KR20020047098A - ＨＥＲ2/ｎｅｕ에 대한 인간 모노클로날 항체 - Google Patents

ＨＥＲ2/ｎｅｕ에 대한 인간 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합 부위가 개시되어 있다. 또한, HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 및 그의 항원 결합 부위를 포함하는 이중특이적 및 다중특이적 분자도 개시되어 있다. 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 인간 모노클로날 항체의 이소타입을 다수 생산할 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예컨대, 형질전환 마우스에서 생산할 수 있다. 또한, 상기 인간 항체를 포함하는 제약 조성물, 상기 인간 항체를 생산하는 비인간 형질전환 동물 및 하이브리도마, 및 상기 인간 항체를 사용한 치료 및 진단 방법도 개시되어 있다.

Description

ＨＥＲ2/ｎｅｕ에 대한 인간 모노클로날 항체 {Human Monoclonal Antibodies to HER2/neu}
성장인자 및 그의 동족 수용체는 세포 증식 및 분화를 조절하고, 성장인자의 구조, 기능 및 발현의 변화는 세포의 형질전환 및 종양발생(oncogenesis)에 관여한다. 여러 가지 공지된 프로토-온코진 (proto-oncogene)은 성장인자 또는 성장인자 수용체, 예컨대, 혈소판으로부터 유래된 성장인자 (PDGF) B쇄를 코딩하는 c-sis, 및 상피 성장인자 (EGF) 수용체를 코딩하는 c-erbB를 코딩한다. ERBB2 또는 HER-2로도 알려진 neu 온코진은 여러 가지 악성 인간 선암종, 특히 악성 유방 및 난소 종양에 관여한다 (1,2). c-erB-2 유전자의 단백질 산물인 pl85HER2(HER2/neu)는 EGF 수용체와 상동성이 있는 막횡단 단백질 티로신 키나제 수용체이고 세포 생장 및 분화의 조절에 관여하는 것으로 생각된다. 여러 가지 모델은 p185HER2의 온코진 (oncogene) 형태가 이량체화 및 내재화 능력 뿐만 아니라 티로신 키나제 활성을 증가시키는 막횡단 돌연변이를 갖고 있음을 제시한다 (3, 4, 5).
HER2/neu는 인간 암, 특히 유방암의 치료를 위한 후보 치료 표적이다 (6). 성장인자 수용체에 결합하여 이 수용체의 기능을 조절하는 항체는 면역요법 뿐만 아니라 인간 종양의 진단 및 예후에 사용할 수 있다. HER2에 대한 모노클로날 항체가 개발되어 있고, 이 항체는 배양물 및 동물 모델에서 항종양 효과를 나타내며 종양 세포의 생장을 억제하는 것으로 입증된 바 있다 (2, 7, 8). 예를 들어, neu 형질전환 세포에서, p185neu의 세포 표면 발현은 형질전환 표현형의 유지에 필요하고, 항-p185neu항체를 사용한 생체내 치료는 neu 형질전환 세포로 접종된 마우스에서 종양의 생장을 억제한다 (9). 더욱이, 타목시펜 및 HER2/neu 항체를 함께 사용한 경우 에스트로겐 수용체 (ER) 양성 및 HER2/neu 양성 인간 유방암 세포의 치료는 타목시펜 또는 HER2/neu 항체 중 하나만을 사용한 경우와 비교할 때 상승되었다 (8).
따라서, HER2/neu를 표적화하기 위한 개선된 방법을 개발하고, 인간 암을 위한 현존 치료법에 대한 대안으로서 보다 안전하며 독성이 보다 적은 치료법을 제공할 필요가 있다.
<발명의 요약>
본 발명은 HER2/neu 수용체에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 뿐만 아니라, 이러한 항체를 1종 이상 함유하는 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에서, 인간 항체의 특징은 인간 항체는 높은 친화도로 HER2/neu 수용체에 결합하여, 인간 이펙터 세포의 존재 하에 (생체내 및 시험관내에서) HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제하고(하거나) HER2/neu 발현 세포의 세포 사멸을 매개하는 것을 특징으로 한다. 따라서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체는 생체내 및 시험관내에서 진단제 및 치료제로 사용할 수 있다.
본 발명의 단리된 인간 항체는 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgAl, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE와 같은 다양한 항체 이소타입을 포함한다. 전형적으로, 이들 인간 항체는 IgG1 (예를 들어, IgGlk) 및 IgM 이소타입을 포함한다. 상기 항체는 전장일 수 있거나 (예를 들어, IgG1 또는 IgG4 항체) 항원-결합 부위 (예를 들어, Fab, F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv 단편)만을 포함할 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 재조합 인간 항체이다. 또 다른 실시양태에서, 인간 항체는 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖고 불멸 세포에 융합되어 있는, 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다. 구체적 실시양태에서, 인간 항체는 본원에서 3.F2, 1.D2, 2.E8, 1.B10 및 3.B4로 불리는 하이브리도마에 의해 생산된다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명의 인간 항-HER2/neu 항체는 하나 이상의 하기 성질을 특징으로 한다.
a) HER2/neu 수용체에 대한 특이성;
b) 친화 상수가 약 107M-1이상, 바람직하게는 약 109M-1이상, 보다 바람직하게는 약 1010M-1내지 1011M-1또는 그 이상인, HER2/neu와의 결합 친화성;
c) 약 103이상, 바람직하게는 약 104, 보다 바람직하게는 약 105M-1S-1의, HER2/neu와의 결합 상수 (Kassoc);
d) 약 10-3s-1, 바람직하게는 약 10-4s-1, 보다 바람직하게는 10-5s-1, 가장 바람직하게는 10-6s-1의, HER2/neu로부터의 해리 상수 (Kdis);
e) HER2/neu를 발현하는 세포를 옵소닌화(opsonization)하는 능력;
f) (예를 들어, 시험관내에서) 인간 이펙터 세포의 존재 하에 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 HER2/neu 발현 세포 (예를 들어, 종양 세포)의 생장을 억제하는 능력 및(또는) HER2/neu 발현 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 능력; 또는
g) HER2/neu에 결합한 후 HER2/neu 발현 세포에 의해 내재화되는 능력.
본 발명의 인간 항체에 의해 표적화될 수 있는 종양 세포의 예로는 선암종 세포, 예를 들어, 타액선, 위 및 신장; 유선암종 세포; 폐암종 세포; 편평 세포암종 세포; 및 난소암 세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
한 실시양태에서, 본 발명의 단리된 인간 항체는 약 107M-1이상, 보다 바람직하게는 약 108M-1이상, 보다 바람직하게는 109M-1이상, 가장 바람직하게는 약 1010내지 1011M-l또는 그 이상의 친화 상수로 HER2/neu 항원에 결합하고, 시험관내에서 약 1 x l0-7M 이하의 IC50또는 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제하고(하거나) 인간 이펙터 세포, 예를 들어, 다형핵 세포 (PMN) 또는 IFN-γ 유도 대식세포에 의한 HER2/neu 발현 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개할 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 인간 항-HER2/neu 항체는 시험관내에서 약 5-10 ㎍/ml, 바람직하게는 약 1-5 ㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 0.5-1 ㎍/ml의 농도로 HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제하고(하거나) 상기 세포의 세포용해 및 사멸을 매개하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 항체 코딩 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이 벡터로 형질감염된 숙주 세포 뿐만 아니라, 이들 숙주 세포를 배양하여 본 발명의 항체를 제조하는 방법도 본 발명에 포함된다.
HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 다양한 이소타입 (예컨대, IgG, IgA 및(또는) IgM)을 발현할 수 있는 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스로부터 단리된 B-세포를 제공한다. 바람직하게는, 단리된 B 세포는 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) HER2/neu 수용체를 발현하는 세포로 면역화된 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻는다. 바람직하게는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는다. 이어서, 단리된 B-세포를 불멸화하여 HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체의 공급원 (예를 들어, 하이브리도마)를 제공한다.
따라서, 본 발명은 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마도 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 하이브리도마는 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖고 불멸 세포에 융합되어 있는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻은 B세포를 포함한다. 형질전환 비인간 동물은 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) HER2/neu 수용체를 발현하는 세포로 면역화시켜 항체-생산 하이브리도마를 만들 수 있다. 본 발명의 구체적 하이브리도마로는 3.F2, 1.D2, 2.E8, l.B10 및 3.B4가 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 형질전환 마우스 (본원에서 "HuMAb"로 불림)와 같은 형질전환 비인간 동물을 제공한다. 구체적인 실시양태에서, 상기 형질전환 비인간 동물은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스이다. 상기 형질전환 비인간 동물은 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) HER2/neu 수용체를 발현하는 세포로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 상기 형질전환 비인간 동물, 예컨대, 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 HER2/neu 수용체에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입 (예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgM)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은 예를 들어, 전형적인 이소타입 전환 또는 비전형적 이소타입 전환에 의해 일어날 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 HER2/neu와 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체를 생산하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스를 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 상기 항원이 풍부한 제제, 및(또는) HER2/neu 수용체를 발현하는 세포로 면역화시키는 것을 포함한다. 이어서, 상기 동물의 B 세포 (예를 들어, 비장 B 세포)를 얻어 골수종 세포와 융합시켜 HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성한다.
본 발명의 단리된 항-HER2/neu 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 유도화될 수 있거나 또 다른 기능성 분자, 예를 들어, 또 다른 펩티드 또는 단백질 (예컨대, Fab' 단편, ScFv 항체 또는 종양 리간드)에 연결될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위는 1종 이상의 다른 분자, 예컨대, 또 다른 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체 또는 다중특이적 항체)에 기능적으로 연결될 수 있다 (예컨대, 화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유 결합 또는 다른 방식으로 연결될 수 있음). 따라서, 또 다른 측면에서, 본 발명은 HER2/neu에 대한 제1 결합 특이적 부위 및 Fc 수용체, 예컨대, 인간 FcγRI (CD64) 또는 인간 Fcα수용체 (CD89)에 대한 제2 결합 특이적 부위를 하나 이상 포함하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다. 한 실시양태에서, 이들 이중특이적 분자 및 다중특이적 분자는 EGF와 같은 종양 리간드를 추가로 포함한다. 따라서, 본 발명의 다중특이적 분자에는 삼중특이적, 사중특이적 및 기타 다중특이적 분자도 포함된다.
구체적 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 1종 이상의 인간 항체 또는 그의 단편 (예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv)을 포함한다. 이러한 이중특이적 분자 및 삼중특이적 분자는 다수의 인간 항체 부위 또는 그의 단편 (예컨대, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv)을 포함할 수 있고(있거나) "키메라" 또는 "인간화" 항체 부위 또는 그의 단편 (예를 들어, 인간 유래의 부위가 남아 있는 비인간 항체 (예컨대, 뮤린)으로부터 유래된 가변 영역 또는 적어도 상보성 결정 영역 (CDR)을 갖는 "인간화" 항체)도 포함할 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 인간 IgG 수용체 즉, FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)와 같은 Fc-감마 수용체 (FcγR) 또는 인간 FcαR (CD89)와 같은 Fc 수용체에 결합하는 1종 이상의 항체 또는 그의 단편을 포함한다. 바람직한 Fc 수용체로는 고친화성 FcγRI 수용체 및 FcαR 수용체 (CD89)가 있다. FcαRI 및 FcγRI는 (1) 면역 이펙터 세포, 예를 들어, 단핵구, PMN, 대식세포 및 수상세포 상에서 주로 발현되고; (2) 고농도로 발현되고 (예를 들어, 세포 당 5,000 내지 100,000); (3) 세포독성 활성 (예를 들어, ADCC, 식세포작용)의 매개자이고; (4) 이들에 표적화된 항원 (자가-항원을 포함함)의 상승된 항원 제공을 매개하기 때문에 본 발명에 사용하기에 바람직한 유발 수용체이다. 바람직한 실시양태에서, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 Fc 수용체의 이뮤노글로불린 (예를 들어, IgG 또는 IgA) 결합 부위와 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합한다. 따라서, 이중특이적 분자와 다중특이적 분자의 결합은 이뮤노글로불린의 생리학적 농도에 의해 방해받지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명의 특징은 치료 잔기, 예를 들어, 세포독성 약물, 효소 활성 독소 또는 그의 단편, 방사선동위원소, 또는 소분자 항암제에 결합된 인간 항-HER2/neu 항체 또는 그의 단편이다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 Fc 수용체를 발현하는 이펙터 세포, 예를 들어, 대식세포 또는 활성화된 PMN 세포를 포함하는 표적-특이적 이펙터 세포 및 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체, 및 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 본 발명의 1종 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 포함하는, 조성물, 예를 들어, 제약 및 진단 조성물을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 조성물은 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 배합물을 포함하며, 상기 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위 각각은 상이한 에피토프에 결합하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 이펙터 세포의 존재 하에 표적 세포의 고효율적 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물은 HER2/neu를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 또 다른 인간 모노클로날 항체와 병용할 수 있다. 따라서, 이러한 병용은 최대 치료 효과를 제공하도록 맞춰진 다양한 치료법을 제공한다. 본 발명의 1종 이상의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위와 본 발명의 1종 이상의 이중특이적 또는 다중특이적 분자의 배합물을 포함하는 조성물, 예를 들어, 제약 조성물도 본 발명의 범위내에 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 이중특이적 또는 다중특이적 항체)를 사용하여 인간 이펙터 세포, 예컨대, 인간 다형핵 세포 (PMN)에 의한 표적 세포의 생장을 억제하고(하거나) 상기 표적 세포의 식세포작용 및(또는) 사멸을 유도시킴으로써 HER2/neu를 발현하는 세포의 증식 및(또는) 분화를 억제하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 본 발명의 방법은 HER2/neu 수용체를 발현하는 세포를 시험관내 또는 생체내에서 인간 이펙터 세포의 존재 하에 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위 중 하나 또는 이들의 배합물과 접촉시키는 것을 포함한다. 상기 방법은 배양물, 예를 들어, 시험관내 또는 생체외 (예컨대, HER2/neu 수용체를 발현하는 세포 및 이펙터 세포를 발현하는 세포를 포함하는 배양물) 중에서 이용할 수 있다. 예를 들어, HER2/neu 수용체를 발현하는 세포 및 이펙터 세포를 함유하는 샘플을 시험관내에서 배양하여 본 발명의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자)와 혼합할 수 있다. 별법으로, 상기 방법은 대상체, 예를 들어, 생체내 (예컨대, 치료 또는 예방) 프로토콜의 일부로서 대상체내에서 수행할 수 있다.
생체내 방법의 경우, 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자)는 HER2/neu-관련 질환을 앓는 인간 환자에게 투여하여 HER2/neu 수용체를 발현하는 세포의 생장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸을 유도할 수 있다. 한 실시양태에서, 상기 대상체는 Fc 수용체, 예컨대, Fcα 수용체 또는 Fcγ 수용체의 발현 또는 활성을 조절하는, 예를 들어, 상승시키거나 억제하는 약제, 예를 들어, 사이토카인으로 더 치료할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자로 치료하는 동안 투여하기에 바람직한 사이토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 있다.
본 발명의 단리된 인간 모노클로날 항체 조성물은 다른 공지된 치료법, 예를 들어, 항암요법과 함께 투여할 수 있다.
본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 치료할 수 있거나 (예를 들어, 완화시킬 수 있거나) 예방할 수 있는 예시적 질환으로는 종양발생 질환이 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이러한 종양발생 질환으로는 선암종, 예를 들어 타액선, 위 및 신장; 유선암종; 폐암종; 편평 세포암종; 및 난소암이 있다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 샘플 중의 HER2/neu 항원의 존재를 시험관내에서 또는 생체내에서 검출하기 위한 방법, 예를 들어, HER2/neu-관련 질환을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 상기 방법은 대조구 샘플과 함께 시험할 샘플을, 본 발명의 인간 모노클로날 항체와 HER2/neu 사이의 결합체의 형성을 허용하는 조건 하에서 상기 항체 또는 그의 항원-결합 부위 (또는 이중특이적 또는 다중특이적 분자)와 접촉시킴으로써 달성된다. 이어서, (예를 들어, ELISA를 이용하여) 두 샘플에서 결합체 형성을 검출하고, 두 샘플 사이의 결합체의 형성에 있어서 임의의 통계학적으로 유의한 차이점은 HER2/neu 항원이 시험 샘플에 존재함을 나타낸다.
본 발명의 다른 특징 및 장점은 하기 상세한 설명 및 청구항으로부터 명백해질 것이다.
도 1은 네오 카세트가 μ1 엑손의 SmaI 부위내로 표적 삽입되어 있는 것을 나타내는 도면이다. 패널 A는 μ좌위의 게놈 구조를 나타내는데, 여기서 채워진박스는 μ엑손을 나타낸다. 패널 B는 CmD 표적 벡터를 나타내는 도면이다. 패널 C는 네오 카세트가 μ1내로 삽입된 표적 μ좌위를 나타낸다.
도 2, 패널 A는 3종의 하이브리도마 배양물, 1.D2, 2.E8 및 3.F2로부터 얻은 항-HER2/neu 항체와 재조합 HER2/neu의 결합을 ELISA로 측정하여 나타낸 막대 그래프이고; 패널 B는 정제된 항-HER2/neu 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4와 종양 세포로부터 제공되는 HER2/neu 항원의 결합을 ELISA로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 3, 패널 A-C는 정제된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 (1.D2, 2.E8, 3.F2, 1.B10 및 3.B4)와 SKBR-3 (A 및 B) 종양 세포의 결합 및 상기 모노클로날 항체와 BT-474 (C) 종양 세포의 결합을 플로우 사이토메트리(flow cytometry)로 검출하여 비교한 것을 나타낸 그래프이다.
도 4는 정제된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 F(ab')2단편 (3.F2 및 2.E8)와 종양 세포 (SKBR-3, BT-474 및 A431)의 결합을 플로우 사이토메트리로 검출하여 비교한 것을 나타낸 그래프이다.
도 5, 패널 A 및 B는 세포 밀도에 의해 측정한, 정제된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 (1.D2, 2.E8, 3.F2, 1.B10 및 3.B4)에 의한 SKBR-3 종양 세포 생장의 억제를 나타내는 그래프이다.
도 6은 세포 밀도에 의해 측정한, 정제된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 F(ab')2단편 (3.F2 및 2.E8)에 의한 SKBR-3 종양 세포 생장의 억제를 나타내는 그래프이다.
도 7, 패널 A 및 B는 세포 밀도에 의해 측정한, 정제된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 (1.D2, 2.E8, 3.F2, 1.B10 및 3.B4) 및 이들의 F(ab')2단편에 의한 BT-474 종양 세포 생장의 억제를 나타내는 그래프이다.
도 8, 패널 A 및 B는 정제된 인간 항 HER2/neu 모노클로날 항체 (1.D2, 2.E8 및 3.F2)에 의해 매개되는, 단핵구 세포에 의한 SKBR-3 종양 세포의 항체 의존성 세포용해 (A); 또는 정제된 인간 항 HER2/neu 모노클로날 항체 (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4)의 존재 하에 IFN-γ유도 대식세포에 의한 SKBR-3 종양 세포의 항체 의존성 세포용해를51Cr 방출에 의해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 9는 인간 항-HER2/neu x 항-CD89 이중특이적 분자 (14.1 x 3.F2)에 의해 매개되는, 다형핵 세포에 의한 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포의 항체 의존성 세포용해를51Cr 방출에 의해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 10은 인간 항-HER2/neu x 항-CD89 이중특이적 분자 (14.1 x 3.F2)에 의해 매개되는, 단핵구 의한 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포의 항체 의존성 세포용해를51Cr 방출에 의해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 11은 인간 항-HER2/neu x 항-CD89 이중특이적 분(14.1 x 3.F2)에 의해 매개되는, 전혈(whole blood)에 의한 BT-474 종양 세포의 항체 의존성 세포용해를51Cr 방출에 의해 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 이중특이적 단일쇄 융합 분자 (931 및 934) 및 이들의 모항체인 HuMAb를 나타낸 도면이다. 14.1 및 3.F2의 가변 경쇄 및 중쇄 영역을 사용하여 931 및 934 (w/EGF) 작제물을 만들었다.
도 13은 14.1 및 3.F2 (항-HER2)의 fab' 단편들로 구성되어 있으며 양성 대조구로 사용되는 화학 결합 이중특이적 분자를 나타내는 도면이다.
도 14 (a)는 플로우 사이토메트리 분석으로 측정한, 형질감염종 상등액 중의 발현된 융합 단백질 931과 934에 대한 스크리닝 (결합) 분석법을 보여주는 막대 그래프이다. 형질감염된 세포 (931 & 934)의 상등액 및 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상등액을 SKBR-3 또는 A431 종양 세포주와 함께 인큐베이션하였다. 융합 단백질의 결합은 파이코에리쓰린 (phycoerythrin)에 결합된 염소 항-인간 IgG fab-2를 사용한 염색으로 검출하였다. 도 14 (b)는 융합 단백질 931과 934의 ADCC 분석을 보여주는 막대 그래프이다. 인큐베이션 기간이 16-18시간이고 표적 (SKBR-3, A431)에 대한 이펙터 (단핵구, PMN)의 비율이 100:1인 크로뮴 방출 분석을 수행하였다. 특이적 세포용해를 매개하는 형질감염된 세포 (931 & 934)의 상등액 및 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상등액을 사용하여 종양 세포의 사멸을 검출하였다.
도 15 (a)는 단일쇄 융합 단백질 931 및 934와 U937 세포의 결합 (플로우 사이토메트리에 의해 측정됨)을 보여주는 그래프이다. U937 세포와 결합하지 않는 항-EGF-R mAb인 425의 fab' 단편을 음성 대조구로 사용하였다. 도 13에 나타낸 화학적으로 연결된 이중특이적 항체 (14.1 x 3.F2)를 양성 대조구로 사용하였다. 도 15 (a)는 단일쇄 융합 단백질 (931 및 934)과 SKBR-3 세포의 결합 (플로우 사이토메트리에 의해 측정됨)을 보여주는 그래프이다. 14.1 fab-2를 음성 대조구로 사용하였다. 도 13에 나타낸 화학적으로 연결된 이중특이적 항체 (14.1 x 3.F2)를 다시 양성 대조구로 사용하였다.
도 16은 단일쇄 융합 단백질 934와 A431 세포의 결합 (플로우 사이토메트리에 의해 측정됨)을 보여주는 그래프이다. 이 실험은 EGF-R을 과발현하는 A431 종양 세포를 사용한다는 점을 제외하고 도 15에 나타낸 바와 동일한 방식으로 수행하였다. EGF와 융합된 14.1의 sFv 단편으로 구성된 융합 단백질을 양성 대조구로 사용하였고, 14.1 fab-2를 음성 대조구로 사용하였다.
도 17은 단일쇄 융합 단백질 931에 의한 SKBR3 (도 17 (a)) 및 BT474 (도 17 (b)) 종양 세포의 PMN (이펙터 세포)-매개 세포독성을 보여주는 그래프이다. 인큐베이션 기간이 16-18시간이고 표적에 대한 이펙터의 비율이 100:1인 크로뮴 방출 분석을 수행하였다. 14.1 fab-2를 각 실험에서 음성 대조구로 사용하였다. 도 18은 단일쇄 융합 단백질 931에 의한 SKBR3 (도 18 (a)) 및 BT474 (도 18 (b)) 종양 세포의 단핵구 (이펙터 세포)-매개 세포독성을 보여주는 그래프이다. 인큐베이션 기간이 16-18시간이고 표적에 대한 이펙터의 비율이 100:1인 크로뮴 방출 분석을 수행하였다. 14.1 fab-2를 각 실험에서 음성 대조구로 사용하였다
본 발명은 HER2/neu 성장인자 수용체 (본원에서 "HER2/neu"로 불림) 및(또는) 관련 수용체의 발현, 특히 과발현을 특징으로 하는 질환의 치료 및 진단을 위한 신규 항체-기재 치료법을 제공한다. 본 발명의 치료법은 HER2/neu 상에 존재하는 에피토프에 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위를 사용한다. 한 실시양태에서, 상기 인간 항체는 V-D-J 재조합 및 이소타입 전환을 통해 HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체의 많은 이소타입 (예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예컨대, 형질전환 마우스에서 생산된다. 따라서, 본 발명의 다양한 측면은 항체 및 항체 단편, 및 그의 제약학적 조성물 뿐만 아니라, 비인간 형질전환 동물, 및 상기 모노클로날 항체를 생산하기 위한 B-세포 및 하이브리도마를 포함한다. 본 발명의 항체를 사용하여 HER2/neu 또는 관련된 교차-반응성 성장인자 수용체를 발현하는 세포를 검출하거나 시험관내 또는 생체내에서 HER2/neu를 발현하는 세포의 생장, 분화 및(또는) 이동을 억제하는 방법도 본 발명에 포함된다.
본 발명을 보다 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해, 일부 용어를 먼저 정의한다. 추가 정의는 발명의 상세한 설명 전체에 걸쳐 기재되어 있다. 용어 "HER2/neu", "HER2", "HER2/neu 항원" 및 "HER2/neu 수용체" 모두 본원에서 상호교환 가능하게 사용되고, 세포, 예를 들어, 인간 종양 세포의 표면 상에 자연 발생적으로 형성되며, 인간 erbB-2 유전자 (HER2 유전자로도 알려짐)에 의해 코딩되는 인간 HER2/neu 수용체의 임의의 변이체 또는 이소폼 (isoform)을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "neu", "neu 항원" 및 "neu 수용체"는 래트 erbB-2 유전자 (래트 neu 유전자로도 불림)에 의해 코딩되는, 인간 HER2/neu에 상응하는 래트 HER2/neu를 말한다. 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 HER2/neu-항원의 결합은 HER2/neu를 발현하는 세포 (예컨대, 종양 세포)의 생장을 억제한다. 또 다른 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 항체와 HER2/neu-항원의 결합은 HER2/neu를 발현하는 세포의 이펙터 세포-매개 식세포작용 및 사멸을 매개한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체"는 이황화 결합에 의해 상호결합된 두 개 이상의 중쇄 (H) 및 두 개 이상의 경쇄 (L)를 포함하는 당단백질을 말한다. 각 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 HCVR 또는 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 3개의 도메인, 즉 CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 각 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 LCVR 또는 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 한 개의 도메인, 즉 CL로 구성된다. VH 및 VL 영역은 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는 초가변 영역으로 더 나누어질 수 있는데, 상기 초가변 영역 사이에는 골격 영역 (FR)으로 불리는, 보존성이 보다 높은 영역이 존재한다. 각 VH 및 VL은 FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4의 순서로 아미노-말단부터 카르복시-말단까지 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 항체의 불변 영역은 면역 시스템의 다양한 세포 (예를 들어, 이펙터 세포) 및 고전적인 보체 시스템의 제1 성분 (Clq)을 비롯한 숙주 조직 또는 인자와 이뮤노글로불린의 결합을 매개할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은, 항체의 "항원 결합 부위" (또는 단순히 "항체 일부"란 용어는 항원 (예컨대, HER2/neu)에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 1종 이상의 항체 단편을 말한다. 항체의 항원-결합 기능은 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있음이 보여진 바 있다. 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 결합 단편의 예로는 (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 구성된 1가 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 가교에 의해 연결된 두 개의 Fab 단편을 포함하는 2가 F(ab')2단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 구성된 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암 (arm)의 VL 및 VH 도메인으로 구성된 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성된 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR)이 있다. 더욱이, Fv 단편의 VL 및 VH 도메인이 별개의 유전자에 의해 코딩된다 하더라도, 재조합 방법을 사용하여, 이들 두 도메인이 페어링(pairing)되어 1가 분자를 형성하는 단일 단백질로서 만드는 합성 링커에 의해 이들 두 도메인을 연결시킬 수 있다 (상기 1가 분자는 단일쇄 Fv (scFv)로 공지되어 있음; 예를 들어, 문헌 (Bird et al., (1998) Science 242: 423-426; 및 Huston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883)을 참조함). 이러한 단일쇄 항체도 항체의 "항원-결합 부위"란 용어에 포함되는 것이다. 이들 항체 단편은 당업자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 얻고, 유용한 단편은 온전한 항체의 경우와 동일한 방식으로 스크리닝한다.
용어 "이중특이적 분자"는 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 결합체를 포함하고, 이들 물질은 (a) 세포 표면 항원 및 (b) 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체와 결합하거나 상호작용하는 두 가지 다른 결합 특이성을 갖는다. 용어 "다중특이적 분자" 또는 "이종특이적 분자"는 (a) 세포 표면 항원, (b) 이펙터 세포의 표면 상의 Fc 수용체 및 (c) 1종 이상의 다른 성분과결합하거나 상호작용하는 두 가지 이상의 다른 특이성을 갖는 임의의 물질, 예를 들어, 단백질, 펩티드, 단백질 결합체 또는 펩티드 결합체를 포함한다. 따라서, 본 발명은 HER2/neu와 같은 세포 표면 항원, 및 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 이중특이적, 삼중특이적, 사중특이적 및 다른 다중특이적 분자를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 용어 "이중특이적 항체"는 디아보디(diabody)를 추가로 포함한다. 디아보디는 VH 및 VL 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 상에 발현되는 이가 이중특이적 항체이지만, 동일한 사슬 상의 상기 두 도메인 사이의 페어링을 허용하기에는 너무 짧은 링커를 사용하기 때문에 또 다른 사슬의 상보적 도메인과 상기 도메인들이 페어링되어 두 개의 항원-결합 부위가 형성된다 [예를 들어, 문헌 (Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2: 1121-1123)을 참조].
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이종 항체"는 두 가지 이상의 항체, 그의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab) 및 유도체, 또는 항원-결합 영역들이 연결된 영역 (이들 중 적어도 두 개의 영역은 다른 특이성을 갖음)을 말한다. 이들 다른 특이성에는 이펙터 세포 상의 Fc 수용체에 대한 결합 특이성, 및 표적 세포, 예컨대, 종양 세포 상의 항원 또는 에피토프에 대한 결합 특이성이 포함된다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 항체를 포함한다. 본 발명의 인간 항체는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열에 의해 코딩되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관내 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이유발이나 생체내 체세포 돌연변이유발에 의해 도입된 돌연변이)를 포함할 수 있다. 그러나, 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "인간 항체"에는 마우스와 같은 다른 포유동물종의 생식세포로부터 유래된 CDR 서열이 인간 골격 서열에 이식되어 있는 항체는 포함되지 않는다.
본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체" 또는 "모노클로날 항체 조성물"은 단일 분자 조성물의 항체 분자로 된 제제를 말한다. 모노크로날 항체 조성물은 특정한 에피토프에 대한 단일 결합 특이성 및 친화성을 보인다. 따라서, 용어 "인간 모노클로날 항체"는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는 단일 결합 특이성을 나타내는 항체를 말한다. 한 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 불멸화 세포에 융합되어 있으며, 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는, 형질전환 비인간 동물, 예를 들어, 형질전환 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산된다.
본원에 사용된 용어 "재조합 인간 항체"는 재조합 방법에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 유전자 (하기 단락 I에 더 자세히 기재됨)로 형질전환된 동물 (예컨대, 마우스)로부터 단리된 항체; 숙주 세포내로 형질감염된 재조합 발현 벡터를 사용시 발현되는 항체; 재조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체; 또는 다른 DNA 서열에 대한 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열의 스플라이싱(splicing)을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조, 발현, 생성 또는 단리되는 항체를 포함한다. 이러한 재조합 인간 항체는 인간 생식세포의 이뮤노글로불린 서열로부터 유래된 가변 및 불변 영역을 갖는다. 그러나, 일부 실시양태에서, 이러한 재조합 인간 항체를 시험관내에서 돌연변이시켜 (또는 인간 Ig 서열로 형질전환된 동물이 사용된 경우에는, 생체내에 체세포 돌연변이를 유발하여) 얻은 재조합 항체의 VH 및 VL 영역의 아미노산 서열은 인간 생식세포의 VH 및 VL 서열로부터 유래하고 이 서열과 관련되어 있지만 생체내에서 인간 생식세포의 항체 레파토리내에 천연적으로 존재하지 않을 수 있는 서열이다.
본원에 사용된 용어 "이종 하이브리드 항체"는 이러한 항체를 생산하는 형질전환 비인간 유기체와 관련되어 정의된다. 이 용어는 형질전환 비인간 동물로 구성되지 않고 대체적으로 형질전환 비인간 동물종 이외의 종으로부터 유래된 유기체에서 발견된 것에 상응하는 아미노산 서열 또는 코딩 핵산 서열을 갖는 항체를 말한다.
본원에 사용된 용어 "헤테로하이브리드 항체"는 다양한 유기체로부터 유래된 경쇄 및 중쇄를 갖는 항체를 말한다. 예를 들어, 뮤린 경쇄와 연결된 인간 중쇄를 갖는 항체는 헤테로하이브리드 항체이다. 헤테로하이브리드 항체의 예로는 전술된 키메라 항체 및 인간화 항체가 있다.
본원에 사용된 용어 "단리된 항체"는 상이한 항원 특이성을 갖는 다른 항체가 실질적으로 없는 항체 (예를 들어, HER2/neu 이외의 항원에 특이적으로 결합하는 항체가 실질적으로 없는, HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 항체)를 말한다. 그러나, 인간 HER2/neu의 에피토프, 이소폼 또는 변이체에 특이적으로 결합하는 단리된 항체는 예컨대, 다른 종으로부터 유래된 다른 관련 성장인자 수용체 (예를 들어, HER2/neu 종 동족체)와 교차 반응할 수 있다. 더욱이, 단리된 항체에는다른 세포 물질 및(또는) 화학물질이 실질적으로 없을 수 있다. 본 발명의 한 실시양태에서, 다양한 특이성을 갖는, "단리된" 모노클로날 항체의 배합물은 잘 정의된 조성물 중에서 배합한다.
본원에 사용된 용어 "특이적 결합"은 미리 결정된 항원과 항체의 결합을 말한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 약 1 x 107M-1의 친화도로 미리 결정된 항원과 결합하고, 미리 결정된 항원 또는 매우 관련된 항원 이외의 비특이적 항원 (예컨대, BSA, 카세인)에 대한 그의 결합 친화도보다 2배 이상 더 높은 친화도로 미리 결정된 항원에 결합한다. 어구 "항원을 인식하는 항체" 및 "항원에 대해 특이적인 항체"는 본원에서 "항원에 특이적으로 결합하는 항체"란 용어와 상호교환 가능하게 사용한다.
본원에 사용된 바와 같이, IgG 항체에 대한 "고친화도"란 용어는 약 107M-1이상, 바람직하게는 약 109M-1이상, 보다 바람직하게는 약 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1또는 그 이상, 예를 들어, 1013M-1또는 그 이상의 결합 친화도를 말한다. 그러나, "고친화성" 결합은 다른 항체 이소타입마다 다를 수 있다. 예를 들어, IgM 이소타입에 대한 "고친화성" 결합은 약 1 x 107M-1이상의 결합 친화도를 말한다.
본원에 사용된 용어 "Kassoc"는 특정한 항체-항원 상호작용의 결합 상수를 말한다.
본원에 사용된 용어 "Kdis"는 특정한 항체-항원 상호작용의 해리 상수를 말한다.
본원에 사용된 "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예컨대, IgM 또는 IgG)를 말한다.
본원에 사용된 "이소타입 전환"은 항체의 클래스 또는 이소타입이 한 Ig 클래스에서 다른 Ig 클래스로 바뀌는 현상을 말한다.
본원에 사용된 "전환되지 않은 이소타입"은 이소타입 전환이 일어나지 않은 경우 생산되는 중쇄의 이소타입 클래스를 말하는데, 전환되지 않은 이소타입을 코딩하는 CH 유전자는 전형적으로 기능적으로 재배열된 VDJ 유전자의 바로 아래에 위치한 제1 CH 유전자이다. 이소타입 전환은 고전적인 이소타입 전환 또는 비고전적인 이소타입 전환으로 분류된다. 고전적인 이소타입 전환은 트랜스진내의 전환 서열 영역을 하나 이상 수반하는 재조합 과정에 의해 일어난다. 비전환적 이소타입 전환은 예를 들어, 인간 σμ과 인간 Σμ(δ-관련 결실) 사이의 상동 재조합에 의해 일어날 수 있다. 트랜스진 간의 재조합 및(또는) 염색체 간의 재조합과 같은 별도의 비고전적 전환 메커니즘이 일어나 이소타입 전환을 수행할 수도 있다.
본원에 사용된 용어 "전환 서열"은 전환 재조합을 담당하는 DNA 서열을 말한다. 전형적인 μ전환 영역인 "전환 공여자 (donor)" 서열은 전환 재조합 동안 결실되는 작제물 영역의 5' (즉, 상류)일 것이다. "전환 수용자" 영역은 결실된 작제물 영역과 대체 불변 영역 (예컨대, γ, ε등) 사이에 있을 것이다. 재조합이항상 일어나는 특정 부위가 없기 때문에, 일반적으로 작제물로부터 최종 유전자 서열을 예측할 수 없을 것이다.
본원에 사용된 "글리코실화 패턴"은 단백질, 보다 구체적으로 이뮤노글로불린 단백질에 공유 결합된 탄수화물 단위의 패턴으로 정의된다. 이종 항체의 글리코실화 패턴이 트랜스진의 CH 유전자가 유래되는 종보다 비인간 형질전환 동물의 종의 상기 글리코실화 패턴과 더 유사하다는 것을 당업자가 인식할 경우, 상기 이종 항체의 글리코실화 패턴은 비인간 형질전환 동물 종에 의해 생산되는 항체 상에서 자연적으로 발생되는 글리코실화 패턴과 실질적으로 유사하다는 것을 특징으로 할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 한 대상체에게 적용되는 "자연-발생"이란 용어는 상기 대상체를 자연 상태에서 발견할 수 있다는 사실을 말한다. 예를 들어, 자연 상태의 공급원으로부터 단리할 수 있고 실험실에서 인간에 의해 고의적으로 변형되지 않은 유기체 (바이러스를 포함함)에 존재하는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 자연 발생적인 서열이다.
본원에 사용된 용어 "재배열된"은 V 단편이 본질적으로 완전한 VH 또는 VL 도메인 각각을 코딩하는 구조로 D-J 또는 J 단편과 바로 인접한 위치에 있는 중쇄 또는 경쇄 이뮤노글로불린 좌위의 구성을 말한다. 재배열된 이뮤노글로불린 유전자 좌위는 생식세포의 DNA와 비교하여 확인할 수 있고, 재배열된 좌위에는 1종 이상의 재조합 7량체/9량체 상동성 원소가 있을 것이다.
V 단편에 대해 본원에 사용된 용어 "재배열되지 않은 구성" 또는 "생식세포구성"이란 용어는 재조합되지 않아 V 단편이 D 또는 J 단편에 바로 인접하는 구성을 말한다.
본원에 사용된 용어 "핵산 분자"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 포함한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, HER2/neu와 결합하는 항체 또는 항체 일부 (예를 들어, VH, VL, CDR3)를 코딩하는 핵산에 대한 용어 "단리된 핵산 분자"는 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에는 HER2/neu 이외의 항원에 결합하는 항체 또는 항체 일부를 코딩하는 다른 뉴클레오티드 서열이 없고 다른 서열이 인간 게놈 DNA 내의 핵산을 자연적으로 플랭킹할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 서열 1 내지 12는 본 발명의 3.F2, 1.D2 및 2.E8 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체의 중쇄 (VH) 및 경쇄 (VL) 영역을 포함하는 뉴클레오티드 및 아미노산 서열에 상응한다. 특히, 서열 1 및 2는 3.F2 항체의 VH에 상응하고, 서열 3 및 4는 3.F2 항체의 VL에 상응하고, 서열 5 및 6은 1.D2 항체의 VH에 상응하고, 서열 7 및 8은 1.D2 항체의 VL에 상응하고, 서열 9 및 10은 2.E8 항체의 VH에 상응하고, 서열 11 및 12는 2.E8 항체의 VL에 상응한다.
핵산의 경우, 용어 "실질적인 상동성"이란 적당한 뉴클레오티드가 삽입 또는 결실되어 있는 두 핵산 또는 그의 특정 서열이 최적으로 정렬되어 비교될 때 뉴클레오티드의 약 80% 이상, 통상적으로 약 90 내지 95% 이상, 보다 바람직하게는 약 98 내지 99.5% 이상 동일함을 의미한다. 또는, 실질적인 상동성은 단편이 선택적인 혼성화 조건 하에서 상기 단편 가닥의 상보체와 혼성화할 때 존재한다.
두 서열 사이의 동일성%은 갭의 수 및 각 갭의 길이를 고려하여 두 서열의 최적 정렬을 위해 도입될 필요가 있는 서열에 의해 나누어진 동일한 위치의 수의 함수이다 (즉, % 상동성 = 동일한 위치의 #/ 위치의 총 # X 100). 서열의 비교 및 두 서열 사이의 동일성%의 측정은 하기 비제한적 실시예에 기재된 바와 같이 수학적인 알고리즘을 이용하여 달성할 수 있다.
두 뉴클레오티드 서열 사이의 동일성%은 NWSgapdna CMP 메트릭스, 40, 50, 60, 70 또는 80의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램을 이용하여 측정할 수 있다. 두 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 동일성%은 PAM120 중량 잔기 표, 12의 갭 길이 페널티 및 4의 갭 페널티를 사용한 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)내로 도입되는 알고리즘 [E. Meyers and W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989))]을 이용하여 측정할 수도 있다. 또한, 두 아미노산 서열 사이의 동일성%은 Blossum 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 중 하나, 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 갭 중량 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 중량을 사용한, GCG 소프트웨어 팩키지 (http://www.gcg.com에서 이용가능함) 중의 GAP 프로그램내로 도입되는 니들만 및 웬치 [Needleman and Wunsch (J Mol. Biol. (48): 444-453 (1970))] 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다.
또한, 본 발명의 핵산 및 단백질 서열을 "의문 서열"로 사용하여 공개 데이터베이스를 검색함으로써 예컨대, 관련된 서열을 확인할 수 있다. 이러한 검색은문헌 (Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10)의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버전 2.0)을 이용하여 수행할 수 있다.
NBLAST 프로그램 (점수 = 100, 단어길이 = 12)으로 BLAST 뉴클레오티드를 검색하여 본 발명의 핵산 분자와 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 얻을 수 있다. XBLAST 프로그램 (점수 =50, 단어길이 =3)으로 BLAST 단백질 검색을 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성이 있는 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교하기 위한 갭 정렬을 얻기 위해서는 갭 BLAST를 문헌 (Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25 (17): 3389-3402)에 기재된 바와 같이 이용할 수 있다. BLAST 및 갭 BLAST 프로그램을 이용할 경우, 각 프로그램 (예컨대, XBLAST 및 NBLAST)의 디폴트 파라미터를 사용할 수 있다 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov를 참조).
핵산은 부분 정제된 형태 또는 실질적으로 순수한 형태로 전체 세포 또는 세포 용해물에 존재할 수 있다. 핵산은 알칼리/SDS 처리, CsCl 밴딩, 컬럼 크로마토그래피, 아가로스 겔 전기영동 및 당업계에 잘 공지되어 있는 다른 기술을 비롯한 표준 기술에 의해 다른 세포 성분 또는 다른 오염물질, 예컨대, 다른 세포 핵산 또는 단백질로부터 분리되어 정제된 경우 "단리된" 또는 "실질적으로 순수한 형태가 된"다 (F. Ausubel, et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York (1987).
cDNA, 게놈 또는 그의 혼합물로부터의 본 발명의 핵산 조성물은 종종 천연 서열로 존재하지만 (변형된 제한효소 부위 등은 제외함), 표준 기술에 따라 돌연변이되어 유전자 서열을 제공할 수 있다. 코딩 서열의 경우, 이들 돌연변이는 원하는 아미노산 서열에 영향을 줄 수 있다. 특히, 천연 V, D, J 불변 서열 및 전환 서열 및 본원에 기재된 다른 이러한 서열과 실질적으로 상동성이 있거나 이들로부터 유도된 DNA 서열도 고려된다 (여기서, "유도된"은 한 서열이 또 다른 서열과 동일하거나 또는 다른 서열로부터 변형된 것임을 의미함).
핵산은 또 다른 핵산 서열과 기능적 관계를 갖도록 놓여 있을 때 "작동 가능하게 연결되어" 있다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 이들이 서열의 전사에 영향을 주다면 코딩 서열에 작동 가능하게 연결되어 있다. 전사 조절 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 연결된 DNA 서열이 인접해 있고, 필요한 경우, 두 개의 단백질 코딩 영역이 인접하여 리딩 프레임으로 연결되어 있다는 것을 의미한다. 전환 서열의 경우, 작동 가능하게 연결되어 있다는 것은 서열이 전환 재조합을 수행할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 연결된 또 다른 핵산을 전달할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터 중 한 유형은 추가 DNA 단편이 결찰될 수 있는 원형 이중가닥 DNA 루프를 말하는 "플라스미드"이다. 또 다른 유형의 벡터는 바이러스 벡터인데, 이 벡터에서 추가 DNA 단편은 바이러스 게놈내로 결찰될 수 있다. 일부 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포에서 자가 복제할 수 있다 (예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피좀형 포유동물 벡터). 다른 벡터 (예를 들어, 비에피좀형 포유동물 벡터)도 숙주 세포내로 도입시 숙주 세포의 게놈내로 삽입되어 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 더욱이, 일부 벡터는 이들과 작동 가능하게 연결된 유전자를 발현시킬 수 있다. 이러한 벡터는 본원에서 "재조합발현 벡터" (또는 단순하게 "발현 벡터")로 불린다.
일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 사용되는 발현 벡터는 종종 플라스미드 형태이다. 본 명세서에서, "플라스미드" 및 "벡터"는 플라스미드가 가장 흔히 사용되는 벡터의 형태이므로 상호교환 가능하게 사용할 수 있다. 그러나, 본 발명은 바이러스 벡터 (예를 들어, 복제 결함 레트로바이러스, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스)와 같은 동일한 기능을 갖는 다른 형태의 발현 벡터를 포함한다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 숙주 세포" (또는 단순하게 "숙주 세포")는 재조합 발현 벡터가 도입된 세포를 말한다. 이러한 용어는 특정 대상 세포 뿐만 아니라 이러한 세포의 자손도 말하는 것으로 이해해야 한다. 돌연변이 또는 환경적인 영향으로 인해 후속 세포에서 일부 변형이 일어날 수 있기 때문에, 사실상 이러한 자손은 모세포와 동일하지 않을 수 있지만 본원에 사용된 용어 "숙주 세포"란 용어의 범위에 여전히 포함된다.
본 발명의 다양한 측면이 하기 단락에 더 자세히 기재된다.
I. HER2/neu에 대한 인간 항체의 생산
본 발명의 모노클로날 항체 (mAb)는 통상적인 모노클로날 항체 방법론, 예를 들어, 표준 체세포 혼성화 기술 (Kohler and Milstein, Nature 256: 495 (1975))을 비롯한 다양한 기술에 의해 생산될 수 있다. 체세포 혼성화 방법이 원리적으로 바람직하다고 하더라도, 모노클로날 항체를 생산하는 다른 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스 또는 온코진 형질전환을 이용할 수 있다.
하이브리도마를 제조하는 데 바람직한 동물 시스템은 뮤린 시스템이다. 마우스에서의 하이브리도마 제조는 매우 잘-확립된 방법이다. 융합용 면역화 비장세포의 단리를 위한 면역화 프로토콜 및 기술은 당업계에 공지되어 있다. 융합 파트너 (예컨대, 뮤린 골수종 세포) 및 융합 방법도 공지되어 있다.
바람직한 실시양태에서, HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체는 마우스 시스템보다는 인간 면역 시스템의 일부를 수반하는 형질전환 마우스를 이용하여 발생시킬 수 있다. 본원에서 "HuMAb" 마우스로 불리는 이들 형질전환 마우스는, 내생 μ쇄 및 κ쇄 좌위를 불활성화시키는 표적 돌연변이와 함께, 정렬되지 않은 인간 중쇄 (μ 및 γ) 및 κ경쇄 이뮤노글로불린 서열을 코딩하는 인간 이뮤노글로불린 유전자 미니좌위를 함유한다 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859). 따라서, 상기 마우스는 마우스의 IgM 또는 Kκ의 감소된 발현을 보이고, 면역화에 반응하여 클래스 전환 및 체세포 돌연변이가 도입된 인간 중쇄 및 경쇄 트랜스진에서 일어나 고친화성 인간 IgGκ모노클로날 항체가 생산된다 (Lonberg, N. et al. (1994), supra; reviewed in Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93, and Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546). HuMAb 마우스의 제조는 하기 단락 II 및 문헌 (Taylor, L. et al. (1992) Nucleic Acids Research 20: 6287-6295; Chen, J. et al. (1993) International Immunology 5: 647-656; Tuaillon et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4: 117-123; Chen, J. et al. (1993) EMBO J. 12: 821-830; Tuaillon et al. (1994) J. Immunol. 152:2912-2920; Lonberg et al., (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113: 49-101; Taylor, L. et al. (1994) International Immunology 6: 579-591; Lonberg, N. and Huszar, D. (1995) Intern. Rev. Immunol. Vol. 13: 65-93; Harding, F. and Lonberg, N. (1995) Ann. N. Y. Acad. Sci 764: 536-546; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851)에 자세히 기재되어 있고, 이들의 전체 개시 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 또한, 미국 특허 제5,545,806호, 제5,569,825호, 제5,625,126호, 제5,633,425호, 제5,789,650호, 제5,877,397호, 제5,661,016호, 제5,814,318호, 제5,874,299호 및 제5,770,429호 (Lonberg and Kay, and GenPharm International); 미국 특허 제5,545,807호 (Surani et al.); 1998년 6월 11일 공개된 WO 98/24884; 1994년 11월 10일 공개된 WO 94/25585; 1993년 6월 24일 공개된 WO 93/1227; 1992년 12월 23일 공개된 WO 92/22645; 1992년 3월 19일 공개된 WO 92/03918도 참조할 수 있는데, 이들 문헌의 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 한다. 별법으로, 실시예 2에 기재된 HC012 형질전환 마우스를 사용하여 인간 항-HER2/neu 항체를 생산할 수 있다.
HuMAb 면역화
HER2/neu에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체를 생산하기 위해, 문헌 (Lonberg, N. et al. (1994) Nature 368 (6474): 856-859; Fishwild, D. et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851 and WO 98/24884)에 기재된 바와 같이 HuMAb 마우스를 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 이 항원이 풍부한 제제, 및(또는)HER2/neu 발현 세포로 면역화시킬 수 있다. 바람직하게는, 마우스는 6-16주다 되었을 때 처음 관주한다. 예를 들어, 단리된 HER2/neu 항원 제제 또는 HER2/neu 항원이 풍부한 제제 (5-20 ㎍)를 사용하여 HuMAb 마우스를 복강내로 면역화시킬 수 있다. 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 HER2/neu 항원이 풍부한 제제를 사용한 면역화가 항체를 발생시키지 않을 경우, HER2/neu을 발현하는 세포, 예컨대, 종양 세포주로 마우스를 면역화시켜 면역 반응을 촉진할 수 있다.
다양한 항원을 사용한 중복 실험은 HuMAb 형질전환 마우스를 프로인트 완전 면역보강제 (complete Freund's adjuvant) 중의 항원을 사용하여 복강내로 (IP) 초기 면역화시킨 후 프로인트 불완전 면역보강제 (incomplete Freund's adjuvant) 중의 항원으로 (총 6회까지) 매주 IP 면역화하는 경우, 상기 HuMAb 형질전환 마우스가 가장 잘 반응한다는 것을 보인 바 있다. 면역 반응은 안와후 출혈에 의해 얻어지는 혈장 샘플을 사용한 면역화 프로토콜의 경로에 걸쳐 관찰할 수 있다. 혈장을 ELISA (하기에 기재함)에 의해 스크리닝할 수 있고, 항-HER2/neu 인간 이뮤노글로불린의 역가가 충분한 마우스를 융합에 사용할 수 있다. 마우스를 희생시켜 비장을 적출하기 3일 전에 항원으로 정맥내 부스팅시킬 수 있다. 각 항원에 대해 2-3회의 융합을 수행할 필요가 있을 수 있음이 예측된다. 각 항원에 대해 6마리의 마우스를 면역화시킬 것이다. 예를 들어, HC07 및 HC012 계통의 총 12마리 HuMAb 마우스를 면역화시킬 수 있다.
HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마의 생산
표준 프로토콜을 기초로 하여 마우스 비장세포를 단리하고 PEG로 마우스 골수종 세포주와 융합시킬 수 있다 (8, 13). 이어서, 생성된 하이브리도마를 항원-특이적 항체의 생산에 대하여 스크리닝한다. 예를 들어, 면역화 마우스로부터의 비장 림프구의 단일 세포 현탁액은 50% PEG를 사용하여 P3X63-Ag8.653 비분비 마우스의 골수종 세포 (ATCC, CRL 1580) 수의 1/6에 상응하는 수의 세포와 융합시킨다. 대략 2 x 105만큼의 세포를 평편 바닥 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅한 후, 20% 태아 클론 혈청, 18% "653" 상태조절 배지, 5% 오리겐 (IGEN), 4 mM L-글루타민, 1 mM L-글라타민, 1 mM 소듐 피루베이트, 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-메르캡토에타놀, 50 유닛/ml 페니실린, 50 mg/ml 스트렙토마이신, 50mg/ml 젠타마이신 및 1 X HAT (Sigma; HAT는 융합으로부터 24시간 후 첨가함)이 함유된 선별 배지에서 2주 동안 인큐베이션한다. 2주 후, HAT를 HT로 바꾼 배지에서 세포를 배양한다. 이어서, ELISA에 의해 개별 플레이트 웰을 인간 항-HER2/neu 모노클로날 IgM 및 IgG 항체에 대해 스크리닝하였다. 일단 광범위한 하이브리도마 생장이 일어나면, 통상 10-14일 후 배지를 관찰한다. 항체 분비 하이브리도마를 다시 플레이팅하고, 다시 스크리닝하고, 인간 IgG, 항-HER2/neu 모노클로날 항체에 대해 여전히 양성이면 제한 희석법으로 2회 이상 서브클로닝할 수 있다. 그 다음으로, 안정한 서브클론을 시험관내에서 배양하여 조직 배양 배지 중의 소량의 항체를 생산하여 특징규명에 사용하였다.
HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체의 결합의 특징규명
본 발명의 인간 모노클로날 HER2/neu 항체의 결합의 특징을 규명하기 위해,면역화 마우스로부터의 혈청을 예를 들어, ELISA로 시험할 수 있다. 요약하건대, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 정제된 HER2/neu 0.25 ㎍/ml으로 코팅한 후, PBS 중의 5% 소혈청 알부민 (BSA)으로 블로킹한다. HER2/neu-면역화 마우스로부터 얻은 혈장 희석액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후, 알카리성 포스패타제에 결합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 플레이트는 pNPP 기질 (1 mg/ml)를 사용하여 현상하고, 405-650의 OD에서 분석한다. 바람직하게는, 가장 높은 역가를 보이는 마우스를 융합에 사용할 것이다.
별법으로, 마이크로타이터 플레이트는 마우스 항-HER2/neu 항체로 코팅하고, 5% BSA 중에서 블로킹하고, HER2/neu를 발현하는 과생장 세포, 예컨대, SKBR-3 종양 세포로부터 얻은 배양 상등액과 함께 인큐베이션하여, 상기 세포에 의해 제공되는 HER2/neu 항원을 포획한다. 정제된 인간 항-HER2/neu 항체의 희석액을 각 웰에 첨가하고 인큐베이션하고, 상기와 같이 결합을 검출한다.
상기한 바와 같은 ELISA 분석법을 이용하여 HER2/neu 면역원과의 양성 반응성을 보이는 항체를 생산하는 하이브리도마에 대해 항체를 스크리닝할 수도 있다. HER2/neu에 대한 높은 결합력으로 결합하는 하이브리도마를 서브클로닝하여 그 특징을 더 규명할 것이다. (ELISA로 분석할 때) 모세포의 반응성을 보유하는, 각 하이브리도마로부터 얻은 한 개의 클론을 선택하여 -140℃에 저장되는 5-10개의 바이알 세포 뱅크를 제조할 수 있고 항체를 정제할 수 있다.
인간 항-HER2/neu 항체를 정제하기 위해, 선별된 하이브리도마를 2 리터 스피너-플라스크에서 생장시켜 모노클로날 항체를 정제할 수 있다. 상등액을 여과하고 단백질 A-세파로스를 사용한 친화 크로마토그래피 (Pharmacia, Piscataway, NJ) 전에 농축할 수 있다. 용출된 IgG를 겔 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 분석하여 순도를 확인할 수 있다. 완충 용액을 PBS로 교체할 수 있고, 1.43 흡광 계수를 사용한 OD280에 의해 농도를 측정할 수 있다. 모노클로날 항체를 분취하여 -80℃에 저장할 수 있다.
선별된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체가 특정한 에피토프에 결합하는지를 알아보기 위해, 시판되는 시약 (Pierce, Rockford, IL)을 사용하여 각 항체를 바이오티닐화할 수 있다. 상기한 바와 같은 HER2/neu 코팅-ELISA 플레이트를 사용하여 표지되지 않은 모노클로날 항체 및 바이오티닐화 모노클로날 항체를 사용한 경쟁 연구를 수행할 수 있다. 바이오티닐화 mAb 결합은 스트렙-아비딘 알칼리성 포스패타제 프로브로 검출할 수 있다.
정제된 항체의 이소타입을 결정하기 위해, 이소타입 ELISA를 수행할 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 웰을 4℃에서 10 ㎍/ml의 항-인간 Ig로 밤새 코팅할 수 있다. 5% BSA로 블로킹한 후, 주위 온도에서 상기 플레이트를 10 ㎍/ml의 모노클로날 항체 또는 정제된 이소타입 대조구와 2시간 동안 반응시킨다. 이어서, 웰을 인간 IgG1 또는 인간 IgM-특이적 알칼리성 포스패타제-결합 프로브와 반응시킬 수 있다. 플레이트를 전술한 바와 같이 현상하고 분석한다.
HER2/neu 수용체를 발현하는 살아 있는 세포와 모노클로날 항체의 결합을 입증하기 위해, 플로우 사이토메트리를 이용할 수 있다. 요약하면, HER2/neu를 발현하는 세포주 (표준 생장 조건 하에서 생장한 것)를 0.1% Tween 80 및 20% 마우스 혈청이 함유된 PBS 중의 다양한 농도의 모노클로날 항체와 혼합하고, 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션한다. 세척 후, 상기 세포를 1차 항체 염색과 동일한 조건 하에서 형광물질-표지 항-인간 IgG 항체와 반응시킨다. 광, 및 단일 세포 상에서 나타나는 측면 산란성을 이용한 FACScan 기구로 샘플을 분석할 수 있다. 형광 현미경을 이용한 다른 분석법을 플로우 사이토메트리 분석법과 함께 또는 플로우 사이토메트리 분석법 대신에 사용할 수 있다. 상기와 동일하게 세포를 염색하고 형광 현미경으로 조사할 수 있다. 이 방법으로 개별 세포를 볼 수 있지만, 항원의 밀도에 따라 민감성이 감소될 수 있다.
웨스턴 브로팅으로 항-HER2/neu 인간 IgG와 HER2/neu 항원의 반응성에 대해 더 시험할 수 있다. 요약하면, HER2/neu를 발현하는 세포로부터의 세포 추출물을 준비하여 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분석할 수 있다. 전기영동 후, 분리된 항원을 니트로셀룰로스 막에 옮기고 20% 마우스 혈청으로 블로킹하고, 시험할 모노클로날 항체로 프로빙한다. 인간 IgG 결합은 항-인간 IgG 알칼리성 포스패타제를 이용하여 검출하고 BCIP/NBT 기질 정제 (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO)로 현상할 수 있다.
HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체의 식세포작용 활성 및 세포 살해 활성
HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항-HER2/neu 항체의 능력이외에, HER2/neu를 발현하는 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 인간 모노클로날 항-HER2/neu 항체의 능력에 대해 시험할 수 있다. 모노클로날 항체 활성의 시험관내 시험은 생체내 모델에서 시험하기 전에 초기 스크리닝을 제공할 것이다. 요약하면, 건강한 공여자의 다형핵 세포 (PMN) 또는 다른 이펙터 세포 (예컨대, IFN-γ유도 대식세포)는 피콜 하이파크 (Ficoll Hypaque) 밀도 원심분리 후 오염 적혈구를 용해시켜 정제할 수 있다. 세척된 PMN은 10% 열-불활성화 소 태아 혈청이 보충된 RPMI에 현탁시키고, 종양 세포에 대한 이펙터 세포의 다양한 비율로 (E:T) HER2/neu를 발현하는51Cr 표지 세포와 혼합할 수 있다. 그 다음, 정제된 인간 항-HER2/neu IgG를 다양한 농도로 첨가할 수 있다. 관련없는 인간 IgG를 음성 대조구로 사용할 수 있다. 분석은 37℃에서 4-16시간 동안 수행할 수 있다. 배양 상등액으로 방출되는51Cr을 측정함으로써 샘플을 세포용해에 대해 분석할 수 있다.
항-HER2/neu 모노클로날 항체는 세포용해가 다수의 모노클로날 항체에 의해 상승되는지 상승되지 않는 지를 알아보기 위해 서로 배합된 상태로 시험할 수도 있다.
HER2/neu에 결합하는 인간 모노클로날 항체를 생체내 모델 (예컨대, 마우스)에서 시험하여 HER2/neu를 발현하는 세포, 예를 들어, 종양 세포의 식세포작용 및 사멸을 매개하는 데 있어서의 상기 항체의 효능을 알아볼 수도 있다. 이들 항체는 예컨대, 하기 기준을 기초로 하여 선별할 수 있고, 하기 기준은 제한되지 않는다:
1) HER2/neu를 발현하는 살아 있는 세포와의 결합;
2) HER2/neu와의 높은 결합 친화도;
3) HER2/neu 상의 특정한 에피토프와의 결합 (함께 사용될 경우 상보적 활성을 갖는 모노클로날 항체가 동일한 에피토프와 경쟁적으로 결합한다는 가정은 제외함);
4) HER2/neu를 발현하는 세포의 옵소닌작용;
5) 인간 이펙터 세포의 존재 하에 HER2/neu를 발현하는 세포의 생장 억제, 식세포작용 및(또는) 사멸의 매개;
6) HER2/neu와 결합한 후 HER2/neu 발현 세포에 의한 내재화;
본 발명의 바람직한 인간 모노클로날 항체는 이들 기준을 하나 이상, 바람직하게는 모두 총족시킨다. 구체적인 실시양태에서, 인간 모노클로날 항체는 예를 들어, 1종 이상의 항-HER2/neu 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 포함하는 제약 조성물로서 함께 사용된다. 예를 들면, 다르지만 상보적인 활성을 갖는 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체를 단일 치료법에서 함께 사용하여 원하는 치료 및 진단 효과를 얻을 수 있다. 이것의 예로는 HER2/neu를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 또 다른 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체와 함께, 이펙터 세포의 존재 하에 표적 세포가 매우 효율적으로 사멸하도록 매개하는 항-HER2/neu 인간 모노클로날 항체를 함유하는 조성물이 있다.
II. 인간 모노클로날 항-HER2/neu 항체를 생성하는 비인간 형질전환 동물의 발생
또 다른 측면으로, 본 발명은 HER2/neu에 대해 특이적으로, 바람직하게는 높은 친화성을 가지며 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현시킬 수 있는 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스를 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스(HuMAb 마우스)는 인간 중쇄 트랜스진 및 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 보유한다. 한 실시양태에서, 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 HER2/neu가 풍부한 제제및(또는) HER2/neu 발현 세포로 면역화된다. 바람직하게는, 비인간 형질전환 동물, 예를 들어 형질전환 마우스는 V-D-J 재조합 및 아이오타입 전환을 수행함으로써 HER2/neu에 대한 수개의 인간 모노클로날 항체 이소타입(예를 들어, IgG, IgA 및(또는) IgE)을 생산할 수 있다. 이소타입 전환은, 예를 들어 전형적이거나 비전형적인 이소타입 전환에 의해 발생될 수 있다.
이종 항체 레파토리를 사용하여 외래 항원 자극에 대해 반응하는 비인간 형질전환 동물을 디자인하기 위해서는, 이종 이뮤노글로불린 트랜스진이 형질전환 동물내에 포함되어 있고 B-세포 발생 경로를 통해 정확하게 작동하는 것을 필요로 한다. 바람직한 실시양태에서, 이종 중쇄 트랜스진의 정확한 작동에는 이소타입 전환이 포함된다. 따라서, 본 발명의 트랜스진은 이소타입 전환, 및 (1) 높은 수준의 세포-유형 특이적 발현, (2) 기능성 유전자 재배열, (3) 대립유전자 배제의 활성화 및 대립유전자 배제에 대한 반응, (4) 주요 레파토리의 충분한 발현, (5) 신호 전달, (6) 체세포 과다변이, 및 (7) 면역 반응 동안의 트랜스진 항체 좌위의 우성화 중 하나 이상을 나타내도록 구성된다.
상기 기준 모두를 충족시킬 필요는 없다. 예를 들어, 형질전환 동물의 내재 이뮤노글로불린 좌위의 기능이 손상된 실시양태의 경우, 트랜스진은 대립유전자 배제를 활성화할 필요가 없다. 또한, 트랜스진이 기능적으로 재배열된 중쇄 및(또는) 경쇄 이뮤노글로불린 유전자를 포함하는 실시양태의 경우, 기능적 유전자 재배열의 두번째 기준은 적어도 트랜스진이 이미 재배열된 경우에는 필요치 않다. 분자 면역학의 배경 기술에 대하여는, 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 문헌 [Fundamental Immunology, 2nd edition (1989), Paul William E., ed. Raven Press, N. Y.]을 참조한다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 데 사용되는 비인간 형질전환 동물은 형질전환 동물의 생식세포에서 재배열된 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 재배열되지 않은 이종 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 트랜스진, 또는 이들의 조합을 포함한다. 중쇄 트랜스진은 각각 하나 이상의 CH유전자를 포함한다. 또한, 중쇄 트랜스진은 형질전환 동물의 B-세포에서 수개의 CH유전자를 코딩하는 이종 트랜스진의 이소타입 전환을 뒷받침할 수 있는 기능성 이소타입 전환 서열을 포함할 수 있다. 이러한 전환 서열은 트랜스진 CH유전자의 공급원 역할을 하는 종 유래의 생식세포 이뮤노글로불린 좌위에서 자연적으로 발생하는 것이거나 또는 이 트랜스진 구조물을 수용하게 될 종 (형질전환 동물)에서 발생하는 것들로부터 유도될 수 있다. 예를 들어, 형질전환 마우스를 생성하는 데 사용되는 인간 트랜스진 구조물은 이 구조물이 마우스 중쇄 좌위에서 자연적으로 발생하는 것과 유사한 전환 서열을 포함하는 경우, 아마도 마우스 전환 서열은 마우스 전환 리컴비나제 효소 시스템을 사용하여 작동이 최적화되지만 인간 전환 서열의 경우에는 그렇지 못한 것과 같이, 이소타입 전환 반응을 더 높은 빈도로 나타낼 수 있다. 전환 서열은 통상의 클로닝 방법에 의해 단리 및 클로닝되거나 또는 이뮤노글로불린 전환 영역 서열과 관련되는 공개된 서열 정보를 기초로 디자인된 합성 올리고뉴클레오티드를 중첩시켜 드 노보(de novo)로 합성할 수 있다 [그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 문헌(Mills et al., Nucl. Acids Res. 15: 7305-7316 (1991); Sideras et al., Intl. Immunol. 1: 631-642 (1989)]. 상기 형질전환 동물 각각의 경우, 기능적으로 재배열된 이종 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진은 형질전환 동물의 B-세포내에 상당한 비율 (10 % 이상)로 존재한다.
본 발명의 형질전환 동물을 생성하는 데 사용되는 트랜스진은 하나 이상의 가변(variable) 유전자 단편, 하나의 변화(diversity) 유전자 단편, 하나의 연결(joining) 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함하는 중쇄 트랜스진을 보유한다. 이뮤노글로불린 경쇄 트랜스진은 하나 이상의 가변 유전자 단편, 하나의 연결 유전자 단편 및 하나 이상의 불변 영역 유전자 단편을 코딩하는 DNA를 포함한다. 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 유전자 단편은 비인간 형질전환 동물로 이루어지지 않은 종으로부터의 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄 유전자 단편을 코딩하는 DNA로부터 유도되거나 또는 이 DNA와 상응한다는 점에서 비인간 형질전환 동물에 대하여 이종성이다. 본 발명의 한 측면으로, 트랜스진은 각 유전자 단편이 재배열되지 않도록, 즉 기능성 이뮤노글로불린 경쇄 또는 중쇄를 코딩하도록 재배열되지 않게끔 구성된다. 재배열되지 않은 이러한 트랜스진은 V, D 및 J 유전자 단편의 재조합 (기능적 재배열)을 지지하며, 바람직하게는 HER2/neu 항원에 노출되는 경우 비인간 형질전환 동물에서 생성된 재배열된 이뮤노글로불린 중쇄내의 D 영역 유전자 단편의 전부 또는 일부의 혼입을 지지한다.
다른 실시양태에서, 트랜스진은 재배열되지 않은 "미니좌위"를 포함한다. 이러한 트랜스진은 통상적으로 C, D 및 J 단편뿐 아니라 V 유전자 단편 하위군의 실질적인 부분을 포함한다. 이와 같은 트랜스진 구조물에서, 다양한 조절 영역, 예를 들어, 프로모터, 인핸서, 클래스 전환 영역, RNA 프로세싱에 대한 스플라이스 공여체 및 스플라이스-수용체 서열 및 재조합 신호 등은 이종 DNA로부터 유도된 상응하는 서열을 포함한다. 이러한 조절 서열은 본 발명에 사용된 비인간 형질전환 동물과 동일한 종 또는 그와 관련된 종 유래의 트랜스진내에 포함될 수 있다. 예를 들어, 인간 이뮤노글로불린 유전자 단편은 형질전환 마우스에서 사용되는 설치류 이뮤노글로불린 인핸서 서열을 갖는 트랜스진에 연결될 수 있다. 또는, 합성 조절 서열은 이 합성 조절 서열과 포유류의 게놈에서 자연적으로 발생하는 것으로 알려진 기능성 DNA 서열 사이에 상동성이 없는 경우 트랜스진에 포함될 수 있다. 합성 조절 서열은 예를 들어 스플라이스-수용체 부위 또는 프로모터/인핸서 모티프의 허용되는 서열을 특정화하는 것과 같은 컨센서스 규칙에 따라 디자인된다. 예를 들어, 미니좌위는 자연 발생적인 생식세포 Ig 좌위에 비해 비필수적인 DNA 부위 (예를 들어, 개입 서열; 인트론 또는 그의 일부)의 내부(즉, 그 부위의 말단부는 아님) 결실을 하나 이상 갖는 게놈 이뮤노글로불린 좌위의 일부를 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, HER2/neu에 대한 인간 항체를 생산하는데 사용되는 형질전환 동물은 그 내용이 본원에 포함되는 WO98/24884의 실시예 12에 기재된 트랜스진(예를 들어, pHC1 또는 pHC2)을 한 카피 이상, 통상적으로 2 내지 10 카피, 때로는 25 내지 50 카피 또는 그 이상을 포함하며, WO 98/24884의 실시예 5, 6, 8 또는 14에 기재된 경쇄 트랜스진의 단일 카피를 포함하는 동물과 교배되며, 그 자손은 WO 98/24884의 실시예 10에 기재된 JH결실 동물과 교배된다. 동물을 교배하여 이 세가지 특질 각각에 대한 동형접합체를 만들어 낸다. 이들 동물은 다음의 유전자형을 갖는다: 재배열되지 않은 인간 중쇄 미니좌위의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 12에 기재됨), 재배열된 인간 K 경쇄 구조물의 단일 카피 (염색체 반수체 세트 당) (WO 98/24884의 실시예 14에 기재됨), 및 기능성 JH단편의 전부가 제거되는, 마우스의 내재 중쇄 좌위 각각에서의 결실 (WO 98/24884의 실시예 10에 기재됨). 이러한 동물을 JH단편의 결실에 대하여 동형접합인 마우스 (WO 98/24884의 실시예 10)와 교배하여 JH결실에 대하여 동형접합이고 인간 중쇄 및 경쇄 구조물에 대하여는 반접합인 자손을 생성하였다. 생성된 동물에 항원을 주입하고, 이 동물을 사용하여 이들 항원에 대한 인간 모노클로날 항체를 생산한다.
이러한 동물로부터 단리된 B 세포는 이들이 각 유전자의 단일 카피만을 포함하고 있기 때문에 인간 중쇄 및 경쇄에 대하여 단일특이적이다. 또한, 이들은 내재 마우스 중쇄 유전자의 카피가 WO 98/24884의 실시예 9 및 12에 기재된 바와 같이 도입된 JH영역에 걸친 결실에 의해 비기능적으로 되기 때문에 인간 또는 마우스 중쇄에 대하여 단일특이적일 것이다. 또한, B 세포의 실질적인 부분은 재배열된 인간 κ경쇄 유전자의 단일 카피의 발현이 B 세포의 실질적인 부분에서 내재 마우스 κ및 람다 쇄 유전자의 재배열을 대립유전자적으로, 이소타입적으로 배제할 것이기 때문에 인간 또는 마우스 경쇄에 대하여 단일특이적일 것이다.
바람직한 실시양태의 형질전환 마우스는 천연 마우스의 이뮤노글로불린과 이상적, 실질적으로 유사한, 중요한 레파토리를 포함하는 이뮤노글로불린을 생산할 것이다. 따라서, 예를 들어, 내재 Ig 유전자가 불활성화되는 경우의 실시양태에서, 총 이뮤노글로불린 수준은 혈청의 약 0.1 내지 10 mg/ml, 바람직하게는 0.5 내지 5 mg/ml, 이상적으로는 약 1.0 mg/ml 이상의 범위일 것이다. IgM으로부터 IgG로의 전환을 수행할 수 있는 트랜스진이 형질전환 마우스에 도입되는 경우, 성체 마우스의 혈청내 IgG 대 IgM의 비율은 바람직하게는 약 10:1이다. IgG 대 IgM 비율은 비성숙 마우스에서는 훨씬 더 낮을 것이다. 일반적으로, 비장 및 림프절 B 세포의 약 10 % 초과, 바람직하게는 40 내지 80 %가 인간 IgG 단백질을 독점적으로 발현시킨다.
레파토리는 이상적으로는 비-형질전환 마우스에서 나타난 것과 비슷하고, 일반적으로는 그의 약 10 % 이상일 것이며, 바람직하게는 25 내지 50 % 이상일 것이다. 일반적으로, 약 1,000 가지 이상의 다른 이뮤노글로불린 (이상적으로는 IgG), 바람직하게는 그의 104내지 106가지 이상이 마우스 게놈내에 도입된 다른 V, J 및D 영역의 수에 주로 의존하여 생산될 것이다. 이러한 이뮤노글로불린은 통상적으로 고도로 항원성인 단백질, 예를 들어 스태필로코쿠스 (staphylococcus) 단백질 A의 대략 절반 이상을 인식할 것이다. 통상적으로, 이러한 이뮤노글로불린은 미리 선택된 항원에 대하여 약 107M-1이상, 바람직하게는 약 109M-1이상, 보다 바람직하게는 약 1010M-1, 1011M-1, 1012M-1이상, 예를 들어, 1013M-1또는 그를 초과하는 친화도를 나타낼 것이다.
몇몇 실시양태에서, 미리 결정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 나타나는 V 유전자의 선택을 제한하기 위해서는 미리 결정된 레파토리를 갖는 마우스를 생산하는 것이 바람직할 수 있다. 미리 결정된 레파토리를 갖는 중쇄 트랜스진은 예를 들어 인간에서 미리 결정된 항원 유형에 대한 항체 반응에서 주로 사용되는 인간 VH 유전자를 포함할 수 있다. 또는, 몇몇 VH 유전자는 여러가지 이유 때문에 (예를 들어, 미리 결정된 항원에 대한 고 친화성 V 영역을 코딩할 가능성이 낮기 때문에; 체세포 돌연변이 및 친화성 증대를 수행할 성향이 낮기 때문에; 또는 일부 인간에 대하여 면역원성이기 때문에) 정의된 레파토리로부터 배제될 수 있다. 따라서, 다양한 중쇄 또는 경쇄 유전자 단편을 포함하는 트랜스진의 재배열에 앞서, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 서열화함으로써 형질전환 동물 이외의 다른 생물 종으로부터의 이러한 유전자 단편을 쉽게 확인할 수 있다.
본 발명의 형질전환 마우스를 상기 기재된 바와 같이 정제된 HER2/neu 항원 제제 또는 HER2/neu가 풍부한 제제및(또는) HER2/neu 발현 세포로 면역화할 수 있다. 이 마우스는 트랜스진내의 전환 재조합(시스-전환)을 통해 클래스-전환을 수행하여 HER2/neu에 반응성인 이뮤노글로불린을 발현하는 B 세포를 생산할 것이다. 이뮤노글로불린은 인간 서열 항체일 수 있으며, 여기서 그의 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 체세포 돌연변이에 의해 유도되는 서열 및 V 영역 재조합 연결부뿐만 아니라 생식세포-코딩된 서열을 포함할 수 있는 인간 트랜스진 서열에 의해 코딩되며, 이러한 인간 이뮤노글로불린 서열은, 체세포 돌연변이 및 특이한 V-J 및 V-D-J 재조합 연결의 결과로서 다른 비-생식세포 서열이 존재할지라도, 인간 VL또는 VH유전자 단편 및 인간 JL또는 JL단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 것으로 언급될 수 있다. 이러한 인간 항체 서열에 대하여, 각 쇄의 가변 영역은 인간 생식세포 V, J, 및 중쇄의 경우에는 D 유전자 단편에 의해 통상적으로 80 % 이상 코딩되고, 종종 가변 영역의 85 % 이상은 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식세포 서열에 의해 코딩되며, 흔히 가변 영역 서열의 90 또는 95 % 이상은 트랜스진 상에 존재하는 인간 생식세포 서열에 의해 코딩된다. 그러나, 비-생식세포 서열은 체세포 돌연변이 및 VJ 및 VDJ 연결에 의해 도입되기 때문에, 인간 서열 항체는 흔히, 마우스의 생식세포내의 인간 트랜스진내에 존재하는 인간 V, D 또는 J 유전자 단편에 의해 코딩되지 않는 일부 가변 영역 서열 (보다 덜 흔하게는 불변 영역 서열)을 가질 것이다. 통상적으로, 이러한 비-생식세포 서열 (또는 각각의 뉴클레오티드 위치)은 CDR내 또는 그 근처, 또는 체세포 돌연변이가 밀집되어 있는 것으로 알려진 영역내에 밀집되어 있을 것이다.
미리 결정된 항원에 결합하는 인간 항체 서열은, 인간 서열 γ쇄 (예를 들어, γ1, γ2a, γ2B 또는 γ3) 및 인간 서열 경쇄 (예를 들어, K)를 포함하는 인간 항체가 생산되도록, 이소타입 전환으로부터 형성될 수 있다. 이러한 이소타입-전환된 인간 서열 항체는 흔히, 항원에 의한 B 세포의 친화도 성숙 및 선택에 이어서 특히 2차 (또는 그 이후의) 항원 투여의 결과로, 통상적으로는 가변 영역내에, 흔히 CDR의 잔기 약 10개 또는 그 내부에 하나 이상의 체세포 돌연변이를 포함한다. 이와 같은 고 친화도 인간 항체 서열은 1 x 109M-1이상, 통상적으로 5 x 109M-1이상, 흔히 1 x 1010M-1이상, 때로는 5 x 1010M-1내지 1 x 1011M-1이상의 결합 친화도를 가질 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 HER2/neu와 고 친화도 (예를 들어, 2 x 109M-1초과)로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하는 하이브리도마를 생산하는데 사용될 수 있는 마우스 유래의 B 세포에 관한 것이다. 따라서, 본 발명의 다른 실시양태에서, 이러한 하이브리도마는 2 x 109M-1이상의 친화도 상수 (Ka)를 가지고 HER2/neu와 결합하는 이뮤노글로불린을 포함하는 조성물을 생산하는데 사용되며, 여기서 상기 이뮤노글로불린은,
(1) 인간 VL유전자 단편 및 인간 JL단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CL유전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 경쇄 불변 영역으로 이루어진 인간 경쇄 서열, 및
(1) 인간 VH유전자 단편, 임의로 D 영역, 및 인간 JH단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 중쇄 가변 영역, 및 (2) 인간 CH유전자 단편에 의해 코딩되는 폴리펩티드 서열과 실질적으로 동일한 폴리펩티드 서열을 갖는 불변 영역으로 이루어진 인간 중쇄 서열을 포함한다.
HER2/neu에 대한 고 친화성 인간 모노클로날 항체의 발생은 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 마우스에서 인간 가변 영역 유전자 단편의 레파토리를 확장하는 방법에 의해 촉진되며, 이 방법은 통합된 인간 이뮤노글로불린 트랜스진에는 존재하지 않는 V 영역 유전자 단편을 포함하는 V 유전자 트랜스진을 게놈내에 도입하는 것을 포함한다. 흔히, V 영역 트랜스진은, 인간 게놈에서 자연적으로 발생하거나 또는 재조합 방법에 의해 서로 단독으로 스플라이싱될 수 있는 것으로서, 인간 VH또는 VL(VK) 유전자 단편 분석의 일부를 포함하는 효모 인공 염색체이며, 순서를 벗어나거나 또는 생략된 V 유전자 단편을 포함할 수 있다. 흔히, 다섯 이상의 기능성 V 유전자 단편은 YAC에 포함되어 있다. 이 방법의 변형법에서, V 레파토리 확장 방법에 의해 생산되는 형질전환 마우스를 만들 수 있으며, 이 마우스는 V 영역 트랜스진상에 존재하는 V 영역 유전자 단편 및 인간 Ig 트랜스진에서 코딩되는 C 영역에 의해 코딩되는 가변 영역 서열을 포함하는 이뮤노글로불린 쇄를 발현시킨다. V 레파토리 확장 방법에 의해, 다섯 이상의 다른 V 유전자를 갖는 형질전환 마우스를 만들 수 있으며, 약 24개 이상의 V 유전자를 포함하는 마우스도 만들 수 있다. 몇몇 V 유전자 단편은 비-기능적일 수 있으며 (예를 들어, 슈도진 (pseudogene) 등), 이러한 단편은 보유되거나 또는 원한다면 당업자에게 공지된 재조합 방법에 의해 선택적으로 결실시킬 수 있다.
마우스 생식세포가, 실질적으로 J 및 C 유전자 단편을 포함하는 인간 Ig 트랜스진에는 존재하지 않는 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 포함하도록 조작한다면, 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC가 다른 인간 Ig 트랜스진을 갖는 마우스 생식세포내로 도입되는 경우의 배경을 비롯하여 특질이 다른 유전적 배경으로 전달되고 도입될 수 있다. 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 수개의 기능적 YAC는 인간 Ig 트랜스진 (또는 수개의 인간 Ig 트랜스진)으로 수행하는 생식세포내에 도입될 수 있다. 본원에서 YAC 트랜스진으로 언급되기는 하지만, 게놈으로 통합되는 경우, 이러한 트랜스진에는 효모에서의 자발적 복제에 필요한 서열 등의 효모 서열이 실질적으로는 결실되어 있을 수 있으며, 이러한 서열은 효모에서의 복제가 더 이상 필요하지 않게 된 다음(즉, 마우스 ES 세포 또는 마우스 전접합체로의 도입에 앞서) 유전자 조작 (예를 들어, 제한 절단 및 펄스-필드(pulsed-field) 겔 전기영동 또는 다른 적합한 방법)에 의해 임의로 제거될 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 서열 발현의 특질을 증대시키는 방법은 인간 Ig 트랜스진, 및 임의로는 확장된 V 단편 레파토리를 갖는 기능적 YAC를 보유하는 형질전환 마우스를 기르는 것을 포함한다. VH및 VL유전자 단편은 둘 다 YAC상에 존재할 수 있다. 이 형질전환 마우스를, 인간 Ig 트랜스진 및(또는) 인간의 다른 림프구 단백질을 코딩하는 트랜스진을 비롯한 인간의 다른 트랜스진을 보유하는 배경을 비롯하여 당업자에 의해 요구되는 어떤 배경에 도입시킬 수 있다. 본 발명은 또한 확장된 V 영역 레파토리 YAC 트랜스진을 갖는 형질전환 마우스에 의해 생산되는 고 친화도 인간 이뮤노글로불린 서열을 제공한다. 상기에는 본 발명의 형질전환 동물의 바람직한 실시양태에 대하여 기술되어 있지만, 하기의 네가지 카테고리로 분류된 다른 실시양태도 본 발명에서 고려된다.
I. 재배열되지 않은 중쇄 및 재배열된 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물,
II. 재배열되지 않은 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물,
III. 재배열된 중쇄 및 재배열되지 않은 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물, 및
IV. 재배열된 중쇄 및 경쇄 이뮤노글로불린 트랜스진을 포함하는 형질전환 동물.
이러한 형질전환 동물 카테고리 중에서, 바람직한 순서는 II > I > III > IV (여기서, 내재 경쇄 유전자 (또는 적어도 K 유전자)는 상동성 재조합 (또는 다른 방법)에 의해 녹아웃됨) 및 I > II > III > IV (여기서, 내재 경쇄 유전자는 녹아웃되지 않으며, 대립유전자 배제에 의해 우성화되어야 함)이다.
III. HER2/neu에 결합하는 이중특이적/다중특이적 분자
본 발명의 또 다른 실시양태에서, HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체 (또는 그의 항원-결합 부위)를 유도체화시키거나, 또는 다른 기능성 분자, 예를 들어 다른 펩티드, 항체 단편 (단일쇄 항체 및 Fab' 항체 단편을 포함함) 또는 단백질 리간드에 연결하여 수개의 결합 부위 또는 표적 에피토프와 결합하는 이중특이적 또는 다중특이적 분자를 생성시킬 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 본 발명은 Fc 수용체, 대표적으로 FcδRI 또는 FcαR에 결합하는 제2 항체 (또는 그의 항원-결합 부위, 또는 그의 단일쇄 항체)에 (화학적 커플링, 유전적 융합, 비공유성 결합 또는 다른 방식에 의해) 기능적으로 연결된 인간 모노클로날 항-HER2/neu 항체 (또는 그의 항원-결합 부위, 또는 그의 단일쇄 항체)를 포함하는 제1 부위를 포함하는 이중특이적 분자를 제공한다 (도 12). 또한, 본 발명은 EGF-R과 같은 HER2/neu 이외의 종양 세포 항원에 결합하는 제3 부위를 추가로 포함하는 다중특이적 분자를 제공한다. 따라서, 본 발명의 특정한 다중특이적 분자는 EGF에 연결된 항-FcR 항체 (그의 항원-결합 부위 또는 그의 단일쇄 항체)에 연결된 인간 항-HER2/neu 항체 (그의 항원-결합 부위 또는 그의 단일쇄 항체)를 포함한다 (도 12).
따라서, 본 발명은 HER2/neu에 대하여 적어도 하나의 제1 결합 특이적 부위 및 제2 표적 에피토프에 대하여 제2 결합 특이적 부위를 갖는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 제2 표적 에피토프는 Fc 수용체, 예를 들어 인간 FcγRI 또는 인간 Fcα수용체이다. 따라서, 본 발명은 FcγR, FcαR 또는 FcεR 발현 이펙터 세포 (예를 들어, 단핵구, 대식세포 또는 다형핵 세포 (PMN)) 및 HER2/neu를 발현시키는 표적 세포에 둘 다 결합할 수 있는 이중특이적 및 다중특이적 분자를 포함한다. 이러한 이중특이적 및 다중특이적 분자는 HER2/neu 발현 세포를 이펙터 세포에 표적화하며, HER2/neu 발현 세포의 식세포작용, 항체 의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC), 사이토카인 방출 또는 수퍼옥사이드 음이온 생성 등의 Fc 수용체-매개 이펙터 세포의 활성을 유발한다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 항-Fc 결합 특이적 부위 및 항-HER2/neu 결합 특이적 부위 이외에도 "항-상승 인자 (EF)"로도 불리는 다른 표적 HER2/neu에 대한 제3 결합 특이적 부위를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 제3 결합 특이적 부위는 세포독성 활성에 관여하는 표면 단백질과 결합함으로써 표적 세포에 대한 면역 반응을 증가시킬 수 있다. 제3 결합 특이적 부위는 소정의 분자, 예를 들어, 항원 또는 수용체와 결합함으로써 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원에 대한 결합 결정자의 효과를 상승시키는 항체 (ScFv를 포함함), 기능적 항체 단편, 또는 리간드일 수 있다. 제3 결합 특이적 부위 또는 "항-상승 인자 부위"는 Fc 수용체 또는 표적 세포 항원과 결합할 수 있다. 또는, 항-상승 인자 부위는 제1 및 제2 결합 특이적 부위가 결합하는 실체와는 다른 실체에 결합할 수 있다. 예를 들어, 항-상승 인자 부위는 세포독성 T-세포와 (예를 들어, 표적 세포에 대한 면역 반응의 증가를 일으키는 CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 또는 다른 면역 세포를 통해) 결합할 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 결합 특이적 부위로서, 예를 들어 Fab, Fab', F (ab')2, Fv 또는 단쇄 Fv를 비롯하여, 1종 이상의 항체 또는 그의 항체 단편을 포함한다. 항체는 본원에 그 내용이 참고로 포함되는, 1990년 8월 7일 허여된 래드너(Ladner) 등의 미국 특허 제4,946,778호에 기재된 것과 같은 경쇄 또는 중쇄 이량체, 또는 Fv 또는 단쇄 구조물과 같은 그의 어떤 최소 단편일 수도 있다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 (a) HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체 (예를 들어, 본원에 기재된 항체 3.F2), 또는 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv를 비롯한 그의 항원-결합 부위, 및 (b) 이펙터 세포의 표면 상에 존재하는 FcγR 또는 FcαR에 대한 인간 모노클로날 항체 (예컨대, 본원에 기재된 항체 14.1), 또는 예를 들어, Fab, Fab', F(ab')2, Fv 또는 단일쇄 Fv를 비롯한 그의 항원-결합 부위를 포함한다. 바람직하게는, 인간 항-Fc 항체는 이펙터 세포에 결합한 경우 인간 IgG 또는 IgA에 의해 방해받지 않는다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "IgG 수용체"는 1번 염색체상에 위치하는 8개의 γ-쇄 유전자들 중 어떤 것을 의미한다. 이 유전자들은 3가지 Fcγ수용체 클래스, 즉 FcγRI (CD64), FcγRII (CD32) 및 FcγRIII (CD16)로 분류되는 총 12가지의 막횡단 또는 가용성 수용체 이소폼을 코딩한다. 바람직한 한 실시양태에서, Fcγ수용체는 인간의 고 친화성 FcγRI이다. 인간 FcγRI은 단량체성 IgG에 대한 고 친화도 (108- 109M-1)를 나타내는 72 kDa 크기의 분자이다.
이와 같은 바람직한 모노클로날 항체의 생산 및 특성화는 그 내용이 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 팡거 (Fanger) 등의 PCT 출원 WO88/00052호 및 미국 특허 제4,954,617호에 기재되어 있다. 이들 항체는 수용체의 Fcγ결합 부위와는 다른 부위에서 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII의 에피토프에 결합하며, 따라서 이들의 결합은 생리학적 수준의 IgG에 의해서는 실질적으로 차단되지 않는다. 본 발명에 유용한 특이적 항-FcγRI 항체는 mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 및 mAb 197이다. mAb 32를 생산하는 하이브리도마 (ATCC 기탁번호 HB9469)는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에서 분양받을 수 있다. 항-FcγRI mAb 22, mAb 22의 F(ab')2단편은 메다렉스, 인크 (Medarex, Inc.; Annandale, N.J.)로부터 입수할 수 있다. 다른 실시양태에서, 항-Fcγ수용체 항체는 모노클로날 항체 22 (H22)의 인간화 형태이다. H22 항체의 생산 및 특성화는 문헌 [Graziano et al. (1995) J. Immunol 155 (10): 4996-5002 및 PCT/US93/10384]에 기재되어 있다. H22 항체 생산 세포주는 1992년 11월 4일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 HA022CL1 명칭으로 기탁되어 기탁번호 CRL 11177을 배정받았다.
또 다른 바람직한 실시양태에서, Fc 수용체에 대한 결합 특이적 부위는 인간 IgA 수용체, 예를 들어 Fc-알파 수용체 (FcαRI (CD89))에 결합하는 항체에 의해 제공된다. 바람직하게는, 상기 항체는 내재 IgA에 의해 차단되지 않는 부위에서 인간 IgA 수용체에 결합한다. 용어 "IgA 수용체"는 19번 염색체 상에 위치하는 하나의 α-유전자 (FcαRI)의 유전자 산물을 포함하는 의미이다. 이 유전자는 55내지 110 kDa 크기의 선택적으로 스플라이싱된 여러 막횡단 이소폼을 코딩하는 것으로 알려져 있다. FcαRI (CD89)은 단핵구/대식세포, 호산구 및 호중구 과립세포에서는 구성적으로 발현되지만, 비-이펙터 세포 집단에서는 발현되지 않는다. FcαRI은 IgA1 및 IgA2 둘 다에 대하여 배지 친화도 (약 5 x 107M-1)를 갖는데, 이는 G-CSF 또는 GM-CSF 등의 사이토카인에 노출되는 경우에 증가한다 (Morton, H. C. et al. (1996) Critical Reviews in Immunology 16: 423-440). IgA 리간드 결합 도메인의 외부의 FcαRI과 결합하는, A3, A59, A62 및 A77로 확인된 네가지 FcαRI-특이적 모노클로날 항체는 문헌 (Monteiro, R. C. et al., 1992, J. Immunol. 148: 1764)에 기재되어 있다. 14.1로 불리는 FcαRI에 대한 완전 인간 모노클로날 항체도 본원에 기재되어 있다.
본원에 사용된 "이펙터 세포 특이적 항체"는 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합하는 항체 또는 기능성 항체 단편을 의미한다. 본 발명에 사용되는 바람직한 항체는 내재 이뮤노글로불린에 의해 결합되지 않는 부위에서 이펙터 세포의 Fc 수용체와 결합한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이펙터 세포"는, 면역 반응의 인식 및 활성화 단계와 대립되는, 면역 반응의 작용 단계에 관여하는 면역 세포를 의미한다. 전형적인 면역 세포에는 골수 또는 림프 기원의 세포, 예를 들어, 림프구 (예를 들어, 세포용해성 T 세포 (CTL)를 비롯한 B 세포 및 T 세포), 살(killer)세포, 자연살세포, 대식세포, 단핵구, 호산구, 호중구, 다형핵 세포, 과립세포, 비만 세포 및호염구가 포함된다. 몇몇 이펙터 세포는 특이적 Fc 수용체를 발현시키며, 특이적 면역 기능을 수행한다. 바람직한 실시양태에서, 이펙터 세포는 항체-의존 세포-매개성 세포독성 (ADCC)을 유도할 수 있고, 예를 들어 호중구는 ADCC를 유도할 수 있다. 예를 들어, FcR을 발현시키는 단핵구, 대식세포는 표적 세포를 특이적으로 사멸시키는 것, 항원을 면역계의 다른 성분에 제시하는 것 또는 항원을 제시하는 세포에 결합하는 것에 관여한다. 다른 실시양태에서, 이펙터 세포는 표적 항원, 표적 세포 또는 미생물을 식세포작용할 수 있다. 이펙터 세포 상의 특정 FcR의 발현은 사이토카인 등의 체액성 인자에 의해 조절될 수 있다. 예를 들어, FcγRI의 발현은 인터페론 감마 (IFN-γ)에 의해 상향조절되는 것으로 알려져 있다. 이러한 발현 증가는 표적에 대한 FcγRI-보유 세포의 세포독성 활성을 증가시킨다. 이펙터 세포는 표적 항원 또는 표적 세포를 식세포작용하거나 용해시킬 수 있다.
"표적 세포"는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 모노클로날 항체, 이중특이적 또는 다중특이적 분자)에 의해 표적화될 수 있는 대상 (예를 들어, 인간 또는 동물)에서의 바람직하지 않은 어떤 세포를 의미한다. 바람직한 실시양태에서, 표적 세포는 HER2/neu를 발현 또는 과다발현시키는 세포이다. HER2/neu를 발현시키는 세포로는 통상적으로 선암종 세포, 예컨대, 타액선, 위 및 신장; 유선암종 세포; 폐암종 세포; 편평 세포암종 세포; 및 난소암 세포 등의 종양 세포가 포함된다.
인간 모노클로날 항체가 바람직하지만, 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자에 사용될 수 있는 다른 항체는 쥐, 키메라 및 인간화 모노클로날 항체이다.
키메라 마우스-인간 모노클로날 항체 (즉, 키메라 항체)는 당업계에 공지된 재조합 DNA기술에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 쥐 (또는 다른 종) 모노클로날 항체 분자의 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자를 제한 효소로 절단하여 쥐 Fc를 코딩하는 영역을 제거하고, 인간 Fc 불변 영역을 코딩하는 유전자의 동등한 부위를 치환한다 [문헌 [Robinson et al., International Patent Publication PCT/US86/02269; Akira, et al., European Patent Application 184,187; Taniguchi, M., European Patent Application 171,496; Morrison et al., European Patent Application 173,494; Neuberger et al., International Application WO 86/01533; Cabilly et al. U. S. Patent No. 4,816,567; Cabilly et al., European Patent Application 125,023; Better et al. (1988 Science 240: 1041-1043); Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al., 1987, J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; and Shaw et al., 1988, J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559]을 참조].
키메라 항체는 항원 결합에 직접 관여하지 않는 Fv 가변 영역의 서열을 인간 Fv 가변 영역의 동등한 서열로 대체함으로써 추가로 인간화할 수 있다. 인간화 키메라 항체에 대한 포괄적인 검토에 대하여는 문헌[Morrison, S. L., 1985, Science 229: 1202-1207 and by Oi et al., 1986, BioTechniques 4: 214]에 제시되어 있다. 이들 방법은 중쇄 또는 경쇄 중 적어도 하나로부터의 이뮤노글로불린 Fv 가변 영역의 전부 또는 일부를 코딩하는 핵산 서열을 단리, 조작 및 발현시키는 것이 포함된다. 이러한 핵산의 공급원은 당업자에게 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 항-GPIIbIIIa항체 생산 하이브리도마인 7E3으로부터 얻을 수 있다. 이어서, 키메라 항체를 코딩하는 재조합 DNA 또는 그의 단편을 적합한 발현 벡터내에 클로닝할 수 있다. 적합한 인간화 항체는 문헌[U. S. Patent 5,225,539; Jones et al. 1986 Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. 1988 Science 239: 1534; and Beidler et al. 1988 J. Immunol. 141: 40534060]에 기재된 CDR 치환법에 의해 선택적으로 생산할 수 있다.
특정 인간 항체의 모든 CDR은 적어도 비-인간 CDR의 일부로 대체되거나 또는 CDR의 일부만이 비-인간 CDR로 대체될 수 있다. 단지 인간화 항체의 Fc 수용체로의 결합에 필요한 CDR의 수를 대체하는 것이 필요한 뿐이다.
인간 항체의 CDR의 적어도 일부를 비-인간 항체로부터 유도된 CDR로 대체할 수 있는 임의 방법에 의해 항체를 인간화할 수 있다. 윈터(Winter)는 본 발명의 인간화 항체를 제조하기 위해 사용될 수 있는 방법을 그의 내용이 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 문헌[1987년 3월 26일 출원된 영국 특허 출원 GB 2188638A]에 기재하고 있다. 제목이 "인간 단핵 식세포 상의 이뮤노글로불린G의 Fc 수용체에 대한 인간화 항체 (Humanized Antibodies to Fc Receptors for Immunoglobulin G on Human Mononuclear Phagocytes)"인 국제 특허 출원 공개 WO 94/10332에 기재된 올리고뉴클레오티드 부위-지시적 돌연변이유발을 이용하여 인간CDR을 비-인간 CDR로 대체할 수 있다.
또한, 특정 아미노산이 치환, 결실 또는 부가된 키메라 및 인간화 항체도 본 발명의 범위내이다. 특히, 바람직한 인간화 항체는 항원에 대한 결합을 증가시키기 위해 프레임워크 영역내에 아미노산 치환부를 갖는다. 예를 들어, 마우스 CDR을 갖는 인간화 항체에서, 인간 프레임워크 영역내에 위치하는 아미노산은 마우스 항체의 상응하는 부위에 위치하는 아미노산으로 대체할 수 있다. 이러한 치환은 몇몇 경우에서 인간화 항체와 항원의 결합을 증가시키는 것으로 알려져 있다. 본원에서는 아미노산이 부가, 결실 또는 치환된 항체를 수식된 항체 또는 변형된 항체로 부른다.
또한, 변형된 항체라는 용어는 예를 들어 항체 일부를 결실, 부가 또는 치환하여 변형시킨 모노클로날 항체, 키메라 항체 및 인간화 항체 등의 항체를 포함하는 의미이다. 예를 들어, 항체의 불변 영역을 결실시키고 이를 항체의 반감기, 예를 들어 혈청 반감기, 안정성 또는 친화도를 증가시키는 불변 영역으로 대체함으로써 항체를 변형시킬 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자가 FcγR에 대해 특이적인 하나 이상의 항원 결합 영역을 가지고 한가지 이상의 이펙터 기능을 개시하는 한 임의 변형은 본 발명의 범위내이다.
본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화학적 기술 [예를 들어, 문헌[D. M. Kranz et al. (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78: 5807]을 참조], "폴리도마 (polydoma)" 기술 [미국 특허 제4,474,893호 참조] 또는 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다.
특히, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자는 당업계에 공지되어 있으며 본원에 제공된 실시예 부분에 기술된 방법을 이용하여 성분 결합 특이적 부위, 예를 들어 항-FcR 결합 특이적 부위와 항-HER2/neu 결합 특이적 부위를 연결하여 제조할 수 있다. 예를 들어, 이중특이적 및 다중특이적 분자의 각 결합 특이적 부위를 별도로 형성한 다음, 서로 연결할 수 있다. 결합 특이적 부위가 단백질 또는 펩티드인 경우, 다양한 커플링 또는 가교결합제를 사용하여 공유결합시킬 수 있다. 가교결합제의 예로는 단백질 A, 카르보디이미드, N-숙신이미딜-S-아세틸-티오아세테이트 (SATA), N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피오네이트 (SPDP), 및 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)가 포함된다 [예를 들어, 문헌[Karpovsky et al. (1984) J. Exp. Med. 160: 1686; Liu, MA et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8648]을 참조]. 다른 방법으로는 문헌[Paulus (Behring Ins. Mitt. (1985) No. 78,118-132); Brennan et al. (Science (1985) 229: 81-83), and Glennie et al. (J. Immunol. (1987) 139: 2367-2375)]에 기재된 것들이 포함된다. 바람직한 연결제는 SATA 및 술포 SMCC이며, 이들 둘 다는 피어스 케미칼 코포레이티드 (Pierce Chemical Co. (Rockford, IL))사로부터 입수할 수 있다.
결합 특이적 부위가 항체 (예를 들어, 두 인간화 항체)인 경우, 두 중쇄의 C-말단 힌지 영역의 술프히드릴 결합을 통해 이들을 연결시킬 수 있다. 특히 바람직한 실시양태에서, 힌지 영역은 연결에 앞서 홀수의 술프히드릴 잔기를, 바람직하게는 하나 포함하도록 변형된다.
또는, 이들 두 결합 특이적 부위는 동일한 벡터내에 코딩되어 동일한 숙주 세포에서 발현 및 조립될 수 있다. 이 방법은 이중특이적 및 다중특이적 분자가 mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F (ab')2 또는 리간드 x Fab 융합 단백질인 경우에 특이 유용하다. 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자, 예를 들어 이중특이적 분자는 단쇄 분자, 예를 들어 단쇄 이중특이적 항체, 하나의 단쇄 항체 및 결합 결정자를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자, 또는 두개의 결합 결정자를 포함하는 단쇄 이중특이적 분자일 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자는 또한 단쇄 분자이거나 또는 둘 이상의 단쇄 분자를 포함할 수 있다. 이중특이적 및 다중특이적 분자를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제5,260,203호; 동 제5,455,030호; 동 제4,881,175호; 동 제5,132,405호; 동 제5,091,513호; 동 제5,476,786호; 동 제5,013,653호; 동 제5,258,498호; 및 동 제5,482,858호에 기재되어 있다.
이중특이적 및 다중특이적 분자가 이들의 특이적 표적으로 결합하는 것은 효소 연결 면역흡착 분석법 (ELISA), 방사면역분석법 (RIA) 또는 웨스턴 블롯 (Western Blot) 분석법에 의해 확인할 수 있다. 이들 각 분석법은 일반적으로 대상 결합체에 대해 특이적인 표지된 시약 (예를 들어, 항체)을 사용함으로써 특정 대상의 단백질-항체 결합체의 존재를 검출한다. 예컨대, FcR-항체 결합체는 예를 들어 항체-FcR 결합체를 인식하여 그와 특이적으로 결합하는 효소-연결 항체 또는 항체 단편을 사용하여 검출할 수 있다. 또는, 이 결합체는 다양한 기타 면역분석법 중 어떤 것을 이용하여 검출할 수 있다. 예를 들어, 방사성면역분석법 (RIA)에서 항체를 방사성 표지하여 사용할 수 있다 [예를 들어, 그 내용이 본 명세서에 포함되는 것으로 하는 문헌[Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, March, 1986]을 참조]. 방사성 동위원소는 γ계수법 또는 섬광계수법에 의하거나 또는 오토라디오그래피법에 의해 검출할 수 있다.
IV. 항체 결합체/면역독소
다른 측면으로, 본 발명은 치료를 위한 잔기, 예를 들어 세포독소, 약물 또는 방사성 동위원소에 결합된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 또는 그의 단편을 특징으로 한다. 세포독소에 결합되는 경우, 이들 항체 결합체는 "면역독소"라 부른다. 세포독소 또는 세포독성제로는 세포에 해로운 (예를 들어, 세포를 사멸시키는) 임의 물질이 포함된다. 그 예로는 탁솔, 사이토칼라신B, 그라미시딘 D, 에티디움 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포시드, 테노포시드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜치신, 독소루비신, 다우노루비신, 디히드록시 안트라신 디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 악티노마이신D, 1-데히드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 푸로마이신, 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제로는 항-대사물질 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈, 5-플루오로우라실 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 티오에파 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 시클로토스파미드, 부술판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티늄(II)(DDP) 시스플라틴), 안트라시클린 (예를 들어, 다우노루비신 (종전에는 다우노마이신이라 함) 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신 (종전에는 악티노마이신이라 함), 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-분열유발제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되지만 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 항체를 방사성 동위원소, 예를 들어 방사성 요오드에 연결하여 HER2/neu-관련 질환, 예를 들어 암의 치료를 위한 세포독성 방사성 약제를 제조할 수 있다.
본 발명의 항체 결합체를 사용하여 소정의 생물학적 반응을 변화시킬 수 있으며, 이 약물 잔기가 전형적인 화학 치료제로 한정되는 것으로 생각하여서는 안된다. 예를 들어, 약물 잔기는 목적하는 생물학적 활성을 보유하는 단백질 또는 폴리펩티드일 수 있다. 이러한 단백질로는 예를 들어 효소 활성 독소 또는 그의 활성 단편, 예를 들어 아브린, 리신 A, 슈도모나스 외독소 또는 디프테리아 독소; 단백질, 예를 들어 종양 괴사 인자 또는 인터페론-γ; 또는 생물학적 반응 변경자, 예를 들어, 림포카인, 인터루킨-1 ("IL-1"), 인터루킨-2 ("IL-2"), 인터루킨-6 ("IL-6"), 과립세포 대식세포 콜로니 자극 인자 ("GM-CSF"), 과립구 콜로니 자극 인자 ("G-CSF"), 또는 기타 성장 인자가 포함될 수 있다.
이러한 치료 잔기를 항체에 결합시키는 기술은 잘 알려져 있다 [예를 들어, 문헌[Arnon et al.,"Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al.,"Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe,"Antibody Carriers OfCytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", in Monoclonal Antibodies'84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985);"Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985), and Thorpe et al.,"The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)]을 참조한다].
V. 제약 조성물
다른 측면으로, 본 발명은 조성물, 예를 들어 본 발명의 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원-결합 부위 중 하나 또는 이들의 조합을 포함하는, 제약상 허용되는 담체와 함께 제제화된 제약 조성물을 제공한다. 바람직한 실시양태에서, 이 조성물은 본 발명의 수개 (예를 들어, 2 이상)의 단리된 인간 항체 또는 그의 항원-결합 부위의 조합을 포함한다. 바람직하게는, 조성물 중의 항체 또는 그의 항원-결합 부위 각각은 HER2/neu의 미리 선택된 다른 에피토프에 결합한다.
한 실시양태에서, 보완적 활성을 갖는 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체들을, 예를 들어 2종 이상의 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체를 포함하는 제약 조성물로서 사용한다. 예를 들어, 이펙터 세포의 존재하에 표적 세포의 사멸을 매우 효과적으로 매개하는 인간 모노클로날 항체를, HER2/neu를 발현시키는 세포의 증식을 억제하는 다른 인간 모노클로날 항체와 병용할 수 있다.
다른 실시양태에서, 조성물은 본 발명의 이중특이적 또는 다중특이적 분자중 하나 또는 이들의 조합을 포함한다 (예를 들어, Fc 수용체에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위 및 HER2/neu에 대한 하나 이상의 결합 특이적 부위를 포함한다).
본 발명의 제약 조성물은 또한 배합 치료법으로, 즉 다른 물질과 배합하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 배합 치료법은 본 발명의 조성물을 1종 이상의 항-종양제 또는 다른 통상의 요법과 함께 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, "제약상 허용되는 담체"는 생리학적으로 상용성인 임의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장성 물질 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 바람직하게는, 담체는 정맥내, 근육내, 피하, 비경구, 척수 또는 표피 투여 (예를 들어, 주사 또는 주입에 의해)에 적합하다. 투여 경로에 따라, 활성 화합물, 즉 항체, 이중특이적 및 다중특이적 분자는 화합물을 실활화할 수 있는 산의 작용 및 다른 자연 조건으로부터 화합물을 보호하는 물질로 코팅될 수 있다.
"제약상 허용되는 염"은 모 화합물의 목적하는 생물학적 활성을 보유하고, 바람직하지 못한 어떤 독성학적 효과도 부여하지 않는 염을 의미한다 [예를 들어, 문헌[Berge, S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66: 1-19]을 참조]. 이러한 염의 예로는 산 부가 염 및 염기 부가 염이 포함된다. 산 부가 염으로는 비독성 무기 산, 예를 들어 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산 및 아인산 등으로부터 유래하는 것들뿐 아니라 비독성 유기산, 예를 들어 지방족 모노- 및 디-카르복실산, 페닐치환된 알카노산, 히드록시 알카노산, 방향족산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부터 유래하는 것들이 포함된다. 염기 부가 염으로는 알칼리토금속, 예를 들어 나트륨, 칼륨, 마그네슘 및 칼슘 등으로부터 유래하는 것들뿐 아니라 비독성 유기 아민, 예를 들어 N,N'-디벤질에틸렌디아민, N-메틸글루카민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민 및 프로카인 등으로부터 유래하는 것들이 포함된다.
본 발명의 조성물은 당업계에 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있다. 당업자라면 알 수 있는 바와 같이, 투여 경로 및(또는) 투여 방식은 원하는 결과에 따라 달라질 것이다. 활성 화합물은 급속한 방출에 대해 화합물을 보호하는 담체, 예를 들어 이식물, 경피 패치 및 미세캅셀화 전달계를 비롯한 조절 방출형 제제와 함께 제조될 수 있다. 생분해성의 생체적합성 고분자, 예를 들어 에틸렌 비닐 아세테이트, 다무수물, 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르 및 폴리락트산을 사용할 수 있다. 이러한 조성물의 제조를 위한 많은 방법은 특허가 허여되었거나 또는 일반적으로 당업자에게 공지된 것이다 [예를 들어, 문헌[Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978]을 참조].
본 발명의 화합물을 어떤 투여 경로로 투여하기 위해서는, 화합물의 실활화를 방지하는 물질로 화합물을 코딩하거나 또는 그 물질과 함께 화합물을 공동 투여하는 것이 필요할 수 있다. 예를 들어, 화합물을 적합한 담체, 예를 들어 리포좀 또는 희석제에 넣어 대상체에게 투여할 수 있다. 제약상 허용되는 희석제로는 염수 및 수성 완충액이 포함된다. 리포좀으로는 수중유중수 CGF 에멀젼뿐 아니라 통상의 리포좀도 포함된다 (Strejan et al. (1984) J. Neuroimmunol. 7: 27).
제약상 허용되는 담체로는 멸균 수용액 또는 분산액, 및 주사용 멸균 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말제가 포함된다. 제약상 활성 물질을 위한 이러한 매질 및 물질의 용도는 당업계에 공지된 것이다. 임의 통상의 매질 또는 물질이 활성 화합물과 비상용성이라는 점 외에는, 본 발명의 제약 조성물 중 그의 사용도 고려된다. 또한, 보충 활성 화합물을 조성물 중에 포함시킬 수도 있다.
치료 조성물은 제조 및 보관 조건하에서 통상적으로 무균적이며 안정해야 한다. 조성물은 높은 약물 농도에 적합한 용액, 마이크로에멀젼, 리포좀 또는 다른 규칙적 형태의 구조물로서 제제화될 수 있다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적합한 이들의 혼합물을 포함하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다. 예를 들어, 레시틴 등의 코딩을 사용하여, 분산액의 경우 소정의 입자 크기를 유지하여, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨, 소르비톨 또는 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 것이다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 조성물 중에 포함시킴으로써 주사용 조성물을 오랜 시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.
주사용 멸균 용액은 소정량의 활성 화합물을 상기 언급된 성분 중 하나 또는 이들의 조합과 함께 적절한 용매 중에 포함시키고, 필요에 따라, 멸균 미세여과함으로써 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 상기 언급된 것들로부터 필요한 기타 성분을 포함하는 무균 비히클 중에 활성 화합물을 포함시켜 제조한다. 주사용 멸균 용액의 제조를 위한 무균 분말제의 경우, 바람직한 제조 방법으로는 활성 성분 이외에 상기 그의 멸균 여과된 용액으로부터 목적하는 임의 다른 성분의 분말을 생성하는 진공 건조법 및 동결건조법 (동결건조)이 있다.
투여 방법을 조정하여 목적하는 최적의 반응 (예를 들어, 치료 반응)을 제공한다. 예를 들어, 단일한 환제를 투여하거나, 시간에 따라 투여량을 여러 번에 나누어 투여하거나, 또는 긴박한 치료 상황에 의해 지시되는 바와 같이 투여량을 비례적으로 줄이거나 늘려서 투여할 수 있다. 용이한 투여 및 균일 투여량을 위해서는 비경구용 조성물을 단위 투여 형태로 제제화하는 것이 특히 이롭다. 본원에 사용된 단위 투여 형태는 치료될 대상을 위한 단위 투여량으로서 적합한, 물리적으로 구별되는 단위를 의미하며, 각 단위는 목적하는 치료 효과를 나타내기 위해 계산된 소정량의 활성 화합물을 필요한 제약 담체와 함께 포함한다. 본 발명의 단위 투여 형태는 (a) 활성 화합물의 독특한 특성 및 달성되는 특이적 치료 효과, 및 (b) 개체에서 민감도의 치료를 위해 이러한 활성 화합물을 혼합하는 기술에서의 고유한 제한에 의하거나 이에 직접 의존하는 것으로 설명되어 있다.
제약상-허용되는 항산화제의 예로는 (1) 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 중황산나트륨, 소듐 메타비술피트 및 아황산나트륨 등; (2) 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸레이트화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸레이트화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트 및 알파-토코페롤 등; 및 (3) 금속 킬레이트화제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산 및 인산 등이 포함된다.
치료용 조성물의 경우, 본 발명의 제제는 경구, 비강, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내 및(또는) 비경구 투여에 적합한 것들을 포함한다. 제제는 편리하게는 단위 투여 형태로 제공될 수 있으며, 제약 분야에 공지된 임의 방법에 의해서 제조할 수 있다. 담체 물질과 배합되어 단위 투여 형태를 형성시킬 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 대상 및 특정 투여 방식에 따라 달라질 것이다. 담체 물질과 배합되어 단위 투여 형태를 형성시킬 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 나타내는 조성물의 양일 것이다. 일반적으로, 100 %를 기준으로, 이 양은 활성 성분의 약 0.01 % 내지 약 99 %, 바람직하게는 약 0.1 % 내지 약 70 %, 가장 바람직하게는 약 1 % 내지 약 30 % 범위일 것이다.
또한, 질내 투여에 적합한 본 발명의 제제로는 당업계에서 적합한 것으로 알려져 있는 담체를 함유하는 펫사리, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포말체 또는 스프레이 제제가 포함된다. 본 발명의 조성물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태로는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제가 포함된다. 활성 화합물은, 무균 조건하에, 제약상 허용되는 담체 및 필요할 수 있는 임의 보존제, 완충제 또는 추진제와 함께 혼합될 수 있다.
본원에 사용된 "비경구 투여" 및 "비경구적으로 투여하다"라는 어구는 장내 투여 및 국소 투여 이외의 투여 방식, 일반적으로 주사에 의한 투여 방식을 의미하며, 정맥내, 근육내, 동맥내, 초내(intrathecal), 피막내(intracapsular), 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관(transtracheal), 피하, 표피하, 관절내, 피막하(subcapsular), 지주막하, 척수내, 경막외 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 제약 조성물 중에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예로는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성유, 예를 들어 올리브유, 및 주사용 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트가 포함된다. 예를 들어, 코팅 물질 (예, 레시틴)을 사용하여, 분산액의 경우 소정의 입자 크기를 유지하여, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다.
이 조성물은 보조제, 예를 들어 보존제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 포함할 수도 있다. 미생물 존재의 방지는 멸균 방법[상기 문헌] 및 다양한 항-박테리아제 및 항-진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올 및 페놀 소르브산 등의 사용에 의해 보장할 수 있다. 등장성 물질, 예를 들어 당 및 염화나트륨 등을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직할 수도 있다. 또한, 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 사용하여 주사용 약제를 장시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.
본 발명의 화합물을 약제로서 인간 및 동물에게 투여하는 경우, 이들은 단독으로 투여하거나 또는 예를 들어 활성 성분 0.01 내지 99.5 % (더 바람직하게는 0.1 내지 90 %)를 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 제약 조성물로서 투여할 수 있다.
선택된 투여 경로와는 관계 없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물 및(또는) 본 발명의 조성물을 당업자에게 공지된 통상의 방법에 의해제약상 허용되는 투여 형태로 제제화한다.
본 발명의 제약 조성물 중 활성 성분의 실제 투여량 수준은 특정 대상에 대한 목적하는 치료 반응을 달성하는 데 효과적인 활성 성분의 양, 조성물 및 대상체에게 무해한 투여 방식을 성취하기 위해서는 달라질 수 있다. 선택된 투여량 수준은 사용된 본 발명의 특정 조성물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용된 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 조성물과 함께 사용되는 기타 약물, 화합물 및(또는) 물질, 치료될 대상체의 연령, 성별, 체중, 증상, 전체적인 건강 및 의학적 기왕력를 비롯한 다양한 약물동태학적 요소 및 의학 분야에 잘 알려진 유사한 요소에 따라 달라질 것이다.
당업계에서 통상의 지식을 가진 의사 또는 수의사라면 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있을 것이다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 목적하는 치료 효과를 달성하기 위하여 제약 조성물 중에 사용되는 본 발명의 화합물의 투여량을 필요한 수준보다 더 낮은 수준에서 시작하여 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점진적으로 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 조성물의 적합한 일일 투여량은 치료 효과를 나타내기에 효과적인 가장 낮은 투여량인 화합물의 양일 것이다. 이 효과적인 투여량은 일반적으로 상기 기술된 요소에 따라 달라질 것이다. 투여는 정맥내, 근육내, 복강내 또는 피하, 바람직하게는 표적 부위 근처에 투여되는 것이 바람직하다. 필요하다면, 치료 조성물의 효과적인 일일 투여량은 하루 동안 적절한 시간 간격으로, 임의로 단위 투여 형태로 2회, 3회, 4회, 5회 또는 6회 이상으로 투여량을 나누어 투여하는 것과 같이 투여될 수 있다.본 발명의 화합물은 단독으로 투여될 수 있지만, 본 발명의 화합물은 제약 제제 (조성물)로서 투여하는 것이 바람직하다.
치료 조성물은 당업계에 공지된 의료 기기를 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 치료 조성물은 바늘이 달려 있지 않은 피하 주사기, 예를 들어 미국 특허 제5,399,163호; 동 제5,383,851호; 동 제5,312,335호; 동 제5,064,413호; 동 제4,941,880호; 동 제4,790,824호; 또는 동 제4,596,556호에 개시된 기기를 사용하여 투여할 수 있다. 본 발명에 유용한 잘 알려진 이식물 및 모듈의 예로는 조절된 속도로 약물을 투여하는 이식용 미세주입 펌프를 개시하는 미국 특허 제4,487,603호; 피부를 통해 약물을 투여하는 치료 기기를 개시하는 동 제4,486,194호; 정확한 주입 속도로 약물을 전달하는 약물 주입 펌프를 개시하는 동 제4,447,233호; 지속적인 약물 전달을 위한 가변 흐름의 이식용 주입 장치를 개시하는 동 제4,447,224호; 멀티-챔버 구획을 갖는 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 동 제4,439,196호; 및 삼투성 약물 전달 시스템을 개시하는 동 제4,475,196호가 포함된다, 이 특허 문헌들은 본원에 참고로 포함된다. 많은 다른 이식물, 전달 시스템 및 모듈은 당업자에게 공지되어 있다.
몇몇 실시양태에서, 본 발명의 인간 모노클로날 항체가 생체내에서 적절히 분포될 수 있도록 제제화할 수 있다. 예를 들어, 혈액-뇌 장벽 (BBB)는 고도로 친수성인 많은 화합물을 배제한다. 본 발명의 치료 화합물이 (원한다면) BBB를 통과하도록 하기 위하여, 치료 화합물을 예를 들어 리포좀내에 제제화할 수 있다. 리포좀을 제조하는 방법에 대하여는, 미국 특허 제4,522,811호; 동 제5,374,548호;및 동 제5,399,331호를 참조한다. 리포좀은 특정 세포 또는 장기로 선택적으로 운반되는 하나 이상의 잔기를 포함할 수 있으며, 따라서 표적으로의 약물 전달을 증가시킨다 [예를 들어, 문헌[V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29: 685]을 참조]. 표적화 잔기의 예로는 폴레이트 또는 비오틴 [예를 들어, 로우(Low) 등의 미국 특허 제5,416,016호]; 만노시드 (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153: 1038); 항체 (P. G. Bloeman et al. (1995) FEBSLett. 357: 140; M. Owais et al. (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39: 180); 계면활성제 단백질 A 수용체 (Briscoe et al. (1995) Am. J. Physiol. 1233: 134), 그의 다른 종은 본 발명의 제제뿐 아니라 발명된 분자의 성분을 포함할 수 있음; p120 [문헌(Schreier et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 9090); 또한 문헌(K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett. 346: 123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4 : 273)을 참조]가 포함된다. 본 발명의 한 실시양태에서, 본 발명의 치료 화합물은 리포좀으로 제제화되며, 보다 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 표적화 잔기를 포함한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 환제를 주사하여 리포좀내 치료 화합물을 종양 또는 감염 근처의 부위로 전달한다. 조성물은 쉽게 주사할 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 조성물은 제조 및 보관 상태하에서 안정성이 있어야 하며, 세균 및 진균 등의 미생물 오염 작용에 대하여 보호되어야 한다.
"치료 유효 투여량"이란 바람직하게는 처리되지 않은 대상체에 비하여 종양 증식을 약 20 % 이상, 보다 바람직하게는 약 40 % 이상, 보다 더 바람직하게는 약60 % 이상, 가장 바람직하게는 약 80 % 이상 억제하는 양을 말한다. 암을 억제하는 화합물의 능력은 인간 종양에서 효능을 나타내는 동물 모델계에서 평가할 수 있다. 또는, 조성물의 이러한 특성은 당업자에게 공지된 분석에 의해 시험관내에서 암을 억제하는 화합물의 능력을 조사함으로써 평가할 수 있다. 치료 유효량의 치료 화합물은 대상체의 종양 크기를 감소시키거나 또는 증상을 개선시킬 수 있다. 당업자라면 대상체의 크기, 대상체의 증상의 심각도, 및 선택된 특정 조성물 또는 투여 경로 등의 인자를 기초로 하여 투여량을 정할 수 있을 것이다.
조성물은 멸균된 것이어야 하며, 주사기로 투여할 수 있을 정도로 유동성이 있어야 한다. 물 이외에, 담체는 등장성의 완충 염 용액, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액상 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 이들의 적합한 혼합물일 수 있다. 예를 들어, 레시틴 등의 코딩을 사용하여, 분산액의 경우 소정의 입자 크기를 유지하여, 계면활성제를 사용하여 적절한 유동성을 유지할 수 있다. 많은 경우에서, 등장성 물질, 예를 들어 당, 다가알콜, 예를 들어 만니톨 또는 소르비톨, 및 염화나트륨을 조성물 중에 포함시키는 것이 바람직하다. 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 또는 젤라틴을 조성물 중에 포함시켜 주사용 조성물을 장시간에 걸쳐 흡수시킬 수 있다.
활성 화합물이 상기 기술된 바와 같이 적절하게 보호되면, 화합물을 예를 들어 비활성 희석제 또는 흡수가능한 식용성 담체와 함께 경구로 투여할 수 있다.
VI. 본 발명의 용도 및 방법
본 발명의 조성물 (예를 들어, HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체 및 그의 유도체/결합체)은 시험관내 및 생체내 진단 및 치료 용도를 갖는다. 예컨대, 이 분자들은 예를 들어 시험관내 또는 생체외 배양 세포 또는 예를 들어 대상체의 생체내 세포에 투여하여 각종 질병을 치료, 예방 또는 진단할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "대상체"라는 용어는 인간 및 비인간 동물을 포함하는 의미이다. 바람직한 인간 동물로는 HER2/neu의 발현, 통상적으로 HER2/neu의 이상 발현 (예를 들어, 과다발현)을 특징으로 하는 질환을 앓는 인간 환자가 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 방법 및 조성물을 사용하여 종양발생 질환, 예를 들어 선암종, 예컨대, 타액선, 위 및 신장, 유선암종, 폐암종, 편평 세포암종 및 난소암의 종양 세포를 비롯하여 HER2/neu를 발현시키는 종양 세포의 존재를 특징으로 하는 질환을 앓는 환자를 치료할 수 있다. 본 발명의 "인간 이외의 동물"에는 모든 척추동물, 예를 들어 포유류 및 포유류 이외의 동물, 예를 들어 인간 이외의 영장류, 양, 개, 소, 닭, 양서류 및 파충류 등이 포함된다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 먼저 시험관내 치료 또는 진단 용도와 관련된 결합 활성에 대하여 시험할 수 있다. 예를 들어, ELISA 및 하기 실시예에 기재된 유동세포계수분석법을 이용하여 본 발명의 조성물을 시험할 수 있다. 또한, HER2/neu를 발현시키는 세포의 세포용해를 비롯하여 한가지 이상의 이펙터-매개된 이펙터 세포 활성을 개시하는 이들 분자의 활성을 분석할 수 있다. 이펙터 세포-매개된 식세포작용에 대한 분석 프로토콜은 하기 실시예에 기재되어 있다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 HER2/neu 관련 질환의 치료 및 진단에 있어서 추가의 용도를 갖는다. 예컨대, 인간 모노클로날 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자를 사용하여 예를 들어 생체내 또는 시험관내에서 다음의 생물학적 활성 중 하나 이상을 유도할 수 있다: HER2/neu를 발현시키는 세포를 옵소닌처리(opsonization)하는 활성; 인간 이펙터 세포의 존재하에 HER2/neu를 발현시키는 세포의 식세포작용 또는 세포용해를 매개하는 활성; 또는 HER2/neu를 발현시키는 세포의 증식을 억제하는 활성.
특정의 실시양태에서, 인간 항체 및 그의 유도체를 사용하여 생체내에서 각종 HER2/neu 관련 질환을 치료, 예방 또는 진단하였다. HER2/neu 관련 질환의 예로는 각종 암, 예를 들어 선암종, 예컨대, 타액선, 위 및 신장, 유선암종, 폐암종, 편평 세포암종 및 난소암이 포함된다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 항체)을 투여하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 사용되는 분자의 적합한 투여량은 환자의 연령 및 체중, 및 사용된 특정 약물에 따라 달라질 것이다. 문헌[Goldenberg, D. M. et al. (1981) Cancer Res. 41: 4354-4360] 및 유럽 특허 제0365997호에 기재된 바와 같이 분자를 방사선핵종 (radionuclide), 예를 들어 131I, 90Y 및 105Rh 등에 연결시킬 수 있다. 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 또한 항-감염제에 연결할 수도 있다.
표적-특이적 이펙터 세포, 예를 들어 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)에 연결된 이펙터 세포를 또한 치료제로 사용할 수도 있다. 표적화를 위한 이펙터 세포는 인간 백혈구, 예를 들어 대식세포,호중구 또는 단핵구일 수 있다. 다른 세포로는 호산구, 자연살세포 및 기타 IgG- 또는 IgA-수용체 보유 세포가 포함된다. 필요하다면, 이펙터 세포는 치료받을 환자로부터 입수할 수 있다. 표적-특이적 이펙터 세포는 생리학적으로 허용되는 용액 중 세포의 현탁액으로 투여될 수 있다. 투여되는 세포의 수는 약 108내지 109일 수 있지만, 치료 목적에 따라 달라질 것이다. 일반적으로, 이 양은 표적 세포, 예를 들어 HER2/neu를 발현시키는 종양 세포에서 위치를 결정하고, 예를 들어 식세포작용에 의해 세포를 사멸시키는데 충분할 것이다. 투여 경로가 달라질 수도 있을 것이다.
표적-특이적 이펙터 세포를 사용한 치료법을, 표적 세포를 제거하는 다른 기술과 함께 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및(또는) 이들 조성물을 공급받은 이펙터 세포를 사용한 항-종양 요법을 화학요법과 병용할 수 있다. 추가로, 병용 면역요법을 이용하여 두가지 다른 세포독성 이펙터 집단을 종양 세포 거부 반응으로 지시할 수 있다. 예를 들어, 항-Fc-감마RI 또는 항-CD3에 연결된 항-HER2/neu 항체를 IgG- 또는 IgA-수용체 특이적 결합제와 함께 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 이중특이적 및 다중특이적 분자를 사용하여, 예를 들어 세포 표면 상의 수용체를 캡핑 및 제거함으로써 이펙터 세포 상의 FcγR 또는 FcαR 수준을 조절할 수 있다. 이러한 목적을 위해서는 항-Fc 수용체 혼합물을 사용할 수도 있다.
또한, 보체 결합 부위, 예를 들어 보체와 결합하는, IgG1, IgG2 또는 IgG3, 또는 IgM으로부터의 부위를 갖는 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)을 보체의 존재하에 사용할 수 있다. 한 실시양태에서, 보체 또는 보체 함유 혈청을 가하여 표적 세포를 본 발명의 결합제 및 적절한 이펙터 세포와 함께 포함하는 세포 집단을 생체외 치료하는 것을 보완할 수 있다. 보체 단백질을 결합시켜 본 발명의 결합제로 코팅된 표적 세포의 식세포작용을 향상시킬 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)로 코팅된 표적 세포는 보체에 의해 용해시킬 수도 있다.
본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 또한 보체와 함께 투여될 수 있다. 따라서, 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 및 혈청 또는 보체를 포함하는 조성물은 본 발명의 범위내이다. 이러한 조성물은 보체가 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자의 근처에 위치하고 있다는 점에서 유리하다. 또는, 본 발명의 인간 항체, 다중특이적 또는 이중특이적 분자, 및 보체 또는 혈청을 별도로 투여할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자) 및 사용 지침을 포함하는 키트도 본 발명의 범위내이다. 이 키트는 적어도 하나의 추가 시약, 예를 들어 보체, 또는 본 발명의 1종 이상의 다른 인간 항체 (예를 들어, 제1 인간 항체와는 다른 HER2/neu 항원의 에피토프와 결합하는 보체 활성을 갖는 인간 항체)를 추가로 포함할 수 있다.
다른 실시양태에서, 예를 들어 사이토카인을 사용하여 환자를 치료함으로써, Fcγ또는 Fcα수용체의 발현 또는 활성을 조절, 예를 들어 증가시키거나 억제시키는 물질을 사용하여 환자를 추가로 치료할 수 있다. 다중특이적 분자를 사용하는 치료 동안 투여되는 바람직한 사이토카인으로는 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립세포-대식세포 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 인터페론-γ (IFN-γ) 및 종양 괴사 인자 (TNF)가 포함된다.
또한, 본 발명의 조성물 (예를 들어, 인간 항체, 다중특이적 및 이중특이적 분자)은 FcγR 또는 HER2/neu를 발현하는 세포를 표적화하는 데, 예를 들어 이러한 세포를 표지하는 데 사용할 수 있다. 이렇게 사용되는 경우, 검출될 수 있는 분자에 결합제를 연결할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 수용체, 예를 들어 FcγR, 또는 HER2/neu를 발현시키는 세포를 생체외 또는 시험관내에서 위치 결정하는 방법을 제공한다. 검출가능한 표지는 예를 들어 방사성 동위원소, 형광성 화합물, 효소 또는 효소 보조인자일 수 있다.
한 실시양태에서, 본 발명은 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 HER2/neu 사이의 결합체 형성을 허용하는 조건하에 샘플 및 대조 샘플을 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 접촉시키는 것을 포함하는, 샘플 중 HER2/neu 항원의 존재를 검출하거나 또는 HER2/neu 항원의 양을 측정하는 방법을 제공한다. 이어서, 결합체의 형성을 검출하는데, 여기서 대조 샘플과 비교할 때 샘플 사이의 결합체 형성에서 차이가 나는 것은 샘플 중 HER2/neu 항원이 존재함을 암시한다.
또 다른 실시양태에서, 본 발명은 생체내 또는 시험관내에서 Fc-발현 세포의 존재를 검출하는 방법 또는 그의 양을 정량화하는 방법을 제공한다. 이 방법은 (i) 검출용 마커에 결합된 본 발명의 조성물 (예를 들어, 다중특이적 또는 이중특이적 분자) 또는 그의 단편을 환자에게 투여하는 단계; 및 (ii) 상기 검출용 마커를 검출하는 방법을 상기 환자에게 적용하여 Fc-발현 세포를 포함하는 부위를 확인하는 단계를 포함한다.
본 발명의 다른 실시양태는 하기 실시예에 기재되어 있다.
하기 실시예는 본 발명에 대한 추가의 설명이지만, 본 발명이 이 실시예로 한정되는 것으로 생각해서는 안된다. 이 출원 명세서에 인용된 모든 도면 및 참고 문헌, 특허 문헌 및 공개 특허 문헌의 내용은 본원에 포함되는 것으로 한다.
<실시예 1> Cmu 표적화된 마우스의 발생
CMD 표적화 벡터의 작제
플라스미드 pICEmu는 Balb/C 게놈 람다 파지 라이브러리로부터 얻어진, mu 유전자를 포함하는 쥐 Ig 중쇄 좌위의 EcoRI/XhoI 단편을 포함한다 (Marcu et al. Cell 22: 187,1980). 이 게놈 단편을 플라스미드 pICEMI9H의 XhoI/EcoRI 부위에 서브클로닝하였다 (Marsh et al; Gene 32,481-485, 1984). pICEmu에 포함된 중쇄 서열은 mu 인트론 인핸서의 3'에 위치하는 EcoRI 부위의 하류로부터, mu 유전자의 마지막 막횡단 엑손의 약 1 kb 하류에 위치하는 XhoI 부위까지 걸쳐있지만, mu 전환 반복 영역의 많은 부분은 이. 콜라이 (E. coli)에서의 계대배양에 의해 결실되었다.
표적화 벡터를 다음과 같이 작제하였다 (도 1 참조). 1.3 kb HindIII/SmaI 단편을 pICEmu로부터 절단하여 HindIII/SmaI 절단된 pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA)에 서브클로닝하였다. 이 pICEmu 단편은 Cmul 5'의 약 1 kb에 위치하는 HindIII 부위로부터 Cmul내에 위치하는 SmaI 부위까지 걸쳐있다. 생성된 플라스미드를 SmaI/SpeI에서 절단하고, Cmul 3'의 SmaI 부위로부터 마지막 Cmu 엑손의 하류에 위치하는 XbaI 부위까지 걸쳐있는, pICEmu로부터의 약 4 kb SmaI/XbaI 단편을 삽입하였다. 생성된 플라스미드 pTAR1을 SmaI 부위에서 선형화하고, neo 발현 카세트를 삽입하였다. 이 카세트는 마우스 포스포글리세레이트 키나제 (pgk) 프로모터 (XbaI/TaqI 단편; Adra et al. (1987) Gene 60: 65-74)의 전사 조절하에 있는, pgk 폴리아데닐화 부위 (PvuII/HindIII 단편; Boer et al. (1990) Biochemical Genetics 28: 299-308)를 포함하는 neo 유전자로 구성된다. 이 카세트는 neo 카세트가 EcoRI/HindIII 단편으로 절단되고, EcoRI/HindIII 절단된 pGEM-7Zf(+)내에 서브클로닝되어 pGEM-7 (KJ1)이 생성된 플라스미드 pKJ1 [문헌[Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기재되어 있음]으로부터 얻었다. EcoRI/SalI 절단에 의해 neo 카세트를 pGEM-7 (KJ1)으로부터 절단하고, 평활 말단화하여 플라스미드 pTARI의 SmaI 부위에 게놈 Cmu 서열의 반대 방향으로 서브클로닝하였다. 문헌[Mansour et al. (1988) Nature 336: 348-352]에 기재된 바와 같이, 생성된 플라스미드를 NotI으로 선형화하고, 헤르페스 심플렉스 바이러스 티미딘 키나제 (tk) 카세트를 삽입하여 상동 재조합체를 보유하는 ES 클론을 증식시켰다. 이 카세트는, 문헌[Tybulewicz et al. (1991) Cell 65: 1153-1163]에 기재된 바와 같이, 마우스 pgk 프로모터 및 폴리아데닐화 부위에 의해 둘러싸여진 tk 유전자의 코딩 서열로 이루어져 있다. 생성된 CMD 표적화 벡터는 중쇄 좌위와 총 약 5.3 kb의 상동성을 포함하며, neo 발현 카세트가 제1 Cmu 엑손의 유일한 SmaI 부위에 삽입된 변이체 mu 유전자를 생성하도록 디자인된다. 표적화 벡터는 전기천공법에 의해 ES 세포내로 도입되기에 앞서 플라스미드 서열내를 절단하는 PvuI으로 선형화된다.
표적화된 ES 세포의 생성 및 분석
본질적으로는 문헌[Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 71-112]에 기재된 바와 같이, AB-1 ES 세포 (McMahon, A. P. and Bradley, A., (1990) Cell 62: 1073-1085)를 분열 불활성인 SNL76/7 세포 공급층상에서 배양하였다 (ibid.). 선형화된 CMD 표적화 벡터를 문헌[Hasty et al. (Hasty, P. R. et al. (1991) Nature 350: 243-246)]에 기재된 방법에 의해 전기천공하여 AB-1 세포내에 도입하였다. 전기천공된 세포를 100 mm 디쉬내에 1 - 2 x 106세포/디쉬의 밀도로 플레이팅하였다. 24시간 후에, G418 (200 ㎍/활성 성분(ml)) 및 FIAU (5 x 10-7M)를 배지에 첨가하고, 약물-내성 클론을 8 내지 9일에 걸쳐 배양하였다. 클론을 선별하여 트립신 처리하고, 두 부분으로 나누어 추가로 증식시켰다. 이어서, 각 클론으로부터 유도된 세포의 절반을 동결시키고 나머지 절반은 벡터와 표적 서열 사이의 상동 재조합에 대하여 분석하였다.
서던 블롯 혼성화에 의해 DNA 분석을 수행하였다. 문헌[Laird et al. (Laird, P. W. et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 4293)]게 기재된 바와 같이 클론으로부터 DNA를 단리하였다. 단리된 게놈 DNA를 SpeI으로 절단하였고, mu 인트론 인핸서와 mu 전환 영역 사이의 서열과 혼성화하는, 915 bp SacI 단편인 프로브 A (도 1 참조)로 프로빙하였다. 프로브 A는 야생형 좌위로부터의 9.9 kb SpeI 단편, 및 CMD 표적화 벡터와 상동 재조합되는 mu 좌위로부터의 진단용 7.6 kb 밴드를 검출한다 (neo 발현 카세트는 SpeI 부위를 포함한다). 서던 블롯 분석에 의해 스크리닝된 1132, G418 및 FIAU 내성 클론 중에서, 세번째가 mu 좌위에서 상동 재조합을 나타내는 7.6 kb SpeI 밴드를 나타내었다. 이 세 클론을 효소 BglI, BstXI 및 EcoRI으로 추가로 절단하여, 벡터가 mu 유전자내에 상동적으로 통합되었음을 확인하였다. 프로브 A와 혼성화되는 경우, 야생형 DNA를 BglI, BstXI 또는 EcoRI으로 절단하여 서던 블롯 분석한 결과, 각각 15.7, 7.3 및 12.5 kb 크기의 단편이 생성되었지만, 표적화된 mu 대립유전자의 존재는 각각 7.7, 6.6 및 14.3 kb 크기의 단편으로 나타났다. SpeI 절단에 의해 검출되는 세 가지 양성 클론은 모두 neo 카세트의 Cmul 엑손으로의 삽입의 특징을 나타내는 예상 BglI, BstXI 및 EcoRI 제한 단편을 나타내었다.
변이 mu 유전자를 보유하는 마우스의 발생
번호 264, 272 및 408로 명명된 세 표적화된 ES 클론을 문헌[Bradley (Bradley, A. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: a Practical Approach. (E. J. Robertson, ed.) Oxford: IRL Press, p. 113-151)]에 기재된 바와 같이 해동시키고 C57BL/6J 배반포에 주입하였다. 주입된 배반포를 가임신 상태의 암컷 자궁내에 착상시켜 주입 ET 세포 및 숙주 배반포로부터 유도되는 세포의 혼합물을 나타내는 키메라 마우스를 발생시켰다. 키메라에 대한 ES 세포 분포의 정도는 흑색 C57BL/6J 배경상에서 ES 세포주로부터 유도되는 아구티(agouti) 외피의 착색량에 의해 시각적으로 평가할 수 있다. 클론 272 및 408은 단지 낮은 비율의 키메라 (즉, 낮은 아구티 착색 비율)를 생산하였지만, 클론 264는 높은 비율의 수컷 키메라를 생산하였다. 이 키메라를 C57BL/6J 암컷과 교배하여 아구티 자손을 발생시켰으며, 이는 생식세포에 의한 ES 세포 게놈의 전달을 암시한다. 표적화된 mu 유전자의 스크리닝을 꼬리 생체검사법으로부터 BglI 절단된 DNA의 서던 블롯 분석에 의해 (ES 세포 DNA의 분석에 대하여 상기 기재된 바와 같이) 수행하였다. 아구티 자손의 약 50 %는 15.7 kb의 야생형 밴드 이외에도 7.7 kb의 혼성화 BglI 밴드를 나타내었으며, 이는 생식세포에 의한 표적화된 mu 유전자의 전달을 증명하였다.
mu 유전자의 기능적 불활성화에 대한 형질전환 마우스의 분석
neo 카세트의 Cmul로의 삽입이 Ig 중쇄 유전자를 불활성화하는지를 결정하기 위해, JH 유전자 단편의 결실로 인해 중쇄 발현을 불활성화하는 JHD 돌연변이에 대하여 동형접합인 마우스와 클론 264 키메라를 교배하였다 (Chen et al, (1993) Immunol. 5: 647-656). 아구티 자손이 4마리 발생되었다. 1개월령의 이들 동물로부터 혈청을 채취하여 ELISA법에 의해 쥐 IgM의 존재에 대하여 분석하였다. 자손 네마리 중 둘에는 IgM이 완전히 결여되어 있었다 (표 1 참조). 꼬리 생체검사법에서 BglI 절단 및 프로브 A (도 1 참조)와의 혼성화, 및 StuI 절단 및 475 bp EcoRI/StuI 단편과의 혼성화 (ibid)에 의해 DNA를 서던 블롯 분석하여 네마리 동물의 유전자형을 결정함으로써, 혈청 IgM을 발현시키지 못하는 동물은 중쇄 좌위의 한 대립유전자가 JHD 돌연변이를 보유하며 다른 대립유전자는 Cmul 돌연변이를 포함하는 동물이라는 사실을 입증하였다. JHD 돌연변이에 대하여 이형접합인 마우스는 야생형 수준의 혈청 Ig를 나타내었다. 이 데이타는 Cmul 돌연변이가 mu 유전자의 발현을 불활성화함을 입증한다.
마우스 혈청 IgM (㎍/ml) IgH 쇄 유전자형
42 < 0.002 CMD/JHD
43 196 +/JHD
44 < 0.002 CMD/JHD
45 174 +/JHD
129 x BL6F1 153 +/+
JHD < 0.002 JHD/JHD
표 1은 CMD 및 JHD 돌연변이 둘 다를 보유하는 마우스 (CMD/JHD), JHD 돌연변이에 대하여 이형접합인 마우스 (+/JHD), 야생형 (129Sv x C57BL/6J) FI 마우스 (+/+), 및 JHD 돌연변이에 대하여 동형접합인 B 세포 결실 마우스 (JHD/JHD)에 대하여 ELISA에 의해 검출된 혈청 IgM의 수준을 나타낸다.
<실시예 2> HCO12 형질전환 마우스의 발생
HC012 인간 중쇄 트랜스진
pHC2의 80 kb 삽입물 및 pVx6의 25 kb 삽입물의 공동주입에 의해 HCO12 트랜스진을 생성시켰다 (Taylor et al., 1994, Int. Immunol., 6: 579-591). 플라스미드 pVx6를 하기 기재된 바와 같이 작제하였다.
생식세포 인간 VH1-18 (DP-14) 유전자를 약 2.5 kb의 5' 플랭킹 및 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열과 함께 포함하는 8.5 kb HindIII/SalI DNA 단편을 플라스미드 벡터 pSP72 (Promega, Madison, WI)내에 서브클로닝하여 플라스미드 p343.7.16을 생성시켰다. 생식세포 인간 VH5-51 (DP-73) 유전자를 약 5 kb의 5' 플랭킹 및 1 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열과 함께 포함하는 7 kb BamHI/HindIII DNA 단편을 pBR322계 플라스미드 클로닝 벡터 pGP1f (Taylor et al. 1992, Nucleic Acids Res. 20:6287-6295)내에 클로닝하여 플라스미드 p251f를 생성시켰다. pGP1f로부터 유도된 새 클로닝 벡터 pGP1k (서열 13)를 EcoRV/BamHI으로 절단하여 생식세포 인간 VH3-23 (DP47) 유전자를 약 4 kb의 5' 플랭킹 및 5 kb의 3' 플랭킹 게놈 서열과 함께 포함하는 10 kb EcoRV/BamHI DNA 단편에 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드 p112.2RR.7을 BamHI/SalI으로 절단하여 p251f의 7 kb 정제된 BamHI/SalI 삽입물과 라이게이션하였다. 생성된 플라스미드 pVx4를 XhoI로 절단하여 p343.7.16의 8.5 kb XhoI/SalI 삽입물과 라이게이션하였다.
VH1-18 유전자를 다른 두 V 유전자와 동일한 방향으로 포함하고 있는 클론을 얻었다. 이어서, pVx6로 명명된 이 클론을 NotI으로 절단하고, 문헌[Hogan et al. (B.Hogan et al., Manipulating the Mouse Embryo, A Laboratory Manual, 2nd edition, 1994, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY)]에 기재된 바와 같이, 정제된 26 kb 삽입물을 pHC2의 정제된 80 kb NotI 삽입물과 함께 1/2일 (C57BL/6J x DBA/2J)F2 배의 전핵내에 1:1의 몰 비율로 공동주입하였다. 주입된 배로부터 발생한 마우스로부터 Vx6 및 HC2 둘 다로부터의 서열을 포함하는 형질전환 마우스의 세 독립 계통을 확립하였다. 이 계통들을 (HC012) 14881, (HC012) 15083 및 (HC012) 15087로 명명하였다. 이어서, 이 계통 각각을 실시예 1에서 설명된 CMD 돌연변이, JKD 돌연변이(Chen et al. 1993, EMBO J. 12: 811-820) 및 (KCo5) 9272 트랜스진(Fishwild et al. 1996, Nature Biotechnology 14: 845-851)을 포함하는 마우스와 교배하였다. 생성된 마우스는 내재 마우스 중쇄 및 카파 경쇄 좌위의 파괴에 대하여 동형접합인 배경에서 인간 이뮤노글로불린 중쇄 및 카파 경쇄 트랜스진을 발현시킨다.
<실시예 3> HER2/neu에 대한 모노클로날 항체 및 이중특이적 분자의 생산
인간 항- HER2/neu 모노클로날 항체는 1) 표준 조건 하에서 생장하고 PBS로 수거 및 세척되는, HER2/neu, 높은 수준으로 발현하는 인간 유방암종 세포 (SKBR-3 및 BT-474); 2) 뮤린 항- HER2/neu 모노클로날 항체 및 항-뮤린 IgG 세파로스로 면역침전된 SKBR-3 세포의 용해물; 3) SKBR-3 세포로부터 제공되는 HER2/neu로부터 유래된 HER2/neu 항원으로 HuMAb 마우스의 HC07 및 HC012 계통을 면역화시킨 후 뮤린 항-HER/neu 모노클로날 항체를 사용한 친화 크로마토그래피로 정제함으로써 얻었다. HC07 HuMAb 마우스는 미국 특허 제5,545,806호, 제5,625,825호 및 제5,545,807호 (이들의 전체 개시 내용은 본 명세서에 포함되는 것으로 함)에 기재된 바와 같이 얻었다.
구체적으로, HC07 및 HC012 마우스를 먼저 프로인트 완전 면역보강제 중에 유화된 항원으로 면역화시켰다. 후속 면역화에서, 항원을 프로인트 불완전 면역보강제와 혼합하였다. 마지막으로, 비장을 절제하기 전에 정제된 항원 및 보강제 없는 항원을 정맥내로 투여하였다. 마우스를 2-3주마다 면역화시켰다. 제3 및 후속 면역화 후, 인간 IgG 항-HER2/neu의 역가를 (하기한 바와 같이) ELISA로 측정하였다. 항-HER2/neu IgG 반응을 보이는 마우스를 비장 절제 전에 3일 동안 또는 3일 및 4일 동안 정제된 항원으로 정맥내 투여하였다. 반응하는 마우스로부터 얻은 비장을 모아 단일 세포로 분산시켰다.
항-HER2/neu 항체를 생산하는 하이브리도마를 얻기 위해, 항-HER2/neu 항체를 함유하는 혈장을 갖는 마우스로부터 얻은 비장세포를 P3X63-Ag8.653 세포 (ATCC CRL 1580라는 명칭으로 ATCC에 기탁된 비분비 마우스 골수종 세포) 및 PEG와 융합시켰다. 하이브리도마를 (약 10-14일 동안) 생장시킨 후, 항-인간 IgG ELISA를 이용하여 하이브리도마를 함유하는 각 웰을 인간 IgG의 생산에 대해 스크리닝하였다. HER2/neu ELISA를 이용하여 양성 하이브리도마를 항원 특이성에 대해 더 시험하였다.
요약하면, 마이크로타이터 플레이트를 PBS 중의 정제된 HER2/neu 0.25 ㎍/ml로 코팅한 후, PBS 중의 5% 소 혈청 알부민으로 블로킹하였다. 항-HER2/neu 생산 하이브리도마로부터 얻은 상등액을 각 웰에 첨가하고 37℃에서 1-2시간 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 PBS/Tween으로 세척한 후 알칼리성 포스패타제에 결합된 염소-항-인간 IgG Fc-특이적 폴리클로날 시약과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 세척 후, 플레이트를 pNPP에 노출시키고 405 nm의 파장에서 마이크로플레이트 판독기로 샘플을 판독하였다. 도 2A는 3.F2, 2.E8 및 1.D2로 불리는 하이브리도마 배양물의 상등액 3종과 재조합 HER2/neu의 결합을 ELISA로 측정하여나타낸 도면이다. 배지 대조구와 비교할 때, 보여진 바와 같이 3종의 항-HER2/neu 하이브리도마 상등액을 사용한 경우 상당한 결합이 검출되었다.
HER2/neu에 대해 특이성을 갖는 인간 IgG 항체를 분비하는 여러 가지 하이브리도마를 서브클로닝하고 인간 모노클로날 항체의 정제를 위해 증식시켰다. 5% CO2를 함유하는 습한 인큐베이터 내의 스피너 플라스크에서 생장한 하이브리도마 배양물의 상등액으로부터 모노클로날 항체를 단리하였다. 항체는 제조자의 지시에 따라 단백질 A-아가로스 컬럼 상 크로마토그래피로 정제하였다 (Pierce, Rockford IL).
마이크로타이터 플레이트를 마우스 항-HER2/neu 항체로 코팅하고 5% BSA로 블로킹한 후, 과생장된 SKBR-3 세포의 상등액과 함께 인큐베이션함으로써, 세포에 의해 제공되는 HER2/neu를 포획하였다. 그 다음으로, 상기 플레이트를 다양한 농도의 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체 또는 이소타입 대조구 (인간 IgG1)와 함께 인큐베이션하였다. 고정된 HER2/neu에 결합한 인간 항-HER2/neu 항체를 상기한 바와 같이 검출하였다. 특히, 도 2B는 ELISA로 측정시 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10, 3.B4와 재조합 HER2/neu의 결합을 나타낸다.
HER2/neu를 발현하는 종양 세포에 결합하고 HER2/neu-음성 세포에 결합하지 않으며, ELISA로 분석시 HER2/neu에 결합하는 인간 IgG를 생산하는 하이브리도마의 특징을 하기와 같이 ELISA 및 플로우 사이토메트리로 더 규명하였다. 이들 성질을 나타내는 상등액이 있는 하이브리도마를 서브클로닝하고, 이들의 항체를 단백질 A친화 크로마토그래피로 정제한 후 상기 항체의 특징을 더 규명하였다.
스크리닝된 12종의 하이브리도마가 ELISA 및 플로우 사이토메트리로 분석시 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 IgG1κ항체를 생산한다 (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10, 3.B4, l.F11, 3.D11, 3.D6, 1.H9, 2.G7, 3.E8 및 2.E11). 이들 모노클로날 항체 중 5종 (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4)이 정제되었고 정제된 HER2/neu 및 HER2/neu를 발현하는 인간 종양 세포에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 이들 5종의 항체는 HER2/neu를 발현하는 인간 종양 세포의 세포용해성 사멸을 매개하고 시험관내에서 인간 종양 세포의 생장을 억제하는 것으로 보였다.
또한, 표준 가교결합 방법을 이용한 이황화 결합을 통해 인간 항-CD89 항체 14.1의 F(ab')2단편과 인간 항-HER2/neu 항체 3.F2의 F(ab')2단편을 화학적으로 결합시켜 14.1 x 3.F2로 불리는 이중특이적 분자를 제조하였다 (도 13).
<실시예 4> HER2/neu에 대한 인간 모노클로날 항체 및 이중특이적 분자의 특징규명
종양 세포와 인간 항-HER2/neu 항체 및 이중특이적 분자의 결합
ELISA에 의해 검출된 바와 같이 HER2/neu에 대한 상당한 결합력을 보이는 5종의 하이브리도마 (3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4) 상등액으로부터 정제된 모노클로날 항체가 HER2/neu를 높은 수준으로 발현하는 종양 세포와 결합하는 능력을 추가로 시험하였다. 요약하면, 종양 세포 (예컨대, SKBR-3 또는 BT-474)를 항체 또는 항체 F(ab')2단편과 함께 인큐베이션하고 세척하여 결합하지 않은 항체를 제거하였다. 형광색소로 표지된 염소-항-인간 F(ab')2를 사용하여 세포에 결합된 인간 항-HER2/neu 항체를 검출하고 플로우 사이토메트리를 이용하여 샘플의 평균 형광 강도를 측정하였다. 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, 항-HER2/neu 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4는 대조구 인간 항체와 비교할 때 HER2/neu를 발현하는 SKBR-3 세포에 대한 상당한 결합력을 나타낸다. 유사하게, 도 3C는 표면 상에 HER2/neu를 발현하는 BT-474 종양 세포와 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4의 결합을 보인다. 도 4는 HER2/neu에 대한 3.F2 및 2.E8 항체의 특이성을 입증한다. 항-HER2/neu 항체 3.F2 및 2.E8는 HER2/neu 발현 종양 세포주 SKBR3 및 BT-474와의 상당한 특이적 결합을 나타낸 반면, HER2/neu 수용체 (c-erbB2)와 동일한 족에 속하는 EGF 수용체 (c-erbB1)를 높은 수준으로 발현하는 A431 종양 세포주에는 잘 결합하지 않는다. 인간 항-HER2/neu 항체 또는 항체 단편을 포함하는 이중특이적 분자를 이와 동일한 방식으로 결합에 대해 시험할 수 있다.
인간 항-HER2/neu 항체 및 이중특이적 분자를 사용한 인간 종양 세포 생장의 억제
다음으로, 위에 입증된 바와 같이 HER2/neu에 대한 특이적 결합을 보이는 항체가 세포 표면 HER2/neu를 발현하는 인간 종양 세포의 생장을 억제하는 능력에 대해 시험하였다. 요약하면, 정제된 항체를 정상적인 생장 조건 하에 6일 동안 종양 세포와 인큐베이션하고, 세포 밀도를 크리스탈 바이올렛 염색으로 측정하였다. 도 5A 및 5B에 나타낸 바와 같이, 정제된 항-HER2/neu 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4로의 처리는 대조구 인간 항체와 비교할 때 SKBR-3 종양 세포의 세포 밀도를 처리량 의존적 방식으로 감소시켰다. 3.F2 및 2.E8 항-HER2/neu 모노클로날 항체의 F(ab')2단편도 처리량 의존적 방식으로 SKBR-3 종양 세포의 생장을 억제한다 (도 6 참조). 더욱이, 도 7A에 나타낸 바와 같이, 항-HER2/neu 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4는 대조구 인간 항체와 비교할 때 BT-474 종양 세포의 세포 밀도를 처리량 의존적 방식으로 감소시켰다. 도 7B는 BT-474 종양 세포를 항-HER2/neu 항체 3.F2 및 2.E8 뿐만 아니라 그의 F(ab')2단편 10 ㎍으로 처리한 경우 대조구 항체와 비교할 때 종양 세포의 생장이 억제됨을 보인다. 인간 항-HER2/neu 항체 또는 항체 단편 (예를 들어, 도 13에 나타낸 바와 같음)을 포함하는 이중특이적 분자를 이와 동일한 방식으로 종양 세포 생장의 억제에 대해 시험할 수 있다.
인간 항-HER2/neu 항체의 항체 의존성 세포-매개 세포독성 (ADCC) 활성
선별된 인간 항-HER2/neu 모노클로날 항체가 세포 표면 HER2/neu를 발현하는 표적 종양 세포의 ADCC를 매개하는 능력도 시험관내에서 시험하였다. 요약하면, 단핵 세포를 건강한 공여자로부터 단리하고 정제된 항-HER2/neu 항체 3.F2, 2.E8 및 1.D2의 존재 하에5lCr 표지 SKBR-3 종양 세포와 함께 인큐베이션하였다. 4시간 후, 웰로부터 배양 상등액을 수거하고51Cr의 방출을 감마 카운터 상에서 측정하였다. 하기 식에 따라 특이적 세포용해율(%)을 측정하였다.
(실험 CPM - 표적 누출 CPM) / (디터전트 용해 CPM - 표적 누출 CPM) X 100%
도 8A는 항-HER2/neu 항체가 대조구 인간 항체와 비교할 때 SKBR-3 종양 세포의 투여량 의존적 세포용해를 매개하였음을 입증한다. 또 다른 연구에서, IFN-y유도 대식세포를 5 ㎍/ml의 항-HER2/neu 항체 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4의 존재 하에51Cr 표지 SKBR-3 세포와 함께 인큐베이션하였다. 4시간 후, 배양 상등액을 수거하고51Cr의 방출을 상술한 바와 같이 측정하였다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, 항-HER2/neu 항체는 대조구 인간 항체와 비교할 때 HER2/neu 과발현 종양 세포의 투여량 의존적 세포용해를 매개하였다.
또한, 정제된 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2 (도 13)를 다형핵 세포에 의한51Cr 표지 SKBR-3 또는 BT-474 인간 종양 세포의 ADCC 사멸에 대해 시험하였다. 37℃에서 밤새 인큐베이션한 후, 배양 상등액으로 방출된51Cr을 분석하여 사멸된 종양 세포의 양을 측정하였다. 보고된 특이적 용해는 이중특이적 분자의 존재 하의 종양 세포 용해의 양에서 다형핵 세포 단독을 사용한 종양 세포 용해의 양을 제외한 양이다. 도 9에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2는 HER2/neu를 발현하는 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포 둘다의 PMN에 의한 세포 사멸을 투여량 의존적 방식으로 매개하였다. 또한, 도 10에 나타낸 바와 같이, 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2는 HER2/neu를 발현하는 SKBR-3 및 BT-474 종양 세포 둘다의 단핵세포에 의한 세포 사멸을 투여량 의존적 방식으로 매개하였다. 두 경우, 10 ㎍/ml의 14.1 F(ab')2를 첨가하면 1 ㎍/ml의 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2에 의한 종양 세포의 ADCC를 완전히 차단하였는데, 이는 표적 세포의 사멸이 이펙터 세포와 CD89의 결합에 의해 완전히 매개되었음을 입증한다. 도 11은 이중특이적 분자 14.1 x 3.F2가HER2/neu를 발현하는 BT-474 종양 세포의 전혈에 의한 세포 사멸도 투여량 의존적 방식으로 매개하였음을 보인다.
하기 실시예에는 HER2/neu와 높은 친화도로 특이적으로 반응하는 인간 모노클로날 항체 및 이중특이적 분자의 생산이 기재되어 있다. 또한, 이들 실시예는 인간 모노클로날 항-HER2/neu 항체가 HER2/neu를 발현하는 인간 종양 세포의 생장을 효과적으로 억제함을 입증한다. 또한, 인간 항-HER2/neu 항체 및 이중특이적 분자는 이펙터 세포의 존재 하에, HER2/neu를 높은 수준으로 발현하는 인간 종양 세포에 대한 세포 사멸 활성을 매개한다. 이러한 결과는 HER2/neu에 대한 완전한 인간 모노클로날 항체 (및 그의 단편) 및 본 발명의 이들 항체를 포함하는 이중특이적 분자가 HER2/neu 관련 질환의 치료에 유용하다는 결론을 지지한다.
<실시예 5> 종양 세포의 세포 매개 세포독성을 촉진하는 HER2/neu 및 CD89 (FcαR)에 대한 인간 항체 결합 부위를 함유하는 이중특이적 및 삼중특이적 분자
하기 연구는 EGF 수용체 (EGF-R) 및(또는) HER2/neu (HER2로도 불림)를 발현하는 종양 세포의 이펙터 세포 매개 사멸을 유도하는 이중특이적 및 삼중특이적 분자의 생산 및 특징규명을 수반한다. 이중특이적 작제물에는 항-HER2 항체 (ScFv 또는 Fab')에 연결된 항-CD89 (항-FcαR) 항체 (ScFv 또는 Fab')가 포함된다. 삼중특이적 작제물에는 EGF에 융합된 이중특이적 항-CD89 (ScFv) X 항-HER2 (ScFv) 작제물이 포함된다. 따라서, 상기 작제물은 종양 세포에 표적화된 CD89 발현 세포의 이펙터 기능을 활성화한다.
융합 작제물의 제작
도 12 및 13은 이중특이적 및 삼중특이적 분자 및 이들의 모 인간 항체 (HuMAb) 각각을 보여 준다. 도 12는 단일쇄 (ScFv) 이중특이적 융합 분자, 931 및 934를 보여 주는데, 이들은 934가 EGF를 포함하지만 931이 포함하지 않는다는 점을 제외하고 동일하다. 14.1 (항-CD89) 및 3.F2 (항-HER2)의 가변 경쇄 및 중쇄 영역을 사용하여 작제물을 발생시켰다. 도 13에는 양성 대조구로 사용된 화학적으로 결합된 fab' 항-CD89 x 항-HER2 이중특이적 분자 (상기 실시예 4에 기재된 바와 같음)가 나타나 있다. 14.1 및 3.F2의 fab'단편을 사용하여 이러한 BsAb를 발생시켰다.
단일쇄 이중특이적 및 삼중특이적 분자 (931 및 934)는 NSO 세포를 플라스미드 (예컨대, pJZ934)로 형질감염시고 G418이 함유된 배지에서 선별함으로써 생산하였다. 세포주를 융합 단백질의 발현에 대해 스크리닝하고 제한 희석 클로닝법으로 서브클로닝하였다. 마지막으로, 용합 단백질은 단백질 L 컬럼 상에서 융합 단백질을 발현하는 세포주의 상등액을 런닝시킨 후 대략 2 ㎍의 정제된 단백질을 비환원 및 환원 조건 하의 4-15% 트리스-글리신 겔 상에 로딩함으로써 정제하였다. 934 작제물은 주로, 환원 조건 하에 단량체로 해리되는 삼량체 종으로서 정제되었다.
종양 세포와 이중특이적 및 삼중특이적 분자 결합의 특징규명
플로우 사이토메트리를 이용하여 이중특이적 및 삼중특이적 분자 결합의 특징을 규명하였다. 도 14(A)에는 형질감염종 상등액 중의 융합 단백질과 종양 세포의 결합이 나타나 있다. 형질감염된 세포 (931 & 934)의 상등액 및 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상등액을 SKBR-3 또는 A431 종양 세포주와 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 파이코에리쓰린에 결합된 염소 항-인간 IgG fab-2로 염색하여 융합 단백질의 결합을 검출하였다. 도 14 (B)에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 세포 (931 & 934)의 상등액도 세포용해 (ADCC)를 매개하였다. 이들 연구에서, 표적 (SKBR-3, A431)에 대한 이펙터 (단핵구, PMN)의 비율을 100:1로 하여 크로뮴 방출에 대한 분석을 16-18시간의 인큐베이션 기간 동안 수행하였다. 특이적 세포 용해를 매개하는 형질감염된 세포 (931 & 934)의 상등액 및 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상등액을 사용하여 종양 세포의 사멸을 검출하였다.
도 15 (A)에는 (CD89 수용체를 통한) U937 세포와 정제된 이중특이적 및 삼중특이적 분자 (931 및 934)의 결합 활성이 나타나 있다. U937 세포와 결합하지 않는 항체 425 (항-EGF-R mAb)의 fab-2 단편을 음성 대조구로 사용하였다. 화학적으로 커플링된 이중특이적 분자인 항-CD89 (Fab') X 항-HER2 (Fab') (도 13에 나타냄)를 양성 대조구로 사용하였다. 도 15 (B)는 (HER2 수용체를 통한) SKBR-3 세포와의 결합을 시험하였다는 점을 제외하고 도 15 (A)와 동일하다. 항-CD89 항체의 fab-2 단편인 14.1을 음성 대조구로 사용하였다. 도 16에는 A431 세포와 934 삼중특이적 작제물의 결합이 나타나 있다. 이 실험은 EGF-R을 과발현하는 A431 종양 세포가 사용되었다는 점을 제외하고는 도 15에 나타낸 바와 동일한 방식으로 수행하였다. EGF에 융합된 14.1의 sFv 단편으로 구성된 융합 단백질을 양성 대조구로 사용하고, 항-CD89 항체의 fab-2 단편인 14.1을 음성 대조구로 사용하였다.
HER2/neu 및 EGF-R 발현 종양 세포의 이펙터 세포-매개 융해
이펙터 세포의 존재 하에 HER2/neu 및 EGF-R 발현 종양 세포의 세포 용해(ADCC)를 매개하는 단일쇄 이중특이적 및 삼중특이적 분자 (931 및 934)의 능력도 시험하였다. 표적 (SKBR-3, A431)에 대한 이펙터 (단핵구, PMN)의 비율이 100:1인 크로뮴 방출 분석을 16-18시간의 인큐베이션 기간 동안 수행하였다. 특이적 세포 용해를 매개하는 형질감염된 세포 (931 및 934) 및 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상등액을 사용하여 종양 세포의 사멸을 검출하였다. 도 14 (B)에 나타낸 바와 같이, 형질감염된 세포 (931 및 934)의 상등액은 단핵구, PMN 및 전혈의 세포 용해 (ADCC)를 매개하였다. 이 연구에서, 표적 (SKBR-3, A431)에 대한 이펙터 (단핵구, PMN)의 비율이 100:1인 크로뮴 방출 분석을 16-18시간의 인큐베이션 기간 동안 수행하였다. 특이적 세포 용해를 매개하는 형질감염된 세포 (931 및 934) 및 형질감염되지 않은 세포 (NSO)의 상등액을 사용하여 종양 세포의 사멸을 검출하였다.
도 17 및 도 18에는 PMN 및 단핵구 각각의 존재 하의, 정제된 단일쇄 이중특이적 작제물 (931)에 의한 SKBR-3 세포 (도 17 (A) 및 도 18 (A)) 및 BT-474 세포 (도 17 (B) 및 도 18 (B))의 이펙터 세포-매개 용해가 나타나 있다. 표적에 대한 이펙터의 비율이 100:1인 크로뮴 방출 분석을 16-18시간의 인큐베이션 기간 동안 수행하였다. 항-CD89 항체의 fab-2 단편 (14.1)을 각 실험에서 음성 대조구로 사용하였다.
결론적으로, 상기 연구에는 종양 세포에 표적화되어 종양 세포의 이펙터 세포-매개 사멸을 유도하는 단일쇄 이중특이적 및 삼중특이적 분자의 발생이 기재되어 있다. 또한, 상기 연구는 이들 이중특이적 및 삼중특이적 분자가 CD89, EGF-R 및 HER2 발현 세포와 결합할 수 있음을 입증한다. 중요하게는, 이들 이중특이적및 삼중특이적 분자가 CD89 발현 면역 이펙터 세포의 존재 하에 EGF-R 및 HER2 과발현 세포의 사멸을 투여량 의존적 방식으로 매개하고 이러한 세포 사멸은 이펙터 세포 상의 CD89에 결합함으로써 매개된다는 것도 입증한다.
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등가물
당업자는 통상적인 실험 이외의 실험을 사용하지 않고도 본 명세서에 기재된 본 발명의 특정한 실시양태의 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가물은 하기 청구항에 포함되는 것이다.

Claims (35)

  1. a) HER2/neu에 대한 약 107M-1이상의 결합 친화 상수;
    b) HER2/neu를 발현하는 세포를 옵소닌화(opsonization)하는 능력;
    c) 시험관내에서 인간 이펙터 세포의 존재 하에 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제하거나 세포용해를 매개하는 능력; 또는
    d) HER2/neu에 결합한 후 HER2/neu 발현 세포에 의해 내재화되는 능력
    중 하나 이상을 갖는, HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  2. 제1항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgAsec, IgD 및 IgE로 구성된 군으로부터 선택되는 이소타입(isotype)을 갖는 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  3. 제1항에 있어서, IgG1κ인 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  4. 제1항에 있어서, HER2/neu를 발현하는 세포가 종양 세포인 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  5. 제4항에 있어서, HER2/neu를 발현하는 세포가 선암종 세포, 예컨대, 타액선, 위 및 신장; 유선암종 세포; 폐암종 세포; 편평 세포암종 세포; 및 난소암 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  6. 제1항에 있어서, 인간 중쇄 트랜스진 (transgene) 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물로부터 얻은, 불멸 세포와 융합된 B 세포를 포함하는 하이브리도마에 의해 생산되는 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  7. 재1항에 있어서, 기탁번호 으로서 ATCC (등록상표)에 기탁된 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4로 구성된 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  8. 인간 이펙터 세포의 존재 하에 HER2/neu를 발현하는 세포의 세포용해를 매개하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  9. 제8항에 있어서, 시험관내에서 1 X 10-7M 이하의 IC50으로 인간 이펙터 세포에 의한 HER2/neu 발현 세포의 세포용해를 매개할 수 있는 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  10. HER2/neu를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  11. 제10항에 있어서, 시험관내에서 1 X 10-7M 이하의 IC50으로 HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제할 수 있는 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위.
  12. 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖고 있으며 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 검출 가능한 양의 인간 모노클로날 항체를 생산하는 형질전환 비인간 동물로부터 얻은, 불멸 세포와 융합된 B 세포를 포함하는 하이브리도마.
  13. 제12항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가
    a) HER2/neu에 대한 약 107M-1이상의 결합 친화 상수;
    b) HER2/neu를 발현하는 세포를 옵소닌화(opsonization)하는 능력;
    c) 시험관내에서 인간 이펙터 세포의 존재 하에 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제하거나 세포용해를 매개하는 능력; 또는
    d) HER2/neu에 결합한 후 HER2/neu 발현 세포에 의해 내재화되는 능력
    중 하나 이상을 갖는 것인 하이브리도마.
  14. 제13항에 있어서, 기탁번호 으로서 ATCC (등록상표)에 기탁된 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4로 구성된 군으로부터 선택되는 하이브리도마.
  15. HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체를 발현하며, 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물.
  16. 인간 중쇄 트랜스진 및 인간 경쇄 트랜스진을 포함하는 게놈을 갖는 형질전환 비인간 동물을, HER2/neu 또는 HER2/neu를 발현하는 세포로 면역화시켜 상기 동물의 B 세포에 의해 항체가 생산되도록 하는 단계;
    상기 동물의 B 세포를 단리하는 단계; 및
    B 세포를 골수종 세포와 융합시켜 HER2/neu에 대해 특이적인 인간 모노클로날 항체를 분비하는 불멸 하이브리도마 세포를 형성하는 단계
    를 포함하는, HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체의 생산 방법.
  17. HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위인 제1 결합 특이적 부위, 및 Fc 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위를 포함하는 이중특이적 분자.
  18. 제17항에 있어서, 상기 Fc 수용체가 인간 FcγRI 또는 인간 Fcα수용체인 이중특이적 분자.
  19. 제17항에 있어서, Fc 수용체의 이뮤노글로불린 결합 부위와 구별되는 부위에서 Fc 수용체에 결합하는 이중특이적 분자.
  20. 제17항에 있어서, Fc 수용체에 결합하는 제2 결합 특이적 부위가 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위인 이중특이적 분자.
  21. 제17항에 있어서, 단일쇄 또는 Fab' 융합 단백질인 이중특이적 분자.
  22. HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위인 제1 결합 특이적 부위, Fc 수용체에 대한 제2 결합 특이적 부위, 및 HER2/neu 이외의 종양 항원에 대한 제3 결합 특이적 부위를 포함하는 다중특이적 분자.
  23. 제22항에 있어서, 제3 결합 특이적 부위가 EGF인 다중특이적 분자.
  24. 제1항의 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위 및 제약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 조성물.
  25. HER2/neu의 상이한 에피토프에 결합하는, 제1항에 따른 2종 이상의 단리된 인간 항체 또는 그의 항원 결합 부위의 배합물을 포함하는 조성물.
  26. HER2/neu를 발현하는 세포를 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 접촉시켜 HER2/neu를 발현하는 세포의 생장을 억제하는 것을 포함하는, HER2/neu를 발현하는 세포 생장의 억제 방법.
  27. HER2/neu를 발현하는 세포를 HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 이펙터 세포의 존재 하에 접촉시켜 HER2/neu를 발현하는 세포의 세포용해가 일어나도록 하는 것을 포함하는, HER2/neu를 발현하는 세포의 세포용해를 유도하는 방법.
  28. HER2/neu에 특이적으로 결합하는 단리된 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위를, HER2/neu-매개 질환의 치료 또는 예방에 효과적인 양으로 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, HER2/neu의 비정상적인 발현을 특징으로 하는 질환의 치료 또는 예방 방법.
  29. 제28항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 Fc 수용체에 대한 결합 특이적 부위에 결합되어 있는 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 상기 인간 모노클로날 항체가 세포독소에 결합되어 있는 것인 방법.
  31. 제28항에 있어서, 상기 질환이 암인 방법.
  32. 제31항에 있어서, 암이 선암종, 예컨대, 타액선, 위 및 신장, 유선암종, 폐암종, 편평 세포암종 및 난소암으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 HER2/neu 사이의 결합체가 형성되도록 하는 조건 하에서 샘플 및 대조구 샘플을 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부위와 접촉시키는 단계; 및
    상기 결합체의 형성을 검출하는 단계
    를 포함하며, 대조구 샘플과 비교할 때 샘플 간의 상이한 결합체의 형성이 상기 샘플 중의 HER2/neu의 존재를 나타내는 것인, 샘플에서 HER2/neu 항원 또는 HER2/neu를 발현하는 세포의 존재를 검출하는 방법.
  34. a) HER2/neu에 대한 약 107M-1이상의 결합 친화 상수;
    b) HER2/neu를 발현하는 세포를 옵소닌화하는 능력;
    c) 시험관내에서 인간 이펙터 세포의 존재 하에 약 10 ㎍/ml 이하의 농도로 HER2/neu 발현 세포의 생장을 억제하거나 상기 발현 세포의 세포용해를 매개하는 능력; 또는
    d) HER2/neu에 결합한 후 HER2/neu 발현 세포에 의해 내재화되는 능력
    중 하나 이상을 갖는, HER2/neu에 특이적으로 결합하는 인간 모노클로날 항체 또는 그의 항원 결합 부위의 중쇄 및 경쇄의 가변 및 불변 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 상기 항체 또는 그의 항원 결합 부위가 기탁번호 으로서 ATCC (등록상표)에 기탁된 3.F2, 2.E8, 1.D2, 1.B10 및 3.B4로 구성된 군으로부터 선택되는 하이브리도마에 의해 생산되는 것인 발현 벡터.
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