CN101622275A - 提供疾患特异性结合分子和靶的方法 - Google Patents

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Abstract

提供了识别疾患相关蛋白新表位的新的特异性结合分子、特别是人抗体及其片段、衍生物和变体，所述疾患相关蛋白来自天然的内源蛋白，但在患者体内以变体形式和/或脱离其正常生理环境普遍存在。另外，描述了包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物组合物和筛选治疗诸如阿尔茨海默病的神经疾病的新的结合分子(可以是或可以不是抗体)和靶的方法。

Description

提供疾患特异性结合分子和靶的方法
技术领域
本发明涉及识别蛋白的疾患相关表位(包括新表位)的新的特异性结合分子，特别是人抗体及其片段、衍生物和变体，所述蛋白来自天然的内源蛋白，并且在患者体内以变体形式和/或脱离其正常生理环境普遍存在。另外，本发明涉及包含此类结合分子、抗体及其模拟物的药物组合物和筛选治疗各种疾病、特别是神经疾病(诸如阿尔茨海默病、淀粉样蛋白病和β-淀粉样蛋白病变)的新的结合分子(可以是或可以不是抗体)、靶和药物的方法。
背景技术
成功产生单克隆抗体依赖于抗原刺激的B细胞与鼠骨髓瘤细胞系的有效和选择性融合，然后选择产生杂交体的稳定的抗体，最初描述于
Figure A20088000629400101
和Milstein，Nature 256(1975)，495-497。然而，鉴于其非人来源，基于鼠的抗体在人中的治疗效用受限于人抗鼠抗体(HAMA)应答。通过遗传工程可获得用于制备人或类人单克隆抗体的方法。然而，迄今可用的方法具有以下缺点：它们不适合用来产生具有在生理的人类免疫应答过程中产生的抗体的特征的抗体。此外，由于在具有正常生理功能的情况下与其他蛋白和/或靶蛋白的交叉反应性，此类抗体可能不够特异。例如，在阿尔茨海默病或帕金森病中，认为还以高亲和力与淀粉样前体蛋白(APP)或α突触核蛋白的生理衍生物交叉反应的抗体表现出与生理靶结构的正常功能相关的副作用。在这方面，不希望的自身免疫病将完全被诱导-一种在采用生理上也存在变体形式的蛋白结构的主动免疫实验的方案设计中几乎不可估算的危险。与靶结构无关的副作用是例如过敏反应，其被预期为系统性施用外源蛋白的不希望的和可怕的副作用。根据近来的发现，在最初来自非人生物(通常来自小鼠)的所谓人源化抗体中也能发生这种情况。另一方面，病理相关抗原的主动免疫具有相当大的患者发展也识别此类蛋白的生理变体的抗体和T细胞应答的危险，并且因此导致危险的和不可控制的自身免疫应答。
因此，需要提供特异于疾病涉及的靶并被人体耐受的物质。
发明内容
发明概述
本发明的一个目的是一种用于鉴定、验证和产生诊断上和治疗上有用的结合分子，特别是针对内源蛋白的病理变体的抗体的方法。更具体地，本发明涉及分离疾患相关蛋白特异性结合分子的方法，其包括：
(a)使获自无症状，或临床上异常稳定，但患有疾病或处于发展疾病危险的患者的样品经受具有预定病理特征的病理改变的细胞或组织的试样；和
(b)鉴定并任选地分离与所述试样结合，但不与可来自健康对象的没有此类病理特征的对应细胞或组织结合的结合分子。
已知的事实是，在自身免疫病中，抗体针对自体细胞和由所述细胞表达的蛋白或诸如糖脂的其他化合物，同时避开已知的耐受机制。同样已知的事实是，在内源赘生性发展中，赘生性细胞的细胞和体液免疫可发展，并且因此可影响针对赘生性组织变性的内源免疫保护机制。
本发明利用抗体也可针对内源蛋白的病理生理相关变体，特别是针对新表位的惊人发现，所述新表位是由于病理改变的转录、翻译、或转录后或翻译后修饰、或蛋白酶解加工、或聚集而形成的。此类抗体针对由于其偏离正常生理的新结构通过发展病理效应而变得与病理生理相关的内源蛋白。然而，由于免疫耐受，在此类病理变体中与对新表位的对应免疫应答有关的抗体未正常表现出针对生理功能性蛋白的任何交叉反应，这与自身免疫病中的情况相反。这是因为潜在交叉反应性抗体的形成被已知的耐受机制特异地抑制，而对病理新表位的免疫应答的发展可逃避耐受。
因此，本发明涉及通过与可识别病理结构的相互作用而从临床上预选的人类对象中鉴定诊断上、治疗上和预防上有活性的结合分子，特别是抗体和抗体片段的新方法。
因此，本发明涉及能识别疾患相关蛋白的表位(包括新表位)的抗体或抗原结合片段和相似的抗原结合分子，所述疾患相关蛋白来自天然的内源蛋白，并且在患者体内以变体形式(例如作为病理蛋白)和/或脱离其正常生理环境普遍存在。此外，本发明涉及包含所述抗体的组合物，以及使用该组合物的免疫治疗和免疫诊断方法。
此外，在抗体鉴定中，根据本发明的方法可无需事先假设其分子靶结构的身份，而只是通过其与病理相关结构的结合来执行。除了因此可能鉴定迄今未知的、特定疾患的分子靶结构外，专门针对病理结构的抗体的进一步优势基于它们的药物动力学有效性不受与非疾患组织结合以使抗体的浓度和吸收效应被缓冲因此妨碍治疗有效浓度的确定的方式负面影响的事实。此外，本发明的抗体和结合分子优选特征在于它们分别在体内与疾患相关蛋白的变体形式或与细胞或细胞膜反应，并且在具有病理特征的疾患组织的切片上，但不与或显著更少程度地与同族蛋白的生理变体反应；还参见，例如，实施例2。
由于本发明允许在疾患细胞和组织中鉴定和分离分子靶结构，进一步的实施方案分别涉及由本发明的新表位特异抗体结合的抗原和病理蛋白(即疾患相关蛋白)。
特别优选的实施方案是证明特征为下文表2和3所述的可变区VH和/或VL的任一抗体的免疫结合特征的人抗体或其抗原结合片段。可选地，抗体是人源化、异源、或嵌合人-鼠抗体，后者特别用于动物的诊断方法和研究。包括抗体或其活性片段、或激动剂和同族分子、或可选地(alternately)其拮抗剂的治疗性组合物、此类组合物在使用这些组合物预防、诊断或治疗疾患中的用途方法也包括在本发明中，其中将有效量的组合物施用于需要此类治疗的患者。
抗体的抗原结合片段可以是单链Fv片段、F(ab′)片段、F(ab)片段和F(ab′)2片段、或任何其他抗原结合片段。在下文特定的实施方案中，抗体或其片段是人IgG同种型抗体。
自然地，本发明分别扩展至产生具有下文限定的特殊和独特特征的抗体的永生化人类B记忆淋巴细胞和B细胞。
本发明还涉及编码本发明的抗体的免疫球蛋白链的至少可变区的多核苷酸。优选地，所述可变区包括下文表2和3所述的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)。CDR的对应组在下文表4中给出。
相应地，本发明还包括包含所述多核苷酸的载体和用其转化的宿主细胞，以及它们用于产生特异于指示和/或引起疾病(特别是脑疾病，诸如阿尔茨海默病和帕金森病)的新表位的抗体和等效结合分子的用途。
抗体、免疫球蛋白链、其结合片段和与所述抗体结合的抗原可分别用在药物组合物和诊断组合物中用于免疫治疗和诊断。然而前述组合物在制备药剂中的用途是优选的。
因此，本发明的特定目的是提供用于治疗或预防特征为中枢神经系统中蛋白的异常积累和/或沉积并且不干扰相应蛋白的天然功能的神经疾病的方法。该方法包括将有效浓度的抗体或抗体衍生物施用于对象，其中抗体与蛋白的病理形式或蛋白沉积物的结合亲和力显著高于与蛋白的正常生理形式的结合亲和力。在优选实施方案中，本发明提供了用于治疗或预防或减缓对象中与淀粉样蛋白β肽的积累和沉积相关疾患的发病的方法，所述疾患诸如阿尔茨海默病、唐氏综合征、轻度认知损害、脑淀粉样蛋白血管病、血管性痴呆、多发性梗死性痴呆。该方法包括将有效浓度的抗体或抗体衍生物施用于对象，其中抗体与蛋白的病理形式或蛋白沉积物的结合亲和力高于与蛋白的正常生理形式的结合亲和力。相似的治疗性方法预计用于治疗帕金森病、亨廷顿病、克雅病(Creutzfeldt-Jakobdisease)、囊性纤维化、高雪病(Gaucher’s disease)和类似疾病。
根据以下的说明书，本发明的其他实施方案将是明显的。
附图简述
图1：针对β-淀粉样蛋白的抗体。A：人抗体。B：用针对人β-淀粉样蛋白的已知抗体的对照染色。患有阿尔茨海默病的临床上异常稳定的患者含有针对β-淀粉样蛋白斑块的抗体。用来自临床上异常稳定的患者的抗体对获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色揭示了与由针对人β-淀粉样蛋白的已知抗体确认的β-淀粉样蛋白斑块结合的抗体。
图2：针对神经原纤维缠结的抗体。A：人抗体。B：用针对人tau的已知抗体的对照染色。健康的人类对象含有针对神经原纤维缠结的抗体。用来自健康对象的抗体对获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色揭示了与由针对人tau的已知抗体确认的神经原纤维缠结结合的抗体。
图3：针对营养不良性轴突的抗体。A：人抗体。B：用针对人tau的已知抗体的对照染色。健康的人类对象含有针对营养不良性轴突的抗体。用来自健康对象的抗体对获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色揭示了与营养不良性轴突结合的抗体。
图4：针对β-淀粉样蛋白的抗体。该图显示从临床上异常稳定的阿尔茨海默病患者中分离的重组人NI-101.11抗体与脑β-淀粉样蛋白斑块的特异性结合。获自患有神经病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片用指示浓度的重组人抗体染色。50pM浓度的抗体与β-淀粉样蛋白斑块的结合暗示了高亲和力的结合。
图5：线性的合成N-末端Aβ多肽不竞争重组人NI-101.11抗体与β-淀粉样蛋白斑块的结合。代表位置1至16的可达1μM浓度的N-末端Aβ-衍生多肽不能竞争针对脑β-淀粉样蛋白的重组抗体(0.5nM)的结合。
图6：重组人NI-101.11抗体识别单体Aβ中不存在的构象Aβ表位。Aβ1-42原纤维而不是线性的合成Aβ1-42单体可竞争脑切片上NI-101.11与β-淀粉样蛋白斑块的结合。
图7：蛋白质印迹上重组人NI-101.11抗体不与线性、单体的合成Aβ结合。单体Aβ制品通过非变性PAGE分离。印迹蛋白用针对β-淀粉样蛋白的人重组抗体和针对N-末端线性Aβ序列的对照抗体(6E10)来探测。没有检测到NI-101.11与单体Aβ的结合。这一观察暗示该抗体识别构象Aβ表位。
图8：人NI-101.11抗体结合从合成的Aβ1-42肽制备的人工淀粉样蛋白原纤维。以同样包被密度包被于ELISA板上的合成的Aβ原纤维或单体的合成Aβ与指示浓度的针对脑β-淀粉样蛋白的重组人抗体一起孵育。针对脑β-淀粉样蛋白的人抗体与人工淀粉样蛋白原纤维的结合活性(空心方块)比单体Aβ(实心方块)高100多倍。对照抗体22C4优先与单体Aβ(实心圆圈)结合，而与原纤维(空心圆圈)结合得不太好。这暗示NI-101.11识别也存在于从合成的Aβ肽制备的人工淀粉样蛋白原纤维上的构象表位。
图9：重组人NI-101.11抗体与细胞全长APP或者存在于培养细胞中的任何其生理衍生物没有交叉反应性。与结合细胞表面APP的对照抗体(6E10)相反，NI-101.11不与存在于细胞表面的全长APP结合。这些数据说明NI-101.11与生理的细胞全长APP没有交叉反应性。
图10A-C：通过大小排阻层析NI-101.11不与单体Aβ结合。图10A和10B显示NI-101.11或不相关的对照抗体不与单体FITC-标记的Aβ1-42结合，而图10C显示识别存在于Aβ的C-末端的线性表位的抗体22C4的显著结合。
图11：竞争性ELISA显示与过量浓度的单体Aβ肽预孵育后，抗体6E10(针对Aβ的N-末端的线性表位的抗体)的结合可被完全阻抑，而与过量浓度的这些单体Aβ肽制品的预孵育没有破坏NI-101.11的结合。
图12：NI-101.13A和NI-101.13B与获自阿尔茨海默病的Tg2676转基因小鼠模型的脑切片的结合。
图13：ELISA显示与单体Aβ相比，NI-101.13A和NI-101.13B优先结合人工淀粉样蛋白原纤维。
图14A-B：图14A显示ELISA中重组NI-101.12与合成的Aβ1-42肽的结合。图14B显示过量的Aβ1-42肽竞争NI-101.12的结合。
图15：在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，针对脑β-淀粉样蛋白的重组人NI-101.11抗体穿越血脑屏障，并在体内与脑β-淀粉样蛋白斑块结合。
图16A-B：在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，重组人NI-101.11抗体改善了异常认知行为。24个月大的arcAβ小鼠每周用3mg/kg抗体i.p.治疗2个月。在治疗完成之前和之后进行Y-迷宫行为测试。
图17：通过外周施用NI-101.11的淀粉样蛋白斑块的血脑屏障穿透和修饰(decoration)。在NI-101.11治疗小鼠中(左图)，NI-101.11可穿越血脑屏障，并与β-淀粉样蛋白沉积物结合，而在用人对照抗体治疗的动物中(右图)，没有此类染色可见。在系统性治疗两个月之后，重组人NI-101.11抗体减少了脑β-淀粉样蛋白斑块的负载。
图18：用NI-101.11的被动免疫减少了arcAβ小鼠中β-淀粉样蛋白的负载。(A，B)硫代黄素S和刚果红斑块负载分析揭示了与对照抗体治疗的动物相比超过50％的显著减少(曼-惠特尼U；ThioS：皮层p＝0.02，海马p＝0.009，和刚果红分析：皮层p＝0.009，海马p＝0.04)。比例尺：200μm。(C-E)硫代黄素S分析揭示了与对照治疗的动物相比，NI-101.11治疗的arcAβ小鼠中β-淀粉样蛋白负荷(C)、β-淀粉样蛋白斑块的数目(D)和平均斑块大小(E)的显著减少。曼-惠特尼U统计：皮层斑块面积p＝0.02；海马斑块面积p＝0.009；皮层斑块数目p＝0.047；海马斑块数目p＝0.047；皮层斑块大小p＝0.009；海马斑块数目p＝0.009。
图19：减少的β-淀粉样蛋白负载伴随着减少的星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生。A)抗GFAP染色的定量揭示，当与对照治疗的转基因动物相比时，NI-101.11治疗的arcAβ小鼠皮层中反应性星形胶质细胞数目的显著减少。B)Iba-1染色的定量显示在NI-101.11治疗的小鼠皮层和海马中倾向于减少数目的活化小胶质细胞。比例尺：200μm。
图20：用重组人NI-101.11抗体治疗两个月后，脑微出血没有增加。患有已证实的块状嗜刚果红淀粉样蛋白血管病的24个月大的arcAβ小鼠每周用3mg/kg抗体i.p.治疗2个月。arcAβ小鼠脑微出血的代表图片由Perl氏普鲁士蓝染色显示(左侧)。定量分析说明与其野生型同窝小鼠相比，arcAβ转基因小鼠中显著增加的微出血(micorhemorrhages)频率。用NI-101.11的慢性治疗没有导致微出血(micorhemorrhages)频率的增加。比例尺：20μm。
图21：重组人NI-101.11抗体在体外抑制合成的Aβ原纤维的形成。重组人NI-101.11抗体对Aβ原纤维形成的影响通过荧光分析测量与聚集的Aβ结合的硫代黄素S来测定。
图22：BV-2小胶质细胞中抗体-介导的剂量依赖性的FITC-Aβ1-42原纤维的吞噬作用在抑制了清除受体系统后测量。NI-101.11触发强有力的剂量依赖性的Fcγ受体-介导的Aβ原纤维的吞噬作用。
发明详述
I.定义
应注意，术语“一个(a)”或“一个(an)”实体指一个或多个该实体；例如，“一个抗体(an antibody)”理解为代表一个或多个抗体。因此，术语“一个(a)”(或“一个(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文可互换使用。
如本文所用，术语“多肽”预期包括单个“多肽(polypeptide)”以及两个以上“多肽(polypeptides)”，并且指主要由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)组成的分子。术语“多肽”指两个或多个氨基酸的任一条或几条链，并且不指特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用来指两个或多个氨基酸的一条或几条链的任何其他术语都包括在定义“多肽”内，并且术语“多肽”可代替或与任何这些术语互换使用。
术语“多肽”也意指多肽的表达后修饰产物，包括但不限于已知保护/封闭基团的糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、或非天然存在的氨基酸的修饰。多肽可来自天然生物来源或通过重组技术产生，但不是必然地从指定的核酸序列翻译而来。多肽可以任何方式产生，包括通过化学合成。
本发明的多肽的大小可以是约3个或更多、5个或更多、10个或更多、20个或更多、25个或更多、50个或更多、75个或更多、100个或更多、200个或更多、500个或更多、1000个或更多、2000个或更多个氨基酸。多肽可以具有确定的三维结构，尽管它们不必然地具有这样的结构。具有确定三维结构的多肽被称为折叠的，而不具有确定三维结构而是可采用多种不同构象的多肽被称为未折叠的。如本文所用，术语糖蛋白指与通过氨基酸残基(例如，丝氨酸残基或天冬酰胺残基)的含氧或含氮侧链与蛋白相连的至少一个碳水化合物部分偶联的蛋白。
“分离”多肽或其片段、变体或衍生物意指不处于其天然环境的多肽。不需要特定水平的纯化。例如，分离多肽可从其天然或自然环境脱离。为了本发明的目的，在宿主细胞中表达的重组产生的多肽和蛋白被认为是分离的，通过任何适合的技术而分离、分级分离、或部分或基本纯化的天然或重组多肽也被认为是分离的。
本发明的多肽还包括前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体及其任何组合。当指本发明的抗体或抗体多肽时，术语“片段”、“变体”、“衍生物”和“类似物”包括保留对应的天然结合分子、抗体或多肽的抗原结合特性的至少一些的任何多肽。本发明的多肽片段包括蛋白水解片段和缺失片段，以及在本文其他地方讨论的特定抗体片段。本发明的抗体和抗体多肽的变体包括上述片段，还包括由于氨基酸置换、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。变体可以天然存在或者是非天然存在的。非天然存在的变体可使用本领域已知的诱变技术产生。变体多肽可包含保守或非保守的氨基酸置换、缺失或添加。新表位特异性结合分子(例如本发明的抗体和抗体多肽)的衍生物是已被改变以便表现出未发现于天然多肽的其他特点的多肽。实例包括融合蛋白。变体多肽在本文也称为“多肽类似物”。如本文所用，结合分子或其片段、抗体或抗体多肽的“衍生物”指具有通过功能性侧基的反应而化学衍生化的一个或多个残基的主题多肽。“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸的一种或多种天然存在的氨基酸衍生物的那些肽。例如，4-羟脯氨酸可置换脯氨酸；5-羟赖氨酸可置换赖氨酸；3-甲基组氨酸可置换组氨酸；同型丝氨酸可置换丝氨酸；鸟氨酸可置换赖氨酸。
术语“多核苷酸”预期包括单个核酸以及两个以上的核酸，并且指分离核酸分子或构建体，例如，信使RNA(mRNA)或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规的磷酸二酯键或非常规的键(例如，酰胺键，诸如发现于肽核酸(PNA)中)。术语“核酸”指存在于多核苷酸的任一个或多个核酸区段，例如，DNA或RNA片段。“分离”核酸或多核苷酸意指从其天然环境脱离的核酸分子(DNA或RNA)。例如，为了本发明的目的，包含于载体中的编码抗体的重组多核苷酸被认为是分离的。分离多核苷酸的其他实例包括保持于异源宿主细胞中的重组多核苷酸或溶液中的纯化(部分或基本纯化的)多核苷酸。分离的RNA分子包括本发明的多核苷酸的体内或体外RNA转录物。根据本发明的分离多核苷酸或核酸进一步包括合成产生的此类分子。另外，多核苷酸或核酸可以是或可以包括调节元件，诸如启动子、核糖体结合位点、或转录终止子。
如本文所用，“编码区”是由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸的一部分。尽管“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，其可被认为是编码区的一部分，但是例如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子以及类似序列的任何侧翼序列不是编码区的一部分。本发明的两个或多个编码区可存在于单个多核苷酸构建体中(例如，在单个载体上)，或在分开的多核苷酸构建体中(例如，在分开的(不同的)载体上)。此外，任何载体可含有单个编码区，或可包含两个或多个编码区，例如，单个载体可分别编码免疫球蛋白的重链可变区和免疫球蛋白的轻链可变区。另外，本发明的载体、多核苷酸、或核酸可编码与编码结合分子、抗体、或其片段、变体、或衍生物的核酸融合或不融合的异源编码区。异源编码区包括但不限于特定的元件或基序，诸如分泌信号肽或异源功能性结构域。
在某些实施方案中，多核苷酸或核酸是DNA。在DNA的情况中，包含编码多肽的核酸的多核苷酸正常可包括启动子和/或可操作地与一个或多个编码区相连的其他转录或翻译控制元件。可操作连接是基因产物(例如，多肽)的编码区与一个或多个调节序列以使基因产物的表达置于调节序列的影响或控制下的方式相连。如果启动子功能的诱导引起编码需要的基因产物的mRNA的转录，以及如果两个DNA片段之间的键合性质不干扰表达调节序列指引基因产物表达或不干扰DNA模板被转录的能力，那么两个DNA片段(诸如多肽编码区和与其结合的启动子)是“可操作连接”。因此，如果启动子能影响该核酸的转录，那么启动子区将与编码多肽的核酸可操作连接。启动子可以是指引DNA仅在预定细胞中基本转录的细胞特异性启动子。除启动子外，其他转录控制元件(例如增强子、操纵子、阻遏子和转录终止信号)可与多核苷酸可操作地连接以指引细胞特异性转录。适合的启动子和其他转录控制区公开于本文。
多种转录控制区对本领域技术人员是已知的。这些转录控制区包括但不限于在脊椎动物细胞中起作用的转录控制区，诸如但不限于，来自巨细胞病毒(即时早期启动子，连同内含子-A)、猿猴病毒40(早期启动子)、和反转录病毒(诸如劳斯肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其他转录控制区包括来自脊椎动物基因(诸如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白)的转录控制区，以及能在真核细胞中控制基因表达的其他序列。其他适合的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子，以及淋巴因子诱导型启动子(例如，可由干扰素或白介素诱导的启动子)。
相似地，多种翻译控制元件对本领域普通技术人员是已知的。这些翻译控制元件包括但不限于核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子和来自小RNA病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。
在其他实施方案中，本发明的多核苷酸是RNA，例如，以信使RNA(mRNA)的形式。
本发明的多核苷酸和核酸编码区可与编码指引由本发明的多核苷酸编码的多肽的分泌的分泌或信号肽的其他编码区缔合。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白具有信号肽或分泌前导序列，一旦正在生成的蛋白链起始了穿过粗面内质网的输出，信号肽或分泌前导序列从成熟蛋白上切下。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽一般具有与多肽的N-末端融合的信号肽，信号肽从完整或“全长”多肽上切下以产生分泌的或“成熟”形式的多肽。在某些实施方案中，使用天然信号肽(例如，免疫球蛋白重链或轻链的信号肽)，或者保留了指引与其可操作连接的多肽的分泌的能力的那些序列的功能性衍生物。可选地，可使用异源哺乳动物信号肽或其功能性衍生物。例如，可用人组织纤溶酶原激活物(TPA)或小鼠β-葡糖醛酸酶的前导序列来置换野生型前导序列。
除非另外指明，术语“疾病”和“疾患”在本文可互换使用。在本发明上下文使用的“结合分子”主要涉及抗体及其片段，但也可指与新表位结合的其他非抗体分子，包括但不限于激素、受体、配体、主要组织相容性复合体(MHC)分子、诸如热激蛋白(HSP)的分子伴侣，以及细胞-细胞粘着分子，诸如钙粘着蛋白、整联蛋白(intergrin)、C-型凝集素和免疫球蛋白(Ig)超家族的成员。因此，仅为清楚起见，并且不限制本发明的范围，下述实施方案的大多数是就代表用于治疗和诊断剂开发的优选结合分子的抗体和类抗体分子而讨论的。
术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文可互换使用。抗体或免疫球蛋白是包含重链的至少可变结构域、并且正常包含重链和轻链的至少可变结构域的抗原结合分子。脊椎动物系统的基本免疫球蛋白结构了解得相对清楚。参见，例如，Harlow等，Antibodies：A LaboratoryManual(抗体实验指南)，(Cold Spring Harbor Laboratory Press，第二版，1988)。
如下文将更详细地讨论，术语“免疫球蛋白”包含可生化地区别的多种类别的多肽。本领域技术人员将理解，重链分为γ、μ、α、δ或ε(γ，μ，α，δ，ε)，其中有一些亚类(例如，γ1-γ4)。链的性质确定了抗体的“类别”分别为IgG、IgM、IgA IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等，表征得很清楚，并且已知其赋予功能专门化。鉴于本公开内容，这些类别和同种型的每一个的修饰形式对熟练的技术人员来说是容易辨别的，并且相应地在本发明的范围内。所有的免疫球蛋白类别都清楚地在本发明的范围内，下述讨论一般将针对免疫球蛋白分子的IgG类。关于IgG，标准的免疫球蛋白分子包含两条相同的分子量大约23,000道尔顿的轻链多肽和两条相同的分子量53,000-70,000的重链多肽。四条链一般以“Y”构型由二硫键相连，其中轻链支持重链，在“Y”的口处开始并延续经可变区。
轻链分为κ或λ(κ，λ)。每重链类别可与κ或λ轻链结合。一般而言，当免疫球蛋白通过杂交瘤、B细胞或遗传改造的宿主细胞产生时，轻链和重链彼此共价键合，并且两条重链的“尾”部通过共价二硫键合或非共价键合彼此键合。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉末端的N-末端延伸到每条链底部的C-末端。
轻链和重链都分成结构和功能同源区。术语“恒定”和“可变”功能地使用。在这方面，应理解，轻链(VL)和重链(VH)部分的可变结构域决定抗原的识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定结构域赋予重要的生物学特性，诸如分泌、经胎盘的迁移率、Fc受体结合、补体结合及类似特性。按照惯例，恒定区结构域的编号随着它们变得与抗体的抗原结合位点或氨基末端更远而增加。N-末端部分是可变区，而C-末端部分是恒定区；CH3和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基末端。
如上文所示，可变区允许抗体选择性地识别和特异地结合抗原上的表位。也就是说，抗体的VL结构域和VH结构域、或互补决定区(CDR)的亚型组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。这种四级抗体结构形成了存在于Y的每个臂末端的抗原结合位点。更具体地，该抗原结合位点由每条VH和VL链上的三个CDR定义。含有足以特异结合抗原的结构的任何抗体或免疫球蛋白片段在本文可交换表示为“抗原结合片段”或“免疫特异性片段”。
在天然存在的抗体中，每个抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是特异地定位以便当抗体在水环境中采取其三维构型时形成抗原结合结构域的短的、不相邻的氨基酸序列。抗原结合结构域中剩余的氨基酸(称为“构架”区)显示更低的分子间可变性。构架区主要采取β-折叠构象，而CDR形成连接的环，在一些情况中，CDR形成β-折叠结构的一部分。因此，构架区的作用是形成提供CDR通过链间非共价相互作用以正确取向定位的支架结构。定位的CDR形成的抗原结合结构域定义了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。该互补表面促进抗体与其同族表位的非共价结合。本领域普通技术人员可容易地鉴定任何特定重链或轻链可变区的分别包含CDR和构架区的氨基酸，因为这些氨基酸已被精确定义(参见，″Sequences of Proteins of Immunological Interest，″(具有免疫学重要性的蛋白序列)Kabat，E.等，美国卫生及公共服务部，(1983)；和Chothia和Lesk，J Mol.Biol.，196：901-917(1987)，其通过引用整体并入本文)。
在本领域使用和/或接受的术语有两种或多种定义的情况中，本文所用的术语的定义预期包括所有这些含义，除非明确指明为相反的意思。具体实例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)来描述重链和轻链多肽可变区内发现的不相邻的抗原组合位点。这一特定区域已描述于Kabat等，美国卫生及公共服务部，″Sequences of Proteinsof Immunological Interest″(具有免疫学重要性的蛋白序列)(1983)和Chothia等，J.Mol.Biol.196：901-917(1987)，其通过引用并入本文，其中当彼此比较时，定义包括重叠的氨基酸残基或氨基酸残基的亚型。然而，指抗体或其变体的CDR的任一定义的应用预期在本文定义和使用的术语的范围内。由上文引用的每个参考文献定义的包含CDR的适当氨基酸残基描述于下文的表I中作为比较。包含特定CDR的确切残基数将根据CDR的序列和大小而变化。本领域技术人员常规地可根据抗体的可变区氨基酸序列来确定哪些残基包含特定的CDR。
表1：CDR定义1
  Kabat   Chothia
  VH CDR1   31-35   26-32
  VH CDR2   50-65   52-58
  VH CDR3   95-102   95-102
  VL CDR1   24-34   26-32
  VL CDR2   50-56   50-52
  VL CDR3   89-97   91-96
1表1中所有CDR定义的编号是根据Kabat等描述的编号惯例(参见下文)。
Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变结构域序列的编号系统。本领域普通技术人员可明确地将该“Kabat编号”系统分配于任何可变结构域序列，而不依赖于除序列本身外的任何实验数据。如本文所用，“Kabat编号”指Kabat等，美国卫生及公共服务部，″Sequence of Proteins of Immunological Interest″(具有免疫学重要性的蛋白序列)(1983)描述的编号系统。除非另外指定，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中所指的特定氨基酸残基位置的编号是根据Kabat编号系统。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、免疫特异性片段、变体、或衍生物包括但不限于，多克隆、单克隆、多特异性、人、人源化、灵长源化、或嵌合抗体、单链抗体、表位结合片段，例如，Fab、Fab′和F(ab′)2、Fd、Fv、单链Fv(scFv)、单链抗体、二硫键相连的Fv(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、Fab表达文库产生的片段和抗独特型(抗-Id)抗体(包括，例如，针对本文公开的抗体的抗-Id抗体)。ScFv分子是本领域已知的，并且描述于例如，美国专利5,892,019。本发明的免疫球蛋白或抗体分子可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如，IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类别(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)或亚类。
在一个实施方案中，本发明的抗体不是具有五价结构的IgM或其衍生物。特别地，在本发明的特定应用、特别是治疗性应用中，IgM不如IgG和其他二价抗体或对应的结合分子有效，因为由于其五价结构和缺少亲和力成熟，IgM通常显示非特异性交叉反应性和非常低的亲和力。
抗体片段(包括单链抗体)可包含单独或与以下的整体或部分的组合的可变区：铰链区、CH1、CH2和CH3结构域。本发明还包括也包含可变区与铰链区、CH1、CH2和CH3结构域的任何组合的抗原结合片段。本发明的抗体或其免疫特异性片段可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。优选地，抗体是人、鼠、驴、兔、山羊、天竺鼠、骆驼、美洲驼、马或鸡的抗体。在另一个实施方案中，可变区可以是condricthoid来源(例如，来自鲨鱼)。如本文所用，“人”抗体包括具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，并且包括从人类患者、人免疫球蛋白文库或具有一种或多种人免疫球蛋白并且不表达内源免疫球蛋白的转基因动物分离的抗体，如下文和例如美国专利第5,939,598号(Kucherlapati等)所述。人抗体仍旧是“人的”，即使抗体中进行了氨基酸置换，例如以便改善结合特征。
如本文所用，术语“重链部分”包括来自免疫球蛋白重链的氨基酸序列。包含重链部分的多肽包括以下的至少一个：CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、或其变体或片段。例如，本发明使用的结合多肽可包括：包含CH1结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH2结构域的多肽链；包含CH1结构域和CH3结构域的多肽链；包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分和CH3结构域的多肽链，或包含CH1结构域、铰链结构域的至少一部分、CH2结构域和CH3结构域的多肽链。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括包含CH3结构域的多肽链。进一步，本发明使用的结合多肽可缺少CH2结构域的至少一部分(例如，CH2结构域的所有或一部分)。如上文所述，本领域普通技术人员将理解，这些结构域(例如重链部分)可被修饰，以致它们与天然存在的免疫球蛋白分子在氨基酸序列上不同。
在本文公开的某些抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物中，多聚体的一条多肽链的重链部分与多聚体的第二条多肽链的重链部分相同。可选地，本发明的含有重链部分的单体不相同。例如，每个单体可包含不同的靶结合位点，形成例如双特异性抗体。
本文公开的诊断和治疗方法中使用的结合多肽的重链部分可来自不同的免疫球蛋白分子。例如，多肽的重链部分可包含来自IgG1分子的CH1结构域和来自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来自IgG1分子和部分来自IgG3分子的铰链区。在另一个实例中，重链部分可包含部分来自IgG1分子和部分来自IgG4分子的嵌合铰链。
如本文所用，术语“轻链部分”包括来自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。优选地，轻链部分包含VL或CL结构域的至少一个。
认为抗体的肽或多肽表位的最小大小是约4至5个氨基酸。肽或多肽表位优选地含有至少7个、更优选地至少9个和最优选地在至少约15个至约30个之间的氨基酸。由于CDR可识别以其三级形式的抗原肽或多肽，包含表位的氨基酸不需要相邻，并且在一些情况中，可能甚至不在同一条肽链上。在本发明中，本发明的抗体识别的肽或多肽表位含有Aβ的至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、更优选地至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个、至少25个或约15个至约30个相邻或不相邻的氨基酸的序列。
根据本发明，术语“新表位”表示独特于疾患模式并且包含于疾病相关蛋白或由疾病相关蛋白形成的表位，所述疾病相关蛋白是其他非病理蛋白的病理变体和/或偏离健康状态生理。所述病理生理变体可通过以下手段形成：病理改变的转录、病理改变的翻译、翻译后修饰、病理改变的蛋白酶解加工、病理改变的与生理或病理生理的相互作用配偶体或细胞结构形成复合体(从改变的共定位意义上说)、或病理改变的结构构象-比如例如聚集、寡聚化或原纤维形成-其三或四维结构不同于生理活性分子的结构。此外，病理生理变体也特征在于它不处于其通常的生理环境或亚细胞区室。作为实例，新表位可位于显然经历或已经历功能损伤的脑组织区域的病理明显的结构中。特定结构(例如细胞或组织、或蛋白)是否展示新表位可通过逆转下文描述的用于分离和表征疾病相关蛋白特异性结合分子的方法来证实，因为结合分子(例如通过所述方法鉴定的抗体)用来筛选与抗体结合的样品，因此确定新表位的存在。
短语“疾患相关蛋白特异的”和“新表位特异的”在本文可与术语“特异识别新表位”互换使用。如本文所用诸如“没有交叉反应性”、“特异的”、“特异识别”、“特异结合”、“优先结合”和类似术语指结合分子区分疾病相关蛋白的新表位和以其野生型形式和天然环境下的天然蛋白的能力。因此，本发明的结合分子对新表位的优先结合亲和力为天然蛋白抗原的至少2倍、优选地至少5倍、通常超过10倍、特别优选地50倍和甚至更优选地高于100倍。此外，结合分子的相对KD(例如，抗体对特定的靶表位，例如新表位)是该抗体与其他配体或与疾患相关蛋白的天然对应物的结合KD的优选地至少1/10、更优选地至少1/100倍或更低。
在本文可互换使用的“特异结合”或“特异识别”一般意指结合分子(例如，抗体)通过其抗原结合结构域与表位结合，并且结合需要抗原结合结构域和表位之间一定的互补性。根据这一定义，当抗体通过其抗原结合结构域与该表位的结合比其与随机的不相关表位的结合更容易时，可以说抗体“特异结合”表位。术语“特异性”在本文用来明确某一抗体与某一表位结合的相对亲和力。例如，可认为抗体“A”对特定表位的特异性高于抗体“B”，或者可以说抗体“A”与表位“C”结合特异性高于其与相关表位“D”的结合。
“优先结合”意指与结合相关、相似、同源或类似表位相比，结合分子(例如，抗体)更容易特异地结合某表位。因此，“优先结合”特定表位的抗体将更可能结合该表位而不是相关表位，尽管此类抗体可与相关表位交叉反应。
作为非限制性实例，如果结合分子(例如，抗体)与第一个表位结合的解离常数(KD)小于抗体对第二个表位的KD，可认为所述结合分子优先结合所述第一个表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一个表位的结合亲和力比抗体对第二个表位的KD小至少一个数量级，可认为抗体优先结合第一个抗原。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一个表位的结合亲和力比抗体对第二个表位的KD小至少两个数量级，可认为抗体优先结合第一个表位。
在另一个非限制性实例中，如果结合分子(例如，抗体)与第一个表位结合的解离率(k(off))小于抗体对第二个表位的k(off)，可认为所述结合分子优先结合第一个表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一个表位的结合亲和力比抗体对第二个表位的k(off)小至少一个数量级，可认为所述抗体优先结合第一个表位。在另一个非限制性实例中，如果抗体与第一个表位的结合亲和力比抗体对第二个表位的k(off)小至少两个数量级，可认为所述抗体优先结合第一个表位。
可以说本文公开的结合分子(例如，抗体或抗原结合片段、变体、或衍生物)与本文公开的靶多肽或其片段或变体以小于或等于5×10-2sec-1、10-2sec-1、5×10-3sec-1或10-3sec-1的解离率(k(off))结合。更优选地，可以说本发明的抗体与本文公开的靶多肽或其片段或变体以小于或等于5×10-4sec-1、10-4sec-1、5×10-5sec-1或10-5sec-1、5×10-6sec-1、10-6sec-1、5×10-7sec-1或10-7sec-1的解离率(k(off))结合。
可以说本文公开的结合分子(例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物)与本文公开的靶多肽或其片段或变体以大于或等于103M-1sec-1、5×103M-1sec-1、104M-1sec-1或5×104M-1sec-1的结合率(k(on))结合。更优选地，可以说本发明的抗体与本文公开的靶多肽或其片段或变体以大于或等于105M-1sec-1、5×105M-1sec-1、106M-1sec-1或5×106M-1sec-1或107M-1sec-1的结合率(k(on))结合。
如果结合分子(例如，抗体)以某种程度上阻抑参考抗体与表位结合的程度与该表位优先结合，可以说所述结合分子竞争性抑制参考抗体与特定表位的结合。可通过本领域已知的任何方法(例如，竞争性ELISA测定)来确定竞争性抑制。可以说抗体至少90％、至少80％、至少70％、至少60％、或至少50％地竞争性抑制参考抗体与特定表位结合。
如本文所用，术语“亲和力”指单个表位与结合分子(例如，免疫球蛋白分子)的CDR的结合强度的量度。参见，例如，Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验指南)(Cold SpringHarbor Laboratory Press，第二版，1988)第27-28页。如本文所用，术语“亲和性(avidity)”指免疫球蛋白群体和抗原的复合体的总体稳定性，即免疫球蛋白与抗原的混合物的功能性结合强度。参见，例如，Harlow，第29-34页。亲和性既与群体中单个免疫球蛋白分子与特定表位的亲和力相关，也与免疫球蛋白和抗原的效价相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复的表位结构的抗原(诸如聚合体)之间的相互作用将是高亲和性相互作用。
还可从交叉反应性方面描述或详细说明本发明的结合分子，例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物。如本文所用，术语“交叉反应性”指特异于一种抗原的抗体与第二种抗原反应的能力；是两个不同抗原物质之间相关性的量度。因此，如果抗体与除诱导其形成的表位之外的其他表位结合，则抗体是交叉反应性的。交叉反应性表位一般含有与诱导表位相同的许多互补结构特征，并且在一些情况中，实际上可能比最初的表位更适合。
例如，某些抗体具有一定程度的交叉反应性，因为它们结合相关但不相同的表位，例如，与参考表位具有至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％、和至少50％同一性的表位(使用本领域已知和本文描述的方法来计算)。如果抗体不与和参考表位具有低于95％、低于90％、低于85％、低于80％、低于75％、低于70％、低于65％、低于60％、低于55％、和低于50％同一性的表位(使用本领域已知和本文描述的方法来计算)结合，可以说抗体具有很少或没有交叉反应性。如果抗体不与该表位的任何其他类似物、直向同源物或同系物结合，则可认为该抗体“高度特异”于某表位。
也可从与本发明的多肽的结合亲和力方面描述或详细说明本发明的结合分子，例如抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物。优选的结合亲和力包括具有低于5×10-2M、10-2M、5×10-3M、10-3M、5×10-4M、10-4M、5×10-5M、10-5M、5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M或10-15M的解离常数或Kd的结合亲和力。
如前所示，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是公知的。如本文所用，术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变结构域，而术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一个(最靠近氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，位于免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。
如本文所用，术语“CH2结构域”包括使用常规编号方案例如从抗体的约残基244延伸至残基360的重链分子部分(残基244至360，Kabat编号系统；残基231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等，上文。CH2结构域是独特的，因为它不与另一个结构域紧密成对。更确切的说，两个N-连接的分支碳水化合物链插入完整的天然IgG分子的两个CH2结构域之间。也有文献清楚记载CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C-末端，并且包含大约108个残基。
如本文所用，术语“铰链区”包括连接CH1结构域与CH2结构域的重链分子部分。该铰链区包含大约25个残基，并且是柔性的，因此允许两个N-末端抗原结合区独立地移动。铰链区可细分为三个不同的结构域：上部、中部和下部铰链结构域(Roux等，J.Immunol.161：4083(1998))。
如本文所用，术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可与第二个硫醇基形成二硫键或桥的硫醇基。在大多数天然存在的IgG分子中，CH1和CL区通过二硫键相连，并且两条重链在对应于使用Kabat编号系统的239和242位置(位置226或229，EU编号系统)通过两个二硫键相连。
如本文所用，术语“改造抗体”指其中重链和轻链或两者的可变结构域通过已知特异性的抗体的一个或多个CDR的至少部分替换和如果需要通过部分构架区替换和序列变化而被改变的抗体。尽管CDR可来自与衍生构架区的抗体同一类别或甚至亚类的抗体，预计CDR将来自不同类别的抗体，并且优选地来自不同物种的抗体。其中来自已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR被移植到人重链或轻链构架区的改造抗体在本文称为“人源化抗体”。可能不需要用来自供体可变区的完整CDR来替换所有的CDR，以将一个可变结构域的抗原结合能力转移至另一个可变结构域。更确切的说，只需要转移保持靶结合位点活性所需的那些残基。考虑到在例如美国专利第5,585,089、5,693,761、5,693,762和6,180,370号中所述的内容，通过进行常规的实验或通过尝试与误差试验，获得功能性改造或人源化抗体将完全在本领域技术人员的能力内。
如本文所用，术语“正确折叠的多肽”包括其中包含多肽的所有功能性结构域都有明显活性的多肽。如本文所用，术语“不正确折叠的多肽”包括其中多肽的功能性结构域的至少一个没有活性的多肽。在一个实施方案中，正确折叠的多肽包含通过至少一个二硫键连接的多肽链，相反地，不正确折叠的多肽包含没有通过至少一个二硫键连接的多肽链。
如本文所用，术语“改造”包括通过合成方法的核酸或多肽分子的操作(例如通过重组技术、体外肽合成、通过肽的酶或化学偶联或这些技术的一些组合)。
如本文所用，术语“连接”、“融合(fused)”或“融合(fusion)”可互换使用。这些术语指通过任何手段(包括化学轭合或重组手段)将两个或多个元件或组分连接到一起。“按阅读框架融合”指两个或多个多核苷酸开放阅读框(ORF)以保持最初ORF的正确翻译阅读框架的方式相连以形成连续的更长的ORF。因此，重组融合蛋白是含有与最初ORF编码的多肽对应的两个或多个区段(所述区段正常不是天然如此连接的)的单个蛋白。尽管阅读框架因此在整个融合区段是连续的，该区段可由例如按阅读框架的接头序列物理上或空间上分开。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可按阅读框架融合，但由编码至少一个免疫球蛋白构架区或其他CDR区的多核苷酸分开，只要“融合”的CDR作为连续多肽的一部分共翻译。
在多肽的上下文中，“线性序列”或“序列”是以氨基到羧基末端方向的多肽的氨基酸次序，其中序列中彼此邻近的残基在多肽的一级结构中是相邻的。
术语“表达”在本文用来指基因产生生化物质(例如RNA或多肽)的过程。该过程包括细胞内基因的功能性存在的任何表现形式，包括但不限于，基因敲减以及瞬时表达和稳定表达。该过程包括但不限于基因转录为信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、小发夹RNA(shRNA)、小干扰RNA(siRNA)或任何其他RNA产物，和此类mRNA翻译为多肽。如果最终需要的产物是生化物质，表达包括该生化物质和任何前体的产生。基因的表达产生“基因产物”。如本文所用，基因产物可以是核酸(例如通过基因转录产生的信使RNA)、或从转录物翻译的多肽。本文所述的基因产物进一步包括具有转录后修饰的核酸(例如多聚腺苷化作用)、具有翻译后修饰(例如，甲基化、糖基化、添加脂类、与其他蛋白亚基缔合、蛋白酶剪切和类似修饰)的多肽。
如本文所用，术语“治疗(treat)”或“治疗(treatment)”指治疗性治疗和预防性(prophylactic)或预防性(preventative)措施，其中目的是预防或减缓(减轻)不希望的生理改变或疾病，诸如癌症的发展或扩散。有益的或希望的临床结果包括但不限于，症状的缓和、疾患程度的减弱、疾患的稳定(即不恶化)状态、疾患进展的延迟或减缓、疾患状态的改善或减轻和减退(部分或完全)，无论可检测或不可检测。“治疗”还可意指与如果不接受治疗的预期存活相比延长的存活。需要治疗的那些包括已经患有病况或疾病的那些，以及易患病况或疾病的那些，或者病况或疾病的表现要被预防的那些。
“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”意指需要诊断、预测、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象，例如人类患者。
II.鉴定结合分子的方法
本发明一般涉及用于从临床预选的人类对象中发现治疗上有效的抗体的手段和方法。如在实施例中证明，针对人脑疾患中异常结构的人抗体可从表型上健康、或临床上异常稳定的患者中分离，并且对应的重组抗体可成功地用于治疗、改善病理和预防脑功能的损害而没有显著的副作用。疾患的临床稳定性或不进展可通过以下作为实例的方法来鉴定：随时间测量临床(例如认知)状态(例如通过神经心理测试)；评价综合功能水平；评估每日生活能力或行为缺损；脑结构的容量分析；体内测量脑中异常蛋白的病理沉积物(例如PETβ-淀粉样蛋白成像)或体液的生化变量(例如tau蛋白或Aβ肽)；以及通过与疾患的天然进程/历史的比较。因此，本发明提供了能识别疾患相关蛋白新表位的抗体和结合分子，所述疾患相关蛋白来自天然的内源蛋白，并且在患者体内以变体形式(例如作为病理蛋白)和/或脱离其正常生理环境普遍存在。特别地，提供了抗体及其抗原结合片段，证明了针对实施例中例证的抗体所概述的免疫结合特征和/或生物学特性。在存在的情况中，所有语法形式的术语“免疫结合特征”或抗体与抗原的其他结合特征指抗体的特异性、亲和力、交叉反应性和其他结合特征。自然地，本发明还扩展至产生抗体的细胞系和重组细胞。本发明进一步涉及包含本发明的结合分子的诊断测定和试剂盒，并且涉及基于其的治疗方法和治疗评估。
本发明基于以下观察：在根据特定临床标准预选的、由于其年龄具有发展比如阿尔茨海默病的神经疾病的危险的人类对象和患者中，也可发现与体液防御相关的针对内源病理生理变体比如Aβ肽聚集体、神经原纤维缠结、营养不良性轴突和其他细胞结构的抗体，这些是疾病的神经病理特征。这些结构可单独或与其他病理结构组合被发现，并且在Aβ聚集体和神经原纤维缠结前体情况中可发展病理效应。然而，特异识别所述结构的那些抗体没有表现出或表现出显著更低的与作为病理结构基础的蛋白的正常生理功能形式的交叉反应性，这与自身免疫应答中已知的情况相反。
不希望受理论所限，基于根据本发明进行的实验，相信疾病不必变得表现和表型上可察觉(如在感染中)，以便引起实验可测量的体液免疫系统的活性，比如特定B细胞或B记忆细胞的产生或活化。在必须被生理清除的肿瘤细胞或分化细胞中，机制是已知的，其中比如细胞免疫系统的T4辅助细胞和细胞毒性T细胞和天然杀伤细胞的配偶体协同诱导凋亡。必须假定，在健康的人中，肿瘤细胞或其前体也通过突变每天形成。然而，这些肿瘤细胞或前体通过体液和细胞机制被迅速促使凋亡，以致检测不到肿瘤。在这个意义上，“健康、或临床上异常稳定的患者”不理解为表示其中没有疾患事件发生的个体，而是表示其中多种疾患事件在它们表型上表现出来之前通过阻抑或防御机制被控制的个体。
鉴于上述，根据本发明假定，从根据临床标准已被预选的特定患者集合或健康的对象中鉴定抗体或产生抗体的细胞应该是可能的，而无需预知靶结构表位(例如新表位)的分子性质，其中在供体生物中耐受已经占优势的情况中(即例如由缺少自身免疫所证实)，以重组产生的物质形式的抗体可成功地被用来抵抗疾患。因此鉴定此类抗体可无需预知靶结构的分子表位，而是仅通过与在临床病理上清楚表征的、来自人类患者或来自相应疾患的动物模型的组织切片中病理上明显结构的新表位的结合来实施。
相应地，在第一个方面，本发明涉及分离疾病相关蛋白特异性结合分子的方法，其包括：
(a)使获自没有症状，或临床上异常稳定，但患有疾病或处于发展疾病的危险或有效抑制了疾病的表现或暴发的患者的样品经受具有预定临床特征的病理或生理改变的细胞或组织的试样；和
(b)鉴定并任选地分离与所述试样优先结合，但不与或以显著更低的亲和力与可来自健康的对象的没有此类病理特征的对应细胞或组织结合的结合分子。
本发明的方法可如实施例部分概述使用本领域技术人员公知的手段来进行。例如，获自患者的液体样品可穿过与稳固地固定于样品固定器的试样靶结构接触的导管的第一个孔，因此允许分别以可溶形式或在细胞表面和膜上表达而存在于样品中的推定结合分子结合所述靶结构。液体样品可含有例如淋巴细胞和/或抗体，而试样可以是组织切片或用不同于病理靶结构的分子或分子组合包被的膜。
任何未结合的物质可通过第二个导管孔被去除。同时，可通过样品固定器恒温器来控制样品固定器的温度，例如推定的结合分子与特异于试样的抗原新表位在人体内发生天然结合的温度。通过流动运动，例如使含有结合分子的液体样品优选地以体温通过靶结构，可模拟结合相互作用的天然系统。然而，也可使用诸如通过摇床或旋转台使样品与试样一起孵育的其他方法。上文提到的系统的特定优势是它通过用样品固定器恒温器降低样品固定器的温度而允许代谢过程在任何时间中断。通过这样做，样品固定器的温度可降低至例如2-10℃，特别是4℃。可根据本发明的方法使用的对应装置描述于欧洲专利申请EP 1 069 431 A2。因此，本发明的方法将允许结合配偶体的鉴定和表征，同时允许鉴定和表征迄今未知的结合过程所需的分子类别、分子组和/或分子部分，即试样的靶结构。这将不仅开发了新的可能的诊断方式，而且还将提供用于分子水平的治疗方法的新的测试系统。
如果特定的替代标志物预测了疾患状态的高概率，但令人惊讶地(可能是由于特定的内源免疫应答)没有变得临床上表现，那么根据本发明患者可能有资格成为健康的志愿者群体。这样，与多种疾患相关的健康的老年人将是这样的个体，其中比如阿尔茨海默病或帕金森病的神经退行性病仍未临床上表现，但其中病理生理蛋白变体(即疾病相关蛋白)的潜伏期发展，在上述意义上通过涉及或不涉及免疫系统细胞组分的体液免疫系统的早期干预，在一定程度上被限制或延迟，直至健康而不是潜伏期的患者参与研究的时刻疾患的临床表现仍未出现。优选地，其中既未被诊断具有自身免疫过程也未出现作为副作用的其他可能的病理病况的不明显的志愿者被招募为第一种情况的样品供体。
一般而言，可使用来自经受生理蛋白或肽变体主动免疫的患者的样品，其中抗体的发展通过免疫接种被加强。例如，抗体可从已被接种Aβ肽疫苗的阿尔茨海默病患者中鉴定和分离。参见例如，Hock等，Nature Medicine 8：1280-1275(2002)，Hock等，Neuron38：547-554(2003)和WO 2004/095031，每个通过引用整体并入本文。然而，使用来自未接受涉及与变体病理蛋白相关或以变体病理蛋白为病因的疾病的此类免疫接种或对应用药的志愿者的样品可能是优选的。
根据本发明，例如，在来自临床病理上表征的人类患者或动物模型(比如例如转基因小鼠)的离体组织中，或在体外细胞结构，或在病理同种异体或异种组织中，分析例如已被临床预选的患者个体的样品中特异识别具有病理明显结构的试样的结合分子的存在。优选地，所述患者和/或所述提供试样的对象是人，最优选地两者都是人。
特征的病理或生理改变的样品、细胞或组织试样优选地在与结合分子(例如，本发明的抗体)反应后通过光学检测来显示。试样可作为/从细胞样品、组织切片、细胞涂片测试、人类疾患的动物模型的细胞或组织样品、或体外培养的细胞和组织材料获得。优选地，所述试样的至少一种以扫描位置的形式存在于样品固定器中，其中每个扫描位置对应于特定的病理结构，并且扫描位置的至少两个同时暴露于与抗体反应的检测。作为实例，针对诸如阿尔茨海默病、帕金森病或tau蛋白病(tauopathies)的神经退行性病的神经病理标志(包括β-淀粉样蛋白斑块、Lewy小体、神经原纤维缠结和营养不良性轴突(neuritis))的抗体可在获自具有相应疾患实体的临床病理上确认的诊断的人死后脑组织的切片上检测。这是通过将石蜡包埋的组织小杆封固于载玻片上然后用患者或健康供体的样品探测完成的。与抗体反应的检测是根据免疫组织化学和显微扫描的标准程序完成的。
含有各种人类疾患组织的多组织显微切片可装配到载玻片上以形成多组织微阵列。相似地，来自人类疾患的动物模型的组织样品、细胞涂片或细胞的其他试样可包埋于石蜡中，并单独或与上述人死后阿尔茨海默病脑组织或组织阵列组合封固于载玻片上。因此，载玻片上的单个测试位置可包含显示病理上明显结构的组织和其他试样的混合阵列。
为了增加测定的通量，将不止一个测试位置封固于载玻片上。优选地，8个测试位置以适合96孔或微量滴定形式的2×4的形式封固于载玻片上。该微量滴定-相容的组织微阵列的更详细的描述可在下文的补充方法部分发现。
如提到，待分析的样品可包括体液、细胞样品或细胞样品的上清液或其衍生物。诸如腰脑脊液(CSF)、血浆或尿的体液可在患者知情同意后根据标准临床程序收集。最优选地，样品包括或来自B-细胞或记忆B-细胞和/或包括抗体。
优选地，所述患者通过有或没有替代标志物、或通过异常稳定的疾患进程而被确定患有仍未表现的疾病或处于发展该疾病的危险。结合替代标志物考虑临床标准，根据本发明疾患在潜伏期病况中具有增加的发病或表现概率，或反之，证明当例如促进疾患的遗传星座(genetic constellation)存在或极度暴露或生活方式使疾患表型发展成为可能时未必已经发生此类疾患。在阿尔茨海默病中，这意味着，根据本发明，搜索这些人类志愿者中针对神经病理相关的蛋白复合体(比如β-淀粉样蛋白斑块中的Aβ聚集体、寡聚Aβ种和β-淀粉样蛋白原纤维)的B细胞或记忆B细胞、神经原纤维缠结的tau纤丝、Lewy小体的α突触核蛋白或迄今未被分子鉴定的组分，根据年龄，这些人类志愿者属于其中阿尔茨海默病的发病率特别高或者遗传上来自具有阿尔茨海默病高危险的群体的个体组。这些人是例如，大于75岁、不具有或仅具有轻微的神经心理上可测量的认知损害的人，或者在肿瘤征候中，具有高度指示的肿瘤标志物(例如遗传肿瘤标志物)但未患有疾患的人(Alloul等，Arch.Gerontology Geriatrics 27(1998)，189；Dunn等，Immunity 21(2004)137-148)。在轻度认知损害中，这些人是数年来保持临床上、神经心理上或认知上稳定的患者，尽管他们每年统计的发展临床上表现并在进一步的进程中进展的神经退行性病的危险超过20％。因此，在一个实施方案中，所述替代标志物选自由老年、脑淀粉样蛋白负载、ApoE基因型、APP基因型、PS1基因型、体液中Aβ肽的水平、异前列腺素(isoprostane)、Tau和磷酸-Tau组成的组。
采用根据本发明的方法的一个特定途径是用完全不同或相关的原发性疾患的病理上明显组织的试样阵列测试来自临床上预选的志愿者的B细胞和B记忆细胞的样品。特别地，此类病理组织来自患有神经退行性病、蛋白错折叠病、组织淀粉样蛋白病和与病理沉积物相关的其他疾患、自身免疫病、炎性疾患、过度增殖和赘生性病(例如肿瘤)、积贮病和包涵体病的人类患者，以及来自人类疾病的动物模型，特别来自被改变具有病理相关的人类基因的小鼠。
在一个特别优选的实施方案中，本发明关注于阿尔茨海默病。在该实施方案中，样品获自优选地满足以下标准的对象：
a)年龄为65岁，优选地70岁，更优选地75岁或更大；
b)具有完全的认知能力和良好的健康；和
c)没有痴呆的临床体征；或
d)具有异常缓慢的疾患进展速率，尽管存在可能的阿尔茨海默病的确定的临床诊断；或
e)具有异常低的从轻度认知损害(MCI)向完全暴发的阿尔茨海默病的转化率。
在进一步的实施方案中，本发明的方法进一步包括以下步骤：
a)从已被鉴定含有优先结合所述试样、但不结合或以显著更低的亲和力结合健康对象的对应细胞或组织的结合分子(例如抗体)的样品中纯化B细胞或B记忆细胞；
b)从所述B细胞或B记忆细胞获得编码所述抗体的免疫球蛋白基因谱系(repertoire)；和
c)使用所述谱系表达所述抗体，并且任选地其中步骤(b)包括以下步骤：
d)从所述B细胞或记忆B细胞获得mRNA；
e)从步骤(iv)的mRNA获得cDNA；和
f)使用引物延伸反应从所述cDNA扩增对应于所述抗体的重链(HC)和κ/λ轻链(LC)的片段。
产生永生化人类B细胞和B记忆淋巴细胞的克隆的方法包括在多克隆B细胞激活物存在时使用埃巴病毒(EBV)转化人类B记忆淋巴细胞的步骤，所述方法概述于国际申请WO2004/076677。该国际申请还描述了用于获得编码感兴趣的抗体的核酸序列的方法，该方法包括下述步骤：制备永生化B细胞克隆、从编码感兴趣的抗体的B细胞克隆获得/测序核酸、进一步将该核酸插入或使用该核酸来制备可表达感兴趣的抗体的表达宿主、在感兴趣的抗体表达的条件下培养或继代培养表达宿主和任选地纯化感兴趣的抗体。毫无疑问，核酸可被操作以在其间引入限制酶切位点、改变密码子使用和/或加入或优化转录和/或翻译调节序列。例如，核酸序列可通过本发明的多肽序列的回译产生，使用诸如载体NTI软件的软件来产生密码子优化和优化RNA稳定性的核酸序列。所有这些技术在本领域的技术发展水平内，并且可由本领域技术人员执行而无需过度的负担。永生化人类B细胞的其他方法是本领域公知的，例如，构建人杂交瘤或人-鼠嵌合杂交瘤。
在进一步的方面，本发明涉及能选择性识别疾患相关蛋白的表位(包括疾患相关蛋白的新表位)的结合分子，结合分子优选地可通过前文所述和实施例中例证的本发明的方法来获得或证实。有利地，本发明的结合分子基本不识别以其非疾病相关形式的所述蛋白；也参见上文。
用于重组产生结合分子，特别是抗体及其模拟物的手段和方法，以及筛选竞争结合分子(可以是或可以不是抗体)的方法在本领域是已知的，并且关于针对β-淀粉样蛋白的抗体和阿尔茨海默病的治疗/诊断概述于例如，国际申请WO2006/103116，其公开内容为了用于治疗或诊断应用的抗体工程和施用目的通过引用并入本文。
然而，如本文所述，特别是关于在人中的治疗性应用，本发明的抗体是人抗体。在这方面，抗体识别的变体病理蛋白优选地与神经疾病(优选地脑疾病)相关。
此外，如在实施例3至5中证明，本发明的结合分子特别是抗体具有几种有利的生物学特性，其中一种或多种是由本发明首次实现的，例如结合分子能：
(i)穿越血脑屏障，例如在病理事件的位点；
(ii)结合β-淀粉样蛋白斑块、脑血管淀粉样蛋白、弥散性Aβ沉积物、神经原纤维缠结、过度磷酸化的tau、α-突触核蛋白阳性Lewy-小体或与营养不良性轴突结合的蛋白聚集体；
(iii)去除脑中β-淀粉样蛋白斑块和/或防止脑中淀粉样蛋白斑块的形成；
(iv)基本恢复正常的行为；和/或
(v)不引起微出血。
在特定的优选实施方案中，本发明的抗体或等效结合分子可通过以下特性的一种或多种与其他抗体区别，例如它们能：
1.在病理事件的位点至少小量穿过血脑屏障；
2.与一种或多种病理生理相关的胞外或细胞结构结合；
3.在体外或体内导致病理生理相关结构的减少；
4.导致病理生理相关结构的减少和与其相关的毒性的降低；
5.导致阻止或延迟疾患的过程；
6.导致细胞和器官特异性和生物功能的再生，并且可能导致继而防止在与病理生理相关结构关联的毒性降解之后最初病理生理的复发；和/或
7.不伴有增加的微出血
此外，与生理前体或衍生物没有交叉反应性导致以下结果：首先，浓度是可预测的，因为避免了健康组织结构的吸收效应，其次，不想要的副作用意义上的自身免疫应答基本上消失。另外，先前的报道暗示在患有CAA的转基因小鼠模型中，脑淀粉样蛋白血管病(CAA)与损害的血管反应性的相关性(Mueggler等，J Neurosci 22(2002)，7218-24.)。在年老的arcAβ小鼠中出现的严重CAA(Knobloch等，Neurobiol.Aging 28：1297-1306(2007)2006年7月31日电子出版)可能因此限制了损伤血管的血管舒张柔性。根据本发明，谨慎地预期使用本发明的抗体的治疗可改善年老的APP转基因小鼠的血管反应性和脑血流。这可通过使用描述于Knobloch等(2006)，上文和公开于美国申请“阿尔茨海默病的转基因动物模型(Transgenic animal model for Alzheimer’s disease)”(Grimm等，序号60/934,291，2007年6月11日提交，其公开内容通过引用并入本文)的arcAβ小鼠模型而被证实。
III.抗体
本发明进一步涉及显示于表2和3的结合分子例如抗体及其结合片段、变体和衍生物。本发明更具体地涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体特异结合与选自由NI-101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B组成的组的参考抗体相同的疾病相关蛋白的新表位。
本发明进一步涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体竞争性抑制选自由NI-101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B组成的组的参考抗体与疾病相关蛋白的新表位的结合。
本发明还涉及抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中抗体包含与选自由NI-101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B组成的组的抗体相同的抗原结合结构域。
本发明进一步示例了几种此类结合分子(例如抗体及其结合片段)，其可通过在其可变区(例如结合结构域)包含VH和/或VL可变区(包含表2(VH)和表3(VL)中所述氨基酸序列的任一个)的至少一个互补决定区(CDR)而被表征。
表2：新表位特异抗体的VH区的氨基酸序列。
  抗体   可变重链序列
  NI-101.10   EVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGIHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：4)
  NI-101.11   EVQLVQSGGGWQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：6)
  NI-101.12   EVQLVESGPGLVKPAETLSLTCTVSGGSIRSGSICWYWIRQPPGKGLEWIGYFCYSGATFYTPSLRGRLTISVDASKNQLSLSLSSVTAADTAVYYCARRAGENSGGIEPYYGMDVWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：10)
  NI-101.13   QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRRSYYWGWIRQSPGKGLEWSGSIHYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSRWGSSWVFDYWGQGTLVTVSS(SEQID NO：14)
  NI-101.12F6A   QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFAFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWFDGTKKYYTDSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNTLRAEDTAVYYCARDRGIGARRGPYYMDVWGKGTTVTVSS(SEQ ID NO：39)
  NI-101.13A   QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRRSYYWGWIRQSPGKGLEWSGSIHYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSRWGSSWVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：42)
  NI-101.13B   QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRRSYYWGWIRQSPGKGLEWSGSIHYSGSTYYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARSRWGSSWVFDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：43)
表3：新表位特异抗体的VL区的氨基酸序列。
  抗体   可变轻链序列(κ或λ)
  NI-101.10   EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：8)
  NI-101.11   EIVLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO：8)
  NI-101.12   DEIVLTQSPSSLSASIGDRVTITCRASESINKYVNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGAPSRVSGSGFGRDFSLTISGLQAEDFGAYFCQQSYSAPYTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：12)
  NI-101.13   QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVYWYQQPPGTAPKLLIYRNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCAAWDDSLSGYVFGTGTKVTVLG(SEQ ID NO：16)
  NI-101.12F6A   DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPLTFGGGTKVEIKR(SEQ ID NO：41)
  NI-101.13A   DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTRTFGQGTKVEIKR(SEQ ID NO：44)
  NI-101.13B   DIQLTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQIPGKAPKLLIYKASSLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSYSRTFGQGTKLEIKR(SEQ ID NO：45)
编码上文鉴定的可变区的对应核苷酸序列示于所附序列表中。表2和3中所述的VH和/或VL区的上述氨基酸序列的CDR的示例组在表4中给出。然而，如在下文讨论，本领域技术人员深知如下事实：在CDR2和CDR3情况中可以另外或可选地使用与表4所示的氨基酸序列有1个、2个、3个或甚至更多个氨基酸不同的氨基酸序列的CDR。
表4：在Kabat命名中新表位特异抗体的VH和VL区的CDR蛋白序列的名称。
  抗体   可变重链   可变轻链
  NI-101.10
  CDR1   SYGIH(SEQ ID NO：17)   RASQSISSYLN(SEQ ID NO：23)
  CDR2   VIWFDGTKKYYTDSVKG(SEQ ID NO：18)   AASSLQS(SEQ ID NO：24)
  CDR3   DRGIGARRGPYYMDV(SEQ ID NO：19)   QQSYSTPLT(SEQ ID NO：25)
  NI-101.11
  CDR1   SYGMH(SEQ ID NO：20)   RASQSISSYLN(SEQ ID NO：23)
  CDR2   VIWFDGTKKYYTDSVKG(SEQ ID NO：21)   AASSLQS(SEQ ID NO：24)
  CDR3   DRGIGARRGPYYMDV(SEQ ID NO：22)   QQSYSTPLT(SEQ ID NO：25)
  NI-101.12
  CDR1   SGSIC(SEQ ID NO：26)   RASESINKYVN(SEQ ID NO：29)
  CDR2   WIGYFCYSGATFYTPSLRG(SEQ ID NO：27)   AASSLQS(SEQ ID NO：30)
  CDR3   RAGENSGGIEPYYGMDV(SEQ ID NO：28)   QQSYSAPYT(SEQ ID NO：31)
  NI-101.13
  CDR1   RRSYYWG(SEQ ID NO：32)   SGSSSNIGSNYVY(SEQ ID NO：35)
  CDR2   SIHYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：33)   RNNQRPS(SEQ ID NO：36)
  CDR3   SRWGSSWVFDY(SEQ ID NO：34)   AAWDDSLSGYV(SEQ ID NO：37)
  NI-101.12F6A
  CDR1   SYGMH(SEQ ID NO：20)   RASQSISSYLN(SEQ ID NO：23)
  CDR2   VIWFDGTKKYYTDSVKG(SEQ ID NO：21)   AASSLQS(SEQ ID NO：24)
  CDR3   DRGIGARRGPYYMDV(SEQ ID NO：22)   QQSYSTPLT(SEQ ID NO：25)
  NI-101.13A
  CDR1   RRSYYWG(SEQ ID NO：32)   RASQSISSYLN(SEQ ID NO：46)
  CDR2   SIHYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：33)   AASSLQS(SEQ ID NO：47)
  CDR3   SRWGSSWVFDY(SEQ ID NO：34)   QQSYSTRT(SEQ ID NO：48)
  NI-101.13B
  CDR1   RRSYYWG(SEQ ID NO：32)   RASQSISSWLA(SEQ ID NO：49)
  CDR2   SIHYSGSTYYNPSLKS(SEQ ID NO：33)   KASSLES(SEQ ID NO：50)
  CDR3   SRWGSSWVFDY(SEQ ID NO：34)   QQYNSYSRT(SEQ ID NO：51)
在一个实施方案中，本发明的抗体是包含表2和3中所述的VH和/或VL区的氨基酸序列的抗体的任一种。可选地，本发明的抗体是与具有表2和3中所述的VH和/或VL区的抗体的至少一种竞争与新表位(neoeptitope)的结合的抗体或其抗原结合片段。上述抗体还可以是鼠的，然而人源化、异源、或嵌合人-鼠抗体是优选的，特别是用于治疗性应用。抗体的抗原结合片段可以是例如，单链Fv片段(scFv)、F(ab′)片段、F(ab)片段和F(ab′)2片段。对一些应用，仅需要抗体的可变区，其可通过用适合的试剂处理抗体以便产生Fab′、Fab或F(ab″)2部分来获得。这些片段足够用于例如，涉及将免疫球蛋白的免疫特异性部分与诸如放射性同位素的检测试剂偶联的免疫诊断程序。
本发明进一步涉及构成本发明的抗体的分离多肽。本发明的抗体包含例如编码来自免疫球蛋白分子的特定抗原结合区的氨基酸序列的多肽。多肽或氨基酸序列“来自”指定蛋白指具有某一氨基酸序列的多肽的来源。在某些情况中，来自特定起始多肽或氨基酸序列的多肽或氨基酸序列的氨基酸序列与起始序列或其部分的氨基酸序列基本相同，其中所述部分由至少10-20个氨基酸、至少20-30个氨基酸、至少30-50个氨基酸组成，或者可由本领域普通技术人员另外鉴定，因为其来自起始序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、主要由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中重链可变区的VH-CDR的至少一个或重链可变区的VH-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。因此，根据该实施方案，本发明的重链可变区具有与上文表4所示的组相关的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3多肽序列。尽管表4显示了由Kabat系统定义的VH-CDR，其他CDR定义(例如，由Chothia系统定义的VH-CDR)也包括于本发明，并且本领域普通技术人员可使用表2和3所示的数据容易地鉴定。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、主要由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区的多肽序列与表4所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VH)、主要由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VH)组成的分离多肽，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区的多肽序列与表4所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同，除了在任一个VH-CDR中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸置换是保守的。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、主要由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离多肽，其中轻链可变区的VL-CDR的至少一个或轻链可变区的VL-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。可选地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。因此，根据该实施方案，本发明的轻链可变区具有与上文表4所示的多肽相关的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3多肽序列。尽管表4显示了由Kabat系统定义的VL-CDR，其他CDR定义(例如，由Chothia系统定义的VL-CDR)也包括于本发明。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白轻链可变区(VL)、主要由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成、或由免疫球蛋白轻链可变区(VL)组成的分离多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区的多肽序列与表4所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含免疫球蛋白重链可变区(VL)、主要由免疫球蛋白重链可变区(VL)组成、或由免疫球蛋白重链可变区(VL)组成的分离多肽，其中VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区的多肽序列与表4所示的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3组相同，除了在任一个VL-CDR中的1个、2个、3个、4个、5个或6个氨基酸置换。在某些实施方案中，氨基酸置换是保守的
免疫球蛋白或其编码cDNA可被进一步修饰。因此，在进一步的实施方案中，本发明的方法包括产生嵌合抗体、人源化抗体、单链抗体、Fab-片段、双特异性抗体、融合抗体、标记抗体或上述抗体的任一个的类似物的任一步骤。对应方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如，HarlOW和Lane″Antibodies，A LaboratoryManual(抗体实验指南)″，CSH Press，Cold Spring Harbor，1988。当所述抗体的衍生物通过噬菌体展示技术获得时，可使用在BIAcore系统中采用的表面等离子共振来增加与本文所述的抗体的任一种结合相同表位的噬菌体抗体的效率(Schier，Human AntibodiesHybridomas 7(1996)，97-105；Malmborg，J.Immunol.Methods 183(1995)，7-13)。嵌合抗体的产生描述于例如，国际申请WO89/09622。人源化抗体的产生方法描述于例如，欧洲申请EP-A1 0 239 400和国际申请WO90/07861。根据本发明使用的抗体的其他来源是所谓的异源抗体。产生异源抗体(诸如在小鼠中产生人抗体)的一般原理描述于例如，国际申请WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096和WO 96/33735。如上文讨论，本发明的抗体可以除完整抗体外的多种形式存在；包括例如，Fv、Fab和F(ab)2，以及以单链的形式；参见例如国际申请WO88/09344。
本发明的抗体或其对应的免疫球蛋白链可使用本领域已知的常规技术被进一步修饰，例如通过使用氨基酸缺失、插入、置换、添加和/或重组和/或单独或组合的本领域已知的任何其他修饰。在产生免疫球蛋白链的氨基酸序列的DNA序列中引入此类修饰的方法是本领域技术人员公知的；参见，例如，Sambrook，MolecularCloning A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，Cold SpringHarbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学实验技术)，Green PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)。本发明的抗体的修饰包括一个或多个组成氨基酸的化学和/或酶衍生化，包括侧链修饰、主链修饰和N-和C-末端修饰，包括乙酰化、羟基化、甲基化、酰胺化和碳水化合物或脂部分、辅因子和类似物的连接。同样地，本发明包括包含与位于羧基末端的异源分子(诸如免疫刺激配体)融合的位于氨基末端的所述抗体或其某一片段的嵌合蛋白的产生；对应的技术细节参见，例如，国际申请WO00/30680。
另外，本发明包括小肽，包括含有上文所述结合分子的那些小肽，例如含有所述的抗体的任一种的可变区的CDR3区，特别是重链的CDR3，因为经常观察到重链CDR3(HCDR3)是具有更大程度可变性，并且主要参与抗原-抗体的相互作用的区域。此类肽可通过重组手段容易地合成或产生以便产生根据本发明有用的结合剂。此类方法是本领域普通技术人员公知的。肽可例如使用可商业获得的自动肽合成仪来合成。肽可通过将表达肽的DNA掺入表达载体并用表达载体转化细胞以产生肽的重组技术来产生。
因此，本发明涉及根据上述手段可获得并显示所述特性(即特异识别新表位)的任何结合分子例如抗体或结合片段。此类抗体和结合分子可通过例如使用前文所述的分离新表位特异性结合分子的方法来测试其结合特异性和亲和力。
作为直接从永生化B细胞或B记忆细胞的培养物中获得免疫球蛋白的替代方案，永生化细胞可用作重排的重链和轻链基因座的来源，用于随后的表达和/或遗传操作。重排的抗体基因可从适当的mRNA反转录以产生cDNA。如果需要，重链恒定区可被交换为不同同种型的重链恒定区或被完全消除。可变区可被连接以编码单链Fv区。多个Fv区可连接以便赋予对不止一个靶的结合能力，或者可采用嵌合重链和轻链的组合。一旦遗传材料可用，如上文所述保持其结合需要的靶的能力的类似物的设计是简单的。用于克隆抗体可变区和产生重组抗体的方法是本领域技术人员已知的，并且描述于例如，Gilliland等，Tissue Antigens 47(1996)，1-20；Doenecke等，Leukemia 11(1997)，1787-1792。
一旦获得了适当的遗传材料，并且如果需要被修饰以编码类似物，包括编码至少重链和轻链的可变区的编码序列在内的编码序列可被插入包含于可被转染进标准的重组宿主细胞的载体上的表达系统。多种此类宿主细胞可用于有效的加工，然而，哺乳动物细胞是优选的。用于此目的的一般哺乳动物细胞系包括但不限于CHO细胞、HEK 293细胞或NSO细胞。
然后抗体或类似物的产生通过在适合宿主细胞生长和编码序列表达的培养条件下培养修饰的重组宿主来进行。然后通过从培养物中分离抗体来回收抗体。表达系统优选地设计为包括信号肽，以便得到的抗体被分泌到培养基中；然而胞内产生也是可能的。
一旦靶结构(例如疾患相关蛋白)被样品和其中相应的结合分子标记，其可通过本领域公知的手段和方法来鉴定，例如使用质谱(MS)技术，诸如描述于国际申请WO00/11208的技术和特别是描述于Hock等，Nat Med 8(2002)，1270-1275；Hock等，Neuron 38(2003)，547-554的技术。因此，在体外产生的根据本发明鉴定的抗体与病理结构(例如病理脑区域切片上的β-淀粉样蛋白斑块)结合但不显著地与健康组织结合的情况中，有希望的候选抗体被鉴定，其分子靶结构随后可通过其与来自病理组织的抗体的结合特性而被富集并纯化，因此可通过蛋白分析和例如MALDI/TOF的质谱方法(Williams，Methods Cell.Biol.62(2000)，449-453；Yates，J.Mass.Spectrom.33(1998)，1-19)来鉴定和表征。
相应地，在另一个实施方案中，本发明涉及由结合分子特别是前文所述的本发明的抗体识别的、并且优选地是疾病相关蛋白的至少一部分的抗原。
根据上文，本发明还涉及编码本发明的抗原或结合分子的多核苷酸，在抗体的情况中优选地编码至少上文所述的抗体的免疫球蛋白链的可变区的多核苷酸。多核苷酸编码的所述可变区一般包含所述抗体的VH和/或VL可变区的至少一个互补决定区(CDR)。本领域技术人员了解抗体的每个可变结构域(重链VH和轻链VL)包含三个高变区，有时称为互补决定区或“CDR”，其侧翼为四个相对保守的构架区或“FR”，并且指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。人IgG亚型抗体的高变区或CDR包含来自轻链可变结构域的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)和重链可变结构域的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)的氨基酸残基(如Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest(具有免疫学重要性的蛋白序列)，第五版，公共卫生部，美国国立卫生研究院，Bethesda，Md(1991)所述)和/或来自高变环的那些残基，例如轻链可变结构域的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)和重链可变结构域的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)(如Chothia等，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917所述)。构架或FR残基是高变区之外的可变结构域残基并支持(bracket)高变区。术语“特异结合”指抗体与预定抗原的结合。抗体一般以10-7M或更低的解离常数(KD)结合，并且以比与除预定抗原外的非特异抗原(例如，BSA、酪蛋白或任何其他特定多肽)的结合KD低至少两倍的KD与预定抗原结合。短语“识别抗原的抗体”和“特异于抗原的抗体”在本文可与术语“特异结合抗原的抗体”互换使用。如本文所用，“高度特异”结合意指抗体对特异靶表位(例如新表位)的相对KD比该抗体与其他配体或与疾患相关蛋白的天然对应物的结合KD低至少10倍。
抗体对抗原的亲和力或亲和性可使用任何适合的方法实验地确定；参见，例如，Berzofsky等，基础免疫学(FundamentalImmunology)中的″Antibody-Antigen Interactions(抗体-抗原相互作用)″，Paul，W.E.，编辑，Raven Press New York，N Y(1984)，Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman and Company New York，N Y(1992)和本文所述的方法。用于测量抗体对抗原的亲和力的一般技术包括ELISA、RIA和表面等离子共振。如果在不同条件下(例如，盐浓度、pH)测量，特定抗体-抗原相互作用的测量亲和力可能不同。因此，亲和力和其他抗原结合参数(例如，KD、IC50)的测量优选地使用抗体和抗原的标准溶液和标准缓冲液来进行。
本领域技术人员将容易理解，具有上述可变结构域的抗体的可变结构域可用于构建具有需要的特异性和生物学功能的其他多肽或抗体。因此，本发明还包括包含上述可变结构域的至少一个CDR、并且有利地具有与所附实施例中所述的抗体基本相同或相似结合特性的多肽和抗体。本领域技术人员将容易理解，使用本文所述的可变结构域或CDR，可根据本领域已知的方法来构建抗体，例如，如欧洲专利申请EP 0 451 216 A1和EP 0 549 581 A1所述。此外，本领域技术人员了解结合亲和力可通过在CDR内或在与Kabat定义的CDR部分重叠的高变环内进行氨基酸置换而被增强(Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.196(1987)，901-917)。因此，本发明还涉及其中上述CDR的一个或多个包含一种或多种优选地不超过两个氨基酸置换的抗体。优选地，本发明的抗体在其免疫球蛋白链的一条或两条中包含表4所示的可变区的两个或所有三个CDR。
如本领域普通技术人员所知，本发明的结合分子(例如，抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物)可包含介导一种或多种效应物功能的恒定区。例如，补体的C1组分与抗体恒定区的结合可活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理作用和裂解中是重要的。补体的活化还刺激炎性反应，并且也可参与自身免疫超敏。进一步，抗体通过Fc区与各种细胞的受体结合，其中抗体Fc区的Fc受体结合位点与细胞的Fc受体(FcR)结合。有许多Fc受体特异于不同类别的抗体，包括IgG(γ受体)、IgE(ε受体)、IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面Fc受体的结合触发许多重要和多样的生物应答，包括抗体包被颗粒的吞没和破坏、免疫复合体的清除、杀伤细胞对抗体包被的靶细胞的裂解(称为抗体依赖性的细胞介导的细胞毒性或ADCC)、炎性介体的释放、胎盘转移和控制免疫球蛋白的产生。
相应地，本发明的某些实施方案包括抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物，其中恒定区结构域的一个或多个的至少一部分被缺失或用其他方法改变，以便提供需要的生化特征，诸如与完整的、未改变的大约相同免疫原性的抗体相比减弱的效应物功能、非共价二聚化的能力、增加的定位于肿瘤位点的能力、缩短的血清半衰期或增加的血清半衰期。例如，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体是包含与免疫球蛋白重链相似但缺少一个或多个重链结构域的至少一部分的多肽链的结构域缺失抗体。例如，在某些抗体中，修饰抗体的恒定区的一个完整结构域将被缺失，例如，CH2结构域的所有或部分将被缺失。在其他实施方案中，用于本文所述的诊断和治疗方法的某些抗体具有被改变以消除糖基化的恒定区(例如，IgG重链恒定区)，这些抗体在本文其他地方被称为无糖基化或“agly”抗体。此类“agly”抗体可酶促地制备，以及通过改造恒定区的共有糖基化位点来制备。然而不受理论所限，相信“agly”抗体可在体内具有改善的安全和稳定性特征。产生具有需要的效应物功能的无糖基化抗体的方法发现于例如WO 2005/018572，其通过引用整体并入。
在本文所述的某些抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物中，Fc部分可使用本领域已知的技术被突变以减弱效应物的功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其他手段)可减弱Fc受体与循环的修饰抗体的结合，因此增加了肿瘤的定位。在其他情况中，可以是根据本发明的恒定区修饰调控补体的结合，因此缩短了血清半衰期和减少了轭合的细胞毒素的非特异性缔合。然而恒定区的其他修饰可用来修饰二硫键合或寡糖部分，由于增加的抗原特异性或抗体柔性而允许增强的定位。得到的生理特征、生物利用率和修饰的其他生化作用(诸如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期)可使用公知的免疫技术容易地测定和定量，而无需过多的实验。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的修饰形式可使用本领域已知的技术从完整前体或母抗体制备。示例性技术在本文被更详细地讨论。
在某些实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的可变区和恒定区全部是人的。全人抗体可使用本领域已知和本文所述技术制备。例如，针对特异抗原的全人抗体可通过将抗原施用于被修饰以便响应于抗原激发而产生此类抗体、但其内源基因座已失效的转基因动物来制备。可用来制备此类抗体的示例性技术描述于美国专利：6,150,584；6,458,592；6,420,140。其他技术是本领域已知的。全人抗体可通过各种展示技术(例如，噬菌体展示或其他病毒展示系统)同样地产生，如本文其他地方更详细地描述。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物可使用本领域已知技术来产生或制备。在某些实施方案中，抗体分子或其片段被“重组地产生”，即使用重组DNA技术产生。用于产生抗体分子或其片段的示例性技术在本文其他地方被更详细地讨论。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物还包括通过任何类型的分子与抗体共价连接以致共价连接不阻止抗体特异性结合其同族表位而被修饰的衍生物。例如但不限于，抗体衍生物包括例如通过已知保护/封闭基团的糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、衍生化、蛋白酶剪切、与细胞配体或其他蛋白的键合等而被修饰的抗体。多种化学修饰的任一种可通过已知技术来执行，包括但不限于特异的化学切割、乙酰化、甲酰化、衣霉素的代谢合成等。另外，衍生物可含有一种或多种非经典氨基酸。
在某些实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物将不在待治疗的动物中(例如在人中)引发有害的免疫应答。在某些实施方案中，本发明的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)来自患者(例如，人类患者)，并且随后用于衍生其的同一物种(例如，人)中以减轻或降低有害免疫应答的出现。
去免疫化作用可用来降低抗体的免疫原性。如本文所用，术语“去免疫化作用”包括修饰T细胞表位的抗体的改变(参见，例如，WO9852976A1、WO0034317A2)。例如，分析来自起始抗体的VH和VL序列，来自每个V区的人T细胞表位“图”显示了与互补决定区(CDR)相关的表位和序列内其他关键残基的位置。分析T细胞表位图中单个的T细胞表位，以便鉴定具有改变最终抗体活性的低危险的可选氨基酸置换。许多可选VH和VL序列被设计包含氨基酸置换的组合，并且这些序列随后被掺入许多结合多肽(例如，新表位特异的抗体或其免疫特异性片段)以用于本文公开的诊断和治疗方法，然后测试其功能。一般产生和测试12和24个之间的变体抗体。然后，将包含修饰的V区和人C区的完整重链和轻链基因克隆进表达载体，随后的质粒引入用于产生完整抗体的细胞系。然后在适当的生化和生物测定中比较抗体，并鉴定最佳的变体。
单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术来制备，包括使用杂交瘤、重组和噬菌体展示技术、或其组合。例如，单克隆抗体可使用杂交瘤技术来产生，包括本领域已知的技术和例如Harlow等，Antibodies：A Laboratory Manual(抗体实验指南)Cold Spring HarborLaboratory Press，第二版，(1988)；Hammerling等，MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas(单克隆抗体和T细胞杂交瘤)Elsevier，N.Y.，563-681(1981)(所述参考文献通过引用整体并入)教导的技术。如本文所用的术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。术语“单克隆抗体”指来自单个克隆(包括任何真核、原核或噬菌体克隆)的抗体，而不是抗体的产生方法。因此，术语“单克隆抗体”不限于通过杂交瘤技术产生的抗体。单克隆抗体可使用本领域已知的多种技术来制备。在某些实施方案中，本发明的抗体来自已通过埃巴病毒转化被永生化的人B细胞，如本文所述。
在公知的杂交瘤方法中(Kohler等，Nature 256：495(1975))，相对短寿或致死的来自哺乳动物的淋巴细胞(例如来自如本文所述的人类对象的B细胞)与永生的肿瘤细胞系(例如，骨髓瘤细胞系)融合，因此产生永生的并且能产生B细胞的遗传编码抗体的杂交细胞或“杂交瘤”。得到的杂交体通过选择、稀释和与包含用于单个抗体形成的特定基因的每个单个株重新生长而分离为单个遗传株。这些单个遗传株产生针对需要的抗原均质的抗体，在指它们的纯遗传家系时被称为“单克隆”。
这样制备的杂交瘤细胞被接种并生长在优选地含有抑制未融合的亲代骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质的适合培养基中。本领域技术人员将理解，用于杂交瘤的形成、选择和生长的试剂、细胞系和介质可从许多来源商业获得，并且标准的方案是完善的。一般测定杂交瘤细胞生长的培养基中针对需要的抗原的单克隆抗体的产生。杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过诸如免疫沉淀、放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)、或本文所述的新表位结合测定的体外测定来确定。产生具有需要的特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞被鉴定后，克隆通过有限稀释程序被亚克隆，并通过标准方法生长(Goding，MonoclonalAntibodies：Principles and Practice(单克隆抗体：原理和实践)，Academic Press，第59-103页(1986))。应进一步理解，亚克隆分泌的单克隆抗体可通过常规纯化程序从培养基、腹水或血清中分离，所述程序诸如，例如，蛋白-A、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析。
识别特异表位的抗体片段可通过已知技术产生。例如，Fab和F(ab′)2片段可重组地产生，或者可使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)的酶通过免疫球蛋白分子的蛋白酶剪切来产生。F(ab′)2片段含有可变区、轻链恒定区和重链的CH1结构域。
诸如本文所述的完整的人抗体对人类患者的治疗性治疗是特别需要的。人抗体可通过本领域已知的多种方法来制备，包括上文所述的使用来自人免疫球蛋白序列的抗体文库的噬菌体展示方法。还参见，美国专利第4,444,887和4,716,111号；和PCT公布WO98/46645、WO 98/50433、WO98/24893、WO 98/16654、WO 96/34096、WO 96/33735和WO 91/10741；其每个通过引用整体并入本文。本发明的人抗体是例如从没有症状但受发展疾病(例如，阿尔茨海默病)的危险影响的患者、或患有疾病但具有异常稳定的疾患进程的患者中分离的。
在另一个实施方案中，编码需要的单克隆抗体的DNA可使用常规程序容易地分离并测序(例如，通过使用能特异结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离和亚克隆的杂交瘤细胞作为此类DNA的优选来源。一旦被分离，DNA可被置于表达载体中，然后转染进原核或真核宿主细胞，诸如但不限于否则不产生免疫球蛋白的大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞。更特别地，分离DNA(如本文所述可以是合成的)可用来克隆用于制备抗体的恒定区和可变区序列，描述于Newman等，1995年1月25日提交的美国专利第5,658,570号，其通过引用并入本文。本质上，这需要从选择细胞中提取RNA、转变成cDNA、并使用Ig特异引物通过PCR扩增。适合此目的的引物也描述于美国专利第5,658,570号。如下文将更详细地讨论，表达需要的抗体的转化细胞可以相对大的量生长，以便提供免疫球蛋白的临床和商业供给。
在一个实施方案中，本发明的抗体包含抗体分子的至少一个重链或轻链CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少两个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少三个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少四个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少五个CDR。在另一个实施方案中，本发明的抗体包含来自一个或多个抗体分子的至少六个CDR。包含可包括于主体抗体的至少一个CDR的示例性抗体分子描述于本文。
在特定实施方案中，重链和/或轻链可变结构域的氨基酸序列可通过本领域公知的方法来检验以鉴定互补决定区(CDR)的序列，例如，通过与其他重链和轻链可变区的已知氨基酸序列比较来确定序列高变性的区域。使用常规重组DNA技术，CDR的一个或多个可被插入构架区内，例如插入人构架区。构架区可以是天然存在的或共有构架区，优选地人构架区(人构架区的列表参见，例如，Chothia等，J.MoI.Biol.278：457-479(1998))。在某些实施方案中，由构架区和CDR的组合产生的多核苷酸编码特异结合需要的多肽的至少一个表位的抗体。在某些实施方案中，一种或多种氨基酸置换可在构架区内产生，以便例如改善抗体与其抗原的结合。另外，此类方法可用来产生参与链内二硫键的一个或多个可变区半胱氨酸残基的氨基酸置换或缺失，以便产生缺少一个或多个链内二硫键的抗体分子。多核苷酸的其他改变包含于本发明，并且在本领域的技术范围内。
可选地，描述单链抗体产生的技术(美国专利第4,694,778号；Bird，Science 242：423-442(1988)；Huston等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883(1988)；和Ward等，Nature 334：544-554(1989))可适以产生单链抗体。单链抗体通过由氨基酸桥连接Fv区的重链和轻链片段产生单链抗体而形成。用于在大肠杆菌中装配功能性Fv片段的技术也可使用(Skerra等，Science 242：1038-1041(1988))。
在另一个实施方案中，可通过显微操作选择淋巴细胞，并分离可变基因。例如，外周血单核细胞可从免疫接种或天然免疫的哺乳动物(例如，人)中分离，并在体外培养约7天。培养物可用来筛选满足筛选标准的特定IgG。分离阳性孔的细胞。单个产生Ig的B细胞可通过FACS或通过在补体介导的溶血噬斑测定中鉴定这些细胞而被分离。产生Ig的B细胞可通过显微操作放入管内，并使用例如RT-PCR来扩增VH和VL基因。VH和VL基因可被克隆到抗体表达载体中，并转染进细胞(例如真核或原核细胞)用于表达。
可选地，产生抗体的细胞系可使用熟练的技术人员公知的技术来选择和培养。此类技术描述于多种实验指南和主要出版物中。在这方面，如下文所述适合用于本发明的技术描述于Current Protocolsin Immunology(最新免疫学实验技术)，Coligan等，编辑，GreenPublishing Associates and Wiley-Interscience，John Wiley and S ons，New York(1991)，其通过引用整体并入本文，包括附录。
本发明的抗体可通过本领域已知的用于抗体的合成的任何方法产生，特别是通过化学合成或优选地通过本文所述的重组表达技术来产生。
在一个实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包含合成的恒定区，其中一个或多个结构域被部分或完全缺失(“结构域缺失抗体”)。在某些实施方案中，相容的修饰抗体将包含结构域缺失构建体或变体，其中完整的CH2结构域被去除(ΔCH2构建体)。对其他实施方案，短连接肽可取代缺失结构域来提供可变区的柔性和自由移动。本领域技术人员将理解，由于CH2结构域对抗体分解代谢率的调节特性，此类构建体是特别优选的。结构域缺失构建体可使用编码IgG1人恒定结构域的载体来衍生(参见，例如，WO 02/060955A2和WO02/096948A2)。该载体被改造为缺失CH2结构域，并且提供了表达结构域缺失IgG1恒定区的合成载体。
在某些实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物是微抗体。微抗体可使用本领域描述的方法来制备(参见，例如，美国专利5,837,821或WO 94/09817A1)。
在一个实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物包含具有几个或甚至单个氨基酸的缺失或置换的免疫球蛋白重链，只要其允许单体亚基之间的缔合。例如，在CH2结构域的选择区域的单个氨基酸的突变可足以明显降低Fc的结合，并因此增加肿瘤定位。相似地，可能需要仅缺失一个或多个恒定区结构域中控制待调控的效应物功能(例如补体结合)的那部分。此类恒定区的部分缺失可改善抗体的选择特征(血清半衰期)，同时保持与主体恒定区结构域相关的其他需要的功能的完整。此外，如上文所示，公开的抗体的恒定区可以是通过增强得到的构建体的特征的一个或多个氨基酸的突变或置换合成的。在这方面，可能破坏了保守结合位点提供的活性(例如Fc的结合)，同时基本保持修饰抗体的构型和免疫原性特征。然而其他实施方案包含添加一个或多个氨基酸到恒定区以增强需要的特征(诸如效应物功能)或提供更多的细胞毒素或碳水化合物的连接。在此类实施方案中，可能需要插入或复制来自选择的恒定区结构域的特定序列。
本发明还提供了包含本文所述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)、主要由本文所述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成或由本文所述的抗体分子(例如，VH区和/或VL区)的变体(包括衍生物)组成的抗体，所述抗体或其片段免疫特异地结合疾病相关多肽或其片段或变体。本领域技术人员已知的标准技术可用来在编码抗体的核苷酸序列中引入突变，包括但不限于引起氨基酸置换的位点定向诱变和PCR介导的诱变。优选地，变体(包括衍生物)编码相对于参考VH区、VH-CDR1、VH-CDR2、VH-CDR3、VL区、VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的少于50个氨基酸置换、少于40个氨基酸置换、少于30个氨基酸置换、少于25个氨基酸置换、少于20个氨基酸置换、少于15个氨基酸置换、少于10个氨基酸置换、少于5个氨基酸置换、少于4个氨基酸置换、少于3个氨基酸置换、或少于2个氨基酸置换。“保守氨基酸置换”是其中氨基酸残基用具有相似电荷的侧链的氨基酸残基替换的氨基酸置换。具有相似电荷的侧链的氨基酸残基家族在本领域已定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。可选地，突变可沿编码序列的所有或部分随机地引入，诸如通过饱和诱变，筛选得到的突变体的生物活性以鉴定保持活性(例如，与疾病相关多肽结合的能力)的突变体。
例如，可能仅在抗体分子的构架区或仅在CDR区引入突变。引入的突变可以是沉默或中性错义突变，例如没有或很少影响抗体结合抗原的能力，实际上一些此类突变不改变任何氨基酸序列。这些类型的突变可用于优化密码子使用、或改善杂交瘤的抗体产生。密码子优化的编码本发明的抗体的编码区公开于本文其他地方。可选地，非中性错义突变可改变抗体结合抗原的能力。大部分沉默和中性的错义突变的位置可能在构架区，而大部分非中性错义突变的位置可能在CDR，尽管这不是绝对的要求。本领域技术人员将能设计和测试具有需要的特性的突变体分子，诸如没有改变抗原结合活性或改变了结合活性(例如，抗原结合活性的改善或抗体特异性的改变)。诱变后，编码蛋白可常规地被表达，编码蛋白的功能和/或生物学活性(例如，免疫特异地与疾病相关多肽的至少一个表位结合的能力)可使用本文所述的技术或通过本领域已知的常规修饰技术来确定。
IV.编码抗体的多核苷酸
根据上文，本发明还涉及编码本发明的结合分子(例如，抗体)的多核苷酸。在抗体的情况中，该多核苷酸可编码上文所述的抗体的免疫球蛋白链的至少可变区。编码上述抗体的本发明的多核苷酸可以是例如，DNA、cDNA、RNA或合成产生的DNA或RNA或重组产生的包含单独或组合的上述多核苷酸的任一种的嵌合核酸分子。优选地，所述多核苷酸是载体的一部分。此类载体可包含允许在适合的宿主细胞和适合的条件下选择所述载体的诸如标志基因的其他基因。优选地，本发明的多核苷酸可操作地与允许在原核或真核细胞中表达的表达控制序列相连。所述多核苷酸的表达包括多核苷酸转录为可翻译的mRNA。确保在真核细胞(优选地哺乳动物细胞)中表达的调节元件是本领域技术人员公知的。这些调节元件通常包括确保转录起始的调节序列和任选地确保转录终止和转录物稳定的poly-A信号。其他调节元件可包括转录以及翻译增强子和/或天然缔合或异源的启动子区。
编码抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可主要由任何多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸组成，其可以是未修饰的RNA或DNA或修饰的RNA或DNA。例如，编码抗体、或其抗原结合片段、变体或衍生物的多核苷酸可主要由单链和双链DNA、单链和双链区混合物的DNA、单链和双链RNA、和单链和双链区混合物的RNA、包含可以是单链或更通常是双链的DNA和RNA或单链和双链区混合物的杂种分子组成。另外，编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可主要由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区组成。编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸也可含有一个或多个修饰碱基或为了稳定性或其他原因修饰的DNA或RNA主链。“修饰”碱基包括例如，三苯甲基化碱基和不常见的碱基，诸如肌苷。可对DNA和RNA进行多种修饰；因此，“多核苷酸”包括化学、酶促或代谢修饰的形式。
编码来自免疫球蛋白(例如，免疫球蛋白重链部分或轻链部分)的多肽的非天然变体的分离多核苷酸可通过将一种或多种核苷酸置换、添加或缺失引入免疫球蛋白的核苷酸序列以便一种或多种氨基酸置换、添加或缺失被引入编码蛋白来产生。可通过标准技术引入突变，诸如位点定向诱变和PCR介导的诱变。优选地，在一个或多个非必需氨基酸残基处进行保守氨基酸置换。
如公知，可通过标准技术从原始的杂交瘤细胞或从其他转化细胞中分离RNA，所述标准技术诸如异硫氰酸胍提取和沉淀，然后离心或层析。需要时，可通过标准技术从总RNA中分离mRNA，所述标准技术诸如寡聚dT纤维素层析。适当的技术为本领域所熟悉。
在一个实施方案中，编码抗体轻链和重链的cDNA可根据公知的方法使用反转录酶和DNA聚合酶同时或分开制备。PCR可由共有恒定区引物或由基于公布的重链和轻链DNA和氨基酸序列的更特异的引物来起始。如上文讨论，PCR也可用来分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在这种情况中，可用共有引物或更大的同源探针(诸如小鼠恒定区探针)来筛选文库。
DNA，一般为质粒DNA，可使用本领域已知的技术从细胞中分离，根据详述于例如前文关于重组DNA技术的参考文献的标准公知的技术进行限制性酶切作图并测序。当然，根据本发明，DNA可以是在分离过程或随后分析期间的任一点合成的。
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、主要由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成的分离多核苷酸，其中重链可变区的CDR的至少一个或重链可变区的VH-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。可选地，VH的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考重链VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。因此，根据该实施方案，本发明的重链可变区具有与表4所示的多肽序列相关的VH-CDR1、VH-CDR2或VH-CDR3多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸、主要由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成或由编码免疫球蛋白轻链可变区(VL)的核酸组成的分离多核苷酸，其中轻链可变区的VL-CDR的至少一个或轻链可变区的VL-CDR的至少两个与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。可选地，VL的VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3区与来自本文公开的抗体的参考轻链VL-CDR1、VL-CDR2和VL-CDR3的氨基酸序列至少80％、85％、90％或95％是相同的。因此，根据该实施方案，本发明的轻链可变区具有与表4所示的多肽序列相关的VL-CDR1、VL-CDR2或VL-CDR3多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸、主要由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成或由编码免疫球蛋白重链可变区(VH)的核酸组成的分离多核苷酸，其中VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3区具有与表4所示的VH-CDR1、VH-CDR2和VH-CDR3组相同的多肽序列。
如本领域所已知，两个多肽或两个多核苷酸之间的“序列同一性”通过比较一个多肽或多核苷酸的氨基酸或核酸序列与第二个多肽或多核苷酸的序列来确定。当在本文讨论时，任何特定的多肽与另一个多肽是否至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％相同可使用本领域已知的方法和计算机程序/软件来确定，诸如但不限于，BESTFIT程序(Wisconsin序列分析程序包，针对Unix的版本8，Genetics Computer Group，University Research Park，575Science Drive，Madison，WI 53711)。BESTFIT使用Smith和Waterman，Advances in Applied Mathematics2：482-489(1981)的局部同源性算法来发现两个序列之间同源性最好的区段。当使用BESTFIT或任何其他序列比对程序确定特定序列与根据本发明的参考序列是否例如95％相同时，当然，参数设置为以便对参考多肽序列的全长计算同一性百分比，并允许参考序列中氨基酸总数最多5％的同源性缺口。
表5：新表位特异抗体的VH区的多核苷酸序列。
  抗体   可变重链序列
  NI-101.10(SEQ IDNO：3)   GAGGTGCAGCTAGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCGCCTTCAGTAGCTATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAACTAAAAAATACTATACAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGTATAGGAGCTCGGCGGGGGCCGTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  NI-101.11(SEQ IDNO：56)   GAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCGCCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAACTAAAAAATACTATACAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGTATAGGAGCTCGGCGGGGGCCGTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  NI-101.11(SEQ IDNO：5)(密码子优化)   GAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGGAGCCTGCGGCTGAGCTGCGCCGCCAGCGGCTTCGCCTTCAGCAGCTACGGCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCCGTGATCTGGTTCGACGGCACCAAGAAGTACTACACCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACACCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGGACCGGGGCATCGGCGCCCGGCGGGGCCCCTACTACATGGACGTGTGGGGCAAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC
  NI-101.12(SEQ IDNO：9)   GAGGTGCAGCTGGTGGAGAGCGGCCCCGGCCTGGTGAAGCCCGCCGAGACCCTGAGCCTGACCTGCACCGTGAGCGGCGGCAGCATCCGGAGCGGCAGCATCTGCTGGTACTGGATCCGGCAGCCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACTTCTGCTACAGCGGCGCCACCTTCTACACCCCCAGCCTGCGGGGCCGGCTGACCATCAGCGTGGACGCCAGCAAGAACCAGCTGAGCCTGAGCCTGAGCAGCGTGACCGCCGCCGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGGCGGGCCGGCGAGAACAGCGGCGGCATCGAGCCCTACTACGGCATGGACGTGTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGAGCAGC
  NI-101.13(SEQ IDNO：13)   CAGGTACAGCTGCAGGAGTCAGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGAAGAAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGAGTGGAAGTATCCATTATAGCGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCTGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTTACCGCCGCAGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGATCACGTTGGGGCAGCAGCTGGGTATTTGACTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACCGTCTCTTCG
  NI-101.12F6A(SEQ IDNO：38)   CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCGTCTGGATTCGCCTTCAGTAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATGGTTTGATGGAACTAAAAAATACTATACAGACTCCGTGAAGGGCAGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACACCCTGAGAGCCGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGATAGGGGTATAGGAGCTCGGCGGGGGCCGTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA
  NI-101.13A(SEQ IDNO：52)   CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGAAGAAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGAGTGGAAGTATCCATTATAGCGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCTGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTTACCGCCGCAGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGATCACGTTGGGGCAGCAGCTGGGTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
  NI-101.13B(SEQ IDNO：53)   CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAGCAGAAGAAGTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGTCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGAGTGGAAGTATCCATTATAGCGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCTGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTTACCGCCGCAGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGATCACGTTGGGGCAGCAGCTGGGTATTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCG
表6：新表位特异抗体的VL区的多核苷酸序列。
  抗体   可变轻链序列(κ或λ)
  NI-101.10和NI-101.11(SEQ IDNO：7)   GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGAGTTACAGTACCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTCGAGATCAAACGTACG
  NI-101.12(SEQ IDNO：11)   GACGAGATCGTGCTGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCATCGGCGACCGGGTGACCATCACCTGCCGGGCCAGCGAGAGCATCAACAAGTACGTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTGCTGATCTACGCCGCCAGCAGCCTGCAGAGCGGCGCCCCCAGCCGGGTGAGCGGCAGCGGCTTCGGCCGGGACTTCAGCCTGACCATCAGCGGCCTGCAGGCCGAGGACTTCGGCGCCTACTTCTGCCAGCAGAGCTACAGCGCCCCCTACACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACC
  NI-101.13(SEQ ID   CAGAGCGTGCTGACCCAGCCGCCGAGCGCGAGCGGCACCCCGGGCCAGCGCGTGACCATTAGCTGCAGCGGCAGCAGCAGCAACATTGGCAGCAACTATGTGTATTGGTATCAGCAGCCGCCGGGCA
  NO：15)   CCGCGCCGAAACTGCTGATTTATCGCAACAACCAGCGCCCGAGCGGCGTGCCGGATCGCTTTAGCGGCAGCAAAAGCGGCACCAGCGCGAGCCTGGCGATTAGCGGCCTGCGCAGCGAAGATGAAGCGGATTATTATTGCGCGGCGTGGGATGATAGCCTGAGCGGCTATGTGTTTGGCACCGGCACCAAAGTGACCGTGCTG
  NI-101.12F6A (SEQ IDNO：40)   GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAACAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAGCAGAGTTACAGTACCCCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGT
  NI-101.13A(SEQ IDNO：54)   GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAGCAGCTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAACAGAGTTACAGTACCAGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGTACG
  NI-101.13B(SEQ IDNO：55)   GACATCCAGTTGACCCAGTCTCCTTCCACCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCCAGTCAGAGTATTAGTAGCTGGTTGGCCTGGTATCAGCAGATTCCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATAAGGCGTCTAGTTTAGAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGATGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATAATAGTTATTCTCGAACGTTCGGCCAAGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGTACG
在这方面，本领域技术人员将容易理解，编码轻链和/或重链的至少可变结构域的多核苷酸可编码两条免疫球蛋白链或仅一条的可变结构域。同样地，所述多核苷酸可处于相同启动子的控制下，或者可被分开控制用于表达。允许在原核宿主细胞中表达的可能的调节元件包含例如，在大肠杆菌中的PL、lac、trp或tac启动子，允许在真核宿主细胞中表达的调节元件的实例是在酵母中的AOX1或GAL1启动子或在哺乳动物或其他动物细胞中的CMV-、SV40-、RSV-启动子、CMV-增强子、SV40-增强子或珠蛋白内含子。除了负责转录起始的元件外，此类调节元件还可包含多核苷酸下游的转录终止信号，诸如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。此外，取决于使用的表达系统，能指引多肽到细胞区室或将其分泌到培养基中的前导序列可加到本发明的多核苷酸的编码序列中，并且是本领域公知的。前导序列在适当的时期与翻译起始和终止序列一起装配，并且优选地前导序列能指引翻译蛋白或其部分分泌到周质间隙或胞外介质。任选地，异源序列可编码包括产生需要的特征(例如，表达的重组产物的稳定性或简化纯化)的C-或N-末端鉴定肽的融合蛋白。在这方面，适合的表达载体是本领域已知的，诸如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pCDM8、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(Invitrogen)、或pSPORT1(GIBCOBRL)。优选地，表达控制序列将是在能转化或转染真核宿主细胞的载体中的真核启动子系统，但也可使用原核宿主的控制序列。一旦载体掺入适当的宿主，该宿主保持在适合核苷酸序列高水平表达的条件下，如果需要，然后可收集和纯化免疫球蛋白轻链、重链、轻链/重链二聚体或完整的抗体、结合片段或其他免疫球蛋白形式；参见，Beychok，Cells of Immunoglobulin Synthesis(免疫球蛋白合成的细胞)，Academic Press，N.Y.，(1979)。
本发明还包括本发明的多核苷酸的片段，如其他地方所述。另外本文所述的编码融合多核苷酸、Fab片段和其他衍生物的多核苷酸也涵盖于本发明。
多核苷酸可通过本领域已知的任何方法来产生或制备。例如，如果抗体的核苷酸序列已知，编码抗体的多核苷酸可由化学合成的寡核苷酸装配(例如，描述于Kutmeier等，BioTechniques 17：242(1994))，简单地说，这涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成、上述寡核苷酸的退火和连接，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
可选地，编码抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的多核苷酸可从来自适合来源的核酸产生。如果含有编码特定抗体的核酸的克隆不可用，但抗体分子的序列已知，则编码抗体的核酸可化学地合成或从适合来源(例如，抗体cDNA文库、或从表达新抗原特异抗体的任何组织或细胞产生的cDNA文库、或从表达新抗原特异抗体的任何组织或细胞(诸如选择来表达抗体的杂交瘤细胞)分离的核酸，优选地poly A+RNA)获得，通过使用可与序列的3′和5′末端杂交的合成引物的PCR扩增，或通过使用特异于特定基因序列的寡核苷酸探针的克隆来例如从编码抗体的cDNA文库鉴定cDNA克隆。然后可使用本领域公知的任何方法将通过PCR产生的扩增的核酸克隆到可复制的克隆载体中。
一旦确定了抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的核苷酸序列和对应的氨基酸序列，其核苷酸序列可使用本领域公知的用于核苷酸序列操作的方法来操作，所述方法例如重组DNA技术、位点定向诱变、PCR等(参见，例如，描述于Sambrook等，MolecularCloning，A Laboratory Manual(分子克隆实验指南)，第二版，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1990)和Ausubel等，编辑，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验技术)，John Wiley & Sons，NY(1998)的技术，两者都通过引用整体并入本文)，以便产生具有不同氨基酸序列的抗体，例如产生氨基酸置换、缺失和/或插入。
V.抗体多肽的表达
本发明还涉及用于产生能表达本发明的抗体或其对应的免疫球蛋白链的细胞的方法，该方法包括用本发明的多核苷酸或载体遗传改造细胞。可通过本发明的方法获得的细胞可用于例如测试本发明的抗体与其抗原的相互作用。
提供本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的分离遗传材料的操作后，编码抗体的多核苷酸一般被插入表达载体，以便引入可用来产生需要量抗体的宿主细胞。
与靶分子结合的抗体或其片段、衍生物或类似物(例如抗体的重链或轻链)的重组表达描述于本文。一旦获得了本发明的编码抗体分子或抗体的重链或轻链或其部分(优选地含有重链或轻链可变结构域)的多核苷酸，用于产生抗体分子的载体可使用本领域公知的技术通过重组DNA技术产生。因此，通过表达含有编码抗体的核苷酸序列的多核苷酸制备蛋白的方法描述于本文。本领域技术人员公知的方法可用来构建含有抗体编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如，体外重组DNA技术、合成技术和体内遗传重组。因此本发明提供了包含可操作地与启动子相连的编码本发明的抗体分子、或其重链或轻链、或重链或轻链可变结构域的核苷酸序列的可复制载体。此类载体可包括编码抗体分子恒定区的核苷酸序列(参见，例如，PCT公布WO 86/05807；PCT公布WO 89/01036；和美国专利第5,122,464号)，并且抗体的可变结构域可被克隆到此类载体中用于完整重链或轻链的表达。
本发明涉及常规用于遗传工程的载体，特别是质粒、粘粒、病毒和噬菌体，所述载体包含编码抗原或优选地本发明的抗体的免疫球蛋白链的可变结构域的多核苷酸；任选地与编码本发明的抗体的其他免疫球蛋白链的可变结构域的本发明的多核苷酸组合。优选地，所述载体是表达载体和/或基因转移或靶向载体。来自诸如反转录病毒、痘苗病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒或牛乳头状瘤病毒的病毒的表达载体可用于将本发明的多核苷酸或载体递送到被靶向的细胞群体。本领域技术人员公知的方法可用来构建重组病毒载体；参见，例如，描述于Sambrook，Molecular Cloning A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.和Ausubel，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验技术)，Green Publishing Associates and Wiley Interscience，N.Y.(1994)的技术。可选地，本发明的多核苷酸和载体可重构到脂质体中用于递送至靶细胞。含有本发明的多核苷酸(例如，免疫球蛋白链重链和/或轻链可变结构域的编码序列和表达控制序列)的载体可通过公知的方法转移到宿主细胞，所述方法根据细胞宿主的类型而不同。例如，氯化钙转染通常用于原核细胞，而磷酸钙处理或电穿孔可用于其他细胞宿主；参见Sambrook，上文。
术语“载体”或“表达载体”在本文用来指根据本发明用作引入宿主细胞并在宿主细胞中表达需要的基因的介质的载体。如本领域技术人员所知，此类载体可容易地选自由质粒、噬菌体、病毒和反转录病毒组成的组。一般而言，与本发明相容的载体将包含选择标志、适当的限制酶切位点以便有助于需要的基因的克隆和进入真核或原核细胞和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
为了本发明的目的，可采用许多表达载体系统。例如，一类载体利用来自诸如牛乳头状瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒、反转录病毒(RSV、MMTV或MOMLV)或SV40病毒的动物病毒的DNA元件。其他载体涉及使用具有内部核糖体结合位点的多顺反子系统。另外，DNA被整合进其染色体的细胞可通过引入允许选择转染的宿主细胞的一种或多种标志来选择。标志可为营养缺陷型宿主提供原养、杀虫剂抗性(例如，抗生素)或对诸如铜的重金属的抗性。选择标志基因可直接与待表达的DNA序列相连，或者可通过共转化被引入同一细胞中。其他元件可能是mRNA的最佳合成所需要的。这些元件可包括信号、剪接信号、以及转录启动子、增强子和终止信号。
在特别优选的实施方案中，克隆的可变区基因与如上文讨论合成的重链和轻链恒定区基因(优选地人的)一起插入表达载体。在一个实施方案中，这是使用称为NEOSPLA的Biogen IDEC，Inc.的专有表达载体实现的(公开于美国专利6,159,730)。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子、小鼠β珠蛋白主要启动子、SV40复制起点、牛生长激素多聚腺苷化序列、新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2、二氢叶酸还原酶基因和前导序列。掺入可变区和恒定区基因、转染到CHO细胞中、然后在含有G418的培养基选择和氨甲蝶呤扩增之后，发现该载体导致非常高水平的抗体表达。当然，能引起在真核细胞中表达的任何表达载体可用在本发明中。适合的载体的实例包括但不限于质粒pcDNA3、pHCMV/Zeo、pCR3.1、pEF1/His、pIND/GS、pRc/HCMV2、pSV40/Zeo2、pTRACER-HCMV、pUB6/V5-His、pVAX1和pZeoSV2(可从Invitrogen，San Diego，CA获得)和质粒pCI(可从Promega，Madison，WI获得)。一般而言，筛选大量转化细胞中表达适合高水平的免疫球蛋白重链和轻链的细胞是可例如通过机器人系统进行的常规实验。载体系统还教导于美国专利第5,736,137和5,658,570号，其每个通过引用整体并入本文。该系统提供了高表达水平，例如，＞30pg/细胞/天。其他示例性载体系统公开于例如美国专利6,413,777。
在其他优选实施方案中，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可使用多顺反子构建体来表达，诸如公开于2002年11月18日提交的美国专利申请公布第2003-0157641 A1号的那些，其整体并入本文。在这些新的表达系统中，感兴趣的多种基因产物(诸如抗体的重链和轻链)可从单个多顺反子构建体产生。这些系统有利地使用内部核糖体进入位点(IRES)来提供相对高水平的抗体。相容的IRES序列公开于美国专利第6,193,980号，其也并入本文。本领域技术人员将理解，此类表达系统可用来有效地产生本应用公开的全套抗体。
更一般地，一旦制备了编码抗体的单体亚基的载体或DNA序列，可将表达载体引入适当的宿主细胞。将质粒引入宿主细胞可通过本领域技术人员公知的各种技术来实现。这些技术包括但不限于，转染(包括电泳和电穿孔)、原生质体融合、磷酸钙沉淀、细胞与包被DNA的融合、显微注射和完整病毒的感染。参见，Ridgway，A.A.G.″Mammalian Expression Vectors(哺乳动物表达载体)″Vectors，Rodriguez和Denhardt，编辑，Butterworths，Boston，Mass.，第24.2章，第470-472页(1988)。将质粒引入宿主一般是通过电穿孔。含有表达构建体的宿主细胞在适合轻链和重链产生的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白的合成。示例性测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、或荧光激活细胞分选分析(FACS)、免疫组织化学和类似技术。
表达载体通过常规技术转移到宿主细胞中，然后转染的细胞通过常规技术培养以产生用于本文所述的方法的抗体。因此，本发明包括含有可操作地与异源启动子相连的编码本发明的抗体或其重链或轻链的多核苷酸的宿主细胞。在表达双链抗体的优选实施方案中，编码重链和轻链的载体可在宿主细胞中共表达以便表达完整的免疫球蛋白分子，如下文详述。
本发明还涉及用本发明的多核苷酸或载体转化的宿主细胞。所述宿主细胞可以是原核或真核细胞。存在于宿主细胞的本发明的多核苷酸或载体可整合到宿主细胞的基因组中，或者其可保持在染色体外。宿主细胞可以是任何原核或真核细胞，诸如细菌、昆虫、真菌、植物、动物或人的细胞。优选的真菌细胞是例如，酿酒酵母(Saccharomyces)属的那些，特别是酿酒酵母种(S.cerevisiae)的那些。术语“原核的”意图包括可用DNA或RNA分子转化或转染以表达本发明的抗体或对应免疫球蛋白链的所有细菌。原核宿主可包括革兰氏阴性以及革兰氏阳性细菌，诸如，例如，大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。术语“真核的”意图包括酵母、高等植物、昆虫和优选地哺乳动物细胞，最优选地HEK 293、NSO和CHO细胞。取决于在重组产生程序中采用的宿主，本发明的多核苷酸编码的抗体或免疫球蛋白链可以是糖基化的或可以是非糖基化的。本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链还可包括起始甲硫氨酸氨基酸残基。使用本领域普通技术人员通常已知的任何技术，本发明的多核苷酸可用来转化或转染宿主。此外，用于制备融合、可操作连接的基因并在例如哺乳动物细胞和细菌中表达这些基因的方法是本领域公知的(Sambrook，Molecular Cloning：A LaboratoryManual(分子克隆实验指南)，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY，1989)。本文所述的遗传构建体和方法可用于在真核或原核宿主中表达本发明的抗体或对应的免疫球蛋白链。一般而言，含有有助于插入的多核苷酸有效转录的启动子序列的表达载体可与宿主一起使用。表达载体一般含有复制起点、启动子和终止子，以及能提供转化细胞的表型选择的特定基因。用于免疫球蛋白表达和分泌的DNA序列和宿主细胞的适合的来源细胞可从许多来源获得，诸如美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection)(″Catalogue of cell lines and Hybridomas(细胞系和杂交瘤目录)，″，第五版(1985)Rockville，Maryland，U.S.A.，其通过引用并入本文)。此外，包含本发明的细胞的转基因动物(优选地哺乳动物)可用于大规模产生本发明的抗体。
因此，在进一步的实施方案中，本发明涉及用于产生疾病相关蛋白特异性结合分子(例如抗体或其结合片段或免疫球蛋白链)的方法，所述方法包括
(a)培养上文所述细胞；和
(b)从培养物中分离所述抗原、结合分子、抗体或其结合片段或免疫球蛋白链。
转化的宿主可生长于发酵罐中，并根据本领域已知的技术培养以获得最佳的细胞生长。一旦表达，本发明的完整的抗体、其二聚体、单个轻链和重链、或其他免疫球蛋白形式可根据本领域标准程序纯化，包括硫酸铵沉淀、亲和柱、柱层析、凝胶电泳和类似程序；参见Scopes，″Protein Purification(蛋白纯化)″，Springer Verlag，N.Y.(1982)。然后可从生长培养基、细胞裂解物或细胞膜级分中分离本发明的抗体或其对应的免疫球蛋白链。例如本发明的重组表达的抗体或免疫球蛋白链的分离和纯化可通过任何常规的手段，诸如，例如，制备型层析分离和诸如涉及使用针对本发明的抗体的恒定区的单克隆或多克隆抗体的免疫分离。对本领域技术人员将是明显的，本发明的抗体可进一步与用于例如药物靶向和成像应用的其他部分偶联。此类偶联可在抗体或抗原表达之后化学地引导至连接位点，或者偶联产物可在DNA水平改造到本发明的抗体或抗原中。然后DNA在适合的宿主系统中表达，表达的蛋白被收集和复性(如果需要)。
至少约90至95％同质性的基本纯的免疫球蛋白是优选的，98％至99％或更高的同质性是药物用途最优选的。一旦部分纯化或纯化到需要的同质性，则抗体可治疗地(包括体外)使用或用于开发和执行测定程序。
宿主细胞可与本发明的两个表达载体共转染，第一个载体编码重链衍生的多肽，第二个载体编码轻链衍生的多肽。两个载体可含有允许重链和轻链多肽同等表达的相同的选择标志。可选地，可使用编码重链和轻链多肽两者的单个载体。在此类情况中，轻链有利地置于重链之前以避免毒性游离重链的过量(Proudfoot，Nature322：52(1986)；Kohler，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：2197(1980))。重链和轻链的编码序列可包含cDNA或基因组DNA。
如本文所用，“宿主细胞”指含有使用重组DNA技术构建并编码至少一个异源基因的载体的细胞。在描述从重组宿主中分离抗体的方法中，术语“细胞”和“细胞培养物”可互换使用来表示抗体的来源，除非另外清楚指定。换句话说，从“细胞”中回收多肽可意指从旋下的完整细胞中，或者从含有培养基和悬浮细胞的细胞培养物中回收多肽。
多种宿主表达载体系统可用来表达用于本文所述的方法的抗体分子。此类宿主表达系统代表感兴趣的编码序列可通过其产生并随后被纯化的介质，也代表当用适当的核苷酸编码序列转化或转染时原位表达本发明的抗体分子的细胞。这些宿主表达系统包括但不限于用含有抗体编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的诸如细菌(例如，大肠杆菌、枯草芽孢杆菌)的微生物；用含有抗体编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酿酒酵母，毕赤酵母(Pichia))；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用含有抗体编码序列的重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染的、或用含有抗体编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或带有含有来自哺乳动物细胞基因组的启动子(例如，金属硫蛋白启动子)或来自哺乳动物病毒的启动子(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BLK、293、3T3细胞)。优选地，特别用于表达完整的重组抗体分子的细菌细胞(诸如大肠杆菌)和更优选地真核细胞用于表达重组抗体分子。例如，诸如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的哺乳动物细胞连同诸如来自人巨细胞病毒的主要即时(intermediate)早期基因启动子元件的载体是有效的抗体表达系统(Foecking等，Gene 45：101(1986)；Cockett等，Bio/Technology 8：2(1990))。
用于蛋白表达的宿主细胞系通常是哺乳动物来源的；相信本领域技术人员有能力优先确定最适合需要的基因产物在其中表达的特定宿主细胞系。示例性宿主细胞系包括但不限于，CHO(中国仓鼠卵巢)、DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢系，DHFR-)、HELA(人颈癌)、CVI(猴肾系)、COS(具有SV40T抗原的CVI的衍生物)、VERY、BHK(幼仓鼠肾)、MDCK、293、WI38、R1610(中国仓鼠成纤维细胞)、BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)、HAK(仓鼠肾系)、SP2/O(小鼠骨髓瘤)、P3x63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)、BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)、RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。CHO细胞是特别优选的。宿主细胞系一般可从商业机构美国组织培养物保藏中心或从发表的文献获得。
另外，可选择调控插入序列表达、或以需要的特定方式修饰和加工基因产物的宿主细胞株。蛋白产物的此类修饰(例如，糖基化)和加工(例如，切割)对蛋白的功能可能是重要的。不同的宿主细胞具有特征的和特定的蛋白和基因产物的翻译后加工和修饰机制。可选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的外源蛋白的正确修饰和加工。为达到这一目的，可使用具有用于初级转录物的正确加工、基因产物的糖基化和磷酸化的细胞机器的真核宿主细胞。
为了重组蛋白长期、高产率的产生，稳定表达是优选的。例如，稳定表达抗体分子的细胞系可被改造。不使用含有病毒复制起点的表达载体，宿主细胞可以用适当表达控制元件(例如，启动子、增强子序列、转录终止子、多聚腺苷化位点等)控制的DNA和可选择标志来转化。引入外源DNA之后，允许改造的细胞在富集培养基中生长1-2天，然后转换为选择培养基。重组质粒中的可选择标志赋予对选择的抗性，并允许细胞将质粒稳定地整合进它们的染色体，并且生长以形成本身可被克隆和扩增成细胞系的转化灶(foci)。该方法可有利地用于改造稳定表达抗体分子的细胞系。
可使用许多选择系统，包括但不限于单纯疱疹病毒胸苷激酶(Wigler等，Cell 11：223(1977))、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Szybalska & Szybalski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48：202(1992))、和腺嘌呤磷酸核糖转移酶(Lowy等，Cell 28：817 1980)基因可分别用于tk-、hgprt-或aprt-细胞。抗代谢物抗性也可用作下述基因选择的基础：dhfr，赋予对氨甲蝶呤的抗性(Wigler等，Natl.Acad.Sci.USA 77：357(1980)；O′Hare等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527(1981))；gpt，赋予对霉酚酸的抗性(Mulligan & Berg，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072(1981))；neo，赋予对氨基糖苷G-418的抗性，Clinical Pharmacy 12：488-505；Wu和Wu，Biotherapy 3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science 260：926-932(1993)；和Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；TIB TECH 11(5)：155-215(1993年5月)；和hygro，赋予对潮霉素的抗性(Santerre等，Gene 30：147(1984)。在重组DNA技术领域通常已知的可用的方法描述于Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology(最新分子生物学实验技术)，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer andExpression(基因转移和表达)，A Laboratory Manual(基因转移和表达实验指南)，Stockton Press，NY(1990)；和Dracopoli等(编辑)，Current Protocols in Human Genetics(最新人类遗传学实验技术)，第12和13章，John Wiley & Sons，NY(1994)；Colberre-Garapin等，J.Mol.Biol.150：1(1981)，其通过引用整体并入本文。
抗体分子的表达水平可通过载体的扩增而增加(综述参见Bebbington和Hentschel，The use of vectors based on geneamplification for the expression of cloned genes in mammalian cells inDNA cloning(用于在哺乳动物细胞中表达克隆的基因的基于基因扩增的载体在DNA克隆中的应用)，Academic Press，New York，第3卷(1987))。当表达抗体的载体系统中的标志可扩增时，存在于宿主细胞培养物中的抑制物水平的提高将增加标志基因的拷贝数。由于扩增区与抗体基因相关，因此抗体的产生也将增加(Crouse等，Mol.Cell.Biol.3：257(1983))。
体外产生允许按比例扩大以产生大量需要的多肽。用于在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术是本领域已知的，并且包括例如在气升式反应器或连续搅拌反应器中的均质悬浮培养，或例如在中空纤维、微囊中、琼脂糖微珠或陶瓷管壳(ceramic cartridge)上的固定或陷入的细胞培养。如果必要和/或需要，多肽溶液可例如在合成的铰链区多肽的优先生物合成之后，或在本文所述的HIC层析步骤之前或之后，通过常规的层析方法来纯化，所述方法例如凝胶过滤、离子交换层析、DEAE-纤维素层析或(免疫)亲和层析。
编码本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的基因也可在非哺乳动物细胞中表达，诸如细菌或昆虫或酵母或植物细胞。容易接纳核酸的细菌包括下述成员：肠杆菌科(enterobacteriaceae)，诸如大肠杆菌或沙门氏菌的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)，诸如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)。应进一步理解，当在细菌中表达时，异源多肽一般成为包涵体的一部分。异源多肽必须被分离、纯化并且然后装配成功能分子。当需要四价形式的抗体时，然后亚基将自动装配成四价抗体(WO02/096948A2)。
在细菌系统中，根据表达的抗体分子的预期用途，可有利地选择许多表达载体。例如，当要产生大量的此类蛋白用于生产抗体分子的药物组合物时，可能需要指引容易纯化的融合蛋白产物高水平表达的载体。此类载体包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等，EMBO J.2：1791(1983))，其中抗体编码序列可按lacZ编码区的阅读框架单独连接到载体中以便产生融合蛋白；pIN载体(Inouye & Inouye，Nucleic Acids Res.13：3101-3109(1985)；VanHeeke & Schuster，J Biol.Chem.24：5503-5509(1989))；和类似载体。pGEX载体也可用于将外源多肽表达为与谷胱甘肽S-转移酶(GST)的融合蛋白。一般而言，此类融合蛋白是可溶的，并且可容易地通过吸附并结合到基质谷胱甘肽-琼脂糖珠上、然后在游离谷胱甘肽存在时洗脱而从裂解细胞中纯化。pGEX载体设计为包括凝血酶或Xa因子蛋白酶剪切位点，以便克隆的靶基因产物可从GST部分释放。
除了原核生物外，还可使用真核微生物。酿酒酵母或常见的面包酵母是最常用的真核微生物，尽管许多其他菌株也常用，例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。
对在酿酒酵母中的表达，例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature282：39(1979)；Kingsman等，Gene 7：141(1979)；Tschemper等，Gene 10：157(1980))是常用的。该质粒已经含有为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母突变株提供选择标志的TRP1基因，例如ATCC第44076号或PEP4-1(Jones，Genetics 85：12(1977))。然后作为酵母宿主细胞基因组特征的trp1缺陷的存在为通过在缺少色氨酸时生长来检测转化提供了有效的环境。
在昆虫系统中，苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)一般用作载体来表达外源基因。病毒在草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞中生长。抗体编码序列可单独克隆到病毒的非必需区域(例如多角体蛋白基因)，并置于AcNPV启动子(例如多角体蛋白启动子)的控制下。
一旦本发明的抗体分子被重组表达，可通过本领域已知的用于纯化免疫球蛋白分子的任何方法来纯化抗体分子，例如，通过层析(例如，离子交换层析、亲和层析、特别是针对蛋白A之后的特定抗原的亲和层析和大小柱层析)、离心、差异溶解(differentialsolubility)、或通过用于蛋白纯化的任何其他的标准技术。可选地，用于增加本发明的抗体的亲和力的优选方法公开于US 20020123057 A1。
VI.融合蛋白和轭合物
本发明的抗体可包含其他结构域，所述结构域通过共价或非共价键相连。键合可基于根据本领域已知和上文所述的方法的遗传融合，或者可通过描述于例如国际申请WO94/04686的例如化学交联来进行。存在于包含本发明的抗体的融合蛋白的其他结构域可优选地通过柔性接头(有利地多肽接头)连接，其中所述多肽接头包含多个亲水的肽键连接的氨基酸，氨基酸的长度足以跨越所述其他结构域的C-末端和本发明的抗体的N-末端之间的距离，或反之亦然。治疗或诊断活性剂可通过各种手段与本发明的抗体或其抗原结合片段偶联。这包括例如，包含本发明的抗体的可变区的单链融合蛋白通过共价方法(诸如肽键合)与治疗或诊断活性剂偶联。其他实例包括包含至少抗原结合片段的分子共价或非共价地与其他分子(包括在下述非限制性例证列表中的那些)偶联。Traunecker，Int.J.Cancer Surp.SuDP 7(1992)，51-52描述了双特异性试剂janusin，其中针对CD3的Fv区与可溶性CD4或与诸如OVCA和IL-7的其他配体偶联。相似地，本发明的抗体的可变区可被构建到Fv分子中，并与诸如在引用的文章中例证的可选配体偶联。Higgins，J.InfectDisease 166(1992)，198-202描述了主要由与针对GP 120的V3区内特定序列的抗体交联的OKT3组成的异型轭合抗体。此类异型轭合抗体也可使用包含在本发明方法的抗体中的至少可变区来构建。特定抗体的其他实例包括描述于Fanger，Cancer Treat.Res.68(1993)，181-194和Fanger，Crit.Rev.Immunol.12(1992)，101-124的抗体。
在本发明的进一步的实施方案中，结合分子、抗体、免疫球蛋白链或其结合片段或抗原被可检测地标记。标记剂可直接或间接与本发明的抗体或抗原偶联。间接偶联的一个实例是通过使用间隔部分。
因此，结合分子(例如，本文鉴定的抗体)的生物活性暗示它们具有足够的亲和力以便使它们成为使药物分别定位于表达疾患细胞和组织的适当表面结构的细胞的潜在候选物。这种靶向和与细胞的结合可用于递送治疗或诊断活性剂和基因治疗/基因递送。具有本发明的抗体的分子/颗粒将特异结合表达病理蛋白变体形式的细胞/组织，因此可能具有诊断和治疗用途。因此，本发明的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)可被标记(例如，荧光、放射性、酶、核磁、重金属)，并用于在体内或体外检测特定的靶，包括体外“免疫化学”类似测定。在体内他们可以与核医学成像技术相似的方式使用来检测表达新表位的组织、细胞或其他材料。因此，在进一步的实施方案中，本发明涉及本发明的结合分子或抗体或其结合片段在制备用于以下的组合物中的用途：用于体内检测或靶向治疗和/或诊断剂至脑中的疾病相关蛋白以便在对象中检测、抑制其形成或减少病理蛋白聚集体或构象，用于改善认知或减缓或逆转与疾患相关的认知衰退，或用于从体液体外提取病理化合物或其前体。
在某些实施方案中，抗体多肽包含正常与抗体无关的氨基酸序列或一个或多个部分。示例性修饰更详细地描述于下文。例如，本发明的单链fv抗体片段可包含柔性接头序列，或者可被修饰以加入功能性部分(例如，PEG、药物、毒素、或标记)。
本发明的抗体多肽可包含融合蛋白、主要由融合蛋白组成、或由融合蛋白组成。融合蛋白是包含例如具有至少一个靶结合位点的免疫球蛋白抗原结合结构域和至少一个异源部分(即自然中不与其天然相连的部分)的嵌合分子。氨基酸序列正常可以在融合多肽中被连接到一起的分开的蛋白存在，或者它们正常可存在于同一蛋白中，但在融合多肽中被置于新的排列。融合蛋白可例如通过化学合成或通过产生并翻译其中肽区域以需要的关系被编码的多核苷酸来产生。
术语“异源”当应用于多核苷酸或多肽时意指来自与同其比较的其余实体不同的实体的多核苷酸或多肽。例如，如本文所用，与抗体、或其抗原结合片段、变体、或类似物融合的“异源多肽”来自同一物种的非免疫球蛋白多肽或不同物种的免疫球蛋白或非免疫球蛋白多肽。
如本文其他地方更详细地讨论，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可进一步与位于N-或C-末端的异源多肽重组地融合或与多肽或其他组合物化学轭合(包括共价和非共价轭合)。例如，抗体可与在检测测定中用作标记的分子和诸如异源多肽、药物、放射性核素或毒素的效应物分子重组地融合或轭合。参见，例加，PCT公布WO 92/08495；WO 91/14438；WO 89/12624；美国专利第5,314,995号；和EP 396,387。
本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可主要由通过肽键或修饰肽键(即肽等构物)彼此相连的氨基酸组成，并且可含有除了20个基因编码的氨基酸外的其他氨基酸。抗体可通过天然方法(诸如翻译后加工)或通过本领域公知的化学修饰技术而被修饰。此类修饰清楚描述于基础教本和更详细的专著以及长篇研究文献中。修饰可在抗体的任何位置发生，包括肽主链、氨基酸侧链和氨基或羧基末端、或在诸如碳水化合物的部分。应理解，同样类型的修饰可以相同或不同程度存在于特定抗体的几个位点。特定抗体还可含有许多类型的修饰。抗体例如由于泛素化可以是分支的，抗体可以是分支或不分支的环状。环状、分支和分支的环状抗体可产生于翻译后的天然过程，或者可通过合成方法产生。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、黄素的共价连接、血红素部分的共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂质或脂质衍生物的共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲基化、共价交联的形成、半胱氨酸的形成、焦谷氨酸的形成、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、GPI锚的形成、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化、异戊二烯化、外消旋化、硒化、硫酸化、诸如精氨酰化的转移-RNA介导的添加氨基酸到蛋白质和泛素化。(参见，例如，Proteins-Structure And Molecular Properties(蛋白-结构和分子特性)，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York第2版(1993)；Posttranslational Covalent Modification Of Proteins(蛋白质的翻译后共价修饰)，B.C.Johnson，编辑，Academic Press，New York，第1-12页(1983)；Seifter等，Meth Enzymol 182：626-646(1990)；Rattan等，Ann NY Acad Sci 663：48-62(1992))。
本发明还提供了包含抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物和异源多肽的融合蛋白。在一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含、主要由、或由具有本发明的抗体的VH区的任一个或多个的氨基酸序列、或本发明的抗体或其片段或变体的VL区的任一个或多个的氨基酸序列和异源多肽序列的多肽组成。在另一个实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含、主要由、或由具有抗体或其片段、变体、或衍生物的VH-CDR的任一个、两个、三个的氨基酸序列、或抗体或其片段、变体、或衍生物的VL-CDR的任一个、两个、三个的氨基酸序列和异源多肽序列的多肽组成。在一个实施方案中，融合蛋白包含具有本发明的抗体、或其片段、衍生物、或变体的VH-CDR3的氨基酸序列和异源多肽序列的多肽，所述融合蛋白特异结合疾病相关蛋白的至少一个新表位。在另一个实施方案中，融合蛋白包含具有本发明的抗体的至少一个VH区的氨基酸序列和本发明的抗体或其片段、衍生物或变体的至少一个VL区的氨基酸序列和异源多肽序列的多肽。优选地，融合蛋白的VH和VL区对应于特异结合疾病相关蛋白的至少一个新表位的单一来源的抗体(或scFv或Fab片段)。在另一个实施方案中，用于本文公开的诊断和治疗方法的融合蛋白包含具有抗体的VH CDR的任一个、两个、三个或多个的氨基酸序列和抗体或其片段或变体的VL CDR的任一个、两个、三个或多个的氨基酸序列和异源多肽序列的多肽。优选地，VH-CDR或VL-CDR的两个、三个、四个、五个、六个或多个对应于单一来源的本发明的抗体(或scFv或Fab片段)。编码这些融合蛋白的核酸分子也包含于本发明中。
报道于文献中的示例性融合蛋白包括以下的融合体：T细胞受体(Gascoigne等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：2936-2940(1987))；CD4(Capon等，Nature 337：525-531(1989)；Traunecker等，Nature339：68-70(1989)；Zettmeissl等，DNA Cell Biol.USA 9：347-353(1990)；和Byrn等，Nature 344：667-670(1990))；L-选择蛋白(归巢受体)(Watson等，J.Cell.Biol.110：2221-2229(1990)；和Watson等，Nature 349：164-167(1991))；CD44(Aruffo等，Cell 61：1303-1313(1990))；CD28和B7(Linsley等，J.Exp Med.173：721-730(1991))；CTLA-4(Lisley等，J.Exp.Med.174：561-569(1991))；CD22(Stamenkovic等，Cell 66：1133-1144(1991))；TNF受体(Ashkenazi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10535-10539(1991)；Lesslauer等，Eur.J.Immunol.27：2883-2886(1991)；和Peppel等，J.Exp.Med.174：1483-1489(1991))；和IgE受体a(Ridgway和Gorman，J Cell.Biol.第115卷，摘要第1448页(1991))。
如在本文其他地方讨论，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可与异源多肽融合以便增加多肽的体内半衰期或用于使用本领域已知方法的免疫测定中。例如，在一个实施方案中，PEG可与本发明的抗体轭合以便增加抗体在体内的半衰期。Leong，S.R.等，Cytokine 16：106(2001)；Adv.in Drug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions 30：512(2002)。
此外，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可与诸如肽的标志序列融合以便有助于抗体的纯化或检测。在优选的实施方案中，标志氨基酸序列是六联-组氨酸肽，诸如pQE载体(QIAGEN，Inc.，9259 Eton Avenue，Chatsworth，Calif，91311)和其他载体中提供的标签，这些载体的许多可商业获得。如Gentz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：821-824(1989)所述，例如，六联-组氨酸提供了融合蛋白的方便的纯化。用于纯化的其他肽标签包括但不限于对应于来自流感血凝素蛋白的表位的“HA”标签(Wilson等，Cell37：767(1984))和“flag”标签。
融合蛋白可使用本领域公知的方法来制备(参见例如美国专利第5,116,964和5,225,538号)。融合体产生的精确位点可通过经验选择以便优化融合蛋白的分泌或结合特征。然后编码融合蛋白的DNA转染到宿主细胞中以便表达。
本发明的抗体可以非轭合形式使用，或者可与多种分子的至少一种轭合例如以便改善分子的治疗特性、有助于靶的检测、或用于患者的成像或治疗。本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可以在纯化之前或之后、以及当纯化进行时被标记或轭合。
特别地，本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可与治疗剂、前体药物、肽、蛋白、酶、病毒、脂类、生物应答调节物、药剂或PEG轭合。
包括常规抗体的免疫毒素轭合物已在本领域广泛描述。毒素可通过常规偶联技术与抗体偶联，或者含有蛋白毒素部分的免疫毒素可作为融合蛋白产生。本发明的抗体可以对应的方式用来获得此类免疫毒素。此类免疫毒素的例证是由Byers，Seminars Cell.Biol.2(1991)，59-70和Fanger，Immunol.Today 12(1991)，51-54描述的那些。
上述融合蛋白可进一步包含可切割的接头或蛋白水解酶的切割位点。这些间隔部分本身可以是不可溶或可溶的(Diener等，Science 231(1986)，148)，并且可被选择以允许药物在靶位点从抗原释放。可与本发明的抗体和抗原偶联用于免疫治疗的治疗剂的实例为药物、放射性同位素、凝集素和毒素。可与本发明的抗体和抗原轭合的药物包括经典地称为诸如丝裂霉素C、柔红霉素和长春花碱的药物的化合物。在使用放射性同位素轭合的本发明的抗体或抗原用于例如免疫治疗时，取决于诸如白细胞分布以及稳定性和发射的因素，某些同位素可能比其他同位素更优选。取决于自身免疫应答，一些发射体可能比其他发射体更优选。一般而言，发射放射性同位素的α和β粒子在免疫治疗中是优选的。优选的是短程、高能发射体，诸如212Bi。可与本发明的抗体或抗原结合用于治疗目的的放射性同位素的实例包括但不限于125I、131I、90Y、67Cu、64Cu、212Bi、212At、211Pb、47Sc、109Pd和188Re。可与本发明的结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段)偶联的其他治疗剂，以及离体和体内治疗方案是已知的，或者可由本领域普通技术人员容易地确定。在适当的情况中，本领域技术人员可使用编码上述抗体、抗原或对应载体的任一种的本发明的多核苷酸来代替蛋白材料本身。
本领域技术人员将理解，取决于选择的待轭合的物质，轭合物也可使用多种技术被装配。例如，具有生物素的轭合物例如通过结合多肽与诸如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯的生物素的活化酯反应来制备。相似地，具有荧光标志的轭合物可在例如本文所列的偶联剂存在时制备，或者通过与异硫氰酸盐(优选地荧光素-异硫氰酸盐)反应来制备。本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物的轭合物可用相似的方式来制备。
本发明进一步包括与诊断或治疗剂轭合的本发明的抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物。抗体可诊断地使用以便例如，监测神经疾患的发展或进展，作为例如确定特定治疗和/或预防方法的疗效的临床测试程序的一部分。通过将抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物与可检测物质偶联可有助于检测。可检测物质的实例包括各种酶、辅基、荧光材料、发光材料、生物发光材料、放射性材料、使用各种正电子成像术的正电子发射金属和非放射性顺磁金属离子。可与抗体轭合用作根据本发明的诊断剂的金属离子参见，例如，美国专利第4,741,900号。适合的酶的实例包括辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、或乙酰胆碱酯酶；适合的辅基复合体的实例包括链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素；适合的荧光材料的实例包括伞形酮、荧光素、荧光素异硫氰酸盐、罗丹明、二氯三嗪胺荧光素、丹磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的实例包括鲁米诺；生物发光材料的实例包括萤光素酶、萤光素和水母发光蛋白；适合的放射性材料的实例包括125I、131I、111In或99Tc。
抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物也可通过将其与化学发光化合物偶联而被可检测地标记。然后通过检测在化学反应期间产生的发光的存在来确定化学发光-标签抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的实例是鲁米诺、异鲁米诺、theromatic吖啶酯(theromatic acridinium ester)、咪唑、吖啶盐和草酸酯。
抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物可被可检测标记的方式之一是通过将其与酶相连，并在酶免疫测定(EIA)中使用连接产物(Voller，A.，″The Enzyme Linked Immunosorbent Assay(ELISA)(酶联免疫吸附测定(ELISA))″微生物学会季刊，Walkersville，Md.，Diagnostic Horizons 2：1-7(1978))；Voller等，J.Clin.Pathol.31：507-520(1978)；Butler，J.E.，Meth.Enzymol.73：482-523(1981)；Maggio，E.(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶免疫测定)，CRC Press，Boca Raton，FIa.，(1980)；Ishikawa，E.等(编辑)，Enzyme Immunoassay(酶免疫测定)，Kgaku Shoin，Tokyo(1981)。与抗体结合的酶将与适当的底物(优选地生色底物)以产生可例如通过分光光度、荧光测定或通过视觉方法来检测的化学部分的方式反应。可用来可检测地标记抗体的酶包括但不限于苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、丙糖磷酸异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、尿素酶、过氧化氢酶、葡糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱酯酶。另外，检测可通过采用酶的生色底物的比色方法来实现。检测也可通过视觉比较底物与相似制备的标准物的酶反应程度来实现。
检测也可使用多种其他免疫测定的任一种来实现。例如，通过放射性标记抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物，可能通过使用放射免疫测定(RIA)来检测抗体(参见，例如，Weintraub，B.，Principles of Radioimmunoassays(放射免疫测定原理)，放射配体测定技术的第七次培训课程，内分泌学会，(1986年3月))，其通过引用并入本文)。放射性同位素可通过包括但不限于γ计数、闪烁计数或放射自显影的手段来检测。
抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物也可使用荧光发射金属(诸如152Eu或镧系其他金属)而被可检测地标记。这些金属可使用诸如二乙烯三胺五乙酸(DTPA)或乙二胺四乙酸(EDTA)的金属螯合基团与抗体相连。
用于将各部分与抗体、或其抗原结合片段、变体、或衍生物轭合的技术是公知的，参见，例如，Arnon等，″Monoclonal AntibodiesFor Immunotargetting Of Drugs In Cancer Therapy(用于在癌症治疗中药物的免疫靶向的单克隆抗体)″，Monaclonal Antibodies AndCancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Reisfeld等(编辑)，第243-56页(Alan R.Liss，Inc.(1985)；Hellstrom等，″Antibodies ForDrug Delivery(用于药物递送的抗体)″，Controlled Drug Delivery(对照药物递送)(第二版)，Robinson等，(编辑)，Marcel Dekker，Inc.，第623-53页(1987)；Thorpe，″Antibodies Carriers Of CytotoxicAgents In Cancer Therapy：A Review(癌症治疗中细胞毒性剂的抗体载体：综述)″，Monoclonal Antibodies ′84：Biological And ClinicalApplications(单克隆抗体′84：生物和临床应用)，Pinchera等(编辑)，第475-506页(1985)；″Analysis，Results，And Future Prospective OfThe Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy(在癌症治疗中放射标记抗体的治疗应用的分析、结果和未来的展望)″，Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy(用于癌症检测和治疗的单克隆抗体)，Baldwin等(编辑)，Academic Press第303-16页(1985)和Thorpe等，″The Preparation And CytotoxicProperties Of Antibody-Toxin Conjugates(抗体-毒素轭合物的制备和细胞毒性特性)″，Immunol.Rev.62：119-58(1982)。
在某些实施方案中，增强例如结合多肽(例如抗体或其免疫特异性片段)的结合分子的稳定性或疗效的部分可被轭合。例如，在一个实施方案中，PEG可与本发明的结合分子轭合以增加结合分子在体内的半衰期。Leong，S.R.等，Cytokine 16：106(2001)；Adv.inDrug Deliv.Rev.54：531(2002)；或Weir等，Biochem.Soc.Transactions30：512(2002)。
VII.使用的组合物和方法
此外，本发明涉及包含本发明的例如抗体或其抗原结合片段的前述结合分子或其化学衍生物、或本发明的多核苷酸、载体或细胞的组合物。本发明的组合物可进一步包含药学可接受的载体。术语“化学衍生物”描述含有正常不是基础分子一部分的其他化学部分的分子。这些部分可改善基础分子的可溶性、半衰期、吸收等。可选地，这些部分可减弱基础分子的不希望的副作用或降低基础分子的毒性。此外，取决于药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可包含诸如白介素或干扰素的其他物质。例如，用于治疗阿尔茨海默病的其他物质可选自由小有机分子、抗-Aβ抗体及其组合组成的组。因此，在特定的优选实施方案中，本发明涉及本发明的例如抗体或其抗原结合片段的结合分子、或与其任一个具有基本相同的结合特异性的结合分子、本发明的多核苷酸、载体或细胞制备用于以下的药物组合物或诊断组合物的用途：用于治疗或预防阿尔茨海默病的进展；用于改善与阿尔茨海默病相关的症状；用于诊断或筛选对象中阿尔茨海默病的存在、或用于确定对象发展阿尔茨海默病的危险。所述药物组合物可设计为静脉内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、肠胃外或作为气雾剂施用；也参见下文。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及治疗特征为中枢神经系统中蛋白的异常积累和/或沉积的神经疾病的方法，该方法包括将治疗有效量的前述本发明的结合分子、抗体、抗原、多核苷酸、载体或细胞的任一种施用于有相应需要的对象。术语“神经疾病”包括但不限于阿尔茨海默病、轻度认知损害、额颞叶痴呆、Lewy小体病、帕金森病、皮克病、宾斯万格病；嗜刚果红淀粉样蛋白血管病、脑淀粉样蛋白血管病、唐氏综合征、多发性梗死性痴呆、亨廷顿病、克雅病、AIDS痴呆复合征、抑郁、焦虑性障碍、恐惧症、贝耳麻痹、癫痫、脑炎、多发性硬化；神经肌肉疾病、神经肿瘤疾病、脑肿瘤、包括中风的神经血管疾病、神经免疫疾病、神经耳科病、包括脊髓损伤的神经外伤、包括神经病理性疼痛的疼痛、小儿神经病和神经精神病、睡眠障碍、图雷特综合征、轻度认知损害、血管性痴呆、多发性梗死性痴呆、囊性纤维化、高雪病、其他运动障碍和一般的中枢神经系统(CNS)病。除非另外指明，术语神经退行性、神经、或神经精神在本文可互换使用。
在本发明中，公开的方法用于鉴定许多疾患的人抗体，并且也用来随后产生所述抗体以便在其免疫系统不与疾患病理发展的对应免疫应答反应的患者中诊断地、治疗地或预防地应用这些抗体。特别地，这种情况将预期发生在高龄出现的疾病中，因为已知免疫系统的反应性连续并显著地随年龄的增加而下降。在这些情况中，治疗上或预防上有活性的抗体可在阻止内源病理蛋白变体富集的方面补偿年龄相关的免疫系统的限制，并且因此可能有助于高龄时更好的健康状态。因此，本发明的医学应用特别适用于例如年龄在60、65、70、75、80或更大的上述患者组，并且主要针对本身以比如例如内切蛋白酶解、构象改变、翻译后修饰的改变、体细胞突变或其组合的任一类错乱(derailment)的形式表现、并且表型上通过发展内源蛋白的病理生理变体而表现的所有疾患。在本发明中，病理生理变体被认为是含有偏离生理的病理新表位的变体，参见上文。
特别地，治疗性应用包括肿瘤病、炎性病和中枢神经系统病，比如阿尔茨海默病、帕金森病、皮克病、具有Lewy小体的痴呆，包括克雅病的朊病毒病、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、皮层基底节变性、具有与17号染色体亨廷顿病类似的帕金森症的额颞叶变性、额颞叶痴呆、脑淀粉样蛋白血管病、轻度认知损害、唐氏综合征、具有荷兰型和冰岛型淀粉样变性的遗传性脑出血、脊髓小脑共济失调和肌萎缩性侧索硬化症，以及青光眼、包涵体肌炎、家族性淀粉样蛋白多神经病和包括来自下述前体蛋白的至少一种的原纤维蛋白的淀粉样蛋白病：SAA(血清-淀粉样-蛋白A)、AL(免疫球蛋白的k或l-轻链)、AH(g1 Ig-重链)、ATTR(转甲状腺素蛋白，血清-前清蛋白)、AApo-A-1(脱辅基脂蛋白A1)、AApoA2(脱辅基脂蛋白A2)、AGel(凝溶胶蛋白)、ACys(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)、ALys(溶菌酶)、AFib(纤维蛋白原)、β-淀粉样蛋白(淀粉样蛋白前体蛋白)、β-淀粉样蛋白2M(β2-微球蛋白)、APrP(朊病毒蛋白)、ACal(降钙素原)、AIAPP(胰岛淀粉样蛋白多肽)；APro(促乳素)、AIns(胰岛素)；AMed(乳粘着蛋白)；Aker(角膜上皮素)；ALac(乳铁蛋白)、Abri(AbriPP)、ADan(ADanPP)；或AANP(心房钠尿肽)，(Skovronsky等，Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2006；1：151-70；Buxbaum，Curr Opin Rheumatol 2003；16：67-75。
本发明的治疗方法的特定优势在于以下事实：来自健康潜伏期的或临床上异常稳定生物的B细胞或B记忆细胞的抗体能以一定的概率预防临床上表现的疾患、或者能以一定的概率降低临床上表现的疾患发病的危险、或者能以一定的概率推迟临床上表现的疾患的发病时间。此类抗体一般也已成功经受了体细胞成熟，即通过抗体可变区的体细胞改变优化以高亲和力结合靶分子的选择性和有效性。
在自身免疫或变态反应中，此类细胞在体内(例如，在人中)没有通过相关或其他生理蛋白或细胞结构而被活化的知识在医学上也是非常重要的，因为这意味着显著增加了成功度过临床测试阶段的可能性。可以说，在至少一个人类对象中预防性或治疗性抗体的潜伏期发展之前，已证明了其效率、可接受性和耐受性。因此可以预期，使用根据本发明的程序，抗体作为治疗剂的靶结构特异性效率和其降低的副作用的概率显著增加了抗体临床成功的可能性。
从前文明显看出，本发明包括包含上述抗体的至少一个CDR的疾患特异性结合分子的任何应用，特别用于诊断和/或治疗分别与阿尔茨海默病和Aβ沉积相关的疾病。优选地，所述结合分子是本发明的抗体或其免疫球蛋白链。另外，本发明涉及前文所述提到的抗体的任一种的抗独特型抗体。这些抗体是与位于抗原结合位点附近的抗体可变区的独特抗原肽序列结合的抗体或其他结合分子。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含上述本发明的结合分子、抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体或细胞的任一种的诊断组合物和任选地适当的检测手段，诸如常规用在基于免疫或核酸的诊断方法中的试剂。本发明的抗体例如适合用于其中抗体能以液相使用或与固相载体结合的免疫测定中。能使用本发明的抗体的免疫测定的实例是以直接或间接形式的竞争性和非竞争性免疫测定。此类免疫测定的实例是放射免疫测定(RIA)、三明治(免疫测定分析)、流式细胞术和蛋白质印迹。本发明的抗原和抗体可与许多不同的载体结合，并且用来分离与其特异结合的细胞。公知的载体的实例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁体。为了本发明的目的，载体的性质可以是可溶的或不可溶的。有许多不同的标记和标记方法是本领域普通技术人员已知的。可用于本发明的标记类型的实例包括酶、放射性同位素、胶体金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物；也参见上文讨论的实施方案。
在进一步的实施方案中，本发明的结合分子，特别是抗体也可用于通过从测试个体中获得体液样品、并且在允许抗体-抗原复合体形成的条件下使体液样品与本发明的抗体接触来诊断个体疾病的方法，所述体液样品可以是血样、淋巴样品、或任何其他体液样品。然后通过本领域已知的方法来确定此类复合体的水平，显著高于在对照样品中形成的复合体的水平表明测试个体中疾患的存在。以同样的方式，也可使用本发明的抗体结合的特定抗原。因此，本发明涉及包含本发明的例如抗体或其抗原结合片段的结合分子的体外免疫测定。
在此上下文中，本发明还涉及特别为此目的设计的手段。例如，可使用基于蛋白或抗体的阵列，该阵列例如负载有来自上述疾病相关蛋白并含有新表位的抗原，以便检测可能存在于患有例如神经疾病特别是阿尔茨海默病的患者中的自身抗体，或者该阵列负载有特异识别上述蛋白的任一种的本发明的抗体或等效的抗原结合分子。例如，Hueber等，Arthritis Rheum.52(2005)，2645-2655报道了类风湿性关节炎中自身抗体的抗原微阵列特征。微阵列免疫测定的设计概述于Kusnezow等，Mol.Cell Proteomics 5(2006)，1681-1696。相应地，本发明还涉及负载有根据本发明鉴定的结合分子或抗原的微阵列。
本发明还分别提供了包含装有上述成分(例如本发明的结合分子、抗体或其结合片段、抗原、多核苷酸、载体或细胞)的一种或多种的一个或多个容器的药物和诊断包或试剂盒。此类容器附带管理药品或生物产品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的通告，该通告反映了机构批准用于人类施用的制造、使用或销售。另外或可选地，该试剂盒包含用在适当诊断测定中的试剂和/或说明书。当然本发明的组合物(例如试剂盒)特别适合用于诊断、预防和治疗伴随着如上文定义的疾病相关蛋白的存在的疾病，特别是淀粉样变性，并且特别适用于治疗阿尔茨海默病(AD)。
术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”和类似术语在本文一般用来意指获得需要的药理和/或生理作用。该作用可以是就完全或部分预防疾患或其症状来说预防性的，和/或可以是就部分或完全治愈疾患和/或由疾患引起的副作用来说治疗性的。术语“治疗”如本文所用包含在哺乳动物特别是人中对疾患的任何治疗，包括：(a)预防易患疾患但仍未诊断患有该疾患的对象中疾患的发病；(b)抑制疾患，例如阻止疾患的发展；或(c)缓解疾患，例如使疾患减轻。
此外，术语“对象”或“患者”指需要治疗病况、疾病或疾患的哺乳动物，优选地人。
本发明的药物组合物可根据本领域公知的方法来配制；参见例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy(雷明顿：药学科学与实践)(2000)，费城科学大学(University of Sciences inPhiladelphia)，ISBN 0-683-306472。适合的药物载体的实例是本领域公知的，包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、诸如油/水乳状液的乳状液、各种类型的润湿剂、无菌溶液等。包含此类载体的组合物可通过公知的常规方法来配制。这些药物组合物可以适合的剂量施用于对象。适合的组合物的施用可通过不同的方式来实现，例如通过静脉内、腹膜内、皮下、肌内、局部或皮内施用。诸如鼻喷雾制剂的气雾剂制剂包括具有防腐剂和等渗剂的活性剂的纯化水溶液或其他溶液。此类制剂优选地调整至与鼻粘膜相容的pH和等渗状态。用于直肠或阴道施用的制剂可作为具有适合载体的栓剂存在。
此外，虽然本发明包括在头骨钻一个小孔来施用本发明药物的现有标准(尽管幸运地不常见)程序，但在优选的方面，本发明的结合分子，特别是抗体或基于抗体的药物可穿越血脑屏障，这允许静脉内或口服施用。
剂量方案将由主治医生和临床因素决定。如医学领域所公知，任何一个患者的剂量取决于许多因素，包括患者的体积、体表面积、年龄、施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、一般健康和同时施用的其他药物。一般的剂量可以是例如，在0.001μg至1000μg的范围内(或在此范围内用于表达或用于抑制表达的核酸)；然而特别考虑到上文提到的因素，可考虑低于或高于此示例范围的剂量。剂量的范围一般例如从约0.0001mg/kg至100mg/kg和更通常地0.01mg/kg至5mg/kg(例如，0.02mg/kg、0.25mg/kg、0.5mg/kg、0.75mg/kg、1mg/kg、2mg/kg等)宿主体重。例如剂量可以是1mg/kg体重或10mg/kg体重或在1-10mg/kg的范围内，优选地至少1mg/kg。在上述范围内的中间剂量也预期在本发明的范围内。对象可每日、每两日(alternative days)、每周或根据经验分析确定的任何其他时间表来施用这些剂量。示例性治疗需要以多剂量在例如至少六个月的延长时段内施用。其他示例性治疗方案需要每两周施用一次或每个月施用一次或每3至6个月施用一次。示例性剂量时间表包括连续每天1-10mg/kg或15mg/kg、每两天30mg/kg或每周60mg/kg。在一些方法中，同时施用具有不同结合特异性的两种或多种单克隆抗体，其中每种抗体的施用剂量落入指示的范围内。通过定期评价监测进展。用于肠胃外施用的制品包括无菌水溶液或非水溶液、悬浮液和乳状液。非水溶剂的实例是丙二醇、聚乙二醇、诸如橄榄油的植物油和诸如油酸乙酯的可注射有机酯。水性载体包括水、醇/水溶液、乳状液或悬浮液，包括盐水和缓冲媒介。肠胃外介质包括氯化钠溶液、林格葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠溶液、乳酸林格溶液或不挥发性油。静脉内介质包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(诸如基于林格葡萄糖溶液的那些)和类似介质。防腐剂和其他添加剂也可存在，诸如，例如，抗菌剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体及类似添加剂。此外，取决于药物组合物的预期用途，本发明的药物组合物可包含诸如多巴胺或精神药理药物的其他物质。此外，药物组合物也可配制为疫苗，例如，如果本发明的药物组合物包含用于被动免疫的抗Aβ抗体。
另外，可能需要共同施用或顺序施用其他物质。治疗有效剂量或量指足以改善症状或病况的活性成分的量。此类化合物的治疗性疗效和毒性可在细胞培养物或实验动物中通过标准药理程序确定，例如，ED50(在群体的50％中治疗有效的剂量)和LD50(对群体的50％为致死的剂量)。治疗性作用和毒性作用的剂量比率是治疗指数，其可表示为LD50/ED50的比率。优选地，组合物中的治疗剂以足以在阿尔茨海默病情况中恢复正常行为和/或认知特性的量存在。
根据本发明的药物组合物可优选地用于治疗神经疾病，包括但不限于阿尔茨海默病、帕金森病、皮克病、具有Lewy小体的痴呆，朊病毒病(包括克雅病)、进行性核上性麻痹、多系统萎缩、皮层基底节变性、具有与17号染色体亨廷顿病类似的帕金森症的额颞叶变性、额颞叶痴呆、脑淀粉样蛋白血管病、轻度认知损害、唐氏综合征、具有荷兰型和冰岛型淀粉样变性的遗传性脑出血、脊髓小脑共济失调、肌萎缩性侧索硬化症、贝耳麻痹、癫痫、脑炎、神经肌肉疾病、青光眼、包涵体肌炎、家族性淀粉样蛋白多神经病、包含来自下述前体蛋白的至少一种的原纤维蛋白的淀粉样蛋白病：SAA(血清-淀粉样-蛋白A)、AL(免疫球蛋白的k或1-轻链)、AH(g1 Ig-重链)、ATTR(转甲状腺素蛋白，血清-前清蛋白)、AApo-A-1(脱辅基脂蛋白A1)、AApoA2(脱辅基脂蛋白A2)、AGel(凝溶胶蛋白)、ACys(半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)、ALys(溶菌酶)、AFib(纤维蛋白原)、β-淀粉样蛋白(淀粉样蛋白前体蛋白)、β-淀粉样蛋白2M(β2-微球蛋白)、APrP(朊病毒蛋白)、ACal(降钙素原)、AIAPP(胰岛淀粉样蛋白多肽)；APro(促乳素)、AIns(胰岛素)；AMed(乳粘着蛋白)；Aker(角膜上皮素)；ALac(乳铁蛋白)、Abri(AbriPP)、ADan(ADanPP)；或AANP(心房钠尿肽)(Skovronsky等，Annu.Rev.Pathol.Mech.Dis.2006；1：151-70；Buxbaum，CurrOpin Rheumatol 2003；16：67-75，神经肿瘤、神经免疫、神经耳科疼痛、小儿神经病、恐惧症、情感障碍、睡眠障碍、图雷特综合征、其他运动障碍和一般的中枢神经系统(CNS)病。
这些和其他实施方案公开并包含于本发明的说明书和实施例中。涉及根据本发明采用的材料、方法、用途和化合物的任一种的其他文献资料可使用例如电子设备从公共图书馆和数据库检索。例如可使用由美国国立卫生研究院的国家生物技术信息中心和/或国家医学图书馆主持的公共数据库“Medline”。诸如作为欧洲分子生物学实验室(EMBL)的一部分的欧洲生物信息研究所(EBI)的数据库的其他数据库和网址是本领域技术人员已知的，并且也可使用因特网搜索引擎获得。生物技术的专利信息概述和用于追溯检索和近期文献通报的专利信息相关来源的纵览在Berks，TIBTECH 12(1994)，352-364中给出。
上文公开内容一般性地描述了本发明。除非另外指明，本文所用的术语被赋予Oxford Dictionary of Biochemistry and MolecularBiology(牛津生物化学与分子生物学字典)，Oxford University Press，1997，2000年改版，2003年再版，ISBN 0 19 850673 2中提供的定义。整个本说明书的正文引用了一些文献。完整的引用目录可发现于说明书的末尾，其后紧接权利要求。所有引用的参考文献(包括整个本说明书引用的文献参考、发布的专利、公布的专利申请和制造商的说明书、使用说明等)的内容清楚地通过引用并入本文；然而没有承认引用的任何文献资料确实是本发明的现有技术。
通过参考下述具体实施例可获得更完全的理解，所述实施例在本文仅为了例证的目的而提供，并且不预期限制本发明的范围。
实施例
下面的实施例进一步例证了本发明，但不应解释为以任何方式限制本发明的范围。诸如在本文采用的常规方法的详述可发现于引用的文献中；也参见″The Merck Manual of Diagnosis and Therapy(默克诊疗手册)″第17版，Beers和Berkow编辑(Merck & Co.，Inc.2003)。
除非另外指示，本发明的实践将采用在本领域技术范围内的细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术。有关用在本发明实践中的一般技术的进一步详述，专业人员可参考细胞生物学和组织培养的标准教本和综述；也参见实施例中引用的参考文献。分子和细胞生物化学的一般方法可发现于诸如以下的标准教本中：Molecular Cloning：ALaboratory Manual(分子克隆：实验指南)，第3版(Sambrook等，Harbor Laboratory Press 2001)；Short Protocols in Molecular Biology(精编分子生物学实验技术)，第4版(Ausubel等编辑，John Wiley& Sons 1999)；DNA Cloning(DNA克隆)，第I和II卷(Glover编辑，1985)；Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)(Gait编辑，1984)；Nucleic Acid Hybridization(核酸杂交)(Hames和Higgins编辑，1984)；Transcription And Translation(转录和翻译)(Hames和Higgins编辑，1984)；Culture Of Animal Cells(动物细胞的培养)(Freshney和Alan，Liss，Inc.，1987)；Gene Transfer Vectors forMammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移载体)(Miller和Calos，编辑)；Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols inMolecular Biology(最新分子生物学实验技术和精编分子生物学实验技术)，第3版(Ausubel等，编辑)；和Recombinant DNAMethodology(重组DNA方法)(Wu，编辑，Academic Press)。GeneTransfer Vectors For Mammalian Cells(哺乳动物细胞的基因转移载体)(Miller和Calos，编辑，1987，Cold Spring Harbor Laboratory)；Methods In Enzymology(酶学方法)，第154和155卷(Wu等，编辑)；Immobilized Cells And Enzymes(固定化细胞和酶)(IRL Press，1986)；Perbal，A Practical Guide To Molecular Cloning(分子克隆实践指南)(1984)；专著，Methods In Enzymology(酶学方法)(Academic Press，Inc.，N.Y.)；Immunochemical Methods In Cell AndMolecular Biology(细胞和分子生物学中的免疫化学方法)(Mayer和Walker，编辑，Academic Press，London，1987)；Handbook OfExperimental Immunology(实验免疫学手册)，I-IV卷(Weir和Blackwell编辑，1986)。Protein Methods(蛋白质方法)(Bollag等，John Wiley & Sons 1996)；Non-viral Vectors for Gene Therapy(用于基因治疗的非病毒载体)(Wagner等编辑，Academic Press 1999)；Viral Vectors(病毒载体)(Kaplitt & Loewy编辑，Academic Press1995)；Immunology Methods Manual(免疫学方法手册)(Lefkovits编辑，Academic Press 1997)；和Cell and Tissue Culture：LaboratoryProcedures in Biotechnology(细胞和组织培养：生物技术的实验程序)(Doyle & Griffiths，John Wiley & Sons 1998)。本公开内容中提到的用于遗传操作的试剂、克隆载体和试剂盒可从诸如BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich和ClonTech的商业供应商获得。细胞培养和培养基收集的一般技术概述于Large ScaleMammalian Cell Culture(大规模哺乳动物细胞培养)(Hu等，Curr.Opin.Biotechnol.8(1997)，148)；Serum-free Media(不含血清的培养基)(Kitano，Biotechnology 17(1991)，73)；Large ScaleMammalian Cell Culture(大规模哺乳动物细胞培养)(Curr.Opin.Biotechnol.2(1991)，375)；和Suspension Culture of Mammalian Cells(哺乳动物细胞的悬浮培养)(Birch等，Bioprocess Technol.19(1990)，251)；Extracting information from cDNA arrays(从cDNA阵列提取信息)，Herzel等，CHAOS 11(2001)，98-107。
以下实验是关于抗体NI-101.11的例证和描述。然而，NI 101系列的其他抗体、特别是NI 101.10在结构上相似，因此可预期提供相似的结果。
补充方法
记忆B细胞展示
特征为异常阳性的临床进程(例如，在危险因素存在时缺少疾患的临床体征)、或无疾病发展的轻度或前驱体征的稳定进程的临床上小心选择的人类对象或长期无进展者被征集来提供外周血淋巴细胞作为起始材料用于分离记忆B细胞。策略是基于传染免疫学中确立的概念：对象的记忆B细胞库保持抗体的特异性，并且可能也保持在先前抗原遭遇期间产生抗体的频率(McHeyzer-Williams和Ahm编辑，Curr.Opin.Immunol.11(1999)，172-179；Bernasconi等，Science 298(2002)，2199-202；Traggiai等，Nat.Med.10(2004)，871-875)。开发这一概念来解释针对传染剂的适应性免疫，以及用于描述在首次感染之后抗体介导的免疫。根据这一理论，记忆B细胞库应完全代表了针对在对象病史中天然地或接种疫苗后已诱导抗体应答的所有抗原的抗体的完整补体。根据本发明，该理论适用于由于其他生理相关蛋白的异常聚集或构象而产生的内源抗原，该抗原因此不经受生理免疫耐受，并且因此可获得抗原特性并诱导针对构象新-表位(新表位)的免疫应答。
记忆B细胞用包括全B细胞标志CD22的表面标志、结合表达IgM、IgD、IgE和IgA的未经历抗原的B细胞的阴性选择来分离。使用该技术，从30ml人血中可获得大约10.000至150.000个记忆B细胞。这些B细胞例如用埃巴病毒永生化，并在照射的人成纤维细胞饲养层上寡克隆地培养(Zubler等，J Immunol.134(1985)，3662-3668；Traggiai等，Nat.Med.10(2004)，871-875)。为改善分泌抗体的记忆B细胞的转化和永生化功效，可使用模拟细菌未甲基化的CpG-二核苷酸的CpG 2006(Hartmann和Krieg J Immunol 164(2)(2000)，944-953)。
实验方案：
从PBL主体选择B细胞是使用MACS技术和CD22微珠(Miltenyi，Bergisch Gladbach，Germany)进行的。PBL用MACS抗人CD22、藻红蛋白-轭合的抗人IgD和APC-轭合抗体抗人IgM、IgA、CD3、CD8、CD56(Becton Dickinson，Basel，Switzerland)标记。CD22-阳性细胞使用LS柱和Midi MACS设备(Miltenyi)分离，然后使用MoFlo细胞分选器(Dako，Fort Collins，USA)选择藻红蛋白-和APC-阴性细胞。然后将CD22-阳性、IgM-、IgD-、IgA-和IgE-阴性的B细胞与含有获自B95-8细胞的上清液的埃巴病毒和浓度为2.5mg/l的CpG 2006(Sigma，Buchs，Switzerland)一起在B细胞培养基(补充有10％胎牛血清的RPMI 1640(Hyclone，Perbio，Lausanne，Switzerland)中孵育。将每孔5-50个细胞接种到含有B细胞培养基的Costar圆底96孔板(Corning，Vitaris，Baar，Switzerland)中从志愿供体制备的30.000个照射的人PBL上。记忆B细胞培养物保持在37℃和5％CO2的加湿细胞培养箱中2-4周，然后培养物的条件培养基在ELISA和其他组织阵列上测定。
抗体筛选
根据在组织切片上与包括蛋白聚集体和异常病理相关结构的病理表位的结合来筛选条件培养基中的抗体，所述组织切片获自具有病理上确认的诊断为包括但不限于阿尔茨海默病的人类患者，或者获自人类疾患的转基因小鼠模型的组织切片，或者来自从包括年老的非人灵长类的人类疾患的动物模型获得的组织切片，或者通过聚集的合成肽制品的ELISA获得。在本发明中，异常病理结构包括但不限于β-淀粉样蛋白斑块、神经原纤维缠结、Lewy小体中的α-突触核蛋白聚集体和在营养不良性轴突中沉积的蛋白聚集体。人类组织也用来排除抗体与正常细胞或超细胞组织结构的交叉反应性。进一步分析选择的抗体的类别，并确定轻链亚类。选择的来自记忆B细胞培养物的病理相关抗体的信使使用RT-PCR被转录、克隆并组合到表达载体中用于重组产生。
实验方案：
使用微量滴定相容的组织微阵列来筛选B细胞条件培养基。
阵列的产生
石蜡-包埋的人死后阿尔茨海默病脑组织被切成直径为1-2mm、长度为10mm的杆。将4个杆垂直包埋到石蜡中以形成适合9×9mm的微量滴定形式的方块。用切片机从该装配体上切下5μm的组织薄片，并且将2个薄片彼此邻近地封固于载玻片上，得到适合96-孔微量滴定形式的2×4杆的装配体。可选地，来自APP转基因小鼠的组织用来制备该组织阵列。
B细胞筛选
来自记忆B细胞培养物的条件培养基使用多道移液器转移到组织阵列载玻片上，并在室温孵育2小时。洗涤步骤之后，使用Cy3-轭合的人IgG二抗(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Suffolk，UK)分析人抗体与组织切片的结合。荧光分析在倒置荧光显微镜(Leica，Heerbrugg，Switzerland)上进行。
ELISA
96孔半面积微量培养板(Corning)用于包被缓冲液(15mMNa2CO3、35mM NaHCO3，pH 9.42)中标准浓度为1μg/ml的合成Aβ-肽于4℃包被过夜。洗涤平板，并且非特异结合位点用含有2％BSA(Sigma，Buchs，Switzerland)的PBS于RT封闭1小时。B细胞条件培养基从记忆B细胞培养板转移至ELISA板，并于室温孵育2小时。使用辣根过氧化物酶(HRP)-轭合的驴抗人IgG多克隆抗体(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.，Cambridgeshire，UK)来确定人抗体的结合，然后在标准的比色测定中测量HRP的活性。
显示感兴趣的特异性的抗体的分子克隆
使用细胞分选器收集选择的记忆B细胞培养物的活体B细胞。制备mRNA，并使用所有人可变重链和轻链构架1(FR1)家族的Ig-构架特异引物作为5′引物和特异于所有人J-H区段的引物作为3′引物的组合来获得免疫球蛋白的重链和轻链序列(Marks等，Mol.Biol.222(1991).，581-597)。可选地，来自记忆B细胞培养物的单个分选细胞的单细胞RT-PCR可用作Ig重链和轻链序列的来源(Babcook等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93(1996)，7843-7848；Brezinschek等，J.Immunol.155(1995)，190-202；Coronella等，Nucleic Acids Research 28(2000)；Owens等，J.Immunol.171(2003)，2725-2733)。单细胞分选保持了最初在B细胞培养物中产生的抗体克隆的免疫球蛋白重链和轻链的正确配对。
具有需要的特异性的抗体克隆的鉴定是通过完整抗体重组表达后重新筛选微量滴定相容的组织微阵列和ELISA来执行的。完整IgG1抗体的重组表达是将可变重链和轻链序列“以正确的阅读框架”插入与可变区序列互补的表达载体之后获得的，所述表达载体具有位于5-引发末端的编码信号肽的序列和位于3′-引发末端的编码适当的恒定结构域的序列。为达到这一目的，引物含有被设计为有助于将可变重链和轻链序列克隆到抗体表达载体中的限制酶切位点。通过将免疫球蛋白重链的RT-PCR产物按阅读框架插入带有信号肽和人免疫球蛋白恒定结构域的重链表达载体来表达重链免疫球蛋白。通过将κ轻链的RT-PCR-产物按阅读框架插入提供信号肽和人κ轻链免疫球蛋白恒定结构域1的轻链表达载体来表达κ轻链免疫球蛋白。可选地，通过将λ轻链RT-PCR-产物按阅读框架插入提供信号肽和人λ轻链免疫球蛋白恒定结构域1的λ轻链表达载体来表达λ轻链免疫球蛋白。
将Ig-重链表达载体和κ或λIg-轻链表达载体共转染进HEK293细胞(或任何其他适当的受体细胞系)后获得功能性重组单克隆抗体。随后使用标准的蛋白A柱纯化来从条件培养基中纯化重组人单克隆抗体。使用瞬时或稳定转染的细胞可无限量地产生重组人单克隆抗体。产生重组人单克隆抗体的细胞系可通过直接使用Ig-表达载体或通过将Ig-可变区重新克隆到不同的表达载体中来建立。诸如F(ab)、F(ab)2和scFv的衍生物也可从这些Ig-可变区产生。
实验方案：
主体B细胞的RT-PCR
通过选择的记忆B细胞培养物的正向和侧向光散射特性鉴定的活细胞使用MoFlo细胞分选器以100-2000个细胞的小份直接分选到装有20μl RNAlater(Ambion，Huntingdon，UK)的0.2ml PCR管中。使用mRNA-Direct Micro试剂盒(Dynal，Invitrogen，Basel，Switzerland)制备mRNA。使用″RT for PCR″试剂盒(ClontechBectonDickinson，Basel，Switzerland)制备cDNA，免疫球蛋白(Ig)重链和轻链可变序列的PCR是使用Advantage 2 PCR试剂盒(Clontech)进行，使用所有人可变重链和轻链构架1(FR1)家族的特异引物作为5′引物和特异于人Ig重链或Igκ或Igλ轻链的恒定结构域的引物作为3′引物的组合。引物购自Microsynth(Balgach，Switzerland)。
用于所有表达载体的信号肽来自描述于V-Base的人免疫球蛋白κ轻链家族1L5序列(MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC；SEQID NO：2)，并且设计为提供Xba1的限制酶切位点，以便有助于PCR扩增的可变区的克隆(ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCTAGATGC；SEQ ID NO：1)。Xba1通过沉默诱变引入。作为用于克隆可变重链区的3′限制酶切位点，Sal1的限制酶切位点被引入载体提供的IgG1的C1。相似地，BsiW1的限制酶切位点被引入κ轻链的C1，而Xho1被引入λ轻链的C1。PCR产物的限制酶切消化和连接到受体载体根据标准程序进行。使用标准试剂盒(Quiagen，Hombrechtikon，Switzerland)制备质粒DNA。受体载体含有CMV启动子，以便抗体基因在哺乳动物细胞中表达。
单细胞RT-PCR
对来自培养B细胞的Ig重链和轻链可变区的单细胞RT-PCR，使用Owens等描述的方法(Owens等，2003)的修改。使用MoFlo细胞分选器，将单细胞直接置于0.2ml PCR管阵列的每个管中。预备使每个管含有10μl Superscript II反转录物酶(Invitrogen)的RT缓冲液。将PCR管骤冻于干冰上，并且就在RT-PCR之前融化。使用随机六联体(Clontech)和Superscript II反转录物酶(Invitrogen)制备cDNA。免疫球蛋白重链和轻链可变区的第1轮PCR使用Ig-可变区家族之间保守的所有信号肽中引发的一组引物作为5′引物来进行。在3′位置，使用特异于Ig C1重链或Igκ-或Igλ轻链恒定区的单个引物。第2轮PCR使用描述用于主体B细胞RT-PCR的引物对第1轮PCR期间获得的PCR-产物来进行。克隆到受体载体相应地进行。
可选的细胞克隆
使用标准的有限稀释方法或通过使用细胞分选器(MoFlo，Dako，Fort Collins，USA)将单个细胞沉积到96孔培养板中进行克隆。对有限稀释，收集记忆B细胞培养物的细胞、通过30μm尼龙筛孔(Falcon，Becton Dickinson，Basel，Switzerland)、重悬于培养基中，并以每孔0.3个细胞的浓度接种到96孔板或384孔板中。
对细胞分选器的接种，设备设置为将每孔一个单个细胞(单个模式1)沉积到补充有B细胞培养基的96孔板中。培养基被补充由活化T细胞调理的培养基。可选地，将30.000个照射的饲养细胞加到培养基中。
免疫球蛋白可变区序列的序列分析
使用特异于存在于表达载体中插入的Ig可变区序列的5′的CMV启动子的引物对克隆的免疫球蛋白可变区序列进行测序。可选地，使用在Ig重链和轻链的恒定结构域引发的引物。获得的序列使用载体NTI软件(Informax-Invitrogen)进行分析和比对。含有编码按前导肽阅读框架的完整免疫球蛋白可变区和恒定结构域的序列的质粒用于表达。
功能性重组单克隆抗体的表达
使用本领域已知技术通过重组表达可产生足够量的抗体(Trill等，Curr.Opin.Biotechnol.6(1995)，553-601)。瞬时转染293HEK细胞后产生可达1mg的重组人单克隆抗体。使用重组慢病毒载体稳定转导293HEK细胞或鼠NSO细胞后产生可达100mg的重组人单克隆抗体。
通过瞬时转染小规模产生人重组抗体
使用标准的磷酸钙共沉淀方法将Ig-重链载体和Ig-轻链载体共转染到HEK 293细胞中。使用蛋白A柱纯化(GE-Healthcare，Otelfingen，Switzerland)从转染的HEK 293细胞调理的培养基中纯化重组抗体。
通过稳定转导大规模产生人重组抗体
本文采用基于慢病毒的转染系统来产生稳定转导的产生人重组抗体的细胞系(Zufferey等，J.Virol.72(1998)，9873-9880)。HEK293细胞与两个不同的慢病毒载体共转导，一个慢病毒载体带有Ig重链的表达盒，另一个带有重组抗体的Ig轻链的表达盒。这种转导方法可用在广范围的哺乳动物细胞系中，诸如CHO和NSO细胞。
在人类疾病的转基因小鼠模型中验证
转基因小鼠如前文所述(Knobloch等，Neurobiol.Aging 7月28日(2006))在C57B1/6和DBA2的杂交背景上产生。测试组与C57B1/6回交一次。小鼠保持在处于颠倒12小时：12小时光照/黑暗周期的标准饲养条件下，并且随意获取食物和水。平衡治疗组的年龄(第1次测试时24个月，第2次测试时26个月)和性别。通过每周一次腹膜内注射抗体(3mg/kg体重)持续2个月的时间(达到每个动物8次注射)来治疗小鼠。
Y-迷宫中的行为测试
使用40x20x10cm臂长的Y形塑料迷宫评价自发交替率。在5分钟期间，记录进入臂的顺序；交替定义为在重叠的三组中连续进入三个臂。交替百分比计算为实际交替与可能交替的比率。抗体治疗2个月后，这些小鼠在Y-迷宫中重新测试。整个实验期间，实验者对治疗和基因型一直保持盲性。
血脑屏障穿过和与脑中异常结构的结合
为评价选择的抗体或其片段是否能穿过血脑屏障并与脑中异常聚集或构象改变的蛋白靶结合，将有效剂量的抗体系统地、腹膜内、静脉内、肌内、皮下或鼻内施用于特征为脑中聚集的或构象改变的蛋白靶的非生理性积累的转基因动物。然后通过标记的抗人Ig二抗的免疫染色、然后标准的免疫组织化学检测来评估脑中抗体与病理特异结构的结合。
实验方案：
PS-1/APPswe阿尔茨海默病转基因小鼠模型在第1天和第3天接受两次150μg NI-101.11的外周注射。第二次注射后24小时处死小鼠，并灌注PBS。冷冻脑，并使用恒冷切片机从冷冻的组织制备组织薄片。通过Cy3-标记的抗人IgG抗体(Jackson ImmunoResearchEurope，Suffolk，UK)的染色测定恒冷切片上人抗体的存在。淀粉样蛋白斑块的定位通过用鼠Aβ-特异的对照抗体6E10(可从Covance获得，目录号SIG-39320)、然后用FITC-标记的抗小鼠IgG抗体共染色恒冷切片来进行。可选地，单独用Cy3-标记的抗人IgG抗体染色。荧光分析在倒置荧光显微镜(Leica)上进行。
脑病理的减少
抗体治疗对脑中聚集或构象改变的蛋白靶水平的影响通过抗体和不相关的抗体对照的系统治疗或靶向脑递送(颅内、鞘内或心室内)至具有脑中聚集或构象改变的蛋白靶的特征的非生理性积累的转基因动物来评价。治疗效果通过改变或聚集的蛋白靶的免疫染色或组织化学染色，并测量此类聚集体覆盖的面积、聚集体的大小和聚集体的数目、和在不同脑区域蛋白靶浓度的生化定量来评估。
缺少抗体-治疗相关的副作用
抗体治疗潜在的靶相关的副作用将通过系统施用或靶向脑递送(颅内、鞘内或心室内)抗体和不相关的抗体对照至具有脑中聚集或构象改变的蛋白靶的特征的非生理性积累的转基因动物来评价。潜在的副作用将通过免疫染色或组织化学染色(例如普鲁士蓝针对微出血(micorhemorrhages)、苏木精-伊红针对活化的白细胞)和生化定量(例如通过ELISA定量细胞因子的水平)来评估。
活细胞的免疫荧光染色
用表达在胞内C-末端融合到黄色荧光蛋白变体Citrine的人野生型APP的载体瞬时转染HEK 293细胞。转染后24小时，细胞与人重组抗体或对照抗体一起于4℃孵育30分钟。洗涤步骤之后，固定细胞，并使用针对人或小鼠IgG的Cy-3-标记的二抗(JacksonImmunoResearch)检测表面结合的抗体。荧光分析在共焦显微镜(Leica)上进行。
Aβ原纤维的制备
Aβ肽购自Bachem(Bubendorf，Switzerland)。冻干的肽重构于TFA中，并且就在其在测定中作为单体Aβ使用前重悬于PBS。Aβ原纤维通过于PBS中100μg/ml浓度的单体Aβ1-42肽于37℃孵育24小时来制备。单体Aβ肽和原纤维制品也用作底物来包被ELISA板。
蛋白质印迹
单体Aβ肽与上样染料混合，加热变性，每个泳道上样0.2μg，并在梯度SDS-PAGE上分离。印迹与一抗一起孵育2小时。使用与辣根过氧化物酶(HRP)轭合的抗人或抗鼠二抗来显示人单克隆一抗或小鼠对照抗体6E10的结合。使用SuperSignal West Femto最大灵敏度底物(Pierce，Fisher Scientific，Wohlen，Switzerland)来显影印迹。
组织淀粉样蛋白斑块结合的竞争
重组人NI-101.11抗体与Aβ肽制品一起孵育2小时。然后抗体/Aβ制品用于获自患有神经病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学染色。制备5μm恒冷切片，用于PBS中的4％BSA、5％山羊血清和5％马血清于室温封闭1小时，用NI-101.11/Aβ制品于室温染色1小时。洗涤步骤之后，使用Cy3-轭合的人IgG二抗(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd)分析人抗体与组织切片的结合。荧光分析在倒置荧光显微镜(Leica，Heerbrugg，Switzerland)上进行。
实施例1
针对在人脑疾患中普遍存在的异常结构的人抗体的检测
来自表型上健康的对象、或临床上异常稳定的阿尔茨海默病患者的抗体通过获自患有病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片的免疫组织化学来测试。图1A说明在临床上异常稳定的患者中存在与β-淀粉样蛋白斑块结合的抗体，这通过用针对人β-淀粉样蛋白的已知抗体(抗体4G8；图1B)的共染色得到证实。健康人类对象中针对获自阿尔茨海默病患者的组织切片中神经原纤维缠结的抗体的存在显示于图2A。这一结果通过用针对人tau(HT7)的已知抗体的共染色得到证实。图3A揭示了健康人类对象中针对获自阿尔茨海默病患者的组织切片中营养不良性轴突的抗体的存在。用针对人tau(HT7)的已知抗体的对照染色描述于图3B。这些结果说明在表型上健康、或临床上异常稳定的患者中存在针对具有组织病理上确认的诊断的人组织样品中可鉴定病理结构的抗体。
实施例2
重组人抗体在体内保持对异常结构的特异性并识别脑淀粉样蛋白斑块中疾患相关β-淀粉样蛋白的构象表位而不识别其生理前体或非病理衍生物
抗体NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13A和NI-101.13B获自具有显著降低的认知衰退速率的临床上异常稳定的阿尔茨海默病患者。抗体的分离和重组产生如补充方法中所述进行。
NI-101.11
测试重组NI-101.11与脑β-淀粉样蛋白斑块的结合(图4)。获自患有神经病理上确认的阿尔茨海默病的患者的脑切片以指示浓度被染色。50pM浓度的抗体与β-淀粉样蛋白斑块的结合暗示高亲和力的结合。加入可达1μM的过量的代表位置1至16的线性的合成N-末端Aβ-衍生多肽不能竞争0.5nM浓度的抗体NI-101.11与β-淀粉样蛋白斑块的结合(图5)。此外，过量Aβ1-42原纤维(4μM)而不是4μM浓度的线性的合成Aβ1-42单体竞争8nM浓度的NI-101.11与脑切片上β-淀粉样蛋白斑块的结合，这暗示NI-101.11识别单体Aβ中不存在的构象表位(图6)。
为进一步评价人重组NI-101.11抗体与线性、单体、合成Aβ的结合，通过非变性PAGE分离单体Aβ制品。印迹蛋白用人重组NI-101.11抗体和针对N-末端线性Aβ序列的对照抗体(6E10)来探测。尽管6E10产生显著的单体Aβ肽的染色，但没有检测到人NI-101.11的结合，这暗示NI-101.11不结合线性单体Aβ肽，而是识别构象Aβ表位。(图7)
重组NI-101.11与从合成的Aβ1-42肽和单体Aβ制备的人工淀粉样蛋白原纤维的结合通过ELISA来确定(图8)。以同样包被密度包被于ELISA板上的合成的Aβ原纤维或单体合成的Aβ与指示浓度的NI-101.11一起孵育。与人工淀粉样蛋白原纤维的结合(空心方块)比单体Aβ(实心方块)高100多倍。针对AβC-末端的对照抗体22C4优先与单体Aβ(实心圆圈)结合，与原纤维(空心圆圈)结合得不太好。这暗示NI-101-10识别也存在于从合成的Aβ肽制备的人工淀粉样蛋白原纤维的构象表位。
针对细胞全长APP的重组人NI-101.11抗体与其任何生理衍生物的交叉反应性通过细胞结合测定来确定(图9)。
稳定表达与作为标志的Citrin融合的人APP的活体HEK 293细胞与重组人NI-101.11抗体或针对N-末端线性Aβ序列的对照抗体6E10一起于4℃孵育30分钟，以防止内在化。Citrin-阳性信号指示表达APP的细胞。与在表达融合构建体的所有细胞中与细胞表面APP结合的对照抗体(6E10)相反，没有检测到重组人NI-101.11抗体与全长APP的结合。这些数据说明NI-101.11与生理、细胞的APP没有交叉反应性。
进一步通过大小排阻层析来证明NI-101.11不与单体Aβ结合：没有观察到NI-101.11或不相关的对照抗体与单体FITC-标记的Aβ1-42的结合(图10A、10B)。相反，针对存在于AβC-末端的线性表位的抗体22C4与FITC-Aβ1-42单体共洗脱(图10C)。
在竞争性ELISA中，在与过量浓度的单体Aβ1-16、Aβ1-28和Aβ1-40肽一起预孵育后，完全阻抑了针对AβN-末端的线性表位的抗体6E10的结合。相反，与过量浓度的线性Aβ肽一起预孵育没有破坏NI-101.11的结合，暗示NI-101.11需要构象表位(图11)。
NI-101.13A和13B
测试重组人抗体NI-101.13A和13B与获自阿尔茨海默病的APP转基因小鼠模型(Tg2576)的脑切片的结合。10nM浓度的NI-101.13A和NI-101.13B产生显著的β-淀粉样蛋白斑块的染色(图12)。重组NI-101.13A和NI-101.13B与从合成的Aβ1-42肽和单体Aβ制备的人工淀粉样蛋白原纤维的结合通过ELISA来确定。以同样包被密度包被于ELISA板上的合成的Aβ原纤维或单体合成的Aβ与指示浓度的NI-101.13A和NI-101.13B一起孵育。与单体Aβ相比，测试的两个抗体都观察到对人工淀粉样蛋白原纤维的优先结合(图13)。
NI-101.12
重组NI-101.12与合成的Aβ1-42肽的结合通过ELISA确认(图14A)。过量的Aβ1-42肽竞争133nM浓度的NI-101.12的结合(图14B)。
实施例3
在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，针对脑β-淀粉样蛋白的重组人抗体穿越血脑屏障，并在体内与脑β-淀粉样蛋白斑块结合
为确定重组人NI-101.11抗体是否穿越血脑屏障并在体内与脑β-淀粉样蛋白斑块结合，转基因PS-1/APPswe阿尔茨海默病小鼠模型在第1天和第3天接受两次150μg NI-101.11的外周注射。第二次注射后24小时处死小鼠，并灌注PBS。收集脑，并且脑切片用FITC-标记的人IgG抗体、或用小鼠单克隆Aβ抗体6E10染色，然后用FITC-标记的小鼠IgG抗体染色来证实脑β-淀粉样蛋白斑块的存在。抗人IgG的淀粉样蛋白斑块的强染色表明重组人NI-101.11抗体可穿越转基因小鼠的血脑屏障，并在活体动物中与脑β-淀粉样蛋白斑块结合(图15)。
实施例4
在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，针对β-淀粉样蛋白的重组人抗体改善异常的认知行为，并赋予β-淀粉样蛋白斑块负载、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生的减少，而不增加微出血频率
24个月大的arcAβ小鼠和年龄匹配的野生型同窝小鼠用3mg/kg重组人NI-101.11抗体或同种型匹配的人对照抗体每周i.p.治疗2个月。为评价转基因小鼠中对异常行为的治疗效果，在治疗完成之前和之后进行Y-迷宫行为测试。使用40x20x10cm臂长的Y形塑料迷宫来评价自发交替率。在5分钟期间，记录进入臂的顺序；交替定义为在重叠的三组中连续进入三个臂。交替百分比计算为实际与可能交替的比率(定义为进入臂的总数-2)乘以100％。使用非配对t-检验比较未治疗的arcAβ小鼠和野生型同窝小鼠对照的Y-迷宫表现。使用非参数克鲁斯凯-沃利斯检验比较所有4组在治疗之后的改善。选择非参数曼-惠特尼U检验对不同组进行成对比较。零-表现者(即不离开它们被放置的臂的小鼠)不包括在分析中。
如在前面的研究中观察到，未治疗的24个月大的arcAβ小鼠与其野生型同窝小鼠相比显著受损(图16A，治疗前；非配对t-检验，p＝0.0007)。
2个月治疗后，与NI-101.11治疗的野生型对照小鼠相比，NI-101.11治疗的arcAβ小鼠显示明显增强的改变水平。改善的分析(即治疗后的表现减去治疗前的表现)显示四组之间的显著差异(图16B，克鲁斯凯-沃利斯检验；p＝0.03)。所有组之间的成对事后分析显示NI-101.11治疗的arcAβ小鼠的认知表现的改善显著高于野生型小鼠(曼-惠特尼U；p＝0.05NI-101.11tg对比NI-101.11野生型；p＝0.008NI-101.11tg对比对照野生型)。该组小鼠与对照抗体治疗的转基因同窝小鼠相比还显示强烈倾向于改善的表现(曼-惠特尼-U；p＝0.08NI-101.11tg对比对照tg)。所有小鼠在重新测试中显示～10％的表现改善，这可能是由于对任务环境的熟悉。
慢性、2个月NI-101.11治疗对淀粉样蛋白负荷、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生的影响通过定量组织化学和免疫组织化学分析来分析。为达到此目的，在行为测试完成后麻醉小鼠，并心脏灌注PBS。一个脑半球在4％低聚甲醛中固定并包埋到石蜡中。用Leica RM 2135切片机(Bannockburn，Illinois)切成5μm的矢状切片。皮层和海马中β-淀粉样蛋白斑块的负载根据标准方案在硫代黄素S和刚果红染色的脑切片上定量。对免疫组织化学，薄片被脱蜡、用于PBS中的4％BSA、5％山羊血清和5％马血清于RT封闭1小时。使用以下稀释的抗体于4℃孵育过夜：抗GFAP(AdvancedImmunochemicals)1∶500，抗IBA1(WAKO)1∶500。荧光团偶联的二抗于RT孵育2小时。每次染色使用间隔75μm的每个小鼠脑的2-3个切片。每个切片以10x放大拍摄2个图像用于皮层分析(顶区和额区)。拍摄完整的海马区(5x放大，修剪为ROI)用于海马分析。使用软件ImageJ进行自动图像分析。
对来自用6E10和抗人IgG免疫的arcAβ小鼠的脑切片的双染色揭示了NI-101.11与Aβ沉积物的结合(图17，左图)，表明NI-101.11可穿越血脑屏障，并与脑β-淀粉样蛋白斑块结合。在对照抗体治疗的arcAβ小鼠中没有观察到人抗体与Aβ沉积物的这种结合(图17右图)。
如硫代黄素S和刚果红染色所揭示，用3mg/kg NI-101.11的慢性治疗引起淀粉样蛋白斑块负载的显著减少。与对照抗体治疗的arcAβ小鼠相比，在皮层和海马这种减少达到大于50％的水平(图18A、B)。除了斑块面积(图18C)，还观察到斑块数目(图18D)和平均斑块大小(图18E)的显著减少。
为测试NI-101.11的慢性治疗是否影响arcAβ小鼠的神经炎性应答，在免疫组织染色之后定量反应性星形胶质细胞和小胶质细胞。与对照抗体治疗的动物相比，NI-101.11治疗的arcAβ小鼠皮层中观察到反应性星形胶质细胞数目的减少(抗GFAP染色)(图19A；曼-惠特尼-U；p＝0.047)。在海马中没有检测到改变。用针对小胶质细胞和巨噬细胞标志的抗体(抗-Iba1)的染色还揭示了统计上倾向于减少的炎症(图19B；曼-惠特尼-U；皮层和海马都是p＝0.075)。星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生的减少与NI-101.11治疗之后观察到的减少的β-淀粉样蛋白负载一致。
用针对Aβ的某些单克隆抗体的被动免疫治疗与脑中微出血频率的增加相关(Pfeifer等，Science 298(2002)，1379；Wilcock等，JNeuroinflammation 1(2004)，24)。为了评价NI-101.11慢性治疗的效果，在慢性NI-101.11治疗后，对arcAβ和野生型小鼠的脑切片进行Per1氏普鲁士蓝染色。该染色揭示存在血红蛋白分解产物血铁黄素和先前微出血的标志(图20)。与野生型同窝小鼠相比，在用对照抗体治疗的年老arcAβ小鼠中，普鲁士蓝阳性特征的频率显著提高(曼-惠特尼-U；p＝0.001)。当与对照抗体治疗的arcAβ小鼠相比时，NI-101.11治疗没有导致微出血数目的增加(曼-惠特尼-U；p＝0.347)，这表明NI-101.11治疗的有益治疗作用发生时没有被动Aβ免疫治疗中经常观察到的这种副作用。
实施例5
针对脑β-淀粉样蛋白的重组人抗体在体外抑制合成的Aβ原纤维的形成
重组人NI-101.11抗体对Aβ-原纤维形成的影响通过荧光分析测量与聚集Aβ结合的硫代黄素S来测定。单体Aβ溶液在有或没有增加浓度的NI-101.11时于37℃孵育24小时。在体外重组人NI-101.11以浓度依赖性的方式抑制合成的Aβ原纤维的形成(图21)。
实施例6
NI-101.11对BV-2小胶质衍生细胞中Aβ原纤维的离体吞噬作用的影响
NI-101.11对Fcγ-受体介导的Aβ原纤维的吞噬作用的影响在BV-2小胶质衍生细胞系中研究。BV-2细胞保持在补充有5％FBS、Pen/Step和谷氨酰胺的DMEM中。细胞用胰蛋白酶消化，将120′000个BV-2细胞/孔接种于平底24-孔板。12小时后，用补充有20mMHEPES(pH 7.3)、1％BSA、10μg/ml Pen/Step的400μl DMEM/F12/孔替换培养基。实验前30分钟加入100μg/ml褐藻糖胶(清除受体抑制剂)。50μM FITC-标记的Aβ原纤维与指示浓度的抗体一起于37℃预孵育30分钟，洗涤两次，然后14′000xg离心5分钟。将该悬浮液加到组织培养板中。30分钟后，BV-2细胞用HBSS洗涤两次以去除未缔合的原纤维Aβ。
细胞用250μg/ml胰蛋白酶/EDTA于4℃处理20分钟，并通过4℃500xg离心5分钟洗涤两次。细胞在FACS-Fix(PBS、2％FA、2％葡萄糖、5mM NaN)中固定20分钟，并用FACS洗液(PBS、5μM EDTA、0.2％BSA)洗涤两次。10′000个细胞的荧光(FL-1)通过FACS分析确定(基于Webster SD等，JI 2001)。
FITC-标记的Aβ1-42原纤维的依赖于Fcγ受体的吞噬作用在抑制清除受体系统后测量。人NI-101.11和可商业获得的针对位于Aβ肽N-末端的线性表位的抗体(6E10)的比较分析说明Aβ原纤维的吞噬作用的剂量依赖性诱导。NI-101.11介导的原纤维的摄取比6E10抗体中观察到的高可达3倍(图22)。这些数据表明，NI-101.11触发小胶质细胞对Aβ原纤维强有力的剂量依赖性的Fcγ受体介导的吞噬作用。
结论
根据本发明进行的上述实验证明，令人惊讶地在表型上健康、无症状的人类对象中、以及在尽管诊断为认知损害或阿尔茨海默病但具有异常稳定的临床疾患进程的患者中，检测保护性和治疗上有活性的抗体和产生抗体的B细胞是可能的。更具体地，可能检测和分离识别抗原的生理功能形式的一类新的人抗体，因此降低了迄今免疫治疗中自身免疫原性副作用问题的危险。因此，提供了特异识别病理生理相关结构的抗原变体的抗体和等效结合分子，所述抗原变体预期被所述抗体结合以通过例如使病原体对表达FcR的巨噬细胞或小胶质细胞可见并且因此使其无害而降低其毒性、或降低其浓度、或促进其降解。实施例中进一步证明，此类抗体治疗上有效，并且能延缓以及防止异常病理蛋白及其聚集体的有害作用，而不增加脑微出血的频率。
序列表
<110>苏黎士大学
<120>提供疾患特异性结合分子和靶的方法
<130>NE30A06/P-WO
<160>56
<170>PatentIn版本3.4
<210>1
<211>66
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>misc-feature
<222>(1)..(66)
<223>来自人VκI L5的前导肽，限制酶切位点Xba 1引入序列的3’
<220>
<221>CDS
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<400>1
atg gac atg cgg gtg ccc gcc cag ctg ctg ggc ctg ctg ctg ctg tgg    48
Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp
1               5                   10                  15
ttc ccc ggc tct aga tgc                                            66
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<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
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<220>
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gag gtg cag cta gtg cag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg    48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc gcc ttc agt agc tat    96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
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ggc ata cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg   144
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
gca gtt ata tgg ttt gat gga act aaa aaa tac tat aca gac tcc gtg    192
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
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aag ggc aga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca ctg tat    240
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ctg caa atg aac acc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288
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gcg aga gat agg ggt ata gga gct cgg cgg ggg ccg tac tac atg gac    336
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp
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gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca                    372
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
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<210>4
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>4
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1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>5
<211>372
<212>DNA
<213>人工
<220>
<223>优化密码子
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(372)
<223>NI-101.11-可变重(Vh)链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(372)
<400>5
gag gtg cag ctg gtg cag agc ggc ggc ggc gtg gtg cag ccc ggc cgg     48
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
agc ctg cgg ctg agc tgc gcc gcc agc ggc ttc gcc ttc agc agc tac     96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
ggc atg cac tgg gtg cgg cag gcc ccc ggc aag ggc ctg gag tgg gtg    144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
gcc gtg atc tgg ttc gac ggc acc aag aag tac tac acc gac agc gtg    192
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
aag ggc cgg ttc acc atc agc cgg gac aac agc aag aac acc ctg tac    240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
ctg cag atg aac acc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc    288
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
gcc cgg gac cgg ggc atc ggc gcc cgg cgg ggc ccc tac tac atg gac    336
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp
            100                 105                 110
gtg tgg ggc aag ggc acc acc gtg acc gtg agc agc                    372
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>6
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>6
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>327
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(327)
<223>NI-101.10和NI-101-11-可变κ(Vκ)轻链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(327)
<400>7
gaa att gtg ctg act cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga     48
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tat     96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
tta aat tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc    144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc    192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt cag cag agt tac agt acc cct ctc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag ctc gag atc aaa cgt acg                327
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
            100                 105
<210>8
<211>109
<212>PRT
<213>智人
<400>8
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr
            100                 105
<210>9
<211>381
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(381)
<223>NI-101.12-可变重(Vh)链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(381)
<400>9
gag gtg cag ctg gtg gag agc ggc ccc ggc ctg gtg aag ccc gcc gag     48
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
acc ctg agc ctg acc tgc acc gtg agc ggc ggc agc atc cgg agc ggc     96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
            20                  25                  30
agc atc tgc tgg tac tgg atc cgg cag ccc ccc ggc aag ggc ctg gag    144
Ser Ile Cys Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
tgg atc ggc tac ttc tgc tac agc ggc gcc acc ttc tac acc ccc agc    192
Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser
    50                  55                  60
ctg cgg ggc cgg ctg acc atc agc gtg gac gcc agc aag aac cag ctg    240
Leu Arg Gly Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Leu
65                  70                  75                  80
agc ctg agc ctg agc agc gtg acc gcc gcc gac acc gcc gtg tac tac    288
Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
tgc gcc cgg cgg gcc ggc gag aac agc ggc ggc atc gag ccc tac tac    336
Cys Ala Arg Arg Ala Gly Glu Asn Ser Gly Gly Ile Glu Pro Tyr Tyr
            100                 105                 110
ggc atg gac gtg tgg ggc cag ggc acc acc gtg acc gtg agc agc        381
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>10
<211>127
<212>PRT
<213>智人
<400>10
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ala Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
            20                  25                  30
Ser Ile Cys Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Arg Gly Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Leu
65                  70                  75                  80
Ser Leu Ser Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Arg Ala Gly Glu Asn Ser Gly Gly Ile Glu Pro Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>11
<211>330
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(330)
<223>NI-101.12-可变κ(Vκ)轻链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(330)
<400>11
gac gag atc gtg ctg acc cag agc ccc agc agc ctg agc gcc agc atc     48
Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile
1               5                   10                  15
ggc gac cgg gtg acc arc acc tgc cgg gcc agc gag agc atc aac aag     96
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys
            20                  25                  30
tac gtg aac tgg tac cag cag aag ccc ggc aag gcc ccc aag ctg ctg    144
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
atc tac gcc gcc agc agc ctg cag agc ggc gcc ccc agc cgg gtg agc    192
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Val Ser
    50                  55                  60
ggc agc ggc ttc ggc cgg gac ttc agc ctg acc atc agc ggc ctg cag    240
Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
gcc gag gac ttc ggc gcc tac ttc tgc cag cag agc tac agc gcc ccc    288
Ala Glu Asp Phe Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro
                85                  90                  95
tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gag atc aag cgg acc            330
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
            100                 105                 110
<210>12
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>12
Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile
1               5                   10                  15
Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys
            20                  25                  30
Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Val Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln
65                  70                  75                  80
Ala Glu Asp Phe Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro
                85                  90                  95
Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr
            100                 105                 110
<210>13
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(363)
<223>NI-101.13-可变重(Vh)链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(363)
<400>13
cag gta cag ctg cag gag tca ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag     48
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tct ggt ggc tcc atc agc aga aga     96
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg
            20                  25                  30
agt tac tac tgg ggc tgg atc cgc cag tcc cca ggg aag ggg ctg gag    144
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
tgg agt gga agt atc cat tat agc ggg agc acc tac tac aac ccg tcc    192
Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
ctc aag agt cga gtc acc ata tct gta gac acg tcc aag aac cag ttc    240
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
tcc ctg aaa ctg agc tct gtt acc gcc gca gac acg gct gtc tat tac    288
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
tgt gcg aga tca cgt tgg ggc agc agc tgg gta ttt gac tac tgg ggc    336
Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
cag ggc aca ctg gtc acc gtc tct tcg                                363
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>14
<211>121
<212>PRT
<213>智人
<400>14
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>15
<211>330
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(330)
<223>NI-101.13-可变λ(Vλ)轻链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(330)
<400>15
cag agc gtg ctg acc cag ccg ccg agc gcg agc ggc acc ccg ggc cag     48
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
cgc gtg acc att agc tgc agc ggc agc agc agc aac att ggc agc aac     96
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
tat gtg tat tgg tat cag cag ccg ccg ggc acc gcg ccg aaa ctg ctg    144
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
att tat cgc aac aac cag cgc ccg agc ggc gtg ccg gat cgc ttt agc    192
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
ggc agc aaa agc ggc acc agc gcg agc ctg gcg att agc ggc ctg cgc    240
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
agc gaa gat gaa gcg gat tat tat tgc gcg gcg tgg gat gat agc ctg    288
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
agc ggc tat gtg ttt ggc acc ggc acc aaa gtg acc gtg ctg           330
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>16
<211>110
<212>PRT
<213>智人
<400>16
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
            100                 105                 110
<210>17
<211>5
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Kabat命名中NI-101.10Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>17
Ser Tyr Gly Ile His
1               5
<210>18
<211>17
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>Kabat命名中NI-101.10Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>18
Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>19
<211>15
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(15)
<223>Kabat命名中NI-101.10Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>19
Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>20
<211>5
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Kabat命名中NI-101.11和NI-101.12F6A Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>20
Ser Tyr Gly Met His
1               5
<210>21
<211>17
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>Kabat命名中NI-101.11和NI-101.12F6A Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>21
Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210>22
<211>15
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(15)
<223>Kabat命名中NI-101.11和NI-101.12F6A Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>22
Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val
1               5                   10                  15
<210>23
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Kabat命名中NI-101.10、NI-101.11和NI-101.12F6A Vκa的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>23
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>24
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>Kabat命名中NI-101.10、NI-101.11和NI-101.12F6A Vκ的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>24
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>25
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Kabat命名中NI-101.10、NI-101.11和NI-101.12F6A Vκ的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>25
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr
1               5
<210>26
<211>5
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(5)
<223>Kabat命名中NI-101.12Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>26
Ser Gly Ser Ile Cys
1               5
<210>27
<211>19
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(19)
<223>Kabat命名中NI-101.12Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>27
Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser
1               5                   10                  15
Leu Arg Gly
<210>28
<211>17
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(17)
<223>Kabat命名中NI-101.12Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>28
Arg Ala Gly Glu Asn Ser Gly Gly Ile Glu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp
1               5                   10                  15
Val
<210>29
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Kabat命名中NI-101.12Vκ的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>29
Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys Tyr Val Asn
1               5                   10
<210>30
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>Kabat命名中NI-101.12 Vκ的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>30
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>31
<211>9
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Kabat命名中NI-101.12 Vκ的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>31
Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr
1               5
<210>32
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>Kabat命名中NI-101.13 Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>32
Arg Arg Ser Tyr Tyr Trp Gly
1               5
<210>33
<211>16
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(16)
<223>Kabat命名中NI-101.13Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>33
Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser
1               5                   10                  15
<210>34
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Kabat命名中NI-101.13Vh的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>34
Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr
1               5                   10
<210>35
<211>13
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(13)
<223>Kabat命名中NI-101.13 Vλ的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>35
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr
1               5                   10
<210>36
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>Kabat命名中NI-101.13 Vλ的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>36
Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser
1               5
<210>37
<211>11
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Kabat命名中NI-101.13 Vλ的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>37
Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val
1               5                   10
<210>38
<211>372
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(372)
<223>NI-101.12F6A-可变重(Vh)链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(372)
<400>38
cag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc gtg gtc cag cct ggg agg     48
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcg tct gga ttc gcc ttc agt agc tat     96
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg    144
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
gca gtt ata tgg ttt gat gga act aaa aaa tac tat aca gac tcc gtg    192
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
aag ggc aga ttc acc atc tcc aga gac aat tcc aag aac aca ctg tat    240
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
ctg caa atg aac acc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt    288
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
gcg aga gat agg ggt ata gga gct cgg cgg ggg ccg tac tac atg gac    336
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp
            100                 105                 110
gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca                    372
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>39
<211>124
<212>PRT
<213>智人
<400>39
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp
            100                 105                 110
Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>40
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(324)
<223>NI-101.12F6A-可变κ(Vκ)轻链序列
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(324)
<400>40
gac atc cag atg acc cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga     48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
gac aga gtc acc atc act tgc cgg gca agt cag agc att agc agc tat     96
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
tta aat tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc    144
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
tat gct gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc    192
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc agc agt ctg caa cct    240
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
gaa gat ttt gca act tat tac tgt cag cag agt tac agt acc cct ctc    288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aaa cgt                    324
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>41
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<400>41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>42
<211>121
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(121)
<223>NI-101.13A-可变重(Vh)链序列
<400>42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>43
<211>121
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(121)
<223>NI-101.13B-可变重(Vh)链序列
<400>43
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg
            20                  25                  30
Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>44
<211>107
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(107)
<223>NI-101.13A-可变轻(Vl)链序列
<400>44
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr
                85                  90                  95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>45
<211>108
<212>PRT
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(108)
<223>NI-101.13B-可变轻(Vl)链序列
<400>45
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>46
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Kabat命名中NI-101.13A-可变轻(Vl)链序列的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>46
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>47
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>Kabat命名中NI-101.13A-可变轻(Vl)链序列的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>47
Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser
1               5
<210>48
<211>8
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(8)
<223>Kabat命名中NI-101.13A-可变轻(Vl)链序列的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>48
Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr
1               5
<210>49
<211>11
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(11)
<223>Kabat命名中NI-101.13B-可变轻(Vl)链序列的CDR蛋白序列的名称，CDR1
<400>49
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala
1               5                   10
<210>50
<211>7
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(7)
<223>Kabat命名中NI-101.13B-可变轻(Vl)链序列的CDR蛋白序列的名称，CDR2
<400>50
Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser
1               5
<210>51
<211>9
<212>PRT
<213>智人
<220>
<223>互补决定区(CDR)
<220>
<221>MISC-FEATURE
<222>(1)..(9)
<223>Kabat命名中NI-101.13B-可变轻(Vl)链序列的CDR蛋白序列的名称，CDR3
<400>51
Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg Thr
1               5
<210>52
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(363)
<223>NI-101.13A-可变重(Vh)链序列
<400>52
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc     60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agaagaagtt actactgggg ctggatccgc    120
cagtccccag ggaaggggct ggagtggagt ggaagtatcc attatagcgg gagcacctac    180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatctgtag acacgtccaa gaaccagttc    240
tccctgaaac tgagctctgt taccgccgca gacacggctg tctattactg tgcgagatca    300
cgttggggca gcagctgggt atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    360
tcg                                                                  363
<210>53
<211>363
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(363)
<223>NI-101.13B-可变重(Vh)链序列
<400>53
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc     60
acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agaagaagtt actactgggg ctggatccgc    120
cagtccccag ggaaggggct ggagtggagt ggaagtatcc attatagcgg gagcacctac    180
tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatctgtag acacgtccaa gaaccagttc    240
tccctgaaac tgagctctgt taccgccgca gacacggctg tctattactg tgcgagatca    300
cgttggggca gcagctgggt atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc    360
tcg                                                                  363
<210>54
<211>324
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(324)
<223>NI-101.13A-可变轻(Vl)链序列
<400>54
gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct    240
gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccagaacgtt cggccaaggg    300
accaaggtgg agatcaaacg tacg                                           324
<210>55
<211>327
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(327)
<223>NI-101.13B-可变轻(Vl)链序列
<400>55
gacatccagt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc     60
atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagattcca    120
gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca    180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct    240
gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctcgaac gttcggccaa    300
gggaccaagc tggagatcaa acgtacg                                        327
<210>56
<211>372
<212>DNA
<213>智人
<220>
<221>V_区
<222>(1)..(372)
<223>NI-101.11-可变重(Vh)链序列
<400>56
gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc     60
tcctgtgcag cgtctggatt cgccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct    120
ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtttg atggaactaa aaaatactat    180
acagactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat    240
ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg    300
ggtataggag ctcggcgggg gccgtactac atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc    360
accgtctcct ca                                                        372

Claims (51)

1.一种分离疾病相关蛋白特异性结合分子的方法，所述方法包括：
(a)使获自无症状但患有疾病或处于发展疾病的危险的患者、或具有异常稳定的疾病进程的患者的样品经受具有预定临床特征的病理上改变的细胞或组织试样；和
(b)鉴定并任选地分离与所述试样结合、但不与健康对象的对应细胞或组织结合的结合分子。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述样品包括体液或细胞样品。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述体液是脑脊液、血浆或5尿。
4.如权利要求1至3任一项所述的方法，其中所述结合分子是抗体。
5.如权利要求1至4任一项所述的方法，其中所述样品包括或来自B细胞或记忆B细胞。
6.如权利要求1至5任一项所述的方法，其中所述患者和对象分别为人。
7.如权利要求1至6任一项所述的方法，其中所述患者已通过有或没有替代标志物而被确定患有尚未表现的疾病或处于发展疾病的危险。
8.如权利要求7所述的方法，其中所述替代标志物选自老年、脑淀粉样蛋白负载、ApoE基因型、APP基因型、PS1基因型、体液中Aβ肽的水平、异前列腺素、Tau和磷酸-Tau。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其中所述疾病选自神经疾病、自身免疫病和肿瘤。
10.如权利要求1至9任一项所述的方法，其中所述疾病是阿尔茨海默病。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述样品获自满足以下标准的患者：
(i)年龄为65岁或更大；
(ii)具有完全的认知能力和良好的健康；和
(iii)没有痴呆的临床体征；或
(iv)具有异常缓慢的疾患进展速率，尽管存在可能为阿尔茨海默病的确定的临床诊断。
12.如权利要求1至11任一项所述的方法，其进一步包括以下步骤：
(i)从已鉴定含有与所述试样结合但不与健康对象的对应细胞或组织结合的例如抗体的结合分子的样品中纯化B细胞或B记忆细胞；
(ii)从所述B细胞或B记忆细胞获得所述抗体的免疫球蛋白基因谱系；和
(iii)使用所述谱系表达所述抗体。
13.如权利要求12所述的方法，其中步骤(ii)包括以下步骤：
(iv)从所述B细胞或记忆B细胞获得mRNA；
(v)从步骤(iv)的mRNA获得cDNA；和
(vi)使用引物延伸反应从所述cDNA扩增对应于所述抗体的重链(HC)和κ轻链(LC)的片段。
14.一种结合分子，其可通过权利要求1至13任一项所述的方法获得，所述结合分子能选择性地识别疾病相关蛋白的新表位。
15.如权利要求14所述的结合分子，所述结合分子基本不识别以其非疾病相关形式存在的所述蛋白。
16.如权利要求14或15所述的结合分子，其为抗体或其抗原结合片段。
17.如权利要求16所述的抗体，其为人抗体。
18.如权利要求14至17任一项所述的结合分子，其中所述疾病是神经疾病。
19.如权利要求14至18任一项所述的结合分子，其中所述疾病是脑疾病。
20.如权利要求14至19任一项所述的结合分子，其能在病理事件位点穿越血脑屏障。
21.如权利要求14至20任一项所述的结合分子，其能结合β-淀粉样蛋白斑块、脑血管淀粉样蛋白、弥散性Aβ沉积物、神经原纤维缠结、过度磷酸化的tau、α-突触核蛋白阳性Lewy-小体或与营养不良性轴突结合的蛋白聚集体。
22.如权利要求14至21任一项所述的结合分子，其能基本恢复正需行为。
23.如权利要求14至22任一项所述的结合分子，其选自单链Fv片段(scFv)、F(ab′)片段、F(ab)片段和F(ab′)2片段。
24.如权利要求14至23任一项所述的结合分子，其为在其可变区包含至少一个表4所示互补决定区(CDR)的抗体或其结合片段。
25.如权利要求24所述的抗体或结合片段，其包含表2和3所示的VH和/或VL区的氨基酸序列。
26.一种抗原，所述抗原被权利要求14至25任一项所述的结合分子识别。
27.如权利要求26所述的抗原，其为前面任一项权利要求中限定的疾病相关蛋白的至少一部分。
28.一种多核苷酸，其编码权利要求14至25任一项所述的结合分子或权利要求26或27所述的抗原。
29.如权利要求28所述的多核苷酸，其编码权利要求24或25所述的抗体或结合片段的免疫球蛋白链的至少可变区。
30.一种载体，其包含权利要求28所述的多核苷酸或权利要求29所述的多核苷酸，任选地与编码所述抗体的其他免疫球蛋白链的可变区的权利要求29所述的多核苷酸组合。
31.一种宿主细胞，其包含权利要求28或29所述的多核苷酸或权利要求30所述的载体。
32.一种用于制备疾病相关蛋白特异性结合分子、抗体或其结合片段或免疫球蛋白链的方法，所述方法包括
(a)培养权利要求31所述的细胞；和
(b)从所述培养物中分离所述结合分子、抗体或其结合片段或免疫球蛋白链。
33.一种结合分子、抗体、或其免疫球蛋白链或结合片段，其由权利要求28或29所述的多核苷酸编码，或者可通过权利要求32所述的方法获得。
34.如权利要求14至25或33任一项所述的结合分子、抗体或结合片段，其被可检测地标记。
35.如权利要求34所述的结合分子、抗体或结合片段，其中所述可检测标记选自酶、放射性同位素、荧光团和重金属。
36.如权利要求14至25或33至35任一项所述的结合分子、抗体或结合片段，其与药物相连。
37.一种组合物，其包含：权利要求14至25或33至36任一项所述的结合分子、抗体或结合片段，权利要求26或27所述的抗原，权利要求28或29所述的多核苷酸，权利要求30所述的载体，或权利要求31所述的细胞。
38.如权利要求37所述的组合物，其为药物组合物，并且进一步包含药学可接受的载体。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其进一步包含用于治疗阿尔茨海默病的其他物质，所述其他物质选自小有机分子、抗-Aβ抗体及其组合。
40.如权利要求37所述的组合物，其为诊断组合物，并且进一步包含常规用在基于免疫或核酸的诊断方法中的试剂。
41.权利要求14至25或33至36任一项所述的结合分子、抗体或结合片段、或具有与上述任一个基本相同的结合特异性的抗体、权利要求26或27所述的抗原、权利要求28或29所述的多核苷酸、权利要求30所述的载体或权利要求31所述的细胞制备药物组合物或诊断组合物的用途，所述药物组合物或诊断组合物用于治疗或预防阿尔茨海默病的进展；用于改善与阿尔茨海默病相关的症状；用于诊断或筛选对象中阿尔茨海默病的存在或用于确定对象发展阿尔茨海默病的危险。
42.如权利要求41所述的用途，其中所述药物组合物通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、肠胃外、或作为气雾剂施用。
43.一种治疗特征为中枢神经系统中蛋白异常积累和/或沉积的神经疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的权利要求14至25或33至36任一项所述的结合分子、权利要求26或27所述的抗原、权利要求28或29所述的多核苷酸、权利要求30所述的载体或权利要求31所述的细胞施用于有相应需要的对象。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述疾病选自阿尔茨海默病、唐氏综合征、轻度认知损害、脑淀粉样蛋白血管病、血管性痴呆、多发性梗死性痴呆、帕金森病、亨廷顿病、克雅病、囊性纤维化或高雪病。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中施用是通过静脉内、肌内、皮下、腹膜内、鼻内、肠胃外或作为气雾剂进行的。
46.一种诊断和/或治疗分别与阿尔茨海默病和Aβ沉积相关的疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的配体Aβ结合分子施用于对象，所述配体Aβ结合分子包含权利要求24或25所述的抗体或结合片段或对应的抗独特型抗体的至少一个CDR。
47.一种用于诊断疾病的试剂盒，所述疾病伴随着要求保护的肽的任一个中限定的疾病相关蛋白的存在，所述试剂盒包含权利要求14至25或33至36任一项所述的结合分子、抗体或结合片段、权利要求26或27所述的抗原、权利要求28或29所述的多核苷酸、权利要求30所述的载体或权利要求31所述的细胞，任选地具有试剂和/或使用说明书。
48.如权利要求14至25或33至36任一项所述的结合分子、抗体或其结合片段的用途，所述用途是用于脑中疾病相关蛋白的体内检测或将治疗剂和/或诊断剂靶向脑中的疾病相关蛋白，在对象中检测病理蛋白聚集体或构象、抑制病理蛋白聚集体或构象的形成或减少病理蛋白聚集体或构象，用于改善认知或减缓或逆转与疾患相关的认知衰退，或用于从体液体外提取病理化合物或它们的前体。
49.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其与参考抗体特异性结合相同的疾病相关蛋白的新表位，所述参考抗体选自NI-101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B。
50.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体竞争性抑制参考抗体与疾病相关的新表位的结合，所述参考抗体选自NI-101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B。
51.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含与选自NI-101.10、NI-101.11、NI-101.12、NI-101.13、NI-101.12F6A、NI-101.13A和NI-101.13B的抗体相同的抗原结合结构域。
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