Ｎ１７発現ベクターを用いて実験をすることができる。
Ｔｉａｍ１の分子経路の抑制が小細胞肺がんの浸潤、転移の抑制に適用可能であるかどうか実験する。その結果、Ｔｉａｍ１の分子経路を抑制することにより、小細胞肺がんの浸潤、転移を抑制することができることが分かる。
（実施例７：ＴＳＬＣ１タンパク質は低分子量Ｇタンパク質Ｒａｃ１を活性化する）
（方法）
（測定法）
（発現ベクターおよびトランスフェクション）
ｐＴＲＥ２／ＴＳＬＣ１を得るために、TSLC1ｃＤＮＡを、ｐＴＲＥ２ｈｙｇｒｏベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。短縮化したＴＳＬＣ１フラグメントを、テンプレートとしてｐＴＳＬＣ１−ＨＡまたはｐｃＴＳＬＣ１を使用して、ＰＣＲによって作製して、ｐＴＲＥｈｙｇｒｏベクターにクローニングした。ＴＳＬＣ１（ΔＣ−ＨＡ）の細胞質性テイルを欠く変異体を作製するために、３９７〜４２２に位置するアミノ酸（ａａ）残基を取り除き、そして、３９６の残基を、ＨＡエピトープタグと融合させた。この短縮化変異体である、プロテイン４．１−ＢＭおよびプロテインＰＤＺ−ＢＭを、それぞれ、タンパク質である４．１−ＢＭを含む１１アミノ酸（４００〜４１０）、ならびにＰＤＺ−ＢＭ（４３９〜４２２）を含む４アミノ酸を取り除くように設計した（図１Ａ）。これらの構築物を、製造者のプロトコルに従って、Ｆｕｇｅｎｅ ６ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で、上述の細胞にトランスフェクトした。安定なクローンを、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む培地中で選択した。
（コラーゲンゲル中での３次元培養および管腔構造形成（Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）アッセイ）
３次元（３Ｄ）培養を、製造者（Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）のプロトコルに従って実施した。細胞を、コラーゲンＩ混合物に添加して、穏かに混合し、そして、５×１０３細胞／ウェルで１２ウェルプレートにプレーティングした。５日齢シストを、一般的なシスト構造およびＴＳＬＣ１の細胞内局在ならびに欠失変異体について調べた。管腔形成の誘導のために、４日齢のシストを、４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を含む新鮮な培地で刺激して、さらに４日間に亘ってインキュベートし、そして、位相差顕微鏡によって調べた。
（細胞分散アッセイ）
細胞を、６ウェルプレート中に１×１０４細胞／ウェルで播いた。次の日に、それらの細胞に、４０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦの存在下または非存在下の、新鮮な培地を供給して、そして、さらに１７時間に亘ってインキュベートした。細胞分散を、位相差顕微鏡で調べた。
（Ｒａｃ１活性化アッセイおよびＲｈｏ活性化アッセイ）
Ｒａｃ１およびＲｈｏの活性化を、それぞれ、Ｒａｃ１活性化アッセイキットおよびＲｈｏ活性化キット（Ｕｐｓｔａｔｅ）を使用して、その製造者のプロトコルに従って、ＧＳＴ−プルダウンアッセイによって決定した。簡潔には、細胞を、１００ｍｍ培養プレートあたり１×１０５細胞で播き、血清飢餓状態にして一晩置いた。次いで、それらの細胞を、種々の時間期間に亘って、４０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦで刺激して、そして、ＭＬＢ溶解緩衝液中で溶解した。Ｒａｃ１−ＧＴＰおよびＲｈｏ−ＧＴＰを、それぞれ、グルタチオン−アガロースビーズ上に固定された、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）−Ｒａｃ１結合ドメイン（ＲＢＤ）およびＧＳＴタグ化Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−Ｒｈｏ結合ドメイン（ＲＢＤ）を用いて、それらの溶解物から沈降させた。総溶解物および総沈降物を、免疫ブロッティングによって分析した。濃度計分析を、ＮＩＨイメージソフトウェアを用いて実施した。
結果を図７に示す。図７は、ＴＳＬＣ１はＨＧＦによるＭＤＣＫ細胞の上皮間葉転換、遊走性、浸潤性、ならびにＲａｃ１の活性化を抑制することを示す。ＧＳＴ−プルダウンアッセイは、Ｒａｃ１の活性化の抑制を同定する手段として使用され得る。
（実施例８：TSLC1タンパク質による低分子量 Ｇ タンパク質 Ｒａｃ１ の活性化は Ｔｉａｍ１ タンパク質を介する。）
実施例７に準じて、TSLC1タンパク質を用いて Ｒａｃ１ の活性化が行われるかどうかを確認することができる。
（実施例９：Ｒａｃ１ タンパク質の優性欠失変異体を加えることにより、Ｒａｃ１活性を阻害すると、小細胞肺がん、ＡＴＬの浸潤、転移が抑制される。）
Ｒａｃ１タンパク質の第１７番目のアミノ酸をアスパラギンに置換したＲａｃ１ Ｎ１７変異体は、Ｒａｃ１ の優性欠失変異体である。Ｒａｃ１Ｎ１７変異体を発現するｐＥＸＶ−Ｒａｃ１Ｎ１７ 発現ベクター（配列番号１２（核酸配列）、配列番号１３（アミノ酸配列））はロンドン大学のＡ．Ｈａｌｌ博士より供与された。
結果を図８に示す。図８は、ＴＳＬＣ１によるがん細胞での遊走性形態、浸潤能は、Ｒａｃ１の優性欠失変異体により阻害されることを示す。Ｒａｃ１の優性欠失変異体を導入したがん細胞、或いは導入しないがん細胞をＮＩＨ３Ｔ３単層細胞上に重層培養し、ドキシサイクリンによりＴＳＬＣ１の発現を誘導した。ＴＳＬＣ１の発現は抗ＴＳＬＣ１抗体と二次抗体（青）にて、またＲａｃ１の優性変異体はＧＦＰとの融合タンパク質として発現、検出した。
（実施例１０：Ｒａｃ１ タンパク質の活性を阻害することにより、小細胞肺がんの浸潤、転移を抑制することができる。）
配列番号５に示す核酸配列に基づいて、ｓｉＲＮＡのセンス配列およびアンチセンス配列を設計する。このｓｉＲＮＡ阻害剤による、小細胞肺がんの浸潤、転移の抑制を観察する。実験としては培養がん細胞にこのｓｉＲＮＡをトランスフェクトして、Ｒａｃ１の発現を抑える。そしてコントロールｓｉＲＮＡ（例えば、配列番号１１）を入れた細胞と、浸潤アッセイ、遊走アッセイ、ＳＣＩＤマウスの尾静脈からの細胞注入による肺転移形成の差などを比較する。これらの実験は、上述のプロトコルを使用することができる。
（実施例１１：ＴＳＬＣ１の形質転換に関する関与）
次に、ＴＳＬＣ１の形質転換に関する関係について調べた。
（材料および方法）
（ｃＤＮＡクローニングおよび発現ベクター）
ＧＳＴ−ＴＳＬＣ１−Ｃ融合タンパク質のための発現ベクター、ＤＡＬ−１−Ｖ５およびＭＰＰ３は、以前に記載された（Ｙａｇｅｔａら、２００２；Ｆｕｋｕｈａｒａら、２００３）。ＤＡＬ−１−Ｆｌａｇ発現ベクターを、Ｖ５−Ｈｉｓのタグ化配列をＦｌａｇのタグ化配列（５’−ＧＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＴＧＡＣＧＡＴＧＡＣＡＡＧ−３’）で置換することによってＤＡＬ−１−Ｖ５から得た。ヒトＭＰＰ１およびヒトＭＰＰ２の全長ｃＤＮＡフラグメントを、ＭＰＰ１のｃＤＮＡ配列（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００２４３６）およびＭＰＰ２のｃＤＮＡ配列（ＮＭ００５３７４）にそれぞれ基づいて、逆転写ＰＣＲによってヒト肺ポリ（Ａ）＋ＲＮＡから得た。その後、これらのｃＤＮＡフラグメントを、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｖ５−Ｈｉｓ ＴＯＰＯ ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｋｓｂａｄ，ＣＡ）からクローニングした。その後、Ｖ５−Ｈｉｓのタグ化配列を、ＨＡのタグ化配列（５’−ＴＡＣＣＣＡＴＡＣＧＡＣＧＴＣＣＣＡＧＡＣＴＡＣＧＣＴ−３’）で置換した。ＧＳＴ融合タンパク質のための発現ベクター、ＤＡＬ−１（１〜１０９ａａ、３０５〜４４６ａａ、３５７〜４４６ａａ）のｃＤＮＡフラグメント、ＭＰＰ１（１〜６５ａａ）のｃＤＮＡフラグメント、ＭＰＰ２（１〜１３７ａａ）のｃＤＮＡフラグメントおよびＭＰＰ３（１〜１３４ａａ）のｃＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによって増幅してｐＧＥＸ−４Ｔ−１（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）中にクローニングした。
（抗体および化学物質）
TSLC1に対するラットモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、ＴＳＬＣ１のカルボキシル末端の１８個の合成ポリペプチドで免疫することによって、ラットにおいて惹起した。ニワトリｍＡｂを、ＴＳＬＣ１の細胞外ドメインに対応する組換えポリペプチドに対して作製した（３Ｅ１）。抗TSLC1ｐＡｂ（ＣＣ２）が、以前に記載された（Ｍａｓｕｄａら、２００２；Ｙａｇｅｔａら、２００２）。ＤＡＬ−１タンパク質のＮ末端部分に対するｐＡｂおよびＭＰＰタンパク質のＮ末端部分に対するｐＡｂを、ＧＳＴ融合タンパク質で免疫することによってウサギにおいて惹起した。抗Ｖ５ ｍＡｂ、抗ＧＳＴ ｍＡＢおよび抗ＨＡ ｐＡｂを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＢＬ（日本国名古屋市）およびＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）からそれぞれ購入した。抗Ｆｌａｇ ｍＡｂおよび抗汎カドヘリンｍＡｂを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。抗ＺＯ−１ ｐＡｂおよび抗ＺＯ−１ ｍＡｂを、Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）から購入した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジンを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｒｏｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。ＨＲＰ標識二次抗体およびフルオレセイン標識二次抗体を、Ａｍｅｒｓｈａｍ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓおよびＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓからそれぞれ得た。
（細胞培養およびトランスフェクション）
Ｃｏｓ−７細胞を、ＲＩＫＥＮ細胞バンク（日本国つくば市）から得た。ＨｅＬａ細胞、ＡＢＣ−１細胞、およびＨＥＫ２９３細胞を、Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ Ｂａｎｋ（日本国大阪市）から得た。ヒトがん細胞であるＳＫ−ＬＵ−１、ＮＣＩ−Ｈ５９６、Ｕ３５１、およびＣａｃｏ−２、ならびにラットの褐色細胞腫であるＰＣ１２を、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。細胞を、供給業者の推奨に従って培養した。トランスフェクションを、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＦｕＧＥＮＥ ６（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｌａｎｄ）を製造業者のプロトコルに従って使用して実行した。
（免疫沈降および免疫ブロット分析）
トランスフェクションの２４時間後、６０ｍｍディッシュ中の細胞を、洗浄し、そして氷上にて１０分間、５００μｌの溶解緩衝液［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ，１％ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ １００、１ｍＭ ＮａＦ、１ｍＭ Ｎａ３ＶＯ５、プロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）で処理した。免疫沈降、電気泳動、および免疫ブロッティングは、以前（Ｙａｇｅｔａら、２００２）に記載された通りに実行した。
（免疫蛍光分析）
ＨＥＫ２９３細胞を、コラーゲンＩでコートした培養ディッシュ（ＢＩＯＣＯＡＴ；ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上に播種した。免疫蛍光を、以前（Ｙａｇｅｔａら、２００２）に記載された通りに実施した。サンプルを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００を用いて試験した。これは、アルゴン／クリプトンレーザー（４８８ｎｍおよび５６８ｎｍ）と赤色レーザーダイオード（６３８ｎｍ）とを備えたレーザー走査共焦点システムである。
（ＲＮＡｉ）
TSLC1を標的とするｓｉＲＮＡ配列は、１位にある開始コドンの最初のアデニンに対して、位置＋１９６〜＋２１４（ｓ１）および＋２０４〜＋２２２（ｓ２）から得た。コントロールｓｉＲＮＡ（５’−ＵＣＡＧＣＡＧＵＧＡＧＡＡＵＡＡＣＵＧ−３’）（配列番号１１）は、対応するＤＮＡ配列において、哺乳動物のどの公知のゲノム配列とも一致しなかった。合成した一対の一本鎖オリゴヌクレオチドを、アニーリングさせ、そしてＯｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造業者のプロトコルに従って用いてトランスフェクトした。その細胞の平均面積および高さを、ソフトウェア（ＮＩＨ Ｉｍａｇｅバージョン１．６２）を使用して定量した。
（結果）
（図９）
ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＳＬＣ１、ＤＡＬ−１およびＭＰＰ１〜ＭＰＰ３の亜細胞局在化。ＨＥＫ２９３のコンフルエント（Ａ）培養物または低密度（Ｂ）培養物を、免疫蛍光によって分析した。細胞を、抗TSLC1ｐＡｂ（ａ）、抗ＤＡＬ−１ ｐＡｂ（ｂおよびａ２）、抗ＭＰＰ１ ｐＡｂ（ｃおよびｂ２）、抗ＭＰＰ２ ｐＡｂ（ｄおよびｃ２）、または抗ＭＰＰ３ ｐＡｂ（ｅおよびｄ２）を用いて染色した。低密度の細胞もまた、抗TSLC1ｍＡｂ（３Ｅ１）（Ｂ、ａ１〜ｄ１、青色）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジン（Ｂ、ａ３〜ｄ３、赤色）を用いて染色した。矢印は、細胞の糸状足突出を示す。左の３つの欄を統合した画像が、右欄に示される（Ｂ、ａ４〜ｄ４）。バー：２０μｍ。
（図１０）
ＲＮＡｉを使用するＴＳＬＣ１発現の抑制によるＨＥＫ２９３細胞の細胞接着および上皮様構造の排除。（Ａ）ＴＳＬＣ１に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓ１もしくはｓ２）またはコントロールｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３におけるＴＳＬＣ１および関連タンパク質の免疫ブロッティング。ＴＳＬＣ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓ１）またはコントロールｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞における、細胞骨格組織化を検出するため（Ｂ）、Ｅ−カドヘリンまたはＺＯ−１の亜細胞局在化を検出するため（Ｄ）、およびＤＡＬ−１またはＭＰＰ２の亜細胞局在化を検出するため（Ｅ）の免疫蛍光分析。ＴＳＬＣ１、アクチンフィラメント、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１、ＤＡＬ−１、およびＭＰＰ２が、抗TSLC1ｐＡｂもしくは抗TSLC1ｍＡｂを用いる染色（Ｂ、Ｄ、およびＥ、ａ１〜ｄ１）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジンを用いる染色（Ｂ、ａ２〜ｃ２）、抗汎カドヘリンｍＡｂを用いる染色（Ｄ、ａ２およびｂ２）、抗ＺＯ−１ ｍＡＢを用いる染色（Ｄ、ｃ２およびｄ２）、抗ＤＡＬ−１ ｐＡｂを用いる染色（Ｅ、ａ２およびｂ２）、ならびに抗ＭＰＰ２ ｐＡｂを用いる染色（Ｅ、ｃ２およびｄ２）によってそれぞれ検出された。矢尻は、ＴＳＬＣ１を発現する細胞間接触部位を示し、一方、矢印は、ＴＳＬＣ１を欠く細胞間接触部位を示す。左および中央の欄を統合した画像が、右の欄に示される。バー；２０μｍ。（Ｃ）コントロールｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３の平均面積および高さ（白色カラム）、ＴＳＬＣ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓ１）で処理したがＴＳＬＣ１を発現するＨＥＫ２９３の平均面積および高さ（明灰色カラム）、およびｓ１で処理したＴＳＬＣ１を欠くＨＥＫ２９３の平均面積および高さ（暗灰色カラム）を示す、ヒストグラム。上記細胞の面積および高さは、皮質アクチンフィラメント束に従って測定した。平均値および標準偏差を、３つの独立した実験に基づいて示した。それらの実験において、最小数８０個の細胞を、各サンプルについて計数した。アスタリスクは、マン−ホイットニーＵ検定によって決定した統計的有意性（ｐ＜０．０００１）を示す。
（図１１）
ＴＳＫＣ１発現を欠くＮＳＣＬＣ細胞におけるＴＳＬＣ１複合体の構成成分の誤局在化。（Ａ）ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるＴＳＬＣ１タンパク質、ＤＡＬ−１タンパク質、ＭＰＰ１タンパク質、ＭＰＰ２タンパク質およびＭＰＰ３タンパク質の免疫ブロッティング。（Ｂ〜Ｄ）ＡＢＣ−１細胞（Ｂ）、ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞（Ｃ）およびＳＫ−ＬＵ−１（Ｄ）細胞における、ＴＳＬＣ１、ＤＡＬ−１、およびＭＰＰ２の亜細胞局在化。細胞を、各タンパク質に対する特異的抗体を用いて（左）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジンを用いて二重染色し、統合した画像を示す（右）。バー；２０μｍ。
（図１２）
膜近傍ドメインにおけるＴＳＬＣ１複合体の模式的図示。（Ａ）ＴＳＬＣ１は、ＤＡＬ−１タンパク質およびＭＰＰタンパク質に結合する。ＭＰＰタンパク質のうちの一メンバーは、生物学的状況に依存してＴＳＬＣ１複合体中に組み込まれる。（Ｂ）ＴＳＬＣ１タンパク質、ＤＡＬ−１タンパク質、およびＭＰＰタンパク質の、ドメイン構造および結合配列。ＴＳＬＣ１の細胞質ドメインにおける４．１結合モチーフおよびＰＤＺ結合モチーフが、それぞれ、赤紫色文字および橙色文字にて示されている。ＭＡＧｕＫにおけるＨＯＯＫコンセンサス配列および塩基性アミノ酸（ａａ）が、それぞれ、緑色文字または下線によって示されている。
（ｓｉＲＮＡによるＴＳＬＣ１発現の抑制によって、ＨＥＫ２９３における成熟細胞接着の形成が排除される）
細胞接着におけるＴＳＬＣ１の生理的役割をＲＮＡ干渉によって調査するために、ＴＳＬＣ１の２つの別個の領域に対する一対の合成二本鎖ｓｉＲＮＡを作製して、ＨＥＫ２９３細胞中に一過性トランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞中へのｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率は、約５０％であると推定した（データは、示さない）。トランスフェクションの５０日間後、ＴＳＬＣ１タンパク質の量は、コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞中の量と比較して、TSLC1ｓｉＲＮＡ（ｓ１またはｓ２）でトランスフェクトした細胞において顕著に減少した。対照的に、ＤＡＬ−１タンパク質、ＭＰＰ２タンパク質、Ｅ−カドヘリンタンパク質、およびＺＯ−１タンパク質の量は、この処理によって変化しなかった。
その後、本発明者らは、細胞形態、細胞骨格組織化および関連タンパク質の亜細胞局在化を、コンフルエント培養物において試験した。ＨＥＫ２９３細胞を、TSLC1ｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、一日間後、細胞を培養スライド上に再播種し、４日間増殖させて、新規に形成した細胞接着部位を観察した。コントロールｓｉＲＮＡでトランスフェクトした細胞において、ＴＳＬＣ１は、すべての細胞間境界に局在化した（図１０Ｂ、図１０Ｄ、および図１０Ｅ、コントロール）。これらの細胞において、周囲アクチンフィラメント（ＡＦ）束と呼ばれる厚いアクチンフィラメント（ＡＦ）束が、生成された（図１０Ｂ、ａ）。Ｅ−カドヘリンおよびＺＯ−１は、細胞間接着部位においてＴＳＬＣ１と共存した（図１０Ｄ、ａおよびｃ）。対照的に、TSLC1ｓｉＲＮＡ（ｓ１）の一過性トランスフェクションによって、約半数のＨＥＫ２９３細胞が、ＴＳＬＣ１発現を喪失した。ＴＳＬＣ１を欠く細胞は、細胞間付着部位において薄いＡＦ束を生成した（図１０Ｂ、ｂおよびｃ、矢印）。Ｅ−カドヘリンおよびＺＯ−１は、細胞境界から消失した（図１０Ｄ、ｂおよびｄ、矢印）。一方、ＴＳＬＣ１を発現する隣接細胞は、おそらくはｓｉＲＮＡトランスフェクションの失敗が原因で、アクチン細胞骨格の異常な組織化も、Ｅ−カドヘリンまたはＺＯ−１の誤局在化も示さなかった（図１０Ｂおよび図１０Ｄ、矢尻）。さらに、ＴＳＬＣ１発現を欠く細胞は、上皮様円柱構造を形成しなかったが、平坦な形態を示した。ＴＳＬＣ１を欠く細胞の平均面積は、同じ視野にあるＴＳＬＣ１発現細胞の平均面積の約２．５倍大きかった。一方、断面図は、ＴＳＬＣ１を欠く細胞の平均高さが、ＴＳＬＣ１を発現する細胞の平均高さの６０％未満であることを示した（図１０Ｃ）。
次に、本発明者らは、ＤＡＬ−１およびＭＰＰ２の亜細胞局在化を試験した。両方のタンパク質は、コントロールｓｉＲＮＡで処理した細胞において、ＴＳＬＣ１とともに細胞間接触部位にて観察された（図１０Ｅ、ａおよびｃ）。ＤＡＬ−１およびＭＰＰ２はまた、TSLC1ｓｉＲＮＡ（ｓ１）のトランスフェクションにも関わらずＴＳＬＣ１を発現する細胞において、細胞境界に局在化した（図１０Ｅ、ｂおよびｄ、矢尻）。対照的に、ＤＡＬ−１およびＭＰＰ２の膜局在化は、ｓｉＲＮＡによって、ＴＳＬＣ１を欠く細胞においては劇的に排除されたが、これらのタンパク質の総量は、変化しなかった（図１０Ｅ、ｂおよびｄ、矢印）。同様の知見が、ＴＳＬＣ１に対する別のｓｉＲＮＡ（ｓ２）によって得られた（データは、示さない）。
（実施例１２：ＴＳＬＣ１のＨＧＦ誘発性細胞分散をブロックする能力のアッセイ）
（実験手順）
（細胞および増殖アッセイ）
ＭＤＣＫのＴｅｔ−Ｏｆｆ細胞株を、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）から入手し、１００μＭ非必須アミノ酸（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、１０％ Ｔｅｔシステム認可ＦＢＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を補充したイーグル最小必須培地（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）中で維持した。関連遺伝子の発現を抑制するために、０．１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（Ｄｏｘ）を培地に添加した。細胞増殖を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ａｓｓａｙキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、ＭＴＳアッセイにより試験した。
（抗体）
TSLC1のＣ末端に対する（ＣＣ２）（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３１０１４−３１０１９）、またはＴＳＬＣ１の外部ドメインに対する（ＥＣ）（Ｍａｏ，Ｘ．，ら（２００３）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６３，７９７９−７９８５）ウサギポリクローナル抗体（ｐＡｂ）については、以前に記載した。ウサギ抗ヘマグルチニン（ＨＡ）ｐＡｂ（ｓｃ−８０５）およびマウス抗ＨＡモノクローナル抗体（ｍＡｂ）クローン１２ＣＡ５を、それぞれ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）およびＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入した。β−カテニン、Ｅ−カドヘリン（クローン３６）およびフィブロネクチンに対するマウスｍＡｂを、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。使用した他のマウスｍＡｂは、ＺＯ−１（Ｚｙｍｅｄ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）およびビメンチン（クローンＶ９，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に特異的であった。イムノブロット分析および免疫蛍光染色のための二次抗体は、それぞれ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ（Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，Ｅｎｇｌａｎｄ）製およびＪａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）製であった。Ｒａｃ１およびＲｈｏの活性化アッセイのために使用した抗体は、それぞれ、マウス抗Ｒａｃ１ ｍＡｂ、クローン２３Ａ８（Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｌａｋｅ Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）およびウサギ抗Ｒｈｏ ｐＡｂ（Ｕｐｓｔａｔｅ）であった。
（発現ベクターおよびトランスフェクション）
ｐＴＲＥ２／ＴＳＬＣ１を得るために、TSLC1ｃＤＮＡをｐＴＲＥ２ｈｙｇｒｏベクター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）にクローニングした。ｐＴＳＬＣ１−ＨＡ（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３１０１４−３１０１９）またはｐｃＴＳＬＣ１（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３１０１４−３１０１９）を鋳型として使用して、ＰＣＲにより短縮型ＴＳＬＣ１フラグメントを作製し、ｐＴＲＥ２ ｈｙｇｒｏベクターにクローニングした。ＴＳＬＣ１（ΔＣ−ＨＡ）の細胞質テイルを欠く変異体を作製するために、３９７〜４２２に位置するアミノ酸（ａａ）残基を取り除き、３９６位の残基を、ＨＡエピトープタグに融合させた（図１３）。短縮型変異体Δ４．１−ＢＭおよびΔＰＤＺ−ＢＭを、それぞれ、プロテイン４．１−ＢＭを包含する１１ ａａ（４００〜４１０）およびＰＤＺ−ＢＭを含有する４ ａａを取り除くように設計した（図１３Ａ）。これらの構築物を、Ｆｕｇｅｎｅ ６試薬（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を製造業者のプロトコルに従って使用して、細胞にトランスフェクトした。安定なコロニーを、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する培地中で選択した。
（タンパク質分析）
細胞溶解物の調製およびイムノブロット分析については、以前に記載されたとおりである（Ｙａｇｅｔａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６２，５１２９−５１３３）。
コラーゲンゲルにおける三次元培養および細管形成（Ｔｕｂｕｌｏｇｅｎｅｓｉｓ）アッセイ）
三次元培養を、製造業者（Ｎｉｔｔａ Ｇｅｌａｔｉｎ，Ｏｓａｋａ，Ｊａｐａｎ）の説明書に従って実施した。細胞を、コラーゲンＩ混合物に添加し、穏やかに混合し、そして、１２ウェルプレートに、５×１０３細胞／ウェルの濃度でプレートした。５日齢胚を、一般的な胚構造および、全長ＴＳＬＣ１の細胞内局在および欠失変異体について試験した。細管形成の誘導について、４日齢胚を、４０ｎｇ／ｍｌの組換えＨＧＦ（Ｓｉｇｍａ）を含有する新鮮な培地で刺激し、さらに４日間インキュベートし、位相差顕微鏡により試験した。全ての画像を、冷却型ＣＣＤデジタルカメラを装備するＮｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ倒立顕微鏡ＴＥ３００（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で撮影した。細管形成を定量するために、嚢胞および管の面積を、ＮＩＨの画像化ソフトウェアにより算出した。統計学的有意差は、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ順位和検定（ｒａｎｋ ｓｕｍ ｔｅｓｔ）により評価した。
（細胞分散アッセイ）
細胞を、１×１０４細胞／ウェルの濃度で、６ウェル培養プレートに撒いた。次の日、細胞に４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦの存在下または非存在下にて、新鮮な培地を与え、さらに１７時間インキュベートした。細胞分散を、位相差顕微鏡により試験し、上記のように写真撮影した。
（免疫染色および共焦点顕微鏡法）
二次元の極性実験について、細胞を、２４ｍｍ Ｔｒａｎｓ−ｗｅｌｌ−ＣＯＬコラーゲンコーティングフィルター挿入物（Ｃｏｓｔａｒ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）あたり１×１０５細胞の濃度で撒き、コンフルエンスになるまで５〜６日間増殖させた。細胞を固定し、以前に記載されたように免疫染色した（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３１０１４−３１０１９）。次いで、染色した細胞を、４８８／５１４ｎｍアルゴンレーザーおよび５４３ｎｍヘリウムネオンレーザーを装備するＢｉｏ−Ｒａｄ Ｒａｄｉａｎｃｅ ２０００レーザー共焦点走査システムで試験した。Ｘ−Ｚ水平切片を０．２μｍのモーターステップにより作製した。各画像は、単一の平均化された（３２回線の走査）画像を表す。核ＤＮＡについて染色する場合、二次抗体を含有する溶液に、ＴＯＴＯ−３ヨージド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添加した。コラーゲンＩ型ゲル中の嚢胞の免疫蛍光走査を、以前に記載されたように実施した（Ｐｏｌｌａｃｋ，Ａ．Ｌ．，ら（１９９７）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １３７，１６５１−１６６２）。
（Ｒａｃ１およびＲｈｏの活性化アッセイ）
Ｒａｃ１およびＲｈｏの活性化を、それぞれ、Ｒａｃ１活性化アッセイキットおよびＲｈｏ活性化キット（Ｕｐｓｔａｔｅ）を、製造業者のプロトコルに従って使用して、ＧＳＴプルダウンアッセイにより決定した。簡単に述べると、細胞を、１００ｍｍ培養プレートあたり１００×１０５細胞で撒いて、一晩血清不足にした。次いで、この細胞を、種々の時間にわたって４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦで刺激し、ＭＬＢ溶解緩衝液中に溶解させた。溶解物から、それぞれ、グルタチオン−アガロースビーズに固定化したグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ化ｐ２１活性化キナーゼ（ＰＡＫ）−Ｒａｃ１結合ドメイン（ＲＢＤ）およびＧＳＴタグ化Ｒｈｏｔｅｋｉｎ−Ｒｈｏ結合ドメイン（ＲＢＤ）を用いて、Ｒａｃ１−ＧＴＰおよびＲｈｏ−ＧＴＰを沈殿させた。総溶解物および沈殿物を、イムノブロット分析により分析した。濃度分析をＮＩＨの画像化ソフトウェアを使用して実施した。
（結果）
（プロテイン４．１−ＢＭおよびＰＤＺ−ＢＭ両方が、三次元培養における嚢胞の増殖において、ＴＳＬＣ１の外側への局在化に必須である）
本発明者らは、以前に、ＴＳＬＣ１が、浸透性支持体上の極性化細胞の外側膜に分布すると報告した（Ｍａｓｕｄａ，Ｍ．，ら（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７，３１０１４−３１０１９）。本発明者らは、細胞質ドメインまたは保存モチーフの欠失が、その外側の局在化に影響を及ぼすかどうかを試験した。欠失変異を発現する細胞の細胞質ゾルにおいて検出される点状のシグナルを除いて、野生型のＴＳＬＣ１を発現する細胞においても見られるように、ＴＳＬＣ１の短縮型のすべてが、細胞の外側表面に集中した（図１４）。三次元細胞外マトリクスにおいて、ＭＤＣＫ細胞は、細胞の単層により線を引かれる中空の嚢胞を形成する（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｌ．Ｅ．，ら（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，５３１−５３７）。本発明者らは、コラーゲンＩゲル中のクローンの各々を包埋し、そして、嚢胞を形成したこれらの全てが、親のＭＤＣＫ細胞に由来するものとは形態学的に識別可能であることを見出した（図１６、左欄）。免疫蛍光顕微鏡法は、ＴＳＬＣ１が、外側膜に局在化する一方で（図１５、ｅおよびｆ）、ΔＣ−ＨＡは、細胞質に拡散的に検出され（図１５、ｉおよびｊ）、このことは、全細胞質ドメインの短縮が、ＴＳＣＬ１の外側への局在化を消滅させることを示した。４．１−ＢＭの大きなフラクションは、外側膜に分布したが、これはまた、細胞質の先端側でも検出された（図１５、ｍおよびｎ）。興味深いことに、ＰＤＺ−ＢＭを欠失することにより、その局在が、外側膜の外側表面から、外側膜の下側三分の一に、そして、基底表面に、シフトした（図１５、ｑおよびｒ）。本発明者らは、接着結合のマーカーであるＺＯ−１について、嚢胞を染色した。ＺＯ−１は通常、親のＭＤＣＫ嚢胞の内側に面する先端表面上で検出される（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｌ．Ｅ．，ら（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，５３１−５３７）。野生型または短縮型のＴＳＬＣ１を発現する嚢胞において、ＺＯ−１は、嚢胞の内側管腔の自由空間を描写する点として検出され（図１５、ｃ、ｇ、ｋ、ｏおよびｓ）、このことは、ＴＳＬＣ１または任意の短縮型変異の発現が、細胞の極性の配向に影響を及ぼさなかったことを示した。
（ＴＳＬＣ１は、ＨＧＦ処理したＭＤＣＫ細胞において、Ｒａｃ１およびＲｈｏの活性を調節する）
ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅは、ＨＧＦ誘導性の細胞分散および細管形成の間の、アクチン骨格の再構成の周知の重要なメディエーターである（Ｋａｉｂｕｃｈｉ，Ｋ．，ら（１９９９）Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １１，５９１−５９６）。以前の研究は、組織培養プレート上のＭＤＣＫ細胞において、ＨＧＦは、Ｒａｃ１の一過性の最初期活性化、およびＲｈｏの持続性の活性化を湯初し、これが、細胞の分散応答と相関することを示している（Ｚｏｎｄａｇ，Ｇ．Ｃ．，ら（２０００）Ｊ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １４９，７７５−７８２）。ＧＳＴ−ＲＡＫ−ＲＢＤおよびＧＳＴＲｈｏｔｅｋｉｎ−ＲＢＤのアガロースビーズを使用して、本発明者らは、親細胞が、ＨＧＦに応答して、Ｒａｃ１活性の最初期増加（１５分以内に基底レベルに戻った）を示し（図１７Ａ、左パネル）、ならびに、持続性のＲｈｏの活性化を示す（図１７Ｂ、左パネル）ことを確認した。対照的に、ＨＧＦで処理したＭＤＣＫ／ＴＳＬＣ１細胞は、Ｒａｃ１の活性化の延長を示し、これは、刺激の４時間後でもなお観察された（図１７Ａ、中央パネル）が、Ｒｈｏ活性には増加が見られなかった（図１７Ｂ、中央パネル）。これらの結果は、ＴＳＬＣ１の発現が、ＨＧＦ刺激されたＭＤＣＫ細胞において、Ｒａｃ１の活性化の延長およびＲｈｏの活性化の減少を誘導することを示す。Ｒａｃ１活性およびＲｈｏ活性に対する、ＴＳＬＣ１のこの調節効果は、その細胞質ドメインに依存するようであった。ＭＤＣＫ／ΔＣ−ＨＡ細胞は、親のＭＤＣＫ細胞（図１７Ａ、左パネル）と同様のＲａｃ１活性化のプロフィールを示した（図１７Ａ、右パネル）が、Ｒｈｏの持続性の活性化は、親のＭＤＣＫ細胞（図１７Ｂ、左パネル）よりも少ない程度に、ＭＤＣＫ／ΔＣ−ＨＡ細胞において観察された（図１７Ｂ、右パネル）。結果的に、ＴＳＬＣ１のＨＧＦ誘発性細胞分散をブロックする能力は、Ｒａｃ１活性およびＲｈｏ活性に対するその調節効果から生じ得ると考えられる。
（結果）
図１７の結果から、ＴＳＬＣ１がＨＧＦによる培養腎細胞の遊走能を阻害することから、細胞遊走能を指標として「ＴＳＬＣ１活性を測定することが可能である」ことを示すといえる。ＴＳＬＣ１の作用を阻害する低分子化合物を探索するときの手段として利用できる可能性があるといえる。
（ＴＳＬＣ１、ＨＧＦによる培養腎細胞の遊走能の阻害能実験）
次に、ＴＳＬＣ１は、ＨＧＦによる培養腎細胞の遊走能を阻害するかどうかを確かめる実験を行った。以下にその方法を説明する。
（ＨＧＦで惹起したＭＤＣＫ細胞、ＭＤＣＫ／ＴＳＬＣ１細胞、ＭＤＣＫ−ｄｅｌｔａＣ−ＨＡ細胞における上皮、並びに間葉系マーカーの発現）
上皮接着蛋白質、並びに間葉系マーカー蛋白質の免疫蛍光染色の結果。緑のシグナルは、それぞれ上皮マーカーであるＥ−カドヘリン、ベータ・カテニン、間葉系マーカーであるビメンチン、フィブロネクチンを示す。青のシグナルは、ＴＯＴＯ−３イオダイドによる核ＤＮＡの染色を表す（グレイスケール表示では、緑が薄めに、青が濃い目に表現されている。）。スケールバーは１０μｍを表す。ＭＤＣＫ／ＴＳＬＣ１細胞、並びにＭＤＣＫ−ｄｅｌｔａＣ−ＨＡ細胞は、ＭＤＣＫ細胞に全長ＴＳＬＣ１ｃＤＮＡ発現プラスミド、並びに 細胞内ドメインに相当する３９７−４４２アミノ酸を欠失させたＴＳＬＣ１ｃＤＮＡに Ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ （ＨＡ）エピトープタグを融合させた発現プラスミドを、それぞれＲｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ社のＦｕＧＥＮＥ６試薬にてトランスフェクションし、３００μｇ／ｍｌのハイグロマイシン含有培地で培養し、ハイグロマイシン耐性を指標として分離した。
各細胞を８穴チャンバー・スライドに播き、４０ｎｇ／ｍｌのＨＧＦのある条件、およびない条件で、それぞれ１７時間培養した。その後、細胞を固定し、免疫染色を行なった。ＴＳＬＣ１はウサギ抗ＴＳＬＣ１多クローン抗体ＣＣ２で検出した。Ｅ−カドヘリン、ベータ・カテニン、フィブロネクチンは、それぞれ、マウス抗Ｅ−カドヘリン、マウス抗ベータ・カテニン、マウス抗フィブロネクチン単クローン抗体（すべてＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）で検出した。一方、ビメンチンはマウス抗ビメンチン単クローン抗体で検出した。免疫蛍光染色に用いた２次抗体はＪａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏから得た。
（結果）
図１８は、TSLC1は、ＨＧＦによる培養腎細胞の遊走能を阻害することを示す結果である。このことから、細胞遊走能を指標としてＴＳＬＣ１活性を測定することが可能である。プレート上の培養腎細胞ＭＤＣＫにＨＧＦを加えると細胞接着が失われ、細胞は遊走し、上皮マーカーであるＥ−カドヘリンおよびβ−カテニンの膜発現が消失し、間葉マーカーであるビメンチンおよびフィブロネクチンが発現する。しかし、ＭＤＣＫ細胞にＴＳＬＣ１を発現させると、この遊走能が抑制される。一方、ＴＳＬＣ１の細胞内ドメインを欠如させると、この抑制能は消失することが判明した。
ＴＳＬＣ１分子経路が活性化した浸潤性がん細胞は、葉状仮足を形成し強く接着、伸展し、洗浄処理後も接着する。ＴＳＬＣ１分子経路を阻害した細胞は接着、伸展せず、洗浄後は蛍光強度がコントロールレベルまですることになる。
（実施例１３：スクリーニング）
まず、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子を活性化する可能性のある物質を、レポータージーンアッセイを用いてスクリーニングする。
（レポータージーンアッセイ）
（方法）
リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ；１０ ｍＭ リン酸塩；１５０ ｍＭ 塩化ナトリウム，ｐＨ ７．２〜７．３．）
ルシフェラーゼレポーターアッセイキット：溶解溶液：２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（７．５）、２ｍＭ ジチオスレイトール（ＤＴＴ），１０％グリセロール、１％ ＴｒｉｔｏｎＸ−１００；ルシフェリンミックス：２０ｍＭトリシン（Ｔｒｉｃｉｎｅ）／１．０７ｍＭ（ＭｇＣＯ３）４Ｍｇ（ＯＨ）２−５Ｈ２Ｏ／２．６７ｍＭＭｇＳＯ４／０．１ｍＭ ＥＤＴＡ／３３．３ｍＭ ＤＴＴ／２７０μＭ コエンザイム（Ｃｏｅｎｚｙｍｅ）Ａ／４７０μＭルシフェリン／５３０μＭＡＴＰ（ニッポンジーンのピッカジーン（Ｃｏｄｅ Ｎｏ．ＰＧＫ−Ｌ１００）を使用することができる）。
（使用する細胞）
小細胞肺がん細胞（初代）、ＭＤＣＫ２細胞など。
（培地）
これらの細胞は、適宜Ｄｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地に１０％ウシ胎仔血清などを用いて培養する。
（ルシフェラーゼ）
ルシフェラーゼは、蛍光（約５６０ｎｍ）作る酵素である。細胞内に、アッセイするタンパク質をコードした核酸配列を含むプラスミドとレポータープラスミド（ルシフェラーゼレポーター）を同時に細胞に強制発現し、レポーター活性を測定する。ルシフェラーゼ遺伝子産物の発現による蛍光を測定することにより、遺伝子発現を測定することができる。
（方法）
（１）上記プラスミドを用いて上記各々の細胞のトランスフェクションを行う。
（２）４８〜７２時間、上記細胞を培養する。
（３）培養上清を除去する。
（４）培養に使用されているウェルまたはディッシュを洗浄する。
（５）細胞の溶解（２４穴プレートの場合、溶解溶液２００μｌ／ウェル）。
（６）ライゼートをＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへうつす。
（７）脱核（遠心分離１５Ｋｒｐｍ、３分，４℃）する。
（８）上清を別のＥｐｐｅｎｄｏｒｆチューブへうつす
（９）液体シンチレーションカウンターにサンプルを挿入する。
（１０）ルシフェリンミックスにサンプル上清を０．５μｌ加える。
（１１）蛍光に起因するカウントを測定する。
このようにして得られた蛍光から、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の機能の抑制または亢進を測定することができる。
（実施例１４：２次スクリーニング）
実施例１３において、がん細胞以外の細胞を用いて（株化細胞または初代培養細胞）、同様の実験を行う。ここで、がん細胞以外の細胞では、ＴＳＣＬ１の分子経路の因子の活性化効果がないか低いものを、好ましいヒットとして選択する。
（実施例１５：ｍＲＮＡの発現低下）
次に、別のスクリーニングの系として、小細胞肺がん初代細胞、３Ｔ３−Ｌ１、３Ｔ３−Ｆ４４２または他の初代培養細胞を用いて、候補薬物ライブラリーの（種々の濃度での）存在下または非存在下で、これらの細胞を培養する。
ｍＲＮＡの発現は、上記実施例に記載される技術に準じて測定する。
これにより、ｍＲＮＡレベルで、発現量を活性化させる化合物を測定することができる。
（実施例１６：自動化）
実施例１３〜１５などで実施するスクリーニングは、ロボットを用いて自動化することができる。この場合、例えば、ベックマンコールターのＢｉｏｍｅｋシリーズを用いて、マイクロプレートを用いたシステムを構築するか、またはＺｙｍａｒｋのＳｔａｃｃａｔｏ Ｍｉｎｉ−Ｓｙｓｔｅｍシリーズを用いてシステムを構築することができる。
このようにして得られたリード化合物は、動物実験に用いることができる。あるいは、このようなリード化合物をもとに、他の化合物を設計することができる。
（実施例１７：動物実験）
実施例１３〜１６などで、小細胞肺がん特異的にＴＳＣＬ１の分子経路の因子を活性化する可能性があることが判明した化合物について、マウス、ラットまたはサルなどの動物に投与してがん組織特異的にＴＳＣＬ１の分子経路の因子 ｍＲＮＡ発現量またはタンパク質量を低下させる化合物をスクリーニングする。
このようなスクリーニングにより、動物において実際にがんに作用する物質をスクリーニングすることができる。
以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。
本発明によれば、がん（特に、小細胞肺がんおよび関連するがんまたは新生物）の診断、処置および／または予防、および／または浸潤・転移の抑制のための技術が提供される。このような技術は、医療およびその周辺（製薬メーカー、試薬メーカー）などにおいて産業上の利用可能性がある。
図１は、ＴＳＬＣ１によるがん細胞の浸潤性形質の誘導を示す。ＴＳＬＣ１ 発現の欠如したがん細胞をＮＩＨ３Ｔ３単層細胞上へ重層培養し、ドキシサイクリンによりＴＳＬＣ１の発現を誘導した。ＴＳＬＣ１は抗ＴＳＬＣ１抗体と二次抗体（青）で、アクチン分子はファロイジン（赤）で染色した。示されるように、ＴＳＬＣ１の過剰発現により、がん細胞は浸潤形質を示した。 図２は、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉを用いた発現抑制による、がん細胞の浸潤性の阻害を示す。ＴＳＬＣ１を高発現するがん細胞をＮＩＨ３Ｔ３単層細胞上へ重層培養し、ＴＳＬＣ１ ｓｉＲＮＡを加えることにより、ＴＳＬＣ１の発現を抑制した。ＴＳＬＣ１は抗TSLC1抗体と二次抗体（緑）で、アクチン分子はファロイジン（青）で染色した。 図３は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を示す。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写・翻訳して作成したＴｉａｍ１タンパク質、ならびに部分断片と、大腸菌にてＧＳＴ融合タンパク質として作成したＴＳＬＣ１細胞内断片（ＧＳＴ−Ｃ）ならびにそのＣ端９アミノ酸を欠失した断片とをＧＳＴカラム上で結合させ、溶出断片を検出した。右端は合成したＴｉａｍ１ならびにその部分断片をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて検出した。 図４および図５は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を示す。培養がん細胞にＶ５タグ配列をつけたＴｉａｍ１タンパク質を導入、発現させ、抗Ｖ５抗体、またはマウスＩｇＧ（図４）、あるいは抗ＴＳＬＣ１抗体、またはマウスＩｇＧ（図５）で免疫沈降し、沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗ＴＳＬＣ１抗体（図４）、ならびに抗Ｔｉａｍ１抗体（図５）にて検出した（ウェスタン・ブロット法）。対照として、細胞溶解物を抗ＴＳＬＣ１抗体、ならびに抗Ｖ５抗体で検出し（図４）、あるいは細胞溶解物と免疫沈降物を抗Ｖ５抗体で検出（図５）した。 図４および図５は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を示す。培養がん細胞にＶ５タグ配列をつけたＴｉａｍ１タンパク質を導入、発現させ、抗Ｖ５抗体、またはマウスＩｇＧ（図４）、あるいは抗ＴＳＬＣ１抗体、またはマウスＩｇＧ（図５）で免疫沈降し、沈降物をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗ＴＳＬＣ１抗体（図４）、ならびに抗Ｔｉａｍ１抗体（図５）にて検出した（ウェスタン・ブロット法）。対照として、細胞溶解物を抗ＴＳＬＣ１抗体、ならびに抗Ｖ５抗体で検出し（図４）、あるいは細胞溶解物と免疫沈降物を抗Ｖ５抗体で検出（図５）した。 図５Ｂは、浸潤性の強いがん細胞で特徴的に認められる短いＴｉａｍ１（短縮型）分子を示す。浸潤性の強いがん細胞（４−８；ＡＴＬ細胞）では、浸潤性の弱いがん細胞ＴＳＬＣ１（１−３；Ｔ−ＡＬＬ細胞）と比較して、Ｔｉａｍ１短縮型断片が特徴的に認められる。細胞溶解液をポリアクリルアミドゲル電気泳動にて分離し、抗Ｔｉａｍ１抗体にて検出した（ウェスタン・ブロット法）。この短いＴｉａｍ断片は、イントロン１３の一部を含む、エクソン１４−２９に対応する新規のスプライシング・バリアントと考えられる。 図５Ｃでは、低分子量Ｔｉａｍ１ に特異的なプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ法によるＡＴＬの低分子量Ｔｉａｍ１ ＲＮＡの検出が示される。特異的ＡＴＬ細胞（４−８）では４１８塩基対の特異的Ｔｉａｍ１ＲＮＡに由来する増幅断片が検出されるが、ＡＬＬ細胞（１−３）や他の細胞ではこのＲＮＡは検出されない。 図６は、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質との共局在を示す。培養がん細胞でＴＳＬＣ１タンパク質の発現をドキシサイクリンにて誘導し、ＴＳＬＣ１タンパク質とＴｉａｍ１タンパク質との局在を、それぞれ抗ＴＳＬＣ１抗体、ならびに抗Ｔｉａｍ１抗体にて検出した。右端は両シグナルを合成した画像である。 図７は、ＴＳＬＣ１はＨＧＦによるＭＤＣＫ細胞の上皮間葉転換、遊走性、浸潤性、ならびにＲａｃ１の活性化を抑制することを示す。 図８は、ＴＳＬＣ１によるがん細胞での遊走性形態、浸潤能は、Ｒａｃ１の優性欠失変異体により阻害されることを示す。Ｒａｃ１の優性欠失変異体を導入したがん細胞、或いは導入しないがん細胞をＮＩＨ３Ｔ３単層細胞上に重層培養し、ドキシサイクリンによりＴＳＬＣ１の発現を誘導した。ＴＳＬＣ１の発現は抗ＴＳＬＣ１抗体と二次抗体（青）にて、またＲａｃ１の優性変異体はＧＦＰとの融合タンパク質として発現、検出した。 図９は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＴＳＬＣ１、ＤＡＬ−１およびＭＰＰ１〜ＭＰＰ３の亜細胞局在化を示す。ＨＥＫ２９３のコンフルエント（Ａ）培養物または低密度（Ｂ）培養物を、免疫蛍光によって分析した。細胞を、抗ＴＳＬＣ１ｐＡｂ（ａ）、抗ＤＡＬ−１ ｐＡｂ（ｂおよびａ２）、抗ＭＰＰ１ ｐＡｂ（ｃおよびｂ２）、抗ＭＰＰ２ ｐＡｂ（ｄおよびｃ２）、または抗ＭＰＰ３ ｐＡｂ（ｅおよびｄ２）を用いて染色した。低密度の細胞もまた、抗ＴＳＬＣ１ｍＡｂ（３Ｅ１）（Ｂ、ａ１〜ｄ１、青色）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジン（Ｂ、ａ３〜ｄ３、赤色）を用いて染色した。矢印は、細胞の糸状足突出を示す。左の３つの欄を統合した画像が、右欄に示される（Ｂ、ａ４〜ｄ４）。バー：２０μｍ。 図１０は、ＲＮＡｉを使用するＴＳＬＣ１発現の抑制によるＨＥＫ２９３細胞の細胞接着および上皮様構造の排除を示す。（Ａ）ＴＳＬＣ１に対するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓ１もしくはｓ２）またはコントロールｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３におけるＴＳＬＣ１および関連タンパク質の免疫ブロッティング。ＴＳＬＣ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓ１）またはコントロールｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３細胞における、細胞骨格組織化を検出するため（Ｂ）、Ｅ−カドヘリンまたはＺＯ−１の亜細胞局在化を検出するため（Ｄ）、およびＤＡＬ−１またはＭＰＰ２の亜細胞局在化を検出するため（Ｅ）の免疫蛍光分析。ＴＳＬＣ１、アクチンフィラメント、Ｅ−カドヘリン、ＺＯ−１、ＤＡＬ−１、およびＭＰＰ２が、抗TSLC1ｐＡｂもしくは抗TSLC1ｍＡｂを用いる染色（Ｂ、Ｄ、およびＥ、ａ１〜ｄ１）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジンを用いる染色（Ｂ、ａ２〜ｃ２）、抗汎カドヘリンｍＡｂを用いる染色（Ｄ、ａ２およびｂ２）、抗ＺＯ−１ ｍＡＢを用いる染色（Ｄ、ｃ２およびｄ２）、抗ＤＡＬ−１ ｐＡｂを用いる染色（Ｅ、ａ２およびｂ２）、ならびに抗ＭＰＰ２ ｐＡｂを用いる染色（Ｅ、ｃ２およびｄ２）によってそれぞれ検出された。矢尻は、ＴＳＬＣ１を発現する細胞間接触部位を示し、一方、矢印は、ＴＳＬＣ１を欠く細胞間接触部位を示す。左および中央の欄を統合した画像が、右の欄に示される。バー；２０μｍ。（Ｃ）コントロールｓｉＲＮＡで処理したＨＥＫ２９３の平均面積および高さ（白色カラム）、ＴＳＬＣ１に対するｓｉＲＮＡ（ｓ１）で処理したがＴＳＬＣ１を発現するＨＥＫ２９３の平均面積および高さ（明灰色カラム）、およびｓ１で処理したＴＳＬＣ１を欠くＨＥＫ２９３の平均面積および高さ（暗灰色カラム）を示す、ヒストグラム。上記細胞の面積および高さは、皮質アクチンフィラメント束に従って測定した。平均値および標準偏差を、３つの独立した実験に基づいて示した。それらの実験において、最小数８０個の細胞を、各サンプルについて計数した。アスタリスクは、マン−ホイットニーＵ検定によって決定した統計的有意性（ｐ＜０．０００１）を示す。 図１１は、ＴＳＫＣ１発現を欠くＮＳＣＬＣ細胞におけるＴＳＬＣ１複合体の構成成分の誤局在化を示す。（Ａ）ヒトＮＳＣＬＣ細胞におけるＴＳＬＣ１タンパク質、ＤＡＬ−１タンパク質、ＭＰＰ１タンパク質、ＭＰＰ２タンパク質およびＭＰＰ３タンパク質の免疫ブロッティング。（Ｂ〜Ｄ）ＡＢＣ−１細胞（Ｂ）、ＮＣＩ−Ｈ５９６細胞（Ｃ）およびＳＫ−ＬＵ−１（Ｄ）細胞における、ＴＳＬＣ１、ＤＡＬ−１、およびＭＰＰ２の亜細胞局在化。細胞を、各タンパク質に対する特異的抗体を用いて（左）、およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５６８色素標識ファロイジンを用いて二重染色し、統合した画像を示す（右）。バー；２０μｍ。 図１２は、膜近傍ドメインにおけるＴＳＬＣ１複合体の模式的図示を示す。（Ａ）ＴＳＬＣ１は、ＤＡＬ−１タンパク質およびＭＰＰタンパク質に結合する。ＭＰＰタンパク質のうちの一メンバーは、生物学的状況に依存してＴＳＬＣ１複合体中に組み込まれる。（Ｂ）ＴＳＬＣ１タンパク質、ＤＡＬ−１タンパク質、およびＭＰＰタンパク質の、ドメイン構造および結合配列。ＴＳＬＣ１の細胞質ドメインにおける４．１結合モチーフおよびＰＤＺ結合モチーフが、それぞれ、赤紫色文字および橙色文字にて示されている。ＭＡＧｕＫにおけるＨＯＯＫコンセンサス配列および塩基性アミノ酸（ａａ）が、それぞれ、緑色文字または下線によって示されている。 図１３は、ＴＳＬＣ１（ΔＣ−ＨＡ）の細胞質テイルを欠く変異体を作製するために、３９７〜４２２に位置するアミノ酸（ａａ）残基を取り除き、３９６位の残基を、ＨＡエピトープタグに融合させたものを示す。図１３Ａは、短縮型変異体Δ４．１−ＢＭおよびΔＰＤＺ−ＢＭを、それぞれ、プロテイン４．１−ＢＭを包含する１１アミノ酸（４００〜４１０）およびＰＤＺ−ＢＭを含有する４アミノ酸を取り除くように設計したものを示す。 図１４は、欠失変異を発現する細胞の細胞質ゾルにおいて検出される点状のシグナルを除いて、野生型のＴＳＬＣ１を発現する細胞においても見られるように、ＴＳＬＣ１の短縮型のすべてが、細胞の外側表面に集中した様子を示す。 図１５は、免疫蛍光顕微鏡法による観察結果を示す。ＴＳＬＣ１が、外側膜に局在化する一方で（図１５、ｅおよびｆ）、ΔＣ−ＨＡは、細胞質に拡散的に検出され（図１５、ｉおよびｊ）、このことは、全細胞質ドメインの短縮が、ＴＳＣＬ１の外側への局在化を消滅させることを示した。４．１−ＢＭの大きなフラクションは、外側膜に分布したが、これはまた、細胞質の先端側でも検出された（図１５、ｍおよびｎ）。興味深いことに、ＰＤＺ−ＢＭを欠失することにより、その局在が、外側膜の外側表面から、外側膜の下側三分の一に、そして、基底表面に、シフトした（図１５、ｑおよびｒ）。本発明者らは、接着結合のマーカーであるＺＯ−１について、嚢胞を染色した。ＺＯ−１は通常、親のＭＤＣＫ嚢胞の内側に面する先端表面上で検出される（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ，Ｌ．Ｅ．，ら（２００２）Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ３，５３１−５３７）。野生型または短縮型のＴＳＬＣ１を発現する嚢胞において、ＺＯ−１は、嚢胞の内側管腔の自由空間を描写する点として検出された（図１５、ｃ、ｇ、ｋ、ｏおよびｓ）。 図１６は、コラーゲンＩゲル中のクローンの各々を包埋し、そして、嚢胞を形成したこれらの全てが、親のＭＤＣＫ細胞に由来するものとは形態学的に識別可能であることを示す図である。 図１７は、親細胞が、ＨＧＦに応答して、Ｒａｃ１活性の最初期増加（１５分以内に基底レベルに戻った）を示し（図１７Ａ、左パネル）、ならびに、持続性のＲｈｏの活性化を示す（図１７Ｂ、左パネル）。対照的に、ＨＧＦで処理したＭＤＣＫ／ＴＳＬＣ１細胞は、Ｒａｃ１の活性化の延長を示し、これは、刺激の４時間後でもなお観察された（図８Ａ、中央パネル）が、Ｒｈｏ活性には増加が見られなかった（図１７Ｂ、中央パネル）。これらの結果は、ＴＳＬＣ１の発現が、ＨＧＦ刺激されたＭＤＣＫ細胞において、Ｒａｃ１の活性化の延長およびＲｈｏの活性化の減少を誘導することを示す。Ｒａｃ１活性およびＲｈｏ活性に対する、ＴＳＬＣ１のこの調節効果は、その細胞質ドメインに依存するようであった。ＭＤＣＫ／ΔＣ−ＨＡ細胞は、親のＭＤＣＫ細胞（図１７Ａ、左パネル）と同様のＲａｃ１活性化のプロフィールを示した（図１７Ａ、右パネル）が、Ｒｈｏの持続性の活性化は、親のＭＤＣＫ細胞（図１７Ｂ、左パネル）よりも少ない程度に、ＭＤＣＫ／ΔＣ−ＨＡ細胞において観察された（図１７Ｂ、右パネル）。 図１８は、ＴＳＬＣ１は、ＨＧＦによる培養腎細胞の遊走能を阻害することを示す。このことから、細胞遊走能を指標としてＴＳＬＣ１活性を測定することが可能である。プレート上の培養腎細胞ＭＤＣＫにＨＧＦを加えると細胞接着が失われ、細胞は遊走し、上皮マーカーであるＥ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、ｂ−カドヘリン（ｂ−ｃａｔｅｎｉｎ）の膜発現が消失し、間葉マーカーであるビメンチン（ｖｉｍｅｎｔｉｎ），フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）が発現していた。しかし、ＭＤＣＫ細胞にＴＳＬＣ１を発現させると、この遊走能が抑制された。一方、ＴＳＬＣ１の細胞内ドメインを欠如させると、この抑制能は消失していた。
（配列表の説明）
配列番号１は、ＴＳＣＬ１をコードする核酸配列（TSLC18A+8B 型 cDNA の塩基配列）である。
配列番号２は、ＴＳＣＬ１のアミノ酸配列（TSLC18A+8B のアミノ酸配列）である。
配列番号３は、Ｔｉａｍ１をコードする核酸配列（TIAM1 cDNA の塩基配列；アクセッシ
ョン番号NM003253）である。
配列番号４は、Ｔｉａｍ１のアミノ酸配列（アクセッション番号NM＿003253）である。
配列番号５は、Ｒａｃ１をコードする核酸配列（アクセッション番号NM＿006908 ）であ
る。
配列番号６は、Ｒａｃ１のアミノ酸配列（アクセッション番号NM＿006908 ）である。
配列番号７および配列番号８は、ＴＳＣＬ１のｓｉＲＮＡの、それぞれセンス配列（５’−ｇｔｃａａｔａａｇａｇｔｇａｃｇａｃｔ−３’）およびアンチセンス配列（５’−ｇａｇｔｇａｃｇａｃｔｃｔｇｔｇａｔｔ−３’）の代表例である。
配列番号９および配列番号１０は、Ｔｉａｍ１のｓｉＲＮＡの、それぞれセンス配列（５’− ＣＧＧ ＣＧＡ ＧＣＵ ＵＵＡ ＡＧＡ ＡＧＡ ＡＴＴ−３’）およびアンチセンス配列（５’− ＵＵＣ ＵＵＣ ＵＵＡ ＡＡＧ ＣＵＣ ＧＣＣ ＧＴＴ −３’）である。
配列番号１１は、コントロールのｓｉＲＮＡの配列（５’−ＵＣＡＧＣＡＧＵＧＡＧＡＡＵＡＡＣＵＧ−３’）である。
配列番号１２は、Ｒａｃ１の優先欠失改変体の核酸配列（配列番号５における２９１番目の核酸がＡになっている。）を示す。
配列番号１３は、Ｒａｃ１の優先欠失改変体のアミノ酸配列（配列番号６における１７番目のアミノ酸がＮになっている。）を示す。
配列番号１４は、ＫＬＨと融合したＴＳＬＣ１のカルボキシル末端の１８アミノ酸の合成ポリペプチド（ＩＮＡＥＧＧＱＮＮＳＥＥＫＫＥＹＦＩ）を示す。
配列番号１５は、ＴＳＬＣ１の細胞質ドメインのアミノ酸配列（ＲＹＦＡＲＨＫＧＴＹＦＴＨＥＡＫＧＡＤＤＡＡＤＡＤＴＡＩＩＮＡＥＧＧＱＮＮＳＥＥＫＫＥＹＦＩ）を示す。配列番号１６は、ＴＳＬＣ１の細胞質ドメインのΔ４．１−ＢＭ欠失体（ＲＹＦＡ−−−−−−−−−−−ＫＧＡＤＤＡＡＤＡＤＴＡＩＩＮＡＥＧＧＱＮＮＳＥＥＫＫＥＹＦＩ）を示す。
配列番号１７は、ＴＳＬＣ１の細胞質ドメインのΔＰＤＺ−ＢＭ欠失体（ＲＹＦＡＲＨＫＧＴＹＦＴＨＥＡＫＧＡＤＤＡＡＤＡＤＴＡＩＩＮＡＥＧＧＱＮＮＳＥＥＫＫ）を示す。配列番号１８および配列番号１９は、ＴＳＣＬ１のｓｉＲＮＡの、それぞれセンス配列およびアンチセンス配列の別の例である。
配列番号２０は、ＴＳＬＣ１の特異的合成オリゴヌクレオチド配列である。
ＴＴＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＴＧＣＴＴＧＣＴＣＡ
配列番号２１は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）を増幅するためのフォワードプライマーである。
配列番号２２は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）を増幅するためのリバースプライマーである。
配列番号２３は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）である。
配列番号２４は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例であるアミノ酸配列（エクソン１４−２９に対応）である。
配列番号２５は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）を増幅するためのフォワードプライマーの核酸配列である。
配列番号２６は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）を増幅するためのリバースプライマーの核酸配列である。
配列番号２７は、配列番号２５および配列番号２６のプライマー対により増幅される断片の核酸配列である。
配列番号２８は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）を増幅するためのフォワードプライマーである。
配列番号２９は、Ｔｉａｍ１の短縮型の代表例である核酸配列（イントロン１３の一部およびエクソン１４−２９に対応）を増幅するためのリバースプライマーである。
配列番号３０は、配列番号２８および配列番号２９のプライマー対により増幅される断片の核酸配列である。

Claims (12)

  1. 小細胞肺がんの転移および／または浸潤を抑制する組成物であって、ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉ、ＴＳＬＣ１に対する抗体、もしくはＴＳＬＣ１の優性欠失変異体を含む、前記組成物。
  2. 前記抑制は、ＴＳＬＣ１の過剰発現を抑制する、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記ＴＳＬＣ１は、配列番号１に示す核酸配列またはその改変体によってコードされるか、配列番号２に示すアミノ酸配列またはその改変配列を有する、請求項１または２に記載の組成物。
  4. 前記ＴＳＬＣ１のＲＮＡｉは、配列番号７および配列番号８に示す配列を有する、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
  5. 小細胞肺がんの抑制因子をスクリーニングする方法であって、
    Ａ）候補物質を提供する工程；
    Ｂ）該候補物質をＴＳＬＣ１の分子経路のアッセイ系に供する工程；
    Ｃ）該候補物質の内、ＴＳＬＣ１の分子経路においてＴＳＬＣ１発現を抑制する因子を同定し、該抑制因子を、小細胞肺がんを抑制する因子であると決定する工程
    を包含する、方法。
  6. 前記候補物質は、核酸分子、ポリペプチド、脂質、糖鎖、有機低分子およびそれらの複合分子からなる群より選択される、請求項５に記載の方法。
  7. 小細胞肺がんの診断薬であって、ＴＳＬＣ１のタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルの発現量をＥＬＩＳＡ法、蛍光抗体法、ウエスタンブロット法、免疫組織染色法、ノーザンブロット法、ドットブロット法、およびＰＣＲ法からなる群から選ばれるいずれかの測定法を用いて測定するための試薬を含む、前記診断薬。
  8. 前記試薬として、配列番号１に示す配列の核酸分子に対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を有する核酸分子を含む、請求項７に記載の診断薬。
  9. 前記試薬として、配列番号２に示す配列のポリペプチドに対する抗体を含む、請求項７に記載の診断薬。
  10. 前記試薬として、配列番号１に示す配列の核酸分子の全部または一部を増幅するように設計されたプライマーを含む、請求項７に記載の診断薬。
  11. 前記試薬として、配列番号１に示す配列の核酸分子の全部または一部に相補的な配列となるように設計されたプローブを含む、請求項７に記載の診断薬。
  12. 前記試薬として、ＴＳＬＣ１遺伝子のｍＲＮＡに特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを含む、請求項７に記載の診断薬。
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