WO2015041310A1 - 抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療 - Google Patents

抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療 Download PDF

Info

Publication number
WO2015041310A1
WO2015041310A1 PCT/JP2014/074789 JP2014074789W WO2015041310A1 WO 2015041310 A1 WO2015041310 A1 WO 2015041310A1 JP 2014074789 W JP2014074789 W JP 2014074789W WO 2015041310 A1 WO2015041310 A1 WO 2015041310A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
protein
antibody
mouse
activated
hemophilia
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/074789
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
剛久 北澤
亜弥 中根
一隆 吉橋
哲弘 添田
厚 武藤
Original Assignee
中外製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 中外製薬株式会社 filed Critical 中外製薬株式会社
Priority to JP2015537971A priority Critical patent/JP6445440B2/ja
Priority to US15/021,718 priority patent/US20160229922A1/en
Priority to EP14845545.4A priority patent/EP3047857A4/en
Publication of WO2015041310A1 publication Critical patent/WO2015041310A1/ja
Priority to US16/391,848 priority patent/US20190248921A1/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding

Definitions

  • the present invention relates to a composition for treating bleeding disorders containing a substance that inhibits the activation of protein C. Specifically, the present invention relates to a composition containing an anti-protein C antibody that inhibits protein C activation as an active ingredient.
  • Hemophilia A is a hemorrhagic disease caused by a congenital defect or dysfunction of blood coagulation factor VIII (FVIII) or blood coagulation factor IX (FIX).
  • the former is called hemophilia A and the latter is called hemophilia B. Since both genes are present on the X chromosome and genetic abnormalities are transmitted by sexual recessive inheritance, more than 99% of affected individuals are male. The prevalence is approximately 1 per 10,000 births and the ratio of hemophilia A to hemophilia B is known to be approximately 5: 1.
  • Main bleeding sites include intra-articular, intramuscular, subcutaneous, intraoral, intracranial, gastrointestinal tract, and nasal cavity.
  • repeated bleeding into the joint has progressed to hemophilic arthropathy with joint disorders and difficulty walking, and eventually joint replacement may be necessary. This is a major factor for the decline.
  • the severity of hemophilia is defined by FVIII activity or FIX activity in the blood. Patients with less than 1% activity are severe, patients with 1% or more but less than 5% are moderate, patients with 5% or more but less than 40% The patient is classified as mild. Severe patients, which account for about 60% of hemophilia patients, have bleeding episodes several times a month, which is significantly more frequent than moderate and mild patients. For this reason, in patients with severe hemophilia, maintaining FVIII activity or FIX activity in blood at 1% or more is considered to be effective in preventing the onset of bleeding symptoms (Non-patent Document 1).
  • vWF Von Willebrand factor
  • blood coagulation factors purified from plasma or produced by gene recombination techniques are mainly used.
  • Blood coagulation factors are not long-lasting (half-life is several hours to several tens of hours).
  • the blood half-life of FVIII preparations and FIX preparations is about 12 hours and 24 hours, respectively. Therefore, for continuous prevention, it is necessary to administer the FVIII preparation about 3 times a week or the FIX preparation about twice a week. This corresponds to maintaining approximately 1% or more as FVIII activity or FIX activity. It has been reported that this prophylactic administration can prevent haemophilic joint disorders caused by frequent intra-articular bleeding, and as a result, greatly contributes to improving QOL of hemophilia A patients.
  • blood clotting factors have the disadvantage of requiring intravenous administration.
  • inhibitors antibodies against FVIII or FIX, called inhibitors, may develop in hemophilia patients, particularly severe hemophilia patients.
  • an inhibitor When an inhibitor is generated, the effect of the coagulation factor formulation is hindered by the inhibitor.
  • neutralization therapy using a large amount of coagulation factor preparation or bypass therapy using complex concentrate or activated blood coagulation factor VII (FVIIa preparation) is performed.
  • hemostasis management for patients becomes very difficult, for example, because periodic supplement prevention has not been established. Therefore, there has been a strong demand for drugs that are not affected by the presence of inhibitors.
  • antibodies are attracting attention and applied as pharmaceuticals because they are highly stable in blood, can be administered subcutaneously, and have low antigenicity.
  • Antibodies are considered useful for the creation of pharmaceuticals because (i) wide dosing intervals, (ii) simple administration, and (iii) independent of the presence of inhibitors.
  • the blood half-life of antibodies is generally relatively long, from days to weeks.
  • antibodies migrate into the blood after subcutaneous administration.
  • it has a structure that is significantly different from FVIII and FIX, and has low antigenicity. That is, the antibody drug satisfies the above (i), (ii), and (iii).
  • PC protein C
  • APC activated protein C
  • EPCR endothelial protein C receptor
  • Non-Patent Document 5 has been reported that an antibody that inhibits the activity of APC exhibits a blood coagulation effect and can be used for the treatment of hemophilia.
  • the present invention is to provide a novel hemorrhagic disease treatment composition, anticoagulant action inhibiting composition or hemostatic action promoting composition having an excellent blood coagulation effect.
  • a pharmaceutical composition for treating bleeding disorders comprising a protein C activation inhibitor.
  • the hemorrhagic disease is a disease selected from hemophilia, acquired hemophilia, and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by dysfunction or deficiency of vWF Composition.
  • a pharmaceutical composition for promoting hemostasis comprising a protein C activation inhibitor.
  • the hemostatic action is an effect on hemorrhagic symptoms of diseases selected from hemophilia, acquired hemophilia, and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by dysfunction or deficiency of vWF.
  • the composition according to [4] The composition according to [4].
  • the composition according to [4], wherein the hemostatic effect is an effect on hemorrhagic symptoms of hemophilia A.
  • a pharmaceutical composition for inhibiting an anticoagulant action comprising a protein C activation inhibitor.
  • the composition according to [7], wherein the anticoagulant action is an anticoagulant action of activated protein C.
  • pharmaceutical composition is a composition used in combination with an activated protein C activity inhibitor.
  • the protein C activation inhibitor is an anti-protein C antibody.
  • the anti-protein C antibody is an antibody that binds to the heavy chain of protein C.
  • An anti-protein C antibody having an action of binding to the heavy chain of protein C and inhibiting the conversion of protein C to activated protein C.
  • a method for treating a bleeding disorder comprising a step of administering a protein C activation inhibitor.
  • the hemorrhagic disease is a disease selected from hemophilia, acquired hemophilia and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by vWF dysfunction or defect the method of.
  • the method according to [15], wherein the hemorrhagic disease is hemophilia A.
  • a method for promoting hemostasis comprising a step of administering a protein C activation inhibitor.
  • the hemostatic action is an effect on bleeding symptoms of a disease selected from hemophilia, acquired hemophilia, and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by vWF dysfunction or deficiency, [18] The method described in [18]. [20] The method according to [18], wherein the hemostatic effect is an effect on hemorrhagic symptoms of hemophilia A. [21] A method for inhibiting an anticoagulant action, comprising a step of administering a protein C activation inhibitor. [22] The method according to [21], wherein the anticoagulant action is an anticoagulant action of activated protein C.
  • the hemorrhagic disease is a disease selected from hemophilia, acquired hemophilia and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by vWF dysfunction or defect Use of. [29] The use according to [27], wherein the hemorrhagic disease is hemophilia A. [30] Use of a protein C activation inhibitor for producing a drug for promoting hemostasis. [31] The hemostatic action is an effect on hemorrhagic symptoms of diseases selected from hemophilia, acquired hemophilia, and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by vWF dysfunction or deficiency, [30] The use according to [30].
  • the hemorrhagic disease is a disease selected from hemophilia, acquired hemophilia, and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by vWF dysfunction or defect Substance.
  • the substance according to [39], wherein the hemorrhagic disease is hemophilia A.
  • the hemostatic action is an effect on hemorrhagic symptoms of diseases selected from hemophilia, acquired hemophilia, and von Willebrand disease or acquired von Willebrand disease caused by dysfunction or deficiency of vWF.
  • the substance according to [42], wherein the hemostatic effect is an effect on hemorrhagic symptoms of hemophilia A.
  • the substance according to [45], wherein the anticoagulant action is an anticoagulant action of activated protein C.
  • the substance according to any of [39] to [46], wherein the protein C activation inhibitor further inhibits the activity of activated protein C.
  • the broken line is the data of plasma without protein C activator (Protac) and without antibody.
  • the inhibitory activity against the anticoagulant action of activated protein C is stronger as Lag time on the vertical axis is shortened or PeakPheight is increased than in the antibody non-added group (0 ⁇ g / mL).
  • Lag time when protein C activator was added was shortened and Peak height added with protein C activator was increased in a concentration-dependent manner for both MP35 ( ⁇ ) and MP51 ( ⁇ ) From these results, it was shown that MP35 and MP51 have an activity of inhibiting the anticoagulant action of activated protein C.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for treating bleeding disorders, which comprises a protein C activation inhibitor.
  • inhibitortion of protein C activation refers to thrombin complexed with thrombomodulin. It means inhibiting protein C degradation.
  • the substance that inhibits the activation of protein C include a substance that inhibits the binding between protein C and thrombin. Specific examples include anti-protein C antibody, anti-thrombin antibody, anti-thrombomodulin antibody, protein C partial peptide, thrombin partial peptide, thrombomodulin partial peptide, and low molecular weight compounds having the same activity as these.
  • an anti-protein C antibody can be mentioned.
  • an antibody refers to an immunoglobulin that is naturally occurring or produced by partial or complete synthesis.
  • the antibody can be isolated from natural resources such as plasma and serum in which it naturally exists, or from the culture supernatant of hybridoma cells producing the antibody, or partially or completely by using techniques such as genetic recombination Can be synthesized.
  • Preferred examples of antibodies include immunoglobulin isotypes and subclasses of those isotypes.
  • human immunoglobulins nine classes (isotypes) of IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgD, IgE, and IgM are known. Of these isotypes, IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 are preferred for the antibody of the present invention.
  • a method for producing an antibody having a desired binding activity is known to those skilled in the art.
  • a method for producing an antibody that binds to protein C is exemplified, but the method is not limited thereto.
  • the anti-protein C antibody can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a mammal-derived monoclonal antibody can be suitably prepared.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by host cells transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • the monoclonal antibodies of the present invention include “humanized antibodies” and “chimeric antibodies”.
  • Monoclonal antibody-producing hybridomas can be prepared, for example, as follows by using known techniques. That is, using a protein C protein as a sensitizing antigen, a mammal is immunized according to a normal immunization method. The resulting immune cells are fused with known parental cells by conventional cell fusion methods. Next, hybridomas that produce anti-protein C antibodies can be selected by screening monoclonal antibody-producing cells that bind to an epitope in the protein C molecule by conventional screening methods.
  • Monoclonal antibodies are produced, for example, as shown below.
  • a suitable host cell is transformed by inserting a gene sequence encoding protein C into a known expression vector.
  • the desired protein C protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • the purified protein C protein can be used as a sensitizing antigen used for immunization against mammals.
  • Protein C partial peptides can also be used as sensitizing antigens.
  • the partial peptide can also be obtained from the amino acid sequence of protein C by chemical synthesis. It can also be obtained by incorporating a part of the protein C gene into an expression vector for expression.
  • the region and size of protein C peptide used as a partial peptide are not particularly limited to a specific embodiment.
  • a preferred binding region for the anti-protein C antibody to inhibit the activation of protein C includes protein C heavy chain.
  • a portion involved in binding to thrombin is preferable, and specifically, an activation peptide in the heavy chain or an epitope present in the vicinity thereof is preferable.
  • the epitope present in the vicinity means that, when an anti-protein C antibody binds to protein C, it is within a range in which the binding between thrombin and protein C can be three-dimensionally inhibited.
  • an antibody can inhibit the conversion of protein C to activated protein C. Therefore, in the present invention, an arbitrary sequence is preferably selected from amino acid sequences corresponding to the heavy chain of protein C and used as a sensitizing antigen.
  • the number of amino acids constituting the peptide to be sensitized antigen is preferably at least 5 or more, for example 6 or more, or 7 or more. More specifically, a peptide having 8 to 50, preferably 10 to 30 residues can be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein obtained by fusing a desired partial polypeptide or peptide of protein C protein with a different polypeptide can be used as a sensitizing antigen.
  • an antibody Fc fragment or a peptide tag can be suitably used.
  • a vector that expresses a fusion protein can be prepared by fusing genes encoding two or more desired polypeptide fragments in-frame and inserting the fusion gene into an expression vector as described above. The method for producing the fusion protein is described in Molecular® Cloning® 2nd® ed. (Sambrook, Jet et al., “Molecular® Cloning® 2nd® ed.,” 9.47-9.58 (1989) Cold® Spring® Labor® Lab.® press).
  • the mammal immunized with the sensitizing antigen is not limited to a specific animal, but is preferably selected in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodent animals eg, mice, rats, hamsters
  • rabbits, monkeys, and the like are preferably used.
  • the above animals are immunized with a sensitizing antigen.
  • immunization is performed by administering a sensitizing antigen by intraperitoneal or subcutaneous injection of a mammal.
  • a sensitized antigen diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline) or physiological saline at an appropriate dilution ratio is mixed with a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, and emulsified, if desired.
  • the sensitizing antigen is administered to the mammal several times every 4 to 21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a low molecular weight when used as a sensitizing antigen, it may be desirable to immunize the sensitizing antigen peptide bound to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • a hybridoma that produces a desired antibody can be prepared as follows using DNA immunization.
  • DNA immunization a sensitized antigen is expressed in vivo in the immunized animal to which the vector DNA constructed in such a manner that the gene encoding the antigen protein can be expressed in the immunized animal.
  • This is an immunization method in which immune stimulation is given.
  • DNA immunization is expected to have the following advantages. -Maintaining the structure of the protein and providing immune stimulation-No need to purify immune antigens
  • DNA expressing protein C protein is first administered to an immunized animal.
  • DNA encoding protein C can be synthesized by a known method such as PCR.
  • the obtained DNA is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • the expression vector for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1 can be suitably used.
  • a method for administering a vector to a living body a generally used method can be used. For example, DNA immunization is performed by introducing gold particles adsorbed with an expression vector into cells of an immunized animal individual using a gene gun.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion. Spleen cells can be used as preferred immune cells.
  • Mammalian myeloma cells are used as the cells fused with the immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient or TK-deficient cells can be selected in media containing 6 thioguanine, 8 azaguanine, or 5 'bromodeoxyuridine, respectively. Normal cells that incorporate these pyrimidine analogs into DNA die. On the other hand, cells deficient in these enzymes that cannot take up these pyrimidine analogs can survive in selective media.
  • a selectable marker called G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) by a neomycin resistance gene.
  • Various myeloma cells suitable for cell fusion are known.
  • Examples of such myeloma cells include P3 (P3x63Ag8.653) (J.JImmunol. (1979) 123 (4), 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1- 7), NS-1 (C. Eur. J. Immunol. (1976) 6 (7), 511-519), MPC-11 (Cell (1976) 8 (3), 405-415), SP2 / 0 ( Nature (1978) 276 (5685), 269-270), FO (J. Immunol. Methods (1980) 35 (1-2), 1-21), S194 / 5.XX0.BU.1 (J. Exp. Med. (1978) 148 (1), 313-323), R210 (Nature (1979) 277 (5692), 131-133) and the like can be suitably used.
  • P3x63Ag8.653 J.JImmunol. (1979) 123 (4)
  • cell fusion between the immune cells and myeloma cells is performed according to a known method such as the method of Köhler and Milstein et al. (Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).
  • the cell fusion can be carried out in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like is used, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide is optionally added to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture are used. Serum replacement fluid such as fetal serum (FCS) can be suitably added.
  • FCS fetal serum
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution, and a PEG solution (for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000) preheated to about 37 ° C. is usually 30 to 60%. It is added at a concentration of (w / v).
  • a desired fused cell is formed by gently mixing the mixture.
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas can be removed by repeating the operation of adding the appropriate culture solution listed above and removing the supernatant by centrifugation.
  • the hybridoma thus obtained can be selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine).
  • a HAT culture solution a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine.
  • the culture using the HAT culture solution can be continued for a time sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fused cells) to die (usually the sufficient time is several days to several weeks).
  • screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody are performed by the usual limiting dilution method.
  • the hybridoma thus obtained can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can selectively proliferate in the HAT medium.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the desired hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • a desired hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, screening and single cloning of hybridomas producing the desired antibody can be performed by conventional limiting
  • Desired antibody screening and single cloning can be suitably performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the binding activity of an antibody to labeled protein C protein can be evaluated based on the principle of ELISA.
  • protein C protein is immobilized on the well of an ELISA plate.
  • the culture supernatant of the hybridoma is brought into contact with the immobilized protein in the well, and an antibody that binds to the immobilized protein is detected.
  • the monoclonal antibody is derived from a mouse, the antibody bound to the cell can be detected by an anti-mouse immunoglobulin antibody.
  • a hybridoma that produces a desired antibody having an ability to bind to an antigen selected by these screenings can be cloned by a limiting dilution method or the like.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody thus produced can be subcultured in a normal culture solution.
  • the hybridoma can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the hybridoma is cultured according to a usual method, and a desired monoclonal antibody can be obtained from the culture supernatant.
  • a hybridoma can be administered to a mammal compatible therewith and allowed to proliferate, and a monoclonal antibody can be obtained from the ascites.
  • the former method is suitable for obtaining a highly pure antibody.
  • An antibody encoded by an antibody gene cloned from antibody-producing cells such as the hybridoma can also be suitably used.
  • An antibody encoded by the gene is expressed by incorporating the cloned antibody gene into a suitable vector and introducing it into a host. Methods for isolation of antibody genes, introduction into vectors, and transformation of host cells have already been established, for example, by Vandamme et al. (Eur. J. Biochem. (1990) 192 (3), 767 -775). As described below, methods for producing recombinant antibodies are also known.
  • cDNA encoding a variable region (V region) of an anti-protein C antibody is obtained from a hybridoma cell that produces an anti-protein C antibody.
  • RNA is extracted from the hybridoma.
  • the following method can be used. -Guanidine ultracentrifugation (Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299) -AGPC method (Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159)
  • Extracted mRNA can be purified using mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience). Alternatively, kits for extracting total mRNA directly from cells, such as QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience), are also commercially available. Using such a kit, mRNA can be obtained from the hybridoma. CDNA encoding the antibody V region can be synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase. cDNA can be synthesized by AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation). In addition, for cDNA synthesis and amplification, 5'-RACE method using Proc. Natl. Acad.
  • the desired cDNA fragment is purified from the obtained PCR product and then ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is produced, introduced into Escherichia coli or the like and a colony is selected, a desired recombinant vector can be prepared from Escherichia coli that has formed the colony. Then, whether or not the recombinant vector has the target cDNA base sequence is confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • cDNA is synthesized using RNA extracted from hybridoma cells as a template to obtain a 5′-RACE cDNA library.
  • a commercially available kit such as a SMART®RACE® cDNA amplification kit is appropriately used for the synthesis of the 5′-RACE® cDNA library.
  • the antibody gene is amplified by PCR using the obtained 5′-RACE® cDNA library as a template.
  • Primers for amplifying mouse antibody genes can be designed based on known antibody gene sequences. These primers have different nucleotide sequences for each immunoglobulin subclass. Therefore, it is desirable to determine the subclass in advance using a commercially available kit such as IsoIStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit (Roche Diagnostics).
  • primers capable of amplifying genes encoding ⁇ 1, ⁇ 2a, ⁇ 2b, ⁇ 3 as heavy chains and ⁇ and ⁇ chains as light chains are provided. Can be used.
  • a primer that anneals to a portion corresponding to a constant region close to the variable region is generally used as the 3 ′ primer.
  • the primer attached to the 5 ′ RACE cDNA library preparation kit is used as the 5 ′ primer.
  • an immunoglobulin comprising a combination of a heavy chain and a light chain
  • Desired antibodies can be screened using the binding activity of the reconstituted immunoglobulin to protein C as an index.
  • the binding of the antibody to protein C is more preferably specific.
  • Antibodies that bind to protein C can be screened, for example, as follows; (1) contacting an antibody comprising a V region encoded by cDNA obtained from a hybridoma with protein C; (2) detecting the binding between protein C and an antibody, and (3) selecting an antibody that binds to protein C.
  • Methods for detecting the binding between antibody and protein C are known. Specifically, the binding between the antibody and protein C can be detected by a technique such as ELISA described above. In order to evaluate the binding activity of the antibody, a protein C-fixed specimen can be appropriately used.
  • a panning method using a phage vector is also preferably used as an antibody screening method using binding activity as an index.
  • an antibody gene is obtained from a polyclonal antibody-expressing cell group as a heavy chain and light chain subclass library
  • a screening method using a phage vector is advantageous.
  • Genes encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain can form a single chain Fv (scFv) by ligating with an appropriate linker sequence.
  • scFv single chain Fv
  • the phage encoding the antigen can be recovered to recover the DNA encoding scFv having the desired binding activity. By repeating this operation as necessary, scFv having a desired binding activity can be concentrated.
  • the cDNA is digested with a restriction enzyme that recognizes restriction enzyme sites inserted at both ends of the cDNA.
  • a preferred restriction enzyme recognizes and digests a base sequence that appears infrequently in the base sequence constituting the antibody gene.
  • a restriction enzyme that gives a sticky end.
  • An antibody expression vector can be obtained by inserting a cDNA encoding the V region of the anti-protein C antibody digested as described above into an appropriate expression vector.
  • a chimeric antibody refers to an antibody having a different origin from the constant region and the variable region. Accordingly, in addition to a heterologous chimeric antibody such as mouse-human, a human-human homologous chimeric antibody is also included in the chimeric antibody of the present invention.
  • a chimeric antibody expression vector can be constructed by inserting the V region gene into an expression vector having a constant region in advance.
  • a restriction enzyme recognition sequence for a restriction enzyme that digests the V region gene can be appropriately arranged on the 5 ′ side of an expression vector holding a DNA encoding a desired antibody constant region (C region).
  • a chimeric antibody expression vector is constructed by fusing both digested with the same combination of restriction enzymes in-frame.
  • Antibody isotype is determined by the structure of the antibody constant region.
  • the antibody constant regions of the IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 isotypes are called C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, and C ⁇ 4, respectively.
  • the constant region of the ⁇ and ⁇ chain is appropriately used as the antibody constant region of the light chain.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so that it is expressed under the control of the expression control region.
  • An expression control region for expressing an antibody includes, for example, an enhancer and a promoter.
  • An appropriate signal sequence can also be added to the amino terminus so that the expressed antibody is secreted extracellularly.
  • the expressed polypeptide can be cleaved at the carboxyl terminal portion of the sequence, and the cleaved polypeptide can be secreted extracellularly as a mature polypeptide.
  • an appropriate host cell is transformed with this expression vector, whereby a recombinant cell expressing a DNA encoding an anti-protein C antibody can be obtained.
  • DNAs encoding antibody heavy chains (H chains) and light chains (L chains) are each incorporated into separate expression vectors.
  • An antibody molecule having an H chain and an L chain can be expressed by co-transfecting the same host cell with a vector in which an H chain and an L chain are incorporated.
  • host cells can be transformed by incorporating DNAs encoding H and L chains into a single expression vector (see WO1994 / 011523).
  • host cells and expression vectors for producing antibodies by introducing an isolated antibody gene into a suitable host are known. Any of these expression systems can be applied to isolate the antigen binding domain of the present invention.
  • animal cells, plant cells, or fungal cells can be used as appropriate. Specifically, the following cells can be exemplified as animal cells.
  • Mammalian cells CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), Hela, Vero, HEK (human embryonic kidney) 293, etc.
  • Amphibian cells Xenopus oocytes, etc.
  • Insect cells sf9, sf21, Tn5, etc.
  • Nicotiana such as Nicotiana tabacum
  • Callus cultured cells can be used as appropriate for transformation of plant cells.
  • -Yeast Saccharomyces genus such as Saccharomyces serevisiae, Pichia genus such as methanol-utilizing yeast (Pichia pastoris)-Filamentous fungi: Aspergillus genus such as Aspergillus niger
  • antibody gene expression systems using prokaryotic cells are also known.
  • bacterial cells such as E. coli and Bacillus subtilis can be appropriately used.
  • An expression vector containing the target antibody gene is introduced into these cells by transformation. By culturing the transformed cells in vitro, a desired antibody can be obtained from the culture of the transformed cells.
  • transgenic animals can also be used for the production of recombinant antibodies. That is, the antibody can be obtained from an animal into which a gene encoding a desired antibody has been introduced.
  • an antibody gene can be constructed as a fusion gene by inserting it in-frame into a gene encoding a protein that is uniquely produced in milk.
  • a protein secreted into milk for example, goat ⁇ casein can be used.
  • the DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the injected embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody can be obtained as a fusion protein with milk protein from milk produced by a transgenic goat (or its progeny) born from a goat that has received the embryo.
  • hormones can be administered to transgenic goats to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat (Bio / Technology (1994), 12 (7), 699-702). .
  • the antigen-binding domain of the antibody is derived from a genetically engineered antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing heteroantigenicity against humans
  • the recombinant antibody includes, for example, a humanized antibody. These modified antibodies are appropriately produced using known methods.
  • variable region of an antibody used for the production of an antigen-binding domain in the anti-protein C antibody of the present invention usually has three complementarity-determining regions (CDRs) sandwiched between four framework regions (FR). It consists of CDRs are regions that substantially determine the binding specificity of an antibody.
  • CDRs complementarity-determining regions
  • FR framework regions
  • the amino acid sequence of CDR is rich in diversity. On the other hand, the amino acid sequence constituting FR often shows high identity even among antibodies having different binding specificities. Therefore, it is generally said that the binding specificity of a certain antibody can be transplanted to another antibody by CDR grafting.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies.
  • non-human animals for example, humanized antibodies obtained by grafting mouse antibody CDRs to human antibodies are known.
  • General genetic recombination techniques for obtaining humanized antibodies are also known.
  • overlap extension PCR overlap extension PCR
  • a base sequence encoding the CDR of a mouse antibody to be transplanted is added to a primer for synthesizing the FR of a human antibody. Primers are prepared for each of the four FRs.
  • a human FR comprising an amino acid sequence having high identity with the FR amino acid sequence adjacent to the mouse CDR to be transplanted.
  • the base sequences to be linked are designed to be connected to each other in frame.
  • Human FRs are synthesized individually by each primer.
  • a product in which DNA encoding mouse CDR is added to each FR is obtained.
  • the base sequences encoding mouse CDRs of each product are designed to overlap each other.
  • the overlapping CDR portions of the products synthesized using the human antibody gene as a template are annealed with each other to perform a complementary chain synthesis reaction. By this reaction, human FRs are linked via the mouse CDR sequence.
  • a human antibody expression vector can be prepared by inserting the DNA obtained as described above and a DNA encoding the human antibody C region into an expression vector so as to be fused in frame. After the recombinant vector is established by introducing the integration vector into the host, the recombinant cell is cultured, and the humanized antibody is expressed by expressing the DNA encoding the humanized antibody. (See European Patent Publication EP239400, International Publication WO1996 / 002576).
  • the CDR forms a favorable antigen-binding site when linked via CDR.
  • a human antibody FR can be suitably selected.
  • FR amino acid residues can be substituted so that the CDR of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • amino acid sequence mutations can be introduced into FRs by applying the PCR method used for transplantation of mouse CDRs into human FRs.
  • partial nucleotide sequence mutations can be introduced into primers that anneal to the FR.
  • a nucleotide sequence mutation is introduced into the FR synthesized by such a primer.
  • a mutant FR sequence having a desired property can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody substituted with an amino acid by the above method (Cancer Res., (1993) 53, 851-856).
  • transgenic animals having all repertoires of human antibody genes are used as immunized animals, and DNA immunization is performed. Desired human antibodies can be obtained.
  • the V region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method.
  • Phages expressing scFv that bind to the antigen can be selected.
  • the DNA sequence encoding the V region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • the V region sequence is fused in-frame with the sequence of the desired human antibody C region, and then inserted into an appropriate expression vector, whereby an expression vector can be prepared.
  • the human antibody is obtained by introducing the expression vector into a suitable expression cell as described above and expressing the gene encoding the human antibody.
  • These methods are already known (see International Publications WO1992 / 001047, WO1992 / 020791, WO1993 / 006213, WO1993 / 011236, WO1993 / 019172, WO1995 / 001438, WO1995 / 015388).
  • Whether or not protein C activation is inhibited can be confirmed according to a known method. For example, after contacting a candidate substance that inhibits the activation of protein C with protein C, thrombin and thrombomodulin are added to initiate the activation reaction of protein C by thrombin. Thereafter, the protein C activation reaction is stopped. By measuring the activity of protein C activated by thrombin, it can be confirmed whether the candidate substance inhibits the activation of protein C. Specifically, as described in Example 4.
  • the protein C activation inhibitor obtained by the above method can be formulated into a pharmaceutical composition according to a conventional method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be used in combination with a substance that inhibits the activity of activated protein C, and the protein C activation inhibitor simultaneously activates activated protein C. It may have an inhibitory activity.
  • “inhibition of activated protein C activity” or “inhibit activated protein C activity” means inactivation of activated coagulation factor V or activated coagulation factor VIII by activated protein C. Means to inhibit.
  • the substance that inhibits the activity of activated protein C include a substance that inhibits the binding between activated protein C and activated coagulation factor V or activated coagulation factor VIII.
  • the partial peptide of coagulation factor VIII include low molecular weight compounds exhibiting the same activity as these.
  • “use in combination with a substance that inhibits the activity of activated protein C” means that a substance that inhibits the activation of protein C and a substance that inhibits the activity of activated protein C are simultaneously separated separately. Or it means combining to administer sequentially.
  • the substance that inhibits the activation of protein C and the substance that inhibits the activity of activated protein C may be contained in one pharmaceutical composition or may be contained in separate pharmaceutical compositions.
  • the kit may include a pharmaceutical composition containing a substance that inhibits the activation of protein C and a pharmaceutical composition containing a substance that inhibits the activity of activated protein C.
  • the substance that inhibits the activation of protein C and the substance that simultaneously inhibits the activity of activated protein C include antibodies. Specifically, for example, among the above-mentioned anti-protein C antibodies, antibodies having an action of inhibiting the activity of activated protein C can be mentioned as preferable antibodies. More specifically, antibodies that bind to protein C and activated protein C can be mentioned.
  • activated protein C Whether or not the activity of activated protein C is inhibited can be confirmed according to a known method. For example, after a candidate substance that inhibits the activity of activated protein C is brought into contact with activated protein C, activated coagulation factor V is added, and activated protein C inactivates the activated coagulation factor V. To start. After that, by adding activated blood coagulation factor X and prothrombin, activated thrombin generation dependent on activated coagulation factor V is started, and by measuring the activity of the generated thrombin, the candidate substance is activated. Whether protein C inactivation is inhibited can be confirmed. Specifically, as described in Example 3.
  • activated protein C since the substance that inhibits the activation of protein C has the action of inhibiting the anticoagulant action by activated protein C and promoting blood coagulation, activated protein C It can be used to inhibit the anticoagulant action due to or to promote the hemostatic action. Moreover, it can utilize for the treatment of the hemorrhagic disease resulting from the fall of a blood coagulation function by the effect
  • vWF von Willebrand disease
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for inhibiting an anticoagulant action, a pharmaceutical composition for promoting a hemostatic action, or a treatment for bleeding disorders, which contains a protein C activation inhibitor.
  • a pharmaceutical composition is provided.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient by either oral or parenteral administration. Preferably, it is parenteral administration. Specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, transpulmonary administration, and transdermal administration.
  • injection administration the pharmaceutical composition of the present invention can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dose for example, the dose can be selected in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg of body weight per administration. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in accordance with a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical, Science, Latest Edition, Mark Publishing, Company, Easton, USA) together with pharmaceutically acceptable carriers and additives. It may be.
  • Pharmaceutically acceptable carriers and additives include, for example, surfactants, excipients, colorants, flavoring agents, preservatives, stabilizers, buffers, suspending agents, isotonic agents, binders, disintegrations. Agents, lubricants, fluidity promoters, flavoring agents and the like. Furthermore, it is not restricted to these, Other commonly used carriers and additives can be used as appropriate.
  • silicic acid lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride
  • the carrier include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • the antibody of the present invention may be encapsulated in microcapsules (microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]) or colloid drug delivery systems (liposomes, albumin microspheres, microemulsions, nanoparticles). And nanocapsules, etc. (see “Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", “Oslo Ed.” (1980), etc.).
  • a method of making a drug into a sustained-release drug is also known and can be applied to the antibody of the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982); US Pat. No. 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983); EP 133,988).
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methyl
  • the present invention also provides a method for preventing and / or treating bleeding, bleeding-related diseases, or diseases caused by bleeding, comprising the step of administering the antibody or composition of the present invention.
  • Administration of the antibody or composition can be carried out, for example, by the method described above.
  • the present invention provides a kit for use in the above method, comprising at least the antibody or composition of the present invention.
  • the kit can be packaged with a syringe barrel, a needle, a pharmaceutically acceptable medium, an alcohol cotton cloth, an adhesive bandage, or instructions describing how to use the kit.
  • the present invention also relates to the use of the pharmaceutical composition comprising the protein C activation inhibitor of the present invention in the production of a preventive and / or therapeutic agent for bleeding, bleeding-related diseases or diseases caused by bleeding.
  • the present invention also relates to a multispecific antigen-binding molecule or bispecific antibody or composition of the present invention for the prevention and / or treatment of bleeding, bleeding-related diseases or diseases caused by bleeding. It should be noted that all prior art documents cited in the present specification are incorporated herein by reference.
  • Example 1 Preparation of mouse protein C cDNA covering the full-length translation region of mouse protein C was amplified from mouse liver by PCR. Using this as a template, the gene was further amplified by the PCR method with a FLAG tag attached to the C-terminus and subcloned into an expression vector. The expression vector was transfected into CHO cells and cultured. Mouse protein C-Flag protein was purified from the obtained culture supernatant according to a conventional method.
  • Example 2 Preparation of anti-mouse protein C rat antibody
  • the mouse protein C-Flag protein (0.1 mg / animal) prepared in Example 1 was mixed with Freund's Complete Adjuvant (FCA, Difco Laboratories, now Becton Dickinson Co).
  • FCA Freund's Complete Adjuvant
  • the rats were inoculated into one footpad of SD rats (2 animals, Charles River Japan).
  • Two weeks after inoculation iliac lymph nodes were removed from the immunized rats.
  • a hybridoma was prepared using the extracted lymph node cells according to a conventional method. Using the culture supernatant of the hybridoma, the binding activity of the antibody produced by the hybridoma to mouse protein C-Flag and Flag protein was measured by ELISA.
  • Hybridomas producing antibodies that specifically showed binding activity to mouse protein C were selected.
  • the selected hybridoma was cultured, and anti-mouse protein C antibody was purified from the culture supernatant according to a conventional method.
  • the purified antibody was screened by the methods described in Examples 3 and 4, and MP35 and MP51 were selected as antibodies that activate mouse protein C and / or inhibit activated protein C activity.
  • Example 3 Effect (method) of anti-mouse protein C antibodies MP35 and MP51 on FVa inactivation by mouse activated protein C (1) Reagent preparation • Anti-mouse protein C antibody was prepared at 15, 50 ⁇ g / mL in Tris-buffered saline (TBSB) containing 0.1% bovine serum albumin. • Hirudin (Merck KgaA) was prepared at 10 IU / mL with TBSB.
  • Mouse protein C-Flag, human ⁇ thrombin (Enzyme Research Laboratories), rabbit thrombomodulin (American Diagnostica), human activated coagulation factor X (FXa, Enzyme Research Laboratories), human activated coagulation factor V (FVa, Enzyme Research) Laboratories) and human prothrombin (Enzyme Research Laboratories) are available in 104 ⁇ M phospholipid solutions (10% phosphatidylserine / 60% phosphatidylcholine / 30% phosphatidylethanolamine (Avanti Polar Lipids); Lab. Haem.
  • TBSB TBSB
  • TBCP TBSB
  • 8.3 mM CaCl 2 and 1.7 mM MgCl 2 24.8 ⁇ g / mL, 1.48 ⁇ g / mL, and 14.8 ⁇ g, respectively.
  • / mL 9.66 ng / mL, 2.25 ng / mL and 50 ⁇ g / mL.
  • mice activated protein C 24.8 ⁇ g / mL mouse protein C-Flag, 1.48 ⁇ g / mL human ⁇ -thrombin, and 14.8 ⁇ g / mL rabbit thrombomodulin were mixed in equal amounts and incubated at 37 ° C for 120 minutes.
  • the anti-mouse protein C antibody MP35 or MP51 increased the absorbance (FIG. 1). Therefore, both MP35 and MP51 were shown to inhibit FVa inactivation by mouse activated protein C.
  • Example 4 Effect of anti-mouse protein C antibodies MP35 and MP51 on mouse protein C activation by thrombin / thrombomodulin complex (method) (1) Preparation of Reagents • Anti-mouse protein C antibody and hirudin were prepared in TBSB at 120 ⁇ g / mL and 75 U / mL, respectively. -Mouse protein C-Flag, human ⁇ -thrombin and rabbit thrombomodulin were prepared in TBCP to 24.8 ⁇ g / mL, 14.8 ⁇ g / mL and 14.8 ⁇ g / mL, respectively. -Spectrozyme aPC (American Diagnostica) was dissolved in 5 mM with purified water and then diluted 6.25 times with purified water.
  • Example 5 Effect of anti-mouse protein C antibody on thrombin generation in mouse plasma supplemented with protein C activator (method)
  • Reagent preparation • Anti-mouse protein C antibody was prepared at 0.18, 0.6, 1.8, 6, 18, 60, and 180 ⁇ g / mL with TBSB.
  • -Protein C activator product name Protac, American Diagnostica Inc was dissolved in purified water (6 U / mL) and further adjusted to 4 U / mL with TBS.
  • the plate was set in a thrombin generation fluorescence system, and after incubation at 37 ° C. for about 5 minutes, measurement was started. (At the same time as the start of measurement, 20 ⁇ L of Fluo-Substrate and Fluo-Buffer mixed solution is added.)
  • Thrombin Calibrator Thrombinoscope BV.
  • the setting conditions of the thrombin generation fluorescence system dedicated analysis software Thrombinoscope software version 3.0.0.29 are as follows. ⁇ Fluo-Substrate and Fluo-Buffer mixed solution volume (Setting item Dispense): 20 ⁇ L ⁇ Agitation time (setting item Shake): 10 seconds ⁇ Measurement time (setting item Totaltime): 60 minutes ⁇ Measurement interval (setting item Interval): 20 seconds ⁇ Excitation wavelength (automatic setting): 390 nm ⁇ Fluorescence wavelength (automatic setting): 460 nm Using the calculated thrombin generation start time (Lag time (min)) and the maximum thrombin generation amount (Peak height (nmol / L)), the ability of anti-mouse protein C antibody to inhibit activated protein C activity in mouse plasma was evaluated. did.
  • FIG. 3A The effect of anti-mouse protein C antibody on thrombin generation in normal mouse plasma supplemented with protein C activator (Protac) is shown in FIG. 3A.
  • Protac protein C activator
  • the Lag time was increased from 2.0 minutes to 2.4 minutes and the Peak height was reduced from 53 nM to 22 nM, so that activated protein C produced by Protac was It was confirmed to show a coagulation effect.
  • Both the anti-mouse protein C antibodies MP35 and MP51 decreased Lag time and increased Peak height when Protac was added in a dose-dependent manner.
  • FVIII-deficient mouse plasma was also evaluated (FIG. 3B).
  • Example 8 Analysis of antigen binding site of anti-mouse protein C antibody (method) It was examined using Western blotting (WB) whether MP35 and MP51 recognize the light chain or heavy chain of mouse PC.
  • Mouse PC [product name] Recombinant Mouse Coagulation Factor XIV / Protein C, [supplier] R & D Systems, [catalog number] 4885-SE) to human thrombin ([product name] Human alpha Thrombin, [supplier] Enzyme research laboratories , [Catalog No.
  • Example 9 Preparation of anti-mouse protein C human antibody Using the mouse protein C protein prepared in Example 1, display phages that bind to mouse protein C were concentrated from the human naive antibody library by the phage display method. Select display phages that specifically bind to mouse protein C and amplify antibody variable region genes from them. It was expressed and purified as recombinant IgG according to a conventional method. The purified antibody was screened by the methods described in Examples 3 and 4 and L2 and L12 were selected as antibodies that activate mouse protein C and / or inhibit activated protein C activity.
  • Example 10 Effect (method) of anti-mouse protein C antibodies L2 and L12 on FVa inactivation by mouse activated protein C
  • the method of Example 3 was followed.
  • Anti-mouse protein C antibody L2 or L12 increased the absorbance (FIG. 5).
  • both L2 and L12 were shown to inhibit FVa inactivation by mouse activated protein C.
  • the antibody concentration during mouse protein C activation reaction is 15 or 50 ⁇ g / mL.
  • Example 11 Effect of anti-mouse protein C antibodies L2 and L12 on mouse protein C activation by thrombin / thrombomodulin complex (method) According to the method of Example 4. (result) The absorbance decreased with the addition of anti-mouse protein C antibody L12. On the other hand, even when L2 was added, there was no change in absorbance (FIG. 6). Thus, L12 was shown to inhibit protein C activation but not L2. The antibody concentration during mouse protein C activation reaction is 30 ⁇ g / mL.
  • the present invention it has become possible to inhibit or suppress the anticoagulant action by protein C and promote the blood coagulation action / hemostatic action. Therefore, the present invention has made it possible to develop new therapeutic agents and new treatment methods for bleeding diseases.

Abstract

本発明者らは、プロテインCの活性化阻害物質を投与することにより優れた抗血液凝固阻害作用が得られることを見出し、本発明を完成した。

Description

抗プロテインＣ抗体による出血性疾患の治療
　本発明は、プロテインCの活性化を阻害する物質を含有する出血性疾患を治療するための組成物に関する。詳しくはプロテインCの活性化を阻害する抗プロテインC抗体を有効成分として含有する組成物に関する。
　血友病 Aは、血液凝固第VIII因子（FVIII）または血液凝固第IX因子（FIX）の先天的欠損又は機能不全に起因する出血性疾患である。前者は血友病A、後者は血友病Bと称される。いずれの遺伝子もX染色体上に存在し、遺伝子異常は伴性劣性遺伝により伝搬されるため、発症患者の99%以上は男性である。有病率はおおよそ出生1万人につき1人で、血友病Aと血友病Bの比率は、おおよそ5:1であることが知られる。
　主な出血部位としては、関節内、筋肉内、皮下、口腔内、頭蓋内、消化管、鼻腔内などが挙げられる。中でも関節内への繰返し出血は、関節障害、歩行困難を伴う血友病性関節症に進展し、最終的には関節置換術が必要となる場合もあることから、血友病患者のQOLを低下させる大きな要因となっている。
　血友病の重症度は、血液中のFVIII活性あるいはFIX活性により規定されており、活性1%未満の患者が重症、1%以上5%未満の患者が中等症、5%以上40%未満の患者が軽症と分類される。血友病患者の約60%を占める重症患者においては、月に数回の出血症状を呈するが、これは中等症患者及び軽症患者に比べ顕著に高頻度である。このことから、重症血友病患者においては、血液中のFVIII活性あるいはFIX活性を1%以上に維持することが、出血症状の発現阻止に有効と考えられている（非特許文献１）。
　関連する出血異常症として、血友病、後天性血友病のほかに、vWFの機能異常または欠損に起因するフォンビルブランド病が知られている。フォンビルブランド因子（vWF）は、血小板が、血管壁の損傷部位の内皮下組織に正常に粘着するのに必要であるだけでなく、FVIIIと複合体を形成し、血漿中FVIIIレベルを正常に保つのにも必要である。フォンビルブランド病患者では、これらの機能が低下し、止血機能異常を来たしている。
　血友病患者における出血の予防及び/または治療には、主として、血漿から精製された若しくは遺伝子組換え技術により作製された血液凝固因子が使用される。
　血液凝固因子は、持続性が十分でなく（半減期は数時間から数十時間）、例えば、FVIII製剤及びFIX製剤の血中半減期は、それぞれ12時間及び24時間程度である。それ故、継続的な予防のためには、FVIII製剤を週に3回程度、あるいはFIX製剤を週2回程度投与する必要がある。これは、FVIII活性あるいはFIX活性として、概ね1%以上を維持することに相当する。この予防投与により、頻回の関節内出血に起因する血友病性関節障害を未然に防ぐことができ、その結果、血友病A患者のQOL向上に大きく寄与するとの報告がある。
　また、出血時の補充療法においても、出血が軽度な場合を除き、再出血を防ぎ、完全な止血を行うため、一定期間、FVIII製剤あるいはFIX製剤を定期的に追加投与する必要がある。
　さらに、血液凝固因子は、静脈内投与が必要であるという欠点を有する。FVIII製剤及びFIX製剤を静脈内投与するには、技術的な困難さが存在する。特に年少の患者に対する投与においては、投与に用いられる静脈が細い故、困難さが一層増す。
　前述の、予防投与や、出血の際の緊急投与においては、多くの場合、家庭療法・自己注射が用いられる。頻回投与の必要性と、投与の際の技術的困難さは、投与に際し患者に苦痛を与えるだけでなく、家庭療法・自己注射の普及を妨げる要因となっている。
　従って、現存の凝固因子製剤に比し、投与間隔が広い薬剤、あるいは投与が簡単な薬剤が、強く求められていた。
　さらに、血友病患者、特に重症血友病患者には、インヒビターと呼ばれるFVIIIあるいはFIXに対する抗体が発生する場合がある。インヒビターが発生すると、凝固因子製剤の効果がインヒビターにより妨げられる。その結果、大量の凝固因子製剤を用いる中和療法か、複合体製剤（complex concentrate）あるいは活性化血液凝固第VII因子（FVIIa製剤）を用いるバイパス療法が実施される。ただ、いずれにおいても、定期補充予防が確立されていないなど、患者に対する止血管理が非常に困難になる。
　従って、インヒビターの存在に左右されない薬剤が、強く求められていた。
　ところで、抗体は血中での安定性が高く、皮下投与可能であり、抗原性も低いことから医薬品として注目され、応用されている。抗体は、(i)投与間隔が広く、(ii)投与が簡単であり、(iii)インヒビターの存在に左右されないため、医薬品の創製には有用であると考えられる。抗体の血中半減期は、一般に、比較的長く、数日から数週間である。また、抗体は、一般に、皮下投与後に血中に移行することが知られている。さらに、FVIIIやFIXとは大きく異なる構造を有し、抗原性も低い。すなわち、抗体医薬品は、上記の(i)、(ii)、（iii）を満たしている。
　一方、プロテインC（PC）は、血液凝固におけるネガティブフィードバック機構で働く因子の一つである。血管内皮に発現するendothelial Protein C receptor（EPCR）に結合し、トロンビン/トロンボモジュリン複合体により活性化されると、活性化プロテインC(APC)となる。APCは、その補因子プロテインSとともに、活性化血液凝固第VIII因子（FVIIIa）及び活性化血液凝固第V因子（FVa）を不活化する(非特許文献２)。従って、PCを阻害することで凝固の促成に動くことは容易に推察される。実際、ホモ接合体先天性PC欠乏症患者においては、出生直後より血栓性の電撃性紫斑病を呈する。更に、重症血友病A患者のうち、血液凝固第V因子（FV）にAPC抵抗性を付与する遺伝子変異（FV Leiden）を有する患者では、凝固因子製剤使用量が少ないとする報告がある。これらの報告は、この推測を後押ししている(非特許文献３)。動物実験においても、Schlachtermanらは、FVIIIもしくはFIX欠損マウスにFV Leiden変異を導入した場合、特定の刺激による微小循環で凝固が促進されることが示されている（非特許文献４）。Butenasらは、APCに対する阻害物質を創製し、合成凝固プロテオームモデルにおいて、それが、FVIII欠乏によるトロンビン生成低下を、部分的に回復させることを示している（非特許文献５）。
　また、APCの活性を阻害する抗体が血液凝固効果を示し、血友病の治療に利用できる可能性も報告されている(特許文献１)。
　しかしながら、APCの活性をin vivoで阻害した場合の血液凝固効果は確認されていない。更に、前述のSchlachtermanらの論文においては、FVIII欠損マウスにおいてはFV Leidenの止血効果はないが、FXI欠損マウスにおいてはFV Leidenの止血効果があるという賛否両方の結果を示している。
　なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
Astermark J. Haemophilia. 2003 9(Suppl.1) 32 Castellino FJ and Ploplis VA, J Thromb and Haemost, 2009 7 (Suppl. 1) 140 van Dijk K et al. J Thromb and Haemost, 2004 92 305 Schlachterman A et al. J Thromb Haemost 2005 3 2730 Butenas S et al. J Thromb Haemost 2006 4 2411
特表2011-500843
　本発明は、優れた血液凝固効果を有する新規な出血性疾患治療用組成物、抗凝固作用阻害用組成物又は止血作用促進用組成物を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究した結果、プロテインCの活性化を阻害することで高い止血効果が得られることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、より具体的には以下の〔１〕～〔１４〕を提供するものである。
〔１〕プロテインＣの活性化阻害物質を含有する、出血性疾患を治療するための医薬組成物。
〔２〕出血性疾患が血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患である、〔１〕に記載の組成物。
〔３〕出血性疾患が血友病Aである、〔１〕に記載の組成物。
〔４〕プロテインＣの活性化阻害物質を含有する、止血作用を促進するための医薬組成物。
〔５〕止血作用が、血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患の出血症状に対する作用である、〔４〕に記載の組成物。
〔６〕止血作用が、血友病Aの出血症状に対する作用である、〔４〕に記載の組成物。
〔７〕プロテインＣの活性化阻害物質を含有する、抗血液凝固作用を阻害するための医薬組成物。
〔８〕抗血液凝固作用が、活性化プロテインCの抗血液凝固作用である、〔７〕に記載の組成物。
〔９〕プロテインＣの活性化阻害物質が、さらに活性化プロテインCの活性を阻害する、〔１〕から〔８〕のいずれかに記載の組成物。
〔１０〕医薬組成物が、活性化プロテインCの活性阻害物質と組み合わせて用いる組成物である、〔１〕から〔９〕のいずれかに記載の組成物。
〔１１〕プロテインＣの活性化阻害物質が、抗プロテインC抗体である、〔１〕から〔１０〕のいずれかに記載の組成物。
〔１２〕抗プロテインＣ抗体が、プロテインＣの重鎖に結合する抗体である、〔１１〕に記載の組成物。
〔１３〕プロテインＣの重鎖に結合し、プロテインＣの活性化プロテインＣへの変換を阻害する作用を有する、抗プロテインＣ抗体。
〔１４〕抗プロテインＣ抗体が、さらに活性化プロテインＣの活性を阻害する作用を有する、〔１３〕に記載の抗体。
〔１５〕プロテインＣの活性化阻害物質を投与する工程を含む、出血性疾患を治療するための方法。
〔１６〕出血性疾患が血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患である、〔１５〕に記載の方法。
〔１７〕出血性疾患が血友病Aである、〔１５〕に記載の方法。
〔１８〕プロテインＣの活性化阻害物質を投与する工程を含む、止血作用を促進するための方法。
〔１９〕止血作用が、血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患の出血症状に対する作用である、〔１８〕に記載の方法。
〔２０〕止血作用が、血友病Aの出血症状に対する作用である、〔１８〕に記載の方法。
〔２１〕プロテインＣの活性化阻害物質を投与する工程を含む、抗血液凝固作用を阻害するための方法。
〔２２〕抗血液凝固作用が、活性化プロテインCの抗血液凝固作用である、〔２１〕に記載の方法。
〔２３〕プロテインＣの活性化阻害物質が、さらに活性化プロテインCの活性を阻害する、〔１５〕から〔２２〕のいずれかに記載の方法。
〔２４〕活性化プロテインCの活性阻害物質と組み合わせて投与される、〔１５〕から〔２３〕のいずれかに記載の方法。
〔２５〕プロテインＣの活性化阻害物質が、抗プロテインC抗体である、〔１５〕から〔２４〕のいずれかに記載の方法。
〔２６〕抗プロテインＣ抗体が、プロテインＣの重鎖に結合する抗体である、〔２５〕に記載の方法。
〔２７〕出血性疾患を治療するための薬剤を製造するためのプロテインＣの活性化阻害物質の使用。
〔２８〕出血性疾患が血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患である、〔２７〕に記載の使用。
〔２９〕出血性疾患が血友病Aである、〔２７〕に記載の使用。
〔３０〕止血作用を促進するための薬剤を製造するためのプロテインＣの活性化阻害物質の使用。
〔３１〕止血作用が、血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患の出血症状に対する作用である、〔３０〕に記載の使用。
〔３２〕止血作用が、血友病Aの出血症状に対する作用である、〔３０〕に記載の使用。
〔３３〕抗血液凝固作用を阻害するための薬剤を製造するためのプロテインＣの活性化阻害物質の使用。
〔３４〕抗血液凝固作用が、活性化プロテインCの抗血液凝固作用である、〔３３〕に記載の使用。
〔３５〕プロテインＣの活性化阻害物質が、さらに活性化プロテインCの活性を阻害する、〔２７〕から〔３４〕のいずれかに記載の使用。
〔３６〕薬剤が、活性化プロテインCの活性阻害物質をさらに含む、〔２７〕から〔３５〕のいずれかに記載の使用。
〔３７〕プロテインＣの活性化阻害物質が、抗プロテインC抗体である、〔２７〕から〔３５〕のいずれかに記載の使用。
〔３８〕抗プロテインＣ抗体が、プロテインＣの重鎖に結合する抗体である、〔３７〕に記載の使用。
〔３９〕出血性疾患を治療するために使用されるプロテインＣの活性化阻害物質。
〔４０〕出血性疾患が血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患である、〔３９〕に記載の物質。
〔４１〕出血性疾患が血友病Aである、〔３９〕に記載の物質。
〔４２〕止血作用を促進するために用いられるプロテインＣの活性化阻害物質。
〔４３〕止血作用が、血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患の出血症状に対する作用である、〔４２〕に記載の物質。
〔４４〕止血作用が、血友病Aの出血症状に対する作用である、〔４２〕に記載の物質。
〔４５〕抗血液凝固作用を阻害するために使用されるプロテインＣの活性化阻害物質。
〔４６〕抗血液凝固作用が、活性化プロテインCの抗血液凝固作用である、〔４５〕に記載の物質。
〔４７〕プロテインＣの活性化阻害物質が、さらに活性化プロテインCの活性を阻害する、〔３９〕から〔４６〕のいずれかに記載の物質。
〔４８〕活性化プロテインCの活性阻害物質と組み合わせて用いる物質である、〔３９〕から〔４７〕のいずれかに記載の物質。
〔４９〕プロテインＣの活性化阻害物質が、抗プロテインC抗体である、〔３９〕から〔４８〕のいずれかに記載の物質。
〔５０〕抗プロテインＣ抗体が、プロテインＣの重鎖に結合する抗体である、〔４９〕に記載の物質。
マウス活性化プロテインCによるFVa不活化に対する抗マウスプロテインC抗体の効果を示す図である。Y軸の吸光度は、生成されたトロンビンの活性を示し、残存FVaが多いほど高い吸光度を示す。マウス活性化プロテインC無添加及び抗体無添加の群は、APC(-), Ab(-)と示し、それ以外はマウス活性化プロテインC添加群を示す。実験の結果、MP35及びMP51の添加により、抗体無添加に比し、吸光度が上昇したことから、MP35及びMP51が残存FVaを増加させる、すなわち活性化プロテインCによるFVa不活化に対して阻害活性を有することが示された。 トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対する抗プロテインC抗体の効果を示す図である。マウスプロテインC活性化反応中の抗体濃度は30 μg/mLである。Y軸の吸光度値は、生成されたマウス活性化プロテインCの活性を示す。トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対する阻害活性が強い。実験の結果、MP51の添加により、抗体無添加に比し、吸光度が低下したことから、MP51が、トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対して阻害活性を有することが示された。一方、MP35の添加によっても、抗体無添加に比し、吸光度は低下しなかったことから、MP35は、トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対して阻害活性を有さないことが示された。 プロテインC活性化物質を添加した正常マウス血漿（Ａ）又はFVIII欠損マウス血漿（Ｂ）のトロンビン生成に対する抗マウスプロテインC抗体の効果を示す図である。プロテインC活性化物質であるProtacの添加により生成した活性化プロテインCの抗凝固作用の強さは、Lag time及びPeak heightで示す。添加した抗体溶液の濃度は0、0.18、0.6、1.8、6、18、60、及び180 μg/mLである。破線はプロテインC活性化物質（Protac）無添加及び抗体無添加の血漿のデータである。抗体非添加群(0 μg/mL)よりも、縦軸のLag timeが短縮するほど、又はPeak heightが上昇するほど、活性化プロテインCの抗凝固作用に対する阻害活性が強い。結果、正常マウス血漿又はFVIII欠損マウス血漿において、MP35（△）及びMP51（●）共に濃度依存的に、プロテインC activator添加時のLag timeを短縮させ、プロテインC activator添加のPeak heightを増加させたことから、MP35及びMP51は、活性化プロテインCの抗凝固作用を阻害する活性を有することを示した。 血友病Aマウスを用いた穿刺出血モデルにおける出血症状に対する抗マウスプロテインC抗体の効果を示す図である。穿刺による出血症状の強さは出血痕総面積（Total bleeding area）で示し、各データは各群の平均値を示す。Vehicle群(0 μg/mL)よりも、縦軸の出血痕総面積が縮小するほど、穿刺による出血症状に対する止血作用が強い。結果、MP51投与により、出血痕総面積が縮小したことから、MP51は止血作用を有することを示した。MP35は止血作用を示さなかった。 マウス活性化プロテインCによるFVa不活化に対する抗マウスプロテインC抗体の効果を示す図である。Y軸の吸光度は、生成されたトロンビンの活性を示し、残存FVaが多いほど高い吸光度を示す。マウス活性化プロテインC無添加及び抗体無添加の群は、APC(-), Ab(-)と示し、それ以外はマウス活性化プロテインC添加群を示す。抗体濃度は15または50 μg/mLである。実験の結果、L2及びL12の添加により、抗体無添加に比し、吸光度が上昇したことから、L2及びL12が残存FVaを増加させる、すなわち活性化プロテインCによるFVa不活化に対して阻害活性を有することが示された。 トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対する抗プロテインC抗体の効果を示す図である。マウスプロテインC活性化反応中の抗体濃度は30 μg/mLである。Y軸の吸光度値は、生成されたマウス活性化プロテインCの活性を示す。トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対する阻害活性が強い。実験の結果、L12の添加により、抗体無添加に比し、吸光度が低下したことから、L12が、トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対して阻害活性を有することが示された。一方、L2の添加によっても、抗体無添加に比し、吸光度は低下しなかったことから、L2は、トロンビン/トロンボモジュリンによるマウスプロテインC活性化に対して阻害活性を有さないことが示された。
　本発明は、プロテインCの活性化阻害物質を含有する、出血性疾患を治療するための医薬組成物を提供する。
　本発明において「プロテインＣの活性化阻害」、「プロテインCの活性化を阻害する」あるいは「プロテインCの活性化プロテインCへの変換を阻害する」とは、トロンボモジュリンと複合体を形成したトロンビンによるプロテインCの分解を阻害することを意味する。プロテインCの活性化を阻害する物質としては、例えば、プロテインCとトロンビンの結合を阻害する物質が挙げられる。具体的には、例えば、抗プロテインC抗体、抗トロンビン抗体、抗トロンボモジュリン抗体、プロテインC部分ペプチド、トロンビン部分ペプチド、トロンボモジュリン部分ペプチド、これらと同様の活性を示す低分子化合物などが挙げられる。
　プロテインＣの活性化阻害剤の好ましい態様として、抗プロテインＣ抗体を挙げることができる。
　本明細書において、抗体とは、天然のものであるかまたは部分的もしくは完全合成により製造された免疫グロブリンをいう。抗体はそれが天然に存在する血漿や血清等の天然資源や抗体を産生するハイブリドーマ細胞の培養上清から単離され得るし、または遺伝子組換え等の手法を用いることによって部分的にもしくは完全に合成され得る。抗体の例としては免疫グロブリンのアイソタイプおよびそれらのアイソタイプのサブクラスが好適に挙げられる。ヒトの免疫グロブリンとして、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgMの9種類のクラス（アイソタイプ）が知られている。本発明の抗体には、これらのアイソタイプのうちIgG1、IgG2、IgG3、IgG4が好ましい。
　所望の結合活性を有する抗体を作製する方法は当業者において公知である。例えば、プロテインCに結合する抗体を作製する方法を例示するが、方法はこれに限定されるものではない。
　抗プロテインC抗体は、公知の手段を用いてポリクローナルまたはモノクローナル抗体として取得され得る。抗体としては、哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好適に作製され得る。哺乳動物由来のモノクローナル抗体には、ハイブリドーマにより産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主細胞によって産生されるもの等が含まれる。なお、本発明のモノクローナル抗体には、「ヒト化抗体」や「キメラ抗体」が含まれる。
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術を使用することによって、例えば以下のように作製され得る。すなわち、プロテインCタンパク質を感作抗原として使用して、通常の免疫方法にしたがって哺乳動物が免疫される。得られる免疫細胞が通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合される。次に、通常のスクリーニング法によって、プロテインC分子中のエピトープに結合するモノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって抗プロテインC抗体を産生するハイブリドーマが選択され得る。
　モノクローナル抗体の作製は、例えば以下に示すように行われる。まず、プロテインCをコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入することによって適当な宿主細胞が形質転換される。当該宿主細胞中または培養上清中から所望のプロテインCタンパク質が公知の方法で精製される。
　哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として当該精製プロテインCタンパク質が使用できる。プロテインCの部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。この際、当該部分ペプチドはプロテインCのアミノ酸配列より化学合成によっても取得され得る。また、プロテインC遺伝子の一部を発現ベクターに組込んで発現させることによっても取得され得る。さらにはタンパク質分解酵素を用いてプロテインCタンパク質を分解することによっても取得され得るが、部分ペプチドとして用いるプロテインCペプチドの領域および大きさは特に特別の態様に限定されない。
　抗プロテインC抗体が、プロテインCの活性化を阻害するための、好ましい結合領域としては、プロテインCの重鎖が挙げられる。特に、トロンビンとの結合に関与する部分が好ましく、具体的には重鎖内のactivation peptide又はその近傍に存在するエピトープが好ましい。ここで近傍に存在するエピトープとは、抗プロテインC抗体がプロテインCと結合した場合に、トロンビンとプロテインCとの結合を立体構造的に阻害できる範囲にあることを意味する。このような抗体は、プロテインCの活性化プロテインCへの変換を阻害することが可能である。したがって、本発明のおいては、プロテインCの重鎖に相当するアミノ酸配列から任意の配列が選択され、感作抗原として用いられることが好ましい。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は少なくとも5以上、例えば6以上、或いは7以上であることが好ましい。より具体的には8～50、好ましくは10～30残基のペプチドが感作抗原として使用され得る。
　また、プロテインCタンパク質の所望の部分ポリペプチドやペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質が感作抗原として利用され得る。感作抗原として使用される融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどが好適に利用され得る。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類またはそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子がインフレームで融合され、当該融合遺伝子が前記のように発現ベクターに挿入されることにより作製され得る。融合タンパク質の作製方法はMolecular Cloning 2nd ed.（Sambrook,J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58（1989）Cold Spring Harbor Lab. press）に記載されている。
　当該感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特定の動物に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）、あるいはウサギ、サル等が好適に使用される。
　公知の方法にしたがって上記の動物が感作抗原により免疫される。例えば、一般的な方法として、感作抗原が哺乳動物の腹腔内または皮下注射によって投与されることにより免疫が実施される。具体的には、PBS（Phosphate-Buffered Saline）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈された感作抗原が、所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントと混合され、乳化された後に、当該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用され得る。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合した当該感作抗原ペプチドを免疫することが望ましい場合もある。
　また、所望の抗体を産生するハイブリドーマは、DNA免疫を使用し、以下のようにしても作製され得る。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現され得るような態様で構築されたベクターDNAが投与された当該免疫動物中で、感作抗原が当該免疫動物の生体内で発現されることによって、免疫刺激が与えられる免疫方法である。タンパク質抗原が免疫動物に投与される一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性が期待される。
－タンパク質の構造を維持して免疫刺激が与えられ得る
－免疫抗原を精製する必要が無い
　DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るために、まず、プロテインCタンパク質を発現するDNAが免疫動物に投与される。プロテインCをコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成され得る。得られたDNAが適当な発現ベクターに挿入され、免疫動物に投与される。発現ベクターとしては、例えばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターが好適に利用され得る。ベクターを生体に投与する方法として、一般的に用いられている方法が利用され得る。例えば、発現ベクターが吸着した金粒子が、遺伝子銃（gene gun）で免疫動物個体の細胞内に導入されることによってDNA免疫が行われる。
　このように哺乳動物が免疫され、血清中におけるプロテインCに結合する抗体力価の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に供される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用され得る。
　前記免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
　HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択され得る。これらのピリミジンアナログをDNA中に取り込む正常な細胞は死滅する。他方、これらのピリミジンアナログを取り込めないこれらの酵素を欠損した細胞は、選択培地の中で生存することができる。この他G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。
　このようなミエローマ細胞として、例えば、P3（P3x63Ag8.653）（J. Immunol.（1979）123 (4), 1548-1550）、P3x63Ag8U.1（Current Topics in Microbiology and Immunology（1978）81, 1-7）、NS-1（C. Eur. J. Immunol.（1976）6 (7), 511-519）、MPC-11（Cell（1976）8 (3), 405-415）、SP2/0（Nature（1978）276 (5685), 269-270）、FO（J. Immunol. Methods（1980）35 (1-2), 1-21）、S194/5.XX0.BU.1（J. Exp. Med.（1978）148 (1), 313-323）、R210（Nature（1979）277 (5692), 131-133）等が好適に使用され得る。
　基本的には公知の方法、例えば、ケーラーとミルステインらの方法（Methods Enzymol.（1981）73, 3-46）等に準じて、前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
　より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、前記細胞融合が実施され得る。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等が使用され、さらに融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤が添加されて使用される。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定され得る。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用され、さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液が好適に添加され得る。
　細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温されたPEG溶液（例えば平均分子量1000から6000程度）が通常30から60％（w/v）の濃度で添加される。混合液が緩やかに混合されることによって所望の融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。次いで、上記に挙げた適当な培養液が逐次添加され、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去され得る。
　このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間（通常、係る十分な時間は数日から数週間である）、上記HAT培養液を用いた培養が継続され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施される。
　このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択され得る。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液）で培養することにより選択され得る。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞が選択的に増殖し得る。所望のハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、所望のハイブリドーマが選択され得る。次いで、通常の限界希釈法によって、所望の抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングが実施され得る。
　所望の抗体のスクリーニングおよび単一クローニングが、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施され得る。例えば、標識化したプロテインCタンパク質に対する抗体の結合活性がELISAの原理に基づいて評価され得る。例えば、ELISAプレートのウェルにプロテインCタンパク質が固定化される。ハイブリドーマの培養上清をウェル内の固定化タンパク質に接触させ、固定化タンパク質に結合する抗体が検出される。モノクローナル抗体がマウス由来の場合、細胞に結合した抗体は、抗マウスイムノグロブリン抗体によって検出され得る。これらのスクリーニングによって選択された、抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマは、限界希釈法等によりクローニングされ得る。
　このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは通常の培養液中で継代培養され得る。また、当該ハイブリドーマは液体窒素中で長期にわたって保存され得る。
　当該ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から所望のモノクローナル抗体が取得され得る。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖せしめ、その腹水からモノクローナル抗体が取得され得る。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに好適なものである。
　当該ハイブリドーマ等の抗体産生細胞からクローニングされる抗体遺伝子によってコードされる抗体も好適に利用され得る。クローニングした抗体遺伝子を適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって、当該遺伝子によってコードされる抗体が発現する。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は、例えば、Vandammeらによって既に確立されている（Eur.J. Biochem.（1990）192 (3), 767-775）。下記に述べるように組換え抗体の製造方法もまた公知である。
　例えば、抗プロテインC抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗プロテインC抗体の可変領域（V領域）をコードするcDNAが取得される。そのために、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、例えば、次のような方法を利用することができる。
－グアニジン超遠心法（Biochemistry (1979) 18 (24), 5294-5299）
－AGPC法（Anal. Biochem. (1987) 162 (1), 156-159）
　抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製され得る。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit（GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマからmRNAが取得され得る。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAが合成され得る。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit（生化学工業社製）等によって合成され得る。また、cDNAの合成および増幅のために、SMART RACE cDNA増幅キット（Clontech製）およびPCRを用いた5'-RACE法（Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85 (23), 8998-9002、Nucleic Acids Res. (1989) 17 (8), 2919-2932）が適宜利用され得る。さらにこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入され得る。
　得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、当該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製され得る。そして、当該組換えベクターが目的とするcDNAの塩基配列を有しているか否かについて、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認される。
　可変領域をコードする遺伝子を取得するためには、可変領域遺伝子増幅用のプライマーを使った5'-RACE法を利用するのが簡便である。まずハイブリドーマ細胞より抽出されたRNAを鋳型としてcDNAが合成され、5'-RACE cDNAライブラリが得られる。5'-RACE cDNAライブラリの合成にはSMART RACE cDNA増幅キットなど市販のキットが適宜用いられる。
　得られた5'-RACE cDNAライブラリを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。公知の抗体遺伝子配列をもとにマウス抗体遺伝子増幅用のプライマーがデザインされ得る。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列である。したがって、サブクラスは予めIso Stripマウスモノクローナル抗体アイソタイピングキット（ロシュ・ダイアグノスティックス）などの市販キットを用いて決定しておくことが望ましい。
　具体的には、例えばマウスIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ1、γ2a、γ2b、γ3、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーが利用され得る。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーには可変領域に近い定常領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方、5'側のプライマーには、5' RACE cDNAライブラリ作製キットに付属するプライマーが利用される。
　こうして増幅されたPCR産物を利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンが再構成され得る。再構成されたイムノグロブリンの、プロテインCに対する結合活性を指標として、所望の抗体がスクリーニングされ得る。プロテインCに対する抗体の取得を目的とするとき、抗体のプロテインCに対する結合は、特異的であることがさらに好ましい。プロテインCに結合する抗体は、例えば次のようにしてスクリーニングされ得る；
（１）ハイブリドーマから得られたcDNAによってコードされるV領域を含む抗体をプロテインCに接触させる工程、
（２）プロテインCと抗体との結合を検出する工程、および
（３）プロテインCに結合する抗体を選択する工程。
　抗体とプロテインCとの結合を検出する方法は公知である。具体的には、先に述べたELISAなどの手法によって、抗体とプロテインCとの結合が検出され得る。抗体の結合活性を評価するためにプロテインCの固定標本が適宜利用され得る。
　結合活性を指標とする抗体のスクリーニング方法として、ファージベクターを利用したパニング法も好適に用いられる。ポリクローナルな抗体発現細胞群より抗体遺伝子を重鎖と軽鎖のサブクラスのライブラリとして取得した場合には、ファージベクターを利用したスクリーニング方法が有利である。重鎖と軽鎖の可変領域をコードする遺伝子は、適当なリンカー配列で連結することによってシングルチェインFv（scFv）を形成することができる。scFvをコードする遺伝子をファージベクターに挿入することにより、scFvを表面に発現するファージが取得され得る。このファージと所望の抗原との接触の後に、抗原に結合したファージを回収することによって、目的の結合活性を有するscFvをコードするDNAが回収され得る。この操作を必要に応じて繰り返すことにより、所望の結合活性を有するscFvが濃縮され得る。
　目的とする抗プロテインC抗体のV領域をコードするcDNAが得られた後に、当該cDNAの両末端に挿入した制限酵素サイトを認識する制限酵素によって当該cDNAが消化される。好ましい制限酵素は、抗体遺伝子を構成する塩基配列に出現する頻度が低い塩基配列を認識して消化する。さらに１コピーの消化断片をベクターに正しい方向で挿入するためには、付着末端を与える制限酵素の挿入が好ましい。上記のように消化された抗プロテインC抗体のV領域をコードするcDNAを適当な発現ベクターに挿入することによって、抗体発現ベクターが取得され得る。このとき、抗体定常領域（C領域）をコードする遺伝子と、前記V領域をコードする遺伝子とがインフレームで融合されれば、キメラ抗体が取得される。ここで「キメラ抗体」とは、定常領域と可変領域の由来が異なる抗体をいう。したがって、マウス－ヒトなどの異種キメラ抗体に加え、ヒト－ヒト同種キメラ抗体も、本発明におけるキメラ抗体に含まれる。予め定常領域を有する発現ベクターに、前記V領域遺伝子を挿入することによって、キメラ抗体発現ベクターが構築され得る。具体的には、例えば、所望の抗体定常領域（C領域）をコードするDNAを保持した発現ベクターの5'側に、前記V領域遺伝子を消化する制限酵素の制限酵素認識配列が適宜配置され得る。同じ組み合わせの制限酵素で消化された両者がインフレームで融合されることによって、キメラ抗体発現ベクターが構築される。
　抗体のアイソタイプは、抗体定常領域の構造によって決定される。IgG1、IgG2、IgG3およびIgG4の各アイソタイプの抗体定常領域は、それぞれ、Cγ1、Cγ2、Cγ3およびCγ4と呼ばれる。また、軽鎖の抗体定常領域はλおよびκ鎖の定常領域が適宜使用される。
　プロテインCに結合するモノクローナル抗体を製造するために、抗体遺伝子が発現制御領域による制御の下で発現するように発現ベクターに組み込まれる。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。また、発現した抗体が細胞外に分泌されるように、適切なシグナル配列がアミノ末端に付加され得る。発現されたポリペプチドは上記配列のカルボキシル末端部分で切断され、切断されたポリペプチドが成熟ポリペプチドとして細胞外に分泌され得る。次いで、この発現ベクターによって適当な宿主細胞が形質転換されることによって、抗プロテインC抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞が取得され得る。
　抗体遺伝子の発現のために、抗体重鎖（H鎖）および軽鎖（L鎖）をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込まれる。H鎖とL鎖が組み込まれたベクターによって、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）されることによって、H鎖とL鎖を備えた抗体分子が発現され得る。あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAが単一の発現ベクターに組み込まれることによって宿主細胞が形質転換され得る（WO1994/011523を参照のこと）。
　単離された抗体遺伝子を適当な宿主に導入することによって抗体を作製するための宿主細胞と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明の抗原結合ドメインを単離するのに応用され得る。真核細胞が宿主細胞として使用される場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が適宜使用され得る。具体的には、動物細胞としては、次のような細胞が例示され得る。
（１）哺乳類細胞、：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby hamster kidney）、Hela、Vero、HEK（human embryonic kidney）293など
（２）両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
（３）昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など
　あるいは植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞が適宜利用され得る。
　さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる。
－酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces）属、メタノール資化酵母（Pichia pastoris）などのPichia属
－糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属
　また、原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。例えば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.coli）、枯草菌などの細菌細胞が適宜利用され得る。これらの細胞中に、目的とする抗体遺伝子を含む発現ベクターが形質転換によって導入される。形質転換された細胞をin vitroで培養することにより、当該形質転換細胞の培養物から所望の抗体が取得され得る。
　組換え抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物も利用され得る。すなわち所望の抗体をコードする遺伝子が導入された動物から、当該抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築され得る。乳汁中に分泌されるタンパク質として、例えば、ヤギβカゼインなどが利用され得る。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、当該注入された胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（またはその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体が乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得され得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに対して投与され得る（Bio/Technology (1994), 12 (7), 699-702）。
　本明細書において記載される抗LAMP5抗体がヒトに投与される場合、当該抗体における抗原結合ドメインとして、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体由来の抗原結合ドメインが適宜採用され得る。遺伝子組換え型抗体には、例えば、ヒト化（Humanized）抗体等が含まれる。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて適宜製造される。
　本発明の抗プロテインC抗体における抗原結合ドメインの作製に用いられる抗体の可変領域は、通常、4つのフレームワーク領域（FR）に挟まれた3つの相補性決定領域（complementarity-determining region;CDR）で構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方、FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い同一性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるとされている。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、例えばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、例えば重複伸長PCR（Overlap Extension PCR）が公知である。重複伸長PCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加される。プライマーは4つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと同一性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるとされている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と同一性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
　また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、ヒト抗体遺伝子を鋳型として合成された産物のオーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
　最終的に3つのCDRと4つのFRが連結されたV領域遺伝子は、その5'末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体C領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト型抗体発現用ベクターが作成できる。
　当該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、当該組換え細胞を培養し、当該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、当該ヒト化抗体が当該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP239400、国際公開WO1996/002576参照）。
　上記のように作製されたヒト化抗体の抗原に対する結合活性を定性的または定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに当該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。例えば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原に対する結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択され得る（Cancer Res., (1993) 53, 851-856）。
　また、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
　さらに、ヒト抗体ライブラリを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発
現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、当該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388参照）。
　また、抗体遺伝子を取得する方法としてBernasconiら（Science (2002) 298, 2199-2202）またはWO2008/081008に記載のようなB細胞クローニング（それぞれの抗体のコード配列の同定およびクローニング、その単離、およびそれぞれの抗体（特に、IgG1、IgG2、IgG3またはIgG4）の作製のための発現ベクター構築のための使用等）の手法が、上記のほか適宜使用され得る。
　プロテインCの活性化を阻害するかどうかは、公知の方法に従って確認することができる。例えば、プロテインCの活性化を阻害する候補物質をプロテインCと接触させた後、トロンビンとトロンボモジュリンとを添加し、トロンビンによるプロテインCの活性化反応を開始させる。その後、プロテインCの活性化反応を停止させる。トロンビンにより活性化されたプロテインCの活性を測定することで、当該候補物質がプロテインCの活性化を阻害しているかどうかを確認することができる。具体的には実施例４に記載の通りである。
　上記の方法によって得られたプロテインCの活性化阻害物質は、常法に従って製剤化し、医薬組成物とすることができる。
　本発明の医薬組成物においては、さらに、活性化プロテインCの活性を阻害する物質と組み合わせて使用してもよく、また、プロテインCの活性化阻害物質が、同時に活性化プロテインCの活性化を阻害する活性を有していてもよい。
　本発明において「活性化プロテインＣの活性阻害」あるいは「活性化プロテインCの活性を阻害する」とは、活性化プロテインCによる活性化凝固第V因子又は活性化凝固第VIII因子の不活性化を阻害することを意味する。活性化プロテインCの活性を阻害する物質としては、例えば、活性化プロテインCと活性化凝固第V因子又は活性化凝固第VIII因子との結合を阻害する物質が挙げられる。具体的には、例えば、抗活性化プロテインC抗体、抗活性化凝固第V因子抗体、抗活性化凝固第VIII因子抗体、活性化プロテインC部分ペプチド、活性化凝固第V因子の部分ペプチド、活性化凝固第VIII因子の部分ペプチドこれらと同様の活性を示す低分子化合物などが挙げられる。
　本発明において「活性化プロテインCの活性を阻害する物質と組み合わせて用いる」とは、プロテインＣの活性化を阻害する物質と活性化プロテインCの活性を阻害する物質とを、同時に、別々に、または、順次に投与するために組み合わせることを意味する。プロテインCの活性化を阻害する物質と活性化プロテインCの活性を阻害する物質は、１つの医薬組成物中に含まれていてもよいし、別々の医薬組成物に含まれていてもよい。さらに、プロテインCの活性化を阻害する物質を含む医薬組成物と活性化プロテインCの活性を阻害する物質を含む医薬組成物が構成に含まれるキットであってもよい。
　また、プロテインＣの活性化を阻害する物質が、同時に活性化プロテインCの活性を阻害する物質としては、例えば、抗体が挙げられる。具体的には、例えば、上述の抗プロテインC抗体のうち、さらに、活性化プロテインCの活性を阻害する作用を有する抗体を好ましい抗体として挙げることができる。より具体的には、プロテインC及び活性化プロテインCに結合する抗体が挙げられる。
　活性化プロテインCの活性を阻害するかどうかは、公知の方法に従って確認することができる。例えば、活性化プロテインCの活性を阻害する候補物質を活性化プロテインCと接触させた後、活性化凝固第V因子を添加し、活性化プロテインCによる活性化凝固第V因子の不活性化反応を開始させる。その後、活性化血液凝固第X因子とプロトロンビンを添加することで、活性化凝固第V因子依存的なトロンビン生成を開始させ、生成されたトロンビンの活性を測定することで、当該候補物質が活性化プロテインCの不活性化を阻害しているかどうかを確認することができる。具体的には実施例３に記載の通りである。
　本発明における医薬組成物は、含有されるプロテインCの活性化を阻害する物質が、活性化プロテインCによる抗血液凝固作用を阻害し、血液凝固を促進させる作用を有することから、活性化プロテインCによる抗血液凝固作用を阻害する、或いは、止血作用を促進するために利用することができる。また、当該血液凝固を促進させる作用により、血液凝固機能の低下に起因する出血性疾病の治療に利用することができる。このような疾患としては、例えば、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患等を挙げることができる。具体的には、血友病、後天性血友病、フォンビルブランド因子（vWF）の機能異常または欠損に起因するフォンビルブランド病、後天性フォンビルブランド病等が挙げられる。
　したがって、本発明は、プロテインCの活性化阻害物質を含有する、抗血液凝固作用を阻害するための医薬組成物、止血作用を促進するための医薬組成物、或いは、出血性疾患の治療のための医薬組成物を提供する。
　本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。医薬的に許容される担体および添加物としては、例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。さらにこれらに制限されず、その他常用の担体や添加物が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。
　また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ[メチルメタクリル酸]等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（"Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed. (1980)等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Langer et al., J.Biomed.Mater.Res. 15: 267-277 (1981); Langer, Chemtech. 12: 98-105 (1982);米国特許第3,773,919号;欧州特許出願公開(EP)第58,481号; Sidman et al., Biopolymers 22: 547-556 (1983);EP第133,988号）。
　また本発明は、本発明の抗体もしくは組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防および／または治療するための方法を提供する。抗体もしくは組成物の投与は、例えば、前記の方法により実施することができる。
　さらに本発明は、少なくとも本発明の抗体もしくは組成物を含む、上記方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、注射筒、注射針、薬学的に許容される媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。
　また本発明は、本発明のプロテインCの活性化阻害物質を含む医薬組成物の、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療剤の製造における使用に関する。
　また本発明は、出血、出血を伴う疾患もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療用の、本発明の多重特異性抗原結合分子もしくは二重特異性抗体、または組成物に関する。
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　本発明を実施例によりさらに詳しく説明するが、本発明はこれに限定されない。種々の変更、修飾が当業者には可能であり、これらの変更、修飾も本発明に含まれる。
〔実施例１〕マウスプロテインCの作製
　マウスプロテインCの全長翻訳領域をカバーするcDNAをマウス肝臓からPCR法により増幅した。これを鋳型に、さらにC末端にFLAG Tagを付与した『遺伝子をPCR法』により増幅し、発現ベクターへサブクローニングした。該発現ベクターをCHO細胞にトランスフェクションし、培養した。得られた培養上清から、常法に従って、マウスプロテインC-Flag蛋白を精製した。
〔実施例２〕抗マウスプロテインCラット抗体の作製
　実施例１で作製したマウスプロテインC-Flag蛋白（0.1 mg/匹）を、Freund's Complete Adjuvant（FCA、Difco Laboratories、現Becton Dickinson Co）と混合し、SDラット（2匹、日本チャールス・リバー株式会社）の片足のフットパッドへ接種した。接種の2週間後、免疫ラットより腸骨リンパ節を摘出した。摘出したリンパ節細胞を用いて、常法に従い、ハイブリドーマを作製した。ハイブリドーマの培養上清を用い、ハイブリドーマが産生する抗体のマウスプロテインC-FlagとFlagタンパクに対する結合活性をELISAに測定した。マウスプロテインCに対して特異的に結合活性を示す抗体を産生するハイブリドーマを選択した。選択したハイブリドーマを培養し、培養上清より抗マウスプロテインC抗体を、常法に従って精製した。精製抗体に関しては、実施例３、４記載の方法等でスクリーニングを実施し、マウスプロテインCの活性化及び/または活性化プロテインC活性を阻害する抗体としてMP35及びMP51を選択した。
〔実施例３〕マウス活性化プロテインCによるFVa不活化に対する抗マウスプロテインC抗体MP35及びMP51の効果
（方法）
(1)試薬の調製
・抗マウスプロテインC抗体は、0.1%牛血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩水（TBSB）にて、15、50 μg/mLに調製した。
・ヒルジン(Merck KgaA)は、TBSBにて、10 IU/mLに調製した。
・マウスプロテインC-Flag、ヒトαトロンビン(Enzyme Research Laboratories)、ウサギトロンボモジュリン(American Diagnostica)、ヒト活性化凝固第X因子（FXa、Enzyme Research Laboratories）、ヒト活性化凝固第V因子（FVa、Enzyme Research Laboratories）及びヒトプロトロンビン(Enzyme Research Laboratories)は、104 μMのリン脂質溶液(10% ホスファチジルセリン／60% ホスファチジルコリン／30% ホスファチジルエタノラミン (Avanti Polar Lipids)；Okuda, M. & Yamamoto, Y. Clin. Lab. Haem. 26, 215-223 (2004)に従い調製)、8.3 mM のCaCl2、 1.7 mMのMgCl2を含むTBSB（TBCP）にて、それぞれ、24.8 μg/mL、1.48 μg/mL、14.8 μg/mL、9.66 ng/mL、2.25 ng/mL及び50 μg/mLに調製した。
・マウス活性化プロテインCは、24.8 μg/mLのマウスプロテインC-Flag、1.48 μg/mLのヒトαトロンビン、14.8 μg/mLのウサギトロンボモジュリンを各等量ずつ混合し、37℃で120分間インキュベーション後、混合溶液の3分の1容量の10 U/mLのヒルジンを添加することにより作製した。これを、TBSBにて、3333倍に希釈した。
・S-2238（CHROMOGENIX）は、精製水で4 mMに溶解後、さらに精製水で1.6 倍希釈した。
(2)アッセイ
　96 wellプレートに、(1)で調製したマウス活性化プロテインC 5 μLと、0.5、1.5、5、15、50、150、500 μg/mLの抗マウスプロテインC抗体 5 μLを混合し、室温にて30分間インキュベーションした。（抗体無添加群においては、抗体溶液の代わりにTBSB 5 μLと混合した。また、マウス活性化プロテインC及び抗体無添加群においては、それらの代わりにTBCP5 μL及びTBSB 5 μLと混合した。）
　次いで、室温にて2.25 ng/mLのFVa 5μLを添加し、FVa不活化反応を開始させた。15分間後、残存FVa活性を評価するために、9.66 ng/mLのヒト FXa 5 μLと50 μg/mLのヒトプロトロンビン 5 μLを添加して、FVa濃度依存的なトロンビン生成反応を開始させた。10分間後、0.5 MのEDTA 5 μLを添加してトロンビン生成反応を停止させた。生成したトロンビンの活性を測定するため、発色基質溶液S-2238 5 μLを添加し、発色反応を開始させた。15分間の発色反応後、405 nmの吸光度変化をSpectraMax 340PC384(Molecular Devices)を用いて測定した。
（結果）
　抗マウスプロテインC抗体 MP35又はMP51は、いずれも吸光度を上昇させた(図１)。従って、MP35及びMP51共にマウス活性化プロテインCによるFVa不活化を阻害することが示された。
〔実施例４〕トロンビン/トロンボモジュリン複合体によるマウスプロテインC活性化に対する抗マウスプロテインC抗体MP35及びMP51の効果
（方法）
(1)試薬の調製
・抗マウスプロテインC抗体及びヒルジンはTBSBにて、それぞれ120 μg/mL及び75 U/mLに調製した。
・マウスプロテインC-Flag、ヒトαトロンビン及びウサギトロンボモジュリンは、TBCPにて、それぞれ、24.8 μg/mL、14.8 μg/mL及び14.8 μg/mLに調製した。
・Spectrozyme aPC（American Diagnostica）は、精製水で5 mMに溶解後、さらに精製水で6.25 倍希釈した。
(2)アッセイ
　96 wellプレートに、120 μg/mLの抗マウスプロテインC抗体 5 μL、及び24.8 μg/mLのマウスプロテインC-Flag蛋白溶液 5 μLを混合し、室温にて30分間インキュベーションした。（抗体無添加群においては、抗体溶液の代わりにTBSB 5 μLと混合した。）
　次いで、37℃にて14.8 μg/mLのヒトαトロンビン 5 μLと14.8 μg/mLのウサギトロンボモジュリン5 μLを添加し、マウスプロテインC活性化反応を開始させた。120分間後、75 U/mLのヒルジン10 μLを添加してプロテインC活性化反応を停止させた。生成した活性化プロテインCの活性を測定するため、発色基質溶液Spectrozyme aPC 10 μLを添加し、発色反応を開始させた。45分間の発色反応後、405 nmの吸光度変化を吸光度計SpectraMax 340PC384(Molecular Devices)を用いて測定した。
（結果）
　抗マウスプロテインC抗体 MP51の添加により、吸光度が低下した。一方、MP35を添加しても、吸光度の変化は示さなかった(図２)。従って、MP51はプロテインC活性化反応を阻害するが、MP35は阻害しないことが示された。なお、マウスプロテインC活性化反応中の抗体濃度は40 μg/mLである。
〔実施例５〕プロテインC活性化物質を添加したマウス血漿におけるトロンビン生成に対する抗マウスプロテインC抗体の効果
（方法）
(1)試薬の調製
・抗マウスプロテインC抗体は、TBSBにて、0.18、0.6、1.8、6、18、60、及び180 μg/mLに調製した。
・プロテインC活性化物質（製品名Protac、American Diagnostica Inc）は、精製水で溶解し（6 U/mL）、更にTBSで4 U/mLに調製した。
(2)アッセイ
　蛍光測定用96ウェルプレート（Thermo Fisher Scientific、Immulon 2HB "U" Bottom Microtiter Plates、3655）の各ウェルに、0.18、0.6、1.8、6、18、60、及び180 μg/mLの抗マウスプロテインC抗体 25 μLとマウスクエン酸血漿15 μLを混和し、室温で15分間静置した。（抗体無添加群においては、抗体溶液の代わりにTBSB 5 μLと混合した。）
　次いで、4 U/mLのプロテインC活性化物質（製品名Protac、American Diagnostica Inc）40 μLと凝固開始試薬であるPPP-Reagent LOW（Thrombinoscope BV.）20 μLを添加し、37℃で15分間室温にて静置した。
　なお、プロテインCをProtacで活性化させない場合のトロンビン生成を測定するため、抗体溶液の代わりに同容量のTBSB、Protacの代わりに同容量のTBSを添加したサンプルも準備した。
　その後、プレートをトロンビン生成蛍光システムにセットし、37℃で約5分間インキュベーション後、測定を開始させた。（測定開始と同時に、Fluo-SubstrateとFluo-Bufferの混合溶液20 μLが添加される。）
　なお、各サンプルから得られる蛍光強度をトロンビン量に換算するために、同一プレート内で、マウス血漿15 μLとTBSB 25 μLの混合溶液に、凝固開始試薬の代わりにThrombin Calibrator（Thrombinoscope BV.）20 μLを添加するウェルも設定した。
　なお、トロンビン生成蛍光システム専用解析ソフトThrombinoscope software version 3.0.0.29（Thrombinoscope BV.）の設定条件は以下のとおりである。
　・Fluo-SubstrateとFluo-Bufferの混合溶液量（設定項目 Dispense）：20 μL
　・攪拌時間（設定項目 Shake）：10秒間
　・測定時間（設定項目 Totaltime）：60分間
　・測定間隔（設定項目 Interval）：20秒
　・励起波長（自動設定）：390 nm
　・蛍光波長（自動設定）：460 nm
　算出されたトロンビン生成開始時間（Lag time（min））及び最大トロンビン生成量（Peak height（nmol/L））を用い、マウス血漿中における抗マウスプロテインC抗体の活性化プロテインC活性阻害能を評価した。
（結果）
　プロテインC活性化物質（Protac）を添加した正常マウス血漿のトロンビン生成に対する抗マウスプロテインC抗体の効果を図3Aに示した。正常マウス血漿にProtacを添加することにより、Lag timeは2.0 分から2.4 分に延長し、Peak heightは53 nMから22 nMに減少したことから、Protacで生成された活性化プロテインCが本血漿において抗凝固作用を示すことが確認された。抗マウスプロテインC抗体MP35、MP51共に用量依存的に、Protac添加時のLag timeを短縮させ、Peak heightを増加させた。
　同様に、FVIII欠乏マウス血漿に関しても評価した（図3B）。FVIII欠乏マウス血漿にProtacを添加することにより、Lag timeは2.2分から2.5分に延長し、Peak heightは33 nMから15 nM減少したことから、Protacで生成された活性化プロテインCが本血漿において抗凝固作用を示すことを確認した。MP35、MP51共に濃度依存的に、Protac添加時のLag timeを短縮させ、Peak heightを増加させた。
　従って、正常マウス血漿又はFVIII欠損マウス血漿において、MP35及びMP51が、活性化プロテインCの抗凝固作用を阻害することにより、凝固作用を促進するポテンシャルを有することが示された。
　また、血漿におけるマウス活性化プロテインC阻害活性に関しては、MP35は、MP51に比し、同等あるいはそれ以上の活性を有していることが示された。
〔実施例６〕FVIII欠損ヌードマウスの作出
　FVIII欠損マウス（B6;129S4-F8tm1Kaz/J mice）を、ヌードマウス（Crlj: CD1-Foxn1nu）と交配し、体毛のない表現型をFVIII欠損マウスに導入した。
〔実施例７〕FVIII欠損ヌードマウスを用いた穿刺出血モデルにおける出血症状に対する抗マウスプロテインC抗体の効果
（方法）
　Vehicle（n = 8）、3 mg/kgの抗マウスプロテインC抗体 MP51(n = 9)、又は30 mg/kgの抗マウスプロテインC抗体 MP35（n = 9）を血友病Aマウスの尾静脈内に投与した。イソフルラン麻酔下で、マウスの左右の大腿内側部筋肉に23G注射針を3 mmの深さで2カ所ずつ穿刺した。穿刺した日をDay0とし、Day1及びDay2に体表から目視可能な出血痕の面積を計測した。Day 1、Day 2それぞれで計測された出血痕面積をマウス個体ごとに総和した出血痕総面積を測定して出血の指標とした。
（結果）
　Vehicle群では、穿刺による出血刺激により、時間経過とともに出血痕総面積が増加した。プロテインC活性化と活性化プロテインCの活性を阻害する抗マウスプロテインC抗体 MP51（3 mg/kg）投与群では、Day 1及びDay 2いずれにおいても、出血痕総面積の増加が抑制された。一方、活性化プロテインCの活性のみを阻害するMP35投与（30 mg/kg）群では、vehicle群と同様に出血痕総面積が増加した(図４)。従って、プロテインC活性化と活性化プロテインCの活性を阻害する抗プロテインC抗体が血友病Aにおける出血症状に対して止血効果を有することが示された。
〔実施例８〕抗マウスプロテインC抗体の抗原結合部位の解析
（方法）
　MP35及びMP51が、マウスPCの軽鎖、重鎖、どちらを認識するかを、western blotting（WB）を用い、検討した。マウスPC（[製品名] Recombinant Mouse Coagulation Factor XIV/Protein C、[供給元] R&D Systems、 [カタログ番号] 4885-SE）をヒトトロンビン（[製品名] Human alpha Thrombin、[供給元] Enzyme research laboratories、[カタログ番号] HT 1002a）及びウサギトロンボモジュリン（[製品名] Rabbit Thrombomodulin、[供給元] Haematologic Technologies、[カタログ番号] RTM-2020）で活性化させ、結果生じたマウス活性化PCをSDS-PAGEした後、PVDF膜に移し、MP35又はMP51と反応させた。二次抗体（[製品名] HRP-Goat anti-Rat IgG (H+L)、[供給元] Life technologies、[カタログ番号] 629520）と基質（[製品名] SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate、[供給元] サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、[カタログ番号] 34076）でMP35あるいはMP51と結合する蛋白を検出した。
（結果）
　WBの結果、MP35は、15と20 kDa間のタンパクと結合することが示された。このタンパクは、分子量及びN末シークエンスからマウス活性化PCの軽鎖であることが確認された。一方、MP51は、37と50 kDa間のタンパクと結合することが示された。このタンパクは、分子量及びN末シークエンスから活性化マウスPCの重鎖であることが確認された。したがって、MP35はマウスPC/マウス活性化PCの軽鎖、MP51はその重鎖を認識することが示された。
〔実施例９〕抗マウスプロテインCヒト抗体の作製
　実施例１で作製したマウスプロテインC蛋白を用い、ヒトナイーブ抗体ライブラリから、ファージディスプレイ法により、マウスプロテインCに結合するディスプレイファージを濃縮した。マウスプロテインCに対して特異的に結合活性を示すディスプレイファージを選択し、そこから抗体可変領域遺伝子を増幅。常法に従って遺伝子組換えIgGとして発現させ、精製した。精製抗体に関しては、実施例３、４記載の方法等でスクリーニングを実施し、マウスプロテインCの活性化及び/または活性化プロテインC活性を阻害する抗体としてL2及びL12を選択した。
〔実施例１０〕マウス活性化プロテインCによるFVa不活化に対する抗マウスプロテインC抗体L2及びL12の効果
（方法）
　実施例３の方法に準じた。
（結果）
　抗マウスプロテインC抗体 L2又はL12は、いずれも吸光度を上昇させた(図５)。従って、L2及びL12共にマウス活性化プロテインCによるFVa不活化を阻害することが示された。なお、マウスプロテインC活性化反応中の抗体濃度は15または50 μg/mLである。
〔実施例１１〕トロンビン/トロンボモジュリン複合体によるマウスプロテインC活性化に対する抗マウスプロテインC抗体L2及びL12の効果
（方法）
　実施例４の方法に準じた。
（結果）
　抗マウスプロテインC抗体 L12の添加により、吸光度が低下した。一方、L2を添加しても、吸光度の変化は示さなかった(図６)。従って、L12はプロテインC活性化反応を阻害するが、L2は阻害しないことが示された。なお、マウスプロテインC活性化反応中の抗体濃度は30 μg/mLである。
　本発明により、プロテインCによる抗血液凝固作用を阻害又は抑制し、血液凝固作用・止血作用を促進することが可能となった。したがって、本発明により、出血性の疾患に対する新たな治療薬や新たな治療法の開発が可能となった。

Claims (14)

  1. 　プロテインＣの活性化阻害物質を含有する、出血性疾患を治療するための医薬組成物。
  2. 　出血性疾患が血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患である、請求項１に記載の組成物。
  3. 　出血性疾患が血友病Aである、請求項１に記載の組成物。
  4. 　プロテインＣの活性化阻害物質を含有する、止血作用を促進するための医薬組成物。
  5. 　止血作用が、血友病、後天性血友病及び、vWFの機能異常又は欠損に起因するフォンビルブランド病又は後天性フォンビルブランド病から選ばれる疾患の出血症状に対する作用である、請求項４に記載の組成物。
  6. 　止血作用が、血友病Aの出血症状に対する作用である、請求項４に記載の組成物。
  7. 　プロテインＣの活性化阻害物質を含有する、抗血液凝固作用を阻害するための医薬組成物。
  8. 　抗血液凝固作用が、活性化プロテインCの抗血液凝固作用である、請求項７に記載の組成物。
  9. 　プロテインＣの活性化阻害物質が、さらに活性化プロテインCの活性を阻害する、請求項１から８のいずれかに記載の組成物。
  10. 　医薬組成物が、活性化プロテインCの活性阻害物質と組み合わせて用いる組成物である、請求項１から９のいずれかに記載の組成物。
  11. 　プロテインＣの活性化阻害物質が、抗プロテインC抗体である、請求項１から１０のいずれかに記載の組成物。
  12. 　抗プロテインＣ抗体が、プロテインＣの重鎖に結合する抗体である、請求項１１に記載の組成物。
  13. 　プロテインＣの重鎖に結合し、プロテインＣの活性化プロテインＣへの変換を阻害する作用を有する、抗プロテインＣ抗体。
  14. 　抗プロテインＣ抗体が、さらに活性化プロテインＣの活性を阻害する作用を有する、請求項１３に記載の抗体。
PCT/JP2014/074789 2013-09-20 2014-09-19 抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療 WO2015041310A1 (ja)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2015537971A JP6445440B2 (ja) 2013-09-20 2014-09-19 抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療
US15/021,718 US20160229922A1 (en) 2013-09-20 2014-09-19 Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody
EP14845545.4A EP3047857A4 (en) 2013-09-20 2014-09-19 Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody
US16/391,848 US20190248921A1 (en) 2013-09-20 2019-04-23 Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013195355 2013-09-20
JP2013-195355 2013-09-20

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US15/021,718 A-371-Of-International US20160229922A1 (en) 2013-09-20 2014-09-19 Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody
US16/391,848 Division US20190248921A1 (en) 2013-09-20 2019-04-23 Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015041310A1 true WO2015041310A1 (ja) 2015-03-26

Family

ID=52688957

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/074789 WO2015041310A1 (ja) 2013-09-20 2014-09-19 抗プロテインｃ抗体による出血性疾患の治療

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20160229922A1 (ja)
EP (1) EP3047857A4 (ja)
JP (1) JP6445440B2 (ja)
TW (1) TWI673063B (ja)
WO (1) WO2015041310A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019009407A1 (ja) * 2017-07-07 2019-01-10 第一三共株式会社 抗プロテインｃ抗体

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020051277A1 (en) * 2018-09-06 2020-03-12 Board Of Regents, The University Of Texas System Treatment and prevention of hemophilic arthropathy with an antibody against endothelial cell protein c receptor (epcr)

Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP0058481A1 (en) 1981-02-16 1982-08-25 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
EP0133988A2 (de) 1983-08-02 1985-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung
JPS60120825A (ja) * 1983-10-18 1985-06-28 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 抗プロテインｃモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
JPH03504332A (ja) * 1988-12-30 1991-09-26 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション プロテインｃに対するモノクローナル抗体
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993009804A1 (en) * 1991-11-18 1993-05-27 The Scripps Research Institute Serine protease derived-polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting coagulation
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
WO1994011523A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
JPH10504186A (ja) * 1994-06-10 1998-04-28 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション プロテインｃに対するカルシウム結合組換え抗体
WO2004009641A1 (ja) * 2002-07-22 2004-01-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha aPC非中和抗体
US7291333B1 (en) * 1992-07-24 2007-11-06 Oklahoma Medical Research Foundation Blockade of protein C activation reduces microvascular surgical blood loss
WO2008081008A1 (en) 2007-01-05 2008-07-10 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
JP2011500843A (ja) 2007-10-26 2011-01-06 オクラホマ・メディカル・リサーチ・ファウンデーション 活性化プロテインｃおよび不活性化プロテインｃに対するモノクロナール抗体

Patent Citations (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
EP0058481A1 (en) 1981-02-16 1982-08-25 Zeneca Limited Continuous release pharmaceutical compositions
EP0133988A2 (de) 1983-08-02 1985-03-13 Hoechst Aktiengesellschaft Regulatorische Peptide enthaltende pharmazeutische Präparate mit protrahierter Freisetzung und Verfahren zu deren Herstellung
JPS60120825A (ja) * 1983-10-18 1985-06-28 Fujisawa Pharmaceut Co Ltd 抗プロテインｃモノクロ−ナル抗体およびそれを産生するハイブリド−マ
EP0239400A2 (en) 1986-03-27 1987-09-30 Medical Research Council Recombinant antibodies and methods for their production
JPH03504332A (ja) * 1988-12-30 1991-09-26 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション プロテインｃに対するモノクローナル抗体
WO1992001047A1 (en) 1990-07-10 1992-01-23 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992020791A1 (en) 1990-07-10 1992-11-26 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1992003918A1 (en) 1990-08-29 1992-03-19 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993006213A1 (en) 1991-09-23 1993-04-01 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993009804A1 (en) * 1991-11-18 1993-05-27 The Scripps Research Institute Serine protease derived-polypeptides and anti-peptide antibodies, systems and therapeutic methods for inhibiting coagulation
WO1993011236A1 (en) 1991-12-02 1993-06-10 Medical Research Council Production of anti-self antibodies from antibody segment repertoires and displayed on phage
WO1993012227A1 (en) 1991-12-17 1993-06-24 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1993019172A1 (en) 1992-03-24 1993-09-30 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
WO1994002602A1 (en) 1992-07-24 1994-02-03 Cell Genesys, Inc. Generation of xenogeneic antibodies
US7291333B1 (en) * 1992-07-24 2007-11-06 Oklahoma Medical Research Foundation Blockade of protein C activation reduces microvascular surgical blood loss
WO1994011523A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Fully impaired consensus kozac sequences for mammalian expression
WO1994025585A1 (en) 1993-04-26 1994-11-10 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
WO1995001438A1 (en) 1993-06-30 1995-01-12 Medical Research Council Sbp members with a chemical moiety covalently bound within the binding site; production and selection thereof
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
JPH10504186A (ja) * 1994-06-10 1998-04-28 オクラホマ メディカル リサーチ ファウンデーション プロテインｃに対するカルシウム結合組換え抗体
WO1996002576A1 (fr) 1994-07-13 1996-02-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anticorps humain reconstitue contre l'interleukine-8 humaine
WO1996033735A1 (en) 1995-04-27 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO1996034096A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
WO2004009641A1 (ja) * 2002-07-22 2004-01-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha aPC非中和抗体
WO2008081008A1 (en) 2007-01-05 2008-07-10 University Of Zurich Method of providing disease-specific binding molecules and targets
JP2011500843A (ja) 2007-10-26 2011-01-06 オクラホマ・メディカル・リサーチ・ファウンデーション 活性化プロテインｃおよび不活性化プロテインｃに対するモノクロナール抗体

Non-Patent Citations (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Remington's Pharmaceutical Science", 1980
"Remington's Pharmaceutical Science", MARK PUBLISHING COMPANY
ANAL. BIOCHEM., vol. 162, no. 1, 1987, pages 156 - 159
ASTERMARK J., HAEMOPHILIA, vol. 9, no. 1, 2003, pages 32
BERNASCONI ET AL., SCIENCE, vol. 298, 2002, pages 2199 - 2202
BIO/TECHNOLOGY, vol. 12, no. 7, 1994, pages 699 - 702
BIOCHEMISTRY, vol. 18, no. 24, 1979, pages 5294 - 5299
BUTENAS S ET AL., J THROMB HAEMOST, vol. 4, 2006, pages 2411
C. EUR. J. IMMUNOL., vol. 6, no. 7, 1976, pages 511 - 519
CANCER RES., vol. 53, 1993, pages 851 - 856
CASTELLINO FJ; PLOPLIS VA, J THROMB AND HAEMOST, vol. 7, no. 1, 2009, pages 140
CELL, vol. 8, no. 3, 1976, pages 405 - 415
CURRENT TOPICS IN MICROBIOLOGY AND IMMUNOLOGY, vol. 81, 1978, pages 1 - 7
J. EXP. MED., vol. 148, no. 1, 1978, pages 313 - 323
J. IMMUNOL. METHODS, vol. 35, no. 1-2, 1980, pages 1 - 21
J. IMMUNOL., vol. 123, no. 4, 1979, pages 1548 - 1550
KOHLER; MILSTEIN ET AL., METHODS ENZYMOL, vol. 73, 1981, pages 3 - 46
LANGER ET AL., J. BIOMED. MATER. RES., vol. 15, 1981, pages 267 - 277
LANGER, CHEMTECH., vol. 12, 1982, pages 98 - 105
MESTERS, R. M. ET AL.: "Identification of a sequence of human activated protein C (residues 390-404) essential for its anticoagulant activity", JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 266, no. 36, 1991, pages 24514 - 24519, XP055328931 *
NATURE, vol. 276, no. 5685, 1978, pages 269 - 270
NATURE, vol. 277, no. 5692, 1979, pages 131 - 133
NUCLEIC ACIDS RES., vol. 17, no. 8, 1989, pages 2919 - 2932
OKUDA, M.; YAMAMOTO, Y., CLIN. LAB. HAEM., vol. 26, 2004, pages 215 - 223
PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 85, no. 23, 1988, pages 8998 - 9002
SAMBROOK, J. ET AL.: "Molecular Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LAB. PRESS, pages: 9.47 - 9.58
SCHLACHTERMAN A ET AL., J THROMB HAEMOST, vol. 3, 2005, pages 2730
See also references of EP3047857A4
SIDMAN ET AL., BIOPOLYMERS, vol. 22, 1983, pages 547 - 556
SUZUKI, K. ET AL.: "Monoclonal Antibodies to Human Protein C : Effects on the Biological Activity of Activated Protein C and the Thrombin-Catalyzed Activation of Protein C", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY, vol. 97, no. 1, 1985, pages 127 - 138, XP008091703 *
VAN DIJK K ET AL., J THROMB AND HAEMOST, vol. 92, 2004, pages 305
VANDAMME ET AL., EUR. J. BIOCHEM., vol. 192, no. 3, 1990, pages 767 - 775

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019009407A1 (ja) * 2017-07-07 2019-01-10 第一三共株式会社 抗プロテインｃ抗体

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015041310A1 (ja) 2017-03-02
EP3047857A1 (en) 2016-07-27
JP6445440B2 (ja) 2018-12-26
TWI673063B (zh) 2019-10-01
US20160229922A1 (en) 2016-08-11
US20190248921A1 (en) 2019-08-15
EP3047857A4 (en) 2017-08-09
TW201609131A (zh) 2016-03-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20240052059A1 (en) Medicinal composition usable for preventing and/or treating blood coagulation factor ix abnormality, comprising multispecific antigen binding molecule replacing function of blood coagulation factor viii
US9090697B2 (en) Methods for treating bleeding disorders
US20220089778A1 (en) Coagulation factor binding proteins and uses thereof
KR102035882B1 (ko) 브라디키닌 b1 수용체 리간드에 대한 항체
JP2003527861A (ja) 増強した抗血液凝固能を持つ抗組織因子抗体
US20160297892A1 (en) Novel Methods and Antibodies for Treating Coagulapathy
WO2021043206A1 (zh) 一种抗tigit免疫抑制剂及应用
TWI716059B (zh) 經改良的促凝血抗體
TW201212938A (en) Antibodies that are capable of specifically binding tissue factor pathway inhibitor
TW202110890A (zh) 抗siglec-9組合物及其用於調節骨髓細胞發炎表型之方法及用途
RU2603097C2 (ru) Антитела к р-селектину и способы их применения и идентификации
TW200407335A (en) Non-neutralizing antibody to inhibit the inactivation of activated protein C
US20190248921A1 (en) Treatment for hemorrhagic diseases by anti-protein-c antibody
TW202210523A (zh) 用於調節骨髓樣細胞發炎表型之抗ｖｓｉｇ４組合物及方法以及其用途
TW202110891A (zh) 抗psgl-1組合物及其用於調節骨髓細胞發炎表型之方法及用途
KR20210153639A (ko) 이중 특이적 항체
US8252287B2 (en) Blood coagulation factor VIII activation-enhancing antibodies
WO2019200357A1 (en) Biomarker for cd47 targeting therapeutics and uses therefor
WO2021210667A1 (ja) 二重特異性抗原結合分子ならびに、それに関連する組成物、組成物の製造のための使用、キット、および方法
TW202208443A (zh) 蛋白質s抗體、其製造方法及其用途
US20210309746A1 (en) Antibodies that bind cd277 and uses thereof
TW201617371A (zh) 針對經活化之因子ｖ之抗體
TW202328191A (zh) 使用her3抗原結合分子的癌症之治療及預防
WO2023159220A1 (en) Anti-cd47 antibodies
TW201906868A (zh) 抗蛋白ｃ抗體

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14845545

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2015537971

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 15021718

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014845545

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014845545

Country of ref document: EP