BRPI1009232B1 - Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo, composição que os compreende, molécula de ácido nucleico, hibridoma e métodos para a preparação de um anticorpo anti-cadm1 - Google Patents

Abstract

ANTICORPOS TOTALMENTE HUMANOS ESPECÍ- FICOS PARA CADM1. A presente invenção refere-se a anticorpos monoclonais isola- dos, particularmente anticorpos monoclonais humanos, mais particularmente a anticorpos projetados resultando na ligação aumentada a receptores Fc e/ou potência aumentada para ADCC ou imunoconjugados, que se ligam especificamente a CADM1 com alta afinidade. As moléculas de ácido nuclei- co que codificam anticorpos de CADM1, vetores de expressão, células hos- pedeiras e métodos para expressão dos anticorpos de CADM1 são também providos. Moléculas biespecíficas e composições farmacêuticas compreen- dendo os anticorpos de CADM1 são também providas. Métodos para detec- ção de CADM1, bem como métodos para tratamento de vários cânceres, incluindo câncer de pulmão e câncer pancreático, são descritos.

Description

PEDIDOS RELACIONADOS

[0001] Este pedido reivindica o benefício do pedido provisório dos Estados Unidos N° 61/209471, depositado em 5 de março de 2009, e pedido provisório dos Estados Unidos N° 61/209390, depositado em 5 de março de 2009, ambos dos quais sendo incorporados por referência aqui em suas totalidades.

CAMPO DA INVENÇÃO

[0002] A presente invenção refere-se geralmente aos campos de imunologia e biologia molecular. Mais especificamente, aqui providos são anticorpos, particularmente anticorpos projetados resultando em ligação aumentada para receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC e imunoconjugados, e outras proteínas terapêuticas direcionadas contra CADM1 de molécula de adesão similar a imunoglobulina, ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos e proteínas terapêuticas, métodos para preparação dos anticorpos monoclonais da invenção, e outras proteínas terapêuticas, e métodos para o tratamento de doenças, tais como cânceres mediados por expressão/atividade de CADM1 e/ou associados com expressão/atividade anormal de ligantes, portanto.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0003] Moléculas de adesão de célula são geralmente identificadas como caderins, integrins, selectins, ou como membros da superfamília Imunoglobulina (Ig). As moléculas da superfamília imunoglobulina incluem receptores de antígeno de superfície de célula, coreceptores e moléculas coestimulatórias do sistema imune, moléculas envolvidas na apresentação de antígeno a linfócitos, moléculas de adesão de célula e alguns receptores de citoquina. As moléculas de adesão de célula da superfamília Ig constituem mais de 100 moléculas em vertebrados, e incluem NCAMs (moléculas de adesão de célula neuronais), família L1 CAMs, ICAMS (moléculas de adesão de célula intracelulares), VCAMS (moléculas de adesão de célula vasculares), SIGLECs (lectins similares à ligação de ácido siálico de Ig, incluindo CD22 e CD83), nectins, CD2, CD48.

[0004] A molécula de superfamília de imunoglobulina CADM1 foi inicialmente caracterizada por grupos de pesquisa múltiplos; como um resultado a molécula é identificada por muitos nomes na literatura científica incluindo molécula de adesão de célula 1, molécula de adesão de célula sináptica (synCAM), molécula de superfamília de imunoglobulina espermatogênica (sgIGSF), IGSF4, BL2, ST17, NECL2, RA175, e CADM1A. Inicialmente reportada para agir adicionalmente como um supressor de tumor, ela é também conhecida como TSLC1 (Murakami et al., Nature Genetics 27(4):427 (2001)).

[0005] Diferente de caderins e integrins, que requerem cátions divalentes tais como Ca+2 ou Mg+2 para atividades adesivas, as moléculas de superfamília de Ig são tipicamente Ca+2 ou Mg+2 independentes. A estrutura de CADM1 é caracterizada como tendo um domínio extracelular com três motivos similares à imunoglobulina, uma α helicoidal que se estende na membrana hidrofóbica simples e um domínio intracelular que se liga às fibras actin via DAL-1, e uma extremidade citoplásmica C-terminal curta contendo um motivo de ligação PDZ. Duas isoformas CADM1 são conhecidas, NM_014333 e NM_001098517, a última tendo a 27 anulações de aminoácidos. A análise indica que as sequências de aminoácido correspondente ao domínio citoplásmico de CADM1 são idênticas em cinco mamíferos e altamente conservadas em vertebrados, sugerindo um papel importante de CADM1 em interação de célula-célula normal. O ortólogo CADM1 de camundongo (AAQ023810) mostra 97% de identidade a CADM1 humano. (Fukami et al., Gene 295:7-12 (2002)).

[0006] CADM1 é expresso em nervos e células tronco (Ito et al. J Pharmacol Sci.;102(1):1-5 (2006)), células alveolares pulmonares (Ito et al. Histol Histopathol. 18(4):1321-9 (2003)), células secretórias pancreáticas (Shingai et al. J Biol Chem.; 278(37):35421-7 (2003)), (Wakayama et al., Blood;101(7):2601-8 (2003)). Ele está também associado com carcinoma hepatocelular (HCC). O CADM1 parece ser expresso em células de duto de bile adulto cirrótico, mas está ausente de dutos de bile adulto livre de doença (Ito et al., Hepatology;45(3):684- 94 (2007)). Ele é adicionalmente reportado estar associado com glioblastomas e câncer de pulmão.

[0007] Dois mecanismos resultantes na inativação de CADM1 foram identificados: através de metilação de promotor, e através de perda de heterozigosidade no local do gene. A metilação do promotor de CADM1 reportadamente resulta em perda de expressão de CADM1 em tumores, incluindo câncer de pulmão, esofageal, pancreático, de seio, e cânceres de próstata, particularmente em tumores com comportamento agressivo. (Murakami et al., Mol Cancer. 4:28 (2005)).

RESUMO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção se refere a estas e outras necessidades relacionadas pela provisão de anticorpos, particularmente anticorpos projetados resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC e imunoconjugados, direcionados contra CADM1, portanto, ácidos nucleicos que codificam tais anticorpos e proteínas terapêuticas, métodos para preparação de anticorpos monoclonais anti-CADM1 e outras proteínas terapêuticas, e métodos para o tratamento de doenças, tais como distúrbios mediados por CADM1, por exemplo, cânceres humanos, incluindo câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, do trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

[0009] Desse modo, a presente invenção proporcionam anticorpos monoclonais isolados, em particular murino, quiméricos, humanizados, e anticorpos monoclonais totalmente humanos, que se ligam a uma ou mais proteínas morfogênicas de osso e receptores, portanto, e que exibem uma ou mais propriedades funcionais desejáveis. Tais propriedades incluem, por exemplo, ligação específica de alta afinidade a CADM1 humano. Também providos são métodos para tratamento de uma variedade de doenças mediadas por CADM1 usando os anticorpos, proteínas, e composições da presente invenção.

[00010] A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, um fragmento de anticorpo, ou um mimético de anticorpo que se liga a um epítope em CADM1 humano reconhecido por um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 19, 20, ou 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NO: 22, 23, ou 24. Em algumas modalidades, o anticorpo isolado é um anticorpo de comprimento total de um isotipo IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4.

[00011] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples, um imunoconjugado, um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, e um anticorpo biespecífico. Em uma modalidade preferida, o anticorpo da presente invenção é um imunoconjugado ou um anticorpo projetado resultando na ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC. O fragmento de anticorpo pode ser selecionado a partir do grupo consistindo em: um UniCorpo, um anticorpo de domínio, e um Nanocorpo. Em algumas modalidades, os imunoconjugados da invenção compreendem um agente terapêutico. Em outro aspecto da invenção, o agente terapêutico é uma citotoxina ou um isótopo radioativo.

[00012] Em algumas modalidades, o anticorpo da presente invenção é selecionado a partir do grupo consistindo em: um Afficorpo, um DARPin, um Anticalin, um Avímero, um Versacorpo, e um Duocalin.

[00013] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 de < 50 Nm, < 10 Nm, ou < 1 Nm.

[00014] Em modalidades alternativas, as composições da presente invenção compreendem um anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00015] Em outros aspectos, o anticorpo da presente invenção é uma composição compreendendo o anticorpo isolado ou porção de ligação de antígeno deste, de acordo com a reivindicação 1, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00016] Em algumas modalidades, a invenção compreende uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou leve do anticorpo isolado, ou porção de ligação de antígeno que se liga a um epítope em CADM1 humano. Outros aspectos da invenção compreendem vetores de expressão compreendendo tais moléculas de ácido nucleico, e células hospedeiras compreendendo tais.

[00017] Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona um método para preparação de um anticorpo anti-CADM1, referido método compreendendo as etapas de: obtenção de uma célula hospedeira que contém uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo da invenção; crescimento da célula hospedeira em uma cultura de célula hospedeira; provisão de condições de cultura de célula hospedeira no qual a uma ou mais moléculas de ácido nucleico são expressas; e recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira ou a partir da cultura de célula hospedeira.

[00018] Em outras modalidades, a invenção é direcionada a métodos para tratamento ou prevenção de uma doença associada com células alvos que expressam CADM1, referido método compreendendo a etapa de administrar a um indivíduo um anticorpo anti-CADM1, ou porção de ligação de antígeno deste, em uma quantidade efetiva para tratar ou prevenir a doença. Em alguns aspectos, a doença tratada ou prevenida pelos anticorpos, ou porção de ligação de antígeno deste, da invenção, é selecionada a partir do grupo consistindo em: cânceres humanos. Em algumas modalidades, a doença tratada ou prevenida pelos anticorpos da presente invenção é um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, do trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

[00019] Em outras modalidades, a invenção é direcionada a um anticorpo anti-CADM1, ou porção de ligação de antígeno deste, para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com células alvos que expressam CADM1. Em alguns aspectos, a doença tratada ou prevenida pelo anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, da invenção, é câncer humano. Em algumas modalidades, a doença tratada ou prevenida pelos anticorpos da presente invenção é um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

[00020] Em outras modalidades, a invenção é direcionada ao uso de um anticorpo anti-CADM1, ou porção de ligação de antígeno deste, para a produção de um medicamento para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com células alvos que expressam CADM1. Em alguns aspectos, a doença tratada ou prevenida pelo medicamento da invenção, é câncer humano. Em algumas modalidades, a doença tratada ou prevenida pelo medicamento da invenção é um câncer selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer colorretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

[00021] Em outras modalidades, a presente invenção é um anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno deste, um fragmento de anticorpo, ou um mimético de anticorpo que se liga a um epítope no CADM1 humano reconhecido por um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionadas a partir do grupo consistindo na sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:19 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:22; a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada colocada em SEQ ID NO:20 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:23; a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada em SEQ ID NO:21 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve colocada em SEQ ID NO:24. Em aspectos adicionais, o anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples, um imunoconjugado, um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, e um anticorpo biespecífico. Em um aspecto preferido, o anticorpo é um imunoconjugado ou um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada para receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC. Em aspectos adicionais da invenção, o fragmento de anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um UniCorpo, um anticorpo de domínio, e um Nanocorpo. Em algumas modalidades, o mimético de anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um Afficorpo, um DARPin, um Anticalin, um Avímero, um Versacorpo, e um Duocalin. Em modalidades adicionais, a composição compreende o anticorpo isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00022] Em algumas modalidades, a presente invenção é uma molécula de ácido nucleico isolada que codifica a cadeia pesada ou leve do anticorpo isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, de anticorpo da invenção, e em aspectos adicionais, podem incluir um vetor de expressão compreendendo tais ácidos nucleicos, e células hospedeiras compreendendo tais vetores de expressão.

[00023] Outra modalidade da presente invenção é um hibridoma que expressa o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, de qualquer um de anticorpos da invenção.

[00024] Outros aspectos da invenção são dirigidos a métodos de produção dos anticorpos da invenção, compreendendo as tapas de: imunização de um animal transgênico compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recuperação de células B de referido animal transgênico; produção de hibridomas de referidas células B; seleção de hibridomas que expressam anticorpos que ligam CADM1; e recuperação de referidos anticorpos que ligam CADM1 de referidos selecionados hibridomas.

[00025] Em outras modalidades, o método de produção de anticorpos anti-CADM1 compreende as etapas de: imunização de um animal transgênico compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recuperação de mRNA a partir das células B de referido animal transgênico; conversão de referido mRNA em cDNA; expressão de referido cDNA em fagos tal que anticorpos anti- CADM1 codificados por referido cDNA são apresentados na superfície de referidos fagos; seleção de fagos que apresentam anticorpos anti- CADM1; recuperação de moléculas de ácido nucleico de referidos selecionados fagos que codificam referidas imunoglobulinas anti- CADM1; expressão de referidas recuperadas moléculas de ácido nucleico em uma célula hospedeira; e recuperação de anticorpos de referida célula hospedeira que liga CADM1.

[00026] Em alguns aspectos da invenção, o anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, se ligam a um epítope no polipeptídeo de CADM1 tendo uma sequência de aminoácido de SEQ ID NOS: 43 ou 44 reconhecido por um anticorpo compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NOS: 19, 20, ou 21 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido colocada em SEQ ID NOS: 22, 23, ou 24.

[00027] Outras características e vantagens da presente invenção serão aparentes a partir da seguinte descrição detalhada e exemplos que não devem ser construídos como limitantes. Os conteúdos de todas as referências, entradas no Banco de Gene, patentes e pedidos de patente publicados citados através de todo este pedido são expressamente aqui incorporados por referência.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00028] A figura 1A mostra uma sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:25) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:19) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano PTA021_A1. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:1), CDR2 (SEQ ID NO:4) e CDR3 (SEQ ID NO:7) são delineadas, e as derivações de linhagem germinativa V, D e J são indicadas.

[00029] A figura 1B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:28) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:22) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano PTA021_A1. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:10), CDR2 (SEQ ID NO:13) e CDR3 (SEQ ID NO:16) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas.

[00030] A figura 2A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:26) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:20) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano PTA021_A2. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:2), CDR2 (SEQ ID NO:5) e CDR3 (SEQ ID NO:8) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas.

[00031] A figura 2B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:29) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:23) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano PTA021_A2. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:11), CDR2 (SEQ ID NO:14) e CDR3 (SEQ ID NO:17) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas.

[00032] A figura 3A mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:27) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:21) da região variável de cadeia pesada do anticorpo monoclonal humano PTA021_A3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:3), CDR2 (SEQ ID NO:6) e CDR3 (SEQ ID NO:9) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V, D e J são indicadas.

[00033] A figura 3B mostra a sequência de nucleotídeo (SEQ ID NO:30) e sequência de aminoácido (SEQ ID NO:24) da região variável de cadeia leve do anticorpo monoclonal humano PTA021_A3. As regiões CDR1 (SEQ ID NO:12), CDR2 (SEQ ID NO:15) e CDR3 (SEQ ID NO:18) são delineadas e as derivações de linhagem germinativa V e J são indicadas.

[00034] A figura 4 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A1 (SEQ ID NO:19) com a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana VH 205 (SEQ ID NO:31) e a sequência de aminoácido de linhagem germinativa JH JH5b (SEQ ID NO:37).

[00035] A figura 5 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A2 (SEQ ID NO:20) com as sequências de aminoácido de linhagem germinativa humana VH 2-05 (SEQ ID NO:32) e a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana JH 5b (SEQ ID NO:38).

[00036] A figura 6 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A3 (SEQ ID NO:21) com as sequências de aminoácido de linhagem germinativa humana VH 2-05 (SEQ ID NO:33) e a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana JH 5b (SEQ ID NO:39).

[00037] A figura 7 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A1 (SEQ ID NO:22) com a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana VK L15 (SEQ ID NO:34) e a sequência de aminoácido de linhagem germinativa humana JK 4 (SEQ ID NO:40).

[00038] A figura 8 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A2 (SEQ ID NO:23) com a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana Vk L15 (SEQ ID NO:35) e a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana JK 4 (SEQ ID NO:41).

[00039] A figura 9 mostra o alinhamento da sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A3 (SEQ ID NO:24) com a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana Vk L15 (SEQ ID NO:36) e a sequência de aminoácido da linhagem germinativa humana JK 4 (SEQ ID NO:42).

[00040] A figura 10 mostra os resultados de análise de FACS em PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3 em células de câncer de pulmão de célula pequena NCI-H69.

[00041] As figuras 11A e 11B mostram os resultados de análise FACS em PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3 em células de câncer de pulmão de célula pequena NCI-H69 e DMS79 respectivamente.

[00042] A figura 12 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 em células de câncer ovariano SKOV3.

[00043] A figura 13 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 em células de câncer de pulmão de célula não pequena A549.

[00044] A figura 14 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 em células de carcinoma de célula renal 786-O e células de melanoma SkMel28.

[00045] A figura 15 mostra os resultados de análise FACS em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3 (nf) em células de câncer de pulmão de célula pequena NCI-H69 e DMS79.

[00046] As figuras 16A e 16B mostram citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) mediada por PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 com as linhas de célula DMS79 e NC1-H69, respectivamente.

[00047] As figuras 17A e 17B mostram os resultados de ensaios Hum-ZAP em PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 em células DMS79 e NCI-H69, respectivamente.

[00048] A figura 18 apresenta um gráfico mostrando o efeito de tratamento usando anticorpos PTA021_A3 fucosilatados ou não- fucosilatados em tamanho de tumor HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

[00049] A figura 19 apresenta um gráfico mostrando o efeito de tratamento com um conjugado M PTA021_A3-Fórmula em tamanho de tumor HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

[00050] A figura 20A apresenta um gráfico mostrando o efeito de tratamento com dosagens de 0,3 umol/kg de um conjugado M de PTA021_A3-Fórmula em tamanho de tumor DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo. A figura 20B apresenta um gráfico mostrando o efeito de tratamento com dosagens de 0,1 e 0,03 umol/kg de um conjugado M de PTA021_A3-Fórmula em tamanho de tumor de DMS79 em modelo de xenoenxerto de camundongo. O estudo se completou no dia 60.

[00051] As figuras 21, 22 e 23 apresentam gráficos mostrando atividade de ADCC de PTA021_A3 e PTA021_A3 não fucosilatado em HepG2, células de 786-O e DMS79, respectivamente.

[00052] A figura 24 apresenta um gráfico mostrando o efeito de tratamento com anticorpo PTA021_A3 sozinho ou em combinação com cisplatina no tamanho de tumor de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo.

[00053] As figuras 25A e 25B mostram os dados de Peso de Corpo para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de citotoxicidade exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00054] As figuras 26A e 26B mostram os dados de Glicose para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00055] As figuras 27A e 27B mostram os dados de Alanina Transaminase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e uma versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00056] As figuras 28A e 28B mostram dados de Aspartato Transaminase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão nãofucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00057] As figuras 29A e 29B mostram os dados de Fosfatase Alcalina para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00058] As figuras 30A e 30B mostram os dados de Lactato Desidrogenase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00059] As figuras 31A e 31B mostram os dados de RBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

[00060] As figuras 32A e 32B mostram os dados de WBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente em um estudo de toxicologia exploratória em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus.

Descrição Detalhada da Invenção

[00061] A presente invenção se refere a anticorpos monoclonais isolados, particularmente anticorpos monoclonais humanos, mais particularmente imunoconjugados e anticorpos projetados resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, que se liga especificamente a CADM1 com alta afinidade. Em certas modalidades, os anticorpos da invenção são derivados de sequências de linhagem germinativa de cadeia pesada e leve particulares e/ou compreendem características particulares tais como regiões CDR compreendendo sequências de aminoácidos particulares. A invenção proporciona anticorpos isolados, anticorpos projetados resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, imunoconjugados, moléculas biespecíficas, affibodies, anticorpos de domínio, nanocorpos, e unicorpos, métodos de produção de referidas moléculas, e composições farmacêuticas compreendendo referidas moléculas e um veículo farmacêutico. A invenção também se refere a métodos de uso das moléculas, tal como para detectar CADM1, bem como para tratar doenças associadas com expressão de CADM1, tal como CADM1 expresso em tumores, incluindo aqueles tumores de câncer de pulmão de célula pequena, e câncer pancreático neuroendócrino, carcinoides de pulmão, e carcinoides gastrintestinal.

[00062] De modo que a presente invenção possa ser mais prontamente compreendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são colocadas através de toda a descrição detalhada.

[00063] Os termos "CADM1", "IGSF4", "superfamília de imunoglobulina, membro 4D", "molécula de adesão de célula 1", "supressor de tumor em câncer de pulmão 1", "TSLC1", "BL2", "ST17", "molécula de adesão de célula sináptica", "syncam 1", "proteína 2 similar à nectin" e "NECL2", são permutavelmente usados, e incluem variantes, isoformas e espécies homólogas de CADM1 humano, incluindo isoforma 1 de CADM1 1 (Acesso no Banco de Genes N° NM_014333), e 2 (Acesso no Banco de Genes N° NM_001098517). As duas isoformas foram também identificadas como OGTA025a e OGTA025b no Pedido PCT (OBT Docket No.:OGL-P121PCT), que é aqui incorporado por referência em sua totalidade. Os anticorpos humanos desta descrevedescrição podem, em certos casos, reagirem por cruzamento com CADM1 de espécies outras do que humanas. Em certas modalidades, os anticorpos podem ser completamente específicos para um ou mais CADM1 humano, e não podem exibir espécies ou outros tipos de reatividade cruzada não humana. A sequência de aminoácido completa de um CADM1 humano exemplar tem Acesso no Banco de Genes número NM_014333.

[00064] O termo "resposta imune" se refere à ação de, por exemplo, linfócitos, células de apresentação de antígeno, células fagocíticas, granulócitos, e macromoléculas solúveis produzidas pelas células acima ou pelo fígado (incluindo anticorpos, citoquinas, e complemento) que resultam em dano seletivo a, destruição de, ou eliminação a partir do corpo humano de patogenias de invasão, células ou tecidos infectados com patogenias, células cancerosas, ou, em casos de autoimunidade ou inflamação patológica, células humanas normais ou tecidos.

[00065] Uma "trajetória de transdução de sinal" se refere ao relacionamento bioquímico entre várias de moléculas de transdução de sinal que desempenham um papel na transmissão de um sinal de uma porção de uma célula para outra porção de uma célula. Conforme aqui usado, a frase "receptor de superfície de célula" inclui, por exemplo, moléculas e complexos de moléculas capazes de receberem um sinal e a transmissão de tal sinal através da membrana de plasma de uma célula. Um exemplo de um "receptor de superfície de célula" da presente invenção é o receptor CADM1.

[00066] O termo "anticorpo" conforme aqui referido inclui anticorpos totais e qualquer fragmento de ligação de antígeno (isto é, "porção de ligação de antígeno") ou cadeias simples destes. Um "anticorpo" se refere a uma glicoproteína que pode compreender pelo menos duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interligadas por pontes de dissulfeto, ou uma porção de ligação de antígeno destas. Cada cadeia pesada é compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como VH) e uma região de cadeia pesada constante. A região constante de cadeia pesada é compreendida de três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como VL ou VK) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL. As regiões VH e VL/VK podem ser subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), interespersas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL/VK é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas de amino-terminal para carboxi-terminal na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regiões variáveis das cadeias pesadas e cadeias leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a ligação da imunoglobulina a tecidos hospedeiros ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetuadoras) e o primeiro componente (Clq) do sistema de complemento clássico.

[00067] O termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porção de anticorpo"), conforme aqui usado, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a capacidade de se ligar a especificamente um antígeno (por exemplo, CADM1). Mostrou- se que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistindo nos domínios VL/VK, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentos Fab articulados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fab’, que é essencialmente um Fab com parte da região de articulação (vide, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul ed., 3.sup.rd ed. 1993); (iv) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (v) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo, (vi) a fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), que consiste em um domínio VH; (vii) uma regiões de determinação de complementaridade isolada (CDR); e (viii) um nanocorpo, uma região variável de cadeia pesada contendo um domínio variável simples e dois domínios constantes. Além disso, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL/VK e VH, são codificados por genes separados, eles podem ser unidos, usando-se métodos recombinantes, por um ligante sintético que capacita que os mesmos sejam produzidos como cadeia de proteína simples em que o par de regiões VL/VK e VH forma moléculas monovalentes (conhecidas como cadeia simples Fv (scFv); vide, por exemplo, Bird et al., (1988) Science 242:423-426; and Huston et al., (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia simples são também pretendidos para serem envolvidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo são obtidos usando-se técnicas convencionais conhecidas àqueles técnicos no assunto, e os fragmentos são classificados para utilidade na mesma maneira como são anticorpos intactos.

[00068] Um "anticorpo isolado," conforme aqui usado, é pretendido se referir a um anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos tendo especificidades antigênicas diferentes (por exemplo, um anticorpo isolado que liga especificamente CADM1 é substancialmente livre de anticorpos que liga especificamente antígenos outros do que CADM1). Um anticorpo isolado que liga especificamente CADM1 pode, contudo, ter reatividade cruzada a outros antígenos, tais como moléculas de CADM1 de outras espécies. Além disso, um anticorpo isolado pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou químicos.

[00069] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", conforme aqui usados, se referem a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular simples. Uma composição de anticorpo monoclonal descreve uma especificidade de ligação simples e afinidade para um epítope particular.

[00070] O termo "anticorpo humano," conforme aqui usado, é pretendido para incluir anticorpos tendo regiões variáveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Além disso, se o anticorpo contém uma região constante, a região constante também é derivada de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica de local in vitro ou por mutação somática in vivo). Contudo, o termo "anticorpo humano," conforme aqui usado, não é pretendido para incluir anticorpos em que sequências de CDR derivadas a partir da linhagem germinativa de outras espécies mamíferas, tal como um camundongo, foram enxertadas nas sequências de estrutura humanas.

[00071] O termo "anticorpo monoclonal humano" se refere a anticorpos que descrevem uma especificidade de ligação simples que tem regiões variáveis nas quais ambas as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em uma modalidade, os anticorpos monoclonais humanos são produzidos por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não transgênico humano, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

[00072] O termo "anticorpo humano recombinante", conforme aqui usado, inclui todos os anticorpos humanos que são preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como (a) anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que é transgênico ou transcromossomal para genes de imunoglobulina humana, ou um hibridoma preparado dos mesmos (descritos adicionalmente abaixo), (b) anticorpos isolados de uma célula hospedeira transformada para expressar o anticorpo humano, por exemplo, de um transfectoma, (c) anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano combinatorial recombinante, e (d) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por quaisquer outros meios que envolvem união de sequências de gene de imunoglobulina humana a outras sequências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis nas quais as regiões de estrutura e CDR são derivadas de sequências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em certas modalidades, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes podem ser individualizados para mutagênese in vitro (ou, quando um transgênico de animal para sequência de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e, desse modo, as sequências de aminoácido das regiões VH e VL/VK dos anticorpos recombinantes são sequências que, enquanto derivadas de e relacionadas a sequências de linhagem germinativa humana VH e VL/VK, não podem existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa humana de anticorpo in vivo.

[00073] Conforme aqui usado, "isotipo" se refere a uma classe de anticorpo (por exemplo, IgM ou IgGl) que é codificado pelos genes de região constante de cadeia pesada.

[00074] As frases "um anticorpo reconhecendo um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são usadas permutavelmente aqui com o termo "um anticorpo que se liga especificamente a um antígeno."

[00075] O termo "derivados de anticorpo humano" se refere a qualquer forma modificada do anticorpo humano, por exemplo, um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

[00076] O termo "anticorpo humanizado" é pretendido para se referir a anticorpos em que sequências de CDR derivadas a partir da linhagem germinativa de outras espécies mamíferas, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humanas. Modificações de região de estrutura adicionais podem ser feitas dentro das sequências de estrutura humanas.

[00077] O termo "anticorpo quimérico" é pretendido para se referir a anticorpos em que as sequências de região variável são derivadas de uma espécie e as sequências de região constante são derivadas de outra espécie, tal como um anticorpo no qual as sequências de região variável são derivadas de um anticorpo de camundongo e as sequências de região constante são derivadas de um anticorpo humano.

[00078] Conforme aqui usado, um anticorpo que "especificamente se liga a CADM1 humano" é pretendido para se referir a um anticorpo que se liga a CADM1 humano com um EC50 de 50 Nm ou menos, 10 Nm ou menos, ou mais preferivelmente 1 Nm ou menos.

[00079] O termo "não se liga substancialmente" a uma proteína ou células, conforme aqui usado, significa não se liga a ou não se liga com uma alta afinidade à proteína ou células, isto é, se liga a proteína ou células com uma KD de 1 x 10-6 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 105 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-4 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-3 M ou mais, ainda mais preferivelmente 1 x 10-2 M ou mais.

[00080] O termo "EC50", conforme aqui usado, é pretendido para se referir a potência de um composto por quantificação da concentração que conduz a 50% de resposta máxima/efeito.

[00081] O termo "Kassoc" ou "Ka", conforme aqui usado, é pretendido para se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo- antígeno particular, pelo que o termo "Kdis" ou "Kd", conforme aqui usado, é pretendido para se referir à taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. O termo "KD", conforme aqui usado, é pretendido para se referir à constante dissociação, que é obtida a partir da proporção de Kd para Ka (isto é, Kd/Ka) e é expressa como uma concentração molar (M). Os valores KD para anticorpos podem ser determinados usando-se métodos bem estabelecidos na técnica. Um método preferido para determinação da KD de um anticorpo é pelo uso de ressonância de plasmon de superfície, preferivelmente usando-se um sistema de biosensor tal como um sistema Biacore®.

[00082] Conforme aqui usado, o termo "alta afinidade" para um anticorpo IgG se refere a um anticorpo tendo uma KD de 1 x 10-7 M ou menos, mais preferivelmente 5 x 10-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 1x10-8 M ou menos, ainda mais preferivelmente 5 x 109 M ou menos, e ainda mais preferivelmente 1 x 10-9 M ou menos, para um antígeno alvo. Contudo, a ligação de "alta afinidade" pode variar para outros isotipos de anticorpo. Por exemplo, ligação de "alta afinidade" para um isotipo IgM se refere a um anticorpo tendo uma KD de 10-6 M ou menos, mais preferivelmente 10-7 M ou menos, ainda mais preferivelmente 10-8 M ou menos.

[00083] O termo "epítope" ou "determinante antigênico" se refere a um local em um antígeno ao qual uma imunoglobulina ou anticorpo se ligam especificamente. Os epítopes podem ser formados ambos de aminoácidos contíguos ou aminoácidos não contíguos justapostos por desdobramento terciário de uma proteína. Os epítopes formados de aminoácidos contíguos são tipicamente retidos na exposição a solventes de desnaturação, pelo que os epítopes formados por desdobramento terciário são tipicamente perdidos no tratamento com solventes de desnaturação. Um epítope tipicamente inclui pelo menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Métodos de determinação de conformação espacial de epítopes incluem técnicas na técnica e aqueles aqui descritos, por exemplo, cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional (vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)).

[00084] Consequentemente, também envolvidos pela presente invenção estão anticorpos que se ligam a (isto é, reconhecem) o mesmo epítope como os anticorpos descritos aqui (isto é, PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3). Os anticorpos que se ligam ao mesmo epítope podem ser identificados por sua capacidade de competir cruzado com (isto é, competitivamente inibir ligação de) um anticorpo de referência a um antígeno alvo em uma maneira estatisticamente significante. A inibição competitiva pode ocorrer, por exemplo, se os anticorpos se ligam a epítopes idênticos ou estruturalmente similares (por exemplo, epítopes de sobreposição), ou epítopes espacialmente próximos que, quando ligados, causam impedimento estérico entre os anticorpos.

[00085] A inibição competitiva pode ser determinada usando-se ensaios de rotina em que a imunoglobulina sob teste inibe ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum. Numerosos tipos de ensaios de ligação competitivos são conhecidos, por exemplo: radioimunoensaio direto ou indireto de fase sólida (RIA), imunoensaio de enzima direto ou indireto de fase sólida (EIA), ensaio de competição intercalado (vide, Stahli et al., Methods in Enzymology 9:242 (1983)); biotin-avidin EIA de fase direta sólido (vide, Kirkland et al., J. Immunol. 137:3614 (1986)); ensaio etiquetado de fase sólida, ensaio intercalado etiquetado direto de fase sólida (vide, Harlow e Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)); RIA de etiqueta direto de fase sólida usando etiqueta I-125 (vide, Morel et al., Mol. Immunol. 25(1):7 (1988)); biotin-avidin EIA direto de fase sólida (Cheung et al., Virology 176:546 (1990)); e RIA etiquetado direto. (Moldenhauer et al., Scand. J. Immunol. 32:77 (1990)). Tipicamente, tal ensaio envolve o uso de antígeno purificado ligado a uma superfície sólida ou células que suportam qualquer destes, uma imunoglobulina de teste não etiquetada e uma imunoglobulina de referência etiquetada. A inibição competitiva é medida por determinação da quantidade de etiqueta ligada a superfície sólida ou células na presença da imunoglobulina de teste. Usualmente a imunoglobulina de teste está presente em excesso. Usualmente, quando um anticorpo de competição está presente em excesso, ele inibirá ligação específica de um anticorpo de referência a um antígeno comum por pelo menos 50-55%, 55-60%, 60-65%, 65-70% 70-75%, ou mais.

[00086] Outras técnicas incluem, por exemplo, métodos de mapeamento de epítope, tal como análise de raios X de cristais de complexos antígeno: anticorpo, que proporcionam resolução atômica do epítope. Outros métodos monitoram a ligação do anticorpo a fragmentos de antígeno ou variações mutadas do antígeno onde perda de ligação devido a uma modificação de um resíduo de aminoácido dentro da sequência de antígeno é frequentemente considerada uma indicação de um componente de epítope. Em adição, métodos combinatoriais computacionais para mapeamento de epítope podem também ser usados. Estes métodos contam com a capacidade dos anticorpo de interesse em isolar peptídeos curtos específicos de afinidade de bibliotecas de peptídeo de mostrador de fago combinatoriais. Os peptídeos, são em seguida, relacionados como condutores para a definição do epítope correspondente ao anticorpo usado para classificar a biblioteca de peptídeo. Para mapeamento do epítope, algoritmos computacionais foram também desenvolvidos que foram mostrados mapear epítopes descontínuos conformacionais.

[00087] Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" inclui qualquer animal humano ou não humano. O termo "animal não humano" inclui todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cães, gatos, cavalos, vaca, galinhas, anfíbios, répteis, etc.

[00088] Vários aspectos da invenção são descritos em detalhes adicionais nas seguintes subseções.

Anticorpos anti-CADM1

[00089] Os anticorpos da invenção são caracterizados por características funcionais particulares ou propriedades dos anticorpos. Por exemplo, os anticorpos se ligam especificamente a CADM1 humano. Preferivelmente, um anticorpo da invenção se liga a CADM1 com alta afinidade, por exemplo, com uma KD de 8 x 10-7 M ou menos, ainda mais tipicamente 1 x 10-8 M ou menos. Os anticorpos anti-CADM1 da invenção preferivelmente exibem uma ou mais das seguintes características: se liga a CADM1 humano com um EC50 de 50 Nm ou menos, 10 Nm ou menos, ou, mais preferivelmente, 1 Nm ou menos; se ligam a células humanas que expressam CADM1.

[00090] Em uma modalidade, os anticorpos preferivelmente se ligam a um epítope antigênico presente no CADM1, cujo epítope não está presente em outras proteínas. Os anticorpos tipicamente se ligam a CADM1, mas não se ligam a outras proteínas, ou se ligam a proteínas com uma baixa afinidade, tal como uma KD de 1 x 10-6 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-5 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-4 M ou mais, mais preferivelmente 1 x 10-3 M ou mais, ainda mais preferivelmente 1 x 10-2 M ou mais. Preferivelmente, os anticorpos não se ligam às proteínas relacionadas, por exemplo, os anticorpos não se ligam substancialmente a ICAMs, VCAMs, ou outras moléculas de adesão de célula. Em uma modalidade, o anticorpo pode ser internalizado em uma célula que expressa CADM1. Ensaios padrões para avaliar internalização de anticorpo são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, em ensaio de internalização HumZap.

[00091] Ensaios padrões para avaliar a capacidade de ligação dos anticorpos para CADM1 são conhecidos na técnica, incluindo, por exemplo, ELISAs, manchas de Western, RIAs, e análise de citometria de fluxo. Ensaios adequados são descritos em detalhes nos Exemplos. As cinéticas de ligação (por exemplo, afinidade de ligação) dos anticorpos também podem ser avaliados por ensaios padrões conhecidos na técnica, tal como por análise de sistema Biacore®. Para avaliar a ligação a células de tumor de célula B de Raji ou Daudi, Raji (ATCC Depósito N° CCL-86) ou Daudi (ATCC Depósito N° CCL-213), as células podem ser obtidas de fontes publicamente disponíveis, tais como a American Type Culture Collection, e usados em ensaios padrões, tais como análise citométrica de fluxo.

Anticorpos Monoclonais PTA021A1, PTA021A2, PTA021A3

[00092] Anticorpos preferidos da invenção são os anticorpos monoclonais humanos PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3, isolados e estruturalmente caracterizados conforme descrito nos Exemplos 1, 2, e 3. As sequências de aminoácidos VH de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:19, 20, e 21, respectivamente. As sequências de aminoácidos VK de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:22, 23, e 24, respectivamente.

[00093] Dado que cada um destes anticorpos podem se ligar a CADM1, as sequências VH e VK podem ser "misturadas e combinadas" para criar outras moléculas de ligação de anti-CADM1 da invenção. A ligação de CADM1 de tais anticorpos "misturados e combinados" pode ser testada usando os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs). Preferivelmente, quando as cadeias VH e VK são misturadas ecombinadas, uma sequência VH de um emparelhamento de VH/VK particular é substituída com uma sequência VH estruturalmente similar. Do mesmo modo, preferivelmente uma sequência VL de um emparelhamento VH/VK particular é substituída com uma sequência VK estruturalmente similar.

[00094] Consequentemente, em um aspecto, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste compreendendo: uma região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:19, 20, e 21; e uma região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22, 23, e 24; no qual o anticorpo se liga especificamente a CADM1, preferivelmente CADM1 humano.

[00095] Combinações preferidas de cadeia pesada e leve incluem: uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:19 e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:22; ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:20; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:23, ou uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:21; e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO:24.

[00096] Em outro aspecto, a invenção proporciona anticorpos que compreendem a cadeia pesada e cadeia leve de CDR1s, CDR2s e CDR3s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3, ou combinações destes. As sequências de aminoácido das VH CDR1s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 1, 2, e 3. As sequências de aminoácido das VH CDR2s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 4, 5, e 6. As sequências de aminoácido das VH CDR3s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:7, 8, e 9. As sequências de aminoácido das VK CDR1s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:10, 11, e 12. As sequências de aminoácido das VK CDR2s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:13, 14, e 15. As sequências de aminoácidos das VK CDR3s de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs:16, 17, e 18. As regiões CDR são delineadas usando-se o sistema Kabat (Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91-3242).

[00097] Dado que cada um destes anticorpos pode se ligar a CADM1 e que especificidade de ligação de antígeno é provida principalmente pelas regiões CDR1, CDR2, e CDR3, as sequências VH CDR1, CDR2, e CDR3 e sequências VK CDR1, CDR2, e CDR3 podem ser "misturadas e combinadas" (isto é, CDRs de anticorpos diferentes podem ser misturadas e combinadas, embora cada anticorpo deve conter uma VH CDR1, CDR2, e CDR3 e uma VK CDR1, CDR2, e CDR3) para criar outras moléculas de ligação de anti-CADM1 da invenção. A ligação de CADM1 de tais anticorpos "misturados e equiparados" pode ser testado usando-se os ensaios de ligação descritos acima e nos Exemplos (por exemplo, ELISAs, análise de Biacore®). Preferivelmente, quando sequências VH CDR são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência de uma sequência VH particular é substituída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar. Do mesmo modo, quando sequências VK CDR são misturadas e combinadas, a sequência CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de uma sequência Vk particular preferivelmente é substituída com uma sequência(s) de CDR estruturalmente similar. Será prontamente aparente ao técnico no assunto que novas sequências VH e VK podem ser criadas por substituição de uma ou mais sequências de região CDR VH e/ou VL/VK com sequências estruturalmente similares a partir das sequências de CDR aqui descritas para anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3.

[00098] Consequentemente, em outros aspectos, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste compreendendo: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:4, 5, e 6; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:7, 8, e 9; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:13, 14, e 15; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:16, 17, e 18; no qual o anticorpo especificamente se liga a CADM1, preferivelmente CADM1 humano.

[00099] Em uma modalidade preferida, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO:1; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 4; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 7; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 10; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 13; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 16.

[000100] Em outra modalidade preferida, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 2; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 5; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 11; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 14; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 17.

[000101] Em outra modalidade preferida, o anticorpo compreende: uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO: 3; uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:6; uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO:9; uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:12; uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO: 15; e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18.

[000102] É bem conhecido na técnica que o domínio de CDR3, independentemente do(s) domínio(s) de CDR1 e/ou CDR2, sozinho pode determinar a especificidade de ligação de um anticorpo para um antígeno cognato e que anticorpos múltiplos podem prognosticavelmente ser gerados tendo a mesma especificidade de ligação baseada em uma sequência de CDR3 comum. Ver, por exemplo, Klimka et al., British J. of Cancer 83(2):252-260 (2000) (descrevendo a produção de um anticorpo anti-CD30 humanizado usando-se somente o CDR3 de domínio variável de cadeia pesada de anticorpo de murino anti-CD30 Ki-4); Beiboer et al., J. Mol. Biol. 296:833-849 (2000) (descrevendo anticorpos de glicoproteína-2 epitelial recombinante (EGP-2) usando-se somente a sequência de CDR3 de cadeia pesada do anticorpo MOC-31 anti-EGP-2 de murino parental); Rader et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95:8910-8915 (1998) (descrevendo um painel de anticorpos humanizados anti-integrin αvβ3 usando-se um domínio de CDR3 variável de cadeia pesada e leve de um anticorpo de murino anti-integrin αvβ3 LM609 no qual cada anticorpo membro compreende uma sequência distinta fora do domínio de CDR3 e capaz de ligar o mesmo epítope como o anticorpo de murino de origem com afinidades tão alta ou mais alta do que o anticorpo de murino de origem); Barbas et al., J. Am. Chem. Soc. 116:2161-2162 (1994) (descrevendo que o domínio de CDR3 proporciona a contribuição mais significante para ligação de antígeno); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:2529-2533 (1995) (descrevendo o enxerto de sequência de CDR3 de cadeia pesada CDR3 de três Fabs (SI-1, SI-40, e SI-32) contra DNA placental humano na cadeia pesada de um Fab toxoide antitétano substituindo, desse modo, a CDR3 de cadeia pesada existente e demonstrando que o domínio de CDR3 sozinho confere especificidade de ligação); e Ditzel et al., J. Immunol. 157:739-749 (1996) (descrevendo estudos de enxerto no qual transferência de somente a CDR3 de cadeia pesada de um Fab LNA3 poliespecífico de origem a uma cadeia pesada de um Fab p313 de ligação toxoide de tétano Ig monoespecífico foi suficiente para reter especificidade de ligação do Fab de origem). Cada uma estas referências é, desse modo, incorporada por referência em sua totalidade.

[000103] Consequentemente, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo derivado de um animal humano ou não humano, no qual o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente ao CADM1. Dentro de certos aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano, tal como um anticorpo de camundongo ou de rato, no qual o anticorpo monoclonal é capaz de se ligar especificamente a CADM1. Dentro de algumas modalidades, tais anticorpos da invenção compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo não humano (a) são capazes de competir a ligação com; (b) reter as características funcionais; (c) se ligar ao mesmo epítope; e/ou (d) ter uma afinidade de ligação similar como o anticorpo não humano correspondente de origem.

[000104] Dentro de outros aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não humano, no qual o anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente a CADM1. Dentro de outros aspectos, a presente invenção proporciona anticorpos monoclonais compreendendo um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve de um primeiro anticorpo humano, tal como, por exemplo, um anticorpo humano obtido de um animal não humano, no qual o primeiro anticorpo humano é capaz de se ligar especificamente a CADM1, e no qual o domínio de CDR3 a partir do primeiro anticorpo humano substitui um domínio de CDR3 em um anticorpo humano que está carecendo de especificidade de ligação para CADM1 para gerar um segundo anticorpo humano que é capaz de se ligar especificamente a CADM1. Dentro de algumas modalidades, tais anticorpos da invenção compreendem um ou mais domínios de CDR3 de cadeia pesada e/ou leve a partir do primeiro anticorpo humano (a) são capazes de competirem ligação com; (b) reterem as características funcionais; (c) se ligarem ao mesmo epítope; e/ou (d) terem uma afinidade de ligação similar como o primeiro anticorpo humano de origem correspondente. Em modalidades preferidas, o primeiro anticorpo humano é PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3.

Anticorpos Tendo Sequências de Linha de germe Particulares

[000105] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada de um gene de imunoglobulina de cadeia pesada de linhagem germinativa particular e/ou uma região variável de cadeia leve de um gene de imunoglobulina de cadeia leve de linhagem germinativa particular.

[000106] Por exemplo, em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene humano VH 2-05, no qual o anticorpo especificamente se liga a CADM1. Em ainda outra modalidade preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene humano VK L15, no qual o anticorpo se liga especificamente a CADM1. Em ainda outra modalidade preferida, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, no qual o anticorpo: compreende uma região variável de cadeia pesada que é o produto de ou derivado de um gene humano VH 2-05 (cujos genes codificam as sequências de aminoácido colocadas em SEQ ID NOs: 31, 32, ou 33, respectivamente); compreende uma região variável de cadeia leve que é o produto de ou derivado de um gene humano VK L15 (cujos genes codificam as sequências de aminoácido colocadas em SEQ ID NOs: 34, 35, ou 36, respectivamente); e especificamente se ligam a CADM1, preferivelmente, CADM1 humano. Exemplos de um anticorpo tendo VH e VK de VH 2-05 e VK L15, respectivamente, são PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3.

[000107] Conforme aqui usado, um anticorpo humano compreende regiões variáveis de cadeia pesada ou leve que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de linhagem germinativa particular se as regiões variáveis do anticorpo são obtidas de um sistema que usa genes de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Tais sistemas incluem imunização de genes que transportam camundongo transgênico de imunoglobulina humana com o antígeno de interesse, ou classificação de uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana descrita no fago com o antígeno de interesse. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana, pode ser identificado como tal por comparação da sequência de aminoácido do anticorpo humano com as sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem germinativa humana e seleção da sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana que é mais próxima da sequência (isto é, maior % de identidade) para a sequência do anticorpo humano. Um anticorpo humano que é "o produto de" ou "derivado de" uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinativa humana particular, pode conter diferenças de aminoácido conforme comparadas à sequência de linhagem germinativa, devido a, por exemplo, mutações somáticas que ocorrem naturalmente, ou introdução intencional de mutação direcionada de local. Contudo, um anticorpo humano selecionado tipicamente é pelo menos 90% idêntico nas sequências de aminoácidos a uma sequência de aminoácido codificada por um gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana, e contém resíduos de aminoácido que identificam o anticorpo humano como sendo humano quando comparado às sequências de aminoácido de imunoglobulina de linhagem germinativa humana de outras espécies (por exemplo, sequências de linhagem germinativa de murino). Em certos casos, um anticorpo humano pode ser pelo menos 95%, ou ainda pelo menos 96%, 97%, 98%, ou 99% idêntica na sequência de aminoácido para a sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa. Tipicamente, um anticorpo humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular descreverá não mais do que 10 diferenças de aminoácido a partir da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em tais casos, o anticorpo humano pode descrever não mais do que 5, ou ainda não mais do que 4, 3, 2, ou 1 diferenças de aminoácido a partir da sequência de aminoácido codificada pelo gene de imunoglobulina de linhagem germinativa.

Anticorpos Homólogos

[000108] Em ainda outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende cadeias variáveis de cadeia pesada e leve compreendendo sequências de aminoácido que são homólogas às sequências de aminoácido dos anticorpos preferidos descritos aqui, e no qual os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-CADM1 da invenção.

[000109] Por exemplo, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve, no qual: a região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:19, 20, e 21; a região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido que é pelo menos 80% homóloga a uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:22, 23, e 24; e o anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 de 10 Nm ou menos.

[000110] O anticorpo pode também se ligar à células CHO transfectadas com CADM1 humano.

[000111] Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado ou um anticorpo quimérico.

[000112] Em outras modalidades, as sequências de aminoácido VH e/ou VK podem ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homólogas às sequências colocadas acima. Um anticorpo tendo regiões VH e VK tendo alta (isto é, 80% ou maior) homologia às regiões VH e VK das sequências colocadas acima, pode ser obtido por mutagênese (por exemplo, mutagênese direcionada de local ou mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codificam SEQ ID NOs:25, 26, 27, 28, 29, e 30, seguido pelo teste do anticorpo codificado alterado para função retida usando-se os ensaios funcionais aqui descritos.

[000113] Conforme aqui usado, a porcentagem de homologia entre duas sequências de aminoácido é equivalente a porcentagem de identidade entre as duas sequências. A porcentagem de identidade entre as duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia = # de posições idênticas/total # de posições x 100), levando-se em conta o número de folgas, e o comprimento de cada folga, que necessita ser introduzido para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências pode ser efetuada usando-se um algoritmo matemático, conforme descrito nos exemplos não limitantes abaixo.

[000114] A porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando-se o algoritmo de E. Meyers e W. Miller (Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)) que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando-se uma tabela de resíduo de peso PAM120, uma penalidade de comprimento de folga de 12 e uma penalidade de folga de 4. Em adição, a porcentagem de identidade entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando-se o algoritmo de Needleman e Wunsch (J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)) que foi incorporado no programa FOLGA no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando-se ou uma matriz Blossum 62 ou uma matriz PAM250, e um peso de folga de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ou 4 e um peso de comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6.

[000115] Adicionalmente ou alternativamente, as sequências de proteína da presente invenção podem adicionalmente serem usadas como uma "sequência de indagação" para realizar uma pesquisa em bases de dados públicas para, por exemplo, identificar sequências relacionadas. Tais pesquisas podem ser realizadas usando-se o programa XBLAST (versão 2.0) de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. As pesquisas de proteína BLAST podem ser realizadas com o programa XBLAST, escore = 50, comprimento de palavra = 3 para obter sequências de aminoácido homólogas às moléculas de anticorpo da invenção. Para obter alinhamentos com folga para proposta de comparação, BLAST com folga pode ser utilizado conforme descrito em Altschul et al., (1997) Acids nucleics Res. 25(17):3389- 3402. Quando se utiliza BLAST e programas BLAST Com Folga, os parâmetros de falta dos respectivos programas (por exemplo, XBLAST e NBLAST) podem ser usados. Ver http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Anticorpos com Modificações Conservativas

[000116] Em certas modalidades, um anticorpo da invenção compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2 e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo CDR1, CDR2 e CDR3 sequências, no qual uma ou mais destas sequências de CDR compreendem sequências especificadas de aminoácido baseadas nos anticorpos preferidos aqui descritos (por exemplo, PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3), ou modificações conservativas destes, e no qual os anticorpos retêm as propriedades funcionais desejadas dos anticorpos anti-CADM1 da invenção. Consequentemente, a invenção proporciona um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3, no qual: a sequência de CDR3 de região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:7, 8, e 9, e modificações conservativas destas; a sequência de CDR3 de região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequência de aminoácido de SEQ ID NOs:16, 17, e 18, e modificações conservativas destas; o anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 de 1 nM ou menos.

[000117] O anticorpo pode também se ligar a células CHO transfectadas com CADM1 humano.

[000118] Em uma modalidade preferida, a sequência de CDR2 da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:4, 5, e 6, e modificações conservativas destas; e a sequência de CDR2 da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs:13, 14, e 15, e modificações conservativas destas. Em outra modalidade preferida, a sequência de CDR1 da região variável de cadeia pesada compreende uma sequência de aminoácido selecionado a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:1, 2, e 3, e modificações conservativas destas; e a sequência de CDR1 da região variável de cadeia leve compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em sequências de aminoácido de SEQ ID NOs:10, 11, e 12, e modificações conservativas destas.

[000119] Em várias modalidades, o anticorpo pode ser, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos humanizados, ou anticorpo quiméricos.

[000120] Conforme aqui usado, o termo "modificações de sequência conservativa" é pretendido para se referir a modificações de aminoácido que não afetam significantemente ou alteram as características de ligação do anticorpo contendo a sequência de aminoácido. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e anulações de aminoácido. Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo da invenção por técnicas padrões conhecidas na técnica, tais como mutagênese direcionada de local e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácido conservativas são substituições em que o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral similar. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofan), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina). Desse modo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR de um anticorpo da invenção podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido a partir da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado para função retida usando-se os ensaios funcionais aqui descritos.

[000121] A sequência de CDR1 da cadeia pesada de SEQ ID NO:1, 2, ou 3 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR1 da cadeia leve de SEQ ID NO:10, 11, ou 12 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR2 da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO:4, 5, ou 6 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR2 da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO:13, 14, ou 15 pode compreendem uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; a sequência de CDR3 da cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO:7, 8, ou 9 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido; e/ou a sequência de CDR3 da cadeia leve mostrada em SEQ ID NO:16, 17, ou 18 pode compreender uma ou mais modificações de sequência conservativa, tais como uma, duas, três, quatro, cinco ou mais substituições, adições ou anulações de aminoácido.

Anticorpos que se ligam ao mesmo Epítope como Anticorpos anti- CADM1 da Invenção

[000122] Em outra modalidade, a invenção proporciona anticorpos que se ligam ao mesmo epítope em CADM1 humano como qualquer dos anticorpos monoclonais CADM1 da invenção (isto é, anticorpos que têm a capacidade competir por cruzamento para ligação a CADM1 com quaisquer dos anticorpos monoclonais da invenção). Em modalidades preferidas, o anticorpo de referência para estudos na competição cruzada para ligação pode ser o anticorpo monoclonal PTA021_A1 (tendo sequências de VH e VK conforme mostrado em SEQ ID NOs:19 e 22, respectivamente), o anticorpo monoclonal PTA021_A2 (tendo sequências de VH e VK conforme mostrado em SEQ ID NOs:20 e 23 respectivamente), ou o anticorpo monoclonal PTA021_A3 (tendo sequências de VH e VK conforme mostrado em SEQ ID NOs:21 e 24 respectivamente). Tais anticorpos de competição cruzada podem ser identificados baseados em sua capacidade de competir por cruzamento com PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 em ensaios de ligação padrões de CADM1. Por exemplo, análise de BIAcore, ensaios de ELISA ou citometria de fluxo podem ser usados para demonstrar competição cruzada para ligação com os anticorpos da presente invenção. A capacidade de um anticorpo de teste para inibir a ligação de, por exemplo, PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3, a CADM1 humano demonstra que o anticorpo de teste pode competir com PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 para ligação a CADM1 humano e, desse modo, se liga ao mesmo epítope em CADM1 humano como PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3. Em uma modalidade preferida, o anticorpo que se liga ao mesmo epítope em CADM1 humano como PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 é um anticorpo monoclonal humano. Tais anticorpos monoclonais humanos podem ser preparados e isolados conforme descrito nos Exemplos.

Anticorpos Projetados e Modificados

[000123] Um anticorpo da invenção adicionalmente pode ser preparado usando-se um anticorpo tendo uma mais das sequências de VH e/ou VL aqui descritas pode ser usado como material de partida para projetar um anticorpo modificado, cujo anticorpo modificado pode ter propriedades alteradas conforme comparadas ao anticorpo de partida. Um anticorpo pode ser projetado por modificação de um ou mais aminoácidos dentro de uma ou ambas as regiões variáveis (isto é, VH e/ou VL), por exemplo, dentro de uma ou mais regiões CDR e/ou dentro de uma ou mais regiões de estrutura. Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser projetado por modificação de resíduos dentro de região (ões) constante(s), por exemplo, para alterar a(s) função (ões) efetuadora(s) do anticorpo.

[000124] Em certas modalidades, o enxerto da CDR pode ser usado para projetar regiões variáveis de anticorpos. Os anticorpos interagem com antígenos alvos predominantemente através de resíduos de aminoácido que estão localizados nas seis regiões de determinação de complementaridade de cadeia pesada e leve (CDRs). Por esta razão, as sequências de aminoácido dentro das CDRs são mais diversas entre anticorpos individuais do que sequência fora das CDRs. Devido às sequências de CDR serem responsáveis por muitas das interações anticorpo-antígeno, é possível expressar anticorpos recombinantes que imitam as propriedades de anticorpos específicos que ocorrem naturalmente por construção dos vetores de expressão que incluem sequências de CDR a partir do anticorpo específico que ocorre naturalmente enxertado nas sequências de estrutura de um anticorpo diferente com propriedades diferentes (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al., (1998) Nature 332:323-327; Jones, P. et al., (1986) Nature 321:522-525; Queen, C. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Ver. U.S.A. 86:10029-10033; Patente dos Estados Unidos N° 5.225.539 para Winter, e Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.).

[000125] Consequentemente, outra modalidade da invenção pertence a um anticorpo monoclonal isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3, SEQ ID NOs:4, 5, e 6, e SEQ ID NOs:7, 8, e 9, respectivamente, e uma região variável de cadeia leve compreendendo sequências de CDR1, CDR2, e CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12, SEQ ID NOs:13, 14, e 15, e SEQ ID NOs:16, 17, e 18, respectivamente. Desse modo, tais anticorpos contêm as sequências de CD de VH e VK de anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2 ou PTA021_A3 ainda podem conter sequências de estrutura diferentes destes anticorpos.

[000126] Tais sequências de estrutura podem ser obtidas de bases de dados de DNA públicas ou referências publicadas que incluem sequências de gene de anticorpo de linhagem germinativa. Por exemplo, sequências de DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados de sequência de linhagem germinativa humana "VBase" (disponível na Internet em www.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase), bem como em Kabat, E. A., et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91-3242; Tomlinson, I. M., et al. (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox, J. P. L. et al. (1994) "A Directory of Human Germ-line VH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage" Eur. J. Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada um do qual são expressamente aqui incorporados por referência. Como outro exemplo, as sequências de DNA de linhagem germinativa para genes humanos de região variável de cadeia pesada e leve podem ser encontradas na base de dados do Banco de Genes. Por exemplo, as seguintes sequências de linhagem germinativa de cadeia pesada encontradas no camundongo HCo7 HuMAb são disponíveis nos Acessos no Banco de Genes acompanhantes números: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 3-33 (NG_0010109 e NT_024637) e 3-7 (NG_0010109 e NT_024637). Como outro exemplo, as seguintes sequência de linhagem germinativa de cadeia pesada encontradas no camundongo HCo12 HuMAb são disponíveis no Acesso no Banco de Genes acompanhante números: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 e BC070333), 5-51 (NG_0010109 e NT_024637), 4-34 (NG_0010109 e NT_024637), 3-30.3 (CAJ556644) e 3-23 (AJ406678).

[000127] As sequências de proteína de anticorpo são comparadas com uma base de dados de sequência de proteína compilada usando- se um dos métodos de pesquisa de similaridade de sequência denominados o Gapped BLAST (Altschul et al., (1997) Nucleics Acids Research 25:3389-3402), que é bem conhecido àqueles técnicos no assunto. BLAST é um algoritmo heurístico em que um alinhamento estatisticamente significante entre a sequência de anticorpo e a sequência de base de dados é do mesmo modo para conter pares de segmento de alto escore (HSP) de palavras alinhadas. Os pares de segmento cujos escores não podem ser aperfeiçoados por extensão ou arranjo são denominados um golpe. Brevemente, as sequências de nucleotídeo de origem VBASE (http://vbase.mrc- cpe.cam.ac.uk/vbase1/list2.php) são transladadas e a região entre e incluindo região de estrutura de FR1 a FR3 é retida. As sequências de base de dados têm um comprimento médio de 98 resíduos. As sequências duplicatas que são equiparações exatas sobre o comprimento total da proteína são removidas. Uma pesquisa de BLAST para proteínas usando-se o programa blastp com falta, parâmetros padrões, exceto o filtro de baixa complexidade, que é terminada, e a matriz de substituição de BLOSUM62, filtros para 5 golpes de topo produzindo equiparações de sequência. As sequências de nucleotídeo são transladadas em todas as seis estruturas e a estrutura com nenhum códon de parada no segmento de equiparação da sequência de base de dados é considerada o golpe potencial. Isto é, por sua vez, confirmado usando-se o programa BLAST tblastx, que translada a sequência de anticorpo em todas as seis estruturas e compara aquelas translações à sequência de VBASE de nucleotídeos dinamicamente transladada em todas as seis estruturas.

[000128] As identidades são combinações exatas de aminoácido entre a sequência de anticorpo e a base de dados de proteína sobre o comprimento total da sequência. As (identidades + equiparação de substituição) positivas não são idênticas, mas substituições de aminoácido guiadas pela matriz de substituição BLOSUM62. Se a sequência de anticorpo combina duas das sequências de base de dados com mesma identidade, o golpe com mais positivos seria decidido para ser o golpe de sequência de combinação.

[000129] As sequências de estrutura preferidas para uso nos anticorpos da invenção são aquelas que são estruturalmente similares às sequências de estrutura usadas por anticorpos selecionados da invenção, por exemplo, similares às sequências de estrutura de VH 2-05 (SEQ ID NO:31) e/ou as sequências de estrutura de VK L15 (SEQ ID NO:34) usadas por anticorpos monoclonais preferidos da invenção. As sequências de VH CDR1, CDR2, e CDR3, e as sequências de VK CDR1, CDR2, e CDR3 podem ser enxertadas nas regiões de estrutura que têm a sequência idêntica conforme aquelas encontradas no gene de imunoglobulina de linhagem germinativa do qual a sequência de estrutura deriva, ou as sequências de CDR podem ser enxertadas em regiões de estrutura que contém uma ou mais mutações conforme comparadas às sequências de linhagem germinativa. Por exemplo, verificou-se que em certos exemplos é benéfico mudar os resíduos dentro das regiões de estrutura para manter ou intensificar a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al).

[000130] Outro tipo de modificação de região variável é mudar resíduos de aminoácido dentro das regiões de VH e/ou VK CDR1, CDR2 e/ou CDR3 para, desse modo, aperfeiçoar uma ou mais propriedades de ligação (por exemplo, afinidade) do anticorpo de interesse. A mutagênese direcionada de local ou mutagênese mediada por PCR pode ser realizada para introduzir a(s) mutação (ões) e o efeito na ligação de anticorpo, ou outras propriedades funcional de interesse, pode ser avaliada em ensaios in vitro ou in vivo conforme aqui descrito e provido nos Exemplos. Preferivelmente modificações conservativas (conforme discutidas acima) são introduzidas. As mutações podem ser substituições, adições ou anulações de aminoácidos, nas são preferivelmente substituições. Além disso, tipicamente não mais do que um, dois, três, quatro ou cinco resíduos dentro de uma região CDR são alterados.

[000131] Consequentemente, em outra modalidade, a presente descrição proporciona anticorpo anti-CADM1 isolado monoclonais, ou porções de ligação de antígeno deste, compreendendo uma região variável de cadeia pesada compreendendo: (a) uma região de VH CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácido conforme comparada a SEQ ID NOs:1, 2, e 3; (b) uma região de VH CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:4, 5, e 6, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácido conforme comparado a SEQ ID NOs:4, 5, e 6; (c) uma região de VH CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:7, 8, e 9, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições de aminoácido, anulações ou adições conforme comparada a SEQ ID NOs:7, 8, e 9; (d) uma região de VK CDR1 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácidos conforme comparada a SEQ ID NOs:10, 11, e 12; (e) uma região de VK CDR2 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:13, 14, e 15, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácidos conforme comparada a SEQ ID NOs:13, 14, e 15; e (f) uma região de VK CDR3 compreendendo uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:16, 17, e 18, ou uma sequência de aminoácido tendo uma, duas, três, quatro ou cinco substituições, adições ou anulações de aminoácidos conforme comparada a SEQ ID NOs:16, 17, e 18.

[000132] Os anticorpos projetados da invenção incluem aqueles em que modificações foram feitas nos resíduos de estrutura dentro de VH e/ou VK, por exemplo, para aperfeiçoar as propriedades do anticorpo. Tipicamente tais modificações de estrutura são feitas para diminuir a imunogenicidade do anticorpo. Por exemplo, uma aproximação é "retromutada" um ou mais resíduos de estrutura à sequência de linhagem germinativa correspondente. Mais especificamente, um anticorpo que tem suportado mutação somática pode conter resíduos estruturais que diferem da sequência de linhagem germinativa da qual o anticorpo é derivado. Tais resíduos podem ser identificados por comparação das sequências de anticorpo de estrutura às sequências de linhagem germinativa para qual o anticorpo é derivado. Por exemplo, para PTA021_A1, usando-se o sistema de numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido #30 (dentro de FR3) de VH é uma asparagina (SEQ ID NO:19) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma serina (SEQ ID NO:31). Para retornar as sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, as mutações somáticas podem ser "retromutadas" à sequência de linhagem germinativa por, por exemplo, mutagênese direcionada de local ou mutagênese mediada por PCR (por exemplo, resíduo #30 do VH de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de asparagina para serina).

[000133] Como outro exemplo, para PTA021_A1, resíduo de aminoácido #54 de VH é um ácido aspártico (SEQ ID NO:19) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma asparagina (SEQ ID NO:31). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #54 do VH de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de ácido aspártico para asparagina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000134] Como outro exemplo, para PTA021_A1, resíduo de aminoácido #50 de VK é uma glicina (SEQ ID NO:22) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VK L15 é uma alanina (SEQ ID NO:34). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #50 do VK de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de glicina para alanina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000135] Como outro exemplo, para PTA021_A1, resíduo de aminoácido #77 de VK é uma asparagina (SEQ ID NO:22) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VK L15 é uma serina (SEQ ID NO:34). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #77 do VK de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de asparagina para serina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000136] Como outro exemplo, para PTA021_A2, resíduo de aminoácido #54 de VH é um ácido aspártico (SEQ ID NO:20) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma asparagina (SEQ ID NO:32). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #54 do VH de PTA021_A2 pode ser "retromutado" de ácido aspártico em asparagina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000137] Como ainda outro exemplo, para PTA021_A2, resíduo de aminoácido #89 de VH é uma isoleucina (SEQ ID NO:20) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma treonina (SEQ ID NO:32). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #89 dentro de FR1 do VH de PTA021_A2 pode ser "retromutado" de isoleucina para treonina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000138] Como outro exemplo, para PTA021_A3, resíduo de aminoácido #54 de VH é um ácido aspártico (SEQ ID NO:21) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VH 2-05 é uma asparagina (SEQ ID NO:33). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo # 54 do VH de PTA021_A3 pode ser "retromutado" de ácido aspártico para asparagina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000139] Como outro exemplo, para PTA021_A3, resíduo de aminoácido #77 de VK é uma asparagina (SEQ ID NO:24) pelo que este resíduo na sequência de linhagem germinativa correspondente VK L15 é uma serina (SEQ ID NO:36). Para retornar às sequências de região de estrutura para sua configuração de linhagem germinativa, por exemplo, resíduo #77 do VK de PTA021_A1 pode ser "retromutado" de asparagina para serina. Tais anticorpos "retromutados" são também pretendidos para serem envolvidos pela invenção.

[000140] Outro tipo de modificação de estrutura envolve mutação de um ou mais resíduos dentro da região de estrutura, ou ainda dentro de uma ou mais regiões CDR, para remover epítopes de célula T para, desse modo, reduzir a imunogenicidade potencial do anticorpo. Esta aproximação é também referida como "deimunização" e é descrita em detalhe adicional na Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20030153043 por Carr et al.

[000141] Em adição ou alternativa às modificações feitas dentro da estrutura ou regiões CDR, os anticorpos da invenção podem ser projetados para incluírem modificações dentro da região de Fc, tipicamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo, tal como meia vida de soro, fixação de complemento, ligação de receptor de Fc, e/ou citotoxicidade celular dependente de antígeno. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificada (por exemplo, uma ou mais porções químicas podem ser fixadas ao anticorpo) ou serem modificadas para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Cada uma destas modalidades é descrita em detalhe adicional abaixo. A numeração de resíduos na região de Fc é aquela do índice dos Estados Unidos de Kabat.

[000142] Em uma modalidade, a região de articulação de CH1 é modificada tal que o número de resíduos de cisteína na região de articulação é alterado, por exemplo, aumentado ou diminuído. Esta aproximação é descrita adicionalmente na Patente dos Estados Unidos N° 5.677.425 por Bodmer et al. O número de resíduos de cisteína na região de articulação de CH1 é alterado para, por exemplo, facilitar montagem das cadeias leves e pesadas ou aumentar ou diminuir a estabilidade do anticorpo.

[000143] Em outra modalidade, a região de articulação de Fc de um anticorpo é passível a mutação para diminuir a meia vida biológica do anticorpo. Mais especificamente, uma ou mais mutações de aminoácido são introduzidas na região de interface de domínio CH2-CH3 do fragmento de articulação-Fc tal que o anticorpo tenha prejudicado a ligação de proteína A Staphylococcal (SpA) relativa a ligação de SpA de domínio de articulação-Fc. Esta aproximação é descrita em detalhe adicional na Patente dos Estados Unidos N° 6.165.745 por Ward et al.

[000144] Em outra modalidade, o anticorpo é modificado para aumentar sua meia vida biológica. Várias aproximações são possíveis. Por exemplo, uma ou mais das seguintes mutações podem ser introduzidas: T252L, T254S, T256F, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 6.277.375 para Ward. Alternativamente, para aumentar a meia vida biológica, o anticorpo pode ser alterado dentro da região CH1 ou CL para conter um epítope de ligação de receptor de salvamento tomado a partir de dois circuitos fechados de um domínio de CH2 de uma região de Fc de uma IgG, conforme descrito nas Patente dos Estados Unidos N° 5.869.046 e N° 6.121.022 por Presta et al.

[000145] Em outra modalidade, o anticorpo é produzido como um Unibody, conforme descrito no WO/2007/059782 que é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[000146] Em ainda outra modalidade, a região de Fc é alterada por substituição de pelo menos um resíduo de aminoácido com um resíduo de aminoácido diferente para alterar a(s) função (ões) efetuadora(s) do anticorpo. Por exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem uma afinidade alterada para um ligante efetuador, mas retém a capacidade de ligação de antígeno do anticorpo de origem. O ligante efetuador a qual afinidade é alterada pode ser, por exemplo, um receptor de Fc ou o componente C1 de complemento. Esta aproximação é descrita em detalhe adicional nas Patentes dos Estados Unidos N° 5.624.821 e N° 5.648.260, ambas por Winter et al.

[000147] Em outro exemplo, um ou mais aminoácidos selecionados de resíduos de aminoácido 329, 331 e 322 podem ser substituídos com um resíduo de aminoácido diferente tal que o anticorpo tem ligação de C1q alterada e/ou citotoxicidade dependente de complemento reduzida ou abolida (CDC). Esta aproximação é descrita em detalhe adicional na Patente dos Estados Unidos N° 6.194.551 por Idusogie et al.

[000148] Em outro exemplo, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das posições do aminoácido 231 e 239 são alteradas para, desse modo, alterar a capacidade do anticorpo se fixar ao complemento. Esta aproximação é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 94/29351 por Bodmer et al.

[000149] Em ainda outro exemplo, a região de Fc é modificada para aumentar a capacidade do anticorpo mediar citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC) e/ou aumentar a afinidade do anticorpo para um receptor FCY por modificação de um ou mais aminoácidos nas seguintes posições: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 ou 439. Esta aproximação é descrita adicionalmente na Publicação PCT WO 00/42072 por Presta. Além disso, os locais de ligação em IgG1 humana para FCYRI, FCYRII, FCYRIII e FcRn foram mapeados e variantes com ligação aperfeiçoada descritos (vide, Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276:6591-6604). As mutações específicas nas posições 256, 290, 298, 333, 334 e 339 foram mostradas para aperfeiçoar ligação a FCYRIII. Adicionalmente, os seguintes mutantes de combinação foram mostrados para aperfeiçoar ligação de FcyRIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A e S298A/E333A/K334A.

[000150] Em ainda outra modalidade, a glicosilação de um anticorpo é modificada. Por exemplo, um anticorpo aglicosilatado pode ser produzido (isto é, o anticorpo carece de glicosilação). A glicosilação pode ser alterada para, por exemplo, aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tais modificações de carboidrato podem ser acompanhadas por, por exemplo, alteração de um ou mais locais de glicosilação dentro da sequência de anticorpo. Por exemplo, uma ou mais substituições de aminoácido podem ser feitas que resulta em eliminação de um ou mais locais de glicosilação de estrutura de região variável para, desse modo, eliminar glicosilação naquele local. Tal aglicosilação pode aumentar a afinidade do anticorpo para antígeno. Tal aproximação é descrita em detalhe adicional nas Patentes dos Estados Unidos N° 5.714.350 e N° 6.350.861 por Co et al.

[000151] Adicionalmente ou alternativamente, um anticorpo pode ser produzido que tem um tipo alterado de glicosilação, tal como anticorpo hipofucosilatado tendo quantidades reduzidas de resíduos fucosil ou um anticorpo tendo estruturas GlcNac de bisecção aumentadas. Tais modelos de glicosilação alterados foram demonstrados aumentar a capacidade de ADCC de anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser acompanhadas por, por exemplo, expressão do anticorpo em uma célula hospedeira com maquinaria de glicosilação alterada. As células com maquinaria de glicosilação alterada foram descritas na técnica e podem ser usadas como células hospedeiras nas quais para expressar anticorpos recombinantes da invenção para, desse modo, produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Por exemplo, as linhas de célula Ms704, Ms705, e Ms709 carecem de gene fucosiltransferase, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferase), tal que os anticorpos expressos nas linhas de células Ms704, Ms705, e Ms709 carecem de fucose em seus carboidratos. As linhas de células Ms704, Ms705 e Ms709 FUT8-/- foram criadas pelo rompimento alvo do gene FUT8 em células CHO/DG44 usando-se dois vetores de substituição (vide Publicação de Patente dos Estados Unidos N° 20040110704 por Yamane et al., e Yamane-Ohnuki et al., (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22). Como outro exemplo, EP 1.176.195 por Hanai et al., descreve uma linhagem de célula com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica um fucosil transferase, tal que os anticorpos expressos em tal linhagem de célula exibem hipofucosilação por redução ou eliminação da enzima relacionada à ligação alfa 1,6. Hanai et al., também descreve linhas de células que têm uma baixa atividade de enzima para adição de fucose à N-acetilglucosamina que se liga a região de Fc do anticorpo, ou não tem atividade de enzima, por exemplo, a linhagem de célula de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). A Publicação PCT WO 03/035835 por Presta descreve uma linhagem de célula variante CHO, células Lec13, com capacidade reduzida de fixar fucose a carboidratos articulados a Asn (297), também resultando em hipofucosilação de anticorpos expressos naquela célula hospedeira (vide também Shields, R.L. et al., (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740). A Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al., descreve linhas de células projetadas para expressar glicosil transferases de modificação de glicoproteína (por exemplo, beta (1,4)-N-acetilglucosaminiltransferase III (GnTIII)) tal que os anticorpos expressos nas linhas de célula projetadas exibem estruturas GlcNac de bisecção aumentada que resultam na atividade aumentada de ADCC dos anticorpos (vide também Umana et al., (1999) Nat. Biotech. 17:176-180). Alternativamente, os resíduos de fucose do anticorpo podem ser clivados usando-se uma enzima fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L-fucosidase remove resíduos fucosil de anticorpos (Tarentino, A.L. et al. (1975) Biochem. 14:5516-23).

[000152] Outra modificação dos anticorpos aqui que é contemplada pela invenção é peguilação. Um anticorpo pode ser peguilatado para, por exemplo, aumentar a meia vida biológica (por exemplo, soro) do anticorpo. Para peguilatar um anticorpo, o anticorpo, ou fragmento deste, tipicamente é regido com polietileno glicol (PEG), tal como um éster reativo ou derivado de aldeído de PEG, sob condições em que um ou mais grupos PEG tornam-se fixados ao anticorpo ou fragmento de anticorpo. Preferivelmente, a peguilação é efetuada via uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula de PEG reativa (ou um polímero solúvel em água reativo análogo). Conforme aqui usado, o termo "polietileno glicol" é pretendido para envolver qualquer das formas de PEG que foram usadas para derivatizar outras proteínas, tais como mono (C1-C10) alcóxi- ou arilóxi-polietileno glicol ou polietileno glicol-maleimida. Em certas modalidades, o anticorpo a ser peguilatado é um anticorpo aglicosilatado. Os métodos para peguilação de proteínas são conhecidos na técnica e podem ser aplicados aos anticorpos da invenção. Ver, por exemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al., e EP 0 401 384 por Ishikawa et al.

Propriedades Físicas do Anticorpo

[000153] Os anticorpos da presente invenção podem ser adicionalmente caracterizados pelas várias propriedades físicas dos anticorpos anti-CADM1. Vários ensaios podem ser usados para detectar e/ou diferenciar classes diferentes de anticorpos baseado nestas propriedades físicas.

[000154] Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção podem conter um ou mais locais de glicosilação em região variável ou de cadeia leve ou de cadeia pesada. A presença de um ou mais locais de glicosilação na região variável pode resultar em imunogenicidade aumentada do anticorpo ou uma alteração do pK do anticorpo devido a ligação de antígeno alterada (Marshall et al., (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA and Morrison SL (2004) J Immunol 172:5489-94; Wallick et al., (1988) J Exp Med 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobiology 12:43R-56R; Parekh et al., (1985) Nature 316:452-7; Mimura et al., (2000) Mol Immunol 37:697-706). A glicosilação tem sido conhecida por ocorrer em motivos contendo uma sequência N-X-S/T. A glicosilação de região variável pode ser testada usando-se um ensaio de Glycoblot, que cliva o anticorpo para produzir um Fab, e, em seguida, testes para glicosilação usando-se um ensaio que mede a oxidação de periodato e formação de base de Schiff. Alternativamente, a glicosilação de região variável pode ser testada usando-se cromatografia leve de Dionex (Dionex-LC), que cliva sacarídeos de um Fab em monossacarídeos e analisa o teor de sacarídeo individual. Em alguns exemplos, é preferido ter um anticorpo anti-CADM1 que não contém glicosilação de região variável. Isto pode ser alcançado ou por seleção de anticorpos que não contém o motivo de glicosilação na região variável ou por mutação de resíduos dentro do motivo de glicosilação usando-se técnicas padrões bem conhecidas na técnica.

[000155] Como um exemplo de glicosilação, para PTA021_A1, usando-se o sistema de numeração de Kabat, o resíduo de aminoácido #30 (dentro do FR3) de VH é uma asparagina (SEQ ID NO:19). Este é um local de glicosilação potencial e este resíduo pode ser mutado para uma glutamina.

[000156] Em uma modalidade preferida, os anticorpos da presente invenção não contêm locais de isomerismo de asparagina. Um efeito de deamidação ou ácido isoaspártico pode ocorrer nas sequências N-G ou D-G, respectivamente. O efeito de deamidação ou ácido isoaspártico resulta na criação de ácido isoaspártico que diminui a estabilidade de um anticorpo pela criação de uma estrutura dobrada fora de uma carbóxi terminal de cadeia lateral preferivelmente do que a cadeia principal. A criação de ácido isoaspártico pode ser medida usando-se um ensaio iso-quant, que usa uma HPLC de fase reversa para testar ácido isoaspártico.

[000157] Cada anticorpo terá um ponto isoelétrico único (pI), mas geralmente os anticorpos cairão na faixa de pH de entre 6 e 9,5. O pI para um anticorpo de IgG1 tipicamente cai dentro da faixa de pH de 79,5 e o pI para um anticorpo de IgG4 tipicamente cai dentro da faixa de pH de 6-8. Os anticorpos podem ter um pI que está for a desta faixa. Embora os efeitos sejam geralmente desconhecidos, existe especulação que os anticorpos com um pI fora da faixa normal podem ter algum desdobramento e instabilidade sob condições in vivo. O ponto isoelétrico pode ser testado usando-se um ensaio de focalização isoelétrico capilar, que cria um gradiente de pH e pode utilizar focalização de laser para precisão aumentada (Janini et al (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al., (2001) Chromatography 53:S75- 89; Hunt et al., (1998) J Chromatogr A 800:355-67). Em alguns exemplos, é preferido ter um anticorpo anti-CADM1 que contém um valor de pI que cai na faixa normal. Isto pode ser alcançado ou por seleção de anticorpos com um pI na faixa normal, ou por mutação de resíduos de superfície carregada usando-se técnicas padrões bem conhecidas na técnica.

[000158] Cada anticorpo terá uma temperatura de fusão que é indicativa de estabilidade térmica (Krishnamurthy R and Manning MC (2002) CurrPharm Biotechnol 3:361-71). Uma estabilidade térmica mais alta indica maior estabilidade total de anticorpo in vivo. O ponto de fusão de um anticorpo pode ser medido usando-se técnicas tal como calorimetria de escaneamento diferencial (Chen et al., (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al., (1999) Immunol Lett 68:47-52). TMI indica a temperatura do desdobramento inicial do anticorpo. TM2 indica a temperatura de desdobramento completo do anticorpo. Geralmente, é preferido que a TM1 de um anticorpo da presente invenção seja maior do que 60°C, preferivelmente maior do que 65°C, ainda mais preferivelmente maior do que 70°C. Alternativamente, a estabilidade térmica de um anticorpo pode ser medida usando-se dicroísmo circular (Murray et al., (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9).

[000159] Em uma modalidade preferida, os anticorpos são selecionados que não degradam rapidamente. A fragmentação de um anticorpo anti-CADM1 pode ser medida usando-se eletroforese capilar (CE) e MALDI-MS, conforme é bem compreendido na técnica (Alexander AJ and Hughes DE (1995) Anal Chem 67:3626-32).

[000160] Em outra modalidade preferida, os anticorpos são selecionados que têm efeitos de degradação mínimo. A agregação pode conduzir a disparo de uma resposta imune onde desejada e/ou propriedades farmacocinéticas alteradas ou desfavoráveis. Geralmente, os anticorpos são aceitáveis com agregação de 25% ou menos, preferivelmente 20% ou menos, ainda mais preferivelmente 15% ou menos, ainda mais preferivelmente 10% ou menos, e ainda mais preferivelmente 5% ou menos. A agregação pode ser medida por várias técnicas bem conhecidas na técnica, incluindo cromatografia líquida de alto desempenho de coluna de exclusão de tamanho (SEC) (HPLC), e leve difusão para identificar monômeros, dímeros, trímeros ou multímeros.

Métodos de Projeção de Anticorpos

[000161] Conforme discutido acima, os anticorpos anti-CADM1 tendo sequências de VHe VK aqui descritas podem ser usados para criar novos anticorpos anti-CADM1 por modificação das sequências de VH e/ou VK, ou a(s) região (ões) constante(s) fixadas a estes. Desse modo, em outro aspecto da invenção, as características estruturais de um anticorpo anti- CADM1 da invenção, por exemplo, PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3, são usadas para criar anticorpos estruturalmente relacionados anti-CADM1 que retêm pelo menos uma propriedade funcional dos anticorpos da invenção, tal como ligação a CADM1 humano. Por exemplo, uma ou regiões de CDR de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3, ou mutações destas, pode ser combinadas recombinantemente com regiões de estrutura conhecidas e/ou outras CDRs para criar anticorpos anti-CADM1 recombinantemente projetados, adicionais, da invenção, conforme discutido acima. Outros tipos de modificações incluem aquelas descritas na seção anterior. O material de partida para o método de projeção é um ou mais das sequências de VH e/ou VK aqui providas, ou uma ou mais regiões de CDR destas. Para criar o anticorpo projetado, não é necessário preparar de fato (isto é, expressar como uma proteína) um anticorpo tendo um ou mais das sequências de VH e/ou VK aqui providas, ou uma ou mais regiões de CDR destas. Preferivelmente, a informação contida na(s) sequência(s) é usada como o material de partida para criar uma "segunda geração" de sequência(s) derivada da(s) sequência(s) original (is) e, em seguida, a "segunda geração" de sequência(s) é preparada e expressa como uma proteína.

[000162] Consequentemente, em outra modalidade, a invenção proporciona um método para preparação de um anticorpo anti-CADM1 compreendendo: provisão de: (i) uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada compreendendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:1, 2, e 3, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:4, 5, e 6, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:7, 8, e 9; e/ou (ii) uma sequência de anticorpo de região variável de cadeia leve compreendendo uma sequência de CDR1 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:10, 11, e 12, uma sequência de CDR2 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:13, 14, e 15, e/ou uma sequência de CDR3 selecionada a partir do grupo consistindo em SEQ ID NOs:16, 17, e 18; alteração de pelo menos um resíduo de aminoácido dentro da sequência de anticorpo de região variável de cadeia pesada e/ou a sequência de anticorpo da região variável de cadeia leve para criar pelo menos uma sequência de anticorpo alterada; e expressão da sequência de anticorpo alterada como uma proteína.

[000163] Técnicas de biologia molecular padrões podem ser usadas para preparar e expressar a sequência de anticorpo alterada.

[000164] Preferivelmente, o anticorpo codificado pela(s) sequência(s) de anticorpo alteradas é um que retém uma, algumas ou todas as propriedades funcionais dos anticorpos anti-CADM1 aqui descritos, cujas propriedades funcionais incluem, mas não são limitadas a: ligação de um CADM1 humano com uma KD de 1x10-7 M ou menos; se liga a células CHO humanas transfectadas com CADM1.

[000165] As propriedades funcionais dos anticorpos alterados podem ser avaliadas usando-se ensaios padrões disponíveis na técnica e/ou aqui descritas, tais como aqueles colocados nos Exemplos (por exemplo, citometria de fluxo, ensaios de ligação).

[000166] Em certas modalidades dos métodos de projeção de anticorpos da invenção, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ou seletivamente ao longo de todo ou parte de uma sequência de codificação de anticorpo anti-CADM1 e o anticorpo modificado anti-CADM1 resultante pode ser classificado para atividade de ligação e/ou outras propriedades funcionais conforme aqui descritas. Métodos mutacionais foram descritos na técnica. Por exemplo, a Publicação PCT WO 02/092780 por Short descreve métodos para criação e classificação de mutações de anticorpo usando-se mutagênese de saturação, conjunto de ligação sintética, ou uma combinação destes. Alternativamente, a Publicação PCT WO 03/074679 por Lazar et al., descreve métodos de uso de métodos de classificação computacional para otimizar as propriedades fisioquímicas dos anticorpos.

Moléculas de Ácido Nucleico que Codificam Anticorpos da Invenção

[000167] Outro aspecto da invenção pertence a moléculas de ácido nucleico que codificam os anticorpos da invenção. Os ácidos nucleicos podem estar presentes em células inteiras, em um lisato de célula, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. Um ácido nucleico é "isolado" ou "tornado substancialmente puro" quando purificado fora dos outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celulares ou proteínas, por técnicas padrões, incluindo tratamento alcalino/SDS, bandagem de CsCl, cromatografia de coluna, eletroforese de gel de agarose e outras bem conhecidas na técnica. Vide, F. Ausubel, et al., ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Um ácido nucleico da invenção pode ser, por exemplo, DNA ou RNA, e pode ou não pode conter sequências intrônicas. Em uma modalidade preferida, o ácido nucleico é uma sequência de cDNA.

[000168] Os ácidos nucleicos da invenção podem ser obtidos usando- se técnicas de biologia molecular padrões. Para anticorpos expressos por hibridomas (por exemplo, hibridomas preparados de camundongos transgênicos transportando genes de imunoglobulina humana conforme descrito adicionalmente abaixo), cDNAs que codificam as cadeias leve e pesada do anticorpo produzido pelo hibridoma podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão ou técnicas de clonagem de cDNA. Para anticorpos obtidos de uma biblioteca de gene de imunoglobulina (por exemplo, usando-se técnicas de descrição de fago), os ácidos nucleicos que codificam o anticorpo podem ser recuperados a partir da biblioteca.

[000169] As moléculas de ácido nucleico preferidas da invenção são aquelas que codificam as sequências de VH e VL dos anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3. As sequências de DNA que codificam as sequências de VH de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 25, 26, e 27, respectivamente. As sequências de DNA que codificam as sequências de VK de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são mostradas em SEQ ID NOs: 28, 29, e 30, respectivamente.

[000170] Outros ácidos nucleicos preferidos da invenção são ácidos nucleicos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência, tal como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência, com uma das sequências mostrada em SEQ ID NOs: 25, 26, 27, 28, 29, e 30, cujos ácidos nucleicos codificam um anticorpo da invenção, ou uma porção de ligação de antígeno deste.

[000171] A porcentagem de identidade entre duas sequência de ácido nucleico é o número de posições na sequência em que o nucleotídeo é idêntico, levando-se em conta o número de folgas e o comprimento de cada folga, que necessita ser introduzida para alinhamento ótimo das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de porcentagem de identidade entre duas sequências podem ser acompanhadas usando-se um algoritmo matemático, tal como o algoritmo de Meyers e Miller ou o programa XBLAST de Altschul descrito acima.

[000172] Ainda adicionalmente, os ácidos nucleicos preferidos da invenção compreendem uma ou mais porções que codificam CDR das sequências de ácido nucleico mostradas em SEQ ID NOs:25, 26, 27, 28, 29, e 30. Nesta modalidade, o ácido nucleico pode codificar a sequência de cadeia pesada CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3, ou a sequência de cadeia leve CDR1, CDR2 e/ou CDR3 de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3.

[000173] Os ácidos nucleicos que têm pelo menos 80%, tais como pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência, com tal porção que codifica CDR de SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 (sequências de VH e VK) são também ácidos nucleicos preferidos da invenção. Tais ácidos nucleicos podem diferir da porção correspondente de SEQ ID NO: 25, 26, 27, 28, 29, ou 30 em uma região de codificação de não CDR e/ou em uma região de codificação de CDR. Onde a diferença está em uma região de codificação de CDR, a região de CDR de ácido nucleico codificada pelo ácido nucleico tipicamente compreende uma ou mais modificação de sequência conservativa conforme definido aqui comparada a sequência de CDR correspondente de PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3.

[000174] Uma vez que os fragmentos de DNA que codificam segmentos de VH e VK são obtidos, estes fragmentos de DNA podem ser adicionalmente manipulados por técnicas de DNA recombinantes padrões, por exemplo, para converter os genes de região variável a genes de cadeia de anticorpo de comprimento total, a genes de fragmento Fab ou a um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento de DNA que codifica VK- ou VH é operativamente ligado a outro fragmento de DNA que codifica outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um articulador flexível. O termo "operativamente ligado", conforme usado neste contexto, é pretendido significar que os dois fragmentos de DNA são unidos tal que as sequências de aminoácido codificadas pelos dois fragmentos de DNA permanecem dentro da estrutura.

[000175] O DNA isolado que codifica a região VH pode ser convertido a um gene de cadeia pesada de comprimento total por ligação operativamente do DNA que codifica VH para outra molécula de DNA que codifica regiões constantes de cadeia pesada (CH1, CH2 e CH3). As sequências de genes humanos de região constante de cadeia pesada são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, E. A., el al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 913242) e os fragmentos de DNA envolvendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrões. A região constante de cadeia pesada pode ser uma região constante de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM ou IgD, mas, mais preferivelmente é uma região constante de IgG1 ou IgG4. Para um gene de cadeia pesada de fragmento Fab, o DNA que codifica VH pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA que codifica somente a região constante CH1 de cadeia pesada.

[000176] O DNA isolado que codifica a região VL/VK pode ser convertido a um gene de cadeia leve de comprimento total (bem como um gene de cadeia leve Fab) por ligação operativamente de DNA que codifica VL para outra molécula de DNA que codifica a região constante de cadeia leve, CL. As sequências de genes humanos de região constante de cadeia leve são conhecidas na técnica (vide, por exemplo, Kabat, E. A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication N° 91-3242) e os fragmentos de DNA envolvendo estas regiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. Em modalidades preferidas, a região constante de cadeia leve pode ser uma região constante capa ou lambda.

[000177] Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA que codificam VH- e VL/VK são operativamente ligados a outro fragmento que codifica um ligador flexível, por exemplo, que codifica a sequência de aminoácido (Gly4 -Ser)3, tal que as sequências de VH e VL/VK podem ser expressas como uma proteína de cadeia simples contígua, com as regiões de VL/VK e VH unidas pelo ligador flexível (vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; McCafferty et al., (1990) Nature 348:552554).

Produção de Anticorpos Monoclonais

[000178] Os anticorpos monoclonais (mAbs) da presente invenção podem ser produzidos por uma variedade de técnicas, incluindo metodologia de anticorpo monoclonal convencional, por exemplo, a técnica de hibridização de célula somática padrão de Kohler e Milstein (1975) Nature 256: 495. Embora os procedimentos de hibridização de célula somática sejam preferidos, em princípio, outras técnicas para produção de anticorpo monoclonal podem ser empregadas, por exemplo, transformação viral ou oncogênica de linfócitos B.

[000179] O sistema de animal preferido para preparação de hibridomas é o sistema de murino. A produção de hibridoma no camundongo é um procedimento muito bem estabelecido. Os protocolos e técnicas de imunização para isolamento de esplenócitos imunizados para fusão são conhecidos na técnica. Coparticipantes de fusão (por exemplo, células de mieloma de murino) e procedimentos de fusão são também conhecidos.

[000180] Os anticorpos quiméricos ou humanizados da presente invenção podem ser preparados baseados na sequência de um anticorpo monoclonal não humano preparada conforme descrito acima. O DNA que codifica as imunoglobulinas de cadeia pesada e leve pode ser obtido do hibridoma não humano de interesse e projetado para conter sequências de imunoglobulina de não murino (por exemplo, humana) usando-se técnicas de biologia molecular padrões. Por exemplo, para criar um anticorpo quimérico, regiões variáveis de murino podem ser articuladas às regiões constantes humanas usando-se métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 4.816.567 para Cabilly et al.). Para criar um anticorpo humanizado, regiões de CDR de murino podem ser inseridas em uma estrutura humana usando-se métodos conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos N° 5.225.539 para Winter, e Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.530.101; 5.585.089; 5.693.762 e 6.180.370 para Queen et al.).

[000181] Em uma modalidade preferida, os anticorpos da invenção são anticorpos monoclonais humanos. Tais anticorpos monoclonais humanos direcionados contra CADM1 podem ser gerados usando-se camundongos transgênicos ou transcromossômicos que transportam partes do sistema imune humano preferivelmente do que o sistema do camundongo. Estes camundongos transgênicos e transcromossômicos incluem camundongos referidos aqui como camundongos das cepas HuMAb Mice® e KM Mice®, respectivamente, e são coletivamente referidos aqui como "camundongos Ig humanos".

[000182] A cepa HuMAb Mice® (Medarex®, Inc.) contém gene de imunoglobulina humana miniloci que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada e leve não rearranjadas (μ e Y) e K, juntas com mutações alvos que inativam a cadeia endógena μ e K loci (vide, por exemplo, Lonberg, et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859). Consequentemente, os camundongos exibem expressão reduzida de camundongo IgM ou k, e em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humanos introduzidos suportam comutação de classe e mutação somática para gerar anticorpos monoclonais IgGk humanos de alta afinidade (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisto em Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49101; Lonberg, N. e Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93, e Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci. 764:536-546). A preparação e uso do HuMAb Mice®, e as modificações genômicas transportadas por tais camundongos, é adicionalmente descrito em Taylor, L. et al. (1992) Acids nucleics Research 20:6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724; Choi et al. (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; and Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851, os conteúdos de todos os quais são especificamente incorporados por referência em sua totalidade. Vide, adicionalmente, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397; 5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; e 5.770.429; todas para Lonberg e Kay; Patente dos Estados Unidos N° 5.545.807 para Surani et al.; Publicações PCT Nos. WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 e WO 99/45962, todas para Lonberg e Kay; e Publicação PCT N° WO 01/14424 para Korman et al.

[000183] Em outra modalidade, os anticorpos humanos da invenção podem ser produzidos usando-se um camundongo que transporta sequências de imunoglobulina humana nos transgenes e transcromossomos, tal como um camundongo que transporta um transgene de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humano. Este camundongo é referido aqui como um camundongo da cepa "KM Mice®", e é descrito em detalhe na Publicação PCT WO 02/43478 para Ishida et al.

[000184] Ainda adicionalmente, sistemas transgênicos de animal alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana são disponíveis na técnica e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-CADM1 da invenção. Por exemplo, um sistema transgênico alternativo referido como o Xenomice (Amgen, Inc.) pode ser usado; tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.939.598; 6.075.181; 6.114.598; 6.150.584 e 6.162.963 para Kucherlapati et al.

[000185] Além disso, sistemas de animal transcromossômicos alternativos que expressam genes de imunoglobulina humana são disponíveis na técnica e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-CADM1 da invenção. Por exemplo, camundongos que transportam ambos transcromossomos de cadeia pesada humano e um transcromossomo de cadeia leve humanos, referidos como "TC camundongos" podem ser usados; tais camundongos são descritos em Tomizuka et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:722-727. Além disso, vacas transportando transcromossomos de cadeia pesada e leve humanos foram descritos na técnica (Kuroiwa et al. (2002) Nature Biotechnology 20:889-894) e Pedido PCT N° WO/2002/092812, e podem ser usados para produzir os anticorpos anti-CADM1 da invenção.

[000186] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem também ser preparados usando-se métodos de descrição de fago para classificação de bibliotecas de genes de imunoglobulina humana. Tais métodos de descrição de fago para isolamento de anticorpos humanos são estabelecidos na técnica. Vide, por exemplo: Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.223.409; 5.403.484; e 5.571.698 para Ladner et al.; Patente dos Estados Unidos Nos. 5.427.908 e 5.580.717 para Dower et al.; Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.969.108 e 6.172.197 para McCafferty et al.; e Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.885.793; 6.521.404; 6.544.731; 6.555.313; 6.582.915 e 6.593.081 para Griffiths et al.

[000187] Os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem também ser preparados usando-se camundongos SCID nos quais células imunes humanas foram reconstituídas tal que uma resposta de anticorpo humano ser gerada após imunização. Tais camundongos são descritos em, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.476.996 e 5.698.767 para Wilson et al.

Imunização de Camundongos de Ig Humanos

[000188] Quando camundongos de Ig humanos são usados para produzir os anticorpos humanos da invenção, tais camundongos podem ser imunizados com uma preparação purificada ou enriquecida de antígeno de CADM1 e/ou CADM1 recombinante, ou células que expressam CADM1, ou uma proteína de fusão de CADM1, conforme descrito por Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851; e Publicações PCT WO 98/24884 e WO 01/14424. Preferivelmente, os camundongos terão 6-16 semanas de idade após a primeira infusão. Por exemplo, uma preparação purificada ou recombinante (5-50 μg) de antígeno de CADM1 pode ser usada para imunizar os camundongos de IgG humanos intraperitonealmente.

[000189] Procedimentos detalhados para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos a CADM1 são descritos no Exemplo 1 abaixo. A experiência cumulativa com vários antígenos tem mostrado que os camundongos transgênicos respondem quando inicialmente imunizados intraperitonealmente (IP) com antígeno em adjuvante completo de Freund, seguido por imunizações IP toda semana seguinte (até um total de 6) com antígeno em adjuvante incompleto de Freund. Contudo, adjuvantes outros do que de Freund são também verificados serem efetivos. Em adição, células inteiras na ausência de adjuvante são verificadas serem altamente imunogênicas. A resposta imune pode ser monitorada sobre o curso do protocolo de imunização com amostras de plasma sendo obtidas por sangrias retro-orbitais. O plasma pode ser classificado por ELISA (conforme descrito abaixo), e camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti-CADM1 podem ser usados para fusões. Os camundongos podem ser agrupados intravenosamente com antígeno 3 dias antes de sacrifício e remoção do baço. É esperado que 2-3 fusões para cada imunização pode necessitar de ser realizada. Entre 6 e 24 camundongos são tipicamente imunizados para cada antígeno. Em uma modalidade, cepas de camundongo suportando cepas transgenes de cadeia pesada humanas HCo7, HCo12 ou HCo17 podem usadas. Alternativamente ou adicionalmente, as cepas KM Mice® podem ser usadas. Em adição, duas ou mais destas cepas podem ser geradas juntas em um camundongo simples tendo uma pluralidade de transgenes de cadeia pesada humanos diferentes.

Geração de Hibridomas de Produção de Anticorpos Monoclonais Humanos

[000190] Para gerar hibridomas de produção de anticorpos monoclonais humanos da invenção, células de nodo de esplenócitos e/ou linfa de camundongos imunizados podem ser isoladas e fundidas a uma linhagem de célula imortalizada apropriada, tal como uma linhagem de célula de mieloma de camundongo. Os hibridomas resultantes podem ser classificados para a produção de anticorpos específicos de antígeno. Por exemplo, suspensões de célula simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados podem ser fundidas a um sexto o número de células de mieloma de camundongo não secretantes P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) com 50% PEG. Alternativamente, a suspensão de célula simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados pode ser fundida usando-se um campo elétrico baseado em método de eletrofusão, usando-se um eletroporador de fusão de célula de câmara grande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland). As células são colocadas em aproximadamente 2 x 105 em placa de microtitulação de fundo plano, seguido por uma incubação de duas semanas em meio seletivo contendo 20% de soro de Clone fetal, 18% de meio condicionado "653", 5% de origem (IGEN), 4 mM de L-glutamina, 1 mM de piruvato de sódio, 5mM de HEPES, 0,055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 unidades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicina e 1X HAT (Sigma; o HAT é adicionado 24 horas após a fusão). Após aproximadamente duas semanas, as células podem ser cultivadas em meio em que o HAT é substituído com HT. As cavidades individuais podem, em seguida, serem classificadas por ELISA para IgM humana monoclonal e anticorpos de IgG. Uma vez que crescimento extensivo do hibridoma ocorre, o meio pode ser observado usualmente após 10-14 dias. Os hibridomas de secreção de anticorpo podem ser recolocados, classificados novamente, e se ainda positivos para IgG humana, os anticorpos monoclonais podem ser subclonados pelo menos duas vezes por limitação da diluição. Os subclones estáveis podem, em seguida, serem cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização.

[000191] Para purificar anticorpos monoclonais humanos, hibridomas podem ser crescidos em frascos de centrifugação de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, N.J.). A IgG eluída pode ser verificada por gel eletroforese e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando-se coeficiente de extinção 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80 °C.

Geração de Transfectomas de Produção de Anticorpos Monoclonais

[000192] Os anticorpos da invenção também podem ser produzidos em um transfectoma de célula hospedeira usando-se, por exemplo, uma combinação de técnicas de DNA recombinante e métodos de transfecção de gene conforme é bem conhecido na técnica (por exemplo, Morrison, S. (1985) Science 229:1202).

[000193] Por exemplo, para expressar os anticorpos, ou fragmentos de anticorpo destes, os DNAs que codificam cadeias pesada e leve de comprimento parcial ou total, podem ser obtidos por técnicas de biologia molecular padrões (por exemplo, amplificação de PCR ou clonagem de cDNA usando-se um hibridoma que expressa o anticorpo de interesse) e os DNAs podem ser inseridos em vetores de expressão tal que os genes são operativamente articulados às sequências de controle transcricional e translacional. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" é pretendido para significar que um gene de anticorpo é ligado em um vetor tal que sequências de controle transcricional e translacional dentro do vetor servem a sua função pretendida de regular a transcrição e translação do gene de anticorpo. O vetor de expressão e sequência de controle de expressão são escolhidos para serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão usada. O gene de anticorpo de cadeia leve e o gene de anticorpo de cadeia pesada podem ser inseridos no vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes de anticorpo são inseridos no vetor de expressão por métodos padrões (por exemplo, ligação de locais de restrição complementar no fragmento de gene de anticorpo e vetor, ou ligação terminal enfraquecida se nenhum local de restrição está presente). A região variável de cadeia pesada e leve dos anticorpos aqui descritos pode ser usada para criar genes de anticorpo de comprimento total de qualquer isotipo de anticorpo por inserção dos mesmos nos vetores de expressão já que codifica cadeia pesada constante e região constante de cadeia leve do isotipo desejado tal que o segmento de VH é operativamente ligado ao(s) segmento(s) de CH dentro do vetor e o segmento de VK é operativamente ligado ao segmento de CL dentro do vetor. Adicionalmente ou alternativamente, o vetor de expressão recombinante e pode codificar um peptídeo de sinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene de cadeia de anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo de sinal é ligado na estrutura interna ao amino-terminal do gene de cadeia de anticorpo. O peptídeo de sinal pode ser um peptídeo de sinal de imunoglobulina ou um peptídeo de sinal heterólogo (isto é, um peptide de sinal de uma proteína de não imunoglobulina).

[000194] Em adição aos genes de cadeia de anticorpo, os vetores de expressão recombinantes da invenção transportam sequências regulatórias que controlam a expressão dos genes de cadeia de anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "sequência regulatória" é pretendido para incluir promotores, intensificadores e outros elementos de controle de expressão (por exemplo, sinais de poliadenilação) que controlam a transcrição ou translação dos genes de cadeia de anticorpo. Tais sequências regulatórias são descritas, por exemplo, em Goeddel (Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Será apreciado por aqueles versados na técnica que o desenho do vetor de expressão, incluindo a seleção de sequências regulatórias, pode depender de fatores tais como a escolha da célula hospedeira a ser transformada, o nível de expressão de proteína desejado, etc. Sequências regulatórias preferidas para expressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementos virais que direcionam altos níveis de expressão de proteína em células de mamífero, tais como promotores e/ou intensificadores derivados de citomegalovírus (CMV), Vírus de Símio 40 (SV40), adenovírus, (por exemplo, o promotor posterior de adenovírus maior (AdMLP) e polioma. Alternativamente, sequências regulatórias não virais podem ser usadas, tais como o promotor de ubiquitin ou promotor de β-globin. Ainda adicionalmente, os elementos regulatórios compostos de sequências de fontes diferentes, tal como o sistema promotor de SRα, que contém sequências a partir do promotor posterior SV40 e a repetição de terminal longo de vírus de leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. et al. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472).

[000195] Em adição aos genes de cadeia de anticorpo e sequências regulatórias, os vetores de expressão recombinantes da invenção podem transportar sequências adicionais, tais como sequências que regulam replicação do vetor em células hospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador selecionável facilita a seleção de células hospedeiras em que o vetor tenha sido introduzido (vide, por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas por Axel et al.). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistência a fármacos, tais como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira na qual o vetor tenha sido introduzido. Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o gene di-hidrofolato reductase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com seleção/amplificação de metotrexato) e o gene neo (para seleção de G418).

[000196] Para expressão das cadeias leve e pesada, o(s) vetor (es) de expressão (ões) que codifica(m) as cadeias pesada e leve é/são transfectado(s) em uma célula hospedeira por técnicas padrões. As várias formas do termo "transfecção" são pretendidas para envolverem uma ampla variedade de técnicas comumente usadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação de fosfato de cálcio, transfecção de DEAE-dextran e similares. Embora seja teoricamente possível expressar os anticorpos da invenção em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e, mais preferivelmente, células hospedeiras de mamífero, é as mais preferidas porque tais células eucarióticas, e, em particular, células de mamífero, são mais plausíveis do que células procarióticas para se reunirem e secretarem um anticorpo corretamente dobrado e imunologicamente ativo. Os genes de expressão de anticorpo procarióticos foram reportados serem inefetivos para produção de altos rendimentos de anticorpo ativo (Boss, M. A. and Wood, C. R. (1985) Immunology Today 6:12-13).

[000197] As célula hospedeiras de mamífero preferidas para expressão dos anticorpos recombinantes da invenção incluem células de Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindo células dhfr- CHO, descritas em Urlaub e Chasin, (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, usadas com um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, conforme descrito em R. J. Kaufman e P. A. Sharp (1982) J. Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma de NSO, células de COS e células de SP2. Em particular, para uso com células de mieloma de NOS, outro sistema de expressão preferido é o sistema de expressão de gene de GS descrito em WO 87/04462 (para Wilson), WO 89/01036 (para Bebbington) e EP 338.841 (para Bebbington). Quando vetores de expressão recombinantes que codificam genes de anticorpo são introduzidos nas células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos por cultura das células hospedeiras por um período de tempo suficiente para permitir expressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meio de cultura no qual as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recuperados a partir do meio de cultura usando-se métodos de purificação de proteína padrões.

Caracterização de Ligação de Anticorpo à Antígeno

[000198] Os anticorpos da invenção podem ser testados para ligação a CADM1 por, por exemplo, ELISA padrão. Brevemente, as placas de microtitulação são revestidas com CADM1 purificado a 0,25 μg/ml em PBS, e, em seguida, bloqueados com 5% de albumina de soro bovino em PBS. As diluições de anticorpo (por exemplo, diluições de plasma de CADM1-camundongos imunizados) são adicionados a cada poço e incubados por 1-2 horas a 37°C. As placas são lavadas com PBS/Tween e, em seguida, incubadas com reagente secundário (por exemplo, para anticorpos humanos, um reagente policlonal específico de Fc de IgG de cabra-anti-humano) conjugado a fosfatase alcalina por 1 hora a 37°C. Após lavagem, as placas são desenvolvidas com substrato pNPP (1 mg/ml), e analisadas a OD de 405-650. Preferivelmente, os camundongos que desenvolvem as titulações mais altas serão usados para fusões.

[000199] Um ensaio de ELISA, conforme descrito acima, pode também ser usado para classificar hibridomas que mostram reatividade positiva com imunogênio de CADM1. Os hibridomas que se ligam com alta avidez a CADM1 são subclonados e adicionalmente caracterizados. Um clone de cada hibridoma, que retém a reatividade das células de origem (por ELISA), pode ser escolhido para produção de um banco de célula de 5-10 frascos armazenado a -140°C, e para purificação de anticorpo.

[000200] Para purificar anticorpos anti-CADM1, os hibridomas selecionados podem ser cultivados em frascos de centrifugação de dois litros para purificação de anticorpo monoclonal. Os sobrenadantes podem ser filtrados e concentrados antes da cromatografia de afinidade com proteína A-sefarose (Pharmacia, Piscataway, NJ). A IgG eluída pode ser verificada por gel eletroforese e cromatografia líquida de alto desempenho para assegurar pureza. A solução tampão pode ser trocada em PBS, e a concentração pode ser determinada por OD280 usando-se coeficiente de extinção de 1,43. Os anticorpos monoclonais podem ser aliquotados e armazenados a -80°C.

[000201] Para determinar se os anticorpos monoclonais de anti- CADM1 selecionados se ligam a epítopes únicos, cada anticorpo pode ser biotinilatado usando-se reagentes comercialmente disponíveis (Pierce, Rockford, IL). Estudos para competição para ligação com os anticorpos da invenção usando-se anticorpos monoclonais não etiquetados e anticorpos monoclonais biotinilatados podem ser realizados usando-se placas de ELISA revestidas com CADM1, conforme descrito acima. A ligação de mAb biotinilatado pode ser detectada com uma sonda de strep-avidin-fosfatase alcalina.

[000202] Para determinar o isotipo de anticorpos purificados, ELISAs de isotipo podem ser realizados usando-se reagentes específicos para anticorpos de um isotipo particular. Por exemplo, para determinar o isotipo de um anticorpo monoclonal humano, as cavidades das placas de microtitulação podem ser revestidas com 1 μg/ml de imunoglobulina anti-humana durante a noite a 4°C. Após bloqueio com 1% de BSA, as placas são reagidas com 1 μg/ml ou menos de anticorpos monoclonais de teste, ou purificadas com controles de isotipo, à temperatura ambiente por uma a duas horas. Os poços podem ser, em seguida, reagidos com sondas conjugadas de ou IgG1 humana ou de fosfatase alcalina específica de IgM humano. As placas são desenvolvidas e analisadas conforme descrito acima.

[000203] Os IgGs humanos anti-CADM1 podem ser adicionalmente testados para reatividade com antígeno de CADM1 por Western Blotting. Brevemente, CADM1 pode ser preparado e submetido a gel de eletroforese de dodecil sulfato de sódio poliacrilamida. Após eletroforese, os antígenos separados são transferidos para membranas de nitrocelulose, bloqueados com 10% de soro de bezerro fetal, e sondados com os anticorpos monoclonais a serem testados. A ligação de IgG humana pode ser detectada usando-se fosfatase alcalina de IgG anti-humana e desenvolvida com comprimidos de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo.).

[000204] A especificidade de ligação de um anticorpo da invenção pode também ser determinada por monitoramento da ligação do anticorpo a células que expressam CADM1, por exemplo, por citometria de fluxo. Tipicamente, uma linhagem de célula, tal como uma linhagem de célula de CHO, pode ser transfectada com um vetor de expressão que codifica uma forma de transmembrana de CADM1. Em algumas modalidades, uma molécula de CADM1 de comprimento total com uma etiqueta amino-terminal HA (SEQ ID NO:43) é expressa na superfície da célula da linhagem de célula de CHO. A proteína transfectada pode compreender uma etiqueta, tal como um etiqueta-myc, preferivelmente no N-terminal, para detecção usando-se um anticorpo para a etiqueta. A ligação de um anticorpo da invenção a CADM1 pode ser determinada por incubação das células transfectadas com o anticorpo, e detecção de anticorpo ligado. A ligação de um anticorpo à etiqueta na proteína transfectada pode ser usada como um controle positivo.

[000205] A especificidade de um anticorpo da invenção para CADM1 pode ser adicionalmente estudada por determinação se ou não o anticorpo se liga a outras proteínas, tais como TSLL2/CADM1C ou outros membros da superfamília de imunoglobulina usando-se os mesmos métodos pelos quais ligação á CADM1 é determinada.

Conjugados de Molécula de Anticorpo Parceiro

[000206] Em um aspecto preferido, é provido um conjugado compreendendo um anticorpo anti-CADM1 de acordo com esta invenção e uma molécula co-participante, o conjugado sendo representado pela fórmula (a) Z[(XZ) aC (XD) bD]m (a) onde Z é um anticorpo de acordo com esta invenção; D é uma molécula coparticipante; e (XZ) aC (XD)b são coletivamente referidos como uma "porção ligadora " ou "ligadr" porque eles articulam os primeiros dois elementos. Dentro do ligador, C é um grupo clivável designado para ser clivado no local de ação biológica pretendido da molécula coparticipante D; XZ e XD são referidos como porções espaçadoras (ou "espaçadores") porque eles espaçam à parte Z e C e C e D, respectivamente; subscritos de a e b são independentemente 0 ou 1 (isto é, a presença de XZ e/ou XD é opcional); e subscrito m é 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 (preferivelmente 1, 2, 3, ou 4). Cada um dos termos precedentes é mais totalmente definido aqui abaixo.

[000207] O anticorpo Z serve como uma função alvo: por ligação a um tecido ou célula alvo onde seu antígeno está localizado, ele dirige o conjugado ali. Preferivelmente, o tecido ou célula alvo é um tumor ou uma célula de câncer e o antígeno é um antígeno associado a tumor ou específico de tumor. A clivagem do grupo C no tecido ou célula alvo libera a molécula parceira D para realizar sua função biológica pretendida. Em alguns exemplos, o conjugado é internalizado em uma célula alvo por endocitose e clivagem ocorre dentro da célula alvo. Dessa maneira, distribuição precisa da molécula coparticipante D é alcançada no local de ação, reduzindo a dosagem necessária. Também, a molécula coparticipante D é normalmente biologicamente inativa (ou significantemente menos ativa) em seu estado conjugado, reduzindo, desse modo, a toxicidade indesejada contra tecidos ou células de não alvos. Como fármacos anticâncer são frequentemente compostos altamente tóxicos com um baixo índice terapêutico, esta é uma consideração importante.

[000208] Conforme refletido pelo subscrito m, cada molécula de anticorpo Z pode conjugar com mais do que uma molécula parceira D, dependendo do número de locais que o primeiro tem disponível para conjugação e as condições experimentais empregadas. Aqueles versados na técnica apreciarão que enquanto cada molécula de anticorpo Z é conjugada a um número inteiro de moléculas parceiras D, uma preparação do conjugado pode analisar uma proporção não inteira de moléculas parceiras D para anticorpo Z, refletindo uma média estatística.

Anticorpo Z

[000209] Qualquer um de vários grupos reativos diferentes no anticorpo Z pode ser usado como um local de conjugação, incluindo grupos ε-amino em resíduos de lisina, porções de carboidrato pendentes, grupos de ácido carboxílico, grupos de dissulfeto, e grupos tiol. Cada tipo de grupo reativo representa uma marca tendo algumas vantagens. Mas algumas limitações. Para revisões nos grupos reativos de anticorpo adequados para conjugação, vide, por exemplo, Garnett, Adv. Fármaco Delivery Rev. 53 (2001), 171-216 e Dubowchik e Walker, Pharmacology & Therapeutics 83 (1999), 67-123, a descrição dos quais são aqui incorporados por referência.

[000210] Em uma modalidade, o anticorpo Z é conjugado via um grupo de lisina ε-amino. Mais anticorpos têm grupos de lisina ε-amino expostos múltiplos, que podem ser conjugados via ligações de amida, ureia, tioureia, ou carbamato usando-se técnicas conhecidas na técnica, incluindo modificação com um agente heterobifuncional (conforme adicionalmente aqui descrito abaixo). Contudo, é difícil controlar qual e quantos grupos ε-amino reagem, conduzindo a variabilidade potencial de batelada-a-batelada em preparações de conjugado. Também, a conjugação pode causar neutralização de um grupo ε-amino protonado importante para manutenção da conformação nativa do anticorpo, ou pode ocorrer em uma lisina perto do ou no local de ligação de antígeno, nem sendo uma ocorrência desejável.

[000211] Em outra modalidade, o anticorpo Z pode ser conjugado via uma cadeia lateral de carboidrato, visto que muitos anticorpos são glicosilatados. A cadeia lateral de carboidrato pode ser oxidada com periodato para gerar grupos aldeído que, por sua vez, podem ser reagidos com aminas para formar um grupo imina, tais como em uma semicarbazona, oxima, ou hidrazona. Se desejado, o grupo imina pode ser reduzido com cianoboro-hidreto de sódio para produzir uma ligação mais estável. Para descrições adicionais na conjugação, via cadeia lateral de carboidratos, vide, por exemplo, Rodwell et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83, 2632-2636 (1986); a descrição do qual é aqui incorporada por referência. Como tal, com grupos de lisina ε-amino existem mais interesse com relação a localização do(s) local (is) de conjugação e estequiometria.

[000212] Em ainda outra modalidade, o anticorpo Z pode ser conjugado, via um grupo de ácido carboxílico. Em uma modalidade, um grupo de ácido carboxílico terminal é funcionalizado para gerar uma carbo-hidrazida, que é, em seguida, reagida com uma porção de conjugação de suporte de aldeído. Vide, Fisch et al., Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 147-153.

[000213] Em ainda outra modalidade, o anticorpo Z pode ser conjugado, via um grupo de dissulfeto que liga em ponte o enxofre de um resíduo de cisteína no anticorpo Z e um enxofre na outra porção do conjugado. Alguns anticorpos (tal como o isotipo de IgG) carecem de grupos tiol livres, mas têm grupos de dissulfeto, por exemplo, na região de articulação. Em tal caso, grupos tiol livres podem ser gerados por redução de grupos de dissulfeto nativos. Os grupos tiol assim gerados podem, em seguida, ser usados para conjugação. Vide, por exemplo, Packard et al., Biochemistry 1986, 25, 3548-3552; King et al., Cancer Res. 54, 6176-6185 (1994); e Doronina et al., Nature Biotechnol. 21(7), 778-784 (2003); as descrições dos quais são aqui incorporados por referência. Novamente, existem interesses relacionados à localização da conjugação e estequiometria e o possível rompimento de conformação nativa de anticorpo.

[000214] Em ainda outra modalidade preferida, o anticorpo Z é conjugado, via o produto de adição nucleofílico de um grupo tiol a uma porção aceitadora. Uma porção aceitadora preferida é um grupo de maleimida, cuja reação com um grupo tiol de anticorpo é ilustrada abaixo:

[000215] Um número de métodos foi desenvolvido para introduzir grupos tiol livres em anticorpos sem quebra de fontes de dissulfeto nativas, cujos métodos podem ser praticados com um anticorpo Z desta invenção. Dependendo do método empregado, pode ser possível introduzir um número prognosticável de sulfidris livres em localizações específicas. Em uma aproximação, anticorpos que sofreram mutação são preparados em que uma cisteína é substituída por outro aminoácido. Vide, por exemplo, Eigenbrot et al., US 2007/0092940 A1; Chilkoti et al., Bioconjugate Chem. 1994, 5, 504-507; Urnovitz et al., US 4.698.420 (1987); Stimmel et al., J. Biol. Chem., 275 (39), 30445-30450 (2000); Bam et al., US 7.311.902 B2 (2007); Kuan et al., J. Biol. Chem., 269 (10), 7610-7618 (1994); Poon et al., J. Biol. Chem., 270 (15), 8571-8577 (1995). Em outra aproximação, uma cisteína extra é adicionada ao C-terminal. Vide, por exemplo, Cumber et al., J. Immunol., 149, 120-126 (1992); King et al, Cancer Res., 54, 6176-6185 (1994); Li et al., Bioconjugate Chem., 13, 985-995 (2002); Yang et al., Protein Engineering, 16, 761-770 (2003); e Olafson et al., Protein Engineering Design & Selection, 17, 21-27 (2004). Um método preferido para introdução de cisteínas livres é aquele ensinado por King, no Pedido Provisório dos Estados Unidos N° de Série 60/957.271, depositado em 22 de agosto de 2007, em que uma sequência de aminoácido suportando cisteína é adicionada ao C-terminal da cadeia pesada de um anticorpo. Este método introduz um número conhecido de resíduos de cisteína (um por cadeia pesada) em uma localização conhecida remota do local de ligação de antígeno. As descrições dos documentos citados neste parágrafo são todas aqui incorporadas por referência.

[000216] Em outra modalidade, os grupos de lisina ε-amino podem ser modificados com reagentes heterobifuncionais tal como 2-iminotiolana ou N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP), convertendo um grupo ε-amino em um grupo tiol ou dissulfeto - criando um substituto de cisteína. Contudo, este método sofre das mesmas limitações de localização de conjugação e estequiometria associadas com grupos ε- amino corretos.

Molécula Parceira D

[000217] A molécula parceira D pode ser um agente terapêutico ou um marcador. Se o primeiro, pode ser, por exemplo, uma citotoxina, um fármaco não citotóxico (por exemplo, um imunosupressor), um agente radioativo, outro anticorpo, ou uma enzima ou fragmento ativo desta, tais como abrin, ricin A, pseudomonas exotoxin, ou toxina de difteria; uma proteína tal como fator de necrose de tumor ou interferon-y; ou, modificadores de resposta biológica tais como, por exemplo, linfoquinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator de estimulação de colônia de macrófago granulócito ("GM- CSF"), fator de estimulação de colônia de granulócito ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento. Se o último, ele pode ser qualquer porção que gera um sinal detectável, tal como uma radioetiqueta, uma etiqueta fluorescente, ou uma enzima que catalisa uma modificação detectável a um substrato. Exemplos de isótopos radioativos que podem ser conjugados a anticorpos para uso diagnosticamente ou terapeuticamente incluem, mas não são limitados a, iodo131, índio111, ítrio90 e lutécio177. O método para preparação de radioimunconjugados são estabelecidos na técnica. Exemplos de radioimunoconjugados são comercialmente disponíveis, incluindo Zevalin® (IDEC Pharmaceuticals) e Bexxar® (Corixa Pharmaceuticals), e métodos similares podem ser usados para preparar radioimunoconjugados usando-se os anticorpos da invenção.

[000218] Uma citotoxina ou agente citotóxico incluem qualquer agente que é prejudicial a (por exemplo, mata) células. Exemplos incluem taxol, cotochalasin B, gramicidin D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposide, tenoposide, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicin, daunorubicin, di-hidróxi antracina diona, mitoxantrona, mitramicina, 1- de-hidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos destes.

[000219] Onde molécula parceira D é um agente terapêutico, classes adequadas de agentes terapêuticos incluem antimetabólitos, agentes de alquilatação, ligantes de ranhura menor de DNA, intercaladores de DNA, reticuladores de DNA, inibidores de histona deacetilase, inibidores de exportação nuclear, inibidores de proteasome, inibidores de topoisomerase I ou II, inibidores de proteína de choque de calor, inibidores de tirosina quinase, antibióticos, e agentes antimitóticos. Exemplos de agentes terapêuticos adequados incluem actinomicina D, antraciclinas, antramicina (AMC), auristatin, bleomicina, busulfan, calicheamicina, camptotecina, carmustina, clorambucil, cis- diclorodiamina platina (II) (DDP), cisplatina, colchicina, ciclofosfamida, citarabina, citochalasin B, dactinomicina, daunorubicin, decarbazina, 1- de-hidrotestosterona, dibromomanitol, di-hidroxiantracindiona, doxorubicina, emetina, epotilona, brometo de etídio, etoposide, 5- fluorouracil, gemcitabina, glucocorticoides, gramicidin D, imatinib, irinotecan, β-lapachona, lidocaína, lomustina, maitansina, mecloretamina, melpalan, 6-mercaptopurina, metotrexato, mitramicina, mitomicina C, mitoxantrona, paclitaxel, procaína, propranolol, puromicina, ricin, estreptozotocin, ácido suberoilanilida hidroxâmico (SAHA), talisomicina, tenoposide, tetracaina, tioepa, 6-tioguanina, tubulisin, vinblastina, vincristina, e análogos, homólogos ou derivados destes.

[000220] Preferivelmente, molécula parceira D é uma citotoxina selecionada a partir do grupo consistindo de auristatinas (especialmente MMAE e MMAF), antibióticos ienediona (especialmente calicheamicin e CalichDMH), doxorubicin, maitansinoides (especialmente DM1 e DM4), Pseudomonas exotoxin A (especialmente sua forma truncada), alquiladores de ligação de ranhura menor de DNA (especialmente CC1065 e análogos de duocarmicina), e análogos ou derivados destes. Um exemplo de um conjugado de anticorpo de calicheamicina é comercialmente disponível (Mylotarg®; American Home Produtos). Aqueles versados na técnica apreciarão que as citotoxinas precedentes são produtos muito mais naturais e que alguma modificação destes - isto é, derivatização - pode ser desejável ou necessário para torná-los prontos para conjugação.

[000221] Alquilador de ligação de ranhura menor de DNA preferido é um análogo ou um derivado de CC-1065 e as duocarmicinas estruturalmente relacionadas, exemplos adequados dos quais são revelados em Ng et al., US 7.087.600 B2 (2006); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., US 7.129.261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317 A1 (2006); Chen et al., US 2006/0004081 A1 (2006); Gangwar et al., US 2006/0247295 A1 (2006); Boyd et al., WO 2007/038658 A2 (2007); Gangwar et al., WO 2007/051081 A1 (2007); Gangwar et al., WO 2007/059404 A2 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); e Chen et al., Pedido PCT N° PCT/US2008/054362, depositado em 20 de fevereiro de 2008; as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência. Tais moléculas parceiras D preferidas podem ser representadas pela fórmula (b):

no qual o sistema de anel A é um arila substituída ou não substituída, um heteroarila substituída ou não substituída, um grupo heterocicloalquila substituída ou não substituída, tal como fenila ou pirrol; E G são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, um heteroátomo, ou uma ligação simples, ou E G são unidos para formar um sistema de anel selecionado de arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída e heterocicloalquila substituída ou não substituída; X é O, S ou NR23, onde R23 é a H, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, ou acila; R3 é (=O) ou OH; R4, R4’, R5 e R5’ são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituída, heteroarila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, halogênio, NO2, NR15R16, NC (O)R15, OC (=O)NR15R16, OC (=O)OR15, C(=O)R15, SR15, OR15, CR15=NR16, ou O (CH2) nN (CH3)2, onde n é um inteiro de 1 a 20, ou qualquer par adjacente de R4, R4’, R5 e R5’, junto com os átomos de carbono aos quais eles são fixados, são unidos para formar uma cicloalquila substituída ou não substituída ou sistema de anel de heterocicloalquila tendo de 4 a 6 membros; R15 e R16 são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, heteroalquila substituída ou não substituída, arila substituída ou não substituído, heteroarila substituída ou não substituída, heterocicloalquila substituída ou não substituída, ou peptidila substituída ou não substituída, onde R15 e R16 juntos com o átomo de nitrogênio ao qual eles são fixados são opcionalmente unidos para formar um sistema de anel de heterocicloalquila substituída ou não substituída tendo de 4 a 6 membros, opcionalmente contendo dois ou mais heteroátomos; R6 é uma ligação simples que está ou presente ou ausente; R7 é CH2-X1 ou -CH2-, com a condição que quando R6 está presente, R6 e R7 são unidos para formar um anel ciclopropila; E X1 é um grupo de saída tal como Cl, Br, F, mesolato, ou tosilato.

[000222] Uma molécula parceira de fórmula (b) pode ser conjugada via um de R3, R4, R4’, R5, e R5’, preferivelmente via R3 (quando R3 é OH) ou R4, mais preferivelmente via R4. Também, R3 pode conduzir uma porção de profármaco, conforme discutido aqui abaixo.

[000223] Uma molécula parceira preferida de fórmula (b) é representada pela fórmula (c):

no qual R3, R4, R4’, R5, R5’, R6, e R7 são conforme definidos aqui acima; Z é O, NH, ou N (alquila inferior); e R1, R1’, R2, e R2’ são independentemente H, alquila inferior substituída ou não substituída, ciano, alcóxi, halogênio, C(=O)R8, ou CO2R8, no qual R8 é NR9R10 ou OR9, no qual R9 e R10 são independentemente H, alquila substituída ou não substituída, ou heteroalquila substituída ou não substituída.

[000224] Uma modalidade mais preferida é mostrada na fórmula (d):

no qual X1 é conforme anteriormente definido e X2 é

[000225] Um exemplo de uma molécula parceira D específica é representado pela fórmula (e):

Onde a molécula parceira D é uma citotoxina, ela pode ser provida de profármaco, isto é, ter fixado a mesma uma porção de profármaco cuja remoção é requerida para ativá-la. Preferivelmente, o grupo de profármaco (1) é removido por um mecanismo de reação diferente daquela para clivagem da citotoxina a partir do conjugado, (2) não é removido ou é somente vagarosamente removido enquanto o conjugado está em circulação no plasma do sangue, mas (3) é eficientemente removido no tecido ou célula alvo. Consequentemente, se o conjugado é casualmente clivado antes de alcançar o tecido ou célula alvo, a citotoxina é liberada em sua forma de profármaco ainda inativa, eliminando ou reduzindo citotoxicidade a tecidos ou células não alvos. Isto é, o requerimento para uma segunda clivagem para ativar a citotoxina proporciona um fator seguro. No exemplo de uma citotoxina de acordo com as fórmulas (b), (c), (d) ou (e), um local preferido para fixação de um grupo de profármaco está na posição etiquetada com um "4". Para aumentar o fator de segurança onde a clivagem do grupo C e remoção da porção de profármaco são ambas mediadas por enzimas, é preferível que enzimas diferentes sejam envolvidas.

[000226] Exemplos não limitativos de grupos de profármacos incluem ésteres, carbamatos, fosfatos e glicosídeos. Para ilustrar, a hidroxila de posição 4 nas citotoxinas de fórmulas ((b)-(e) pode ser providacom profármaco com as seguintes porções de profármaco:

[000227] A molécula parceira D pode também ser um marcador. O marcador pode ser qualquer etiqueta que gera um sinal detectável, tal como uma radioetiqueta, uma etiqueta fluorescente, ou uma enzima que catalisa uma modificação detectável um substrato. Marcadores (também denominados grupos repórteres ou etiquetas detectáveis) são bem conhecidos na área de imunoensaios, pesquisa biomédica, e diagnose médica, e podem ser detectados por meios espectroscópicos, fotoquímicos, bioquímicos, imunoquímicos, elétricos, óticos ou químicos. O marcador é preferivelmente um isótopo radioativo, um agente fluorescente ou quimioluminescente ou precursor destes, um cromóforo, uma enzima, ou combinações destes. Exemplos de enzimas adequadas são peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β- galactosidase, e glicose oxidase. Agentes fluorescentes incluem fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansila, umbelliferona, etc. Compostos quimioluminescentes incluem luciferin e 2,3-di-hidroftalazinadionas tal como luminol.

Ligador -(XZ)aC(XD)b-

[000228] Conforme notado acima, a porção articuladora de um conjugado desta invenção compreende até três elementos: um grupo clivável C e espaçadores opcionais XZ e XD.

[000229] O grupo clivável C é selecionado de forma tal que ele seja relativamente estável, enquanto o conjugado está na circulação geral do plasma do sangue é prontamente clivado uma vez que o conjugado alcança seu local de ação pretendido. Preferivelmente, o conjugado é internalizado por endocitose por uma célula alvo sob ligação do anticorpo Z a um antígeno descrito na superfície da célula alvo. Subsequentemente, a clivagem do grupo C ocorre em um corpo vesicular da célula alvo (um endossomo precoce, um endossomo posterior, ou, especialmente, uma lisosima).

[000230] Em uma modalidade, o grupo C é um grupo sensível ao pH. O pH no plasma sanguíneo está levemente acima de neutro, enquanto o pH dentro do lisossomo é acídico, cerca de 5. Desse modo, um grupo C cuja clivagem é catalisada ácida clivará a uma taxa várias ordens de grandeza mais rápida dentro de um lisossomo do que na taxa do plasma sanguíneo. Exemplos de grupos sensíveis a ácido adequados incluem cis-aconitila amidas e hidrazonas, conforme descrito em Shen et al., US 4.631.190 (1986); Shen et al., US 5.144.011 (1992); Shen et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 102, 1048-1054 (1981) e Yang et al., Proc. Natl Acad. Sci (USA), 85, 1189-1193 (1988); as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.

[000231] Em outra modalidade, o grupo C é um dissulfeto. Os dissulfetos podem ser clivados por um mecanismo de troca de tiol- dissulfeto, a uma taxa dependente da concentração de tiol ambiente. A medida que a concentração intracelular de glutationa e outros tióis é mais alta do que suas concentrações de soros, a taxa de clivagem de um dissulfeto será mais alta intracelularmente. Adicionalmente, a taxa de troca de tiol-dissulfeto pode ser modulada pelo ajuste das características estéricas e eletrônicas do dissulfeto (por exemplo, um alquil-aril dissulfeto versus um alquil-alquil dissulfeto; substituição no anel arila, etc.), capacitando o desenho de articulações de dissulfeto que têm estabilidade intensificada de soro ou uma taxa de clivagem particular. Para descrições adicionais relacionadas a grupo dissulfeto cliváveis em conjugados, vide, por exemplo, Thorpe et al., Cancer Res. 48, 6396-6403 (1988); Santi et al., US 2005/0287155 A1 (2005); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., WO 2002/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317 A1 (2006); e Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); as descrições das quais são aqui incorporadas por referência.

[000232] Um grupo C preferido compreende uma ligação de peptídeo que é clivada preferencialmente por uma protease no local de ação pretendido, conforme oposto a por uma protease no soro. Tipicamente, o grupo C compreende de 1 a 20 aminoácidos, preferivelmente de 1 a 6 aminoácidos, mais preferivelmente de 1 a 3 aminoácidos. O(s) aminoácido(s) pode(m) ser a-aminoácidos naturais e/ou não naturais. Os aminoácidos naturais são aqueles codificados pelo código genético, bem como aminoácidos derivados destes, por exemplo, hidroxiprolina, Y-carboxiglutamato, citrulina, e O-fosfoserina. O termo aminoácido também inclui análogos de aminoácido e miméticos. Os análogos são compostos tendo a mesma estrutura geral H2N(R)CHCO2H de um aminoácido natural, exceto que o grupo R não é um encontrado entre os aminoácidos naturais. Exemplos de análogos incluem homoserina, norleucina, metionina-sulfóxido, e metionina metil sulfônio. Um aminoácido mimético é um composto que tem uma estrutura diferente da estrutura química geral de um a-aminoácido, mas funciona em uma maneira similar a um. O termo "aminoácido não natural" é pretendido representar a forma estereoquímica "D", os aminoácidos naturais sendo da forma "L".

[000233] Preferivelmente, o grupo C contém uma sequência de aminoácido que é uma sequência de reconhecimento de clivagem para uma protease. Muitas sequências de reconhecimento de clivagem são conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Matayoshi et al. Science 247: 954 (1990); Dunn et al. Meth. Enzymol. 241: 254 (1994); Seidah et al. Meth. Enzymol. 244: 175 (1994); Thornberry, Meth. Enzymol. 244: 615 (1994); Weber et al. Meth. Enzymol. 244: 595 (1994); Smith et al. Meth. Enzymol. 244: 412 (1994); e Bouvier et al. Meth. Enzymol. 248: 614 (1995); as descrições das quais são aqui incorporadas por referência.

[000234] Para conjugados que não são pretendidos para serem internalizados por uma célula, um grupo C pode ser escolhido tal que ele é clivado por uma protease presente na matriz extracelular na vizinhança do tecido alvo, por exemplo, uma protease liberada por células de corante mais próximas ou uma protease associada a tumor. Proteases associadas a tumor extracelulares exemplares são timet oligopeptidase (TOP) e CD10.

[000235] Para conjugados que são designados para ser internalizados por uma célula, o grupo C preferivelmente compreende uma sequência de aminoácido selecionada para clivagem por uma protease endossomal ou lisossomal, especialmente a última. Exemplos não limitativos de tais proteases incluem catepsinas B, C, D, H, L e S, especialmente catepsina B. A catepsina B preferencialmente cliva peptídeos a uma sequência -AA2-AA1- onde AA1 é um aminoácido de ligação de hidrogênio fortemente ou básico (tal como lisina, arginina, ou citrulina) e AA2 é um aminoácido hidrofóbico (tal como fenilalanina, valina, alanina, leucina, ou isoleucina), por exemplo, Val-Cit (onde Cit denota citrulina), ou Val-Lys. (Aqui, sequências de aminoácido são escritas na direção N-para-C, como em H2N-AA2-AA1-CO2H, a menos que o contexto indique claramente de outro modo). Para informação adicional com relação a grupo de catepsina clivável, vide, Dubowchik et al., Biorg. Med. Chem. Lett. 8, 3341-3346 (1998); Dubowchik et al., Bioorg. Med. Chem. Lett., 8 3347-3352 (1998); e Dubowchik et al., Bioconjugate Chem. 13, 855-869 (2002); as descrições dos quais são incorporadas por referência.

[000236] Em uma modalidade, o Grupo C é um peptídeo compreendendo as duas sequências de aminoácido -AA2-AA1- no qual AA1 é lisina, arginina, ou citrulina, e AA2 é fenilalanina, valina, alanina, leucina ou isoleucina. Em outra modalidade, C consiste de uma sequência de um a cinco aminoácidos selecionados a partir do grupo consistindo de Val-Cit, Ala-Val, Val-Ala-Val, Lys-Lys, Pro-Val-Gly-Val-Val (SEQ ID NO:45), Ala-Asn-Val, Val-Leu-Lys, Cit-Cit, Val-Lys, Lys, Cit, Ser, e Glu.

[000237] A preparação e desenho dos grupos cliváveis C compreendendo um aminoácido simples é adicionalmente discutida em Chen et al., Pedido PCT N° PCT/US2008/054362, depositado em 20 de fevereiro de 2008, a descrição dos quais é aqui incorporada por referência.

[000238] O grupo C pode também ser um grupo fotoclivável, por exemplo, um nitrobenzil éter que é clivado sob exposição à luz.

[000239] O grupo C pode ser ligado diretamente ao anticorpo Z ou molécula parceira D; isto é, espaçadores XZ e XD, conforme o caso pode ser, pode estar ausente. Por exemplo, se o grupo C é um dissulfeto, um dos dois enxofres pode ser um resíduo de cisteína ou seu substituto no anticorpo Z. Ou, o grupo C pode ser uma hidrazona ligada a um aldeído em uma cadeia lateral de carboidrato. Ou, o grupo C pode ser uma ligação de peptídeo formada com um grupo de lisina ε-amino do anticorpo Z.

[000240] Quando presente, o espaçador XZ proporciona separação espacial entre o grupo C e o anticorpo Z, a fim de que o primeiro não interfira estericamente com a ligação de antígeno pelo último, ou o último interfira estericamente com a clivagem do primeiro. Adicionalmente, o espaçador XZ pode ser usado para conferir solubilidade aumentada ou propriedades de agregação diminuídas aos conjugados. Um espaçador XZ pode compreender um ou mais segmentos modulares que podem ser unidos em qualquer número de combinações. Exemplos de segmentos adequados para um espaçador XZ são:

onde o subscrito r é 1 a 24, preferivelmente 2 a 4. Estes segmentos podem ser combinados para produzir espaçadores XZ tais como:

[000241] O espaçador XD, se presente, proporciona separação espacial entre o grupo C e a molécula parceira D, a fim de que o último não interfira estericamente ou eletronicamente com a clivagem do primeiro. O espaçador XD também pode servir para introduzir massa molecular adicional e funcionalidade química em um conjugado. Geralmente, a massa adicional e funcionalidade afetarão a meia vida do soro e outras propriedades do conjugado. Desse modo, através de seleção judiciosa dos grupos de espaçadores, a meia-vida do soro de um conjugado pode ser modulada. O espaçador XD também pode ser unido dos segmentos modulares, conforme descrito acima no contexto do espaçador XZ.

[000242] Qualquer espaçador XZ ou XD, ou ambos, podem compreender uma porção de autoimolação. Brevemente, uma porção de autoimolação é uma porção que (1) é ligada ao grupo C e ou ao anticorpo Z ou à molécula parceira D, e (2) tem uma estrutura tal que a clivagem do grupo C inicia uma sequência de reação que resulta na porção de autoimolação para própria não ligação do anticorpo Z ou molécula parceira D, conforme o caso pode ser. Em outras palavras, uma reação no local distal do anticorpo Z ou molécula parceira D (clivagem do grupo C) faz com que a ligação XZ-Z ou XD-D se rompa também. A presença de uma porção de autoimolação é desejável no caso do espaçador XD porque, se, após clivagem do conjugado, o espaçador XD ou uma porção deste permanecem fixados à molécula parceira D, a atividade biológica da última pode ser prejudicada. O uso de uma porção de autoimolação é especialmente preferido onde o grupo clivável C é um olipeptídeo.

[000243] Porções de autoimolação (i)-(v) ligadas a um grupo hidroxila ou amino em uma molécula parceira D são mostradas abaixo:

[000244] Em cada exemplo, a porção de autoimolação é a estrutura entre linhas tracejadas a e b, com características estruturais adjacentes mostradas para proporcionar o contexto. As porções de autoimolação (i) e (v) são ligadas a uma molécula parceira D-NH2 (isto é, molécula parceira D é conjugada via um grupo amino), enquanto porções de autoimolação (ii), (iii), e (iv) são ligadas a uma molécula parceira D-OH (isto é, molécula parceira D é conjugada via um grupo hidroxila). A clivagem da ligação amida na linha tracejada b (isto é, o grupo C é a peptídeo) libera o nitrogênio amida como um nitrogênio amina, iniciando uma sequência de reação que resulta na clivagem da ligação na linha tracejada a, e a consequente liberação da molécula parceira D-OH ou D-NH2, conforme o caso pode ser. Para descrições adicionais com relação a porções de autoimolação, vide, Carl et al., J. Med. Chem., 24 (3), 479-480 (1981); Carl et al., WO 81/01145 (1981); Dubowchik et al., Pharmacology & Therapeutics, 83, 67-123 (1999); Firestone et al., US 6.214.345 B1 (2001); Toki et al., J. Org. Chem. 67, 1866-1872 (2002); Doronina et al., Nature Biotechnology 21 (7), 778-784 (2003) (erratum, p. 941); Boyd et al., WO 2005/112919 (2005); Boyd et al., WO 2007/038658 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); Feng, US 7.375.078 B2 (2008); e Sentermet al., US 2003/0096743 A1 (2003); as descrições dos quais são incorporadas por referência.

Exemplos de Conjugados

[000245] Exemplos de conjugados produzidos com um anticorpo Z(SH)m desta invenção (onde m é 1, 2, 3, 4, ou 5) são mostrados abaixo. Os conjugados A-1 a A-6 e A-8 a A-15 são conjugados em que o grupo clivável C compreende uma ligação de peptídeo. Os conjugados A-7 e A-16 são conjugados em que o grupo clivável C é uma hidrazona. Os conjugados A-17 e A-18 são conjugados em que o grupo clivável C é um dissulfeto. Nos conjugados A-1 a A-2, A-5 a A-9, A-11 a A-14, e A-16, a molécula parceira D é uma citotoxina tendo uma porção de profármaco fixada a esta. Os conjugados A-10, A-11, A-14, e A-15 são conjugados tendo uma porção de autoimolação (duas no caso de conjugado A-10). Os conjugados A-1 a A-8 e A-10 a A-18 ilustram o uso de espaçadores tendo segmentos modulares.

[000246] Onde presente nas fórmulas precedentes, Hal é Cl ou Br e R30 é o grupo de profármaco de carboxiesterase-clivável carbamato mostrado abaixo:

Preparação de Conjugados

[000247] Os conjugados desta invenção preferivelmente são preparados primeiro por união de molécula parceira D e ligador (XZ) aC (XD)b para formar uma porção D-(XZ) aC (XD) b-R31, onde R31 é um grupo funcional para reação com um grupo funcional no anticorpo Z, para formar o conjugado. Exemplos de grupos adequados R21 incluem:

, onde R32 é Cl, Br, F, mesilato, ou tosilato, e R33 é Cl, Br, I, F, OH, -O-N-succinimidil, -O-(4-nitrofenil), -O-pentafluorofenil, ou - O-tetrafluorofenil. A preparação de porções adequadas D-(XZ) aC (XD) b-R31 é revelada em Ng et al., US 7.087.600 B2 (2006); Ng et al., US 6.989.452 B2 (2006); Ng et al., US 7.129.261 B2 (2006); Ng et al., WO 02/096910 A1 (2002); Boyd et al., US 2006/0024317 A1 (2006); Chen et al., US 2006/0004081 A1 (2006); Gangwar et al., US 2006/0247295 A1 (2006); Boyd et al., WO 2007/038658 A2 (2007); Gangwar et al., WO 2007/051081 A1 (2007); Gangwar et al., WO 2007/059404 A2 (2007); Sufi et al., WO 2008/083312 A2 (2008); e Chen et al., Pedido PCT N° PCT/US2008/054362, depositado em 20 de fevereiro de 2008; as descrições dos quais são aqui incorporadas por referência.

[000248] Em uma modalidade preferida (fórmula M), R31 é um grupo maleimida e o grupo funcional no anticorpo Z é um grupo tiol conforme ilustrado em seguida, usando-se conjugado A-2 onde Hal é Cl e anticorpo Z(SH)m:

Fórmula M

[000249] O seguinte é um procedimento ilustrativo, baseado na introdução de grupos tiol livres em um anticorpo pela reação de seus grupos de lisina ε-amino com 2-iminotiolano, seguido por reação com uma porção articulador-fármaco D-(XZ) aC (XD) b-R31, onde R31 é maleimida. Inicialmente o anticorpo é tampão trocado em 0,1 M de tampão de fosfato (pH 8,0) contendo 50 mM de NaCl e 2 mM de DTPA e concentrado a 5-10 mg/mL. A tiolação é alcançada através da adição de 2-iminotiolano ao anticorpo. A quantidade de 2-iminotiolano a ser adicionada pode ser determinada por um experimento preliminar e varia de anticorpo para anticorpo. No experimento preliminar, uma titulação de quantidades aumentadas de 2-iminotiolano é adicionada ao anticorpo, e seguindo incubação com o anticorpo por 1 hora à temperatura ambiente, o anticorpo é desalgado em 50 mM de tampão de HEPES pH 6,0 HEPES usando-se uma coluna de Sephadex G-25 e o número de grupos tiol introduzidos determinado rapidamente por reação com ditiodipiridina (DTDP). A reação de grupos tiol com DTDP resulta na liberação de tiopiridina, que pode ser monitorada espectroscopicamente a 324 nm. AS amostras a uma concentração de proteína de 0,5-1,0 mg/mL são tipicamente usadas. A absorvência a 280 nm pode ser usada para determinar precisamente a concentração de proteína nas amostras, e, em seguida, uma alíquota de cada amostra (0,9 mL) é incubada com 0,1 mL de DTDP (5 mM de solução de estoque em etanol) por 10 minutos à temperatura ambiente. Amostras vazias de tampão somente mais DTDP são também incubadas. Após 10 minutos, a absorvência a 324 nm é medida e o número de grupos tiol é quantificado usando-se um coeficiente de extinção para tiopiridina de 19.800 M-1.

[000250] Tipicamente um nível de tiolação de três grupos tiol por anticorpo é desejado neste procedimento. Por exemplo, com alguns anticorpos isto pode ser alcançado pela adição de um excesso 15 vezes de 2-iminotiolano, seguido por incubação à temperatura ambiente por 1 hora. O anticorpo é, em seguida, incubado com 2-iminotiolano na proporção molar desejado e, em seguida, desalgado em tampão de conjugação (50 mM pH 6,0 de tampão HEPES contendo 5 mM de glicina e 2 mM de DTPA). O material tiolatado é mantido em gelo, enquanto o número de tióis introduzido é quantificado conforme descrito acima.

[000251] Após verificação do número de tióis introduzidos, a porção de fármaco-articulador D-(XZ)aC(XD)b-R31 é adicionada a um excesso molar de 3 vezes por tiol. A reação de conjugação é permitida proceder em tampão de conjugação também contendo uma concentração final de 5% de dimetilsulfóxido (DMSO), ou solvente alternativo similar. Comumente, a solução de estoque de fármaco-articulador é dissolvida em 100% de DMSO. A solução de estoque é adicionada diretamente ao anticorpo tiolatado, que tem bastante DMSO adicionado para trazer a concentração final a 10%, ou pré-diluído em tampão de conjugação contendo uma concentração final de 10% de DMSO, seguido por adição a um volume igual de anticorpo tiolatado.

[000252] A mistura de reação de conjugação é incubada à temperatura ambiente por 2 horas com agitação. Em seguida à incubação, a mistura de reação de conjugação é centrifugada e filtrada através de filtro de 0,2 μm. A purificação do conjugado pode ser alcançada através de cromatografia usando-se um número de métodos. Em um método, o conjugado é purificado usando-se cromatografia de exclusão de tamanho em uma coluna Sephacryl S200 pré-equilibrada com 50 mM pH 7,2 de tampão HEPES contendo 5 mM de glicina e 50 mM de NaCl. A cromatografia é efetuada a uma taxa de fluxo linear de 28 cm/h. As frações contendo conjugado são coletadas, reunidas e concentradas. Em um método alternativo, purificação pode ser alcançada através de cromatografia de troca de íon. As condições variam de anticorpo para anticorpo e devem ser otimizadas em cada caso. Por exemplo, a mistura de reação de conjugado de anticorpo- fármaco é aplicada a uma coluna SP-Sepharose pré-equilibrada em 50 mM pH 5,5 de HEPES contendo 5mM de glicina,. O anticorpo conjugado é eluído usando-se um gradiente de 0-1 M de NaCl em tampão de equilíbrio a pH 5,5. Frações relevantes contendo o conjugado são reunidas e dialisadas contra tampão de formulação (50 mM pH 7,2 de tampão HEPES contendo 5 mM de glicina e 100 mM de NaCl).

[000253] Aqueles versados na técnica compreenderão que as condições acima descritas e metodologia são exemplares e não limitativas e que outras aproximações para conjugação de anticorpos são conhecidas na técnica e utilizáveis na presente invenção.

ADEPT

[000254] Em outra modalidade, um anticorpo de acordo com esta invenção é conjugado a uma enzima para uso em terapia de prófármaco de enzima direcionada de anticorpo (ADEPT). Na ADEPT, uma enzima é guiada a um local de tumor pelo anticorpo ao qual ela é conjugada. Aqui, a enzima age em um prófármaco subsequentemente administrado para liberar localmente o fármaco ativo correspondente. Vide, por exemplo, Melton et al., J. Natl Cancer Inst. 88(3/4), 153-165 (1996). Enzimas exemplares que podem ser conjugadas para uso em ADEPT incluem carboxipeptidase A e G2, fosfatase alcalina, β-glucuronidase, β-lactamase, β-glucosidase, penicilina amidase, aminopeptidase, citosina deaminase, e nitroreductase.

[000255] Devido a ADEPT não requerer a liberação da enzima a partir do anticorpo, a presença de um grupo clivável entre o anticorpo e a enzima não é mandatária. Desse modo, um conjugado de ADEPT pode ser representado pela fórmula (f) Z-X-D (f) onde Z é um anticorpo desta invenção; D é uma enzima, e X é um articulador que liga Z e D.

Imunoconjugados

[000256] Imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidas como "imunotoxinas".

[000257] As citotoxinas podem ser conjugadas a anticorpos da invenção usando-se tecnologia de articulador disponível na técnica. Exemplos de tipos de articuladores que foram usados para conjugar uma citotoxina a um anticorpo incluem, mas não são limitados a, hidrazonas, tioéteres, ésteres, articuladores contendo dissulfetos e peptídeo. Um articulador pode ser escolhido, isto é, por exemplo, susceptível a clivagem por baixo pH dentro do compartimento lisossomal ou susceptível a clivagem por proteases, tais como proteases preferencialmente expressas em tecido de tumor, tal como catepsinas (por exemplo, catepsinas B, C, D).

Moléculas Biespecíficas

[000258] Em outro aspecto, a presente invenção caracteriza moléculas biespecíficas compreendendo um anticorpo anti-CADM1, ou um fragmento deste, da invenção. Um anticorpo da invenção, ou porção de ligação de antígenos deste, pode ser derivatizado ou ligado a outra molécula funcional, por exemplo, outro peptídeo ou proteína (por exemplo, outro anticorpo ou ligante para um receptor) para gerar uma molécula biespecífica que se liga a pelo menos dois locais de ligação diferentes ou moléculas alvos. O anticorpo da invenção pode, de fato, ser derivatizado ou ligado a mais do que uma outra molécula funcional para gerar moléculas multiespecíficas que se ligam a mais do que dois locais de ligação diferentes e/ou moléculas alvos; tais moléculas multiespecíficas são também pretendidas para serem envolvidas pelo termo "molécula biespecífica" conforme aqui usado. Para criar uma molécula biespecífica da invenção, um anticorpo da invenção pode ser funcionalmente ligado (por exemplo, por acoplamento químico, fusão genética, associação não covalente, ou de outro modo) a uma ou mais outras moléculas de ligação, tal como outro anticorpo, fragmento de anticorpo, peptídeo ou mimético de ligação, tal que uma molécula biespecífica resulta.

[000259] Consequentemente, a presente invenção inclui moléculas biespecíficas compreendendo pelo menos uma primeira especificidade de ligação para CADM1 e uma segunda especificidade de ligação para um segundo epítope alvo. Em uma modalidade particular da invenção, o segundo epítope alvo é um receptor de Fc, por exemplo, FcyRI humano (CD64) ou um receptor de Fcα humano (CD89). Portanto, a invenção inclui moléculas biespecíficas capazes de se ligarem a ambas FcyR ou FcαR que expressam células efetuadoras (por exemplo, monócitos, macrófagos ou células polomorfonucleares (PMNs)), e a células alvo que expressam CADM1. Estas moléculas biespecíficas alvo de CADM1 que expressam células a célula efetuadora e disparam atividades de célula efetuadora mediada por receptor, tais como fagocitose de CADM1 que expressa células, citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), liberação de citoquina, ou geração de ânion de superóxido.

[000260] Em uma modalidade da invenção em que a molécula biespecífica é multiespecífica, a molécula pode adicionalmente incluir uma terceira especificidade de ligação, em adição a uma especificidade de ligação anti-Fc e uma especificidade de ligação anti-CADM1. Em uma modalidade, a terceira especificidade de ligação é uma porção de fator de anti-intensificação (EF), por exemplo, uma molécula que se liga a uma proteína de superfície envolvida na atividade citotóxica e, desse modo, aumenta a resposta imune contra a célula alvo. A "porção de fator de anti-intensificação" pode ser um anticorpo, fragmento de anticorpo funcional ou a ligante que se liga a uma dada molécula, por exemplo, um antígeno ou um receptor, e, desse modo, resulta em uma intensificação do efeito dos determinantes de ligação para o receptor de Fc ou antígeno de célula alvo. A "porção de fator de anti-intensificação" pode se ligar a um receptor Fc ou a um antígeno de célula alvo. Alternativamente, a porção de fator de anti-intensificação pode se ligar a uma entidade que seja diferente da entidade a qual a primeira e segunda especificidades de ligação se ligam. Por exemplo, a porção de fator de anti-intensificação pode se ligar a uma célula T citotóxica (por exemplo, via CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 ou a outra célula imune que resulta em uma resposta imune aumentada contra a célula alvo).

[000261] Em uma modalidade, as moléculas biespecíficas da invenção compreendem como uma especificidade de ligação pelo menos um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo deste, incluindo, por exemplo, um Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb ou um Fv de cadeia simples. O anticorpo pode também ser um dímero de cadeia leve ou de cadeia pesada, ou qualquer fragmento mínimo deste tal como um Fv ou um construto de cadeia simples conforme descrito na Patente dos Estados Unidos N° 4.946.778 para Ladner et al., os conteúdos da qual é expressamente incorporado por referência.

[000262] Em uma modalidade, a especificidade de ligação para um receptor de FCY é provida por um anticorpo monoclonal, a ligação da qual não é bloqueada por imunoglobulina humana G (IgG). Conforme aqui usado, o termo "receptor de IgG" se refere a qualquer dos oito genes de cadeia-y localizados no cromossomo 1. Estes genes codificam um total de doze isoformas de transmembrana ou de receptor solúvel que são agrupados em três classes de receptor de Fcy: FcyRI (CD64), FcyRII(CD32), e FcyRIII (CD16). Em uma modalidade preferida, o receptor de FCY é um FcyRI de alta afinidade humana. O FcyRI humano é uma molécula de 72 kDa, que mostra alta afinidade para IgG monomérica (108 - 109 M-1).

[000263] A produção e caracterização de certos anti-Fcy □ □anticorpos monoclonais preferidos são descritas na Publicação PCT WO 88/00052 e na Patente dos Estados Unidos N° 4.954.617 para Fanger et al., os ensinamentos dos quais são totalmente incorporados por referência aqui. Estes anticorpos se ligam a um epítope de FcyRI, FcyRII ou FcyRIII em um local que é distinto do local de ligação de Fcy do receptor e, desse modo, sua ligação não é bloqueada substancialmente por níveis fisiológicos de IgG. Anticorpos anti-FcyRI específicos úteis nesta invenção são mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 e mAb 197. O mAb 32 de produção de hibridoma é disponível a partir de American Type Culture Collection, ATCC N° de Acesso HB9469. Em outras modalidades, o anticorpo de receptor de anti-Fcy é uma forma humanizada de anticorpo monoclonal 22 (H22). A produção e caracterização do anticorpo H22 é descrita em Graziano, R.F. et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 e Publicação PCT WO 94/10332 para Tempest et al. A linhagem de célula de produção de anticorpo H22 foi depositada na American Type Culture Collection sob a designação HA022CL1, e tem o n° de acesso CRL 11177.

[000264] Em ainda outras modalidades preferidas, a especificidade de ligação para um receptor de Fc é provida por um anticorpo que se liga a um receptor de IgA humana, por exemplo, um receptor de Fc-alfa (Fc aRI (CD89)), a ligação do qual não é preferivelmente bloqueada por imunoglobulina A humana (IgA). O termo "receptor de IgA" é pretendido para incluir o produto de gene de um a-gene (FcaRI) localizado no cromossomo 19. Este gene é conhecido para codificar várias isoformas de transmembrana alternativamente divididas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) é constitutivamente expresso nos monócitos/macrófagos, granulócitos eosinofílicos e neutrofílicos, mas não em populações de célula não efetuadora. FcaRI tem afinidade de meio (® 5 x 107 M-1) para ambas IgA1 e IgA2, que é aumentada sob exposição a citoquinas tais como G-CSF ou GM-CSF (Morton, H.C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16:423-440). Quatro anticorpos monoclonais específicos de FcaRI, identificados como A3, A59, A62 e A77, que se ligam a Fca RI fora do domínio de ligação de ligante de IgA, foram descritos (Monteiro, R.C. et al. (1992) J. Immunol. 148:1764).

[000265] FcaRI e FcyRI são receptores disparadores preferidos para uso nas moléculas biespecíficas da invenção porque eles são (1) expressos principalmente em células efetuadoras imunes, por exemplo, monócitos, PMNs, macrófagos e células dendríticas; (2) expressos em altos níveis (por exemplo, 5.000-100.000 por célula); (3) mediadores de atividades citotóxicas (por exemplo, ADCC, fagocotose); e (4) apresentação de antígenos intensificados mediados, incluindo autoantígenos, alvejados para os mesmos.#p.78

[000266] Enquanto os anticorpos monoclonais humanos são preferidos, outros anticorpos que podem ser empregados nas moléculas biespecíficas da invenção são anticorpos monoclonais de murino, quiméricos e humanizados.

[000267] As moléculas biespecíficas da presente invenção podem ser preparadas por conjugação das especifidades de ligação constituintes, por exemplo, as especificidades de ligação de anti-FcR e anti-CADM1, usando-se métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, cada especificidade de ligação da molécula biespecífica pode ser gerada separadamente e, em seguida, conjugada a uma outra. Quando as especificidades de ligação são proteínas ou peptídeos, uma variedade de agentes de acoplamento ou de reticulação pode ser usada para conjugação covalente. Exemplos de agentes de reticulação incluem proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5,5'- ditiobis(ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM), N-succinimidil-3-(2-piridilditio)propionato (SPDP), e sulfosuccinimidil 4- (N-maleimidometil) ciclohaxano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) (vide, por exemplo, Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160:1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:8648). Outros métodos incluem aqueles descritos em Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. N° 78, 118-132; Brennan et al. (1985) Science 229:81-83, e Glennie et al. (1987) J. Immunol. 139: 2367-2375). Agentes de conjugação preferidos são SATA e sulfo-SMCC, ambos disponíveis de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL).

[000268] Quando as especificidades de ligação são anticorpos, eles podem ser conjugados via ligação de sulfidril das regiões de articulação C-terminais das duas cadeia pesadas. Em uma modalidade particularmente preferida, a região de articulação é modificada para conter um número ímpar de resíduos sulfidril, preferivelmente um, antes da conjugação.

[000269] Alternativamente, ambas especificidades de ligação podem ser codificadas no mesmo vetor e expressas e unidas na mesma célula hospedeira. Este método é particularmente útil onde a molécula biespecífica é um mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 ou ligante x proteína de fusão de Fab. Uma molécula biespecífica da invenção pode ser uma molécula de cadeia simples compreendendo um anticorpo de cadeia simples e um determinante de ligação, ou uma molécula biespecífica de cadeia simples compreendendo dois determinantes de ligação. As moléculas biespecíficas podem compreender pelo menos duas moléculas de cadeia simples. Métodos para preparação de moléculas biespecíficas são descritos, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos Números 5.260.203; 5.455.030; 4.881.175; 5.132.405; 5.091.513; 5.476.786; 5.013.653; 5.258.498; e 5.482.858, todas das quais são expressamente aqui incorporadas por referência.

[000270] A ligação das moléculas biespecíficas a seus alvos específicos pode ser confirmada por, por exemplo, ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio (RIA), Análise de FACS, bioensaio (por exemplo, inibição de crescimento), ou ensaio de Mancha de Western. Cada um destes ensaios geralmente detecta a presença de complexos de proteína-anticorpo de interesse particular pelo emprego de um reagente etiquetado (por exemplo, um anticorpo) específico para o complexo de interesse. Por exemplo, os complexos de FcR-anticorpo podem ser detectados usando-se, por exemplo, um anticorpo ligado a enzima ou fragmento de anticorpo que reconhece e especificamente se liga aos complexos de anticorpo-FcR. Alternativamente, os complexos podem ser detectados usando-se qualquer de uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, o anticorpo pode ser radioativamente etiquetado e usado em um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986, que é incorporado por referência aqui). O isótopo radioativo pode ser detectado por meios tais como o uso de um contador Y, ou um contador de cintilação, ou por autoradiografia

Fragmentos de Anticorpos e Miméticos de Anticorpo

[000271] A presente invenção não é limitada a anticorpos tradicionais, e pode ser praticada através do uso de fragmentos de anticorpo e miméticos de anticorpo. Conforme detalhado abaixo, uma ampla variedade de tecnologias de fragmento de anticorpo e mimético de anticorpo foi agora desenvolvida, e são amplamente conhecidas na técnica. Enquanto um número destas tecnologias, tais como anticorpos de domínio, Nanocorpos, e UniCorpos, faz uso de fragmentos de, ou outras modificações a, estruturas tradicionais de anticorpo, existem também tecnologias alternativas, tais como Afficorpos, DARPins, Anticalins, Avímeros, e Versacorpos que empregam estruturas de ligação que, enquanto elas imitam a ligação de anticorpo tradicional, são geradas de e funcionam via mecanismos distintos.

[000272] Os Anticorpos de Domínio (dAbs) são as menores unidades de ligação funcional de anticorpos, correspondente às regiões variáveis de ou as cadeias pesada (VH) ou leve (VL) de anticorpos humanos. Os Anticorpos de Domínio têm um peso molecular de aproximadamente 13 kDa. Domantis desenvolveu uma série de bibliotecas grandes e altamente funcionais de VH e VL dAbs humanos totais (mais do que dez bilhões de sequências diferentes em cada biblioteca), e usam estas bibliotecas para selecionar dAbs que são específicos para alvos terapêuticos. Em contraste a muitos anticorpos convencionais, Anticorpos de Domínio são bem expressos em sistemas de célula bacterial, de levedura, e de mamífero. Detalhes adicionais de anticorpos de domínio e métodos de produção destes podem ser obtidos por referência às Patentes dos Estados Unidos 6.291.158; 6.582.915; 6.593.081; 6.172.197; 6.696.245; N° de Série dos Estados Unidos 2004/0110941; Pedido de patente europeu N° 1433846 e Patentes Européias 0368684 & 0616640; WO05/035572, WO04/101790, WO04/081026, WO04/058821, WO04/003019 e WO03/002609, cada um do qual é aqui incorporado por referência em sua totalidade.

[000273] Nanocorpos são proteínas terapêuticas derivadas de anticorpo que contêm as propriedades estruturais únicas e funcionais de anticorpos de cadeia pesada que ocorrem naturalmente. Estes anticorpos de cadeia pesada contêm um domínio variável simples (VHH) e dois domínios constantes (CH2 e CH3). Importantemente, o domínio de VHH clonado e isolado é um polipeptídeo perfeitamente estável que abriga a capacidade de ligação de antígeno total do anticorpo de cadeia pesada original. Os nanocorpos têm uma alta homologia com os domínios VH de anticorpos humanos, e podem ser adicionalmente humanizados sem qualquer perda de atividade. Importantemente, os Nanocorpos têm um baixo potencial imunogênico, que foi confirmado nos estudos primários com compostos de condução de Nanocorpo.

[000274] Os nanocorpos combinam as vantagens de anticorpos convencionais com características importantes de fármacos de molécula pequena. Os nanocorpos mostram alta especificidade alvo, alta afinidade para seu alvo e baixa toxicidade inerente. Contudo, similar a fármacos de molécula pequena eles podem inibir enzimas e prontamente acessar clivagens de receptor. Além disso, os Nanocorpos são extremamente estáveis, podem ser administrados por meios outros do que injeção (vide, por exemplo, WO 04/041867, que é aqui incorporado por referência em sua totalidade) e são fáceis de produzir. Outras vantagens dos Nanocorpos incluem o reconhecimento incomum ou oculto de epítopes como um resultado de seu pequeno tamanho, ligação em cavidades ou locais ativos de alvos de proteína com alta afinidade e seletividade devido a sua flexibilidade de formato de fármaco única 3-dimensional, proporcionando meia vida e facilidade e velocidade de descoberta de fármaco.

[000275] Os Nanocorpos são codificados por genes simples e são eficientemente produzidos em quase todos os hospedeiros procarióticos e eucarióticos, por exemplo, E. coli (vide, por exemplo, US 6.765.087, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade), moldes (por exemplo, Aspergillus ou Trichoderma) e levedura (por exemplo, Saccharomyces, Kluyveromyces, Hansenula ou Pichia) (vide, por exemplo, US 6.838.254, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade). O processo de produção é escalável e quantidades de multi- kilograma de Nanocorpos foram produzidas. Devido aos Nanocorpos exibirem uma estabilidade superior comparada com anticorpos convencionais, eles podem ser formulados como uma solução de armazenamento longo e pronta para uso.

[000276] O método de Nanoclone (vide, por exemplo, WO 06/079372, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade) é um método proprietário para geração de Nanocorpos contra um alvo desejado, baseado na seleção de alta produção automática de células-B, e pode ser usado no contexto da presente invenção.

[000277] UniCorpos são outras tecnologias de fragmento de anticorpo; contudo, esta tecnologia é baseada na remoção da região de articulação de anticorpos de IgG4. A anulação da região de articulação resulta em uma molécula que é essencialmente metade do tamanho de anticorpos de IgG4 tradicionais e tem uma região de ligação univalente preferivelmente do que a região de ligação bivalente de anticorpos de IgG4. É também bem conhecido que os anticorpos de IgG4 são inertes e, desse modo, não interagem com o sistema imune, que pode ser vantajoso para o tratamento de doenças onde uma resposta imune não é desejada, e esta vantagem é passada nos UniCorpos. Por exemplo, os UniCorpos pode funcionar para inibirem ou silenciar, mas não matar, as células as quais eles são ligados. Adicionalmente, a ligação do UniCorpo às células de câncer não as estimulam a proliferar. Além disso, devido aos UniCorpos serem cerca de metade do tamanho dos anticorpos de IgG4 tradicionais, eles podem mostrar melhor distribuição sobre tumores sólidos maiores com eficácia potencialmente maior. Os UniCorpos são retirados do corpo a uma taxa similar aos anticorpos de IgG4 inteiros, e são capazes de se ligarem com uma afinidade similar a seus antígenos como anticorpos totais. Detalhes adicionais de UniCorpos podem ser obtidos por referência a patente WO2007/059782, que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[000278] As moléculas de Afficorpo representam uma nova classe de proteínas de afinidade baseadas em um domínio de proteína de 58 resíduos de aminoácido, derivado de um dos domínios de ligação de IgG de proteína A staphylococcal. Estes três domínios de feixe de espiral foram usados como um suporte para a construção de bibliotecas de fagemid combinatóriacombinatórias, das quais variantes de Afficorpo que têm como alvo as moléculas desejadas podem ser selecionadas usando-se tecnologia de descrição de fago (Nord K, Gunneriusson E, Ringdahl J, Stahl S, Uhlen M, Nygren PA, Proteínas de ligação selecionadas de bibliotecas combinatóriais de um domínio de receptor bacterial de α-espiral, Nat Biotechnol 1997;15:772-7. Ronmark J, Gronlund H, Uhlen M, Nygren PA, Imunoglobulina A humana (IgA)- ligantes específicos de projeto combinatórial de proteína A, Eur J Biochem 2002;269:2647-55.). A estrutura simples, robusta das moléculas de Afficorpo em combinação com seu baixo peso molecular (6 kDa), as tornam adequadas para uma ampla variedade de aplicações, por exemplo, reagentes de detecção (Ronmark J, Hansson M, Nguyen T, et al, Construção e caracterização de quimeras de afficorpo-Fc produzidas em Escherichia coli, J Immunol Methods 2002;261:199-211) e para inibir interações de receptor (Sandstorm K, Xu Z, Forsberg G, Nygren PA, Inhibition of the CD28-CD80 co stimulation signal by a CD28-binding Affibody ligand developed by combinatórial protein engineering, Protein Eng 2003;16:691-7). Detalhes adicionais de Afficorpos e métodos de produção destes podem ser obtidos por referência a Patente dos Estados Unidos 5831012 que é aqui incorporada por referência em sua totalidade.

[000279] Afficorpos Etiquetados podem também serem úteis em aplicações de imagem para determinação de abundância de Isoformas.

[000280] DARPins (Proteínas de Repetição de Ankyrin Designadas) são um exemplo de uma tecnologia de mimético de anticorpo DRP (Proteína de Repetição Designada) que foi desenvolvida para explorar as capacidades de ligação de polipeptídeos de não anticorpo. As proteínas de repetição tais como ankyrin ou proteínas de repetição ricas em leucina, são moléculas de ligação ubíquas, que ocorrem, diferente de anticorpos, intra- e extracelularmente. Duas unidades estruturais de repetição de arquitetura modular única (repetições), que empilham juntas para formar domínios de repetição alongados revelando superfícies de ligação alvo variáveis e modulares. Baseado nesta modularidade, bibliotecas combinatóriais de polipeptídeos com especificidades de ligação altamente diversificadas podem ser geradas. Esta estratégia inclui o desenho de consenso de repetições autocompatíveis revelando resíduos de superfície variável e sua montagem aleatória em domínios de repetição.

[000281] DARPins podem ser produzidos em sistemas de expressão bacterial em rendimentos muito altos e eles pertencem às proteínas mais estáveis conhecidas. DARPins de alta afinidade, altamente específicos, a uma ampla faixa de proteínas alvos, incluindo receptores humanos, citoquinas, kinases, proteases humanas, vírus e proteínas de membrana, foram selecionados. DARPins tendo afinidades na faixa de nanomolar de dígito simples a picomolar podes ser obtidos.

[000282] DARPins foram usados em uma ampla faixa de aplicações, incluindo ELISA, ELISA de intercalação, análise citométrica de fluxo (FACS), imuno-histoquímica (IHC), aplicações de chip, purificação de afinidade ou manchamento de Western. Os DARPins também se comprovam serem altamente ativos no compartimento intracelular, por exemplo, como proteínas marcadoras intracelulares fundidas à proteína fluorescente verde (GFP). Os DARPins foram adicionalmente usados para inibir entrada viral com IC50 na faixa de pM. Os DARPins não são somente ideais para bloquear interações de proteína-proteína, mas também para inibir enzimas. As proteases, kinases e veículos foram bem sucedidamente inibidos, mais frequentemente um modo de inibição alostérico. Enriquecimentos muito rápidos e específicos no tumor e tumor muito favorável a proporções de sangue produzem DARPins bem adequados para diagnósticos in vivo ou aproximações terapêuticas.

[000283] Informação adicional com relação a DARPins e outras tecnologias de DRP podem ser encontradas na Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2004/0132028, e Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 02/20565, ambos dos quais são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade.

[000284] Anticalins são uma tecnologia de mimético de anticorpo adicional; contudo neste caso a especificidade de ligação é derivada de lipocalins, uma família de proteínas de baixo peso molecular que são naturalmente e abundantemente expressas em tecidos humanos e fluidos do corpo. Os lipocalins têm evoluído para realizar uma faixa de funções in vivo associadas com o transporte fisiológico e armazenagem de compostos quimicamente sensíveis ou insolúveis. Os lipocalins têm uma estrutura intrínseca robusta compreendendo um β-recipiente altamente conservado que suporta quatro voltas em um terminal da proteína. Estas voltas formam a entrada a uma bolsa de ligação e diferenças conformacionais nesta parte da contagem da molécula para a variação na especificidade de ligação entre lipocalins individuais.

[000285] Enquanto a estrutura total de voltas hipervariáveis suportadas por uma estrutura de β-folha conservada é reminiscente das imunoglobulinas, os lipocalins diferem consideravelmente dos anticorpos em termos de tamanho, sendo compostos de uma cadeia de polipeptídeo simples de 160-180 aminoácidos que é marginalmente maior do que um domínio de imunoglobulina simples.

[000286] Os lipocalins são clonados e seus circuitos fechados são submetidos a projeto de modo a criar Anticalins. As bibliotecas de Anticalins estruturalmente diversas foram geradas e a descrição de Anticalin permite a seleção e classificação de função de ligação, seguido pela expressão e produção de proteína solúvel para análise adicional em sistemas procarióticos ou eucarióticos. Estudos têm demonstrado bem sucedidamente que Anticalins podem ser desenvolvidos, que são específicos para virtualmente qualquer proteína alvo humana poder ser isolada e afinidades de ligação na faixa nanomolar ou mais alta podem ser obtidas.

[000287] Anticalins podem também serem formatados como proteínas alvos duplas, assim denominadas Duocalins. A Duocalin liga dois alvos terapêuticos separados em uma proteína monomérica facilmente produzida usando-se processos de produção padrões, enquanto retém especificidade alvo e afinidade indiferente da orientação estrutural de seus dois domínios de ligação.

[000288] A modulação de alvos múltiplos através de uma molécula simples é particularmente vantajosa em doenças conhecidas por envolver mais do que um fator causativo simples. Além disso, formatos de ligação bi- ou multivalentes tais como Duocalins têm potencial significante em ter como alvo moléculas de superfície de célula em doença, mediando efeitos agonísticos nas trajetórias de transdução de sinal ou induzindo efeitos de internalização intensificados, via ligação e agrupamento de receptores de superfície de célula. Além disso, a alta estabilidade intrínseca de Duocalins é comparável a Anticalins monoméricos, oferecendo formulação flexível e distribuição potencial para Duocalins.

[000289] Informação adicional com relação a Anticalins pode ser encontrada na Patente dos Estados Unidos N° 7.250.297 e Publicação de Pedido de Patente Internacional N° WO 99/16873, ambos dos quais são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade.

[000290] Outra tecnologia de mimético de anticorpo útil no contexto da presente invenção são Avímeros. Os Avímeros são evoluídos de uma grande família de domínios de receptor extracelular humano por embaralhamento de exon in vitro e descrição de fago, gerando proteínas de multidomínio com ligação e propriedades inibitórias. A ligação múltipla independente de domínios de ligação foi mostrada criar a avidez e resulta na afinidade aperfeiçoada e especificidade comparada com proteínas de ligação de epítope simples convencionais. Outras vantagens potenciais incluem produção simples e eficiente de moléculas específicas multialvo em Escherichia coli, termoestabilidade aperfeiçoada e resistência a proteases. Os Avímeros com afinidades subnanomolares foram obtidos contra uma variedade de alvos.

[000291] Informação adicional com relação a Avímeros pode ser encontrada nas Publicações de Pedido de Patente dos Estados Unidos Nos. 2006/0286603, 2006/0234299, 2006/0223114, 2006/0177831, 2006/0008844, 2005/0221384, 2005/0164301, 2005/0089932, 2005/0053973, 2005/0048512, 2004/0175756, todos dos quais são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade.

[000292] Os Versacorpos são outra tecnologia de mimético de anticorpo que pode ser usada no contexto da presente invenção. Os Versacorpos são pequenas proteínas de 3-5 kDa com >15% de cisteínas, que formam um suporte de densidade de dissulfeto alto, substituindo o núcleo hidrofóbico que as proteínas típicas têm. A substituição de um grande número de aminoácidos hidrofóbicos compreendendo o núcleo hidrofóbico, com um pequeno número de dissulfetos resulta em uma proteína que é menor, mais hidrofílica (menos agregação e ligação não específica), mais resistente a proteases e calor, e tem uma baixa densidade de epítopes de célula-T, porque os resíduos que contribuem mais para a apresentação de MHC são hidrofóbicos. Todas as quatro destas propriedades são bem conhecidas por afetarem a imunogenicidade, e juntas elas são esperadas causarem uma grande diminuição na imunogenicidade.

[000293] A inspiração para Versacorpos vem dos biofarmacêuticos injetáveis naturais produzidos por sanguessugas, serpentes, aranhas, escorpiões, lesmas e anêmonas, que são conhecidos por exibir imunogenicidade inesperadamente baixa. Partindo-se das famílias de proteína natural selecionada, por delineação e por classificação do tamanho, hidrofobicidade, processamento de antígeno proteolítico, e densidade de epítope são minimizadas a níveis distante abaixo da média para proteínas injetáveis naturais.

[000294] Dada a estrutura de Versacorpos, estes miméticos de anticorpo oferecem um formato versátil que inclui multivalência, multiespecificidade, uma diversidade de mecanismos de meia vida, módulos de alvejamento de tecido e a ausência da região Fc do anticorpo. Além disso, Versacorpos são produzidos em E. coli em altos rendimentos, e devido a sua hidrofilicidade e pequeno tamanho, os Versacorpos são altamente solúveis e podem ser formulados a altas concentrações. Os Versacorpos são excepcionalmente estáveis ao calor (eles podem ser fervidos) e oferecem vida útil prolongada.

[000295] Informação adicional com relação a Versacorpos pode ser encontrada ma Publicação de Pedido de Patente dos Estados Unidos N° 2007/0191272 que é, desse modo, incorporada por referência em sua totalidade.

[000296] A descrição detalhada de tecnologias de fragmento de anticorpo e mimético de anticorpo provida acima não é pretendida para ser uma lista compreensiva de todas as tecnologias que podem ser usadas no contexto do presente relatório descritivo. Por exemplo, e também não por meio de limitação, uma variedade de tecnologias adicionais incluindo tecnologias à base de polipeptídeo alternativas, tais como fusões de regiões de determinação complementares, conforme esboçadas em Qui et al., Nature Biotechnology, 25(8) 921-929 (2007), que é, desse modo, incorporado por referência em sua totalidade, bem como tecnologias à base de ácido nucleico, tais como tecnologias de aptâmero de RNA descritas nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.789.157. 5.864.026. 5.712.375. 5.763.566. 6.013.443. 6.376.474. 6.613.526. 6.114.120. 6.261.774, e 6.387.620, todas das quais são, desse modo, incorporadas por referência, podem ser usadas no contexto da presente invenção.

Composições Farmacêuticas

[000297] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combinação de anticorpos monoclonais, ou porções de ligação de antígeno(s) dos mesmos, da presente invenção, formulados com um veículo farmaceuticamente aceitável. Tais composições podem incluir um ou uma combinação de (por exemplo, dois ou mais diferentes) anticorpos, ou imunoconjugados ou moléculas biespecíficas da invenção. Por exemplo, uma composição farmacêutica da invenção pode compreender uma combinação de anticorpos (ou imunoconjugados ou biespecíficos) que se ligam a epitopos diferentes do antígeno alvo, ou que têm atividades complementares.

[000298] As composições farmacêuticas da invenção também podem ser administradas em terapia de combinação, isto é, combinadas com outros agentes. Por exemplo, a terapia de combinação pode incluir um anticorpo anti-CADM1 da presente invenção combinado com pelo menos um outro agente anti-inflamatório ou imunossupressor. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser usados na terapia de combinação são descritos em maiores detalhes abaixo na seção de usos dos anticorpos da invenção.

[000299] Conforme aqui usado, "veículo farmaceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacterial e antifungal, agentes de retardamento isotônico e de absorção, e similares, que são fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é adequado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidermal (por exemplo, por injeção ou infusão). Dependendo da rota de administração, o composto ativo, isto é, anticorpo, imunoconjugado ou molécula biespecífica, pode ser revestido em um material para proteger o composto da ação de ácidos e outras condições naturais que podem inativar o composto.

[000300] Os compostos farmacêuticos da invenção podem incluir um ou mais sais farmaceuticamente aceitáveis. Um "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se a um sal que retém a atividade biológica desejada do composto de origem e não concede quaisquer efeitos toxicológicos indesejados (vide, por exemplo, Berge, S.M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66:1-19). Exemplos de tais sais incluem sais de adição ácidos e sais de adição básicos. Os sais de adição ácidos incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos não tóxicos, tais como hidroclórico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, hidrobrômico, hidroiódico, fosforoso e similares, bem como de ácidos orgânicos não tóxicos, tais como ácidos di- e mono-carboxílicos alifáticos, ácidos alcanoicos fenil-substituído, ácidos hidróxi alcanoico, ácidos aromáticos, ácidos sulfônicos alifáticos e aromáticos, e similares. Os sais de adição básicos incluem aqueles derivados de metais alcalinos terrosos, tais como sódio, potássio, magnésio, cálcio e similares, bem como de aminas orgânicas não tóxicas, tais como N,N'- dibenzoletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína, e similares.

[000301] Uma composição farmacêutica da invenção também pode incluir um antioxidante farmaceuticamente aceitável. Exemplos de antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis incluem: (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cisteína hidrocloreto, bissulfato de sódio, metabissulfito de sódio, sulfito de sódio, e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como ascorbil palmitato, hidroxianisol butilatado (BHA), hidroxitolueno butilatado (BHT), lecitin, propol galato, alfa-tocoferol, e similares; e (3) agentes de quelatação de metal, tais como ácido cítrico, etilenodiamina ácido tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico, e similares.

[000302] Exemplos de veículos aquosos e não aquosos adequados que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tal como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tal como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitin, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersões, e pelo uso de surfactantes.

[000303] Estas composições podem também conter adjuvantes, tais como conservantes, agentes de umedecimento, agentes de emulsificação e agentes de dispersão. A prevenção de presença de micro-organismos pode ser assegurada tanto por procedimentos de esterilização, como pela inclusão de vários agentes antibacteriais e antifungais, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol ácido sórbico, e similares. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares, nas composições. Em adição, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser considerada pela inclusão de agentes que retardam absorção, tal como monoestearato de alumínio e gelatina.

[000304] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquosas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções injetáveis estéreis ou dispersão. O uso de tal meio e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio convencional ou agente é incompatível com o composto ativo, o uso deste nas composições farmacêuticas da invenção é contemplado. Compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas composições.

[000305] Composições terapêuticas tipicamente devem ser estéreis e estáveis sob as condições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma solução, microemulsão, lipossomo, ou outra estrutura ordenada adequada à alta concentração de fármaco. O veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol, e polietileno glicol líquido, e similares), e misturas adequadas destes. A fluidez correta pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitin, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, polialcoóis tais como manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser considerada por incluir na composição um agente que retarda absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina.

[000306] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas por incorporação do composto ativo na quantidade requerida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, conforme requerido, seguido por microfiltração de esterilização. Geralmente, dispersões são preparadas pela incorporação do composto ativo em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são secagem por vácuo e congelamento-secagem (liofilização) que produz um pó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente desejado adicional de uma solução filtrada estéril previamente deste.

[000307] A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem simples variará dependendo do indivíduo sendo tratado, e do modo particular de administração. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com um material veículo para produzir uma forma de dosagem simples geralmente será aquela quantidade da composição que produz um efeito terapêutico. Geralmente, fora de dez porcento, esta quantidade variará de cerca de 0,01 porcento a cerca de noventa e nove porcento de ingrediente ativo, preferivelmente de cerca de 0,1 porcento a cerca de 70 porcento, mais preferivelmente de cerca de 1 porcento a cerca de 30 porcento de ingrediente ativo em combinação com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[000308] Os regimes de dosagem são ajustados para proporcionar a resposta desejada ótima (por exemplo, uma resposta terapêutica). Por exemplo, uma massa simples pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas sobre o tempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada conforme indicado pelas exigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições parenterais na forma de dosagem unitária de administração e uniformidade de dosagem. A forma de dosagem unitária conforme aqui usada se refere a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os indivíduos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade predeterminada de composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas por e diretamente dependentes de (a) as características únicas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser alcançado, e (b) as limitações inerentes na técnica de composição de tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade nos indivíduos.

[000309] Para administração do anticorpo, as faixas de dosagem variam de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg, e, mais usualmente, 0,01 a 5 mg/kg, do peso corpóreo do hospedeiro. Por exemplo, as dosagens podem ser 0,3 mg/kg de peso corpóreo, 1 mg/kg de peso corpóreo, 3 mg/kg de peso corpóreo, 5 mg/kg de peso corpóreo ou 10 mg/kg de peso corpóreo ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg. Um regime de tratamento exemplar requer administração uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada três semanas, uma vez a cadaquatro semanas, uma vez em um mês, uma vez todos 3 meses, ou uma vez a cada três a 6 meses. Regimes de dosagem preferidos para um anticorpo anti-CADM1 da invenção incluem 1 mg/kg de peso corpóreo, ou 3 mg/kg de peso corpóreo, via administração intravenosa, com o anticorpo sendo dado usando-se uma das seguintes tabelas de dosagem: (i) a cada quatro semanas para seis dosagens, em seguida a cada três meses; (ii) a cada três semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corpóreo uma vez, seguido por 1 mg/kg de peso corpóreo todas três semanas.

[000310] Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com especificidades de ligação diferentes são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada anticorpo administrada cai dentro das faixas indicadas. O anticorpo é usualmente administrado em ocasiões múltiplas. Intervalos entre dosagens simples podem ser, por exemplo, semanalmente, mensalmente, a cada três meses ou anualmente. Os intervalos podem também ser irregulares conforme indicado por medição de níveis de sangue de anticorpo ao antígeno alvo no paciente. Em alguns métodos, a dosagem é ajustada para alcançar uma concentração de anticorpo de plasma de cerca de 1-1000 μg /ml e, em alguns métodos, cerca de 25-300 μg /ml.

[000311] Alternativamente, o anticorpo pode ser administrado como uma formulação de liberação sustentada, em cujo caso administração menos frequente é requerida. A dosagem e frequência varia dependendo da meia vida do anticorpo no paciente. Em geral, os anticorpos humanos mostram a meia vida mais longa, seguido pelos anticorpos humanizados, anticorpo quiméricos, e anticorpos não humanos. A dosagem e frequência de administração pode variar dependendo se o tratamento é profilático ou terapêutico. Em aplicações profiláticas, uma dosagem relativamente baixa é administrada em intervalos relativamente infrequentes sobre um longo período de tempo. Alguns pacientes continuam a receber tratamento pelo resto de suas vidas. Em aplicações terapêuticas, uma dosagem relativamente alta em intervalos relativamente curtos é às vezes requerida até que a progressão da doença seja reduzida ou terminada, e preferivelmente até que o paciente mostre melhora parcial ou completa dos sintomas da doença. Em seguida, ao paciente pode ser administrado um regime profilático.

[000312] Os níveis de dosagem atuais dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que é efetiva para alcançar a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição, e modo de administração, sem ser tóxico ao paciente. O nível de dosagem desejado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregadas, ou o éster, sal ou amida destas, a rota de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular sendo empregado, a duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e história médica anterior do paciente sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos nas técnicas médicas.

[000313] Uma "dosagem terapeuticamente efetiva" de um anticorpo anti-CADM1 da invenção preferivelmente resulta em uma diminuição na severidade dos sintomas da doença, um aumento na frequência e duração de períodos livres do sintoma da doença, ou uma prevenção de dano ou incapacidade devido à aflição da doença. Por exemplo, para o tratamento de tumores de CADM1+, uma "dosagem terapeuticamente efetiva" preferivelmente inibe o crescimento da célula ou crescimento do tumor por pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente por pelo menos cerca de 40%, ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 60%, e ainda mais preferivelmente por pelo menos cerca de 80% relativo aos indivíduos não tratados. A capacidade de um composto inibir crescimento de tumor pode ser avaliada em um sistema de modelo de animal predisposto de eficácia em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada pelo exame da capacidade do composto inibir crescimento da célula, tal inibição pode ser medida in vitro por ensaios conhecidos àqueles versados no assunto. Uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou, de outro modo, melhorar os sintomas de um indivíduo. Um versado no assunto será capaz de determinar tais quantidades baseado em tais fatores como o tamanho do indivíduo, a severidade dos sintomas do indivíduo, e a composição particular ou rota de administração selecionada.

[000314] Uma composição da presente invenção pode ser administrada via uma ou mais rotas de administração usando-se uma ou mais de uma variedade de métodos conhecidos na técnica. Conforme será apreciado àqueles versados no assunto, a rota e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados. Rotas preferidas de administração para anticorpos da invenção incluem intravenosa, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, subcutânea, espinhal ou outras rotas parenterais de administração, por exemplo, por injeção ou infusão. A frase "administração parenteral", conforme aqui usada, significa modos de administração outros do que administração enteral e tópica, usualmente por injeção, e incluem, sem limitação, intravenosa, injeção intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaraquinoide, intraspinhal, epidural e intrasternal, e infusão.

[000315] Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado via uma rota não parenteral, tal como um rota tópica, epidermal ou mucosal de administração, por exemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, retalmente, sublingualmente ou topicamente.

[000316] Os compostos ativos podem ser preparados com veículos que protegerão o composto contra liberação rápida, tal como formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdermais, e sistemas de distribuição microencapsulados. Polímeros biodegradáveis, biocompatíveis podem ser usados, tais como etileno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoesteres, e ácido polilático. Muitos métodos para a preparação de tais formulações são patenteados ou geralmente conhecidos àqueles versados no assunto. Vide, por exemplo, Sustained e Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[000317] As composições terapêuticas podem ser administradas com dispositivos médicos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade preferida, uma composição terapêutica da invenção pode ser administrada com um dispositivo de injeção hipodérmico sem agulha, tal como os dispositivos descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.399.163; 5.383.851; 5.312.335; 5.064.413; 4.941.880; 4.790.824; ou 4.596.556. Exemplos de implantes bem conhecidos e módulos úteis na presente invenção incluem: Patente dos Estados Unidos N° 4.487.603, que revela uma bomba de micro-infusão implantável para dispersão de medicação a uma taxa controlada; Patente dos Estados Unidos N° 4.486.194, que revela um dispositivo terapêutico para administrar medicamentos através da pele; Patente dos Estados Unidos N° 4.447.233, que revela uma bomba de infusão de medicação para distribuição de medicação a uma taxa de infusão precisa; Patente dos Estados Unidos N° 4.447.224, que revela um aparelho de infusão implantável de fluxo variável para distribuição de fármaco contínua; Patente dos Estados Unidos N° 4.439.196, que revela um sistema de distribuição de fármaco osmótico tendo compartimentos de multicâmara; e Patente dos Estados Unidos N° 4.475.196, que revela um sistema de distribuição de fármaco osmótico. Estas patentes são aqui incorporadas por referência. Muitos outros tais implantes, sistemas de distribuição, e módulos são conhecidos àqueles versados no assunto.

[000318] Em certas modalidades, os anticorpos monoclonais humanos da invenção podem ser formulados para assegurar distribuição correta in vivo. Por exemplo, a barreira sangue-cérebro (BBB) exclui muitos compostos altamente hidrofílicos. Para assegurar que os compostos terapêuticos da invenção cruzem o BBB (se desejado), eles podem ser formulados, por exemplo, em lipossomos. Para métodos de produção de lipossomos, vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 4.522.811; 5.374.548; e 5.399.331. Os lipossomos podem compreender uma ou mais porções que são seletivamente transportadas em células específicas ou órgãos, desse modo, intensificando a distribuição de fármaco alvo (vide, por exemplo, V.V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Porções alvos exemplares incluem folato ou biotin (vide, por exemplo, Patente dos Estados Unidos 5.416.016 para Low et al.); mannosides (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); antibodies (P.G. Bloeman et al. (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); surfactant protein A receptor (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); p120 (Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); vide também K. Keinanen; M.L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346:123; J.J. Killion; I.J. Fidler (1994) Immunométodos 4:273.

Usos e Métodos

[000319] O anticorpos, particularmente os anticorpos humanos, composições de anticorpo e métodos da presente invenção têm numerosas utilidades diagnósticas e terapêuticas in vitro e in vivo envolvendo a diagnose e tratamento de distúrbios mediados por CADM1. Por exemplo, estas moléculas podem ser administradas às células na cultura, in vitro ou ex vivo, ou a indivíduos humanos, por exemplo, in vivo, para tratar, prevenir e diagnosticar uma variedade de distúrbios. Conforme aqui usado, o termo "indivíduo" é pretendido para incluir animais humanos e não humanos. Animais não humanos incluem todos os vertebrados, por exemplo, mamíferos e não mamíferos, tais como primatas não humanos, ovelha, cães, gatos, vacas, cavalos, galinhas, anfíbios, e répteis. Indivíduos preferidos incluem pacientes humanos tendo distúrbios mediados por atividade de CADM1. Os métodos são particularmente adequados para tratamento de pacientes humanos tendo um distúrbio associado com expressão de CADM1 aberrante. Quando anticorpos para CADM1 são administrados juntos com outro agente, os dois podem ser administrados em ou em ordem ou simultaneamente.

[000320] Dada a ligação específica dos anticorpos da invenção para CADM1, os anticorpos da invenção podem ser usados para detectar especificamente expressão de CADM1 na superfície de células e, além disso, podem ser usados para purificar CADM1 via purificação de imunoafinidade.

[000321] Além disso, dada a expressão de CADM1 em várias células de tumor, os anticorpos humanos, composições de anticorpo e métodos da presente invenção podem ser usados para tratar um indivíduo com um distúrbio tumorigênico, por exemplo, um distúrbio caracterizado pela presença de células de tumor que expressam CADM1 incluindo, por exemplo, câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, de trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, de trato gastrintestinal, fígado, ou rim.

[000322] Em uma modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas biespecíficas e composições) da invenção podem ser usados para detectar os níveis de CADM1, ou níveis de células que contêm CADM1 on sua superfície de membrana, cujos níveis podem, em seguida, serem articulados a certos sintomas de doença. Alternativamente, os anticorpos podem ser usados para inibir ou bloquear função de CADM1 que, por sua vez, pode ser articulado à prevenção ou melhora de certos sintomas de doença, implicando, desse modo, em CADM1 como um mediador da doença. Isto pode ser alcançado pelo contato de uma amostra e uma amostra de controle com o anticorpo anti-CADM1 sob condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e CADM1. Quaisquer complexos formados entre o anticorpo e CADM1 são detectados e comparados na amostra e no controle.

[000323] Em outra modalidade, os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e composições) da invenção podem ser inicialmente testados para atividade de ligação associada com uso terapêutico ou diagnóstico in vitro. Por exemplo, as composições da invenção podem ser testadas usando-se os ensaios de citometria de fluxo descritos nos Exemplos abaixo.

[000324] Os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas, imunoconjugados e composições) da invenção têm utilidade adicional na terapia e diagnose de doenças relacionadas a CADM1. Por exemplo, os anticorpos monoclonais humanos, as moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e os imunoconjugados podem ser usados para induzir in vivo ou in vitro uma ou mais das seguintes atividades biológicas: inibir o crescimento de e/ou matar uma célula que expressa CADM1; mediar fagocitose ou ADCC de uma célula que expressa CADM1 na presença de células efetuadoras humanas, ou bloquear ligação de ligante de CADM1 a CADM1.

[000325] Em uma modalidade particular, os anticorpos (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e composições) são usados in vivo para tratar, prevenir ou diagnosticar uma variedade de doenças relacionadas a CADM1. Exemplos de doenças relacionadas a CADM1 incluem, entre outras, tecidos de câncer humano representando câncer de pulmão de célula pequena, câncer pancreático neuroendócrino, câncer de fígado, carcinoides de pulmão, e carcinoides gastrintestinal.

[000326] Rotas adequadas de administração das composições de anticorpo (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção in vivo e in vitro são bem conhecidas na técnica e podem ser selecionadas por aqueles versados no assunto. Por exemplo, as composições de anticorpo podem ser administradas por injeção (por exemplo, intravenosa ou subcutânea). Dosagens adequadas das moléculas usadas dependerão da idade e peso do indivíduo e da concentração e/ou formulação da composição de anticorpo. Conforme previamente descrito, os anticorpos humanos anti-CADM1 da invenção podem ser coadministrados com um ou outros mais agentes terapêuticos, por exemplo, um agente citotóxico, um agente radio tóxico ou um agente imunossupressivo. O anticorpo pode estar articulado ao agente (como um imunocomplexo), ou pode ser administrado separado do agente. No último caso, (administração separada), o anticorpo pode ser administrado antes de, após ou concorrentemente com o agente, ou pode ser coadministrado com outras terapias conhecidas, por exemplo, uma terapia anticâncer, por exemplo, radiação. Tais agentes terapêuticos incluem, entre outros, agentes anti-neoplástico tais como doxorubicina (adriamicina), cisplatina bleomicin sulfato, carmustina, clorambucil, e ciclofosfamida hidroxiureia que, por si mesmas, são somente efetivos em níveis que são tóxicos ou subtóxicos a um paciente. A cisplatina é intravenosamente administrada como uma dose de 100 mg/kg uma vez a cada quatro semanas e adriamicina é intravenosamente administrada como uma dose de 60-75 mg/ml uma vez a cada 21 dias. A coadministração dos anticorpos humanos anti- CADM1, ou fragmentos de ligação de antígenos destes, da presente invenção, com agentes quimioterapêuticos proporcionam dois agentes anticâncer que operam via mecanismos diferentes que produzem um efeito citotóxico a células de tumor humano. Tal coadministração pode solucionar problemas devido ao desenvolvimento de resistência a fármacos ou uma mudança na antigenecidade das células de tumor que tornariam as mesmas não reativas com o anticorpo.

[000327] As células efetuadoras específicas de alvo, por exemplo, células efetuadoras articuladas às composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem também ser usadas como agentes terapêuticos. As células efetuadoras para alvejamento podem ser leucócitos humanos tais como macrófagos, neutrófilos ou monócitos. Outras células incluem eosinófilos, células matadoras originais e outras células que suportam IgG- ou receptor de IgA. Se desejado, as células efetuadoras podem ser obtidas do indivíduo a ser tratado. As células efetuadoras específicas de alvo podem ser administradas como uma suspensão de células em uma solução fisiologicamente aceitável. O número de células administradas pode ser na ordem de 108-109, mas variará dependendo da proposta terapêutica. Em geral, a quantidade será suficiente para obter localização na célula alvo, por exemplo, uma célula de tumor que expressa CADM1, e para afetar morte de célula por, por exemplo, fagocitose. As rotas de administração podem também variar.

[000328] A terapia com células efetuadoras específicas de alvo pode ser realizada em conjunto com outras técnicas para remoção de células alvos. Por exemplo, terapia antitumor usando-se as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção e/ou células efetuadoras providas com estas composições pode ser usada em conjunto com quimioterapia. Adicionalmente, imunoterapia de combinação pode ser usada para direcionar duas populações efetuadoras citotóxicas distintas para rejeição de célula de tumor. Por exemplo, anticorpos anti-CADM1 articulados a anti-Fc-gama RI ou anti-CD3 podem ser usados em conjunto com agentes de ligação específicos de receptor de IgG ou IgA.

[000329] Moléculas biespecíficas e multiespecíficas da invenção podem também ser usadas para modular níveis de FCYR ou FCYR nas células efetuadoras, tais como por capeamento e eliminação de receptores na superfície da célula. As misturas de receptores anti-Fc podem também ser usadas para esta proposta.

[000330] As composições (por exemplo, anticorpos humanos, humanizados, ou anticorpos quiméricos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas e imunoconjugados) da invenção que têm locais de ligação de complemento, tais como porções de IgG1, -2, ou -3 ou IgM que se ligam ao complemento, podem também ser usadas na presença de complemento. Em uma modalidade, tratamento ex vivo de uma população de células compreendendo células alvos com um agente de ligação da invenção e células efetuadoras apropriadas pode ser suplementado pela adição de complemento ou soro contendo complemento. A fagocitose de células alvos revestidas com um agente de ligação da invenção pode ser aperfeiçoada por ligação de proteínas de complemento. Em outra modalidade, as células alvos revestidas com as composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem também ser lisadas pelo complemento. Em ainda outra modalidade, as composições da invenção não ativam o complemento.

[000331] As composições (por exemplo, anticorpo humano, humanizado ou anticorpos quimérico, moléculas multiespecíficas e moléculas biespecíficas e imunoconjugados) da invenção podem também ser administradas junto com complemento. Em certas modalidades, a presente descrição proporciona composições compreendendo anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas e soro ou complemento. Estas composições podem ser vantajosas quando o complemento está localizado em proximidade aos anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas. Alternativamente, os anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas da invenção e o complemento ou soro podem ser administrados separadamente.

[000332] Também dentro do escopo da presente invenção estão kits compreendendo as composições de anticorpo da invenção (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas ou biespecíficas, ou imunoconjugados) e instruções para uso. O kit pode adicionalmente conter um ou mais reagentes adicionais, tais como um reagente imunossupressivo, um agente citotóxico ou um agente radio tóxico, ou um ou mais anticorpos humanos adicionais da invenção (por exemplo, um anticorpo humano tendo uma atividade complementar que se liga a um epitopo no antígeno de CADM1 distinto do primeiro anticorpo humano).

[000333] Consequentemente, pacientes tratados com as composições de anticorpo da invenção podem ser adicionalmente administrados (antes de, simultaneamente com, ou seguindo administração de um anticorpo humano da invenção) com outro agente terapêutico, tal como um agente citotóxico ou radiotóxico, que intensifica ou aumenta o efeito terapêutico dos anticorpos humanos.

[000334] Em outras modalidades, o indivíduo pode ser adicionalmente tratado com um agente que modula, por exemplo, intensifica ou inibe a expressão ou atividade de receptores FCY ou FCY por, por exemplo, tratamento do indivíduo com uma citoquina. Citoquinas preferidas para administração durante tratamento com as moléculas multiespecíficas incluem fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF), fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF), interferon- y (IFN-y), e fator de necrose de tumor (TNF).

[000335] As composições (por exemplo, anticorpos humanos, moléculas multiespecíficas e biespecíficas) da invenção podem também ser usadas em células alvos que expressam FcyR ou CADM1, por exemplo para etiquetação de tais células. Para tal uso, o agente de ligação pode ser articulado a uma molécula que pode ser detectada. Desse modo, a invenção proporciona métodos para localização ex vivo ou in vitro de células que expressam receptores de Fc, tais como FCYR, ou CADM1. A etiqueta detectável pode ser, por exemplo, um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima.

[000336] Em uma modalidade particular, a invenção proporciona métodos para detecção da presença de antígeno de CADM1 em uma amostra, ou medição da quantidade de antígeno de CADM1, compreendendo contactar a amostra, e uma amostra de controle, com um anticorpo monoclonal humano, ou uma porção de ligação de antígeno deste, que especificamente se liga a CADM1, sob condições que permitem formação de um complexo entre o anticorpo ou porção deste e CADM1. A formação de um complexo é, em seguida, detectada, no qual uma formação de complexo de diferença entre a amostra comparada à amostra de controle é indicativa da presença de antígeno de CADM1 na amostra.

[000337] Em outras modalidades, a invenção proporciona métodos para tratamento de um distúrbio mediado por CADM1 em um indivíduo, por exemplo, cânceres humanos, incluindo câncer de pulmão de célula pequena, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, de trato gastrintestinal, rim, fígado, pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), e tumores carcinoides incluindo aqueles de pâncreas, pulmão, de trato gastrintestinal, fígado ou rim.

[000338] Em ainda outra modalidade, imunoconjugados da invenção podem ser usados para compostos alvos (por exemplo, agentes terapêuticos, etiquetas, citotoxinas, rádio toxinas imunossupressoras, etc.) para células que têm receptor de CADM1 de superfície de células por ligação de tais compostos ao anticorpo. Por exemplo, um anticorpo anti-CADM1 pode ser conjugado a qualquer dos compostos de toxina descritos nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 6. 281. 354 e 6.548.530, Publicações de Patente dos Estados Unidos Nos. 20030050331, 20030064984, 20030073852, e 20040087497, ou publicados em WO 03/022806. Desse modo, a invenção também proporciona métodos para localização ex vivo ou in vivo de células que expressam CADM1 (por exemplo, com uma etiqueta detectável, tal como um radioisótopo, um composto fluorescente, uma enzima, ou um cofator de enzima). Alternativamente, os imunoconjugados podem ser usados para matar células que têm receptor de CADM1 de superfícies de célula por citotoxinas alvos ou rádio toxinas a CADM1.

[000339] A presente invenção é adicionalmente ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como adicionalmente limitantes. Os conteúdos de todas as figuras e todas as referências, patentes e pedidos de patente publicados citados através de todo este pedido são expressamente aqui incorporados por referência.

EXEMPLOS Exemplo 1: Geração de Anticorpos monoclonais humanos contra Antígeno de CADM1

[000340] Uma proteína de fusão recombinante composta do domínio extracelular do CADM1 (CADM1 ECD) articulado a um polipeptídeo de não CADM1 (proteína his) (SEQ ID NO:44) foi gerada por métodos recombinantes padrão e usada como antígeno para imunização (vide abaixo).

Cepas de Transgênicas de HuMAb Mouse ® e KM Mouse ®

[000341] Anticorpos monoclonais totalmente humanos a CADM1 foram preparados usando-se cepas HCo7 e HCo27 do HuMAb Mouse® transgênico e a cepa KM de camundongos transgênicos transcromossômicos, cada um dos quais expressa genes de anticorpo humano. Em cada uma destas cepas de camundongo, o gene de cadeia leve de camundongo kappa endógeno foi como um homozigoto rompido conforme descrito em Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820 e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi como um homozigoto rompido conforme descrito no Exemplo 1 da Publicação PCT WO 01/09187. Cada uma destas cepas de camundongo conduz um transgene de cadeia leve kappa humana, KCo5, conforme descrito em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. A cepa HCo7 conduz o transgene de cadeia pesada humano HCo7 conforme descrito nas Patentes dos Estados Unidos Nos. 5.545.806; 5.625.825; e 5.545.807. A cepa HCo27 conduz o transgene de cadeia pesada humana HCo27 conforme descrito na Publicação PCT WO 01/09187. A cepa de KM Mouse® contém o SC20 transcromossomo, conforme descrito na Publicação PCT WO 02/43478.

Imunizações de HuMab e KM

[000342] Para gerar anticorpos monoclonais totalmente humanos para CADM1, camundongos HuMab das cepas HCo7, HCo27 e camundongo KM foram imunizados com proteína purificada recombinante CADM1- ECD-his. Esquemas gerais de imunização para estes camundongos são descritos em Lonberg, N. et al (1994) Nature 368(6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 e Publicação PCT WO 98/24884. Os camundongos tinham 6-16 semanas de idade após a primeira infusão de antígeno. Uma preparação recombinante purificada (5-50 μg) de proteína CADM1-ECD-his foi usada para imunizar o HuMab e KM Mouse®.

[000343] Os camundongos transgênicos foram imunizados com o antígeno em adjuvante Ribi ou intraperitonealmente (IP), subcutaneamente (Sc) ou via salteador (FP) em intervalos de 3-21 dias (até um total de 9 imunizações). A resposta imune foi monitorada por sangrias retroorbitais. O plasma foi classificado por ELISA (conforme descrito abaixo), e os camundongos com titulações suficientes de imunoglobulina humana anti-CADM1 foram usados para fusões. Os camundongos foram agrupados intravenosamente com antígeno 3 e 2 dias antes do sacrifício e remoção do baço. Tipicamente, 10-20 fusões para cada antígeno foram realizadas. Várias dúzias de camundongos foram imunizadas para cada antígeno.

Seleção de um Animal de HuMab Mouse® ou KM Mouse® Produzindo Anticorpos anti-CADM1

[000344] Para selecionar um animal HuMab Mouse® ou KM Mouse® de produção de anticorpos que ligam CADM1, soro de camundongos imunizados foi testado por ELISA conforme descrito por Fishwild, D. et al. (1996)(supra). Brevemente, placas de microtitulação foram revestidas com CADM1 reconbinante purificado a 1-2 μg /ml em PBS, 50 μl/cavidades incubadas a 4°C durante a noite, em seguida bloqueadas com 200 μl/cavidade de 5% de soro de galinha em PBS/Tween (0,05%). As diluições de plasma de camundongos imunizados de CADM1 foram adicionadas a cada cavidade e incubadas por 1-2 horas a temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS/Tween e, em seguida, incubadas com um anticorpo policlonal cabra-anti-humano IgG Fc conjugado com peroxidase de rábano silvestre (HRP) por 1 hora à temperatura ambiente. Após lavagem, as placas foram desenvolvidas com substrato ABTS (Moss Inc, produto: ABTS-1000) e analisadas por espectrofotômetro a OD 415-495. Os camundongos que desenvolvem as titulações mais altas de anticorpos anti-CADM1 foram usados para fusões. As fusões foram realizadas conforme descrito abaixo e sobrenadantes de hibridoma foram testados para atividade anti-CADM1 por ELISA e FACS.

Geração de Hibridomas de Produzindo Anticorpos monoclonais humanos para CADM1

[000345] Os esplenócitos de camundongo, isolados de um HuMab Mouse® e/ou um KM Mouse®, foram fundidos com uma linha de célula de mieloma de camundongo usando-se eletrofusão à base campo elétrico usando-se um eletroporador de fusão de refugo de câmara grande Cyto Pulse (Cyto Pulse Sciences, Inc., Glen Burnie, MD). Brevemente, suspensões de célula simples de linfócitos esplênicos de camundongos imunizados foram fundidos a número igual de Sp2/0 de células de mieloma de camundongo de não secreção (ATCC, CRL 1581). As células foram colocadas a uma densidade de aproximadamente 2x104/cavidade em placas de microtitulação de fundo plano, que foram, em seguida, incubadas em meio seletivo contendo 10% de soro bovino fetal, 10% de meio condicionado P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% de origem (IGEN) em DMEM (Mediatech, CRL 10013, com alta glicose, L-glutamina e piruvato de sódio) mais 5 mM de HEPES, 0,055 mM 2-mercaptoetanol, 50 mg/ml de gentamicina e 1x HAT (Sigma, CRL P-7185). Após 1-2 semanas, as células foram cultivadas em meio no qual o HAT foi substituído com HT. Aproximadamente 10-14 dias após a colocação da célula, os sobrenadantes de cavidades individuais foram classificados primeiro para se eles contêm anticorpos humanos g,k. Os sobrenadantes que foram contados positivos para g,k humano foram, em seguida, subsequentemente classificados por ELISA e FACS (descritos acima) para anticorpos IgG monoclonais humanos anti-CADM1 para anticorpos de IgG. O anticorpo que secreta hibridomas foram transferidos para 24 placas de cavidade, classificado novamente e, se ainda positivo para anticorpos de IgG humanos anti-CADM1 monoclonais, foram subclonados pelo menos duas vezes por limitação da diluição. Os subclones estáveis foram, em seguida, cultivados in vitro para gerar pequenas quantidades de anticorpo em meio de cultura de tecido para caracterização adicional.

[000346] Os clones de hibridoma PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 gerados de um KM Mouse® foram selecionados para análise adicional.

Exemplo 2: Caracterização Estrutural de Anticorpos monoclonais humanos PTA021_A1, PTA021_A2, ou PTA021_A3

[000347] As sequências de cDNA que codificam a região variável de cadeia pesada e leve dos anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 foram obtidas dos hibridomas de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3, respectivamente, usando-se técnicas de PCR padrões e foram sequenciadas usando-se técnicas de sequenciamento de DNA padrões.

[000348] As sequências de anticorpo podem ser mutagenizadas para reverter de volta para os resíduos de linhagem germinativa em um ou mais resíduos. Por exemplo, região variável de cadeia pesada PTA021_A1 pode ser mutagenizada para refletir a sequência de linhagem germinativa em locais específicos (por exemplo, resíduo 30) para remover locais de glicosilação (por exemplo, uma mutação de N30Q).

[000349] O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A1 são mostrados na figura 1A e em SEQ ID NO:19 e 25, respectivamente.

[000350] O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A1 são mostrados na figura 1B e em SEQ ID NO:28 e 22, respectivamente.

[000351] A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de PTA021_A1 para as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de PTA021_A1 utiliza um segmento VH de linhagem germinativa humana VH 2-05, um segmento D da linhagem germinativa humana 6-6, e um segmento JH de linhagem germinativa humana JH 5b. O alinhamento da sequência de PTA021_A1 VH para a sequência de linhagem germinativa VH 2-05 é mostrada na figura 4. A análise adicional da sequência de PTA021_A1 VH usando-se o sistema Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia pesada de CDR1, CDR2 e CD3 conforme mostrado nas figuras 1A e 4, e em SEQ ID NOs:1, 4 e 7, respectivamente.

[000352] A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de PTA021_A1 para as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas demonstrou que a cadeia leve de PTA021_A1 utiliza um segmento de VK da linhagem germinativa humana de VK L15 e um segmento de JK de linhagem germinativa humana de JK 4. O alinhamento da sequência de PTA021_A1 VK para a sequência de linhagem germinativa de VK L15 é mostrado na figura 7. Análise adicional da sequência de PTA021_A1 VK usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrada nas figuras 1B e 7, e em SEQ ID NOs:10, 13 e 16, respectivamente.

[000353] O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A2 são mostrados na figura 2A e em SEQ ID NO:26 e 20, respectivamente.

[000354] O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A2 são mostrados na figura 2B e em SEQ ID NO:29 e 23, respectivamente.

[000355] A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada do PTA021_A2 para as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa humana conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de PTA021_A2 utiliza um segmento de VH de linhagem germinativa humana de VH 2-05, um segmento D da linhagem germinativa humana 6-6, e um segmento JH da linhagem germinativa humana de JH 5b. O alinhamento da sequência de PTA021_A2 VH para a sequência de linhagem germinativa de VH 2-05 é mostrada na figura 5. A análise adicional da sequência de PTA021_A2 VH usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia pesada de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrado nas figuras 2A e 5, e em SEQ ID NOs:2, 5 e 8, respectivamente.

[000356] A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de PTA021_A2 para as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linhagem germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de PTA021_A2 utiliza um segmento de VK da linhagem germinativa humana de VK L15 e um segmento de JK da linhagem germinativa humana de JK 4. O alinhamento da sequência de PTA021_A2 VL para a sequência de linhagem germinativa de VK L15 é mostrada na figura 8. A análise adicional da sequência de PTA021_A2 VK usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de CDR1, CDR2 e CD3 regiões, conforme mostrado nas figuras 2B e 8, e em SEQ ID NOs:11, 14 e 17, respectivamente.

[000357] O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia pesada de PTA021_A3 são mostrados na figura 3A e em SEQ ID NO:27and 21, respectivamente.

[000358] O nucleotídeo e sequências de aminoácido da região variável de cadeia leve de PTA021_A3 são mostrados na figura 3B e em SEQ ID NO:30 e 24, respectivamente.

[000359] A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia pesada de PTA021_A3 para as sequências de cadeia pesada de imunoglobulina de linhagem germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia pesada de PTA021_A3 utiliza um segmento de VH da linhagem germinativa humana de VH 2-05 e um segmento de D da linhagem germinativa humana 6-6, e um segmento JH da linhagem germinativa humana JH JH5b. O alinhamento da sequência de PTA021_A3 VH para a sequência de linhagem germinativa de VH 2-05 é mostrada na figura 6. A análise adicional da sequência de PTA021_A3 VH usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrado nas figuras 3A e 6, e em SEQ ID NOs: 3, 6 e 9, respectivamente.

[000360] A comparação da sequência de imunoglobulina de cadeia leve de PTA021_A3 para as sequências de cadeia leve de imunoglobulina de linhagem germinativa conhecidas demonstrou que a cadeia leve de PTA021_A3 utiliza um segmento de VK da linhagem germinativa humana de VK L15 e um segmento de JK da linhagem germinativa humana de JK 4. O alinhamento da sequência de PTA021_A3 VL para a sequência de linhagem germinativa de VK L15 é mostrada na figura 9. A análise adicional da sequência de PTA021_A3 VL usando-se o sistema de Kabat de determinação de região de CDR conduz a delineação das regiões de cadeia leve de CDR1, CDR2 e CD3, conforme mostrado nas figuras 3B e 9, e em SEQ ID NOs:12, 15, e 18, respectivamente.

Exemplo 3: Caracterização de Propriedades de Ligação de Anticorpos monoclonais de CADM1 Estudos de Citometria de Fluxo

[000361] Neste exemplo, a ligação de mAbs PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3 (NF) para CADM1 de superfície de célula foi examinada por citometria de fluxo.

[000362] Para testar a capacidade dos anticorpos se ligarem a proteína de CADM1 de superfície de célula, os anticorpos foram incubados com células diferentes que expressam CADM1: NCI-H69 (ATCC Designação HTB-119™), uma linha de célula humana de câncer de pulmão de célula pequena; DMS79 (ATCC Designação CRL- 2049™), uma linha de câncer de pulmão de célula pequena humana; SKOV3 (ATCC Designação HTB-77™), uma linha de célula humana de câncer ovariano; A549 (ATCC Designação CCL-185™), uma linha de célula de câncer de pulmão de célula não pequena; SkMel28 (ATCC Designação HTB-72™), uma linha de célula humana e 786-O (ATCC Designação CRL-1932™), uma linha de célula humana de carcinoma de célula renal. Para os estudos de citometria de fluxo, os anticorpos monoclonais de PTA021_A1, PTA021_A2, PTA021_A3 e PTA021_A3 (NF) foram diluídos com 1x PBS frio + 0,1 % de BSA a 40 μg/ml. Para a reação de ligação, 50 μl de solução de anticorpo diluída foi adicionado a 50 μl de suspensão de célula contendo 4 x 105 células e a mistura foi incubada em gelo por 30-60 minutes. As células foram, em seguida, lavadas três vezes com 1x PBS + 0,1 % de BSA. Uma diluição 1:50 de fragmento R-phycoerythrin-etiquetado cabra anti-humano IgG FY F(ab)2 (Jackson ImmunoResearch Labs, Cat. # 109-116-098) foi adicionada e a mistura foi incubada em gelo por 1 hora, seguido por lavagem duas vezes com 1x PBS frio + 0,1 % de BSA. Após a lavagem final, 200 μl de 1x PBS frio + 0,1% de BSA foi adicionado a cada solução e análise de ligação de anticorpo foi efetuada por FACS.

[000363] A figura 10 e Tabela 1 abaixo mostram os resultados da análise de citometria de fluxo e o EC50 para ligação à linha de célula de NCI-H69. Os resultados demonstram que todos os três anticorpos monoclonais se ligam efetivamente a CADM1 humano de superfície de célula. Tabela 1: Ligação de Anticorpos anti-CADM1 a Células que Expressam CADM1 humano

[000364] As figuras 11A e 11B mostram os resultados da análise de citometria de fluxo em NCI-H69 e DMS79 de linhas de célula de câncer de pulmão de célula pequena.

[000365] A figura 12 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo em anticorpo PTA021_A3 no SKOV3 de linha de célula de câncer ovariano.

[000366] A figura 13 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo em anticorpo PTA021_A3 no A549 de linha de célula de câncer de pulmão de célula não pequena.

[000367] A figura 14 mostra os resultados de análise citométrica de fluxo em anticorpo PTA021_A3 em 786-O de linhas de células de carcinoma de célula renal e SkMel28 de célula de melanoma.

[000368] Os resultados das figuras 11 a 14 demonstram que PTA021_A3 se liga efetivamente a CADM1 humano de superfície de célula em células diferentes que expressam CADM1.

[000369] A figura 15 mostra os resultados da análise citométrica de fluxo na versão não fucosilatada de PTA021_A3 (NF) em NCI-H69 e DMS79 de linhas de células de câncer de pulmão de célula pequena. Estes resultados demonstram que a não fucosilação não afeta a ligação de PTA021_A3 a CADM1 humano de superfície de célula.

Exemplo 4: Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo Mediada por Anti-CADM1 mAbs

[000370] Para determinar a capacidade do anti-CADM1 mAbs matar as células que expressam CADM1 na presença de células efetuadoras via citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC), duas linhas de célula, NCI-H69 e DMS79, foram usadas como as células alvos.

[000371] As células efetuadoras humanas foram preparadas de sangue total conforme segue. As células mononucleares de sangue periférico humano foram purificadas de sangue total heparinizado por separação padrão Ficoll-paque. As células foram resuspensas em meio RPMI1640 media contendo 10% de FBS (inativado por calor) e 200 U/ml de IL-2 humano e incubadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células foram coletadas e lavadas quatro vezes em meio de cultura e resuspensas a 1 x 107 células/ml. As células alvos foram preparadas por incubação com reagente BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) a 2,5 μl de BATDA por 1 x 106 células alvos/mL por 20 minutes a 37° C. As células alvos foram lavadas quatro vezes, centrifugadas e trazidas a um volume final de 1 x 105 células/ml.

[000372] As células alvo foram testadas para ADCC específico de anticorpo aos anticorpos monoclonais humanos anti-CADM1 usando-se a análise de emissão de fluorescência Delfia conforme segue. Células NCI-H69 ou DMS79 (100 μl de células alvos etiquetadas, 104 células/cavidade) foram incubadas com 50 μl de células efetuadoras (106cells/cavidade) e 50 μl de anticorpo (10ug/ml de concentração final). Uma proporção de alvo para efetuadora de 1:25 foi usada através de todos os experimentos. Em todos os estudos, um controle de isotipo IgG1 humano foi usado como um controle negativo. As células foram centrifugadas a 2000 rpm e incubadas por uma hora de incubação a 37° C. Os sobrenadantes foram, em seguida, coletados, submetidos a centrifugação e 20 μl de sobrenadante foi transferido para uma placa de fundo plano, a qual 180 μl de solução Eu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foi adicionado e lido em uma leitora RubyStar (BMG Labtech). A % de lisis foi calculada conforme segue: (liberação de amostra - liberação espontânea * 100)/(liberação máxima - liberação espontânea), onde a liberação espontânea é a fluorescência das cavidades que contêm células alvos mais células efetuadoras e liberação máxima é a fluorescência de cavidades contendo células alvos e foram tratadas com 2% de Triton-X.

[000373] Os resultados são resumidos abaixo na Tabela 2 e figuras 16A e 16B, que demonstram que PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 são capazes de induzir especificamente ADCC nas linhas de célula de câncer que expressam CADM1. Tabela 2: Citotoxicidade celular dependente do anticorpo Mediada por Anticorpos PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3

Exemplo 5: Internalização de Anticorpo de CADM1

[000374] Os anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 foram mostrados serem internalizados por células NCI-H69 e DMS79 após ligação às células usando-se um ensaio Hum-Zap. O ensaio Hum-ZAP mostrou internalização dos anticorpos monoclonais anti-CADM1 através da ligação de um anticorpo secundário anti- humano IgG conjugado a toxin saporin. (Advanced Targeting System, San Diego, CA, IT-22-100). Primeiro, PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 foram ligados à superfície das células de NCI-H69 ou DMS79. Em seguida, os anticorpos Hum-ZAP foram ligados aos anticorpos primários. Em seguida, o anticorpo primário/complexo HumZAP foi internalizado pelas células. A entrada de Saporin nas células resultou em inibição da síntese de proteína e eventual morte da célula.

[000375] O ensaio Hum-ZAP foi conduzido conforme segue. Cada uma das células foi semeada a uma densidade de 3 x 103 células por cavidade. Os anti-CADM1 anticorpos monoclonais ou um IgG humano de controle de isotipo foram serialmente diluídos, em seguida adicionados às células. O Hum-ZAP foi, em seguida, adicionado a uma concentração de 2 μg/ml e as placas permitidas incubarem por 96 horas. A viabilidade da célula nas placas foi detectada por kit de Ensaio De Viabilidade de Célula Luminescente CellTiter-Glo® (Promega, G7571) e as placas foram lidas a 490nM por um Luminomitor (Tuner BioSystems, Sunnyvale, CA). O dado foi analisado por Prism (Gráficopad). A morte da célula foi proporcional à concentração de PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 anticorpos monoclonais. As figuras 17A e 17B mostram que os anti-CADM1 anticorpos monoclonais foram eficientemente internalizados por células de DMS79 e NCI-H69 respectivamente conforme comparado ao anticorpo de controle de isotipo hIgG1.

Exemplo 6: CADM1 é colocalizado com LAMP1

[000376] O anticorpo monoclonal PTA021_A3 foi mostrado colocalizar com LAMP1 e, desse modo, ser internalizado. PTA021_A3 foi ligado às células de NCI-H69, lavados e incubados a 37°C por 45 minutos. O PTA021_A3 anticorpo foi rastreado via um anticorpo anti-humano etiquetado FITC.

[000377] Algumas células foram permeabilizadas e manchadas com anti-humano LAMP1, detectado com TRITC secundário etiquetado.

[000378] Os resultados mostram que PTA021_A3 e LAMP1 são co- localizados nos endossomos.

Exemplo 7: Anticorpos anti-CADM1 se ligam a tecidos de cancer

[000379] Anti-CADM1 anticorpos monoclonais PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 foram mostrados se ligarem a tecidos humanos de câncer incluindo tecidos representando câncer de pulmão de célula pequena, câncer pancreático neuroendócrino, câncer de fígado, carcinoides de pulmão, e carcinoides gastrointestinal. As biópsias de pacientes com câncer foram obtidas e os anticorpos usados para manchamento de imuno-histoquímica (Cytomyx, MA). 5 μm de núcleos de tecido foram usados. Após secagem por 30 minutos em lâminas, as seções de tecido foram fixadas com acetona à temperatura ambiente por 5 minutos. As lâminas foram enxaguadas em PBS e, em seguida, bloqueadas com proteína livre de soro e bloqueador de peroxidase (Dako S2001, CO) e subsequentemente incubadas com complexo de anticorpo primário a 5 μg/ml por 45 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, as the lâminas foram lavadas e incubadas por 30 minutos com anticorpo secundário conjugado a FITC (Jackson Immunoresearch Lab, 109-097-003) e lavadas novamente com PBS e incubadas com polímero HRP conjugados (Dako, CO, K4063) por 20 minutos. Cromogênio (Dako K3464) foi usado como um substrato, resultando em manchamento marrom. As lâminas foram montadas em Faramount Aqueous Mounting Media (Dako, S3025). PTA021_A1, PTA021_A2 e PTA021_A3 foram mostrados se ligarem especificamente a células de tumor dos tipos listados acima. Quando manchados com estes anticorpos monoclonais, outros órgãos exibem manchamento negativo ou não específico, que incluem útero, pulmão, fígado, rim, cólon, coluna cervical, seio, tutano de osso, cerebelo, cérebro, esôfago, coração, próstata, placenta, pituitária, ovário, mesotélio, amígdala, pele, intestino delgado, músculo esqueletal, estômago, baço, timo, e tireoide. O dado demonstra que o anti-CADMhuMabs PTA021_A1, PTA021_A2, e PTA021_A3 reconhece CADM1 expresso em tumores, incluindo aqueles tumores de câncer de pulmão de célula pequena, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), cânceres neuroendócrinos (incluindo aqueles do pâncreas, pulmão e trato gastrointestinal), câncer de fígado, carcinoides do pulmão, câncer de seio, câncer de cólon, câncer de próstata, câncer ovariano, câncer de rim, e carcinoides gastrointestinal.

[000380] A imuno-histoquímica no anticorpo PTA021_A3 em amostras de tecido de câncer de pulmão de célula pequena mostrou 75% de prevalência manchamento de membrana de alto nível (+++) de todas as células de tumor. A imuno-histoquímica no anticorpo PTA021_A3 em amostras de tecido de câncer de fígado mostrou manchamento em 75%-95% de amostras com 45% de tumores mostrando manchamento de membrana de alto nível (+++) de todas as células de tumor. Estudos adicionais em PTA021_A3 foram efetuados em conjuntos menores de amostra de câncer de pulmão de célula não pequena, câncer de seio, câncer de próstata, câncer coloretal, câncer ovariano e carcinoma de célula renal. A prevalência de manchamento positivo em carcinoma de pulmão de célula não pequena, carcinoma de seio e carcinoma de célula clara renal foi ~66%; em carcinoma e prevalência de carcinoma ovariano foi 100% e adenocarcinoma coloretal mostrou manchamento positivo em 17% de amostras. Tumores neuroendócrinos do pulmão, pâncreas e trato gastrointestinal foram também testados com carcinoides de pulmão e amostras pancreáticas neuroendócrinas mostrando 75% de prevalência e tumores neuroendócrinos de trato gastrointestinal mostrando manchamento positivo em 65% de amostras.

Exemplo 8: Efeito de anticorpos anti-CADM1 focusilatados e não focusilatados em crescimento de tumor de câncer de fígado em um modelo de xenoenxerto de camundongo

[000381] O efeito de PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) no crescimento de câncer de fígado derivado de células de HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado. Neste modelo de xenoenxerto, SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 2,5 x 106 de células de HepG2/camundongo e as células de HepG2 foram permitidas crescerem para ca. 30 dias. Os camundongos foram em seguida randomizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) conforme segue na Tabela 3: Tabela 3: Protocolo de Imunização para Modelo de Xenoenxerto de Tumor de HEPG2

[000382] Nexavar Sorafenib, um inibidor de quinase múltiplo à base de química usado para tratar carcinoma de célula normal e câncer de fígado, foi usado como um controle para terapia alvo.

[000383] Conforme visto na figura 18, o tratamento com os PTA021_A3 e PTA021_A3 NF anticorpos reduziu significantemente a taxa de crescimento do tumor, com o PTA021_A3 NF anticorpo não fucosilatado sendo o mais potente.

Exemplo 9: Anticorpo anti-CADM1-fármaco conjugado inibe crescimento de célula de HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo

[000384] O efeito de um PTA021_A3 conjugado de acordo com a fórmula M (daqui por diante referido como "PTA021_A3-Fórmula A conjugado" ou "PTA021_A3-Fórmula M") no crescimento de carcinoma hepatocelular derivado de células de HepG2 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado. Neste modelo de xenoenxerto, SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 2,5 x 106 de células de HepG2/camundongo e as células de HepG2 foram permitidas crescerem para ca. 30 dias. Os camundongos foram, em seguida, randomizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) com PTA021_A3- Fórmula M conjugado (0,1 umole/kg, ou 0,03umol/kg). DT, e anti difteria toxin anticorpo, foi usado como um controle de isotipo de não ligação. Nexavar Sorafenib, um inibidor de kinase múltiplo à base de químico usado para tratar carcinoma de célula renal e câncer de fígado, foi usado como um controle para terapia alvo.

[000385] Conforme visto na figura 19, o tratamento com o PTA021_A3-Fórmula M conjugado inibiu significantemente a taxa de crescimento de tumor em um modo dependente da dose.

Exemplo 10: Anticorpo anti-CADM1-fármaco conjugado inibe crescimento de célula de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo

[000386] O efeito de PTA021_A3-Fórmula M no crescimento de câncer de pulmão de célula pequena derivado de células de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado. Neste modelo de xenoenxerto, SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 5 x 106 de células de DMS79/camundongo e as células de DMS79 foram permitidas crescer até que o volume de tumor médio foi ca. 200 mm3. Os camundongos foram em seguida randomizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) com PTA021_A3-Fórmula M conjugado em dois estudos.

[000387] Conforme visto na figura 20A, o tratamento com o PTA021_A3-Fórmula M conjugado a 0,3 μmole/kg causou regressão completa do tumor em todos os camundongos através de todo o estudo (dia 88). Conforme visto na figura 20B, o tratamento com o PTA021_A3- Fórmula M conjugado causou regressão do tumor na dose de 0,1umol/kg através do estudo que se completou no dia 60. A dose baixa de 0,03umol/kg causou retardo significante no crescimento do tumor.

Exemplo 11: Citotoxicidade Celular Dependente de Anticorpo Mediada por PTA021_A3 e não fucosilatado PTA021_A3

[000388] Um ensaio de citotoxicidade de fluorescência foi usado para determinar a capacidade do PTA021_A3 anti-CADM1 mAb não focusilatado matar células que expressam CADM1 na presença de células efetuadoras via citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC com HepG2, 786-O e DMS79 células).

[000389] As células efetuadoras humanas foram preparadas de sangue total conforme segue. As células mononucleares de sangue periférico humano foram purificadas de sangue total heparinizado por separação padrão Ficoll-paque. As células foram resuspensas em meio RPMI1640 contendo 10% de FBS (inativado por calor) e 200 U/ml de IL- 2 humano e incubadas durante a noite a 37°C. No dia seguinte, as células foram coletadas e lavadas quatro vezes em meio de cultura e resuspensas a 2 x 107 células/ml. As células alvos CHO-mesothelin foram preparadas por incubação com reagente BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) a 2,5 μl de BATDA por 1 x 106 células alvos/mL por 20 minutos a 37° C. As células alvos foram lavadas quatro vezes, centrifugadas e trazidas a um volume final de 1 x 105 células/ml.

[000390] As células HepG2, 786-O e DMS79 (100 μl de células alvos etiquetadas, 104células/cavidade) foram incubadas com 50 μl de células efetuadoras (106cells/cavidade) e 50 μl de anticorpo (10ug/ml de concentração final). Uma proporção de alvo para efetuadora de 1:25 foi usada através de todos os experimentos. Em todos os estudos, um controle de isotipo IgG1 humano foi usado como um controle negativo. As células foram centrifugadas a 2000 rpm e incubadas por uma hora de incubação a 37° C. Os sobrenadantes foram, em seguida, coletados, submetidos a centrifugação e 20 μl de sobrenadante foi transferido para uma placa de fundo plano, a qual 180 μl de solução Eu (Perkin Elmer, Wellesley, MA) foi adicionado e lido em uma leitora RubyStar (BMG Labtech). A % de lisis foi calculada conforme segue: (liberação de amostra - liberação espontânea * 100)/(liberação máxima - liberação espontânea), onde a liberação espontânea é a fluorescência das cavidades que contêm células alvos mais células efetuadoras e liberação máxima é a fluorescência de cavidades contendo células alvos e foram tratadas com 2% de Triton-X.

[000391] As figuras 21, 22 e 23 mostram que ambos PTA021_A3 e não fucosilatados PTA021_A3 são capazes de induzir ADCC em células de HepG2, 786-O e DMS79, e que o PTA021_A3 não focusilatado é o anticorpo mais potente. O mesmo efeito pode ser observado nas outras linhas de célula que expressam CADM1 tal como a linha SCLC NCI- H69.

Exemplo 12: Anticorpo anti-CADM1/cisplatina inibe crescimento de célula de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo

[000392] O efeito de PTA021_A3 sozinho e em combinação com cisplatina no crescimento de SCLC derivado de células de DMS79 em um modelo de xenoenxerto de camundongo foi examinado. Neste modelo de xenoenxerto, SCID camundongos (CB17, de Charles River Laboratories, Hollister, CA) foram implantados com 5 x 106 de células de DMS79/camundongo e as células de DMS79 foram permitidas crescer até que os tumores alcancem uma média de 200 mm3. Os camundongos foram em seguida randomizados e tratados intraperitonealmente (i.p.) conforme mostrado no gráfico de volume de tumor.

[000393] Conforme visto na figura 24, o tratamento com PTA021_A3 sozinho retarda o crescimento do tumor, e em combinação com cisplatina mostra atividade antitumor significante e sinergística.

Exemplo 13: Avaliação da toxicidade de PTA021_A3NF, PTA021_A3, e PTA021_A3-Fórmula M.

[000394] O perfil de toxicidade de anti Anticorpos de CADM1, incluindo anticorpos não focusilatados e anticorpo-fármaco conjugados, é avaliado em macacos cynomolgus usando-se, por exemplo, PTA021_A3 e seus derivados. Os resultados de ensaio de IHC têm mostrado que macacos cynomolgus e humanos mostram modelos similares de expressão de CADM1 quando submetidos a IHC usando- se PTA021_A3. Adicionalmente, a proteína de CADM1 mostra alta afinidade em cynos e humanos. Doses Múltiplas IV entre, por exemplo, 0,1mg/kg e 100mg/kg são usadas para determinar a dose máxima tolerada para uso para identificar doses apropriadas para ensaios clínicos em humanos.

[000395] Um estudo de toxicologia exploratória foi conduzido em PTA021_A3 e a versão não fucosilatada de PTA021_A3(NF) em macacos cynomolgus. 8 macacos cynomolgus de quarto anos de idade não naive (naive para biológicos, nas foram previamente tratados em um estudo de farmacocinética de molécula pequena) foram usados no estudo avaliado em dois grupos com dois machos e duas fêmeas em cada grupo. Os animais no Grupo 1 foram tratados com o não fucosilatado PTA021_A3(NF) anticorpo em uma dose intravenosa única (IV) a 1 mg/kg. Os animais no Grupo 2 foram tratados com o PTA021_A3 anticorpo em uma dose IV única a 1 mg/kg.

[000396] As observações clínicas e mortalidade/morbidez foram avaliadas duas vezes diariamente de manhã e à tarde. O peso corpóreo, hematologia e química do sangue foram analisados nos dias 11, 0, 1, 3, 8, 15 e 22. As avaliações de hematologia incluem RBC, HGB, HCT, PLT, MCH, MCV, Reticulócitos, WBC e Contagem Diferencial. As avaliações químicas do sangue incluem AST, ALT, ALP, CRE, BUN, GLU, CHO, TP, ALB, TBIL, LDH, TG, Ca, P, A/G, K, Na e Cl.

[000397] Não existem observações abertas significativas (por exemplo, comportamento de alimentação) durante o estudo. Não existem efeitos observáveis mos tecidos neuroendócrinos (por exemplo, mudanças hormonais que conduziriam a mudanças comportamentais e sinais de sofrimento). Não existe também evidência de dor ou tremor notado. As figuras 25 a 32 mostram que todas as análises conduzidas estavam dentro dos valores esperados normais.

[000398] As figuras 25A e 25B mostram os dados de peso corpóreo para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000399] As figuras 26A e 26B mostram is dados de Glicose para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000400] As figuras 27A e 27B mostram os dados de Alanina Transaminase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000401] As figuras 28A e 28B mostram is dados de Aspartato Transaminase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000402] As figuras 29A e 29B mostram os dados de Fosfatase Alcalina para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000403] As figuras 30A e 30B mostram os dados de Lactato Dehidrogenase para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000404] As figuras 31A e 31B mostram os dados de RBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

[000405] As figuras 32A e 32B mostram os dados de WBC para macacos machos e macacos fêmeas respectivamente.

Exemplo 14: Avaliação da eficácia de PTA021_A3NF, PTA021_A3, e PTA021_A3-Fórmula M.

[000406] CADM1 mostrou-se ser expresso em muitos tipos de câncer por IHC usando-se o PTA021_A3 HuMAb. Linhas de células representando modelos de tumor de câncer são usadas para demonstrar eficácia de Anticorpos anti-CADM1 conjugados não confirmados e toxina para tratar vários cânceres. Por exemplo, PTA021_A3 e derivados deste são usados por si ou em combinação com padrões de cuidado em modelos de eficácia de câncer renal (786- O células), melanoma (SkMel28 células) e câncer de pulmão de célula pequena (DMS79 células) onde CADM1 é expresso. PTA021_A3 e outros anticorpos anti-CADM1 podem ser usados com modelos de animal de xenoenxerto usando-se linhas de células que expressam CADM1 representando cânceres, tais como cânceres neuroendócrinos, câncer de cólon, câncer de seio, câncer ovariano, e câncer de próstata.

[000407] Todas as referências citadas neste relatório, incluindo sem limitação todos os artigos, publicações, patentes, pedidos de patente, apresentações, textos, relatórios, manuscritos, brochuras, livros, internet, artigos de jornal, periódicos, folhas de fato de produto, e similares, podem, desse modo, ser incorporados por referência em seu relatório em suas totalidades. A discussão das referências aqui é pretendida para meramente resumir as asserções feitas por seus autores e nenhuma admissão é feita que qualquer referência constitui técnica anterior e reserve à Requerente o direito de desafiar a precisão e pertinência das referências citadas.

[000408] Embora a invenção precedente tenha sido descrita em algum detalhe por meio de ilustração e exemplo para proposta de clareza de compreensão, será prontamente aparente àqueles versados no assunto à luz dos ensinamentos desta invenção que certas mudanças e modificações podem ser feitas a esta sem fugir do espírito ou escopo das reivindicações em anexo. RESUMO DA LISTAGEM DE SEQUÊNCIA

Claims (15)

1. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo que se liga a um epitopo no CADM1 humano, caracterizado pelo fato de compreende uma região variável de cadeia pesada compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 19, 20, ou 21, e uma região variável de cadeia leve compreendendo a sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 22, 23, ou 24.

2. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo ou um fragmento de anticorpo do mesmo que se liga a um epitopo no CADM1 humano, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO:1, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:4, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 7, uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:10, uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:13, e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 16; ou (b) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO:2, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:5, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 8, uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:11, uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:14, e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 17; ou (c) uma região variável de cadeia pesada CDR1 compreendendo SEQ ID NO:3, uma região variável de cadeia pesada CDR2 compreendendo SEQ ID NO:6, uma região variável de cadeia pesada CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 9, uma região variável de cadeia leve CDR1 compreendendo SEQ ID NO:12, uma região variável de cadeia leve CDR2 compreendendo SEQ ID NO:15, e uma região variável de cadeia leve CDR3 compreendendo SEQ ID NO: 18.

3. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: (a) o referido anticorpo é um anticorpo de comprimento total de um isotipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4; (b) o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em um anticorpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anticorpo humano, um anticorpo de cadeia simples, um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada a receptores Fc e/ou potência aumentada para ADCC e um anticorpo biespecífico; (c) o anticorpo que é conjugado a um agente terapêutico, preferivelmente em que o agente terapêutico é uma citotoxina ou um isótopo radioativo; ou (d) o referido anticorpo se liga a CADM1 humano com um EC50 na faixa de < 50 nM, preferencialmente em que o referido anticorpo se liga a CADM1 humano com EC50 na faixa de < 10nM, e mais preferencialmente, em que o referido anticorpo se liga ao CADM1 humano com um EC50 na faixa de < 1nM.

4. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado, porção de ligação de antígeno, ou fragmento de anticorpo que se liga a um epítopo no CADM1 humano como definido na reivindicação 1 ou 2, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

5. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica a cadeia pesada ou leve do anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo ou fragmento de anticorpo do mesmo que se liga a um epítopo no CADM1 humano como definido na reivindicação 1 ou 2, ou um vetor de expressão compreendendo a referida molécula de ácido nucleico, ou uma célula hospedeira compreendendo o referido vetor de expressão.

6. Método para preparação de um anticorpo anti-CADM1, o referido método sendo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: obtenção de uma célula hospedeira que contém uma ou mais moléculas de ácido nucleico que codificam o anticorpo definido na reivindicação 1 ou 2; crescimento da célula hospedeira em uma cultura de célula hospedeira; provisão de condições de cultura de célula hospedeira no qual a uma ou mais moléculas de ácido nucleico são expressas; e recuperação do anticorpo a partir da célula hospedeira ou a partir da cultura de célula hospedeira.

7. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que é para uso no tratamento ou prevenção de uma doença associada com as células alvo que expressam CADM1, preferencialmente em que a referida doença é um câncer humano e ainda mais preferencialmente em que o referido câncer humano é selecionado a partir do grupo consistindo em: câncer de pulmão de célula pequena, leucemia de célula-T adulta, câncer de pulmão de célula não pequena (incluindo carcinomas escamosos e adenocarcinomas), melanoma, câncer de seio, câncer coloretal, câncer ovariano, câncer de próstata, cânceres neuroendócrinos incluindo aqueles de pulmão, adrenal, pituitário, do trato gastrintestinal, rim, fígado (incluindo carcinomas hepatocelulares), pâncreas (incluindo insulinomas e glucagonomas), glioblastomas, e tumores carcinoides, incluindo aqueles do pâncreas, pulmão, trato gastrintestinal, fígado, e rim.

8. Anticorpo monoclonal isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, ou um fragmento de anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, que se liga a um epitopo no CADM1 humano, caracterizado pelo fato de que compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve selecionada do grupo consistindo em: a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 19 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 22; a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 20 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 23; e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 21 e a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 24.

9. Anticorpo isolado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que: o referido anticorpo é selecionado a partir do grupo consistindo em: um anticorpo total, um fragmento de anticorpo, um anticorpo humanizado, um anticorpo de cadeia simples, um imunoconjugado, um anticorpo projetado resultando em ligação aumentada a receptores de Fc e/ou potência aumentada para ADCC, e um anticorpo biespecífico.

10. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende o anticorpo isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 8 e um veículo farmaceuticamente aceitável.

11. Molécula de ácido nucleico isolada, caracterizada pelo fato de que codifica a cadeia pesada ou leve do anticorpo isolado ou uma porção de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 8, ou um vetor de expressão compreendendo a referida molécula de ácido nucleico; ou uma célula hospedeira compreendendo o referido vetor de expressão.

12. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que expressa o anticorpo ou porção de ligação de antígeno do mesmo ou fragmento de anticorpo do mesmo que se liga a um epítopo no CADM1 humano, como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 8.

13. Método para preparação de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 8, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: imunização de um animal transgênico compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recuperação de células B de referido animal transgênico; produção de hibridomas de referidas células B; seleção de hibridomas que expressam anticorpos que ligam CADM1; e recuperação de referidos anticorpos que ligam CADM1 de referidos selecionados hibridomas.

14. Método de preparação dos anticorpos anti-CADM1, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: imunização de um animal transgênico compreendendo genes de imunoglobulina humana com um peptídeo de CADM1; recuperação de células B de referido animal transgênico; conversão de referido mRNA em cDNA; expressão de referido cDNA em fagos tal que anticorpos anti-CADM1 codificados por referido cDNA são apresentados na superfície de referidos fagos; seleção de fagos que apresentam anticorpos anti-CADM1; recuperação de moléculas de ácido nucleico de referidos selecionados fagos que codificam referidas imunoglobulinas anti- CADM1; expressão de referidas recuperadas moléculas de ácido nucleico em uma célula hospedeira; e recuperação de anticorpos como definidos em qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 8, de referida célula hospedeira que liga CADM1.

15. Imunoconjugado, caracterizado pelo fato de que compreende (i) um anticorpo isolado como definido na reivindicação 8 ou 9 e (ii) um agente terapêutico.

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