CN101501070B - 抗原性gm-csf肽和针对gm-csf的抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供分泌人单克隆抗体的杂交瘤系，所述单克隆抗体具有高度结合特异性和生物活性，尤其是抗粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的中和活性，以及制备杂交瘤株的方法。还提供了靶抗原和表位。该抗体可用于治疗方法，例如在癌症、感染性疾病或者自身免疫病的治疗中。

Description

抗原性GM-CSF肽和针对GM-CSF的抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求享有2006年2月8日提交的美国临时专利申请60/771,251和2006年2月17日提交的60/774,500的权益，每一篇的内容在此完整引入作为参考。 
发明领域
本发明总体涉及免疫治疗领域。更具体地，本发明涉及用于产生单克隆抗体的抗原，以及能够中和自身免疫和癌细胞并且可以中和炎性应答的单克隆抗体。 
发明背景
在整个说明书中引用了不同的出版物，包括专利、公布的申请、技术文献和学术论文。这些被引用出版物中的每一个均在此完整引入作为参考并且通用。 
因为其独特的药理学和安全模式，目前利用治疗性单克隆抗体(MAb)针对数种与疾病相关的抗原。与疾病相关的靶抗原是CD20，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，表皮生长因子受体(EGFR)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。 
最初发现粒细胞巨噬细胞-集落刺激因子(GM-CSF)是一种蛋白，具有从小鼠骨髓的前身细胞中产生粒细胞和巨噬细胞集落的能力，并因此得名(Burgess等人(1980)Blood 56：947-58.)。后续研究已经证实GM-CSF在增强成熟巨噬细胞和粒细胞的功能中的作用(Handman和Burgess(1979)J.Immunol.122：1134-1137；Hamilton等人(1980)J.Cell Physiol.103：435-445；Gamble等人(1985)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 82：8667-8671)，表明GM-CSF在炎性应答中的作用(Hamilton等人(1980)J.Cell Physiol.103：435-445)。随着对该分子的研究，已经清楚GM-CSF具有其他功能，来源于其影响更成熟的骨髓细胞例如粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞的性质的能力。GM-CSF的功能通过结合CD116来介导，所述CD116是粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体，亦称为集落刺激因子2受体α，与GM-CSF以低亲和力结合。β亚基，称为CD131，也是与IL3和IL5受体共用的，其自身对GM-CSF没有可检测的结合活性，但当与α亚基结合时是高亲和力结合必需的，并在信号转导中起着根本的作用。GM-CSF受体可见于骨髓祖细胞和成熟骨髓细胞，包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核吞噬细胞和单核细胞。此外，已经证明GM-CSF受体亚基存在于正常的非造血组织中，例如人胎盘、内皮和中枢神经系统的少突胶质细胞。 
在从骨髓内的早期骨髓祖细胞产生粒细胞和巨噬细胞中，GM-CSF起着主要的生物学作用。开始没有认识到但后来被发现的是GM-CSF在宿主对外界刺激的应答以及在炎性和自身免疫病症中的其他生理功能。在非常早期的研究中，脂多糖(LPS)注射小鼠后，从肺组织-条件培养基纯化了GM-CSF(Burgess等人(1977)J.Biol.Chem.252：1998-2003)。许多研究者认为，GM-CSF是正常生理条件下粒细胞、巨噬细胞和嗜酸性粒细胞系细胞数目和活性状态的主要调节剂之一。但是，还有假说认为GM-CSF的异常表达可能导致与病理结果有关的免疫和炎性应答的改变。数年前已有建议，应把GM-CSF看成一种促炎性细胞因子(Hamilton等人，1980，J.Cell Physiol.103：435-445)。此外，GM-CSF可能在许多人类炎性病理体质中起作用，例如类风湿性关节炎，自身免疫病理，炎性肾病和炎性肺病例如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)。有趣的是，已经提出多发性硬化和GM-CSF之间存在关联(McQualter等人(2001)J.Exp.Med.，194：873-881)。在自身免疫脑脊髓炎的实验模型，即用于多发性硬化的模型中，发现GM-CSF涉及自身免疫-介导的脱髓鞘。 
单核细胞、巨噬细胞和中性粒细胞用GM-CSF处理后的体内试验证明，GM-CSF能够活化这些细胞类型并延长它们的存活特性。此外，接触GM-CSF引起这些细胞类型中炎性介质的释放，进一步的研究证明这些细胞具有杀伤某些生物体甚至是肿瘤细胞的能力(Hamilton(1993)Immunol.Today 14：18-24；Hamilton，(1993)Lancet342：536-539；Takahashi，(1993)Blood 81：357-364)。为了确认体内试验是否预示GM-CSF在体内的功能，对啮齿类动物进行全身给药。显示出通过腹膜内给药蛋白来人为增加GM-CSF的循环水平确实导致循环中性粒细胞和循环腹膜巨噬细胞的数量增加，并且在啮齿类动物的腹膜腔中存在CD5+巨噬细胞发育和分化的增加(Metcalf等人，(1987)Exp.Hematol.15：1-9)。 
还显示GM-CSF能够“激发”细胞以更强烈、协同的方式应答第二种刺激，例如LPS或者干扰素-γ(Hart等人，1988，J.Immunol.141：1516-1521)。可以在体外以及体内用GM-CSF激发小鼠，使得它们在LPS或者TNF-α的后续攻击后，产生循环促炎性细胞因子的水平增加。 
在临床背景下，给腹膜透析患者施用GM-CSF引起巨噬细胞的显著募集(Selgas等人，1996，Kidney Int.50：2070-2078)。有趣的是，并且从啮齿类动物的研究可以预测，在临床条件给药GM-CSF可能导致炎性细胞因子生成的增强和潜在有害的副作用。例如，当类风湿性关节炎患者用GM-CSF治疗以矫正与费尔蒂氏(Felty’s)综合征相关的的中性白细胞减少时，他们的关节炎加剧(Hazenberg等人，1991，Blood 74：2769-2770)。在另一种临床背景下，癌症化疗之后，GM-CSF治疗使类风湿性关节炎恶化(de Vries等人，(1991)J.Immunol.163：4985-4993)。对人供体的GM-CSF全身给药增强了分离的粒细胞产生过氧化物的能力，并增强循环单核细胞的细胞毒性以及导致单核细胞额数量增加(Perkins等人，1993，Am J.Hematol.43：279-285)。GM-CSF的异常表达还与人的肺病相关。例如，看起来少量刺激物、内毒素或者感染导致肺中GM-CSF的上调使易受TH2免疫偏离和哮喘的影响 (Eisenbarth等人(2002)J.Exp.Med.196：1645-1651)。上面概述的研究表明，GM-CSF通过细胞募集、增加细胞存活和/或激发活化在炎性过程的活化中起作用。 
数个关联性和实验性数据表明GM-CSF在哮喘中的作用。小鼠哮喘模型中，证明使用中和抗体抑制哮喘表型的能力(Yamashita(2002)Cell Immunol.219：92)，而数个测量哮喘患者BAL液体中细胞因子的研究发现GM-CSF增加(Gajewska(2003)Curr Drug TargetsInflamm Allergy 2：279)。 
类风湿性关节炎(RA)是一种慢性炎性自身免疫病，已有GM-CSF可能涉及该疾病的充分证据。已经发现RA损伤中GM-CSF的水平升高(Xu等人(1989)J.Clin.Invest.83：876)，并且由炎性细胞因子例如IL-1和TNF-α刺激后的固有关节细胞(软骨细胞和滑膜成纤维细胞)在体外产生(Leizer等人(1990)Blood 76：1989)。胶原-诱导的小鼠关节炎(CIA)是RA的自身免疫模型，这取决于对II型胶原(CII)的体液和细胞免疫应答(Seki等人(1988)J.Immunol.140，1477)。历史上这种RA表型限于载有H-2q或者H-2r单倍型的小鼠品系，通常在DBA/1小鼠中进行(Wooley(1988)Methods Enzymol.162：361)。在转基因小鼠中进行了一系列研究，所述转基因小鼠是小鼠GM-CSF基因座纯合无效的(Stanley等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：5592)。有趣的是，与其野生型同窝对照相比，GM-CSF缺陷小鼠对胶原-诱导的关节炎的诱导有抗性(Campbell等人(1998)J.Immunol.161：3639-3644)。 
更感兴趣的是GM-CSF无效小鼠具有受损的表面活性物质清除率，这导致小鼠肺泡蛋白沉积症(PAP)，其近似模拟了此处描述的人类病症。此外，PAP表型可以通过GM-CSF基因的肺-特异性递送、(Zsengaller等人(1998)Hum.Gene Ther.9：2101-2109)，GM-CS气雾吸入或用于造血重建的骨髓移植(Reed等人(1999)Am.J.Physiol.276：L556-L563；Nishinakamura等人(1996)J.Exp.Med.183：2657-2662) 进行矫正。 
成年人肺泡蛋白沉积症(PAP)是一种罕见的疾病，特征为磷脂和表面活性蛋白在肺泡中的积聚。猜想是PAP源于肺泡巨噬细胞和II型上皮细胞无法清除过量的表面活性物质(Mazzone等人(2001)Clev.Clin.J.Med.68：977-992)。PAP诊断通常需要开胸肺活检，该疾病的标准疗法是通过全肺灌洗物理去除积聚的表面活性物质(Shah等人(2000)Thorax 55：67-77)。此外，已经表明，PAP患者具有针对GM-CSF的循环中和抗体，因此提示该细胞因子是该疾病的原因。还不清楚这种自身免疫反应是否对GM-CSF是特异的。但是，已经显示，PAP患者的一个亚群用GM-CSF疗法得到好转，这支持以下假设，即通过基因破坏或者抗体介导的中和造成的GM-CSF缺失导致PAP的发病。 
还有证据支持GM-CSF在癌症中的作用。例如，GM-CSF在白血病的发生和进展中起作用，例如幼年型粒单核细胞性白血病(JMML)；Emanuel PD(2004)Curr.Hematol.Rep.3：203-209)。JMML特征为正常造血的破坏，导致骨髓中不成熟骨髓细胞的过度、不当增殖。这些增殖的造血癌细胞可能转移到脾和肝。有趣的是，JMML患者对GM-CSF高度敏感，并表现出类似于过表达GM-CSF的转基因小鼠的病理特征(Lang等人(1987)51：675-86)。此外，已经显示GM-CSF促进JMML细胞的生长和存活(Emanuel等人(1991)Blood 77：925-9)。在JMML转基因小鼠模型中，阻断GM-CSF减轻骨髓、血液和脾中的JMML细胞负担(Iversen等人(1997)Blood，90：4910-7)。 
从敲除GM-CSF的小鼠疾病模型以及人类疾病例如体循环中产生针对GM-CSF的循环抗体的PAP中可以清楚，这种细胞因子是一种重要的病理介质。因此开发一种能够拮抗GM-CSF活性的药物的方法可能是一种有价值的人类疗法，所述方法通过开发针对细胞因子本身的抗体或者通过阻断GM-CSF受体。已经制备出数种针对重组 GM-CSF分子的多克隆和单克隆抗体。例如，Beffy等人((1994)，Hybridoma 13：457-468)在新西兰白兔中制备出重组人GM-CSF的多克隆抗体，在Balb/c小鼠中制备出单克隆抗体。在利用MO7e细胞的体外细胞增殖分析中，这些兔和一些鼠单克隆抗体能够中和GM-CSF的活性。在进一步的研究中，Nice等人(1990，Growth Factors 3，159-169)对一种中和性鼠类抗GM-CSF抗体LMM 102的结合位点进行表位作图。通过产生重组人GM-CSF的一系列消化产品，利用反相HPLC分级分离片段，继之对胰蛋白酶片段的额外S.aureus V8消化以限定包括通过二硫键连接的两个肽的产品，描绘出明确定义的表位。Dempsey等人(1990，Hybridoma 9，545-558)制备出针对人GM-CSF的3种小鼠抗体，其在体外分析系统中中和GM-CSF，EC50在0.1到1.7纳摩范围。这些抗体与鼠GM-CSF或者其他相关的细胞因子不发生反应。所有上述抗体都是用于人血清GM-CSF检测以及抑制GM-CSF信号的体外分析的有效试剂。但是，所有这些抗体几乎没有治疗价值，因为它们来源于鼠或者兔体系的事实。已经尝试从鼠对应物的制备嵌合抗体，通过将鼠抗GM-CSF抗体的可变域亚克隆到人类骨架。该策略产生能够在体外中和GM-CSF并且可用作治疗剂的嵌合抗体(WO 03/068924A2)。 
治疗性抗体的一个重要方面是其引发免疫效应功能的能力，例如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，因为Fc区域的序列差异，已经显示啮齿类动物Mab在人类中介导效应功能弱，因此需要嵌合或者人源化以获得最佳药理性能。此外，如果它们在非人宿主细胞中产生，具有完全人序列的Mab仍不能支持ADCC，因为在非人宿主细胞中产生可能改变MAb的天然糖基化模式(Shinkawa等人.(2003)J.Biol.Chem.278：3466-73)。 
鉴于这些事实，优选通过人B细胞产生治疗性抗体。先前已经报道了制备分泌人MAb的杂交瘤的方法(WO2004/046330)。利用人B细胞产生的治疗性MAb能够发挥人类效应功能，并且因为其天然 的人类结构，免疫原性非常有限。先前已经报道了杂交瘤或者源自人B细胞的Epstein-Barr病毒(EBV)转化的类淋巴母细胞系的制备(Kirman等人(2002)Hybrid Hybridomics 21：405-14；Boerner等人.(1991)J.Immunol.147：86-95；Zafiropoulos等人(1997)J.Immunol.Methods200：181-90)，但是，关于这些抗体和细胞系的长期稳定性、制造方法适宜性和抗体药理学性质方面的特征的信息是有限(van Dijk等人(2001)Curr.Opin.Chem.Biol.5：368-74)。 
因此需要治疗性人抗体，用于治疗与传染性、炎性疾病、自身免疫病症和其他疾病例如癌症相关的炎症。还希望这种抗体引发免疫效应功能，并且在人类患者中是良好耐受的。本发明涉及这些和其他长期需要。 
发明概述
本发明描述了特异结合GM-CSF的分离的人类抗体。该抗体可以包括具有SEQ ID NO：42或者48的重链CDR3。在一些优选的实施方式中，抗体可以包括具有SEQ ID NO：8或者16的重链。在一些优选的实施方式中，抗体可以包括具有SEQ ID NO：12或者18的轻链。在一些实施方式中，抗体具有两条重链。在一些实施方式中，抗体具有两条轻链。抗体是高亲和力抗体，可以具有小于大约1×10-8M的亲和力。优选的，抗体是单克隆抗体，并且更优选是人类单克隆抗体。在高度优选的实施方式中，抗体与包括氨基酸序列SEQ ID NO：3，4，5，35，36，37，38或者39的多肽上的表位特异结合。还提供表达这种抗体的细胞，例如杂交瘤细胞。 
本发明还描述了编码特异结合GM-CSF的抗体的多核苷酸。在一些优选的实施方式中，多核苷酸包括SEQ ID NO：10或者17的重链序列。在一些优选的实施方式中，多核苷酸包括SEQ ID NO：14或者19的轻链序列。还提供包括这种多核苷酸的载体。 
本发明还描述了在需要这种治疗的对象中治疗GM-CSF介导的炎性疾病的方法。该方法包括给对象施用有效量的组合物以治疗GM-CSF介导的炎性疾病，所述组合物包括药学上可接受的载体和至少一种特异结合GM-CSF的抗体。在这些方法的优选方面，抗体可以包括具有SEQ ID NO：42或者48的重链CDR3。在一些优选的实施方式中，抗体可以包括具有SEQ ID NO：8或者16的重链。在一些优选的实施方式中，抗体可以包括具有SEQ ID NO：12或者18的轻链。抗体是高亲和力抗体，可具有小于大约1×10-8M的亲和力。 
附图简述
图1显示用于抗原特异性人MAb筛选的抗原组ELISA。3种GM-CSF特异性人Mab(E5，G7，E10)与人GM-CSF反应，而不与组中的其他抗原反应。抗体215是与GM-CSF(hGM-CSF)和鼠GM-CSF(mGM-CSF)结合的鼠MAb。 
图2A和2B显示人MAb对天然人GM-CSF的高特异性。如图2A所示，可溶性人GM-CSF结合鼠杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞呈递针对人GM-CSF的细胞表面免疫球蛋白(Ig)。随后在反应物中添加MAb E5，并利用FITC偶联的山羊抗人Ig测量其与人GM-CSF的结合。E5不与鼠杂交瘤细胞(中间栏)表达的任意一种表面蛋白结合，而只结合细胞表面Ig(下栏)捕获的可溶性GM-CSF。如图2B所示，藻红蛋白(PE)-标记的人GM-CSF(PE-GM)可以与E10细胞表面表达的Ig反应。过量的未标记GM-CSF(底栏)竞争PE-GM结合。 
图3显示类型-转换的杂交瘤细胞的抗原-结合IgG的分泌。按照材料和方法中的描述处理杂交瘤细胞E5细胞(亲代)。利用基于ELISPOT的筛选方法鉴定具有类型-转换(转换的)的杂交瘤克隆。进行ELISA以评定IgM或者IgG的结合，所述ELISA测量包被在板上的人GM-CSF的特异性结合。转换的IgG MAb显示与亲代IgM相当的与抗原的结合。 
图4显示用完全的人MAb对TF-1细胞系的GM-CSF依赖性生长抑制。人GM-CSF-依赖性人红白血病细胞系TF-1(ATCC，VA) 在包含10ng/mL重组人GM-CSF(PeproTech，NJ)的完全RPMI 1640中生长。在实验前一天，TF-1细胞在无GM-CSF的0.1％FBS中生长。收集饥饿的TF-1细胞，用分析培养基(具有0.5％BSA的普通RPMI)洗涤两次。细胞重悬于分析培养基，并以10,000细胞/孔的浓度种于96孔微孔板。所述孔包含分析培养基、100pg/mL GM-CSF或者GM-CSF，与图中指定浓度的待测或者同种型对照Igs预孵育1小时。3天后，每孔添加40μl细胞滴定试剂(Promega，WI)，板在37℃继续孵育1小时。用分光光度计在490nm测量光密度(O.D.)，从样品中减去培养基背景。如下计算GM-CSF中和百分比：100-[(有Ig的O.D./无Ig的O.D.)×100]。 
图5A显示ELISA结果，表明所有被测的E5-3D2亚克隆均分泌高水平的Ig。杂交瘤细胞E5-3D2系生长60代，然后通过分析生产细胞的频率来评定制备的稳定性。通过有限稀释随机选择源自3D2细胞的亚克隆(X1-X10)，并利用基于ELISA的分析测量其Ig生成。通过目测检查包含细胞的孔，将405nm的吸光度对集落大小标准化。图5B显示在包含1升无血清培养基的搅拌生物反应器中接种3D2细胞后，对数期测得的特定生产率是24pg/细胞/天，以及在第1至5天的Ig生成记录的活细胞数目。 
图6A显示BAT标记物中单核苷酸缺失的实施例的结果，所述BAT标记物发现于用错配修复抑制剂处理的E5杂交瘤细胞中。直方图中穿过中央峰的虚线表示野生型(wt)或者截短(contracted)(-1nt)片段的大小。图6B中，亲代和错配修复-抑制的细胞被种于微板以分别产生3,763和2,437Ig-分泌克隆(O.D.＞0.2)。通过ELISA测定Ig浓度，记录O.D.值大于1的克隆频率，表示为筛选克隆总数的百分比。 
图7提供描述产生完全的人类杂交瘤细胞系的每个步骤的流程示意图。 
图8显示用于抗原特异性人MAb筛选的抗原组ELISA。3种GM-CSF特异性huMAb，E10、G9和E5(未描述)，与人GM-CSF反应而不与组中的其他抗原反应。利用针对不同抗原的特异性mAb优 化有效的抗原包被以获得更大的分析灵敏度。615和215是两种抗人GM-CSF的鼠MAb。 
图9显示MAb E10的同种型测定。为了确定E10的同种型，利用抗人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgM、Lκ和LλFc特异性抗体进行标准分析以得出同种型。 
图10显示利用E10和G9MAb的Western分析。利用E10和G9进行Western印迹分析以确定抗体是否与人重组GM-CSF交叉反应。mAb215是小鼠抗人GM-CSF中和单克隆抗体，作为阳性对照，道：1上样肿瘤细胞裂解产物作为阴性蛋白对照，道：2上样500ng rh GM-CSF(PeProTech，NJ USA)，如图5所示E10和G9与人GM-CSF反应。 
图11显示E10的BIACORE分析。E10.20结合速率常数(ka)＝2.47×104，解离速率常数(kd)＝2.16×10-5，总亲和力(KD)为0.87nM。 
图12显示MAb G9的同种型测定。为确定G9的同种型，利用抗人IgG、IgG1、IgG2、IgG3、IgM、Lκ和Lλ特异性抗体进行标准分析以得出同种型(双份样品，图3)。 
图13显示G9的BIACORE分析。10G9.1结合速率常数(ka)＝8.47×106，解离速率常数(kd)＝9.27×10-5，总亲和力(KD)为0.87nM。 
图14显示G9表位作图的策略。重叠肽用于对应于SEQ IDNO：35-38和64-85的氨基酸序列的G9表位结合位置的作图。 
图15显示利用重叠肽通过Western印迹分析的G9表位作图分析，所述重叠肽涵盖对应于SEQ ID NOs：35-38和65-86的氨基酸序列的人GM-CSF蛋白序列。抗体阳性肽包括SEQ ID NO：35-38。 
说明性实施方式的详细说明
涉及本发明方法和其他方面的各种术语用于整个说明书和权利要求。除非另外指出，这种术语采用它们本领域的平常含义。其他特别定义的术语的解释方式与此处提供的定义一致。 
应理解本发明不限于特定的方法、试剂、化合物、组合物或者生物系统，它们当然可以改变。还应理解此处使用的术语只是用 于描述特定实施方式，而不是为了限制。当用于本说明书和所附权利要求时，单数形式“a”、“an”和the”包括复数指示，除非上下文明确另有规定。因此，例如，“细胞”的含义包括两种或更多种细胞的组合，等等。 
此处叙述的每种范围包括范围的所有组合和亚组合，以及其中包含的特定数字。 
当涉及可测值例如量、短暂的持续时间等等时，此处使用的术语“大约”表示包括从特定值±20％或者±10％，更优选±5％，更加优选±1％，更甚优选±0.1％的变化，因为这种变化适于进行所公开的方法。 
“传染病”包括，但不限于，感染了病原体、病毒、细菌、真菌或者寄生虫。病毒的实例包括，但不限于，严重急性呼吸综合征(SARS；由SARS-相关的冠状病毒引起)，B型或者C型肝炎，流感，水痘，腺病毒，I型或者II型单纯疱疹病毒，牛瘟，鼻病毒，埃可病毒，轮状病毒，呼吸道合胞病毒，乳头状瘤病毒，乳多泡病毒，巨细胞病毒，棘状病毒，虫媒病毒，汉坦病毒，柯萨奇病毒，腮腺炎病毒，麻疹病毒，风疹病毒，脊髓灰质炎病毒，和I型或者II型人类免疫缺陷性病毒(HIV)。细菌的实例包括，但不限于，埃博拉，葡萄球菌A-E，疟原虫(疟疾)，结核分支杆菌，分枝杆菌属，支原体，奈瑟氏菌属和军团杆菌属。寄生虫的实例包括，但不限于，立克次氏体和衣原体。 
“炎性疾病”包括，但不限于，急性和慢性免疫和自身免疫病理，例如，但不限于，类风湿性关节炎，自身免疫病，炎性肾病和炎性肺病例如哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)，多发性硬化症，和自身免疫脑脊髓炎。 
“自身免疫病”是一种疾病或者病症，来自并且针对个体自身组织或者其共分离或者表现形式或者其所导致的病症。自身免疫疾 病的实例包括，但不限于关节炎(类风湿性关节炎例如急性关节炎，慢性类风湿性关节炎，痛风或者痛风性关节炎，急性痛风性关节炎，急性免疫关节炎，慢性炎性关节炎，变性关节炎，II型胶原-诱导的关节炎，感染性关节炎，莱姆(Lyme)关节炎，增生性关节炎，牛皮癣关节炎，斯蒂尔氏(Still′s)病，脊椎关节炎，和幼年-发作的类风湿性关节炎，骨关节炎，慢性发展性关节炎(arthritis chronica progrediente)，畸形关节炎，慢性原发多发性关节炎(polyarthritis chronica primaria)，反应性关节炎，和强直性脊柱炎)，炎性过度增殖皮肤病，牛皮癣例如斑状牛皮癣、点滴状牛皮癣、脓疱性牛皮癣、和银屑病甲，特应性包括特应性疾病比如枯草热和乔布氏(Job′s)综合征，皮炎包括接触性皮炎、慢性接触性皮炎、剥脱性皮炎、过敏性皮炎、过敏性接触性皮炎、疱疹样皮炎、钱币状皮炎、脂溢性皮炎、非特异性皮炎、原发性刺激物接触性皮炎和特应性皮炎，x-连锁的过IgM综合征，过敏性眼内炎性疾病，荨麻疹例如慢性过敏性荨麻疹和慢性特发性荨麻疹包括慢性自身免疫荨麻疹，肌炎，多肌炎/皮肤肌炎，少年型皮肌炎，中毒性表皮坏死溶解，硬皮病(包括全身性硬皮病)，硬化症例如全身性硬化症，多发性硬化症(MS)例如脊髓-眼MS，原发性进展性MS(PPMS)，和复发缓解型MS(RRMS)，进行性全身性硬化症，动脉粥样硬化症，动脉硬化症，弥漫性硬化症，运动失调硬化症，视神经脊髓炎(NMO)，炎性肠病(IBD)(例如，克罗恩氏病，自身免疫-介导的胃肠疾病，结肠炎例如溃疡性结肠炎(ulcerative colitis)、溃疡性结肠炎(colitis ulcerosa)、显微镜结肠炎、胶原样结肠炎、息肉状结肠炎、坏死性小肠结肠炎和透壁结肠炎，和自身免疫炎症性肠病)，肠炎，坏疽性脓皮病，结节性红斑，原发性硬化性胆管炎，呼吸窘迫综合征，包括成年或者急性呼吸窘迫综合征(ARDS)，脑膜炎，所有或者部分葡萄膜的炎症，虹膜炎，脉络膜炎，自身免疫血液学病症，类风湿性脊椎炎，类风湿性滑膜炎，遗传性血管性水肿，脑膜炎中的脑神经损害，妊娠疱疹，妊娠性类天疱疮，阴囊瘙痒，自身免疫卵巢功能早期衰竭，源于自身免疫病症的突发性耳聋，IgE-介导的疾病例如过敏性和变应性和特应性鼻炎，脑炎例如罗斯默森氏(Rasmussen′s) 脑炎以及边缘和/或脑干脑炎，葡萄膜炎，例如前葡萄膜炎，急性前葡萄膜炎，肉芽肿性葡萄膜炎，非肉芽肿性葡萄膜炎，晶状体抗原性(phacoantigenic)葡萄膜炎，后葡萄膜炎，或者自身免疫葡萄膜炎，有和没有肾病综合征的肾小球肾炎(GN)例如慢性或者急性肾小球肾炎例如原发性GN，免疫-介导的GN，膜性GN(膜性肾病)，特发性膜型GN或者特发性膜性肾病，膜-或者膜性增殖GN(MPGN)，包括I型和II型，和快速进行性GN，增殖性肾炎，自身免疫多腺内分泌失效，龟头炎包括形质细胞局限性龟头炎，龟头包皮炎，环形离心性红斑，持久性色素障碍性红斑，多形红斑，环状肉芽肿，光泽性苔癣，慢性萎缩性苔癣样皮炎，慢性单纯性苔癣，小棘苔藓，扁平苔癣，板层状鱼鳞病，表皮松解性角化过度症，恶变前角化病，坏疽性脓皮病，过敏性病症和应答，过敏反应，湿疹包括过敏性或者特应性湿疹、干性湿疹、出汗障碍性湿疹和多孔掌跖湿疹，哮喘例如细支气管哮喘、支气管哮喘和自身免疫哮喘，涉及T细胞浸润和慢性炎性应答的病症，抗外源抗原的免疫反应例如怀孕期间的胎儿A-B-O血型，慢性肺炎性疾病，自身免疫心肌炎，白细胞粘附缺陷，狼疮包括狼疮肾炎、狼疮大脑炎、儿科狼疮，非肾狼疮、肾外狼疮、盘形狼疮和盘状红斑狼疮，脱发狼疮、全身性红斑狼疮(SLE)例如皮肤SLE或者亚急性皮肤SLE，新生儿狼疮综合征(NLE)，和播散性红斑狼疮，幼年发作(I型)糖尿病，包括儿科胰岛素-依赖糖尿病(IDDM)，成年发作糖尿病(II型糖尿病)，自身免疫糖尿病，特发性尿崩症，糖尿病性视网膜病，糖尿病肾病，糖尿病大-动脉病症，与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发性过敏反应有关的免疫应答，肺结核，结节病，肉芽肿病包括淋巴瘤样肉芽肿病，韦格纳(wegener′s)肉芽肿病，粒性白细胞缺乏症，血管炎，包括血管炎、大-血管血管炎(包括风湿性多肌痛和巨细胞(高安，Takayasu′s)动脉炎)、中-血管血管炎(包括川崎(Kawasaki′s)病和多发性结节性动脉炎/结节性动脉周围炎)、显微镜多动脉炎、免疫血管炎、CNS血管炎、皮肤血管炎、超敏性血管炎、坏死性脉管炎例如全身坏死性脉管炎、和ANCA-相关的血管炎，例如丘-施(Churg-Strauss)血管炎或者综合征(CSS)和ANCA-相关的小-血管血管炎， 颞动脉炎，再生障碍性贫血，自身免疫再生障碍性贫血，库氏(Coombs)阳性贫血，Diamond Blackfan贫血，溶血性贫血或者免疫性溶血性贫血包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)，恶性贫血(anemia pemiciosa)，阿狄森氏病，纯红细胞贫血或者发育不全(PRCA)，因子VIII缺陷，甲型血友病，自身免疫中性白细胞减少，各类血细胞减少，白血球减少症，涉及白细胞渗出的疾病，CNS炎性病症，多重器官损伤综合征例如那些败血病、外伤或者出血的继发症，抗原抗体复合物-介导的疾病，抗小球基底膜疾病，抗磷脂抗体综合征，过敏性神经炎，白塞氏(Behcet’s)病/综合征，卡斯托曼氏(Castleman′s)综合征，古德帕斯彻(Goodpasture’s)氏综合征，雷诺氏(Reynaud′s)综合征，史格兰氏(Sjogren′s)综合征，斯蒂芬斯-约翰逊(stevens-johnson)综合征，类天疱疮例如类天疱疮和皮肤类天疱疮，天疱疮(包括寻常天疱疮，落叶状天疱疮，天疱疮粘液-膜类天疱疮，和红斑性天疱疮)，自身免疫多内分泌腺疾病，莱特尔氏(Reiter’s)病或者综合征，热损伤，子痫前期，免疫复合物病症例如免疫复合物性肾炎，抗体-介导的肾炎，多神经病，慢性神经病例如IgM多神经病或者IgM-介导的神经病，血小板减少(例如，心肌梗死患者发展出的)，包括血栓性血小板减少性紫癜(TTP)，输注后紫癜(PTP)，肝素-诱导的血小板减少，和自身免疫或者免疫-介导的血小板减少例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)包括慢性或者急性FTP，巩膜炎例如特发性角膜巩膜炎，巩膜表层炎，睾丸和卵巢的自身免疫病包括自身免疫睾丸炎和卵巢炎，原发性甲状腺机能减退，甲状旁腺机能减退，自身免疫内分泌疾病包括甲状腺炎例如自身免疫甲状腺炎，桥本病，慢性甲状腺炎(桥本氏甲状腺炎)，或者亚急性甲状腺炎，自家免疫性甲状腺病，特发性甲状腺机能减退，格雷夫斯(Grave′s)病，多腺综合征例如自身免疫多腺综合征(或者多腺内分泌病综合征)，肿瘤伴随综合征，包括神经肿瘤伴随综合征例如兰伯-伊森(Lambert-Eato)n肌无力综合征或者兰伯-伊森(Lambert-Eaton)综合征，僵人综合征，脑脊髓炎例如过敏性脑脊髓炎或者脑脊髓炎过敏症和实验性过敏性脑脊髓炎(EAE)，重症肌无力例如胸腺瘤-相关的重症肌无力，小脑变性，神经性肌强直，眼阵 挛或者眼阵挛肌阵挛综合征(OMS)，和感觉神经病，多灶性运动神经病，希恩氏(Sheehan’s)综合征，自身免疫肝炎，慢性肝炎，狼疮样肝炎，巨-细胞肝炎，慢性活动型肝炎或者自身免疫慢性活动型肝炎，淋巴间质肺炎(LIP)，闭塞性细支气管炎(非移植)对NSIP，格林-巴利(Guillain-Barre)综合征，伯格氏(Berger′s)病(IgA肾病)，特发性IgA肾病，线性IgA皮肤病，急性发热性中性白细胞增多性皮病，角膜脓疱皮肤病，暂时皮肤棘层松角皮肤病，肝硬化例如原发性胆汁性肝硬变和肺变硬，自身免疫肠病综合征，乳糜泻，粥样泻(麦胶性肠病)，顽固性口炎性腹泻，特发性口炎性腹泻，冷沉球蛋白血症，肌萎缩侧索硬化(ALS；卢-格里格(Lou Gehrig′s)病)，冠状动脉病，自身免疫耳疾病例如自身免疫内耳疾病(AIED)，自身免疫听力损失，多软骨炎例如顽固性或者复发的或者复发性多软骨炎，肺泡蛋白沉积症，柯根(Cogan’s)综合征/非梅毒间质性角膜炎，贝尔(Bell′s)麻痹，斯威特(Sweet′s)病/综合征，红斑痤疮自身免疫，带状疱疹-相关的疼痛，淀粉样变性，非癌淋巴细胞增多，原发性淋巴细胞增多，其包括单克隆B细胞淋巴细胞增多(例如，良性单株丙种球蛋白病和未定性单克隆丙种球蛋白病，MGUS)，周围神经病，肿瘤伴随综合征，离子通道病例如癫痫症、偏头痛、心律不齐、肌肉病症、耳聋、眼盲、周期性麻痹和CNS的离子通道病，孤独症，炎性肌病，局灶或者节段性或者局灶节段性肾小球硬化病(FSGS)，内分泌眼病，葡萄膜视网膜炎，脉络膜视网膜炎，自身免疫肝脏病症，纤维肌痛，多重内分泌衰竭，施密特(Schmidt′s)综合征，肾上腺炎，胃萎缩，早老性痴呆，脱髓鞘病例如自身免疫脱髓鞘病和慢性炎性脱髓鞘多神经病，德雷斯勒(Dressler′s)综合征，斑秃，全秃，CREST综合征(钙沉着病症，雷诺氏现象，食管运动障碍，肢端硬化，和毛细血管扩张)，男性和女性自身免疫不育症，例如，归因于抗精子的抗体，混合结缔组织病，卡格氏(Chagas’)病，风湿热，反复流产，农民肺，多形性红斑，心脏切开术后综合征，库欣(cushing′s)综合征，养鸟者肺，过敏性肉芽肿性血管炎，良性淋巴细胞的脉管炎，阿尔波特氏(Alport’s)综合征，牙槽炎例如过敏性牙槽炎并纤维化性肺泡炎，间质肺病，输液反应， 麻疯病，疟疾，寄生虫疾病例如利什曼病、锥虫病、血吸虫病、蛔虫病、曲霉病、Sampter′s综合征，类风湿尘肺综合征，登革热，心内膜炎，心内膜心肌纤维化，弥漫性间质性肺纤维化，间质的肺部纤维化，肺纤维化，特发性肺纤维化，囊性纤维化，内眼炎，持久性隆起性红斑，胎儿成红细胞增多，嗜酸性筋膜炎，苏尔曼(Shulman′s)综合征，费尔蒂(Felty’s)综合征，丝虫病，睫状体炎例如慢性睫状体炎、异色性(heterochronic)睫状体炎，虹膜睫状体炎(急性或者慢性的)，或者富克斯(Fuch′s)睫状体炎，亨-舒(Henoch-Schonlein)紫癜，人类免疫缺陷性病毒(HIV)感染，SCID，获得性免疫缺陷综合征(ADDS)，埃可病毒感染，脓毒病，内毒素血症，胰腺炎，甲状腺功能亢进，细小病毒感染，风疹病毒感染，免疫接种后综合征，先天风疹感染，埃-巴二氏病毒感染，腮腺炎，伊文氏(Evan′s)综合征，自身免疫性腺生成障碍衰竭，西登哈姆氏(Sydenham’s)舞蹈病，链球菌感染后肾炎，thromboangitis ubiterans，甲状腺毒症，脊髓痨，脉络膜炎，巨-细胞多肌痛，慢性过敏性肺炎，干性角膜结膜炎，流行性角膜结膜炎，特发性肾脏综合征，微小病变型肾病，良性家族和局部缺血-再灌注损伤，移植器官再灌注，视黄醛自身免疫，关节炎症，支气管炎，慢性阻塞性气道/肺病，硅肺，口疮，口疮性口炎，动脉硬化病症，aspermiogenese，自身免疫溶血，伯克氏(Boeck’s)病，冷沉球蛋白血症，杜普伊特伦氏(Dupuytren′s)挛缩，endophthalmia phacoanaphylactica，过敏性肠炎，麻风的结节性红斑，特发性面神经麻痹，慢性疲劳综合征，发烧性风湿，哈曼-里奇(Hamman-Rich′s)病，感觉神经听力损失，血红素尿paroxysmatica，性腺机能减退，局部回肠炎，白细胞减少，传染性单核细胞增多症，横断脊髓炎，原发性自发性粘液性水肿，肾病，眼炎综合征(ophthalmia symphatica)，睾丸炎肉芽肿病，胰腺炎，急性多神经根炎，坏疽性脓皮病，亚急性甲状腺炎，获得性脾萎缩，非恶性胸腺瘤，白癜风，中毒性休克综合征，食物中毒，涉及T细胞浸润的病症，白细胞-粘附缺陷，与细胞因子和T淋巴细胞介导的急性和迟发型过敏相关的免疫应答，涉及白细胞渗出的疾病，多重器官损伤综合征，抗原抗体复合物-介导的疾病，抗肾小球基底膜病，过敏性神 经炎，自身免疫多内分泌腺疾病，卵巢炎，原发性粘液性水肿，自身免疫萎缩性胃炎，交感性眼炎，风湿病疾病，混合结缔组织病，肾病综合征，胰岛炎，多内分泌腺衰竭，自身免疫多腺综合征I型，成年-发作的特发性甲状旁腺机能减退(AOIH)，心肌病例如膨胀心肌病，后天性大疱性表皮松解(EBA)，血色病，心肌炎，肾病综合征，原发性硬化性胆管炎，脓性或者非脓性窦炎，急性或者慢性窦炎，筛骨、额骨、上颌骨、或者蝶窦炎，嗜酸性粒细胞-相关的病症例如嗜曙红细胞增多、肺部浸润嗜曙红细胞增多、嗜曙红细胞增多-肌痛综合征、吕弗勒氏(Loffler’s)肺炎、慢性嗜酸细胞性肺炎、热带性肺嗜曙红细胞增多、支气管肺炎曲霉病、曲霉肿、或者包含嗜酸性粒细胞的肉芽瘤，过敏症，血清反应阴性的脊柱关节病，多内分泌腺自身免疫病，硬化性胆管炎，巩膜，巩膜外层，慢性皮肤粘膜念珠菌病，布鲁顿氏(Bruton′s)综合征，婴儿期一过性低丙种球蛋白血症，维一奥二氏综合征，共济失调毛细血管扩张综合征，血管扩张，胶原病相关的自身免疫病症，风湿病，神经病，淋巴腺炎，血压反应降低，血管机能障碍，组织损伤，心血管局部缺血，痛觉过敏，肾缺血，大脑局部缺血，和伴随血管化的疾病，过敏性超敏病症，肾小球性肾炎，再灌注损伤，局部缺血再灌注病症，心肌或者其他组织的再灌注损伤，淋巴瘤气管支气管炎，炎性皮肤病，具有急性炎性组分的皮肤病，多重器官衰竭，大疱疾病，肾皮层坏死，急性化脓性脑膜炎或者其他中枢神经系统炎性病症，眼和眼窝炎性病症，粒细胞输血-相关的综合征，细胞因子-诱导的毒性，发作性睡病，急性严重炎症，慢性顽固性炎症，肾盂炎，动脉内增生，消化性溃疡，瓣炎，和子宫内膜异位。 
“保守修饰的变异体”适用于氨基酸和核酸序列。就特定核酸序列而言，保守修饰的变异体是指那些编码相同或者基本上相同氨基酸序列的核酸，或者在核酸不编码氨基酸序列的情况下，是指基本上相同的序列。因为遗传密码的简并性，很多功能相同的核酸编码任意给定的蛋白。例如，密码子GCA、GCC、GCG和GCU均编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸用密码子指定的各个位置，密码子可以改 变为所述的任意一个对应密码子而不改变编码的多肽。这种核酸变异是“沉默变异”，这是一种保守修饰的变异。此处编码多肽的每个核酸序列还描述了核酸每个可能的沉默变异。技术人员将认识到，核酸中的每个密码子(除了AUG，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子，和TGG，其通常是色氨酸的唯一密码子)可以被修饰以产生功能相同的分子。因此，对于表达产物来说，在每种描述的序列中均隐含编码多肽的核酸的各种沉默变异，但不针对实际的探针序列。 
“重组”当用于关于，例如，细胞，或者核酸，蛋白，或者载体时，表示所述细胞、核酸、蛋白或者载体已经通过导入异源核酸或者蛋白或者天然核酸或者蛋白的改变进行修饰，或者细胞源于这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞中未发现的基因，或者表达以其他方式异常表达、低表达或者根本不表达的天然基因。 
短语“核酸”或者“多核苷酸序列”是指从5′到3′端读出的脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸碱基的单链或者双链聚合物。核酸还可能包括修饰的核苷酸，所述核苷酸允许聚合酶的正确通读并且不改变该核酸编码的多肽的表达，包括，例如，保守修饰的变异体。 
此处“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换用于指代氨基酸残基的聚合物。该术语用于一种或者多种氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物，以及用于天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物。本发明的多肽包括保守修饰的变异体。本领域技术人员清楚，对核酸、肽、多肽或者蛋白序列的取代、缺失或添加是“保守修饰的变异体”，它改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或者小比例氨基酸，其中改变导致用化学相似的氨基酸取代一种氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。这种保守修饰的变异体在本发明的多态性变异体、种间同系物和等位基因以外，但并不排除它们。下列八组每组包含互相保守取代的氨基 酸：1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；3)天门冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；5)异亮氨酸(I)，亮氨酸(L)，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(33)。术语“保守取代”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲代氨基酸，条件是这种多肽还显示需要的结合活性。 
“氨基酸”是指天然存在和合成的氨基酸，以及功能类似于天然存在的氨基酸的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是那些遗传密码编码的氨基酸，以及那些后来被修饰的氨基酸，例如，羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸酯和O-磷酸丝氨酸。“氨基酸类似物”是指与天然存在的氨基酸具有相同碱基化学结构的化合物，即，α碳上结合氢、羧基、氨基和R基团，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。这种类似物具有修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或者修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的碱基化学结构。“氨基酸模拟物”是指一种化合物，其结构不同于氨基酸的一般化学结构，但功能类似于天然存在的氨基酸。 
此处氨基酸可以用它们通常已知的3字母符号或者1字母符号表示，这它们是IUPAC-IUB生化命名委员会(IUPAC-IUBBiochemical Nomenclature Commission)推荐的(参见下面的表1)。核苷酸，同样地，可以表示为它们公认的单字母代码。 表1                 符号 1-字母        3-字母           氨基酸 Y             Tyr              L-酪氨酸 G             Gly              L-甘氨酸 F             Phe              L-苯丙氨酸 M             Met              L-甲硫氨酸 A              Ala                L-丙氨酸 S              Ser                L-丝氨酸 I              Ile                L-异亮氨酸 L              Leu                L-亮氨酸T              Thr                L-苏氨酸 V              Val                L-缬氨酸 P              Pro                L-脯氨酸 K              Lys                L-赖氨酸 H              His                L-组氨酸 Q              Gln                L-谷氨酰胺 E              Glu                L-谷氨酸 W              Trp                L-色氨酸 R              Arg                L-精氨酸 D              Asp                L-天冬氨酸 N              Asn                L-天冬酰胺 C              Cys                L-半胱氨酸 
应注意此处所有通过式表示的氨基酸序列，其从左到右的方向是氨基端到羧基端的常规方向。 
此处使用的术语“体外(in vitro)”或者“离体(ex vivo)”是指一种人造环境和人造环境中发生的过程或者反应，例如，但不限于，试管和细胞培养物。术语“体内”是指一种自然环境(例如，动物或者细胞)和自然环境中发生的过程或者反应。 
当涉及组合物、载体、稀释剂和试剂时，“药学上可接受的”、“生理上可耐受的”和其语法上的变化可以互换使用，表示能够给药人类但不产生达到禁止组合物给药程度的有害生理作用的材料。 
术语“药学上可接受的载体”是指试剂，赋形剂，细胞，化 合物，材料，组合物，和/或剂型，它们在合理的医药判断范围内，适用于接触人类和动物的组织并且没有与合理的效益/风险比例相抵的过度的毒性、刺激性、变态反应或者其他并发症。如此处更详细的描述，适用于本发明的药学上可接受的载体包括气体，液体，以及半固体和固体材料。 
除了有注释时，“对象”或者“患者”可以互换使用，表示哺乳动物例如人类患者和非人灵长类动物，以及实验动物例如兔，狗，猫，大鼠，小鼠，和其他动物。因此，此处使用的“对象”或者“患者”表示可以给药本发明组合物的任意哺乳动物患者或者对象。在本发明的一些实施方式中，患者患有感染性或者炎性疾病，或者自身免疫病。在本发明的一些实施方式中，患者已经被诊断患有癌症。在本发明一个示范性实施方式中，为鉴定接受本发明治疗的候选患者，采用公认的筛选方法来确定对象现有疾病或者病症的状况或者与靶或者疑似疾病或者病症相关的风险因素。这些筛选方法包括，例如，确定对象是否患有感染性疾病、炎性疾病、癌症或者自身免疫病的检查。这些和其他常规方法允许临床医生选择需要治疗的对象。 
“治疗”是指在成功治疗或者改善例如，感染性疾病、炎性疾病例如GM-CSF-介导的炎性疾病、癌症或者自身免疫病的成征象，包括任意客观或者主观的参数例如症状的消除；缓解；减轻或者使患者对疾病状态更加耐受；减慢恶化或者衰退的速率；或者使恶化的终点减少了衰弱。症状的治疗或者改善可以基于客观或者主观的参数；包括检查结果。因此，术语“治疗”包括给药本发明的化合物或者药剂以延缓、减轻、或者遏制或者抑制与癌症相关的症状或者病症、感染性疾病、炎性疾病例如GM-CSF-介导的炎性疾病、或者自身免疫病的进展。治疗包括，例如，抑制退变细胞生长，抑制癌症或者肿瘤病进展，维持肿瘤生长的抑制，和诱导缓解。 
此处使用的“治疗性化合物”是指可用于疾病或者病症例如 癌症、感染性疾病、炎性疾病或者自身免疫病的预防或者治疗的化合物。 
“治疗作用”是指对象疾病、疾病的症状或者疾病副作用的减轻、清除或者预防。“有效量”是指获得预期作用所需的量。“治疗有效量”是指当给药对象治疗疾病、病症或者紊乱时，足以实现治疗该疾病的量。 
“伴随给药(concomitant administration)”、“同时给药(concurrent administration)”或者“共同给药(coadministration)”用在这里包括活性剂(例如，MAb，化疗剂，生物分子)以结合或者组合形式，一起或者彼此前后给药。多个药剂可以通过相同或者不同的途径，同时或者相继给药，只要这种给药方式足以允许所有药剂在作用部位达到有效浓度。本领域普通技术人员可以没有困难地确定本发明具体药物和组合物的适当给药时间、顺序和剂量。 
“供体细胞”是用于泛指细胞融合到人B细胞以产生杂交瘤细胞。所述细胞包括但不限于本领域技术人员已知的啮齿类动物骨髓瘤；啮齿类动物细胞系，人细胞系；禽细胞系。可以通过本领域技术人员已知的任何方法获得细胞系。 
“免疫球蛋白”或者“抗体”用于泛指抗体分子和各种源于抗体的分子，包括高等哺乳动物中存在的一类糖蛋白类别的任意成员，是免疫系统的主要组分。术语“抗体”作为最广义使用，具体包括单克隆抗体、具有多表位特异性的抗体组合物、双特异抗体、双抗体和单链分子，以及抗体片段(例如，Fab，F(ab′)2和Fv)，只要它们显示所需的生物活性。免疫球蛋白分子包括抗原结合结构域，其每个包括轻链和重链的尾端部分，和Fc区域，这是各种功能必需的，例如补体结合作用。存在5种类型的免疫球蛋白，其中Fc区域中重链的一级结构决定免疫球蛋白类型。具体地，α、δ、ε、γ和μ链分别对应IgA、IgD、 IgE、IgG和IgM。此处使用的“免疫球蛋白”或者“抗体”包括α、δ、ε、γ和μ的所有亚类，还表示4链免疫球蛋白结构的任意天然(例如，IgA和IgM)或者合成多体。抗体非共价地、特异地、可逆地结合抗原。 
此处使用的术语“单克隆抗体”是指获自基本上同源抗体种群的抗体，即，除了可能少量存在的天然存在突变以外，包含该种群的特定抗体是相同的。例如，可以通过抗体生成细胞的单克隆制备单克隆抗体。与多克隆抗体不同，单克隆抗体是单特异性的(例如，对单一抗原的单一表位特异)。修饰词“单克隆的”表示抗体从基本上同源种群获得的性质，不应理解为要求通过任意特定的方法制备抗体。例如，依照本发明使用的单克隆抗体可以按照Kohler等人(Nature，256：495，1975)最先描述的杂交瘤细胞方法制备，或者能够通过重组DNA方法制备。利用例如Marks等人(J.Mol.Biol，222：581-597，1991)描述的技术，还可以从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。 
此处使用的“嵌合的”是指一种免疫球蛋白，其中重链和轻链可变区不是人源的，而其中重链和轻链的恒定区是人源的。 
“人源化”是指一种免疫球蛋白例如抗体，其中直接参与重链和轻链的抗原结合、互补确定区(CDR)的氨基酸不是人源的，而免疫球蛋白分子的其他部分、可变重链和轻链的框架区域以及重链和轻链的恒定区是人源的。 
“完全人的”是指一种免疫球蛋白，例如抗体，其中整个分子是人源的或者由与人抗体形式相同的氨基酸序列组成。 
“表位”是指抗原作为抗体结合位点的免疫决定簇。在此处使用时，术语“构象表位”是指除了氨基酸不间断系列以外的抗原氨基酸之间由空间关系形成的不连续表位。 
“杂交瘤”是指培养的肿瘤淋巴细胞和激发的B-或者T-淋巴细胞之间细胞融合的产物，其表达亲本细胞的特异免疫潜力。 
“GM-CSF”是指一类糖蛋白生长因子的家族，其控制粒细胞和单核细胞-巨噬细胞的生成、分化和功能。示范性的，但绝非这类分子的唯一形式，可以参见美国专利5,602,007(34)，引入作为参考。 
此处使用的术语“生物分子”是指可以与抗体偶联、与抗体共同给药、在抗体给药前后给药、或者以其他方式与本发明抗体联用的任意分子。生物分子包括，但不限于，酶，蛋白，肽，氨基酸，核酸，脂质，碳水化合物，和片段，同系物，类似物，或者衍生物，和其组合。生物分子的实例包括但不限于白介素-2，干扰素α，干扰素β，干扰素γ，美罗华(rituxan)，泽娃灵(zevalin)，赫赛汀(herceptin)，爱必妥(erbitux)和阿瓦斯丁(avastin)。生物分子可以是天然、重组或者合成的，并可以对它们的天然形式进行修饰，例如，糖基化，乙酰化，磷酸化，十四烷基化，等等。此处使用的术语生物分子不限于天然存在的分子，而包括不是生物来源的合成分子。 
本发明的多肽可以利用多肽领域技术人员已知的技术从氨基酸合成。通常，这些方法包括向生长肽链连续添加一个或者多个氨基酸残基或者适当保护的氨基酸残基。通常，利用合适的、选择性可移除的保护基团来保护第一氨基酸残基的氨基或者羧基。不同的、选择性可移除的保护基团用于包含反应性侧基的氨基酸(例如，赖氨酸)。 
制备本发明多肽的不同方法是本领域已知的(WO89/06657；WO 92/22315；WO 98/49191；美国专利5,260,273；5,164,369；5,407,914；5,789,381；5,952,303；6,013,619；6,013,764；6,120,795；6,613,734.)。 
可以在本发明多肽的任意末端添加额外的残基，例如为了 提供“接头”，这样的话这类多肽可以方便地附着到标记物或者固体基质或者载体。可用于本发明多肽的标记物、固体基质和载体是本领域已知的；此处还描述了一些实例。 
氨基酸残基接头通常是至少一个残基，可以是40或者更多个残基，更常见的是1到10个残基。用于连接的典型氨基酸残基是酪氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、谷氨酸和天冬氨酸等。此外，通过末端NH2酰化作用对序列进行修饰，例如，乙酰化，或者巯基乙酸酰胺化，末端-羧基酰胺化，例如，氨，甲胺等等，本发明的多肽序列可以异于天然序列。 
尽管已经清楚此处公开的多个有效多肽，例如，SEQ ID NO：1-5，但是以下事实也是正确的，即各种各样的其他分子，包括不常见但天然存在的氨基酸、天然氨基酸的代谢产物和分解代谢物、被取代的氨基酸和氨基酸类似物、以及“D”构型的氨基酸也可用于本发明的分子和组合物。此外，“设计的”氨基酸衍生物、类似物和模拟物也可用于本发明的不同化合物、组合物和方法，以及包括由非酰胺键组成的骨架结构的聚合物。 
此处使用的多肽和氨基酸残基“类似物”和“衍生物”旨在包括氨基酸的代谢产物和分解代谢物，以及包括了不同于那些通常在称为“天然存在的”L-形态氨基酸中发现的键、骨架、侧链或者侧基的分子。(术语“类似物”和“衍生物”在此处也可以方便地互换使用。)。因此，D-氨基酸，模拟氨基酸和具有“设计”的侧链的氨基酸的分子(即，可以替代具有表面活性的分子中的一种或者多种氨基酸)也包括在此处的术语“类似物”和“衍生物”中。 
例如，除表1所列的L-氨基酸外，氨基酸代谢产物例如高精氨酸，瓜氨酸，鸟氨酸，和α-氨基丁酸也可用于本发明的分子和组合物。 
在另一个变异体中，可以期望构建一种采用更“刚性的”构象的分子；其实现的一种方法是在氨基酸的α碳原子上添加甲基或者其他基团。 
此外，通常不是源自蛋白但性质已知并且如此处所述可用的取代氨基酸，包括下列实例：L-刀豆氨酸；1-甲基-L-组氨酸；3-甲基-L-组氨酸；2-甲基-L-组氨酸；α，∈-二氨基庚二酸(L型，内消旋型，或者这两种)；肌氨酸；L-鸟氨酸甜菜碱；组氨酸的甜菜碱(herzynine)；L-瓜氨酸；L-磷酸精氨酸；D-章鱼肉碱；邻-氨甲酰基-D-丝氨酸；γ-氨基丁酸酸；和β-赖氨酸。包括下列所示的D-氨基酸和D-氨基酸类似物，也可用于本发明的蛋白、肽和组合物：D-丙氨酸，D-丝氨酸，D-缬氨酸，D-亮氨酸，D-异亮氨酸，D-别异亮氨酸，D-苯丙氨酸，D-谷氨酸，D-脯氨酸，和D-别羟脯氨酸，等等。上述也可用于本发明的GM-CSF多肽。 
还应理解本发明包括各种各样修饰的氨基酸，包括类似物、代谢产物、分解代谢物和衍生物，与修饰发生的时间或者位置无关。本质上，修饰的氨基酸可以分为3种类型：(1)氨基酸的分解产物和代谢分解物；(2)通过翻译后修饰(例如，侧链的修饰)产生的修饰氨基酸；和(3)通过非代谢或者非分解代谢过程(例如，实验室中修饰氨基酸或者衍生物的合成)对氨基酸的修饰。 
本发明还预期可以轻易地设计残基单位的氨基酸的侧链，所述残基单位通过在线性、支链或者烃或者杂环排列中添加或者减去亚甲基团以包括更长或者缩短的侧链。线性和支链结构还可以包含非碳原子例如S、O或者N。脂肪酸也是此处表面活性分子的有效成分。设计的侧链可以终止于有(R′)或者无(R)荷电或者极性基团附件。 
类似物，包括使用不同接头产生的分子，也可以用于本发 明的肽。通过除酰胺键以外的键连接的有侧链的分子，例如，仅举几个实例，包含氨基酸侧链或者其他侧链(R-或者R′-)的分子，其中组分通过羧酸酯或者磷酸酯、亚乙基、亚甲基、酮或者醚键连接，如此处所述也是有效的。本质上，任意氨基酸侧链，包含R或者R′基团的分子如此处所述也是有用的。 
本发明还预期包括肽二聚体的分子，所述肽二聚体通过合适的接头连接，例如，通过半胱氨酸分子连接的肽二聚体。(如本领域技术人员所认识，两个半胱氨酸分子可以通过二硫桥连接在一起，所述二硫桥由它们的硫醇基氧化形成)。因此这类接头或者桥接可以交联不同的多肽链，二聚体，三聚体，等等。可用于连接肽二聚体和/或其他肽多体的其他有效接头包括上面所列的那些，例如，羧酸酯或者磷酸-酯，亚乙基，亚甲基，酮或者醚键，等等。 
本领域技术人员将体会，可以对个体氨基酸、键和/或链自身进行各种修饰，这种修饰将产生属于本发明范围的分子，只要所获分子具有此处所述的生物学(例如，抗原性)活性。 
本发明优选的抗原性多肽是GM-CSF(SEQ ID NO：1)的抗原性肽，优选成熟GM-CSF(SEQ ID NO：2)。在一些实施方式中，抗原性肽包括SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少5个连续氨基酸。在其他实施方式中，抗原性肽包括SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。在其他实施方式中，抗原性肽包括SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少15个连续氨基酸。在其他实施方式中，免疫原性部分包括如SEQID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少20个连续氨基酸。在还有的其他实施方式中，免疫原性部分包括SEQ ID NO：1或者SEQID NO：2所示氨基酸序列的至少25个连续氨基酸。在本发明某些优选的实施方式中，GM-CSF蛋白的抗原性肽是成熟GM-CSF(SEQ ID NO：2)的氨基酸序列的氨基酸14-28(SEQ ID NO：3)，氨基酸9-23(SEQ ID NO：4)或者氨基酸80-94(SEQ ID NO：5)。 
在本发明的一些实施方式中，GM-CSF或者其抗原性肽被偶联到免疫原性蛋白以增强抗原的免疫原性。免疫原性蛋白可以是增强细胞免疫应答的任意蛋白，例如，但不限于破伤风类毒素C(TT)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，白蛋白，卵清蛋白，小鸡白蛋白(CAB)，牛血清白蛋白，甲状腺球蛋白，白喉类毒素，BCG，霍乱菌毒素等等。在一些实施方式中，抗原通过成熟蛋白的变性产生。 
此处使用先前报道的利用初级人B细胞产生分泌人MAb(WO2004/046330)杂交瘤的方法。外周血单核细胞，优选人PBMC，在靶抗原存在的条件下进行离体免疫，然后通过与供体细胞的细胞融合永生化。或者，鉴定了选择的PBMC，其中血清对目的抗原具有高免疫反应性的。 
筛选分泌靶抗原-特异性MAb的源自供体细胞的杂交细胞。在一些实施方式中提供了从离体免疫的免疫球蛋白-生成细胞生成杂交瘤细胞的方法，所述杂交瘤细胞产生抗靶抗原的单克隆抗体，该方法包括：(a)离体将包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞与靶抗原混合；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与供体细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)确定杂交瘤细胞产生的抗体与抗原的结合；和(d)选择产生结合靶抗原的抗体的杂交瘤细胞；从而产生生成抗靶抗原抗体的杂交瘤细胞。在一种优选的实施方式中，PBMC来自于健康的供体。靶抗原优选是GM-CSF，更优选包括SEQ ID NO：35-38中的一个氨基酸序列。 
或者，用于产生杂交瘤的方法包括以下步骤，所述杂交瘤生成对抗与疾病相关的靶抗原的单克隆抗体：(a)离体将外周血单核细胞与供体细胞融合以形成杂交瘤细胞，所述外周血单核细胞包括源自患有疾病的患者或者抗原-接触的供体的免疫球蛋白-生成B细胞； (b)确定杂交瘤细胞产生的抗体与靶抗原的结合；和(c)选择生成结合靶抗原的抗体的杂交瘤细胞；从而生成表达抗靶疾病抗体的杂交瘤细胞。优选的，靶抗原是与疾病-相关的抗原，并且优选与癌症、感染性疾病或者自身免疫病有关。更优选，疾病相关抗原是GM-CSF。靶抗原优选是GM-CSF，更优选包括SEQ ID NOs：35-38的一个氨基酸序列。在一个优选的实施方式中，抗原-接触的供体已接触GM-CSF或者已患有肺泡蛋白沉积症(PAP)。 
本发明提供从离体-免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生杂交瘤细胞的方法，所述杂交瘤细胞生成针对靶抗原的抗体(例如，GM-CSF或者其抗原性肽)，包括：(a)离体将包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞与靶抗原结合；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与供体细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)对杂交瘤细胞生成的免疫球蛋白与靶抗原的结合进行筛选；从而产生杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞生成针对靶抗原的抗体。在一种优选的实施方式中，PBMC来自于健康的供体。在一些实施方式中，靶抗原包括本发明的抗原性多肽。靶抗原优选包括SEQ ID NO：1-5中的一个氨基酸序列，优选SEQ ID NO：3-5中的任意一个。 
或者，本发明提供产生杂交瘤细胞的方法，所述杂交瘤细胞生成针对靶抗原(例如，GM-CSF，或者其抗原性肽)的抗体，包括：(a)从抗原-接触的供体选择包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)针对杂交瘤细胞生成的免疫球蛋白与靶抗原的结合进行筛选；从而产生杂交瘤细胞，所述杂交瘤细胞生成针对靶抗原的抗体。在一些实施方式中，靶抗原包括本发明的抗原性多肽。靶抗原优选的包括SEQ ID NO：1-5中的一个氨基酸序列，更优选SEQ ID NO：3-5中的任意一个。在一个优选的实施方式中，供体已经接触GM-CSF或者其抗原性肽，或者可能已患有肺泡蛋白沉积症(PAP)。 
在一些实施方式中，供体(例如，骨髓瘤)细胞表达错配修复的蛋白抑制剂。在一些方面，杂交瘤细胞表达错配修复的蛋白抑制剂。在本发明方法的一些实施方式中，在骨髓瘤与免疫球蛋白-生成细胞融合后，错配修复的蛋白抑制剂被导入杂交瘤细胞。在其他实施方式中，在与免疫球蛋白-生成细胞融合前，错配修复的蛋白抑制剂被导入供体或者骨髓瘤细胞。在还有的其他实施方式中，供体或者骨髓瘤细胞或者抗体生成细胞是错配修复中天然缺陷的。 
错配修复的蛋白抑制剂包括错配修复基因的显性失活等位基因。错配修复基因的显性失活等位基因包括但不限于PMS2，PMS1，PMSR3，PMSR2，PMSR6，MLH1，GTBP，MSH3，MSH2，MLH3或者MSH1的显性失活等位基因，和mutL和mutS基因的同系物。此外，可以使用能够干扰错配修复的多肽。例如，mutL PMS2的显性失活等位基因包括PMS2的前133个氨基酸。mutL同系物中氨基酸的进一步描述揭示了氨基酸LSTAVKELVENSLDAGATNIDLKLKDYGVDLIEVSDNGCGVEEENFE(SEQ ID NO：6)和LRQVLSNLLDNAIKYTPEGGEITVSLERDGDHLEITVEDNGPGIPEEDLE(SEQ ID NO：7)或者其片段。错配修复的蛋白抑制剂因此包括SEQID NO：6和7的多肽和其片段。在优选的实施方式中，错配修复的蛋白抑制剂被灭活。例如，在鉴定杂交瘤细胞产生针对靶抗原的单克隆抗体前后，可以灭活错配修复的蛋白抑制剂。可以采用本领域已知的任何方法灭活错配修复的蛋白抑制剂，例如，从细胞去除诱导物或者去除错配修复的蛋白抑制剂(即，消除细胞的错配修复蛋白抑制剂)。错配修复抑制剂的灭活稳定了超突变杂交瘤的基因组。 
在本发明产生杂交瘤细胞方法的一些实施方式中，杂交瘤细胞接触错配修复的化学抑制剂。本发明方法的某些实施方式中使用的错配修复化学抑制剂包括，但不限于，蒽、腺苷三磷酸酶抑制剂、核酸酶抑制剂、RNA干扰分子、聚合酶抑制剂和反义寡核苷酸中的至 少一种，所述反义寡核苷酸与编码错配修复蛋白的核苷酸特异杂交(WO2004/046330)。在优选的实施方式中，化学抑制剂是具有下式的蒽化合物： 
Figure S2007800048460D00311
其中R1-R10独立的是氢，羟基，氨基，烷基，取代烷基，烯基，取代的烯基，炔基，取代的炔基，O-烷基，S-烷基，N-烷基，O-烯基，S-烯基，N-烯基，O-炔基，S-炔基，N-炔基，芳基，取代的芳基，芳氧基，取代的芳氧基，杂芳基，取代的杂芳基，芳烷氧基，芳烷基，烷基芳基，烷基芳氧基，芳基磺酰基，烷基磺酰基，烷氧羰基，芳氧羰基，胍基，羧基，醇，氨基酸，磺酸盐，烷基磺酸盐，CN，NO2，醛基，酯，乙醚，冠醚，酮，有机硫化合物，有机金属基团，羧酸，有机硅或者任选包含一个或多个烷基化羟基的碳水化合物；其中所述杂烷基，杂芳基，和取代的杂芳基包含至少一种杂原子，即氧、硫、金属原子、磷、硅或者氮；和其中所述取代的烷基、取代的烯基、取代的炔基、取代的芳基和取代的杂芳基的的所述取代基是卤素，CN，NO2，低级烷基，芳基，杂芳基，芳烷基，芳氧基，胍基，烷氧羰基，烷氧基，羟基，羧基和氨基；和其中所述氨基任选用酰基基团、或者1到3个芳基或者低级烷基基取代。在某些实施方式中，R5和R6是氢。在其他实施方式中，R1-R10独立的是氢，羟基，甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，苯基，甲苯基，羟甲基，羟丙基，或者羟丁基。蒽的非限制性实例包括1，2-二甲基蒽，9，10-二甲基蒽，7，8-二甲基蒽，9，10-二苯基蒽，9，10-二羟甲基蒽，9-羟甲基-10-甲基蒽，二甲基蒽-1，2-二醇，9-羟甲基-10-甲基蒽-1，2-二醇，9-羟甲基-10-甲基蒽-3，4-二醇，和9，10-二-间-甲苯基蒽。 
化学抑制剂可以被引入细胞的生长培养基。在一些实施方 式中，可以从超突变杂交瘤细胞去除化学抑制剂以便重新稳定细胞的基因组。或者，所述方法可以包括错配修复化学抑制剂的灭活，从而稳定超突变杂交瘤的基因组。 
在一些实施方式中，所述方法还包括从抗体-生成细胞克隆免疫球蛋白-生成基因并将免疫球蛋白基因转染哺乳动物表达细胞，其中免疫球蛋白基因被可操作地连接到表达控制序列。 
本发明还提供从离体免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生哺乳动物表达细胞的方法，所述哺乳动物表达细胞生成针对靶抗原的高亲和力抗体，包括：(a)离体将包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞与靶抗原结合；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与供体细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)确定杂交瘤细胞生成的抗体与抗原的结合；(d)通过抑制错配修复优化杂交瘤的抗体生成；或者将杂交瘤的免疫球蛋白基因克隆入哺乳动物表达细胞，其中哺乳动物表达细胞的错配修复被抑制；和(e)选择生成结合靶抗原的抗体的杂交瘤细胞；从而产生生成抗靶抗原抗体的杂交瘤细胞。作为步骤(a)和(b)的替代，可以使用包括免疫球蛋白-生成B细胞的外周血单核细胞与供体细胞的离体融合以形成杂交瘤细胞，所述外周血单核细胞源自患病的患者或者抗原-接触的供体。 
本发明还提供从离体免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生哺乳动物表达细胞的方法，所述哺乳动物表达细胞生成针对靶抗原的高亲和力抗体，包括：(a)离体将包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞与靶抗原结合；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)对所述杂交瘤细胞生成的抗体与靶抗原的结合进行筛选；(d)通过抑制错配修复优化杂交瘤的生成；或者将杂交瘤的免疫球蛋白基因克隆入哺乳动物表达细胞，其中哺乳动物表达细胞的错配修复被抑制；和(e)与杂交瘤或者重组细胞生成的抗体相比，筛选分泌与靶抗原具有更高亲和力抗体的哺乳动物表达细胞。 
本发明还提供从离体免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生哺乳动物表达细胞的方法，所述哺乳动物表达细胞生成高滴度的高亲和力抗体，包括：(a)离体将包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞与靶抗原结合；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与供体细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)确定杂交瘤细胞生成的抗体与抗原的结合；(d)将杂交瘤的免疫球蛋白基因克隆入亲代哺乳动物表达细胞，其中哺乳动物表达细胞的错配修复被抑制；(e)孵育亲代哺乳动物细胞或者杂交瘤表达细胞以进行诱变，从而形成超突变的哺乳动物表达细胞；(f)选择可超突变的哺乳动物表达细胞，所述细胞分泌的抗体与亲代杂交瘤细胞生成的抗体相比与靶抗原具有更高的亲和力，或者选择可超突变的哺乳动物表达细胞，所述细胞比亲代哺乳动物表达细胞分泌更高滴度的抗体；从而从离体免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生哺乳动物表达细胞，所述哺乳动物表达细胞生成针对靶抗原的抗体。作为步骤(a)和(b)的替代，可以使用包括免疫球蛋白-生成B细胞的外周血单核细胞与供体细胞的离体融合以形成杂交瘤细胞，所述外周血单核细胞源自患病的患者或者抗原-接触的供体。 
本发明还提供从离体免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生哺乳动物表达细胞的方法，所述哺乳动物表达细胞生成高滴度的高亲和力抗体，包括：(a)离体将包括免疫球蛋白-生成细胞的外周血单核细胞与靶抗原结合；(b)将免疫球蛋白-生成细胞与供体细胞融合以形成杂交瘤细胞；(c)对杂交瘤细胞生成的抗体与抗原的结合进行筛选；(d)将杂交瘤的免疫球蛋白基因克隆入亲代哺乳动物表达细胞，其中哺乳动物表达细胞的错配修复被抑制或者通过抑制错配修复优化杂交瘤的生成；(e)孵育亲代哺乳动物细胞或者杂交瘤表达细胞以进行诱变，从而形成超突变的哺乳动物表达细胞；(f)筛选可超突变的哺乳动物表达细胞，其分泌的抗体与杂交瘤细胞生成的抗体相比与靶抗原具有更高的亲和力；和(g)对可超突变的哺乳动物表达细胞进行筛选，所述细胞比亲代哺乳动物表达细胞分泌更高滴度的抗体；从而从离体 免疫的免疫球蛋白-生成细胞产生哺乳动物表达细胞，所述哺乳动物表达细胞生成高滴度的高亲和力抗体。 
在本发明方法的一些实施方式中，利用基于ELISA的分析或者能够测量本领域已知的抗体-抗原结合的其他分析筛选抗体。Crowther，J.R.(2001)The ELISA guidebook，1st ed.(ELISA指南，第一版)Humana Press，Totowa，NJ。 
在一些实施方式中，筛选分析用于筛选超突变杂交瘤，所述超突变杂交瘤生成的抗体比亲代杂交瘤生成的抗体具有更高的亲和力。 
在一些实施方式中，本发明的方法还包括选择超突变的抗体-生成细胞，其抗体滴度比最初挑选的细胞生成的抗体滴度更高。 
将免疫球蛋白-生成细胞与骨髓瘤细胞融合的方法以及可用于这类方法的骨髓瘤细胞也是本领域已知的。Kohler&Milstein，Eur.J.Immunol.1976.6：511-9.通过细胞融合产生抗体生成组织培养物和肿瘤系(Derivation of specific antibody-producing tissue culture andtumor lines by cell fusion)。 
用于产生计划施用于人的Mab的人B细胞可能代表病毒传播的潜在载体。可以对融合伴侣细胞和供体的外周血单核细胞(PBMCs)进行预筛以证实病毒DNA的缺失，例如，通过PCR，包括免疫缺陷-1和2病毒，乙型肝炎和丙型肝炎病毒，巨细胞病毒，疱疹-6病毒，和EB病毒。 
根据本发明方法产生的杂交瘤细胞包括在本发明的范围内。 
本发明还包括针对杂交瘤细胞生成的靶抗原的抗体，所述杂交瘤细胞根据本发明的方法产生。本发明的抗体还包括利用本发明的多核苷酸重组生成的抗体。优选的本发明抗体是单克隆抗体。本发明抗体优选的是完全人类的，更优选完全人类的单克隆抗体。 
本发明优选抗体特异结合靶抗原的表位，例如构象表位。本发明的抗体优选针对与疾病-相关的抗原，例如，但不限于GM-CSF，优选人GM-CSF(SEQ ID NO：1)，更优选成熟的人GM-CSF(SEQ IDNO：2)。在一些实施方式中，与抗体结合的表位包括SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少5个连续氨基酸。在其他实施方式中，与抗体结合的表位包括SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少10个连续氨基酸。在其他实施方式中，与抗体结合的表位包括SEQ ID NO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少15个连续氨基酸。在其他实施方式中，与抗体结合的表位包括SEQ IDNO：1或者SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的至少20个连续氨基酸。还有的其他实施方式中，与抗体结合的表位包括SEQ ID NO：1或者SEQID NO：2所示氨基酸序列的至少25个连续氨基酸。在本发明某些优选的实施方式中，与抗体结合的GM-CSF表位包括SEQ ID NO：33-36中至少一种的氨基酸序列。抗体-生成细胞已经于2007年1月18日(10G9)和2007年2月2日(E10)置于Amer.Type Cult.Coll.(10801 UniversityBlvd.，Manassas，Virginia 20110-2209)，并已经分别分配了登录号Access.No.PTA-8173和PTA-8193。本发明抗GM-CSF抗体的实例是这类细胞生成的抗体。 
本领域技术人员清楚，抗体特异性主要由6个CDR区决定，尤其是H链CDR3(KaIa M等人(2002)J.Biochem.132：535-41；MoreaV等人(1998)J.Mol.Biol.275：269-94；和，Chothia C等人(1987)J.Mol.Biol.196：901-17)。但是，抗体框架区可能在抗原-抗体相互作用中起作用(Panka DJ等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：3080-4)，特别是关于它们在CDR环的构象中的作用(Foote J等人(1992)J.Mol.Biol.224：487-99)。因此，本发明的抗体可以包括H或者L链CDR或 者FWR区的任意组合，其赋予了抗体对GM-CSF的特异性。根据说明书的描述和此处的示范，可以使用本领域常规进行的结构域重排实验(shuffling experiments)(Jirholt P等人(1998)Gene 215：471-6；SoderlindE等人(2000)Nature Biotechnology 18：852-6)产生特异结合GM-CSF的抗体。通过这类结构域重排实验产生的抗体在本发明的范围内。 
因此，在一些实施方式中，抗体包括重链CDR1氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：40或者46基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括重链CDR2氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：41或者47基本上相同或者一致。在一些特别优选的实施方式中，抗体包括重链CDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQID NO：42或者48基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括轻链CDR1氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：43或者49基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括轻链CDR2氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：44或者50基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括轻链CDR3氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：45或者51基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括重链FWR1氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：52或者58基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括重链FWR2氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：53或者59基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括重链FWR3氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：54或者60基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括轻链FWR1氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ IDNO：55或者61基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括轻链FWR2氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：56或者62基本上相同或者一致。在一些实施方式中，抗体包括轻链FWR3氨基酸序列，所述氨基酸序列与SEQ ID NO：57或者63基本上相同或者一致。 
在一些优选的实施方式中，本发明的抗体包括重链，所述重链包括SEQ ID NO：8、9或者16的氨基酸序列。重链可以由包括SEQ ID NO：10、11或者17的核苷酸序列的核酸序列编码。在一些优选的实施方式中，本发明的抗体包括轻链，所述轻链包括SEQ ID NO：12、13或者18的氨基酸序列。轻链可以由包括SEQ ID NO：14，15或者19的核苷酸序列的核酸序列编码。 
应理解因为在重链和轻链以及编码它们的基因中可能存在的天然序列变异，本领域技术人员预期在氨基酸序列或者编码它们的基因中发现一些水平的变异，但仍保持本发明抗体独特的结合性质(例如，特异性和亲和力)。这种期待部分源于遗传密码的简并性，以及保守氨基酸序列变异的已知进化成功，其不会明显改变编码蛋白的性质。因此，这类变异体和同系物被认为基本上是彼此相同的，包括在本发明的范围内。 
因此本发明的抗体包括具有单个或者多个氨基酸取代、缺失、添加或者替换的变异体，所述变异体保留了本发明抗体的生物学性质(例如，结合亲和力或者免疫效应活性)。技术人员可以制备具有单个或者多个氨基酸取代、缺失、添加或者替换的变异体。这些变异体可以包括，尤其是：(a)一个或多个氨基酸残基被保守或者非保守氨基酸取代的变异体，(b)从多肽添加或者去除一个或多个氨基酸的变异体，(c)一个或多个氨基酸包括取代基团的变异体，和(d)多肽与另一种肽或者多肽融合的变异体，所述另一种肽或者多肽例如融合伴侣、蛋白标签或者其他化学部分，其可赋予多肽有用的性质，例如，针对抗体的表位，多聚组氨酸序列，生物素部分等等。本发明的抗体可以包括变异体，其中在保守或者非保守的位置，一个种类的氨基酸残基被另一种类的相应残基取代。在其他实施方式中，非保守位置的氨基酸残基被保守或者非保守的残基取代。获得这些变异体的技术，包括遗传学(抑制，缺失，突变，等等)、化学和酶学技术，是本领域普通技术人员已知的。 
在一些优选的实施方式中，抗体可以包括重链和轻链，所 述重链包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ IDNO：12的氨基酸序列。在一些优选的实施方式中，抗体可以包括重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO：16的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO：18的氨基酸序列。在一些实施方式中，抗体可以包括重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO：9的氨基酸序列，所述轻链包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列。但是本领域技术人员清楚，在一些情况下，指定重链与不同轻链的配对，或者指定轻链与不同重链的配对将生成比天然组合具有相同或者更高特异性和/或亲和力的抗体。因此，本发明不限于H和L链对的优选组合，因此本发明的抗体包括H和L链对的不同组合，包括但不限于，此处描述的H和L链，或者本领域技术人员会知道的其他H或者L链，或者以其他方式实验性确定的与此处描述的H和L链相容以便获得与GM-CSF的特异性和高亲和力结合。 
本发明的优选抗体包括两条重链。本发明的优选抗体包括两条轻链。更优选的是包括本发明两条重链和两条轻链的抗体。 
本发明的抗体包括具有一个或者多个氨基酸取代、缺失、添加或者替换的变异体，所述变异体保留本发明抗体的生物学性质(例如，结合亲和力或者免疫效应活性)。技术人员可以制备具有单个或者多个氨基酸取代、缺失、添加或者替换的变异体。这些变异体可以包括，尤其是：(a)一个或多个氨基酸残基被保守或者非保守氨基酸取代的变异体，(b)从多肽添加或者去除一个或多个氨基酸的变异体，(c)一个或多个氨基酸包括取代基团的变异体，和(d)多肽与另一种肽或者多肽融合的变异体，所述另一种肽或者多肽例如融合伴侣、蛋白标签或者其他化学基团，其可以赋予多肽有用的性质，例如，针对抗体的表位，多聚组氨酸序列，生物素基团等等。本发明的抗体可以包括变异体，其中在保守或者不保守的位置，一个种类的氨基酸残基被另一种类相应的残基取代。在另一种实施方式中，非保守位置的氨基酸残基被保守或者非保守的残基取代。获得这些变异体的技术，包 括遗传学(抑制，缺失，突变，等等)、化学和酶学技术，是本领域普通技术人员已知的。本发明的抗体还包括抗体片段。“片段”是指长度为优选至少大约40、更优选至少到大约50、更优选至少大约60、更优选至少大约70、更优选至少大约80、更优选至少大约90，和更优选至少大约100个氨基酸的多肽序列，其保留了全长序列的一些生物活性或者免疫活性，例如，结合亲和力或者亲合力和免疫效应活性。 
本发明抗体对靶抗原具有结合亲和力，包括小于1×10-2的解离常数(KD)。在一些实施方式中，KD小于1×10-3。在其他实施方式中，KD小于1×10-4。在一些实施方式中，KD小于1×10-5。在还有的其他实施方式中，KD小于1×10-6。在其他实施方式中，KD小于1×10-7。在其他实施方式中，KD小于1×10-8。在其他实施方式中，KD小于1×10-9。在其他实施方式中，KD小于1×10-10。在还有的其他实施方式中，KD 小于1×10-11。在一些实施方式中，KD小于1×10-12。在其他实施方式中，KD小于1×10-13。在其他实施方式中，KD小于1×10-14。在还有的其他实施方式中，KD小于1×10-15。 
本发明的抗体包括被修饰的衍生物，例如，通过将任意类型的分子共价连接到抗体，使得共价连接不阻止抗体结合其表位。合适衍生物的实例包括，但不限于糖基化抗体和片段，乙酰化抗体和片段，PEG化抗体和片段，磷酸化抗体和片段，以及酰胺化抗体和片段。本发明的抗体自身可以衍生自已知的保护/封闭基团，蛋白水解切割，连接到细胞配体或者其他蛋白，等等。此外，如上所述本发明的抗体可以包含一个或多个非常规氨基酸。在本发明的一些实施方式中，GM-CSF或者其表位被偶联到免疫原性蛋白以增强抗原的免疫原性。免疫原性蛋白可以是增强细胞免疫应答的任意蛋白，例如，但不限于破伤风类毒素C(TT)，钥孔血蓝蛋白(KLH)，白蛋白，卵清蛋白，小鸡白蛋白(CAB)，牛血清白蛋白，甲状腺球蛋白，白喉类毒素，BCG，霍乱菌毒素等等。在一些实施方式中，抗原通过成熟蛋白的变性产生。 
本发明的抗体可以具有翻译后部分，所述部分提高抗体活性或者稳定性。这些部分包括硫，甲基，碳水化合物，磷以及在免疫球蛋白分子上经常发现的其他化学基团。 
本发明的抗体可以是任意同种型。利用体内类型转换或者遗传工程可以改变抗体的同种型。 
提供编码本发明多肽的核苷酸序列。本发明的核酸包括但不限于基因组DNA，DNA，cDNA，RNA，双链和单链核酸，和其互补序列。 
本发明优选的多核苷酸包括编码SEQ ID NO：8和/或SEQID NO：12的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，抗体的重链由包括SEQ ID NO：10的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体的轻链由包括SEQ ID NO：14的多核苷酸编码。还提供包括核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码SEQ ID NO：8的氨基酸序列和SEQ ID NO：12的氨基酸序列。优选这种多核苷酸包括SEQ ID NO：10和/或SEQ ID NO：14的核酸序列。 
本发明优选的多核苷酸包括编码SEQ ID NO：8和/或SEQID NO：18氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，抗体的重链由包括SEQ ID NO：17的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体的轻链由包括SEQ ID NO：19的多核苷酸编码。还提供包括核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码SEQ ID NO：16的氨基酸序列和SEQ ID NO：18的氨基酸序列。优选这种多核苷酸包括SEQ ID NO：17和/或SEQ ID NO：19所示的核酸序列。 
在一些实施方式中，本发明的多核苷酸(和它们编码的肽)包括前导序列。可以使用本领域已知的任意前导序列。前导序列可以 包括但不限于限制性位点和/或翻译起始位点。例如，本发明提供编码SEQ ID NO：9和/或SEQ ID NO：13的氨基酸序列的核酸序列。在一些实施方式中，抗体的重链由包括SEQ ID NO：11的多核苷酸编码。在一些实施方式中，抗体的轻链由包括SEQ ID NO：15的多核苷酸编码。还提供包括核酸序列的多核苷酸，所述核酸序列编码SEQ ID NO：9的氨基酸序列和SEQ ID NO：13的氨基酸序列。优选这种多核苷酸包括SEQID NO：11和/或SEQ ID NO：15的核酸序列。 
本发明还预期包括本发明多核苷酸的载体和宿主细胞，例如但不限于重组宿主细胞，表达本发明的多核苷酸。 
提供了包含编码目的多肽的序列的重组表达载体。该表达载体可以包含一个或多个附加序列，例如但不限于调控序列(例如，启动子，增强子)，选择性标记物，和多腺苷酸化信号。 
本发明的重组表达载体包括编码至少一种重组蛋白的合成、基因组或者cDNA-来源的核酸片段，其被可操作地连接到合适的调控元件。这类调控元件可以包括转录启动子，编码合适mRNA核醣体结合位点的序列，和控制转录和翻译终止的序列。表达载体，尤其是哺乳动物表达载体，还可以包括一个或多个非转录元件例如复制起点，连接到待表达基因的合适启动子和增强子，其他5′或者3′侧翼非转录序列，5′或者3′非翻译序列(例如必要的核糖体结合位点)，多腺苷酸化位点，剪接供体和受体位点，或者转录终止序列。还可以包括赋予在宿主中复制的能力的复制起点。 
可以通过病毒来源提供表达载体的转录和翻译控制序列，所述表达载体用于转化脊椎动物细胞。示范性载体按照Okayama和Berg(1983)Mol.Cell.Biol.3：280的描述构建。 
系统中可使用的选择性标记物包括本领域已知的那些，例 如阳性和阴性选择性标记物，例如但不限于抗生素抗性基因(例如，新霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，卡那霉素抗性基因，四环素抗性基因，青霉素抗性基因)，HSV-TK，用于更昔洛韦筛选的HSV-TK衍生物，或者用于6-甲基嘌呤筛选的细菌嘌呤核苷磷酸化酶基因。(Gadi等人(2000)Gene Ther.7：1738-1743)。[0034]编码选择性标记物的核酸序列或者其克隆位点可以在编码目的多肽的核酸序列或者其克隆位点的上游或者下游。 
在一些实施方式中，载体包括一个或多个启动子，例如但不限于组成型、可诱导、宿主-特异性和/或组织-特异性启动子。例如，通常使用的启动子和增强子来源于人巨细胞病毒(CMV)，腺病毒2，猿猴肾病毒40(SV40)和多瘤。病毒基因组启动子、控制和/或信号序列可用于驱动表达，所述表达取决于相容的宿主细胞。还可以使用源自管家基因的启动子(例如，β-球蛋白，胸苷激酶，和EF-1α启动子)，这取决于载体要在其总表达的细胞类型的同一性。在一些实施方式中，启动子在编码一个或多个目的多肽的核酸序列的上游。 
本发明的载体可以包含一个或多个内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site，IRES)。在融合载体中包含IRES序列有利于增强一些蛋白的表达。 
在一些实施方式中，载体系统将包括一个或多个多腺苷酸化位点(例如，SV40)，其可以在任意上述核酸序列的上游或者下游。 
载体组分可以紧接连接，或者以对表达基因产物提供最佳间隔的方式排列(即，通过在ORF之间引入“间隔”核苷酸)，或者采用另一种方式放置。也可以被排列调控元件，例如IRES模体，以提供对于表达的最佳间隔。 
转染本发明表达载体的细胞可以在阳性选择条件下进行筛 选和/或对重组蛋白表达进行筛选。扩增重组-阳性细胞，筛选显示所需表型的亚克隆。 
细胞，包括真核和原核细胞，可以用本发明的表达载体转化。因此，本发明的另一个实施方式提供用本发明表达载体转化的宿主细胞。本发明的细胞优选的是真核细胞，更优选的是植物、啮齿类动物或者人类来源的细胞，例如但不限于尤其是NSO，CHO，perC.6，Tk-ts13，BHK，HEK293细胞，COS-7，T98G，CV-1/EBNA，L细胞，C127，3T3，HeLa，NS1，Sp2/0骨髓瘤细胞和BHK细胞系。 
通常，利用细胞悬浮液或者单个细胞进行转染，尽管其他方法也能实现使足够部分的被处理细胞或者组织掺入多核苷酸的程度，从而使转染细胞能够生长和被利用。转染技术是公知的。数种转化方案是本领域已知的。参见，例如，Kaufman(1988)Meth.Enzymology(酶学)185：537。本领域技术人员很容易理解，合适的转化方案通过宿主细胞类型和目的基因的性质来确定。任意这类方案的基本组成包括在合适的宿主细胞中引入编码目的蛋白的核酸序列，然后鉴定和分离以稳定、可表达方式掺入载体DNA的宿主细胞。导入多核苷酸的技术包括但不限于电穿孔，转导，细胞融合，氯化钙的使用，以及多核苷酸与脂质一起包装，用于与目的细胞融合。如果转染是稳定的，则可选择的标志基因在多个细胞世代表达一致的水平，从而得到细胞系。 
一种常见的转染哺乳动物细胞的方法特别是磷酸钙沉淀。另一种方法是聚乙二醇(PEG)-诱导的细菌原生质体与哺乳动物细胞的融合。Schaffner等人(1980)Proc.Natl.Acad.Sci USA 77：2163。另一种方法是电穿孔，其也可用于将DNA直接导入宿主细胞的细胞质，例如Potter等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA 81：7161的描述。 
还可以利用多聚脂质体试剂例如Lipofectin和Lipofectamine(购自Gibco BRL，Gaithersburg，MD)进行DNA的转 染，所述多聚脂质体试剂形成类脂-核酸复合物(或者脂质体)，当用于培养的细胞时，其促进核酸被摄取入细胞。 
一旦鉴定出表达所需蛋白的细胞，它可以被扩增和筛选。转染细胞可以采用许多方式进行筛选。例如，可以针对目的多肽的表达对细胞进行筛选。对于其中载体也包含抗生素抗性基因的细胞来说，可以针对抗生素抗性对细胞进行筛选，阳性筛选为包含载体的细胞。在其他实施方式中，细胞可以在选择性条件下生长。 
一旦鉴定出生成蛋白的克隆，可以进一步筛选细胞系以鉴定具有一个或多个所需表型的亚克隆，例如但不限于显示高滴度表达、增强的生长性质和/或产生具有所需生物化学特性的蛋白的能力的细胞，例如，由于蛋白修饰和/或改变的翻译后修饰。这些表型可能是由于指定亚克隆的固有性质或者诱变。诱变可以通过使用化学剂、UV-波长光、辐射、病毒、插入突变剂、缺陷型DNA修复或者这类方法的组合实现。 
本发明的另一方面描述本发明抗体的药物组合物。药物组合物可用于治疗疾病，例如，患者的癌症、感染性疾病或者炎性疾病。 
本发明提供包括与可接受的载体一起配制的一种或多种MAb的药物组合物，所述MAb用于治疗疾病，例如但不限于癌症、感染性疾病或者炎性疾病。 
在预防性应用中，给患者施用预防有效量的药物组合物，所述患者易患疾病或者病症(例如，癌症、感染性疾病或者炎性疾病)或者处于疾病或者病症的风险之下。有风险的个体包括，但不限于，有癌症、感染性疾病或者炎性疾病家族史的个体，先前接受癌症、感染性疾病或者炎性疾病治疗的个体，和呈现任意其他临床征兆的个体，所述征兆表明他们发展癌症、感染性疾病或者炎性疾病的可能性增加。 换种说法，具有风险的个体是被认为处于比一般人群发展癌症、感染性疾病或者炎性疾病的风险更高的任意个体。术语“预防有效量”是指产生功效的制剂量，观察到的所述功效是预防癌症、感染性疾病或者炎性疾病的发作或者复发。通常通过将制剂的功效与向类似情况的个体施用缺少活性剂的第二种制剂时观察到的功效进行比较，以确定制剂的预防有效量。 
在治疗性应用中，给疑有或者已经患有这类疾病的患者施用足以治愈或者至少部分遏制疾病症状(生化和/或组织学)的治疗有效量组合物，所述疾病症状包括疾病进展中的其并发症和中间病理表型。 
在预防和治疗方案中，药剂通常以数个剂量给药，直到实现足够应答。通常，对应答进行监控，如果应答开始减弱，给予重复剂量。 
用于疾病治疗的单克隆抗体的有效剂量，所述疾病例如此处描述的癌症、感染性疾病或者炎性疾病，根据许多不同的因素而不同，包括给药方式，靶位点，患者的生理状态，患者是人还是动物，施用的其他药物、和治疗是预防还是治疗性的。通常患者是人，但非人哺乳动物也可以被治疗。 
给药取决于待治疗的疾病状态的严重性和应答，疗程持续从几天到数天到数月，或者直到实现治愈或者达到疾病状态的减轻。可以通过测量患者或者对象体内药物的积聚来计算最佳给药方案。普通技术人员可以轻易确定最佳剂量、给药方法和重复率。最佳剂量可能是不同的，这取决于个体抗体的相对功效和，在联合给药的情况下，用于疾病治疗的已知药品的相对功效。根据体外和体内动物模型中发现有效的EC50s，通常可以估算最佳剂量。 
通常，剂量从每kg体重0.01μg到100g，可以每日、每周、每月或者每年给予一次或者多次，或者甚至每2到20年一次。给药剂量和频率可以改变，这取决于治疗是预防还是治疗性的。在预防性应用中，在长时间内以相对低频率的时间间隔给药相对低的剂量。一些患者在他们的余生中持续接受治疗。在治疗性应用中，有时需要在相对短的时间间隔内相对高的剂量，直到疾病的进展被减轻或者终止，优选直到患者显示病症的部分或者完全改善。此后，患者可以采用预防方案给药。 
尽管个人需要可能不同，但确定制剂有效量的最佳范围在本领域技术之内。可以从动物研究推断人的剂量(REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，20TH ED.，(雷氏药物科学，第20版)Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，2000)。通常要求剂量提供制剂的有效量，这是本领域技术人员可以调节的，根据以下因素而改变：年龄、健康、大体状况、体重，受者的疾病或者病症的类型和程度、治疗频率、联合疗法(如果有的话)的性质以及所需效果的性质和范围。 
本发明的药物组合物可以与药学上可接受的载体一起配制。合适的药学上可接受的载体包括水，PBS，盐溶液(例如林格氏(Ringer′s)溶液)，醇，油，明胶和碳水化合物，例如乳糖、直链淀粉、或者淀粉，脂肪酸酯，羟甲基纤维素，和聚乙烯基吡咯烷。这类制品可以被灭菌，并且如果需要，与辅剂混合，例如润滑剂，防腐剂，稳定剂，湿润剂，乳化剂，用于影响渗透压的盐，缓冲液，和颜料。适用于本发明的药物载体是本领域已知的(REMINGTON′SPHARMACEUTICAL SCIENCES，20TH ED.，(雷氏药物科学，第20版)Gennaro编，Mack Publishing Co.，Easton，PA，2000)。 
药物制剂，其可以方便地存在于单位剂型中，可以根据制药工业公知的常规技术进行制备。这类技术包括将活性成分与药物载 体结合的步骤。通常，通过将活性成分与液体载体或者精细粉碎的固体载体或者这两者均匀和紧密地结合来制备制剂。制剂可以存在于单位剂量或者多剂量容器中，例如，密封的安瓿和小瓶，可以保存于冷冻或者冷冻-干燥(冻干)条件，只需在使用前即刻添加无菌液体载体。 
药物组合物通常配制为无菌的，基本上等渗的和完全符合美国食品和药品管理局(the U.S.Food and Drug Administration)的所有药品生产质量管理规范(Good Manufacturing Practice，GMP)。     
关于制剂、剂量和给药方式的其他指导是本领域现有的(Berkow等人，1997，THE MERCK MANUAL OF MEDICALINFORMATION(默克医药信息手册)，Home，ed.，Merck ResearchLaboratories，Whitehouse Station，NJ.；Goodman etal.，1996，GOODMAN&GILMAN′S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS，9th ed.(GOODMAN&GILMAN的治疗药理基础)McGraw-Hill HealthProfessions Division，New York；Ebadi，1998，CRC DESK REFERENCEOF CLINICAL PHARMACOLOGY(临床药理桌面参考)，CRC Press，Boca Raton，Ha.；Katzung，2001，BASIC & CLINICALPHARMACOLOGY，8TH ED(基础和临床药理，第8版).Lange MedicalBooks/McGraw-Hill Medical Pub.Division，New York；Speight等人，1997，AVERV′S DRUG TREATMENT：A GUIDE TO THE PROPERTIES，CHOICE，THERAPEUTIC USE AND ECONOMIC VALUE OF DRUGSIN DISEASE MANAGEMENT，4TH ED.(AVERV的药物治疗：疾病管理中药物的性质、选择、治疗用途和经济价值的指导，第4版)AdisInternational，Auckland/Philadelphia，PA)。 
当用作药物治疗时，本发明的组合物可以单独给药或者与用于疾病治疗的其他化合物或者组合物共同给药，用于癌症、感染性疾病或者炎性疾病。这类化合物的实例，此处称为“补加化合物”，或者“补加组合物”，包括但不限于，抗生素，抗细胞因子，抗哮喘药物，抗 磷脂酶(例如，磷脂酶的抑制剂)，血管扩张剂(例如，腺苷，β-肾上腺素激动剂或者拮抗剂，β-肾上腺素阻断剂，α-肾上腺素阻断剂，利尿药，平滑肌血管扩张剂，硝酸盐，和血管紧张素-转换酶抑制剂)，生物分子，细胞生长抑制剂和化疗剂。本发明的药物组合物可以包括，例如，一个或多个补加化合物。在一些实施方式中，抗体被偶联到补加化合物。 
根据本发明的另一方面，提供了试剂盒，例如，用于癌症、感染性疾病或者炎性疾病的治疗。 
本发明的试剂盒包括本发明的抗体或者抗体组合物和说明书，所述说明书用于在治疗患者的癌症、感染性疾病或者炎性疾病或者抑制靶抗原(例如，GM-CSF)生物活性的方法中使用该试剂盒。试剂盒可以包括至少一种补加化合物。试剂盒可以包括给药抗体或者抗体组合物的说明书和/或工具，例如，通过注射。 
本发明的抗体可以用于检测生物样品中的抗原，所述生物样品例如但不限于血清。可以使用本领域已知的任意方法，例如但不限于流式细胞术。例如，生物样品可以与本发明的抗体孵育，继之以洗涤并与标记的第二抗体抗体孵育。例如，第二抗体可以针对轻链，并且为了检测目的与FlTC或者藻红蛋白偶联。 
通过本领域已知的任意方法，在抗原中和检测法中可以测定本发明抗体的抗原中和活性。例如，利用抗原-依赖性细胞系，可以评定抗体的中和活性。GM-CSF-依赖性细胞系的例子包括但不限于TF-1和AML-193。 
在第一种抗原中和分析中，抗原-依赖性细胞悬浮在分析培养基中，分析培养基、抗原或者抗原与待测或者同工型对照抗体预孵育1小时。孵育期后，通过本领域已知的任意方法评价生长抑制。例 如，可以添加细胞滴定剂(Promega，WI)，然后继续孵育，在分光光度计中在490nm测量光密度(O.D.)，并从样品中减去培养基背景。如下所示计算抗原中和百分比：100-[有Ig的O.D./无Ig的O.D]]×100]。 
在另一种中和分析中，抗原与本发明的抗-抗原抗体混合。向混合物添加抗原-依赖细胞，然后孵育。该孵育期后，测量生长抑制。例如，可以添加DNA增殖标记物MTS，然后测量染料的掺入。抗体存在下染料掺入相对于无抗-抗原抗体下的减少表明抗原的中和。 
或者，抗原-依赖细胞在抗原存在下生长，然后向培养基添加增加量的抗体，并按照上面所述评定中和活性。 
本发明的治疗方法包括抑制靶抗原例如GM-CSF的生物活性的方法，和通过给需要的患者或者对象施用本发明抗体的药物组合物，治疗疾病例如但不限于癌症、感染性疾病或者炎性疾病的方法。GM-CSF的生物活性包括但不限于结合GM-CSF受体。所述方法可用于，例如，影响疾病例如但不限于，癌症、感染性疾病或者炎性疾病的预防性或者治疗性治疗。 
本发明的治疗方法适用于人和非人动物。受益于本发明的非人动物包括宠物、外来的(例如，动物园动物)和本地的牲畜。优选的非人动物是哺乳动物。 
本发明使用的抗体可以采用任意可接受的剂型口服给药，例如胶囊，片剂，水悬剂，溶液等等。抗体也可以非肠胃给药。即通过下列给药途径：皮下，静脉内，肌内，关节内，滑膜内，胸骨内，鼻内，局部，鞘内，肝内，病变内和颅内注射或者输注技术。通常，抗体提供为肌内或者静脉注射。 
本发明的抗体可以单独给药或者与药学上可接受的载体一 起给药，所述药学上可接受的载体包括可接受的佐剂、介质和赋形剂。 
本发明的抗体可以在另一种治疗剂之前、之后或者同时给药。例如，本发明的抗体可以单独给药或者与补加化合物共同给药。 
本发明的抗体可以作为未偶联或者偶联抗体的同质混合物或者未偶联和偶联抗体的异质混合物给药。 
可以通过各种方式评定有效的治疗。在一种实施方式中，通过疾病的进展变慢确定癌症、感染性疾病或者炎性疾病的有效治疗。在其他实施方式中，有效疗法通过患者的健康增进来测量，包括这类体征例如体重增加，力量恢复，疼痛减轻，精力旺盛，和更健康患者的主观表征。 
提供下列实施例以便更详细地描述本发明。它们旨在说明，而不是限制本发明。 实施例1 针对GM-CSF的抗原特异性人MAb的产生 
材料和方法
人B细胞，体外免疫和细胞培养。在后面的所有程序中，细胞在37℃5％CO2中生长。Leukopacks获自破伤风类毒素(TT)-免疫的健康个体。利用Ficoll-Plaque(Amersham BioSciences)纯化PBMC，并分别通过 人CD4和CD19筛选试剂盒(StemCellTechnologies)，从PBMC分离CD19阳性B细胞和CD4阳性T细胞，混合以制备B细胞/T细胞库(BT4细胞)。BT4细胞在完全RPMI1640(Invitrogen，CA)中培养，其包含10％热灭活的人血清AB(Nabi，FL)，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen，CA)。 
对于离体免疫，BT4细胞在T-和B-细胞表位存在下共培养。简单来说，在受辐射的自体同源PBMC以1∶1比例存在的条件下，BT4细胞以106/mL密度种于包含1Lf/mL破伤风类毒素(TT)(Cylex，MD)的完全RPMI中以生成活化的T细胞(T-库)。为了产生抗原-活化的B细胞(B-库)，BT4细胞以3×106细胞/mL的密度种于完全RPMI中，所述完全RPMI包含10％人血清AB，5％来自活化T细胞的条件培养基，20U/mL IL-2，0.5ng/mL IL-6，100U/mL IL-10(PrepoTech，NJ)和250ng/mL肽混合物(bio-World，OH)，所述肽代表靶抗原的不同区域，被合成以包含先前描述的T-和B-细胞表位(Zafiropoulos等人.(1997)J.Immunol.Methods 200：181-90)。 
针对GM-CSF选择的B细胞表位是：EHVNAIQEARRLLNL(SEQ ID NO：3)，STQPWEHVNAIQEAR(SEQ IDNO：4)，MASHYKQHCPPTPET(SEQ ID NO：5)。 
在受辐射CHO饲养细胞单层上，包含10％热-灭活人AB血清和400U/ml IL-4(PeproTech，NJ)的完全RPMI中，T-和B-库分别单独培养7天，然后以1∶10比例共培养(106细胞/mL)。5天后，融合共培养的T-和B-库以产生所述的杂交瘤。 
为了肺泡蛋白沉积症(PAP)患者B细胞的永生化，对100ml全血进行处理以纯化PBMC。在受辐射的CHO饲养细胞存在下，淋巴细胞在完全RPMI中培养7-10天，所述完全RPMI包含10％热灭活胎牛血清(FBS)，(JRH Biosciences，KS)，2ng/mL IL-4(PeproTech，NJ)，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen，CA)，50μg/mL转铁蛋白，5ng/mL豆蔻酸-佛波醇-乙酸酯(PMA)和0.5μg/mL环孢霉素A(Sigma，MO)。然后按照如下所述电融合淋巴细胞。 
细胞融合和筛选抗原-反应杂交瘤的酶联免疫吸附检测 (ELISA)。用于产生计划给人施用的Mab的人B细胞可能表现为病毒传播的潜在介质。可以通过PCR对融合伴侣细胞和来自健康供体的PBMC进行预筛以证实没有病毒DNA，包括免疫缺陷-1和2病毒，乙型肝炎和丙型肝炎病毒，巨细胞病毒，疱疹-6病毒，和EB病毒。利用CYTOPULSE CEEF-50装置(Cyto Pulse Sciences，Inc.，MD)，以1∶1的淋巴细胞对K6H6/B5比例，将淋巴细胞与K6H6/B5细胞(ATCC，VA)融合。 
融合后，细胞在完全RPMI中以～5,000细胞/孔种于平底96孔微孔板，所述完全RPMI包含10％热灭活FBS，2mM L-谷氨酰胺，0.1mM非必需氨基酸，1mM丙酮酸钠，55μM 2-巯基乙醇(Invitrogen，CA)，100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤和16μM胸苷(HAT，Sigma，MO)。每周更换培养基，保持HAT选择直到抗原反应性筛选完成(3-5周)。 
为了鉴定抗原-反应性MAb，利用整合了洗板机和分光光度计的BIOMEK FX液体处理系统自动进行基于ELISA的筛选。简单来说，微量滴定板用50μL/孔自制重组抗原(1μg/mL GM-CSF)在室温下包被6小时，所述抗原用包被缓冲液(50mM碳酸盐-碳酸氢盐，pH9.4)稀释。然后板用结合缓冲液(包含1％BSA(Sigma，MO)和0.05％Tween 20(BioRad，CA)的PBS)在室温下封闭2小时。板用洗涤缓冲液(包含0.05％Tween 20的PBS)洗涤一次，将50μl/孔杂交瘤上清转移到ELISA板。结合反应在室温下进行2小时。随后，洗板4次，添加用结合缓冲液1∶10,000稀释的100μl辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的山羊抗人IgG+M(Jackson ImmunoResearch Laboratories，PA)，反应在室温下进行1.5小时。最后，洗板4次，添加100μl/孔的SureBlue底物(KPL，MD)10分钟。通过添加50μl/孔的1N硫酸终止反应，在450nm测定吸光度。 
荧光-激活的细胞分类(FACS)分析。利用冰冷的结合缓 冲液(DPBS，无钙或者镁，0.5％BSA)进行Ig结合和细胞洗涤步骤，在V形底微孔板中起始反应，利用FACSAria装置(BD Biosciences，NJ)分析样品。对于图3A显示的FACS实验，106小鼠抗-GM-CSF杂交瘤细胞(Mul19/2)添加100ng/反应的GM-CSF，然后与抗-GM-CSF人MAb E5孵育。用10μg/mL FITC-标记的山羊抗人Ig(SouthernBiotech，AL)检测GM-CSF特异性MAb的结合。对于图3B显示的FACS实验，洗涤E10杂交瘤细胞，在90μl体积中以500,000细胞/孔接种。然后每孔添加10μl藻红蛋白(PE)-标记的GM-CSF(R&D System，MN)，细胞在冰上孵育1小时。对于未标记的GM-CSF竞争，杂交瘤细胞在室温下与5μg/m重组人GM-CSF(PeproTech，NJ)预孵育1小时，洗涤3次，然后在分析前与如上所述的PE-GM-CSF孵育。对于图4显示的FACS实验，A431和A431-K5细胞(Dr.Tra Pastan惠赠，National Cancer Institute)用结合缓冲液稀释的10μg/mL C12MAb或者正常人IgM(JacksonImmunoResearch Laboratories，PA)染色，如上所述进行反应。 
GM-CSF中和生物测定。GM-CSF-依赖性人红白血病细胞系TF-1(ATCC，VA)在包含10ng/mL重组人GM-CSF(PeproTech，NJ)的完全RPMI 1640(如上所述)中生长。在实验前一天，TF-1细胞在无GM-CSF的0.1％FBS中生长。饥饿细胞洗涤两次，重悬于分析培养基，以10,000细胞/孔的浓度种于96孔微孔板。所述孔或者包含分析培养基、100pg/mL GM-CSF或者包含GM-CSF，与图例所示浓度的待测或者同种型对照Ig预孵育1小时。3天后，每孔添加40μl细胞滴定剂(Promega，WI)，板在37℃继续孵育1小时。用分光光度计在490nm测量光密度(O.D.)，从所有样品减去培养基背景。如下所示计算GM-CSF中和百分比：100-(有Ig的O.D./无Ig的O.D.×100)。 
抗体类型-转换。杂交瘤细胞用10mL PBS洗涤一次，重悬于完全RPMI中，种于平底96孔微孔板，在37℃5％CO2中孵育。4天后，通过移液重悬细胞，将100μl转移到包被2.3μg/mL山羊抗人IgG(H+L)(Jackson Immunoresearch，PA)的20ELISPOT板(Millipore，MA)。 组织培养板中的剩余细胞添加额外的100μl完全RPMI。过夜孵育后，用包含0.05％Tween(PBST)的PBS洗涤ELISPOT板3次，然后添加100μl 2μg/mL山羊抗人IgG(H+L)-HRP，板在室温下振摇孵育1小时。板用PBST洗涤3次，然后向孔中添加100μL AEC底物溶液(Sigma，St.Louis，MO)，并在室温下振摇孵育90分钟。吸出底物，用dH2O洗板，风干。扩增来自显示阳性斑点(表明IgG生成)的孔的克隆。通过以1000，100，10和0.25细胞/孔重复接种阳性克隆，连续重复上述步骤，同时追踪阳性孔直到鉴定出分泌IgG的单细胞集落。 
利用中空纤维和搅拌生物反应器的发酵。在包含1LHyQCDM4NS0无血清培养基(HyClone，UT)的2L生物反应器(B BraunStat B-DU)中接种2.5×105/mL细胞，所述培养基分别保持葡萄糖和谷氨酰胺在6g/L和4mM。控制的设定点是：pH 7.1，空气dO240％饱和度，温度37℃，搅拌速率为80rpm。每日收集2mL样品，1mL利用Cedex装置进行细胞计数，1mL用于通过ELISA测量Ig浓度。对于中空纤维运行，在包含15mL完全RPMI的FiberCell系统(Bellco，NJ)中接种108个活细胞，当消耗50％葡萄糖时，利用包含1升新鲜培养基的内置贮器再进料。 
错配修复的抑制增加杂交瘤细胞系的基因多样性。杂交瘤细胞在完全RPMI(阴性对照)或者包含250μM或者500μM MMR-抑制蒽化合物的完全RPMI中生长。每3到4天细胞用含或者不含morphocene的新鲜培养基1∶5稀释进行传代，3周后收集细胞，以2×106 细胞/mL重悬于FACS缓冲液(含1％BSA的PBS)。细胞用10μg/mLFITC-偶联的山羊抗人Ig(Jackson Immunoresearch)在冰上染色30分钟。细胞用10ml冰冷的FACS缓冲液洗涤，重悬于3mL FACS缓冲液。在冰上添加10μL Viaprobe(Becton Dickinson，Franklin Lakes，NJ)5分钟，在FACSAria细胞分类器(Becton Dickinson)上根据高Ig表面染色对活细胞进行分类。设门(gate)用于分类细胞，所述细胞代表具有最高Ig表面染色的5％亚群。为了筛选滴度升高的克隆，FACS分类细 胞种于U型底96孔板，在37℃5％CO2中孵育1周。从孔中收集50μL上清，利用山羊抗人IgM+G包被的板通过ELISA分析IgM生成。作为内部对照，每个ELISA板中的3个孔接种50μL 10ng/mL人IgM(Jackson Immunoresearch)。450nm获得的O.D.值对内部对照孔的平均值归一化。扩增显示高IgM信号的孔用于进一步分析。为了微卫星不稳定性(MSI)分析，利用Qiagen DNeasy组织试剂盒(Qiagen)从亲代或者morphocene-处理的细胞提取DNA。利用D4荧光标记的BAT-26-F(5′-tcaccatccattgcacagtt-3′)(SEQ ID NO：20)和BAT-26-R(5′-ctgcgagaaggtactcaccc-3′)(SEQ ID NO：21)引物，pfuUltraTM高保真聚合酶(Stratagene，CA)扩增BAT poly A重复标记物(7)，如下孵育反应物：95℃5分钟；94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟共9次循环，每次循环退火温度降低1℃；94℃1分钟、52℃1分钟和72℃2分钟共30次循环；72℃最终延伸10分钟。利用DNA稀释获得单拷贝的标记物等位基因，所述DNA只在50％的PCR反应中产生扩增子。PCR产物用CEQ上样溶液1∶10稀释，然后加入Beckman CEQ 8000基因分析系统用于片段分析。 
抗原-特异性人MAb的产生。如上所述，用从志愿对象(健康供体)获得的低温保存的B细胞进行离体免疫。或者，从人类对象获得B细胞，所述人类对象的血清包含对目的抗原特异性的高滴度MAb。后一方法的原理基于以下可能性，即一些抗原特异性MAb可以来自异常免疫应答(如在自身免疫患者的情况下)，或者衍生自针对肿瘤、微生物或者疫苗抗原的体内免疫应答。 
在经离体免疫的细胞和来自PAP患者B细胞产生的杂交瘤文库融合后，鉴定数种抗原-反应性人MAb。选择4种杂交瘤细胞系，E5(IgM)、G7(IgM)、E10(IgG)和G9(IgG)用于进一步研究，通过ELISA检测它们生成的人MAb的特异性。图1显示E5、G7和E10人MAb只与GM-CSF反应，而不与其他10个无关的被测抗原反应，包括小鼠GM-CSF，其与人同系物具有53％的同一性。对于G9杂交瘤获 得相似的结果。进行FACS分析以证实这些人MAb的特异性。使人GM-CSF结合小鼠杂交瘤细胞的表面，所述小鼠杂交瘤细胞表达对人GM-CSF不同表位特异性的膜结合MAb。在这些条件下，E5MAb结合这些细胞的表面，如荧光强度偏移所示(图2A，底栏)。该结果证明E5MAb结合天然人GM-CSF的能力。当没有细胞结合的GM-CSF时，E5MAb不与这些杂交瘤细胞表达的任意一种膜结合蛋白交叉反应(图2A，中间栏)。类似地，通过FACS分析，E10Mab显示高度特异性。此外，因为发现E10Mab结合杂交瘤细胞膜，通过FACS显示其结合可溶性、藻红蛋白(PE)-标记的GM-CSF的能力(图2B，中间栏)，通过E10杂交瘤细胞与过量未标记GM-CSF的预孵育证明了结合的特异性(图2B，较低栏)。 
人MAbs的重新类别-转换。利用如上所述的两种策略，已经制备出针对各种人和非人抗原的IgG和IgM。尽管市场上大部分治疗性抗体是IgG同种型，测试潜在治疗性IgM Mab的癌症试验已经显示肿瘤的体内消退(16，17)。这些临床反应可归因于IgM强烈固定和激活补体途径以及有效杀伤肿瘤细胞的能力。IgG结合巨噬细胞和NK细胞上的Fc受体，因此可以调节抗肿瘤细胞的ADCC活性。可以在体内检测具有相同特异性(相同抗原和表位)的IgG和IgM的最佳药理学活性。在优选IgG同种型的情况下，用于IgM重新类别-转换的快速有效程序(参见材料和方法)已经进行。用E5系为例，鉴定了在使用的生长条件下类型-转换到IgG同种型的细胞亚群。E5IgG显示出与亲代E5IgM一样的可变区核苷酸序列以及相似的与GM-CSF的反应性(图3)。 
人MAbs的生物学活性。对靶定疾病可溶性介质的治疗性MAb所探索的药理学性质包括中和生长因子的能力。如上所述，一种这类实施例是作为RA介质的GM-CSF(9-11)。利用基于细胞的分析评定人MAb阻断GM-CSF功能的能力，其中人骨髓成红血细胞(TF1)的生长取决于它们培养基中该细胞因子的存在。如图4所示，E10和 G9均显著抑制GM-CSF-依赖细胞的生长，而人IgG同种型对照显示没有效果。E10和G9之间观察到的效力差异分别与它们870和14皮摩尔的表观亲和力良好相关。E5MAb只显示极小的中和活性，与其较低的亲和力一致(5nM)。 
分泌人MAb的杂交瘤的滴度和稳定性的评价。MAb生成系的一个重要性状是完整批量制造周期期间Ig分泌的稳定性。在周期持续时间为大约2个月的一种情况下，每隔24小时倍增的细胞系从解冻到收集经历大约60代。E5系被用作检测MAb滴度和用我们的方法产生的杂交瘤生产稳定性的模型。源自该细胞系的克隆，3D2，显示24小时的倍增时间，在超过两个月的连续培养后，通过有限稀释法重新克隆。通过ELISA测定生产性克隆的频率，测量它们在细胞密度归一化的条件培养基中的Ig浓度。图5A显示所有被测的E5-3D2亚克隆分泌高水平的Ig，表明60代后该细胞群Ig生产的均匀保留。然后利用小规模(15mL)中空纤维系统评定Ig生成。在中空纤维筒(catridge)中接种细胞，利用包含1升新鲜培养基的内置贮器连续进料。从第5天开始，每日收集筒(15mL)中的所有条件培养基，替换为新鲜培养基。再另外进行4天发酵，同时利用已知浓度的Ig标准品通过ELISA测定每日的Ig滴度。记录4天运行期间1.2g/L的累计滴度。在第8和9天之间，葡萄糖消耗达到其顶点(每天2克/L)，表明细胞对极高细胞密度具有良好的耐受。利用搅拌生物反应器系统，在1升规模补料分批运行中评价生产性能。首先从冷冻安瓿解冻细胞，接种在摇瓶中，然后种于包含1升无血清培养基的搅拌生物反应器(Bauer)中。进行发酵直到细胞存活率降低到低于60％(第6天)。在第1和5天之间记录Ig生成和细胞密度，显示于图5B。在对数期(第1-4天)，测得24pg/细胞/天的比生产率，倍增时间平均为23.4小时，表明这些细胞从烧瓶到生物反应器的良好扩展性，并保持更高的滴度。 
分泌人Mab的杂交瘤通过错配修复调节的基因优化。先前已经证明了利用称为形态发生的方法提高MAb生成细胞系质量的有效 性，所述方法需要MMR的短暂调节(Nicolaides等人(1995)Genomics30：195-206；和，Nicolaides等人(1998)Mol.Cell.Biol.18：1635-41.)。在利用该方法增加细胞库的基因多样性后，进行高通量筛选以鉴定显示更高滴度、亲和力(Grasso等人.(2004)Bioprocess Int.2：58-64；和，Nicolaides等人(2005)Ann.N.Y.Acad.Sci.1059：1-11)，或者生长率提高(Grasso，L.个人观察)的亚克隆。E5细胞经历了形态发生以证明利用我们的杂交瘤策略产生的MAb-分泌系中表型多样性的能力增加。通过检测BAT poly-A重复标记物的微卫星不稳定性(MSI)来监控MMR抑制。对进行形态发生处理的细胞中分析的24个BAT等位基因中，3个等位基因显示包括如图6A所示的单核苷酸缺失和插入的改变。在亲代细胞24个BAT等位基因的任意一个中都未检测到MSI。随后，通过有限稀释在微孔板中接种亲代或者经形态发生-处理的细胞。令细胞克隆分泌MAb 1周，通过ELISA分析它们条件培养基中的Ig浓度。从筛选的克隆总数(亲代3,763个，形态发生库2,437个)中测定O.D.大于1(高Ig分泌)的克隆频率，发现在经形态发生-处理的群中增加了260％(p＝0.0014)(图6B)。 
总结
本研究利用优化的离体免疫和人B细胞永生化处理并结合错配修复的抑制，展现了一种开发用于免疫治疗的人MAb的可行策略。利用这种方法，可以产生高特异性和生物学活性的MAb，所述MAbs由稳定杂交瘤细胞系分泌。 
根据本发明的方法，已经实现在4天中空纤维发酵运行期间超过60次倍增的稳定MAb生成并且每升生成超过1克MAb，表明通过本方法产生的杂交瘤细胞适合于灌流系统和可能的大批量生产。此外，该方法产生的杂交瘤在补料分批生物反应器运行中表现良好，表明这些细胞系在商业应用上的潜在用途。概括来说，此处介绍的平台方法为快速和合算开发优质、完全的人抗体提供了替代方法，免疫治疗用途。 实施例2完全人抗GM-CSF抗体的产生；PAP细胞的分离 
患有成年人肺泡蛋白沉积症(PAP)的患者在肺泡处积聚磷脂和表面活性蛋白。已经假定PAP是由于肺泡巨噬细胞和II型上皮细胞不能清除过量的表面活性物质所致。如上所述，已经在鼠模型中证明GM-CSF控制肺表面活性稳态的作用，推断是人的病理原因。此外，已经显示PAP患者具有针对GM-CSF的循环、中和抗体，因此提示该细胞因子是该疾病的病因。还不清楚这种自身免疫反应是否对GM-CSF特异。但是，已经显示PAP患者的一个亚群用GM-CSF疗法得到好转，这支持以下假设，即通过基因破坏或者抗体介导的中和造成GM-CSF缺失导致PAP发展。 
GM-CSF特异性抗体的分离。从PAP患者分离外周血单核细胞(PBMC)。简单来说，从全血回收PAP患者的B细胞。全血用等体积的PBS-/-稀释，通过颠倒容器温和混合内含物。25ml稀释的血液铺盖在包含25ml Ficoll-Paque(Amersham Biosciences AB，UppsalaSweden)的50ml试管中。室温下试管在2,000rpm离心30分钟。利用10-ml移液管从界面层收集PBMC，转移到新的50-ml管中，用PBS-/-洗涤两次。PBMC沉淀在10ml ACK Lysing缓冲液(150mM NH4Cl，10mM KHCO3，0.1mM Na2EDTA，pH 7.2)中重悬，室温孵育5分钟以裂解红细胞，用PBS-/-洗涤两次。 
PAP B细胞与骨髓瘤细胞系融合以产生杂交瘤。通过下列方法将从PAP患者富集的B细胞与各种骨髓瘤细胞(人-小鼠异杂交瘤，ATCC，VA，USA)；CBF-7细胞(人-小鼠异杂交瘤)；HEK293；人骨髓瘤细胞融合。B细胞和融合伴侣细胞应具有良好的存活率(＞90％存活和在对数期)。在它们的原始培养基中计数这两种细胞类型，在15ml管中以1∶1比例混合，然后4℃在1,000RPM离心6分钟。细胞用10-15ml冷CPFM(CYTOPULSE融合培养基，Cyto Pulse Sciences，MD USA) 洗涤3次。最终沉淀重悬成10×106细胞/ml CPFM。利用CYTOPULSECEEF-50(Cyto Pulse Sciences，MD USA)进行电融合。按照厂商和经验指导优化融合参数，融合效率平均一次杂交5,000个受脉冲的细胞。融合后，细胞在完全RPMI中以～5,000细胞/孔种于平底96孔微孔板，所述完全RPMI包含10％热灭活FBS，100μM次黄嘌呤，0.4μM氨基蝶呤，和16μM胸苷(HAT，Sigma，MO USA)。每周更换培养基，保持HAT选择直到完成抗原反应性。 
ELISA筛选分析。为了鉴定抗原-反应性MAb的，利用整合洗板机和分光光度计的BIOMEK FX液体处理系统，自动进行基于ELISA的筛选。简单来说，微量滴定板用50μL/孔自制重组抗原(1μg/mL GM-CSF)在室温下包被6小时，所述抗原用包被缓冲液(50mM碳酸盐-碳酸氢盐，pH 9.4)稀释。然后板用结合缓冲液(包含3％BSA(Sigma，MO)和0.05％Tween 20(BioRad，CA)的PBS)在室温下封闭2小时。板用洗涤缓冲液(包含0.05％Tween 20的PBS)洗涤一次，将50μl/孔杂交瘤上清转移到ELISA板。结合反应在室温下进行2小时。随后，洗板4次，添加用结合缓冲液1∶10,000稀释的100μl辣根过氧化物酶(HRP)-偶联的山羊抗人IgG+M(Jackson ImmunoResearchLaboratories，PA)，反应在室温下进行1.5小时。最后，洗板4次，添加100μl/孔的SureBlue底物(KPL，MD)10分钟。通过添加50μl/孔的1N硫酸终止反应，在450nm测定吸光度。 
FACS分析和分类。在每项研究中，利用冰冷的结合缓冲液(无钙或者镁的DPBS，0.5％BSA)进行Ig结合和细胞洗涤步骤。洗涤PBMC或者杂交瘤细胞，以500,000细胞/孔接种。添加FITC和藻红蛋白(PE)-标记的抗人CD3、CD19、CD20(SouthernBiotech，AL)，和PE-标记的GM-CSF(R&D System，MN)(10-100倍稀释)，在冰上孵育1小时。然后用结合缓冲液洗涤细胞3次，利用FACSARIA装置(BDBiosciences，NJ)进行分析或者分类。图9显示Mab E10同种型分析的结果。为了确定E10的同种型，利用抗人IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgM， Lκ和LλFc特异性抗体进行标准分析以得到同种型。 
GM-CSF中和生物分析。人GM-CSF-依赖的人红白血病细胞系TF-1(ATCC，VA)在包含10ng/mL重组人GM-CSF(PeproTech，NJ)的完全RPMI 1640(见上)中生长。在实验前一天，TF-1细胞在无GM-CSF的0.5％FBS中生长。收集饥饿的TF-1细胞，用分析培养基(具有0.5％BSA的普通RPMI)洗涤两次。细胞重悬于分析培养基，以10,000细胞/孔的浓度种于96孔微孔板。所述孔包含分析培养基、100pg/mL GM-CSF或者GM-CSF，与图中指定浓度的待测或者同种型对照Ig预孵育1小时。3天后，每孔添加40μl细胞滴定试剂(Promega，WI)，板在37℃继续孵育1小时。用分光光度计在490nm测量光密度(O.D.)，并从样品中减去培养基背景。如下计算GM-CSF中和百分比：100-[(有Ig的O.D./无Ig的O.D.)×100]。图4显示用完全的人MAb对TF-1细胞系的GM-CSF依赖的生长抑制。 
抑制错配修复以增加杂交瘤细胞系的遗传多样性。错配修复的抑制可以导致遗传多样性同胞细胞的生成增强、细胞发育或者抗体活性。为了促进MAb活性和细胞生长，杂交瘤细胞在完全RPMI(阴性对照)或者包含250μM或者500μM错配修复抑制剂morphocene(9，10-二甲基蒽，MP Biomedicals，CA)的完全RPMI中生长。每隔3到4天细胞用含或者不含morphocene的新鲜培养基1∶5稀释进行传代，3周后收集细胞，以2×106细胞/mL重悬于FACS缓冲液(含1％BSA的PBS)。细胞用10μg/mL FITC-偶联的山羊抗人Ig(JacksonImmunoresearch)在冰上染色30分钟。细胞用10ml冰冷的FACS缓冲液洗涤，重悬于3mL FACS缓冲液。在冰上添加10μL Viaprobe(BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ)5分钟，在FACSAria细胞分类器(Becton Dickinson)上根据高Ig表面染色对活细胞进行分类。设门用于分类细胞，所述细胞代表具有最高Ig表面染色的5％亚群。该种群在有或没有错配修复(MMR)的化学抑制剂下扩增一周，并且该程序再重复两次。为了筛选滴度升高的克隆，FACS分类的细胞以0.8细胞/孔种 于U型底96孔板的200μl完全RPMI中。板在37℃5％CO2中孵育1周。从孔中收集50μL上清，利用山羊抗人IgM+G包被的板通过ELISA分析IgM生成。作为内部对照，每个ELISA板中的3个孔接种50μL 10ng/mL人IgM(Jackson Immunoresearch)。450nm获得的O.D.值对内部对照孔的平均值归一化。扩增显示高IgM信号的孔用于进一步分析。为了MSI分析，利用Qiagen DNeasy Tissue试剂盒(Qiagen)，从亲代或者MMR抑制剂-处理的细胞提取DNA。利用D4荧光标记的BAT-26-F(5′-tcaccatccattgcacagtt-3′)(SEQ ID NO：20)和BAT-26-R(5′-ctgcgagaaggtactcaccc-3′)(SEQ ID NO：21)引物、pfuUltraTM高保真聚合酶(Stratagene，CA)扩增BAT poly A重复标记物(7)，如下孵育反应：95℃5分钟；94℃1分钟、60℃1分钟和72℃2分钟共9次循环，每次循环退火温度降低1℃；94℃1分钟、52℃1分钟和72℃2分钟共30次循环；72℃最终延伸10分钟。利用DNA稀释液获得单拷贝的标记物等位基因，所述DNA只在50％的PCR反应中产生扩增子。PCR产物用CEQ上样溶液1∶10稀释，然后加样到Beckman CEQ 8000基因分析系统用于片段分析。(Blake等人Stepwise deletions of poly A sequencesin mismatch repair-deficient colorectal cancers.(在错配修复缺陷的结肠直肠癌中逐步删除poly A序列)(200I)Am./.Pathol.158：1867-70.)。 实施例3 对GM-CSF具有高度特异性的单克隆抗体E10的产生 
数种抗体来源于PAP患者的B细胞。这些抗体是IgM、IgG同种型。利用此处描述的特异性分析，发现这些抗体中的每一种均特异结合GM-CSF。从肺泡蛋白沉积症(PAP)患者的B细胞与任一种骨髓瘤细胞的融合然后通过如上所述的ELISA筛选抗人GM-CSF单克隆抗体，产生一种抗GM-CSF人IgG1单克隆抗体E10。 
来自PAP患者(91ml全血)的血液用于分离总共4950万个PBMC。这些细胞的存活率是99.0％。FACS分析的结果显示于表2。通过在cRPMI1640(10ml)中将大约2500万个PBMC与饲养细胞一起 培养，来扩增B细胞，所述CRPMI1640包含IL-42ng/ml(PeproTech)，转铁蛋白50μg/ml(Sigma)，PMA 5ng/ml(Sigma)和环孢霉素A0.5μg/ml(Sigma)。培养11天后，剩余1200万个细胞，随后通过电融合(CytoPulseCEEF-50)与骨髓瘤细胞进行融合。FACS分析结果显示于表2。 表2.E10单克隆抗体的产生和FACS分析 
   FITC-CD3(％)  FITC-CD20(％)   PE-GMCSF(％)   CD20/GMCSF
  PBMC  62.6  14.4   5.9   6.3
  培养11天  77.2  17.0   0.7   0.1
融合细胞在RPMI 1640(Invitrogen，CA，USA)中培养，所述RPMI 1640包含10％热灭活的FBS(JRH Biosciences，KS USA)；L-谷氨酰胺，200mM(Invitrogen，CA，USA)；非必需氨基酸，10mM(Invitrogen，CA，USA)；丙酮酸钠溶液，100mM(Invitrogen，CA，USA)；青链霉素(Invitrogen，CA，USA)；2-巯基乙醇，55mM(Invitrogen，CA，USA)；和1×HAT(Sigma，MO USA)。 
培养12天后，大约48％的杂交瘤培养物显示生长。随后，利用重组GM-CSF(PeproTech，NJ，USA)通过GM-CSF特异性ELISA筛选杂交瘤。分离数个克隆，包括那些对GM-CSF阳性的。这些克隆再用ELISA检测以证实它们对重组GM-CSF特异，对破伤风毒素(TT)不特异。克隆4E10显示与GM-CSF的特异性反应，但与TT没有。克隆4E10随后被亚克隆。3周后，通过ELISA筛选培养的亚克隆以证实对GM-CSF的特异性仍被保持，然后按照如下所述进一步表征。 
E10的表征。为了确定抗GM-CSF抗体E10的特异性，利用大量抗原进行抗原-特异性ELISA(图8)。图8比较了与下列抗原的结合：hIL-1a，hIL-2，hTL-3，hTL-4，hIL-5，IL-6，hIL-13，hGM-CSF，mGM-CSF，BSA和TT。后续研究中，将抗GM-CSF抗体的结合与人GM-CSF，人间皮素(Mesothilin)，SEB，BGG，CAB，HEL，TT，BSA，山 羊IgG，人粘蛋白和小鼠IgG进行比较(数据未显示)。这两项研究中4E10只与人GM-CSF反应。 
为了确定E10的同种型，利用抗人IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgM，Lκ和Lλ进行标准分析以得出同种型。该分析显示4E10是IgG1和κ抗体(参见图9)。 
利用细胞系TF-1检测E10在体外中和GM-CSF生物活性的能力，所述TF-1依赖该细胞因子来存活和生长(参见图8)。人GM-CSF-依赖的人红白血病细胞系TF-1(ATCC，VA)在包含10ng/mL重组人GM-CSF(PeproTech，NJ)的完全RPMI 1640中生长。在实验前一天，TF-1细胞在无GM-CSF的0.1％FBS中生长。收集饥饿的TF-1细胞，用分析培养基(具有0.5％BSA的普通RPMI)洗涤两次。细胞悬浮在分析培养基中，以10,000细胞/孔的浓度种于96孔微孔板。所述孔包含任一种分析培养基、100pg/mL GM-CSF或者GM-CSF与浓度范围20μg/mL到0.315μg/mL的待测或者同种型对照Igs预孵育1小时。3天后，每孔添加40μl细胞滴定试剂(Promega，WI)，板在37℃继续孵育1小时。用分光光度计在490nm测量光密度(O.D.)，从所有样品中减去培养基背景。如下计算GM-CSF中和百分比：100-[有Ig的O.D./无Ig的O.D.)×100]。抗体4E10能够在体外以100pg/ml的浓度中和GM-CSF的活性。 
利用E10进行Western印迹分析以确定抗体是否与人重组GM-CSF交叉反应。如图10所示，在还原条件下E10与人GM-CSF交叉反应。 
为了测定E10的结合亲和力，如下进行BIACORE分析。E10的结合常数大约是870pM(图11)。 实施例4 对GM-CSF具有高度特异性的单克隆抗体G9的产生 
从肺泡蛋白沉积症(PAP)患者的B细胞与K6或者CBF-7的融合然后通过如上所述的ELISA筛选抗人GM-CSF单克隆抗体，产生抗GM-CSF人IgG1单克隆抗体G9。 
来自PAP患者(91ml全血)的血液用于分离总共4950万个PBMC。这些细胞的存活率是99.0％(数据未显示)。通过在cRPMI1640(10ml)中与饲养细胞一起培养大约2500万个PBMC，来扩增B细胞；所述cRPMI1640包含IL-42ng/ml(PeproTech)；转铁蛋白50μg/ml(Sigma)；PMA 5ng/ml(Sigma)；和环孢霉素A 0.5μg/ml(Sigma)。培养11天后，剩余1200万个细胞，随后通过电融合(CytoPulse CEEF-50)与骨髓瘤细胞进行融合。 
融合细胞在RPMI 1640(Invitrogen，CA，USA)中培养，所述RPMI 1640包含10％热灭活的FBS(JRH Biosciences，KS USA)；L-谷氨酰胺，200mM(Invitrogen，CA，USA)；非必需氨基酸，10mM(Invitrogen，CA，USA)；丙酮酸钠溶液，100mM(Invitrogen，CA，USA)；青链霉素(Invitrogen，CA，USA)；2-巯基乙醇，55mM(Invitrogen，CA，USA)；和1×HAT(Sigma，MO USA)。 
培养12天后，大约48％的杂交瘤培养物显示生长。随后，利用使用重组GM-CSF(PeproTech，NJ，USA)的GM-CSF特异性ELISA筛选杂交瘤。分离数个克隆，包括那些对GM-CSF阳性的。这些克隆再用ELISA检测以证实它们对重组GM-CSF特异，对破伤风毒素(TT)不特异。G9群显示与GM-CSF的高度特异性反应，但与TT没有。随后，亚克隆G9群以获得纯的培养物。3周后，通过ELISA筛选培养的亚克隆以证实对GM-CSF的特异性仍被保持，然后按照如下所述对亚克隆进行进一步表征。 
G9的表征。为了确定抗GM-CSF抗体G9的特异性，利用 一定范围的抗原进行抗原特异性EL1SA(图8)。图8比较了与下列抗原的结合：hIL-1a，hIL-2，hTL-3，hTL-4，hIL-5，IL-6，hIL-13，hGM-CSF，mGM-CSF，BSA和TT。后续研究中，将抗GM-CSF抗体与人GM-CSF，人间皮素，SEB，BGG，CAB，HEL，TT，BSA，山羊IgG，人粘蛋白和小鼠IgG的结合进行比较(数据未显示)。这两项研究中G9只与人GM-CSF反应。 
为了确定G9的同种型，利用抗人IgG，IgG1，IgG2，IgG3，IgM，Lκ和Lλ进行标准分析以得出同种型。该分析显示G9是IgG1和κ抗体(图12)。 
G9中和生物分析。利用细胞系TF-1检测G9在体外中和GM-CSF生物活性的能力，所述TF-1依赖该细胞因子来存活和生长(图4)。人GM-CSF-依赖的人红白血病细胞系TF-1(ATCC，VA)在包含10ng/mL重组人GM-CSF(PeproTech，NJ)的完全RPMI 1640中生长。在实验前一天，TF-1细胞在无GM-CSF的0.1％FBS中生长。收集饥饿的TF-1细胞，用分析培养基(具有0.5％BSA的普通RPMI)洗涤两次。细胞悬浮在分析培养基中，以10,000细胞/孔的浓度种于96孔微板。所述孔包含分析培养基、100pg/mL GM-CSF，或者包含GM-CSF，与浓度范围20μg/mL到0.315μg/mL的待测或者同种型对照Igs预孵育1小时。3天后，每孔添加40μl细胞滴定试剂(Promega，WI)，板在37℃继续孵育1小时。用分光光度计在490nm测量光密度(O.D.)，从所有样品中减去培养基背景。如下计算GM-CSF中和百分比：100-[有Ig的O.D./无Ig的O.D.)×100]。抗体G9能够在体外以100pg/ml的浓度中和GM-CSF的活性。 
利用G9进行Western印迹分析以确定抗体是否与人重组GM-CSF交叉反应。如图10所示，在还原条件下G9与人GM-CSF交叉反应。 
为了测定G9的结合亲和力，如上所述进行BIACORE分析。G9的结合常数大约是11-17pM(图13)。 实施例5 编码完全人抗GM-CSF抗体G9和E10的核苷酸序列 
抗体G9。通过标准方法获得完全人抗GM-CSF抗体G9的核苷酸和氨基酸序列。简单来说，按照制造商的说明书利用Trizol试剂(Invitrogen)从杂交瘤G9分离总RNA。按照制造商的说明书利用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)合成针对cDNA的信息。为了扩增轻链和重链可变区，利用对应轻链的引物SEQ ID NO：22和SEQ IDNO：23以及对应重链的引物SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，使用Herculase DNA聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。PCR产物被克隆入pCR4-TOPO载体(Invitrogen)，转化到大肠杆菌(E.coli)Mach1细胞中，在LB卡那霉素板上筛选转化体。利用TempliPhi试剂(GEHealthcare)，针对具有如上所述相同引物对的插入片段对集落进行筛选，4个阳性集落每一个都用来产生用于DNA序列测定的模板DNA。利用Beckman Coulter DTCS测序试剂，用引物SEQ ID NO：26和SEQ IDNO：27对DNA插入片段进行测序，然后在Beckman Coulter CEQ2000上进行数据获取和分析。为了给轻链添加前导肽序列，利用HerculaseDNA聚合酶，以引物SEQ ID NO：28和SEQ ID NO：23对阳性克隆进行再扩增。为了产生包括前导肽序列的全长重链(SEQ ID NO：11)，利用原始cDNA作为模板，以引物SEQ ID NO：29和SEQ ID NO：30进行PCR。所获PCR产物进行TA克隆，转化入Mach1细胞，如上所述鉴定阳性克隆。利用TempliPhi试剂产生的模板DNA，以引物SEQ IDNO：25，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：33，SEQ ID NO：34，SEQ ID NO：27和SEQ ID NO：30对全长G9重链cDNA进行测序。所获的G9全长重链(SEQ ID NO：11)和G9全长轻链的DNA序列(SEQ ID NO：15)显示如下。从SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：15衍生的预测翻译产物分别显示于SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：13。从SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：14衍生的预测翻译产物分别显示于SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：12。SEQ ID NO：11和15的下划线序列表示通过PCR添加的前导序列。SEQ ID NO：10和14的多核苷酸序列分别编码G9抗体的重链和轻链，不含添加的前导序列。SEQ ID NO：9和13的小写字母序列表示通过PCR反应添加的人前导肽序列。SEQ ID NO：8，9，12和13的下划线序列表示CDR区。SEQ ID NO：8，9，12和13的剩余序列是可变区和恒定区的框架。重链恒定区起始于氨基酸序列WGQG(SEQ ID NO：8的氨基酸111或者SEQ ID NO：9的氨基酸130)，轻链恒定区起始于氨基酸序列FGQG(SEQ ID NO：12的氨基酸98或者SEQ ID NO：13的氨基酸117)。 
抗体E10。通过标准方法获得完全人抗GM-CSF抗体E10的核苷酸和氨基酸序列。简单来说，按照制造商的说明书利用Trizol试剂(Invitrogen)从杂交瘤E10分离总RNA。按照制造商的说明书，利用Superscript II逆转录酶(Invitrogen)，合成针对cDNA的信息。为了扩增轻链和重链可变区，利用对应轻链的引物SEQ ID NO：22和SEQ ID NO：23以及对应重链的引物SEQ ID NO：24和SEQ ID NO：25，使用Herculase DNA聚合酶(Stratagene)进行PCR反应。PCR产物被克隆入pCR4-TOPO载体(Invitrogen)，转化入大肠杆菌Mach1细胞，在LB卡那霉素板上筛选转化体。利用TempliPhi试剂(GE Healthcare)，针对具有如上所述相同引物对的插入片段对集落进行筛选，4个阳性集落每一个都用来产生用于DNA序列测定的模板DNA。利用BeckmanCoulter DTCS测序试剂，用引物SEQ ID NO：26和SEQ ID NO：27对DNA插入片段进行测序，然后在Beckman Coulter CEQ2000进行数据获取和分析。所获的编码E10重链可变区的DNA序列(SEQ ID NO：17)和E10全长轻链(SEQ ID NO：19)的DNA序列显示如下。从SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：19衍生的预测翻译产物分别显示于SEQ ID NO：16和SEQ ID NO：18。SEQ ID NO：16和18的下划线序列表示CDR区。SEQID NO：16和18的剩余序列是可变区和恒定区的框架。重链恒定区起始于氨基酸序列WGQG(SEQ ID NO：16的氨基酸115)，轻链恒定区起始于氨基酸序列FGQG(SEQ ID NO：18的氨基酸98)。 实施例6 抗GM-CSF抗体的表位作图 
为绘制与G9结合的GM-CSF表位，产生了一系列重叠的肽，所述肽跨越人GM-CSF的长度(图14)。简单来说，设计包括人GM-CSF序列(GenBank登陆号#AAA52578，残基14到144)的25个重叠12-mer肽以包含7个氨基酸重叠。通过每个肽的C端连接到衍生纤维素膜(SPOTs技术，Sigma Genosys)的表面，由固相合成将肽制备为3.7mm×3.7mm的个体斑点。利用标准Western印迹分析以确定哪个肽与G9交叉反应(图15)。纤维素膜在甲醇中湿润，4℃在封闭溶液(5％BSA，1×TBS，0.1％Tween-20，0.1％NaN3)中封闭过夜。添加包含1mg/ml纯化的10G9抗体的新鲜封闭溶液，印迹在4℃孵育过夜。印迹在TBS-T(1×TBS，0.1％Tween-20)中印迹3次，每次5分钟，并在用稀释剂(5％BSA，1×TBS，0.1％Tween-20)1∶10,000稀释的HRP-偶联山羊抗人IgG(H+L)(Jackson ImmunoResearch cat.109-035-088)中孵育1小时。利用SuperSignal West Femto ECL底物试剂盒(Pierce cat.34095)对印迹显影，然后对BioMAX膜(Kodak)曝光一秒钟。利用该方法，肽#6，13，14，15和可能的肽#23均被G9抗体特异识别，其分别对应于SEQID NO：18，SEQ ID NO：19，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：21和SEQ IDNO：47。 
本发明不限于以上描述和举例说明的实施方式，但是可以在所属权利要求的范围内进行变化和修饰。 
序列表： 
SEQ ID NO：1： 
MWLQSLLLLGTVACSISAPARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE 
SEQID NO：2： 
APARSPSPSTQPWEHVNAIQEARRLLNLSRDTAAEMNETVEVISEMFDLQEPTCLQTRLELYKQGLRGSLTKLKGPLTMMASHYKQHCPPTPETSCATQIITFESFKENLKDFLLVIPFDCWEPVQE 
SEQ ID NO：3：EHVNAIQEARRLLNL 
SEQ ID NO：4：STQPWEHVNAIQEAR 
SEQ ID NO：5：MASHYKQHCPPTPET 
SEQ ID NO：6：LSTAVKELVENSLDAGATNIDLKLKDYGVDLIEVSDNGCGVEEENFE 
SEQ ID NO：7：LRQVLSNLLDNAIKYTPEGGEITVSLERDGDHLEITVEDNGPGIPEEDLE 
SEQ ID NO：8：G9 Predicted Heavy Chain Amino Acid Sequence 
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRHWMHWLRQVPGKGPVWVSRINGAGTSITYADSVRGRFTISRDNANNTLFLQMNSLRADDTALYFCARANSVWFRGLFDYWGQGTPVTVSSASTKGPS VFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK＊
SEQ ID NO：9：G9 Predicted Heavy Chain Amino Acid Sequence (w/Leader) 
mgwsciilflvatatgvhsEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRHWMHWLRQVPGKGPVWVSRINGAGTSITYADSVRGRFTISRDNANNTLFLQMNSLRADDTALYFCARANSVWFRGLFDYWGQGTPVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK＊
SEQ ID NO：10：G9 Heavy Chain Nucleic Acid Sequence 
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGACACTGGATGCACTGGCTTCGCCAGGTTCCAGGTAAGGGGCCGGTCTGGGTCTCACGTATCAATGGTGCTGGGACTTCCATAACCTACGCGGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAACAACACACTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGACGACACGGCTCTTTATTTCTGTGCAAGAGCGAACAGCGTCTGGTTCCGGGGCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCA AAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGA 
SEQ ID NO：11：G9 Heavy Chain Nucleic Acid Sequence (w/Leader) 
aagcttgccgccaccATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTTCAGCCGGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGACACTGGATGCACTGGCTTCGCCAGGTTCCAGGTAAGGGGCCGGTCTGGGTCTCACGTATCAATGGTGCTGGGACTTCCATAACCTACGCGGACTCCGTGAGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAACAACACACTGTTTCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCCGACGACACGGCTCTTTATTTCTGTGCAAGAGCGAACAGCGTCTGGTTCCGGGGCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCCGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCCGGGAAATGAgaattc
SEQ  ID NO：12：G9 Predicted Light Chain Amino Acid Sequence 
EIVLTQSPVTLSVSPGERVTLSCRASQSVSTNLAWYQQKLGQGPRLLIYGASTRATDIPARFSGSGSETEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPDTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSG TASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC＊
SEQ ID NO：13：G9 Predicted Light Chain Amino Acid Sequence (w/Leader) 
mgwsciilflvatatgvhsEIVLTQSPVTLSVSPGERVTLSCRASQSVSTNLAWYQQKLGQGPRLLIYGASTRATDIPARFSGSGSETEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYDKWPDTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC＊
SEQ ID NO：14 G9 Light Chain Nucleic Acid Sequence 
GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGTCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGTCACTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCACCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACTTGGCCAGGGTCCCAGGCTCCTCATTTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGATATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGAGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATGATAAGTGGCCGGACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA 
SEQ ID NO：15 G9 Light Chain Nucleic Acid Sequence (w/Leader) 
aagcttgccgccacCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCAGTCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGGGAAAGAGTCACTCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCACCAACTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACTTGGCCAGGGTCCCAGGCTCCTCATTTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGATATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGAGACAGAGT TCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTCTGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAATATGATAAGTGGCCGGACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGAC TACGAGAAACACA AAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGTTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAAgaattc
SEQ ID NO：16 Predicted E10 Heavy Chain Amino Acid Sequence 
QVQLEESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFTNYGMHWVRQAPGKGLEWLALISYDGNRQYYADSVKGRFTVSRDNPNNTLHLEMKSLRAEDSAIYYCARGAGVLLWFGDLSWFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVD 
SEQ ID NO：17 E10 Heavy Chain Nucleic Acid Sequence 
CAGGTACAGCTGGAGGAGTCAGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTCAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCACCTTCACTAATTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGACTCGAGTGGCTGGCACTCATATCCTATGATGGAAATAGGCAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATCCCAACAACACACTGCATCTGGAGATGAAGAGCCTGCGAGCCGAAGACTCGGCTATATATTACTGTGCGAGAGGGGCTGGGGTATTACTGTGGTTCGGCGACTTATCCTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGAC 
SEQ ID NO：18 Predicted E10 Light Chain Amino Acid Sequence 
DIQMTQSPSNLSASVGDRVTITCRASQNINTWLAWYQHKPGKPPKLRIYQASTLESGVPSRFSGSGSGTIFTLTISSLQPDDFGTYYCQQNNSYPYTFGQGTKLEINRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSMDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 
SEQ ID NO：19 E10 Light Chain Nucleic Acid Sequence 
GATATCCAGATGACCCAGTCTCCTTCCAACCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACAATCACTTGTCGGGCCAGTC AAATATTAATACCTGGCTGGCCTGGTATCAGCACAAACCAGGGAAACCCCCTAAGCTCCGGATATATCAGGCGTCTACGTTAGAAAGTGGGGTCCCTTCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACGATATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGGAACTTATTACTGCCAACAGAATAATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAACCGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGA ACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCATGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA 
SEQ ID NO：20：TCACCATCCATTGCACAGTT 
SEQ ID NO：21：CTGCGAGAAGGTACTCACCC 
SEQ ID NO：22：GAHRTYSWGHTGACBCAGTCTCC 
SEQ ID NO：23： 
GATCGAATTCTTAACACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGCTCAGGCC 
SEQ ID NO：24：AGGTRCAGCTGBWGSAGTCDG 
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SEQID NO：28： 
GATCGGATCCGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCGAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC 
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SEQ ID NO：30： 
GATCGGATCCAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 
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SEQ ID NO：63 (E10 L FWR3) GVPSRFSGSGSGTIFTLTISSLQPDDFGTYYC 
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Claims (25)

1.一种分离的特异性结合GM-CSF的人单克隆抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:40的CDR1、SEQ IDNO:41的CDR2和SEQ ID NO:42的CDR3，而所述轻链包括SEQ IDNO:43的CDR1、SEQ ID NO:44的CDR2和SEQ ID NO:45的CDR3，其中所述抗体对人GM-CSF的结合亲和力至少对应于17pM的解离常数。
2.权利要求1的抗体，其中所述抗体包括如SEQ ID NO:8的氨基酸1-110所示的重链可变结构域和如SEQ ID NO:12的氨基酸1-97所示的轻链可变结构域。
3.权利要求1的抗体，其中所述抗体包括如SEQ ID NO:8的氨基酸序列所示的重链和如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的轻链。
4.一种组合物，其包含权利要求1的抗体和药学上可接受的载体。
5.一种多核苷酸，其编码权利要求1的抗体。
6.权利要求5的多核苷酸，其中重链由如SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列编码，或者其中轻链由如SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列编码。
7.一种载体，其包括权利要求5的多核苷酸序列。
8.一种细胞，其表达权利要求1的抗体。
9.权利要求8的细胞，其中所述细胞是杂交瘤。
10.有效量的治疗GM-CSF介导的炎性疾病的组合物在制备在对象中治疗GM-CSF-介导的炎性疾病的药物中的应用，所述组合物包括药学上可接受的载体和至少一种特异性结合GM-CSF的抗体，其中所述抗体包括重链和轻链，所述重链包括SEQ ID NO:40的CDR1、SEQ IDNO:41的CDR2和SEQ ID NO:42的CDR3，而所述轻链包括SEQ IDNO:43的CDR1、SEQ ID NO:44的CDR2和SEQ ID NO:45的CDR3，所述抗体对人GM-CSF的结合亲和力至少对应于17pM的解离常数。
11.权利要求10的应用，其中所述对象是人。
12.权利要求10的应用，其中所述抗体包括如SEQ ID NO:8的氨基酸1-110所示的重链可变结构域和如SEQ ID NO:12的氨基酸1-97所示的轻链可变结构域。
13.权利要求10的应用，所述抗体包括如SEQ ID NO:8的氨基酸序列所示的重链和如SEQ ID NO:12的氨基酸序列所示的轻链。
14.权利要求10的应用，其中所述GM-CSF-介导的炎性疾病是类风湿性关节炎,多发性硬化症,哮喘,肺泡蛋白沉积症,结肠癌，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，或者白血病。
15.权利要求14的应用，其中所述白血病是幼年型粒-单核细胞性白血病。
16.一种制备权利要求1的抗体的方法，包括在适于生成抗体的条件下培养权利要求8或9的宿主细胞，并从细胞培养物中回收抗体。
17.权利要求1的抗体在制备用于在炎性疾病患者中抑制人GM-CSF生物活性的药物中的应用。
18.权利要求17的应用，其中所述炎性疾病是类风湿性关节炎,多发性硬化症或哮喘。
19.权利要求1的抗体在制备用于在癌症患者中抑制人GM-CSF生物活性的药物中的应用。
20.权利要求19的应用，其中所述癌症是白血病。
21.权利要求19的应用，其中所述癌症是幼年型粒-单核细胞性白血病。
22.权利要求19的应用，还包括给所述患者施用化疗剂。
23.权利要求22的应用，其中所述抗体与所述化疗剂偶联。
24.权利要求1的抗体在制备用于在感染性疾病患者中抑制人GM-CSF生物活性的药物中的应用。
25.权利要求24的应用，其中所述感染性疾病是脓毒性休克。
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