CN104185681A - C1orf32抗体及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于治疗癌症的C1ORF32-特异性抗体、抗体片段、替代支架、轭合物、以及包含它们的组合物。

Description

C1ORF32抗体及其用于治疗癌症的用途
发明领域
本发明在至少一些方面涉及C1ORF32-特异性抗体、抗体片段、轭合物、替代支架、包含它们的组合物、以及其用于治疗癌症的用途。
发明背景
T-细胞活化在驱动保护性免疫应答与病原性免疫应答两者中起着重要作用，并且它需要完成一系列周密安排的具体步骤，这些步骤可被任何数量的关键事件抢先或破坏。为了变得被有成效地活化，天然T细胞必须接受来自抗原呈递细胞(APC)的两个独立信号。第一信号1是抗原特异性的，并且当T细胞抗原受体碰到APC上的适当的抗原-MHC复合体时发生。这个信号是必要的，但不足以用于确定免疫应答的命运(faith)。免疫应答的命运是由第二、抗原独立性信号(信号2)决定的，该信号是通过一种T细胞共刺激分子来递送，该T细胞共刺激分子接合其APC-表达性配体。这种第二信号可以是刺激性的(正向共刺激)抑或抑制性的(负向共刺激或共抑制)。在共刺激信号不存在的情况下，或在共抑制信号存在的情况下，T-细胞活化是受损的或中止的，这可以导致抗原特异性无应答性(称为T-细胞无反应性)的状态，或可以导致T-细胞凋亡性死亡。
共刺激分子对通常由APC上表达的配体和T细胞上表达的其同源受体组成。共刺激分子的原型配体/受体对是B7/CD28和CD40/CD40L。
肿瘤细胞经常表达负向共刺激分子并且因此利用这些分子的免疫调节活性来逃避免疫监视。这类肿瘤表达的B7用作肿瘤相关抗原(TAA)并且已成为有吸引力的癌症生物标志物以及主动(疫苗接种)和被动(抗体介导的)癌症免疫疗法的药物靶标，从而提供打破免疫耐受性和刺激免疫系统的策略。
癌症疫苗接种涉及给予肿瘤抗原并且用于打破免疫耐受性且诱导针对肿瘤的主动T-细胞应答。疫苗疗法包括使用裸DNA、肽、重组蛋白以及全细胞疗法，其中患者自身的肿瘤细胞用作疫苗的来源。
用于治疗癌症的抗-TAA抗体的施用包括裸抗体疗法、药物/毒素轭合的抗体疗法、过继性免疫疗法以及细胞免疫性融合疗法(具有抗-TAA抗体活性的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)或天然杀伤(NK)细胞群体的发展)。这些治疗性方法所靶向的抗原表位存在于细胞表面，与非肿瘤细胞相比在肿瘤细胞中过度表达，并且被封闭功能活性、抑制细胞增殖或诱导细胞死亡的抗体所靶向。
免疫系统的负向调节剂(被称为免疫检查点)在维持对自身抗原的耐受性中起重要作用。免疫检查点被肿瘤使用并且成为产生有效肿瘤免疫性的障碍，从而在遏制否则有效的抗肿瘤免疫应答中起重要作用。若干免疫检查点是负向共刺激蛋白，免疫调节剂的B7/CD28家族的成员。靶向这些负向调节剂检查点的免疫调节抗体疗法(如针对CTLA4和PD-1的那些)已经证明了有希望的临床结果。
被动免疫治疗策略在肿瘤学中完善建立的并且涉及抗癌单克隆抗体的被动转移作为所靶向的疗法。相比之下，主动免疫治疗策略目的在于引出身体的抗肿瘤免疫性，并且仅最近才开始显示出在癌症治疗方面的成功。在癌症中活化免疫系统用于治疗益处长期以来一直是肿瘤学的一个目标。在若干主动免疫治疗方法之中，免疫调节抗体疗法是指使用直接增强抗肿瘤免疫应答的组分(如T细胞)的功能或封闭否则将遏制有效抗肿瘤免疫性的单克隆抗体。近来这种策略(还被称为免疫调节抗体)已经最终在临床试验中获得了概念验证。免疫检查点的封闭似乎以转化人癌症治疗剂的方式来释放抗肿瘤免疫应答的潜力。最值得注意地是，抗-CTLA4抗体伊匹单抗实现具有转移性黑色素瘤的患者存活率的显著增加的能力，对于这些患者来说，常规治疗已经失败。在用一种抗-PD-1抗体MDX1106治疗的患者中也已经获得了显著临床应答。
高度免疫原性的肿瘤(如恶性黑色素瘤)对于免疫系统操纵最具应答性，并且因此许多这些治疗形式已经首先应用于具有黑色素瘤的患者。然而，众多正在进行的临床研究目的在于通过以下方式来靶向多种肿瘤：将靶向免疫检查点的试剂与其他更常规的方法(如靶向疗法、化学疗法以及放射疗法)或与其他新颖的免疫治疗方法(包括治疗性癌症疫苗)进行组合。广泛的临床前数据确实已经显示：导致肿瘤细胞死亡的治疗剂释放肿瘤抗原并且为检查点封闭性抗体提供正确刺激因素(fuel)(即使在免疫原性较弱的肿瘤中)，从而在这类药剂中产生令人印象深刻的治疗协同作用。在多个临床前研究中获得了类似观察结果，从而证明治疗性癌症疫苗和检查点封闭的协同功效。
这类试剂可以与肿瘤特异性抗原结合给予，作为用于增强对患者中的抗原的免疫应答的一种佐剂。此外，这类试剂在其他类型的癌症免疫疗法，如过继性免疫疗法中可以是有用的，其中肿瘤特异性T细胞群体被扩增并且被引导以攻击并且杀伤肿瘤细胞。能够增加这类抗肿瘤应答的试剂具有很大的治疗潜力，并且在克服肿瘤免疫疗法的障碍的尝试中可以是有价值的。
使用不同共刺激蛋白的激动剂和拮抗剂来调节共刺激已经作为治疗自身免疫性疾病、移植排斥、过敏症以及癌症的策略而被广泛地研究。这个领域已经由被批准用于治疗RA的CTLA4-Ig(阿巴西普(Abatacept)，)和最近被批准用于治疗黑色素瘤的抗-CTLA4抗体(伊匹单抗，)在临床上进行开拓。其他共刺激调节剂当前处于临床研发的晚期阶段，包括抗PD-1抗体(MDX-1106)，它正处于用于晚期/转移性透明细胞肾细胞癌(RCC)的治疗的研发；以及用于治疗肾脏同种异体移植物移植的抗-CD40L抗体(BG9588，)。此外，共刺激的调节与不同类型的感染有关的累积证据支持这类试剂作为用于感染性疾病的疗法的有希望的潜力。根据这一点，这类试剂正处于用于病毒性感染的临床开发中，例如正在针对治疗丙型肝炎而对抗PD-1Ab(MDX-1106)进行测试。另一个实例是CP-675,206(替西木单抗(tremelimumab)并且抗-CTLA4Ab处于患有肝细胞癌的丙型肝炎病毒感染的患者的临床试验中。
可诱导的调节性T细胞(iTreg)的积聚在许多肿瘤中是常见的，并且形成肿瘤组织中的免疫抑制细胞的主要亚群。Treg产生一种免疫抑制性环境并且调节抗肿瘤免疫性，并且因此表示免于免疫监视的主要肿瘤抗性机制。iTreg因此被视为用于癌症治疗的重要细胞靶标。
除了它们在阻抑效应T细胞应答中的功能之外，多种免疫-检查点受体(如CTLA4和PD-1)以及其他各物像TIM3和LAG3在iTreg的表面上以高水平表达并且直接促进效应子免疫应答的Treg细胞介导的抑制。在临床测试中的许多免疫检查点抗体最有可能封闭iTreg的免疫抑制活性作为增强抗肿瘤免疫性的机制。实际上，通过伊匹单抗进行的CTLA4封闭的作用方式中的两个重要因素是效应T细胞活性的增强和Treg免疫抑制活性的抑制。
为了解除iTreg并且恢复效应T细胞的抗肿瘤功能，单独地或与常规治疗或免疫疗法组合使用的若干策略正处于开发中。
B细胞在识别外来抗原中起重要作用，并且它们产生用于提供针对不同类型的感染因子的保护所需的抗体。T细胞辅助B细胞是获得性免疫应答的一个关键过程。滤泡辅助性T(Tfh)细胞是在B细胞辅助中特化的CD4+T细胞的一个亚群(由克罗蒂(Crotty)评论，免疫学年报(Annu.Rev.Immunol.)29:621-663,2011)。Tfh细胞表达B细胞归巢趋化因子受体CXCR5，该趋化因子受体驱使Tfh细胞以一种CXCL13-依赖性方式迁移至淋巴结中的B细胞滤泡之中。B细胞辅助和T细胞依赖性抗体应答对Tfh细胞的需求表明这种细胞类型对于针对不同类型的感染因子的保护性免疫以及对于合理的疫苗设计是十分重要的。
发明概述
尽管近年来在癌症生物学和癌症治疗的理解中有所进展，但癌症治疗的成功率仍然较低。因此，对于能够成功治疗癌症的新的疗法(例如像特异性封闭性抗体)存在未满足的需求，这些新疗法在刺激针对肿瘤的免疫系统中具有治疗应用。
“封闭性抗体”是指与一种具体蛋白质或一种蛋白质上的表位结合并且然后任选地封闭该蛋白质与一个或多个其他结合配偶体的相互作用的任何抗体。
根据至少一些实施例，本发明提供单克隆抗体和/或多克隆抗体以及抗原结合片段，和/或包含它们的替代支架和/或轭合物和/或免疫轭合物，它们特异性地结合以下各物：选自下组的C1ORF32(ILDR2)蛋白中的任一种，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的任一种；和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQID NO:14、10、11、15中的任一种；和/或其片段、和/或表位，其中这些抗体适于用作治疗剂和/或诊断剂(体外诊断方法与体内诊断方法两者)，特别是用于治疗和/或诊断癌症和恶性肿瘤，其中该癌症是非转移性的、侵袭性的或转移性的。如在此所用，术语“抗体”可以任选地是指以下中的任一者(并且还任选地指以下各物的组合)：单克隆抗体和/或多克隆抗体和抗原结合片段和/或替代支架和/或轭合物和/或免疫轭合物。
出人意料地，C1ORF32-Ig蛋白显示出增强CD4T细胞到iTreg的分化，从而表明C1ORF32途径涉及在iTreg诱导和分化之中。根据本发明的至少一些实施例，用封闭性单克隆抗体靶向C1ORF32抑制iTreg积聚和免疫抑制功能。根据本发明的至少一些实施例，这类封闭性C1ORF32抗体增强效应T细胞活性。根据至少一些实施例，本发明提供封闭性抗体，该封闭性抗体特异性地结合以下各物：选自下组的C1ORF32(ILDR2)蛋白中的任一种，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的任一种；和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、10、11、15中的任一种；和/或其片段、和/或表位，该封闭性抗体可以任选地并且优选地单独地或与一种或多种增效剂相组合特别是应用于癌症免疫疗法，该一种或多种增效剂增加内源性抗肿瘤应答。
此外，出人意料地，已经发现一种抗体可以任选地并且优选地特别应用于治疗某些癌症，针对这些癌症这种抗体证明了具体功效；该抗体特异性地结合以下各物：选自下组的C1ORF32(ILDR2)蛋白中的任一种，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的任一种；和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、10、11、15中的任一种；和/或其片段、和/或表位。在此还提供包含这种抗体与一种药学上可接受的载体的结合的药用组合物。
此外，出人意料地，已经发现所述抗体在特定癌症中证明了具体功效，这些癌症包括其中C1ORF32在恶性细胞、浸润到肿瘤中的免疫细胞(如T细胞、B细胞、巨噬细胞、骨髓衍生抑制细胞、肥大细胞)和/或间质肿瘤细胞上表达的癌症。以上所列举的这些细胞中的任一者上的C1ORF32表达可以在通过标准护理剂治疗之前存在抑或在治疗后诱导。
这类特定癌症包括以下中的任一种或多种：甲状腺癌、食道鳞状细胞癌、乳腺癌、乳腺粉刺癌(comedocarcinoma)、乳腺侵袭性导管癌、乳腺髓样癌、卵巢癌、卵巢乳头状浆液性和粘液性癌、卵巢颗粒细胞肿瘤、卵巢的表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、卵巢囊腺癌、卵巢子宫内膜样肿瘤、肾癌、肾透明细胞癌、肾嫌色细胞腺瘤、肾肉瘤样癌、前列腺腺癌、良性前列腺增生、肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、肝纤维板层癌(fibrolamellar)、肝假腺样(pseudoglandular)(腺样)癌、肝多形性(巨细胞)癌、肝透明细胞癌、胆管癌、胰腺癌、胰腺导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、胰腺导管腺癌、胰腺腺鳞癌、胰腺印戒细胞癌、胰腺肝样癌、胰腺胶样癌、胰腺未分化癌、胰腺的伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、胰腺的低至中等级别神经内分泌癌、胰腺类癌肿瘤、恶性黑色素瘤、骨肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤、淋巴瘤、子宫癌、膀胱癌、肺癌、睾丸精原细胞瘤、结肠直肠癌、以及脊髓肿瘤，其中：
1.甲状腺癌优选地包括以下中的一种或多种：甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌(优选地II期和III期)、偶发性乳头状癌(IPC)、甲状腺髓样癌、间变性甲状腺癌。
2.乳腺癌优选地包括侵袭性导管癌(优选地II至IV期)和/或分化不良侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选地2级)。
3.卵巢癌优选地包括以下中的一种或多种：乳头状浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌、以及子宫内膜样肿瘤。
4.肾(kidney)(肾脏(renal))癌优选地包括以下中的一种或多种：透明细胞癌(优选地I期至II期)、嫌色细胞腺瘤、肉瘤样癌(sarcomatoidescarcinoma)。
5.前列腺腺癌优选地包括任何适合阶段的前列腺腺癌(优选地I期至III期)、良性前列腺增生或具有5或更高的格里森得分(Gleason score)的前列腺腺癌。在一个具体实施例中，前列腺腺癌选自格里森得分5或更高。
6.肝细胞癌(HCC)优选地包括以下中的一种或多种：II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层癌、假腺样(腺样)癌、多形性(巨细胞)癌以及透明细胞HCC和胆管癌。
7.胰腺癌优选地包括以下中的一种或多种：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤。
8.恶性黑色素瘤优选地包括IV期恶性黑色素瘤和/或以下中的一种或多种：恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、以及软组织黑色素瘤。
9.肉瘤优选地包括以下中的一种或多种：骨、软骨以及软组织肉瘤，包括但不限于成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏(Askin's)肿瘤、尤因氏(Ewing's)肉瘤、卡波济氏(Kaposi's)肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、以及神经纤维肉瘤。
10.淋巴瘤优选地包括以下中的一种或多种：霍奇金氏(Hodgkin's)淋巴瘤(结节硬化型、混合细胞亚型、富含淋巴细胞或淋巴细胞优势型、淋巴细胞消减型、以及未指定型)、B细胞淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特氏(Burkitt)淋巴瘤、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病)、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤(结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤：塞扎莱(Sézary)综合征和蕈样真菌病，间变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤)。
11.子宫癌优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)。
12.膀胱癌优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)。
13.肺癌优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞癌。
14.结肠直肠癌优选地包括结肠和直肠腺癌(优选地中度至不良分化的)。
根据至少一些实施例，对于以上所描述的癌症中的任何来说，任选地以上所描述的癌症类型或亚型各自可以任选地形成一个单独的实施例和/或可以任选地被组合为实施例或子实施例。
根据至少一些实施例，对于以上所描述的癌症中的任何来说，提供在此所描述的治疗方法以及还有这些抗体和药用组合物的用途，其中该癌症在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中所包含的C1ORF32多肽；和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种；和/或其片段、和/或表位。
如在此所用，当术语“其表位”出现时，它可以任选地并且非限制性地指如在SEQ ID NO2、3、5、或6中所体现的表位。
根据至少一些实施例，本发明提供一种用于治疗癌症和恶性肿瘤(任选地其中该癌症是非转移性的、侵袭性的或转移性的)的药用组合物，该药用组合物包含单克隆抗体和/或多克隆抗体和/或抗原结合片段，它们特异性地结合以下各物：选自下组的C1ORF32蛋白中的任一种，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的任一种；和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、10、11、15中的任一种；和/或其片段、和/或表位。任选地对于在此所描述的任何应用或用途来说，可以使用所描述的单克隆抗体中的任一种。
根据至少一些实施例，提供一种单克隆或多克隆抗体或其一种抗原结合片段，它们包含与SEQ ID NO:2、3、5、6中的任一种特异性地结合的抗原结合位点。
根据至少一些实施例，提供适于治疗癌症的一种单克隆或多克隆抗体或其一种抗原结合片段，它们包含与以下各物特异性地结合的抗原结合位点：具有SEQ ID NO:1、7-10、11、13-15、17、103中的任一种的序列的C1ORF32多肽中的任一种、和/或其片段、和/或表位，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌(denosquamouscarcinomas)、印戒细胞癌(signet ring cell carcinomas)、肝样癌、胶样癌(colloid carcinomas)、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤。
根据至少一些实施例，提供一种单克隆或多克隆抗体或其一种抗原结合片段，它们包含与SEQ ID NO:2、3、5、6中的任一种特异性地结合的抗原结合位点。
根据至少一些实施例，提供一种单克隆抗体，该单克隆抗体具有包含以下的氨基酸序列：
以下中的至少一个：轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:84、以及SEQ IDNO:100的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:85、以及SEQ ID NO:101的序列，或CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:86、以及SEQ ID NO:102的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列；或
以下中的至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:78、以及SEQ IDNO:94的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:79、以及SEQ ID NO:95的序列，或CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:80、以及SEQ IDNO:96的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列。
任选地，例如，在一些任选的实施例中，该抗体包含：
至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:84、以及SEQ ID NO:100的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:85、以及SEQ ID NO:101的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:86、以及SEQ IDNO:102的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列；和/或
至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:78、以及SEQ ID NO:94的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:79、以及SEQ ID NO:95的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:80、以及SEQ IDNO:96的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列。
任选地，例如，在一些任选的实施例中，该抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:52中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:53中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:54中列出的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:62中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:63中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:64中列出的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列。
任选地，例如，在替代实施例中，该抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:68中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:69中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:70中列出的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:46中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:47中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:48中列出的序列，或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列。
任选地，例如，在替代实施例中，该抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:84中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:85中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:86中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:78中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:79中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:80中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列。
任选地，例如，在替代实施例中，该抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:100中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:101中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:102中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:94中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:95中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:96中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列。
任选地，该抗体具有选自SEQ ID NO:40、56、72、88中的任一种的重链的氨基酸序列、和/或选自SEQ ID NO:42、58、74、90中的任一种的轻链的氨基酸序列、或与其具有至少85％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列。
任选地，该抗体具有在SEQ ID NO:40中列出的重链的氨基酸序列、和/或在SEQ ID NO:42中列出的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体具有在SEQ ID NO:56中列出的重链的氨基酸序列、和/或在SEQ ID NO:58中列出的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体具有在SEQ ID NO:72中列出的重链的氨基酸序列、和/或在SEQ ID NO:74中列出的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体具有在SEQ ID NO:88中列出的重链的氨基酸序列、和/或在SEQ ID NO:90中列出的轻链的氨基酸序列。
根据至少一些实施例，提供一种具有由核酸序列编码的氨基酸序列的单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:81、以及SEQ ID NO:97，CDR2区，该CDR2区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:82、以及SEQ ID NO:98，以及CDR3区，该CDR3区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:83、以及SEQ ID NO:99，或其一种退化变体；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、以及SEQ ID NO:91，CDR2区，该CDR2区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:76、以及SEQ ID NO:92，以及CDR3区，该CDR3区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:77、以及SEQ ID NO:93，或其一种退化变体。
根据至少一些实施例，提供一种具有由核酸序列编码的氨基酸序列的单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:49中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:50中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:51中列出的核酸序列编码；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:43中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:44中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:45中列出的核酸序列编码。
在一些实施例中，该抗体由一个核酸序列编码并且包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:65中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:66中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:67中列出的核酸序列编码；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:59中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:60中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:61中列出的核酸序列编码。
在一些实施例中，该抗体由一个核酸序列编码并且包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:81中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:82中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:83中列出的核酸序列编码；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:75中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:76中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:77中列出的核酸序列编码。
在一些实施例中，该抗体由一个核酸序列编码并且包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:97中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:98中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:99中列出的核酸序列编码；和/或
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:91中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:92中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:93中列出的核酸序列编码。
任选地，该抗体具有由选自以下的一个核酸序列编码的重链的氨基酸序列：SEQ ID NO:39、55、71、87中的任一种，和由选自以下的一个核酸序列编码的轻链的氨基酸序列：SEQ ID NO:41、57、73、89中的任一种，或其一种退化变体。
任选地，该抗体具有由在SEQ ID NO:39中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列,和由在SEQ ID NO:41中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体具有由在SEQ ID NO:55中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列,和由在SEQ ID NO:57中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体具有由在SEQ ID NO:71中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列,和由在SEQ ID NO:73中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体具有由在SEQ ID NO:87中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列,和由在SEQ ID NO:89中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
任选地，该抗体包含选自下组的CDR氨基酸序列，该组由以下各项组成：(a)如在此所列举的序列；(b)除了重链CDR3中在位置100A(卡巴特(Kabat)编号系统)处的丝氨酸残基之外，与在(a)中指定的那些CDR氨基酸序列的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守性氨基酸取代的序列；(c)与在(a)或(b)中指定的这些序列具有90％或更大、95％或更大、98％或更大、或99％或更大序列一致性的氨基酸序列；(d)具有由多核苷酸编码的氨基酸序列的一种多肽，该多核苷酸具有编码如在此所列举的氨基酸的一个核酸序列。
任选地，任何以上抗体可以由用一种载体转化的一种杂交瘤分泌，该载体包含编码例如如在此所描述的氨基酸序列的任何适合的核酸序列。
任选地，该抗体由5166-2和/或5166-9杂交瘤分泌，这些杂交瘤根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)专利保藏处，10801大学大道(University Boulevard)，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(Virginia)20110-2209U.S.A.，由ATCC接收部门于2013年1月18日接收，分别具有临时登录号：5166-2PTA-13472和/或5166-9PTA-13473。
根据至少一些实施例，提供一种杂交瘤，该杂交瘤根据布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)专利保藏处，10801大学大道，马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209U.S.A.，由ATCC接收部门于2013年1月18日接收，分别具有临时登录号：5166-2PTA-13472和/或5166-9PTA-13473。
根据至少一些实施例，提供一种由以上杂交瘤产生的抗体。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，癌症在癌细胞上或在浸润集聚为肿瘤的癌细胞的免疫细胞上表达一种或多种C1ORF32多肽。任选地，所述一种或多种C1ORF32多肽包含以下各物：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的一种或多种、和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，该抗体是一种全人抗体、嵌合抗体、人源化或灵长类化(primatized)抗体。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，该抗体选自下组，该组由以下各项组成：Fab、Fab’、F(ab')2、F(ab')、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单元。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，该抗体可以是双特异性的，意味着Ig分子的一个臂对于结合如在此所描述的靶蛋白或表位是特异性的，并且该Ig分子的另一个臂具有一种不同的特异性，该特异性能够增强或重定向该抗体或片段的生物活性。在这方面，一种多特异性抗体也被认为是至少双特异性的。在为多价的意义上，该抗体或片段还可以是多特异性的。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，该抗体被偶联至一个选自以下的部分：一种药物、放射性核素、荧光团、酶、毒素、治疗剂、或化学治疗剂；并且其中该可检测的标志物是一种放射性同位素、金属螫合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，一种药用组合物包含这种抗体或一种抗原结合片段。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段或在此所描述的药用组合物来说，提供一种用于治疗癌症的用途，其中该癌症表现出在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中所包含的C1ORF32多肽、和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位，并且其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤。
根据至少一些实施例，提供一种用于治疗癌症的方法，其中该癌症表现出在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：包含SEQ IDNO:1、7、9、13、17、103的C1ORF32多肽、和/或选自下组的其相对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位，并且其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的如在此所描述的抗体或抗体结合片段中的任一种或如在此所描述的药用组合物。
任选地，将该治疗与适用于治疗癌症的另一个部分或疗法进行组合。
任选地，该疗法是放射疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、过继性T细胞疗法、Treg消减、手术或与常规药物的组合疗法。
任选地，该部分选自下组，该组由以下各项组成：免疫抑制剂、细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体(例如贝伐单抗(bevacizumab)、爱必妥(erbitux))、肽、百普素体(pepti-bodies)、小分子、化学治疗剂(如细胞毒性剂和细胞生长抑制剂(例如紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂))、免疫学修饰剂(如干扰素和白细胞介素)、免疫刺激抗体、生长激素或其他细胞因子、叶酸、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱酰酶抑制剂、以及蛋白酶体抑制剂。
任选地，对于在此所描述的任何抗体或片段来说，提供一种用于诊断癌症的用途，其中该癌症表现出在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：包含SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103的C1ORF32多肽、和/或选自下组的其相对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ IDNO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位，并且其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤。
根据至少一些实施例，提供一种用于诊断受试者中的癌症的方法，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤的，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤，该方法包括在该受试者中或在从所述受试者获得的样品中检测以下各物：SEQ IDNO:1、7、9、13、17、103中所包含的C1ORF32多肽中的任一种、和/或选自下组的其相对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位。
任选地，在体内或体外进行检测该多肽。还任选地，该检测是通过免疫测定进行的。还任选地，使用如在此所描述的抗体或片段进行该检测。
以下实施例和子实施例任选地是用如在此所描述的这些抗体、方法、组合物或用途中的任一种来实施，任选地其中所述甲状腺癌选自以下中的一种或多种：甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌(优选地II期和III期)、偶发性乳头状癌(IPC)、甲状腺髓样癌、间变性甲状腺癌。
任选地所述食道癌是食道鳞状细胞癌。
任选地所述侵袭性导管癌选自II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌，和/或其中所述髓样癌是2级髓样癌。
任选地所述浆液性和粘液性卵巢癌选自Ic期至IIIb期浆液性和粘液性卵巢癌。
任选地所述肾透明细胞癌选自I期至II期肾透明细胞癌。
任选地所述肝细胞癌选自II期和III期肝细胞癌。
任选地所述霍奇金氏淋巴瘤选自结节硬化型、混合细胞亚型、富含淋巴细胞或淋巴细胞优势型、淋巴细胞消减型、以及未指定型。
任选地，所述B细胞淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病。
任选地，所述T细胞淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤：塞扎莱综合征和蕈样真菌病，间变性大细胞淋巴瘤、以及血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤。
任选地，所述子宫内膜样腺癌选自I期至IIIc期子宫内膜样腺癌。
任选地，所述膀胱移行细胞癌选自II期至IV期移行细胞癌。
任选地，所述小细胞肺癌选自I期至IIIb期小细胞肺癌，和/或其中所述非小细胞肺癌选自不良至中度分化的鳞状和腺癌。
任选地，所述抗体或片段抑制由C1ORF32引出的活性。
任选地，所述抗体或片段调节B7相关的共刺激、增加T细胞活化、减轻T-细胞抑制、增加细胞因子分泌、增加IL-2分泌；增加由T-细胞产生的干扰素-γ、增加Th1应答、减少Th2应答、促进癌症表位铺展、降低T细胞活化的抑制、增加哺乳动物中的T细胞应答、刺激抗原特异性记忆应答、引出癌细胞的细胞凋亡或裂解、刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞生长抑制作用、诱导癌细胞的直接杀死、诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
任选地，所述抗体或片段增加针对癌症的免疫应答。
任选地，所述抗体或片段降低调节性T淋巴细胞(T-reg)的活性。
任选地，所述抗体或片段抑制iTreg分化。
任选地，如本文所描述的抗体、方法、组合物或用途的特征在于与一种增效剂组合向受试者给予该抗体和/或组合物以获得一种治疗作用，其中所述增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、增强抗肿瘤免疫应答的常规/经典化学疗法、增强抗肿瘤免疫应答的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激抗体、治疗性癌症疫苗、过继性细胞转移。
任选地，常规/经典化学治疗剂选自吉西他滨、奥沙利铂、顺铂、卡铂(和其他基于铂的化合物)、环磷酰胺、蒽环类(如阿霉素、柔红霉素)、紫杉烷类(如紫杉醇、多西他赛)、微管抑制剂(如长春新碱)、叶酸拮抗剂(如甲氨蝶呤)、mTOR途径抑制剂(如坦罗莫司和雷帕霉素)、奥沙利铂、环磷酰胺、阿霉素、以及米托恩醌。
任选地，靶向疗法试剂选自组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(如伏立诺他、丁酸钠以及MS-275)、硼替佐米、威罗菲尼、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(如埃罗替尼、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼)、治疗性单克隆抗体(如抗EGFR mAb西妥昔单抗、anatimumab、曲妥珠单抗)。
任选地，靶向免疫抑制细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自抗有丝分裂药物(如环磷酰胺、吉西他滨、米托恩醌、氟达拉滨、沙立度胺、以及沙立度胺衍生物)、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体直接靶向Treg的消减性抗体或杀伤性抗体(如抗-CD25达利珠单抗和巴利昔单抗)、配体定向毒素(如地尼白介素-毒素连接物(denileukin diftitox)(Ontak)：人IL-2和白喉毒素的一种融合蛋白、或LMB-2：一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的融合体)、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径的试剂(如外核苷酸酶抑制剂或A2A腺苷受体的抑制剂)、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂(像西地那非)、ROS抑制剂(如硝基阿司匹林(nitroaspirin))。
任选地，免疫刺激抗体选自靶向免疫检查点的拮抗性抗体如CTLA4(实例：伊匹单抗)、PD-1(实例：BMS-936558/MDX-1106)、PDL-1(实例：BMS-936559/MDX-1105)、LAG-3(实例：IMP-321)、TIM-3、BTLA和/或靶向免疫刺激蛋白质的激动性抗体如CD40(实例：CP-870、893)、CD137(实例：BMS-663513)、OX40(实例：抗-OX40)、GITR(实例：TRX518)。
任选地，治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗，包括用于发动针对一种肿瘤抗原的免疫原性应答的蛋白质或肽、编码肿瘤抗原的重组病毒以及细菌载体、编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗、靶向树突状细胞的蛋白质、树突状细胞、表达GM-CSF和/或Flt-3配体的基因修饰的肿瘤细胞。
任选地，治疗性癌症疫苗包括基于树突状细胞的疫苗。
任选地，对于任何以上所描述的抗体来说，癌症在癌细胞上或在浸润集聚为肿瘤的癌细胞的免疫细胞中表达一种或多种C1ORF32多肽。
根据至少一些实施例，本发明提供以上抗体及其片段，其中该抗体是一种嵌合、人源化、全人抗体和/或是在靶细胞上具有CDC或ADCC活性的一种抗体或抗体片段。
特别包括的是免疫活化或免疫抑制性抗体和片段，如经由ADCC(抗体依赖性细胞毒性)或CDC(补体依赖性细胞毒性)活性靶向细胞的抗体或片段。
根据至少一些实施例，本发明提供适用于以上疗法和相关诊断方法中的以上抗体片段和轭合物，包括但不限于Fab、F(ab')2、Fv或scFv片段。
根据本发明的至少一些实施例，主题抗体和片段直接地或间接地附接至标志物和其他效应子部分(如一种可检测的标志物)、或附接至一种效应子部分如一种酶、毒素、治疗剂、或化学治疗剂。
根据至少一些实施例，本发明提供以上抗体或片段，这些抗体或片段直接地或间接地附接至一种放射性同位素、金属螫合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物、或化学发光化合物。
根据至少一些实施例，本发明提供药用和/或诊断组合物，这些组合物包含一种治疗上和/或诊断上有效形式的一种以上抗体或抗体片段。
根据至少一些实施例，本发明提供用于治疗或预防癌症的方法，这些方法包括向患者给予有效量的以上抗体和/或药用组合物。
任选地，如在此所描述，将该治疗与有用于治疗癌症的另一个部分或疗法进行组合。任选地，该疗法是放射疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、过继性T细胞疗法、Treg消减、手术或与常规药物的组合疗法。
根据至少一些实施例，本发明提供用于在生物样品或个体中体外或体内检测C1ORF32蛋白的存在和/或水平的测定，这些测定包括将该样品与以上抗体相接触，并且检测该样品中和/或该个体中的C1ORF32蛋白的结合。
根据至少一些实施例，本发明提供用于检测癌症、诊断癌症、监测癌症进展或治疗功效或癌症的复发、或选择用于癌症的一种疗法、检测受癌症影响的细胞的方法，这些方法包括检测一种C1ORF32的表达。
这类诊断方法任选地包括在受试者中或在从所述受试者获得的样品中检测以下各物：在SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中包含的C1ORF32多肽中的任一种、和/或选自下组的其对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位。任选地，在体内或体外、任选地通过免疫测定并且还任选地通过使用抗体或片段来进行检测该多肽。
根据一个实施例，在一个样品中检测C1ORF32多肽的存在和/或水平指示癌症的存在和/或其严重性和/或其进展。根据另一个实施例，与在一个健康受试者或从该健康受试者获得的一个样品中C1ORF32多肽的表达和/或水平相比，C1ORF32多肽表达和/或水平的变化指示癌症的存在和/或其严重性和/或其进展。根据一个另外的实施例，与在早期阶段在所述受试者或从其获得的一个样品中该多肽的水平和/或表达相比，该多肽表达和/或水平的变化指示癌症的进展。根据仍另外的实施例，检测该多肽的存在和/或其在表达和/或水平上的相对变化对于选择一种治疗和/或监测癌症的治疗来说是有用的。
根据至少一些实施例，本发明提供如在此所描述的抗体和片段，任选地并且优选地，其中该抗体以1×10-8M或更小KD结合人C1ORF32，并且其中该抗体表现出以下特性中的至少一个：调节B7相关的共刺激、增加T细胞活化、减轻T-细胞抑制、增加细胞因子分泌、增加IL-2分泌；增加由T-细胞产生的干扰素-γ、增加Th1应答、减少Th2应答、促进癌症表位铺展、降低T细胞活化的抑制、增加哺乳动物中的T细胞应答、刺激抗原特异性记忆应答、引出癌细胞的细胞凋亡或裂解、刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞生长抑制作用、诱导癌细胞的直接杀死、诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性。
任选地，该抗体或片段增加针对癌症的免疫应答。
任选地，该抗体或片段降低调节性T淋巴细胞(T-reg)的活性。
任选地，该抗体或片段抑制iTreg分化。
根据至少一些实施例，本发明提供一种包含以上抗体或其抗原结合部分的双特异性分子，该抗体或其抗原结合部分连接至与所述以上抗体或其抗原结合部分具有相同或不同的抗原结合靶标或特异性的一个第二功能部分。
编码本发明的这些抗体或其抗原结合部分的核酸分子以及包含这类核酸的表达载体和包含这类表达载体的宿主细胞也由本发明所涵盖。此外，本发明提供一种包含人免疫球蛋白重链转基因和轻链转基因的转基因小鼠，其中该小鼠表达本发明的一种抗体；以及从这种小鼠制备的杂交瘤，其中该杂交瘤产生本发明的抗体。
根据至少一些实施例，本发明提供以上单克隆抗体和/或多克隆抗体和抗原结合片段和/或包含它们的药用组合物用于治疗癌症的用途，其中该癌症表现出在肿瘤细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达C1ORF32蛋白。任选地，虽然在此提供单克隆抗体和多克隆抗体的实例，但这类单克隆抗体和多克隆抗体的片段、和/或包含它们的替代支架和/或轭合物和/或免疫轭合物也可以任选地被包括作为这类实施例的一部分。
根据本发明的至少一些实施例，抗C1ORF32抗体、其片段、轭合物和/或包含它们的药用组合物还可以以组合疗法给予，即与其他增效剂和/或疗法相组合，例如与癌症治疗护理标准领域中已知的任何疗法(如可以在例如http://www.cancer.gov/cancertopics中找到)相组合。
根据至少一些非限制性实施例，可以任选地与一种增效剂组合向受试者给予该抗体或片段以获得一种治疗性作用，其中所述增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、增强抗肿瘤免疫应答的常规/经典化学疗法、增强抗肿瘤免疫应答的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激抗体、治疗性癌症疫苗、过继性细胞转移。
任选地，常规/经典化学治疗剂选自吉西他滨、奥沙利铂、顺铂、卡铂(和其他基于铂的化合物)、环磷酰胺、蒽环类(如阿霉素、柔红霉素)、紫杉烷类(如紫杉醇、多西他赛)、微管抑制剂(如长春新碱)、叶酸拮抗剂(如甲氨蝶呤)、mTOR途径抑制剂(如坦罗莫司和雷帕霉素)、奥沙利铂、环磷酰胺、阿霉素、以及米托恩醌。
任选地，靶向疗法试剂选自组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂(如伏立诺他、丁酸钠以及MS-275)、硼替佐米、威罗菲尼、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)(如埃罗替尼、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼)、治疗性单克隆抗体(如抗EGFR mAb西妥昔单抗、anatimumab、曲妥珠单抗)。
任选地，靶向免疫抑制细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自抗有丝分裂药物(如环磷酰胺、吉西他滨、米托恩醌、氟达拉滨、沙立度胺、以及沙立度胺衍生物)、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体直接靶向Treg的消减性抗体或杀伤性抗体(如抗-CD25达利珠单抗和巴利昔单抗)、配体定向毒素(如地尼白介素-毒素连接物(Ontak)：人IL-2和白喉毒素的一种融合蛋白、或LMB-2：一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的融合体)、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径的试剂(如外核苷酸酶抑制剂或A2A腺苷受体的抑制剂)、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂(像西地那非)、ROS抑制剂(如硝基阿司匹林)。
任选地，免疫刺激抗体选自靶向免疫检查点的拮抗性抗体如CTLA4(实例：伊匹单抗)、PD-1(实例：BMS-936558/MDX-1106)、PDL-1(实例：BMS-936559/MDX-1105)、LAG-3(实例：IMP-321)、TIM-3、BTLA和/或靶向免疫刺激蛋白质的激动性抗体如CD40(实例：CP-870、893)、CD137(实例：BMS-663513)、OX40(实例：抗-OX40)、GITR(实例：TRX518)。
任选地，治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗(包括用于发动针对一种肿瘤抗原的免疫原性应答的蛋白质或肽、编码肿瘤抗原的重组病毒以及细菌载体、编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗、靶向树突状细胞的蛋白质、树突状细胞。
任选地，治疗性癌症疫苗包括基于树突状细胞的疫苗。
附图简要说明
图1呈现使用来自免疫的兔血清和免疫前兔血清(1:250)的测试血液，对与小鼠IgG2a蛋白融合的C1ORF32的细胞外结构域(C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a-融合蛋白)(SEQ ID NO:4)的蛋白质印迹分析结果。这些结果证明特异性抗C1ORF32抗体(来自免疫的兔#R1(R7531)、R2(R7532)、R4(R7534)的血清)识别出在预期的条带大小(约50kDa)处的重组C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a-融合蛋白(SEQ ID NO:4)，而来自免疫的兔R3的血清未检测到任何特异性信号。图标符号：泳道1表示R1(R7531)免疫的血清；泳道2表示R1(R7531)免疫前血清；泳道3表示R2(R7532)免疫前血清；泳道4表示R2(R7532)免疫的血清；泳道5表示R3(R7533)免疫前血清；泳道6表示R3(R7533)免疫的血清；泳道7表示R4(R7534)免疫前血清；并且泳道8表示R4(R7534)免疫的血清。
图2证明使用亲和力纯化的pAb R7531抗体，对C1ORF32转染的HEK293T细胞的重组池的蛋白质印迹分析。该图呈现使用抗C1ORF32pAbs R7531(2ug/ml)，用空载体(泳道1)、人-C1ORF32(SEQ ID NO:1)(泳道2)、HA标记的人-C1ORF32(SEQ ID NO:22)(泳道3)、小鼠-人嵌合C1ORF32(SEQ ID NO:8)(泳道4)、Flag标记的小鼠-C1ORF32(SEQID NO:21)(泳道5)转染的HEK293T池的30μg溶解产物的蛋白质印迹分析。与作为阴性对照的稳定HEK293T池的全细胞提取物形成对照，在不同的HEK293T-C1ORF32-转染的细胞中检测到对应于约30kDa人C1OFR32(SEQ ID NO:1)或对于Flag标记的小鼠-C1ORF32(SEQ ID NO:21)来说约70kDa的预期大小的条带。在所有细胞系中在更高分子量处没有观察到特异性条带。
图3证明与(图3B)HEK293T细胞相比，表达人C1ORF32蛋白(SEQID NO:1)的(图3A)重组HEK293T细胞中对C1ORF32特异的多克隆抗体(R7531、R7532、R7534)的流式细胞术分析。非相关的兔IgG(西格玛(Sigma)，目录号I5006)用作一个阴性对照。这些结果证明使用抗C1ORF32抗体，C1ORF32的细胞表面表达。
图4呈现使用抗C1ORF32单克隆抗体5159-1(2μg/ml)，表达C1ORF32蛋白的HEK293T细胞的蛋白质印迹分析。该图证明用以下各物转染的HEK293T池的全细胞溶解产物的蛋白质印迹分析：空载体(阴性对照细胞)(泳道1)、人-C1ORF32(SEQ ID NO:1)表达细胞(泳道2)、HA标记的人-C1ORF32(SEQ ID NO:22)表达细胞(泳道3)、小鼠-人嵌合C1ORF32(SEQ ID NO:8)表达细胞(泳道4)、Flag标记的小鼠-C1ORF32(SEQ IDNO:21)表达细胞(泳道5)。与用pIRES-puro3空载体(泳道1)转染的稳定HEK293T池的全细胞提取物形成对照，检测到对于人-C1ORF32(泳道2)和HA标记的人-C1ORF32(泳道3)来说，对应于约30kDa的特异性条带。在小鼠-人嵌合C1ORF32(SEQ ID NO:8)(泳道4)中观察到低信号，并且在小鼠-C1ORF32-Flag(SEQ ID NO:21)表达细胞中未检测到信号。
图5证明与非相关的IgG1对照抗头孢菌素相比，使用小鼠单克隆抗C1ORF32抗体(20μg/ml)、随后1:250稀释的驴抗小鼠IgG DyLight549轭合的第二Ab，不同C1ORF32蛋白的膜表达。图5A呈现空载体转染的细胞；图5B呈现人-C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:1)；图5C呈现HA标记的人-C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:22)；图5D呈现嵌合小鼠-人C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:8)；图5E呈现小鼠C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:21)。
图6呈现使用抗C1ORF32单克隆抗体5159-1和作为不相关的Ab阴性对照的小鼠抗-头孢菌素，表达人C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的重组CHO-K1细胞或用空载体pIRESpuro3转染的稳定池细胞的FACS分析。
图7证明与用空载体pIRESpuro3转染的CHO-K1稳定池细胞相比，在表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)的CHO-K1重组细胞中，单克隆抗C1ORF32抗体5166-2(左)和5166-9(右)与人C1ORF32蛋白的结合。小鼠抗头孢菌素和正常小鼠血清用作阴性对照。
图8呈现小细胞肺癌中C1ORF32的阳性免疫浸润细胞染色。癌细胞的免疫反应性较低，但浸润肿瘤的巨噬细胞显示出C1ORF32的高阳性(箭头)。
图9：呈现评价在HEK293T细胞上表达的C1ORF32对Jurkat细胞的活化的作用的实验设置的示意性图解。
图10：证明在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制Jurkat细胞活化。将表达C1ORF32或pRp载体的25K(图10A)或50K(图10B)HEK293T细胞与Jurkat细胞(50K每孔)共培养并且通过流式细胞术针对CD69的表达进行分析。CD69的ΔMFI值在(图10C)中示出。
图11证明在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制用抗CD3-UCHT克隆活化的Jurkat细胞。将表达C1ORF32或pRp载体的25K(图11A)或50K(图11B)HEK293T细胞与Jurkat细胞(50K每孔)一起孵育过夜，并且通过流式细胞术针对CD69的表达进行分析。CD69的ΔMFI值在(图11C)中示出。
图12证明在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制用抗CD3和抗CD28活化的Jurkat细胞。将通过板结合的抗CD3(0.1或0.25μg/ml)(图12A)或板结合的抗CD3(0.1或0.25μg/ml)加可溶性抗CD28(图12B)活化的Jurkat细胞孵育过夜，并且通过流式细胞术针对CD69的表达进行分析。图12C呈现以25、50或100K每孔的浓度接种于用0.1或0.25抗-CD3(OKT克隆)涂覆的孔中的、与50K Jurkat细胞一起孵育过夜的、表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的HEK293T细胞。通过流式细胞术针对CD69的表达对Jurkat细胞进行分析。示出ΔMFI值。图12D呈现以50K每孔的浓度接种于用0.1或0.25抗-CD3(OKT克隆)涂覆的孔中的、在有或无2μg/ml可溶性抗CD28的情况下与50K Jurkat细胞一起孵育过夜的、表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的HEK293T细胞。通过流式细胞术针对CD69的表达对Jurkat细胞进行分析。示出ΔMFI值。
图13证明在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制Jurkat细胞活化。图13A或图13C呈现分别与50K Jurkat细胞一起孵育7.5小时或过夜的、表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的25K HEK293T细胞的结果。图13B或图13D呈现分别与50K Jurkat细胞一起孵育7.5小时或过夜的表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的50K HEK293T细胞的结果。通过流式细胞术针对CD69的表达对细胞进行分析。示出CD69的ΔMFI值。
图14示出与静止和活化的小鼠T细胞的C1ORF32(SEQ ID NO:24)结合曲线。在可溶性抗-CD28(2μg/ml)存在下，将小鼠CD4+CD25-CD4T细胞保持“未活化”或用固定的抗-CD3(2μg/ml)刺激。在48小时之后，在用于封闭Fcγ-受体的小鼠抗-CD16/32的存在下，将抗-CD3/28刺激的CD4细胞用生物素化的C1ORF32H:M(N278A；无糖基化的)(SEQ IDNO:38)或同种型对照(生物素化的小鼠IgG2a；Biolegend公司)，接着用链霉亲和素-PE进行染色。
图15示出C1ORF32(SEQ ID NO:1)的异位表达在TCR刺激时抑制小鼠CD4T细胞分裂。图15A呈现在1:4或1:2HEK-293:CD4比率下在表达C1ORF32T(蓝色)或空载体(灰色)的HEK-293转染株存在下，用CFSE标记的并且用板结合的抗-CD3(0.5μg/ml)刺激的小鼠CD4+CD25-T细胞(1×105)的流式细胞术结果。百分比是指已经分裂两次以上的细胞的分率。图15B呈现指示已经分裂两次以上的细胞的百分比(平均值±SD)的直方图(*P值<0.05，P值<0.001，学生t检验)。
图16呈现使用识别C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1和17)的细胞外结构域的一种特异性多克隆抗体(rb-抗-7531)，在表达空载体、SEQ ID NO:17以及SEQ ID NO:1的刺激细胞上进行的FACS分析，以便评估这些蛋白质的膜表达水平。
图17呈现响应于表达SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:17C1ORF32分子，作为对照的空载体、已知共刺激分子或已知共抑制分子的刺激细胞，大量(Bulk)T细胞增殖的结果。所示的是6个实验的平均值+/-SEM。**p<0.01和#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
图18呈现响应于表达空载体或表达表达不同的C1ORF32分子、共刺激分子或共抑制分子的载体的刺激细胞，T细胞(CD4+)增殖的结果。所示的是3个实验的平均值+/-SEM。*p<0.05、**p<0.01以及#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
图19呈现响应于表达空载体或表达表达不同的C1ORF32分子、共刺激分子或共抑制分子的载体的刺激细胞，T细胞(CD8+)增殖的结果。所示的是3个实验的平均值+/-SEM。**p<0.01、***p<0.001以及#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
图20呈现响应于表达空载体或表达表达不同的C1ORF32分子、共刺激分子或共抑制分子的载体的刺激细胞，T细胞(天然CD4+CD45RA+)增殖的结果。**p<0.01和***p<0.001(学生T检验)表示与空载体相比显著不同的结果。
图21呈现响应于表达不同的C1ORF32分子，或作为对照的共刺激分子、共抑制分子或空载体的刺激细胞，T细胞(大量(Bulk))增殖(A)和细胞因子分泌(B-G)的结果。细胞因子数据表示来自从一式三个的孔池化的SN的一式三个的测量值。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、以及#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
图22呈现使用识别C1ORF32的细胞外结构域的一种特异性单克隆抗体(5159-1)，在C1ORF32转导的黑色素瘤细胞(mel526、mel624.38以及SK-mel23)上进行的FACS分析，以便评估这些蛋白质的膜表达水平。
图23呈现使用识别转导的特异性TCR的细胞外结构域的一种特异性单克隆抗体(5159-1)，对TCR F4转导的刺激的CD8+细胞(CTL)进行的FACS分析，以便评估这种特异性TCR的膜表达水平。
图24证明在SK-mel23黑色素瘤细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)在共培养测定中抑制F4TCR表达CTL的活化，如通过减少的IFNγ分泌所观察到的。该图表示使用来自用F4TCR转导的四个不同供体的CTL的四个独立的实验。在mel624.38黑色素瘤细胞上表达的C1ORF32还抑制CTL活化，但这种作用未达到统计显著性。在mel526黑色素瘤细胞上表达的C1ORF32不抑制CTL活化，*p<0.01。
图25示出通过C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:18)诱导的Treg分化。天然CD4+T细胞在促进iTreg细胞的条件和对照Ig(10μg/ml)抑或C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:18)(1或3μg/ml)存在下、在辐射处理的Balb/c脾细胞(以1:1比率；5×105T细胞每孔)和OVA323-339肽(20μg/ml)存在下活化。通过流式细胞术在4天培养之后针对Treg标记物FoxP3的表达对细胞进行分析。
图26示出与原代活化的和新鲜分离的NK细胞的C1ORF32(SEQ IDNO:24)结合。将来自三个不同供体的人NK原代细胞系(图26A)或来自三个其他供体的新鲜分离的NK细胞(图26B)与5μg未标记的C1ORF32(SEQ ID NO:24)或对照同种型mIgG2a一起进行孵育。灰色直方图是mIgG2a，红色或黑色直方图是C1ORF32。
图27证明HEK293T细胞上的C1ORF32(SEQ ID NO:1)表达导致HEK293T对被NK细胞杀伤的敏感性的微小减少。Y轴呈现杀伤的百分比。X轴呈现效应子与靶(E:T)比率。*指代p值<0.05。
图28证明5166-9抗C1ORF32抗体显示出针对表达C1ORF32的HEK293的有效CDC活性。将HEK293细胞系与5166-9或对照同种型mIgM在补体存在下进行孵育并且在1小时之后测量存活力。
图29证明5166-9抗C1ORF32抗体显示出针对表达C1ORF32的CHOK1细胞的CDC活性。将CHOK1细胞系与5166-9或对照同种型mIgM在补体存在下进行孵育并且在1小时之后测量存活力。
图30呈现与CHOK1相比，HEK293T细胞上的C1ORF32表达。基于使用一种C1ORF32抗体5159-1对C1ORF32的检测，与CHOK1C1ORF32相比，HEK293C1ORF32细胞表达更多靶抗原。
发明详细说明
在至少一些实施例中，本发明涉及多克隆抗体和单克隆抗体以及其片段和/或轭合物、和/或包含它们的药用组合物、和/或包含它们的诊断组合物，其中这些抗体特异性地结合C1ORF32蛋白，并且其中所述抗体适于用作治疗剂和/或诊断剂(特别是用于治疗和/或诊断癌症)，这些抗体特别是人、人源化或嵌合单克隆抗体，包括促进或抑制由C1ORF32引出的活性的那些。
不希望受一个封闭的列表或一种单一假设限制，根据本发明的不同实施例的抗体可以任选地具有一种或多种以下特性。这种中和抗体可以任选地促进Th2向Th1移动，从而潜在地使朝向在肿瘤微环境中所诱导的一种Th2/M2环境的移动回复，该Th2/M2环境减少对肿瘤的免疫应答。该抗体因此可以任选地促进针对肿瘤起作用的免疫系统组分(Th1)，同时抑制促进癌症的组分(Th2)。
根据本发明的至少一些实施例，这种抗体可以任选地抑制iTreg积聚和免疫抑制功能、和/或增强效应T细胞活性。
如在此使用的术语“癌症”应该被理解为涵盖任何赘生性疾病(无论是侵袭性的还是转移性的)，这种赘生性疾病的特征在于导致恶性生长或肿瘤的异常的并且不受控的细胞分裂，该赘生性疾病的非限制性实例在此进行了描述。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体来源于特定重链和轻链种系序列和/或包含具体结构特征，如包含具体氨基酸序列的至少一个CDR区。根据至少一些实施例，本发明提供分离的抗体、制作这类抗体的方法、包含这类抗体的免疫轭合物和双特异性分子、以及根据本发明的至少一些实施例含有这些抗体、免疫轭合物、替代支架或双特异性分子的药用组合物和诊断组合物。
根据至少一些实施例，本发明涉及使用这些抗体及其片段来检测C1ORF32蛋白中的任一种的体外和体内方法。
根据至少一些实施例，本发明进一步涉及使用以上抗体及其片段和/或轭合物、和/或包含它们的药用组合物来治疗癌症的方法，如在此所描述。C1ORF32蛋白披露于与本申请共同被拥有的PCT申请号WO/2009/032845和WO/2012/001647中，这些PCT申请特此通过引用而结合，就如同完全在此阐明一样。这些申请证明与小鼠IgG2a融合的C1ORF32分子的ECD序列抑制由抗CD3和抗-CD28诱导的人与小鼠T细胞活化、细胞因子分泌。C1ORF32融合蛋白还抑制Th1活化，同时诱导Th2，从而暗示C1ORF32在T细胞生物学而不是T细胞的整体抑制中具有特异性作用。融合蛋白改善多发性硬化小鼠模型(EAE模型)和类风湿关节炎(CIA)模型中的疾病症状，从而证明C1ORF32在免疫调节中具有重要作用。WO/2012/001647申请证明了C1ORF32免疫调节功能，并且具体地说证明了其在不同实验系统(包括体外研究、离体研究以及体内研究)中对T细胞活化的抑制活性。总而言之，这些结果指示C1ORF32(其是负向共刺激因子的B7/CD28家族成员)是一种新颖的免疫检查点。
WO 2009/032845披露C1ORF32特异性抗体潜在地适用作治疗剂和/或诊断剂(体外诊断方法与体内诊断方法二者)。特别包括的是免疫活化或免疫抑制性抗体和片段，如经由ADCC(抗体依赖性细胞毒性)或CDC(补体依赖性细胞毒性)活性靶向细胞的抗体或片段，这些抗体和片段特别是用于治疗其中C1ORF32抗原有差别地表达的病状，包括不同癌症和恶性肿瘤。
在本发明的至少一些实施例中，C1ORF32被发现涉及在iTreg诱导和分化中。不希望受单一假设限制，对C1ORF32特异的封闭性单克隆抗体被发现抑制iTreg积聚和免疫抑制功能，并且增强效应T细胞活性。因此，C1ORF32封闭性抗体任选地并且优选地单独地或与一种或多种增效剂相组合应用于癌症免疫疗法，该一种或多种增效剂增加内源性抗肿瘤应答。
此外，已经出人意料地发现，根据本发明的不同实施例的抗体特别适用于治疗如在此所描述的特定癌症。
为了使本发明可更容易理解，首先定义某些术语。另外的定义贯穿详细说明而阐明。
“免疫细胞”是指来自造血源的任何细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、单核细胞、树突状细胞、以及巨噬细胞。
如在此使用，术语“多肽”是指一个任意长度的氨基酸链，无论是否被修饰(例如，磷酸化或糖基化)。
如在此使用，“共刺激多肽”或“共刺激分子”是一种一旦与T细胞上的细胞表面分子相互作用便调节T细胞应答的多肽。
如在此所用，“共刺激信号传导”是在抗原特异性T细胞应答过程中，来源于抗原呈递细胞上的共刺激多肽与T细胞上的其受体之间的相互作用的信号传导活性。不希望受单一假设限制，该抗原特异性T细胞应答据信由两种信号介导：1)在MHC的背景下呈现的T细胞受体(TCR)与抗原肽的接合(信号1)，和2)通过不同共刺激受体/配体对之间的接触递送的一个第二抗原独立性信号(信号2)。不希望受单一假设限制，这个“第二信号”在决定T细胞应答的类型(活化与抑制)以及该应答的强度和持续时间中是关键的，并且该“第二信号”由来自共刺激分子(如B7蛋白家族)的正信号和负信号两者调节。
如在此所用，术语“B7”多肽是指共刺激T细胞的B7蛋白家族的一个成员，包括但不限于：B7-1、B7-2、B7-DC、B7-H5、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H6、B7-S3以及其生物活性片段和/或变体。代表性生物活性片段包括会共刺激T细胞的细胞外结构域或细胞外结构域的片段。
如在此所用，术语C1ORF32是指以下各物：在SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的任一种中列出的蛋白质中的任一种、和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:14、10、11、15中的任一种，和/或其变体、和/或其直向同源物和/或片段、和/或编码它们的核酸序列，它们在癌症中、在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中有差别地表达。
如在此使用，术语“免疫学的(immunologic)”、“免疫学的(immunological)”或“免疫”应答是针对受者患者中的肽的有益的体液(抗体介导的)和/或细胞(由抗原特异性T细胞或其分泌产物介导的)应答的发展。这种应答可为通过给予免疫原来诱导的主动应答或通过给予抗体或引发的T-细胞来诱导的被动应答。不希望受单一假设限制，细胞免疫应答是通过结合II类MHC分子或I类MHC分子来呈递多肽表位以便分别活化抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞来引出的。该应答还可以涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱性粒细胞、树突状细胞、星形细胞、小神经胶质细胞、嗜酸性粒细胞的活化，嗜中性粒细胞或先天性免疫的其他组分的活化或募集。细胞介导的免疫应答的存在可以通过增殖测定(CD4+T细胞)或CTL(细胞毒性T淋巴细胞)测定来确定。体液和细胞应答对于免疫原的保护或治疗作用的相对贡献可以通过单独地将抗体以及T-细胞从免疫接种的同系动物中分离并且测量在第二受试者中的保护或治疗作用来区分。
“免疫原性试剂”或“免疫原”能够在给予至一个哺乳动物时诱导针对其自身的免疫应答，可任选地连同一种佐剂。
如在此所指的术语“抗体”包括全多克隆抗体和单克隆抗体以及其任何抗原结合片段(即，“抗原结合部分”)或单链。“抗体”是指包含由二硫键互相连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白、或其抗原结合部分。每个重链包括至少一个重链可变区(在此缩写为VH)和一个重链恒定区。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2以及CH3。每个轻链包括至少一个轻链可变区(在此缩写为VL)和一个轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域，CL。VH和VL区可以被进一步细分为散布有更保守区(被命名为构架区(FR))的高变异度区(被命名为互补性决定区(CDR))。每个VH和VL包括三个CDR和四个FR，按以下顺序从氨基末端排到羧基末端：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的一个结合结构域。这些抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体系统的第一组分(Clq)。
如在此使用，术语一个抗体的“抗原结合部分”(或简单地“抗体部分”)是指保留了特异性结合一种抗原(例如，C1ORF32分子，和/或其片段)的能力的一个抗体的一个或多个片段。已经示出抗体的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来执行。涵盖在术语一个抗体的“抗原结合部分”内的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，一个由V轻结构域、V重结构域、恒定轻(CL)结构域以及CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab').2片段，一个在铰链区包括由二硫桥键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)Fd片段，它由VH结构域和CH1结构域组成；(iv)Fv片段，它由一种抗体的一个单臂的VL结构域和VH结构域组成；(v)dAb片段(华德(Ward)等人，(1989)自然(Nature)341:544-546)，它由VH结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是它们可以使用重组方法经由一个合成接头来接合，这个合成接头使它们能够被制作为一个单一的蛋白链，其中VL区和VH区组成一对以形成单价分子(被称为单链Fv(scFv)；参见例如，博尔德(Bird)等人(1988)科学(Science)242:423-426；以及休斯顿(Huston)等人(1988)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883)。这类单链抗体还旨在涵盖在术语一个抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体片段是使用本领域普通技术人员所知的常规技术来获得的，并且以和完整抗体相同的方式针对效用对这些片段进行筛选。
如在此所用，“分离的抗体”旨在是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，分别特异性结合C1ORF32蛋白和/或其片段，并且基本上不含特异性结合除了C1ORF32之外的抗原的抗体)。然而，特异性结合C1ORF32蛋白的分离的抗体可以分别与其他抗原具有交叉反应性，如来自其他物种的C1ORF32分子。此外，分离的抗体可基本上上不含其他细胞材料和/或化学品。
如在此使用，术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”是指一种单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物针对具体表位展示出单一结合特异性和结合亲和性。
如在此使用，术语“人抗体”旨在包括具有可变区的抗体，其中构架区和CDR区两者都来源于人种系免疫球蛋白序列。此外，如果该抗体包含一个恒定区，那么该恒定区也来源于人种系免疫球蛋白序列。根据本发明的至少一些实施例的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过在体外随机诱变或位点特异性诱变或通过在体内体细胞突变来引入的突变)。然而，如在此使用，术语“人抗体”不旨在包括其中来源于另一个哺乳动物物种(如小鼠)的种系的CDR序列已经被移植到人构架序列上的抗体。
术语“人单克隆抗体”是指具有可变区、展示出单一结合特异性的抗体，其中构架区和CDR区两者都来源于人种系免疫球蛋白序列。在一个实施例中，人单克隆抗体是由一种杂交瘤产生的，该杂交瘤包括从转基因非人类动物(例如转基因小鼠)获得的B细胞，该细胞融合至无限增殖化细胞、具有一个包括人重链转基因和轻链转基因的基因组。
如在此使用，术语“重组人抗体”包括通过重组手段制备、表达、产生或分离的所有人抗体，如(a)从一种动物(例如，小鼠)分离的抗体，这种动物对于人免疫球蛋白基因是转基因的或转染色体的，或自该动物制备的杂交瘤(下面进一步描述)；(b)从被转化以表达人抗体的宿主细胞(例如，从转染瘤)分离的抗体；(c)从重组、组合人抗体文库分离的抗体；以及(d)通过任何其他手段制备、表达、产生或分离的抗体，这些手段涉及将人免疫球蛋白基因序列剪接至其他DNA序列。这类重组人抗体具有可变区，其中构架区和CDR区来源于人种系免疫球蛋白序列。然而，在某些实施例中，这类重组人抗体可以经受体外诱变(或，当使用针对人Ig序列转基因的动物时，体内体细胞诱变)，并且因此对这些重组抗体的VH区和VL区的氨基酸序列是这样的序列，这些序列虽然来源于并且与人种系VH序列和VL序列相关，但在体内人抗体种系组库中可以不天然地存在。
如在此所用，“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如，IgM或IgG1)。
短语“识别抗原的抗体”和“抗原特异性抗体”与术语“特异性结合抗原的抗体”在此是可互换使用的。
如在此所用，“与人C1ORF32蛋白特异性地结合”的抗体旨在是指与C1ORF32蛋白结合的抗体，优选地具有5×10-8M或更小、更优选3×10-8M或更小、甚至更优选1×10-9M或更小、甚至更优选1×10-10M、甚至更优选1×10-11M并且甚至更优选1×10-12M或更小的KD的抗体。
如在此使用，术语“K-assoc”或“Ka”旨在指一个具体抗体-抗原相互作用的结合速率；而如在此使用，术语“Kdiss”或“Kd”旨在指一个具体抗体-抗原相互作用的离解速率。如在此使用，术语“KD”旨在指离解常数，它获得自Kd与Ka的比值(即，Kd/Ka)并且被表示为摩尔浓度(M)。抗体的KD值可以使用本领域完善建立的方法来确定。用于确定抗体的KD值的一种优选方法是通过使用表面等离子体共振，优选地使用一个生物传感器系统，如系统。
如在此所用，术语一种IgG抗体的“高亲和性”是指针对一个靶抗原具有10-8M或更小、更优选10-9M或更小并且甚至更优选10-10M或更小的KD的抗体。然而，对于其他抗体同种型，“高亲和性”结合可以发生变化。例如，对于IgM同种型，“高亲和性”结合是指具有10-7M或更小、更优选10-8M或更小的KD的抗体。
如在此所用，术语“受试者”或“患者”包括任何人类或非人类动物。术语“非人类动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，如非人灵长类、绵羊、狗、猫、马、牛、鸡、两栖动物、爬行动物等。
如在此所用，术语“疫苗”是指改善对一种具体疾病的免疫性的一种生物制剂，其中该疫苗包括一种抗原，如削弱形式或杀伤形式的病原体、其毒素或其表面蛋白之一，针对它们引出免疫应答。一种疫苗典型地包括作为免疫增强剂来刺激免疫系统的一种佐剂。如在此所用，术语“治疗性疫苗”和/或“治疗性疫苗接种”是指一种用于治疗持续性疾病(如传染性疾病或癌症)的疫苗。
如在此所用，术语“佐剂”是指用于刺激免疫系统并且增加对一种疫苗的应答、而本身不具有任何特异性抗原作用的一种试剂。
本发明的不同方面在以下小节中进一步详细描述。
抗C1ORF32抗体
根据本发明的至少一些实施例的抗体(包括具有具体种系序列的那些)，同源抗体、具有保守修饰的抗体、工程化并且修饰的抗体，特征在于这些抗体的具体功能特征或特性。例如，这些抗体与人C1ORF32特异性地结合。优选地，根据本发明的至少一些实施例的抗体以高亲和性，例如以10-8M或更小或10-9M或更小或甚至10-10M或更小的KD与相应的C1ORF32结合。根据本发明的至少一些实施例的C1ORF32特异性抗体优选地展示出一种或多种以下特征：
(i)以5×10-8M或更小的KD与相应的人C1ORF32结合，例如任选地如在此所描述；
(ii)调节(增强或抑制)免疫共刺激以及相关活性和功能，这样的T细胞应答涉及在抗肿瘤免疫和自身免疫中；
(iii)与由癌细胞表达的C1ORF32抗原结合，但基本上不与正常细胞结合；
(iv)增加T细胞增殖；
(v)增加由T细胞产生的干扰素-γ；
(vi)增加IL-2分泌；
(vii)增加Th1应答；
(e)减少Th2应答
(f)刺激抗原特异性记忆应答；
(g)刺激抗体应答；和/或
(h)抑制体内癌细胞生长，
其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌，优选甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌(优选地II期和III期)、偶发性乳头状癌(IPC)、甲状腺髓样癌、甲状腺间变性癌；鳞状细胞癌，食道鳞状细胞癌；乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)；卵巢癌，乳头状浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；肾癌，透明细胞癌(优选地I期至II期)、嫌色细胞腺瘤、肉瘤样癌；前列腺腺癌(优选地I期至III期)，良性前列腺增生；肝细胞癌(优选地II期和III期)，恶性肝细胞瘤、纤维板层癌、假腺样(腺样)癌、多形性(巨细胞)癌、以及透明细胞HCC和胆管癌；胰腺癌，导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤；恶性黑色素瘤，优选IV期恶性黑色素瘤和/或以下中的一种或多种：恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤以及软组织黑色素瘤；骨肉瘤、软骨肉瘤以及软组织肉瘤，包括但不限于成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤以及神经纤维肉瘤；淋巴瘤，优选地包括霍奇金氏淋巴瘤(结节硬化型、混合细胞亚型、富含淋巴细胞或淋巴细胞优势型、淋巴细胞消减型、以及未指定型)、B细胞淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病)、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤(结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤：塞扎莱综合征和蕈样真菌病、渐变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤)；子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)；膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)；肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌；睾丸精原细胞瘤；结肠直肠癌，优选地包括结肠和直肠腺癌(优选地中度至不良分化的)；以及脊髓肿瘤。
另外，优选地，这些抗体和/或其轭合物在引出选择性杀伤这类癌细胞并且对调节自身免疫和癌症中涉及的免疫应答中是有效的。
用于评价这些抗体对C1ORF32的结合能力的标准测定在本领域是已知的，包括例如ELISA、蛋白质印迹以及RIA。适合的测定详细地描述于实例中。这些抗体的结合动力学(例如，结合亲和性)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，如通过Biacore分析。
一旦产生C1ORF32特异性抗体，来自抗体的序列可以与C1ORF32结合，VH和VL序列可以被“混合并且匹配”以产生根据本发明的至少一些实施例的其他抗C1ORF32结合分子。这类“混合并且匹配”的抗体的C1ORF32结合可以使用以上所描述的结合测定(例如，ELISA)来进行测试。优选地，当VH和VL链混合并且匹配时，来自一个具体VH/VL配对的VH序列被一个结构类似的VH序列所替代。同样，优选地，来自一个具体VH/VL配对的VL序列被一个结构类似的VL序列所替代。例如，同源抗体的VH和VL序列是特别适合用于混合和匹配的。
具有具体种系序列的抗体
在某些实施例中，本发明的抗体包含来自具体种系重链免疫球蛋白基因的一个重链可变区和/或来自具体种系轻链免疫球蛋白基因的一个轻链可变区。
如在此使用，如果一个抗体的可变区是从使用人种系免疫球蛋白基因的系统获得的，那么这种人抗体包含作为具体种系序列的“产物”的或自其“起源的”重链或轻链可变区。此类系统包括用感兴趣的抗原对携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠进行免疫，或用感兴趣的抗原对噬菌体上展示的人免疫球蛋白基因库进行筛选。作为人类种系免疫球蛋白序列的“产物”的或自其“起源的”人类抗体可以像这样进行鉴定，通过将人抗体的氨基酸序列与人种系免疫球蛋白的氨基酸序列进行比较，并且选择与该人抗体的序列在序列上最接近的(即，最大一致性％)的人类种系免疫球蛋白序列。
作为具体人种系免疫球蛋白序列的“产物”的或自其“起源的”人抗体可以包含与种系序列相比的氨基酸差异，例如由于天然发生的体细胞突变或位点定向突变的刻意引入而导致的氨基酸差异。然而，选择的人抗体与由人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上典型地是至少90％一致的，并且当与其他物种的种系免疫球蛋白氨基酸序列(例如，鼠科种系序列)相比时，包含鉴定该人抗体是人的氨基酸残基。在某些情况下，人抗体与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列在氨基酸序列上可以是至少95％、96％、97％、98％、或99％一致的。典型地，来源于具体人种系序列的人抗体将展示出与由该人种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于10个氨基酸的差异。在某些情况下，这种人抗体可以展示出与由该种系免疫球蛋白基因编码的氨基酸序列不多于5个，或甚至不多于4个、3个、2个、或1个氨基酸的差异。
同源抗体
在仍另一个实施例中，本发明的抗体包含重链可变区和轻链可变区，该重链可变区和轻链可变区分别包含与优选的抗-C1ORF32抗体的分离的抗-C1ORF32氨基酸序列同源的氨基酸序列，其中这些抗体保留母体抗-C1ORF32抗体的所希望的功能特性。
如在此使用，两种氨基酸序列之间的百分比同源性等于这两种序列之间的百分比一致性。考虑了缺口的数目以及每个缺口的长度(在这两种序列的优化比对中需要引它们)，这两种序列之间的百分比一致性是由这些序列共享的相同位置的数目的函数(即，同源性％＝相同位置的数目#/位置的总数目#×100)。序列的比较和两种序列之间的百分比一致性的确定可以使用数学算法来完成，如下面非限制性实例中所描述。
使用PAM120权重残基表，缺口长度罚分12以及缺口罚分4，两种氨基酸序列之间的百分比一致性可以使用E·迈耶斯(E.Meyers)和W·米勒(W.Miller)(计算机在生物科学中的应用(Comput.Appl.Biosci.)4:11-17(1988))算法来确定，这种算法已经被合并到ALIGN程序(2.0版)中。另外，使用Blossum62矩阵或PAM250矩阵，和缺口权重16、14、12、10、8、6、或4以及长度权重1、2、3、4、5、或6，两种氨基酸序列之间的百分比一致性可以使用尼德曼(Needleman)和翁施(Wunsch)(分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)48:444-453(1970))算法来确定，这种算法已经被合并到GCG软件包(可商购的)中的GAP程序中。
另外的或可替代地，本发明的蛋白序列可以被进一步用作“查询序列”以进行针对公共数据库的检索，以例如鉴定相关序列。这类检索可以使用阿尔丘尔(Altschul)等人(1990)分子生物学杂志215:403-10的XBLAST程序(2.0版)来进行。BLAST蛋白检索可以用XBLAST程序(得分＝50、字长＝3)来进行以获得与根据本发明的至少一些实施例的抗体分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目标的有缺口的比对，可以利用如在阿尔丘尔等人(1997)核酸研究(Nucleic Acids Res.)25(17):3389-3402中所描述的有缺口的BLAST。当利用BLAST和有缺口的BLAST程序时，可以使用对应程序(例如，XBLAST和NBLAST)的默认参数。
具有保守修饰的抗体
在某些实施例中，本发明的抗体包含一个重链可变区(包含CDRl序列、CDR2序列以及CDR3序列)和一个轻链可变区(包含CDRl序列、CDR2序列以及CDR3序列)，其中这些CDR序列中的一个或多个包含基于使用在此的方法分离和产生的优选的抗-C1ORF32抗体的指定的氨基酸序列，或其保守修饰，并且其中这些抗体分别保留根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体的所希望的功能特性。
在不同实施例中，抗-C1ORF32抗体可以是例如人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
如在此使用，术语“保守序列修饰”旨在指不显著地影响或改变包含该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这类保守修饰包括氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术(如位点定向诱变和PCR-介导的诱变)来向根据本发明的至少一些实施例的抗体中引入修饰。保守氨基酸取代是其中的氨基酸残基被具有类似侧链的一个氨基酸残基替代的取代。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有以下的氨基酸：碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，β支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，根据本发明的至少一些实施例的抗体的CDR区内的1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其他氨基酸残基替代，并且可以使用在此所描述的功能性测定针对保留的功能(即，上面在(c)至(j)中所阐明的功能)对这个改变的抗体进行测试。此外计算机程序可供用于进行这些和其他同步优化，如在本领域中熟知的。
在一些实施例中，仅进行一个取代。在一些实施例中，进行2至3个取代。在一些实施例中，进行4至6个取代。在仍其他实施例中，进行7至10个取代。
与根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32结合相同表位的抗体。
在另一个实施例中，本发明提供了与人C1ORF32上的优选表位结合的抗体，这些抗体拥有所希望的功能特性，如B7共刺激的调节和相关功能。可以选择具有所希望的表位特异性的其他抗体，并且对于与C1ORF32抗原结合，它们将具有与所希望的抗体交叉竞争的能力。
工程化并且修饰的抗体
根据本发明的至少一些实施例的抗体可以进一步使用具有来源于抗-C1ORF32抗体起始材料的一个或多个VH和/或VL序列的抗体以工程化一个修饰的抗体来进行制备，这个修饰的抗体可以具有从起始抗体改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即，VH和/或VL)内(例如一个或多个CDR区内和/或一个或多个构架区内)的一个或多个残基来使一个抗体工程化。另外的或可替代地，可以通过修饰恒定区内的残基来使一个抗体工程化，例如用来改变该抗体的效应子功能。
可以进行的一类可变区工程化是CDR移植。抗体主要通过以下氨基酸残基与靶抗原相互作用，这些氨基酸残基位于六个重链和轻链互补决定区(CDR)中。由于这个原因，CDR内的氨基酸序列比CDR外的序列在单独抗体之间更加多样化。因为CDR序列负责大多数抗体-抗原相互作用，所以有可能通过构建表达载体来表达模拟具体天然存在的抗体的特性的重组抗体，这些表达载体包括来自具体天然存在的抗体的CDR序列，这些CDR序列已经被移植到来自具有不同特性的不同抗体的构架序列上(参见，例如，赖克曼·L.(Riechmann,L.)等人(1998)自然332:323-327；琼斯·P(Jones,P)等人(1986)自然321:522-525；奎因·C(Queen,C)等人(1989)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.See.U.S.A)86:10029-10033；温特(Winter)的美国专利号5,225,539、以及奎因等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762以及6,180,370)。
适合的构架序列可以从公共DNA数据库或包括种系抗体基因序列的公开参考文件中获得。例如，人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在以下中找到：“Vbase”人种系序列数据库(可在因特网上获得)、以及卡巴特·E·A(Kabat,E.A.)等人(1991)免疫学重要的蛋白质的序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)第五版，美国卫生和公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，NIH出版号91-3242；汤姆林森·I·M(Tomlinson,I.M.)等人(1992)“人种系VH序列的组库揭示约五十组具有不同高变环的VH区段(The Repertoire of HumanGermline VH Sequences Reveals about Fifty Groups of VH Segments withDifferent Hypervariable Loops)”分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227:776-798；以及考克斯·J·P·L(Cox,J.P.L.)等人(1994)“人种系VH区段的目录揭示它们的使用中的强烈偏离(A Directory of Human Germ-lineVH Segments Reveals a Strong Bias in their Usage)”欧洲免疫学杂志(Eur.JImmunol.)24:827-836；这些文献各自的内容通过引用明确地结合在此。
另一种类型的可变区修饰是使VH和/或VL CDR1、CDR2和/或CDR3区内的氨基酸残基突变，以由此改善感兴趣的抗体的一种或多种结合特性(例如，亲和性)。为了引入突变，可以进行位点定向诱变或PCR-介导的诱变，并且对抗体结合、或其他感兴趣的功能特性的影响可以在体外或体内测定中适当地进行评估。优选地，引入保守修饰(如上所讨论的)。这些突变可以是氨基酸取代、添加或缺失，但是优选是取代。此外，典型的是改变CDR区内的不多于一个、两个、三个、四个或五个残基。
根据本发明的至少一些实施例的工程化抗体包括其中对在VH和/或VL内的构架残基做了修饰的那些，例如用来改善该抗体的特性。典型地，做出此类构架修饰以减少该抗体的免疫原性。例如，一个途径是“回复突变”相应的种系序列的一个或多个构架残基。更确切地，已经历体细胞突变的抗体可以包含不同于该抗体自其起源的种系序列的构架残基。这类残基可以通过将该抗体构架序列与该抗体自其起源的种系序列进行比较来鉴定。
除了在构架区或CDR区内做出的修饰之外或作为其替代方案，根据本发明的至少一些实施例的抗体可以被工程化以便在Fc区内包括修饰，典型的是改变该抗体的一种或多种功能特性，如血清半衰期、补体结合、Fc受体结合、和/或抗原-依赖性细胞毒性。此外，根据本发明的至少一些实施例的抗体可以是化学上修饰的(例如，可以将一个或多个化学部分附接至该抗体)或可以是被修饰以改变其糖基化，再一次用来改变该抗体的一种或多种功能特性。这类实施例将在下面进一步描述。Fc区中的残基的编号是卡巴特(Kabat)的EU指数的编号。
在一个实施例中，将CH1的铰链区进行修饰这样使得在该绞链区中的半胱氨酸残基的数目改变，例如，增加或减少。这个途径进一步描述于博德默尔(Bodmer)等人的美国专利号5,677,425中。将CH1的绞链区中的半胱氨酸残基的数目改变，以例如协助轻链和重链的组装或以增加或减少该抗体的稳定性。
在另一个实施例中，将抗体的Fc铰链区进行突变以减小该抗体的生物半衰期。更确切地，在Fc-铰链片段的CH2-CH3结构域的界面区中引入一个或多个氨基酸突变，这样使得该抗体具有相对于天然Fc-铰链结构域SpA结合的受损的葡萄球菌蛋白A(SpA)结合。这个途径进一步详细描述于华德(Ward)等人的美国专利号6,165,745中。
在另一个实施例中，将该抗体进行修饰以增加其生物半衰期。不同的途径是可能的。例如，可以引入一种或多种以下突变：T252L、T254S、T256F，如华德的美国专利号6,277,375所描述的。可替代地，为了增加生物半衰期，可以在CH1或CL区内对该抗体进行改变以包含取自IgG的Fc区的CH2结构域的两个环中的补救受体结合表位，如普雷斯塔(Presta)等人的美国专利号5,869,046和6,121,022中所描述的。
在另外的其他实施例中，Fc区是通过将至少一个氨基酸残基用一个不同氨基酸残基进行替代而改变的，以改变该抗体的效应子功能。例如，可以将一个或多个选自氨基酸残基234、235、236、237、297、318、320以及322的氨基酸用一个不同氨基酸残基进行替代，这样使得该抗体具有针对效应子配体的改变的亲和性，但是保留母体抗体的抗原结合能力。亲和性被改变的效应子配体可以是例如Fc受体或补体的C1组分。这个途径进一步详细描述于温特等人的美国专利号5,624,821和5,648,260二者中。
在另一个实例中，可以将一个或多个选自氨基酸残基329、331以及322的氨基酸用一个不同氨基酸残基进行替代，这样使得该抗体具有改变的C1q结合和/或减少的或废除的补体依赖性细胞毒性(CDC)。这个途径进一步详细描述于伊多吉(Idusogie)等人的美国专利号6,194,551中。
在另一个实例中，可以将氨基酸位置231和239内的一个或多个氨基酸残基进行改变，以由此改变该抗体固定补体的能力。这个途径进一步描述于博德默尔等人的PCT公开案WO 94/29351中。
在又另一个实例中，Fc区被修饰以提高抗体介导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)的能力和/或通过修饰在以下位置处的一个或多个氨基酸来增加抗体对Fcy受体的亲和力：238、239、248、249、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、301、303、305、307、309、312、315、320、322、324、326、327、329、330、331、333、334、335、337、338、340、360、373、376、378、382、388、389、398、414、416、419、430、434、435、437、438或439。这个途径进一步描述于普雷斯塔(Presta)的PCT公开案WO 00/42072中。此外，人IgGl上针对Fcγ、FcγRII、FcγRIII以及FcRn的结合位点已经被绘制出，并且具有改善的结合的变体已经被描述(参见希尔兹·R·L(Shields,R.L.)等人(2001)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276:6591-6604)。示出位置256、290、298、333、334以及339处的特定突变可改善对FcyRIII的结合。另外，以下组合突变体显示出改善FcγRIII结合：T256A/S298A、S298A/E333A、S298A/K224A以及S298A/E333A/K334A。此外，突变(如M252Y/S254T/T256E或M428L/N434S)改善对FcRn的结合并且增加了抗体的循环半衰期(参见陈(Chan)CA和卡特(Carter)PJ(2010)自然评论免疫学(Nature RevImmunol)10:301-316)。
在仍另一个实施例中，对抗体的糖基化进行修饰。例如，可以制作去糖基化(aglycoslated)抗体(即，该抗体缺少糖基化)。可以改变糖基化作用例如以增加该抗体对抗原的亲和性。这类碳水化合物修饰可以通过例如改变该抗体序列内的一个或多个糖基化位点来完成。例如，可以进行一个或多个氨基酸取代，这导致一个或多个可变区构架糖基化位点的消除，以由此在那个位点处消除糖基化作用。此类去糖基化作用(aglycosylation)可以增加该抗体对抗原的亲和性。这种途径进一步详细描述于寇(Co)等人的美国专利号5,714,350和6,350,861中。
另外的或可替代地，可以制作一种具有改变类型的糖基化作用的抗体，如一种具有减少量的岩藻糖(fucosyl)残基的低岩藻糖化(hypofucosylated)抗体或一种具有增加的平分(bisecting)GlcNac结构的抗体。已经证明这样的改变的糖基化模式增加抗体的ADCC能力。此类碳水化合物修饰可以通过例如在一个具有改变的糖基化机器(glycosylation machinery)的宿主细胞中表达该抗体来完成。在本领域中已经对具有改变的糖基化机器的细胞进行了描述，并且它们可以用作其中表达根据本发明的至少一些实施例的重组抗体的宿主细胞，以由此产生具有改变的糖基化作用的抗体。例如，细胞系Ms704、Ms705、以及Ms709缺乏岩藻糖转移酶(fucosyltransferase)基因FUT8(α(1,6)岩藻糖转移酶)，这样使得在Ms704、Ms705、以及Ms709细胞系中表达的抗体关于其碳水化合物缺乏岩藻糖。Ms704、Ms705、以及Ms709FUT8.-/-细胞系是通过使用两个置换型载体靶向破坏CHO/DG44细胞中的FUT8基因来产生的(参见山根(Yamane)等人的美国专利公开号20040110704和山根-大贯(Ohnuki)等人(2004)生物技术与生物工程(Biotechnol Bioeng)87:614-22)。作为另一个实例，哈奈(Hanai)等人的EP 1,176,195描述了一种具有功能上破坏的编码岩藻糖转移酶的FUT8基因的细胞系，这样通过减少或消除α1,6键-相关酶使得在这样的一种细胞系中表达的抗体展示出低岩藻糖化(hypofucosylation)。哈奈(Hanai)等人还描述了具有低的用于将岩藻糖添加至与该抗体的Fc区结合的N-乙酰氨基葡萄糖的酶活性或不具有这种酶活性的细胞系，例如大鼠骨髓瘤细胞系YB2/0(ATCC CRL1662)。普雷斯塔(Presta)的PCT公开WO03/035835描述了一种具有减少的将岩藻糖附接至Asn(297)-连接的碳水化合物的能力的变体CHO细胞系Lec13细胞，从而导致在那种宿主细胞中表达的抗体的低岩藻糖化(hypofucosylation)(还参见希尔兹·R·L等人(2002)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:26733-26740)。乌马纳(Umana)等人的PCT公开WO 99/54342描述了被工程化以表达糖蛋白修饰的糖基转移酶(例如，β(1,4)-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶III(GnTIII))的细胞系，这样使得在该被工程化的细胞系中表达的抗体展示出增加的平分GlcNac结构，这导致这些抗体的增加的ADCC活性(还参见乌马纳等人(1999)自然生物技术(Nat.Biotech.)17:176-180)。可替代地，该抗体的岩藻糖残基可以使用岩藻糖苷酶而被剪切掉。例如，岩藻糖苷酶α-L-岩藻糖苷酶将岩藻糖残基从抗体中除去(塔伦蒂诺·A·L(Tarentino,A.L.)等人(1975)生物化学(Biochem.)14:5516-23)。
由本发明在此考虑抗体的另一种修饰是聚乙二醇化作用。可以将一个抗体聚乙二醇化以例如增加该抗体的生物(例如，血清)半衰期。为了将一个抗体聚乙二醇化，典型的是在其中一个或多个PEG基团被附接至该抗体或其片段的条件下，将该抗体或其片段与聚乙二醇(PEG)(如PEG的反应性酯或醛衍生物)进行反应。优选地，聚乙二醇化作用是经由与一种反应性PEG分子(或类似反应性水可溶聚合物)的酰化反应或烷化反应来进行的。如在此所用，术语“聚乙二醇”旨在涵盖已经用来衍化其他蛋白质的任何形式的PEG，如单(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇或聚乙二醇-马来酰亚胺。在某些实施例中，有待聚乙二醇化的抗体是一种去糖基化的抗体。用于聚乙二醇化蛋白质的方法在本领域中是已知的，并且可以被应用于根据本发明的至少一些实施例的抗体。参见例如西村(Nishimura)等人的EP 0 154 316和石川(Ishikawa)等人的EP 0 401 384。
工程化抗体的方法
如上所讨论，具有在此所披露的VH和VK序列的抗-C1ORF32抗体可以分别通过修饰VH和/或VL序列、或附接至其上的恒定区来用于产生新的抗-C1ORF32抗体。因此，在根据本发明的至少一些实施例的另一个方面，根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体的结构特征用来产生结构上相关的抗-C1ORF32抗体，这些抗体保留了根据本发明的至少一些实施例的抗体的至少一种功能特性，如分别与人C1ORF32的结合。例如，一种C1ORF32抗体或其突变体的一个或多个CDR区可以与已知构架区和/或其他CDR重组地组合以产生另外的、重组工程化的、根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体，如上所讨论。其他类型的修饰包括在先前部分中所描述的那些。用于工程化方法的起始材料是在此所提供的一个或多个VH和/或VK序列、或其一个或多个CDR区。为了产生工程化的抗体，实际上制备(即，表达为一种蛋白)具有一个或多个在此所提供的VH和/或VK序列、或其一个或多个CDR区的抗体是没有必要的。当然，包含在这些序列中的信息被用作产生来源于原始序列的“第二代”序列的起始材料，并且然后将这些“第二代”序列进行制备并且表达为一种蛋白。
可以使用标准分子生物学技术来制备并且表达改变的抗体序列。
优选地，由这些改变的抗体序列编码的抗体是分别保留抗-C1ORF32抗体的一种、一些或全部功能特性的抗体，该抗体通过在此所提供的方法产生并且具有在此所提供的序列，这些功能特性包括以具体KD水平或更小与C1ORF32抗原结合和/或调节B7共刺激和/或选择性地与表达C1ORF32抗原的所希望的靶细胞(例如像癌细胞)结合。
这些改变的抗体的功能特性可以使用本领域可用的和/或在此所描述的标准测定来评估。
在根据本发明的至少一些实施例的工程化抗体的方法的某些实施例中，可以沿着全部或部分的抗C1ORF32抗体编码序列随机性地或选择性地引入突变，并且可以针对结合活性和/或其他所希望的功能特性对生成的修饰抗-C1ORF32抗体进行筛选。
已经在本领域中对突变方法进行了描述。例如，绍特(Short)的PCT公开案WO 02/092780描述了使用饱和诱变、合成连接组装(syntheticligation assembly)、或其组合来产生并筛选抗体突变的方法。可替代地，拉扎尔(Lazar)等人的PCT公开案WO 03/074679描述了使用计算筛选方法来优化抗体的理化性质的方法。
编码抗体的核酸分子
本发明的另一方面涉及对根据本发明的至少一些实施例的抗体进行编码的核酸分子。这些核酸可以存在于全细胞中、细胞溶解产物中、或部分纯化或充分纯的形式中。当通过标准技术被从其他细胞组分或其他污染物(例如其他细胞核酸或蛋白质)纯化开时，核酸是“分离的”或“致使充分纯的”，这些标准技术包括碱/SDS处理、CsCl条带(banding)、柱色谱法、琼脂糖凝胶电泳以及其他本领域熟知的技术。参见，F·奥苏贝尔(F.Ausubel)等人编辑(1987)当代分子生物学实验指南(Current Protocols inMolecular Biology)，跨学科的威利格林出版社(Greene Publishing and WileyInterscience)，纽约。根据本发明的至少一些实施例的核酸可以是例如DNA或RNA，并且可以包含或可以不包含内含子序列。在一个优选实施例中，该核酸是cDNA分子。
可以使用标准分子生物学技术来获得根据本发明的至少一些实施例的核酸。对于由杂交瘤(例如，从如下进一步描述的携带人免疫球蛋白基因的转基因小鼠制备的杂交瘤)表达的抗体而言，可以通过标准PCR扩增或cDNA克隆技术来获得对由该杂交瘤制作的抗体的轻链和重链进行编码的cDNA。对于从免疫球蛋白基因库(例如，使用噬菌体展示技术)获得的抗体而言，编码该抗体的核酸可以从该库中回收。
一旦获得编码VH和VL区段的DNA片段，这些DNA片段可以通过标准重组DNA技术来进行进一步操纵，例如用来将可变区基因转化为全长抗体链基因、Fab片段基因或scFv基因。在这些操作中，将编码VL的或编码VH的DNA片段操作性地连接至编码另一种蛋白的另一个DNA片段，如抗体恒定区或柔性接头。
如在此背景下使用，术语“操作性地连接”旨在意味着将这两个DNA片段连接，这样使得由这两个DNA片段编码的氨基酸序列仍然在构架内。
可以通过将编码VH的DNA操作性地连接至编码重链恒定区(CH1、CH2以及CH3)的另一个DNA分子来将编码VH区的分离的DNA转化为全长重链基因。人重链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见，例如卡巴特·E·A等人(1991)免疫学重要的蛋白质的序列，第五版，美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的DNA片段。重链恒定区可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgE、IgM或IgD恒定区，但是最优选地是IgG1或IgG4恒定区。对于Fab片段重链基因而言，编码VH的DNA可以被操作性地连接至只编码重链CH1恒定区的另一个DNA分子。
可以通过将编码VL的DNA操作性地连接至编码轻链恒定区CL的另一个DNA分子来将编码VL区的分离的DNA转化为全长轻链基因(连同Fab轻链基因)。人轻链恒定区基因的序列是本领域中已知的(参见，例如卡巴特·E·A等人(1991)免疫学重要的蛋白质的序列，第五版，美国卫生和公共服务部，NIH出版号91-3242)，并且可以通过标准PCR扩增来获得涵盖这些区的DNA片段。轻链恒定区可以是κ或λ恒定区，但是最优选地是κ恒定区。
为了产生scFv基因，将编码VH的和编码VL的DNA片段操作性地连接至编码柔性接头(例如编码氨基酸序列(Gly4-Ser)3)的另一个片段，这样使得VH序列和VL序列可以被表达为连续的单链蛋白，VH区和VL区由该柔性接头连接(参见，例如，博尔德(Bird)等人(1988)科学242:423-426；休斯顿等人(1988)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85:5879-5883；麦卡弗蒂(McCafferty)等人，(1990)自然348:552-554)。
抗-C1ORF32单克隆抗体的产生
本发明的单克隆抗体(mAb)可以通过多种技术来生产，包括常规单克隆抗体方法学，例如科勒(Kohler)和米尔斯坦(Milstein)(1975)自然256:495的标准体细胞杂交技术。尽管原则上体细胞杂交程序是优选的，但是可以采用用于产生单克隆抗体的其他技术，例如B淋巴细胞的病毒性或致癌性转化。
用于制备杂交瘤的一个优选动物系统是鼠科系统。在小鼠中杂交瘤的产生是一种非常完善建立的程序。用于分离免疫脾细胞用于融合的免疫方案和技术在本领域中是已知的。融合配偶体(例如，鼠科动物骨髓瘤细胞)以及融合程序也是已知的。
本发明的嵌合抗体或人源化抗体可以基于如上所述制备的鼠科动物单克隆抗体的序列来制备。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以从感兴趣的鼠科动物杂交瘤获得，并且可以使用标准分子生物学技术来工程化以包含非鼠科动物(例如，人)免疫球蛋白序列。例如，为了产生嵌合抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物可变区连接至人恒定区(参见例如，卡比乌伊(CabiUy)等人的美国专利号4,816,567)。为了产生人源化抗体，可以使用本领域已知的方法将鼠科动物CDR区插入到人构架中(参见例如，温特的美国专利号5,225,539和奎因等人的美国专利号5,530,101、5,585,089、5,693,762以及6,180,370)。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体是人单克隆抗体。这类针对C1ORF32的人单克隆抗体可以使用携带人免疫系统而非小鼠系统的部分的转基因小鼠或转染色体小鼠来产生。这些转基因小鼠和转染色体小鼠在此分别被称为HuMAb小鼠RTM和KM小鼠RTM，并且在此被统称为“人Ig小鼠”。HuMAb小鼠TM(梅达雷克斯公司(Medarex，Inc.))含有编码未重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座、连同使内源μ和κ链基因座失活的靶向突变(参见例如，兰博尔格(Lonberg)等人(1994)自然368(6474):856-859)。因此，该小鼠展示出小鼠IgM或κ的表达减少，并且响应于免疫，所引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变以产生高亲和力人IgGκ单克隆(上文的兰博尔格·N等人(1994)，同上；评论于兰博尔格·N(1994)实验药物学手册(Handbook of Experimental Pharmacology)113:49-101中；兰博尔格·N和胡萨尔·D(Huszar,D.)(1995)国际免疫学评论(Intern.Rev.Immunol.)13:65-93，以及哈丁·F(Harding,F.)和兰博尔格·N(1995)纽约科学院年刊(Ann.N.Y.Acad.Sci.)764:536-546)。HuMab小鼠RTM的制备和由这类小鼠携带的基因组修饰进一步描述于泰勒·L(Taylor,L.)等人(1992)核酸研究(Nucleic Acids Research)20:6287-6295；陈·J(Chen,J.)等人(1993)国际免疫学(International Immunology)5:647-656；图埃朗(Tuaillon)等人(1993)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90:3720-3724；蔡(Choi)等人(1993)自然遗传学(Nature Genetics)4:117-123；陈·J等人(1993)欧洲分子生物学组织期刊(EMBO J.)12:821-830；图埃朗等人(1994)免疫学杂志(J.Immunol.)152:2912-2920；泰勒·L.等人(1994)国际免疫学6:579-591；以及菲什维尔德·D(Fishwild,D.)等人(1996)自然生物技术(Nature Biotechnology)14:845-851中，所有这些文献的内容特此通过引用以其全部内容明确地结合。进一步参见，全部属于兰博尔格(Lonberg)和凯(Kay)的美国专利号5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299、以及5,770,429；苏拉尼(Surani)等人的美国专利号5,545,807；全部属于兰博尔格和凯的PCT公开号WO 92/03918、WO 93/12227、WO94/25585、WO 97/13852、WO 98/24884以及WO 99/45962；以及科曼(Korman)等人的PCT公开号WO 01/14424。
在另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例的人抗体可以使用在转基因和转染色体上携带人免疫球蛋白序列的小鼠(如携带人重链转基因和人轻链转染色体的小鼠)来进行培养。在此被称为“KM小鼠TM”的这类小鼠被详细描述于石田太郎(Ishida)等人的PCT公开WO 02/43478中。
再者，表达人免疫球蛋白基因的替代转基因动物系统在本领域是可用的，并且可以用来培养根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体。例如，可以使用被称为Xenomouse(Abgenix公司)的替代转基因系统；这类小鼠描述于例如库切拉帕提(Kucherlapati)等人的美国专利号5,939,598、6,075,181、6,114,598、6,150,584以及6,162,963中。
此外，表达人免疫球蛋白基因的替代转染色体动物系统在本领域是可用的，并且可以用来培养根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体。例如，可以使用被称为“TC小鼠”、携带人重链转染色体和人轻链转染色体两者的小鼠；这类小鼠被描述于富冢(Tomizuka)等人(2000)美国科学院院刊(Proc.Natl.Acad Sci.USA)97:722-727中。此外，已经在本领域中描述了携带人重链和轻链转染色体的牛(黑岩(Kuroiwa)等人(2002)自然生物技术20:889-894，并且这些牛可以用来培养根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体。
根据本发明的至少一些实施例的人单克隆抗体还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法来制备。用于分离人抗体的这类噬菌体展示方法在本领域是完善建立的。参见例如：拉德纳(Ladner)等人的美国专利号5,223,409、5,403,484、以及5,571,698；道尔(Dower)等人的美国专利号5,427,908和5,580,717；麦卡弗蒂(McCafferty)等人的美国专利号5,969,108和6,172,197；以及格里菲思(Griffiths)等人的美国专利号5,885,793、6,521,404、6,544,731、6,555,313、6,582,915以及6,593,081。
根据本发明的至少一些实施例的人单克隆抗体还可以使用SCID小鼠来制备，在这些小鼠中已经重构了人免疫细胞，这样使得当免疫时可以产生人抗体应答。这类小鼠描述于，例如，威尔逊(Wilson)等人的美国专利号5,476,996和5,698,767中。
人IG小鼠(HUMAN IG MICE)的免疫
当人Ig小鼠被用来培养根据本发明的至少一些实施例的人抗体时，可以用C1ORF32抗原和/或重组C1ORF32融合蛋白的纯化制剂或富集制剂来免疫这类小鼠，如由以下所描述：兰博尔格·N等人(1994)自然368(6474):856-859；菲什维尔德·D等人(1996)自然生物技术14:845-851；以及PCT公开WO 98/24884和WO 01/14424。优选地，在第一次输注时，这些小鼠将是6至16周龄。例如，可以使用C1ORF32抗原的纯化制剂或重组制剂(5至50微克)来腹腔内地免疫人Ig小鼠。
其他人用不同抗原的先前经验已经示出当首先用完全弗氏佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫，随后用完全弗氏佐剂中的抗原每隔一周IP免疫(共有6次)时，转基因小鼠会有响应。然而，发现除弗氏佐剂以外的佐剂也是有效的。此外，发现没有佐剂存在下的全细胞是高度免疫原性的。可以在免疫方案的过程中通过眶后取血获得的血浆样品来对免疫应答进行监测。可以通过ELISA筛选血浆(如下所述)，并且具有足够滴定度的抗-C1ORF32人免疫球蛋白的小鼠可以用于融合。在处死并且移出脾脏之前的3天，可以使用抗原来静脉内地使小鼠增强免疫。期望的是对于每次免疫都需要进行2-3次融合。对于每种抗原典型地免疫6与24只之间的小鼠。通常使用HCo7和HCo12两种品系。此外，HCo7和HCo12两种转基因可以被一起繁殖到具有两种不同人重链转基因(HCo7/HCo12)的一只单个小鼠中。可替代地或另外地，可以使用KM小鼠RTM品系。
生产人单克隆抗体的杂交瘤的产生
为了产生生产根据本发明的至少一些实施例的人单克隆抗体的杂交瘤，可以从免疫小鼠分离脾细胞和/或淋巴结细胞，并且可以被融合至一个适当的无限增殖化细胞系，如小鼠骨髓瘤细胞系。可以针对抗原特异性抗体的生产对这些生成的杂交瘤进行筛选。例如，可以将来自免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬浮液用50％的PEG融合至六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL1580)。将细胞以约2×10-5在平底微量滴定板上接种，随后在含有以下的选择性培养基中孵育两周：20％胎儿克隆血清、18％“653”条件培养基、5％origen(IGEN)、4mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮钠、5mM HEPES、0.055mM2-巯基乙醇，50单位/ml青霉素、50mg/ml链霉素、50mg/ml庆大霉素以及1X HAT(西格玛公司；在融合后24小时添加HAT)。在约两周之后，可以将细胞在将HAT用HT替代的培养基中进行培养。然后可以通过ELISA针对人类单克隆IgM抗体和IgG抗体对单独的孔进行筛选。一旦大量的杂交瘤生长出现，通常在10至14天之后可以对培养基进行观察。抗体分泌杂交瘤可以被重新接种、再次筛选，并且如果对人IgG仍然是阳性的，那么这些单克隆抗体可以通过有限稀释法被亚克隆至少两次。然后可以将稳定的亚克隆在体外培养，以在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
为了纯化人单克隆抗体，可以使选择的杂交瘤生长在用于单克隆抗体纯化的两升转瓶中。在用蛋白A-琼脂糖(法玛西亚公司(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州(N.J.))亲和层析之前，可以将上清液过滤并且浓缩。为了保证纯度，可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法对洗脱的IgG进行检查。可以将缓冲溶液换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD280来对浓度进行确定。这些单克隆抗体可以等分并且储存在-80℃下。
生产单克隆抗体的转染瘤的产生
根据本发明的至少一些实施例的抗体还可以使用例如本领域中所熟知的重组DNA技术和基因转染方法的组合来在宿主细胞转染瘤中生产(例如，莫里森·S.(Morrison,S.)(1985)科学229:1202)。
例如，为了表达这些抗体、或其抗体片段，可以通过标准分子生物学技术(例如，PCR扩增或使用表达感兴趣的抗体的杂交瘤的cDNA克隆)来获得编码部分的或全长的轻链和重链的DNA，并且这些DNA可以被插入至表达载体中，这样使得这些基因被操作性地连接至转录和翻译控制序列。在此背景下，术语“操作性地连接”旨在意味着抗体基因被连接至一个载体，这样使得该载体内的转录和翻译控制序列发挥其调节该抗体基因的转录和翻译的预期功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞是能相容的。可以将抗体轻链基因和抗体重链基因插入至单独的载体中，或更典型地，这两种基因被插入至同一表达载体中。通过标准方法将抗体基因插入至表达载体中(例如，抗体基因片段和载体上的互补限制位点的连接，或如果不存在限制位点，平末端连接)。可以使用在此所描述的这些抗体的轻链和重链可变区，来通过将它们插入至表达载体来产生任何抗体同种型的全长抗体基因，这些表达载体已经编码了所希望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区，这样使得VH区段被操作性地连接至该载体内的CH区段并且VK区段被操作性地连接至该载体内的CL区段。另外的或可替代地，这种重组表达载体可以对协助该抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽进行编码。可以将该抗体链基因克隆至该载体中，这样使得信号肽被构架内地连接至该抗体链基因的氨基末端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即，来自非免疫球蛋白的信号肽)。
除了抗体链基因之外，根据本发明的至少一些实施例的重组表达载体携带控制这些抗体链基因在宿主细胞中的表达的调节序列。术语“调节序列”旨在包括控制这些抗体链基因的转录或翻译的启动子、增强子以及其他表达控制元件(例如，多腺苷酸化信号)。这类调节序列描述于例如戈德尔(Goeddel)(基因表达技术：酶学方法185(Gene Expression Technology.Methods in Enzymology185)，学术出版社(Academic Press)，圣地亚哥(SanDiego)，加利福利亚洲(Calif.)(1990))中。本领域技术人员应该理解，表达载体的设计、包括调节序列的选择可能取决于这类因素，如待转化的宿主细胞的选择、所希望的蛋白质的表达水平等。用于哺乳动物宿主细胞表达的优选调节序列包括在哺乳动物细胞中指导高水平的蛋白质表达的病毒元件，如来源于巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))以及多瘤病毒的启动子和/或增强子。可替代地，可以使用非病毒调节序列，如泛素蛋白启动子或β-珠蛋白启动子。再者，调节元件由来自包含来自SV40早期启动子的序列和人T细胞白血病病毒类型1的长末端重复的不同来源，如SRα启动子系统的序列组成(泰克倍·Y(Takebe,Y.)等人(1988)分子细胞生物学(Mol.Cell.Biol.)8:466-472)。
除了这些抗体链基因和调节序列之外，根据本发明的至少一些实施例的重组表达载体可以携带另外的序列，如在宿主细胞中调节该载体的复制的序列(例如，复制起点)以及选择性标志物基因。选择性标志物基因协助已经向其中引入该载体的宿主细胞的选择(参见例如，全部是阿克塞尔(Axel)等人的美国专利号4,399,216、4,634,665以及5,179,017)。例如，典型地，选择性标志物基因赋予已经向其中引入该载体的宿主细胞对药物如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗性。优选的选择性标志物基因包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(用于在用甲氨蝶呤选择/扩增的dhfr-宿主细胞中使用)和neo基因(用于G418选择)。
为了轻链和重链的表达，通过标准技术将编码重链和轻链的表达载体转染至宿主细胞中。不同形式的术语“转染”旨在涵盖多种多样的通常用于将外源DNA引入至原核或真核宿主细胞中的技术，例如电穿孔、磷酸钙沉淀、DEAE-葡聚糖转染等。尽管理论上在原核宿主细胞抑或真核宿主细胞中表达根据本发明的至少一些实施例的抗体是可能的，但是在真核细胞、并且最优选是哺乳动物宿主细胞中的抗体的表达是最优选的，因为这类真核细胞、并且特别是哺乳动物细胞比原核细胞更容易组装并且分泌适当折叠的并且有免疫学活性的抗体。已经报道抗体基因的原核表达对于生产高产量的活性抗体是无效的(波斯·M·A(Boss,M.A)和伍德·C·R(Wood,C.R.)(1985)当今免疫学(Immunology Today)6:12-13)。
用于表达根据本发明的至少一些实施例的这些重组抗体的优选哺乳动物宿主细胞包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括描述于乌尔劳布(Urlaub)和蔡辛(1980)美国科学院院刊77:4216-4220中的dhfr-CHO细胞，该dhfr-CHO细胞与DHFR选择性标志物一起使用，例如像R·J·考夫曼(R.J.Kaufman)和P·A·夏普(P.A.Sharp)(1982)分子生物学(Mol.Biol.)159:601-621所描述)、NSO骨髓瘤细胞、COS细胞以及SP2细胞。具体地，用于与NSO骨髓瘤细胞一起使用的另一个优选的表达系统是披露于WO 87/04462、WO 89/01036以及EP 338,841中的GS基因表达系统。当将编码抗体基因的重组表达载体引入到哺乳动物宿主细胞中时，这些抗体是通过将这些宿主细胞培养一段足够允许在这些宿主细胞中的抗体的表达或更优选地，允许该抗体分泌到这些宿主细胞生长的培养基中的时间来产生的。可以使用标准蛋白质纯化方法将抗体从该培养基中回收。
与抗原结合的抗体的表征
可以通过(例如)标准ELISA针对与C1ORF32的结合对根据本发明的至少一些实施例的抗体进行测试。简言之，将微量滴定板用PBS中的0.25微克/ml的纯化C1ORF32进行涂覆，并且然后用PBS中的5％牛血清白蛋白封闭。将抗体的稀释液(例如，来自免疫的小鼠的血浆稀释液)添加至各孔并且在37℃下孵育1至2小时。将这些板用PBS/吐温进行洗涤，并且然后用与碱性磷酸酯酶轭合的第二试剂(例如，对于人抗体来说，山羊-抗-人-IgG Fc-特异性多克隆试剂)在37℃下孵育1小时。在洗涤之后，将这些板用pNPP底物(1mg/ml)显影，并且在405至650的OD下进行分析。优选地，显露出最高滴定度的小鼠将用于融合。
还可以使用如上所描述的ELISA测定来筛选示出与C1ORF32免疫原的阳性反应性的杂交瘤。将以高亲和力与C1ORF32结合的杂交瘤进行亚克隆并且进一步表征。可以选择来自每个杂交瘤的保留母体细胞的反应性(通过ELISA)的一个克隆，用于制作在-140℃下储存的5至10个小瓶细胞库，并且用于抗体纯化。
为了纯化抗-C1ORF32抗体，可以使选择的杂交瘤生长在用于单克隆抗体纯化的两升的转瓶中。在用蛋白A-琼脂糖(法玛西亚公司(Pharmacia)，皮斯卡塔韦(Piscataway)，新泽西州)亲和层析之前，可以将上清液过滤并且浓缩。为了保证纯度，可以通过凝胶电泳和高效液相色谱法对洗脱的IgG进行检查。可以将缓冲溶液换成PBS，并且可以使用1.43消光系数通过OD280来对浓度进行确定。这些单克隆抗体可以等分并且储存在-80℃下。
为了确定所选择的抗-C1ORF32单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以使用可商购的试剂(皮尔斯公司(Pierce)，罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(Ill))使每个抗体生物素化。可以使用如上所描述的C1ORF32涂覆的-ELISA平板来进行使用未标记的单克隆抗体和生物素化的单克隆抗体的竞争性研究。可以用链球菌-抗生物素蛋白-碱性磷酸酯酶探针检测生物素化的mAb结合。
为了确定纯化抗体的同种型，可以使用特异性针对一种具体同种型的抗体的试剂来进行同种型ELISA。例如，为了确定人单克隆抗体的同种型，可以在4℃下将微量滴定板的孔用1微克/ml的抗人免疫球蛋白进行涂覆过夜。在用1％BSA封闭之后，将这些板与1mug/ml或更少的测试单克隆抗体或纯化的同种型对照在环境温度下反应一至二个小时。然后这些孔可以与人IgG1抑或人IgM-特异性碱性磷酸酯酶轭合的探针进行反应。将平板如上所述进行显影和分析。
可以对应地通过蛋白质印迹法针对与C1ORF32抗原的反应性进一步对抗-C1ORF32人IgG进行测试。简言之，可以制备C1ORF32抗原并且使其经受十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳之后，将这些分离的抗原转移至硝酸纤维素膜，用10％胎牛血清进行封闭，并且用有待测试的单克隆抗体进行探测。可以使用抗人IgG碱性磷酸酯酶对人IgG结合进行检测，并且用BCIP/NBT底物片剂(西格玛化学公司(Sigma Chem.Co.)，圣路易斯(St.Louis)，密苏里州(Mo.))进行显影。
替代支架
根据至少一些实施例，本发明涉及具有类似于特异性抗体的范围的特异性和亲和力的蛋白支架。根据至少一些实施例，本发明涉及一种抗原结合构建体，这种抗原结合构建体包含被连接至一个或多个表位结合结构域的一个蛋白支架。这类工程化蛋白支架通常是通过设计一个聚焦于环区或另外的可允许表面区域的随机突变文库并且通过经由噬菌体展示或相关技术针对给定的靶标对变体进行选择来获得的。根据至少一些实施例，本发明涉及替代支架，包括，但不限于：抗运载蛋白(anticalin)、DARPin、犰狳重复序列蛋白(Armadillo repeat proteins)、蛋白A、脂质运载蛋白、纤维连接蛋白结构域、锚蛋白共有序列重复结构域、硫氧还蛋白、化学约束肽(chemically constrained peptides)等。根据至少一些实施例，本发明涉及用作治疗癌症、自身免疫性疾病以及感染性疾病连同用于体内诊断学的治疗剂的替代支架。
根据至少一些实施例，本发明进一步提供一种药用组合物，该药用组合物包含如在此所描述的一种抗原结合构建体、一种药学上可接受的载体。
如在此所用，术语“蛋白支架”包括但不限于免疫球蛋白(Ig)支架，例如IgG支架，该支架可以是四链或双链抗体，或可以仅包括抗体的Fc区，或可以包括来自抗体的一个或多个恒定区(其恒定区可以是人的或灵长类源的)，或可以是人恒定区和灵长类恒定区的人造嵌合体。这类蛋白支架除了该一个或多个恒定区之外还可以包括抗原结合位点，例如其中该蛋白支架包括一个完整IgG。这类蛋白支架能够被连接至其他蛋白结构域，例如具有抗原结合位点的蛋白结构域，例如表位结合结构域或ScFv结构域。
“结构域”是具有独立于蛋白质的其他部分的三级结构的一种折叠的蛋白结构。通常，结构域负责蛋白质的离散功能特性，并且在许多情况下，可以被添加至、除去或转移至其他蛋白质而不失去该蛋白质的剩余部分和/或该结构域的功能。“单个抗体可变结构域”是包括抗体可变结构域的序列特征的一种折叠的多肽结构域。因此，它包括完全抗体可变结构域和修饰的可变结构域，例如其中一个或多个环已经被不是抗体可变结构域的特征的序列所替代，或已经被平截或包括N末端或C末端延伸的抗体可变结构域，连同至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。
短语“免疫球蛋白单个可变结构域”是指与独立于不同V区或结构域的抗原或表位特异性结合的抗体可变结构域(VH、V HH、V L)。免疫球蛋白单个可变结构域能以与其他不同可变区或可变结构域一起(例如，同多聚体或异多聚体)的方式存在，其中该单个免疫球蛋白可变结构域不需要这些其他区或结构域结合抗原(即，其中该免疫球蛋白单个可变结构域独立于另外的可变结构域结合抗原)。“结构域抗体”或“dAb”与如在此所使用的术语能够结合抗原的“免疫球蛋白单个可变结构域”是相同的。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人抗体可变结构域，但是还包括来自其他物种的单个抗体可变结构域，如啮齿类动物(例如，如在WO 00/29004中所披露)、铰口鲨以及骆驼科动物V HH dAb。骆驼科动物V HH是来源于包括以下物种、产生天然缺乏轻链的重链抗体的免疫球蛋白单个可变结构域多肽：骆驼、美洲驼、羊驼、单峰骆驼、以及原驼。这类V HH结构域可以根据本领域可用的标准技术进行人源化，并且根据本发明这类结构域仍被认为是“结构域抗体”。如在此使用，“VH”包括骆驼科动物V HH结构域。NARV是另一类在软骨鱼类(包括铰口鲨)中鉴定出的免疫球蛋白单个可变结构域。这些结构域也称为新颖抗原受体(Novel AntigenReceptor)可变区(通常缩写为V(NAR)或NARV)。关于进一步细节，参见分子免疫学(MoI.Immunol.)44,656-665(2006)和US 20050043519 A。
术语“表位结合结构域”是指独立于不同V区或结构域与抗原或表位特异性结合的结构域，这可以是一种结构域抗体(dAb)(例如人、骆驼科动物或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域)或它可以是一种作为选自下组的支架的衍生物的结构域，该组由以下各项组成：CTLA-4(Evibody)；脂质运载蛋白；蛋白A衍生的分子，如蛋白A的Z-结构域(Affibody，SpA)，A-结构域(Avimer/Maxibody)；热激蛋白，如GroEI和GroES；转铁蛋白(反式体(trans-body))；锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)；肽适体；C-类凝集素结构域(四连接素)；人&#947-晶体蛋白以及人泛素蛋白(affilins)；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的蝎毒素库尼茨(kunitz)型结构域；犰狳重复序列蛋白、硫氧还蛋白、以及纤维连接蛋白(adnectin)；该结构域已经经受蛋白质工程化以获得与除了天然配体之外的配体的结合。
对应于抗体的CDR的环可以被异源序列取代以赋予不同结合特性，即Evibodies。关于进一步细节，参见免疫学方法杂志(Journal of ImmunologicalMethods)248(1-2),31-45(2001)。脂质运载蛋白是细胞外蛋白质的一个家族，这些脂质运载蛋白转运小的疏水性分子如类固醇、后胆色素(bilin)、类视黄醇以及脂质。它们具有在圆锥形结构的开口末端有多个环的刚性的二级结构，它们可以被工程化以与不同靶抗原结合。抗运载蛋白大小是160-180个之间的氨基酸，并且来源于脂质运载蛋白。关于进一步细节，参见生物化学与生物物理学报(Biochim Biophys Acta)1482:337-350(2000)、US7250297B1以及US20070224633。affibody是一种来源于金黄色葡萄球菌的蛋白A的支架，它可以被工程化以结合抗原。该结构域由约58个氨基酸的三螺旋束组成。已经通过表面残基的随机化生成了文库。关于进一步细节，参见蛋白质工程、设计与选择(Protein Eng.Des.SeI.)17,455-462(2004)和EP 1641818 A1。Avimer是来源于A-结构域支架家族的多结构域蛋白。约35个氨基酸的天然结构域采取限定的二硫化物键合结构。通过由A-结构域家族展示的天然变异的改组产生多样性。关于进一步细节，参见自然生物技术23(12),1556-1561(2005)和调研药物的专家评论(Expert Opinion on Investigational Drugs)16(6),909-917(2007年6月)。转铁蛋白可以通过将肽序列插入自由表面环中而被工程化以结合不用靶抗原。工程化转铁蛋白支架的实例包括反式体(Trans-body)。关于进一步细节，参见生物化学杂志(J.Biol.Chem)274,24066-24073(1999)。
设计的锚蛋白重复序列蛋白(DARPin)来源于锚蛋白，锚蛋白是介导整合膜蛋白附接至细胞骨架的一种蛋白家族。单个的锚蛋白重复序列是由两个α螺旋；-β转角组成的一种33个残基的基序。它们可以通过随机化在每个重复序列的第一α-螺旋和β-转角中的残基而被工程化，以结合不同的靶抗原。可以通过增加模块的数目来增加其结合界面(亲和性成熟的方法)。关于进一步细节，参见分子生物学杂志332,489-503(2003)、美国科学院院报(PNAS)100(4),1700-1705(2003)和分子生物学杂志369,1015-1028(2007)以及US 20040132028A1。
纤维连接蛋白是可以被工程化以结合抗原的一种支架。Adnectin由具有15个重复单位的人III型纤维连接蛋白(FN3)的第10结构域的天然氨基酸序列的骨架组成。位于β夹层的一个末端的三个环可以被工程化以使Adnectin能够特异性地识别感兴趣的治疗靶标。关于进一步细节，参见蛋白质工程、设计与选择18,435-444(2005)、US 20080139791、WO2005056764以及US 6818418 B1。
肽适体是由恒定的支架蛋白、典型地是硫氧还蛋白(TrxA)组成的组合识别分子，这种恒定的支架蛋白包含在活性位点处插入的约束可变肽环。关于进一步细节，参见生物疗法专家评论(Expert Opin.Biol.Ther.)5.783-797(2005)。
微体来源于长为25至50个氨基酸的天然发生的微量蛋白，这些微量蛋白包含3至4个半胱氨酸桥—微量蛋白的实例包括KalataBI和科诺毒素(conotoxin)以及打结素(knottin)。这些微量蛋白具有一个环，该环可以被工程化以包括高达25个氨基酸而不影响该微量蛋白的整体折叠。工程化的打结素结构域的进一步细节参见WO 2008098796。
结合结构域的其他表位包括已经作为支架被用于工程化不同靶抗原结合特性的蛋白质，包括人&#947；β-晶体蛋白和人泛素蛋白(affilin)、人类蛋白酶抑制剂的库尼茨型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、蝎毒素(卡律蝎毒素(charybdotoxin))、C-型凝集素结构域(四连接素)，它们评论于第7章-来自治疗性抗体手册的非抗体支架(Non-AntibodyScaffolds from Handbook of Therapeutic Antibodies)(2007，由斯蒂芬迪贝尔(Stefan Dubel)编辑)和蛋白质科学(Protein Science)15:14-27(2006)中。本发明的表位结合结构域可以来源于任何这些替代蛋白结构域。
轭合物或免疫轭合物
本发明涵盖用于在免疫疗法中使用的轭合物，这些轭合物包含C1ORF32抗原及其可溶性部分，包括其胞外结构域或部分或变体。例如，本发明涵盖以下轭合物，其中C1ORF32抗原的ECD被附接至一个免疫球蛋白或其片段。本发明涵盖它们用于促进或抑制C1ORF32抗原活性(如免疫共刺激)的用途以及它们在治疗移植、自身免疫、以及在此所描述的癌症适应症中的用途。
在另一个方面，本发明特征在于免疫轭合物，这些免疫轭合物包含被轭合至一个治疗部分(如细胞毒素、药物(例如，免疫抑制剂)或放射性毒素)的抗-C1ORF32抗体、或其片段。这类轭合物在此被称为“免疫轭合物”。包含一种或多种细胞毒素的免疫轭合物被称为“免疫毒素”。细胞毒素或细胞毒性剂包括对细胞有害(例如，杀伤)的任何试剂。实例包括紫杉酚、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙素、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光辉霉素、放线菌素D、1-去氢睾酮、糖皮质激素、普罗卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、和嘌罗霉素及其类似物或同系物。治疗剂还包括例如，抗代谢药(例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶氨烯咪胺)，烷化剂(例如，氮芥、thioepa、苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀(BSNU)和洛莫司汀(CCNU)、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链唑霉素、丝裂霉素C、以及顺-二氯二氨铂(cis-dichlorodiamine platinum)(II)(DDP)顺铂)，蒽环类(例如，柔红霉素(原来是道诺霉素)和阿霉素)，抗生素(例如，更生霉素(原来是放线菌素)、博来霉素、光辉霉素、以及安曲霉素(AMC))，以及抗有丝分裂试剂(例如，长春新碱和长春碱)。
可以轭合至根据本发明的至少一些实施例的抗体的治疗性细胞毒素的其他优选实例包括多卡米新、刺孢霉素、美登素和奥利斯他汀(auristatin)、及其衍生物。刺孢霉素抗体轭合物的一个实例是可商购的(Mylotarg.TM.；惠氏药厂(Wyeth))。
可以使用本领域中可用的接头技术使细胞毒素轭合至根据本发明的至少一些实施例的抗体。已经用于将细胞毒素轭合至抗体的接头类型的实例包括，但不限于：腙、硫醚、酯、二硫化物以及含有肽的接头。可以选择例如易于被溶酶体分隔区内低pH裂解或易于被蛋白酶(如优先在肿瘤组织中表达的蛋白酶，如组织蛋白酶(例如组织蛋白酶B、C、D))裂解的接头。
关于细胞毒素、接头的类型以及用于使治疗剂轭合至抗体的方法的进一步讨论，还参见萨伊托·G(Saito,G.)等人(2003)先进药物递送综述(Adv.Drug Deliv.Rev.)55:199-215；特雷尔·P·A(Trail,P.A.)等人(2003)癌症免疫学免疫治疗(Cancer Immunol.Immunother.)52:328-337；佩恩·G(Payne,G.)(2003)癌细胞(Cancer Cell)3:207-212；艾伦·T·M(Allen,T.M.)(2002)癌症自然评论(Nat.Rev.Cancer)2:750-763；帕斯坦·I(Pastan,I.)和克莱德曼·R·J(Kreitman,R.J.)(2002)研究药物的最新观点(Curr.Opin.Investig.Drugs)3:1089-1091；森特·P·D(Senter,P.D.)和施普林格·C·J(Springer,C.J.)(2001)先进药物递送综述53:247-264。
本发明的抗体还可以被轭合至放射性同位素以产生细胞毒性放射性药物，也被称为放射免疫轭合物。可以被轭合至诊断或治疗用途的抗体的放射性同位素的实例包括，但不限于：碘131、铟111、钇90以及镥177。用于制备放射免疫轭合物的方法在本领域中是建立的。放射免疫轭合物的实例是可商购的，包括Zevalin.TM.(IDEC制药公司(IDECPharmaceuticals))和Bexxar.TM.((科雷莎制药公司(CorixaPharmaceuticals))，并且类似方法可以用来使用根据本发明的至少一些实施例的抗体制备放射免疫轭合物。
根据本发明的至少一些实施例的抗体轭合物可以用来修饰一种给定的生物应答，并且药物部分不应被解释为限于经典的化学治疗剂。例如，药物部分可以是拥有所希望的生物活性的蛋白质或多肽。这类蛋白质可以包括例如，酶活性毒素或其活性片段，如相思豆毒素、蓖麻毒蛋白A、假单胞菌外毒素、或白喉毒素；一种蛋白质，如肿瘤坏死因子或干扰素-γ；或生物学应答修饰剂，例如像淋巴因子、白细胞介素-1(“IL-1”)、白细胞介素-2(“IL-2”)、白细胞介素-6(“IL-6”)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(“GM-CSF”)、粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)，或其他生长因子。
用于使这种治疗部分轭合至抗体的技术是熟知的，参见例如，阿尔农(Arnon)等人，“癌症治疗中用于免疫靶向药物的单克隆抗体(MonoclonalAntibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy)”，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy)，莱斯菲尔德(Reisfeld)等人(编辑)第243页至56页(艾伦R.利斯有限公司(Alan R.Liss,Inc.)1985)；赫尔斯特伦(Hellstrom)等人，“用于药物递送的抗体(Antibodies For Drug Delivery)”，控制药物递送(Controlled Drug Delivery)(第2版)，罗宾逊(Robinson)等人(编辑)，第623页至53页(马塞尔德克有限公司(Marcel Dekker,Inc.)1987)；索普(Thorpe)，“癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：评论(Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents InCancer Therapy:A Review)”，单克隆抗体'84：生物和临床应用(MonoclonalAntibodies'84:Biological And Clinical Applications)，平凯拉(Pinchera)等人(编辑)，第475页至第506页(1985)；“癌症治疗中放射性标记抗体的治疗用途的分析、结果、以及未来前景(Analysis,Results,And FutureProspective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In CancerTherapy)”，用于癌症检测和治疗的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies ForCancer Detection And Therapy)，鲍德温(Baldwin)等人(编辑)，第303页至16页(学术出版社(Academic Press)1985)；以及索普等人，“抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性特性(The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates)”，免疫学评论(Immunol.Rev.),62:119-58(1982)。
双特异性分子
在另一个方面，本发明特征在于双特异性分子，这些双特异性分子包含根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体、或其片段。根据本发明的至少一些实施例的抗体、或其抗原结合部分可以被衍生化或被连接至另一种功能分子，例如，另一种肽或蛋白质(例如，受体的另一种抗体或配体)，以产生与至少两个不同结合位点或靶分子结合的双特异性分子。根据本发明的至少一些实施例的抗体还可以被实际衍生化或被连接至一种以上其他的功能分子以产生与多于两个的不同结合位点和/或靶分子结合的多特异性分子；这类多特异性分子也旨在由如在此使用的术语“双特异性分子”所涵盖。为了产生根据本发明的至少一些实施例的双特异性分子，可以将一种抗体功能上地连接至(例如，通过化学偶联、基因融合、非共价缔合或以另外的方式)一个或多个其他结合分子，如另一个抗体、抗体片段、肽或结合模拟物，这样使得生成一种双特异性分子。
因此，本发明包括以下双特异性分子，这些双特异性分子包含对C1ORF32的至少一种第一结合特异性以及对一种第二靶向表位的第二结合特异性。根据本发明的至少一些实施例，这种第二靶向表位是一种Fc受体，例如，人Fc γ RI(CD64)或人Fc α受体(CD89)。因此，本发明包括能够与以下结合的双特性分子：表达Fc γR、Fc α R或Fc ε R的效应细胞(例如，单核细胞、巨噬细胞或多形核细胞(PMN))，以及表达C1ORF32的靶细胞两者。这些双特异性分子将C1ORF32表达细胞靶向至效应细胞并且触发Fc受体介导的效应细胞活性，如C1ORF32表达细胞的吞噬作用、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、细胞因子释放、或超氧化物阴离子的产生。
根据本发明的至少一些实施例，其中这种双特异性分子是多特异性的，该分子除了抗-Fc结合特异性和抗-6f结合特异性之外，还可以进一步包括一种第三结合特异性。在一个实施例中，该第三结合特异性是一种抗增强因子(EF)部分，例如与细胞毒性活性中涉及的表面蛋白结合并且由此增加针对靶细胞的免疫应答的分子。
术语“抗增强因子部分”可以是与给定分子(例如，抗原或受体)结合的抗体、功能性抗体片段或配体，并且由此导致Fc受体或靶细胞抗原的结合决定簇的作用的增强。“抗增强因子部分”可以结合Fc受体或靶细胞抗原。可替代地，抗增强因子部分可以与一种实体结合，该实体不同于第一和第二结合特异性结合的实体。例如，抗增强因子部分可以结合细胞毒性T-细胞(例如，经由CD2、CD3、CD8、CD28、CD4、CD40、ICAM-1，或导致针对靶细胞的增加的免疫应答的其他免疫细胞，或与细胞毒性活性中涉及的一种表面蛋白结合)。
根据本发明的至少一些实施例，这些双特异性分子包含作为结合特异性的至少一种抗体、或其抗体片段，包括例如Fab、Fab'、F(ab').sub.2、Fv、或单链Fv。这种抗体还可以是轻链或重链二聚体，或其任何最小片段，如Fv或在拉德纳(Ladner)等人美国专利号4,946,778中所描述的单链构建体，其内容通过引用明确结合。
根据本发明的至少一些实施例，这些双特异性分子是基于本领域中已知的任何技术产生，包括但不限于：“双可变结构域”(DVD)抗体，阿伯特(Abbott)，如描述于美国专利号7,612,181中，该专利的内容通过引用明确地结合；“双亲和力重靶向”(DART)(宏观基因公司(Macrogenics)，血液杂志(Blood)2011；117(17):4542-4551)；“F-star的模块抗体技术”(蛋白质工程、设计与选择2010；23(4):289)；“双特异性T细胞接合技术”(BITE)((Micromet)，免疫学治疗杂志(JImmunother.)2009年6月；32(5):452-64)；“双环技术”(双环治疗剂，自然化学生物学(Nature Chemical Biology)2009；5,502-507)；“双靶向结构域抗体”(dAb，多曼提斯公司(Domantis)，美国专利申请20100247515)。
在一个实施例中，对Fey受体的结合特异性是由一种单克隆抗体提供的，这种结合不被人免疫球蛋白G(IgG)所封闭。如在此所用，术语“IgG受体”是指位于染色体1上的八种γ链基因的任一种。这些基因编码总计十二种跨膜或可溶性受体同种型，这些同种型可以被分成三种Fc γ受体类别：Fc γRI(CD64)、Fc γRII(CD32)、以及Fc γRIII(CD16)。在一个优选实施例中，Fc γ受体是一种人高亲和力Fc.γ RI。人Fc γ RI是对单体IgG(108-10-9M.-1)显示出高亲和力的一种72kDa分子。
某些优选的抗-Fc γ单克隆抗体的生产和表征描述于范格(Fanger)等人的PCT公开WO 88/00052中和美国专利号4,954,617中，这些专利的传授内容通过引用而完全结合在此。这些抗体在一个相异于该受体的Fc γ结合位点的位点处与Fc γ R1、FcyRII或FcyRIII的表位结合，因此，其结合不被生理水平的IgG实质上封闭。在本发明中有用的特异性抗-Fc γRI抗体是mAb22、mAb32、mAb44、mAb62以及mAb197。生产mAb32的杂交瘤是从美国典型培养物保藏所ATCC登录号HB9469可获得的。在其他实施例中，抗-Fcy受体抗体是单克隆抗体22(H22)的人源化形式。H22抗体的生产和表征描述于格拉齐亚诺·R·F(Graziano,R.F.)等人(1995)免疫学杂志155(10):4996-5002和PCT公开WO 94/10332中。生产H22抗体的细胞系保藏于美国典型培养物保藏所的HAO22CLI名下并且具有登录号CRL11177。
在仍其他优选实施例中，对Fc受体的结合特异性是由与人类IgA受体(例如，Fc-α受体(Fc α RI(CD89)))结合的抗体提供的，其结合优选地不被人免疫球蛋白A(IgA)所封闭。术语“IgA受体”旨在包括位于染色体19上的一个α-基因(Fc α RI)的基因产物。已知这个基因编码55至10kDa的数种替代剪接的跨膜同种型。
Fc α RI(CD89)组成性地表达于单核细胞/巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及嗜中性粒细胞上，但是不在非效应细胞群体上表达。Fc α RI对IgAl与IgA2两者具有中等亲和力(约5×10-7M-l)，这种亲和力当暴露于细胞因子(如G-CSF或GM-CSF)时增加(莫尔顿·H·C(Morton,H.C.)等人(1996)免疫学关键评论(Critical Reviews in Immunology)16:423-440)。已经对结合IgA配体结合结构域外的Fc α RI、被鉴定为A3、A59、A62以及A77的四种Fc a RI-特异性单克隆抗体进行了描述(蒙泰罗·R·C(Monteiro,R.C.)等人(1992)免疫学杂志148:1764)。
Fc α RI和F cγRI是用于在根据本发明的至少一些实施例的双特异性分子中使用的优选触发受体，因为它们(1)主要在免疫效应细胞(例如，单核细胞、PMN、巨噬细胞以及树突状细胞)中表达；(2)以高水平表达(例如，5,000-100,000/细胞)；(3)是细胞毒性活性(例如，ADCC、吞噬作用)的介体；(4)介导抗原的增强的抗原呈递，包括靶向它们的自身抗原。
尽管人单克隆抗体是优选的，但是可以在根据本发明的至少一些实施例的双特异性分子中采用的其他抗体是鼠科动物、嵌合以及人源化单克隆抗体。
本发明的双特异性分子可以使用本领域中已知的方法，通过使组成结合特异性(例如抗-FcR和抗-C1ORF32结合特异性)轭合来制备。例如，双特异性分子的每种结合特异性可以单独地产生并且然后彼此轭合。当结合特异性是蛋白质或肽时，可以使用多种偶联剂或交联剂来用于共价轭合。交联剂的实例包括蛋白A、碳二亚胺、N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)、5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(DTNB)、邻亚苯基二马来酰亚胺(邻PDM)、N-琥珀酰亚胺基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、以及4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸磺基琥珀酰亚胺酯(磺基-SMCC)(参见例如，卡夫斯基(Karpovsky)等人(1984)实验医学杂志(J.Exp.Med.)160:1686；刘·M·A(Liu,M A)等人(1985)美国科学院院刊82:8648)。其他方法包括描述于以下中的那些：保卢斯(Paulus)(1985)贝林研究所通报(Behring Ins.Mitt.)第78期，118-132；布伦南(Brennan)等人(1985)科学229:81-83；以及格伦尼(Glennie)等人(1987)免疫学杂志139:2367-2375。优选的轭合剂是SATA和磺基-SMCC，两者都从皮尔斯化学有限公司(Pierce Chemical Co.)(罗克福德(Rockford)，伊利诺伊州(Ill.))可获得。
当结合特异性是抗体时，它们可以经由两个重链的C-末端绞链区的巯基键合来轭合。在一个特别优选的实施例中，在轭合之前，将绞链区进行修饰以包含奇数的巯基残基，优选是一个。
可替代地，两种结合特异性可以在同一载体中编码并且在同一宿主细胞中表达和组装。当双特异性分子是mAbXmAb、mAbXFab、FabXF(ab')2或配体XFab融合蛋白时，这种方法是特别有用的。根据本发明的至少一些实施例的双特异性分子可以是包括一个单链抗体和一个结合决定簇的一种单链分子，或包括两个结合决定簇的一种单链双特异性分子。双特异性分子可以包括至少两个单链分子。用于制备双特异性分子的方法描述于，例如美国专利号5,260,203；美国专利号5,455,030；美国专利号4,881,175；美国专利号5,132,405；美国专利号5,091,513；美国专利号5,476,786；美国专利号5,013,653；美国专利号5,258,498；以及美国专利号5,482,858中。
这些双特异性分子与其特异性靶标的结合可以通过例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、FACS分析、生物测定(例如，生长抑制)、或蛋白印迹测定来进行确认。每种这些测定通常通过采用对感兴趣的复合体特异的标记试剂(例如，抗体)来检测特别感兴趣的蛋白-抗体复合体的存在。例如，可以使用例如识别并且与抗体-FcR复合体特异性结合的酶连抗体或抗体片段对FcR-抗体复合体进行检测。可替代地，可以使用任何多种其他免疫测定对这些复合体进行检测。例如，可以将该抗体放射性标记并且在放射性免疫测定(RIA)中使用(参见例如，温特劳布·B(Weintraub,B.)，放射性免疫测定的原则(Principles ofRadioimmunoassays)，关于放射性配体测定技术的第七次培训课程(Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques)，内分泌学会(The Endocrine Society)，1986年3月，其通过引用结合在此)。可以通过这样的手段，如使用γ计数器或闪烁计数器或通过放射自显影来对放射性同位素进行检测。
药用组合物及其用途
在另一方面，本发明提供一种组合物，例如，一种药用组合物，该药用组合物含有与一种药学上可接受的载体配制在一起的C1ORF32特异性单克隆抗体或其抗原结合部分中的一种或组合。这类组合物可以包括以下中的一种或组合：(例如，两种或更多种不同的)根据本发明的至少一些实施例的抗体、和/或免疫轭合物和/或替代支架和/或双特异性分子。例如，根据本发明的至少一些实施例的药用组合物可以包含与靶抗原上的不同表位结合或具有互补活性的抗体(或免疫轭合物或双特异性分子)的组合。
C1ORF32特异性抗体(特别是人抗体和抗体组合物)具有多种治疗效用和体外及体内诊断效用，涉及癌症的治疗和诊断，该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌，优选甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌(优选地II期和III期)、偶发性乳头状癌(IPC)、甲状腺髓样癌、甲状腺间变性癌；鳞状细胞癌，食道鳞状细胞癌；乳腺癌，优选II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌、粉刺癌以及髓样癌(优选2级)；卵巢癌，乳头状浆液性和粘液性癌(优选地Ic期至IIIb期)、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；肾癌，透明细胞癌(优选地I期至II期)、嫌色细胞腺瘤、肉瘤样癌；前列腺腺癌(优选地I期至III期)，良性前列腺增生；肝细胞癌(优选地II期和III期)，恶性肝细胞瘤、纤维板层癌、假腺样(腺样)癌、多形性(巨细胞)癌、以及透明细胞HCC和胆管癌；胰腺癌，导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤；恶性黑色素瘤，优选IV期恶性黑色素瘤和/或以下中的一种或多种：恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤以及软组织黑色素瘤；骨肉瘤、软骨肉瘤以及软组织肉瘤，包括但不限于成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤以及神经纤维肉瘤；淋巴瘤，优选地包括霍奇金氏淋巴瘤(结节硬化型、混合细胞亚型、富含淋巴细胞或淋巴细胞优势型、淋巴细胞消减型、以及未指定型)、B细胞淋巴瘤(弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病)、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤(结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤：塞扎莱综合征和蕈样真菌病、渐变性大细胞淋巴瘤、血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤)；子宫癌，优选地包括子宫内膜样腺癌(优选地I期至IIIc期)；膀胱癌，优选地包括移行细胞癌(优选地II期至IV期)；肺癌，优选地包括小细胞肺癌(优选地I期至IIIb期)、非小细胞肺癌(优选地不良至中度分化的鳞状和腺癌)以及大细胞肺癌；睾丸精原细胞瘤；结肠直肠癌，优选地包括结肠和直肠腺癌(优选地中度至不良分化的)；以及脊髓肿瘤。
不希望受单一假设限制，抗-C1ORF32抗体可以防止针对癌细胞的T细胞刺激的负调节作用。例如，可以将这些分子向培养物中的、体外的或离体的细胞给予，或向人受试者(例如，体内)给予来治疗、预防并且诊断多种病症。
根据本发明的至少一些实施例的这些抗体(例如，人抗体、多特异性分子和双特异性分子、免疫轭合物、替代支架以及组合物)可以用于体内或体外引出一种或多种以下生物活性：抑制表达C1ORF32的细胞的生长和/或杀伤这种细胞；在人效应细胞存在下介导表达C1ORF32的细胞的吞噬作用或ADCC；或封闭C1ORF32配体与C1ORF32的结合。
“治疗”是指治疗性治疗和预防性(prophylactic或preventative)措施两者。需要治疗的那些包括已经患有癌症的那些连同在其中要预防该癌症的那些。因此，有待治疗的哺乳动物在此可能已经被诊断为患有该癌症或可能易患该癌症或对该癌症敏感。如在此所用，术语“治疗”是指上述癌性疾病、病症或病状的预防，发作的延迟，治愈，逆转(reversing)，弱化，缓解，最小化，抑制或停止(halting)其有害作用，或其可觉察的症状的稳定。它还包括管理如上所描述的癌症。“管理”是指降低疾病的严重程度、降低疾病的发作频率、减少这类发作的持续时间、降低这类发作的严重程度、减缓/降低癌症细胞生长或增殖、减缓至少一种症状的进展、改善至少一种可测量的身体参数等。
用于治疗目标的“哺乳动物”是指被分类为哺乳动物的任何动物，包括人、家养动物和农场动物，以及动物园动物、体育动物、或宠物动物，如狗、马、猫、牛、等。优选地，哺乳动物是人。
术语“治疗有效量”是指根据本发明的试剂有效地治疗哺乳动物的疾病或病症的量。
本发明的治疗剂可以单独，或作为它们与药学上可接受的载体混合于其中的药用组合物的一部分来提供给受试者。
根据本发明的至少一些实施例的抗C1ORF32抗体、其片段、轭合物和/或包含它们的药用组合物还可以以组合疗法，即，与其他增效剂和/或其他疗法组合给予。根据至少一些实施例，抗C1ORF32抗体可以与癌症治疗护理标准领域中已知的任何疗法(如可以在例如http://www.cancer.gov/cancertopics中找到)组合使用。
例如，组合疗法可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂、其他化合物或免疫疗法、或免疫刺激策略组合的抗C1ORF32抗体、其片段、轭合物和/或包含它们的药用组合物，该至少一种其他治疗剂或免疫调节剂、其他化合物或免疫疗法、或免疫刺激策略包括但不限于：肿瘤疫苗、过继性T细胞疗法、Treg消减、抗体(例如，贝伐单抗、爱必妥、伊匹单抗)、肽、百普素体、小分子、化学治疗剂，如细胞毒性剂和细胞生长抑制剂(例如，紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂)、免疫学修饰剂(如干扰素和白细胞介素)、免疫刺激性抗体、生长激素或其他细胞因子、叶酸、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱酰酶抑制剂、蛋白酶体抑制剂等。在另一个实例中，组合疗法可以包括与至少一种其他治疗剂或免疫调节剂组合的以下物质：根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体或C1ORF32调节剂，如含有C1ORF32抗原的胞外结构域或一种小分子(如肽、核酶、适体、siRNA)、或与C1ORF32结合的其他药物的一种可溶性多肽轭合物。
根据本发明的至少一些实施例，可以与抗-C1ORF32抗体组合使用的治疗剂是增强抗肿瘤应答的增效剂。
不同策略可供用于将抗-ILDR2封闭性抗体与增效剂进行组合用于癌症免疫疗法。根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与主要目的在于增加内源性抗肿瘤应答的增效剂组合使用，如：
a.与其他癌症免疫疗法组合，如过继性T细胞疗法、治疗性癌症疫苗、或免疫刺激性抗体；
b.某些致死刺激物和细胞凋亡诱导物(如放射疗法和一些经典化学疗法)导致免疫原性细胞死亡，其中死亡性癌细胞用作一种内源性治疗性疫苗并且刺激抗肿瘤免疫应答；
c.数种抗癌剂(包括经典的化学疗法和靶向疗法)通过诱导肿瘤细胞的免疫原性死亡或通过接合免疫效应机制来刺激肿瘤特异性免疫应答(卡鲁兹(Galluzzi)等人2012)。在此方面，节律式化学疗法似乎具有免疫刺激而不是免疫抑制作用。
作为增强抗肿瘤免疫应答的试剂的常规/经典化学疗法选自下组，该组由以(但不限于)下各项组成：
吉西他滨，它增加恶性细胞上的MCH I类的表达、增强肿瘤抗原与T细胞的交叉呈递、并且选择性地杀伤源自骨髓的抑制细胞(MDSC)；
奥沙利铂、顺铂、卡铂(和其他基于铂的化合物)，它们也增加恶性细胞上的MCH I类的表达，从而导致肿瘤抗原与T细胞的增强的交叉呈递；
环磷酰胺，它也增加恶性细胞上的MCH I类的表达。此外，低剂量的环磷酰胺选择性地抑制抑制性细胞亚群(包括MDSC和Treg)，并且有利于CD4辅助细胞分化为IL-17分泌抗肿瘤亚型，恢复NK和T细胞效应子功能，并且抑制免疫抑制细胞因子(即IL-10、IL-4、IL-13)的产生。
蒽环类化合物如阿霉素——其增强肿瘤抗原特异性CD8T细胞的增殖，并且通过IL-17产生γδT细胞和活化的CD8T细胞促进肿瘤浸润；和柔红霉素——其加重癌细胞的抗原表达。
紫杉烷类如紫杉醇——其削弱细胞因子产生和Treg的存活力；和多西他赛——其降低MDSC的水平；
其他微管抑制剂，如长春新碱——其增加特异性DC亚群的丰度，并且刺激DC介导的抗原呈递；
叶酸拮抗剂，如甲氨蝶呤——在低浓度下其似乎促进DC的成熟和它们刺激T细胞的能力。mTOR途径抑制剂(如坦罗莫司和雷帕霉素)，可以具有免疫刺激作用并且增强CD8T细胞活化，同时减少IDO表达和Treg。
某些化学治疗剂(如奥沙利铂、环磷酰胺、阿霉素、以及米托蒽醌)，触发免疫原性细胞死亡。
可以与抗-C1ORF32抗体组合使用的一些化学疗法(如紫杉醇、顺铂、以及阿霉素)具有增加肿瘤细胞至粒酶B的渗透性的能力，从而使它们对CTL介导的溶解敏感，即使它们不表达由CTL识别的抗原(即旁观者效应)。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与双膦酸酯类、尤其是氨基-双膦酸酯类(ABP)组合使用，这些双膦酸酯类已经显示出具有抗癌活性。与ABP相关的一些活性是在人γδT细胞上，这些细胞跨越先天性和获得性免疫的界面并且具有有效的抗肿瘤活性。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与作为增强抗肿瘤免疫应答的试剂的靶向疗法组合使用(卡鲁兹等人2012；范内曼(Vanneman)和德拉诺夫(Dranoff)2012)：
一些靶向试剂似乎至少部分地对脱靶机制发挥它们的治疗功效，这些脱靶机制中的一些是由免疫系统介导的。
例如，数种组蛋白脱酰酶(HDAC)抑制剂(如伏立诺他、丁酸钠以及MS-275)增加癌细胞表面上的NK活化受体配体的表达，从而促进肿瘤细胞被NK细胞识别。硼替佐米(一种蛋白酶体抑制剂)使肿瘤细胞对CTL介导的或NK介导的细胞溶解敏感。
威罗菲尼(一种BRAF抑制剂)增加肿瘤抗原的表达并且减少免疫抑制细胞因子的肿瘤分泌。JAK2抑制剂增强DC成熟和DC介导的抗原呈递和T细胞引发。
某些酪氨酸激酶抑制剂(TKI)如埃罗替尼、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼，通过以下来促进癌症定向免疫应答：增加MHC II类表达、诱导免疫原性细胞死亡、降低肿瘤浸润免疫抑制细胞——Treg和MDS的水平、减少由肿瘤细胞表达的免疫抑制酶IDO和/或抑制DC功能。
某些治疗性单克隆抗体(如抗-EGFR mAb西妥昔单抗和帕尼单抗、或抗-HER2曲妥珠单抗)有利于肿瘤特异性细胞毒性CD8T细胞的产生和NK细胞浸润至肿瘤以及NK细胞介导的mAb-依赖性细胞细胞毒性。贝伐单抗减少Treg并且有利于DC的分化。
不是所有靶向疗法都增强抗肿瘤免疫应答，因为它们中的一些实际上接合不想要的免疫抑制机制，这些免疫抑制机制将对于发动针对肿瘤的免疫应答是有害的。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与靶向Treg的治疗剂组合使用(法恰贝内(Facciabene)等人2012；伯恩等人2011；加布里洛维奇(Gabrilovich)和纳加拉杰(Nagaraj)2009)。
多种通常使用的化学治疗剂减少调节T细胞(Treg)的数目或免疫抑制能力。这些药物(其发挥Treg的非特异性靶向作用)包括抗有丝分裂药物，如环磷酰胺、吉西他滨、米托蒽醌、以及氟达拉滨、以及沙利度胺和沙利度胺衍生物和COX-2抑制剂。
新颖的Treg特异性靶向试剂包括：1)通过识别Treg细胞表面受体直接靶向Treg的消减或杀伤性抗体，如抗-CD25达利珠单抗和巴利昔单抗，或2)配体定向毒素如地尼白介素-毒素连接物(Ontak)：人IL-2和白喉毒素的一种融合蛋白，或LMB-2：一种针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的融合体，3)靶向Treg细胞表面受体如CTLA4、PD-1、OX40以及GITR的抗体。
用于破坏Treg功能的其他选项包括TLR调节、或干扰腺苷能途径的试剂(如外核腺苷酶抑制剂)、或A2A腺苷受体的抑制剂。
用于封闭Treg诱导的选项包括TGF-β抑制剂，并且用于封闭Treg募集至肿瘤组织的选项包括趋化因子受体抑制剂，如CCL2/CCR4途径。
用于靶向MDSC的选项包括促进它们分化为不具有抑制功能的成熟髓样细胞。维生素A代谢物(如视黄酸、全反式视黄酸(ATRA))已经被发现刺激MDSC分化为DC和巨噬细胞。维生素D3近来已经显示出对MDSC具有类似的作用。
另一种选项是通过COX2抑制剂、磷酸二酯酶5抑制剂(像西地那非)、ROS抑制剂(如硝基阿司匹林)抑制MDSC抑制活性。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与作为增强抗肿瘤免疫应答的试剂的免疫刺激抗体组合使用(帕多尔(Pardoll)2012)。
免疫刺激抗体通过直接地调节免疫功能(即封闭其他抑制性靶标或增强共刺激蛋白)来促进抗肿瘤免疫性。在这些之中的是靶向以下免疫检查点的拮抗性抗体：如CTLA4(实例：伊匹单抗)、PD-1(实例：BMS-936558/MDX-1106)、PDL-1(实例：BMS-936559/MDX-1105)、LAG-3(实例：IMP-321)、TIM-3、BTLA，和/或靶向以下免疫刺激蛋白的激动性抗体：如CD40(实例：CP-870、893)、CD137(实例：BMS-663513)、OX40(实例：抗-OX40)、GITR(实例：TRX518)。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与作为增强抗肿瘤免疫应答的试剂的治疗性癌症疫苗组合使用，这些治疗性疫苗允许改善T细胞的引发并且改善抗原呈递(梅尔曼(Mellman)等人2011；波露卡(Palucka)和邦舍罗(Banchereau)2012)。
这类治疗性癌症疫苗的非限制性实例包括外源性癌症疫苗和基于树突状细胞的疫苗。
外源性癌症疫苗包括用于发动针对一种肿癌抗原的免疫原性应答的蛋白质或肽(可能与树突状细胞的引诱剂(如GM-CSF)一起)、编码肿瘤抗原的重组病毒和细菌载体(可能与促炎性或其他引诱剂(如GM-CSF)一起)、编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗、靶向树突状细胞的蛋白质、树突状细胞。
树突状细胞(DC)可以从癌症患者中分离并且通过几种方式被引发用于呈递肿瘤特异性T细胞：可以将DC负载有具有刺激因子(如GM-CSF)的肿癌抗原的融合蛋白或肽，或偶联到DC靶向的mAb，或负载有离体活化和成熟的肿瘤细胞或溶解产物，然后重新输注回到患者中。可以用单核细胞进行类似的途径。树突状细胞还可以通过将辐射处理的细胞因子分泌全肿瘤细胞(如GM-CSF)注射回到肿瘤患者来体内引发——树突状细胞吞噬这些肿瘤细胞并且在体内将肿瘤抗原呈递至T细胞。
根据本发明的至少一些实施例，用于癌症免疫疗法的抗-C1ORF32抗体与过继性细胞转移组合使用以用于增强抗肿瘤免疫应答(雷斯蒂福(Restifo)等人2012)。
免疫疗法的一种途径是基于天然发生的或基因工程化的肿瘤-特异性细胞的过继性转移。用已经离体扩增的细胞群体治疗患者被称为过继性细胞转移(ACT)。在离体扩增之后被输注回到患者中的细胞可以运输到肿瘤并且介导其破坏。可以离体将从肿瘤块提取的具有所希望的T细胞受体(TCR)特异性的T细胞进行选择并且扩增，并且然后过继性转移到患有癌症的患者中。在这种过继性转移之前，可以通过辐射和/或化学疗法对宿主进行免疫消减。淋巴消减、过继性细胞转移以及T细胞生长因子(如IL-2)的组合可以导致肿瘤患者中的延长的肿瘤根除。另外，可以对T细胞进行离体基因工程化以赋予对于肿瘤相关抗原的特异性。例如，可以将具有特别好的抗肿瘤应答的T细胞的TCR克隆插入到病毒表达载体中，并且用于感染来自待治疗的患者的自体T细胞。另一种选项是使用嵌合抗原受体(CAR)，这些嵌合抗原受体具有类似抗体的特异性并且识别移植到能够活化T细胞的TCR细胞内结构域上的靶细胞的表面上的MHC-非限制性结构。
根据本发明的至少一些实施例的C1ORF32特异性抗体、和/或替代支架和/或多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物、包含它们的组合物可以与一种或多种其他治疗剂一起共给予，该一种或多种治疗剂与根据本发明的至少一些实施例的组合物结合或协同起作用以治疗或预防癌症。C1ORF32相关的治疗剂以及该一种或多种其他治疗剂可以按任一顺序或同时地给予。其他治疗剂是例如细胞毒性剂、放射性毒素剂或免疫抑制剂。该组合物可以被连接至该试剂(作为免疫复合体)或可以与该试剂分开给予。在后一种情况(分开给予)下，该组合物可以在该试剂之前、之后或同时给予，或可以与其他已知疗法，例如抗癌疗法(例如辐射)共给予。这类治疗剂除了其他之外还包括抗肿瘤剂，如阿霉素(doxorubicin，adriamycin)、顺铂硫酸博莱霉素、卡莫司汀、瘤可宁、以及环磷酰胺羟基脲，它们本身只有处于对患者有毒性或亚毒性水平才有效。顺铂依照100mg/剂量每四周静脉内给药一次，并且阿霉素依照60-75mg/ml剂量每21天静脉内给药一次。根据本发明的至少一些实施例的人-C1ORF32抗体、或其抗原结合片段和/或替代支架与化学治疗剂的共给予提供两种抗癌剂，这两种抗癌剂经由不同机制起作用，这对人肿瘤细胞产生细胞毒性作用。这样的共给予可以解决归因于使得肿瘤细胞对抗体无反应性的肿瘤细胞对药物的抗性的发展或其抗原性的变化的问题。在其他实施例中，可以另外用一种试剂治疗受试者，该试剂通过(例如)用细胞因子治疗该受试者来调节(例如，增强或抑制)Fcy或Fcy受体的表达或活性。用于在用多特异性分子治疗过程中给予的优选细胞因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、以及肿瘤坏死因子(TNF)。
靶标特异性效应细胞，例如被连接至根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人抗体、多特异性分子以及双特异性分子)的效应细胞也可以被用作治疗剂。用于靶向的效应细胞可以是人白细胞，如巨噬细胞、中性粒细胞或单核细胞。其他细胞包括嗜酸性粒细胞、自然杀伤细胞以及其他带IgG-受体或IgA-受体的细胞。如果希望的话，效应细胞可以从有待治疗的受试者获得。靶标特异性效应细胞可以作为生理学上可接受的溶液中的细胞悬浮液来给予。给予的细胞的数目可以是约10-8至10-9，但是将取决于治疗目的而变化。通常，这个量将足以获得在靶细胞(例如，表达C1ORF32蛋白的肿瘤细胞)处的定位，并且通过例如吞噬作用实现杀伤细胞。给予途径也可以变化。
使用靶标特异性效应细胞的治疗可以与用于去除靶细胞的其他技术结合进行。例如，使用根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人抗体、多特异性分子以及双特异性分子)和/或配备有这些组合物的效应细胞的抗肿瘤疗法可以与化学疗法结合使用。另外的，可以使用组合免疫疗法来使两种不同的细胞毒性效应群体针对肿瘤细胞排斥。例如，被连接至抗-Fc-γ RI或抗-CD3的抗-C1ORF32抗体可以与IgG-或IgA-受体特异性结合剂结合使用。
根据本发明的至少一些实施例的双特异性分子和多特异性分子也可以用来调节效应细胞上的Fc γ R或Fc γ R水平，如通过成帽(capping)并且消除细胞表面上的受体。抗-Fc受体的混合物也可以用于这个目的。
在补体存在的情况下，还可以使用根据本发明的至少一些实施例的具有补体结合位点(如来自结合补体的IgG1、IgG2、或IgG3或IgM的部分)的治疗组合物(例如，人抗体、替代支架、多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物)。在一个实施例中，包含具有根据本发明的至少一些实施例的结合剂的靶细胞以及适当的效应细胞的细胞群体的离体治疗可以通过添加补体或含有补体的血清进行补充。被根据本发明的至少一些实施例的结合剂包衣的靶细胞的吞噬作用可以通过补体蛋白的结合来改善。在另一个实施例中，被根据本发明的至少一些实施例的组合物(例如，人抗体、多特异性分子以及双特异性分子)包衣的靶细胞也可以被补体溶解。在仍另一个实施例中，根据本发明的至少一些实施例的组合物不活化补体。
根据本发明的至少一些实施例的治疗组合物(例如，人抗体、替代支架、多特异性分子和双特异性分子以及免疫轭合物)也可以与补体一起给予。因此，根据本发明的至少一些实施例，存在包含人抗体、多特异性分子或双特异性分子以及血清或补体的组合物。这些组合物是有利的，因为这种补体位于紧密接近这些人类抗体、多特异性分子或双特异性分子处。可替代地，根据本发明的至少一些实施例的人抗体、多特异性分子或双特异性分子与补体或血清可以分开给予。
如在此所用，“药学上可接受的载体”包括生理学上相容的任何以及全部溶剂、分散体介质、涂料、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。优选地，载体适合于静脉内、肌肉内、皮下、肠胃外、脊柱或表皮给予(例如通过注射或输注)。取决于给药途径，活性化合物(即，含有C1ORF32抗原的胞外结构域、抗体、免疫轭合物、替代骨架、和/或双特异性分子的可溶性多肽轭合物)可以被包衣在一种材料中，以保护化合物免受酸的作用和可能使该化合物失活的其他自然条件。根据本发明的至少一些实施例的药用组合物可以包含一种或多种药学上可接受的盐。“药学上可接受的盐”是指保留母体化合物的所希望的生物活性并且不赋予任何所不希望的毒物学作用的盐(参见例如，博尔格·S·M(Berge,S.M.)等人(1977)药学杂志(J.Pharm.Sci.)66:1-19)。这类盐的实例包括酸加成盐以及碱加成盐。酸加成盐包括来源于无毒无机酸的那些盐，这些无机酸例如盐酸、硝酸、磷酸、硫酸、氢溴酸、氢碘酸、磷酸等等，以及来源于无毒有机酸的盐，这些有机酸例如脂族单羧酸和二羧酸、苯基取代链烷酸、羟基链烷酸、芳族酸类、脂族以及芳族磺酸等等。碱加成盐包括来源于碱土金属的那些盐，这些碱土金属如钠、钾、镁、钙等等；以及来源于无毒有机胺的盐，这些有机胺如N,N'-二苄基乙二胺、N-甲基葡萄糖胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、普鲁卡因(procaine)等等。
根据本发明的至少一些实施例的药用组合物还可以包含药学上可接受的抗氧化剂。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：(1)水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠等等；(2)油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等等；以及(3)金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸、以及类似物。可以用于根据本发明的至少一些实施例的药用组合物中的适合的水性和非水性载体的实例包括水、乙醇、多元醇(如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)、以及其适合的混合物，植物油(如橄榄油)，以及可注射有机酯(如油酸乙酯)。适当流动性可例如通过使用涂层材料(例如卵磷脂)在分散液的情况下通过维持所要求的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来维持。
这些组合物还可含有佐剂，如防腐剂、润湿剂、乳化剂以及分散剂。预防存在微生物可通过上述灭菌程序，以及通过包含不同抗细菌剂和抗真菌剂(例如对羟苯甲酸酯(paraben)、氯代丁醇、苯酚山梨酸、以及类似物)来确保。还可以希望的是将等渗剂(如糖、氯化钠、以及类似物)包含于组合物中。另外，可通过包含延迟吸收的试剂(如单硬脂酸铝和明胶)来实现可注射药物形式的延长的吸收。
药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。这些介质和试剂对于药学活性物质的使用在本领域中是已知的。除非任何常规介质或试剂与活性化合物不相容，否则考虑其在根据本发明的至少一些实施例的药用组合物中的用途。辅助活性化合物也可以并入组合物中。
治疗组合物典型地必须在制造以及储存条件下是无菌并且稳定的。组合物可配制为溶液、微乳液、脂质体，或适合于高药物浓度的其他有序结构。载体可以为含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇，以及液体聚乙二醇等等)以及其合适混合物的溶剂或分散介质。适当流动性可例如通过使用涂层(例如卵磷脂)在分散液的情况下通过维持所希望的颗粒大小、以及通过使用表面活性剂来维持。在许多情况下，可取的是将等渗剂，例如糖、多元醇(例如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化钠包含在组合物中。可通过在组合物中包括例如单硬脂酸盐和明胶的延迟吸收的试剂来实现可注射组合物的延长的吸收。无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所希望的成分的粉末。
无菌可注射溶液可通过将所需量的活性化合物根据需要与以上列举的成分中的一个或其组合一起并入适当溶剂中，随后灭菌微滤来制备。总体上，分散液通过将活性化合物并入无菌媒介物中来制备，该无菌媒介物含有一种基础分散介质以及来自以上列举的那些成分的所需其他成分。在制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选制备方法是真空干燥以及冷冻干燥(冻干)，这从其先前无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何另外所希望的成分的粉末。
可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量取决于所治疗的受试者以及具体给予模式而变化。可与载体材料组合以便产生单一剂型的活性成分的量总体上是产生治疗效果的组合物的量。通常，在百分之一百中，与药学上可接受的载体相组合，这个量将在从约百分之0.01至约百分之九十九的活性成分、优选地从约百分之0.1至约百分之70、最优选地从约百分之1至约百分之30的活性成分的范围内。
剂量方案经过调整以便提供最佳所希望应答(例如治疗应答)。例如，可给予单次丸剂，可随着时间的推移来给予若干分次剂量或剂量可按治疗情况的紧急状态指示来按比例减少或增加。尤其有利的是将肠胃外组合物配制成剂量单位形式，以实现方便给予以及剂量均匀性。如在此使用的剂量单位形式是指适合作为用于待治疗的受试者的单一剂量的物理上离散单位；每个单位含有预定数量的经过计算结合所需药用载体以产生所希望治疗效果的活性化合物。根据本发明的至少一些实施例的剂量单位形式的规格由以下因素支配以及直接取决于以下因素：(a)活性化合物的独特特征以及待实现的特定治疗效果，以及(b)调配这种活性化合物以便治疗个体的感受性的领域中固有的限制。
为了给予该抗体，该剂量的范围是从约0.0001至100mg/kg，并且更通常是0.01至5mg/kg的宿主体重。例如，剂量可为0.3mg/kg体重、1mg/kg体重、3mg/kg体重、5mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg范围内。示例性治疗方案必须每周给予一次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每3个月一次或每3至6个月一次。根据本发明的至少一些实施例的抗体的优选剂量方案包括经由静脉内给予1mg/kg体重或3mg/kg体重，其中该抗体是使用以下给药方案给出：(i)每四周，六个剂量，然后每三个月；(ii)每三周；(iii)3mg/kg体重一次，然后每3周1mg/kg体重。
在一些方法中，具有不同结合特异性的两种或更多种单克隆抗体可以被同时给予，在这种情况下给予的每种抗体的剂量落入所指示的范围。抗体通常在多种场合被给予。单一剂量之间的间隔可以是例如，每周、每月、每三个月或每年。间隔也可以是无规律的，如由在患者中测量针对靶标抗原的抗体的血液水平所指示的。在一些方法中，调节剂量以实现约1至1000mug/ml的血浆抗体浓度，并且在一些方法中约25至300微克/ml。
可替代地，治疗剂可以持续释放配制品形式给予，在此情况下所要求的给予频率更小。剂量和频率取决于治疗剂在患者体内的半衰期而变化。总体上，人抗体展示最长半衰期，随后为人源化抗体、嵌合抗体以及非人抗体。融合蛋白的半衰期可广泛地变化。给予剂量和频率可取决于治疗是预防性或是治疗性而变化。在预防性应用中，相对较低剂量以相对稀少的间隔在长时期内给予。一些患者在其余生继续接受治疗。在治疗性应用中，有时要求相对较短间隔下的相对较高剂量直到疾病进展减少或终止为止，并且优选地直到患者展示疾病症状的部分或完全改进为止。此后，可向患者给予预防方案。
本发明的药用组合物中的活性成分的实际剂量水平可以改变以便获得对于具体患者、组合物以及给予模式可有效实现所希望的治疗应答，而对患者无毒的活性成分的量。选择的剂量水平将取决于各种药代动力学因素，包括所使用的本发明的具体组合物或其酯、盐或酰胺的活性、给予途径、给予时间、所使用的具体化合物的排泄速率、治疗持续时间、与所使用的具体组合物组合使用的其他药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病状、一般健康状况以及以前病史，以及医学领域熟知的类似因素。
根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体的“治疗有效剂量”优选地导致疾病症状的严重程度的降低、无疾病症状期的频率和持续时间的增加、寿命的增加、疾病的缓和、或归因于疾病折磨的损伤或残疾的预防或减少。例如，对于C1ORF32阳性肿瘤的治疗来说，相对于未治疗的受试者，“治疗有效剂量”优选地抑制细胞生长或肿瘤生长达至少约20％，更优选达至少约40％，甚至更优选达至少约60％，并且仍然更优选达至少约80％。化合物抑制肿瘤生长的能力可以在预测在人类肿瘤中的疗效的一种动物模型中进行评估。可替代地，组合物的这种特性可以通过检查该化合物抑制的能力来进行评价，这样的体外抑制是通过熟练的从业者已知的测定进行的。治疗化合物的治疗有效量可以降低肿瘤尺寸，或以另外的方式改善受试者的症状。
本领域普通技术人员将能够基于诸如受试者体型、受试者症状的严重程度以及所选择的具体组合物或给予途径的因素来确定治疗有效量。
本发明的组合物可以经由一种或多种给予途径、使用在本领域中已知的各种方法中的一种或多种来给予。如本领域技术人员将认识到，给予途径和/或模式将取决于所希望的结果而变化。根据本发明的至少一些实施例的治疗剂的优选给予途径包括血管内递送(例如注射或输注)、静脉内、肌肉内、真皮内、腹膜内、皮下、脊柱、口服、肠内、直肠、肺部(例如吸入)、鼻腔、局部(包括经皮肤、口腔以及舌下)、膀胱内、玻璃体内、腹膜内、阴道、大脑递送(例如脑室内、大脑内以及对流增强扩散)、CNS递送(例如鞘内、髓周以及脊柱内)或肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内以及真皮内)、经粘膜(例如舌下给予)给予或经由植入物给予，或其他肠胃外给予途径，例如通过注射或输注，或在本领域中已知的其他递送途径和/或给予形式。如在此所用，短语“肠胃外给予”意味着除了肠给予和局部给予之外的、通常通过注射的给予模式，并且包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘内、囊内、眼眶内、心内、真皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外以及胸骨内注射和输注。在一个具体实施例中，根据本发明的至少一些实施例的蛋白质、治疗剂或药用组合物可腹膜内或静脉内给予。
可替代地，调节C1ORF32蛋白活性的C1ORF32特异性抗体和/或其轭合物和/或替代支架和/或其组合可以经由非肠胃外途径给予，如局部、表皮或粘膜给药途径，例如，鼻内、口服、鞘、直肠、舌下或局部地。
活性化合物可用将保护化合物以便避免快速释放的载体来制备，例如控释制剂，包括植入物、经皮贴片以及微囊化递送系统。可以使用可生物降解的、生物相容的聚合物，如乙烯-乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯以及聚乳酸。用于制备这类配制品的许多方法是授予专利的或通常是本领域技术人员已知的。参见例如，持续以及受控释放药物递送系统(Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems)，J·R·罗宾逊(Robinson)编辑，马塞尔德克有限公司(Marcel Dekker,Inc.)，纽约(New York)，1978。
治疗组合物可以用在本领域中已知的医学装置来给予。例如，在一个优选实施例中，根据本发明的至少一些实施例的治疗组合物可以使用针状皮下注射装置来给予，如在美国专利号5,399,163；5,383,851；5,312,335；5,064,413；4,941,880；4,790,824；或4,596,556中所披露的装置。适用于本发明的熟知的植入物和模块的实例包括：美国专利号4,487,603，其披露了一种用于以受控的速率分配药剂的可植入的微型输注泵；美国专利号4,486,194，其披露了一种用于通过皮肤给予药物的治疗装置；美国专利号4,447,233，其披露了一种用于以精确输注速率递送药剂的药剂输注泵；美国专利号4,447,224，其披露了一种用于连续药物递送的可变流动可植入的输注装置；美国专利号4,439,196，其披露了一种具有多室隔室的渗透药物递送系统；以及美国专利号4,475,196，其披露了一种渗透药物递送系统。这些专利通过引用结合在此。许多其他这类植入物、递送系统以及模块是本领域技术人员已知的。
在某些实施例中，可以配制这些抗体以确保适当的体内分布。例如，血脑屏障(BBB)排除许多高度亲水性化合物。为了确保根据本发明的至少一些实施例的治疗化合物穿过BBB(如果希望)，它们可例如在脂质体中进行配制。关于制造脂质体的方法，参见例如，美国专利号4,522,811；5,374,548；以及5,399,331。脂质体可以包含被选择性运输至特定细胞或器官中、由此增强靶向药物递送的一个或多个部分(参见例如V·V·兰纳德(V.V.Ranade)(1989)临床药理学杂志(J.Clin.Pharmacol.)29:685)。示例性靶向部分包括叶酸或生物素(参见例如，洛(Low)等人的美国专利号5,416,016)；甘露糖苷(梅泽(Umezawa)等人，(1988)，生物化学生物物理学研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)153:1038)；抗体(P·G·布罗曼(P.G.Bloeman)等人(1995)欧洲生物化学学会联盟快讯(FEBS Lett.)357:140；M·欧维斯(M.Owais)等人(1995)抗微生物剂化学治疗(Antimicrob.Agents Chemother.)39:180)；表面活性蛋白A受体(布里斯科(Briscoe)等人(1995)美国生理学杂志(Am.J Physiol.)1233:134)；p120(施雷尔(Schreier)等人(1994)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)269:9090)；还参见K·凯纳宁(K.Keinanen)、M·L·劳卡宁(M.L.Laukkanen)(1994)欧洲生物化学学会联盟快讯346:123；J·J·基林(J.J.Killion)、I·J·菲德勒(I.J.Fidler)(1994)免疫方法(Immunomethods)4:273。
根据本发明的至少一些实施例的抗-C1ORF32抗体可以用作中和抗体。中和抗体(Nab)是能够结合并且中和或抑制特异性抗原由此抑制其生物作用(例如通过封闭细胞或病毒上的受体、抑制该病毒与宿主细胞的结合)的一种抗体。Nab将通过封闭其活性所需的重要的表面分子抑或通过妨碍该试剂与靶细胞上的其受体的结合来部分地或完全地废除试剂的生物作用。
用于肠胃外给予的配制品
在一个进一步的实施例中，在此披露的组合物(包括含有肽和多肽的那些)是以水溶液形式通过肠胃外注射来给予。这种制剂也可呈悬浮液或乳液形式。通常，所提供的药用组合物包含有效量的肽或多肽，并且任选地包含药学上可接受的稀释剂、防腐剂、增溶剂、乳化剂、佐剂和/或载体。这类组合物任选地包含以下物质中的一种或多种：稀释剂、无菌水，不同缓冲内容物(例如Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)、pH以及离子强度的缓冲盐水；以及添加剂，如清洁剂和增溶剂(例如，TWEEN20(聚山梨醇酯-20)、TWEEN80(聚山梨醇酯-80))，抗氧化剂(例如水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、焦亚硫酸钠、半胱胺酸盐酸盐、硫酸氢钠、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠；油溶性抗氧化剂，如抗坏血酸棕榈酸酯、丁羟茴醚(BHA)、丁羟甲苯(BHT)、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚；以及金属螯合剂(如柠檬酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、山梨糖醇、酒石酸、磷酸)，以及防腐剂(例如硫柳汞、苯甲醇)和增量物质(例如乳糖、甘露糖醇)。非水性溶剂或媒介物的实例是乙醇、丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄榄油和玉米油)、明胶，以及可注射有机酯，如油酸乙酯。这些制剂可冷冻干燥(冻干)或真空干燥并且在即将使用之前再溶解/再悬浮。这种制剂可通过(例如)经由细菌保留过滤器过滤、通过将灭菌剂并入组合物中、通过辐射处理组合物、或通过加热组合物来进行灭菌。
局部给予的配制品
在此披露的C1ORF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体可以局部应用。局部给予对于大多数肽配制品并不能良好地起作用，但是如果应用至肺、鼻腔、口腔(舌下、颊腔)、阴道或直肠粘膜，它可以是尤其有效的。
组合物在以具有小于约5微米的气体动力学直径的气溶胶抑或喷雾干燥颗粒形式递送时可在吸入时被递送至肺并且横穿肺上皮衬里到达血流。
可以使用被设计成经肺部递送治疗产品的广泛范围的机械装置，包括但不限于雾化器、计量剂量吸入器以及粉末吸入器，这些全部是本领域技术人员所熟悉的。可商购的装置的一些具体实例是Ultravent雾化器(马林克罗制药公司(Mallinckrodt Inc.)，密苏里州圣路易斯(St.Louis,Mo.))；Acorn II雾化器(马奎斯特医疗产品(Marquest Medical Products)，科罗拉多州恩格尔伍德(Englewood,Colo.))；Ventolin计量剂量吸入器(葛兰素公司(Glaxo Inc.)，北卡罗来纳州研究三角园(Research Triangle Park,N.C.))；以及Spinhaler粉末吸入器(费森斯公司(Fisons Corp.)，马萨诸塞州贝德福德(Bedford,Mass.))。Nektar、Alkermes以及Mannkind都具有经过批准或处于临床试验中的可吸入胰岛素粉末制剂，其中这种技术可应用于在此描述的配制品。
给予至粘膜的配制品典型地将是喷雾干燥的药物颗粒，它们可并入片剂、凝胶剂、胶囊剂、悬浮液或乳液中。标准药用赋形剂可从任何配方设计师处获得。口服制剂可呈口香糖、凝胶条、片剂或锭剂形式。还可制备经皮配制品。这些通常将是软膏、洗剂、喷雾剂或贴片，全部可使用标准技术来制备。经皮配制品将需要包含渗透促进剂。
受控的递送聚合物基质
在此披露的C1ORF32多肽、片段、融合多肽、核酸以及载体也可以在受控释放配制品中给予。可制造受控释放聚合物装置以便在植入聚合物装置(杆、圆柱体、膜、盘)或注射(微粒)之后全身性长期释放。基质可呈例如微球的微粒形式，其中肽分散于固体聚合物基质或微胶囊中，其中核心具有与聚合物外壳不同的材料，并且肽是分散或悬浮于在性质上可为液体或固体的核心中。除非在此明确定义，否则微粒、微球以及微胶囊可互换使用。可替代地，聚合物可铸造成从数纳米至四厘米范围内的薄板或膜、通过研磨或其他标准技术产生的粉末，或甚至如水凝胶的凝胶。
可使用不可生物降解抑或可生物降解的基质递送多肽或编码多肽的核酸，但是可生物降解基质是优选的。这些基质可以为天然或合成聚合物，但是合成聚合物由于降解以及释放概况的更好表征而为优选的。该聚合物是基于所希望的释放时段来选择的。在一些情况下，线性释放可能是最有用的，尽管在其他情况中，脉冲释放或“大量释放”可以提供更有效的结果。聚合物可以呈水凝胶(通常吸收多达按重量计约90％的水)形式，并且可任选地与多价离子或聚合物交联。
基质可以通过溶剂蒸发、喷雾干燥、溶剂萃取以及本领域技术人员已知的其他方法来形成。可生物蚀解的微球可以使用开发用于制作微球以便进行药物递送的任何方法来制备，这些方法例如由马西威兹(Mathiowitz)和朗格尔(Langer)，受控释放杂志(J.Controlled Release)，5:13-22(1987)；马西威兹等人，反应性聚合物(Reactive Polymers)，6:275-283(1987)；以及马西威兹等人，应用高分子科学杂志(J.ApplPolymer ScL)，35:755-774(1988)所描述。
这些装置可经过配制用于局部释放来治疗植入或注射区域—通常将递送比用于治疗整个身体或全身递送的剂量少得多的剂量。这些装置可被植入或注射至皮下、肌内、脂肪或被吞咽。
抗-C1ORF32抗体的诊断用途
根据本发明的至少一些实施例，抗体(例如，人单克隆抗体、多特异性分子和双特异性分子以及组合物)可以用于检测C1ORF32的水平或在其膜剂表面上含有C1ORF32的细胞的水平，然后可以将这些水平与某些疾病症状相联系。可替代地，这些抗体可以用于抑制或封闭C1ORF32功能，这进而可以与癌症的预防或改善相联系。这可以通过以下来实现：使样品和对照样品与抗-C1ORF32抗体在允许相应的抗体与C1ORF32之间形成复合体的条件下相接触。在样品和对照物中检测并且比较该抗体与C1ORF32之间形成的任何复合体。
根据本发明的至少一些实施例，这些抗体(例如，人抗体，多特异性分子和双特异性分子以及组合物)可以最初在体外针对与治疗或诊断用途相关的结合活性进行测试。例如，根据本发明的至少一些实施例的组合物可以使用流式细胞术测定来进行测试。
还在本发明范围内的是试剂盒，这些试剂盒包括根据本发明的至少一些实施例的C1ORF32特异性抗体(例如，人抗体、替代支架、双特异性分子或多特异性分子、或免疫轭合物)和使用说明书。该试剂盒可以进一步包含一种或多种另外的试剂(如免疫抑制剂、细胞毒性剂或放射性毒素剂)，或根据本发明的至少一些实施例的一种或多种另外的人抗体(例如，具有互补活性、与相异于第一人抗体的抗原中的表位结合的一种人抗体)。
根据本发明的至少一些实施例的抗体也可以用来靶向表达Fc γ R或C1ORF32的细胞，例如用于标记这类细胞。对于这种用途来说，结合剂可以连接至可以被检测的一种分子。因此，本发明提供用于离体或体外定位表达Fc受体(如Fc γ R)或C1ORF32抗原的细胞。可检测的标记可以是，例如，放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子。
在具体实施例中，本发明提供分别用于检测样品中C1ORF32抗原的存在和/或水平、或测量C1ORF32抗原的量的方法，这些方法包括使该样品和对照样品与一种抗体、或其一种抗原结合部分(其与C1ORF32特异性地结合)在允许该抗体或其部分与C1ORF32之间形成复合体的条件下相接触。然后检测复合体的形成，其中该样品与对照样品相比之间的差异复合体形成指示该样品中C1ORF32抗原的存在。如上所述，本发明具体地说包括用于体外或体内检测C1ORF32抗原的测定，如免疫测定、放射免疫测定、放射性测定、放射成像测定、ELISA、蛋白质印迹法、FACS、狭线印迹、免疫组织化学测定、以及本领域技术人员熟知的其他测定。
在仍另一个实施例中，可以使用本发明的免疫轭合物通过将化合物连接至抗体而将这类化合物(例如，治疗剂、标记、细胞毒素、放射性毒素、免疫抑制剂等)靶向具有C1ORF32细胞表面受体的细胞。因此，本发明还提供了用于离体或体内定位表达C1ORF32的细胞的方法(例如，用可检测的标记，如放射性同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子)。可替代地，这些免疫轭合物可以用于通过使细胞毒素或放射性毒素靶向C1ORF32抗原来杀伤具有C1ORF32细胞表面受体的细胞。
根据至少一些实施例，本发明提供一种用于使一个器官或组织成像的方法，该方法包括：(a)向有需要这种成像的受试者给予一种标记的多肽；并且(b)检测该标记的多肽以确定该标记的多肽集中于受试者体内的位置。当用于成像应用中时，根据本发明的至少一些实施例的标记的多肽通常具有与其共价或非共价附接的成像剂。适合的成像剂包括但不限于放射性核素、可检测标签、荧光团、荧光蛋白、酶蛋白、以及类似物。本领域技术人员将熟悉将成像剂附接至多肽的其他方法。例如，成像剂可经由位点特异性轭合来附接，例如，将成像剂共价附接至肽连接物，如存在于Fc融合分子的羧基末端的具有五个至七个精氨酸的聚精氨酸部分。成像剂还可直接经由非位点特异性轭合来附接，例如，将成像剂共价附接至存在于多肽中的伯胺基团。本领域技术人员将认识到成像剂还可经由非共价相互作用(例如离子键、疏水性相互作用、氢键、范德华力、双极子-双极子键等)来结合至蛋白质。
在某些情况下，通过将放射性核素直接附接至多肽来将多肽用放射性核素进行放射性标记。在某些其他情况中，放射性核素结合至螯合剂或附接至多肽的螯合剂-接头。用于直接轭合的适合的放射性核素包括但不限于18F、124I、125I、131I及其混合物。与螯合剂一起使用的适合的放射性核素包括但不限于，47Sc、64Cu、67Cu、89Sr、86Y、87Y、90Y、105Rh、111Ag、111In、117m Sn、149Pm、153Sm、166Ho、177Lu、186Re、188Re、211At、212Bi及其混合物。优选地，结合至螯合剂的放射性核素是64Cu、90Y、111In或其混合物。适合的螯合剂包括但不限于DOTA、BAD、TETA、DTPA、EDTA、NTA、HDTA、其膦酸酯类似物及其混合物。本领域技术人员将熟悉用于将放射性核素、螯合剂以及螯合剂-连接物附接至本发明的多肽的方法。具体地说，附接可便利地使用(例如)可商购的双官能连接基团(通常为异双官能连接基团)来完成，这些连接基团可附接至存在于多肽上的无干扰位置中的官能团，并且然后进一步连接至放射性核素、螯合剂或螯合剂-连接物。
适合于用作成像剂的荧光团或荧光染料的非限制实例包括Alexa染料(英杰生命技术有限公司(Invitrogen Corp.)；加利福尼亚州卡尔斯巴德(Carlsbad,Calif.))、荧光素、异硫氰酸荧光素(FITC)、Oregon GreenTM；若丹明、得克萨斯红、异硫氰酸四若丹明(TRITC)、CyDyeTM荧光剂(例如Cy2、Cy3、Cy5)等等。
适合于用作成像剂的荧光蛋白的实例包括但不限于绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白(例如DsRed)、黄色荧光蛋白、青色荧光蛋白、蓝色荧光蛋白以及其变体(参见例如美国专利号6,403,374、6,800,733以及7,157,566)。GFP变体的具体实例包括但不限于，增强的GFP(EGFP)、去稳定的EGFP、描述于多恩(Doan)等人，分子生物学(Mol.Microbiol.)，55:1767-1781(2005)中的GFP变体，描述于克莱默(Crameri)等人，自然生物技术，14:315-319(1996)中的GFP变体，描述于里佐(Rizzo)等人，自然生物技术，22:445(2004)和钱(Tsien)，生物化学年评(Annu.Rev.Biochem.)，67:509(1998)中的天蓝色荧光蛋白，以及描述于内格尔(Nagal)等人，自然生物技术，20:87-90(2002)中的黄色荧光蛋白。DsRed变体描述于例如谢恩(Shaner)等人，自然生物技术，22:1567-1572(2004)中并且包括mStrawberry、mCherry、morange、mBanana、mHoneydew以及mTangerine。另外DsRed变体描述于，例如，王(Wang)等人，美国科学院院刊101:16745-16749(2004)中，并且包括mRaspberry和mPlum。DsRed变体的另外实例包括描述于菲舍尔(Fischer)等人，欧洲生物化学学会联盟快讯，577:227-232(2004)中的mRFPmars和描述于菲舍尔等人，欧洲生物化学学会联盟快讯，580:2495-2502(2006)中的mRFPruby。
在其他实施例中，结合至根据本发明的至少一些实施例的多肽的成像剂包括可检测标签，例如像生物素、抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白或中性链亲和素。在其他实施例中，成像剂包含酶蛋白，包括但不限于荧光素酶、氯霉素乙酰转移酶、β-半乳糖苷酶、β-葡糖醛酸酶、辣根过氧物酶、木聚糖酶、碱性磷酸酶、以及类似物。
在本领域中已知用于检测受试者体内的放射性核素的放射性发射的任何装置或方法是适用于本发明的。例如，如使用旋转γ照相机和放射性核素闪烁照相术检测来自单光子γ发射放射性核素的辐射的单光子发射计算机断层术(SPECT)的方法(其使用闪烁γ照相机获得组织、器官或身体系统中放射性核素分布的一个图像或一系列连续图像)可以用于检测从本发明的放射性标记的多肽所发射的辐射。正电子发射断层术(PET)是用于检测受试者体内的辐射的另一种适合的技术。旨在用于医学用途的微型并且灵活的辐射检测器由Intra-Medical LLC(加利福尼亚州圣塔莫尼卡(Santa Monica,Calif.))生产。磁共振成像(MRI)或本领域技术人员已知的任何其他成像技术也适合于检测放射性核素的放射性发射。不管所使用的方法或装置为何，这种检测旨在确定标记的多肽集中于受试者体内的位置，并且这种浓度是疾病活性的指标。
动物和人的非侵入性荧光成像还可提供体内诊断信息并且用于多种临床专科中。例如，多年以来已开发出用于在UV激发之后进行简单眼部观察直至使用先进设备进行复杂光谱成像的技术(参见例如安德森(Andersson)-恩格斯(Engels)等人，医学和生物学中的物理学(Phys.Med.Biol.)，42:815-824(1997))。用于体内检测荧光(例如，来自荧光团或荧光蛋白)的本领域已知的具体装置和方法包括但不限于，体内近红外荧光(参见例如，弗兰基尼(Frangioni)，化学生物当前观点(Curr.Opin.Chem.Biol.)，7:626-634(2003))、MaestroTM体内荧光成像系统(美国剑桥科研仪器公司(Cambridge Research&Instrumentation,Inc.)；沃本(Woburn)，马塞诸塞州(Mass.))、使用飞点扫描器的体内荧光成像(参见例如，拉马努金(Ramanujam)等人，IEEE生物医学工程会报(IEEE Transactions on Biomedical Engineering)，48:1034-1041(2001))等。
用于检测光学应答的其他方法或装置包括但不限于目视检查、CCD摄像机、视频摄像机、摄影胶片、激光扫描装置、荧光计、光电二极管、量子计数器、落射荧光显微镜、扫描显微镜、流式细胞仪、荧光酶标仪或使用光电倍增器管的信号放大。
根据一些实施例，用于进行根据本发明的至少一些实施例的诊断测定、取自受试者(患者)的样品选自下组，该组由以下各项组成：体液或分泌物，包括但不限于血液、血清、尿液、血浆、前列腺液、精液(seminalfluid)、精液(semen)，皮肤、呼吸道、肠道、以及泌尿生殖道的外分泌物，眼泪、脑脊髓液、滑液、痰液、唾液、乳、腹膜液、胸膜液、囊液，乳腺导管系统(the breast ductal system)(和/或其灌洗)、支气管肺泡灌洗、生殖系统的灌洗、以及身体的任何其他部分或身体中的系统的灌洗的分泌物；任何器官(包括分离的细胞或组织)的样品，其中该细胞或组织可以从一种选自以下但不限于以下的器官获得：肺、前列腺、结肠、卵巢和/或乳房组织、和/或任何其他实体组织；粪便或组织样品，或其任何组合。在一些实施例中，这个术语涵盖体内细胞培养组分的样品。在经受诊断测定之前，该样品可以任选地使用一种适合的洗脱液进行稀释。
在一些实施例中，在本发明背景下的短语“标志物”是指与取自不患有上述疾病或病状之一的受试者的一种可比较的样品相比，有差异地存在于取自患有在此所描述的疾病或病状之一的患者(受试者)的样品中的核酸片段、肽、或多肽。
在一些实施例中，短语“有差异地存在”是指与取自不患有在此所描述的疾病或病状之一的患者的一种可比较的样品相比，存在于取自患有在此所描述的疾病或病状之一的患者的样品中的标志物的量或质量上的差异。例如，如果一种样品中的核酸片段的量显著不同于另一种样品中的核酸片段的量，那么核酸片段可以任选地差异地存在于这两种样品之间，例如如通过杂交和/或基于NAT的测定所测量的。如果一种样品中的多肽的量显著不同于另一种样品中的多肽的量，那么多肽可以任选地差异地存在于这两种样品之间。应该指出的是，如果该标志物在一种样品中是可检测的但在另一种样品中是不可检测的，那么可以认为这样的一种标志物是差异地存在的。可任选地，如在此所描述，相对低量的上调可以充当该标志物。本领域的普通技术人员可以容易地确定这样的相对水平的标志物；进一步的指导提供于下面的每种单独的标志物的说明之中。
在一些实施例中，短语“诊断(diagnostic)”意味着鉴定一种病理学病状的存在或性质。诊断方法在其敏感性和专一性方面存在不同。诊断测定的“敏感性”是测试呈阳性的患病个体的百分数(“真阳性”的百分数)。未由该测定检测的患病个体是“假阴性”。未患病并且在该测定中呈阴性的受试者被叫做“真阴性”。诊断测定的“专一性”是1减去假阳性率，其中“假阳性”率被定义为测试呈阳性但不患有该疾病的那些的比例。尽管一种具体的诊断方法可能不提供病状的决定性诊断，但是如果这种方法提供在诊断中协助的阳性指示，它就是合格的。
如在此所用，术语“诊断(diagnosis)”是指通过其病征、症状、并且特别是从不同诊断程序的结果来鉴定医学病状或疾病的过程，这些诊断程序包括例如，在从个体获得的生物样品(例如，如下所定义的，在细胞、组织或血清中)中检测根据本发明的至少一些实施例的核酸或多肽的表达。此外，如在此使用，术语“诊断(diagnosis)”涵盖以下：筛选疾病，检测疾病的存在或严重程度，提供疾病的预后，监测疾病的进展或复发，连同对疾病、病症或病状的疗效和/或复发的评估，以及为疾病选择一种疗法和/或治疗，给定的疾病疗法的优化，监测疾病的治疗，和/或预测针对特定患者或亚群体的疗法的适合性或确定治疗产品在患者或亚群体中的适当配量。诊断程序可以在体内或体外进行。
在一些实施例中，当就如在此所描述的多核苷酸或多肽的表达水平上的差异而论时，短语“定性”是指表达的存在对比不存在；或在一些实施例中，是指表达的时空调节；或在一些实施例中，是指表达的时机；或在一些实施例中，是指对表达的分子的任何翻译后修饰；以及其他如本领域普通技术人员所理解的。在一些实施例中，当就如在此所描述的多核苷酸或多肽的表达水平上的差异而论时，短语“定量”是指表达量上的绝对差异，如通过任何本领域中已知的手段所确定的；或在其他实施例中，是指统计学上可以是显著的相对差异；或在一些实施例中，当被视为一个整体或在延长的一段时间内等，指示就表达的差异而言的趋势。
在一些实施例中，术语“诊断(diagnosing)”是指把疾病或症状分级，确定疾病的严重性，监测疾病的进展，预测疾病的后果和/或恢复的前景。术语“检测”还可以任选地涵盖以上任一项。
在一些实施例中，对根据本发明的疾病的诊断可以受到对从受试者获得的生物样品中的本发明的多核苷酸或多肽的水平的确定的影响，其中所确定的水平可以与该疾病的易患病体质、或存在或不存在有关。应该指出的是，“从受试者获得的生物样品”还可以任选地包括未从该受试者身体上移除的样品，如下进行更加详细的描述。
在一些实施例中，术语“水平”是指RNA和/或蛋白质的表达水平，或是指本发明的标志物的DNA拷贝数。
典型地，从受试者获得的生物样品中的标志物的水平与从一个健康个体获得的类似样品(生物样品的实例是在此所描述的)中的同一标志物的水平是不同的(即，增加或减少)。
为了确定一个受试者中的感兴趣的标志物的DNA、RNA和/或多肽的水平，可以利用许多熟知的组织或流体采集方法来从受试者采集生物样品。
实例包括但不限于：细针穿刺活检，穿刺活检，芯针穿刺活检以及手术活检(例如，脑活检)，以及灌洗。不管所使用的程序，一旦获得活检/样品，就可以确定该标志物的水平并且因此可以做出诊断。
确定同一来源的正常组织中的同一标志物的水平优选地并行实现，以对照正常组织检测该标志物的升高的表达和/或扩增和/或减少的表达。
在一些实施例中，术语标志物的“测试量”是指与具体疾病或病状的诊断一致的受试者样品中的标志物的量。测试量可以是绝对量(例如，微克/ml)抑或相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施例中，术语标记的“对照量”可以是有待与标志物的测试量进行比较的任何量或一系列的量。例如，标志物的对照量可以是患有具体疾病或病状的患者或不患有这样的一种疾病或病状的人中的标记的量。对照量可以是绝对量(例如，微克/ml)抑或相对量(例如，信号的相对强度)。
在一些实施例中，术语“检测”是指鉴定有待检测的目标的存在、不存在或量。
在一些实施例中，术语“标记”包括被光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段可检测的任何部分或事项。例如，有用的标记包括32P，35S，荧光染料，电子致密试剂，酶(例如，如在ELISA中常用的)，生物素-链霉亲和素，毛地黄毒苷(dioxigenin)，针对其的抗血清或单克隆抗体可获得的半抗原和蛋白，或具有与靶标互补的序列的核酸分子。标记通常产生一种可以用来定量样品中结合的标记的量的可测量的信号，例如放射性信号、发色信号、或荧光信号。该标记可以共价地、抑或通过离子键、范德华力或氢键被合并进或附接至引物或探针，例如与被链霉亲和素识别的放射性核苷酸、或生物素化的核苷酸合并。该标记可以是直接或间接可检测的。间接检测可以涉及一个第二标记与该第一标记直接或间接地结合。例如，该标记可以是结合配偶体的配体，例如作为链霉亲和素的结合配偶体的生物素，或作为可以与其特异性杂交的互补序列的结合配偶体的核苷酸序列。结合配偶体本身可以是直接可检测的，例如，抗体本身可以被荧光分子所标记。结合配偶体还可以是间接可检测的，例如，具有互补核苷酸序列的核酸可以是分支DNA分子的一部分，这通过与其他标记的核酸分子的杂交反过来是可检测的(参见例如，法荷兰德(P.D.Fahrlander)和克劳斯纳(A.Klausner)，生物/技术(Bio/Technology)6:1165(1988))。信号的定量例如通过闪烁计数法、光密度测定法或流式血细胞计数术实现。
可任选地并且优选地用于与免疫测定一起使用的示例性可检测的标记包括但不限于磁珠，荧光染料，放射性标记，酶(例如，辣根过氧化物、碱性磷酸酯酶以及ELISA中常用的其他物质)，以及量热标记(如胶体金或有色玻璃或塑料珠)。可替代地，样品中的该标志物可以使用间接测定来检测，其中例如使用一种第二、标记抗体来检测结合的标志物特异性抗体；和/或竞争或抑制测定，其中例如将与该标志物的不同表位结合的单克隆抗体与该混合物同时孵育。
“免疫测定”是使用与抗原特异性结合的抗体的一种测定。免疫测定的特征在于使用具体抗体的特异性结合特性来分离、靶向、和/或定量该抗原。
当提及蛋白质或肽(或其他表位)时，在一些实施例中，短语与抗体“特异性(或选择性)结合”或“与…具有特异性(或选择性)免疫反应性”或“特异性相互作用或结合”，是指确定蛋白质以及其他生物制剂的异质群体中的蛋白质的存在的结合反应。因此，在特指的免疫测定的条件下，特异性抗体与具体蛋白质的结合比背景(非特异性信号)大至少两倍，并且不以显著的量实质上地与该样品中存在的其他蛋白质结合。在这样的条件下，与抗体的特异性结合可能需要针对其对具体蛋白质的特异性对抗体进行选择。例如，可以选择为来自特定物种(如大鼠、小鼠、或人)的精液碱性蛋白而培养的多克隆抗体，以获得与精液碱性蛋白具有特异免疫反应性而与其他蛋白质(除了精液碱性蛋白的多态变体和等位基因之外)不具有特异免疫反应性的仅那些多克隆抗体。这种选择可以通过减去与来自其他物种的精液碱性蛋白交叉反应的抗体来实现。可以使用多种免疫测定方式来选择与具体蛋白具有特异免疫反应性的抗体。例如，常规地使用固相ELISA免疫测定来选择与蛋白质具有特异免疫反应性的抗体(参见例如，哈洛(Harlow)和莱恩(Lane)，抗体：实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，(1988)，用于说明可以用来确定特异免疫反应性的免疫测定方式和条件)。典型地，特异性或选择性反应将是至少两倍背景信号或背景噪声，并且更典型地大于10倍至100倍背景。
在另一个实施例中，本发明提供了一种用于在生物样品中检测本发明的多肽的方法，包括：使生物样品与特异性识别根据本发明的多肽的一种抗体进行接触并且检测所述相互作用；其中相互作用的存在与该生物样品中多肽的存在相关。
在本发明的一些实施例中，在此所描述的这些多肽是用于诊断疾病和/或指示病状的标志物的非限制性实例。本发明的每种标志物可以单独地或组合地用于不同用途，包括但不限于疾病和/或指示病状的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测。
本发明的每种多肽/多核苷酸可以单独地或组合地用于不同用途，包括但不限于疾病和/或指示病状的预后、预测、筛选、早期诊断、确定进展、疗法选择以及治疗监测，如上所详细说明的。
这样的一种组合可以任选地包括标志物的任何亚组合，和/或特征是至少一种其他标志物(例如一种已知的标志物)的组合。此外，关于确定在此所描述的任何标志物与在此所描述的任何其他标志物、和/或任何其他已知标志物、和/或任何其他标志物之间的定量的或半定量的测量值的比例，这样的一种组合可以任选地并且优选地如上所描述的来使用。
在本发明的一些实施例中，提供了用于疾病或病状的诊断的方法、用途、装置以及测定。可任选地，可以与本发明一起使用多个标志物。多个标志物可以任选地包括在此所描述的标志物，和/或一个或多个已知标志物。优选地，然后使多个标志物与该疾病或病症相关联。例如，这样的关联可以任选地包括对多个标志物中的每个的浓度进行确定，以及单独地将每个标志物浓度与阈值水平进行比较。可任选地，如果该标志物浓度高于或低于阈值水平(取决于该标志物和/或正在进行的诊断测试)，那么该标志物浓度与该疾病或病状相关联。可任选地并且优选地，多个标志物浓度与该疾病或病状相关联。
可替代地，这样的关联可以任选地包括对多个标志物中的每个的浓度进行确定，基于多个标志物中的每个的浓度计算单一指数值，以及将这个指数值与阈值水平进行比较。
还可替代地，这样的关联可以任选地包括对至少一种标志物中的暂时变化进行确定，并且其中将该暂时变化用于关联步骤中。
还可替代地，这样的关联可以任选地包括对至少“X”数目的多个标志物是否具有预定范围外和/或高于或低于阈值(如上所述)的浓度进行确定。“X”的值可以任选地是一个标志物、多个标志物或全部标志物；可替代地或另外的，不是在“X”的计数中包括任何标志物，而是多个标志物中的一个或多个特异性标志物可以任选地被要求与该疾病或病状相关联(根据一个范围和/或阈值)。
还可替代地，这样的关联可以任选地包括对针对两个标志物的标志物浓度的比例是否在范围之外和/或高于或低于阈值进行确定。可任选地，如果该比例高于或低于该阈值水平和/或在范围之外，那么该比例与该疾病或病状相关联。
可任选地，这些相关性中的两个或更多个的组合可以被与一张单个的图一起来使用，和/或用于多个图之间的关联。
可任选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少70％的敏感性、至少85％的专一性辨别一种疾病或病状。如在此使用，敏感性涉及检测的阳性(患病)样品的数目/存在的阳性样品的总数；专一性涉及检测的真阴性(非患病)样品的数目/存在的阴性样品的总数。优选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少80％的敏感性、至少90％的专一性辨别一种疾病或病状。更优选地，当与正常受试者相比时，这种方法以至少90％的敏感性、至少90％的专一性辨别一种疾病或病状。还更优选地，当与表现出模拟疾病或病状症状的症状的受试者相比时，这种方法以至少70％的敏感性、至少85％的专一性辨别一种疾病或病状。
可以使用多种本领域的普通技术人员熟知的方式来对标志物组进行分析。例如，可以将组的每个成员与“正常”值、或指示具体结果的值进行比较。具体的诊断/预后可以取决于每个标志物与这个值的比较；可替代地，如果只有一个子集的标志物在正常范围之外，那么这个子集可以指示具体的诊断/预后。技术人员还将理解，可以将诊断标志物、差别诊断标志物、预后标志物、标志物发作时间、疾病或病状差异标志物等合并于一个单一测定或装置中。标志物通常还可以用于多种目的，针对不同目的，例如通过将不同阈值或不同加权因子应用于该标志物。
在一个实施例中，这些组包括用于以下目标的标志物：疾病的诊断；如果疾病处于急性期和/或如果疾病的急性发作已经发生，疾病和适应症的诊断；如果疾病处于非急性期和/或如果疾病的非急性发作已经发生，疾病和适应症的诊断；指示急性期和非急性期或发作的组合是否已经发生；疾病的诊断以及随后的不良后果的预后；疾病的诊断以及随后的急性期或非急性期或发作的预后；疾病的进展(例如对于癌症，这样的进展可以包括例如转移的发生或复发)。
上面的诊断还可以任选地包括用来将其与其他疾病区分开的该疾病的差别诊断，包括特征可以在于一种或多种类似的或相同的症状的那些疾病。
在某些实施例中，一种或多种诊断的或预后的指示物仅通过这些指示物的存在或不存在而与一种病状或疾病相关联。在其他实施例中，可以确立诊断的或预后的指示物的阈值水平，并且患者样品中的这些指示物的水平可以简单地与这些阈值水平进行比较。诊断的和/或预后测试的敏感性以及专一性不只是取决于该测试的分析“质量”——它们还取决于什么构成异常结果的定义。在实践中，接受者工作特征曲线、或“ROC”曲线典型地是通过在“正常”和“患病”群体中绘制对其相对频率的变量的值，和/或通过将治疗前、治疗中和/或治疗后从受试者得到的结果进行比较来计算的。
免疫测定
在本发明的另一个实施例中，可以使用免疫测定来定性地或定量地检测和分析样品中的标志物。这种方法包括：提供与标志物特异性结合的一种抗体；使样品与该抗体进行接触；以及在该样品中检测与该标志物结合的该抗体的复合体的存在。
为了制备与标志物特异性结合的抗体，可以使用纯化的蛋白质标志物。可以使用任何本领域已知的适合的方法来制备与蛋白质标记物特异性结合的抗体。
在提供了抗体之后，可以使用任何多种公认的免疫学结合测定来对标志物进行检测和/或定量。有用的测定包括例如，酶免疫测定(EIA)(如酶联免疫吸附测定(ELISA))、放射性免疫测定(RIA)、蛋白质印迹测定、或狭线印迹测定，参见例如，美国专利号4,366,241；4,376,110；4,517,288；以及4,837,168。通常，从受试者获得的样品可以与特异性结合该标志物的抗体进行接触。
可任选地，在将该抗体与样品进行接触之前，可以将该抗体固定至固相支持体以协助该复合体的洗涤以及随后的分离。固相支持体的实例包括但不限于，例如处于以下形式的玻璃或塑料：微量滴定板、棒、珠、或微珠。抗体也可以被附接至固相支持体。
在将该样品与抗体孵育之后，将该混合物进行洗涤，并且可以检测出形成的抗体-标志物复合体。这可以通过将洗涤的混合物与检测试剂一起孵育来实现。可替代地，样品中的该标志物可以使用间接测定来检测，其中例如使用一种第二、标记抗体来检测结合的标志物特异性抗体；和/或竞争或抑制测定，其中例如将与该标志物的不同表位结合的单克隆抗体与该混合物同时孵育。
贯穿这些测定，在试剂的每种组合之后需要孵育和/或洗涤步骤。孵育步骤可以从约5秒钟至数小时变化，优选是从约5分钟至约24小时。然而，孵育时间将取决于测定方式、标志物、溶液的体积、浓度等。通常，这些测定将在环境温度下进行，但是它们可以在一个温度范围内(如10℃至40℃)进行。
可以使用免疫测定来确定来自受试者的样品中的标志物的测试量。首先，可以使用上述的免疫测定方法来检测样品中的标志物的测试量。如果该样品中存在标志物，那么在上述适合的孵育条件下，它将与特异性结合该标志物的抗体形成抗体-标志物复合体。抗体-标志物复合体的量可以任选地通过与标准品进行比较来确定。如上所指出，只要测量值的单位可以与对照量和/或信号进行比较，那么标志物的测试量不需要以绝对单位进行测量。
放射-免疫测定(RIA)：在一个版本中，这种方法涉及所希望的底物的沉淀并且涉及在此以下详细说明的方法，其中在一个可沉淀的载体(例如琼脂糖珠粒)固定有特异性抗体以及放射性标记的抗体结合蛋白(例如，被I125标记的蛋白A)。沉淀的小粒的计数的数目与底物的量成正比。
在RIA的一个交替版本中，采用标记的底物和未标记的抗体结合蛋白。以变化的量的形式添加包含未知量的底物的样品。来自标记的底物的沉淀计数的减少与添加的样品中的底物的量成正比。
酶联免疫吸附测定(ELISA)：这种方法涉及将包含蛋白底物的样品(例如，固定的细胞或蛋白溶液)向一个表面(如微量滴定板的孔)的固定。应用与一种酶偶联的底物特异性抗体并且允许它与该底物结合。然后采用与该抗体偶联的酶通过比色反应来检测并且定量该抗体的存在。在这种方法中常用的酶包括辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。如果很好校准并且在反应的线性范围内，那么该样品中存在的底物的量与产生的颜色的量成正比。为了改善定量准确度，通常采用底物标准品。
蛋白质印迹：这种方法涉及借助丙烯酰胺凝胶将底物与其他蛋白质的分离，随后是将该底物向膜(例如，尼龙或PVDF)的转移。然后通过与该底物特异性结合的抗体对该底物的存在进行检测，这反过来通过抗体结合试剂来进行检测。抗体结合试剂可以是例如蛋白A、或其他抗体。抗体结合试剂可以如在上文所述的进行放射性标记或酶联。检测可以通过放射自显影、比色反应或化学发光。这种方法允许通过该膜上的相对位置来定量底物的量和确定其一致性两者，膜上的相对位置是电泳过程中丙烯酰胺凝胶中的迁移距离的指示。
免疫组织化学分析：这种方法涉及通过底物特异性抗体对固定的细胞中的底物的原位检测。底物特异性抗体可以被酶联或被连接至荧光团。通过显微镜和主观评价进行检测。如果采用酶联抗体，那么需要比色反应。
荧光活化细胞分选(FACS)：这种方法涉及通过底物特异性抗体对细胞中的底物的原位检测。这些底物特异性抗体被连接至荧光团。借助细胞分选机器进行检测，当每个细胞穿过一个光束时，该细胞分选机器读出由每个细胞射出的光的波长。这种方法可以同时采用两种或更多种抗体。
无线成像方法
这些方法包括但不限于，正电子发射断层扫描(PET)、单光子发射计算机断层扫描(SPECT)。这两种技术都是非侵入性的，并且可以用来检测和/或测量多种多样组织事件和/或功能，例如像检测癌性细胞。与PET不同，SPECT可以任选地同时与两种标记一起使用。例如关于可以使用的标记的成本和类型，SPECT也具有一些其他优势。例如，美国专利号6,696,686描述了SPECT用于检测乳腺癌的用途，并且通过引用将其结合在此，如同完全在此阐明一样。
治疗诊断学：
术语治疗诊断学描述了诊断测试的以下用途：用于根据诊断测试的结果诊断疾病、选择正确的治疗方案和/或根据诊断测试的结果监测患者对治疗的反应。可以使用治疗诊断学测试来为患者选择特别可能使其受益并且不太可能产生副作用的治疗。它们还可以提供个体患者的疗效的早期的并且客观的指示，这样使得(如果必需的话)这种治疗能以最小的延迟来改变。例如：DAKO和基因泰克公司(Genentech)一起产生了用于乳腺癌的治疗的HercepTest和赫赛汀(Herceptin)(曲妥珠单抗)，这是与一种新的治疗药物一起被同时批准的第一种治疗诊断学测试。除了HercepTest(一种免疫组织化学测试)之外，其他的治疗诊断学测试正处于研发中，它们使用传统的临床化学、免疫测定、基于细胞的技术以及核酸测试。PPGx's最近推出了TPMT(巯基嘌呤S-甲基转移酶)测试，它使得医生能够鉴定对6-巯基嘌呤(一种用于白血病的治疗的试剂)有潜在致命不良反应的风险的患者。而且，Nova Molecular公司开辟了载脂蛋白E基因的SNP基因分型以预测阿尔茨海默病患者对拟胆碱能药治疗的反应，并且现在它广泛地用于针对这种适应症的新药的临床试验中。因此，治疗诊断学领域代表诊断测试信息的交叉点，诊断测试信息能预测患者对治疗的反应连同为那位具体患者选择适当的治疗。
替代标志物：
替代标志物是一种这样的标志物，它在实验室和/或根据患者的生理信号或症状可检测，并且在治疗试验中被用作针对临床上有意义的终点的替代物。替代标志物是患者如何感觉、发挥功能、或生存的直接量度，预期的是它预测治疗的效果。就患者的治疗效果而言，当替代标志物可以比感兴趣的终点(被称为临床终点)更早、更便利地、或更频繁地被测量时，对此类标志物的需要大大地升高。理想地，替代标志物应该是生物学上貌似合理的、预测疾病的进展的并且被归一化测定(包括但不限于传统的临床化学、免疫测定、基于细胞的技术、核酸测定以及成像形态)可测量的。
通过以下实例来进一步说明本发明。这一信息以及实例是说明性的并且不应被视为进一步限制。贯穿本申请引用的所有图以及所有参考文献、专利以及公开专利申请的内容明确地通过引用结合在此。
实例
实例1：C1ORF32蛋白的克隆
a.人C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)
使用来源于小细胞肺癌cDNA样品的cDNA作为模板并且使用界定完整ORF(SEQ ID NO:20)的基因特异性引物，通过RT-PCR来进行人C1ORF32(编码为SEQ ID NO:1)的短同种型的全长克隆。
50μl的PCR反应含有10ng的作为模板的小细胞肺癌、2.5μl(10μM)的各引物100-746_For(SEQ ID NO:27)和100-787_Rev(SEQ ID NO:29)以及铂PFXTM(英杰公司(Invitrogen.)，卡尔斯巴德(Carlsbad)，加利福利亚洲(CA)，USA，目录号：1178-021)。PCR程序是：在95℃下5分钟；按照以下循环35次：在94℃下30秒钟、在55℃下30秒钟、在68℃下50秒钟；接着在68℃下10分钟。
将PCR产物纯化，用Nhe和EcoRI限制性内切酶(新英格兰生物实验室(New England Biolabs)，贝弗利(Beverly)，马萨诸塞州，美国)进行消化。然后使用T4DNA连接酶(普洛麦格公司，目录号：M1801)将消化的DNA连接至之前用上述限制性内切酶进行消化的pIRESpuro3(pRp)载体(克隆技术公司，目录号：631619)中。
根据制造商的说明书将所得到的DNA转化成感受态大肠杆菌细菌DH5α(RBC生物科学公司(RBC Bioscience)，台北，台湾，目录号：RH816)，然后接种在LB-氨比西林琼脂板上用于选择重组质粒，并且在37℃下孵育过夜。在第二天，将阳性菌落生长在补充有100μg/ml氨比西林的5ml极品肉汤(Terrific Broth)中，同时在37℃下振荡过夜。使用QiaprepTM Spin小量制备试剂盒(Miniprep Kit)(Qiagene公司，目录号：27106)将质粒DNA从细菌培养物中分离。通过测序核实插入片段(Hylabs公司，雷霍沃特(Rehovot)，以色列)。相应的核酸序列在SEQ ID NO:20中示出。
b.HA标记的人C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:22)
使用以上所描述的未标记的构建体的完整ORF作为模板并且使用在C1ORF32(SEQ ID NO:22)的细胞外结构域区内在氨基酸位置51处将HA标签同框插入的特异性引物(SEQ ID NO:27和28)，通过PCR来进行HA标记的人C1ORF32(编码为SEQ ID NO:22)的全长克隆。
使用铂PFXTM、10ng的作为模板的人C1ORF32_pIRESpuro3(pRp)载体以及10uM的引物100-746_For(SEQ ID NO:27)和100-927_Rev(SEQ ID NO:28)，通过PCR来进行克隆。将所得到的DNA转化到感受态大肠杆菌DH5α中。该克隆程序和该转化程序是如以上所描述的进行。相应的核酸序列在SEQ ID NO:22中示出。
c.嵌合小鼠-人C1ORF32(SEQ ID NO:8)
编码为SEQ ID NO:1的人C1ORF32用于通过如下添加存在于小鼠ECD中的2个氨基酸错配：T75->P和S79->A来产生具有小鼠细胞外结构域的蛋白质，从而得到具有小鼠ECD序列和源自人短同种型的短尾的嵌合蛋白。这通过如下位点定向诱变来进行：
50μl的PCR反应含有10ng的作为模板的人C1ORF32_pRp构建体(SEQ ID NO:21)、2.5μl(10μM)的各引物200-386_For(SEQ ID NO:25)和200-387_Rev(SEQ ID NO:26)以及PfuUltra II融合HS DNA聚合酶(Stratagene公司，目录号600670)。PCR程序是：在95℃下3分钟；按以下以下进行12次循环：在95℃下1分钟、在55℃下1分钟、在72℃下3分钟；接着在47℃下1分钟并且在72℃下10分钟。将PCR产物用2μl的DpnI(新英格兰生物实验室，目录号R0176S)在37℃下处理2小时。根据制造商的说明书将5μl的PCR产物转化到NEB5-α感受态大肠杆菌细胞(目录号：NEB-C2987H)中并且如以上所描述的进行处理。通过测序来核实DNA并且在SEQ ID NO:30中示出。
d.FLAG标记的小鼠C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:21)
通过基因合成(金维智公司(GENEWIZ)，美国)来进行小鼠-C1ORF32-Flag(编码为SEQ ID NO:21)的全长克隆。
将合成的DNA(SEQ ID NO:21)用NheI和NotI限制性内切酶(新英格兰生物实验室，贝弗利，马萨诸塞州，美国)进行消化。在消化之后，将DNA负载至用溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶上，在100V下、在l×TAE溶液中进行电泳，并且使用UV光进行可视化。在核实预期的条带大小之后，使用QIAquickTM凝胶提取试剂盒(Qiagen公司，目录号：28707)从该凝胶切除并且提取PCR产物。然后使用T4DNA连接酶(普洛麦格公司，目录号：M1801)将消化的DNA连接至之前用上述限制性内切酶进行消化的pIRESpuro3(pRp)载体(克隆技术公司，目录号：631619)中。如以上所描述将所得到的DNA转化到NEB5-α感受态大肠杆菌细胞中。使用pIRESpuro3载体特异性引物通过PCR对阳性菌落进行筛选(数据未示出)，并且通过测序核实插入片段。相应的核酸序列在SEQ ID NO:21中示出。
实例2：对C1ORF32蛋白特异的多克隆抗体的产生
在西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(以色列(Israel))进行培养针对C1ORF32的特异性多克隆抗体(pAb)的工序，这些工序包括肽合成、肽轭合、动物免疫、取血以及抗体纯化。对两对兔(每个表位一对)进行注射以便产生C1ORF32(SEQ ID NO:1)-特异性抗体。所有动物护理、处理以及注射是由西格玛(以色列)进行。
用于兔免疫的肽是如下：C1ORF32-ep1肽(SEQ ID NO:2)，该肽具有对应于来自C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基75至93的氨基酸序列，该氨基酸序列在SEQ ID NO:2:TRAQSLSKRNLEWDPYLDC中列出。所使用的第二肽是C1ORF32-ep2肽(SEQ ID NO:3)，该肽具有对应于来自C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基148至163的氨基酸序列，该氨基酸序列在SEQ ID NO:3:TTPDDLEGKNEDSVEL中列出。将一个C末端半胱氨酸添加至C1ORF32-ep2肽(SEQ ID NO:3)，以便使该肽轭合至KLH载体，如在SEQ ID NO:6:TTPDDLEGKNEDSVEL-C中所列出。
将25mg的各肽以95％纯度进行合成，其中10mg被轭合至KLH载体。如下将各对兔用相应轭合的肽进行免疫：将兔R1(R7531)和R2(R7532)用C1ORF32-ep1肽(SEQ ID NO:2)进行免疫，并且兔R3(R7533)和R4(R7534)用C1ORF32-ep2肽(SEQ ID NO:6)进行免疫。每两周对动物进行免疫。从各兔收集60ml产生血液，并且用针对其培养对应的抗体的肽进行亲和纯化。
如以下所描述，使用来自兔编号1、2、3以及4的测试血液，通过蛋白质印迹分析来确定针对C1ORF32培养的多克隆抗体(pAb)与如在SEQ ID NO:4中所列出的、对应于与小鼠IgG2a蛋白融合的C1ORF32-ECD的部分(SEQ ID NO:4)的相应的C1ORF32蛋白的结合。
将25μl的样品缓冲液(英杰公司，目录号：NP0007)添加至0.1ug蛋白质。此外，添加1,4-二硫苏糖醇(DTT；一种还原剂)至100mM的最终浓度。然后将样品在70℃下孵育10分钟，随后在20,000xg下旋转1分钟。
根据制造商的说明书，将蛋白质样品负载至4％至12％Bis-Tris凝胶(英杰公司，目录号：NP0321)中，并且使用XCell SureLockTM小电泳槽(英杰公司，目录号：E10001)使凝胶在1×MOPS SDS运行缓冲液(英杰公司，目录号：NP0001)中运行。根据制造商的说明书，使用XCellTM II印迹装置(英杰公司，目录号：E19051)将这些分离的蛋白质转移至一个硝酸纤维素膜(施莱歇&许尔公司，目录号：401385)。
对含有印迹蛋白的膜进行处理，用于如下的抗体检测：
将膜的非特异区通过在室温下、在补充有0.05％吐温-20(PBST)的稀释于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的5％脱脂乳中孵育1/2小时进行封闭(所有随后的孵育均在室温下发生，持续1小时)。然后将封闭溶液用以下第一抗体溶液进行置换：以1:250稀释于封闭溶液中的以上所描述的针对C1ORF32的兔多克隆。在3次5分钟洗涤之后，应用第二抗体：以1:10,000稀释于封闭溶液中的与轭合有过氧化物的酶亲和纯化山羊抗兔IgG轭合的山羊抗兔(goat anti-rabbit conjugated to Peroxidase conjugatedAffipure Goat anti Rabbit IgG)(杰克逊公司(Jackson)，目录号：111-035-003)。在三次5分钟洗涤之后，应用ECL底物(皮尔斯公司(PIERCE)，目录号：PIR-34080)持续1分钟，接着暴露于X射线薄膜(富士公司(Fuji)，目录号：100NIF)。结果呈现于图1中。
图1证明如与免疫前血液相比，来自免疫的兔R1(R7531)、R2(R7532)以及R4(R7534)的血清与在约50kDa的所预期的条带大小处的重组C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:4)结合。来自兔R3的血清在这种试验条件下是不可检测的。
实例3：表达C1ORF32蛋白的稳定池的产生
建立在HEK-293T细胞中过度表达人C1ORF32(SEQ ID NO:1)蛋白、嵌合人-小鼠C1ORF32(SEQ ID NO:8)蛋白以及小鼠C1ORF32(SEQID NO:21)蛋白的稳定池细胞。
如下将人C1ORF32pIRESpuro3构建体(SEQ ID NO:22)或pIRESpuro3空载体稳定地转染至HEK-293T细胞中：
将HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞接种在适合用于组织培养的一种无菌6孔板中，使用2ml预先加热的完全培养基：DMEM[杜氏改良的伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Media)，生物工业公司(Biological Industries)(贝特哈曼(Beit Ha’Emek)，以色列(Israel))，目录号：01-055-1A]+10％FBS[胎牛血清，生物工业公司(贝特哈曼，以色列)，目录号：04-001-1A]+4mM L-谷氨酰胺[生物工业公司(贝特哈曼，以色列)，目录号：03-020-1A]。使用稀释至94ul OptiMEM(GIBCO31985-047)中的6μl FuGENE6试剂(罗氏公司(Roche)，目录号：11-814-443-001)，将每孔500,000个细胞用2μg的DNA构建体进行转染。将该混合物在室温下孵育15分钟。将该复杂混合物逐滴添加至这些细胞中并且旋流。将细胞放置于维持在37℃、具有5％的CO2含量的孵育箱中。转染之后48小时，将转染细胞转移至含有15ml的选择培养基(补充有5μg\ml嘌罗霉素(西格玛，目录号P8833)的完全培养基)的75cm2的组织培养烧瓶中。将细胞放置于孵育箱中，并且每3至4天改变培养基，直到观察到克隆形成。
当足够数量的细胞通过选择时，收获细胞。将细胞在冰上，在补充有蛋白酶抑制剂(罗氏公司，目录号：11873580001)的300μl RIPA缓冲液(50mM Tris HCl pH8，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中进行溶解，持续20分钟。在4℃下在20,000xg下离心15分钟之后，将透明上清液转移至洁净试管中并且添加100μl的 LDS样品缓冲剂(英杰公司，目录号：NP0007)。此外，添加1,4-二硫苏糖醇(DTT；一种还原剂)至100mM的最终浓度。然后将样品在70℃下孵育10分钟，随后在20,000xg下旋转1分钟。根据制造商的说明书，在将每泳道30μl样品负载至4％至12％Bis-Tris凝胶(英杰公司，目录号：NP0321)中后进行SDS-PAGE(拉米利·U·K，自然1970；227；680-685)，并且使用XCell SureLockTM小电泳槽(英杰公司，目录号：E10001)使凝胶在1xMOPS SDS运行缓冲液(英杰公司，目录号：NP0001)中运行。根据制造商的说明书，使用XCellTM II印迹装置(英杰公司，目录号：E19051)将这些分离的蛋白质转移至一个硝酸纤维素膜(施莱歇&许尔公司，目录号：401385)。
如以上所描述通过SDS-PAGE将样品进行进一步处理和分析。
在CHO-K1细胞中过度表达C1ORF32蛋白的稳定池细胞的建立
如下将CHO-K1细胞用人C1ORF32(SEQ ID NO:1)和pIRESpuro3空载体质粒进行稳定转染：
将CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞接种在适合用于组织培养的一种无菌6孔板中，该板包含2ml预先加热的完全培养基：F12营养素混合物(哈姆公司(Ham))(Gibco，目录号：01-055-1A)+10％FBS[胎牛血清，生物工业公司(贝特哈曼，以色列，目录号：04-001-1A)]+4mML-谷氨酰胺[生物工业公司(贝特哈曼，以色列)，目录号：03-020-1A]。使用稀释至100ulI无血清培养基(英杰公司，目录号：31985-047)中的4.5μl脂质转染胺2000转染试剂(英杰公司，目录号：11668019)，将每孔500,000个细胞用2μg的DNA构建体进行转染。将该混合物在室温下孵育15分钟。将该复杂混合物逐滴添加至这些细胞中。将这些细胞放置于维持在37℃、具有5％的CO2含量的孵育箱中。转染后48小时，将这些细胞转移至含有15ml的选择培养基(补充有12μg\ml嘌罗霉素(西格玛公司，目录号P8833)的完全培养基)的75cm2的组织培养烧瓶中。将细胞放置于孵育箱中，并且每3至4天置换培养基，直到观察到克隆形成。
实例4：使用表达C1ORF32的稳定池，多克隆抗C1ORF32抗体的表征
A.使用多克隆抗C1ORF32抗体，表达C1ORF32的稳定池的蛋白质印迹分析
为了核实抗体特异性，使用抗C1ORF32纯化的pAbs R7531，通过蛋白质印迹法对在HEK293T重组细胞中表达C1ORF32的稳定池的全细胞提取物进行分析。
当足够数量的细胞通过选择时，收获细胞。将细胞在冰上，在补充有蛋白酶抑制剂(罗氏公司，目录号：11873580001)的300μl RIPA缓冲液(50mM Tris HCl pH8，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，0.1％SDS)中进行溶解，持续20分钟。在4℃下在20,000xg下离心15分钟之后，将透明上清液转移至洁净试管中并且添加100μl的LDS样品缓冲剂(英杰公司，目录号：NP0007)。此外，添加1,4-二硫苏糖醇(DTT；一种还原剂)至100mM的最终浓度。然后将样品在70℃下孵育10分钟，随后在20,000xg下旋转1分钟。根据制造商的说明书，在将每泳道30μl样品负载至4％至12％Bis-Tris凝胶(英杰公司，目录号：NP0321)中后进行SDS-PAGE(拉米利·U·K，自然1970；227；680-685)，并且使用XCell SureLockTM小电泳槽(英杰公司，目录号：E10001)使凝胶在1xMOPS SDS运行缓冲液(英杰公司，目录号：NP0001)中运行。根据制造商的说明书，使用XCellTM II印迹装置(英杰公司，目录号：E19051)将这些分离的蛋白质转移至一个硝酸纤维素膜(施莱歇&许尔公司，目录号：401385)。
如以上所描述通过SDS-PAGE将样品进行进一步处理和分析。
结果呈现于图2中。
图2证明使用抗C1ORF32pAbs R7531(2μg/ml)，用空载体(泳道1)、人-C1ORF32(SEQ ID NO:1)(泳道2)、HA标记的人-C1ORF32(SEQID NO:22)(泳道3)、嵌合小鼠-人C1ORF32(SEQ ID NO:8)(泳道4)、Flag标记的小鼠-C1ORF32(SEQ ID NO:21)(泳道5)转染的HEK293T池的30ug溶解产物的蛋白质印迹分析。与用pIRESpuro3空载体转染的稳定HEK293T池的全细胞提取物形成对照，在不同的HEK293T-C1ORF32-转染的细胞中检测到对应于对于人C1OFR32来说约30kDa或对于小鼠C1ORF32(SEQ ID NO:21)来说约70kDa的预期大小的条带。然而，在所有细胞系中在更高MW(分子量)处观察到非特异性条带。
B.使用多克隆抗C1ORF32抗体，表达C1ORF32的稳定池的FACS分析
为了核实在以上所描述的稳定转染中pAb与天然细胞表面的C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的结合，使用如在此在章节“对C1ORF32蛋白特异的多克隆抗体的产生”中所描述的抗C1ORF32多克隆抗体R7531、R7532以及R7534进行了流式细胞术分析。非相关的兔IgG用作阴性对照(西格玛，目录号I5006)。将表达C1ORF32的重组HEK293T细胞使用抗C1ORF32抗体(A)进行染色，或HEK293T用空载体pIRESpuro3进行转染，接着是用驴抗小鼠-FITC轭合的第二Ab(杰克逊公司(Jackson)，目录号711-096-152)，并且针对荧光信号的存在对其进行观察。
使用基于PBS的无酶细胞解离缓冲液(Gibco；13151-014)将重组HEK293T-C1ORF32细胞从该板上解离，在FACS缓冲液[杜氏磷酸盐缓冲盐水(PBS)(生物工业公司，02*023-lA)/1％牛白蛋白(西格玛，A7030)]中进行洗涤并且计数。将0.5×106个细胞以20ug/ml再悬浮于100μl抗体溶液中，并且在冰上孵育1小时。将这些细胞用冰冷的FACS缓冲液进行洗涤并且使用如所指示的第二抗体在冰上孵育1小时。将这些细胞用冰冷的FACS缓冲液进行洗涤并且再悬浮于300μl的FACS缓冲液中，然后在FACS机器(FACSCalibur，BD)上进行分析。使用Cellquest Pro VER.5.2获得数据并且对其进行分析。结果呈现于图3中。
图3证明使用对C1ORF32特异的多克隆抗体(R7531、R7532、R7534)，与用空载体pIRESpuro3转染的HEK293T相比(B)，表达C1ORF32未标记的蛋白的重组HEK293T细胞(A)的流式细胞术分析。非相关的兔IgG(西格玛，目录号I5006)用作一个阴性对照。
这些结果表示多克隆抗体与天然细胞表面的C1ORF32蛋白的特异性结合。
实例5A：对C1ORF32蛋白特异的小鼠单克隆抗体的开发
C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的单克隆抗体的开发在SLRC银湖研究公司(Silver Lake Research Corporation)，加利福利亚，美国)进行。
根据本领域的普通技术人员所熟知的工序，在SLRC进行所有工序，包括肽合成、动物护理和处理、动物的免疫、取血、融合、杂交瘤筛选以及亚克隆。
C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的单克隆抗体的开发是在如下两个项目中进行的：如以下所描述的项目5159(A)和项目5166(B)。
项目5159
SLRC使用专利性EAPTM(增强的亲和力平台)系统来产生EAP-修饰的抗原用于使用一个肽序列来进行免疫，该肽序列具有对应于来自人C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的细胞外结构域的氨基酸残基63至85的一个氨基酸序列，在该肽的C’末端处具有另外Cys，如在SEQ ID NO:6，TTPDDLEGKNEDSVELC中所列出。
使用之前所描述的纯化的重组ECD-mIgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:4)或过度表达C1ORF32蛋白的HEK-293T细胞的稳定池，通过ELISA来进行结合筛选。将三个阳性克隆进行进一步处理用于亚克隆以便建立稳定的杂交瘤克隆。将杂交瘤进行稳定、亚克隆并且处理用于抗体产生和纯化。进行mAbs5159-1、5159-2以及5159-3的产生和纯化以由各mAb产生大规模纯化的批次用于进一步分析。
各抗体的同种型分型确定如下：5159-1鼠类IgG1；5159-2鼠类IgG1；5159-3鼠类IgG1。
项目5166
SLRC使用专利性EAPTM系统来产生EAP-修饰的抗原用于使用融合蛋白C1ORF32-ECD-hIgG1(SEQ ID NO: 23)和C1ORF32-ECD-mIgG2a(SEQ ID NO: 24)作为免疫原来进行免疫
使用融合蛋白C1ORF32-ECD-hIgG1(SEQ ID NO: 23)和C1ORF32-ECD-mIgG2a(SEQ ID NO: 24)或在此在章节“表达C1ORF32蛋白的稳定池的产生”中描述的过度表达C1ORF32的HEK-293T细胞的稳定池，通过ELISA来进行结合筛选。将两个阳性克隆5166-2和5166-9进行进一步处理用于亚克隆以便建立稳定的杂交瘤克隆并且同种型分型如下：对于5166-2来说鼠类IgG1并且对于5166-9来说鼠类IgM。将杂交瘤进行稳定、亚克隆并且处理用于抗体产生和纯化。进行mAbs5166-2和5166-9的产生和纯化以由各mAb产生大规模纯化的批次用于进一步分析。
实例5B：单克隆抗体测序
按照Plus RNA纯化系统(英杰公司，目录号：15596-026)的技术手册，从冷冻的杂交瘤细胞提取总RNA。将总RNA通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。按照SuperScriptTM III第一链合成系统(英杰公司，目录号：18080-051)的技术手册，使用同种型特异性反义引物或通用引物将总RNA逆转录成cDNA。然后进行RT-PCR以扩增该抗体的重链和轻链。将VH和VL的抗体片段根据金斯瑞公司(GenScript)的RACE的标准操作工序进行扩增。
使用标准分子克隆工序，将扩增的抗体片段分开地克隆至一种标准克隆载体中。
进行菌落PCR筛选以鉴定具有正确大小的插入片段的克隆。
将具有正确VH和VL插入片段大小的十个单个菌落送出用于测序。10个不同克隆的VH基因和VL基因被发现几乎相同。
以下所示的共有序列是由如在此所描述保藏的杂交瘤5166-2产生的抗体，即抗体5166-2的序列。5166-2抗体的重链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:39和40中示出。5166-2抗体的轻链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:41和42中示出。前导序列是以斜体字体示出；CDR1、CDR2、CDR3的序列是以粗体示出。恒定区FR1、FR2、FR3、以及FR4是以常规字体示出。5166-2抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:43、44、45中列出。5166-2抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:46、47、48中列出。5166-2抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:49、50、51中列出。5166-2抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:52、53、54中列出。
SEQ ID NO:39，5166-2重链：DNA序列(411bp)
前导序列-FR1-C-FR2--FR3--FR4
CAGATCCAGT
TGGTGCAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCT GGGTGAAGCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGC CGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGTTAGATGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO:40，5166-2重链：氨基酸序列(137AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
QIQLVQSGPELKKPGETVKISCKAS WVKQAPGKGLKWMGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCVRWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:41，5166-2轻链：DNA序列(381bp)
前导序列-FR1--FR2-CDR2-FR3--FR4 GACATTG
TGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGC TGGTATCAACAGAAACCAGGTCAATCTCCTAAACTACTGATTTACGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATTACCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGATTATTTCTGT TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:42，5166-2轻链：氨基酸序列(127AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
GDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC WYQQKPGQSPKLLIYGVPDRFTGSGSGTDFTLTITNVQSEDLADYFCFGGGTKLEIK
以下所示的共有序列是由如在此所描述保藏的杂交瘤5166-9产生的抗体，即抗体5166-9的序列。5166-9抗体的重链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:55和56中示出。5166-9抗体的轻链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:57和58中示出。前导序列是以斜体示出；CDR1、CDR2、CDR3的序列是以粗体示出。恒定区FR1、FR2、FR3、以及FR4是以常规字体示出。5166-9抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:59、60、61中列出。5166-9抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:62、63、64中列出。5166-9抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:65、66、67中列出。5166-9抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:68、69、70中列出。
SEQ ID NO:55，5166-9重链：DNA序列(420bp)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
GAAGTGAAGA
TGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAACCTCT TGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCA CGATTCACCATCTCCAGAGACAATGCCAAGAACACCCTGTACCTGCAAATGAGCCGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTATCTGCA
SEQ ID NO:56，5166-9重链：氨基酸序列(140AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
EVKMVESGGGLVQPGGSLKLSCATS WVRQTPEKRLEWVARFTISRDNAKNTLYLQMSRLKSEDTAMYYCARWGQGTLVTVSA
SEQ ID NO:57，5166-9轻链：DNA序列(381bp)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
AGACATTG
TGATGACCCAGTCTCACAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCATCACCTGC CTGGTATCAACAGAAACCAGGACAATCTCCTAAACTATTGATTTACGGAGTCCCTGATCGCTTCACTGGCAGTGGATCTGGGACGGATTTCACTTTCACCATCAGCAGTGTGCAGGCTGAAGACCTGGCAGTTTATTACTGT TTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATAAAA
SEQ ID NO:58，5166-9轻链：氨基酸序列(127AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
MESQIQVFVFVFLWLSGVDGDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC WYQQKPGQSPKLLIYGVPDRFTGSGSGTDFTFTISSVQAEDLAVYYCFGGGTKLEIK
以下所示的共有序列是抗体5159-1的序列。5159-1抗体的重链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:71和72中示出。5159-1抗体的轻链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:73和74中示出。前导序列是以斜体字体示出；CDR1、CDR2、CDR3的序列是以粗体示出。恒定区FR1、FR2、FR3、以及FR4是以常规字体示出。
5159-1抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:75、76、以及77中列出。5159-1抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:78、79、以及80中列出。5159-1抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:81、82、以及83中列出。5159-1抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:84、85、以及86中列出。
SEQ ID NO:71，5159-1重链：DNA序列(411bp)
前导序列-FR1-FR2--FR3--FR4
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGGCCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAATCTGACTTGTTCTTTCTCT TGGATTCGTCAGCCTTCAGGGAAGGGTCTGGAGTGGCTGGCA CGACTGACAATCTCCAAGGATATCTCCAACAACCAGGTTTTCCTAAAGATCGCCAGTGTGGACACTGCAGATTCTGCCACATATTATTGTGGTCGA TGGGGCCAAGGCACCATTCTCACGGTCTCCTCC
SEQ ID NO:72，5159-1重链：氨基酸序列(137AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
QVTLKESGPGILQPSQTLNLTCSFS WIRQPSGKGLEWLARLTISKDISNNQVFLKIASVDTADSATYYCGRWGQGTILTVSS
SEQ ID NO:73，轻链5159-1：DNA序列(381bp)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATATATGCATCTCTAGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGC TGGTTCCAGCAGAAACCAGGAAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATGGTGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTCTCTCACCATCAGCAGCCTGGATTATGAAGATATGGGAATTTACTATTGT TTCGGTGGAGGCACCAAACTGG
AAATCAAA
SEQ ID NO:74，轻链5159-1：氨基酸序列(127AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
DIKMTQSPSSIYASLGERVTITC WFQQKPGKSPKTLIYGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLDYEDMGIYYCFGGGTKLEIK
以下所示的共有序列是抗体5159-2的序列。5159-2抗体的重链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:87和88中示出。5159-2抗体的轻链的DNA和氨基酸序列分别在SEQ ID NO:89和90中示出。前导序列是以斜体字体示出；CDR1、CDR2、CDR3的序列是以粗体示出。恒定区FR1、FR2、FR3、以及FR4是以常规字体示出。
5159-2抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:91、92、以及93中列出。5159-1抗体重链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:94、95、以及96中列出。5159-2抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的核酸序列分别在SEQ ID NO:97、98、以及99中列出。5159-2抗体轻链CDR1、CDR2、CDR3的相应氨基酸序列分别在SEQ ID NO:100、101、以及102中列出。
SEQ ID NO:87，重链5159-2：DNA序列(411bp)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
CAGGTTACTCTGAAAGAGTCTGACCCTGGGATATTGCAGCCCTCCCAGACCCTCAGTCTGACTTGTTCTTTCTCT TGGATTCGTCAGCCATCAGGGAAGGGTCTGGAATGGCTGGCA CGACTGACTATCTCCAAGGATACCTCCAGCAGCCAGGTATTCCTCAAGATCGCCAATGTGGACACTGCAGATACTGCCACATACTACTGTGCTCGA TGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
SEQ ID NO:88，5159-2重链：氨基酸序列(137AA)
前导序列-FR1--FR2--FR3--FR4
QVTLKESDPGILQPSQTLSLTCSFS WIRQPSGKGLEWLARLTISKDTSSSQVFLKIANVDTADTATYYCARWGQGTTLTVSS
SEQ ID NO:89，轻链5159-2：DNA序列(381bp)
前导序列-FR1--FR2-FR33-FR4
GACATCAAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCATGTATGCATCTCTGGGAGAGAGAGTCACTATCACTTGC TGGTTCCACCAGAAACCCGTGAAATCTCCTAAGACCCTGATCTATGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTATTTTCTCACCATCAGCAGCCTGGAGTATGAAGATATGGGAATTTATTATTGTTTCGGTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAA
SEQ ID NO:90，5159-2轻链：氨基酸序列(127AA)
前导序列-FR1-FR2--FR3-FR4
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITC WFHQKPVKSPKTLIYGVPSRFSGSGSGQDYFLTISSLEYEDMGIYYCFGGGTKLEIK
实例6：使用表达C1ORF32的稳定池重组细胞，单克隆抗C1ORF32抗体的表征
A.使用抗C1ORF32MABs5159，表达C1ORF32的重组细胞的蛋白质印迹分析
在对来自用C1ORF32pIRESpuro构建体或用空载体(pIRES-puro3阴性对照)转染的HEK-293T(ATCC，CRL-11268)细胞的全细胞溶解产物进行蛋白质印迹分析时观察到抗体-蛋白质相互作用。将25μl的 LDS样品缓冲液(英杰公司，目录号：NP0007)添加至30ug全细胞溶解产物并且如在此实例4所描述进行处理。
图4证明使用纯化的抗C1ORF32单克隆抗体5159-1(2ug/ml)，用以下各物转染的HEK293T池的全细胞溶解产物的蛋白质印迹分析：空载体(泳道1)、人-C1ORF32(泳道2)(SEQ ID NO:1)、HA标记的人-C1ORF32(SEQ ID NO:22)(泳道3)、嵌合小鼠-人C1ORF32(SEQ ID NO:8)(泳道4)、Flag标记的小鼠-C1ORF32(SEQ ID NO:21)(泳道5)。与用pIRES-puro3空载体(泳道1)转染的稳定HEK293T池的全细胞提取物形成对照，检测到对于人-C1ORF32(泳道2)和HA标记的人-C1ORF32(泳道3)来说，对应于约30kDa的特异性条带。在突变的C1ORF32(泳道4)中观察到低信号，并且没有在小鼠-C1ORF32转染的细胞中检测到信号。
B.使用抗C1ORF32MABs5159，表达C1ORF32的重组细胞的FACS分析
进行流式细胞术分析以核实在以上所描述的稳定转染细胞中mAb与天然细胞表面的C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的结合。使用对C1ORF32特异的单克隆抗体：5159-1、5159-2、5159-3来进行检测。抗头孢菌素用作阴性对照(SLRC，CH2025P)。将表达C1ORF32蛋白(即人C1ORF32(SEQ ID NO:1))、嵌合人-小鼠C1ORF32(SEQ ID NO:8)以及Flag标记的小鼠C1ORF32(SEQ ID NO:21)的重组HEK293T细胞如在此实例6中所描述，用抗C1ORF32抗体或抗-头孢菌素，接着用驴抗小鼠DyLight549轭合的第二Ab(杰克逊公司715-506-150)进行染色。观察到荧光信号。结果呈现于图5中。
图5证明与非相关的IgG对照抗头孢菌素相比，使用小鼠单克隆抗C1ORF32抗体(20ug/ml)、随后1:250稀释的驴抗小鼠IgG DyLight549轭合的第二Ab，不同C1ORF32蛋白的膜表达。图5A是指空载体转染的细胞；图5B是指人-C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:1)；图5C是指HA标记的人-C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:22)；图5D是指嵌合人-小鼠C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:8)；图5E是指Flag标记的小鼠C1ORF32转染的细胞(SEQ ID NO:21)。
此外，与用空pIRESpuro3载体转染的CHO-K1细胞相比，对表达人C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的重组CHO-K1细胞进行流式细胞术分析。将稀释至2ug/ml的单克隆抗C1ORF32抗体5159-1与细胞在冰上孵育1小时，接着将1:100稀释的山羊抗小鼠-Alexa Fluor488轭合的第二Ab(英杰公司A11001)与细胞进行孵育。小鼠抗-头孢菌素用作阴性对照。观察到荧光信号。结果呈现于图6中。
图6证明与CHO-K1细胞相比，表达人C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的CHO-K1(ATCC，CCL-61)细胞中单克隆5159-1抗C1ORF32抗体与C1ORF32蛋白结合的流式细胞术分析。
实例7：MABs5166与细胞表面C1ORF32蛋白结合的FACS分析
为了核实在以上所描述的稳定转染中MAB与天然细胞表面的C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的结合，使用抗C1ORF32单克隆抗体5166-2和5166-9进行了流式细胞术分析。抗-头孢菌素(银湖公司，CH2025P)和正常小鼠血清(杰克逊公司，目录号015-000-120)用作阴性对照。
将表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)的重组CHO-K1细胞通过C1ORF325166的MAB或通过抗-头孢菌素，接着1:100稀释的山羊抗小鼠-AlexaFluor488(英杰公司A11001)第二Ab进行染色，并且针对荧光信号的存在对其进行观察。
将重组CHO-K1_人C1ORF32(SEQ ID NO:1)细胞如章节“使用抗C1ORF32MABs5159，通过FACS分析进行稳定池表征C1ORF32”中所描述进行处理。结果呈现于图7中。
图7证明与CHO-K1稳定池相比，在表达C1ORF32人蛋白的CHO-K1重组细胞中，单克隆抗C1ORF32抗体5166-2(左)和5166-9(右)与人C1ORF32蛋白的结合。小鼠抗-头孢菌素用作阴性对照。
实例8：使用抗-C1ORF32多克隆抗体R1(R7531)的免疫组织化学(IHC)研究
为了评估R1(R7531)抗C1ORF32的组织结合曲线，在一组正常(非赘生性)人组织中并且在一组肿瘤组织上对该抗体进行了检查。用C1ORF32转染的HEK-293细胞用作一个阳性对照并且用于校准用于染色的pAb。兔血清IgG用作同种型对照抗体。
以上所描述的亲和力纯化的抗C1ORF32抗体R1(R7531)用作第一抗体，并且主要检测系统由载体抗-兔第二(BA-1000)和载体ABC-AP试剂盒(AK-5000)与载体红色底物试剂盒(SK-5100)组成，该系统用于产生紫红色颜色的沉积物。阴性对照包括在不存在第一抗体的情况下在相邻切片上进行整个免疫组织化学程序。人福尔马林固定的石蜡包埋的组织是购自(百欧迈斯公司(Biomax Inc.)抑或阿斯特兰德公共有限公司(Asterand plc))。这些载玻片由病理学家进行解释并且将各抗体针对特异性信号的存在和背景水平进行评价。染色强度是以0至4的标尺进行记录(0＝阴性，1＝红色，2＝微弱，3＝中等，4＝强)。将载玻片用连接至一个尼康(Nikon)E400显微镜的一个DVC1310C数码照相机成像。在1.25μg/ml的浓度下，抗体R7531在阳性转染的对照细胞系中显示中等染色并且空载体阴性对照细胞是阴性。
表1呈现结果的总结，描述了在来自抗体的大多数细胞中显示出中等至强染色的赘生性组织。如可以从表1中看出，以下肿瘤证明C1ORF32的中等至强表达：肝细胞癌(II期和III期)、肾嫌色细胞腺瘤、胰岛细胞癌、恶性黑素瘤(IV期)、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、膀胱的移行细胞癌癌(II期至IV期)以及霍奇金氏淋巴瘤。还在以下中观察到弱至中等染色：B细胞淋巴瘤和T细胞淋巴瘤、乳腺癌(侵入性导管癌IIa期、IIb期至IIIb期)、乳头状甲状腺癌(II期)、卵巢浆液性和粘液性癌(1c期至IIIb期)、卵巢颗粒细胞肿瘤、肾透明细胞癌(I期至II期)和肉瘤样癌、前列腺腺癌(I期至III期)、肝胆管癌、胰管和粘液性腺癌、皮肤鳞状癌、睾丸的精原细胞瘤、横纹肌肉瘤、血管肉瘤以及子宫子宫内膜样腺癌。两个脊髓肿瘤也显示中等染色。显示染色的细胞因此可以被假定为在此所描述的抗体的潜在靶标。
表1：癌组织微阵列IHC的总结：
在外周组织(每个组织1个样本)内，在子宫内膜腺体、巨噬细胞的亚群以及胰岛内的细胞的亚群中观察到中等至强染色。在乳房上皮、浆细胞、枯氏细胞(Kupffer cell)、睾丸莱氏细胞(Leydig cell)、肥大细胞、胎盘营养细胞、软骨细胞，偶见内皮内衬血管(occasional endothelia liningvessel)和子宫内膜基质细胞中观察到中度染色。
还在淋巴组织阵列上进行具体针对正常淋巴结的IHC研究，该淋巴组织阵列由来自身体内多个位置的福尔马林固定的人淋巴结的48个核心组成。C1ORF32pAb是以1.25μg/ml的浓度使用。C1ORF32显示在48个中的9个中有微弱染色，并且在48个正常淋巴结样品中的39个内有淋巴细胞的微弱或微弱至中等染色。三个正常淋巴结样品也包括在肿瘤阵列中，并且这些样品显示淋巴细胞内红色至微弱染色。除淋巴细胞之外，浆细胞和偶见巨噬细胞和内皮细胞也显示染色。
对排前4的癌症TMA的免疫组织化学(IHC)分析
将抗-C1ORF32兔多克隆抗体通过在阳性对照细胞系的FFPE切片中的免疫组织化学进行校准。将切片在脱蜡、再水合以及在PT连接设备中在Flex+3-合-1pH9.0抗原修复溶液中抗原修复(retrieval)之后以0.3μg/ml进行孵育。使用DAKO Envision Flex+检测试剂检测结合的抗体。该抗体在所测试的阳性对照细胞系样品中检测到特异性信号。
在最佳条件的校准之后，在人癌组织微阵列(阿斯特兰德的“排前4的”TMATM)上对抗C1ORF32pAb进行测试。总体上，C1ORF32蛋白在所研究的几种肿瘤中表达。最一致地表现出C1ORF32-免疫反应性的肿瘤类型是前列腺腺癌，其中所有样品显示阳性(参见表2)。
在乳腺肿瘤组内，染色强度是低(1+)，其中仅三个肿瘤得分为2+(不良分化浸润性导管癌(IDC)、3级IDC以及粉刺癌)。3个乳腺癌样品(其中上皮细胞多数数为阴性)在免疫浸润细胞(2级和3级浸润性导管癌，2级髓样癌)中显示阳性染色。在大肠组内，所有肿瘤是腺癌并且在所有分析的肿瘤中观察到低免疫反应性。五个样品具有2+的免疫反应性(指示它们是中度至不良分化的)。在肺肿瘤组中，这些肿瘤中的两个是强免疫反应性的，具有2+的得分；并且两个都是不良至中度分化的鳞状细胞癌抑或大细胞癌组织学。一个肺肿瘤核心在1+的强度下似乎是>50％免疫反应性的。正常肺样品在来自所有取样的供体中的每一个的至少一个核心中是阳性的。中度分化的肺鳞状细胞癌的一个样品(其中该肿瘤对于C1ORF32反应性是阴性的)具有中等染色浸润免疫细胞。在前列腺肿瘤中，记录了更高水平的免疫反应性。从26个前列腺腺癌的一个群组，所有肿瘤在本研究中似乎是C1ORF32免疫反应性的，其中大多数得分为+1。两个肿瘤记录了3+得分(格里森得分6和7)并且六个肿瘤(格里森得分5、6以及7)得分为2+。在正常前列腺样品内，在腺上皮中观察到染色。
表2-排前4的组织阵列中前列腺样品的表达
前列腺肿瘤全切片和免疫浸润细胞中C1ORF32的表达
将10个前列腺癌石蜡包埋的切片在抗原修复之后进行脱蜡和染色。对于抗原修复和染色来说，根据制造方案使用Ventana超IHC/ISH系统。对于抗C1ORF32pAb(零件号760-2018)使用蛋白酶修复，抗CD68KP-1小鼠单克隆购自Ventana并且使用标准修复方案(CC1模块，Ventana)，吉姆萨染液(Giemsa Stain)购自Ventana(目录号860-006)。在用抗C1ORF32pAb染色的所有样品中观察到至少微弱染色。六个肿瘤具有+1的得分，并且4个肿瘤具有+2的得分。免疫浸润细胞的亚群(这些细胞在形态学上被鉴定为巨噬细胞和肥大细胞)对于C1ORF32免疫反应性也是阳性的。对于巨噬细胞使用抗-CD68抗体，并且对于肥大细胞使用吉姆萨染液对这些细胞的性质进行进一步确认。此外，形态学上评价所获得的不同TMA数据，还在乳腺癌、小细胞肺癌(I期、II期、IIIa期以及IIIb期)(图8)和非小细胞肺癌、结肠直肠癌(III期)中观察到阳性免疫浸润细胞。所有这些癌症在癌细胞中具有低至阴性染色，但是免疫浸润细胞中C1ORF32的阳性免疫反应性指示通过刺激免疫系统的潜在抗癌症治疗，并且因此还指示这些细胞类型可以任选地是如在此所描述的抗体疗法的靶标。
实例9：在HEK293T细胞上表达的C1ORF32对JURKAT T细胞的活化的作用
为了进一步评价处于其膜形式的C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)对T细胞活化的抑制作用，使用过度表达C1ORF32的HEK293T细胞(使用针对C1ORF32的胞外结构域的多克隆抗体和单克隆抗体两者，通过流式细胞术来核实表达)或作为阴性对照的用仅载体(pRp3)转染的HEK293T细胞与在存在板结合的抗-CD3抗体的情况下活化的原代CD4+鼠类T细胞或JurkatT细胞的共培养测定。实验设置描绘于图9中。
过度表达C1ORF32蛋白的HEK293T细胞是如在此实例3中所描述产生的。
a)如通过CD69表达测量的Jurkat T细胞的抗-CD3介导的活化。
第1天：
1.将稀释于1×PBS中的抗-CD3(克隆OKT3，eBioscience公司；目录号16-0037-85或克隆UCHT1，BD生物科学公司(BD Bioscience)；目录号555329)在所指示的浓度下以75μL/孔固定在96孔板上
2.将板用石蜡膜包裹并且在4℃下孵育过夜(O.N.，overnight)
3.将异位表达C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)的HEK293T_pRp和HEK293T细胞池以每块T75板12×106个细胞的浓度接种并且在补充有10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素的DMEM培养基中在增湿的孵育箱中培养过夜。
第2天：
1.将用抗-CD3涂覆的孔用200μl的×1PBS洗涤3次。将流体在无菌环境中倾析出来。在最后一次洗涤之后，将板印迹在无菌吸水纸上以去除任何残余流体。
2.将前一天接种的HEK293T细胞用丝裂霉素C(西格玛，M4287)进行处理：将在H2O中新鲜制备的900μl的0.5mg/ml溶液直接添加至8.1ml的生长培养基，以获得50μg/ml的最终浓度。将细胞与丝裂霉素C在37℃下孵育1小时。
3.将丝裂霉素C处理的293T细胞用10ml的1×PBS洗涤3次并且通过添加2ml的细胞解离缓冲液(Gibco；目录号13151-014)去除。
4.将脱离的HEK293T细胞再悬浮于8ml的补充有10％FBS、L-谷氨酰胺、青霉素以及链霉素的RPMI(Jurkat细胞的生长培养基)中。
5.使用贝克曼库尔特计数器(Beckman coulter counter)对细胞进行计数并且将细胞稀释至0.5×106个细胞/ml。
6.将细胞进行连续稀释并且在所指示的浓度下接种于每孔100μl的RPMI Jurkat细胞的生长培养基(如上所描述)中。
7.将HEK293T细胞孵育2小时以允许附着。
8.在不存在或存在2μg/ml可溶性抗CD28(克隆CD28.2，eBioscience公司，目录号16-0289-85)的情况下，将50,000个Jurkat细胞(ATCC，克隆E6-1，TIB-152，源自人T细胞白血病)以每孔100μl的体积添加至各孔的RPMI Jurkat细胞的生长培养基中。
9.将细胞在增湿的孵育箱中共培养过夜。
第3天：
1.将细胞转移至U-形板，在1500rpm、4℃下离心5分钟，并且将上清液倾析出来。
2.将抗-CD69Ab(Biolegend公司，PE-抗人CD69，克隆FN50，目录号310906，10μg/ml，2μl/孔)和Fc-封闭剂(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，人FcR封闭剂，目录号120000-442，1μl/孔)在冰冷的FACS缓冲液(1×+0.5％BSA+2mM EDTA+0.05％叠氮化物)中稀释并且以每孔50μl的最终体积添加。
3.通过吸移(在不产生气泡的情况下)轻轻地混合孔内容物。
4.将板在冰上孵育30分钟。
5.将细胞用200μl的FACS缓冲液洗涤一次并且将板在1500rpm、4℃下离心5分钟。通过倾析丢弃上清液。
6.将细胞再悬浮于200μl的FACS缓冲液中并且转移至用另外的100μl FACS缓冲液填充的FACS试管中。
7.通过流式细胞术针对CD69的细胞表面表达(平均荧光强度(MFI))对Jurkat细胞进行分析。将Jurkat细胞根据前向散射(FSC)对侧向散射(SSC)进行门控(gated)。门控程序通过用抗-CD2抗体(Biolegend公司；克隆RPA-2.10，目录号300206)对细胞进行染色以鉴定T细胞来进行验证。
如通过CD69表达测量的Jurkat T细胞的抗CD3介导的活化的抑制。
使用用C1ORF32(SEQ ID NO:1)转染的HEK293T细胞来评价在细胞膜上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)对T细胞活化的作用，这些HEK293T细胞与通过板结合的抗-CD3抗体活化的Jurkat T细胞共培养。用仅载体(pRp3)转染的HEK293T细胞用作阴性对照。
图10和图11中所示的代表性结果指示在存在HEK293T/C1ORF32细胞的情况下，用两种不同的抗-CD3克隆(分别是OKT2和UCHT1)刺激的Jurkat T细胞表现出减少的活化，如通过CD69(T细胞活化的早期标志物)的降低的水平所表现的。如图12中所示，当Jurkat细胞被抗-CD3抗体连同抗-CD28抗体的组合活化时，获得类似的结果。即使在7.5小时共培养之后，也可以观察到Jurkat细胞活化的显著抑制(图13)。
图10示出在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制Jurkat细胞活化。将表达C1ORF32或pRp载体的HEK293T细胞的25K(图10A)或50K(图10B)细胞接种在用0.1或0.25μg/ml的抗-CD3(OKT3克隆)预先涂覆的孔中。在2小时之后添加Jurkat细胞(50K每孔)并且将细胞孵育过夜。通过流式细胞术针对CD69的表达对细胞进行分析。CD69的MFI值在(图10C)中示出。
图11示出在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制用抗CD3-UCHT克隆活化的Jurkat细胞。将表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的HEK293T细胞的25K(图11A)或50K(图11B)细胞接种在用2或4μg/ml的抗-CD3(UCHT1克隆)预先涂覆的孔中。在2小时之后添加Jurkat细胞(50K每孔)并且将细胞孵育过夜。通过流式细胞术针对CD69的表达对细胞进行分析。CD69的ΔMFI值在(图11C)中示出。
图12示出在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制用抗CD3和抗CD28活化的Jurkat细胞。将通过板结合的抗CD3(0.1或0.25μg/ml)(图12A)或板结合的抗CD3(0.1或0.25μg/ml)加可溶性抗CD28(图12B)活化的Jurkat细胞孵育过夜，并且通过流式细胞术针对CD69的表达进行分析。(图12C)将表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的HEK293T细胞以25、50或100K/孔的浓度接种于用0.1或0.25抗-CD3(OKT克隆)涂覆的孔中。在2小时之后添加50K Jurkat细胞并且将细胞孵育过夜。通过流式细胞术针对CD69的表达对Jurkat细胞进行分析。示出ΔMFI值。(图12D)将表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的HEK293T细胞以50K/孔的浓度接种于用0.1或0.25抗-CD3(OKT克隆)涂覆的孔中。在2小时之后在有或无2μg/ml的可溶性抗CD28的情况下添加50K Jurkat细胞，并且将细胞孵育过夜。通过流式细胞术针对CD69的表达对Jurkat细胞进行分析。示出ΔMFI值。
图13示出在HEK293T细胞上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制Jurkat细胞活化。将表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)或pRp载体的25K(图13A、图13C)或50K(图13B、图13D)HEK293T细胞接种在用0.5、1或2μg/ml的抗-CD3(OKT克隆)涂覆的孔中。在2小时之后添加50K Jurkat细胞并且将细胞共孵育7.5小时(图13A、图13B)或过夜(图13C、图13D)。通过流式细胞术针对CD69的表达对细胞进行分析。示出CD69的ΔMFI值。
在HEK293T细胞的膜上表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)抑制T细胞活化。使用两种浓度的抗-CD3(OKT克隆，0.25至1μg/ml或UCHT1克隆，2至4μg/ml)和两种浓度的HEK293T细胞(每孔25,000或50,000个细胞)的基质，观察到最高的抑制作用。在过夜孵育之后并且甚至在7.5小时孵育之后，观察到T细胞活化的抑制。这些结果指示，与C1ORF32蛋白的细胞外结构域的Fc融合形式类似，在细胞表面上表达的天然膜蛋白质也具有功能抑制活性，并且因此可以用作适合用于抗癌症治疗的治疗性拮抗性单克隆Ab的靶标。这些结果与其它发现结果一致，从而指示“T细胞刺激”BW-5147细胞中膜C1ORF32蛋白的异位表达抑制人T细胞增殖，如在此下所描述。
实例10：在HEK-293细胞膜上表达的C1ORF32抑制小鼠CD4T细胞
为了确认C1ORF32蛋白对小鼠T细胞的抑制活性，使C1ORF32蛋白(SEQ ID NO:1)在HEK-293细胞上异位表达，如在此实例3中所描述。使用编码人C1ORF32(SEQ ID NO:1)的表达载体或空载体。转染株中C1ORF32的细胞膜表达是通过FACS分析使用特异性抗-C1ORF32多克隆Ab进行验证的(数据未示出)。使用用板结合的抗-CD3活化的CFSE标记的小鼠CD4+T细胞，在HEK-293上表达的C1ORF32的抑制作用是明显的(图15)。如图15中所示，当每给定数目的T细胞存在更多HEK-293细胞(即1:2对1:4HEK-293:CD4)时，抑制作用更高。
图15示出C1ORF32(SEQ ID NO:1)的异位表达在TCR刺激时抑制小鼠CD4T细胞分裂。图15A呈现在1:4或1:2HEK-293:CD4比率下在表达C1ORF32或空载体的HEK-293转染株存在下，用CFSE标记的并且用板结合的抗-CD3(0.5μg/ml)刺激的小鼠CD4+CD25-T细胞(1×105)的结果。在第4天时，收获细胞，并且通过流式细胞术进行分析。百分比是指已经分裂两次以上的细胞的分率。图15B呈现指示已经分裂两次以上的细胞的百分比(平均值±SD)的直方图(*P值<0.05，P值<0.001，学生T检验)。
实例11：人T细胞应答中C1ORF32的功能性作用
本研究的目的是使用表达C1ORF32的T细胞刺激细胞，评价C1ORF32在人T细胞活化过程中的功能性作用。
编码C1ORF32的表达构建体的产生和表征
将C1ORF32蛋白(分别是SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:1)的cDNA(密码子优化的以用于在鼠类细胞中表达，SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:32)进行基因合成并且经由Sfi-I位点定向克隆至逆转录病毒载体中。
编码全长C1ORF32蛋白SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:1的双顺反子和单顺反子表达构建体分别是在pMIGII载体和pCJK2载体中产生的。通过琼脂糖凝胶电泳对构建体进行验证，并且被表达于展示出高水平的膜结合抗-CD3抗体(Bw-3/2)的Bw5147细胞中(“mb-抗-CD3高刺激细胞”(莱特纳·J·W(Leitner,J.,W.)等人，2010免疫学方法杂志362:131-141.))。出于对照目的，将Bw5147细胞用一种“空载体”pCJK2转导用于单顺反子表达或用pMIGII转导用于双顺反子表达。此外，表达活化共刺激分子(ICOSL和CD70)的Bw-3/2细胞，表达源自一个单顺反子pBMN-B7-H3＝“B7-H3”和一个双顺反子载体pMIGII-B7-H3的B7-H3、以及B7-H1(PD-L1)的Bw-3/2-细胞产生为负向共刺激/共抑制分子。ICOSL、CD70或B7-H3表达刺激细胞的实验已经在之前进行了描述(普菲斯特哈默·K·C(Pfistershammer,K.，C.)等人，2006.欧洲免疫学杂志36:1104-1113；科伯·J.(Kober,J.)等人，2008.欧洲免疫学杂志38:2678-2688；莱特纳·J·W等人.2010.免疫学方法杂志362:131-141)。通过GFP的FACS-分析对双顺反子构建体的存在和表达进行确认。使用DyLight-649抗-小鼠IgG(H+L)抗体通过FACS对刺激膜结合(stimulating membrane-bound)抗-CD3抗体的均匀高表达进行确认，DyLight-649抗-小鼠IgG(H+L)抗体与刺激细胞上表达的鼠科动物单链抗体反应。根据使用其它分子(例如B7-H3)的先前实验，使用单顺反子逆转录病毒表达，可以预期更高的表面表达。对应刺激细胞中单顺反子构建体的表达的高转录水平通过qRT-PCR使用用primer3程序产生的引物对SEQ ID NO:35-36和35-37来进行确认。使用特异性多克隆Ab对SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:1(其具有相同的细胞外结构域)的表达进行检查。使用这种pAb的FACS分析在携带SEQ ID NO:17的细胞中显示非常弱的膜表达，而SEQ ID NO:1显示稳健表达(图16)。
T细胞
用于在该项目内进行的实验的来自志愿者供体的人血液的使用由维也纳医科大学(Medical University of Vienna)的伦理委员会批准(EKNr.:865/2011)。从来源于健康志愿者供体的血沉棕黄层或肝素化血液中纯化T细胞，并且使用Ficoll-Paque(GE-医疗集团(GE-Healthcare))通过标准密度离心获得单核部分。通过携带CD11b、CD14、CD16、CD19、CD33以及II类MHC的细胞(具有与顺磁性链霉亲和素珠粒结合的对应的生物素化的mAb)的MACS-消减来获得大量人T细胞(莱特纳·J等人，2009欧洲免疫学杂志39:1754-1764)。通过向这些池中添加生物素化的CD4和CD8mAb来获得纯化的CD8T细胞和CD4T细胞。使用来自美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)的天然CD4+T细胞分离试剂盒II来分离天然CD4T细胞。分离之后，针对纯度通过FACS分析对细胞进行分析，并且具有足够纯度(>90％)的样品用于实验。
使用表达C1ORF32分子的刺激细胞和对照刺激细胞的T细胞刺激实验
使用表达C1ORF32分子的刺激细胞和对照刺激细胞的一系列T细胞活化实验是在如所描述的标准条件下进行的(莱特纳·J等人，2010免疫学方法杂志362:131-141)。补充有10％FBS(西格玛)、抗生素以及抗真菌剂(分别是PenStrep和两性霉素(Amphotericin))的RPMI1640培养基(英杰公司)用于培养Bw细胞并且还用于功能性实验。简言之，收获刺激细胞，计数、辐射处理(2×3000rad)并且接种于平底96孔板中(20.000细胞/孔)。将液氮储存的MACS-纯化的T细胞解冻，计数并且添加至孔中(100.000个细胞/孔)；总体积为200μl/孔。为每种条件建立一式三个的孔。在48小时共培养之后，收获从一式三个的孔收集的上清液(SN)(50μl/孔)并且冷冻用于细胞因子分析。使用IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-13的抗体对与纯化的重组细胞因子相结合进行基于Luminex的多重细胞因子分析以建立标准曲线。在一些实验中，还测量了IL-17或IL-4，但是因为这些细胞因子的浓度通常非常低，所以对于大多数样品来说，这些测量值被省去。进行一式三份的测量并且将结果描绘为平均值+/-SEM。如所描述的，在48小时时去除50μl的SN之后，如所描述将甲基-3H-胸苷(50μl/孔，1:80稀释于培养基中；最终浓度：0.025mCi；珀金埃尔默公司(PerkinElmer)/新英格兰核公司(New England Nuclear Corporation)，韦尔斯利(Wellesley)，马塞诸塞州(MA))添加至孔。在另外18小时培养之后，将板在过滤板上进行收获并且在β-计数器中测定3H-胸苷的结合。此外，进行一系列使用MACS-纯化的T细胞亚群(CD4T细胞、CD45RA-阳性CD4T细胞以及CD8T细胞)的类似实验。
所有实验中的另外对照包括仅具有刺激细胞的孔(数据未示出)。进行这一点以在显微镜下评估细胞并且还用于测定刺激细胞在没有T细胞情况下的3H-胸苷结合。来自实验(其中在辐射后观察到刺激细胞的快速分解)的数据被排除在该分析之外。这种现象在辐射之后偶然发生；并且其原因目前尚不清楚。此外，未刺激的和PMA/离子霉素(Ionomycin)刺激的T细胞也针对3H-胸苷结合进行分析。
此外，进行标准的CFSE稀释实验：将T细胞进行CFSE-标记并且将100.000个T细胞与辐射处理的刺激细胞共培养(每孔20.000个细胞)。在7天共培养之后，进行FACS分析：将细胞用抗-CD8-APC进行染色，并且通过在CD8和CD4(CD8-阴性)T细胞上的电子门控来评估CFSE-稀释。
还进行基于刺激细胞的实验以评估C1ORF32蛋白对活化标志物(CD25和CD69)的潜在调节。然而，在这些实验中，观察到这些分子的非常弱的诱导，该诱导未通过C1ORF32-蛋白调节(数据未示出)。
按以下方式进行统计比较：仅其中来自C1ORF32-蛋白和对照组的结果可获得的实验被包括在分析中。T-检验用于统计分析(未进行多重比较的调整)以评价与表达C1ORF32-蛋白或CD70、ICOSL以及B7-H3的刺激细胞对比对照刺激细胞(pCJK2)的共培养物中T细胞的增殖。所有试验一式三份地进行。
结果：
使用大量T细胞的T细胞刺激实验
测量用对照或C1ORF32(SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:1)表达刺激细胞刺激的大量T细胞的增殖的6个独立实验的统计分析显示，与pCJK2对照刺激细胞相比，SEQ ID NO:1表达细胞中的增殖显著更低(35％抑制)。这种作用与B7-H1的作用(32％)是可比的(图17)。通过表达SEQ ID NO:17的刺激细胞诱导的增殖被减少至较低程度(12％抑制)，但没有达到统计显著性，但是应该指出，SEQ ID NO:17具有与SEQID NO:1相同的细胞外结构域。这一发现结果可能是如使用识别共同细胞外结构域的特异性抗体通过FACS分析所评估的其更低表达的结果(图16)。如所预期的，表达共刺激分子CD70和ICOSL的刺激细胞诱导的T细胞增殖比对照刺激细胞显著更高。通过B7-H3表达刺激细胞诱导的增殖与用对照刺激细胞获得的增殖相比略低(15％)，但这未达到统计显著性。
使用CD4T细胞的T细胞刺激实验
使用CD4T细胞进行三个独立实验。通过表达CD70或ICOSL的刺激细胞诱导的增殖与对照刺激细胞相比显著更高。表达B7-H3的刺激细胞显著地抑制增殖(53％，p<0.05)，然而，对于表达B7-H1的细胞观察到仅少量减少(约20％)，这未达到统计显著性。由表达SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:1的刺激细胞诱导的增殖未受影响。图18中示出了结果。
图18呈现响应于表达空载体或表达表达不同的C1ORF32分子、共刺激分子或共抑制分子的载体的刺激细胞，T细胞(CD4+)增殖的结果。所示的是3个实验的平均值+/-SEM。*p<0.05、**p<0.01以及#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
使用CD8T细胞的T细胞刺激实验
使用CD8T细胞进行三个独立实验。与对照刺激细胞相比，表达C1ORF32蛋白的刺激细胞诱导CD8T细胞的更低增殖(31％至32％抑制；图19)，然而，这种作用未达到统计显著性。与对照刺激细胞相比，由表达CD70或ICOSL的刺激细胞诱导的增殖显著更高，而使用B7-H3和B7-H1表达刺激细胞获得的增殖显著更低(53％-56％)。
图19呈现响应于表达空载体或表达表达不同的C1ORF32蛋白、共刺激分子或共抑制分子的载体的刺激细胞，T细胞(CD8+)增殖的结果。所示的是3个实验的平均值+/-SEM。**p<0.01、***p<0.001以及#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
使用天然CD4T细胞的T细胞刺激实验
使用天然CD4T细胞进行三个独立实验。由表达SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:1的刺激细胞诱导的增殖与由对照刺激细胞(pCJK2；图20)诱导的增殖应答没有区别。由B7-H3和B7-H1表达刺激细胞诱导的增殖与对照刺激细胞相比更低，但该差异未达到统计显著性。由表达CD70或ICOSL的刺激细胞诱导的增殖显著更高。
图20呈现响应于表达空载体或表达表达不同的C1ORF32分子、共刺激分子或共抑制分子的载体的刺激细胞，T细胞(天然CD4+CD45RA+)增殖的结果。**p<0.01和***p<0.001(学生T检验)表示与空载体相比显著不同的结果。
CFSE-标记实验
进行两个CFSE-标记实验，一个使用大量T细胞并且一个使用天然CD4T细胞。在两个实验中，由C1ORF32表达刺激细胞或表达B7-H3和B7-H1的细胞诱导的CFSE-稀释与使用对照刺激细胞所获得的CFSE-稀释是可比的。除了CD70表达刺激T细胞显著例外之外，所有刺激细胞诱导很少增殖应答(数据未示出)。
细胞因子
在来自大多数实验的大量、CD4+、CD8+以及天然T细胞的共培养SN中测定细胞因子(IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17以及IFN-γ)的浓度。图21A至图21G的结果显示根据使用大量T细胞的代表性实验，SEQID NO:17和SEQ ID NO:1对增殖和细胞因子分泌的作用。通常，观察到使用共抑制分子，细胞因子产生的抑制是T细胞增殖的抑制的函数。一些细胞因子(IL-2、IL-13并且尤其IL-4)的浓度处于更低pg范围中，这被认为是极其低的。
图21呈现响应于表达不同的C1ORF32蛋白，或作为对照的共刺激分子、共抑制分子或空载体的刺激细胞，T细胞(大量)增殖(A)和细胞因子分泌(B-G)的结果。细胞因子数据表示来自从一式三个的孔收集的SN的一式三个的测量值。*p<0.05、**p<0.01、***p<0.001、以及#p<0.0001(学生T检验)表示与空载体相比的显著不同结果。
使用表达C1ORF32分子的刺激细胞的实验中所获得的结果指示当在其活化过程中存在时，它们能够抑制人T细胞应答。使用表达SEQ IDNO:1的刺激细胞所获得的结果证明与用对照刺激细胞刺激的T细胞相比，人T细胞的更低增殖(总结于表3中)。这种作用的程度与由阳性对照B7-H3和B7-H1中的一个或两个所发挥的作用的程度类似。如以上所提及，SEQ ID NO:17仅被弱表达，这可以解释其较差的抑制活性。
使用大量T细胞、纯化的CD8T细胞、CD4T细胞或天然CD4T细胞检查由表达C1ORF32分子的刺激细胞诱导的增殖。作用在CD8T细胞中最显著，而对其他细胞类型的作用在大多数情况下更弱(表3)。细胞因子分泌的抑制通常与T细胞增殖的抑制一致。总而言之，这些结果表明C1ORF32蛋白在人T细胞活化过程中的抑制作用。
表3呈现在刺激细胞上表达的C1ORF32-蛋白和共抑制对照物对T细胞的不同亚型的活化(如通过增殖所评估的)的抑制作用。所示的是与表达空载体的刺激细胞相比的抑制％。*表示统计学上显著的结果。
表3
除了证明C1ORF32的膜结合形式产生对于T细胞活化的负信号的以上实例之外，与本申请共同被拥有的WO/2012/001647中的实例5和实例8(其特此通过引用结合，就如如同完全在此阐明一样)证明在不同实验系统中，与小鼠IgG2A Fc结构域融合的C1ORF32ECD的融合蛋白对T细胞的活化具有抑制作用。在所有实验系统中，与用作阴性对照的同种型匹配的抗体相比，C1ORF32-ECD-Fc的存在引起T细胞活化的减少。这是通过T细胞增殖的减少以及细胞因子分泌的抑制观察到的。因此，不希望受单一假设限制，对C1ORF32特异的中和抗体将被预期消除这种受体的抑制活性，并且由此，将被预期增强肿瘤免疫监视。
实例12：C1ORF32对细胞毒性T淋巴细胞(CTL)功能活性的作用
在一种实验系统中对异位表达的C1ORF32(SEQ ID NO:1)对人细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能活性的作用进行测试，其中C1ORF32(SEQ ID NO:1)在作为靶细胞的人癌细胞(之前所描述的SK-MEL-23、mel624.38以及mel526(托帕利安·S·L(Topalian,S.L.)等人1989，免疫学杂志(J.Immunol.)142:3714-3725；霍顿·A·N(Houghton,A.N.)等人，1987.实验医学杂志(J.Exp.Med.)165:812-829))上过度表达，然后将这些人癌细胞与过度表达肿瘤相关抗原(TAA)特异性和HLA-A2限制的T细胞受体(TCR)的引发的人CD8+T细胞(CTL)共培养。待测试的读出值包括活化依赖性的细胞因子分泌、活化标志物的表达以及杀伤活性。
黑色素瘤细胞系中C1ORF32(SEQ ID NO:1)的表达：为了在靶细胞中表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)，将编码这种蛋白质的cDNA使用特异性引物(SEQ ID NOs:33和34)进行扩增，用酶PciI和NotI进行消化并且克隆至基于MSCV的逆转录病毒载体载体(pMSGV1)中(卡里许，等人，免疫学杂志2005年12月1日；175(11):7226–7234)。
首先使用限制性内切酶并且随后通过测序来进行克隆的核实。在序列确认之后，产生大量逆转录病毒载体(大量制备)以用于后续使用。
使用基于纤维连接蛋白(retronectin)的方案将三个人黑色素瘤细胞系(SK-MEL-23、mel624.38以及mel526)用编码C1ORF32(SEQ ID NO:1)的逆转录病毒载体进行转导；简言之，在用该逆转录病毒载体和双嗜性包膜基因(VSV-G)转染之后在293GP细胞(逆转录病毒包装细胞系)中产生逆转录病毒上清液。将该逆转录病毒上清液接种在纤维连接蛋白涂覆的板上，之后转导以使病毒粒子能够与板结合。然后，将黑色素瘤细胞添加至该板持续6小时。在这之后，将细胞在一个新的培养容器中进行补充。该蛋白质的转导效率和表达通过用C1ORF32特异性抗体(在此所描述的5159-1)对转导的肿瘤细胞进行染色来测定并且通过流式细胞术进行分析。
效应细胞的转导：
为了使用人CTL进行功能测定，使用原代人淋巴细胞，这些原代人淋巴细胞被工程化以表达F4TCR，F4TCR是识别HLA-A2+/MART1+黑色素瘤细胞的一种MART-1-特异性HLA-A2+限制性TCR。这种TCR最近在临床试验中在终末疾病黑色素瘤患者中使用，以通过使用编码TCR的逆转录病毒特异性地赋予来自外周血液的自体淋巴细胞对肿癌的识别(摩根(Morgan)等人，2006科学，314:126-129)。将用PHA刺激5至10天的新鲜分离的PBL(外周血液白细胞)通过电穿孔用来自MART-126-35-特异性TCR(被称为F4)的α链和β链的体外转录的mRNA进行转染。简言之，电穿孔是使用一种ElectroSquare Porator在400V/500us下进行的。每个链的体外转录的mRNA的量是每106个细胞1ug。随后将转染的淋巴细胞转移至一个新的培养容器并且在含有300IU的IL-2、每2至3天进行补充的淋巴细胞培养基中进行培养。
由候选物转导细胞介导的细胞因子分泌：
建立表达C1ORF32(SEQ ID NO:1)的黑色素瘤细胞与F4-TCR转导的T细胞的共培养物。通过ELISA测量细胞因子分泌(IFN-γ和IL-2)以评估效应CD8T细胞对不同转导的肿瘤细胞系的特异性识别和应答。对于这些测定来说，将105个效应子与105个黑色素瘤靶细胞共培养16小时。在稀释以便处于ELISA测定的线性范围中的培养物上清液中测量细胞因子分泌。
将人黑色素瘤细胞系(SK-MEL-23、mel624.38以及mel526)首先使用C1ORF32特异性单克隆抗体5159-1进行染色以用于C1ORF32蛋白的表达。未在母体(非转导细胞)的表面上检测到C1ORF32，如通过流式细胞术所测定(数据未示出)。然后将这些细胞系用编码C1ORF32蛋白SEQ ID NO:1的逆转录病毒载体进行转导，如在此所描述。转导48小时之后，通过流式细胞术来评估C1ORF32表达的水平并且将其与母体细胞系的水平进行比较。对于所测试的不同细胞系，蛋白质表达的水平在高于背景30％至60％之间的范围(图22)。
如在此所描述，将PBL用PHA刺激5至10天并且随后用MART-1特异性TCR F4进行电穿孔。将效应CD8+PBL在含有IL-2的淋巴细胞培养基中进行培养。图23示出针对两个不同供体所获得的TCR表达的水平。
将效应CD8+PBL添加至母体黑色素瘤系(mel526、mel624.38或SK-MEL23)抑或对应的C1ORF32转染株。在开始共培养16小时之后，评估IFNγ和IL-2分泌的水平。在使用4个不同的T细胞供体的4个独立的实验中，在与C1ORF32表达SK-MEL-23细胞系共培养之后，与母体细胞系相比，观察到来自CTL的IFNγ分泌的显著减少(约40％)(p＝0.01)。使用其他C1ORF32表达细胞系，所观察到的IFNγ分泌的差异未发现统计学显著性(图24)。
然而，在第二组实验(总计3个)中，与C1ORF32表达SK-MEL23细胞的共培养物中所观察到的减少较不显著(约10％)(数据未示出)。另外，似乎还看出，转导的黑色素瘤系中C1ORF32表达的水平随时间(6周)略微减少。
关于IL-2分泌，获得不一致的结果，这些结果显示在一些情况下，观察到一些共培养实验中的略微增加(数据未示出)，这种增加未达到统计学显著性。
这个研究分析了异位表达的C1ORF32对CTL效应子功能的作用。这些结果指示黑色素瘤细胞上的C1ORF32表达导致由CTL分泌的IFNγ减少。这些结果指出活性中的一种趋势。实验系统中一些特征的另外优化正在进行：
1)黑色素瘤细胞系上C1ORF32异位表达的水平和均匀性。
2)原代活化的CD8细胞上F4T细胞受体的表达水平
3)测试对CTL杀伤活性直接作用的研究的延伸
不希望受单一假设限制，对在不同黑色素瘤细胞系上表达的C1ORF32的CTL的作用方面的差异可以通过在不同黑色素瘤系上内源性表达的共刺激蛋白/共抑制蛋白的不同组库来解释。
实例13：C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:18)体外上调可诱导的调节T细胞(iTreg)的分化
Treg在有助于肿瘤免疫逃避的免疫抑制网络中起着重要作用。为了测试抗C1ORF32抗体封闭Treg分化的能力，首先测试C1ORF32融合蛋白与天然T细胞的相互作用是否影响它们分化为iTreg。为此目的，使用C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:18)，并且通过测试调节T细胞标志物FoxP3的表达、当在iTreg驱动条件存在下孵育时通过CD4+CD25+纯化的T细胞来评价其对调节T细胞的分化的作用。
经由automax分选(CD4-阴性分选加CD25阳性分离，接着CD62L-阳性分选)从DO11.10小鼠中分离天然CD4+T细胞。
将细胞在IL-2(100U/ml)、TGF-β(10ng/ml)以及对照Ig(10ug/ml)或C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ ID NO:18)(1或3ug/ml)存在下、在辐射处理的Balb/c脾细胞(以1:1比例；5×105T细胞/孔)和OVA323-339肽(20ug/ml)存在下活化。在培养第4天时，收获细胞并且染色用于存活力、CD4、CD25、以及FoxP3表达。
如在图25中所证明，在C1ORF32-ECD-小鼠IgG2a融合蛋白(SEQ IDNO:18)存在下孵育天然CD4+CD25+T细胞导致CD4+CD25+FoxP3+T细胞的百分比的有效和剂量依赖性增加。这些结果指示C1ORF32蛋白与T细胞上其对应受体的相互作用导致iTreg分化的诱导。因此，不希望受单一理论限制，使用封闭这种相互作用的C1ORF32特异性抗体适用于下调iTreg分化，并且通过这一点增加针对癌症的免疫系统活性。
如在此所示，离体结果证明C1ORF32-Ig融合蛋白增强CD4T细胞分化为iTreg。这些结果表明C1ORF32途径涉及在iTreg诱导和分化中，并且暗示使用封闭性单克隆抗体靶向C1ORF32抑制iTreg积聚和免疫抑制功能。此外，通过抑制C1ORF32免疫检查点活性，这类封闭性抗体还将增强效应T细胞活性。因此通过C1ORF32封闭性抗体增强效应T细胞活性并且抑制iTreg免疫抑制活性导致单独的或与一种增效剂组合使用这类抗体的癌症治疗中增强的有益作用。
除证明C1ORF32在促进iTreg的分化中的作用的以上结果之外，WO/2012/001647(通过引用结合，就如如同完全在此阐明一样)中的实例5、6以及11证明使用小鼠和人CD4+T细胞，在特异性Th驱动条件下活化时C1ORF32对Th分化的作用。鼠类T细胞活化是抗原特异性的抑或多克隆的。使用小鼠或人细胞，在大多数这些实验设置中的结果指出C1ORF32对T细胞的免疫调节作用，由此Th1和Th17驱动的应答(在Th1和Th17驱动条件下促炎细胞因子的分泌和细胞增殖)被抑制，而抗炎细胞因子(所获得的Th2，和IL-10)的分泌被促进。
已知肿瘤逃避免疫监视的机制之一是促进Th2/M2定向的免疫应答(比斯瓦斯·S·K(Biswas SK)，等人，2010年10月；11(10):889-96)。因此，不希望受单一假设限制，抑制C1ORF32的以上所证明的免疫调节作用(即，Th2应答的促进以及Th1应答的抑制)的一种中和抗体对于治疗癌症是有益的。
实例14：C1ORF32与NK细胞的结合和C1ORF32异位表达对NK杀伤活性的作用
这个分析的目的是评价C1ORF32(含有C1ORF32的细胞外结构域与mIgG2a的Fc的Fc融合蛋白(SEQ ID NO:24))与NK细胞的结合潜力；并且评价C1ORF32在HEK293T细胞上的异位表达是否影响其对被NK细胞杀伤的敏感性。在此所描述了所使用的过度表达C1ORF32(SEQID NO:1)的HEK293T细胞。
从外周血单核细胞中分离NK细胞：
人NK细胞是使用人NK细胞分离试剂盒和autoMACS仪器(美天旎生物技术公司，奥本(Auburn)，加利福利亚洲(CA))从PBL(外周血液细胞)中分离的。
原代NK细胞系的产生：
人原代NK细胞系是通过将纯化的人原代NK细胞以一个细胞/孔接种在96孔U型底板的、补充有10％FCS、10％白细胞条件培养基、以及1μg/ml PHA的完全培养基中。添加辐射处理的饲养细胞(来自两个供体的2.5×104同种异体PBMC和各孔中5×103RPMI8866B细胞系)。将如通过以多种细胞密度生长所定义的增殖克隆(其中细胞的生长在少于三分之一的所接种的孔中发生)在完全培养基中在96-孔板中扩增。将这些人活化的原代NK细胞系在补充有1mM谷氨酰胺、1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2×10-5Mβ-ME以及50U/ml rhulL-2的RPMI、10％人血清中。此处呈现的结合测定和杀伤测定是使用NK细胞的多克隆群体(即在来自各供体的所有存活的NK克隆的合一之后)进行的。
细胞毒性测定：
使用S35释放测定对NK细胞针对异位表达C1ORF32的HEK-293的细胞毒性活性进行评价，其中将效应细胞与5×103[S35]蛋氨酸-标记的靶细胞在不同E/T比率下在U型底微量滴定板中进行混合。在37℃下过夜孵育之后，通过在4℃下在1,000rpm下离心10分钟来终止测定，并且收集100μl上清液用于液体闪烁计数。如下计算特异性溶解百分比：溶解％＝[(cpm实验孔-cpm自发释放)/(cpm最大释放-cpm自发释放)]×100。自发释放是通过仅用培养基孵育S35-标记的靶细胞来确定。最大释放是通过在0.1M NaOH中溶解靶细胞来确定。在所有呈现的实验中，自发释放是最大释放的<25％。
结合测定
将NK细胞用5μg的C1ORF32(SEQ ID NO:24)或同种型对照(mIgG2a)在冰上孵育2小时。在细胞洗涤之后，添加第二抗小鼠抗体并且通过流式细胞术对结合进行评价。
C1ORF32与NK细胞的结合
在这些实验中，对C1ORF32(SEQ ID NO:24)与NK细胞(即活化的原代NK细胞系)以及与来自一些不同供体的新鲜分离的NK细胞的结合进行评价。
结果呈现于图26中，证明了C1ORF32(SEQ ID NO:24)与原代活化的NK细胞和新鲜分离的NK细胞的结合。将来自三个不同供体的人NK原代细胞系(图26A)或来自三个其他供体的新鲜分离的NK细胞(图26B)与5μg未标记的C1ORF32(SEQ ID NO:24)或对照同种型mIgG2a一起进行孵育。灰色直方图是mIgG2a，红色直方图或黑色直方图属于C1ORF32。
如在图26中所示，C1ORF32(SEQ ID NO:24)大体上展示没有与NK细胞的结合，但是在一些情况下非常弱的结合是明显的(如在供体编号3、5以及6中)。
C1ORF32在HEK293T细胞中的过度表达导致NK细胞细胞毒性的降低
评估了HEK293T细胞上C1ORF32(SEQ ID NO:1)的异位表达对其对被NK细胞杀伤的敏感性的作用。图27呈现HEK293T细胞上C1ORF32(SEQ ID NO:1)表达导致其对被NK细胞杀伤的敏感性的稍微减少的结果。将人NK原代细胞与过度表达C1ORF32的细胞(293T-001)或未转染的HEK293T细胞(293T-对照)共孵育，并且如在此材料和方法中所描述来评估杀伤百分比。效应子与靶(E:T)比例(X轴)在1:40至1:5的范围(效应细胞的两倍稀释)。*指代p值<0.05。
图27中所示的结果显示C1ORF32(SEQ ID NO:1)的表达导致NK杀伤活性的略微降低，这种降低仅在最高E:T比例下达到统计显著性(p<0.05)。
不希望受单一假设限制，示出C1ORF32(SEQ ID NO:1)过度表达对HEK293T细胞对被NK细胞杀伤的敏感性的作用的数据提出以下可能性：NK细胞涉及在C1ORF32作用机制中。通过结合测定检测到NK细胞上C1ORF32的反受体的表达处于低水平。不希望受单一假设限制，有可能C1ORF32与NK细胞上的反受体的结合亲和力在不同NK克隆之间是可变的，并且因此不能在这个测定中稳健地检测到。
NK细胞使用多种受体以检测异常细胞，包括肿瘤以及其转移。NK细胞的活性由活化性受体与抑制性受体之间的平衡来决定。描绘C1ORF32是一种抑制性配体(其与NK细胞上的对应受体结合并且抑制NK细胞的细胞溶解活性)的这些结果支持使用一种中和C1ORF32特异性抗体，该抗体抑制这种负调节并且因此增强免疫系统对肿瘤的清除。
实例15：活化的T细胞上C1ORF32推定受体的表达
通过使用板结合的抗-CD3和可溶性抗-CD28来测试C1ORF32与静止的或活化的小鼠CD4T细胞的结合来对C1ORF32的推定对应受体的表达进行研究。为了防止与Fcγ受体结合，使用C1ORF32的无糖基化型式(含有N278A突变的Fc，SEQ ID NO:38)。此外，抗-CD16/CD32抗体用于封闭Fcγ-受体。图14中所示的结果指示没有C1ORF32与未活化的T细胞的可检测的结合，并且与活化的CD4+T细胞的结合有小但是清楚的增加。这些结果表明活化的T细胞表达C1ORF32的推定对应受体。如可以在图10至图13、图15至图21中看出，C1ORF32的膜结合形式产生T细胞活化的负信号。因此，不希望受单一假设限制，对C1ORF32特异的中和抗体消除这种受体的抑制活性，并且由此，增强肿瘤免疫监视。
图14示出与静止和活化的小鼠T细胞的C1ORF32结合曲线。在可溶性抗-CD28(2μg/ml)存在下，将无损(Untouched)小鼠CD4+CD25-CD4T细胞保持在培养基中(“未活化”)或用固定的抗-CD3(2μg/ml)刺激。在48小时之后，在用于封闭Fcγ-受体的小鼠抗-CD16/32的存在下，将抗-CD3/28刺激的CD4细胞用生物素化的C1ORF32H:M(N278A；无糖基化的)(SEQ ID NO:38)或同种型对照(生物素化的小鼠IgG2a；Biolegend公司)，接着用链霉亲和素-PE进行染色。
实例16：C1ORF32异位表达细胞系上通过抗C1ORF32抗体5166-9的补体依赖性细胞毒性(CDC)的效应子功能活性
本实验的目的是建立解决表达C1ORF32的细胞系上C1ORF32单克隆抗体的补体固定能力的功能测定以及使用该测定来筛选CDC效应子功能的潜在治疗性抗体。
C1ORF32表达细胞系：
表达人C1ORF32或空载体的HEK293T细胞和CHOK1细胞是如以上所描述产生的。将转染的HEK293T细胞在补充有10％FBS、谷氨酰胺-Penstrep的DMEM中在选择5ug/ml嘌罗霉素的情况下进行培养。类似地，将转染的CHOK1细胞在补充有10％FBS、谷氨酰胺-Penstrep的F12中在选择12ug/ml嘌罗霉素下进行培养。完全培养基(CM)是指对应细胞系的培养基。
抗体：针对C1ORF32的5166-9(IgM)、5159-3(IgG2a)以及5159-1(IgG1)纯化的小鼠单克隆抗体是根据如在此所描述在美国银湖产生的。纯化的小鼠IgM同种型对照，克隆MM-30(目录号401602)和纯化的小鼠IgG2a同种型对照，克隆MOPC-173(目录号400224)购自美国Biolegend公司。
试剂：纯化的兔补体(目录号CL-3441)购自加拿大西达琳实验室(Cedarlane laboratories)。细胞滴度Glo试剂购自美国普洛麦格公司(目录号G7570)。
细胞毒性测定：细胞毒性测定：使用细胞滴度CellTiter-Glo试剂对针对异位表达C1ORF32的HEK293和CHOK1的C1ORF32抗体的CDC活性进行评价。将细胞以5×103个细胞/孔的密度接种在96孔组织培养板的50ulCM中。在培养过夜之后，将2×抗体、同种型、单独培养基的连续稀释液以相等体积添加至对应孔。添加新鲜重构的补体并且将板在37℃下孵育。在1小时之后，将板平衡至室温，每孔添加100ul的细胞滴度CellTiter-Glo试剂并且在室温下孵育5至10分钟。将170ul转移至一个白色板并且在Victor2板阅读器(珀金埃尔默)上测量荧光。将数据在Excel中导出并且分析，并且在GraphPad Prism中绘制。
如下计算CDC百分比：100-[(RLU实验孔/RLU补体单独)×100]。条件一式三份地运行并且数据表示2个实验。
FACS染色：将HEK293T和CHOK1母体和CGEN15001T表达细胞进行洗涤并且在4℃下在FACS缓冲液(PBS(美国生命技术公司(LifeTechnologies))、1％BSA(西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))以及0.01％叠氮化钠(西格玛奥德里奇公司))中在25ul的不同浓度的5159-1中进行染色持续60分钟。将细胞在FACS缓冲液中洗涤一次，在4℃下再悬浮于25ul的山羊抗小鼠IgG的Alexa Fluor647轭合的F(ab’)2片段(杰克逊免疫研究公司(Jackson Immunoresearch)目录号115-606-146)中持续30分钟。将这些细胞在FACS缓冲液中再洗涤，再悬浮于35ul的FACS缓冲液和35ul的4％多聚甲醛中并且在FACS Calibur抑或Intellicyt HTFC上进行分析。将数据通过FlowJo、Excel以及GraphPadPrism进行分析。
抗C1ORF32抗体(如5166-9)对C1ORF32表达细胞、例如对异位表达C1ORF32的HEK293具有有效的CDC活性。
在这些实验中，评价了抗体5166-9(一种小鼠IgM单克隆)对表达C1ORF32的HEK293T和CHOK1细胞的活性。如在图28中所示，5166-9展示对表达C1ORF32的HEK293T细胞的有效CDC活性，具有1.8ng/ml或0.01nM的EC50。在空载体对照细胞系上观察到显著更低水平的活性(右图)。空载体系上较低水平的活性很可能是由于抗原的较低水平的内源性表达(数据未示出)。与HEK293T细胞类似，抗体5166-9在CHOK1细胞中展示出剂量依赖性CDC活性，具有33ng/ml或0.2nM的EC50(图29)。最大杀伤作用与表达C1ORF32的HEK293T相比更低。效力中的这些差异可以通过以下来解释：表达C1ORF32的CHOK1转染株上的不完全表达(通过FACS，40％的细胞显示无表达——数据未示出)以及更低水平的C1ORF32表达，如通过FACS可见(图30)。5159-3(一种IgG2a小鼠单克隆)的活性在这些测定中显示显示最小活性(数据未示出)。
图28证明5166-9抗C1ORF32抗体显示出针对表达C1ORF32的HEK293的有效CDC活性。将HEK293细胞系与5166-9或对照同种型mIgM在补体存在下进行孵育并且在1小时之后测量存活力。
图29证明5166-9抗C1ORF32抗体显示出针对表达C1ORF32的CHOK1细胞的CDC活性。将CHOK1细胞系与5166-9或对照同种型mIgM在补体存在下进行孵育并且在1小时之后测量存活力。
图30呈现与CHOK1相比，HEK293T细胞上的C1ORF32表达。基于使用一种C1ORF32抗体5159-1对C1ORF32的检测，与CHOK1C1ORF32相比，HEK293C1ORF32细胞表达更多靶抗原。
这些数据显示表达C1ORF32的HEK293T细胞和CHOK1细胞上抗C1ORF32Ab(5166-9)的CDC活性。这些测定可以用于表征C1ORF32的功能性Ab。这些结果提出以下可能性：人IgG1子类的C1ORF32治疗性抗体(已知用于补体固定活性)可以潜在地通过多种作用机制起作用，包括C1ORF32表达癌细胞上CDC介导的效应子功能。
实例17：C1ORF32蛋白作为癌症免疫监视的调节剂的作用：
1)体内概念证明
a)小鼠癌症同系模型：
(i)将过度表达C1ORF32蛋白或非相关对照蛋白的肿瘤细胞移植至遗传匹配的小鼠。然后检查肿瘤体积(和处死动物之后的肿瘤重量)以证明肿瘤生长的延迟(即，过度表达C1ORF32的肿瘤比过度表达非相关对照蛋白的肿瘤生长得更快)。进行来自肿癌引流淋巴结的免疫细胞的离体分析以评价调节性T细胞与效应T细胞的比率。
(ii)用针对C1ORF32蛋白的中和抗体作为单一疗法来治疗同系肿瘤。将肿瘤细胞移植至遗传一致的小鼠中。将荷瘤小鼠用不同剂量的针对C1ORF32蛋白的中和抗体进行注射。作为用对C1ORF32蛋白特异的中和抗体治疗的结果，对肿瘤的排斥增加(即在用针对C1ORF32蛋白的中和抗体治疗的小鼠中，肿瘤比用非相关抗体治疗的小鼠中的肿瘤生长得更慢)。进行来自肿癌引流淋巴结的免疫细胞的离体分析以确定调节性T细胞与效应T细胞的比率。
所测试的肿瘤细胞系来自不同来源，包括结肠癌、乳腺癌以及卵巢癌、黑色素瘤、肉瘤以及血液癌。同系模型在几种小鼠品系中进行，包括BALB/c、C57bl/6以及C3H/Hej。在第一组实验中，所使用的这些同系可移植模型主要是被证明为预测癌症免疫疗法的那些。这些模型包括：BALB/c背景的B16-F10黑色素瘤(根据描述于Tihui Fu等人.癌症研究(Cancer Res)2011；71:5445-5454中的方法)、MC38结肠癌(根据描述于Ngiow SF等人.癌症研究2011年5月15日；71(10):3540-51中的方法)、ID8卵巢癌(根据描述于Krempski等人.免疫学杂志2011；186:6905-6913中的方法)、MCA105肉瘤(根据描述于王(Wang)等人.实验医学杂志第208卷第3期577-592中的方法)、CT26结肠癌(根据描述于Ngiow SF等人.癌症研究2011年5月15日；71(10):3540-51中的方法)以及4T1乳腺癌(根据描述于武田·K(Takeda K)等人.免疫学杂志2010年5月15日；184(10):5493-501中的方法)。
(iii)同系肿瘤和用针对C1ORF32蛋白的中和抗体与另一线疗法的组合的治疗的建立。将肿瘤细胞移植至遗传一致的小鼠中。在建立肿瘤之后，将小鼠用不同剂量的针对C1ORF32蛋白的中和抗体与以下组合进行IP注射：常规化学疗法(例如，环磷酰胺，根据描述于Mkrtichyan等人.欧洲免疫学杂志2011；41,2977-2986中的方法)、其他免疫检查点封闭剂(例如，PD1和CTLA4，根据描述于科伦(Curran)等人.美国科学院院刊2010年3月2日；107(9):4275-80中的方法)、其他免疫调节剂(例如抗-IL18，根据描述于泰尔梅(Terme)等人.癌症研究2011；71:5393-5399中的方法)、癌症疫苗(根据描述于赫维茨(Hurwitz)等人.癌症研究60，2444-2448，2000年5月1日中的方法)或放射性疗法(根据描述于维布鲁格(Verbrugge)等人.癌症研究2012；72:3163-3174中的方法)。
(iv)人癌症异种移植模型：将内源性表达C1ORF32的人癌症细胞系移植至免疫缺陷小鼠中。将对用抗-C1ORF32抗体治疗的小鼠与用非相关同种型匹配的抗体治疗的小鼠中的肿瘤体积进行评估。在一组研究中，将抗-C1ORF32抗体与一种毒素轭合(根据描述于卢瑟·N，等人.分子癌症治疗学，2010年4月；9(4):1039-46中的方法)以评估抗体药物轭合物(ADC)活性。在另一组实验中，将小鼠用针对C1ORF32的人IgG1或小鼠IgG2a同种型抗体进行治疗(根据描述于霍尔布鲁克·E·科尔特(Holbrook E.Kohrt)等人.临床研究杂志(J Clin Invest.)2012年3月1日；122(3):1066-1075中的方法)。这些抗体同种型用于评估抗体依赖性细胞毒性(ADCC)介导的肿瘤消除。
2)表达分析
a)从人肿瘤生物活组织检查分离的肿瘤和免疫细胞上的C1ORF32蛋白的表达
(i)使用针对C1ORF32蛋白的特异性抗体，在来自肿瘤的分离的细胞群体上进行C1ORF32蛋白的表达验证。如Kryczek I.等人.实验医学杂志(J.Exp.Med.)；2006；第203卷；第871页至881页和癌症研究2007；67；8900-8905中所述的，从肿瘤活组织检查新鲜分离不同细胞群体(例如肿瘤细胞、内皮、肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)和DC、B细胞和不同的T细胞亚群(CD4、CD8以及Treg))，以证明C1ORF32在肿瘤细胞中和肿瘤间质以及免疫浸润物上的表达。
(ii)在来自肿瘤的分离的细胞群体上进行人C1ORF32ECD-FC蛋白的结合测定。如实验医学杂志；2006；第203卷；第871页至881页和癌症研究2007；67；8900-8905中所述的，从肿瘤新鲜分离来自肿瘤活组织检查的不同细胞群体(例如肿瘤细胞、内皮细胞、肿瘤相关的巨噬细胞(TAM)和DC、B细胞和不同的T细胞(CD4、CD8以及Treg))，以显示C1ORF32的反受体在肿瘤细胞中和肿瘤间质以及免疫细胞上的表达。
b)从荷瘤小鼠的引流淋巴结和脾分离的细胞上的C1ORF32蛋白的表达
(i)如M·罗查(M Rocha)等人，临床癌症研究(Clinical CancerResearch)1996第2卷，811-820中所述的，使用针对C1ORF32蛋白的特异性抗体，在上皮癌细胞以及来自荷瘤C57小鼠的肿瘤引流淋巴结与脾的免疫细胞上进行C1ORF32蛋白的表达验证。对三种不同的癌症类型进行了测试：B16(黑色素瘤)、ID8(卵巢)以及MC38(结肠)，以便评价C1ORF32在肿瘤细胞和肿瘤引流淋巴结内的免疫细胞中的表达。
(ii)如以上所描述，在分离自上皮癌的细胞以及来自C57荷瘤小鼠的肿瘤引流淋巴结与脾的免疫细胞上进行小鼠C1ORF32ECD-FC蛋白的结合测定，以显示C1ORF32的反受体在肿瘤细胞和肿瘤引流淋巴结中的免疫细胞中的表达。
c)M2极化的巨噬细胞上C1ORF32蛋白的表达
(i)如比斯瓦斯·S·K(Biswas SK)，自然免疫学(Nat.Immunol.)2010；第11卷；第889页-896页中所描述，使用针对C1ORF32蛋白的特异性抗体，在分离自外周血、分化为巨噬细胞并且暴露于“M2驱动刺激物”(例如IL4、IL10、糖皮质激素、TGFβ)的原代单核细胞上进行C1ORF32蛋白的表达验证，以便显示C1ORF32在M2分化的巨噬细胞中的表达。
ii)如以上所描述，在分离自外周血、分化为巨噬细胞且暴露于“M2驱动刺激物”(例如，IL4、IL10、糖皮质激素、TGFβ)的原代单核细胞上进行C1ORF32人ECD-FC蛋白的结合测定，以评价C1ORF32的反受体在M2分化的巨噬细胞中的表达。
实例18：针对C1ORF32蛋白的封闭性抗体与已知免疫检查点的封闭的组合的抗肿瘤作用
免疫细胞上的抑制性受体是癌症中免疫逃逸的关键调节剂。在这些之中的是已知免疫检查点，如CTLA4、PD-1以及LAG-3。一个单个免疫检查点的封闭经常导致肿瘤的增强的效应T细胞浸润，但还可能导致其他未封闭的阴性受体在这些T细胞中的补偿上调。然而，一个以上抑制途径的封闭允许T细胞进行更有效的肿瘤应答，并且增加效应T细胞(Teff)与调节性T细胞(Treg)的比率。确切地说，这类抑制性受体的双重封闭已经显示在动物肿瘤模型中发挥协同治疗作用(科伦等人，2010美国科学院院报107:4275-4280；吴(Woo)等人2011癌症研究72:917-927)。基于这些发现结果，正在具有转移性黑色素瘤的患者中在临床试验中对抗-CTLA-4封闭性抗体与抗-PD-1封闭性抗体的组合进行测试。
在C57Bl/6背景中在同系癌症MC38模型中对针对C1ORF32的封闭性抗体与针对PD-1的封闭性抗体的组合进行了测试(如描述于吴等人2011癌症研究72:917-927中)。简言之，将MC38细胞(2×106)皮下植入C57Bl/6小鼠。将具有可触知的肿瘤的小鼠以10mg/kg抗-C1ORF32mAb和/或抗-PD-1mAb(4H2)的剂量进行腹膜内注射。将同种型对照Ab以20mg/kg给药或以10mg/kg添加至单独的抗-PD-1或抗-C1ORF32抗体治疗中。用电子测径器测量肿瘤的体积并且计算对肿瘤生长的作用。表现为肿瘤生长的抑制的治疗作用在组合针对两个靶标(PD-1或C1ORF32)的封闭性抗体时增强。在肿瘤引流淋巴结和非引流淋巴结中测定效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率和Teff与Treg的比率。
实例19：针对C1ORF32蛋白的封闭性抗体与使用环磷酰胺的节律式疗法的组合的抗肿瘤作用
由于环磷酰胺的直接细胞毒性作用和它针对旺盛分裂细胞的抑制活性，它已被用作针对某些实体肿瘤和淋巴瘤的标准烷化化学治疗剂。虽然高剂量的环磷酰胺可能导致免疫细胞的消减，但低剂量已显示增强免疫应答并且诱导抗肿瘤免疫介导的作用，这主要通过减少免疫抑制Treg细胞的数目和功能(布罗德(Brode)和库克(Cooke)2008重症免疫学评论(Crit.Rev.Immunol.)28:109-126)。使用除环磷酰胺之外的经典化学疗法的节律式疗法也已经显示具有免疫刺激作用，包括吉西他滨；基于铂的化合物，如奥沙利铂、顺铂以及卡铂；蒽环类，如阿霉素；紫杉烷，如紫杉醇和多西他赛；微管抑制剂，如长春新碱。
环磷酰胺与其他免疫疗法(如抗-4-1BB活化Ab或抗-PD1封闭性Ab)的组合疗法产生协同抗癌作用(金姆(Kim)等人.2009分子癌症治疗学8:469-478；Mkrtichyan等人.2011欧洲免疫学杂志41:2977-2986)。
在C57BL/6背景中在同系B16黑色素瘤模型中对抗-C1ORF32封闭性mAb与环磷酰胺的组合进行了测试(如描述于金姆等人.2009分子癌症治疗学8:469-478中)。简言之，将C57BL/6小鼠以4×105B16-F10黑色素瘤细胞进行皮下注射。在肿瘤移植当天给予环磷酰胺(150mg/kg)的单次腹膜内注射，并且在肿瘤移植当天开始、相隔5天给予100μg的针对C1ORF32的中和抗体的五次注射。为了检查组合疗法对建立的肿瘤的抗肿瘤作用，在肿瘤细胞注射之后第5天抑或第10天开始给予组合疗法。用电子测径器测量肿瘤的体积并且计算对肿瘤生长的作用。表现为肿瘤生长的抑制的治疗作用在组合环磷酰胺与针对C1ORF32的封闭性抗体时增强。在肿瘤引流淋巴结和非引流淋巴结中测定效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率和Teff与Treg的比率。
实例20：针对C1ORF32蛋白的封闭性抗体与细胞肿瘤疫苗的组合的抗肿瘤作用
作为增强抗肿瘤应答的试剂，治疗性癌症疫苗能够改进T细胞的引发并且改进抗原呈递。在这些之中的是细胞肿瘤疫苗，这些疫苗使用全细胞或细胞溶解产物作为抗原的来源或作为递送抗原的平台。基于树突状细胞(DC)的疫苗集中于离体抗原递送至DC。其他治疗性癌症疫苗由进行遗传修饰以分泌免疫刺激细胞因子或生长因子(如GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或Flt3-配体))的肿瘤细胞组成，目的在于在免疫刺激背景中将肿瘤抗原体内递送至内源性DC。
一些体内研究已经显示了免疫检查点封闭(如抗-CTLA-4抗体)仅在与GM-CSF或Flt3-配体转导的肿瘤疫苗(分别称为Gvax和Fvax)组合时在免疫原性较差的肿瘤中的有效治疗作用(万埃尔莎(van Elsas)等人1999实验医学杂志190:355-366；科伦和艾利森(Allison)2009癌症研究69:7747-7755)，并且单独抗体仅在小鼠中在最具免疫原性的肿瘤模型中有效。此外，两种免疫治疗剂(如抗-CTLA4封闭性抗体和抗-PD-1封闭性抗体)的组合与治疗性癌症疫苗(如Gvax和Fvax)结合更有效(科伦等人2010美国科学院院报107:4275-4280)。
在存在或不存在抗-PD-1封闭性抗体的情况下，使用被工程化以分泌GMCSF或Flt3-配体(分别是Gvax和Fvax)的辐射处理的黑色素瘤细胞，对C1ORF32中和抗体与肿瘤细胞疫苗的组合的作用进行测试(如描述于科伦等人2010美国科学院院报107:4275-4280中)。简言之，将小鼠在第0天用5×104个B16-BL6细胞在侧腹中进行皮内(i.d.)注射，并且在第3天、第6天以及第9天在对侧侧腹上用106个辐射处理的(150Gy)基因修饰的B16细胞(表达GMCSF或Flt3-配体)与腹膜内给予的100ug抗-C1ORF32封闭性抗体相组合进行治疗，该治疗是在有或没有100ug的抗PD-1封闭性抗体(克隆RMP1-14)或抗-PDL-1封闭性抗体(9G2)的情况下进行。同种型Ig用作阴性对照。用电子测径器测量肿瘤的体积并且计算对肿瘤生长的作用。表现为肿瘤生长的抑制的治疗作用在组合针对C1ORF32的封闭性抗体与基因修饰的肿瘤细胞疫苗时增强。抗-PD-1封闭性抗体或抗-PDL-1封闭性抗体进一步增强这种作用。在肿瘤引流淋巴结和非引流淋巴结中测定效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率和Teff与Treg的比率。
实例21：针对C1ORF32蛋白的封闭性抗体与放射疗法的组合的抗肿瘤作用
由于放射疗法的强效的抗增殖和死亡诱导能力，它长期以来一直被用作抗癌疗法。然而，最近的临床前和临床数据指示，免疫原性细胞死亡也可以是电离辐射的重要后果，并且局部放射疗法能够引起和/或调节抗肿瘤免疫应答(瑞特兹(Reits)等人2006实验医学杂志203:1259-1271)。临床前研究已经显示在存在或不存在另外的免疫疗法(如活化抗4-1BBAb)的情况下，放射疗法与免疫疗法(包括免疫检查点(如CTLA4和PD-1)的封闭抗体)的组合治疗的增强的治疗作用(德马里亚(Demaria)等人2005临床癌症研究(Clin.Can.Res.)11:728-734；Verbruge等人2012癌症研究72:3163-3174)。
将在BALB/c背景下使用同系4T1乳腺癌细胞系来对封闭性抗-C1ORF32抗体与放射疗法的组合进行评估(如描述于德马里亚等人2005临床癌症研究11:728-734中)。简言之，将5×104个4T1细胞皮下注射在BALB/c小鼠的侧腹中。治疗在肿瘤达到5mm的平均直径(体积65mm3)时开始。动物组包括单独用每种方式(抗-C1ORF32或放射疗法)和用同种型Ig对照、以及抗-C1ORF32与放射疗法的组合、或Ig对照与放射疗法的组合进行治疗。将放射疗法通过12Gy的一或两个部分(间隔48小时)递送至原发性肿瘤。在放射疗法之后第1天、第4天以及第7天以200ug腹膜内给予抗-C1ORF32Ab或Ig对照。在另一组实验中，封闭抗-PD-1mAb(RMP1-14)并且活化抗anti-4-1BB mAb(3E1)。用电子测径器测量肿瘤的体积并且计算对肿瘤生长的作用。表现为肿瘤生长的抑制的治疗作用在组合针对C1ORF32的封闭性抗体与放射疗法时增强。抗-PD-1封闭性抗体或抗-4-1BB活化Ab进一步增强这种作用。在肿瘤引流淋巴结和非引流淋巴结中测定效应T细胞＝Teff(CD8+IFNg+)细胞的频率和Teff与Treg的比率。
已经对本发明进行了描述并且提供了涉及用于在治疗和诊断癌症中使用的所希望的抗-C1ORF32抗体的制造和选择的实施例。现在通过下面的权利要求书对本发明进行进一步描述。任选地，在此所描述的任何以上实施例或子实施例可以进行组合以形成任何适合的组合或子组合。
PCT/RO/134表

Claims (67)

1.一种适于治疗癌症的单克隆或多克隆抗体或其一种抗原结合片段，它们包含与以下各物特异性地结合的一个抗原结合位点：具有SEQ ID NO:1、7、9-11、13-15、17、103中的任一种的序列的C1ORF32多肽中的任一种、和/或其片段、和/或表位，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤。
2.一种单克隆或多克隆抗体或其一种抗原结合片段，包含与SEQ ID NO:2、3、5、6中的任一种特异性地结合的一个抗原结合位点。
3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，该抗体或抗原结合片段具有包含以下的氨基酸序列：
以下中的至少一个：轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:84、以及SEQ IDNO:100的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:69、SEQ ID NO:85、以及SEQ ID NO:101的序列，或CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:86、以及SEQ ID NO:102的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；或
以下中的至少一个：重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:78、以及SEQ IDNO:94的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:79、以及SEQ ID NO:95的序列，或CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:80、以及SEQ IDNO:96的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:84、以及SEQ ID NO:100的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:85、以及SEQ ID NO:101的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:86、以及SEQ IDNO:102的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列；以及
至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含选自SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:78、以及SEQ ID NO:94的序列，CDR2区，该CDR2区包含选自SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:79、以及SEQ ID NO:95的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含选自SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:80、以及SEQ IDNO:96的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少95％同源性的序列。
5.根据权利要求4所述的单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:52中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:53中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:54中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；以及
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:62中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:63中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:64中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列，或
3)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:68中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:69中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:70中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；以及
4)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:46中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:47中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:48中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列，或
5)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:84中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:85中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:86中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；以及
6)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:78中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:79中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:80中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列，或
7)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:100中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:101中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:102中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列；以及
8)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区包含在SEQ ID NO:94中列出的序列，CDR2区，该CDR2区包含在SEQ IDNO:95中列出的序列，以及CDR3区，该CDR3区包含在SEQ ID NO:96中列出的序列，或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列。
6.根据权利要求3所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有选自SEQ IDNO:40、56、72、88中的任一种的重链的氨基酸序列、和/或选自SEQ ID NO:42、58、74、90中的任一种的轻链的氨基酸序列、或与其具有至少95％同源性的序列、或与其具有至少90％同源性的序列。
7.根据权利要求6所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有在SEQ ID NO:40中列出的重链的氨基酸序列、在SEQ ID NO:42中列出的轻链的氨基酸序列中的至少一种或两者。
8.根据权利要求6所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有在SEQ ID NO:56中列出的重链的氨基酸序列、在SEQ ID NO:58中列出的轻链的氨基酸序列中的至少一种或两者。
9.根据权利要求6所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有在SEQ ID NO:72中列出的重链的氨基酸序列、在SEQ ID NO:74中列出的轻链的氨基酸序列中的至少一种或两者。
10.根据权利要求6所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有在SEQ ID NO:88中列出的重链的氨基酸序列、在SEQ ID NO:90中列出的轻链的氨基酸序列中的至少一种或两者。
11.一种多核苷酸，该多核苷酸具有编码任何这些以上抗体的氨基酸序列的一个核酸序列。
12.一种具有由核酸序列编码的氨基酸序列的单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:81、以及SEQ ID NO:97，CDR2区，该CDR2区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:82、以及SEQ ID NO:98，以及CDR3区，该CDR3区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:83、以及SEQ ID NO:99，或其一种退化变体；以及
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:75、以及SEQ ID NO:91，CDR2区，该CDR2区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:76、以及SEQ ID NO:92，以及CDR3区，该CDR3区由选自以下的核酸序列编码：SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:77、以及SEQ ID NO:93，或其一种退化变体。
13.一种具有由核酸序列编码的氨基酸序列的单克隆抗体，该单克隆抗体包含：
1)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:49中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:50中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:51中列出的核酸序列编码；以及
2)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:43中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:44中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:45中列出的核酸序列编码，或
3)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:65中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:66中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:67中列出的核酸序列编码；以及
4)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:59中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:60中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:61中列出的核酸序列编码，或
5)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:81中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:82中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:83中列出的核酸序列编码；以及
6)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:75中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:76中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:77中列出的核酸序列编码，或
7)至少一个轻链可变区，该轻链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:97中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:98中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:99中列出的核酸序列编码；以及
8)至少一个重链可变区，该重链可变区包含CDR1区，该CDR1区由在SEQ ID NO:91中列出的核酸序列编码；CDR2区，该CDR2区由在SEQID NO:92中列出的核酸序列编码；以及CDR3区，该CDR3区由在SEQ IDNO:93中列出的核酸序列编码。
14.根据权利要求13所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有由选自以下的核酸序列编码的重链的氨基酸序列：SEQ ID NO:39、55、71、87中的任一种，和由选自以下的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列：SEQ ID NO:41、57、73、89中的任一种，或其一种退化变体。
15.根据权利要求13所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有由在SEQ IDNO:39中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列、和由在SEQ ID NO:41中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
16.根据权利要求13所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有由在SEQ IDNO:55中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列、和由在SEQ ID NO:57中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
17.根据权利要求13所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有由在SEQ IDNO:71中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列、和由在SEQ ID NO:73中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
18.根据权利要求13所述的单克隆抗体，该单克隆抗体具有由在SEQ IDNO:87中列出的核酸序列编码的重链的氨基酸序列、和由在SEQ ID NO:89中列出的核酸序列编码的轻链的氨基酸序列。
19.根据以上权利要求中任一项所述的抗体，该抗体包含选自下组的一个氨基酸序列，该组由以下各项组成：(a)如在此所列举的序列；(b)除了重链CDR3中在位置100A(卡巴特编号系统)处的丝氨酸残基之外，与在(a)中指定的那些氨基酸序列的不同之处在于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个保守性氨基酸取代的序列；(c)与在(a)或(b)中指定的这些序列具有85％或更大、90％或更大、95％或更大、98％或更大、或99％或更大序列一致性的氨基酸序列；(d)具有由一个多核苷酸编码的氨基酸序列的一种多肽，该多核苷酸具有编码如在此所列举的这些氨基酸的一个核酸序列。
20.一种载体，该载体包含具有根据以上权利要求中任一项所述的序列的一种多核苷酸。
21.一种杂交瘤，该杂交瘤包含如权利要求20所述的载体。
22.一种抗体，该抗体由如权利要求21所述的杂交瘤分泌。
23.根据以上权利要求中任一项所述的抗体，该抗体由5166-2和/或5166-9杂交瘤分泌，这些杂交瘤根据布达佩斯条约(Budapest Treaty)的规定保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)专利保藏处，10801大学大道(University Boulevard)，马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州(Virginia)20110-2209U.S.A.，由ATCC接收部门于2013年1月18日接收，分别具有临时登录号：5166-2PTA-13472和/或5166-9PTA-13473。
24.一种5166-2和/或5166-9杂交瘤，该杂交瘤根据布达佩斯条约的规定保藏在美国典型培养物保藏所(ATCC)专利保藏处，10801大学大道，马纳萨斯，弗吉尼亚州20110-2209U.S.A.，由ATCC接收部门于2013年1月18日接收，分别具有临时登录号：5166-2PTA-13472和/或5166-9PTA-13473。
25.一种抗体，该抗体由如权利要求24所述的任何杂交瘤产生。
26.如以上权利要求所述的抗体或抗原结合片段，其中该癌症在癌细胞上或在浸润集聚为肿瘤的癌细胞的免疫细胞中表达一种或多种C1ORF32多肽。
27.如权利要求26所述的抗体或抗原结合片段，其中所述一种或多种C1ORF32多肽包含以下各物：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的一种或多种、和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位。
28.根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体是一种全人抗体、嵌合抗体、人源化或灵长类化抗体。
29.根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体选自下组，该组由以下各项组成：Fab、Fab'、F(ab')2、F(ab')、F(ab)、Fv或scFv片段和最小识别单元。
30.根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中该抗体被偶联至一个选自以下的部分：一种药物、放射性核素、荧光团、酶、毒素、治疗剂、或化学治疗剂；并且其中该可检测的标志物是一种放射性同位素、金属螫合剂、酶、荧光化合物、生物发光化合物或化学发光化合物。
31.一种药用组合物，该药用组合物包含根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
32.根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗体结合片段、或根据权利要求31所述的药用组合物用于治疗癌症的用途，其中该癌症表现出在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：包含在SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中的C1ORF32多肽、和/或选自下组的其相对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位，并且其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤。
33.一种用于治疗癌症的方法，其中该癌症在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：包含SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103的C1ORF32多肽、和/或选自下组的其相应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位，并且其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤，该方法包括向有需要的受试者给予有效量的根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗体结合片段中的任一种或根据权利要求28所述的药用组合物。
34.如权利要求33所述的方法，其中将该治疗与有用于治疗癌症的另一个部分或疗法进行组合。
35.如权利要求34所述的方法，其中该疗法是放射疗法、抗体疗法、化学疗法、光动力学疗法、过继性T细胞疗法、Treg消减、手术或与常规药物的组合疗法。
36.如权利要求34所述的方法，其中该部分选自下组，该组由以下各项组成：免疫抑制剂、细胞毒性药物、肿瘤疫苗、抗体、肽、百普素体(pepti-bodies)、小分子、化学治疗剂、细胞毒性剂和细胞生长抑制剂、免疫学修饰剂、干扰素、白细胞介素、免疫刺激生长激素、细胞因子、维生素、矿物质、芳香酶抑制剂、RNAi、组蛋白脱酰酶抑制剂、以及蛋白酶体抑制剂。
37.如权利要求36所述的方法，其中该部分选自下组，该组由以下各项组成：贝伐单抗、爱必妥、紫杉醇、顺铂、长春瑞宾、多西他赛、吉西他滨、替莫唑胺、伊立替康、5FU、卡铂、以及叶酸。
38.根据以上权利要求中任一项所述的抗体或抗体结合片段用于诊断癌症的用途，其中该癌症表现出在癌细胞上或在浸润肿瘤的免疫细胞中表达以下各物：包含SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103的C1ORF32多肽、和/或选自下组的其相对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位，并且其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤。
39.一种用于诊断受试者中的癌症的方法，其中该癌症选自下组，该组由以下各项组成：甲状腺癌、食道癌、乳腺侵袭性导管癌、乳腺粉刺癌、2级乳腺髓样癌、选自下组的卵巢癌，该组由以下各项组成：浆液性和粘液性癌、颗粒细胞肿瘤、表面上皮-间质肿瘤(腺癌)、囊腺癌以及子宫内膜样肿瘤；选自下组的肾癌，该组由以下各项组成：透明细胞癌、嫌色细胞腺瘤、以及肉瘤样癌；具有5或更高格里森得分的前列腺腺癌、I期至III期前列腺腺癌、良性前列腺增生、II期和III期肝细胞癌、恶性肝细胞瘤、纤维板层肝细胞癌、假腺样(腺样)肝细胞癌、多形性(巨细胞)肝细胞癌、透明细胞HCC、胆管癌，选自以下的胰腺癌：导管和粘液性腺癌、胰岛细胞癌、家族性非典型性多发性痣黑色素瘤-胰腺癌综合征(FAMMM-PC)、外分泌胰腺癌、导管腺癌、腺鳞癌、印戒细胞癌、肝样癌、胶样癌、未分化癌、以及伴有破骨细胞样巨细胞的未分化癌、低至中等级别神经内分泌癌、以及胰腺类癌肿瘤，IV期恶性黑色素瘤、恶性雀斑样痣黑色素瘤、浅表扩散性黑色素瘤、肢端雀斑样痣黑色素瘤、粘膜黑色素瘤、结节性黑色素瘤、息肉状黑色素瘤、促纤维增生性黑色素瘤、无黑色素性黑色素瘤、软组织黑色素瘤、成骨肉瘤、软骨肉瘤、平滑肌肉瘤、血管肉瘤、阿斯金氏肿瘤、尤因氏肉瘤、卡波济氏肉瘤、脂肪肉瘤、恶性纤维组织细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经纤维肉瘤、霍奇金氏淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、T细胞淋巴瘤、子宫内膜样腺癌、膀胱移行细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、大细胞肺癌、睾丸精原细胞瘤、中度至不良分化的结肠直肠腺癌、以及脊髓肿瘤，该方法包括在该受试者中或在从所述受试者获得的一个样品中检测以下各物：SEQ ID NO:1、7、9、13、17、103中所包含的C1ORF32多肽中的任一种、和/或选自下组的其相对应的细胞外结构域，该组由以下各项组成：SEQ ID NO:10、14、11、15中的任一种，和/或其片段、和/或表位。
40.根据权利要求39所述的方法，其中在体内或体外进行检测该多肽。
41.根据权利要求40所述的方法，其中该检测是通过免疫测定进行的。
42.根据权利要求40所述的方法，其中使用根据以上权利要求中任一项所述的抗体或片段来进行该检测。
43.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述甲状腺癌选自以下中的一种或多种：甲状腺乳头状癌、甲状腺滤泡状癌(优选地II期和III期)、偶发性乳头状癌(IPC)、甲状腺髓样癌、间变性甲状腺癌。
44.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述食道癌是一种食道鳞状细胞癌。
45.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述侵袭性导管癌选自II期至IV期和/或不良分化的侵袭性导管癌，和/或其中所述髓样癌是2级髓样癌。
46.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述浆液性和粘液性卵巢癌选自Ic期至IIIb期浆液性和粘液性卵巢癌。
47.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述肾透明细胞癌选自I期至II期肾透明细胞癌。
48.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述肝细胞癌选自II期和III期肝细胞癌。
49.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述霍奇金氏淋巴瘤选自结节硬化型、混合细胞亚型、富含淋巴细胞或淋巴细胞优势型、淋巴细胞消减型、以及未指定型。
50.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述B细胞淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、粘膜相关的淋巴组织淋巴瘤(MALT)、小细胞淋巴细胞性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、纵膈大B细胞淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、结节性边缘区B细胞淋巴瘤(NMZL)、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病。
51.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述T细胞淋巴瘤选自下组，该组由以下各项组成：结外T细胞淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤：塞扎莱综合征和蕈样真菌病，间变性大细胞淋巴瘤、以及血管免疫母细胞T细胞淋巴瘤。
52.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述子宫内膜样腺癌选自I期至IIIc期子宫内膜样腺癌。
53.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述膀胱移行细胞癌选自II期至IV期移行细胞癌。
54.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述小细胞肺癌选自I期至IIIb期小细胞肺癌，和/或其中所述非小细胞肺癌选自不良至中度分化的鳞状癌和腺癌。
55.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述抗体或片段抑制由C1ORF32引出的活性。
56.如权利要求55所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述抗体或片段调节B7相关的共刺激、增加T细胞活化、减轻T细胞抑制、增加细胞因子分泌、增加IL-2分泌；增加由T细胞产生的干扰素-γ、增加Th1应答、减少Th2应答、促进癌症表位铺展、降低T细胞活化的抑制、增加哺乳动物中的T细胞应答、刺激抗原特异性记忆应答、引出癌细胞的细胞凋亡或裂解、刺激对癌细胞的细胞毒性或细胞生长抑制作用、诱导癌细胞的直接杀死、诱导补体依赖性细胞毒性和/或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性、和/或具有CDC活性。
57.如权利要求56所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述抗体或片段增加针对癌症的免疫应答。
58.如权利要求56所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述抗体或片段降低调节性T淋巴细胞(T-reg)的活性。
59.如权利要求56所述的抗体、方法、组合物或用途，其中所述抗体或片段抑制iTreg分化，
60.如以上权利要求中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，与一种或多种增效剂组合同时或顺序地向受试者给予以获得一种治疗作用，其中所述一种或多种增效剂选自下组，该组由以下各项组成：放射疗法、增强抗肿瘤免疫应答的常规/经典化学疗法、增强抗肿瘤免疫应答的靶向疗法、靶向Treg和/或MDSC的治疗剂、免疫刺激抗体、治疗性癌症疫苗、过继性细胞转移。
61.如权利要求60中任一项所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该常规/经典化学治疗剂选自吉西他滨、奥沙利铂、顺铂、卡铂、基于铂的化合物、环磷酰胺、蒽环类、阿霉素、柔红霉素、紫杉烷类、紫杉醇、多西他赛、微管抑制剂、长春新碱、叶酸拮抗剂、甲氨蝶呤、mTOR途径抑制剂、坦罗莫司和雷帕霉素、奥沙利铂、环磷酰胺、阿霉素、以及米托恩醌。
62.如权利要求60所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该靶向疗法试剂选自组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂、伏立诺他、丁酸钠以及MS-275、硼替佐米、威罗菲尼、JAK2抑制剂、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)、以及治疗性单克隆抗体。
63.如权利要求62所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该靶向疗法试剂选自埃罗替尼、伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼、抗EGFR mAb西妥昔单抗、anatimumab、以及曲妥珠单抗。
64.如权利要求60所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该靶向免疫抑制细胞Treg和/或MDSC的治疗剂选自抗有丝分裂药物、环磷酰胺、吉西他滨、米托恩醌、氟达拉滨、沙立度胺、沙立度胺衍生物、COX-2抑制剂、通过识别Treg细胞表面受体直接靶向Treg的消减性抗体或杀伤性抗体、抗-CD25达利珠单抗、巴利昔单抗、配体导向的毒素、地尼白介素-毒素连接物(Ontak)：人IL-2和白喉毒素的一种融合蛋白、或LMB-2：针对CD25的scFv与假单胞菌外毒素之间的一种融合体、靶向Treg细胞表面受体的抗体、TLR调节剂、干扰腺苷能途径的试剂、外核苷酸酶抑制剂、或A2A腺苷受体的抑制剂、TGF-β抑制剂、趋化因子受体抑制剂、视黄酸、全反式视黄酸(ATRA)、维生素D3、磷酸二酯酶5抑制剂、西地那非、ROS抑制剂、以及硝基阿司匹林。
65.如权利要求60所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该免疫刺激抗体选自靶向以下各项中的一种或多种的拮抗性抗体：CTLA4、伊匹单抗、PD-1、BMS-936558、MDX-1106、PDL-1、BMS-936559/MDX-1105、LAG-3、IMP-321、TIM-3或BTLA和/或靶向以下各项中的一种或多种的激动性抗体：CD40、CP-870、893、CD137、BMS-663513、OX40、抗-OX40、GITR或TRX518。
66.如权利要求60所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该治疗性癌症疫苗选自外源性癌症疫苗，包括用于发动针对一种肿瘤抗原的免疫原性应答的蛋白质或肽、编码肿瘤抗原的重组病毒以及细菌载体、编码肿瘤抗原的基于DNA的疫苗、靶向树突状细胞的蛋白质、树突状细胞、表达GM-CSF和/或Flt-3配体的基因修饰的肿瘤细胞。
67.如权利要求60所述的抗体、方法、组合物或用途，其中该治疗性癌症疫苗包括基于树突状细胞的疫苗。
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