BRPI0806328A2 - moléculas de ligação e, anticorpos ou fragmento de ligação e uso dos mesmos, antìgeno, polinucleotìdeo, vetor e célula hospedeira compreendo o referido polinucleotìdeo, método de preparação de uma molécula de ligação beta-ámilóide especìfica, bem como composição - Google Patents

Abstract

MOLéCULAS DE LIGAçãO E, ANTICORPOS OU FRAGMENTO DE LIGAçãO E USO DOS MESMOS, ANTìGENO, POLINUCLEOTìDEO, VETOR E CéLULA HOSPEDEIRA COMPREENDO O REFERIDO POLINUCLEOTìDEO, MéTODO DE PREPARAçãO DE UMA MOLéCULA DE LIGAçãO BETA-AMILóIDE ESPECìFICA, BEM COMO COMPOSIçãO. A presente invenção refere-se a novas moléculas aglutinantes específicas, particularmente anticorpos humanos como também fragmentos, derivados e variantes que reconhecem neoepitopos de proteínas associadas à doença, que derivam de proteínas endógenas nativas, mas que são prevalentes no organismo de um paciente em uma forma variante e/ou fora de seu contexto fisiológico normal. Além disso, estão descritas as composições farmacêuticas compreendendo tais moléculas aglutinantes, anticorpos e representações e métodos de rastreio para novas moléculas aglutinantes, que podem ou não podem ser anticorpos como também alvos no tratamento de distúrbios neurológicos tais como a doença de Alzheimer.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODO PARA PROPICIAR MOLÉCULAS AGLUTINANTES E ALVOS ESPECÍFI- COS DE DOENÇAS".

Campo da invenção

A presente invenção refere-se a novas moléculas específicas de aglutinação, particularmente anticorpos humanos, bem como fragmentos, derivados e variantes dos mesmos, que reconhecem epitopos de doenças associadas, incluindo neoepítopos, das proteínas que resultam de proteínas nativas endógenas e que são prevalentes no corpo de um paciente em uma forma variante e/ou fora do seu contexto fisiológico normal. Além disso, a presente invenção refere-se a composições farmacêuticas compreendendo tais moléculas aglutinantes, anticorpos e réplicas e aos métodos de rastreio para novas moléculas aglutinantes, que podem ou não ser anticorpos, alvos e fármacos no tratamento de diversos distúrbios, em particular, distúrbios neurológicos como a doença de Alzheimer1 amiloidoses e patologia de beta- amiloide.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

O sucesso na geração de anticorpos monoclonais repousa na eficiente e seletiva fusão de células B estimuladas por antígenos com uma linha de células de mieloma murino seguida pela seleção de híbridos produ- tores de anticorpos estáveis, conforme originalmente descrito por Kõhler e Milstein, Nature 256 (1975), 495-497. No entanto, a utilidade terapêutica em seres humanos de anticorpos com base murina é dificultada pela resposta dos anticorpos humanos anti-camundongo (HAMA) em virtude da sua ori- gem não-humana. Abordagens para a produção de anticorpos monoclonais humanos ou similares aos humanos tornaram-se disponíveis através da en- genharia genética. No entanto, os métodos disponíveis até agora sofrem a desvantagem de que não se encontram aptos a produzir anticorpos com as características daqueles produzidos no decurso de uma resposta imune hu- mana fisiológica. Além disso, esses anticorpos não podem ser suficiente- mente específicos devido à reatividade cruzada com outras proteínas e/ou a proteína-alvo em contexto com funções fisiológicas normais. No caso da do- ença de Alzheimer ou da doença de Parkinson1 por exemplo, considera-se que os anticorpos que também reagem de forma cruzada com alta afinidade com derivados fisiológicos da proteína precursora amiloide (APP) ou alfa- sinucleína exibem efeitos colaterais relacionados com as funções normais das estruturas-alvo fisiológicas. Neste aspecto, uma doença autoimune in- desejável seria diretamente induzida - um risco dificilmente calculável no projeto conceituai das experiências de imunização ativa que empregam es- truturas de proteínas que, na forma variante, também ocorrem fisiologica- mente. Os efeitos colaterais não relacionados com a estrutura-aIvo são, por exemplo, reações anafiláticas, que são de se esperar como efeitos colaterais indesejáveis e temidos da administração sistêmica das proteínas exógenas. De acordo com recentes descobertas, este também pode ser o caso nos chamados anticorpos humanizados, que originalmente provêm de organis- mos não-humanos, geralmente a partir de camundongos. Por outro lado, a imunização ativa com antígenos relevantes patológicos comporta o risco considerável de pacientes desenvolverem respostas a anticorpos e a células T, que também reconhecem variantes fisiológicas dessas proteínas e, con- sequentemente, levam a uma perigosa e incontrolável resposta autoimune.

Assim, existe uma necessidade de propiciar agentes que são específicos para um alvo envolvido em um distúrbio e que são tolerados pelo corpo humano.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Um objetivo da presente invenção é um método de identificação, validação e produção, por meio de diagnóstico e de forma terapêutica, de moléculas aglutinantes úteis, em especial anticorpos que são dirigidos contra variantes patológicas de proteínas endógenas. Mais especificamente, a pre- sente invenção refere-se a um método de isolamento de uma molécula aglu- tinante de proteína específica associada à doença, compreendendo:

(a) submeter uma espécime obtida a partir de um paciente assin- tomático ou que esteja excepcionalmente clinicamente estável, mas que es- teja afetado por ou com risco de desenvolver um distúrbio a um espécime de células ou tecidos patologicamente alterados com características patológicas predeterminadas; e

(b) identificar e opcionalmente isolar uma molécula aglutinante que se aglutina ao dito espécime, mas não às células ou tecidos correspon- dentes sem tais características patológicas, uma vez que pode ser derivada de um sujeito saudável.

Conhecido é o fato de que, em caso de doenças autoimunes, os anticorpos são dirigidos contra as células autólogas e proteínas ou outros compostos, tais como glicolipídeos expressos pelas ditas células enquanto escapam dos mecanismos de tolerância conhecidos. Também conhecido é o fato de, em caso de desenvolvimentos neoplásticos endógenos, uma imuni- dade celular e humoral às células neoplásicas pode desenvolver-se e pode, portanto, criar mecanismo de proteção imunológica endógena contra a de- generação neoplásica dos tecidos.

A presente invenção faz uso da constatação surpreendente de que os anticorpos também podem ser dirigidos contra as variantes patofisio- Iogicamente relevantes de proteínas endógenas, em especial contra os neo- epítopos, que se formam devido à transcrição, tradução ou modificação pós- transcrição ou pós-tradução ou processamento proteolítico ou agregação patologicamente alterados. Esses anticorpos são direcionados contra proteí- nas endógenas que, devido à sua nova estrutura que se desvia da fisiologia normal, tornam-se patofisiologicamente relevantes por meio do desenvolvi- mento de efeitos patológicos. Por motivos de tolerância imunológica, os anti- corpos relacionados com a resposta imune correspondente aos neoepítopos nessas variantes patológicas normalmente não apresentam, entretanto, quaisquer reações cruzadas contra as proteínas fisiologicamente funcionais, contrariamente ao caso de doenças autoimunes. Isto porque a formação de anticorpos potencialmente reativos cruzados é especificamente reprimida pelos mecanismos de tolerância conhecidos, ao passo que o desenvolvi- mento de uma resposta imune aos neoepítopos patológicos pode escapar à tolerância.

Assim, a presente invenção refere-se a uma nova abordagem de identificação por meio de diagnóstico, de forma terapêutica e preventiva de moléculas aglutinantes ativas, especialmente anticorpos e fragmentos de anticorpos de sujeitos humanos pré-selecionados por meio da interação com estruturas patológicas identificáveis.

A presente invenção é, assim, dirigida a anticorpos ou fragmen- tos de aglutinação a antígenos e moléculas de aglutinação a antígenos simi- lares que são capazes de reconhecer epitopos, incluindo neoepítopos, de proteínas associadas à doença, que resultam de proteínas endógenas nati- vas e são prevalentes no corpo de um paciente em uma forma variante, por exemplo, como proteína patológica e/ou fora de seu contexto fisiológico normal. Além disso, a presente invenção refere-se a composições compre- endendo os ditos anticorpos e a métodos imunoterapêuticos e imunodiag- nósticos utilizando os mesmos.

Além disso, na identificação de anticorpos, o método de acordo com a presente invenção pode prescindir da hipótese prévia sobre a identi- dade de sua estrutura-alvo molecular, exclusivamente por meio de sua as- sociação com estruturas patologicamente relevantes. Além da possibilidade de assim identificar estruturas-alvo moleculares até aqui desconhecidas para doenças específicas, outra vantagem dos anticorpos que são exclusivamen- te dirigidos contra estruturas patológicas baseia-se no fato de que a sua dis- ponibilidade farmacodinâmica não é negativamente influenciada pela agluti- nação a tecidos não-doentes de tal modo que o anticorpo é amortecido com relação a sua concentração e efeitos de submersão, impedindo deste modo a determinação de concentrações terapeuticamente eficazes. Além disso, o anticorpo e as moléculas de aglutinação da presente invenção são preferi- velmente caracterizados pelo fato de que eles reagem com a forma variante da proteína associada à doença in vivo ou com uma célula ou membrana de célula e em uma seção de tecido com a doença caracterizado patologica- mente, respectivamente, mas sem ou em uma medida significantemente menor com a variante fisiológica da proteína cognata; vide também, por e- xemplo, o Exemplo 2.

Uma vez que a presente invenção permite a identificação e iso- lamento de estruturas-alvo moleculares nas células e tecidos doentes, outra modalidade refere-se ao antígeno e à proteína patológica, ou seja, a proteí- na associada à doença, respectivamente, que é aglutinada pelo anticorpo específico do neoepítopo da presente invenção.

Uma modalidade particularmente preferida é um anticorpo hu- mano ou um fragmento aglutinante de antígeno do mesmo que demonstra suas características aglutinantes imunológicas de qualquer dos anticorpos caracterizados pelas regiões variáveis VH e/ou VL, tal como estabelecido nas Tabelas 2 e 3, infra. Alternativamente, o anticorpo é um anticorpo humaniza- do, xenogênico ou um anticorpo humano-murino quimérico, sendo este últi- mo particularmente útil no caso de métodos diagnósticos e estudos em ani- mais. Composições terapêuticas, incluindo anticorpo ou fragmentos ativos do mesmo ou agonistas e moléculas cognatas ou, alternativamente, antago- nistas das mesmas e os métodos de utilização de tais composições na pre- venção, diagnóstico ou tratamento de uma doença com essas composições também estão incluídos, em que uma quantidade eficaz da composição é administrada a um paciente que necessite de tal tratamento.

O fragmento aglutinante de antígeno do anticorpo pode ser um fragmento Fv de cadeia única, um fragmento F(ab'), um fragmento F(ab) e um fragmento F(ab')2 ou qualquer outro fragmento aglutinante ao antígeno. Em uma modalidade específica, infra, o anticorpo ou fragmento do mesmo é um anticorpo isótipo de IgG humano.

Naturalmente, a presente invenção abrange o linfócito de memó- ria B e a célula B humanos imortalizados, respectivamente, que produzem o anticorpo contendo as características distintas e únicas, tal como definido abaixo.

A presente invenção também se refere aos polinucleotídeos co- dificando pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulina do anticorpo da invenção. Preferivelmente, a dita região variável compreen- de pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) do VH e/ou VL da região variável conforme estabelecido nas Tabelas 2 e 3, infra. Um conjunto correspondente de CDRs é apresentado na Tabela 4, infra.

Assim, a presente invenção também engloba vetores compreen- dendo os ditos polinucleotídeos e as células hospedeiras transformadas con- juntamente, bem como sua utilização para a produção de um anticorpo e de moléculas de aglutinação equivalentes que são específicos para neoepíto- pos que são indicativos e/ou causadores de um distúrbio, em especial para um distúrbio do cérebro, como a doença de Alzheimer e a doença de Parkin- son.

O anticorpo, a(s) cadeia(s) de imunoglobulina, seus fragmentos aglutinantes e o antígeno que se aglutina ao dito anticorpo podem ser usa- dos em composições farmacêuticas e diagnosticas para imunoterapia e di- agnóstico, respectivamente. A utilização das composições precedentes na preparação de um medicamento é, no entanto, preferida.

Portanto, é um objetivo em particular da presente invenção pro- piciar métodos para tratar ou prevenir um distúrbio neurológico caracterizado pelo acúmulo e/ou deposição anormal de uma proteína no sistema nervoso central, sem interferir com a função natural das respectivas proteínas. Os métodos compreendem a administração de uma concentração efetiva de um anticorpo ou derivado de anticorpo ao sujeito no qual o anticorpo aglutina-se à forma patológica da proteína ou do depósito da proteína com uma afinida- de substancialmente maior do que a forma fisiológica normal da proteína. Em uma modalidade preferida, a presente invenção fornece métodos para tratar ou impedir ou retardar o aparecimento de doenças associadas à acu- mulação e deposição do peptídeo beta amiloide em um sujeito, como a do- ença de Alzheimer, síndrome de Down, comprometimento cognitivo leve, angiopatia amiloide cerebral, demência vascular, demência multi-infarto. Os métodos compreendem a administração de uma concentração efetiva de um anticorpo ou derivado de anticorpo ao sujeito, na qual o anticorpo liga-se à forma patológica da proteína ou ao depósito da proteína com maior afinidade do que à forma fisiológica normal da proteína. Abordagens terapêuticas simi- lares são contempladas para o tratamento da doença de Parkinson, doença de Huntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, fibrose cística, doença de Gau- cher e similares.

Outras modalidades da presente invenção serão evidentes a partir da descrição que se segue. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Anticorpo contra beta-amiloide. A: Anticorpos humanos. B: Man- cha de controle com anticorpos conhecidos contra beta-amiloide humano. Pacientes excepcionalmente clinicamente estáveis com doença de Alzhei- mer contêm anticorpos para placas beta-amiloides. A mancha imuno- histoquímica com anticorpos de pacientes excepcionalmente clinicamente estáveis nas seções do cérebro obtidas de pacientes com doença de Al- zheimer confirmada patologicamente revela anticorpos que se aglutinam às placas beta-amiloides confirmadas por um anticorpo conhecido contra o be- ta-amiloide humano.

Figura 2: Anticorpo contra emaranhados neurofibrilares. A: Anticorpos humanos. B: Mancha de controle com anticorpos conhecidos contra a prote- ína tau humana. Sujeitos humanos saudáveis contêm anticorpos para ema- ranhados neurofibrilares. A mancha imuno-histoquímica com anticorpos de pacientes saudáveis nas seções do cérebro obtidas de pacientes com doen- ça de Alzheimer confirmada patologicamente revela anticorpos que se aglu- tinam aos emaranhados neurofibrilares confirmados por um anticorpo co- nhecido contra a proteína tau humana. Figura 3: Anticorpo contra neurites distróficas. A: Anticorpos humanos. B: Mancha de controle com anticorpos conhecidos contra a proteína tau huma- na. Sujeitos humanos saudáveis contêm anticorpos para neurites distróficas. A mancha imuno-histoquímica com anticorpos de pacientes saudáveis nas seções do cérebro obtidas de pacientes com doença de Alzheimer confirma- da patologicamente revela anticorpos que se aglutinam às neurites distrófi- cas.

Figura 4: Anticorpo contra beta-amiloide. A figura mostra a aglutinação específica do anticorpo NI-101.11 recombinante humano, que foi isolado de um paciente com doença de Alzheimer excepcionalmente estável clinica- mente, às placas beta-amiloides do cérebro. As seções cerebrais obtidas de um paciente com doença de Alzheimer neuropatologicamente confirmada foram manchadas com anticorpos recombinantes humanos nas concentra- ções indicadas. Anticorpo que se aglutina às placas beta-amiloides com concentrações de 50 pM sugere aglutinação de alta afinidade. Figura 5: A aglutinação do anticorpo NI-101.11 humano recombinante às placas beta-amiloides não sofre concorrência dos polipeptídeos Abeta de terminação-N sintéticos lineares. A aglutinação do anticorpo recombinante contra o beta-amiloide (0,5 nM) cerebral não sofre concorrência do polipeptí- dio derivado de Abeta de terminação N representando as posições 1 a 16 em concentrações de até 1 μΜ. Figura 6: O anticorpo NI-101.11 humano recombinante reconhece um epi- topo Abeta conformacional que não está presente no Abeta monomérico. A aglutinação do NI-101.11 às placas beta-amiloides nas seções do cérebro podem sofrer concorrência das fibrilas Abetal-42, mas não dos monômeros Abetal-42 sintéticos lineares. Figura 7: O anticorpo NI-101.11 humano recombinante não se aglutina ao Abeta sintético monomérico linear no método Western blot. Preparações de Abeta monomérico foram separadas por PAGE não-desnaturante. A proteína detectada pelo método Blot foi examinada com o anticorpo recombinante humano contra o beta-amiloide e os anticorpos de controle contra as se- qüências de Abeta linear de terminação-N (6E10). Nenhuma aglutinação de NI-101.11 ao Abeta monomérico foi detectada. Esta constatação sugere que o anticorpo reconhece um epitopo conformacional Abeta. Figura 8: O anticorpo NI-101.11 humano aglutina-se às fibrilas amiloides artificiais preparadas a partir dos peptídeos do Abetal-42 sintéticos. As fibri- las do Abeta sintético ou do Abeta sintético monomérico cobrindo as placas ELISA em densidades de cobertura iguais foram incubadas com anticorpos humanos recombinantes contra o beta-amiloide cerebral nas concentrações indicadas. A atividade de aglutinação do anticorpo humano contra o beta- amiloide cerebral para fibrilas amiloides artificiais (quadrados abertos) é mais de 100 vezes superior em comparação ao Abeta monomérico (quadrados preenchidos). O anticorpo de controle 22C4 liga-se preferencialmente ao Abeta monomérico (ciclos preenchidos) e menos preferencialmente às fibri- las (círculos abertos). Isto sugere que o NI-101.11 reconhece um epitopo conformacional, que também está presente em fibrilas amiloides artificiais preparadas a partir de peptídeos sintéticos Abeta.

Figura 9: Reatividade cruzada ausente de anticorpo NI-101.11 humano recombinante para APP de extensão total celular ou com qualquer de seus derivados fisiológicos ocorrendo em células expostas à cultura. Em contraste com o anticorpo de controle (6E10) que se aglutina ao APP de superfície das células, a aglutinação de NI-101.11 ao APP de extensão total em superfícies celulares está ausente. Estes dados demonstram reatividade cruzada ausen- te de NI-101.11 para APP de extensão total celular, fisiológica. Figura 10A-C: Ausência de ligação da NI-101.11 ao Abeta monomérico via cromatografia de exclusão de tamanho. As figuras 10A e 10B não mos- tram qualquer aglutinação do NI-101.11 ou de um anticorpo de controle não relacionado ao Abeta 1-42 rotulado de FITC1 enquanto a Figura 10C mostra aglutinação proeminente do anticorpo 22C4 que reconhece um epitopo linear presente na terminação-C do Abeta.

Figura 11: O ELISA de concorrência mostra que a aglutinação do anticorpo 6E10, um anticorpo dirigido contra um epitopo linear na terminação-N do Abeta, poderia ser completamente bloqueada quando da pré-incubação com concentrações superiores de peptídeos Abeta monoméricos, enquanto a pré-incubação com concentrações superiores destas preparações de peptí- deos de Abeta monoméricos não aboliu a aglutinação do NI-101.11. Figura 12: A aglutinação de NI-101.13A e NI-101.13B às seções cerebrais obtidas do modelo de camundongo transgênico Tg2676 da doença de Al- zheimer.

Figura 13: ELISA mostrando aglutinação preferencial de NI-101.13A e NI- 101. 13B às fibrilas amiloides artificiais em comparação com o Abeta mono- mérico.

Figura 14A-B: A Figura 14A mostra a aglutinação do NI-101.12 recom- binante ao peptídeo sintético Abetal-42 através do ELISA. A Figura 14B mostra que a aglutinação do NI-101.12 sofreu concorrência do peptídeo Abetal-42 em excesso.

Figura 15: Anticorpo humano recombinante NI-101.11 contra o beta- amiloide cerebral cruza a barreira hematoencefálica em um modelo de ca- mundongo transgênico da doença de Alzheimer e se aglutina às placas do beta-amiloide encefálicas in vivo.

Figura 16A-B: O anticorpo NI-101.11 humano recombinante aperfeiçoa o comportamento cognitivo anormal em um modelo de camundongo trans- gênico da doença de Alzheimer. Camundongos arcAbeta com 24 meses de idade foram tratados semanalmente i.p. com 3 mg/kg de anticorpos por dois meses. O teste comportamental de labirinto em Y foi realizado antes e após a conclusão do tratamento.

Figura 17: A penetração na barreira hematoencefálica e a decoração das placas amiloides pela administração periférica do NI-101.11. O NI-101.11 pode atravessar a barreira hematoencefálica e se aglutinar aos depósitos beta-amiloides em camundongos tratados com NI-101.11 (painel esquerdo), enquanto que nenhuma dessas manchas é visível nos animais tratados com o anticorpo de controle humano (painel direito). O anticorpo NI-101.11 hu- mano recombinante reduz a carga das placas de beta-amiloides no cérebro após o tratamento sistêmico por dois meses.

Figura 18: A imunização passiva com NI-101.11 reduz a carga de beta- amiloides em camundongos arcAbeta. As análises das cargas das placas de Tioflavina S (A1B) e Vermelho de congo revelam significativas reduções de mais de 50% em comparação com os animais tratados com anticorpo de controle (Mann-Whitney U, ρ = 0,02 para o córtex, ρ = 0,009 para o hipo- campo para TioS e ρ = 0,009 para o córtex e p=0,04 para o hipocampo para a análise com Vermelho de congo). Barra graduada: 200 pm. A análise de (C-E) Tioflavina S revela uma redução significativa no peso de beta- amiloides (C), no número de placas beta-amiloides (D) e no tamanho médio das placas (E) em camundongos arcAbeta tratados com NI-101.11 em com- paração com animais tratados com controle. Estatísticas em Mann-Whitney U: ρ = 0,02 para córtex da área da placa; ρ = 0,009 para hipocampo da área 30 da placa; ρ = 0,047 para córtex de número da placa; ρ = 0,047 para hipo- campo de número da placa; ρ = 0,009 para córtex de tamanho da placa; ρ = 0,009 para hipocampo de número da placa. Figura 19: A carga reduzida de beta-amiloides é acompanhada por uma diminuição de astrocitose e microgliose: A) A quantificação da mancha anti- GFAP revelou uma redução significativa no número de astrócitos reativos no córtex de camundongos arcAbeta tratados com NI-101.11, quando compa- rados com os trangênicos tratados com controle. Β) A quantificação da man- cha lba-1 mostrou uma tendência para um número reduzido de microglia ativada em camundongos tratados com NI-101.11 no córtex e no hipocampo. Barra graduada: 200μm.

Figura 20: Não há aumento das micro-hemorragias encefálicas após dois meses de tratamento com anticorpo N1-101.11 humano recombinante. Ca- mundongos de 24 meses de idade arcAbeta com angiopatia amiloide congo- fílica massiva comprovada foram tratados semanalmente i.p. com 3 mg/kg de anticorpos por dois meses. Imagem representativa de uma micro- hemorragia encefálica em camundongos arcAbeta revelada pela mancha azul da Prússia (à esquerda). A análise quantitativa demonstra uma freqüên- cia significativamente elevada de micro-hemorragias em camundongos tran- gênicos arcAbeta em comparação com filhotes selvagens. O tratamento crô- nico com NI-101.11 não resultou em aumento da freqüência de micro- hemorragias. Barra graduada: 20μm

Figura 21: O anticorpo NI-101.11 humano recombinante inibe a formação de fibrilas Abeta sintéticas in vitro. O efeito do anticorpo NI-101.11 humano recombinante na formação das fibrilas Abeta foi testado pela medição da Tioflavina S aglutinada ao Abeta agregado pela análise porfluorescência. Figura 22: Fagocitose dependente de dosagem mediada por anticorpos das fibrilas de FITC-Abeta1-42 pelas células microgliais BV-2 foi medida quando da inibição do sistema receptor "scavenser". O NI-101.11 desencadeia fago- citose mediada por receptor Fcgama dependente de dosagem potente de fibrilas Abeta.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

I. Definições

Deve ser observado que o termo "um" ou "uma" entidade refere- se a uma ou mais daquela entidade; por exemplo, "um anticorpo", represen- ta um ou mais anticorpos. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais" e "pelo menos um" podem ser usados permutavelmente aqui.

Conforme utilizado aqui, o termo "polipeptídeo" destina-se a a- branger um "polipeptídeo" singular, como também o plural "polipeptídeos" e refere-se a uma molécula composta de monômeros (aminoácidos) linear- mente ligada por aglutinações de amida (também conhecidos como agluti- nações de peptídeo). O termo "polipeptídeo" refere-se a qualquer cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos e não se refere a um comprimento es- pecífico do produto. Assim, os peptídeos, dipeptídeos, tripeptídeos, oligopep- tídeos, "proteína", "cadeia de aminoácidos" ou qualquer outro termo utilizado para referência a uma cadeia ou cadeias de dois ou mais aminoácidos, são incluídos na definição de "polipeptídeo" e o termo "polipeptídeo" pode ser usado em vez de ou permutavelmente com qualquer um destes termos.

O termo "polipeptídeo" destina-se igualmente a fazer referência a produtos de modificações pós-expressão do polipeptídeo, incluindo, entre outros, a glicosilação, acetiiação, fosforilação, amidação, derivação através de grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica ou modifi- cação por aminoácidos não-naturalmente ocorrentes. Um polipeptídeo pode ser derivado de uma fonte biológica natural ou produzido por tecnologia re- combinante, mas não é necessariamente traduzido a partir de uma seqüên- cia de ácido nucleico designada. Ele pode ser gerado de qualquer forma, inclusive por síntese química.

Um polipeptídeo da invenção pode ser de um tamanho de cerca de 3 ou mais, 5 ou mais, 10 ou mais, 20 ou mais, 25 ou mais, 50 ou mais, 75 ou mais, 100 ou mais, 200 ou mais, 500 ou mais, 1.000 ou mais ou 2.000 ou mais aminoácidos. Os polipeptídeos podem ter uma estrutura tridimensional definida, embora não necessariamente tenham essa estrutura. Os polipeptí- deos com uma estrutura tridimensional definida são referidos como dobra- dos, e os polipeptídeos que não possuem uma estrutura tridimensional defi- nida, mas podem adotar um grande número de diferentes conformações, são referidos como desdobrados. Conforme utilizado aqui, o termo glicopro- teína refere-se a uma proteína acoplada a, pelo menos, uma porção de car- boidrato que é anexada à proteína através de uma cadeia lateral contendo oxigênio ou contendo nitrogênio de um resíduo de aminoácido, por exemplo, um resíduo de serina ou um resíduo de asparagina.

Um polipeptídeo "isolado" ou um fragmento, variante ou derivado seu, significa um polipeptídeo que não se encontra em seu meio natural. Nenhum nível particular de purificação é exigido. Por exemplo, um polipeptí- deo isolado pode ser removido de seu ambiente natural ou nativo. Polipeptí- deos e proteínas recombinantemente produzidos expressos em células hos- pedeiras são considerados isolados para fins da invenção, visto que são po- lipeptídeos nativos ou recombinantes que foram separados, fracionados ou substancialmente ou parcialmente purificados por qualquer técnica adequa- da.

Também incluídos como polipeptídeos da presente invenção estão os fragmentos, derivados, análogos ou variantes dos polipeptídeos precedentes e qualquer combinação destes. Os termos "fragmento", "varian- te", "derivativo" e "análogo", quando se referem a anticorpos ou polipeptí- deos de anticorpos da presente invenção, incluem quaisquer polipeptídeos que retêm pelo menos algumas das propriedades de aglutinação a antíge- nos da molécula de aglutinação nativa, anticorpo ou polipeptídeo correspon- dentes. Fragmentos de polipeptídeos da presente invenção incluem frag- mentos proteolíticos, bem como fragmentos de supressão, além de fragmen- tos de anticorpos específicos discutidos em outro lugar aqui. As variantes de anticorpos e polipeptídeos de anticorpos da presente invenção incluem fragmentos, como descritos acima, e também polipeptídeos com seqüências de aminoácidos alteradas devido a substituições, supressões ou inserções. Variantes que podem ocorrer naturalmente ou não-naturalmente. As varian- tes que não ocorrem naturalmente podem ser produzidas utilizando as técni- cas de mutagênese conhecidas na técnica. Polipeptídeos variantes podem compreender substituições, supressões ou inserções de aminoácidos con- servadores e não-conservadores. Derivados de moléculas de aglutinação específica de neoepítopo, por exemplo, anticorpos e polipeptídeos de anti- corpos da presente invenção, são polipeptídeos que foram alterados de mo- do a exibir características adicionais não encontradas no polipeptídeo nativo. Exemplos incluem proteínas de fusão. Os polipeptídeos variantes também podem ser aqui referidos como "análogos de polipeptídeos". Conforme utili- zado aqui, um "derivado" de uma molécula ou fragmento de aglutinação, um anticorpo ou um polipeptídeo de anticorpo se refere a um polipeptídeo de sujeito contendo um ou mais resíduos quimicamente derivados pela reação de um grupo lateral funcional. Também incluídos como "derivados" são os peptídeos que contêm um ou mais derivados de aminoácidos de ocorrência natural dentre os vinte aminoácidos-padrão. Por exemplo, a 4-hidroxiprolina pode ser substituída por prolina; 5-hidroxilisina pode ser substituída por Iisi- na; 3-metil-histidina pode ser usada em lugar da histidina; homesserina pode ser substituída por serina; ornitina pode ser substituída por lisina.

O termo "polinucleotídeo" destina-se a abranger um ácido nucle- ico singular, bem como ácidos nucleicos plurais, e refere-se a uma molécula de ácido nucleico isolada ou construtora, por exemplo, RNA mensageiro (mRNA) ou DNA de plasmídeo (pDNA). Um polinucleotídeo pode incluir uma aglutinação de fosfodiéster convencional ou uma aglutinação não- convencional (por exemplo, uma aglutinação de amidas, tais como encon- tradas nos ácidos nucleicos de peptídeos (PNA)). O termo "ácido nucleico" refere-se a qualquer um ou mais segmentos de ácido nucleico, por exemplo, fragmentos de DNA ou RNA, presentes em um polinucleotídeo. Ácido nucle- ico ou polinucleotídeo "isolado" significa uma molécula de ácido nucleico, DNA ou RNA1 que foi removida de seu ambiente nativo. Por exemplo, um polinucleotídeo recombinante codificando um anticorpo contido em um vetor é considerado isolado para efeitos da presente invenção. Outros exemplos de um polinucleotídeo isolado incluem polinucleotídeos recombinantes man- tidos em células hospedeiras heterólogas ou polinucleotídeos (parcial ou substancialmente) purificados em solução. Moléculas de RNA isoladas in- cluem transcrições de RNA in vivo ou in vitro de polinucleotídeos da presen- te invenção. Polinucleotídeos ou ácidos nucleicos isolados, de acordo com a presente invenção, além disso, incluem tais moléculas produzidas sintetica- mente. Além disso, o polinucleotídeo ou o ácido nucleico pode ser ou pode incluir um elemento regulador, como promotor, sítio de aglutinação de ribos- somos ou um terminador de transcrição.

Conforme utilizado aqui, uma "região de codificação" é uma por- ção de ácido nucleico, que consiste em códons traduzidos em aminoácidos. Embora um "códon de parada" (TAG, TGA ou TAA) não seja traduzido em um aminoácido, este pode ser considerado como parte de uma região codifi- cadora, mas quaisquer seqüências flanqueadora ("flankis sequence"), por exemplo, promotores, sítios de aglutinação de ribossomos, terminadores transcricionais, íntron e similares, não fazem parte de uma região codificado- ra. Duas ou mais regiões codificadores da presente invenção podem estar presentes em um único constructo de polinucleotídeos, por exemplo, em um único vetor ou constructos de polinucleotídeos separados, por exemplo, em vetores (diferentes) separados. Além disso, qualquer vetor pode conter uma única região codificadora ou pode incluir duas ou mais regiões codificadoras, por exemplo, um único vetor pode codificar separadamente uma região vari- ável de cadeia pesada de imunoglobulinas e uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina. Além disso, um vetor, polinucleotídeo ou ácido nu- cleico da invenção podem codificar regiões de codificação heterólogas, quer fundidas ou não fundidas a um ácido nucleico que codifica uma molécula de aglutinação, um anticorpo ou fragmento, variante ou seu derivado. Regiões codificadoras heterólogas incluem, sem limitação, elementos ou motivos es- pecializados, tais como peptídeo de sinal secretor ou um domínio funcional hetérólogo.

Em certas modalidades, o polinucleotídeo ou ácido nucleico é o DNA. No caso do DNA, uma polinucleotídeo compreendendo um ácido nu- cleico que codifica um polipeptídeo normalmente pode incluir um promotor e/ou outros elementos de transcrição ou tradução operavelmente associados a uma ou mais regiões codificadoras. Uma associação operável se dá quan- do uma região codificadora de um produto de gene, por exemplo, um poli- peptídeo, é associado a uma ou mais seqüências reguladoras de tal modo que coloque a expressão do produto do gene sob a influência ou o controle da(s) sequência(s) reguladora(s). Dois fragmentos de DNA (como uma regi- ão codificadora de polipeptídeo e um promotor associado) são "operavel- mente associados" se a indução da função do promotor resultar na transcri- ção do mRNA que codifica o produto do gene desejado e se a natureza da ligação entre os dois fragmentos de DNA não interfere com a capacidade das seqüências reguladoras de expressão de direcionar a expressão do pro- duto do gene ou interfere com a capacidade do modelo de DNA ser transcri- to. Assim, a região do promotor seria operavelmente associada com um áci- do nucleico codificando um polipeptídeo se o promotor for capaz de efetuar a transcrição daquele ácido nucleico. O promotor pode ser um promotor de célula específica que direciona a transcrição substancial do DNA apenas em células predeterminadas. Outros elementos de controle de transcrição, além de um promotor, por exemplo, os potencializadores, operadores, repressores e sinais de término de transcrição, podem ser operavelmente associados com o polinucleotídeo para direcionar a transcrição específica das células. Promotores adequados e outras regiões de controle de transcrição são des- critos aqui.

Uma variedade de regiões de controle de transcrição é conheci- da daqueles versados na técnica. Estas incluem, entre outras, regiões de controle de transcrição que funcionam em células de vertebrados, tais como, mas não limitados a, segmentos promotores e intensificadores de citomega- lovírus (o promotor antecipado imediato, em conjunto com íntron-A), vírus símio 40 (o promotor antecipado) e retrovírus (como vírus Rous sarcoma). Outras regiões de controle de transcrição incluem aquelas derivadas de ge- nes de vertebrados tais como actínia, proteína de choque térmico, vertebra- dos, como a actínia, proteínas de choque térmico, hormônio de crescimento bovino e β-globina de coelhos, como também outras seqüências capazes de controlar a expressão dos genes em células eucarióticas. Outras regiões de controle de transcrição adequadas incluem promotores específicos de teci- dos e potencializadores, como também promotores induzíveis de Iinfocina (por exemplo, promotores induzíveis por interferons ou interleucinas).

Da mesma forma, uma variedade de elementos de controle de tradução é conhecida por aqueles versados na técnica. Estes incluem, mas não estão limitados a, sítios de aglutinação de ribossomos, códons de inicia- ção e término de tradução e elementos derivados de picornavírus (especial- mente um sítio de entrada de ribossomo interno, ou IRES, também referido como uma seqüência CITE).

Em outras modalidades, um polinucleotídeo da presente inven- ção é o RNA1 por exemplo, sob a forma de RNA mensageiro (MRNA).

As regiões codificadoras de polinucleotídeos e ácidos nucleicos da presente invenção podem estar associadas a outras regiões codificado- ras que codificam peptídeos secretores e de sinalização, que direcionam a secreção de um polipeptídio codificado por um polinucleotídeo da presente invenção. De acordo com a hipótese de sinal, as proteínas secretadas pelas células mamíferas têm uma seqüência de peptídeo ou de líder secretor de sinal que é clivada da proteína madura, uma vez que a exportação da cres- cente cadeia de proteínas através do retículo endoplásmico grosso tiver sido iniciada. Aqueles versados na técnica têm conhecimento que os polipeptí- deos secretados pelas células de vertebrados geralmente têm um peptídeo de sinal fundido à terminação N do polipeptídeo, que é clivado do polipeptí- deo completo ou de "comprimento total" para produzir uma forma secretada ou "madura" do polipeptídeo. Em certas modalidades, o peptídeo de sinal nativo, por exemplo, um peptídeo de sinal de cadeia pesada de imunoglobu- Iina ou de cadeia leve é usado ou um derivado funcional dessa seqüência que retém a capacidade de direcionar a secreção do polipeptídeo que é ope- ravelmente associado com este. Alternativamente, um peptídeo de sinal mamífero heterólogo ou derivado seu, pode ser usado. Por exemplo, a se- quência líder do tipo selvagem pode ser substituída pela seqüência líder do ativador de plasminogênio de tecido humano (TPA) ou de β-glucuronidase de camundongos.

Salvo disposição em contrário, os termos "distúrbio" e "doença" são utilizados alternadamente aqui. Uma "molécula de aglutinação", confor- me utilizada no contexto da presente invenção relaciona-se principalmente a anticorpos e seus fragmentos, mas também pode referir-se a outras molécu- las não de anticorpos que se aglutinam a um neoepítopo, incluindo, entre outros, hormônios, receptores, ligantes, grandes moléculas (MHC) do com- plexo de histocompatibilidade, acompanhantes tais como proteínas de cho- que térmico (HPSs)1 bem como moléculas de aderência célula-célula tais como membros das super famílias (Ig) da caderina, intergrina, Iecitina do tipo Ce imunoglobulina. Assim, por uma questão de clareza e sem restringir o âmbito da presente invenção, a maioria das modalidades seguintes é discu- tida com relação aos anticorpos e moléculas similares a anticorpos que re- presentam as moléculas de aglutinação preferidas para o desenvolvimento de agentes terapêuticos e diagnósticos.

Os termos "anticorpos" e "imunoglobulina" são utilizados alter- nadamente aqui. Um anticorpo ou imunoglobulina é uma molécula de agluti- nação a antígeno que inclui pelo menos o domínio variável de uma cadeia pesada e, normalmente, compreende, pelo menos, os domínios variáveis de uma cadeia pesada e uma cadeia leve. As estruturas de imunoglobulinas básicas em sistemas de vertebrados sistemas são relativamente bem com- preendidas. Vide, por exemplo, Harlow et ai, Antibodies: A Laboratory Ma- nual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. 1988).

Conforme será discutido em maior detalhe abaixo, o termo "imu- noglobulina" compreende várias classes amplas de polipeptídeos que podem ser distinguidos bioquimicamente. Aqueles versados na técnica observarão que as cadeias pesadas são classificadas como gama, mu, alfa, delta ou epsilon, (γ, μ, (, (, () com algumas subclasses entre eles (por exemplo, (γ1- γ4). É característica desta cadeia determinar a "classe" do anticorpo como IgG, IgM, IgA IgG ou IgE, respectivamente. As subclasses de imunoglobulina (isotipos), por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, etc. são bem carac- terizadas e são conhecidas por conferir especialização funcional. Versões modificadas de dada dessas classes e isotipos são prontamente discerníveis àqueles versados na técnica em vista da descrição presente e, conse- quentemente, estão dentro do âmbito da presente invenção. Todas as classes de imunoglobulinas estão claramente dentro do âmbito da presente invenção, a discussão seguinte será geralmente dirigida à classe IgG das moléculas de imunoglobulina. Com relação à IgG, uma molécula de imu- nogobulina-padrão compreende dois polipeptídeos de cadeia leve idênticos de peso molecular de aproximadamente 23.000 Dáltons e dois polipeptídeos de cadeia pesada idênticos de peso molecular de 53.000-7000. As quatro cadeias são normalmente unidas pelas ligas de dissulfeto em uma configu- ração em "Y" na qual as cadeias leves envolvem as cadeias pesadas ini- ciando na abertura do "Y" e continuando através da região variável.

Cadeias leves são classificadas como kappa ou Iambda (κ, λ). Cada classe de cadeia pesada pode ser aglutinada com uma cadeia leve kappa ou lambda. Em geral, as cadeias leves e pesadas são covalente- mente aglutinadas umas às outras e as porções da "cauda" das duas cadeias pesadas são aglutinadas entre si por ligações covalentes de dis- sulfeto ou ligações não covalentes quando as imunoglobulinas são geradas quer por hibridomas, células B ou células hospedeiras projetadas genetica- mente. Na cadeia pesada, as seqüências de aminoácidos percorrem a partir de uma terminação N nas terminações bifurcadas da configuração em U até a terminação C na base de cada cadeia.

Tanto as cadeias leves e pesadas são divididas em regiões de homologia estrutural e funcional. Os termos "constante" e "variável" são utili- zados funcionalmente. Neste contexto, será observado que os domínios va- riáveis tanto das porções de cadeia leve (VL) e pesada (VH) determinam o reconhecimento e a especificidade do antígeno. Inversamente, os domínios constantes da cadeia leve (CL) e de cadeia pesada (CH1, CH2 ou CH3) con- ferem importantes propriedades biológicas tais como a secreção, mobilidade transplacentária, aglutinação do receptor Fc1 aglutinação complementar e similar. Por convenção, a numeração dos domínios das regiões constantes aumenta à medida que se tornam mais distantes do sítio de aglutinação do antígeno ou da terminação amino do anticorpo. A porção da terminação N é uma região variável e na porção da terminação C é uma região constante; os domínios CH3 e CL realmente compreendem a terminação carbóxi da ca- deia pesada e leve, respectivamente.

Conforme indicado acima, a região variável permite que o anti- corpo seletivamente reconheça e especificamente aglutine epitopos sobre antígenos. Isto é, o domínio VL e o domínio VH ou subgrupo de regiões de- terminantes da complementaridade (CDRs)1 de um anticorpo se combinam para formar a região variável que define um sítio tridimensional de aglutina- ção aos antígenos. Esta estrutura de anticorpos quaternária forma o sítio de aglutinação aos antígenos presentes no final de cada braço do Y. Mais es- pecificamente, o sítio de aglutinação aos antígenos é definido por três CDRs em cada uma das cadeias VH e VL. Qualquer anticorpo ou fragmento de imunoglobulina que contém estrutura suficiente para especificamente se a- glutinar a um antígeno é denotado aqui permutavelmente como um "frag- mento de aglutinação a antígenos" ou um "fragmento imunoespecífico".

Em anticorpos ocorrendo naturalmente, as seis "regiões deter- minantes de complementaridade" ou "CDRs" presentes em cada domínio de aglutinação a antígenos são seqüências curtas, hão contíguas de aminoáci- dos que são especificamente posicionados para formar o domínio de agluti- nação a antigenos já que o anticorpo assume a sua configuração tridimensi- onal em um ambiente aquoso. O restante dos aminoácidos nos domínios de aglutinação dos antígenos, referidos como regiões de "estrutura", mostram menor variabilidade intermolecular. As regiões de estrutura de trabalho ado- tam uma conformação de folha-β e as CDRs formam alças que ligam a estrutura em folha-β e, em alguns casos, formam parte dela. Assim, regiões de estrutura atuam de modo a formar um andaime que propicia o posiciona- mento das CDRs na correta orientação através de interações intercadeias, não covalentes. O domínio de aglutinação dos antígenos formado pelas CDRs posicionadas define uma superfície complementar ao epitopo no antígeno imunorreativo. Esta superfície complementar promove a aglutina- ção não-covalente do anticorpo ao seu epitopo cognato. Os aminoácidos compreendendo as CDRs e as regiões de estrutura, respectivamente, po- dem ser facilmente identificados por qualquer região dada variável de cadeia pesada ou leve por alguém ordinariamente versado na técnica, desde que tenham sido definidos com precisão (Vide "Sequences of Proteins of Immu- nological lnterest", Kabat, E., et al., E.U. Department of Health and Human Services, (1983); e Chothia and Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987), que são incorporados neste documento por referência em sua totalidade).

No caso de haver duas ou mais definições de um termo que é utilizado e/ou aceito na técnica, a definição do termo, tal como é utilizada neste documento destina-se a incluir todos esses significados a menos que explicitamente afirmado o contrário. Um exemplo específico é a utilização do termo "região determinante de complementaridade" ("CDR") para descrever os sítios combinantes de antígenos não-contíguos dentro da região variável de polipeptídeos de cadeia leve e pesada. Esta região em particular foi de- scrita por Kabat et al., E.U. Dept. of Health and Human Services, "Se- quences of Proteins of Immunological Interest" (1983) e por Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987), que são incorporados por referência neste documento, em que as definições incluem sobreposição ou subconjuntos de resíduos de aminoácidos quando comparados uns com os outros. No en- tanto, a aplicação de qualquer uma das duas definições para se referir a uma CDR de um anticorpo ou suas variantes, destina-se a estar dentro do âmbito do termo conforme definido e usado aqui. Os resíduos de aminoáci- dos apropriados que abrangem as CDRs1 tal como definido por cada uma das referências acima citadas estão apresentados na Tabela I abaixo como comparação. Os números exatos dos resíduos que abrangem uma determi- nada CDR irão variar dependendo da seqüência e tamanho do CDR. Aque- les versados na técnica poderão rotineiramente determinar quais resíduos compreendem uma CDR especial, dada a seqüência de aminoácidos da região variável do anticorpo.

Tabela 1: Definicoes das CDRs1

<table>table see original document page 22</column></row><table>

A numeração de todas as definições de CDRs na Tabela 1 está de acordo com as convenções de numeração apresentadas por Kabat et al. (vide abaixo).

Kabat et al. também definiram um sistema de numeração para as seqüências de domínios variáveis que é aplicável a qualquer anticorpo. Alguém com habilidade ordinária na técnica designa este sistema de "nume- ração de Kabat" a qualquer seqüência de domínio variável, sem dependên- cia de quaisquer dados experimentais além da seqüência em si. Conforme utilizado aqui, a "numeração de Kabat" refere-se ao sistema de numeração estabelecidos por Kabat et al., E.U. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Salvo disposição em contrário, as referências à numeração das posições de resíduos de ami- noácidos específicos em um anticorpo ou fragmento de aglutinação ao antí- geno, variante ou seu derivado da presente invenção estão de acordo com o sistema de numeração de Kabat.

Anticorpos ou fragmentos de aglutinação aos antígenos, frag- mentos imunoespecíficos, variantes ou seus derivados da invenção incluem, entre outros, anticorpos policlonais, monoclonais, multi específicos, huma- nos, humanizados, primatizados ou anticorpos quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos de aglutinação aos epitopos, por exemplo, Fab, Fab'e F(ab')2, Fd, Fvs, Fvs de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia úni- ca, Fvs ligados aos bissulfetos (sdFv), fragmentos compreendendo quer um domínio VL ou VH1 fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressões de Fab e anticorpos antiidiotípicos (anti-ld), (incluindo, por exemplo, anticor- pos anti-ld para os anticorpos descritos aqui). As moléculas ScFv são co- nhecidas na técnica e são descritas, por exemplo, na patente U.S. N°. 5.892.019. A imunoglobulina ou as moléculas de anticorpos da invenção po- dem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IGD, IgA e IgY), clas- se (por exemplo, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgAI e lgA2) ou subclasse de mo- lécula de imunoglobulina.

Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção não é IgM ou um de seus derivados com uma estrutura pentavalente. Particulares, em aplicações específicas da presente invenção, especialmente no uso te- rapêutico, os IgMs são menos úteis do que o IgG e outros anticorpos biva- Ientes ou moléculas de aglutinação correspondentes visto que os IgMs1 de- vido à sua estrutura pentavalente e a falta de maturação da afinidade apre- sentam freqüentemente reatividades cruzadas inespecíficas e com afinidade muito baixa.Fragmentos de anticorpos, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender região(ões) variável(eis) separadamente ou em combi- nação com a totalidade ou uma parte do seguinte: região hinse e domínios CH1, CH2 e CH3. Também incluídos na invenção estão os fragmentos de aglutinação ao antígeno também compreendendo qualquer combinação de região(ões) variável(eis) com uma região hinse e domínios CH1, CH2 e CH3. Anticorpos ou seus fragmentos imunoespecíficos da presente invenção po- dem ser de origem de qualquer animal incluindo aves e mamíferos. Preferi- velmente, os anticorpos são humanos, murinos, asininos, de coelho, cabra, porco da Guiné, camelo, lhama, cavalo ou galinha. Em outra modalidade, a região variável pode ser condrictioide em sua origem (por exemplo, de tuba- rões). Conforme usado aqui, os anticorpos "humanos" incluem anticorpos contendo seqüência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e in- cluem anticorpos isolados de pacientes humanos, conjuntos de imunoglobu- lina humana ou de animais trangênicos para uma ou mais imunoglobulinas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, conforme descrito abaixo e, por exemplo, na Patente U.S. N0. 5.939.598 de Kucherlapati et al. Um an- ticorpo humano é ainda "humano" mesmo se as substituições de aminoáci- dos forem feitas no anticorpo, por exemplo, para melhorar as característics de aglutinação.

Conforme usado aqui, o termo "parte de cadeia pesada" inclui seqüências de aminoácidos derivadas de uma cadeia pesada de imunoglo- bulina. Um polipeptídeo compreendendo uma parte de cadeia pesada com- preende pelo menos um dos seguintes: um domínio CH1, um domínio hinse (por exemplo, região hinse superior, mediana e/ou inferior), um domínio CH2, um domínio CH3 ou uma variante ou seu fragmento. Por exemplo, um polipeptídeo de aglutinação para uso na invenção pode compreender uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH1; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH1 e pelo menos uma parte de um domínio hinse e um domínio CH2; uma cadeia de polipeptídeos compre- endendo um domínio CH1 e um domínio CH3; uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio hinse e um domínio CH3 ou uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH1, pelo menos uma parte de um domínio hinse, um domínio CH2 e um domínio CH3. Em outra modalidade, um polipeptídeo da invenção compreende uma cadeia de polipeptídeos compreendendo um domínio CH3. Além disso, um polipeptídeo de aglutinação para uso na invenção pode ser desprovido de pelo menos uma parte de um domínio CH2 (por exemplo, to- do ou parte de um domínio CH2). Conforme estabelecido acima, será com- preendido por alguém com habilidade ordinária na técnica que esses domí- nios (por exemplo, partes de cadeia pesada) podem ser modificados de tal modo que eles variem na seqüência de aminoácidos a partir da molécula de imunoglobulina ocorrente naturalmente.

Em certos anticorpos ou fragmentos de aglutinação ao antígeno, variantes ou seus derivados descritos aqui, as partes de cadeia pesada de uma cadeia de polipeptídeo de um multímero são idênticas àquelas em uma segunda cadeia de polipeptídeos do multímero. Alternativamente, os monô- meros contendo a parte de cadeia pesada da invenção não são idênticos. Por exemplo, cada monômero pode incluir um sítio de aglutinação a alvos diferentes, formando, por exemplo, um anticorpo biespecífico.

As partes de cadeia pesada de um polipeptídeo de aglutinação para utilização nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos neste do- cumento podem ser derivadas de moléculas de imunoglobulinas diferentes. Por exemplo, uma parte da cadeia pesada de um polipeptídeo pode incluir um domínio de CH1 derivado de uma molécula de IgGI e de uma região hinse derivada de uma molécula de lgG3. Em outro exemplo, uma parte de cadeia pesada pode incluir uma região hinse derivada, em parte, de uma molécula de IgGI, e, em parte, de uma molécula de lgG3. Em outro exem- plo, uma parte de cadeia pesada pode incluir uma região hinse derivada, em parte, de uma molécula IgGI e, em parte, de uma molécula lgG3. Em outro exemplo, uma parte de cadeia pesada pode incluir uma região hinse quimé- rica derivada, em parte, de uma molécula IgGI e, em parte, de uma molécu- la lgG4.

Conforme utilizado aqui, o termo "parte de cadeia leve" inclui seqüências de aminoácidos provenientes de uma cadeia leve de imunoglo- bulina. Preferencialmente, a parte de cadeia leve inclui pelo menos um do- mínio de VL ou CL.

Considera-se que o tamanho mínimo de um epitopo de peptídeo ou polipeptídeo seja de cerca de quatro a cinco aminoácidos. Os epitopos de peptídeos ou polipeptídeos contêm pelo menos sete, mais preferivelmente pelo menos nove e mais preferivelmente entre pelo menos cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos. Uma vez que um CDR pode reconhecer um peptí- deo ou polipeptídeo antigênico na sua forma terciária, os aminoácidos com- preendendo um epitopo não precisam estar contíguos e, em alguns casos, podem mesmo não estar na mesma cadeia de peptídeos. Na presente in- venção, o epitopo de peptídeo ou polipeptídeo reconhecido por anticorpos da presente invenção contém uma seqüência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais preferivelmente, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25 ou entre cerca de 15 a cerca de 30 aminoácidos Αβ contíguos ou não- contíguos.

O termo "neoepítopo", em conformidade com a presente inven- ção denota um epitopo que é único para o padrão de uma doença e contido em ou formado por uma proteína associada à distúrbio, que é uma variante patológica de uma de uma proteína diferentemente não patológica e/ou em desvio da fisiologia do estado saudável. As ditas variantes patofisiológicas podem ser formadas por meio de transcrição patologicamente alterada, tra- dução patologicamente alterada, modificação pós-tradução, processamento proteolítico alterado patologicamente, formação complexa alterada patologi- camente com parceiros ou estruturas celulares em interação fisiológica ou patofisiológica no sentido de uma co-localização alterada ou conformação estrutural alterada patologicamente, como, por exemplo agregação, oligome- rização ou fibrilação, cuja estrutura tridimensional ou tetradimensional difere da estrutura da molécula fisiologicamente ativa. Além disso, uma variante patofisiológica pode também ser caracterizada, na medida em que não se situe no seu ambiente fisiológico ou compartimento subcelular habituais.

Como exemplo, neoepítopos podem estar localizados nas estruturas patolo- gicamente conspícuas nas áreas dos tecidos encefálicos que obviamente experimentam ou já experimentaram danos funcionais. Se uma determinada estrutura, por exemplo, célula ou tecido ou proteína exibindo um neoepítopo, puder ser verificada ou não pela inversão do método descrito a seguir para isolamento e caracterização de uma molécula de aglutinação específica à proteína associada ao distúrbio na medida em que uma molécula de agluti- nação, por exemplo, um anticorpo identificado pelo dito método usado para rastrear uma espécime para aglutinação ao dito anticorpo, deste modo de- terminando a presença de um neoepítopo.

As expressões "específico de proteína associada à doença" e "específico de neoepítopo" são utilizados alternadamente aqui com o termo "especificamente reconhecendo um neoepítopo". Como aqui usados termos tais como "ausência de reatividade cruzada", "específicos", "especificamente reconhecendo", "especificamente de aglutinação", "preferencialmente de aglutinação" e similares referem-se à capacidade da molécula de aglutina- ção discriminar entre o neoepítopo de uma proteína associada ao distúrbio e a proteína nativa e da proteína em sua forma e tipo selvagem e no contexto natural. Assim, a molécula de aglutinação da presente invenção tem uma afinidade de aglutinação preferencial para o neoepítopo sobre o antígeno da proteína nativa por um fator de, pelo menos, dois, de preferência, pelo me- nos 5, geralmente mais de um fator de 10, particularmente preferida por um fator de 50 e ainda mais preferida acima de 100. Além disso, a Kd relativa da molécula de aglutinação, por exemplo, o anticorpo para o epitopo alvo espe- cífico, por exemplo, o neoepítopo, é preferencialmente pelo menos 10 vezes menos, mais preferencialmente pelo menos 100 vezes menos ou mais do que a K0 para aglutinação daquele anticorpo a outros Iigantes ou à contra- parte nativa da proteína associada à doença. As frases "especificamente aglutina-se" ou "especificamente re- conhece," utilizadas permutavelmente aqui. Significam que uma molécula de aglutinação, por exemplo, um anticorpo se aglutina a um epitopo via seu domínio de aglutinação ao antígeno e que a aglutinação implica alguma complementaridade entre o domínio de aglutinação do antígeno e o epitopo. Segundo esta definição, é dito que um anticorpo "aglutina-se especificamen- te" a um epitopo quando este se aglutina a esse epitopo, através do seu domínio de aglutinação ao antígeno mais prontamente do que este se agluti- naria a um epitopo aleatório, não relacionado. O termo "especificidade" é aqui utilizado para qualificar a afinidade relativa pela qual certo anticorpo aglutina-se a certo epitopo. Por exemplo, o anticorpo "A" pode ser conside- rado como tendo uma maior especificidade para um determinado epitopo do que o anticorpo "B" ou pode ser dito que o anticorpo "A" aglutina-se ao epi- topo "C", com uma maior especificidade do que este tem para o epitopo "D" relacionado.

A frase "preferencialmente aglutina-se" significa que a molécula de aglutinação, por exemplo, o anticorpo especificamente aglutina-se a um epitopo mais prontamente do que ela se aglutinaria a um epitopo relaciona- do, similar, homólogo ou análogo. Assim, um anticorpo que "preferencial- mente aglutina-se" a um determinado epitopo mais provavelmente se agluti- naria a esse epitopo do que a um epitopo relacionado, embora tal anticorpo possa reagir cruzadamente com o epitopo relacionado.

Por meio de exemplo não-limitante, uma molécula de aglutina- ção, por exemplo, um anticorpo, pode ser considerado que se aglutina a um primeiro epitopo, preferencialmente se aglutinar o dito primeiro epitopo com um constante de dissociação (Kq) que é menor do que a Kd do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não-limitante, um anticorpo pode ser considerado que se aglutina a um primeiro antígeno preferencialmente se aglutinar o primeiro epitopo com uma afinidade que tenha pelo menos uma ordem de magnitude menor do que a K0 do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não-limitante, um anticorpo pode ser considerado que se aglutina a um primeiro epitopo preferencialmente se aglutinar o pri- meiro epitopo com uma afinidade que tenha pelo menos duas ordens de magnitude menores do que a Kd do anticorpo para o segundo epitopo.

Em outro exemplo não-limitante, uma molécula de aglutinação, por exemplo, um anticorpo pode ser considerado que aglutina um primeiro epitopo preferencialmente se aglutinar o primeiro epitopo com uma taxa off (k(off)) que seja menor do que a (k(off)) do anticorpo para o segundo epito- po. Em outro exemplo não-limitante, pode-se considerar que um anticorpo aglutine um primeiro epitopo preferencialmente se aglutinar o primeiro epito- po com uma afinidade que tenha pelo menos uma ordem de magnitude me- nor do que a k(off) do anticorpo para o segundo epitopo. Em outro exemplo não-limitante, pode-se considerar que um anticorpo aglutine um primeiro epi- topo preferencialmente se este aglutinar o primeiro epitopo com uma afini- dade que tenha pelo menos duas ordens de magnitude menores do a k(off) do anticorpo para o segundo epitopo.

Pode-se dizer que uma molécula de aglutinação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de aglutinação ao antígeno, variante, descrita neste documento, aglutine um polipeptídeo alvo aqui ou um fragmento ou variante seu com uma taxa off (k(off)) inferior ou igual a 5 X 10ˉ2 segˉ1, 10ˉ2 segˉ1, 5 X 10ˉ3 segˉ1 ou 10ˉ3 segˉ1. Mais preferencialmente, pode-se dizer que um anticorpo da invenção aglutine um polipeptídeo alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante sua, com uma taxa off (k(off)) inferior ou igual a 5 x 10ˉ 4segˉ1, 10ˉ4 segˉ1, 5 X 10ˉ5 segˉ1 ou 10ˉ5 segˉ1, 5 X 10ˉ6 segˉ1, 10ˉ6 segˉ1, 5X 10ˉ7 segˉ1 ou 107 segˉ1.

Pode-se dizer que uma molécula de aglutinação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento, variante, derivado de aglutinação ao antígeno, descrita neste documento, aglutina um polipeptídeo alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante deste com uma taxa on (k(on)), superior ou igual a 103 Mˉ1 segˉ1, 5 x 103 Mˉ1 segˉ1, 104 Mˉ1 segˉ1 ou 5 X 104 Mˉ1 segˉ1. Mais preferi- velmente, pode-se dizer que um anticorpo da invenção aglutine um polinu- cleotídeo alvo descrito aqui ou um fragmento ou variante sua, com uma taxa on (k(on)) igual ou superior a 105 Mˉ1 segˉ1, 5 x 105 Mˉ1 segˉ1, 106 Mˉ1 segˉ1 ou 5 x 106 Mˉ1 seqˉ1 ou 107 Mˉ1 segˉ1. É dito que uma molécula de aglutinação, por exemplo, um anti- corpo, inibe de forma concorrente a aglutinação de um anticorpo de referên- cia a um epitopo dado se este preferencialmente se aglutinar a esse epitopo na medida em que ele bloqueia, em algum grau, a aglutinação do anticorpo de referência ao epitopo. A inibição competitiva pode ser determinada por qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, os ensaios de concor- rência ELISA. Pode-se dizer que um anticorpo inibe de forma concorrente a aglutinação do anticorpo de referência a um determinado epitopo em pelo menos 90%, pelo menos 80%, pelo menos 70%, pelo menos 60% ou, pelo menos, 50%.

Conforme utilizado aqui, o termo "afinidade" refere-se a uma medida da força da ligação de um epitopo individual à CDR de uma molécula de aglutinação, por exemplo, uma molécula de imunoglobulina. Vide, por exemplo, Harlow et ai, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Har- bor Laboratory Press, 2nd ed. 1988) páginas 27-28. Conforme utilizado aqui, o termo "avidez" refere-se à estabilidade geral do complexo entre uma popu- lação de imunoglobulinas e um antígeno ou seja, a força de combinação funcional de uma mistura de imunoglobulinas com o antígeno. Vide, por e- xemplo, Harlow nas páginas 29-34. Avidez está relacionada com a afinidade das moléculas individuais de imunoglobulinas na população com epitopos específicos e também as valências das imunoglobulinas e do antígeno. Por exemplo, a interação entre um anticorpo monoclonal bivalente e um antígeno com uma estrutura de epitopos altamente repetitiva, como um polímero, se- ria de alta avidez.

Moléculas de aglutinação, por exemplo, anticorpos ou fragmen- tos, variantes ou seus derivados de aglutinação ao antígeno da invenção também podem ser descritos ou especificados em termos de sua reatividade cruzada. Conforme utilizado aqui, o termo "reatividade cruzada" refere-se à capacidade de um anticorpo, específico para um antígeno, de reagir com um segundo antígeno; uma medida da relação entre duas diferentes substâncias antigênicas. Assim, um anticorpo tem reatividade cruzada se este se aglutina a um epitopo diferente daquele que induziu sua formação. O epitopo de rea- tividade cruzada geralmente contém muitas das mesmas características es- truturais complementares que o epitopo indutor, e, em alguns casos, pode realmente ser mais adequado do que o original.

Por exemplo, alguns anticorpos têm algum grau de reatividade cruzada, na medida em que eles aglutinam epitopos relacionados, mas não idênticos, por exemplo, epitopos com pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55% e pelo menos 50% de iden- tidade (como calculado por meio de métodos conhecidos na técnica e descri- tos a seguir) a um epitopo de referência. Pode-se dizer que um anticorpo tem pouca ou nenhuma reatividade cruzada se não aglutinar epitopos com menos de 95%, menos de 90%, menos de 85%, menos de 80%, menos de 75%, menos de 70%, menos de 65%, menos de 60%, menos de 55% e me- nos de 50% de identidade (conforme calculado por meio de métodos conhe- cidos na técnica e descritos a seguir) a um epitopo de referência. Um anti- corpo pode ser considerado "muito específico" em relação a um determinado epitopo, se ele não aglutina qualquer outro análogo, ortológo ou homólogo daquele epitopo.

Moléculas de aglutinação, por exemplo, anticorpos ou fragmen- tos de aglutinação ao antígeno, variantes ou seus derivados da invenção também podem ser descritas ou especificadas em termos da sua afinidade de aglutinação a um polipeptídeo da invenção. Afinidades de aglutinação preferidas incluem aquelas com um constante de dissociação ou Kd inferior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10'6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10'9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M ou 10-15 M,.

Conforme indicado anteriormente, as estruturas das subunida- des e a configuração tridimensional regiões dos constantes das várias clas- ses de imunoglobulinas são bem-conhecidas. Conforme utilizado aqui, o termo "domínio VH" inclui o domínio variável terminal de uma cadeia pesada de imunoqlobulina e o termo "domínio CH1" inclui o primeiro domínio da re- gião constante (mais amino-terminal) de uma cadeia pesada de imunoglobu- lina. O domínio CH1 é adjacente ao domínio VH e é amino-terminal para a região dependente de uma molécula de cadeia pesada de imunoglobulina.

Conforme utilizado aqui o termo "domínio CH2" inclui a parte de uma molécula de cadeia pesada que se estenda, por exemplo, de cerca do resíduo 244 para resíduo de 360 de um anticorpo usando esquemas de nu- meração convencional (resíduos 244 a 360, sistema de numeração de Kabat e resíduos 231-340, sistema de numeração da UE; vide Kabat EA et al. op. cit. O domínio CH2 é único na medida em que ele não está intimamente Ii- gado a outro domínio. Em vez disso, duas cadeias de carboidratos ramifica- das ligadas em N são interpostas entre os dois domínios CH2 de uma molé- cula de IgG nativa intacta. Também é bem documentado que o domínio GH3 estende-se desde o domínio CH2 até o terminal C da molécula do IgG e in- clui cerca de 108 resíduos.

Conforme utilizado aqui, o termo "região hinse" inclui a parte de uma molécula de cadeia pesada que una o domínio CH1 ao domínio CH2. Esta região hinse compreende aproximadamente 25 resíduos e é flexível, permitindo assim que as duas regiões de aglutinação ao antígeno do termi- nal N movam-se independentemente. As regiões hinse podem ser subdividi- das em três domínios distintos: domínios hinse superior, médio e inferior (Roux et al., J. Immunol. 161:4083 (1998)).

Conforme utilizado aqui o termo "ligação de dissulfeto" inclui a ligação covalente formada entre dois átomos de enxofre. A cisteína de ami- noácido compreende um grupo tiol que pode formar uma ponte ou liga de dissulfeto com um segundo grupo tiol. Na maioria das moléculas de IgG que ocorrem naturalmente, as regiões CH1 e CL estão ligadas por uma liga de dissulfeto e as duas cadeias pesadas estão ligados por duas ligas de dissul- feto nas posições correspondentes a 239 e 242 usando o sistema de nume- ração de Kabat (posição 226 ou 229, sistema de numeração da UE).

Conforme utilizado aqui, o termo "anticorpo projetado" refere-se a um anticorpo no qual o domínio variável na cadeia pesada e leve ou em ambas é alterado pelo menos pela substituição parcial de uma ou mais C- DRs de um anticorpo de especificidade conhecida e, se necessário, pela substituição parcial da região de estrutura e pela mudança de seqüência. Embora as CDRs possam ser derivadas de um anticorpo da mesma classe ou mesma subclasse que o anticorpo do qual as regiões de estrutura são derivadas, é previsto que as CDRs serão derivadas de um anticorpo de clas- se diferente e, de preferência, de um anticorpo de uma espécie diferente. Um anticorpo projetado em que uma ou mais CDRs "doadoras" de um anti- corpo não humano de especificidade conhecida é enxertado em uma região de estrutura de cadeia pesada ou leve humana é aqui referido como "um anticorpo humanizado". Pode não ser necessário substituir todas as CDRs pelas CDRs completas a partir da região variável doadora para transferir a capacidade de aglutinação do antígeno de um domínio variável para outro. Pelo contrário, pode ser necessário somente transferir os resíduos que são necessários para manter a atividade do sítio de aglutinação alvo. Dadas as explicações apresentadas em, por exemplo nas patentes do EUA de N0 5.585.089, 5.693.761, 5.693.762 e 6.180.370, estará bem enquadrado na competência daqueles versados na técnica, quer pela realização da experi- mentação rotineira ou por teste de tentativa e erro para obter um anticorpo funcional projetado ou humanizado.

Conforme utilizado aqui, o termo "polipeptídeo devidamente do- brado" inclui polipeptídeos nos quais todos os domínios funcionais compre- endendo o polipeptídeo são distintamente ativos. Conforme utilizado aqui, o termo "polipeptídeo indevidamente dobrado" inclui polipeptídeo nos quais pelo menos um dos domínios funcionais do polipeptídeo não é ativo. Em uma modalidade, um polipeptídeo devidamente dobrado compreende cadei- as de polipeptídeos ligadas por pelo menos uma liga de dissulfeto e, inver- samente, um polipeptídeo dobrado indevidamente compreende cadeias de polipeptídeos não ligadas por pelo menos uma ligação de dissulfeto.

Conforme utilizado aqui, o termo "projetado" inclui a manipula- ção de moléculas de ácido nucleico ou de polipeptídeos por meios sintéticos (por exemplo, por técnicas recombinantes, síntese de peptídeo in vitro, por acoplamento enzimático ou químico de peptídeos ou alguma combinação destas técnicas).

Conforme utilizado aqui, os termos "ligado", "fundido" ou "fusão" são utilizados alternadamente. Estes termos referem-se à junção de mais dois elementos ou componentes, seja por que meio for, incluindo conjugação química ou meio recombinante. Uma "fusão em estrutura" refere-se à junção de duas ou mais estruturas de leitura abertas de polinucleotídeos (ORFs) para formar uma ORF maior contínua, de forma que se mantenha a estrutura de leitura de tradução correta das ORFs originais. Assim, uma proteína de fusão recombinante é uma proteína única contendo dois ou mais segmentos que correspondem a polipeptídeos codificados pelas ORFs originais (cujos segmentos não são normalmente unidos desta forma por natureza). Embora a estrutura de leitura quadro seja, portanto, contínua ao longo dos segmen- tos fundidos, os segmentos podem ser fisicamente ou espacialmente sepa- rados, por exemplo, seqüência de Iigadores na estrutura. Por exemplo, os polinucleotídeos que codificam as CDRs de uma região variável de imuno- globulina podem ser fundidos, na estrutura, mas podem ser separados por um polinucleotídeo que codifica pelo menos uma região de estrutura de imu- noglobulinas ou regiões de CDRs adicionais, contanto que as CDRs "fundi- das" sejam co-traduzidas como parte de um polipeptídeo contínuo.

No contexto de polipeptídeos, uma "seqüência linear" ou uma "seqüência" é uma ordem de aminoácidos em um polipeptídeo em uma dire- ção terminal de amino para carboxila na qual os resíduos que estão próxi- mos uns dos outros na seqüência são contíguos na estrutura primária do polipeptídeo.

O termo "expressão", conforme utilizado neste documento refe- re-se a um processo pelo qual um gene produz um bioquímico, por exemplo, um RNA ou polipeptídeo. O processo inclui qualquer manifestação da pre- sença funcional do gene dentro da célula, incluindo, entre outros, redução de genes, como também a expressão temporária e a expressão estável. Esta inclui, entre outros, a transcrição do gene em RNA mensageiro (mRNA), RNA de transferência (tRNA), RNA na forma de um pequeno grampo de ca- belo (shRNA), RNA pequeno de interferência (siRNA) ou qualquer outro pro- duto de RNA e a tradução desse mRNA em polipeptídeo(s). Se o produto final pretendido for um bioquímico, a expressão inclui a criação desse bio- químico e quaisquer bioquímicos precursores. A expressão de um gene pro- duz um "produto de gene". Conforme utilizado aqui, um produto de gene po- de ser um ácido nucleico, por exemplo, um RNA mensageiro produzido pela transcrição de um gene ou um polipeptídeo, que é traduzido de uma trans- crição. Os produtos de genes descritos neste documento, além disso, inclu- em ácidos nucleicos com modificações pós-transcricionais, por exemplo, poliadenilação ou polipeptídeos com modificações pós-tradução, por exem- pio, metilação, glicosilação, adição de lipídios, associação com outras subu- nidades de proteínas, clivagem proteolítica e similares.

Conforme utilizado aqui, os termos "tratar" ou "tratamento" refe- rem-se tanto a um tratamento terapêutico e a medidas profiláticas ou preven- tivas, onde o objetivo é prevenir ou desacelerar (diminuir) uma alteração ou distúrbio fisiológico indesejado, tal como o desenvolvimento ou a propaga- ção do câncer. Resultados clínicos benéficos ou desejados incluem, entre outros, alívio dos sintomas, diminuição da extensão da doença, estabilização do estado da doença (ou seja, não agravamento), atraso ou abrandamento da progressão da doença, melhora ou alívio do estado da doença e diminui- ção temporária da gravidade da doença (parcial ou total), quer seja detectá- vel ou não detectável. "Tratamento" pode também significar sobrevida pro- longada em comparação com a sobrevida esperada sem receber tratamento. Aqueles que necessitam de tratamento incluem aqueles já com a condição ou o distúrbio, bem como aqueles propensos a ter a condição ou o distúrbio ou aqueles em que a manifestação da condição ou distúrbio deva ser evita- da.

Por "sujeito" ou "individual" ou "animal" ou "paciente" ou "mamí- fero", entende-se qualquer sujeito, particularmente um sujeito mamífero, por exemplo, um paciente humano, para o qual se pretende o diagnóstico, prog- nóstico, prevenção ou terapia.

II. Métodos para identificar moléculas de aglutinação

A presente invenção geralmente está relacionada com os meios e os métodos para descobrir anticorpos terapeuticamente eficazes a partir de sujeitos humanos clinicamente pré-selecionados. Tal como demonstrado nos exemplos, anticorpos humanos contra estruturas anormais em doenças no cérebro humano podem ser isolados de pacientes fenotipicamente sau- dáveis ou clinicamente excepcionalmente estáveis e os anticorpos recombi- nantes correspondentes podem ser utilizados com sucesso para o tratamen- to, melhora da patologia e prevenção do comprometimento da função cere- bral sem efeitos colaterais substanciais. A estabilidade clínica ou a não- progressão da doença pode ser identificada por exemplo, por meio da medi- ção ao longo do tempo dos rastreios clínicos, por exemplo, cognitivo, de sta- tus (por testes neuropsicológicos, por exemplo); avaliação do nível funcional global, avaliação das capacidades da vida diária ou déficits comportamen- tais; análise volumétrica das estruturas cerebrais; medição in vivo dos depó- sitos patológicos das proteínas anormais no cérebro (por exemplo, rastreios por imagem PET beta-amiloide) ou variáveis bioquímicas nos fluidos corpo- rais (por exemplo, proteínas tau ou peptídeos Abeta) e por comparação com o curso natural/histórico da doença. Assim, a presente invenção fornece an- ticorpos e moléculas de aglutinação que são capazes de reconhecer neoepí- topos de proteínas associadas a doenças que se originam das proteínas en- dógenas nativas e são prevalentes no corpo de um paciente em uma forma variante, por exemplo, proteína patológica e/ou fora do seu contexto fisioló- gico normal. Em particular, anticorpos e seus fragmentos de aglutinação aos antígenos são propiciados, que demonstram características de aglutinação imunológica e/ou propriedades biológicas conforme indicado para o anticor- po ilustrado nos exemplos. Onde presente, o termo "características de aglu- tinação imunológica" ou outras características de aglutinação de um anticor- po com um antígeno, em todas as suas formas gramaticais, refere-se à es- pecificidade, afinidade, reatividade cruzada e outras características de aglu- tinação de um anticorpo. Naturalmente, a presente invenção estende-se a linhas de produção de anticorpos e células recombinantes também. A pre- sente invenção ainda refere-se a ensaios e kits de diagnóstico que compõem a molécula de aglutinação da presente invenção e a métodos terapêuticos e avaliações terapêuticas com base nelas.

A presente invenção é baseada na observação de que, em sujei- tos humanos e pacientes pré-selecionados de acordo com critérios clínicos específicos, que têm o risco de desenvolver um distúrbio neurológico como a doença de Alzheimer, devido à sua idade, em relação à defesa humoral, an- ticorpos endógenos para patofisiológicas variantes como os agregados de peptídeos Abeta1 emaranhados neurofibrilares, neurites distróficas e outras estruturas celulares também podem ser encontradas, que são neuropatolo- gicamente características da doença. Estas estruturas podem ser encontra- das isoladamente ou em combinação com outras estruturas patológicas e podem, como no caso dos agregados Abeta e dos precursores dos emara- nhados neurofibrilares, desenvolver efeitos patológicos. No entanto, esses anticorpos especificamente reconhecendo as ditas estruturas não apresen- tam nenhuma reatividade cruzada ou reatividade cruzada significativamente inferior às formas funcionais fisiologicamente normais das proteínas subja- centes às estruturas patológicas, ao contrário do caso conhecido de uma resposta autoimune.

Sem intenção de estar preso à teoria, com base nos experimen- tos realizados em conformidade com a presente invenção, acreditava-se que um distúrbio não tem que se tornar manifesto e fenotipicamente perceptível, como no caso de uma infecção, a fim de resultar em uma atividade experi- mentalmente mensurável do sistema imune-humoral como a geração ou ati- vação de células B ou células B de memória específicas. No caso de células tumorais ou células diferenciadas, que têm de ser fisiologicamente elimina- das, os mecanismos já são conhecidos, onde parceiros como as células au- xiliares T4 e as células T citotóxicas e as células assassinas naturais do sis- tema imuno-celular cooperam na indução de apoptose. Deve-se supor que, também em um ser humano saudável, as células tumorais ou suas precurso- ras sejam formadas em uma base diária, por meio de mutação. Entretanto, estas são imediatamente levadas à apoptose por meio dos mecanismos hu- moral e celular, para que um tumor não seja detectável. Neste sentido, de um "paciente saudável ou excepcionalmente clinicamente estável" não se depreende um indivíduo no qual não ocorra nenhum evento de doença, mas sim um indíviduo no qual diversos eventos de doença são controlados por mecanismos de bloqueio ou defesa antes de eles próprios se manifestarem fenotipicamente.

Em face do exposto, foi hipotetizado em conformidade com a presente invenção que deveria ser possível identificar um anticorpo ou uma célula produtora de anticorpos a partir de coletivos de pacientes específicos ou sujeitos saudáveis, que foram pré-selecionados de acordo com os crité- rios clínicos, sem pré-cognição de natureza molecular de um epitopo de es- trutura-alvo, por exemplo, neoepítopo, onde o anticorpo, no caso de tolerân- cia já prevalecente no corpo do doador, o qual é, por exemplo, provado pela ausência de auto-imunidade, poderia ser empregado com sucesso contra uma doença na forma de um agente produzido recombinantemente. A identi- ficação de tal anticorpo pode assim ser conduzida sem a pré-cognição do epitopo molecular da estrutura-alvo, mas, em vez disso, somente por meio da aglutinação aos neoepítopos de estruturas patologicamente conspícuas em seções de tecido clínica-patologicamente bem caracterizadas derivadas de pacientes humanos ou de modelos animais da respectiva doença.

Assim, em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de isolar uma molécula de aglutinação específica à proteína as- sociada à doença, compreendendo:

(a) submeter uma espécime obtida a partir de um paciente que não apresenta sintomas ou que se apresente excepcionalmente clinica- mente estável, mas que esteja afetado por ou com risco de desenvolver um distúrbio ou efetivamente suprimir a manifestação ou o surto de um distúrbio, a um espécime de células patologicamente ou fisiologicamente alteradas ou a tecido de características clínicas pré-determinadas; e

(b) identificar e opcionalmente isolar uma molécula de aglu- tinação que preferencialmente se aglutina ao dito espécime, mas sem afini- dade ou com afinidade significativamente inferior às células correspondentes ou tecidos sem tais características patológicas, já que podem vir a ser obti- dos de um sujeito saudável. O método da presente invenção pode ser executado conforme descrito na seção Exemplos com meios bem-conhecidos para alguém ver- sado na técnica. Por exemplo, uma espécime de líquido obtida do paciente pode ser passada através de uma primeira abertura de um canal que está em contato com a estrutura da espécime alvo firmemente fixada em um su- porte de objeto, deste modo permitindo a suposta aglutinação das moléculas presentes na espécime, quer na forma solúvel ou expressa na superfície e membrana da célula, respectivamente, para aglutinação à dita estrutura- alvo. A espécime de líquido pode conter, por exemplo linfócitos e/ou anticor- pos, enquanto o espécime pode ser uma seção de tecido ou uma membrana revestida com moléculas ou combinações moleculares que são distintas pa- ra uma estrutura patológica alvo.

Qualquer matéria não aglutinante pode ser removida via a se- gunda abertura do canal. Ao mesmo tempo, a temperatura do suporte de objeto pode ser controlada por um termostato do suporte de objeto, por e- xemplo, a uma temperatura na qual a aglutinação natural da suposta molé- cula de aglutinação ao neoepítopo do antígeno específico para o espécime ocorra no corpo humano. Por meio do movimento do fluxo, por exemplo, po- derá ser simulada a passagem da espécime de líquido, contendo moléculas preferivelmente na temperatura corporal, sobre os sistemas naturais da es- trutura-alvo. Entretanto, outros métodos de incubação da espécime com o espécime, como por meio de um agitador ou mesa rotativa podem ser utili- zados também. Uma vantagem especial do mencionado sistema é que este permite uma interrupção de processos metabólicos, a qualquer momento, pela diminuição da temperatura do suporte de objeto por meio do termostato do suporte de objeto. Ao fazê-lo, a temperatura do objeto titular pode ser reduzida para, por exemplo 2-10° C, em particular 4o C. Um dispositivo cor- respondente que pode ser utilizado de acordo com o método da presente invenção é descrito no pedido da patente européia EP 1 069 431 A2. Assim, o método da presente invenção permitirá a identificação e a caracterização dos parceiros de aglutinação, bem como, ao mesmo tempo, identificar e ca- racterizar as classes moleculares, os grupos moleculares e/ou as partes mo- leculares necessárias para o processo de aglutinação ou seja, as estruturas- alvo do espécime, que até o presente podem ser desconhecidas. Isto não só irá abrir novos possíveis meios de diagnóstico, mas também irá fornecer um novo sistema de teste para abordagens terapêuticas, em um nível molecular.

Como um paciente pode se habilitar, de acordo com a presente invenção, a um grupo de voluntários saudáveis se marcadores substitutos específicos com uma elevada probabilidade de um estado de uma doença, que surpreendentemente e, possivelmente, devido a uma resposta endóge- na imuno específica endógena não se manifestar clinicamente, contudo. Neste sentido, em relação a diversas doenças, um idoso saudável seria um indivíduo no qual uma doença neurodegenerativa como a doença de Al- zheimer ou a doença de Parkinson ainda não se manifestou clinicamente, mas no qual o desenvolvimento pré-clínico das variantes das proteínas pato- fisiológicas ou seja, proteínas associadas à doença e no sentido acima men- cionado, por meio da intervenção precoce do sistema imune humoral com ou sem o envolvimento dos componentes celulares do sistema imune, foi res- tringido ou retardado a tal ponto que, até o momento em que o paciente saudável, mas não pré-clinico, participou no estudo, a manifestação clínica da doença ainda não ocorreu. Preferencialmente, voluntários não óbvios, nos quais nem os processos autoimunológicos foram diagnosticados nem ocorreram outras possíveis condições patológicas como efeitos secundários, são recrutados como doadores para a espécime na primeira instância.

Em princípio, podem ser utilizadas amostras de pacientes que tenham sido submetidos a uma imunização ativa com variantes de proteínas ou peptídeos fisiológicos, em que o desenvolvimento do anticorpo foi impul- sionado pela imunização. Anticorpos, por exemplo, podem ser identificados e isolados de pacientes com doença de Alzheimer que tenham sido vacina- dos com peptídeo Abeta. Vide, por exemplo, Hock et ai, Nature Medicine 8:1280-1275 (2002), Hock et ai Neuron 38:547-554 (2003) e WO 2004/095031, cada um incorporado neste documento por referência em suas totalidades. No entanto, pode ser preferida a utilização de amostras de vo- luntários que não tenham recebido essa imunização ou medicação corres- pondente relativa à doença à qual a proteína patológica variante está asso- ciada e/ou é causadora de tal doença.

De acordo com a presente invenção, as amostras de um pacien- te, por exemplo, de indivíduos que tenham sido clinicamente pré- selecionados são analisadas quanto à presença de moléculas de aglutina- ção especificamente reconhecendo estruturas patologicamente evidentes, por exemplo, em tecido ex vivo de pacientes humanos clínico- patologicamente caracterizados ou modelos animais como, por exemplo, camundongos trangênicos ou estruturas celulares in vitro ou em tecido alo- gênico ou xenogênico patológico. Preferencialmente, o dito paciente e/ou o dito sujeito que fornece o espécime é ser humano, mais preferivelmente am- bos o são.

A espécime patologicamente ou fisiologicamente alterada carac- terística, a célula ou espécime de tecido, são preferivelmente exibidos pela detecção ótica após a reação com uma molécula de aglutinação, por exem- plo, o anticorpo da presente invenção. O espécime pode ser obtido como/a partir de uma espécime de células, seção de tecidos, teste de esfregaço ce- lular, espécime de células ou tecidos de um modelo animal de uma doença humana ou de material celular ou de tecido exposto à cultura in vitro. Prefe- rivelmente, pelo menos um exemplar do dito espécime está presente em um suporte de objeto na forma de posicionador para varredura, no qual cada posição de varredura corresponde a uma estrutura patológica específica e, pelo menos, duas posições de varredura são concomitantemente expostas para detecção de uma reação com o anticorpo. A título de exemplo, os anti- corpos para as marcas neuropatológicas de tais doenças neurodegenerati- vas como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou tauopatias, inclu- indo placas de beta-amiloides, corpos de Lewy, emaranhados neurofibrilares e neurite distrófica, podem ser detectados em seções obtidas de tecidos en- cefálicos humanos post-mortem com diagnóstico confirmado clínico- patologicamente das respectivas entidades das doenças. Isto é feito pela colocação de pequenos bastonetes de tecido incrustados em parafina sobre lâminas de vidro que são então analisadas com amostras de um paciente ou doador saudável. A detecção de uma reação com o anticorpo é feita seguin- do procedimentos padrão de imuno-histoquímica e varredura microscópica.

Múltiplas microsseções de tecido contendo vários tecidos com várias doenças humanas podem ser colocados sobre a lâmina de vidro para formar um microarranjo de múltiplos tecidos. Da mesma forma, espécimes adicionais de amostras de tecido de modelos animais de doença humana, esfregaço celular ou células podem ser incrustados em parafina e colocados sobre lâminas de vidro isoladamente ou em combinação com os arranjos de tecidos ou tecido encefálico com doença de Alzheimer post-mortem humano acima descrito. Assim, uma única posição de teste sobre a lâmina de vidro pode incluir arranjos misturados de tecido e outros espécimes exibindo es- truturas evidentes patologicamente.

A fim de aumentar o resultado do ensaio, mais de uma posição de ensaio é colocada sobre uma lâmina de vidro. Preferencialmente, oito posições de ensaio são colocadas em lâminas de vidro em formato de dois por quatro ajustando-se ao formato de 96 cavidades ou de microtitulação. Uma descrição mais detalhada deste microarranjo de tecidos compatível com a micro titulação pode ser encontrada na seção de métodos comple- mentar abaixo.

Conforme mencionado, a espécime a ser analisada pode incluir um fluido corporal, uma espécime de célula ou o sobrenadante de uma es- pécime de células ou um derivado deles. Fluidos corporais, tais como o lí- quido cefalorraquidiano (LCR) lombar, plasma ou urina podem ser coletados seguindo os procedimentos clínicos padrão após consentimento expresso dos pacientes. Mais preferivelmente, a espécime compreende ou é obtida a partir de células-B ou células B de e/ou inclui anticorpos.

Preferivelmente, determinou-se que o dito paciente é afetado por um distúrbio não ainda manifestado ou em risco de desenvolver o distúrbio pela presença ou ausência de um marcador substituto ou por um curso de doença excepcionalmente estável. Critérios clínicos deverão ser considera- dos com relação aos marcadores substitutos com uma maior probabilidade de ocorrência ou manifestação de uma doença, de acordo com a presente invenção, no sentido de uma condição pré-clínica, ou, vice-versa, a qual a- testa a improbabilidade de tal doença já ter ocorrido, como, por exemplo, a existência de uma constelação genética promovendo a doença ou uma ex- posição extrema ou modo de vida tornar provável o desenvolvimento fenotí- pico de uma doença. No caso da doença de Alzheimer, isto significa que, de acordo com a presente invenção, tais voluntários humanos são investigados quanto a células B ou células B de memória contra complexos de proteína associados à neuropatologia como agregados Abeta, espécie Abeta oligo- méricos e fibrilas de beta-amiloide em placas de beta-amiloide, quanto a fi- lamentos tau em emaranhados neurofibrilares, quanto à alfa-sinucleina em corpos de Lewy ou componentes até então não identificada molecularmente que, com relação à idade, pertencem a um grupo de indivíduos nos quais a prevalência da doença de Alzheimer é particularmente elevada ou cujos in- divíduos se originam geneticamente de uma população que ostenta um alto risco para a doença de Alzheimer. Estas são, por exemplo, pessoas com mais de 75 anos que não tenham nenhum comprometimento ou que tenham apenas comprometimentos cognitivos neuropsicologicamente mensuráveis marginais, ou em caso de indicações de tumor, pessoas com marcadores de tumor altamente indicativos, por exemplo, de marcadores de tumores genéti- cos, mas que não têm a doença (Alloul et al., Arch. Gerontology Geriatrics 27 (1998), 189; Dunn et al., Immunity 21 (2004) 137-148). No caso do com- prometimento cognitivo leve, estes são pacientes que permaneceram clini- camente, neuropsicologicamente ou cognitivamente estáveis durante anos, apesar do seu risco estatístico anual de mais de 20% para o desenvolvimen- to de uma doença neurodegenerativa que se apresente clinicamente mani- festa e progressiva mais adiante. Assim, em uma modalidade, o dito marca- dor substituto é selecionado do grupo constituído por velhice, carga amiloide cerebral, genótipo ApoE, genótipo APP1 genótipo PS1, níveis nos fluidos corporais de peptídeo Abeta, isoprostanos, Tau e fosfo-Tau.

Uma abordagem em particular no emprego do método de acordo com a presente invenção consiste em testar as amostras de células B e de células de memória B de voluntários pré-selecionados clinicamente contra arranjos de espécimes de tecidos evidentes patologicamente de doenças inteiramente diferentes ou primárias relacionadas. Em especial, esses teci- dos patológicos originam-se de pacientes humanos que sofrem de doenças neurodegenerativas, doenças de falso dobramento de proteínas, amiloidoses de tecidos e outras doenças relacionadas com depósitos patológicos, distúr- bios autoimunes, doenças inflamatórias, doenças hiperproliferativas e neo- plásicas, como por exemplo, tumores, doenças de armazenamento e doen- ças de inclusão bem como de modelos animais de doenças humanas, em especial de camundongos alterados com genes humanos relevantes patolo- gicamente.

Em uma modalidade particularmente preferida, a presente in- venção concentra-se na doença de Alzheimer. Nesta modalidade, a espéci- me é obtida a partir de um sujeito que preferivelmente preencha os seguin- tes critérios:

a) Tenha 65, preferivelmente 70 e mais preferivelmente mais de 75 anos de idade ou mais;

b) tenha plena capacidade cognitiva e boa saúde e

c) não tenha sinais clínicos de demência ou

d) tendo taxas de progressão da doença invulgarmente lentas, ape- sar da presença de um diagnóstico clínico de provável doença de Alzheimer ou

e) Tenha taxas de conversão excepcionalmente baixas, desde um Comprometimento Cognitivo Leve (MCI) até doença de Alzheimer profunda.

Em uma outra modalidade, o método da presente invenção ain- da compreende as etapas de:

a) depuração de células B ou células B de memória a partir de uma espécime que tenha sido identificada como contendo moléculas de aglutina- ção, por exemplo, anticorpos que preferencialmente se aglutinam ao dito espécime mas sem afinidade ou com afinidade significativamente mais baixa para células ou tecido correspondentes de um sujeito saudável;

b) obtenção de repertório de genes de imunoglobulina que codificam os anticorpos das ditas células B ou das células de memória B; e c) utilização do dito repertório para expressar os ditos anticorpos e opcionalmente onde o passo (b) compreender as etapas de:

d) obtenção do mRNA das ditas células B ou das células B de memó- ria;

e) obtenção de cDNA a partir do mRNA da etapa (iv) e

f) utilização de uma reação de extensão para multiplicar, a partir do dito cDNA, os fragmentos correspondentes às cadeias pesadas (HC) e às cadeias leves (LC) de kappa/lambda dos referidos anticorpos.

Métodos de produção de clones de uma célula B e linfócito B de memória humanos imortalizados, consistindo na etapa de transformação dos linfócitos B de memória humanos utilizando o Vírus Epstein Barr (EBV) na presença de um ativador de células B policlonais estão resumidos no pedido internacional W02004/076677. Este pedido internacional também descreve métodos para a obtenção de uma seqüência de ácido nucleico que codifica um anticorpo de interesse, compreendendo as etapas de preparação de um clone de células B imortalizadas e de obtenção/sequenciamento de ácidos nucleicos de clone de células B que codifica o anticorpo de interesse e, em seguida, a inserção da ácido nucleico ou o uso do ácido nucleico para prepa- rar um hospedeiro de expressão que possa expressar o anticorpo de inte- resse, expor à cultura ou a sub-expor à cultura o hospedeiro de expressão sob condições nas quais o anticorpo de interesse seja expresso e, opcio- nalmente, purificar o anticorpo de interesse. Obviamente o ácido nucleico pode ser manipulado neste ínterim para introduzir os sítios de restrição, para alterar o uso do códon, e/ou para adicionar ou otimizar as seqüências regu- ladoras de transcrição e/ou tradução. Por exemplo, as seqüências de ácidos nucleicos podem ser geradas por retro-tradução das seqüências polipeptídi- cas do presente invenção usando software como o software NTI vetor para gerar as seqüências de ácidos nucleicos que são otimizadas por códon e otimizadas para estabilidade do RNA. Todas estas técnicas são do estado da técnica e podem ser executadas por pessoa versada na técnica sem difi- culdade. Métodos adicionais de imortalização de células B humanas são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, a construção de hibrídomas hu- manos ou hibridomas quiméricos murino-humanos.

Em outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma molécu- la de aglutinação que é capaz de reconhecer seletivamente um epitopo de uma proteína associada à doença, incluindo um neoepítopo de uma proteína associada à doença, que pode ser preferivelmente obtido ou validado pelo método da presente invenção previamente aqui descrito e ilustrado nos e- xemplos. Com vantagem, a molécula de aglutinação da presente invenção não reconhece substancialmente a dita proteína em sua forma não associa- da ao distúrbio; vide também supra.

Meios e métodos para a produção de recombinantes das molé- culas de aglutinação, em particular seus anticorpos e réplicas como também métodos de varredura para moléculas de aglutinação em competição, que podem ou não podem ser anticorpos, são conhecidos na técnica e estão sumarizados, por exemplo, no pedido internacional W02006/103116 com relação aos anticorpos contra o beta-amiloide e ao tratamento/diagnóstico da doença de Alzheimer1 cujo conteúdo da descrição está incorporado aqui co- mo referência para este propósito de projeto e administração de anticorpos para aplicações terapêuticas ou diagnosticas.

Entretanto, conforme descrito aqui, em particular com relação às aplicações terapêuticas em seres humanos, o anticorpo da presente inven- ção é um anticorpo humano. Neste contexto, a proteína patológica variante reconhecida pelo anticorpo é preferivelmente associada com um distúrbio neurológico, preferivelmente um distúrbio do cérebro.

Além disso, como demonstrado nos exemplos 3 a 5, a molécula de aglutinação da presente invenção, em particular um anticorpo, possui vá- rias propriedades biológicas vantajosas, uma ou mais das quais foram con- sumadas pela presente invenção pela primeira vez. Por exemplo, ela é ca- paz de:

(i) atravessar a barreira hematoencefálica, por exemplo, no local do evento patológico;

(ii) aglutinar placas de beta-amiloides, amiloide cérebro-vascular, depósitos Abeta difusos, emaranhados neurofibrilares, tau hiperfosforilata- dos, corpos de Lewy positivos de alfa-sinucleina ou agregados de proteína associados com neurites distróficas;

(iii) remover placas de beta-amiloide no cérebro e/ou prevenir a for- mação de placas amiloides no cérebro;

(iv) substancialmente restaurar um comportamento normal e/ou;

(v) não causar nenhuma micro-hemorragia.

Em uma modalidade particular preferida, o anticorpo ou a molé- cula de aglutinação equivalente da presente invenção pode ser distinguido de outros anticorpos por uma ou mais das seguintes propriedades, por e- xemplo, eles são capazes de:

1. atravessar, pelo menos em pequenas quantidades, a barreira hematoencefálica no local dos eventos patológicos;

2. aglutinar-se a uma ou mais estruturas extracelulares ou celula- res patofisiologicamente relevantes;

3. levar à redução da estrutura patofisiologicamente relevante in vitro ou in vivo;

4. levar à redução da estrutura patofisiologicamente relevante e à redução de uma toxicidade associada aos mesmos;

5. levar ao bloqueio ou retardo de um processo de doença;

6. levar à regeneração das funções celulares e específicas de ór- gãos e orgânicas e, possivelmente, a uma prevenção secundária da recor- rência da fisiopatologia original após degradação da toxicidade relacionada com a estrutura patofisiologicamente relevante e/ou;

7. não estarem associados com o aumento de micro-hemorragias.

Além disso, a ausência de reatividade cruzada com precursores fisiológicos ou derivados leva à conseqüência de que, em primeiro lugar, as concentrações são previsíveis, visto que os efeitos dissipadores nas estrutu- ras dos tecidos sadios são evitados e, em segundo lugar, a ausência subs- tancial das respostas autoimunes no sentido de efeitos colaterais indeseja- dos. Além disso, os relatórios anteriores sugeriram uma associação de angi- opatia amiloide cerebral (AAC) com reatividade vascular comprometida em um modelo de camundongo transgênico com AAC (Mueggler et ai, J Neu- rosei 22 (2002), 7218-24.). A AAC grave ocorrendo em camundongos velhos 3ΓθΑβ. (Knobloch et al. Neurobiol. Aging 28:1297-1306 (2007) Epub 31 de julho de 2006) poderia, assim, limitar a flexibilidade vasodilatadora dos vasos sangüíneos afetados. De acordo com a presente invenção, é prudente espe- rar que o tratamento com os anticorpos da presente invenção possa melho- rar a vasoreatividade e o fluxo sangüíneo cerebral em camundongos trangê- nicos APP velhos. Isto pode ser validado usando o modelo de camundongos arcAft descrito em Knobloch et al. (2006), supra e descritos no pedido U.S. "Transgenic animal model for Alzheimer's Disease", de Grimm et al., Número de série 60/934.291 protocolado em 11 de junho de 2007, cujo conteúdo da descrição está incorporado neste documento como referência. III. Anticorpos

A presente invenção é ainda direcionada às moléculas de agluti- nação, por exemplo, anticorpos e moléculas de aglutinação, variantes e seus derivados apresentados na Tabela 2 e 3. A presente invenção é mais espe- cificamente dirigida a um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seus derivados, onde o anticorpo aglutina-se especificamente ao mesmo neoepítopo de uma proteína associada ao distúrbio como um anti- corpo de referência selecionado do grupo consistindo em NI-101.10, Nl- 101.11, 101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13AeNI-101.13B.

A invenção é ainda dirigida a um anticorpo ou fragmento de a- glutinação a antígeno, variante ou seus derivados, onde o anticorpo inibe competitivamente um anticorpo de referência selecionado a partir do grupo consistindo em NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A e NI-101.13B da aglutinação ao neoepítopo de uma proteína associada ao distúrbio.

A invenção é também dirigida a um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seus derivados, onde o anticorpo com- preende um domínio de aglutinação a antígeno idêntico ao de um anticorpo selecionado a partir do grupo consistindo em NI-101.10, NI-101.11, NI- 101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A e NI-101.13B.

A presente invenção ainda exemplifica várias dessas moléculas de aglutinação, por exemplo, anticorpos e seus fragmentos de aglutinação, que podem ser caracterizados por incluir em sua região variável, por exem- plo, no domínio de aglutinação, pelo menos, uma região determinante de complementaridade (CDR), da região variável VH e/ou VL região variável compreendendo qualquer uma das seqüências de aminoácidos representa- das na Tabela 2 (Vh) e Tabela 3 (VL).

Tabela 2: Seqüências de aminoácidos da região Vh de anticorpos específi- cos de neoepítopos._

<table>table see original document page 49</column></row><table> <table>table see original document page 50</column></row><table>

Tabela 3: Seqüências de aminoácidos da região VL dos anticorpos específi- cos de neoepítopos. <table>table see original document page 50</column></row><table> As seqüências de nucleotídeos correspondentes codificando as regiões variáveis acima identificadas estão estabelecidas na listagem de se- qüências, em anexo. Um conjunto exemplar de CDRs das seqüências de aminoácidos acima da região VH e/ou VL conforme ilustrado nas tabelas 2 e 3 é apresentado na Tabela 4. No entanto, como discutido a seguir, aqueles versados na técnica tem pleno conhecimento de que, além disso ou alterna- tivamente, CDRs podem ser usadas, as quais diferem em sua seqüência de aminoácidos daquelas apresentadas na Tabela 4, em um, dois, três ou ainda mais aminoácidos no caso de CDR2 e CDR3.

Tabela 4: Denominação da CDR em seqüências protéicas na Nomenclatu- ra Kabat das regiões Vh e Vl de anticorpos específicos de neoepítopos.

<table>table see original document page 51</column></row><table> <table>table see original document page 52</column></row><table>

Em uma modalidade, o anticorpo da presente invenção é qual-

quer um dos anticorpos compreendendo uma seqüência de aminoácidos da região Vh e/ou VL como demonstrado nas Tabelas 2 e 3. Alternativamente, o anticorpo da presente invenção é um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, que compete pela aglutinação ao neoepítopo com pelo menos um dos anticorpos contendo a região Vh e/ou VL conforme ilustrado nas Ta- belas 2 e 3. Estes anticorpos podem ser murinos também, no entanto, anti- corpos humanizados, xenogênicos ou humano-murinos quiméricos são pre- feridos, em especiai para aplicações terapêuticas. Um fragmento ae agiuíi- nação a antígeno do anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fv de cadeia única (scFv), um fragmento F (ab'), um fragmento F(ab) e um frag- mento F(ab')2. Para algumas aplicações, apenas as regiões variáveis dos anticorpos são necessários, o que pode ser conseguido pelo tratamento do anticorpo reagentes adequados, de modo a gerar partes de Fab', Fab ou F (ab")2. Esses fragmentos são suficientes para a utilização, por exemplo, em procedimentos imunodiagnósticos envolvendo o acoplamento das partes imunoespecíficas de imunoglobulinas a reagentes detectores tais como ra- dioisótopos.

A presente invenção é ainda dirigida a polipeptídeos isolados que compõem os anticorpos da presente invenção. Anticorpos do presente invenção compreendem polipeptídeos, por exemplo, seqüências de aminoá- cidos codificando regiões de aglutinação a antigenos específicos derivados das moléculas de imunoglobulina. Um polipeptídeo ou seqüência de amino- ácidos "derivado de" uma proteína designada refere-se à origem do polipep- tídeo contendo uma certa seqüência de aminoácidos. Em certos casos, o polipeptídeo ou a seqüência de aminoácidos é derivado de um determinado polipeptídeo ou seqüência de aminoácidos de partida que possui uma se- qüência de aminoácidos essencialmente idêntica àquela da seqüência de partida ou uma parte dela, na qual a parte consiste em pelo menos 10-20 aminoácidos, pelo menos 20-30 aminoácidos, pelo menos 30-50 aminoáci- dos ou que seja, de outro modo, identificável a alguém versado na técnica como tendo sua origem na seqüência de partida.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polipep- tídeo isolado, consistindo essencialmente em, ou consistindo em, uma regi- ão variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH)1 onde pelo menos um dos VH-CDRs da região variável da cadeia pesada ou pelo menos duas das VH-CDRs da região variável da cadeia pesada são, pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácidos de VH-CDR1, VH- CDR2 ou VH-CDR3 da cadeia pesada de referência dos anticorpos descritos aqui. Alternativamente, as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 do VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de amino- ácidos de CDR1-VH, VH-CDR2 e VH-CDR3 da cadeia pesada de referência dos anticorpos descritos aqui. Assim, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia pesada da invenção possui seqüências de polipep- tídeos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 relacionadas com os grupos a- presentados na Tabela 4, supra. Enquanto a Tabela 4 ilustra as VH-CDRs definidas pelo sistema Kabat, outras definições de CDR, como por exemplo, VH-CDRs definidas pelo sistema Chothia, também estão incluídas na pre- sente invenção e podem ser facilmente identificadas por uma pessoa de ha- bilidade ordinária na técnica usando os dados apresentados nas Tabelas 2 e 3.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polipep- tídeo composto isolado, compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulinas (VH) na qual as regiões de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 possuem se- qüências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos de VH-CDR1, VH- CDR2 e VH-CDR3 ilustrados na Tabela 4.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polipep- tídeo isolado, consistindo essencialmente em ou consistindo em uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) em que as regiões de VH- CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 possuem seqüências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos de VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 apresentados na Tabela 4, à exceção de um, dois, três, quatro, cinco, seis substituições de aminoácidos em qualquer uma VH-CDR. Em certas modalidades, as substi- tuições de aminoácidos são conservadoras.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polipep- tídeo isolado, compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistin- do em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulinas (VL), onde pelo menos uma das VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das VL-CDRs da região variável de cadeia leve são, pelo me- nos, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 de cadeia leve de referência dos anticor- pos descritos aqui. Alternativamente, as regiões de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às se- qüências de aminoácidos de VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 de cadeia leve de referência dos anticorpos descritos aqui. Assim, de acordo com esta mo- dalidade, uma região variável de cadeia leve da invenção possui seqüências de polipeptídeos relacionadas com os polipeptídeos mostrados na Tabela 4, supra. Enquanto a Tabela 4 mostra as VL-CDRs definidas pelo sistema Ka- bat, outras definições de CDR, por exemplo, VL-CDRs definidas no sistema Chotia, estão também incluídas na presente invenção.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polipep- tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistin- do em uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL) na qual as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 possuem seqüências de polipeptí- deos que são idênticas aos grupos VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostra- dos na Tabela 4.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polipep- tídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou consistin- do em uma região variável de cadeia [s/c:] pesada de imunoglobulina (VL) na qual as regiões VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 possuem seqüências de polipeptídeos que são idênticas aos grupos VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 mostrados na Tabela 4, exceto por uma, duas, três, quatro, cinco ou seis substituições de aminoácidos em qualquer VL-CDR. Em certas modalidades, as substituições de aminoácidos são conservadoras.

Uma imunoglobulina ou seus cDNAs de codificação pode ainda ser modificada. Assim, em uma nova modalidade, o método da presente in- venção compreende qualquer uma das etapas de produção de um anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo de cadeia única, anticorpo de Fab-fragmento, anticorpo biespecífico, anticorpo de fusão, anticorpo rotulado ou análogo de qualquer um desses. Métodos correspondentes são conheci- dos à pessoa versada na técnica e são descritos, em Harlow e Lane "Anti- bodies, A Laboratory Manual", CSH Press, Cold Spring Harbor, 1988. Quan- do derivados desses ditos anticorpos são obtidos através da técnica de exi- bição de fagos, a ressonância de plásmon superficial conforme empregada no sistema BIAcore pode ser utilizada para aumentar a eficiência dos anti- corpos do fago que se aglutinam ao mesmo epitopo como o de qualquer um dos anticorpos aqui descritos (Schier, Human Antibodies Hybridomas 7 (1996), 97-105; Malmborg, J. Immunol. Methods 183 (1995), 7-13). A produ- ção de anticorpos quiméricos é descrita, por exemplo, no pedido internacio- nal W089/09622. Métodos para a produção de anticorpos humanizados são descritos, por exemplo, no pedido de patente européia EP-A1 O 239 400 e no pedido internacional W090/07861. Uma outra fonte de anticorpos a ser utilizada em conformidade com a presente invenção são os chamados anti- corpos xenogênicos. O princípio geral para a produção de anticorpos xeno- gênicos, tal como anticorpos humanos em camundongos é descrito, por e- xemplo, nos pedidos internacionais W091/10741, W094/02602, W096/34096 e WO 96/33735. Conforme discutido anteriormente, o anticor- po da invenção pode existir em uma variedade de formas, além dos anticor- pos completos, incluindo, por exemplo, Fv1 Fab e F(ab)2, assim como em cadeias únicas; vide, por exemplo, o pedido internacional W088/09344.

Os anticorpos da presente invenção ou sua(s) correspondente(s) cadeia(s) de imunoglobulinas ainda podem ser modificados utilizando técni- cas convencionais conhecidas na técnica, por exemplo, usando exclu- são(ões), inserção(ões), substituição(ões), adição(ões), e/ou recombina- ção(ões) e/ou qualquer(quaisquer) outra(s) modificação(ões) conhecida(s) na técnica quer independentemente ou em combinação. Métodos de intro- dução de tais modificações na seqüência de DNAs subjacentes, a seqüência de aminoácidos de uma cadeia de imunoglobulinas são bem-conhecidos pela pessoa versada na técnica; vide, por exemplo, Sambrook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) e NY Ausubel, Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1994). Modificações do anticorpo da invenção inclu- em derivatizações químicas e/ou enzimáticas em um ou mais aminoácidos constituintes, incluindo as modificações da cadeia lateral, as modificações da espinha dorsal e as modificações dos radicais N- e C-, incluindo acetilação, hidroxílação, metilação, amidação e a ligação das porções de carboidrato ou lipídios, co-fatores e similares. Do mesmo modo, a presente invenção englo- ba a produção de proteínas quiméricas que compõem o anticorpo descrito ou algum fragmento deste no radical do grupo amina fundido à molécula he- teróloga, como um Iigante imunoestimulatório no radical do grupo carboxila; ver, por exemplo, pedido internacional W000/30680 para detalhes técnicos correspondentes.

Além disso, a presente invenção abrange pequenos peptídeos incluindo aqueles que contêm uma molécula de aglutinação, conforme des- crito acima, por exemplo, contendo a região CDR3 da região variável de qualquer um dos anticorpos mencionados, em particular a CDR3 da cadeia pesada, visto que tem sido freqüentemente observado que a CDR3 de ca- deia pesada (HCDR3) é a região que possui um grau maior de variabilidade e uma participação predominante na interação de anticorpos-antigenos. Es- ses peptídeos podem facilmente ser sintetizados ou produzidos por meio de recombinação para produzir um agente de aglutinação útil de acordo com a invenção. Esses métodos são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica. Peptídeos podem ser sintetizados, por exemplo, utilizando sintetiza- dores de peptídeos automatizados que estão comercialmente disponíveis. Os peptídeos podem ser produzidos por técnicas de recombinação pela in- corporação do DNA expressando o peptídeo em um vetor de expressão e transformando células com o vetor de expressão para produzir o peptídeo.

Assim, a presente invenção refere-se a qualquer molécula de aglutinação, por exemplo, um anticorpo ou fragmento de aglutinação que é obtido de acordo com os meios descritos e exibe as propriedades mencio- nadas ou seja, aquelas que especificamente reconhecem um neoepítopo. Esses anticorpos e moléculas de aglutinação podem ser testados quanto a sua especificidade e afinidade de aglutinação, por exemplo, utilizando o mé- todo de isolamento das moléculas de aglutinação específicas do neoepítopo descritas anteriormente neste documento.

Como uma alternativa para a obtenção de imunoglobulinas dire- tamente a partir da cultura de células B ou células B de memória imortaliza- das, as células imortalizadas podem ser usadas como uma fonte de cadeia pesada rearranjada e de Ioci de cadeia leve para posterior expressão e/ou manipulação genética. Genes de anticorpos rearranjados podem transcritos inversamente a partir de mRNAs apropriados para a produção de cDNA. Se desejado, a região constante da cadeia pesada pode ser trocada por aquela com um isótopo diferente ou totalmente eliminado. As regiões variáveis po- dem ser ligadas para codificar as regiões de cadeia única Fv. Múltiplas regi- ões Fv podem ser ligadas para conferir capacidade de aglutinação a mais de um alvo ou podem ser empregadas combinações quiméricas de cadeia leve e pesada. Uma vez que o material genético está disponível, a concepção de análogos, como descrito acima, que conservam a sua capacidade de agluti- nar o alvo desejado, é simples. Métodos de clonagem de regiões variáveis de anticorpos e geração de anticorpos recombinantes são conhecidos pela pessoa versada na técnica e são descritos, por exemplo, em Gilliland et aí. Tissue Antigens 47 (1996), 1-20; Doenecke et al. Leukemia 11 (1997), 1787- 1792.

Uma vez que o material genético adequado é obtido e, se dese- jado, modificado para codificar um análogo, as seqüências de codificação, incluindo aquelas que codificam, no mínimo, as regiões variáveis da cadeia leve e pesada, podem ser inseridas em sistemas de expressão contidos em vetores que podem ser transfectados em células hospedeiras recombinan- tes-padrão. Uma variedade de tais células hospedeiras pode ser utilizada, para um processamento eficiente, no entanto, células de mamíferos são pre- feridas. As linhas de células mamíferas típicas úteis para esta finalidade in- cluem, entre outras, células CHO, células HEK 293 ou células NSO.

A produção do anticorpo ou análogo é então realizada pela ex- posição à cultura de hospedeiro recombinante modificado sob condições de cultura apropriadas para o crescimento das células hospedeiras e a expres- são das seqüências de codificação. Os anticorpos são então recuperados pelo isolamento deles da cultura. Os sistemas de expressão são preferivel- mente projetados para incluir peptídeos de sinal de modo que os anticorpos resultantes são secretados no meio; no entanto, a produção intracelular também é possível. Uma vez que a estrutura-alvo, por exemplo, a proteína associa- da à doença tiver sido rotulada pela molécula de aglutinação respectiva ali, ela poderá ser identificada por meios e métodos bem-conhecidos na técnica, por exemplo, utilizando técnicas de espectrometria de massa (MS), tais co- mo aquelas descritas no pedido internacional W000/11208 e especificamen- te aquelas descritas em Hock et ai, Nat Med 8 (2002), 1270-1275; Hock et al. Neuron 38 (2003), 547-554. Assim, caso o anticorpo identificado em con- formidade com a presente invenção produzido in vitro se aglutinar às estrutu- ras, patológicas, por exemplo, às placas beta-amiloides nas seções da área patológica do cérebro, mas não de forma significativa aos tecidos saudáveis, um anticorpo candidato promissor foi identificado cuja estrutura-alvo molecu- lar pode ser posteriormente enriquecida e purificada através de suas propri- edades de aglutinação ao anticorpo de tecidos patológicos e, como resulta- do, pode ser identificada e caracterizada por meio de métodos de espectro- metria de massa e analíticos de proteínas, como por exemplo MALDI/TOF (Williams, Methods Cell. Biol. 62 (2000), 449-453; Yates, J. Mass Spectrom. 33 (1998), 1-19).

Assim, em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um antígeno que é reconhecido pela molécula de aglutinação, especialmen- te o anticorpo do presente invenção descrito anteriormente neste documen- to, o qual, preferivelmente, é pelo menos parte de uma proteína associada ao distúrbio.

De acordo com o acima exposto, a presente invenção também refere-se a um polinucleotídeo que codifica o antígeno ou a molécula de a- glutinação da presente invenção, caso o anticorpo, preferivelmente, pelo menos uma região variável de uma cadeia de imunoglobulinas do anticorpo descrito acima. Normalmente, a dita região variável codificada pelos polinu- cleotídeos inclui pelo menos uma região de determinação de complementa- ridade (CDR), de Vh e/ou Vl da região variável do dito anticorpo. A pessoa versada na técnica sabe que cada domínio variável (o Vh de cadeia pesada e o Vl de cadeia leve) de um anticorpo hipervariável compreende três regi- ões hipervariaveis, às vezes denominadas regiões de determinação de com- plementaridade ou "CDRs" ladeadas por quatro regiões de estrutura de su- porte relativamente conservadas ou "FRs" e referem-se aos resíduos de a- minoácidos de um anticorpo que são responsáveis pela aglutinação a antí- geno. As regiões hipervariáveis ou CDRs do subtipo de IgG humano com- preendem resíduos de aminoácidos dos resíduos 24-34 (L1), 50-56 (L2) e 89-97 (L3), no domínio variável de cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável de cadeia pesada como descrito por Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md (1991) e/ou os resíduos provenientes de uma alça hipervariável, por exemplo, resíduos 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3), no domínio variável de cadeia leve e 26-32 (H1), 53- 55 (H2) e 96-101 (H3), no domínio variável de cadeia pesada conforme des- crito por Chothia et ai, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917. Resíduos da estru- tura ou FR são os resíduos de domínio variável diferentes e que incluem as regiões hipervariáveis. O termo "aglutinação específica" refere-se à aglutina- ção do anticorpo a um antígeno predeterminado. Normalmente, o anticorpo aglutina-se com uma constante de dissociação (KD), de 10 M ou menos, e aglutina-se ao antígeno predeterminado com uma Kd que seja pelo menos duas vezes menor que sua K0 para aglutinação a um antígeno não específi- co (por exemplo, BSA1 caseína ou qualquer outro polipeptídeo especificado), com exceção do antígeno predeterminado. As frases "um anticorpo reco- nhece um antígeno" e "um anticorpo específico para um antígeno" são utili- zadas alternadamente aqui com o termo "um anticorpo que se aglutina es- pecificamente a um antígeno". Conforme utilizado aqui aglutinação "altamen- te específica" significa que a Kd relativa do anticorpo para o epitopo alvo es- pecífico, por exemplo, neoepítopo é, pelo menos, 10 vezes menor do que a Kd para aglutinação daquele anticorpo a outros Iigantes ou à contraparte na- tiva da proteína associada à doença.

A afinidade ou avidez de um anticorpo para um antígeno pode ser determinada experimentalmente usando qualquer método adequado; vide, por exemplo, Berzofsky et al. "Antibody-Antigen lnteractions" In Fun- damental immunology, Paul, W. E., ed., Raven Press New York, NY (1984), Kuby1 Janis lmmunology, W. Η. Freeman and Company New York, NY (1992) e os métodos descritos aqui. As técnicas gerais para medição da afi- nidade de um anticorpo para um antígeno incluem ELISA, RIA e ressonância de plásmon de superfície. A afinidade medida de uma interação de anticor- po-antígeno em particular pode variar, se medida sob diferentes condições, por exemplo, concentração de sal, pH. Assim, as medições de afinidade e outros parâmetros de aglutinação a antígenos, por exemplo, Kd, IC50, são realizados de preferência com soluções padronizadas de anticorpo e antíge- no e uma solução-tampão padrão.

A pessoa versada na técnica facilmente reconhecerá que o do- mínio variável do anticorpo que contém o domínio variável acima descrito pode ser usado para a construção de outros polipeptídeos ou anticorpos da especificidade e função biológica pretendida. Assim, a presente invenção também engloba polipeptídeos e anticorpos compreendendo pelo menos uma CDR do domínio variável acima descrito e que, com vantagem, possu- em basicamente as mesmas propriedades de aglutinação, ou semelhante, que do anticorpo descrito nos exemplos anexados. A pessoa versada na técnica facilmente reconhecerá que com o uso dos domínios variáveis ou CDRs aqui descritos, os anticorpos podem ser construídos de acordo com métodos conhecidos na técnica, por exemplo, tal como descritos no pedido da patente européia EP 0 451 216 A1 e EP 0 549 581 A1. Além disso, a pessoa versada na técnica sabe que a afinidade de aglutinação pode ser aumentada através de substituições de aminoácidos nas CDRs ou nas alças hipervariáveis (Chothia e Lesk, J. Mol. Biol. 196 (1987), 901-917), que se sobrepõem parcialmente com as CDRs, tal como definido por Kabat. Assim, a presente invenção também refere-se aos anticorpos em que uma ou mais das CDRs mencionadas incluem uma ou mais, de preferência não mais de duas substituições de aminoácidos. Preferencialmente, os anticorpos da in- venção incluem em uma ou ambas das suas cadeias de imunoglobulinas duas ou todas as três CDRs das regiões variáveis, tal como apresentadas na Tabela 4.

As moléculas de aglutinação, por exemplo, anticorpos ou frag- mentos de aglutinação ao antígeno, variantes ou seus derivados da inven- ção, tal como do conhecimento daqueles versados na técnica, podem com- preender uma região constante que media uma ou mais funções da molécu- la executora. Por exemplo, a aglutinação do componente C1 do complemen- to de uma região constante de anticorpos pode ativar o sistema de comple- mento. A ativação do complemento é importante na opsonização e Iise dos patógenos de células. A ativação do complemento também estimula a res- posta inflamatória e pode também estar envolvido na hipersensibilidade au- toimune. Além disso, os anticorpos se aglutinam aos receptores nas diferen- tes células através da região Fc, com um sítio de aglutinação ao receptor FC na região Fc do anticorpo que se aglutina a um receptor Fc (FCR) em uma célula. Há um número de receptores Fc que são específicos para as diferen- tes classes de anticorpos, incluindo anticorpos IgG (receptores gama), IgE (receptores epsilon), IgA (receptores alfa) e IgM (receptores mu). A aglutina- ção dos anticorpos aos receptores Fc nas superfícies das células desenca- deia uma série de respostas biológicas incluindo absorção e destruição de partículas revestidas com anticorpos, depuração de complexos imunes, Iise de células-alvo revestidas de anticorpos pelas células assassinas (processo chamado de citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos ou ADCC), liberação de mediadores inflamatórios, transferência placentária e controle de produção de imunoglobulina.

Assim, certas modalidades da invenção incluem um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seus derivados, nos quais pelo menos uma porção de um ou mais dos domínios das regiões constan- tes foi eliminada ou, de outro modo, alterada, de modo a proporcionar as características bioquímicas desejadas tais como funções reduzidas da molé- cula executora, a capacidade de dimerização de modo não covalente, capa- cidade aumentada para localizar no sítio de um tumor, redução na meia-vida do soro ou aumento da meia-vida do soro em comparação com um anticorpo total, inalterado com aproximadamente a mesma imunogenicidade. Por e- xemplo, alguns anticorpos para utilização nos métodos de diagnóstico e tra- tamento descritos aqui são anticorpos excluídos do domínio que compreen- dem uma cadeia de polipeptídeo similar a uma cadeia pesada de imunoglo- bulina, mas que não possui pelo menos uma porção de um ou mais domí- nios de cadeia pesada. Por exemplo, em determinados anticorpos, um do- mínio inteiro da região constante do anticorpo modificado será excluído, por exemplo, o todo ou parte do domínio de CH2 domínio será excluído. Em ou- tras modalidades, certos anticorpos para utilização nos métodos de diagnós- tico e tratamento descritos aqui possuem uma região constante, por exem- plo, uma região do constante de cadeia pesada, que é alterada para eliminar a glicosilação, referidos aqui como em outros locais como anticorpos aglico- silatados ou "agli". Tais anticorpos "agli" podem ser preparados enzimatica- mente, bem como pela engenharia do(s) sítio(s) de glicosilação de consenso na região constante. Embora não preso à teoria, acredita-se que anticorpos "agli" possam ter um perfil de maior segurança e estabilidade in vivo. Méto- dos de produção de anticorpos aglicosilatados, tendo função desejada de moléculas executoras são encontrados por exemplo em WO 2005/018572, que se acha incorporada como referência, na sua totalidade.

Em certos anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus derivados aqui descritos, a parte Fc pode ser modificada para diminuir a função das moléculas executoras utilizando técnicas conhe- cidas na técnica. Por exemplo, a eliminação ou desativação (através de mu- tações pontuais ou por outros meios), de um domínio de região constante poderá reduzir a aglutinação do receptor Fc do anticorpo modificado circu- lante, aumentando assim a localização do tumor. Em outros casos, pode ser que as modificações da região constante coerentes com a invenção presen- te, moderem a aglutinação do complemente e, assim, reduzam a meia-vida do soro e a associação não específica de uma citotoxina conjugada. Mas outras modificações da região constante podem ser usadas para modificar os elos de dissulfeto ou as porções de oligossacarídeos que permitem me- lhor localização devido à especificidade dos antígenos ou à flexibilidade dos anticorpos. O perfil fisiológico resultante, a biodisponibilidade e outros efeitos bioquímicos das modificações, tais como localização do tumor, biodistribui- ção e meia-vida do soro, podem ser facilmente medidos e quantificados utili- zando técnicas imunológicas bastante conhecidas sem experimentação in- devida.

Formas modificadas de anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígenos, variantes ou seus derivados da invenção podem ser criadas a partir dos anticorpos precursores ou totais usando técnicas conhecidas na técnica. Técnicas exemplares são discutidas em mais detalhes aqui.

Em certas modalidades as regiões variáveis e constantes dos anticorpos ou fragmentos de aglutinação ao antígeno, variantes ou seus de- rivados da invenção são integralmente humanas. Anticorpos totalmente hu- manos podem ser produzidos usando técnicas que são conhecidas na técni- ca e conforme descrito aqui. Por exemplo, anticorpos totalmente humanos contra um antígeno específico podem ser preparados pela administração do antígeno a um animal transgênico que foi modificado para produzir esses anticorpos em resposta ao desafio antigênico, mas cujos Ioci endógenos fo- ram desativados. Técnicas exemplares que podem ser utilizadas para fabri- car tais anticorpos são descritas nas patentes U.S.: 6.150.584, 6.458.592, 6.420.140. Outras técnicas são conhecidas na técnica. Anticorpos totalmente humanos podem também ser produzidos por diferentes tecnologias de exibi- ção, por exemplo, exibição de bacteriófagos ou outros sistemas de exibição de vírus, conforme descrito em maior detalhe noutro lugar aqui.

Anticorpos ou fragmentos de aglutinação ao antígeno, variantes ou seus derivados da invenção podem ser produzidos ou fabricados usando técnicas que são conhecidas na técnica. Em certas modalidades, moléculas de anticorpos ou seus fragmentos são "produzidas recombinantemente", ou seja, são produzidas usando a tecnologia do DNA recombinante. Técnicas exemplares para fabricação de moléculas de anticorpos ou seus fragmentos são discutidas em mais detalhe noutro lugar aqui.

Anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus derivados da invenção também incluem os derivados que são modi- ficados, por exemplo, a fixação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de modo tal que a fixação covalente não impede o anticorpo de especificamente aglutinar-se ao seu epitopo cognato. Por exemplo, mas não por meio de limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por glicosilação, acetilação, prelação, fosfo- rilação, amidação, derivação por grupos de proteção/bloqueio conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um Iigante celular ou a outra proteína, etc. Quaisquer das inúmeras modificações químicas podem ser realizadas por técnicas conhecidas, incluindo entre outras, a clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica da tunicamicina, etc. Além disso, os derivados podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Em certas modalidades, os anticorpos ou fragmentos de agluti- nação a antígeno ou seus derivados da invenção não irão suscitar uma res- posta imune deletéria no animal a ser tratado, por exemplo, em um ser hu- mano. Em certas modalidades, moléculas de aglutinação, por exemplo, anti- corpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno da invenção são derivados de um paciente, por exemplo, um paciente humano, e são posteriormente utilizadas na mesma espécie da qual foram obtidas, por exemplo, de um ser humano, aliviando ou minimizando a ocorrência de respostas imunes deleté- ria.

A desimunização também pode ser usada para diminuir a imu- nogenicidade de um anticorpo. Conforme utilizado aqui, o termo "desimuni- zação" inclui a modificação de um anticorpo para modificar epitopos de célu- las T (vide, por exemplo, W09852976A1, W00034317A2). Por exemplo, as seqüências VH e VL do anticorpo de partida são analisadas e um "mapa" dos epitopos das células T humanas de cada região V mostra a localização dos epitopos com relação às regiões determinantes de complementaridade (CDRs) e outros resíduos-chave dentro da seqüência. Epitopos de células T individuais do mapa dos epitopos de células T são analisados para identificar as substituições de aminoácidos com um baixo risco de alterar a atividade do anticorpo final. Uma série de seqüências VH e VL alternativas é concebi- da compreendendo combinações de substituições de aminoácidos e essas seqüências são posteriormente incorporadas em uma variedade de polipep- tídeos de aglutinação, por exemplo, anticorpos específicos de neoepítopos ou seus fragmentos imunoespecíficos para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento métodos descritos aqui, que são, então, testados quanto à fun- ção. Normalmente, entre 12 e 24 anticorpos variantes são produzidos e tes- tados. Os genes da cadeia leve e pesada completos, compreendendo regi- ões C humanas e V modificadas, são então clonados em vetores de expres- são e os plasmídeos subsequentes introduzidos nas linhas de células para a produção do anticorpo total. Os anticorpos são então comparados em ensai- os biológicos e bioquímicos adequados e a variante ideal é identificada.

Os anticorpos monoclonais podem ser preparados com uma grande variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo a utilização de hibridomas, recombinante e tecnologias de exibição de bacteriófago ou uma combinação dos mesmos. Por exemplo, os anticorpos monoclonais po- dem ser produzidos utilizando técnicas de hibridomas incluindo aquelas co- nhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et ai, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); Hammerling et ai, Em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas Else- vier, NY, 563-681 (1981) (as ditas referências incorporadas como referência em sua totalidade). O termo "anticorpos monoclonais", como utilizado neste documento não se limita aos anticorpos produzidos através de tecnologia de hibridomas. O termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que é obtido a partir de um único clone, incluindo qualquer clone eucariótico, pro- cariótico ou de bacteriófago e não o método pelo qual ele é produzido. As- sim, o termo "anticorpos monoclonais" não se limita aos anticorpos produzi- dos através da tecnologia de hibridomas. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando uma grande variedade de técnicas conhecidas na técnica. Em certas modalidades, os anticorpos da presente invenção são derivados de células humanas B que tenham sido imortalizadas através da transformação com o vírus Epstein-Barr, conforme descrito aqui.

No processo bem-conhecido de hibridomas (Kohler et al., Nature 256:495 (1975)), os linfócitos de relativa vida curta ou mortais, de um mamí- fero, por exemplo, as células B derivadas de um sujeito humano como aqui descrito, são combinadas com uma linha de células tumorais imortais (por exemplo, uma linha de células de mieloma), assim, produzindo células híbri- das ou "hibridomas" que são imortais e capazes de produzir anticorpo gene- ticamente codificado da célula B. Os híbridos resultantes são segregados em cepas genéticas únicas por seleção, diluição e recrescimento com dada ce- pa individual compreendendo genes específicos para a formação de um úni- co anticorpo. Eles produzem anticorpos, que são homogêneos contra um antígeno desejado e, em referência à sua ascendência genética pura, são denominados "monoclonais".

As células de hibridomas assim preparados são semeadas e cultivadas em um meio de cultura adequado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células parentais de mieloma, não fundidas. Aqueles versados na técnica observarão que reagentes, linhas de células e meio para a formação, sele- ção e crescimento de hibridomas são comercialmente disponíveis a partir de um certo número de fontes e protocolos padronizados estão bem estabeleci- dos. Geralmente, o meio de cultura no qual as células de hibridomas estão crescendo é testado quanto à produção de anticorpos monoclonais contra o antígeno desejado. A especificidade de aglutinação dos anticorpos monoclo- nais produzidos por células de hibridomas é determinada por ensaios in vi- tro, como a imunoprecipitação, radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoab- sorvente ligado a enzimas (ELISA) ou ensaios de aglutinação de neoepíto- pos tal como descrito aqui. Após as células de hibridomas serem identifica- das, as quais produzem anticorpos da especificidade, afinidade e/ou ativida- de desejadas, os clones podem ser subclonados pelos procedimentos de diluição limitadores e cultivados pelos métodos-padrão (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, Academic Press, pp 59-103 (1986)). Se- rá ainda observado que os anticorpos monoclonais secretados pelos subclo- nes podem ser separados do meio de cultura, o fluido de ascite ou soro por processos convencionais de purificação, como, por exemplo, proteína-A, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise ou cromatografia por afinidade.

Fragmentos de anticorpos que reconhecem epitopos específicos poderão ser gerados pelas técnicas conhecidas. Por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2 podem ser produzidos recombinantemente ou por clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas como a pa- paína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para a produção de frag- mentos F(ab')2). Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CH1 da cadeia pesada.

Anticorpos completamente humanos, tais como aqui descritos, são particularmente desejáveis para tratamento terapêutico de pacientes humanos. Anticorpos humanos podem ser produzidos por uma variedade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de exibição de bacterió- fago descritos acima usando bibliotecas de anticorpos derivadas de seqüên- cias de imunoglobulinas humanas. Vide também a patente dos EUA N0. 4.444.887 e 4.716.111; e publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741, cada um dos quais é incorporado aqui como referência na sua totalidade. Anticorpos humanos da presente invenção são isolados, por exemplo, de pacientes sem sintomas mas afetados com o risco de desenvolvimento de um distúrbio como, por exemplo, a doença de Alzheimer ou de um paciente com o distúrbio, mas com um curso da doença excepcionalmente estável.

Em outra modalidade, anticorpos monoclonais desejados codifi- cadores de DNA podem ser prontamente isolados e sequenciados utilizando procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleo- tídeos que são capazes de se aglutinar especificamente aos genes codifica- dores das cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos). As células de hibridomas isoladas e subclonadas servem como uma fonte preferida de tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células procarióticas ou eucarióticas, tais como, entre outras, células E. coli, células COS símias, células ovarianas de hamster chinês (CHO) ou células de mieloma que, de outro modo, não pro- duzem imunoglobulinas. Mais particularmente, o isolamento do DNA (que pode ser sintético, como descrito aqui) pode ser utilizado para clonar se- qüências de regiões constantes e variáveis para a fabricação dos anticorpos, tal como descrito em Newman et ai, patente dos EUA N0. 5.658.570, deposi- tada em 25 de janeiro de 1995, que é incorporada como referência neste documento. Essencialmente, isso implica a extração de RNA de células se- lecionadas, conversão para cDNA e amplificação por PCR utilizando inicia- dores específicos de lg. Iniciadores adequados para esta finalidade também são descritas na Patente U.S. N°. 5.658.570. Como será discutido com mais detalhe a seguir, células transformadas expressando o anticorpo desejado podem ser produzidas em quantidades relativamente grandes para propiciar suprimentos clínicos e comerciais de imunoglobulina.

Em uma modalidade, um anticorpo da invenção inclui pelo me- nos uma CDR de cadeia pesada ou leve de uma molécula de anticorpo. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos duas CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpos. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção inclui pelo menos três CDRs de uma ou mais molécu- las de anticorpos. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção inclui pe- lo menos quatro CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpos. Em outra modalidade, um anticorpo da invenção compreende pelo menos cinco CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpos. Em outra modalidade, um anticor- po da invenção inclui pelo menos seis CDRs de uma ou mais moléculas de anticorpos. Moléculas exemplares de anticorpos compreendendo pelo me- nos uma CDR que podem ser incluídas nos anticorpos do sujeito são descri- tas aqui.

Em uma modalidade específica, a seqüência de aminoácidos dos domínios variáveis de cadeia pesada e/ou leve pode ser inspecionada para identificar as seqüências das regiões de determinação de complemen- taridade (CDRs) através de métodos que são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, por comparação com seqüências de aminoácidos conhecidos de outras regiões variáveis de cadeia leve e pesada para determinar as regi- ões de hipervariabilidade das seqüências. Usando técnicas de DNA recom- binantes de rotina, uma ou mais CDRs podem ser inseridas nas regiões de estrutura, por exemplo, nas regiões de estrutura humana. As regiões de es- trutura podem ser regiões de estrutura que ocorrem naturalmente ou de con- senso e, preferivelmente, regiões de estrutura humana (vide, por exemplo, Chothia et ai, J. Moi Bioi 278:457-479 (1998) para uma lista de regiões de estrutura humana). Em certas modalidades, o polinucleotídeo gerado pela combinação das regiões de estrutura e CDRs codifica um anticorpo específi- co que se aglutina especificamente a pelo menos um epitopo de um polipep- tídeo desejado. Em certas modalidades, uma ou mais substituições de ami- noácidos podem ser feitas nas regiões de estrutura para, por exemplo, me- lhorar a aglutinação do anticorpo ao seu antígeno. Além disso, esses méto- dos podem ser usados para fazer substituições de aminoácidos ou exclu- sões de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que fazem parte de uma aglutinação de dissulfetos intra-cadeias para gerar moléculas de an- ticorpos que não possuem uma ou mais aglutinações de dissulfetos intra- cadeias. Outras alterações nos polinucleotídeos são abrangidas pela presen- te invenção e na habilidade da técnica.

Alternativamente, as técnicas descritas para a produção de anti- corpos de cadeia única (patente dos EUA N0. 4.694.778; Bird, Science 242:423-442 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei. E.U.A. 85:5879- 5883 (1988) e Ward et al., Nature 334:544-554 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única são formados pela ligação dos fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv através de uma ponte de aminoácidos, resultando em um anticorpo de ca- deia única. Técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E coli também podem ser utilizadas (Skerra et ai, Science 242:1038-1041 (1988)).

Em outra modalidade, linfócitos podem ser selecionados pela micromanipulação e pelos genes variáveis isolados. Por exemplo, células mononucleares sangüíneas periféricas podem ser isoladas de um mamífero imunizado ou naturalmente imune, por exemplo, um humano e expostos à cultura por cerca de 7 dias, in vitro. As culturas podem passar por varredura quanto a IgGs específicas que satisfaçam os critérios de varredura. Células de cavidades positivas podem ser isoladas. Células B produtoras de Ig indi- viduais podem ser isoladas por FACS ou por sua identificação em um ensai- do de placas hemolíticas mediadas por complemento. Células B produtoras de Ig podem ser micromanipuladas para um tubo e os genes VH e VL po- dem ser amplificados, utilizando, por exemplo, TR-PCR. Os genes VH e VL podem ser clonados em um vetor de expressão de anticorpo e transfectados para células (por exemplo, células procarióticas ou eucarióticas) para ex- pressão.

Alternativamente, linhas produtoras de anticorpos podem ser selecionadas e expostas à cultura através de técnicas bem-conhecidas para o artesão versado. Essas técnicas são descritas em uma variedade de ma- nuais de laboratório e publicações primárias. Neste contexto, as técnicas 10 adequadas para o uso da invenção, tal como descrito abaixo estão descritas no documento Current Protocols in Immunology, Coligan et ai, Eds., Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons, New York (1991), que é aqui incorporado como referência na sua totalidade, in- cluindo os suplementos.

Anticorpos da presente invenção podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em par- ticular, através da síntese química ou de preferência, pelas técnicas de ex- pressão recombinantes como descrito aqui.

Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado da invenção compreende uma região constante sintética onde um ou mais domínios são parcialmente ou total- mente eliminados ("anticorpos de domínio excluído"). Em certas modalida- des, anticorpos modificados compatíveis compreenderão constructos de domínio excluído ou variantes onde todo o domínio CH2 foi removido (cons- tructos ACH2). Para outras modalidades, um peptídeo de ligação curta pode ser usado em lugar do domínio excluído para propiciar flexibilidade e liber- dade de movimento para a região variável. Aqueles versados na técnica irão observar que tais constructos são particularmente preferidas devido às pro- priedades retulatórias do domínio CH2 na taxa catabólica do anticorpo. Constructos de domínios excluídos podem ser obtidos usando-se um vetor que codifica um domínio constante humano IgGi (vide, por exemplo, WO 02/060955A2 e W002/096948A2). Este vetor é projetado para eliminar o domínio CH2 e fornecer um vetor sintético que expressa uma região cons- tante de IgGI de domínio excluído.

Em certas modalidades, anticorpos ou fragmentos de ligação a antígeno, variantes ou seus derivados da presente invenção são minicorpos.

Minicorpos podem ser fabricados usando os métodos descritos na técnica (Vide, por exemplo, a patente U.S. 5.837.821 ou WO 94/09817A1).

Em uma modalidade, um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado da invenção compreende uma cadeia pesada de imunoglobulina contendo exclusão ou substituição de alguns ou até mesmo de um único aminoácido, desde que permita a associação entre as subunidades monoméricas. Por exemplo, a mutação de um único amino- ácido em áreas selecionadas do domínio CH2 pode ser suficiente para redu- zir substancialmente a aglutinação de Fc e assim aumentar a localização do tumor. Do mesmo modo, pode ser desejável simplesmente excluir aquela parte de um ou mais domínios de regiões constantes que controlam a função da molécula executora (por exemplo, aglutinação de complementos) a ser modulada. Estas exclusões parciais das regiões constantes podem melhorar as características selecionadas do anticorpo (meia-vida do soro), deixando intactas outras funções desejáveis associadas com o domínio da região constante do sujeito. Além disso, conforme mencionado anteriormente, as regiões constantes dos anticorpos descritos podem ser sintéticas através da mutação ou substituição de um ou mais aminoácidos, o que reforça o perfil da construção resultante. A este respeito, pode ser possível para interromper a atividade propiciada por um sítio de aglutinação conservado (por exemplo, aglutinação de Fc), enquanto que substancialmente mantém a configuração e o perfil imunogênico do anticorpo modificado. Mas outras modalidades in- cluem a adição de um ou mais aminoácidos para a região constante para melhorar as características desejáveis, tais como função da molécula execu- tora ou propiciar maior fixação da citotoxina ou carboidrato. Em tais modali- dades, pode ser desejável inserir ou replicar seqüências específicas deriva- das dos domínios de região constante selecionados.

A presente invenção também propicia anticorpos que compreen- dem, consistem essencialmente em ou consistem em, variantes (incluindo derivados) de moléculas de anticorpos (por exemplo, as regiões VH e/ou regiões VL) aqui descritas, cujos anticorpos ou seus fragmentos se agluti- nam imunoespecificamente a um polipeptídeo associado ao distúrbio ou fragmento ou variante seu. Normas técnicas-padrão por aqueles de habilida- de na técnica podem ser usadas para introduzir mutações na seqüência de nucleotídeos que codificam um anticorpo, incluindo, entre outros, meutagê- nese dirigida pelo sítio e mutagênese mediada pela PCR que resultam em substituições de aminoácidos. Preferivelmente, as variantes (incluindo deri- vados) codificam menos de 50 substituições de aminoácidos, menos de 40 substituições de aminoácidos, menos de 30 substituições de aminoácidos, menos de 25 substituições de aminoácidos, menos de 20 substituições de aminoácidos, menos de 15 substituições de aminoácidos, menos de 10 substituições de aminoácidos, menos de 5 substituições de aminoácidos, menos de 4 substituições de aminoácidos, menos de 3 substituições de ami- noácidos ou menos de 2 substituições de aminoácidos em relação à região de referência VH: CDR1-VH, VH-CDR2, VH-CDR3; região VL, VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3. A "substituição de aminoácidos conservadora" é a- quela em que o resíduo de aminoácido é substituído por um resíduo de ami- noácido contendo uma cadeia lateral com uma carga similar. Famílias de resíduos de aminoácidos com cadeias laterais com cargas similares foram definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias late- rais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais acídi- cas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicínia, asparagina, glutamina, serina, treoni- na, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadei- as laterais beta-ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e ca- deias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histi- dina). Alternativamente, mutações podem ser introduzidas aleatoriamente ao longo de todo ou parte da seqüência de codificação, como por mutagênese de saturação e os mutantes resultantes podem sofrer varredura quanto à atividade biológica para identificar mutantes que retenham atividade (por exemplo, a capacidade de vincular um polipeptídeo associado ao distúrbio).

Por exemplo, é possível introduzir mutações somente nas regi- ões de estrutura ou somente nas regiões CDR de uma molécula de anticor- po. Mutações introduzidas podem ser mutações de falso sentido silenciosas ou neutras, por exemplo, têm pouco ou nenhum efeito sobre a capacidade de um anticorpo aglutinar-se ao antígeno, na verdade, algumas dessas mu- tações não alteram qualquer que seja a seqüência de aminoácidos. Esses tipos de mutações podem ser úteis para otimizar o uso do códon ou melho- rar a produção de anticorpos do hibridoma. As regiões de codificação otimi- zadas pelo códon que codificam os anticorpos da presente invenção estão descritas noutro lugar neste documento. Alternativamente, mutações de sen- tido falso não neutras poderão alterar a capacidade do anticorpo de se aglu- tinar ao antígeno. A localização da maioria das mutações de sentido falso e neutras provavelmente deverá ser nas regiões de estrutura, enquanto a loca- lização da maioria das mutações de sentido falso não neutras deverá ser na CDR, embora esta não seja uma exigência absoluta. Alguém versado na técnica seria capaz de conceber e testar moléculas mutantes com as propri- edades desejadas tais como nenhuma alteração na atividade de aglutinação ao antígeno ou alteração na atividade de aglutinação (por exemplo, melhori- as na atividade de aglutinação ao antígeno ou mudança na especificidade do anticorpo). Após a mutagênese, a proteína codificada poderá rotineiramente ser expressa e a atividade funcional e/ou biológica da proteína codificada (por exemplo, a capacidade de aglutinar imunoespecificamente pelo menos um epitopo de um polipeptídeo associado ao distúrbio) pode ser determina- da através de técnicas descritas aqui ou por rotineiramente modificar as téc- nicas conhecidas na técnica. IV. Polinucletoídeos que Codificam Anticorpos

De acordo com o acima exposto, a presente invenção também refere-se a um polinucleotídeo que codifica uma molécula de aglutinação da presente invenção, como por exemplo, um anticorpo. No caso do anticorpo, o polinucleotídeo pode codificar pelo menos uma região variável de uma ca- deia de imunoglobulina do anticorpo descrito acima. O polinucleotídeo da invenção que codifica o anticorpo acima descrito pode ser, por exemplo, o DNA, cDNA, RNA ou DNA ou RNA produzido sinteticamente ou uma molé- cula de ácido nucleico quimérica produzida recombinantemente compreen- dendo qualquer desses polinucleotídeos isoladamente ou em combinação. Preferivelmente o dito polinucleotídeo é parte de um vetor. Esses vetores podem incluir mais genes, tais como genes marcadores que permitem a se- leção do dito vetor em uma célula hospedeira adequada e sob condições adequadas. Preferivelmente, o polinucleotídeo da invenção está operativa- mente ligado às seqüências de controle da expressão permitindo a expres- são nas células procarióticas ou eucarióticas. A expressão do dito polinucle- otídeo compreende a transcrição do polinucleotídeo para um mRNA traduzí- vel. Os elementos reguladores que asseguram á expressão em células eu- carióticas, preferivelmente células mamíferas, são bem-conhecidos daqueles versados na técnica. Eles geralmente incluem seqüências reguladoras que asseguram a iniciação da transcrição e, opcionalmente, sinais de poli-A que asseguram o término da transcrição e a estabilização do transcrito. Elemen- tos reguladores adicionais podem incluir elementos transcricionais, bem co- mo potenciadores traducionais e/ou regiões de promotores naturalmente associadas ou heterólogas.

Um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seus derivados pode ser composto de qualquer polirribonucleotídeo ou polidesoxirribonucleotídeo, que pode ser RNA ou DNA inalterado ou RNA ou DNA modificado. Por exemplo, um poli- nucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antíge- no ou seu derivado pode ser composto de um DNA de fita única ou dupla, DNA que é uma mistura de regiões de fita única e dupla, RNA de fita única e dupla e RNA que é uma mistura de regiões de fita única e dupla, moléculas híbridas compreendendo DNA e RNA que podem ser de fita única ou, mais normalmente, de fita dupla ou uma mistura de regiões de fita única e dupla. Além disso, um polinucleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado pode ser composto de re- giões de fita tripla compreendendo RNA ou DNA ou RNA e DNA. Um polinu- cleotídeo que codifica um anticorpo ou fragmento de aglutinação ao antíge- no, variante ou seu derivado pode também conter uma ou mais bases modi- ficadas ou espinhas dorsais de DNA ou RNA modificadas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases triti- Iadas e bases incomuns tais como inosina. Uma variedade de alterações pode ser feita ao DNA e RNA1 assim, o "polinucleotídeo" engloba formas quimicamente, enzimaticamente ou metabolicamente modificadas.

Um polinucleotídeo isolado que codifica uma variante não natu- ral de um polipeptídeo derivado de uma imunoglobulina (por exemplo, uma parte de cadeia pesada ou parte de cadeia leve de imunoglobulina) pode ser criado pela introdução de uma ou mais substituições de nucleotídeos, adi- ções ou exclusões na seqüência nucleotídica da imunoglobulina tal que uma ou mais substituições, adições ou exclusões de aminoácidos são introduzi- das na proteína codificada. As mutações podem ser introduzidas por técni- cas-padrão, como a mutagênese dirigida ao sítio e mutagênese mediada pela PCR. Preferivelmente, as substituições conservadoras de aminoácidos são feitas em um ou mais resíduos de aminoácidos não essenciais.

Como é sabido, o RNA pode ser isolado a partir das células de hibridomas originais ou de outras células transformadas pelas técnicas- padrão, tais como a extração e precipitação de isotiocianato de guanidínio seguidas da centrifugação ou cromatografia. Onde desejável, o mRNA pode ser isolado do RNA total por técnicas-padrão tais como a cromatografia em celulose-oligo dT. Técnicas adequadas são familiares na técnica.

Em uma modalidade, cDNAs que codificam as cadeias leves e pesadas do anticorpo podem ser produzidos, simultaneamente ou separa- damente, por meio da transcriptase reversa e polimerase do DNA em con- formidade com métodos bem-conhecidos. A PCR pode ser iniciada pelos iniciadores de região constante de consenso ou por iniciadores mais especí- ficos com base nas seqüências de aminoácidos e de DNA de cadeia leve e pesada publicadas. Conforme discutido acima, a PCR também pode ser uti- lizada para isolar clones de DNA que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpos. Neste caso, as bibliotecas podem passar por uma varredura pelos iniciadores de consenso ou sondas homólogas maiores, tal como son- das de região constante dos camundongos.

O DNA1 normalmente o DNA plasmidial, pode ser isolado das células através de técnicas conhecidas na técnica, restrição mapeada e se- quenciada, em conformidade com as técnicas-padrão bem-conhecidas apre- sentadas em detalhe, por exemplo, nas referências precedentes relativas às técnicas de DNA recombinante. Evidentemente, o DNA pode ser sintético, de acordo com a presente invenção, em qualquer ponto durante o processo de isolamento ou posterior análise.

Em uma modalidade, a presente invenção propicia um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica umá região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH), onde pelo menos uma das CDRs da região variável de cadeia pesada ou pelo menos duas CDRs-VH da região variável de cadeia pesada são, pelo menos, 80%, 85%, 90% ou 95% idênticos às seqüências de referência de aminoácidos CDR1-VH, VH-CDR2 ou VH- CDR3 dos anticorpos descritos aqui. Alternativamente, as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 da VH são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idên- ticas às seqüências de referência de aminoácidos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 de cadeia pesada descritas aqui. Assim, de acordo com esta mo- dalidade, uma região variável de cadeia pesada da invenção tem seqüências de polipeptídeos VH-CDR1, VH-CDR2 ou VH-CDR3 relacionadas às se- qüências de polipeptídeos mostradas na Tabela 4.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polinu- cleotídeo isolado compreendendo, consistindo essencialmente em ou con- sistindo em um ácido nucleico que codifica uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina (VL), onde pelo menos uma das VL-CDRs da região variável de cadeia leve ou pelo menos duas das VL-CDRs da região variável de cadeia leve são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às se- qüências de referência de aminoácidos VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 de cadeia leve dos anticorpos descritos aqui. Alternativamente, as regiões VL- CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 da VL são pelo menos 80%, 85%, 90% ou 95% idênticas às seqüências de referência de aminoácidos VL-CDR1, VL-CDR2 e VL-CDR3 de cadeia leve dos anticorpos descritos aqui. Assim, de acordo com esta modalidade, uma região variável de cadeia leve da invenção tem seqüências de polipeptideos VL-CDR1, VL-CDR2 ou VL-CDR3 relacionadas às seqüências de polipeptideos mostradas na Tabela 4.

Em outra modalidade, a presente invenção propicia um polinu- cleotídeo isolado, compreendendo, consistindo essencialmente em, ou con- sistindo em um ácido nucleico codificando uma região variável de cadeia pesada de imunoglobulina (VH) na qual as regiões VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 têm seqüências de polipeptideos que são idênticos aos grupos VH-CDR1, VH-CDR2 e VH-CDR3 apresentados na Tabela 4.

Tal como é conhecida na técnica, a "identidade de seqüência" entre os dois polipeptideos ou dois polinucleotídeos é determinada pela comparação da seqüência de aminoácidos ou ácidos nucleicos de um poli- peptídeo ou polinucleotídeo com a seqüência de um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo. Quando discutido aqui, se um determinado polipeptídio é pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% ou 95% idêntico a outro polipeptídeo, pode ser determinado por meio de métodos e programas de computador/software conhecidos na técni- ca, como o seguinte, mas não limitado a este: BESTFIT program (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wl 53711). O BESTFIT utiliza o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman, Ad- vances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981), para encontrar o melhor segmento de homologia entre as duas seqüências. Ao utilizar o BESTFIT ou qualquer outro programa de alinhamento de seqüência para determinar se uma determinada seqüência, por exemplo, é 95% idêntica a uma seqüência de referência, de acordo com a presente invenção, os parâmetros são defi- nidos, naturalmente, de tal forma que o percentual de identidade é calculado ao longo de todo o comprimento da seqüência de polipeptideos de referên- cia e que as lacunas na homologia de até 5% do número total de aminoáci- dos na seqüência de referência são permitidas.

Tabela 5: Seqüências de polinucleotídeos da região Vh dos anticorpos espe- cíficos de neoepítopos.

<table>table see original document page 79</column></row><table> <table>table see original document page 80</column></row><table> <table>table see original document page 81</column></row><table> <table>table see original document page 82</column></row><table>

A este respeito, a pessoa versada na técnica facilmente reco- nhecerá que os polinucleotídeos que codificam pelo menos o domínio variá- vel da cadeia leve e/ou pesada podem codificar os domínios variáveis de ambas as cadeias de imunoglobulina ou de somente uma. Da mesma forma, os ditos polinucleotídeos podem estar sob o controle do mesmo promotor ou podem ser separadamente controlados pela expressão. Elementos regulado- res possíveis que permitem a expressão em células hospedeiras procarióti- cas compreendem, por exemplo, o promotor PL, 1ac, trp ou tac em E. coli e exemplos para elementos reguladores que permitem a expressão em células hospedeiras eucarióticas são o promotor AOX1 ou GAL1 em levedo ou o promotor CMV-, SV40-,RSV-, o potencializador CMV-, SV40- ou um íntron da globina em mamíferos e outras células de animais. Elementos lado a lado que são responsáveis pela iniciação da transcrição de tais elementos regu- ladores podem também compreender os sinais de término de transcrição, tais como o sítio SV40-poli-A ou o sítio tk-poli-A, a jusante do polinucleotí- deo. Além disso, dependendo do sistema de expressão usado, as seqüên- cias líderes capazes de direcionar o polipeptídeo para um compartimento celular ou secretá-lo para o meio podem ser adicionadas à seqüência codifi- cadora do polinucleotídeo da invenção e são bem-conhecidos na técnica. A(s) sequência(s) líder(es) é(são) montada(s) na fase apropriada com se- qüências de tradução, iniciação e término, e, preferivelmente, uma seqüên- cia líder capaz de direcionar a secreção da proteína traduzida ou uma por- ção sua, para o espaço periplásmico ou meio extracelular. Opcionalmente, a seqüência heteróloga poderá codificar uma proteína de fusão incluindo um peptídeo de identificação com terminação C ou N imprimindo as característi- cas desejadas, por exemplo, a estabilização ou a purificação simplificada do produto recombinante expresso. Neste contexto, vetores de expressão ade- quados são conhecidos na técnica, tais como o vetor de expressão cDNA Okayama-Berg pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) ou pSPORT1 (GIBCO BRL). Preferivelmente, as seqüências de controle da expressão serão os sistemas do promotor eucariótico em vetores capazes de transformar ou transfectar células hospedeiras eucarióticas, mas as seqüências de controle para hospedeiros procarióticos podem também ser usadas. Uma vez que o vetor tenha sido incorporado no hospedeiro a- propriado, o hospedeiro é mantido sob condições adequadas para expres- são de alto nível das seqüências de nucleotídeos e, conforme desejado, a coleta e a purificação das cadeias leves de imunoglobulina, das cadeias pe- sadas, dos dímeros das cadeias leves/pesadas e dos anticorpos intactos, dos fragmentos de aglutinação ou de outras formas de imunoglobuiina po- dem seguir; vide, Beychok1 Cells of Immunoglobulin Synthesis, Academic Press, N.Y., (1979).

A presente invenção também inclui fragmentos dos polinucleotí- deos da invenção, conforme descrito em outro lugar neste documento. Além disso, os polinucleotídeos que codificam os polinucleotídeos de fusão, os fragmentos Fab e outros derivados, conforme descrito aqui, são também contemplados pela invenção.

Os polinucleotídeos podem ser produzidos ou fabricados por qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a seqüência de nu- cleotídeos do anticorpo for conhecida, um polinucleotídeo codificador do an- ticorpo pode ser montado a partir de oligonucleotídeos sintetizados quimi- camente (por exemplo, conforme descrito em Kutmeier et ai., BioTechniques 17:242 (1994)), o que, resumidamente, envolve a síntese de sobreposição das porções contendo oligonucleotídeos da seqüência codificadora do anti- corpo, o recozimento e a ligação daqueles oligonucleotídeos, e então a am- plificação dos oligonucleotídeos ligados pela PCR.

Alternativamente, um polinucleotídeo codificador de um anticor- po ou um fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado, pode ser gerado de um ácido nucleico a partir de uma fonte adequada. Se um clone contendo um ácido nucleico codificador de um anticorpo em parti- cular não estiver disponível, mas a seqüência da molécula do anticorpo for conhecida, um ácido nucleico codificador do anticorpo pode ser quimicamen- te sintetizado ou obtido de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de cDNA de anticorpo ou uma biblioteca de cDNA gerada de ou ácido nucle- ico, preferivelmente poli A+RNA, isolado de qualquer tecido ou células ex- pressando o anticorpo específico de neoantígeno, tais como células de hibri- domas selecionadas para expressar um anticorpo) pela amplificação da PCR utilizando iniciadores sintéticos hibridizáveis para as terminações 3' e 5' da seqüência ou pela clonagem usando uma sonda de oligonucleotídeo especí- fica para a seqüência de genes em particular para identificar, por exemplo, um clone de cDNA a partir de uma biblioteca de cDNA que codifica o anti- corpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados pela PCR podem então ser clonados nos vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem-conhecido na técnica.

Uma vez que a seqüência de nucleotídeos e a seqüência de a- minoácidos correspondente do anticorpo ou do fragmento de aglutinação ao antígeno, variante ou seu derivado for determinada, sua seqüência de nu- cleotídeos pode ser manipulada usando métodos bem-conhecidos na técni- ca para a manipulação da seqüência de nucleotídeos, por exemplo, técnicas de DNA recombinantes, mutagênese direcionada ao sítio, PCR, etc. (vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et a/., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Har- bor, N.Y. (1990) e Ausubel et ai, eds., Current Protocols in Molecular Bio- Iogy, John Wiley & Sons, NY (1998), que são ambos incorporados por refe- rência aqui em sua totalidade) para gerar anticorpos contendo uma seqüên- cia de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições de ami- noácidos, exclusões e/ou inserções de aminoácidos. V. Expressão de Polipeptídeos de Anticorpos

A presente invenção também envolve um método para produção de células capazes de expressar um anticorpo da invenção ou sua(s) cadei- a(s) de imunoglobulina(s) correspondente(s), compreendendo células gene- ticamente de engenharia com o polinucleotídeo ou com o vetor da invenção. As células obtidas pelo método da invenção podem ser usadas, por exem- plo, para testar a interação do anticorpo da invenção com seu antígeno.

Em seguida à manipulação do material genético isolado para propiciar anticorpos ou fragmentos de aglutinação de antígenos, variantes ou seus derivados da invenção, os polinucleotídeos codificadores dos anticor- pos são normalmente inseridos em um vetor de expressão para introdução nas células hospedeiras que podem ser usados para produzir a quantidade desejada do anticorpo.

A expressão recombinante de um anticorpo ou fragmento, deri- vado ou seu análogo, por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anti- corpo que se aglutina a uma molécula-alvo descrita aqui. Uma vez que o polinucleotídeo codificador de uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo ou sua porção (preferivelmente contendo o domínio variável da cadeia pesada ou leve) da invenção tiver sido obtido, o vetor para a produção da molécula do anticorpo poderá ser produzido pela tecnologia do DNA recombinante usando técnicas bem-conhecidas na técni- ca. Assim, os métodos para preparação de uma proteína pela expressão de um polinucleotídeo contendo um anticorpo codificador da seqüência de nu- cleotídeos estão descritos aqui. Os métodos que são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores de expressão contendo seqüências de codificação de anticorpos e sinais de controle de transcrição e de tradução apropriados. Esses métodos incluem, por exemplo, técnicas de DNA recombinantes in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. A invenção, portanto, propicia vetores repli- cáveis compreendendo uma seqüência codificadora de uma molécula de anticorpo da invenção ou uma cadeia pesada ou leve sua, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, operavelmente ligados a um promotor. Tais vetores podem incluir a seqüência de nucleotídeos codificadores da região constante da molécula do anticorpo (vide, por exemplo, PCT Publica- tion WO 86/05807; PCT Publication WO 89/01036; e Patente U.S. N0. 5.122.464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado em tal vetor para expressão da cadeia pesada ou leve inteira.

A presente invenção refere-se a vetores, particularmente plas- mídeos, cosmídeos, vírus e bacteriófagos usados convencionalmente na engenharia genética, que compreende um polinucleotídeo codificador do antígeno ou preferivelmente um domínio variável de uma cadeia de imuno- globulina de um anticorpo da invenção; opcionalmente em combinação com um polinucleotídeo da invenção que codifica o domínio variável de outra ca- deia de imunoglobulinas do anticorpo da invenção. Preferivelmente, o dito vetor é um vetor de expressão e/ou um vetor de transferência ou de direcio- namento de genes. Os vetores de expressão derivados dos vírus tais como retrovirus, vírus vaccinia, vírus associados a adeno, vírus da herpes ou vírus papiloma bovino, podem ser usados para entrega dos polinucleotídeos ou vetor da invenção na população de células direcionadas. Métodos que são bem-conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser usados para construir vetores virais; vide, por exemplo, as técnicas descritas em Sam- brook, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Labora- tory (1989) N.Y. e Ausubel, Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (1994). Alternativamente, os polinucleotídeos e os vetores da invenção podem ser reconstituídos em lipossomas para a entrega das células-alvo. Os vetores contendo os polinu- cleotideos da invenção (por exemplo, o(s) domínio(s) variável(eis) pesado(s) e/ou leve(s) das seqüências de codificação e das seqüências de controle de expressão das cadeias de imunoglobulinas) podem ser transferidos para a célula hospedeira por métodos bem-conhecidos, que variam dependendo do tipo de hospedeiro celular. Por exemplo, a transfecção de cloreto de cálcio é comumente utilizada para células procarióticas, ao passo que o tratamento com fosfato de cálcio ou a eletroporação pode ser utilizado para outros hos- pedeiros celulares; vide Sambrook, supra.

O termo "vetor" ou "vetor de expressão" é usado aqui com o sig- nificado de vetores usados em conformidade com a presente invenção como veículo para introdução em expressão de um gene desejado em uma célula hospedeira. Conforme de conhecimento daqueles versados na técnica, tais vetores podem facilmente ser selecionados do grupo consistindo em plasmí- deos, fagos, vírus e retro-vírus. Em geral, os vetores compatíveis com a pre- sente invenção compreenderão um marcador de seleção, sítios de restrição apropriados para facilitar a clonagem do gene desejado e a capacidade de entrar e/ou replicar em células eucarióticas ou procarióticas.

Para os fins desta invenção, inúmeros sistemas de vetores de expressão podem ser empregados. Por exemplo, uma classe de vetor utiliza elementos do DNA que são derivados de vírus de animais tais como o vírus papiloma bovino, vírus polioma, adenovírus, vírus vaccinia, baculovírus, re- tro-vírus (RSV, MMTV ou MOMLV) ou vírus SV40. Outros envolvem o uso de sistemas polícistrônicos com sítios de aglutinação de ribossomos inter- nos. Além disso, as células que integraram o DNA em seus cromossomos podem ser selecionadas pela introdução de um ou mais marcadores que permitem a seleção de células hospedeiras transfectadas. O marcador pode propiciar a prototrofia para um hospedeiro auxotrófico, resistência ao biocídio (por exemplo, antibióticos) ou resistência a metais pesados tais como cobre.

O gene do marcador selecionável pode ser diretamente ligado às seqüên- cias do DNA para ser expresso ou introduzido na mesma célula pela co- transformação. Elementos adicionais podem também ser necessários para a síntese ideal do mRNA. Estes elementos podem incluir seqüências de sinais, sinais de divisão, como também promotores de transcrição, potencializado- res e sinais de término.

Em modalidades particularmente preferidas, os genes das regi- ões variáveis clonadas são inseridos em um vetor de expressão em conjunto com os genes das regiões constantes de cadeia pesada e leve sintéticos (preferivelmente humanos), conforme discutido acima. Em uma modalidade, isto é efetuado usando um vetor de expressão patenteado da Biogen 1DEC, Inc., denominado NEOSPLA (descrito na patente U.S. 6.159.730). Este vetor contém o promotor/potencializador do citomegalovírus, o promotor principal da betaglobina de camundongos, a origem SV40 de réplica, a seqüência de poliadenilação de hormônios de crescimento bovino, o exon 1 e o exon 2 de fosfotransferase de neomicina, o gene de reductase de di-hidrofolato e a se- qüência líder. Descobriu-se que este vetor resulta em expressão de nível muito alto de anticorpos quando da incorporação de genes de regiões variá- veis e constantes, transfecção em células CHO, seguido pela seleção em meio contendo G418 e amplificação de metotrexato. É claro que qualquer vetor de expressão que for capaz de elicitar a expressão em células eucarió- ticas pode ser usado na presente invenção. Exemplos de vetores adequados incluem, mas não estão limitados a plasmídeos pcDNA3, pHCMV/Zeo, p- CR3.1, pEF1/His, pIND/GS, pRc/HCMV2, pSV40/Zeo2, pTRACER-HCMV, pUB6/V5-His, pVAX1 e pZeoSV2 (disponíveis pela Invitrogen, San Diego, CA), e plasmídeo pCI (disponível pela Promega, Madison, Wl). Em geral, a varredura de grandes números de células transformadas para aquelas que expressam níveis adequadamente altos se as cadeias pesada e leve de i- munoglobulina for experimentação de rotina, a qual pode ser realizada, por exemplo, por sistemas robóticos. Os sistemas de vetores são também ensi- nados nas patentes U.S. N0. 5.736.137 e 5.658.570, cada qual está incorpo- rada aqui como referência em sua totalidade. Este sistema propicia altos níveis de expressão, por exemplo, >30 pg/célula/dia. Outros sistemas de vetores exemplares são descritos, por exemplo, na patente U.S. 6.413.777.

Em outras modalidades preferidas, os anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus derivados da invenção podem ser expressos usando constructos policistrônicos tais como aqueles descri- tos na Publicação do Pedido de Patente U.S. N0. 2003-0157641 A1, deposi- tado em 18 de novembro de 2002 e incorporado aqui em sua totalidade. Nesses novos sistemas de impressão, múltiplos produtos de genes de inte- resse tais como cadeias pesadas e leves de anticorpos podem ser produzi- dos a partir de um único constructo policistrônico. Esses sistemas com van- tagem usam um sítio de entrada de ribossomo interno (IRES) para propiciar níveis relativamente altos de anticorpos. Seqüências IRES compatíveis es- tão descritas na Patente U.S. N°. 6.193.980 que se encontra também incor- porada aqui. Aqueles versados na técnica observarão que tais sistemas de expressão podem ser usados para efetivamente produzir a faixa ampla de anticorpos descrita no pedido presente.

Mais geralmente, uma vez que o vetor ou seqüência de DNA codificadora de uma subunidade monomérica do anticorpo foi elaborada, o vetor de expressão pode ser introduzido em uma célula hospedeira apropri- ada. A introdução do plasmídeo na célula hospedeira pode ser realizada a- través de várias técnicas bem-conhecidas por aqueles versados na técnica. Estas incluem, mas não estão limitadas à, transfecção (incluindo eletroforese e eletroporação), fusão de protoplastos, precipitação de fosfato de cálcio, fusão de células com DNA envelopado, microinjeção e infecção com vírus intacto. Vide Ridgway, A. A. G. "Mammalian Expression Vectors" Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds., Butterworths, Boston, Mass., Chapter 24.2, pp. 470-472 (1988). Normalmente, a introdução de plasmídeos no hospedei- ro se dá via eletroporação. As células hospedeiras que acolhem o constructo da expressão são cultivadas sob condições apropriadas à prodção das ca- deias leves e das cadeias pesadas e testadas quanto à síntese das proteí- nas da cadeia pesada e/ou leve. Técnicas de ensaio exemplares incluem ensaio imunosorbente ligado a enzimas (ELISA), radioimunoensaio (RIA) ou análise de selecionador de células ativadas por fluorescênica (FACS), imu- no-histoquímica e similar.

O vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira pelas técnicas convencionais e as células transfectadas são então expostas à cultura através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo para uso nos métodos descritos aqui. Assim, a invenção inclui células hospedei- ras contendo um polinucleotídeo codificador de um anticorpo da invenção ou uma cadeia pesada ou leve sua, operavelmente ligada a um promotor hete- rólogo. Em modalidades preferidas para a expressão de anticorpos de ca- deia dupla os vetores codificadores de ambas cadeias pesada e leve podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão da molécula de imu- noglobulina inteira, conforme detalhado abaixo.

A presente invenção ainda refere-se a células hospedeiras trans- formadas com um polinucleotídeo ou vetor da invenção. A dita célula hospe- deira pode ser uma célula procariótica ou eucariótica. O polinucleotídeo ou vetor da invenção que está presente na célula hospedeira pode ser integra- do ao genoma da célula hospedeira ou pode ser mantido extracromosso- malmente. A célula hospedeira pode ser qualquer célula procariótica ou eu- cariótica, tal como uma célula de inseto, fungo, planta, animal ou ser huma- no. As células de fungos preferidas, por exemplo, aquelas do genus Saeeha- romyces, em particular aquelas da espécie S. cerevisiae. O termo "procarió- tico" significa incluir todas as bactérias que possam ser transformadas ou transfectadas com as moléculas de DNA ou RNA para a expressão de um anticorpo da invenção ou das cadeias de imunoglobulinas correspondentes. Os hospedeiros procarióticos podem incluir bactérias gram negativas como gram positivas tais como, por exemplo, E. coli, S. typhimurium, Serratia mar- cescens e Bacillus subtilis. O termo "eucariótico" significa incluir levedo, planta vascular, inseto e preferivelmente células mamíferas, mais preferivel- mente células HEK 293, NSO e CHO. Dependendo do hospedeiro emprega- do em um procedimento de produção recombinante, os anticorpos ou cadei- as de imunoglobulinas codificados pelo polinucleotídeo da presente invenção podem ser glicosilados ou podem ser não glicosilados. Anticorpos da inven- ção ou das cadeias de imunoglobulinas correspondentes podem também incluir um resíduo de aminoácido de metionina inicial. Um polinucleotídeo da invenção pode ser usado para transformar ou transfectar o hospedeiro u- sando qualquer uma das técnicas comumente conhecidas por aqueles ver- sados na técnica. Além disso, métodos para preparação de genes fundidos, operavelmente ligados e para expressão dos mesmos em, por exemplo, cé- lulas mamíferas e bactérias são bem-conhecidos na técnica (Sambrook, Mo- lecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY1 1989). Os constructos e métodos genéticos descritos ali podem ser utilizados para expressão do anticorpo da invenção ou de cadei- as de imunoglobulinas correspondentes em hospedeiros eucarióticos ou procarióticos. Em geral, vetores de expressão contendo seqüências de pro- motores que facilitam a transcrição eficiente do polinucleotídeo inserido são usados em relação com o hospedeiro. O vetor de expressão normalmente contém uma origem de replicação, um promotor e um exterminador, como também genes específicos que são capazes de propiciar a seleção fenotípi- ca das células transformadas. As células de fontes adequadas para as se- qüências de DNA e as células hospedeiras para a expressão e secreção da imunoglobulina podem ser obtidas a partir de inúmeras fontes, tais como a publicação American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas", Fifth edition (1985) Rockville, Maryland1 EUA, que está incor- porada aqui como referência). Além disso, animais trangênicos, preferivel- mente mamíferos, compreendendo células da invenção podem ser usados para a produção em larga escala de anticorpos da invenção.

Assim, em outra modalidade, a presente invenção refere-se a um método para a produção de uma molécula de aglutinação específica à proteína associada ao distúrbio, por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de aglutinação ou sua(s) cadeia(s) de imunoglobulinas, o dito método com- preendendo

(a) Exposição de uma célula à cultura conforme descrito acima; e

(b) Isolamento do dito antígeno, da molécula de aglutinação, do an- ticorpo ou do fragmento de aglutinação ou de sua(s) cadeia(s) de imunoglo- bulina da cultura.

Hospedeiros transformados podem ser cultivados em fermenta- dores e expostos à cultura de acordo com as técnicas conhecidas na técnica para obtenção do crescimento ideal das células. Uma vez expressos, os an- ticorpos totais, seus dímeros, cadeias leves e pesadas individuais ou outras formas de imunoglobulinas da presente invenção, podem ser purificados de acordo com os procedimentos padrão da técnica, incluindo precipitação de sulfato de amônio, colunas de afinidade, cromatografia de colunas, eletrofo- rese de gel e similares; ver, Scopes, "Protein Purification", Springer Verlag, N.Y. (1982). O anticorpo ou sua(s) cadeia(s) de imunoglobulina(s) corres- pondente(s) da invenção podem então ser isolados do meio de cultivo, dos Iisatos celulares ou das porções das membranas celulares. O isolamento e a purificação dos, por exemplo, anticorpos ou cadeias de imunoglobulinas ex- pressos recombinantemente da invenção podem se dar através de qualquer meio convencional tais como, por exemplo, separações cromatográficas preparatórias ou separações imunológicas tais como aquelas envolvendo o uso de anticorpos monoclonais ou policlonais direcionados, por exemplo, contra a região constante do anticorpo da invenção. Será evidente àqueles versados na técnica que os anticorpos da invenção podem ser ainda acopla- dos as outras porções para, por exemplo, aplicações de direcionamento e formação da imagem em fármaco. Tal acoplamento pode ser conduzido quimicamente após a expressão do anticorpo ou do antígeno ao sítio de fi- xação ou o produto do equipamento pode ser projetado para o anticorpo ou antígeno da invenção no nível do DNA. Os DNAs são então expressos em um sistema de hospedeiros adequado e as proteínas expressas são coleta- das e recaracterizadas, se necessário.

As imunoglobulinas substancialmente puras de pelo menos cer- ca de 90 a 95% de homogeneidade são preferidas e de 98 a 99% ou mais de homogeneidade mais preferidas, para usos farmacêuticos. Uma vez puri- ficados, parcialmente ou até a homogeneidade, conforme desejado, os anti- corpos podem, então, ser usados terapeuticamente (incluindo extra corpo- ralmente) ou no desenvolvimento ou realização de procedimentos de ensai- os.

A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois vetores de expressão da invenção, o primeiro vetor codificando um polipeptídeo de- rivado de cadeia pesada e o segundo vetor codificando um polipeptídeo de- rivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores selecioná- veis idênticos que possibilitam a expressão igual de polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Alternativamente, um vetor único pode ser usado que codifica ambos polipeptídeos de cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve é colocada com vantagem antes da cadeia pesada para impedir um ex- cesso de cadeia pesada sem toxicidade (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Nati Acad. Sei. USA 77:2197 (1980)). As seqüências codifica- dores para as cadeias pesada e leve podem compreender o cDNA ou o DNA genômico.

Conforme usado aqui, o termo "células hospedeiras" refere-se a células que acolhem vetores construídos usando técnicas de DNA recombi- nante e codificando pelo menos um gene heterólogo. Em descrições dos processos para isolamento de anticorpos dos hospedeiros recombinantes, os termos "célula" e "cultura de células" são usados intercambiavelmente para denotar a fonte do anticorpo, a menos que esta esteja claramente es- pecificada de outro modo. Em outras palavras, a recuperação do polipeptí- deo das "células" pode significar a partir das células totais dilatadas ou de cultura de células contendo ambas as células do meio e suspensas.

Uma variedade de sistemas de vetor de expressão de hospedei- ro pode ser utilizada para expressar moléculas de anticorpos para uso nos métodos descritos aqui. Tais sistemas de expressão de hospedeiros repre- sentam veículos pelos quais as seqüências codificadoras podem ser produ- zidas e subseqüentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as seqüências co- dificadoras de nucleotídeos apropriados, expressar uma molécula de anti- corpo da invenção in situ. Estas incluem, entre outras, a micro-organismos tais como bactérias (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformados com ve- tores de expressão de DNA de bacteriófago recombinante, DNA plasmídeo ou DNA cosmídeo contendo seqüências de codificação de anticorpos; Ieve- do (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformados com vetores de expressão de Ievedo recombinantes contendo seqüências codificadoras de anticorpos; sistemas de células de insetos infectados com vetores de ex- pressão de vírus recombinante (por exemplo, baculovirus) contendo seqüên- cias codificadoras de anticorpos; sistemas de células de plantas infectadas com vetores de expressão de vírus recombinante (por exemplo, vírus mosai- co de couve-flor, CaMV; vírus mosaico de tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (por exemplo, plas- mídeo Ti) contendo seqüências codificadoras de anticorpos; ou sistemas de células mamíferas (por exemplo, células COS, CHO, BLK, 293, 3T3) aco- lhendo constructos de expressão recombinantes contendo promotores deri- vados do genoma das células mamíferas (por exemplo, promotor de metalo- tioneína) ou de vírus mamíferos (por exemplo, o promotor tardio do adenoví- rus, o promotor 7,5K do vírus vaccinia). Preferivelmente, células bacterianas tais como Escherichia coli e mais preferivelmente, células eucarióticas, es- pecialmente para a expressão da molécula de anticorpo recombinante total, são usadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, células mamíferas tais como células ovarianas de hamster chi- nês, em conjunto com um vetor tal como o elemento promotor do gene pre- coce intermediário principal do citomegalovírus humano são um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et ai., Gene 45:101 (1986); Coc- kett et ai., BioiTechnoiogy 8:2 (1990)).

A linha de células hospedeiras usada para expressão da proteí- na é freqüentemente de origem mamífera: aqueles versados na técnica têm a capacidade de preferencialmente determinar linhas de células hospedeiras em particular que são mais adaptadas ao produto de gene desejado a ser expresso ali. Linhas de células hospedeiras exemplares incluem, entre ou- tras, CHO (Ovário de Hamster Chinês), DG44 e DUXB11 (linhas de Ovários de Hamster Chinês, DHFR menos), HELA (carcinoma cervical humano), CVI (linha de rim de macaco), COS (um derivado de CVI com antígeno SV40 T), VERY, BHK (rim de hamster bebê), MDCK, 293, WI38, R1610 (fibroblasto de hamster chinês) BALBC/3T3 (fibroblasto de camundongo), HAK (linha de rim de hamster), SP2/0 (mieloma de camundongo), P3x63-Ag3.653 (mieloma de camundongo), BFA-1c1BPT (células endoteliais bovinas), RAJI (linfócito humano) e 293 (rim humano). Células CHO são particularmente preferidas. As linhas de células hospedeiras encontram-se normalmente disponíveis através dos serviços comerciais, da The American Tissue Culture Collection ou da literatura publicada.

Além disso, uma cepa de células hospedeiras pode ser escolhi- da que module a expressão das seqüências inseridas ou modifique e pro- cesse o produto de genes no modo específico desejado. Tais modificações (por exemplo, a glicosilação) e o processamento (por exemplo, a clivagem) dos produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem características e mecanismos es- pecíficos para o processamento pós-tradução e modificação das proteínas e produtos de genes. As linhas de células apropriadas ou sistemas hospedei- ros podem ser escolhidos para assegurar a modificação e o processamento corretos da proteína estrangeira expressa. Para esta finalidade, as células hospedeiras eucarióticas que possuem o maquinário celular para processa- mento apropriado do transcrito primário, da glicosilação e fosforilação do produto dos genes podem ser usadas.

Para produção de longo prazo, de alto rendimento de proteínas recombinantes, a expressão estável é preferida. Por exemplo, linhas das células que expressam estavelmente a molécula do anticorpo podem ser projetadas. Em vez de usar vetores de expressão que contenham origens vitais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com o DNA controlado pelos elementos de controle de expressão apropriados (por exemplo, promotor, potencializador, seqüências, exterminadores de transcri- ção, sítios de polidadenilação, etc.) e um marcador selecionável. Em seguida à introdução do DNA estrangeiro, pode se deixar as células projetadas cres- cerem por 1-2 dias em meios enriquecidos, e então, serem comutadas para meios seletivos. O marcador selecionável no plasmídeo recombinante confe- re resistência à seleção e permite que as células estavelmente integrem o plasmídeo em seus cromossomas e cresçam para formar foci que, por sua vez, podem ser clonados e expandidos para linhas de células. Este método pode, com vantagem, ser usado para projetar linhas de células que estavel- mente expressam a molécula do anticorpo.

Inúmeros sistemas de seleção podem ser usados, incluindo, en- tre outros, a cinase de timidina de vírus herpes simplex (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), fosforribosiltransferase de ipoxantina-guanina (Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992)) e os genes de fosforri- bosiltransferase de adenina (Lowy et ai, Cell 22:817 1980) podem ser em- pregados em células tk-, hgprt- ou aprt, respectivamente. Também, a resis- tência antimetabólito pode ser usada como base da seleção para os genes seguintes: dfr, que confere resistência ao metrotrexato (Wigler et ai, Natl. Acad. Sei. USA 77:357 (1980); O1Hare et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resis- tência ao aminoglicosídeo G-418 Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacoi Toxicoi 32:573-596 (1993); Mulligan, Science 260:926-932 (1993); and Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993); TIB TECH 11(5): 155-215 (May, 1993); e hygro, que confere resistênica à higromicina (Santerre et ai, Gene 30:147 (1984). Métodos comumente conhecidos na técnica da tecno- logia do DNA recombinante que podem ser usados, são descritos em Au- subel et ai (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Ma- nual, Stockton Press, NY (1990); e nos capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al. J. Mol. Biol. 150:1 (1981), que são incorporados nes- te documento como referência em sua totalidade.

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados pela amplificação do vetor (para uma revisão, ver Bebbing- ton and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Academic Press, New York, Vol. 3. (1987)). Quando um marcador no sistema de veto- res que expressa o anticorpo for amplificável, o aumento no nível do inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentar o número de cópias do gene do marcador. Visto que a região amplificada é associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo também aumentará (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)).

A produção in vitro permite a escala ascendente para propiciar grandes quantidades dos polipeptídeos desejados. Técnicas para cultivo de células mamíferas sob condições de cultura de tecidos são conhecidas na técnica e incluem cultura de suspensão homogênea, por exemplo, em um reator suspenso ou em um reator contínuo de agitador ou cultura celular i- mobilizada ou presa, por exemplo, em fibras ocas, microcápsulas, em micro- esferas de agarose ou cartuchos de cerâmica. Se necessário, e/ou deseja- do, as soluções de polipeptídeos pode ser purificada pelos métodos usuais de cromatografia como, por exemplo, filtração em gel, cromatografia de troca iônica, cromatografia sobre DEAE-celulose ou cromatografia de (imuno- )afinidade, por exemplo, após a biossíntese preferencial de um polipeptídeo de região de dependência sintética ou antes de ou após a etapa de croma- tografia HIC exposta aqui.

Genes que codificam anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígenos, variantes ou seus derivados da invenção podem também ser ex- pressos de células não-mamíferas tais como de bactérias ou insetos ou fun- gos ou células de plantas. As bactérias que facilmente absorvem ácidos nu- cleicos incluem membros do Enterobacteriaceae, como cepas de Escheri- chia coii e Salmoneila\ Bacillaceae, tais como Baciilus subtilis; Pneumococ- eus\ Streptoeoeeus e Haemophilus influenzae. Será ainda observado que, quando expresso em bactérias, os polipeptídeos heterólogos normalmente tornam-se parte dos corpos de inclusão. Os polipeptideos heterólogos de- vem ser isolados, purificados e posteriormente agrupados em moléculas funcionais. Quando as formas tetravalentes dos anticorpos forem desejadas, as subunidades se auto-agruparão em anticorpos tetravalentes (W002/096948A2).

Em sistemas bacterianos, inúmeros vetores de expressão po- dem ser, com vantagem, selecionados dependendo do uso pretendido para a molécula de anticorpo sendo expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade deste tipo de proteína deve ser produzida, para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, vetores que dire- cionam a expressão de altos níveis de produtos de proteínas de fusão que são prontamente purificados podem ser desejáveis. Esses vetores incluem, entre outros, o vetor pUR278 de expressão do Ei coli, mas não se limitam a este. (Ruther et ai, EMBO J. 2:1791 (1983)), no qual o anticorpo que codifi- ca a seqüência pode ser ligado individualmente no vetor na moldura com a região de codificação 1acZ, de modo que a proteína de fusão é produzida; vetores pIN (Inouye & lnouye, NucIeicAcids Res. 13:3101-3109 (1985); Van Heeke & Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)) e similares. Os veto- res pGEX podem também ser usados para expressar os polipeptideos es- trangeiros como proteínas de fusão com a glutationa S-transferase (GST).

Em geral, essas proteínas de fusão são solúveis e podem facilmente ser pu- rificadas a partir de células Iisadas por adsorção e com aglutinação às esfe- ras de glutationa-agarose da matriz seguido pela extração na presença de glutationa livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir sítios de trom- bina ou clivagem de protease de fator Xa de modo que o produto do gene alvo clonado pode ser liberado de uma porção de GST.

Além de procariotes, micróbios eucarióticos também podem ser utilizados. Saccharomyces eerevisiae ou Ievedo comum de padaria, é o mais comumente usado dentre os micro-organismos eucarióticos, embora uma série de outras cepas seja comumente disponível, por exemplo, Piehia pastoris.

Para a expressão em Saccharomyces, o plasmídeo YRp7, por exemplo, (Stinchcomb et al., Nature 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene 10:157 (1980)) é comumente utilizado. Este plasmídeo já contém o gene TRP1 que determina um marcador de se- leção para uma cepa mutante de Ievedo sem a capacidade de crescer em triptofano, por exemplo ATCC N°. 44076 ou PEP4-1 (Jones, Genetics 85:12 (1977)). A presença da lesão trpl como uma característica do genoma da célula hospedeira do levedo então propicia um ambiente eficaz para detectar a transformação pelo crescimento na ausência de triptofano.

Em um sistema de insetos, o vírus Autographa californica da po- liedrose nuclear (AcNPV) é normalmente usado como um vetor para expres- sar genes estranhos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A seqüência de codificação do anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não-essenciais (por exemplo, o gene poliedrina) do vírus e coloca- dos sob controle de um promotor AcNPV (por exemplo, o promotor poliedri- na).

Uma vez que a molécula de um anticorpo da invenção tenha si- do recombinantemente expressa, ela pode ser purificada por qualquer méto- do conhecido na técnica para a purificação de uma molécula imunoglobulina, por exemplo, por cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, espe- cialmente por afinidade para o antígeno específico após a Proteína A e pela cromatografia de coluna dimensionadora), centrifugação, solubilidade dife- rencial ou por qualquer outra técnica-padrão para a purificação de proteínas. Alternativamente, um método preferido para o aumento da afinidade de anti- corpos da invenção é descrito em E.U. 2002 0123057 A1. VI. Proteínas de fusão e conjugados

Os anticorpos da presente invenção podem incluir um novo do- mínio, o dito domínio sendo ligado por ligações covalentes ou não covalen- tes. A ligação pode ser baseada na fusão genética de acordo com os méto- dos conhecidos na técnica e descritos acima ou pode ser realizada através, por exemplo, da ligação cruzada química, conforme descrição, por exemplo, no pedido internacional W094/04686. O domínio adicional presente na pro- teína de fusão que inclui o anticorpo da invenção pode ser preferencialmente ser ligado por um Iigador flexível, com vantagem um Iigador de polipeptídeo, em que o dito Iigador de polipeptídeo compreende aminoácidos ligados a peptídeos, hidrofílicos, plurais de comprimento suficiente para abranger a distância entre a extremidade de terminação-C do dito outro domínio e a ex- tremidade de terminação N do anticorpo da invenção ou vice-versa. O agen- te terapêutico ou diagnosticamente ativo pode ser acoplado ao anticorpo da invenção ou a um fragmento de aglutinação a antígeno seu por diversos meios. Isto inclui, por exemplo, proteínas de fusão de cadeia única compre- endendo as regiões variáveis do anticorpo da invenção acopladas por méto- dos covalentes, tais como ligações peptídicas, ao agente terapêutica ou di- agnosticamente ativo. Outros exemplos são moléculas que incluem pelo menos um fragmento de aglutinação a antígeno acoplado às moléculas adi- cionais, covalentemente ou não covalentemente incluem aqueles na lista ilustrativa não-limitantea seguinte. Traunecker, Int. J. Câncer Surp. SuDP 7 (1992), 51-52, descrevem o reagente bioespecífico janusin no qual a região Fv dirigida ao CD3 é acoplada ao CD4 solúvel ou a outros ligantes, tais co- mo OVCA e IL-7. Do mesmo modo, as regiões variáveis do anticorpo da in- venção podem ser construídas nas moléculas Fv e acopladas a ligantes al- ternativos tais como aqueles ilustrados no citado artigo. Higgins1 J. Infect Disease 166 (1992), 198-202, descreveu um anticorpo hetero-conjugado composto de OKT3 ligado cruzadamente a um anticorpo direcionado a uma seqüência específica na região V3 do GP120. Tais anticorpos hetero- conjugados podem também ser construídos usando pelo menos as regiões variáveis contidas no anticorpo dos métodos da invenção. Exemplos adicio- nais de anticorpos específicos incluem aqueles descritos por Fanger, Câncer Treat. Res. 68 (1993), 181-194 e por Fanger, Crit. Rev. Immunol. 12 (1992), 101-124.

Em uma nova modalidade da presente invenção, a molécula de aglutinação, o anticorpo, a cadeia de imunoglobulina ou um fragmento de aglutinação seu ou o antígeno é rotulado de forma detectável. Agentes rotu- Iadores podem ser acoplados quer direta ou indiretamente aos anticorpos ou antígenos da invenção. Um exemplo de acoplamento indireto se dá através da utilização de uma porção espaçadora.

Assim, a atividade biológica das moléculas de aglutinação, por exemplo, anticorpos aqui identificados, sugere que eles tenham afinidade suficiente para torná-los candidatos potenciais à localização do fármaco para células expressando as estruturas superficiais da célula e do tecido doentes, respectivamente. Este direcionamento e aglutinação às células poderiam ser úteis para a produção de agentes terapeuticamente ou diagnosticamente ativos e para a produção de genes/terapia de genes. As moléculas/partículas com um anticorpo da invenção se aglutinariam especificamente às célu- las/tecidos expressando a forma variante da proteína patológica e, portanto, poderiam ter uso diagnóstico e terapêutico. Assim, a molécula de aglutina- ção, por exemplo, o anticorpo ou seu fragmento de aglutinação ao antígeno da presente invenção poderiam ser rotulados (por exemplo, metal fluores- cente, radioativo, enzima, magnético nuclear, pesado) e usados para detec- tar alvos in vivo ou in vitro, incluindo "imunoquímica" como testes in vitro. In vivo, eles poderiam ser usados de forma similar às técnicas de imagem de medicina nuclear para detectar tecidos, células ou outros materiais expres- sando o neoepítopo. Assim, em outra modalidade, a presente invenção refe- re-se ao uso de uma molécula de aglutinação ou a um anticorpo da presente invenção ou ao seu fragmento de aglutinação para a preparação de uma composição para detecção in vivo de direcionamento ou de um agente tera- pêutico e/ou diagnóstico para uma proteína associada ao distúrbio sem cé- rebro, detectando, suprimindo ou reduzindo a formação de agregados de proteínas ou conformações patológicas em um sujeito, para aperfeiçoamento da cognição ou retardamento ou reversão do declínio cognitivo associado a doenças ou para extração extra-corpórea de compostos patológicos ou seus precursores dos fluidos corporais.

Em certas modalidades, o polipeptídeo do anticorpo compreende uma seqüência de aminoácidos ou uma ou mais porções não normalmente associadas com um anticorpo. Modificações exemplares são descritas mais detalhadamente abaixo. Por exemplo, um fragmento de anticorpo fv de ca- deia única da invenção pode compreender uma seqüência de Iigadores fie- xíveis ou pode ser modificado para adicionar uma metade funcional (por e- xemplo, PEG1 um fármaco, uma toxina ou um rótulo.)

Um polipeptídeo de anticorpo da invenção pode compreender, consistir essencialmente em ou consistir em uma proteína de fusão. As pro- teínas de fusão são moléculas quiméricas, que incluem, por exemplo, um domínio de aglutinação a antígeno de imunoglobulina com pelo menos um sítio de aglutinação de alvo e pelo menos uma porção heteróloga, isto é, uma porção com a qual ela não está naturalmente ligada na natureza. As seqüências de aminoácidos podem normalmente existir em proteínas sepa- radas que são reunidas no polipeptídeo de fusão ou podem normalmente existir na mesma proteína, mas são colocadas em um novo arranjo no poli- peptídeo de fusão. As proteínas de fusão podem ser criadas, por exemplo, por síntese química ou através da criação e tradução de um polinucleotídeo em que as regiões de peptídeos são codificadas na relação desejada.

O termo "heterólogos", tal como aplicado a um polinucleotídeo ou a um polipeptídeo, significa que o polinucleotídeo ou o polipeptídeo é de- rivado de uma entidade distinta daquela do restante da entidade à qual ele está sendo comparado. Por exemplo, tal como utilizado aqui, um "polipetí- deo heterólogo" a ser fundido a um anticorpo ou um fragmento de aglutina- ção a antígeno, variante ou análogo seu, é derivado de um polipeptídeo não de imunoglobulina da mesma espécie ou de um polipeptídeo de imunoglobu- lina ou não de imunoglobulina de uma espécie diferente.

Conforme discutido em mais detalhes em outros pontos aqui, os anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus deri- vados da invenção poderão ser ainda recombinantemente fundidos a um polipeptídeo heterólogo na terminação N- ou C- ou quimicamente conjuga- dos (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) aos polipeptídeos ou outras composições. Por exemplo, os anticorpos podem ser recombinan- temente fundidos ou conjugados a moléculas úteis como rótulos nos ensaios de detecção e nas moléculas executoras tais como polipeptídeos heterólo- gos, fármacos, radionuclídeos ou toxinas. Vide por exemplo, as publicações PCT WO 92/08495, WO 91/14438, WO 89/12624; Patente dos EUA N°. 5.314.995; e PE 396.387.

Anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus derivados da invenção podem ser compostos de aminoácidos uni- dos uns aos outros pelas ligações de peptídeos ou por ligações de peptídeos modificados, ou seja, isósteres de peptídeos e podem conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados com gene. Os anticorpos podem ser modificados por processos naturais, tais como processamento pós- tradução ou por técnicas de modificação química que são bem-conhecidas na técnica. Tais alterações são bem descritas em textos básicos e em mo- nografias mais detalhadas, bem como em volumosa literatura de investiga- ção. As alterações podem ocorrer em qualquer lugar do anticorpo, incluindo a espinha dorsal do peptídeo, as cadeias laterais de aminoácidos e as termi- nações amino e carboxila ou em porções tais como carboidratos. Será ob- servado que o mesmo tipo de alteração pode estar presente no mesmo grau ou em diferentes graus em diversos sites em um determinado anticorpo. A- lém disso, um dado anticorpo pode conter vários tipos de modificações. Os anticorpos podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiqi- tinação e eles podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Anticorpos cícli- cos, ramificados e cíclicos ramificados podem resultar de processos naturais pós-tradução ou podem ser produzidos pelos métodos sintéticos. As modifi- cações incluem acetilação, acilação, ribosilação-ADP, amidação, fixação covalente de flavina, fixação covalente de uma porção heme, fixação cova- Iente de um nucleotídeo ou derivado de nucleotídeo, fixação covalente de um lipídio ou derivado de lipídio, fixação covalente de fosfatidilinositol, Iiga- ção cruzada, ciclização, formação de ligação de dissulfeto, desmetilação, formação de ligações covalentes cruzadas, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodinação, metilação, miristoilação, oxidação, pegilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada de RNA-de-transferência de ami- noácidos para proteínas tais como arginilação e utiquitinação. (Vide por e- xemplo, Proteins - Structures and molecular properties, Τ. E. Creighton, W. Η. Freeman and Company1 New York, 2nd Ed. (1993); Postranslational Co- valent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Ed. Academic Press, New York, pgs. 1-12 (1983) ; Seifter et ai, Meth Enzymol 182: 626-646 (1990); Rattan et al„ Ann NYAcad Sci 663:448-62 (1992).

A presente invenção também propicia proteínas de fusão com- preendendo um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado e polipeptídeo heterólogo. Em uma modalidade, uma prote- ína de fusão da invenção compreende, consiste essencialmente em ou con- siste em um polipeptídeo contendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões VH de um anticorpo da invenção ou a seqüência de aminoácidos de qualquer uma ou mais das regiões VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos ou variantes suas e uma seqüência heteróloga de polipeptídeos. Em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso em métodos de diagnóstico e tratamento aqui descritos compreende, consiste essencialmente em ou consiste em um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das VH-CDRs de um anticorpo ou de fragmentos, variantes, ou derivados seus ou a seqüência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três das VL-CDRs de um anticorpo ou fragmentos, variantes ou seus derivados e uma seqüência de polipeptídeos heterólogos. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um polipeptídeo ten- do a seqüência de aminoácidos, uma VH-CDR3 de um anticorpo do presen- te invenção ou fragmento, derivado ou variante e uma seqüência heteróloga de polipeptídeos, que especificamente se liga a proteínas de fusão em me- nos um neoepítopo de um distúrbio associado à proteína. Em outra modali- dade, uma proteína de fusão compreende um polipeptídeo tendo a seqüên- cia de aminoácidos de pelo menos uma região de VH de um anticorpo da invenção e a seqüência de pelo menos uma região de VL de um anticorpo da invenção ou fragmentos, derivados ou variantes seus e uma seqüência de polipeptídeos heterólogos. Preferencialmente, as regiões VH e VL da pro- teína de fusão correspondem a um anticorpo de única fonte (ou fragmento de scFv ou Fab), que especificamente aglutina pelo menos um neoepítopo de uma proteína associada ao distúrbio. Em outra modalidade, uma proteína de fusão para uso nos métodos de diagnóstico e tratamento descritos aqui compreende um polipeptídeo tendo a seqüência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das VH CDRs de um anticorpo e a seqüência de aminoácidos de qualquer uma, duas, três ou mais das VL CDRs de um anti- corpo ou fragmentos ou variantes e uma seqüência heteróloga de polipeptí- deos. Preferivelmente, duas, três, quatro, cinco, seis ou mais das VH-CDR (s) ou LV-CDR (s) correspondem a um anticorpo de uma única fonte (ou fragmento de scFv ou Fab) da invenção. Moléculas de ácido nucleico que codificam estas proteínas de fusão são também contempladas pela inven- ção.

Proteínas de fusão exemplares reportadas na literatura incluem fusões do receptor de células T (Gascoigne et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:2936-2940 (1987)); CD4 (Capon et al., Nature 337:525-531 (1989); Trau- necker et al., Nature 339:68-70 (1989); Zettmeissl et al., DNA Cell Biol. USA 9:347-353 (1990); e Byrn et al., Nature 344:667-670 (1990)); L-selectin (re- ceptor homing) (Watson et al., J. Cell. Biol. 110:2221-2229 (1990); e Watson et al., Nature 349:164-167 (1991)); CD44 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313

(1990)); CD28 e B7 (Linsley et al., J. Exp. Med. "/73:721-730 (1991)); CTLA- 4 (Lisley et ai, J. Exp. Med. 174:561-569 (1991)); CD22 (Stamenkovic et al.,

Cell 66:1133-1144 (1991)); receptor TNF (Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10535-10539 (1991); Lesslauer et ai, Eur. J. Immunol. 27:2883- 2886 (1991); e Peppel et ai, J. Exp. Med. 174:1483-1489 (1991)); e IgE re- ceptor a (Ridgway e Gorman, J. Celi Biol. Voi 115, Abstract No. 1448 (1991)).

Conforme discutido noutro lugar neste relatório, os anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antigeno, variantes ou seus derivados da in- venção podem ser fundidos aos polipeptídeos heterólogos para aumentar a meia vida in vivo dos polipeptídeos ou para uso em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, em uma modalidade, PEG pode ser conjugado aos anticorpos da invenção para aumentar sua meia vida in vivo. Leong, S.R., et al., Cytokine 16:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); ou Weir et ai., Biochem. Soe. Transactions 30:512 (2002).

Além disso, os anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antí- geno, variantes ou seus derivados da invenção podem ser fundidos às se- qüências de marcador, tal como um peptídeo para facilitar sua purificação ou detecção. Em modalidades preferidas, a seqüência de aminoácidos de mar- cador é um peptídeo de hexa-histidina, tal como o rótulo propiciado em um vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, Califórnia, 91311), entre outros, muitos dos quais são comercialmente disponíveis. Conforme descrito em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. E.U.A. 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina propicia a purificação conveniente da proteína de fusão. Outros rótulos de peptídeos úteis para purificação inclu- em, entre outros, o rótulo "HA", o qual corresponde a um epitopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e ao rótulo "bandeira".

As proteínas de fusão podem ser preparadas usando métodos que são bem-conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Patente U.S. n°S. 5.116.964 e 5.225.538). O local exato no qual se dá a fusão pode ser sele- cionado empiricamente para otimizar as características de secreção ou aglu- tinação da proteína de fusão. O DNA que codifica a proteína de fusão é, en- tão, transfectado para uma célula hospedeira para a expressão.

Os anticorpos da presente invenção podem ser usados em for- ma não conjugada ou podem ser conjugados com pelo menos uma de uma variedade de moléculas, por exemplo, para melhorar as propriedades tera- pêuticas da molécula, para facilitar a detecção alvo ou a formação de ima- gem ou terapia do paciente. Os anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno ou seus derivados da invenção podem ser rotulados ou conjugados que antes ou após a purificação, quando a purificação for realizada.

Em particular, os anticorpos ou fragmentos de aglutinação a an- tígeno, variantes ou seus derivados da invenção podem ser conjugados com agentes terapêuticos, pró-farmacos, peptídeos, proteínas, enzimas, vírus, lipídios, modificadores da resposta biológica, agentes farmacêuticos ou PEG. Conjugados que são imunotoxinas incluindo anticorpos conven- cionais foram amplamente descritos na técnica. As toxinas podem ser aco- pladas aos anticorpos pelas técnicas convencionais de acoplamento ou imu- notoxinas contendo porções de toxinas de proteínas podem ser produzidas como proteínas de fusão. Os anticorpos da presente invenção podem ser usados em uma forma correspondente para obter tais imunotoxinas. Exem- plos de tais imunotoxinas são aqueles descritos por Byers1 Seminars Cell. Biol. 2 (1991), 59-70 e por Fanger1 lmmunol. Today 12 (1991), 51-54

A proteína de fusão descrita acima pode ainda compreender um ligador clivável ou sítio de clivagem para proteinases. Estas porções espa- çadoras, por sua vez, podem ser solúveis ou insolúveis (Diener et ai, Scien- ce 231 (1986), 148) e podem ser selecionadas para permitir a liberação do fármaco do antígeno no sítio alvo. Exemplos de agentes terapêuticos que podem ser acoplados aos anticorpos ou antígenos da presente invenção para imunoterapia são fármacos, radiosótopos, Iectinas e toxinas. Os fárma- cos com as quais pode haver a conjugação com os anticorpos ou antígenos da presente invenção incluem compostos que são classicamente referidos como fármacos tais como mitomicina C, daunorrubicina e vinblastina. Na utilização de anticorpos ou antígenos conjugados radioisotopicamente da invenção para, por exemplo, imunoterapia, certos isótopos podem ser mais preferíveis do que outros dependendo de tais fatores como a distribuição de leucócitos como também a estabilidade ou emissão. Dependendo da respos- ta autoimune, alguns emissores podem ter preferência sobre outros. Em ge- ral, radioisótopos emissores de partículas α e β são preferidos na imunote- rapia. Preferidos são os emissores de alta energia, e de curta faixa tais como 212Bi. Exemplos de radioisótopos que podem ser aglutinados a anticorpos ou antígenos da invenção para fins terapêuticos incluem, entre outros, I125, I131, 90Y, 67Cu, 64Cu, 212Bi, 212At, 47Pb, 109Sc, Pd e 188Re. Outros agentes tera- pêuticos que podem ser acoplados à molécula de aglutinação, por exemplo, o anticorpo ou o fragmento de aglutinação a antígeno seu da invenção, co- mo também protocolos terapêuticos ex vivo e in vivo, são conhecidos ou po- dem ser facilmente verificados por aqueles versados na técnica. Sempre que apropriado, a pessoa versada na técnica poderá usar um polinucleotídeo da invenção que codifica um dos anticorpos acima descritos, antígenos ou os vetores correspondentes em vez do próprio material proteico.

Aqueles versados na técnica observarão que os conjugados também podem ser agrupados usando uma variedade de técnicas depen- dendo do agente selecionado a ser conjugado. Por exemplo, os conjugados com biotina são preparados, por exemplo, pela reação de um polipeptídeo aglutinante com um éster de biotina ativado tal como o éster de N- hidroxissucinimida de biotina. Similarmente, os conjugados com um marca- dor fluorescente podem ser preparados na presença de um agente de aco- plamento, por exemplo, aqueles listados neste relatório ou pela reação com isotiocianato, preferivelmente isotiocianato-fluoresceína. Os conjugados dos anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus deri- vados da invenção são preparados de forma análoga.

A presente invenção ainda abrange anticorpos ou fragmentos de aglutinação a antígeno, variantes ou seus derivados da invenção conjugados com um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpos podem ser u- sados diagnosticamente para, por exemplo, monitorar o desenvolvimento ou progressão de uma doença neurológica como parte de um procedimento de teste clínico para, por exemplo, determinar a eficácia de um dado regime de prevenção e/ou tratamento. A detecção pode ser facilitada pelo acoplamento do anticorpo ou fragmento de aglutinação de antígeno, variante ou seu deri- vado a uma substância detectável. Exemplos de substâncias detectáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materi- ais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de pósitron usando várias tomografias de emissão de pósitron e íons metálicos paramagnéticos não radioativos. Vide por exemplo, a patente dos U.S. N°. 4.741.900 para íons metálicos que podem ser conjugados com anticorpos para uso como diagnósticos de acordo com a presente invenção. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de raiz forte, fosfatase alcalina, β-galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupos prostéticos incluem streptavidin/biotin e avidin/biotin; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isoti- ocianato de fluoresceína, rodamina, fluoresceína de diclorotriazinilamina, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material Iuminescente inclui luminol; exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina e aquorina; e exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 111In ou 99Tc.

Um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado também pode ser rotulado de forma detectável através seu acoplamento a um composto quimioluminescente. A presença do anticorpo rotulado como quimioluminescente é então determinada pela detecção da presença de luminescência que surge durante o curso de uma reação quími- ca. Exemplos de compostos rotulantes quimioluminescentes particularmente úteis são o luminol, isoluminol, éster de acridínio teromático, imidazole, sal de acridínio e éster de oxalato.

Um dos meios pelos quais um anticorpo ou fragmento de agluti- nação a antígeno, variante ou seu derivado pode ser rotulado de forma de- tectável é através da ligação do mesmo a uma enzima e pelo uso de um pro- duto ligado em um imunoensaio de enzimas (EIA) (Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)" Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md., Diagnostic Horizons 2:1-7 (1978)); Voller et al., J. Clin. Pathol. 31:507-520 (1978); Butler, J. E., Meth. Enzymol. 73:482- 523 (1981); Maggio, E. (ed.), Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Ra- ton, Fla., (1980); Ishikawa, E. et ai, (eds.), Enzyme lmmunoassay, Kgaku Shoin, Tóquio (1981). A enzima, que é aglutinada ao anticorpo irá reagir com um substrato adequado, de preferência um substrato cromogênico, de forma a produzir uma porção química que pode ser detectada, por exemplo, por espectrofotometria, fluorimetria ou por meios visuais. As enzimas que podem ser usadas para rotular de forma detectável o anticorpo incluem, entre ou- tras, desidrogenase de malato, nuclease estafilococcal, isomerase delta-5- esteroide, desidrogenase de álcool de levedo, alfa-glicerofosfato, desidroge- nase, isomerase fosfato de triose, peroxidase de raiz forte, fosfatase alcali- na, asparaginase, oxidase de glicose, beta-galactosidase, ribonuclease, ure- ase, catalase, desidrogenase de glicose-6-fosfato, glucoamilase e acetilcoli- nesterase. Além disso, a detecção pode ser realizada por métodos colorimé- tricos que empregam um substrato cromogênico para a enzima. A detecção também pode ser realizada por comparação visual da extensão da reação enzimática de um substrato, em comparação com padrões igualmente pre- parados.

A detecção também pode ser realizada usando qualquer um dentre uma variedade de outros imunoensaios. Por exemplo, através da marcação de forma radioativa do anticorpo ou do fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado, é possível detectar o anticorpo através da utilização de um radioimunoensaio (RIA) (vide, por exemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioli- gand Assay Techniques, The Endocrine Society, (March, 1986)), que são incorporados por referência neste documento). O isótopo radioativo pode ser detectado por meio de, entre outros, um contador gama, um contador de cintilação ou autorradiografia.

Um anticorpo ou fragmento de aglutinação a antígeno, variante ou seu derivado, pode também ser rotulado de forma detectável usando me- tais emissores de fluorescência tal como o 152Eu ou outros da série de Ian- tanida. Estes metais podem ser afixados ao anticorpo utilizando tais grupos quelantes como ácido dietilenotriaminopentacético (DTPA) ou ácido etileno- diaminotetracético (EDTA).

Técnicas para conjugar várias porções a um anticorpo ou frag- mento de aglutinação a antígeno, variante ou seus derivados deles são bem- conhecidos; vide por exemplo, Arnon et ai, "Monoclonal Antibodies For Im- munotargeting Of Drugs In Câncer Therapy", in Monoclonal Antibodies And Câncer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. (1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), Mareei Dekker, Inc., pp. 623-53 (1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Câncer Therapy: A Revi- ew", in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications, Pin- chera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And Future Pros- pective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Câncer The- rapy", in Monoclonal Antibodies For Câncer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), Academic Press pp. 303-16 (1985), and Thorpe et ai, "The Pre- paration And Cytotoxie Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58 (1982).

Em certas modalidades, uma porção que aumenta a estabilidade ou eficácia de uma molécula de aglutinação, por exemplo, um polipeptídeo de aglutinação, por exemplo, um anticorpo ou seu fragmento imunoespecífi- co, pode ser conjugado. Por exemplo, em uma modalidade, o PEG pode ser conjugado com as moléculas de aglutinação da invenção para aumentar a sua meia vida in vivo. Leong, S.R., et al., Cytokine 76:106 (2001); Adv. in Drug Deliv. Rev. 54:531 (2002); ou Weir et al., Biochem. Soe. Transactions 30:512 (2002).

VII. Composições e métodos de uso

Ademais, a presente invenção refere-se às composições com- preendendo a referida molécula de aglutinação, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de aglutinação ao antígeno da presente invenção ou seus derivados químicos ou o polinucleotídeo, vetor ou célula da invenção. A composição da presente invenção pode ainda compreender um veículo far- maceuticamente aceitável. O termo "derivado químico" descreve uma molé- cula que contém porções químicas adicionais que não são normalmente uma parte da molécula de base. Tais porções podem melhorar a solubilida- de, a meia vida, absorção, etc. da molécula de base. Alternativamente, as porções podem atenuar os efeitos colaterais indesejáveis da molécula de base ou diminuir a toxicidade da molécula de base. Além disso, a composi- ção farmacêutica da presente invenção pode compreender outros agentes tais como interleucinas ou interferons dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica. Por exemplo, para uso no tratamento da doença de Alzheimer, o agente adicional pode ser selecionado a partir do grupo constituído de pequenas moléculas orgânicas, anticorpos anti-Abeta e suas combinações. Assim, em uma determinada modalidade, a presente invenção refere-se ao uso da molécula de aglutinação, por exemplo, anticorpo ou seu fragmento de aglutinação do antígeno da presente invenção ou de uma mo- lécula de aglutinação contendo substancialmente as mesmas especificida- des de qualquer um destes, o polinucleotídeo, o vetor ou a célula da presen- te invenção para a preparação de uma composição farmacêutica ou de di- agnóstico para tratar ou impedir a progressão da doença de Alzheimer, para a melhora dos sintomas associados com a doença de Alzheimer; para o di- agnóstico ou varredura de um sujeito quanto à presença da doença de Al- zheimer ou para determinar o risco de um sujeito de desenvolver a doença de Alzheimer. A dita composição farmacêutica pode ser projetada para ser administrada por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parentérica ou em aerossol; ver também infra.

Assim, em uma modalidade, a presente invenção refere-se a um método de tratamento de um distúrbio neurológico caracterizado pelo acú- mulo anormal e/ou deposição de uma proteína no sistema nervoso central, cujo método compreende a administração a um sujeito com esta necessida- de de uma quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer uma das molé- culas de aglutinação, anticorpos, antígenos, polinucleotídeos, vetores ou células da presente invenção. O termo "distúrbio neurológico" inclui, entre outros, Doença de Alzheimer, comprometimento cognitivo leve, demência fronto-temporal, doença de corpos de Lewy, doença de Parkinson1 doença de Pick, doença de Binswanger; angiopatia amiloide congofílica, angiopatia amiloide cerebral, síndrome de Down, demência de multi-infarto, Doença de Huntington, doença de Creutzfeldt-Jakob, demência de AIDS complexa, de- pressão, ansiedade, fobia, a paralisia de Bell, epilepsia, encefalite, esclerose múltipla, doenças neuromusculares, distúrbios neuro-oncológicos, tumores cerebrais, distúrbios neurovasculares incluindo derrame, distúrbios neuroi- munológicos, doença neuro-otológica, neurotrauma incluindo lesão da medu- la espinhal, dor, incluindo dor neuropática, doenças pediátricas, neurológicas e neuropsiquiátricas, distúrbios do sono, síndrome de Tourette, comprome- timento cognitivo leve, demência vascular, demência multi-infarto, fibrose cística, doença de Gaucher, outros distúrbios do movimento e doenças do sistema nervoso central (SNC) em geral. Salvo disposição em contrário, os termos neurodegenerativas, neurológicas ou neuropsiquiátricos são utiliza- dos indiferentemente aqui.

No âmbito da presente invenção, um método é descrito para ca- racterizar anticorpos humanos para um grande número de doenças e para também produzir os ditos anticorpos subseqüentemente para empregá-los em forma de diagnóstico, terapeuticamente ou como prevenção em tais pa- cientes cujo imunosistema não reagiu com a imunoresposta correspondente ao desenvolvimento da patologia da doença. Em particular, isto terá que ser esperado em doenças que ocorrem em idade avançada porque, como se sabe, a reatividade do sistema imune diminui de forma contínua e significati- va conforme a idade aumenta. Nestes casos, anticorpos ativos terapêutica ou preventivamente poderiam compensar as restrições relacionadas com a idade do sistema imune, no que refere-se ao bloqueio do enriquecimento das variantes da proteína patofisiológica endógena e poderiam, assim, con- tribuir para um melhor estado de saúde na idade avançada. Assim, o uso médico da presente invenção é particularmente válido para o grupo dos pa- cientes acima descritos, por exemplo, na idade de 60, 65, 70, 75, 80 ou mais velhos e, em princípio, refere-se a todas as doenças manifestando-se em forma de descarrilamento de qualquer espécie, como por exemplo endopro- teólise, alterações de conformação, alterações de modificações pós- tradução, mutações somáticas ou combinações dos mesmos, fenotipicamen- te por meio do desenvolvimento de variantes patofisiológicas da proteína endógena. No âmbito da presente invenção, variantes patofisiológicas são consideradas como sendo variantes contendo neoepítopos patológicos que se desviam da fisiologia, vide supra.

Em particular, as aplicações terapêuticas incluem doenças tumo- rais, doenças inflamatórias e doenças do sistema nervoso central, como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson1 doença de Pick, demência com corpos de Lewy, doenças de Prion, incluindo doença de Creutzfeldt-Jakob, paralisia supra nuclear progressiva, atrofia de múltiplos sistemas, degenera- ção corticobasal, degeneração fronto-temporal com Parkinsonismo similar à doença de Huntington de cromossoma 17, demência fronto-temporal, angio- patia amiloide cerebral, comprometimento cognitivo leve, síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com amiloidose tipo holandês e tipo islan- dês, ataxia espinocerebelar e esclerose lateral amiotróica como também glaucoma, miosite corporal de inclusão, polineuropatia amiloide familial e amiloidose compreendendo proteínas fibrilares derivadas de pelo menos uma das seguintes proteínas precursoras: SAA (do inglês Serum-Amyioid- Protein A, proteína sérica amiloide A), AL (cadeias k or I-Ieves de imunoglo- bulinas), AH (cadeias g1 Ig pesadas), ATTR (transtiretina, prealbumina séri- ca), AApo-A-1 (Apolipoproteína A1), AApoA2 (Apolipoproteína A2), AGeI (Gelsolina), ACys (Cistatina C), ALys (Lisozima), AFib (Fibrinógeno), Beta- amiloide (proteína precursora de amiloide), Beta-amiloide 2M (beta2- microglobulina), APrP (proteína Prion), ACaI (Procalcitonina), AIAPP (poli- peptídeo amiloide da ilhota); APro (Prolactina), Alns (Insulina); AMed (Lacta- derina); Aker (cerato-epitelina); ALac (Lactoferrina), Abri (AbriPP), ADan (A- DanPP); ou AANP (peptídeo natriurético atrial), (Skovronsky at al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2006; 1:151-70; Buxbaum, Curr Opin Rheumatol 2003; 16: 67-75.

Uma vantagem em particular da abordagem terapêutica da pre- sente invenção reside no fato de que os anticorpos derivados das células B e das células de memória B a partir de organismo excepcionalmente estável pré-clinicamente ou clinicamente saudável são, com uma certa probabilida- de, capazes de evitar a manifestação clínica da doença ou de diminuir o ris- co da ocorrência de uma doença manifesta clinicamente ou de retardar o momento da ocorrência de uma doença manifesta clinicamente. Normalmen- te, esses anticorpos também já passaram com sucesso através da matura- ção somática ou seja, da otimização com relação à seletividade e eficácia na aglutinação de alta afinidade à molécula-alvo por meio de variação somática das regiões variáveis do anticorpo.

O conhecimento de que tais células in vivo, por exemplo, em um ser humano, não foram ativadas por meio de proteínas relacionadas ou ou- tras proteínas fisiológicas ou estruturas de células no sentido de uma reação alérgica ou autoimunológica é também de grande importância médica pois isso significa um considerável aumento da chance de passar com sucesso pelas fases dos testes clínicos. Por assim dizer, a eficácia, tolerabilidade e aceitabilidade já foram demonstradas antes do desenvolvimento pré-clínico do anticorpo terapêutico ou profilático em pelo menos um sujeito humano. Pode ser esperado então que com um procedimento de acordo com a pre- sente invenção, a eficácia específica da estrutura-alvo de um anticorpo como agente terapêutico e a diminuição da probabilidade de efeitos colaterais au- mentam significativamente sua probabilidade clínica de sucesso.

Do exposto, é evidente que a presente invenção engloba qual- quer utilização de uma molécula de aglutinação específica da doença com- preendendo pelo menos uma CDR do anticorpo acima descrito, em particu- lar para diagnóstico e/ou tratamento de um distúrbio relacionado com a do- ença de Alzheimer e a deposição Abeta, respectivamente. Preferivelmente, a dita molécula de aglutinação é um anticorpo da presente invenção ou sua cadeia de imunoglobulinas. Além disso, a presente invenção refere-se a an- ticorpos antiidiotípicos de qualquer um dos anticorpos mencionados descri- tos anteriormente neste documento. Existem anticorpos ou outras moléculas de aglutinação que se aglutinam à seqüência de peptídeos antigênicos úni- cos localizados em uma região variável do anticorpo próxima ao sítio de a- glutinação ao antígeno.

Em outra modalidade, a presente invenção refere-se a uma composição de diagnóstico compreendendo qualquer uma das moléculas de aglutinação descritas acima, anticorpos, fragmentos de aglutinação a antí- geno, polinucleotídeos, vetores ou células da invenção e, opcionalmente, meios adequados para a detecção, tais como reagentes convencionalmente usados em métodos de diagnóstico baseados em ácido imuno ou nucleico. Os anticorpos da invenção são, por exemplo, adequados para uso em imu- noensaios nos quais eles podem ser utilizados na fase líquida ou aglutinada a um veículo da fase sólida. Exemplos de imunoensaios que podem utilizar os anticorpos da invenção são imunoensaios concorrentes e não concorren- tes em um formato direto ou indireto. Exemplos desses imunoensaios são o radioimunoensaio (RIA), o sanduíche (ensaio imunométrico), a citometria de fluxo e o ensadio pelo método Western blot. Os antígenos e anticorpos da invenção podem ser aglutinados a muitos veículos diferentes e utilizados para isolar células especificamente aglutinadas aos mesmos. Exemplos de veículos bem-conhecidos incluem o vidro, poliestireno, cloreto de polivinila, polipropileno, polietileno, policarbonato, dextram, nylon, amiloses, celuloses naturais e modificadas, poliacrilamidas, agaroses e magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel para fins da invenção. Há muitos rótu- los e métodos diferentes de marcação conhecidos daqueles versados na técnica. Exemplos dos tipos de rótulos que podem ser utilizados na presente invenção incluem enzimas, radioisótopos, metais coloidais, compostos fluo- rescentes, compostos quimioluminescentes e compostos bioluminescentes; ver também as modalidades discutidas anteriormente neste documento.

Por uma nova modalidade, as moléculas de aglutinação, em es- pecial anticorpos da presente invenção também podem ser utilizadas em um método para o diagnóstico de um distúrbio em um indivíduo para obter uma espécime de fluido corporal da pessoa testada, que pode ser uma espécime de sangue, uma espécime linfática ou qualquer outra espécime de fluido corporal e promover o contato da espécime de fluido corporal com um anti- corpo da presente invenção sob condições que permitam a formação de complexos antigeno-anticorpo. O nível desses complexos é então determi- nado por métodos conhecidos na técnica, um nível significativamente mais elevado do que o formado em uma espécime de controle que indica a doen- ça no indivíduo testado. Da mesma forma, o antígeno específico aglutinado aos anticorpos da invenção também pode ser usado. Assim, a presente in- venção refere-se a um imunoensaio in vitro compreendendo a molécula de aglutinação, por exemplo, seu fragmento de aglutinação a anticorpo ou antí- geno da invenção.

Neste contexto, a presente invenção também refere-se aos mei- os especificamente projetados para esta finalidade. Por exemplo, uma dis- posição com base em proteínas ou em anticorpos pode ser utilizada, a qual, por exemplo, é carregada com quaisquer antígenos derivados da referida proteína associada ao distúrbio e que contém o neoepítopo para detectar autoanticorpos que podem estar presentes em pacientes que sofrem de, por exemplo, um distúrbio neurológico, em especial a doença de Alzheimer ou com anticorpos ou moléculas equivalentes de aglutinação a antígeno da pre- sente invenção que reconhecem especificamente qualquer uma dessas pro- teínas. Por exemplo, perfil de microdisposição de antígenos de anticorpos na artrite reumatoide foi relatado por Hueber et al. Arthritis Rheum. 52 (2005), 2645-2655. O projeto dos imunoensaios de micro disposições é resumido em Kusnezow et al., Mol. Cell Proteomics 5 (2006), 1681-1696. Assim, a presente invenção também se refere com as microdisposições carregadas com moléculas ou antígenos de aglutinação identificados em conformidade com a presente invenção.

A presente invenção também fornece um pacote ou kit farma- cêutico e de diagnostico, respectivamente, compreendendo um ou mais re- cipientes cheios com um ou mais dos ingredientes acima descritos, por e- xemplo, molécula de aglutinação, anticorpo ou fragmento de aglutinação, antígeno, polinucleotídeo, vetor ou célula da presente invenção. Associado com esse(s) recipiente (s) poderá estar um anúncio na forma prescrita por uma agência governamental que regulamenta a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou de produtos biológicos, cujo anúncio reflete a a- provação pela agência de fabricação, utilização ou venda para administração em seres humanos. Além disso ou alternativamente, o kit inclui reagentes e/ou instruções de uso em ensaios de diagnóstico apropriados. A composi- ção, por exemplo, o kit da presente invenção é, certamente, particularmente adequada para o diagnóstico, prevenção e tratamento de um distúrbio que vem acompanhado da presença de uma proteína associada à doença con- forme definido acima, especialmente a amiloidose e, em particular, aplicável ao tratamento da doença de Alzheimer (dC).

Os termos "tratamento", "que trata" e similares, são aqui usados geralmente para obter um efeito farmacológico e/ou fisiológico desejado. O efeito pode ser profilático em termos de totalmente ou parcialmente prevenir uma doença ou seu sintoma e/ou pode ser terapêutico em termos de parci- almente ou completamente curar uma doença e/ou seu efeito adverso atribu- ido à doença. O termo "tratamento", como utilizado neste documento abran- ge qualquer tratamento de uma doença em um mamífero, especialmente um ser humano e inclui: (a) impedir a ocorrência da doença em um sujeito que pode estar predisposto à doença, mas não foi diagnosticado ainda como ve- ículo dela; (b) inibir a doença, por exemplo, interrompendo seu desenvolvi- mento; ou (c) aliviar a doença, por exemplo, causando sua regressão.

Além disso, o termo "sujeito" ou "paciente" refere-se a um mamí- fero, de preferência humano, que necessita de tratamento para uma condi- ção, distúrbio ou doença.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser formuladas de acordo com métodos bem-conhecidos na técnica; ver, por exemplo Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2000) by the University of Sciences in Philadelphia, ISBN 0-683-306472. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são bem-conhecidos na técnica e inclu- em soluções-tampão salinas de fosfato, água, emulsões, tais como emul- sões de óleo/água, diversos tipos de umidificantes, soluções estéreis, etc. Composições compreendendo tais veículos podem ser formuladas por mé- todos convencionais bastante conhecidos. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao sujeito em dose adequada. A administração de composições adequadas pode ser efetuada por diferentes meios, por exem- plo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular, adminis- tração tópica e intradérmica. As formulações em aerossol, como formulações em spray nasal incluem soluções aquosas purificadas ou outras soluções do agente ativo com agentes conservantes e agentes isotônicos. Tais formula- ções são de preferência ajustadas até um pH e estado isotônico compatível com as membranas mucosas nasais. Formulações para administração retal ou vaginal podem ser apresentadas na forma de supositório com um veículo adequado.

Além disso, enquanto a presente invenção inclui o corrente pro- cedimento padrão (embora afortunadamente raro) de perfurar um pequeno orifício no crânio para administrar um fármaco da presente invenção, em um aspecto preferido, a molécula de aglutinação, especialmente o anticorpo ou o fármaco com base no anticorpo da presente invenção pode atravessar a barreira hematoencefálica, o que permite a administração intravenosa ou oral.

A posologia deverá ser determinada pelo médico assistente e por fatores clínicos. Como é bastante sabido nas técnicas médicas, as dosa- gens para qualquer paciente dependem de muitos fatores, incluindo a altura do paciente, a área de superfície do corpo, a idade, o composto particular a ser administrado, gênero, hora e via de administração, saúde geral e outros fármacos sendo administrados simultaneamente. Uma dose típica pode ser, por exemplo, na faixa de 0,001 a 1,000 pg (ou do ácido nucleico para ex- pressão ou inibição de expressão neste intervalo); no entanto, doses abaixo ou acima desta faixa exemplar são visualizadas, especialmente consideran- do os fatores acima mencionados. Geralmente, a dosagem pode variar, por exemplo, de cerca de 0,0001 a 100 mg/kg e mais geralmente de 0,01 a 5 mg/kg (por exemplo, 0,02 mg/kg, 0,25 mg/kg, 0,5 mg/kg, 0,75 mg/kg, 1 mg/kg de 2 mg/kg, etc), do peso corporal do hospedeiro. Por exemplo, as doses podem ser de 1 mg/kg de peso corporal ou 10 mg/kg de peso corporal ou dentro da faixa de 1-10 mg/kg, de preferência, pelo menos, 1 mg/kg. Doses intermediárias nas faixas acima são também destinadas a estar dentro do âmbito da invenção. Os sujeitos podem receber tais doses diárias, em dias alternativos, semanalmente ou de acordo com qualquer outra programação determinada pela análise empírica. Um tratamento exemplar envolve a ad- ministração em doses múltiplas durante um período prolongado, por exem- plo, de pelo menos seis meses. Regimes de tratamentos exemplares adicio- nais envolvem a administração uma vez a cada duas semanas ou uma vez por mês ou uma vez a cada 3 a 6 meses. Programações de dosagens e- xemplares incluem 1-10 mg/kg ou 15 mg/kg em dias consecutivos, 30 mg/kg em dias alternados ou 60 mg/kg semanalmente. Em alguns métodos, dois ou mais anticorpos monoclonais com diferentes especificidades de aglutinação são administrados simultaneamente, em cujo caso a dosagem de cada anti- corpo administrado se enquadra dentro das faixas indicadas. O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica. Preparações para administra- ção parenteral incluem soluções aquosas ou não aquosas, suspensões e emulsões. Exemplos de solventes não aquosos são propileno glicol, polieti- leno glicol, óleos vegetais, como o azeite de oliva, ésteres orgânicos injetá- veis tais como o oelato de etila. Veículos aquosos incluem a água, soluções alcoólicas/aquosas, emulsões ou suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Veículos parenterais incluem solução de cloreto de sódio, dex- trose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Iactato de Ringer ou óleos fixos. Veículos intravenosos incluem reabastecedores de fluidos e nutrientes rea- bastecedores de eletrólitos (tais como aqueles baseados na dextrose de Ringer) e similares. Conservantes e outros aditivos podem também estar presentes, como, por exemplo, antibióticos, antioxidantes, quelantes e gases inertes e outros do gênero. Além disso, a composição farmacêutica da in- venção pode incluir mais agentes como a dopamina ou fármacos psicofar- macológicos, dependendo da utilização pretendida da composição farma- cêutica. Além disso, a composição farmacêutica também pode ser formulada como uma vacina, por exemplo, se a composição farmacêutica da invenção compreende um anticorpo anti-Αβ para a imunização passiva.

Além disso, a co-administração ou a administração seqüencial de outros agentes podem ser desejável. Uma dose ou quantidade terapeuti- camente eficaz refere-se àquela quantidade de ingrediente ativo suficiente para aliviar os sintomas ou a condição. A eficácia terapêutica e a toxicidade desses compostos podem ser determinadas pelos procedimentos farmacêu- ticos-padrão nas culturas de células ou em animais cobaias, por exemplo, ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população) e LD50 (a dose letal para 50% da população). A relação entre a dose terapêutica e efeitos tóxicos é o índice terapêutico e pode ser expressa como a razão, LD50/ED50. Preferivelmente, o agente terapêutico na composição está presente em uma quantidade suficiente para restabelecer um comportamento normal e/ou as propriedades cognitivas no caso da doença de Alzheimer.

As composições farmacêuticas em conformidade com a presen- te invenção podem de preferência ser usadas para o tratamento dos distúr- bios neurológicos, incluindo, entre outros, a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Pick1 demência com corpos de Lewy1 doenças de Pri- on, incluindo doença de Creutzfeldt-Jakob, paralisia supra nuclear progressi- va, atrofia de múltiplos sistemas, degeneração corticobasal, degeneração fronto-temporal com Parkinsonismo similar à doença de Huntington de cro- mossoma 17, demência fronto-temporal, angiopatia amiloide cerebral, com- prometimento cognitivo leve, síndrome de Down, hemorragia cerebral here- ditária com amiloidose tipo holandês e tipo islandês, ataxia espinocerebelar e esclerose lateral amiotróica como também glaucoma, miosite corporal de inclusão, polineuropatia amiloide familial e amiloidose compreendendo prote- ínas fibrilares derivadas de pelo menos uma das seguintes proteínas precur- soras: SAA (proteína sérica amiloide A), AL (cadeias k or I-Ieves de imuno- globulinas), AH (cadeias g1 Ig pesadas), ATTR (transtiretina, prealbumina sérica), AApo-A-1 (Apolipoproteína A1), AApoA2 (Apolipoproteína A2), AGeI (GeIsoIina)1 ACys (Cistatina C), ALys (Lisozima), AFib (Fibrinogêneo), Beta- amiloide (proteína precursora de amiloide), Beta-amiloide 2M (beta2- microglobulina), APrP (proteína Prion), ACaI (Procalcitonina), AIAPP (poli- peptídeo amiloide da ilhota); APro (ProIactina)1 Alns (Insulina); AMed (Lacta- derina); Aker (eerato-epitelina); ALac (Lactoferrina)1 Abri (AbriPP), ADan (A- DanPP); ou AANP (peptídeo natriurético atrial), (Skovronsky at al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 2006; 1:151-70; Buxbaum, Curr Opin Rheumatol 2003; 16: 67-75. , neuro-oncologia, neuro-imunologia, dor neuro-otológica, neurologia pediátrica, fobia, distúrbios afetivos, distúrbios do sono, Síndrome de Tourette1 outros distúrbios do movimento e doenças do sistema nervoso central (CNS) em geral.

Estas e outras modalidades são descritas e abrangidas pela descrição e exemplos da presente invenção. Outra literatura a respeito de qualquer um dos materiais, métodos, usos e compostos a ser empregados em conformidade com a presente invenção podem ser encontrados em bibli- otecas públicas e bancos de dados, usando, por exemplo, dispositivos ele- trônicos. Por exemplo, o banco de dados público "Medline" pode ser utiliza- do, o qual é hospedado pelas seguintes instituições: National Center for Bio- technology Information e/ou National Library of Medicine alocadas nos Insti- tutos Nacionais de Saúde (National Institutes of Health). Outros bancos de dados e endereços da internet, tais como aqueles do European Bioinforma- tics Institute (EBI'), que é parte do European Molecular Biology Laboratory (EMBL) são conhecidos daqueles versados na técnica e podem também ser obtidos usando ferramentas de busca na internet. Uma visão geral das in- formações de patentes em biotecnologia e um levantamento das fontes de informações de patentes úteis para busca retrospectiva e para conhecimento atual são apresentados em Berks, Tibtech 12 (1994), 352-364.

A descrição acima geralmente descreve a presente invenção. Salvo indicação em contrário, um termo conforme usado aqui observa a de- finição encontrada no Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Bio- logy, Oxford University Press, 1997, revisto em 2000 e reimpresso em 2003, ISBN 0 19 850673 2. Vários documentos são citados em todo o texto do pre- sente relatório descritivo. Citações bibliográficas completas podem ser en- contradas no final da especificação imediatamente precedente às reivindica- ções. O conteúdo de todas as referências citadas (incluindo referências de literatura, patentes emitidas, pedidos de patentes publicados conforme cita- dos neste pedido e nos relatórios descritivos, instruções do fabricante) é aqui incorporado expressamente como referênica; entretanto, não existe admis- são de que qualquer documento seja, de fato, técnica anterior com relação à presente invenção.

Um entendimento mais completo pode ser obtido através da consulta aos exemplos específicos seguintes que são fornecidos aqui para fins de ilustração somente e não se destinam a limitar o âmbito da invenção.

EXEMPLOS

Os exemplos que seguem ilustram mais ainda a invenção, mas não deverão ser interpretados como limitadores do âmbito da invenção sob nenhum aspecto. Descrições detalhadas de métodos convencionais, tais como aqueles empregados neste documento podem ser encontradas na lite- ratura citada, ver também "The Merck Manual of Diagnosis and Therapy" Seventeenth Ed. by Beers and Berkow (Merck & Co., Inc. 2003).

A prática da presente invenção empregará, salvo indicado em contrário, técnicas convencionais de biologia celular, cultura celular, biologia molecular, biologia transgênica, microbiologia, DNA recombinante e imuno- logia, que estão dentro da habilidade da técnica. Para mais detalhes das técnicas gerais úteis na prática desta invenção, o profissional poderá consul- tar os livros-texto-padrão e revisões sobre biologia celular e cultura de teci- dos; ver também as referências citadas nos exemplos. Métodos gerais em bioquímica molecular e celular podem ser encontrados em tais livros-texto- padrão como: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed. (Sambrook et ai Harbor Laboratory Press 2001); Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed. (Ausubel et al. Eds., John Wiley & Sons 1999); DNA Cloning, Volumes I and II (Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (Gait ed., 1984); Nucleic Acid Hybridization (Hames and Higgins eds. 1984); Transcription And Trans- lation (Hames and Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (Freshney and Alan, Liss, Inc., 1987); Gene TransferVectors for Mammalian Cells (Mil- ler and Calos, eds.); Current Protocols in Molecular Biology and Short Proto- cols in Molecular Biology, 3rd Edition (Ausubel et ai, eds.); e Recombinant DNA Methodology (Wu, ed., Academic Press). Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, eds., 1987, Cold Spring Harbor Labora- tory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et ai, eds.); Immobili- zed Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); Perbal, A Practical Guide To Mo- lecular Cloning (1984); o tratado, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimen- tal Immunology, Volumes I-IV (Weir and Blackwell, eds., 1986). Protein Me- thods (Bollag et ai, John Wiley & Sons 1996); Non-viral Vectors for Gene Therapy (Wagner et ai eds., Academic Press 1999); Viral Vectors (Kaplitt & Loewy eds., Academic Press 1995); Immunology Methods Manual (Lefkovits ed., Academic Press 1997); and Cell and Tissue Culture: Laboratory Proce- dures in Biotechnology (Doyle & Griffiths, John Wiley & Sons 1998). Os rea- gentes, vetores de clonagem e kits para manipulação genética mencionados neste dodumento podem ser adquiridos de fornecedores comerciais tais co- mo BioRad, Stratagene, Invitrogen1 Sigma-Aldrich e ClonTech. Técnicas ge- rais em cuoura celular e colecao de meios estão apresentados em Large Scale Mammalian Cell Culture (Hu et al., Curr. Opin. Biotechnol. 8 (1997), 148); Serum-free Media (Kitano, Biotechnology 17 (1991), 73); Large Scale Mammalian Cell Culture (Curr. Opin. Biotechnol. 2 (1991), 375); and Sus- pension Culture of Mammalian Cells (Birch et al., Bioprocess Technol. 19 (1990), 251); Extracting information from cDNA arrays, Herzel et a!., CHAOS 11 (2001), 98-107.

Os seguintes experimentos são ilustrados e descritos com rela- ção ao anticorpo NI-101.11. Entretanto, os outros anticorpos da série Nl 101, em especial Nl 101.10 são estruturalmente similares e, portanto, deles se pode esperar que apresentem resultados comparáveis.

Métodos complementares

Exibição das células de memória B

Sujeitos humanos selecionados cuidadosamente clinicamente que são caracterizados por cursos clínicos excepcionalmente positivos, por exemplo, ausência de sinais clínicos da doença na presença de fatores de risco ou de cursos estáveis de sinais suaves ou prodrômicos sem nenhum desenvolvimento da doença ou de não progressores de longo prazo são re- crutados para propiciar linfócitos sangüíneos periféricos como material de partida para o isolamento das células B de memória. A estratégia está base- ada no conceito estabelecido na imunologia da infecção de que um conjunto de células B de memória do sujeito preserva as especificidades do anticorpo e, possivelmente, também as freqüências de anticorpos geradas durante os encontros de antígenos anteriores (McHeyzer-WiIIiams e Ahmed Curr. Opin. Immunol. Opin. 11 (1999), 172-179, Bernasconi et al., Science 298 (2002), 2199-202; Traggiai et al., Nat. Med. 10 (2004), 871-875). Este conceito foi desenvolvido para explicar a imunidade versátil contra os agentes infeccio- sos, como também para descrever a imunidade mediada pelo anticorpo após a primeira infecção. Segundo esta teoria, o complemento total dos anticor- pos contra todos os antígenos que haviam induzido uma resposta do anti- corpo no histórico do sujeito, seja naturalmente ou após a vacinação, deve ser plenamente representado no conjunto das células B de memória. De a- cordo com a presente invenção esta teoria é aplicada aos antígenos endó- genos gerados como resultado da agregação ou conformação anormal de uma outra proteína de outro modo relevante fisiológica e que, como tal, não está sujeita à tolerância imunológica fisiológica e, assim, pode adquirir pro- priedades antigênicas e induzir uma resposta imune contra os neoepitopos conformacionais. (neoepitopos).

As células B de memória são isoladas com marcadores de su- perfície incluindo o marcador de célula B pan CD22, em combinação com a seleção negativa das células B não experimentadas com antígeno que ex- pressaram IgM, IgD, IgE e IgA. Com esta técnica, aproximadamente 10.000 a 150.000 células de memória B podem ser obtidas a partir de 30 ml de san- gue humano. Estas são imortalizadas, por exemplo com o vírus Epstein Barr e expostas à cultura oligo-clonalmente em camadas de alimentador de fibro- blasto humano irradiado (Zubler et al., J Immunol. 134 (1985), 3662-3668; Traggiai et al., Nat. Med. 10 (2004), 871-875). Para melhorar a eficácia da transformação e da imortalização das células B de memória secretoras do anticorpo, CpG 2006 que imita as atividades dos CpG-binucleotídeos não metilatados bacterianos (Hartmann and Krieg J Immunol 164(2) (2000), 944- 953) podem ser usados. Protocolo experimental:

A seleção de células B do volume de PBL foi realizada utilizando a tecnologia MACS e microesferas CD22 (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Ale- manha). PBL foi rotulado com MACS anti-humano CD22, IgD anti-humano conjugado com ficoeritrina e anticorpos conjugados com APC antihumanos IgM, IgA, CD3, CD8, CD56 (Becton Dickinson, Basel, Suíça). Células positi- vas-CD22 foram isoladas usando colunas LS e dispositivo Midi MACS (Mil- tenyi), seguido pela seleção de células negativas-APC e ficoeritrina usando um selecionador de células MoFIo. (Dako, Fort Collins, E.U.A.). Células B CD22-positivas, IgM, IGD-, IgA-, IgE-negativas foram então incubadas com vírus Epstein Barr contendo sobrenadante obtido a partir das células B95-8 e CpG 2006 (Sigma, Buchs1 Suíça), na concentração de 2,5 mg/l em meio de células B (RPMI 1640 complementado com 10% de soro bovino fetal (Hyclo- ne, Perbio1 Lausanne, Suíça). 5-50 células foram cultivadas por cavidade em placas de 96 cavidades de base redonda Costar (Corning, Vitaris, Baar1 Suí- ça) em meio de células B1 em 30.000 PBL humano irradiado preparado de doadores voluntários. As culturas das células B de memória foram mantidas a 37°C e 5% de C02 em uma incubadora de cultura celular umidificada por 2-4 semanas após cujo período, o meio condicionado das culturas foi testa- do em ELISA e em disposições de tecidos.

Varredura de Anticorpos

Os anticorpos em meios condicionados passam por varredura quanto à aglutinação a epitopos patológicos incluindo agregados de proteí- nas e estruturas relevantes patologicamente, anormais em cortes de tecidos obtidas de pacientes humanos com diagnósticos confirmados patologica- mente incluindo, entre outros, a doença de Alzheimer ou obtidos de cortes de tecidos de modelos de camundongos transgênicos da doença humana ou de cortes de tecidos obtidos de modelos animais da doença humana incluin- do primatas não-humanos idosos ou pelo ELISA de preparações de peptí- deos sintéticos agregados. Estruturas anormais, patológicas no sentido des- ta invenção incluem, mas não estão restritas a, placas β-amiloide, emara- nhados neurofibrilares, agregados de alfa-sinucleínas em corpos de Lewy e agregados de proteínas depositados em neurites distróficas. Tecidos huma- nos também são usados para excluir reatividades cruzadas de anticorpos com estruturas de tecido supercelular ou celular normal. Anticorpos escolhi- dos são ainda analisados quanto à determinação de classe e subclasse de cadeia leve. Mensagens selecionadas de anticorpos relevantes para a pato- Iogia das culturas de células B de memória são transcritas usando TR-PCR, clonadas e combinadas em vetores de expressão para a produção recombi- nante.

Protocolo experimental:

Varredura do meio condicionado de células B usando microdis- posições de tecidos compatíveis com microtitulação.

Produção de disposições

Tecidos cerebrais de seres humanos com doença de Alzheimer pós-morte inseridos em parafina foram cortados em bastões de 1-2 mm de diâmetro e 10 mm de comprimento. Quatro bastões foram inseridos verti- calmente em parafina de modo a formar um quadrado que coubesse no for- mato do microtitulação de 9 por 9 mm. Fatias de tecido de 5 μιτι foram corta- das a partir deste conjunto com um micrótomo e duas fatias foram agrupa- das adjacentes uma à outra nos slides de vidro resultantes em um conjunto de bastões de 2 por 4 adaptados ao formato do microtitulação de 96 cavida- des. Alternativamente, tecidos de camundongos transgênicos APP foram usados para preparar as disposições dos tecidos.

Varredura de Células B

Meio condicionado das culturas de células B de memória foi transferido para lâminas de disposições de tecidos usando uma pipeta de multicanais e incubado por 2 h em temperatura ambiente. Após uma etapa de lavagem, a aglutinação de anticorpos humanos para cortes de tecidos foi analisada usando anticorpos secundários conjugados de Ci-3 quanto ao IgG humano (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Suffolk, Reino Unido). A análise da fluorescência foi realizada em um microscópio invertido de fluo- rescência (Leica, Heerbrugg1 Suíça).

ELISA

Microplacas de meia área de 96 cavidades (Corning) foram re- vestidas com peptídeo Abeta sintético em uma concentração-padrão de 1pg/ml em tampão de revestimento (15 mM Na2C03, 35 mM NaHC03, pH 9.42) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas e sítios de aglutinação não específicos foram bloqueados por 1 h em TR com PBS contendo 2% BSA (Sigma, Buchs, Suíça). O meio condicionado de células B foi transferido das chapas de cultura de células B de memória para chapas ELISA e foi in- cubado por 2 h em temperatura ambiente. A ligação dos anticorpos humanos foi determinada utilizando anticorpos policonais de IgG antihumanos de asno conjugados-(HRP) de peroxidase de raiz forte (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Cambridgeshire, UK), seguida da medição da atividade HRP em um ensaio colorimétrico-padrão.

Clonagem molecular de anticorpos exibindo especificidade de interesse Células B vivas de culturas de células B de memória são cultiva- das usando um selecionador de células. O mRNA é preparado e seqüências de cadeia leve e pesada de imunoglobulina são obtidas usando iniciadores específicos de estrutura-lg para toda família de estrutura 1 (FR1) da cadeia leve e pesada variável humana como iniciadores de 5' em combinação com iniciadores específicos para todos os segmentos J-H humanos como inicia- dores 3' (Marks et ai., Mol. Biol. 222 (1991), 581-597). Alternativamente, o TR-PCR de células únicas de células selecionadas únicas da cultura de cé- lulas B de memória pode ser usado como fonte desequências de cadeia leve e pesada de Ig (Babcook et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93 (1996), 7843- 7848; Brezinschek et ai, J. Immunol. 155 (1995), 190-202; Coronella et ai., Nucleic Acids Research 28 (2000); Owens, et ai., J. Immunol. 171 (2003), 2725-2733). A seleção de células únicas conserva o emparelhamento corre- to das cadeias leve e pesada de imunoglobulinas dos clones de anticorpos originalmente produzidos na cultura das células B.

A identificação do clone de anticorpo com a especificidade dese- jada é realizada através da revarredura em microdisposição de tecidos com- patíveis com o microtitulação e a ELISA quando da expressão recombinante de anticorpos completos. A expressão recombinante de anticorpos de IgGI completos é obtida quando da inserção das seqüências de cadeia leve e pesada variáveis "na estrutura de leitura correta" para vetores de expressão que complementam a seqüência de regiões variáveis com uma seqüência codificadora de um peptídeo de sinal na ponta do prime-5 e na ponta-3' com uma seqüência codificadora do(s) domínio(s) constantes apropriados. Para esse efeito, os iniciadores continham sítios de restrição projetados para faci- litar a clonagem de seqüências de cadeia leve e pesada variável para veto- res de expressão de anticorpos. A imunoglobulina de cadeia pesada é ex- pressa pela inserção do produto TR-PCR da cadeia pesada da imunoglobu- lina na estrutura em um vetor de expressão de cadeia pesada comportando um peptídeo de sinal e domínios constantes da imunoglobulina humana. A imunoglobulina da cadeia leve kappa é expressa pela inserção do produto TR-PCR da cadeia leve kappa em estrutura em um vetor de expressão de cadeia leve propiciando um peptídeo de sinal e o domínio constante 1 da imunoglobulina de cadeia leve kappa humana. Alternativamente, a imuno- globulina de cadeia leve Iambda é expressa pela inserção do produto TR- PCR de cadeia leve Iambda em estrutura em um vetor de expressão de ca- deia leve Iambda propiciando um peptídeo de sinal e o domínio constante 1 da imunoglobulina de cadeia leve Iambda humana.

Os anticorpos monoclonais recombinantes funcionais são obti- dos quando da co-transfecção em células HEK 293 (ou qualquer outra linha de célula de recipiente apropriado) de um vetor de expressão de cadeia pe- sada de Ig e um vetor de expressão de cadeia leve Ig Iambda ou kappa. O anticorpo monoclonal humano recombinante é posteriormente purificado do meio condicionado usando uma purificação da coluna A da proteína-padrão. O anticorpo monoclonal humano recombinante pode ser produzido em quan- tidades ilimitadas usando células transientemente ou estavelmente transfec- tadas. Linhas de células produtoras de anticorpos monoclonais humanos recombinantes podem ser estabelecidas usando vetores de expressão-lg diretamente ou pela re-clonagem das regiões variáveis de Ig em diferentes vetores de expressão. Derivados, tais como F (ab), F (ab)2 e scFv também podem ser gerados a partir destas regiões variáveis de Ig.

Protocolo experimental:

TR-PCR de células B em volume:

As células vivas conforme identificadas por suas propriedades de dispersão da luz para os lados e para frente de culturas de células B de memória foram selecionadas em partes de 100-2000 células diretamente em tubos de 0,2 ml de PCR tubos enchidos com 20μΙ de RNAIater (Ambion, Huntingdon, Reino Unido), utilizando um selecionador de células MoFIo. mRNA foi preparado utilizando o kit micro de mRNA-direto (Dynal, Invitro- gen, Basel, Suíça). cDNA foi preparado usando o kit "TR para PCR" (Clonte- ch BectonDickinson, Basel, Suíça) e a PCR das seqüências variáveis de ca- deia leve e pesada (Ig) de imunoglobulina foi realizada usando o Kit Advan- tage 2 PCR (CIontech) usando iniciadores específicos para todas as famílias de trabalho de estrutura 1 (FR1) de cadeia leve e pesada variável humana em combinação com os iniciadores específicos para os domínios constantes de cadeias leves Iambda Ig ou kappa Ig ou pesada Ig como iniciadores 3'. Iniciadores foram adquiridos da Microsynth (Balgach, Suíça).

Um peptídeo de sinal que foi usado em todos os vetores de ex- pressão foi derivado da seqüência 1 L5 de famílias de cadeia leve kappa de imunoglobulina humana (MDMRVPAQLLGLLLLWFPGSRC; SEQ ID NO: 2) conforme descrito em Base-V e projetado para propiciar o sítio de restrição Xba para facilitar a clonagem das regiões variáveis amplificadas de PCR (ATGGACATGCGGGTGCCCGCCCAGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTG GTTCCCCGGCTCTAGATGC; SEQ ID NO: 1). Xbal foi introduzido pela mu- tagênese silenciosa. Como um sítio de restrição 3 usado para a clonagem de regiões de cadeia pesada variáveis SaH foi introduzido no C1 do IgGI propi- ciado pelo vetor. Do mesmo modo, o sítio de restrição BsiWI foi introduzido no C1 da cadeia leve kappa e Xhol foi introduzido no C1 da cadeia leve lambda. O resumo da restrição de PCR e ligadura ao destinatário em vetores foi realizada de acordo com procedimentos normais. O DNA de Plasmídeo foi preparado utilizando kits-padrão (Quiagen, Hombrechtikon1 Suiça). Os vetores recebedores continham um promotor CMV para expressão dos ge- nes de anticorpos em células mamíferas. TR-PCR de célula única

Para o TR-PCR de células únicas de regiões variáveis de cadeia leve e pesada de Ig de células B cultivadas, foi usada uma modificação do método descrito por Owens et ai (Owens et al., 2003). Células únicas foram depositadas diretamente em cada tubo de uma disposição de tubos PCR de 0,2 ml utilizando o selecionador de células MoFIo. Cada tubo foi preparado para conter 10 μΙ de tampão de TR para transcriptase reverso do Superscrit Il (Invitrogen). Tubos de PCR foram congelados por choque em gelo seco e descongelados imediatamente antes de TR-PCR. O cDNA foi preparado uti- lizando hexâmeros aleatórios (CIontech) e transcriptase reversa do Supers- cript Il (Invitrogen). O 1o ciclo de PCR das regiões variáveis de cadeia pesa- da e leve de imunoglobulina foi realizada usando, como iniciadores 5', um conjunto de iniciadores que foram preparados para uso em todos os peptí- deos de sinal conservados entre as famílias de regiões variáveis de lg. Na posição 3', iniciadores únicos específicos para a região constante da cadeia pesada de C1 Ig ou a cadeia leve Iambda de Ig ou kappa de Ig foram usa- dos. O 2o ciclo de PCR foi realizado em produtos de PCR obtidos durante o primeiro ciclo de PCR usando os iniciadores conforme descrito para TR-PCR de células B em volume. A clonagem em vetores recebedores foi, portanto, realizada.

Clonagem Celular Alternativa

A clonagem foi realizada usando o método de diluição Iimitado- padrão ou através de deposição de células únicas em chapas de cultura de 96 cavidades utilizando um selecionador de células (MoFIo, Dako, Fort Col- lins, EUA). Para limitar a diluição, células de uma cultura de células B de memória foram colhidas, passaram por uma malha de náilon de 30 μηη (Fal- con, Becton Dickinson, Basel, Suíça), ressuspensas em meio e semeadas em placas de 96 cavidades ou placas de 384 cavidades em uma concentra- ção de 0,3 células por cavidade.

Para semeadura com o selecionador de células, o dispositivo foi configurado para depositar uma célula única (modo único 1) por cavidade diretamente em placas de 96 cavidades complementadas com meio de célu- las Β. O meio de cultura foi complementado com meio condicionado por cé- lulas T ativadas. Alternativamente, 30.000 células de alimentador irradiadas foram adicionadas ao meio. O meio de cultura foi complementado com meio condicionado por células T ativadas.

Análise seqüencial das seqüências das regiões variáveis de imunoqlobulina

O sequenciamento das seqüências das regiões variáveis de i- munoglobulinas clonadas foi realizado usando iniciadores específicos para o promotor de CMV presente 5' das seqüências das regiões variáveis de Ig inseridas. Alternativamente, iniciadores que foram preparados para uso nos domínios constantes das cadeias leve e pesada de Ig foram utilizados. Se- quências obtidas foram analisadas e alinhadas usando software Vector NTI (Informax-lnvitrogen). Plasmídeos contendo seqüências que codificaram as regiões variáveis de imunoglobulinas completas em consonância com o pep- tídeo líder e o domínio constante foram usadas para expressão.

Expressão de anticorpos monoclonais recombinantes funcionais

Os anticorpos podem ser produzidos em quantidades suficientes pela expressão recombinante usando tecnologias conhecidas na técnica (Trill et al, Curr. Opin. Biotechnol. 6 (1995), 553-601). O anticorpo monoclo- nal humano recombinante de até 1 mg foi produzido quando da transfecção transitória de células HEK-293. O anticorpo monoclonal humano recombi- nante de até 100 mg foi produzido mediante a transdução estável de células HEK-293 ou de células murinas NOS usando vetores lentivírus recombinantes.

Produção em pequena escala de anticorpo recombinante humano por trans- fecção transitória

Vetor de cadeia pesada de Ig e vetores de cadeia leve de Ig fo- ram co-transfectados para células HEK-293 usando o método-padrão de co- precipitação de fosfato de cálcio. Anticorpos recombinantes foram purifica- dos a partir do meio condicionado por células HEK-293 utilizando purificação da coluna A de proteínas (GE-Healthcare, Otelfingen1 Suíça).

Produção em grande escala de anticorpos recombinantes humanos por transdução estável

Aqui, um sistema de transfecção com base em lentivírus foi em- pregado para gerar linhas de células convertidas estavelmente produzindo anticorpo recombinante humano (Zufferey et ai, Virol. 72 (1998), 9873- 9880). Células HEK-293 foram co-convertidas com dois Ientivetores distin- tos, um portando um cassette de expressão para a cadeia pesada de Ig, o outro um cassette para cadeia leve de Ig de um anticorpo recombinante. Es- te método de transdução pode ser utilizado em uma ampla gama de linhas de células de mamíferos, tais como células CHO e NSO.

Validação em modelos de camundonqos transgênicos da doença humana

Camundongos transgênicos foram gerados como descrito ante- riormente (Knobloch et al. Neurobiol. Aging July 28 (2006)) sobre um fundo híbrido C57B1/6 e DBA2. O grupo de teste foi retrocruzado uma vez quanto a C57BL/6. Os camundongos foram mantidos sob condições habitacionais- padrão, em um ciclo claro/escuro de 12h:12h invertido e tiveram livre acesso à alimentação e água. Os grupos de tratamento foram equilibrados por idade (24 meses no primeiro ensaio, 26 meses no 2o teste) e gênero. Camundon- gos são tratados com anticorpos (3mg/kg de peso corporal), com injeções intraperitoneais uma vez por semana, durante um período de 2 meses, resul- tando em 8 injecções por animal.

Ensaios Comportamentais no labirinto em Y

A taxa de alternação espontânea é avaliada usando um labirinto de plástico em forma de Y, com braços medindo 40 χ 20 χ 10 cm. Durante sessões de 5 minutos, as seqüências de entradas de braços são registradas; a alternância foi definida como entradas sucessivas nos três braços, em con- juntos trigêmeos de sobreposição. A alternância de percentual foi calculada como a razão das alternâncias reais a possíveis. Após 2 meses de tratamen- to de anticorpos, os camundongos são retestados no labirinto em Y. Os ex- perimentadores são sempre mantidos cegos para ambos os tratamentos e genótipos durante todo o experimento.

Penetração e aglutinação da barreira hemato-encefálica a estruturas anor- mais no cérebro

Para avaliar se os anticorpos ou seus fragmentos selecionados podem penetrar na barreira hemato-encefálica e se aglutinar aos seus alvos de proteínas anormalmente agregados ou de conformação alterada no cére- bro, uma dose eficaz do anticorpo é administrada sistemicamente, intraperi- tonealmente, por via intravenosa, intramuscular, subcutânea ou intranasal a um animal transgênico que é caracterizado pelo acúmulo não fisiológico do alvo de proteína agregado ou de conformação alterada no cérebro. A agluti- nação do anticorpo às estruturas específicas da patologia no cérebro é então avaliada pela imunocoloração com um anticorpo secundário de Ig anti- humano seguido da detecção imuno-histoquímica-padrão. Protocolo experimental:

Camundongos do modelo transgênico PS-1/APPswe para a do- ença de Alzheimer receberam duas injeções periféricas de 150 pg de Nl- 101.11 no dia 1 e no dia 3. Os camundongos foram sacrificados 24 h após a segunda injeção e pulverizados com PBS. Os cérebros foram congelados e as fatias de tecido foram preparadas a partir do tecido congelado usando o criótomo. A presença de anticorpo humano nas seções criostáticas foi testa- da pela mancha com anticorpo de IgG anti-humano rotulado de Cy3 (Jack- son ImmunoResearch Europe, Suffolk, Reino Unido). A localização das pla- cas amiloides foi realizada através da co-mancha das seções criostáticas com o anticorpo de controle específico de Abeta murino 6E10 (disponível pela Covance, Catálogo Número SIG-39320), seguido pelo anticorpo de IgG anticamundongo rotulado FITC. Alternativamente, a mancha com anticorpo de IgG anti-humano rotulado de Cy3 foi utilizada isoladamente. A análise da fluorescência foi realizada em um microscópio invertido de fluorescência (Le- ica).

Redução da patologia cerebral

Os efeitos do tratamento com o anticorpo nos níveis de alvos de proteínas agregados ou de conformação alterada no cérebro foram avalia- dos pelo tratamento sistêmico ou pela produção pelo cérebro alvo do anti- corpo (intracraniano, intratecal ou intraventricular) e pelo controle de um an- ticorpo não relacionado para animais transgênicos com acúmulo não fisioló- gico característico do alvo de proteína agregado ou de conformação alterada no cérebro. Os efeitos do tratamento são avaliados pela imunocoloração ou mancha histoquímica dos alvos de proteína alterados ou agregados e pela medição da área coberta por tais agregados, pelo tamanho dos agregados e pelo número de agregados e pela quantificação bioquímica das concentra- ções dos alvos de proteínas em diferentes áreas do cérebro. Ausência de efeitos colaterais relacionados com o tratamento com o anticor- po

Os efeitos potenciais adversos relacionados com o alvo do tra- tamento com o anticorpo serão avaliados pela administração sistêmica ou pela produção pelo cérebro alvo do anticorpo (intracraniano, intratecal ou intraventricular) e um controle do anticorpo não relacionado com animais transgênicos com acúmulo não fisiológico característico do alvo de proteína agregado ou de conformação alterada no cérebro. Os efeitos colaterais em potencial serão avaliados pela imunocoloração ou mancha histoquímica (por exemplo, azul prussiano para micro-hemorragias, hematoxilina-eosina, célu- las sangüíneas brancas ativadas) e quantificação bioquímica (por exemplo, níveis de citocinas pelo ELISA).

Mancha de immunofluorescência das células vivas

Células HEK-293 células foram transfectadas temporariamente com um vetor que expressa APP selvagem humano fundido na terminação C intracelular com a variante amarelo citrina fluorescente da proteína. 24 horas após a transfecção, as células foram incubadas com anticorpos recombinan- tes humanos ou com anticorpos de controle a 4°C durante 30 minutos. Após uma etapa de lavagem, a célula foi fixada e o anticorpo aglutinado à superfí- cie foi detectado usando anticorpos secundários rotulados Cy-3 em IgG hu- mano ou de camundongo (Jackson ImmunoReséarch). A análise de fluores- cência foi realizada em um microscópio confocal (Leica).

Preparação das fibrilas Abeta

O peptídeo Abeta foi adquirido da Bachem (Bubendorf, Suíça). O peptídeo Iiofilizado foi reconstituído em TFA e resuspenso em PBS imedia- tamente antes de sua utilização como Abeta monomérico nos ensaios. As fibrilas Abeta foram preparadas pela incubação de peptídeo Abetal-42 pep- tídeo monomérico em uma concentração de 100pg/ml em PBS a 37°C por 24h. As preparações de peptídeos Abeta monoméricos e fibrilas foram tam- bém usados como substrato para cobrir placas ELISA.

Método "Western blotting"

O peptídeo Abeta monomérico foi misturado com corante de car- regamento, desnaturado a quente e carregado com 0,2 pg por via, e separa- do em um gradiente SDS-PAGE. As manchas foram incubadas com anticor- po primário por 2 h. A aglutinação do anticorpo monoclonal humano primário ou anticorpo de controle de camundongos 6E10 foi revelada utilizando anti- corpos anti-humanos ou anticamundongos secundários conjugados com a peroxidase de raiz-forte (HRP). Manchas foram desenvolvidas usando Subs- trato de Sensibilidade Máxima SuperSignaI West Femto (Pierce, Fisher Sci- entific, Wohlen, Suíça). Concorrência da aglutinação das placas de amiloides de tecidos

O anticorpo NI-101.11 humano recombinante foi incubado por 2 h com preparações de peptídeos Abeta. As preparações de anticorpos/Abeta foram então usadas para mancha imuno-histoquímica da seção do cérebro obtida de um paciente com a doença de Alzheimer neuropatologicamente confirmada. Seções-crio de 5 pm foram preparadas, bloqueadas com 4% BSA, 5% de soro de cabra e 5% de soro de cavalo em PBS por 1 h em TA e manchadas com preparações de NI-101.11/Abeta por 1 h em temperatura ambiente. Após uma etapa de lavagem, a aglutinação dos anticorpos huma- nos às seções de tecidos foi analisada usando anticorpos secundários con- jugados de Cy3 em IgG humano (Jackson ImmunoResearch Europe Ltd). A análise da fluorescência foi realizada em um microscópio invertido de fluo- rescência (Leica, Heerbrugg, Suíça).

Exemplo 1

Detecção de anticorpos humanos contra estruturas anormais prevalentes em doenças do cérebro humano

Anticorpos a partir de indivíduos fenotipicamente saudáveis ou extraordinariamente clinicamente estáveis com a doença de Alzheimerforam testados por imuno-histoquímica nas seções cerebrais obtidas de pacientes com doença de Alzheimer patologicamente confirmada. A figura demonstra a presença de anticorpos em um paciente clinicamente excepcionalmente es- tável que se aglutinam a placas beta-amiloides conforme foi confirmado pela co-mancha com um anticorpo conhecido contra o beta-amiloide humano (an- ticorpo 4G8; Figura 1B). A presença em um sujeito humano saudável de an- ticorpos para emaranhados neurofibrilares em uma seção de tecido obtido de um paciente com doença de Alzheimer é mostrada na figura 2A. Este re- sultado foi confirmado pela co-mancha com um anticorpo conhecido contra tau humano (HT7). A figura 3A revela a presença em um sujeito humano saudável de anticorpos contra neurites distróficas em uma seção de tecido obtida de um paciente com doença de Alzheimer. Mancha de controle com anticorpo conhecido contra o tau humano (HT7) é ilustrada na Figura 3 B. Esses resultados demonstram a presença, em pacientes fenotipicamente saudáveis ou excepcionalmente clinicamente estáveis, de anticorpos contra estruturas patológicas identificáveis em amostras de tecido humano com diagnóstico histopatologicamente confirmado.

Exemplo 2

Anticorpos humanos recombinantes mantêm especificidade para estrutura anormal in vivo e reconhecem epitopo conformacional de protepina beta- amiloide associada à doença em placas de amiloides do cérebro mas não seu precursor fisiológico ou derivado não patogênico.

Anticorpos NI-101.11, NI-101,12, NI-101.13A e NI-101.13B fo- ram obtidos de pacientes com a doença de Alzheimer excepcionalmente cli- nicamente estáveis com uma taxa significantemente reduzida de declínio cognitivo. O isolamento dos anticorpos e a produção de recombinantes fo- ram realizados conforme especificado nos métodos complementares. NI-101.11

O NI-101.11 recombinante foi testado quanto à aglutinação às placas beta-amiloides do cérebro. As seções cerebrais obtidas de um paci- ente com doença de Alzheimer neuropatologicamente confirmada foram manchadas nas concentrações indicadas. A aglutinação do anticorpo às pla- cas beta-amiloides com concentrações de 50 pM sugere aglutinação de alta afinidade. A aglutinação do anticorpo NI-101.11 às placas beta-amiloides em uma concentração de 0,5 nM não pode sofrer concorrência pela adição de quantidades excessivas de polipeptídeo derivado de Abeta de terminação N sintético linear representando posições de 1 a 16 em concentrações de até 1 μΜ (Figura 5). Além disso, a aglutinação de NI-101.11 às placas beta- amiloides nas seções do cérebro em concentração de 8 nM sofre concorrên- cia de quantidades excessivas de fibrilas de Abetal-42 (4 μΜ) mas não de monômeros de Abetal-42 sintéticos lineares a uma concentração de 4 μΜ, sugerindo que Nl -101.11 reconhece um epitopo conformacional que não está presente no Abeta monomérico (Figura 6).

Para melhor avaliar a aglutinação do anticorpo NI-101.11 re- combinante humano ao Abeta sintético monomérico linear, preparações de Abeta monomérico foram separadas pelo PAGE não-desnaturante. Proteína manchada foi examinada com anticorpo NI-101.11 recombinante humano e um com um anticorpo de controle contra as seqüências Abeta lineares de terminação-N (6E10). Enquanto que o 6E10 produziu mancha proeminente do peptídeo Abeta monomérico, nenhuma aglutinação foi detectada para Nl- 101.11 sugerindo que NI-101.11 não se aglutina ao peptídeo Abeta mono- mérico linear mas reconhece um epitopo Abeta conformacional. (Figura 7)

A aglutinação do recombinante NI-101.11 às fibrilas amiloides artificiais preparadas a partir de peptídeos Abetal-42 sintéticos e do Abeta monomérico foi determinada pelo ELISA (Figura 8). Fibrilas Abeta ou Abeta sintéticas monoméricas pintadas sobre placas ELISA em iguais densidades de cobertura foram incubadas com NI-101.11 nas concentrações indicadas. A aglutinação às fibrilas amiloides artificiais (quadrados abertos) é mais do que 100 vezes superior conforme comparado com o Abeta monomérico (quadrados preenchidos). O anticorpo de controle 22C4 contra a terminação C do Abeta preferencialmente se aglutina ao Abeta monomérico (círculos preenchidos) e menos preferencialmente às fibrilas (círculos abertos). Isso sugere que o NI-101-10 reconhece um epitopo conformacional, que também está presente nas fibrilas amiloides preparadas a partir de peptídeos Abeta sintéticos.

A reatividade cruzada do anticorpo NI-101.11 humano recombi- nante contra o AP de comprimento total celular ou com qualquer de seus derivados fisiológicos foi determinada pelos testes de aglutinação das célu- las (Figura 9).

As células HEK-293 vivas que estavelmente expressam o APP humano fundido ao Citrin como um marcador foram incubadas por 30 minu- tos a 4°C, para evitar a internalização, com o anticorpo NI-101.11 humano recombinante ou com o anticorpo de controle 6E10 contra a seqüência Abe- ta linear de terminação N. Sinais de Cintrin-positivo indicam células que ex- pressam APP. Em contraste com o anticorpo de controle (6E10) que se aglu- tina ao APP de superfície da célula em todas as células que expressam o padrão de fusão, nenhuma aglutinação de anticorpo NI-101.11 humano re- combinante ao APP de comprimento total é detectada. Estes dados demons- tram a ausência de reatividade cruzada de NI-101.11 para APP de celular fisiológico.

A falta de aglutinação de NI-101.11 ao Abeta monomérico foi ainda demonstrada pela cromatografia de exclusão do tamanho. Nenhuma algutinação do NI-101.11 ou de um anticorpo de controle não relacionado foi observada para o Abeta 1-42 não rotulado de FITC monomérico. (Figura 10A, 10B). Em contraste, o anticorpo 22C4 dirigido contra um epitopo linear pre- sente na terminação C do Abeta co-eluiu com os monômeros FITC-AbetaI- 42 (Figura 10 C).

Em um ELISA de concorrência, a aglutinação de 6E10, um anti- corpo dirigido contra um epitopo linear na terminação N do Abeta, poderia ser completamente bloqueado quando da pré-incubação com concentrações em excesso de peptídeos Abetal-16, Abetal-28 and Abetal-40 monoméri- cos. Em contraposição, a pré-incubação com concentrações em excesso de peptídeos Abeta lineares não aboliu a aglutinação do NI-101.11, sugerindo que o NI-101.11 requer um epitopo conformacional (Figura 11).

NI-101.13A e 13B

Os anticorpos NI-101.13A e 13B humanos recombinantes foram testados quanto à aglutinação às seções cerebrais obtidas de um modelo de camundongo APP transgênico de doença de Alzheimer (Tg2576). NI- 101.13A e NI-101.13B produziram mancha proeminente de placas beta- amiloides na concentração ~de~ 10 nM (Figura 12). aglutinação dos NI- 101. 13A e NI-101.13B recombinantes às fibrilas amiloides artificiais prepara- das dos peptídeos Abetal-42 sintéticos e do Abeta monomérico foi determi- nada pelo ELISA. As fibrilas Abeta sintéticas ou Abeta sintético monomérico pintados sobre as placas ELISA em iguais densidades de revestimento fo- ram incubadas com NI-101.13A e NI-101.13B nas concentrações indicadas. Aglutinação preferencial para fibrilas amiloides artificiais em comparação com monoméricas Abeta foi observado para ambos os anticorpos testados (Figura 13).

NI-101.12

A aglutinação do NI-101.12 recombinante ao peptídeo Abetal-42 sintético foi confirmada pelo ELISA (Figura 14A). A aglutinação do NI-101.12 em concentração de 133 nM sofreu concorrência pelo excesso de peptídeo Abetal-42 (Figura 14 B).

Exemplo 3

O anticorpo humano recombinante contra o beta-amiloide do cérebro cruza a barreira hematoencefálica em um modelo de camundongo transgênico da doença de Alzheimer e se aglutina às placas do beta-amiloide encefálicas in vivo.

Para determinar se o anticorpo NI-101.11 humano recombinante cruza a barreira hematoencefálica e se aglutina às placas beta-amiloides do cérebro in vivo, os camundongos do modelo da doença de Alzheimer PS- 1/APPswe transgênicos receberam duas injeções periféricas de 150 pg de NI-101.11 no dia 1 e no dia 3. Os camundongos foram sacrificados 24 h a - pós a segunda injeção e perfundidos com PBS. Os cérebros foram colhidos e as seções dos cérebros foram manchadas com anticorpos rotulados de FITC contra IgG humano ou com anticorpo 6E10 de anticorpo Abeta mono- clonal de camundongo seguido por um anticorpo rotulado de FITC contra IgG de camundongo para confirmar a presença das placas beta-amiloide do cérebro. A intensa mancha das placas amiloides com IgG anti-humano indi- cou que o anticorpo NI-101.11 humano recombinante pode cruzar a barreira hematoencefálica dos camundongos transgênicos e se aglutinar às placas beta-amiloides em animais vivos. (Figura 15).

Exemplo 4

O anticorpo humano recombinante contra o beta-amiloide melhora o compor- tamento cognitivo anormal e confere a redução de carga de placas beta- amiloides, astrogiose e microgliose em um modelo de camundongo transgê- nico da doença de Alzheimer sem aumentar a freqüência das micro- hemorragias.

Camundongos com arcAbeta de 24 meses de idade e filhotes do tipo selvagem com a mesma idade foram tratados semanalmente i.p. com 3 mg/kg de anticorpo NI-101.11 humano recombinante ou com um anticorpo de controle humano combinado com isotipo durante 2 meses. Para avaliar o efeito do tratamento sobre o comportamento anormal em camundongos transgênicos, o teste comportamental de labirinto em Y1 foi realizado antes e após a conclusão do tratamento. A taxa espontânea de alternação foi avalia- da usando um labirinto de plástico em forma de Y1 com braços medindo de 40 x 20 x 10 cm. Durante sessões de 5 minutos, as seqüências de entradas de braços são registradas; a alternância foi definida como entradas sucessi- vas nos três braços, em conjuntos trigêmeos de sobreposição. A alternância de percentual foi calculada como a razão das alternâncias reais para possí- veis (definido como o número total de entradas de braços - 2) multiplicado por 100%. O desempenho do labirinto em forma de Y de camundongos ar- cAbeta não tratados e de controle de filhotes do tipo selvagem foi compara- do usando um teste-t não emparelhado. Um teste não-paramétrico de Krus- kal-Wallis foi utilizado para comparar a melhora após o tratamento em todos os 4 grupos. O teste U de Mann-Whitney não-paramétrico foi escolhido para comparação em forma de par dos diferentes grupos. Os executores-zero (isto é, camundongos que não deixaram o braço em que eles estavam) fo- ram excluídos da análise.

Como foi observado nos estudos anteriores, camundongos ar- cAbeta de 24 meses de idade demonstraram estar significativamente inca- pacitados em comparação com seus irmãos do tipo selvagem (Figura 16A, antes do tratamento; teste t não emparelhado, ρ = 0,0007).

Camundongos arcAbeta tratados com NI-101.11 mostraram cla- ramente níveis de alteração elevados em comparação com camundongos de controle do tipo selvagem tratados com NI-101.11 após 2 meses de trata- mento. Análise da melhoria (ou seja, o desempenho após o tratamento me- nos desempenho antes do tratamento) mostrou uma diferença significativa entre os quatro grupos (Figura 16 B, teste de Kruskal-Wallis, ρ = 0,03). Uma análise post-hoc em forma de par entre todos os grupos mostrou que os ca- mundongos arcAbeta tratados com NI-101.11 melhorou seu desempenho cognitivo significativamente mais do que os camundongos do tipo selvagem (U de Mann-Whitney, ρ = 0,05 NI-101.11 tg em contraposição ao NI 101.11 wt, ρ = 0,008 NI-101.11 tg em contraposição ao controle wt). Este grupo de camundongos também mostrou uma forte tendência para o desempenho melhorado em comparação com os filhotes trangênicos tratados com anti- corpo de controle (U de Mann-Whitney; p=0.08 NI-101.11 tg em contraposi- ção ao controle tg). Todos os camundongos mostraram uma melhora de -10% no desempenho na repetição do teste, o que foi ocorreu provavelmen- te devido ao ambiente familiar da tarefa.

Os efeitos do tratamento com NI-101.11 por 2 meses em peso amiloide, astrogliose e microgliose foram analisados pela análise histoquími- ca e imuno-histoquímica quantitativa. Para essa finalidade, os camundongos foram anestesiados após a conclusão dos testes comportamentais e foram perfundidos transcardialmente com PBS. Um hemisfério cerebral foi fixado em 4% de paraformaldeído e incrustado em parafina. Seções sagitais de 5 μm foram cortadas com um micrótomo Leica RM 2135 (Bannockburn, Illi- nois). A carga de placa beta-amiloide em córtex e o hipocampo foram quanti- ficados nas seções do cérebro manchadas com Tioflavina S e Vermelho de congo, de acordo com o protocolo padrão. Para imunofluorescência, fatias foram desparafinadas, bloqueadas com 4% BSA, 5% de soro de cabra e 5% de soro de cavalo em PBS por 1h em TR. Os anticorpos foram incubados durante a noite a 4°C utilizando as seguintes diluições: anti GFAP (Advanced Immunochemicals) 1:500, anti IBA1 (Wako) 1:500. Anticorpos secundários acoplados de fluorofore foram incubados em TR por 2 h. 2-3 seções por cé- rebro de camundongo com 75 pm de espaçamento foram usadas para cada mancha. 2 imagens por seção foram tomadas na ampliação de 10x para a- nálise córtex (região frontal e parietal). Toda a área do hipocampo (5x de ampliação cortada para ROI) foi levada para a análise do hipocampo. A aná- lise da imagem automatizada foi feita com o software ImageJ.

Dupla mancha de seções de cérebro de camundongos arcAbeta imunizados com 6E10 e aglutinação revelada de IgG anti-humano de NI- 101.11 para depósitos Abeta (Figura 17, painel esquerdo), indicando que o NI-101.11 pode atravessar a barreira hematoencefálica e se aglutinar às pla- cas beta-amiloides. Nenhuma aglutinação como esta do anticorpo humano aos depósitos Abeta foi observada em camundongos arcAbeta tratados com anticorpo de controle (Figura 17 painel direito).

O tratamento crônico com 3mg/kg de NI-101.11 resultou em uma redução significativa da carga da placa amiloide como foi revelado pela Tio- flavina S e mancha Vermelho de congo. Esta redução atingiu níveis superio- res a 50% no córtex e no hipocampo em comparação aos camundongos ar- cAbeta tratados com anticorpo de controle (Figura 18 A, B). Além da área da placa (Fig 18 C), reduções significativas foram também observadas para o número de placas (Figura 18 D) e o tamanho medido da placa (Figura 18 E).

Para testar se o tratamento crônico com NI-101.11 afeta a res- posta neuroinflamatória nos camundongos arcAbeta, astrócitos reativos e microglia foram quantificados após a mancha imuno-histológica. A redução no número de astrócitos reativos (anti-mancha GFAP) foi observada no cór- tex de camundongos arcAbeta tratados com NI-101.11 em comparação com animais tratados com anticorpos de controle (Figura 19A; U deMann- Whitney, p = 0,047). Nenhuma alteração foi detectada no hipocampo. A mancha com um anticorpo contra um marcador de microglia e macrófagos (anti-lbal) também revelou uma tendência estatística para inflamação redu- zida (Figura 19 B; U de Mann-Whitney1 p = 0,075 tanto para o córtex como para o hipocampo). A diminuição na astrocitose e microgliose está alinhada com a carga beta-amiloide reduzida observada após o tratamento com NI- 101.11.

A imunoterapia passiva com certos anticorpos monoclonais diri- gidos contra o Abeta pode ser associada com freqüência aumentada de mi- cro-hemorragias no cérebro (Pfeifer et al., Science 298 (2002), 1379; Wil- cock et al., J Neuroinflammation 1 (2004), 24). Para avaliar os efeitos da te- rapia crônica com NI-101.11, a mancha azul da Prússia de Perl foi realizada nas seções do cérebro de camundongos do tipo selvagem e arcAbeta aos tratamento com NI-101.11 crônico. Esta mancha revela a presença de he- mossiderina, um produto de divisão da hemoglobina e marcador de micro- hemorragias anteriores (Figura 20). Em camundongos arcAbeta idosos tra- tados com um anticorpo de controle, a freqüência dos perfis positivos de azul prussiano foi significativamente elevada em comparação aos filhotes do tipo selvagem (U de Mann-Whitney1 ρ = 0,001). O tratamento com o NI-101.11 não levou a um aumento do número de micro-hemorragias quando compa- rado com os camundongos arcAbeta tratados com anticorpo de controle (U de Mann-Whitney, ρ = 0,347), indicando que os efeitos terapêuticos benéfi- cos do tratamento NI-101.11 ocorreram na ausência deste efeito colateral freqüentemente observado de imunoterapia passiva ao Abeta.

Exemplo 5

Anticorpo humano recombinante contra o beta-amiloide do cérebro inibe a formação das fibrilas abeta sintéticas in vitro.

O efeito do anticorpo NI-101.11 humano recombinante na forma- ção das fibrilas-Abeta foi testado pela medição da aglutinação de Tioflavina S ao Abeta agregado pela análise de fluorescência. Soluções Abeta mono- méricas foram incubadas a 37°C durante 24 h, quando da ausência do au- mento da concentração de NI-101.11. A formação de fibrilas Abeta sintéticas in vitro foi inibida pelo NI-101.11 humano recombinante de maneira depen- dente da concentração (Figura 21).

Exemplo 6

Efeitos do NI-101.11 sobre a fagocitose ex-vivo de fibrilas abeta por células derivadas micróglias BV-2

Os efeitos do NI-101.11 na fagocitose mediada pelo receptor- Fcgama das fibrilas Abeta foram estudados na linha de células derivadas de micróglias BV-2. As células BV-2 foram mantidas em DMEM complementado com 5% de FBS, Etapa/Pen e glutamina. As células foram tripisinizadas e cavidades/120.000 células BV-2 foram cultivadas em placas de 24 cavidades de base plana. Após 12 h, o meio foi substituído por 400 ul de DMEM/F12/cavidade completado com de 20 mM de HEPES (pH 7,3), 1% BSA1 10 mg/ml Etapa/Pen. 100 pg/ml de Fucoidan, um inibidor do receptor "scavenser", foi adicionado 30 minutos antes da experiência. 50 μΜ de fibri- las Abeta rotuladas de FITC foram pré-incubadas com concentrações indi- cadas de anticorpos durante 30 minutos a 37°C, lavadas duas vezes seguido de centrifugação por 5 min. a 14.000 χ g. Esta suspensão foi adicionada às placas de cultura do tecido. Após 30 min, as células BV-2 foram lavadas du- as vezes com HBSS para remover Abeta fibrilar não associado.

As células foram tratadas com 250 pg/m de tripsina/EDTA por 20 min a 4°C e lavadas duas vezes por centrifugação a 500 χ g por 5 min a 4°C. As células foram fixadas durante 20 min. em FACS-Fix (PBS, 2U, 2% de gli- cose, 5 mM NaN) e lavadas duas vezes com lavagem FACS (PBS, 5 μΜ EDTA, 0,2% BSA). A fluorescência (FL-1) de 10.000 células foi determinada pela análise FACS (com base em Webster SD etal., Jl 2001).

Fagocitose dependente do receptor Fcgamma de fibrilas Abetal- 42 rotuladas de FITC foi medida quando da inibição do sistema do receptor "scavenser". A análise comparativa de um anticorpo NI-101.11 humano e um anticorpo disponível comercialmente com um epitopo linear na terminação N do peptídeo Abeta (6E10) demonstrou a indução dependente de dose de fagocitose das fibrilas Abeta. A aceitação das fibrilas mediadas por NI- 101.11 é até 3 vezes maior que a observada para o anticorpo 6E10 (Figura 22). Esses dados indicam que o NI-101.11 dispara fagocitose mediada por receptor Fogamma dependente de dose potente de fibrilas Abeta pelas célu- las microgliais.

Conclusão

Conforme demonstrado nos experimentos acima realizados em conformidade com a presente invenção, foi surpreendentemente possível detectar os anticorpos ativos protetores e terapêuticos e as células-B produ- toras de anticorpos em sujeitos humanos fenotipicamente saudáveis, assin- tomáticos, como também em pacientes com cursos de doença clínicos ex- cepcionalmente estáveis a despeito de um diagnóstico de incapacidade cog- nitiva ou doença de Alzheimer. Mais especificamente, uma nova classe de anticorpos humanos poderia ser detectada e isolada, que discrimina a forma fisiologicamente funcional de um antígeno, minimizando, assim, o risco de efeitos secundários autoimunogênicos, até aqui representando um problema na imunoterapia. Assim, anticorpos e moléculas de aglutinação equivalentes são propiciados de modo que especificamente reconhecem uma variante do antígeno em uma estrutura patofisiologicamente relevante, à qual o anticor- po deverá se aglutinar para diminuir sua toxicidade ou para reduzir sua con- centração ou para promover sua degradação, por meio de, por exemplo, tor- nar o patógeno vísviel para macrogafos expressadores de FcR ou células micróglias e, portanto, torná-lo inócuo. Como ainda demonstrado nos exem- plos, tais anticorpos são terapeuticamente eficazes e são capazes de sus- pender como também impedir efeitos prejudiciais de proteínas patológicas anormais e seus agregados sem aumentar a freqüência das micro- hemorragias do cérebro. Listagem de Seqüência

<110> Universidade de Zurique

<120> MÉTODO PARA PROPICIAR MOLÉCULAS AGLUTINANTES E ALVOS ESPECÍFICOS DE DOENÇAS

<130> NE30A06/P-W0 <160> 56

<170> Patente versão 3.4

<210> 1

<211> 66

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> característica variada <222> (1) . . (66)

<223> Peptideo Líder derivado e a partir de Vkappa I L5 humano, sítio de restrição Xba 1 introduzido 3' da seqüência <220>

<221> CDS

<222> (1)..(66)

<400> 1

atg gac atg cgg gtg ccc gcc cag ctg ctg ggc ctg ctg ctg ctg tgg 48

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

ttc ccc ggc tct aga tgc 66

Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20

<210> 2

<211> 22

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp 15 10 15

Phe Pro Gly Ser Arg Cys 20

<210> 3

<211> 372

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região V_ <222> (1) .. (372)

<223> NI-IOl.10-seqüência de cadeia pesada variável (Vh) <220>

<221> CDS <222> (1) · · (372) <400> : gag gtg cag cta gtg cag tct ggg gga ggc gtg gtc cag CCt ggg agg 48 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga CtC tcc tgt gca gcg tct gga ttc gcc ttc agt age tat 96 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ala Phe Ser 30 Ser Tyr ggc ata cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Ile His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val gca gtt ata tgg ttt gat gga act aaa aaa tac tat aca gac tcc gtg 192 Ala Val 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Thr Lys Lys Tyr Tyr 60 Thr Asp Ser Val aag ggc aga ttc a cc ate tcc aga gac aat tcc aag aac aca ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac acc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Thr 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tvr Tvr 95 Cvs gcg aga gat agg ggt ata gga gct cgg cgg ggg ccg tac tac atg gac Ala Arg Asp Arg 100 Gly Ile Gly Ala Arg 105 Arg Gly Pro Tyr Tyr 110 Met Asp gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca Val Trp Gly 115 Lys Gly Thr Thr Val 120 Thr Val Ser Ser <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 00> 4 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Ile His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val 50 55 60 Lys 65 Gly Arg Phe Thr Ile 70 Ser Arg Asp Asn Ser 75 Lys Asn Thr Leu Tyr 80 Leu Gln Met Asn Thr 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly 115 Lys Gly Thr Thr Val 120 Thr Val Ser Ser

336

372

<210> 5

<211> 372

<212> DNA

<213> Artificial <220>

<223> Códon otimizado <220>

<221> Região V

<222> (1)..(372)

<223> ΝΙ-101.11-seqüência de cadeia pesada variável (Vh) <220>

<221> CDS

<222> (1)..(372)

<4 00> 5

gag gtg cag ctg gtg cag age ggc ggc ggc gtg gtg cag ccc ggc cgg 4 8

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 15 10 15

age ctg cgg ctg age tgc gcc gcc age ggc ttc gcc ttc age age tac 96

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

ggc atg cac tgg gtg cgg cag gcc ccc ggc aag ggc ctg gag tgg gtg 144

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

gcc gtg ate tgg ttc gac ggc acc aag aag tac tac acc gac age gtg 192

Ala Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val

50 55 60

aag ggc cgg ttc acc ate age cgg gac aac age aag aac acc ctg tac 240

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

ctg cag atg aac acc ctg cgg gcc gag gac acc gcc gtg tac tac tgc 288

Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

gcc cgg gac cgg ggc ate ggc gcc cgg cgg ggc ccc tac tac atg gac 336

Ala Arg Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp

100 105 110

gtg tgg ggc aag ggc acc acc gtg acc gtg age age 372

Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 6 <211> 124 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 6

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ala Phe Ser 30 Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Val 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Thr Lys Lys Tyr Tyr 60 Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Arg 100 Gly Ile Gly Ala Arg 105 Arg Gly Pro Tyr Tyr 110 Met Asp Val Trp Gly 115 Lys Gly Thr Thr Val 120 Thr Val Ser Ser

<210> 7

<211> 327 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> Região V_ <222> (1) . . (327)

<223> ΝΙ-101.10 e ΝΙ-101-ll-seqüência de cadeia leve kappa variável (Vkappa) <220>

<221> CDS

<222> (1) . . (327) <400> 7

gaa att gtg ctg act cag tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

35 1 5 10 15

gac aga gtc acc ate act tgc cgg gca agt cag age att age age tat 96

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

tta aat tgg tat caa cag aaa cca ggg aaa gee cct aag etc ctg ate 144

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

tat get gca tcc agt ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc ate age agt ctg caa cct 240

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

gaa gat ttt gca act tat tac tgt cag cag agt tac agt acc cct ctc 288

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu

85 90 95

act ttc ggc gga ggg acc aag ctc gag ate aaa cgt aeg 327

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr 100 105

<210> 8

<211> 109

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Ser Tyr Ser Thr Pro 95 Leu Thr Phe Gly Gly 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys Arg Thr <210> 9 <211> 381 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Região V_ <222> (1) . . (381) <223> NI-101.12 -seqüência de cadeia pesada variável (Vh) <220> <221> CDS <222> (1) . .(381) <4 00> 9 gag gtg cag ctg gtg gag age ggc CCC ggc ctg gtg aag ccc gcc gag Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ala Glu 1 5 10 15 acc ctg age ctg acc tgc acc gtg age ggc ggc age ate cgg age ggc Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Arg 30 Ser Gly age ate tgc tgg tac tgg ate cgg cag CCC CCC ggc aag ggc ctg gag Ser Ile Cys Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 tgg ate ggc tac ttc tgc tac age ggc gcc acc ttc tac acc CCC age Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser 50 55 60 ctg cgg ggc cgg ctg acc ate age gtg gac gee age aag aac cag ctg Leu Arg Gly Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Leu 65 70 75 80 age ctg age ctg age age gtg acc gcc gcc gac acc gcc gtg tac tac Ser Leu Ser Leu Ser 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr tgc gcc cgg cgg gcc ggc gag aac age ggc ggc ate gag CCC tac tac Cys Ala Arg Arg 100 Ala Gly Glu Asn Ser 105 Gly Gly Ile Glu Pro 110 Tyr Tyr ggc atg gac gtg tgg ggc cag ggc acc acc gtg acc gtg age age Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 10 <211> 127 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ala Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Arg 30 Ser Gly Ser Ile Cys Trp Tyr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser 50 55 60 Leu Arg Gly Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Leu 65 70 75 80 Ser Leu Ser Leu Ser 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Arg 100 Ala Gly Glu Asn Ser 105 Gly Gly Ile Glu Pro 110 Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 11 <211> 330 <212> DNA

<213> Homo sapiens <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <400>

Região V_ (D · · (330)

ΝΙ-101.12-Seqüência de cadeia leve kappa variável (Vkappa)

CDS

(1)··(330) 11

gac gag ate gtg ctg acc cag age cee age age etg age gec age ate Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile 15 10 15

ggc gae cgg gtg acc ate acc tgc cgg gec age gag age ate aac aag Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys

20 25 30

tac gtg aac tgg tac cag cag aag ccc ggc aag gec ccc aag ctg ctg Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

ate tac gcc gcc age age ctg cag age ggc gcc ccc age cgg gtg age Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Val Ser

50 55 60

ggc age ggc ttc ggc cgg gac ttc age ctg acc ate age ggc ctg cag Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80

gcc gag gac ttc ggc gcc tac ttc tgc cag cag age tac age gcc ccc Ala Glu Asp Phe Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro

85 90 95

tac acc ttc ggc cag ggc acc aag gtg gag ate aag cgg acc Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110

<210> 12

<211> 110

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 12

Asp Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile 15 10 15

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys

20 25 30

Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Ala Pro Ser Arg Val Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Phe Gly Arg Asp Phe Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80

Ala Glu Asp Phe Gly Ala Tyr Phe Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro

85 90 95

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr 100 105 110

13 363 DNA

Homo sapiens

<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <400>

Região V_ (1) . . (363)

NI-IOl.13-Seqüência de cadeia pesada variável (Vh)

CDS

(1)..(363) 13

cag gta cag ctg cag gag tca ggc cca gga ctg gtg aag cct tcg gag Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15

acc ctg tcc ctc acc tgc act gtc tet ggt ggc tcc ate age aga aga Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg

20 25 30

agt tac tac tgg ggc tgg ate cgc cag tcc cca ggg aag ggg ctg gag Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

96

144

192

240

288

330

48

96

144 35 40 45 tgg agt gga agt ate cat tat age ggg age acc tac tac aac ccg tcc Trp Ser 50 Gly Ser Ile His Tyr 55 Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser CtC aag agt cga gtc acc ata tet gta gac acg tcc aag aac cag ttc Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 tcc ctg aaa ctg age tet gtt acc gcc gea gac acg gct gtc tat tac Ser Leu Lys Leu Ser 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr tgt gcg aga tca cgt tgg ggc age age tgg gta ttt gac tac tgg ggc Cys Ala Arg Ser 100 Arg Trp Gly Ser Ser 105 Trp Val Phe Asp Tyr 110 Trp Gly cag ggc aca ctg gtc acc gtc tet tcg Gln Gly Thr 115 Leu Val Thr Val Ser 120 Ser <210> 14 <211> 121 <212> PRT <213> 1 Homo sapiens <400> 14 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu 20 Thr Cys Thr Val Ser 25 Gly Gly Ser Ile Ser 30 Arg Arg Ser Tyr Tyr 35 Trp Gly Trp Ile Arg 40 Gln Ser Pro Gly Lys 45 Gly Leu Glu Trp Ser 50 Gly Ser Ile His Tyr 55 Ser Gly Ser Thr Tyr 60 Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80 Ser Leu Lys Leu Ser 85 Ser Val Thr Ala Ala 90 Asp Thr Ala Val Tyr 95 Tyr Cys Ala Arg Ser 100 Arg Trp Gly Ser Ser 105 Trp Val Phe Asp Tyr 110 Trp Gly Gln Gly Thr 115 Leu Val Thr Val Ser 120 Ser

192

240

288

336

363

<210> 15 <211> 330 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> Região V <222> (1) . . (330) <223> NI-IOl.13 -Seqüência de cadeia ι leve lambda ι variável (Vlambda) <220> <221> CDS <222> (1) . . (330 ) <400> 15 cag age gtg ctg acc cag ccg ccg age gcg age ggc acc ccg ggc cag Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 cgc gtg acc att age tgc age ggc age age age aac att ggc age aac Arg Val Thr Ile 20 Ser Cys Ser Gly Ser 25 Ser Ser Asn Ile Gly 30 Ser Asn tat gtg tat tgg tat cag cag ccg ccg ggc acc gcg ccg aaa ctg ctg Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 att tat cgc aac aac cag cgc ccg age ggc gtg ccg gat cgc ttt age Ile Tyr Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 ggc age aaa age ggc acc age gcg age ctg gcg att age ggc ctg cgc Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 age gaa gat gaa gcg gat tat tat tgc gcg gcg tgg gat gat age ctg Ser Glu Asp Glu Ala 85 Asp Tyr Tvr Cvs Ala 90 Ala Trp Asp Asp Ser 95 Leu

48

96

144

192

240

288 age ggc tat gtg ttt Ser Gly Tyr Val Phe 100

<210> 16 <211> 110 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16

Gln Ser Val Leu Thr 1 5

Arg Val Thr Ile Ser 20

Tyr Val Tyr Trp Tyr 35

Ile Tyr Arg Asn Asn 50

Gly Ser Lys Ser Gly 65

Ser Glu Asp Glu Ala 85

Ser Gly Tyr Val Phe 100

<210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) . . (5)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de NI-101.10 Vh, CDRl <400> 17

Ser Tyr Gly Ile His 1 5

<210> 18 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) . . (17)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de NI-101.10 Vh, CDR2

<400> 18

Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 15 10 15

Gly

<210> 19 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(15)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.10 Vh, CDR3 <4 00> 19

Asp Arg Glv Ile Glv Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tvr Met Asp Val 1 5 10 15

ggc acc ggc acc aaa gtg acc gtg ctg Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 105 110 Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 10 15 Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 25 30 Gln Gln Pro Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 40 45 Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 55 60 Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 70 75 80 Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu 90 95 Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu 105 110 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(5)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.11 e NI-101.12F6A Vh, CDRl <400> 20

Ser Tyr Gly Met His 1 5

<210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) .. (17)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.11 e NI-101.12F6A <400> 21

Val Ile Trp Phe Asp Gly Thr Lys 1 5

Gly

<210> 22 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(15)

<223> > Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.11 e NI-101.12F6A Vh, CDR3 <400> 22

Asp Arg Gly Ile Gly Ala Arg Arg Gly Pro Tyr Tyr Met Asp Val 1 5 10 15

<210> 23 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(11)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.10, NI-101.11 e NI-101.12F6A Vkappa, CDRl <400> 23

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 24

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

Vh, CDR2

Lys Tyr Tyr Thr Asp Ser Val Lys 10 15 <223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1)..(7)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.10, NI-101.11 e NI-101.12F6A Vkappa, CDR2

<400> 24

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 25

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1)..(9)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.10, NI-101.11 and NI-101.12F6A Vkappa, CDR3

<400> 25

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 26

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1)..(5)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.12 Vh, CDRl

<400> 26

Ser Gly Ser Ile Cys

1 5

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1) .. (19)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.12 Vh, CDR2

<400> 27

Trp Ile Gly Tyr Phe Cys Tyr Ser Gly Ala Thr Phe Tyr Thr Pro Ser

1 5 10 15

Leu Arg Gly

<210> 28

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1) . . (17) <223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.12 Vh, CDR3 <400> 28

Arg Ala Gly Glu Asn Ser Gly Gly Ile Glu Pro Tyr Tyr Gly Met Asp 15 10 15

Val

<210> 29

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(11)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl. 12 Vkappa, CDRl <400> 29

Arg Ala Ser Glu Ser Ile Asn Lys Tyr Val Asn

15 10

<210> 30

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) . . (7)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.12 Vkappa, CDR2 <4 00> 30

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) . . (9)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.12 Vkappa, CDR3 <400> 31

Gln Gln Ser Tyr Ser Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 32

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(7)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.13 Vh, CDRl <4 00> 32

Arg Arg Ser Tyr Tyr Trp Gly 1 5

<210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(16)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.13 Vh, CDR2 <400> 33

Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser

1 5 10 15

<210> 34

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(11)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.13 Vh, CDR3 <400> 34

Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr 15 10

<210> 35 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(13)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.13 Vlambda, CDRl <4 00> 35

Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Tyr 15 10

<210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) . . (7)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.13 Vlambda, CDR2 <4 00> 36

Arg Asn Asn Gln Arg Pro Ser 1 5

<210> 37 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1)..(11)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat

de

NI-101.13 Vlambda, CDR3

<400> 37

Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val 1 5 10

<210> 38

<211> 372

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região V

<222> (1)..(372)

<223> NI-IOl.12F6A-seqüência dde cadeia pesada variável (Vh)

<220>

<221> CDS

<222> (1)..(372)

<400> 38

cag gtg cag ctg gtg gag tet ggg gga ggc gtg gtc cag CCt ggg agg 48 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 tcc ctg aga CtC tcc tgt gca gcg tet gga ttc gcc ttc agt age tat 96 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ala Phe Ser 30 Ser Tyr ggc atg cac tgg gtc cgc cag gct cca ggc aag ggg ctg gag tgg gtg 144 Gly Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val gca gtt ata tgg ttt gat gga act aaa aaa tac tat aca gac tcc gtg 192 Ala Val 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Thr Lys Lys Tyr Tyr 60 Thr Asp Ser Val aag ggc aga ttc acc ate tcc aga gac aat tcc aag aac aca ctg tat 240 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 ctg caa atg aac acc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288 Leu Gln Met Asn Thr 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys gcg aga gat agg ggt ata gga gct cgg cgg ggg ccg tac tac atg gac 336 Ala Arg Asp Arg 100 Gly Ile Gly Ala Arg 105 Arg Gly Pro Tyr Tyr 110 Met Asp gtc tgg ggc aaa ggg acc acg gtc acc gtc tcc tca 372 Val Trp Gly 115 Lys Gly Thr Thr Val 120 Thr Val Ser Ser <210> 39 <211> 124 <212> PRT <213> 1 Homo sapiens <400> 39 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu 20 Ser Cys Ala Ala Ser 25 Gly Phe Ala Phe Ser 30 Ser Tyr Gly Met His 35 Trp Val Arg Gln Ala 40 Pro Gly Lys Gly Leu 45 Glu Trp Val Ala Val 50 Ile Trp Phe Asp Gly 55 Thr Lys Lys Tyr Tyr 60 Thr Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Thr 85 Leu Arg Ala Glu Asp 90 Thr Ala Val Tyr Tyr 95 Cys Ala Arg Asp Arg 100 Gly Ile Gly Ala Arg 105 Arg Gly Pro Tyr Tyr 110 Met Asp Val Trp Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 40 <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <220> <221> <222> <400>

324 DNA Homo

sapiens

Região V (1)··(324)

NI-IOl.12F6A-seqüência de cadeia leve variável (Vkappa) CDS

(1)...(324) 40

20

tta aat tgg tat Leu Asn Trp Tyr 35

tat gct gca tcc Tyr Ala Ala Ser 50

agt gga tct ggg Ser Gly Ser Gly 65

70

85

100

41

108

PRT

Homo sapiens 41

tct cca tcc tcc ctg tct gca tct gta gga 48 Ser Pro Ser Ser 10 Leu Ser Ala Ser Val 15 Gly tgc cgg gca agt cag age att age age tat 96 Cys Arg Ala 25 Ser Gln Ser Ile Ser 30 Ser Tyr aaa cca ggg aaa gcc CCt aag CtC ctg ate 144 Lys Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc 192 Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 55 60 ttc act CtC acc ate age agt ctg caa CCt 240 Phe Thr Leu Thr Ile 75 Ser Ser Leu Gln Pro 80 tac tgt cag cag agt tac agt acc CCt etc 288 Tyr Cys Gln Gln 90 Ser Tyr Ser Thr Pro 95 Leu aag gtg gag ate aaa cgt 324 Lys Val Glu 105 Ile Lys Arg

<210> <211> <212> <213> <400>

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

1 5 10

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser

20 25

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

35 40

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 65 70 75

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr

85 90

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

42 121 PRT

Homo sapiens

45

Ser Val Gly 15 Ser Ser Tyr 30 Leu Leu Ile Phe Ser Gly Leu Gln Pro 80 Thr Pro Leu 95

<210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>

Região V (1)■■(121)

NI-IOl.13A-seqüência 42

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser 1 5

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 20

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile 35

Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr

de cadeia pesada variável (Vl)

Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

10 15

Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg

25 30

Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu 40 45 Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 43 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> Região V <222> (1)..(121)

<223> NI-101.13B-seqüência de cadeia pesada variável (Vh) <400> 43

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Arg

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ser Gly Ser Ile His Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Ser Arg Trp Gly Ser Ser Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 44 <211> 107 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<221> Região V <222> (1) .. (107)

<223> NI-101.13A-seqüência de cadeia leve variável (Vl) <400> 44

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 45

<211> 108

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região V <222> (1) . . (108)

<223> NI-101.13B-seqüência de cadeia leve variável (Vl) <400> 45

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr 20 Ile Thr Cys Arg Ala 25 Ser Gln Ser Ile Ser 30 Ser Trp Leu Ala Trp 35 Tyr Gln Gln Ile Pro 40 Gly Lys Ala Pro Lys 45 Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr 85 Tyr Tyr Cys Gln Gln 90 Tyr Asn Ser Tyr Ser 95 Arg Thr Phe Gly Gln 100 Gly Thr Lys Leu Glu 105 Ile Lys Arg <210> 46 <211> 11

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(11)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.13A-seqüência de cadeia leve variável (Vl)fCDRl <400> 46

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1)..(7)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.13A-seqüência de cadeia leve variável (V1),CDR2 <4 00> 47

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) .. (8)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-IOl.13A-seqüência de cadeia leve variável (V1),CDR3 <4 00> 48

Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Arg Thr 1 5

<210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR) <220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA <222> (1) .. (11) <223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101. 13B-seqüência de cadeia leve variável (V1),CDR1,

<400> 49

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1)··(7)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.13B-seqüência de cadeia leve variável (V1),CDR2

<400> 50

Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser 1 5

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<220>

<223> Região determinante de complementaridade (CDR)

<220>

<221> CARACTERÍSTICA VARIADA

<222> (1) . . (9)

<223> Denominação das seqüências de proteínas de CDR na Nomenclatura Kabat de

NI-101.13B-seqüência de cadeia leve variável (Vl),CDR3

<400> 51

Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Ser Arg Thr 1 5

<210> 52

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região V

<222> (1)..(363)

<223> NI-IOl.13A-seqüência de cadeia pesada variável (Vh)

<400> 52

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agaagaagtt actactgggg ctggatccgc 120

cagtccccag ggaaggggct ggagtggagt ggaagtatcc attatagcgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatctgtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaaac tgagctctgt taccgccgca gacacggctg tctattactg tgcgagatca 300

cgttggggca gcagctgggt atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360

tcg 363

<210> 53

<211> 363

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<220>

<221> Região V

<222> (1)..(363)

<223> NI-IOl.13B-seqüência de cadeia pesada variável (Vh)

<400> 53

caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tctctggtgg ctccatcagc agaagaagtt actactgggg ctggatccgc 120

cagtccccag ggaaggggct ggagtggagt ggaagtatcc attatagcgg gagcacctac 180

tacaacccgt ccctcaagag tcgagtcacc atatctgtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaaac tgagctctgt taccgccgca gacacggctg tctattactg tgcgagatca 300 cgttggggca gcagctgggt atttgactac tggggccagg gaaccctggt caccgtctcc 360 tcg <210> <211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>

363

54 324 DNA Homo

sapiens

Região V (1) .. (324)

NI-IOl.13A-seqüência de cadeia leve variável (Vl) 54

gacatccagt tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtatca gcagaaacca gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct gaagattttg caacttacta ctgtcaacag agttacagta ccagaacgtt cggccaaggg accaaggtgg agatcaaacg tacg <210> 55 327 DNA

Homo sapiens

60 120 180 240 300 324

<211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>

Região V (1)..(327)

NI-101.13B-seqüência de cadeia leve variável (Vl) 55

gacatccagt tgacccagtc tccttccacc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc atcacttgcc gggccagtca gagtattagt agctggttgg cctggtatca gcagattcca gggaaagccc ctaagctcct gatctataag gcgtctagtt tagaaagtgg ggtcccatca aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct gatgattttg caacttatta ctgccaacag tataatagtt attctcgaac gttcggccaa gggaccaagc tggagatcaa acgtacg <210> 56 372 DNA

Homo sapiens

60 120 180 240 300 327

<211> <212> <213> <220> <221> <222> <223> <400>

Região V (1).·(372)

NI-101.11-seqüência de cadeia pesada variável (Vh) 56

gaggtgcagc tggtgcagtc tgggggaggc gtggtccagc ctgggaggtc cctgagactc tcctgtgcag cgtctggatt cgccttcagt agctatggca tgcactgggt ccgccaggct ccaggcaagg ggctggagtg ggtggcagtt atatggtttg atggaactaa aaaatactat acagactccg tgaagggcag attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacactgtat ctgcaaatga acaccctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagagatagg ggtataggag ctcggcgggg gccgtactac atggacgtct ggggcaaagg gaccacggtc

60 120 180 240 300 360

accgtctcct ca

372

Claims (51)

1. Método para isolamento de uma molécula aglutinante especí- fica de proteína associada a distúrbio, compreendendo: (a) a exposição de uma espécime obtida de um paciente sem sintomas, mas afetado por ou em risco de desenvolver um distúrbio, ou de um paciente com um curso de doença excepcionalmente estável, a um espécime de células alteradas patologicamente ou tecido de características clínicas predetermi- nadas; e (b) a identificação e, opcionalmente, o isolamento de uma molécula agluti- nante que se aglutina ao dito espécime, mas não às células ou tecidos cor- respondentes de um sujeito saudável.

2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a dita espé- cime compreende um fluido corporal ou uma espécime de célula.

3. Método de acordo com a reivindicação 2, em que o dito fluido 15 corporal ser um fluido cerebroespinal, plasma ou urina 5.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -3, em que a dita molécula aglutinante é um anticorpo.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -4, em que a dita espécime compreende ou é derivada de células-B ou de 20 células-B de memória.

6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -5, em que o dito paciente e o dito sujeito, respectivamente, são seres huma- nos.

7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -6, em que foi determinado que o dito paciente estava afetado por um distúr- bio ainda não manifestado ou em risco de desenvolver o distúrbio pela pre- sença ou ausência de um marcador substituto.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, em que o dito mar- cador substituto é selecionado do grupo consistindo em senilidade, carga de amiloides cerebrais, genótipo ApoE, genótipo APP, genótipo PS1, níveis em fluidos corporais de peptídeo Abeta, isoprostanos, Tau e fosfo-Tau.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a -8, em que o dito distúrbio é selecionada do grupo consistindo em distúrbios, neurológicos, distúrbios, autoimunes e tumores.

10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o dito distúrbio é a doença de Alzheimer.

11. Método de acordo com a reivindicação 10, em que a espé- cime é obtida de um paciente que se enquadra nos seguintes critérios: (i) tem 65 anos de idade ou mais; (ii) possui capacidade cognitiva completa e boa saúde; e (iii) não apresenta nenhum sinal clínico de demência; ou (iv) possui taxas excepcionalmente lentas da progressão do distúrbio, a des- peito da presença de um diagnóstico clínico estabelecido de provável doen- ça de Alzheimer.

12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ainda compreendendo as etapas de: (i) purificação das células B ou das células B de memória a partir de uma espécime que foi identificada como contendo moléculas aglutinantes, por exemplo, anticorpos que se aglutinam ao dito espécime, mas não às células ou tecido correspondente de um sujeito saudável; (ii) obtenção de um repertório de genes de imunoglobulina para os ditos an- ticorpos das ditas células B e células B de memória; e (iii) uso do dito repertório para expressar os ditos anticorpos.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, em que a etapa (ii) compreende as etapas de: (iv) obtenção do mRNA das ditas células B ou células B de memória; (v) obtenção do cDNA do mRNA da etapa (iv); e (vi) uso de uma reação de extensão de iniciador para ampliação a partir do dito cDNA, dos fragmentos correspondentes às cadeias pesadas (HC) e às cadeias leves kappa (LC) dos ditos anticorpos.

14. Molécula aglutinante obtida pelo método como definido em 30 qualquer uma das reivindicações 1 a 13, a qual é capaz de seletivamente reconhecer um neoepitopo de uma proteína associada ao distúrbio.

15. Molécula aglutinante de acordo com a reivindicação 14, a qual substancialmente não reconhece a dita proteína em sua forma não as- sociada ao distúrbio.

16. Molécula aglutinante de acordo com a reivindicação 14 ou -15, a qual é um anticorpo ou um fragmento aglutinante antígeno do mesmo.

17. Anticorpo como definido na reivindicação 16, o qual é um anticorpo humano.

18. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 17, em que o dito distúrbio é um distúrbio neurológico.

19. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 18, em que o dito distúrbio é um distúrbio do cérebro.

20. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações de 14 a 19, a qual é capaz de cruzar a barreira hematoencefáli- ca no local do evento patológico.

21. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 20, capaz de aglutinar placas beta-amiloides, amiloide ce- rebrovascular, depósitos Abeta difusos, emaranhados neurofibrilares, tau hiperfosforilatados, corpos de Lewy positivos para alfa-sinucleína ou agrega- dos de proteína associados com neuritos distróficos.

22. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 21, a qual é capaz de substancialmente restaurar o com- portamento normal.

23. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 22, a qual é selecionada do grupo consistindo em fragmen- to Fv (scFv) em cadeia única, em um fragmento F(ab'), em um fragmento F(ab) e em um fragmento F(ab')2.

24. Molécula aglutinante de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 14 a 23, a qual é um anticorpo ou respectivo fragmento agluti- nante do mesmo compreendendo em sua região variável pelo menos uma região determinante de complementaridade (CDR) conforme ilustrado na Tabela 4.

25. Anticorpo ou fragmento aglutinante como definido na reivin- dicação 24 compreendendo uma seqüência de aminoácidos da região VH e/ou Vl conforme ilustrado nas Tabelas 2 e 3.

26. Antígeno, o qual é reconhecido pela molécula aglutinante como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 25.

27. Antígeno de acordo com a reivindicação 26, o qual é pelo menos parte de uma proteína associada a distúrbio conforme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

28. Polinucleotídeo codificando a molécula aglutinante como de- finida em qualquer uma das reivindicações 14 a 25, ou o antígeno como de- finido na reivindicação 26 ou 27.

29. Polinucleotídeo de acordo com a reivindicação 28, codifican- do pelo menos a região variável de uma cadeia de imunoglobulinas do anti- corpo ou do fragmento aglutinante como definido na reivindicação 24 ou 25.

30. Vetor compreendendo o polinucleotídeo como definido na reivindicação 28, ou o polinucleotídeo como definido na reivindicação 29, opcionalmente em combinação com um polinucleotídeo como definido na reivindicação 29, que codifica a região variável da outra cadeia de imunoglo- bulina do dito anticorpo.

31. Célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29, ou um vetor como definido na reivindica- ção 30.

32. Método para preparação de uma molécula aglutinante espe- cífica de proteína associada a distúrbio, um anticorpo ou um fragmento aglu- tinante ou cadeia(s) de imunoglobulina dos mesmos, o dito método compre- endendo: (a) a cultura da célula da reivindicação 31; e (b) o isolamento da dita molécula aglutinante, do anticorpo ou fragmento a- glutinante ou cadeia(s) de imunoglobulina dos mesmos a partir da cultura.

33. Molécula aglutinante, um anticorpo, uma cadeia de imuno- globulina ou um fragmento aglutinante dos mesmos codificado por um poli- nucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29, ou obteníveis pelo mé- todo como definido na reivindicação 32.

34. Molécula aglutinante, anticorpo ou fragmento aglutinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25 ou 33, que é detectá- vel por marcação.

35. Molécula aglutinante, anticorpo ou fragmento aglutinante de acordo com a reivindicação 34, em que o rótulo detectável foi selecionado do grupo consistindo em uma enzima, em um radioisótopo, um fluoróforo e um metal pesado.

36. Molécula aglutinante, anticorpo ou fragmento aglutinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25 ou 33 a 35, que é liga- do a um fármaco.

37. Composição compreendendo a molécula aglutinante, anti- corpo ou fragmento aglutinante de qualquer das reivindicações 14 a 25 ou -33 a 36, o antígeno como definido na reivindicação 26 ou 27, o polinucleotí- deo como definido na reivindicação 28 ou 29, o vetor como definido na rei- vindicação 30 ou a célula como definido na reivindicação 31.

38. Composição de acordo com a reivindicação 37, a qual é uma composição farmacêutica e ainda compreende um veículo aceitável farma- ceuticamente.

39. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 38, ainda compreendendo um agente adicional útil para tratamento da doença de Alzheimer, selecionado do grupo consistindo em moléculas orgânicas pequenas, anticorpos anti-Abeta e combinações dos mesmos.

40. Composição de acordo com a reivindicação 37, a qual é uma composição diagnostica e ainda compreende reagentes convencionalmente usados em métodos diagnósticos baseados em ácido nucleico ou imune.

41. Uso da molécula aglutinante, anticorpo ou fragmento agluti- nante de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25 ou 33 a 36 ou de um anticorpo contendo substancialmente as mesmas especificidades aglutinantes daqueles, o antígeno como definido na reivindicação 26 ou 27, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29, o vetor como de- finido na reivindicação 30 ou a célula como definido na reivindicação 31 para a preparação de uma composição farmacêutica ou diagnostica para trata- mento ou prevenção da progressão da doença de Alzheimer; para a melhora dos sintomas associados à doença de Alzheimer; para diagnóstico ou ras- treio de um sujeito quanto à presença da doença de Alzheimer ou para de- terminação do risco de um sujeito de desenvolver a doença de Alzheimer.

42. Uso de acordo com a reivindicação 41, em que a dita com- posição farmacêutica é administrada de forma intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parenteral ou em aerossol.

43. Método de tratamento de um distúrbio neurológico caracteri- zado pelo acúmulo e/ou deposição anormal de uma proteína no sistema ner- voso central, cujo método compreende a administração a um sujeito com esta necessidade de uma quantidade terapeuticamente eficaz da molécula aglutinante como definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 25 ou -33 a 36, do antígeno como definido na reivindicação 26 ou 27, do polinucleo- tídeo como definido na reivindicação 28 ou 29, do vetor como definido na reivindicação 30 ou da célula como definido na reivindicação 31.

44. Método de acordo com a reivindicação 43, em que o dito dis- túrbio é selecionado do grupo consistindo na doença de Alzheimer, na sín- drome de Down, no impedimento cognitivo moderado, na angiopatia amiloi- de cerebral, na demência vascular, na demência multi-infarto, no distúrbio de Parkinson, no distúrbio de Huntington, no distúrbio de Creutzfeldt-Jakob, na fibrose cística ou no distúrbio de Gaucher.

45. Método de acordo com a reivindicação 43 ou 44, em que a administração é realizada de forma intravenosa, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, parenteral ou em aerossol.

46. Método de diagnóstico e/ou tratamento de um distúrbio rela- cionado com a doença de Alzheimer e a deposição Abeta, respectivamente, compreendendo a administração a um sujeito de uma quantidade terapeuti- camente eficaz de uma molécula aglutinante de Abeta Iigante compreenden- do pelo menos um CDR do anticorpo ou um fragmento aglutinante como de- finido na reivindicação 24 ou 25 ou de um anticorpo anti-idiotípico corres- pondente.

47. Kit para diagnóstico de um distúrbio que é acompanhado da presença de uma proteína associada a distúrbio conforme definido em qual- quer um dos peptídeos reivindicados, o dito kit compreendendo a molécula aglutinante, o anticorpo ou o fragmento aglutinante de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 25 ou 33 a 36, o antígeno como definido na reivindicação 26 ou 27, o polinucleotídeo como definido na reivindicação 28 ou 29, o vetor como definido na reivindicação 30 ou a célula como definido na reivindicação 31, opcionalmente com reagentes e/ou instruções para uso.

48. Uso de uma molécula aglutinante, um anticorpo ou fragmen- to aglutinante dos mesmos de qualquer das reivindicações 14 a 25 ou 33 a 36 para detecção in vivo de ou direcionando um agente terapêutico e/ou di- agnóstico a uma proteína associada a distúrbio no cérebro, detectando, su- primindo a formação de ou reduzindo os agregados ou conformações da proteína patológica em um sujeito, para melhora da cognição ou retardamen- to ou reversão do declínio cognitivo associado com as doenças, ou para ex- tração extracorpórea dos compostos patológicos ou de seus precursores dos fluidos corporais.

49. Anticorpo isolado ou fragmento aglutinante ao antígeno que especificamente aglutina ao mesmo neoepitopo de uma proteína associada a distúrbio como um anticorpo de referência selecionado do grupo consistin- do em NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, Nl-101.13AeNI-101.13B.

50. Anticorpo isolado ou fragmento aglutinante do antígeno, em que o anticorpo competitivamente inibe um anticorpo de referência selecio- nado do grupo consistindo em NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A e NI-101.13B de se aglutinar ao neoepitopo de um distúrbio associado.

51. Anticorpo isolado ou fragmento aglutinante do antígeno em que o anticorpo compreende um domínio de aglutinação do antígeno idênti- co àquele de um anticorpo selecionado do grupo consistindo em NI-101.10, NI-101.11, NI-101.12, NI-101.13, NI-101.12F6A, NI-101.13A e NI-101.13B.