JP2003527861A - 増強した抗血液凝固能を持つ抗組織因子抗体 - Google Patents

増強した抗血液凝固能を持つ抗組織因子抗体

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Abstract

(57)【要約】 本発明は増強した抗凝固能を持つ抗組織因子（抗ＴＦ）抗体、及びこのような抗体を同定、作成及び使用するための方法及び手段に関する。本発明の抗ＴＦ抗体は、ＴＦのＣ末端巨大分子基質結合領域にエピトープとの結合領域を含むことが示される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 （発明の背景） （発明の分野） 本発明は、抗組織因子（抗ＴＦ）抗体、特に増強した抗凝固能を持つものを作
成する方法に関する。本発明は更に、抗ＴＦ抗体、それらを作成する方法及び手
段、抗体を含む組成物、及び様々な疾患及び障害の診断、管理、予防及び治療に
おけるそれらの使用に関する。
【０００２】 （関連技術の説明） Ａ．組織因子 組織因子（ＴＦ）は、凝固因子ＶＩＩａ（ＦＶＩＩａ）及びチモーゲン前駆体
因子ＶＩＩ（ＦＶＩＩ）のレセプターである。天然ヒトＴＦ（ｈＴＦ）は、２６
３アミノ酸残基の糖タンパク質であって、細胞外ドメイン（残基１〜２１９）、
単一の膜貫通ドメイン（残基２２０−２４２）、および短い細胞質ドメイン（残
基２４３〜２６３）からなる（Fisher等, [1987] Thromb. Res. 48: 89-99, Mor
rissey等, [1987] Cell 50:129-135）。ＴＦの細胞外ドメインは、各々が約１０
５アミノ酸の２つの免疫グロブリン様フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインからな
る（Huang等, [1998] J. Mol. Biol. 275:873-894）。各ドメインは、Ｉｇスー
パーファミリーＣ２型相同性を持つ２つの反平行のβ-シートから形成される。 ＦＶＩＩａとＴＦとのタンパク質相互作用は、全体的にＴＦ細胞外ドメインに
媒介され（Muller等, [1994] Biochem. 33: 10864-10870; Gibbs等, [1994] Bio
chem. 33: 14003-14010; Ruf等, [1994] Biochem. 33: 1565-1572）、それは大
腸菌、培養されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞及びサッカロミセ
スセレビシアエにおいて発現されている（Waxman等, [1992] Biochemistry 31:
3998-4003; Ruf等, [1991] J. Bio. Chem. 266: 2158-2166及びShigematsu等, [
1992] J. Biol. Chem. 267: 21329-21337）。ｈＴＦ細胞外ドメイン及びＦＶＩ
Ｉａを阻害する活性部位とのその複合体の構造が、最近ｘ-線結晶学によって決
定されている（Harlos等, [1994] Nature 370: 662-666; Muller等, [1994] Bio
chemistry 33: 10864; Muller等, [1996] J. Mol. Biol. 256:144-159; Banner
等, [1996] Nature 380: 41-46）。
【０００３】 ｈＴＦの細胞外ドメインはアラニンスキャンニング突然変異誘発によって広範
に特徴付けられている（Kelley等, [1995] Biochemistry, 34: 10383-10392; Gi
bbs等, [1994], 上掲; Ruf等, [1994], 上掲）。アミノ酸１６−２６および１２
９−１４７の領域にある残基はＦＶＩＩａとの結合並びにこの分子の凝血原機能
に寄与している。残基Ｌｙｓ２０、Ｔｒｐ４５、Ａｓｐ５８、Ｔｙｒ９４、及び
Ｐｈｅ１４０はＦＶＩＩａとの結合の自由エネルギー（ΔＧ）に大きく寄与（1k
cal/mol）をしている（Kelley等, (1995) 上掲）。Ｌｙｓ２０及びＡｓｐ５８の
アラニン残基との置換は、ＦＶＩＩａ親和性においてそれぞれ７８及び３０倍の
低下を導く（Kelley等, [1995] 上掲）。ＦＶＩＩａに接触する他の近傍部位で
の１７の単一部位突然変異体の組は、親和性において小幅な低下（ΔΔＧ＝0.3
- 1.0 kcal mol-1）をもたらした。各々が結晶構造においてＦＶＩＩａに接触し
ているＴＦ残基Ｔｈｒ１７、Ａｒｇ１３１、Ｌｅｕ１３３及びＶａｌ２０７の突
然変異は、ＦＶＩＩａへの親和性に影響しない。Ｌｙｓ１５Ａｌａ及びＴｙｒ１
８５Ａｌａの突然変異は、親和性の小さな向上（ΔΔＧ＝-0.4 kcal mol-1）を
もたらす（Kelley等, [1995] 上掲）。ｈＴＦにおけるＬｙｓ２０のアラニン置
換によって課される親和性の７８倍の低下は、Ａｓｐ５８のトリプトファン置換
によって逆転する（Lee及びKelley, [1998] J. Biol. Chem. 273: 4149-4154）
。
【０００４】 アミノ酸１５７−１６８の領域にある残基はＴＦ-ＦＶＩＩａの凝結促進機能
に寄与するが（Kelley等, [1995] 上掲；Ruf等, [1992] J. Biol. Chem., 267:
22206-22210）、ＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ結合にとっては重要ではない。リジン残
基１６５及び１６６がＴＦ補因子機能に重要なことが示されているが、ＦＶＩＩ
ａ複合体の形成には関与していない（Roy等, [1991] J. Biol. Chem., 266: 220
63; Ruf等, [1992], J. Biol. Chem., 267: 6375）。リジン残基１６５及び１６
６は、ＴＦのＣ末端フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインに位置し、突然変異誘発
の結果に基づいてＦＶＩＩａ結合に重要であることが判明している残基とは反対
側の分子表面にある（Kelley等, (1995) 上掲）。これらのリジン残基をアラニ
ンで置換すると、ＴＦ-ＦＶＩＩａ複合体によって触媒されるＦＸ活性化速度の
低下をもたらす（Ruf等, (1992) 上掲）。ｈＴＦ（ｓＴＦ）の残基１−２１９を
含むＬｙｓ１６５Ａｌａ−Ｌｙｓ１６６Ａｌａ変異体（ｈＴＦＡＡ）は、ＦＶＩ
Ｉａへの結合について膜ＴＦとの競合を通してインビトロでの血液凝固の外部経
路を阻害する。動脈血栓症のウサギモデルにおいて、この変異体は、出血傾向を
増加させることなく血栓形成を部分的に阻止する（Kelley等, (1997) Blood 89,
3219-3227）。しかしながら、抗血栓効果には、この変異体の高用量が必要とさ
れ、これは一部には、ＦＶＩＩａがｓＴＦよりも約１０００倍緊密に細胞表面Ｔ
Ｆに結合するからである（Kelley等, (1997) 上掲）。より大きな見かけの親和
性は、ＦＶＩＩａγ-カルボキシグルタミン酸含有（Ｇｌａ）ドメインとリン脂
質との相互作用による。
【０００５】 ＴＦは血管内皮によって血漿から分離された細胞上に構成的に発現される（Ca
rson,S.D.及びJ.P.Brozna、[1993], Blood Coag. Fibrinol., 4: 281-292）。内
皮細胞及び単球上におけるその発現は、炎症性サイトカイン又は細菌性リポ多糖
との接触によって誘発される（Drake等, [1989] J. Cell Biol., 109: 389）。
組織が損傷を受けると、露出したＴＦの細胞外ドメインは、ＦＶＩＩと親和性の
高いカルシウム依存性複合体を形成する。一旦ＴＦと結合すると、ＦＶＩＩはぺ
プチド結合切断によって活性化されてセリンプロテアーゼＦＶＩＩａを与え得る
。この段階をインビボで触媒する酵素はまだ確認されていないが、インビトロで
はＦＸａ、トロンビン、ＴＦ-ＦＶＩＩａ、及びＦＩＸａがこの切断を触媒でき
る（Davie等, [1991] Biochemistly 30: 10363-10370）。ＦＶＩＩａはその生理
学的基質であるＦＸ及びＦＩＸに弱い活性しか示さないが、ＴＦ-ＦＶＩＩａ複
合体はＦＸおよびＦＩＸを迅速に活性化する。 ＴＦ-ＦＶＩＩａ複合体は、外因性血液凝固経路の第一次的な開始剤を構成す
る（Carson, S.D.及びJ.P. Brozna, [1993] Blood Coag. Fibrinol., 4: 281-29
2; Davie, E.W.等 [1991] Biochemistry, 30: 10363-10370; Rapaport, S.I.及
びL.V.M. Rao, [1992]Arterioscler. Thromb., 12: 1111-1121）。この複合体は
、ＦＸからＸａ因子（ＦＸａ）、ＦＩＸからＩＸａ因子（ＦＩＸａ）、及びそれ
に加えてＦＶＩＩからＦＶＩＩａへの活性化により外因性経路を開始させる。Ｔ
Ｆ-ＦＶＩＩａの作用は最終的にプロトロンビンからトロンビンへの変換を誘発
し、多くの生物学的機能を実行する（Badimon, L.等 [1991] Trends Cardiovasc
. Med. 1: 261-267）。トロンビンの最も重要な機能は、フィブリノーゲンのフ
ィブリンへの変換であり、それは重合して凝血塊を形成する。
【０００６】 この血漿プロテアーゼ系の関与は、動脈及び静脈の血栓症、敗血性ショック、
成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、播種性血管内血液凝固症（ＤＩＣ）及び他の
様々な疾患状態を含む種々の臨床的表現型に重要な役割を果たしていることが示
唆されている（Haskel, E.J.等 [1991], Circulation, 84: 821-827; Holst, J.
等 [1993] Haemostasis, 23(補1): 112-117; Creasey, A.A.等 [1993] J. C1in.
Invest., 91: 2850-2860; またColman, R.W. [1989] N. Engl. J. Med., 320:
1207-1209; Bone, R.C. [1992] Arch. Intern. Med., 152: 1381-1389も参照）
。ＴＦの過剰発現及び／又は異常な利用は血栓症および敗血症双方の病理生理学
に関連している（Taylor等, [1991] Circ. Shock, 33: 127; Warr等 [1990], B
lood, 75: 1481; Pawashe等 [1994] Circ. Res., 74: 56）。ＴＦは、動脈硬化
症プラーク内にある細胞の表面に発現される（Wilcox等, [1989] Proc. Natl. A
cad. Sci. USA, 86: 2839）。さらに、ＴＦは腫瘍転移に影響するとされている
（Bromberg等 [1995] Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 8205）。
【０００７】 Ｂ．抗組織因子抗体 ヒト化又はキメラ型のモノクローナル抗体は、様々な疾患の治療にうまく使用
されている（Vaswani及びHamilton,[1998] Ann. Allergy Asthma Immunol. 81:
105-119; Vaughan等, [1998]Nature Biotechnology 16: 535-539）。 ｈＴＦとの抗体反応性が記載されている（Tanaka等, [1985] Throm. Res. 40:
745-756; Tanaka等, [1986] Chem. Abstracts, 104:366:49211z; Morrissey等,
[1988] Throm. Res. 52:247-260; 米国特許第5,223,427号; Ruf等, [1992] J. C
rystal Growth 122:253-264; Huang等, [1998] 275:873-894）。抗ＴＦモノクロ
ーナル抗体は、様々な霊長類又は非霊長類の種の組織因子活性を阻害することが
示されている（Morrissey等, [1988] 上掲; Huang等 [1998] 上掲）。抗ＴＦモ
ノクローナル抗体の中和は、ヒヒ敗血症モデルで死亡を予防し（Taylor等 [1991
] Circ. Shock, 33: 127）、ウサギにおけるエンドトキシン誘導ＤＩＣを弱める
（Warr等 [1990] Blood, 75: 1481）ことが示された。 組織因子との抗体反応によるＴＦ開始血液凝固の阻害は、治療の様式として提
供されており（欧州特許第0266993 B1号）、血栓形成の部分でＴＦを特異的に認
識する抗体の使用は、様々な血栓性疾患の治療に有望な方法であると現在考えら
れている。実際に、抗ＴＦモノクローナル抗体を用いたインビボの研究では、効
果的な抗凝固活性が証明された（Levi等, [1994] J. Clin. Invest. 93, 114-12
0; Taylor等, [1991] Circulatory Shock 33, 127-134; Himber等, [1997] Thro
mb Haemostasis 78, 1142-1149; Pawashe等, [1994] Circ. Res. 74, 56-63; Ra
gni等, [1996] Circulation 93, 1913-1918; Jang等, [1992] Arterioscl. Thro
mb. 12, 948-954; Thomas等, [1993] Stroke 24, 847-854; Golino等, [1996] N
ature Med. 2, 35-40）。ＣＤＲグラフト抗ｈＴＦ抗体の使用は、組織因子媒介
性凝固の減弱又は防止のためとして説明されている（国際公開WO96/40621）。
【０００８】 しかしながら、前述のインビボ研究に使用された抗体の明確なＴＦ結合部位は
、Levi等, 上掲に使用された抗体の他は、知られていない。ＴＦの補助因子機能
がＴＦ分子の幾つかの決定領域に関係するため、抗体のエピトープに結合する位
置は、抗体の阻害効力を測定する重要な要因であり得る。因子ＶＩＩａ（ＦＶＩ
Ｉａ）の補助因子として、細胞表面に現れているＴＦは、細胞膜にＦＶＩＩ／Ｆ
ＶＩＩａを固定し、それによってＦＶＩＩａの全体的な構造を安定化している（
Waxman等, [1993] Biochemistry 32, 3005-3012）。また、ＴＦへの結合は、触
媒ドメインの正確な空間的方向付け及びリン脂質膜に関して活性な部位の位置決
定を導く（McCallum等, [1997] J.Biol. Chem. 272, 30160-30166; Banner等, [
1996] Nature 380, 41-46）。多くのＴＦ-ＦＶＩＩａ接触表面領域はＴＦとのＦ
ＶＩＩａ軽鎖相互作用により提供される。より細かくは、更に重要な接触表面は
、Ｎ末端ＴＦドメインとＦＶＩＩａ触媒ドメインの間にある。この接触は、小規
模な合成のための、並びに巨大分子基質への触媒作用の増強に主な役割を担うと
考えられる（Dickinson等, [1996] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 14379-143
84; Dickinson及びRuf, [1997] J. Biol. Chem. 272, 19875-19879)。更にＴＦ
は、残基Ｋ１６５及びＫ１６６を介する（Huang等, 上掲; Ruf等, [1992], J. B
iol. Chem., 267: 6375-6381; Roy等, [1991] J. Biol. Chem., 266: 22063-220
66; Kelley等, [1995] Biochemistry 34,10383-10392）、基質（Huang等, [1996
] J. Biol. Chem. 271, 21752-21757）、及びＴＦのＣ末端ドメインの隣接する
残基（Ruf等, [1992] J. Biol. Chem., 267: 22206-22210）、との直接の相互作
用に関与する。この複合体、補助因子-酵素-基質の相互作用に加えて、最近の観
察によりＦＶＩＩａのγ-カルボキシグルタミン酸-リッチ（Ｇｌａ）ドメインが
基質相互作用に寄与することが示唆された（Huang等, [1996] 上掲; Ruf等, [19
91] J. Biol. Chem. 266, 15719-15725; Martin等, [1993] Biochemistry 32, 1
3949-13955; Ruf等, [1999] Biochemistry 38, 1957-1966）。従って、そのエピ
トープ位置に基づく抗ＴＦ抗体は、これらＴＦ媒介性過程の１つ又は幾つかを妨
げ、抗凝固効果における違いとなりうる。このような抗体エピトープ依存性の効
力の差異は非平衡状態で拡大し、治療の状況下でも恐らく支配しているであろう
。この背景において、血液中で循環する抗体及び基質は、ＴＦにさらされると同
時に相互作用しうる。
【０００９】 当該分野で知られる多くの抗ＴＦ抗体の限定された特徴、及びＴＦがその血栓
性活性を発揮することによるメカニズムの複雑さから見て、増強した抗凝固能を
持つ抗ＴＦ抗体を確実に作成することは今日まで不可能であった。 抗ＴＦ抗体の特徴がその抗凝固能において最も重大な影響を持つということを
確定づけることが本発明の目的である。他の目的は、増強した抗凝固能を持つ抗
ＴＦ抗体を設計することにある。
【００１０】 （発明の概要） 本発明は、一つには、様々な抗ＴＦ抗体間の効力の違いを抗体が結合するＴＦ
エピトープの位置により、従って阻害の特定の形態により明らかにすることがで
きることを、経験的に見出したことに基づく。ＴＦのＣ末端巨大分子基質結合領
域と重複するエピトープに結合し、よってＴＦ基質相互作用を妨げる抗ＴＦ抗体
は、最も強力な抗凝血物質である。この発見は、初めて血栓症を治療又は抑制す
る高い能力を持つ抗ＴＦ抗体の目的ある作成を可能にする。 従って、本発明の一態様は、増強された抗凝固能力を持つ抗組織因子（抗ＴＦ
）抗体を同定するための、（ａ）複数の抗ＴＦ抗体でエピトープマッピングを行
い、更に（ｂ）組織因子（ＴＦ）のＣ末端巨大分子基質結合領域の少なくとも部
分を含むエピトープに結合する抗体を選択することを含む方法に関する。組織因
子は好ましくはヒトであり、巨大分子基質は因子Ｘ（ＦＸ）又は因子ＩＸ（ＦＩ
Ｘ）である。特に好ましい実施態様では、選択される抗体は、基質因子ＦＸ又は
ＦＩＸと直接相互作用するＴＦ領域を含むエピトープを、好ましくはＴＦと基質
因子のＧｌａドメインとの結合を妨げる又は阻害する部位に結合することによっ
て、認識する。他の好ましい実施態様では、選択された抗体はｈＴＦの残基Ｋ１
６５、Ｋ１６６及びＫ２０１を含むエピトープに結合する。また他の実施態様で
は、エピトープは更にｈＴＦの残基Ｎ１９９、Ｒ２００及びＩ１５２を含む。更
に他の実施態様では、エピトープは更にｈＴＦの残基Ｙ１５６を含む。特定の実
施態様では、該方法は、抗体Ｄ３、５Ｇ６及びＴＦ８-５Ｇ９の何れかのものと
本質的に同じｈＴＦエピトープに結合する抗体を同定するために使用される。あ
る場合には、上記に特定される結合特性を有し、ｈＴＦと因子ＶＩＩａ（ＦＶＩ
Ｉａ）の結合を妨げないことは抗体を選択するのに有利になり得る。本発明に従
って同定される全ての抗体は、（以下に定義されるような）ポリ-又はモノ-クロ
ーナル抗体であってもよく、齧歯類の、（例えばマウス）、ヒト化又はヒト抗体
であってもよい。
【００１１】 本発明はまた、本発明に従って同定された抗体を含む組成物、及びＴＦ-ＦＶ
ＩＩａが媒介又は関連する過程又は現象を阻害するために、又は限定するもので
はないが血栓症及び凝固障害を含む、ＴＦ-ＦＶＩＩａ関連疾患又は障害を予防
又は治療するためにこのような抗体を使用する方法も包含する。 他の態様では、本発明は、組織因子（ＴＦ）のＣ末端巨大分子基質結合領域の
少なくとも部分を含む抗原に対する抗体を産生させることを含む、増強した抗凝
固能を持つ抗体を作成する方法に関する。さらに、抗体は齧歯類、例えばマウス
、ヒト化及びヒト抗体を含む、（以下に定義されるような）ポリ又はモノクロー
ナル抗体であってもよい。好ましい実施態様では、抗体は、ＴＦ、好ましくはヒ
トＴＦ（ｈＴＦ）の完全なＣ末端巨大分子基質結合領域を含む抗原に対して産生
される。好ましくは、抗原は、ｈＴＦの残基Ｋ１６５、Ｋ１６６及びＫ２０１、
場合によっては残基Ｎ１９９、Ｒ２００及びＩ１５２を含む抗体を産生するのに
使用される。抗原はｈＴＦの残基Ｙ１５６を更に含む。 また他の態様では、本発明は、配列番号：１（マウスＤ３のＶＨ配列、図８）
又は配列番号：２（ヒト化Ｄ３Ｈ４４のＶＨ配列、図８）のアミノ酸配列を含む
抗組織因子（抗ＴＦ）抗体重鎖可変ドメインに関する。 更なる態様では、本発明は、配列番号：３（マウスＤ３のＶＬ配列、図９）又
は配列番号：４（ヒト化Ｄ３Ｈ４４のＶＬ配列、図９）のアミノ酸配列を含む抗
組織因子（抗ＴＦ）軽鎖可変ドメインに関する。 更なる態様では、本発明は、配列番号：５（マウス５Ｇ６のＶＨ配列-図１５
）のアミノ酸配列を含む抗組織因子（抗ＴＦ）重鎖可変ドメインに関する。 更なる態様では、本発明は、配列番号：６（マウス５Ｇ６のＶＬ配列-図１５
）のアミノ酸配列を含む抗組織因子（抗ＴＦ）軽鎖可変ドメインに関する。
【００１２】 他の態様では、本発明は、配列番号：１、２又は５の抗組織因子（抗ＴＦ）抗
体重鎖可変ドメインをコードする配列を含む単離された核酸に関する。 他の態様では、本発明は、配列番号：３、４又は６の抗組織因子（抗ＴＦ）抗
体軽鎖可変ドメインをコードする配列を含む単離された核酸に関する。 更なる態様では、本発明は、上記に定義されるような核酸を含み、発現する能
力のあるベクター、該ベクターで形質転換した宿主細胞、該組み換え宿主細胞を
含む細胞培地、及びコードされるポリペプチドを生成するために該核酸を発現さ
せる方法に関する。 本発明はまた、重鎖可変ドメインがＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨ（配列番号：７）の
配列を有する超可変領域ＣＤＲ-Ｈ１、ＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤ（
配列番号：８）の配列を有するＣＤＲ-Ｈ２及びＤＴＡＡＹＦＤＹ（配列番号：
９）の配列を有するＣＤＲ-Ｈ３を含む、重及び軽鎖可変ドメインを含むヒト化
抗組織因子（抗ＴＦ）抗体に関する。好ましい実施態様では、本発明のヒト化抗
ＴＦ抗体は、ＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮ（配列番号：１０）の配列を有する超可変
領域ＣＤＲ-Ｌ１、ＹＡＴＳＬＡＥ（配列番号：１１）の配列を有するＣＤＲ-Ｌ
２及びＬＱＨＧＥＳＰＷＴ（配列番号：１２）の配列を有するＣＤＲ-Ｌ３を含
む軽鎖可変ドメインを持つ。好ましくは、重及び軽鎖両方の超可変領域は、ヒト
フレームワーク領域で提供される。本発明の範囲内である特定の抗体は、限定す
るものではないが、（ａ）マウス抗体Ｄ３（Ｄ３Ｍｕｒ）、（ｂ）ヒト化抗体Ｄ
３Ｈ４４、（ｃ）マウス抗体５Ｇ６、及び（ｄ）抗体（ａ）−（ｃ）の何れか１
つと本質的に同じエピトープに特異的に結合する抗体を含む。
【００１３】 他の態様では、本発明は、上記に定義されるようなヒト化抗ＴＦ抗体重及び軽
鎖可変ドメインをコードする配列を含む単離された核酸、該核酸を含み、発現す
る能力のあるベクター、該ベクターで形質転換した組み換え宿主細胞、該組み換
え宿主細胞を含む細胞培地、及びコードしたポリペプチドを生成するために該核
酸を発現させる方法に関する。 他の態様では、本発明は、請求項１の方法により同定可能な抗組織因子（抗Ｔ
Ｆ）抗体を製薬的に許容可能な担体と混合されて含む組成物に関する。抗体は、
好ましくは抗ｈＴＦ抗体であり、好ましくはヒト化又はヒトである。例えば、組
成物は、（ａ）マウス抗体Ｄ３（Ｄ３Ｍｕｒ）、（ｂ）ヒト化抗体Ｄ３Ｈ４４、
（ｃ）マウス抗体５Ｇ６ 、及び（ｄ）抗体（ａ）−（ｃ）の何れか１つと本質
的に同じエピトープに特異的に結合する抗体からなる群から選択される抗体を、
製薬的に許容可能な担体と混合されて含む。 本発明は更に、本発明の抗組織因子（抗ＴＦ）抗体の有効量を対象に投与する
ことを含む、ＴＦ-ＦＶＩＩａ関連疾患又は障害、例えば血栓症又は凝固障害の
予防又は治療のための方法に関する。 本発明はまた、本発明の一又は複数の抗体を、場合によっては、所望される診
断的又は治療的使用に利用可能な一又は複数の更なる活性成分と組み合わせて含
む診断的手段、診断キット及び製造品に関する。
【００１４】 （好適な実施態様の詳細な説明） （定義） 説明を通して使用される略語は次のものを含む：ＩＸａ因子についてのＦＩＸ
ａ；ＸＩａ因子についてのＦＸＩａ；Ｘａ因子についてのＦＸａ；組織因子につ
いてのＴＦ；チモーゲンＶＩＩ因子についてのＦＶＩＩ；ＶＩＩａ因子について
のＦＶＩＩａ；組織因子−ＶＩＩａ因子複合体についてのＴＦ-ＦＶＩＩａ；Ｆ
ＶＩＩ及び／又はＦＶＩＩａについてのＦＶＩＩ／ＦＶＩＩａ；図１３（配列番
号：１３）のｈＴＦ配列の細胞外ドメイン残基１−２１９を含む可溶性組織因子
についてのｓＴＦ；ｈＴＦＡＡ、天然ｈＴＦ配列の位置１６５及び１６６におけ
るＬｙｓのＡｌａへの置換を含むｓＴＦ変異体；Dennis等, (1994) J. Biol. Ch
em. 269(35): 22129-22136において同一の名前であるクニッツ型ＴＦ-ＦＶＩＩ
ａ阻害剤についてのＴＦ７Ｉ-Ｃ；見掛けの平衡解離定数についてのＫＤ；プロ
トロンビン時間についてのＰＴ；活性化部分トロンボプラスチン時間についての
ＡＰＴＴ。 用語「抗凝固能」は、物質、例えばここでの抗体の、血液凝固のインビトロ又
はインビボアッセイにおける血液凝固を抑制、阻害又は延長させる能力を意図し
て使用される。血液凝固アッセイは当該分野において既知であり、例えば、ここ
での実施例１、Kirchhofer等, Arteripscler. Thoromb. Vasc. Biol. 15, 1098-
1106(1995); 及びKirchhofer等, J. Clin. Invest. 93, 2073-2083(1994)に記載
されるヒト生体外血栓症モデル、及び本出願の実施例に記載されるもののような
プロトロンビン時間アッセイ、本出願の実施例に記載されるようなヒト血漿の因
子Ｘ活性化の測定に基づくアッセイを含む。 標準的な血液凝固のインビボ又はインビトロアッセイ、例えば上述されるアッ
セイで決定されるように、血液凝固を抑制、阻害又は延長する能力が、ＴＦのＣ
末端巨大分子基質結合領域の少なくとも部分を含むエピトープ以外のＴＦエピト
ープに結合する抗ＴＦ抗体の能力を超える場合に、本発明の抗体の抗凝固能は「
増強され」る。好ましくは、増強した抗凝固能を持つ抗ＴＦは、異なるＴＦエピ
トープに結合する参照抗体よりも低用量及び／又は短時間で同じ効果（抑制、阻
害又は延長）に達する。好ましくは、本発明の範囲内の抗体と参照抗体の能力の
間の差異は、選択される標準的な血液凝固アッセイでの並べる対照によって決定
されるので、少なくとも約１．５倍、より好ましくは約２倍、更に好ましくは少
なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約５倍である。
【００１５】 「ＴＦのＣ末端巨大分子基質結合領域」は、因子ＩＸ（ＦＩＸ）の巨大分子基
質因子Ｘ（ＦＸ）とのＴＦの相互作用によるものであるＴＦの３次元構造内のＣ
末端領域として定義される。ｈＴＦにおいてＦＸ相互作用領域は、Muller等, J.
Mol. Biol. 256, 144-159(1996)に定義されるようにｈＴＦの細胞外ドメインの
第２のＦＮＩＩＩ分子内に位置し、上掲のMuller等, 図３、及びここでの図１４
に示されるβ鎖のβ８Ａ〜β１６Ｇを含む。ｈＴＦの巨大分子基質結合領域の主
な部分は、残基Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１６６（Roy等, (1991)上掲; Ruf等, (199
2) J. Biol. Chem. 267:6375-6381; Huang等, (1996) J. Biol. Chem. 271:2175
2-21757）、Ｔｙｒ１５７、Ｌｙｓ１５９、Ｓｅｒ１６３、Ｇｌｙ１６４，Ｔｙ
ｒ１８５（Kirchhofer等, (1999) Thromb. Haemost. Suppl. 300, 抄録; Kirchh
ofer等, (2000) Biochemistry, 39:7380-7387）を含む。Ｔｙｒ１５６、Ｔｒｐ
１５８、Ｌｙｓ１６９、Ａｓｎ１７３、Ｇｌｕ１７４、Ａｓｎ１９９、Ａｒｇ２
００、Ｌｙｓ２０１及びＡｓｐ２０４等のＦ.Ｘ相互作用に寄与する更なるｈＴ
Ｆ残基がある。基質Ｆ.ＩＸはほぼ同一のｈＴＦ領域に相互作用し、主な相互作
用領域（Ｌｙｓ１６５、Ｌｙｓ１６６、Ｔｙｒ１５７、Ｌｙｓ１５９、Ｓｅｒ１
６３、Ｇｌｙ１６４、Ｔｙｒ１８５）はＦ.Ｘのものと一致している。観察され
た唯一の違いは、ｈＴＦ残基Ｔｒｐ１５８及びＡｓｐ２０４に関連していたが、
両方ともＦ.Ｘ相互作用に比べＦ.ＩＸ相互作用に対して重要性が低いようである
。 用語「エピトープ」は、タンパク質抗原上の（モノクローナル又はポリクロー
ナル）抗体の結合部位を指して使用される。
【００１６】 ＴＦのＣ末端巨大分子基質結合領域に結合する抗体は、「エピトープマッピン
グ」により同定される。タンパク質上のエピトープの位置をマッピング又は特徴
付けするための当該分野で既知の多くの方法があり、抗体-抗原複合体の結晶構
造の解像、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、及び合成ペプチドに基づく
アッセイ、例えばHarlow及びLane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, C
old Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999の
第１１章に記載されるようなものを含む。競合アッセイは以下に検討される。遺
伝子断片発現アッセイによれば、タンパク質をコードする翻訳領域を、無作為に
又は特定遺伝子構築によっての何れかで断片化し、試験される抗体とのタンパク
質の発現した断片の応答性を決定する。遺伝子断片は、例えばＰＣＲにより作成
され、次いで放射活性アミノ酸の存在下でインビトロでのタンパク質に転写及び
翻訳されうる。次いで、抗体の放射活性標識したタンパク質断片への結合が、免
疫共沈降及びゲル電気泳動により決定される。また、特定のエピトープは、ファ
ージ粒子の表面に表示されるランダムペプチド配列の巨大なライブラリ（ファー
ジライブラリ）を用いることにより同定することができる。あるいは、重複した
ペプチド断片の決定されたライブラリは、シンプルな結合アッセイでの試験抗体
への結合を試験されうる。後にでてくる方法は、約５〜１５アミノ酸の直線状エ
ピトープを定義するのに適している。 抗体は、２つの抗体が同一の又は立体的に重複したエピトープを認識する場合
に、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同
一の又は立体的に重複したエピトープに結合するかどうかを決定する最も広く使
用され、早い方法は、競合アッセイであり、標識した抗原又は標識した抗体の何
れかを使用して全ての数の異なる形式で構成されうる。通常、抗原は９６穴プレ
ート上に固定され、標識した抗体の結合を阻害する非標識抗体の能力を放射活性
又は酵素標識を用いて測定する。
【００１７】 ここで用いられる場合のアミノ酸又はアミノ酸残基という用語は、変異体につ
いて以下でさらに説明するように、天然発生Ｌアミノ酸又はＤアミノ酸を意味す
る。共通して使用される一及び三文字略語が、アミノ酸についてここで用いられ
る（Bruce Alberts等, Molecular Biology of the Cell, Garland Publishing,
Inc., New York (3d ed. 1994)）。 「ＴＦ-ＦＶＩＩａ媒介又は関連過程又は事象」、あるいはこれと同等に、「
血漿ＦＶＩＩａに関連する活性」は、本発明によればＴＦ-ＦＶＩＩａの存在を
必要とする任意の事象である。凝血塊形成の一般的機構は、Medical Physiology
, 13th ed., Lange, Los Altos CA, pp411-414 (1987)の総説においてGanongに
より、及びBach (1988) CRC Crit. Rev. Biochem. 23(4): 359-368により概説さ
れている。血液凝固には、血小板凝集を誘発するトロンビン生成及び血小板プラ
グを安定化するフィブリン形成という２つの経路の合流が必要とされる。この過
程は、各々が別々のプロ酵素およびプロ補因子の存在を必要とする幾つかの段階
を含む。この過程は、フィブリンの架橋および血栓形成で終了する。フィブリノ
ーゲンはトロンビンの作用でフィブリンに変換される。一方、トロンビンは、プ
ロトロンビンのタンパク質分解的切断によって形成される。このタンパク質分解
は活性化された血小板表面に結合するＦＸａによって行われ、ＦＶａとカルシウ
ムの存在下でプロトロンビンを切断する。ＴＦ-ＦＶＩＩａは凝固の外部経路に
よるＦＸのタンパク質分解的活性化のために必要である。従って、ＴＦ-ＦＶＩ
Ｉａが媒介又は関連する過程又はＦＶＩＩａに関連する活性は、ＴＦ-ＦＶＩＩ
複合体形成からフィブリン血小板凝塊形成まで及び最初にＴＦ-ＦＶＩＩａの存
在を必要とする凝固カスケードにおける任意の段階を含む。例えばＴＦ-ＦＶＩ
Ｉａ複合体はＦＸからＦＸａ、ＦＩＸからＦＩＸａ、及びこれに加えてＦＶＩＩ
からＦＶＩＩａへの活性化によって外部経路を開始させる。ＴＦ-ＦＶＩＩａ媒
介又は関連プロセス又はＦＶＩＩａ活性は、例えば、因子ＶＩＩ及び他の必要な
試薬の存在下での因子Ｘから因子Ｘａへの変換についてRoy, S. (1991) J. Biol
. Chem., 266: 4665-4668、及びO'Brien, D.等 (1988) J. Clin. Invest., 82:
206-212に記載されたもののような標準的な検定法を使用して便利に測定できる
。
【００１８】 「ＴＦ-ＦＶＩＩａ関連疾患又は障害」は、深部脈管血栓症、動脈血栓症、発
作、腫瘍転移、血栓溶解、動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄のような脈管病
、炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、
汎発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）及びその他の疾患のような急性および慢性の徴
候を含むフィブリン形成に関連する慢性血塞性疾患又は障害を意味する。ＴＦ-
ＦＶＩＩａ関連障害は、前記のようなインビボ凝固障害に限定されるものではな
く、透析操作、血液濾過又は外科手術の間の血液バイパス等の過程で患者からイ
ンラインで取り出された血液を含む血液の体外循環に起因する血液凝固といった
エキソビボのＴＦ-ＦＶＩＩａ関連過程も含む。 「出血性疾患」は、遺伝的及び後天性の出血傾向に特徴づけられる。このよう
な出血性疾患の例は、因子ＶＩＩＩ、ＩＸ又はＸＩの欠損症である。後天性疾患
の例は、例えば因子ＶＩＩＩ、フォン・ビルブラント因子、因子ＩＸ、Ｖ、ＸＩ
、ＸＩＩ及びＸＩＩＩ等の血液凝固因子に対する後天性の阻害、凝固因子合成の
低下を含む肝臓疾患の結果としての止血障害、急性及び慢性腎臓疾患に伴う出血
傾向、及び外傷又は手術後の鬱血を含む。
【００１９】 用語「組織因子タンパク質」及び「哺乳動物組織因子タンパク質」は、天然発
生哺乳動物組織因子又は以下に記載するような組換え組織因子に対応するアミノ
酸配列を有するポリペプチドを意図して使用される。天然発生ＴＦには、ヒト種
並びにウサギ、ラット、ブタ、ヒト以外の霊長類、ウマ、マウス及びヒツジの組
織因子のような他の動物種の組織因子を含む（例えば、Hartzell等, (1989) Mol
. Cell. Biol., 9: 2567-2573; Andrews等, (1991) Gene, 98: 265-269; 及びTa
kayenik等, (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm., 181: 1145-1150参照）。ヒ
ト組織因子のアミノ酸配列は図１３（配列番号：１３）に示される。他の哺乳動
物組織因子タンパク質のアミノ酸配列は、一般に知られているか、又は従来法技
術を通して入手可能である。 ここで使用される「治療」とは、有益な又は所望される臨床結果が得られるた
めのアプローチである。本発明の目的において、これに限られないが、有益な又
は所望される臨床結果は、症状の緩和、疾病範囲の減少、疾患の安定した（つま
り、悪くならない）状態、病気進行の遅延又は減速、疾患状態の回復又は緩和、
及び緩解（部分的又は全体的にかかわらず）を含む。「治療」はまた、治療を受
けない場合に予測される生存に比較しての延命を意味することもできる。「治療
」は、疾患の病状の進行又は変化を防止する意図で実施される介入である。従っ
て、「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的手段の両方を意味する。治療
に必要なものは、既に疾患を有するもの並びに疾患が防止されるべきものを含む
。従って、「治療」は、上記に定義されるようなＴＦ-ＦＶＩＩａが媒介又は関
連した過程又は現象、又はＴＦ-ＦＶＩＩａ関連疾患又は障害、又は出血性疾患
の防止を意図して実施される介入である。
【００２０】 治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、ス
ポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシなどを含む哺乳類に分
類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。 「抗体」（Ａｂｓ）及び「免疫グロブリン」（Ｉｇｓ）は同じ構造的特徴を持
つ糖タンパク質である。抗体は特定の抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グ
ロブリンは抗体及び抗原特異性を持たない他の抗体様分子の両方を含む。後者の
種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系では低レベルで産生され、ミエローマ
において産生レベルが増加する。 「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及
び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５０,０００ダルトンの異種四量体糖タ
ンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合してお
り、異なる免疫グロブリンアイソタイプ重鎖中のジスルフィド結合の数は相違す
る。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した部位との間で鎖内ジスルフィド架橋
を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインに続いて可変ドメイン(ＶＨ)を一
端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有
し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメイ
ンは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖
可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。 「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲
に異なるという事を意味し、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合及び特
異性に利用される。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様
には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の超可変領域と呼ばれ
る３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保存された部分は
フレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン各々
は、４つのＦＲｓ（それぞれＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）を含み、大体
はβシート構造をとり、３つの超可変領域によって連結され、ループ結合を形成
し、ある場合にはその一部、βシート構造を形成する。各鎖の超可変領域は、Ｆ
Ｒにより近接して結合され、他の鎖の超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の
形成に寄与している(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Inter
est, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethe
sda, MD. (1991), 647-669頁を参照)。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に
直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性
細胞毒性における抗体の関与を示す。
【００２１】 ここで使用される場合、「超可変領域」なる用語は、抗原結合において重要な
抗体のアミノ酸残基を意味する。超可変領域は、「相補性決定領域」又は「ＣＤ
Ｒ」のアミノ酸残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４（Ｌ１）、
５０−５６（Ｌ２）及び８９−９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの３１−３５
（Ｈ１）、５０−５６（Ｈ２）及び９５−１０２（Ｈ３）；Kabat等, Sequences
of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, Nati
onal Institute of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「超可変ループ」
からの残基(すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５
２（Ｌ２）及び９１−９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメインの２６−３２（Ｈ１）
、５３−５５（Ｈ２）及び９６−１０１（Ｈ３）；Chothia及びLesk J.Mol.Biol
. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここに
定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。 抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれ、各々単一の抗原結合部位を
持つ２つの同一な抗原結合断片、及び、その名称が容易に結晶化する能力を反映
している残りの「Ｆｃ」断片を生成する。ペプシン処理により、２つの抗原結合
部位を有するが、交差結合抗原であり得るＦ(ａｂ')２断片が生成される。 「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含む最小抗体断片である。この領
域は、緊密に非共有的に結合した１つの重鎖と１つの軽鎖の可変ドメインの二量
体からなる。この配置では、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を決
定するために各可変ドメインの３つの超可変領域が相互作用する。正確には、６
つの超可変領域が抗体に抗原結合特異性を与える。しかし、単一の可変ドメイン
（又は抗原特異的な３つの超可変領域しか含まないＦｖの半分）でさえも抗原を
認識し結合する能力を持つが、結合部位全体よりは親和性が低い。 また、Ｆａｂ断片は軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ
１）も含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを
含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端における数個の残基の付加によりＦ
ａｂ断片と相違する。Ｆａｂ'-ＳＨは、ここにおいて、定常ドメインのシステイ
ン残基が遊離のチオール基を持つＦａｂ'の記号である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は
、元々、それらの間にヒンジシステインを持つＦａｂ'断片の対として生成され
た。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００２２】 任意の脊椎動物種からの抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、それらの定常
ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる
２つの明らかに異なる型の１つに分類できる。 重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンは異なるクラ
スに分けられる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、Ｉ
ｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、これらの幾つかは、更にサブクラス（アイソ
タイプ）、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇ
Ａ２に分けられる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメイン
は、各々α、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンの
サブユニット構造及び三次元配置は良く知られている。 「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特にモノクローナル抗
体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(
例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片も含
む。 「抗体断片」には、全長抗体の一部、一般的にはその抗原結合又は可変領域が
含まれる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダ
イアボディー(diabodies)；直鎖状抗体；１本鎖抗体分子；及び抗体断片から形
成される多重特異性抗体が含まれる。 ここで用いられる「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の
集団、即ち、集団を構成する個々の抗体が少量存在する起こりうる自然発生突然
変異体以外は同一であるような集団から得られる抗体を意味する。モノクローナ
ル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に向けられている。さらに、通常
は、異なる決定基（エピトープ）に対して作られた様々な抗体を含む従来の（ポ
リクローナル）抗体調製物とは違い、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決
定基に対して向けられている。「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均
一な抗体集団から得られるような抗体の特徴を示すものであって、ある特定の方
法による抗体の生産を必要とすることを意味するためのものではない。例えば、
本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256: 495
(1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法により作成してもよいし、
組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）により作成してもよい
。また「モノクローナル抗体」はファージ抗体ライブラリから、例えば、Clacks
on等, Nature, 352: 624-628 (1991)及び Marks等, J. Mol. Biol., 222: 581-5
97 (1991)に記載された技術を用いて単離してもよい。
【００２３】 ここで、モノクローナル抗体は特に、「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含
み、それは、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種から誘導された又は特定の抗
体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同であるが、
鎖の残りの部分は他の種から誘導された又は他の抗体クラス又はサブクラスに属
する抗体、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限りにおいてそれらの抗体
の断片の対応する配列と同一又は相同である（米国特許第4,816,567号；Morriso
n等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)）。 非ヒト（例えばマウス）抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンから誘
導される最小配列を含有する特定のキメラ抗体である。大部分において、ヒト化
抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であって、そのレシピエントの
超可変領域の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を持つ非ヒト霊長類又はマ
ウス、ラット又はウサギ等の非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域の残基に
より置換されている。ある場合は、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（
ＦＲ）残基が対応する非ヒト残基で置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピ
エント抗体にも、ドナー抗体にも見られない残基を含んでもよい。これらの修飾
は、抗体の性能をさらに精密にするために施される。一般にヒト化抗体は、超可
変領域の全て又は実質上全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域
の全て又は実質上全てがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１つ、
典型的には２つの可変ドメインの実質的に全部を含有するであろう。また、ヒト
化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの
ものの少なくとも一部も含有するであろう。さらなる詳細については、Jones等,
Nature 321: 522-525 (1986)；Reichmann等, Nature 332: 323-329 (1988)；及
びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2: 593-596 (1992)を参照のこと。
【００２４】 「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含
み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。一般に、Ｆｖポリペ
プチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓ
Ｆｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓＦｖの概説につい
ては、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113,
Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参
照のこと。 「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指
し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ−ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)
に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合している。非常に短いために同一鎖上で二つの
ドメインの対形成を不可能にするリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補
ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を形成する。ダイアボディ
は、例えば、EP404,097; WO93/11161；及びHollingerら, Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA 90:6444-6448 (1993)に更に詳細に記載されている。 この出願を通して用いられる場合の「直鎖状抗体」なる表現は、Zapata等, Pr
otein Eng. 8(10):1057-1062 (1995)に記載された抗体を指す。簡単に言えば、
これらの抗体は一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(
ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む。直鎖状抗体は二重特異性又は単一特異性とす
ることができる。
【００２５】 （発明の実施の方法） Ａ．抗体の調製 非ヒトＴＦ抗体のヒト化及び様々な抗ＴＦ抗体の作成の方法が以下の実施例に
記載される。抗ＴＦ抗体をヒト化するために、非ヒト抗体初期物質を調製する。
変異体を生成されることを意図する場合には、親抗体を調製する。このような非
ヒト化抗体初期物質及び親抗体を生成するための例示的な技術が後の章に記載さ
れる。 （ｉ）ポリクローナル抗体 ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポ
リクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを
、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤
及び／又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射す
る。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク
質、例えば血清アルブミン、又は大豆トリプシン阻害剤に抱合させるのが有用で
ある。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びＭ
ＰＬ-ＴＤＭが含まれる。
【００２６】 （ｉｉ）モノクローナル抗体 例えば、モノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最
初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国
特許第4,816,567号)によって作製することができる。 ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハ
ムスター又はマカクザルを上記のようにして免疫し、免疫化に用いられたタンパ
ク質に特異的に結合する抗体を産生するか又は産生することのできるリンパ球を
導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、
リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてミエローマ
細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibo
dies: Principles and Practice, 59-103頁[Academic Press, 1986])。 このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親のミエロ
ーマ細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培
地に蒔き、増殖させる。例えば、親のミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングア
ニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失する
ならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の
増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有
するであろう(ＨＡＴ培地)。 好ましいミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による
抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性
である細胞である。これらの中でも、好ましいミエローマ株化細胞は、マウスミ
エローマ株、例えば、米国カリフォルニア州サンディエゴのソーク・インスティ
テュート・セル・ディストリビューション・センターより入手し得るＭＯＰ-２
１及びＭ.Ｃ.-１１マウス腫瘍から由来するもの、及び米国メリーランド州ロッ
クビルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手し得るＳＰ-
２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞である。ヒトミエローマ及びマウス−ヒトヘテ
ロミエローマ株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されて
いる（Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibod
y Production Techniques and Applications,51-63頁、Marcel Dekker, Inc., N
ew York, [1987]）。
【００２７】 ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体
の産生について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモ
ノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合アッセイ、例え
ばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によっ
て測定する。 モノクローナル抗体の結合親和性は例えばMunson等, Anal. Biochem., 107:22
0 (1980)のスキャッチャード分析法によって決定することができる。 所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞
が特定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方
法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に好適な培地には
、例えば、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が含まれる。また、該ハイブリ
ドーマ細胞は、動物中で腹水症腫瘍としてインビボで増殖させることができる。 サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-
セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析
、又はアフィニティークロマトグラフィーのような常套的な抗体精製法により、
培地、腹水、又は血清から好適に分離される。 モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モロクロ
ーナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴ
ヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離され配列決定される。ハ
イブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離
されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外で
は抗体タンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハム
スター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又はミエローマ細胞のような宿主細胞中に形質移入し
、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体を合成することができる。抗体の組換
え発現は以下に更に詳細に説明する。
【００２８】 （ｉｉｉ）ヒト化抗体 下記の実施例２は抗ＴＦ抗体のヒト化の方法を説明する。 一般に、ヒト化抗体は非ヒトである供給源からそこに導入された一又は複数の
アミノ酸残基を有している。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「移入」残
基と称され、典型的には「移入」可変ドメインから得られる。ヒト化は本質的に
は齧歯類のＣＤＲｓ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することに
より、Winterと共同研究者 [Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann
等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (198
8)]の方法に従って実施できる。
【００２９】 （ｉｖ）抗体のアミノ酸配列変異体 また、実施例２は親抗体に関する増強した親和性を持つ抗ＴＦ抗体のアミノ酸
配列変異体を生成するための方法論を説明する。 抗ＴＦ抗体のアミノ酸配列変異体は、抗ＴＦ抗体ＤＮＡ中に適当なヌクレオチ
ド変化を導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような
変異体は、例えば、ここでの実施例に抗ＴＦ抗体のアミノ酸配列内の残基の欠失
及び／又は挿入及び／又は置換を含む。最終コンストラクトが所望の特徴を有す
るとするならば、欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、その最終コンス
トラクトに達するまでなされる。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数
又は位置の変化などの、ヒト化又は変異体抗ＴＦ抗体の翻訳後プロセスを変更し
うる。 突然変異誘発の好ましい位置である抗ＴＦ抗体の所定の残基又は領域の特定の
ために有用な方法は、Cunningham及びWells, Science 244: 1081-1085 (1989)に
記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。こ
こで、標的残基の残基又は基が同定され（例えば、arg, asp, his, lys,及びglu
等の荷電残基）、中性又は負荷電アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリア
ラニン）に置換され、アミノ酸とＴＦ抗原との相互作用に影響を及ぼす。ついで
置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において
又はそれに対して更なる又は他の変異体を導入することにより精密にされる。し
かして、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質
は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析す
るために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領
域で実施し、発現された抗ＴＦ抗体変異体を所望の活性についてスクリーニング
する。 アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さ
の範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミ
ノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例には、Ｎ末端メチオニル残基を
持つ抗ＴＦ抗体又はエピトープタグに融合した抗体が含まれる。抗ＴＦ抗体の他
の挿入変異体は、抗体の血清半減期を向上させる酵素又はポリペプチドの、抗Ｔ
Ｆ抗体のＮ又はＣ末端への融合物を含む（以下参照）。 他の型の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、抗ＴＦ抗体
分子において少なくとも一つのアミノ酸残基が異なる残基で置換されている。置
換突然変異に対して最も興味深い部位は超可変領域を含むが、ＦＲ変化も考えら
れる。保存的置換は、「好ましい置換」と題して表１に示す。このような置換が
生物学的活性の変化をもたらす場合、表１に「例示的置換」と名前を付け、又は
アミノ酸の分類に関して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し
、生成物をスクリーニングしてもよい。
【００３０】
【表１】
【００３１】 抗体の生物学的性質における実質的な修飾は、（ａ）置換領域のポリペプチド
骨格の構造、例えばシート又は螺旋配置、（ｂ）標的部位の分子の電荷又は疎水
性、又は（ｃ）側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を
選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて
群に分けることができる： （１）疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile; （２）中性の親水性：cys, ser, thr; （３）酸性：asp, glu; （４）塩基性：asn, gln, his, lys, arg; （５）鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び （６）芳香族：trp, tyr, phe。 非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを
必要とするであろう。 ヒト化又は変異体抗ＴＦ抗体の適切な配置の維持に関与しない任意のシステイ
ン残基は、一般にセリンで置換し、分子の酸化的安定性を向上させて異常な架橋
を防止する。逆に、抗体にシステイン結合を付加して、その安定性を向上させて
もよい（特に、抗体が抗体断片、例えばＦｖ断片であるもの）。 特に好ましい型の置換変異体は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の一
又は複数の超可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる発展のために選択
され、得られた変異体は、それらが作製された親抗体と比較して向上した生物学
的特性を有している。そのような置換変異体を作製する簡便な方法は、ファージ
ディスプレイを使用する親和性突然変異を含む。簡潔に言えば、幾つかの超可変
領域部位（例えば６−７部位）を突然変異させて各部位における全ての可能なア
ミノ酸置換を生成させる。こうして生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒
子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への一価の融合物にデ
ィスプレイされる。ファージディスプレイ変異体は、ついで、ここに開示される
ようなそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングさ
れる。修飾のための候補となる超可変領域部位を同定するために、アラニンスキ
ャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を
同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結
晶構造を分析して抗体とヒトＴＦ間の接点を特定するのが有利である場合もある
。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補であ
る。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するような
スクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗
体を更なる開発のために選択する。
【００３２】 抗体のアミノ酸変異の他の型は、抗体の元のグリコシル化パターンを変更する
。変更とは、抗体に見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又は抗体
に存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。 抗体のグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結
合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラ
ギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン（ここでＸはプロリンを除く任
意のアミノ酸）のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的
結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド
配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グ
リコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、
糖類Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの一つが結合
することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた
用いられる。 抗体へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上
述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させ
ることによって簡便に達成される。該変化は、元の抗体の配列への一又は複数の
セリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-
結合グリコシル化部位の場合)。 抗ＴＦ抗体のアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られ
た種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、
天然源からの単離（天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合）又は初期に調製さ
れた変異体又は抗ＴＦ抗体の非変異体のオリゴヌクレオチド媒介（又は部位特異
的）突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製
を含む。
【００３３】 （ｖ）ヒト抗体 ヒト抗体は、ファージ表示ライブラリ［Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol
., 227:381(1991)；Marksら, J. Mol. Biol., 222:581 (1991)］を含むこの分野
で知られた種々の方法を用いて作成することもできる。また、Coleら及びBoerne
rらの方法も、ヒトモノクローナル抗体の調製に利用することができる(Coleら,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)及びBo
ernerら, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)]。同様に、ヒト抗体はヒト免疫グ
ロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子は
部分的又は完全に不活性化されたマウスに導入することにより産生することがで
きる。投与の際に、遺伝子再配列、組立、及び抗体レパートリーを含むあらゆる
観点においてヒトに見られるものに非常に類似しているヒト抗体の生産が観察さ
れる。このアプローチは、例えば米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同
第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；同第5,661,016号、及び次
の科学文献：Marksら, Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonbergら, Natur
e 368 856-859 (1994); Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwildら, N
ature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 1
4, 826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995)
に記載されている。
【００３４】 （ｖｉ）抗体断片 ある実施態様では、ヒト化又は変異体抗ＴＦ抗体は抗体断片である。抗体断片
を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、
無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimoto等,
Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)；及びB
rennan等, Science, 229:81(1985)を参照のこと)。しかし、これらの断片は現在
は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片
は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形
成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施
態様では、Ｆ(ａｂ')２は、ロイシンジッパーＧＣＮ４を用いて形成され、Ｆ(ａ
ｂ')２分子の組み立てを増進させる。他のアプローチ法では、Ｆｖ、Ｆａｂ又は
Ｆ(ａｂ)２断片は、組み換え宿主細胞培地から直接単離することができる。抗体
断片作成の他の技術は、熟練者にとって明らかであろう。
【００３５】 （ｖｉｉ）多重特異性抗体 ある実施態様では、少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を
有する多重特異性（例えば、二重特異性）ヒト化又は変異体抗ＴＦ抗体を作成す
ることが所望されうる。例えば、二重特異性抗体はＴＦタンパク質の２つの異な
るエピトープに結合しうる。あるいは、抗ＴＦアームは、ＴＦ発現細胞に細胞防
御メカニズムを集中させるように、ＦｃγＲＩ(ＣＤ６４)、ＦｃγＲＩＩ(ＣＤ
３２)及びＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)等のＩｇＧ(ＦｃγＲ)に対するＦｃレセプ
ター、又はＴ細胞レセプター分子(例えばＣＤ２又はＣＤ３)等の白血球上のトリ
ガー分子に結合するアームと結合しうる。また、二重特異性抗体はＴＦを発現す
る細胞に細胞障害剤を局在化するためにも使用されうる。これらの抗体はＴＦ結
合アーム及び細胞障害剤(例えば、サポリン(saporin)、抗インターフェロン-α
、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトトレキセート又は放射性同位体ハプテ
ン)と結合するアームを有する。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えば
Ｆ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。 二重特異性抗体を作成するための他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子
間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセント
を最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの
少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の
小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置
き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、
大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換える
ことにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのよう
な不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが
提供される。1996年9月6日に公開のWO96/27011参照。 二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合
体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していても良い。ヘ
テロ抱合抗体は適当な架橋方法によって生成できる。当技術分野においては、適
切な架橋剤は周知であり、それらは複数の架橋法と共に米国特許第4,676,980号
に記されている。
【００３６】 抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例
えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら,
Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')
２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤
亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジス
ルヒド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアー
ト(ＴＮＢ)誘導体に転換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプ
トエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再転換し、他のＦａｂ'-ＴＮ
Ｂ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性
抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。また更なる実
施態様では、大腸菌から直接回収されるＦａｂ'-ＳＨ断片は、インビトロで化学
的に結合させて二重特性抗体を形成することができる、例えばShalaby等, J. Ex
p.Med. 175:217-225(1992)。 組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な方法
もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して
生産された。Kostelnyら, J.Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及び
Ｊｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異
なった抗体のＦａｂ'部分に結合させられた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で
還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成す
る。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Ho
llingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された
「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供し
た。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短い
リンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してな
る。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨ ドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆ
ｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告され
ている。Gruberら, J.Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと。あるいは、二
重特異性抗体はZapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)に記載されるよ
うにして作成される「直線状抗体」であってもよい。 二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することがで
きる。Tuttら J.Immunol. 147:60(1991)。
【００３７】 （ｖｉｉｉ）他の修飾 ヒト化または変異体抗ＴＦ抗体の他の修飾が考えられる。本発明の抗体をエフ
ェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させる
のが望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この
領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生
成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び／又は増加した補体媒介
細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を有しうる。Caron等, J.
Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-292
2 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Can
cer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用
いても調製しうる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して
、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson
等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。 本発明はまた、化学治療薬、毒素（例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の
酵素活性毒素、又はその断片）などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体（即ち
、放射性抱合）に複合された抗体を含む免疫複合体にも関する。 このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることので
きる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活
性断片、（緑膿菌からの）外毒素Ａ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシン
(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fo
rdii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカー
ナ(Phytolaca americana)タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ-Ｓ）
、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(
curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria ofici
nalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリ
クトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomyci
n)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性
抱合抗体の生成に利用可能である。例として、２１２Ｂｉ、１３１Ｉ、１３１Ｉ
ｎ、９０Ｙ及び１８６Ｒｅを含む。
【００３８】 抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、
例えば、Ｎ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオネート（Ｓ
ＰＤＰ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（ジメチ
ルアジピミデートＨＣＬ等）、活性エステル（ジスクシンイミジルスベラート等
）、アルデヒド（グルタルアルデヒド等）、ビス-アジド化合物（ビス(ｐ-アジ
ドベンゾイル)ヘキサンジアミン等）、ビス-ジアゾニウム誘導体（ビス-(ｐ-ジ
アゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等）、ジイソシアネート（トリエン２
，６-ジイソシアネート等）、及びビス-活性フッ素化合物（１，５-ジフルオロ-
２，４-ジニトロベンゼン等）を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は
、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することがで
きる。カーボン-１４-標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン
トリアミン五酢酸（ＭＸ-ＤＴＰＡ）は、放射性ヌクレオチドの抗体への抱合の
ためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。 他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター
」（ストレプトアビジン等）に抱合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患
者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細
胞毒性薬（例えば、放射性ヌクレオチド等）に抱合された「リガンド」（アビジ
ン等）を投与する。 また、ここに開示する抗ＴＦ抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。
抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3688
(1985); Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特
許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方
法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556
号に開示されている。 特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ
-誘導ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ-ＰＥ）を含む脂質組成物での逆
相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズの孔のフィルターを通
して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦ
ａｂ'断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されてい
るように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに抱合され得る。化学治療
薬（ドキソルビシン等）は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizo
n等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
【００３９】 本発明の抗体は、ＡＤＥＰＴにおいてプロドラッグ（例えば、ペプチジル化学
療法剤WO81/01145参照）を活性抗ガン剤に改変するプロドラッグ活性酵素に抗体
を抱合させることにより使用されうる。例えば、WO88/07378及び米国特許出願第
4,975,278号参照。 ＡＤＥＰＴに利用できる免疫複合体の酵素成分は、そのより活性な細胞毒形態
にそれを改変させるように、このような方法においてプロドラッグで活性能力の
ある任意の酵素を含む。 限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスフェート含
有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；
スルフェート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスル
ファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化す
るのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアー
ゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例
えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化
するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含むプロドラッグの転化に有用なＤ-
アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロ
ドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシ
ダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用な
βラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチ
ル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬
剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧ
アミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた知られている酵
素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるた
めに使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照
のこと)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして
、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するように調製することができる。 この発明の酵素は、上で検討したヘテロ二官能性架橋剤の使用のような当該分
野でよく知られている技術によって抗ＴＦ抗体に共有的に結合させることができ
る。あるいは、当該分野でよく知られた組換えＤＮＡ技術を用いて（例えば、Ne
uberger等, Nature, 312: 604-608 [1984]）、本発明の酵素の少なくとも機能的
に活性な部分に本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域が結合されてなる融合タ
ンパク質を構築することができる。
【００４０】 本発明のある実施態様においては、例えば腫瘍浸透性を増大させるために無傷
の抗体よりも抗体フラグメントを使用することが望ましい。この場合、その血清
半減期を増大させるために抗体フラグメントを改変することが望ましい。これは
、例えば、抗体フラグメントにサルベージレセプター結合エピトープを導入する
ことにより(例えば、抗体フラグメント中の適当な領域の突然変異により、ある
いはついで抗体フラグメントの何れかの末端又は中央に、例えばＤＮＡ又はペプ
チド合成により融合されるペプチドタグ内にエピトープを導入することにより)
、達成できる。1996年10月17日公開のWO96/32478参照。 エピトープに結合するサルベージレセプターは、Ｆｃドメインの一又は二のル
ープ由来の一又は複数の任意のアミノ酸残基が抗体断片の類似位置に移動する領
域を好ましく構成する。さらにより好ましくは、Ｆｃドメインの一又は二のルー
プ由来の３以上の残基が移動する。またより好ましくは、エピトープはＦｃ領域
の（例えば、ＩｇＧの）ＣＨ２ドメインから得られ、抗体のＣＨ１、ＣＨ３、又
はＶＨ領域、又はそのような領域の一より多くに転移する。あるいは、エピトー
プは、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインから得られ、抗体断片のＣＬ領域真野はＶＬ領
域、又はその両方に移動する。 最も好ましい位置実施態様では、サルベージレセプター結合エピトープは、配
列：ＰＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号：１４）を含み、場合によっては更にＨ
ＱＳＬＧＴＱ（配列番号：１５）、ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号：１６）、ＨＱ
ＮＩＳＤＧＫ（配列番号：１７）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号：１８）か
らなる群から選択される配列を含み、好ましくは、ここで抗体断片はＦａｂ又は
Ｆ(ａｂ')２である。他の最も好ましい実施態様では、サルベージレセプター結
合エピトープは、配列：ＨＱＮＬＳＤＧＫ（配列番号：１６）、ＨＱＮＩＳＤＧ
Ｋ（配列番号：１７）、又はＶＩＳＳＨＬＧＱ（配列番号：１８）及び配列：Ｐ
ＫＮＳＳＭＩＳＮＴＰ（配列番号：１４）を含むポリペプチドである。 また、ヒト化又は変異体抗ＴＦ抗体の共有結合修飾は、本発明の範囲に含まれ
る。それらは、適切であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又は化学的切
断により作成されうる。他の型の抗体の共有結合修飾は、選択された側鎖又はＮ
又はＣ末端残基と反応可能な有機誘導化剤を抗体の標的アミノ酸残基に反応させ
ることにより分子内に導入される。ポリペプチドの例示的な共有結合修飾は、米
国特許出願第5,534,615号に記載され、特に開示によりここに取り込む。抗体の
共有結合的修飾の好ましい型は、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエ
チレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一
つへの、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417
号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での抗体の結合を含む。
【００４１】 Ｂ．ベクター、宿主細胞及び組換え方法 また、本発明は、ヒト化または変異体抗ＴＦ抗体をコードする単離された核酸
、該核酸を含んでなるベクター及び宿主細胞、及び抗体の作成のための組み換え
技術を提供する。 抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、さらなるクロ
ーニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される
。他の実施態様では、抗体は相同的組み換え技術により作成することができ、例
えば米国特許出願第5,204,244号に記載され、特に開示によりここに取り込む。
モノクローナル抗体をコードするＤＮＡが容易に単離され、通常の手法を用いて
(例えば、抗体の軽鎖及び重鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴ
ヌクレオチドを使用することによって)配列決定される。多くのベクターが入手
可能である。ベクターの構成要素としては、一般に、これらに制限されるもので
はないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又
は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終
結配列であり、例えば、1996年7月9日公開の米国特許出願第5,534,615号に記載
され、開示によりここに取り込む。 ここでのベクター中のＤＮＡのクローニングあるいは発現に適切な宿主細胞は
、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切
な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシ
ェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(E
rwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セ
ラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例え
ば枯草菌及びバシリ・リチェフォルミス(B.licheniformis)(例えば、1989年4月1
2日に公開された DD266,710に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、
シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。一つの好適
な大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ATCC31,446)であるが、他の大腸菌Ｂ
、大腸菌Ｘ１７７６(ATCC31,537)及び大腸菌Ｗ３１１０(ATCC27,325)のような株
も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。 原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、抗ＴＦ抗体をコ
ードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミ
セス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで
最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的
に入手可能でここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベ
ロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ATCC12,424)、Ｋ.ブル
ガリカス(ATCC16,045)、Ｋ．ウィッケラミイ(ATCC24,178)、Ｋ.ワルチイ(ATCC56
,500)、Ｋ．ドロソフィラルム(ATCC36,906)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．
マルキシアナス；ヤローウィア(EP402,226)；ピチアパストリス(EP183,070)；カ
ンジダ；トリコデルマ・リーシア(EP244,234)；アカパンカビ；シュワニオマイ
セス、例えばシュワニオマイセスオクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパン
カビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属宿主、例えば偽巣性
コウジ菌及びクロカビが使用できる。
【００４２】 グリコシル化抗ＴＦ抗体の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導され
る。無脊椎動物細胞の例としては植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロ
ウィルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテ
ラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピク
トゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビ
クス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウィルス株
、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス
・モリ ＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、そのようなウィルスは本発明におい
てここに記載したウィルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ細
胞の形質転換に使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、ト
マト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することができる。 しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中
での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になっている。有用な哺乳動物宿主株化
細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, A
TCC CRL1651);ヒト胚腎臓株（２９３又は懸濁培養での増殖のためにサブクロー
ン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 [1977]）；ハムスタ
ー乳児腎細胞(ＢＨＫ, ATCC CCL10)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨ
ＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 [1980]);マウ
スのセルトリ細胞（ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 [1980]）;サ
ルの腎細胞 (ＣＶ１ ATCC CCL70); アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６
, ATCC CRL-1587); ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ATCC CCL2); イヌ腎細胞 (Ｍ
ＤＣＫ, ATCC CCL34); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ATCC CRL1442)
; ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ATCC CCL75); ヒト肝細胞 (Ｈｅｐ Ｇ２, ＨＢ８０６
５); マウス乳房腫瘍細胞 (ＭＭＴ０６０５６２, ATCC CCL51);ＴＲＩ細胞（Mat
her等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 [1982]）;ＭＲＣ５細胞;ＦＳ４細
胞である。 宿主細胞は、抗ＴＦ抗体生産のために上述の発現又はクローニングベクターで
形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列を
コードしている遺伝子を増幅するために適切に修飾された常套的栄養培地で培養
される。
【００４３】 本発明の抗ＴＦ抗体を生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地におい
て培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)
、最小必須培地((ＭＥＭ)(シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコ
の改良イーグル培地(ＤＭＥＭ)(シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、
Hamら, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnesら, Anal. Biochem. 102:255 (1980),
米国特許第4,767,704号；同4,657,866号；同4,927,762号；4,560,655号；又は
同5,122,469号；国際公開WO 90/03430；国際公開WO 87/00195；又は米国特許再
発行第30,985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用でき
る。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインス
リン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、
カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌ
クレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシ
ン(商品名）薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化
合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて
補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている
適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のた
めに選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には
明らかであろう。 組換え技術を使用する場合、抗体は細胞内、細胞膜周辺腔内に生成されるか、
又は培地に直接分泌され得る。抗体が細胞内に生成される場合、第１段階として
、粒状屑、宿主細胞又は溶菌断片を、例えば遠心分離又は超遠心分離にかけて取
り除く。培地又は溶菌物を遠心分離にかけ、粒状屑、例えば宿主細胞又は溶菌断
片を取り除く。Carterら, Bio/Technology 10:163-167(1992)は、大腸菌の細胞
膜周辺腔に分泌されるタンパク質を単離するための手順について記載している。
簡単に述べると、細胞ペーストを酢酸ナトリウム(ｐＨ３．５)、ＥＤＴＡ、及び
フェニルメチルスルホニルフロリド（ＰＭＳＦ）の存在下で、３０分以上かけて
解凍する。細胞屑は遠心分離により除去することができる。抗体が培地へ分泌さ
れている場合、そのような発現系からの上清は、一般的には第１に市販のタンパ
ク質濃縮フィルター、例えばAmicon又はMillipore Pelliconの限外濾過ユニット
を用いて濃縮する。ＰＭＳＦなどのプロテアーゼ阻害剤を上記の任意の工程に含
めてタンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含めて外来性の汚染物の成長
を防止してもよい。
【００４４】 細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシアパタイトクロマトグラ
フィー、ゲル電気泳動、透析、及びアフィニティクロマトグラフィを用いて精製
でき、アフィニティクロマトグラフィが好ましい精製技術である。アフィニティ
リガンドとしてのプロテインＡの適合性は抗体に存在する免疫グロブリンＦｃ領
域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ
４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる（Lindmarkら, J. immunol. Me
th. 62: 1-13 (1983)）。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒト
γ３に推奨されている（Gussら, EMBO J. 5: 1657 1575 (1986)）。アフィニテ
ィリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の
材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機
械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い
処理時間を可能にする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX(商品
名)樹脂（J.T. Baker, Phillipsburg, NJ）が精製に有用である。イオン交換膜
での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上のクロマトグラフィー、ア
ニオン又はカチオン交換樹脂（ポリアスパラギン酸カラム）上でのヘパリンSEPH
AROSE(商品名)クロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ
、及び硫酸アンモニウム沈殿などの他の技術も、回収される抗体に応じて利用可
能である。 任意の予備精製工程に続いて、対象とする抗体と汚染物とを含む混合物に、約
２．５−４．５のｐＨでの溶離バッファーを用いて、低ｐＨ疎水性相互作用クロ
マトグラフィーを施してもよく、好ましくは低い塩濃度（例えば、約0-0.25M塩
）で実施される。
【００４５】 Ｃ． 医薬製剤 本発明で使用される抗体の治療用製剤は、凍結乾燥された製剤又は水性溶液の
形態で、任意的な製薬上許容可能なキャリア、賦形剤又は安定剤と、所望の精製
度を有する抗体とを混合することにより(Remington's Pharmaceutical Sciences
, 16th edition, A. Osol, Ed., (1980))、調製され保管される。許容できる担
体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒
性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメ
チオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム
クロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウ
ム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えば
メチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノー
ル；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリ
ペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリ
ビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ア
ルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデ
キストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、ス
クロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム
等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)；及び／又はＴ
ＷＥＥＮ(商品名）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ(商品名）又はポリエチレングリコール
(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。 ここで、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好まし
くは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る（以下のＦ
の章を参照）。このような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組合せ
て存在する。
【００４６】 また活性成分は、例えばコアセルベーション技術又は界面重合により調製され
たマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロ
カプセル及びポリペプチド-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル、コロイド
状ドラッグデリバリー系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マ
イクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル）又はマクロエマルションに
捕捉させてもよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences
16版, Osol, A. 編, (1980)に開示されている。 インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。このことは、滅菌
濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。 徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、抗体を含む疎
水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えば
フィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリ
エステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)又
はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号)）、Ｌ
-グルタミン酸とエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸
ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬｕｐｒｏｎ Ｄｅｐｏｔ
(商品名)（乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可
能なミクロスフィア）、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以
上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより
短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水
分に暴露された結果として変性し又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変
化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化の
ために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換によ
る分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒド
リル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添
加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達
成されうる。
【００４７】 Ｄ．抗体の非治療的用途 本発明の抗体はアフィニティ精製剤として使用することができる。このプロセ
スでは、抗体は、当該分野で良く知られた方法を用いてセファデックス樹脂又は
濾紙などの固相上に固定化される。固定化された抗体を精製すべきＴＦタンパク
質（又はその断片）を含有する試料と接触させ、その後支持体を適当な溶媒で洗
浄し、その溶媒が、固定化抗体に結合したＴＦタンパク質を除く試料中の実質的
に全ての物質を除去する。最後に、支持体をグリシンバッファー、ｐＨ５．０等
の他の適当な溶媒で洗浄して、抗原をＴＦ抗体から放出させる。 また抗ＴＦ抗体は、ＴＦタンパク質のための、例えば、対象とする抗原の特定
の細胞、組織、又は血清中での発現を検出するための診断アッセイにおいても有
用である。このような診断方法は、ＴＦの異常な発現、例えば過剰な又は低い発
現に関連した様々な疾患の診断にに利用されうる。例えば、ＴＦの過剰発現及び
／又は異常な利用は、血栓症及び敗血症の両方の病態生理関連しており、ＴＦは
腫瘍転移に関与している。従って、抗ＴＦ抗体はこれらの疾患の診断に利用され
うる。 診断的応用においては、抗体は典型的には検出可能な部分で標識される。一般
的に以下の範疇にグループ分けされる多数の標識が利用可能である： （ａ）放射性同位体、例えば、３５Ｓ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ及び１３１Ｉ
等。抗体は、例えばCurrent Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coli
gen等編, Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)に記載され
た技術を用いて放射性同位体で標識され、放射性はシンチレーションカウンティ
ングにより測定できる。 （ｂ）蛍光標識、例えば希土類キレート（ユーロピウムキレート）又はフルオ
レセインとその誘導体、ローダミンとその誘導体、ダンシル、リサミン(Lissami
ne)、フィコエリトリン及びテキサスレッド等が使用できる。蛍光標識は、例え
ば上掲のCurrent Protocols in Immunologyに開示された技術を用いて抗体に結
合させることができる。蛍光は蛍光定量計によって定量できる。 （ｃ）種々の酵素−基質標識が利用でき、米国特許第4,275,149号は、それら
の幾つかの概説を提供している。酵素は一般に種々の技術を用いて測定可能な色
素原基質の化学変換を触媒する。例えば、酵素は基質における色変化を触媒し、
それは分光学的に測定可能である。あるいは、酵素は基質の蛍光又は化学発光を
変化させうる。蛍光変化を定量化する技術は上述している。化学発光基質は化学
反応によって電子的に励起され、ついで（例えば化学発光計を用いて）測定可能
な光を放出するか、又は蛍光受容体にエネルギーを供与する。酵素標識の例には
、ルシフェラーゼ（例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米
国特許第4,737,456号）、ルシフェリン、２,３-ジヒドロフタラジンジオン、リ
ンゴ酸塩デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（Ｈ
ＲＰＯ）等のペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダー
ゼ、グルコアミラーゼ、リソザイム、糖類オキシダーゼ（例えば、グルコースオ
キシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ、及びグルコース-６-ホスフェートデヒ
ドロゲナーゼ）、ヘテロ環オキシダーゼ（ウリカーゼ及びキサンチンオキシダー
ゼ等）、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ等が含まれる。酵素
を抗体に結合させる技術は、O'Sullivan等, Methods for Preparation of Enzym
e-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym
. (J. Langone & H. Van Vunakis編）Academic press, New York, 73: 147-166
(1981)に記載されている。
【００４８】 酵素−基質の組み合わせの例は、例えば以下を含む： (i)セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰＯ）と基質としての過酸化水素
で、過酸化水素が染料前駆物質（例えば、オルトフェニレンジアミン（ＯＰＤ）
又は３,３',５,５'-テトラメチルベンジジンヒドロクロリド（ＴＭＢ））を酸化
する； (ii)アルカリホスファターゼ（ＡＰ）と色素原基質としてのパラ-ニトロフェ
ニルホスフェート； (iii)β-Ｄ-ガラクトシダーゼ（β-Ｄ-Ｇａｌ）と色素原基質（例えば、ｐ-ニ
トロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ）又は蛍光原基質４-メチルウンベリフェ
リル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ。 当業者には、数多くの他の酵素−基質の組み合わせが利用可能である。これら
の一般的な概説は、米国特許第4,275,149号及び第4,318,980号を参照のこと。 標識は抗体に間接的に結合される場合もある。当業者であれば、これを達成す
るための種々の技術を知っているであろう。例えば、抗体にビオチンを結合させ
、上述した３つの広い範疇の標識の任意のものにアビジンを結合するか、又はそ
の逆が可能である。ビオチンはアビジンに選択的に結合し、よってこの間接的な
方式で抗体に標識を結合させることができる。あるいは、抗体との標識の間接的
な結合を達成するために、抗体に小さなハプテン（例えばジゴキシン）を結合さ
せ、上述の異なるタイプの標識を抗ハプテン抗体（例えば抗ジゴキシン抗体）に
結合させる。よって、抗体との標識の間接的な結合を達成できる。
【００４９】 本発明の他の実施態様では、抗ＴＦ抗体を標識する必要はなく、その存在がＴ
Ｆ抗体に結合する標識抗体を用いて検出できる。 本発明の抗体は任意の公知のアッセイ法、例えば競合結合アッセイ、直接及び
間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で用いられうる。Zola, Mo
noclonal Antibodies: A Manual of Techniques, pp. 147-158 (CRC Press, Inc
. 1987)。 競合結合アッセイは、限定した量の抗体との結合における、試験用サンプルに
対して競合する標識された標準体の能力による。試験用サンプル中のＴＦタンパ
ク質の量は、抗体が結合する標準体の量に対して逆比例する。結合する標準体の
量の測定を容易にするため、好ましくは抗体は競合の前後に不溶化され、抗体に
結合する分析物及び標準体は、便宜上、結合しないで残存する標準体及び分析物
から分離する。 サンドイッチアッセイでは、検出される互いに異なる免疫原部分、又はエピト
ープ、又はタンパク質に結合可能な２つの抗体が使用される。サンドイッチアッ
セイにおいて、分析されるテスト用サンプルは、固体支持体に固定化された第１
の抗体に結合し、その後、第２の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の３部位
複合体が形成される。例えば、米国特許第4,376,110号を参照されたい。第２の
抗体は検出可能な部分で、それ自身が標識されてもよく（直接サンドイッチアッ
セイ）、又は検出可能な部分で標識された抗免疫グロブリン抗体を使用して測定
してもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、一方の種類のサンドイッチア
ッセイはＥＬＩＳＡアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。 免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものであるか凍結されていても
よく、パラフィンに埋設されていてもよく、防腐剤、例えばホルマリンで固定さ
れていてもよい。 また抗体はインビボ診断アッセイでも使用できる。一般に、抗体は放射性核種
（１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ、１４Ｃ、１３１Ｉ、１２５Ｉ、３Ｈ、３２Ｐ又は３５ Ｓ等）で標識され、抗原又はそれを発現する細胞が免疫シンチオグラフィーによ
って局在化され得る。
【００５０】 Ｅ．診断キット 簡便さの点から、本発明の抗体はキット、すなわち、診断アッセイを実施する
ための使用説明書と上述した量の試薬の包装した組み合わせとして提供すること
ができる。検出可能な標識が酵素である場合は、キットは基質及び酵素によって
必要とされる補助因子(例えば、検出可能なクロモフォア又はフルオロフォアを
提供する基質前駆体)を含むであろう。さらに、他の添加物、例えば安定剤、緩
衝液(例えばアッセイ及び／又は洗浄溶解緩衝液)等々が含まれうる。様々な試薬
の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液中の濃度をもたら
すために広く変化させられうる。特に、試薬は、適切な濃度を有する試薬溶液を
解凍時に提供する賦形剤を含む、通常は凍結乾燥された乾燥粉末として提供され
うる。
【００５１】 Ｆ．抗体の治療的な使用 治療的用途のために、本発明の抗ＴＦ抗体は、上述したもののような製薬的に
許容可能な投与形態で哺乳動物、好ましくはヒトに投与され、筋肉内、腹腔内、
脳脊髄内、皮下、関節内、滑膜内、包膜内、経口、局所又は吸入経路により、ボ
ーラスとして、又は期間にわたる連続注入によりヒトに静脈内注入するものを含
む。また抗体は、腫瘍内、腫瘍周辺、病巣内、又は病巣周辺経路で好適に投与さ
れ、局所的並びに全身に治療効果を発揮する。腹腔内経路は、例えば卵巣腫瘍の
治療に特に有用であることが予期されている。 疾患の予防又は治療のために、抗体の適切な投与量は、上述のように治療され
るべき疾患の型、重度及び疾患の原因、抗体が予防又は治療の目的で投与される
かどうか、前治療、患者の病歴及び抗体に対する応答性、及び主治医の判断に依
存する。抗体は、治療の期間にわたって、又は一回、患者に適切に投与される。 抗ＴＦ抗体は、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の疾患又は障害、例えばＴＦ-ＦＶ
ＩＩａ関連疾患又は障害の治療に利用される。このような疾患または障害は、深
部脈管血栓症、動脈血栓症、発作、腫瘍転移、血栓溶解、動脈硬化症及び血管形
成術後の再狭窄のような脈管病、炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人
呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ）、汎発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）ような急性およ
び慢性の徴候を含むフィブリン形成に関連する慢性血塞性疾患または障害を意味
する。ＴＦ-ＦＶＩＩａ関連障害は、前記のようなインビボ凝固障害に限定され
るものではなく、透析操作、血液濾過または外科手術の間の血液バイパス等のプ
ロセスで患者からインラインで取り出された血液を含む血液の体外循環に起因す
る血液凝固といったエキソビボのＴＦ-ＦＶＩＩａ関連プロセスも含む。
【００５２】 疾患のタイプと重篤さに応じて、約1μg/kgから約50mg/kg（例えば、0.1-20mg
/kg）の抗体が、例えば一又は複数の別々の投与であろうと、あるいは連続注入
によるものであろうと、患者への初期候補投与量である。典型的な１日の用量は
、上記の要因に依存し、約1μg/kgから約20mg/kg又はそれ以上の範囲である。数
日間又はそれ以上にわたる繰り返し投与の場合は、状態に応じて、疾患徴候の望
ましい抑制が起こるまで治療を続ける。しかし、他の用量計画も有用でありうる
。この療法の進行は、例えば、Ｘ線腫瘍画像診断を含む常套的な技術及びアッセ
イで容易に監視される。 本発明の他の実施態様によれば、疾患の予防又は治療における抗体の効果は、
これらの目的に効果的である他の薬剤、例えばヘパリン、低分子量ヘパリン及び
又は血小板糖タンパク質ＩＩｂＩＩＩａの阻害剤、及び又はクマリン及び又は他
の抗凝固又は抗血小板薬の商業的に入手可能な形態、又は一又は複数の従来から
ある化学療法剤、例えば、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝
拮抗剤、抗生物質、ピリミジン類似物、５-フルオロウラシル、シスプラチン、
プリンヌクレオシド、アミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコ
ルチコステロイド類と連続して又は組み合わせて抗体を投与することにより向上
しうる。このような他の薬剤は、投与される組成物中に存在し、又は別々に投与
されうる。また、抗体は、放射活性物質の照射に伴うか投与に伴うかにかかわら
ず、放射線療法と連続して、又は組み合わせて適切に投与される。
【００５３】 Ｇ．製造品 本発明の他の実施態様では、上記の疾患の診断又は治療に有用な物質を含む製
造品が提供される。この製造品は容器と使用説明書とを含んでなる。好適な容器
は、例えば、ビン、バイアル、シリンジ、及び試験管を含む。容器は、ガラス又
はプラスチックなどの種々の材料から形成されてよい。容器は、状態を診断し治
療するのに有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、
容器は皮下注射針で貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグ又はバイア
ルであってよい)。組成物中の活性剤は、抗ＴＦ抗体である。容器上又は添付さ
れる使用説明書又はラベルは、組成物が選択した状態の診断又は治療のために使
用されることを示す。製造品はさらに、リン酸緩衝塩水、リンガー液及びデキス
トロース溶液などの製薬的に許容されるバッファーを含む第２の容器を具備して
もよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使
用上の指示を付けたパッケージ挿入物を含む商業的及び使用者の見地から望まし
い他の材料を含んでもよい。 限定のためではなく、例示のために以下の実施例を提示する。本明細書に開示
する引用文献は全て参考のために開示を明示的に引用するものである。
【００５４】 （実施例） 実施例１ この実施例は、５の中和抗ＴＦ抗体の結合エピトープの決定を示し、異なる系
での抗凝固能における結合親和性及びエピトープ位置の各役割を明らかにする。
興味深いことに、結果は、抗凝固能が抗体結合親和性と関係ないことを示す。む
しろ、効果は主にＴＦ分子上の抗体結合部位の的確な位置により決定する。
【００５５】 材料 無脂肪酸ＢＳＡはカルビオケム社(Calbiochem)（La Jolla, CA）から入手した
。ヒト組み換えＦＶＩＩａはMark O'Connel（ジェネンテック社(Genentech, Inc
.)）から寄贈された。ＦＸはHaematologic Technologies Inc.（Essex Junction
, VT）から入手した。トロンビン阻害物質ナプサガトラン(napsagatran)は、Dr.
Kurt Hilpert（ロシュ社, スイス）から寄贈された。クロモザイム(Chromozym)
ｔ-ＰＡはBoehringer Mannheim（Indianapolis, IN）から入手した。残基１−２
４３を含む切断型膜貫通組織因子（ＴＦ１−２４３）は、記載されるようにして
（４７、４８）生成し、再脂肪化した。ＦＸ色素生産性基質Ｓ２７６５はDiapha
rma Group社（Columbus, OH）から入手した。
【００５６】 マウスＤ３Ｆａｂ断片の調製 Ｆａｂ断片を、システインの存在下でパパインを用いて消化することによりＤ
３抗体から調製した。Ｄ３Ｍａｂの濃縮溶液を、0.1Mの酢酸ナトリウムｐＨ５．
５、1mMのＥＤＴＡに対する透析により消化に備えた。この溶液（11.6mg/mLの抗
体）に個体システインを最終濃度50mMまで加えた。十分なパパイン（Worthingto
n biochemical Corp., Lakewood, NJ）を抗体との重量比が１：１００になるま
で加え、溶液を３７℃でインキュベートした。８時間後に消化を100mMのヨード
アセトアミドの添加により停止させてパパインを非活性化した。残った無傷の抗
体及びＦｃ断片を、タンパク質Ａセファロースカラムに溶液を通すことにより取
り除いた。流し通した分画中のＦａｂ断片を、固定された可溶性ＴＦ１−２１９ （ｓＴＦ）のカラムでのアフィニティークロマトグラフィーにより更に精製した
。親和性カラムを、製造業者が提供する使用説明に従って1x5mLのＨＮＳ活性化
ＨｉＴｒａｐカラム（Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ）を用いて準備した
。得られた最終結合濃度は、mLの樹脂につき25mgのｓＴＦであった。Ｄ３Ｆａｂ
を0.1Mの酢酸塩ｐＨ３、0.2MのＮａＣｌの溶液で洗浄することによりこのカラム
から溶出し、Ｆａｂ含有分画を貯めて2Mのトリス塩基で中和した。
【００５７】 凝固アッセイ プレインキュベーションアッセイのために、20μlの抗体を180μlの再脂肪化
ヒト組織因子（Innovin, Dade Behring Inc., Newark, DE）に添加し、３７℃で
１５分間インキュベートした。100μlの正常クエン酸ヒト血漿（Pheninsula Blo
od Bank, Burlingame, CA）を添加し、MLA Electra800（Medical Laboratory Au
tomation Inc.,; Pleasant, NY）を用いて測定した。
【００５８】 プロトロンビン時間アッセイ プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイ、抗体をクエン酸ヒト血漿に添加した。
５分のインキュベーションの後、ヒト組織因子試薬Innovinを加えることにより
凝固を開始した。凝固時間をＰＴ法を用いてＡＣＬ３００（Coulter Corp., Mia
mi, FL）で測定した。両アッセイについて、抗体濃度を反応混合物（組織因子試
薬を含む）の最終濃度として記録した。
【００５９】 ｓＴＦ突然変異体の部位特異的突然変異、発現、及び精製 大腸菌でのｓＴＦ突然変異体（ＴＦ１−２１９）の発現及びそれに続くＤ３抗
体親和性カラムでの精製を先に記載（Kelley等, [1995] Biochemistry 34: 1038
3-10392）されるようにして実施した。Ｄ３カラム（N199A:R200A及びK201A:D204
A）に結合しなかったｓＴＦ突然変異体については、７Ｇ１１抗体カラムを使用
した。このカラムを製造業社の使用説明に従ってＣＮＢｒ活性化セファロース４
Ｂ（Pharmacia, Piscataway, NJ）を７Ｇ１１抗体に結合させることにより準備
した。細胞のペレットを−２０℃で少なくとも１時間保存した。浸透圧衝撃上清
を50mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、500mMのＮａＣｌ（緩衝液Ａ）で平衡にし
た抗体親和性カラムに用いた。非特異的結合のタンパク質を取り除くために、カ
ラムを緩衝液Ａ及び50mMのトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、1.0MのＮａＣｌ、0.5Mの
塩化テトラメチルアンモニウムの６カラム量で洗浄した。ｓＴＦ突然変異体を0.
1Mの酢酸ナトリウム、ｐＨ３．０、0.2MのＮａＣｌで溶出させた。分画を中和し
、最大分画をCentriprep 10（Amicon, Beverly, MA）を用いて濃縮した。タン
パク質濃度を、量的アミノ酸分析データから計算した29.4mM-1cm-1のλ２８０を
用いて吸光度測定器により決定した。29.4mM-1cm-1のλ２８０はｓＴＦのＴｒｐ
からＰｈｅへの突然変異に使用された。
【００６０】 抗ＴＦ抗体のＴＦ結合親和性測定及び抗体のエピトープマッピング 固定した抗体に対するｓＴＦの結合親和性をPharmacia BIAcore2000 計器（Ph
armacia Biosensor）における表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）測定により決定し
た。各抗体をアミンカップリング化学反応（Pharmacia Biosensor）を用いて２
０００−３０００の共鳴単位のレベルでセンサーチップ表面に結合した。典型的
な実験では、４つの異なる抗体をセンサーチップのそれぞれ４つのフローセルに
固定してセンサーグラムを４つ全ての抗体について同時に記録した。センサーグ
ラムは２倍増の15.6nM〜500nMの範囲の濃度でｓＴＦ結合を記録した。運動定数
を製造業者により供給されるソフトウェアを用いた１：１の結合モデルに従って
非直線回帰分析により測定した。解離定数を運動定数から計算した。ｓＴＦへの
結合についての抗体及びＦＶＩＩａの間の競合を測定するための実験では、同じ
ｓＴＦ濃度の系は、5μMのヒト組み換えＦＶＩＩａの存在下で調製した。これら
の溶液を、センサーチップへの注入の前に３０分間、外界温度でインキュベート
した。モノクローナル抗体に結合するｓＴＦのエピトープは、固定した抗体の親
和性におけるｓＴＦのアミノ酸置換の影響を測定することにより決定された。親
和性は、野生型タンパク質のための上記のようなＳＲＰ測定により決定した。
【００６１】 モノクローナル抗体 モノクローナル抗体７Ｇ１１を、ＭＰＬ/ＴＤＭアジュバンド（Ribi Immunoch
em Research, Hamilton, MT）中の20μgのｓＴＦによって皮下に３回、腹腔内に
３回、２週間隔でメスのＢＡＬＢ/ｃマウスを免疫化することにより生成した。
これらのマウスを更に毎週100ulのＭＰＬ/ＴＤＭアジュバンド中の10μgのｓＴ
Ｆを足蹠に８回追加免疫した。５Ｇ６を毎週１３回100μlのＭＰＬ/ＴＤＭアジ
ュバンド中10μgのｓＴＦで足蹠を介してメスのＢＡＬＢ/ｃマウスを免疫化する
ことにより生成した。最後の追加免疫の４日後に、膝窩リンパ節を取り出し、記
載されるように（Chuntharapai及びKim, [1997] Methods Enzymol. 288: 15-27
）35%のポリエチレングリコールを使用してマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U.1（
Yelton等, [1978] Curr. Top. Microbial. Immunol. 81: 1-7）と融合した。Ｅ
ＬＩＳＡにより決定されるように、ｓＴＦに特異的なハイブリドーマ細胞株分泌
抗体を、限界希釈法により２回クローン化し、さらに特徴付けした。腹水症をＢ
ＡＬＢ/ｃマウスに作り、モノクローナル抗体をセファロース４Ｂにコンジュゲ
ートしたタンパク質Ｇを用いて精製した。Ｄ３抗体の生成は先に記載があり（Pa
borsky等, [1990] Port. Engineering 3:547-553）、抗体６Ｂ４は別々の免疫プ
ロトコールからである。ＨＴＦ１抗体はCarson等（Carson等, [1987]上掲）によ
り記載されている。
【００６２】 ヒト血漿のＦＸ活性化 抗体をドナーの血漿プールからのヒトクエン酸血漿（Peninsula Blood Bank,
Burlingame, CA）で室温において１０分間希釈した。インキュベーションの終わ
りにトロンビン阻害剤ナプサガトラン(napsagatran)（Hilpert等, [1994] J. Me
d. Chem. 37:3889-3901; Gast及びTshopp [1995] Blood Cage. Fibrinolysis 6:
533-560）を添加した。ＦＸ活性を20mMのｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、15mMＣａＣ
ｌ２含有0.5%ＢＳＡ（ＨＢＳ緩衝液）中の再脂質化ＴＦ１−２４３で開始させた
。反応混合物は33%の血漿を含有し、再脂質化ＴＦ１−２４３、ナプサガトラン
、及びＣａＣｌ２の濃度はそれぞれ0.4nM、0.5μM及び5mMであった。１５秒間隔
で採った50μlのアリコットを150μlの20mMＥＤＴＡで停止させた。第２段階で
は、50μl の1.5mMＦＸａ色素生産性基質Ｓ２７６５を添加し、405nmの吸光度の
増加を比色マイクロプレートリーダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）
でモニターした。初期率を４５秒時点までの値の直線回帰により計算した。後期
の時点で得られたアリコットの値は、反応の直線フェーズがこの短い期間に限ら
れることを示した。再脂質化Ｔ１−２４３を除いたコントロール実験では、色素
生産性の活性の増加は無いことが示され、ＴＦなしにＦＸａ生成はないことを示
した。また、ナプサガトランは、用いた条件下でＳ２７６５に対しＦＸａアミド
分解活性に影響せず、トロンビンに対する高い選択性の報告（Hilpert等, [1994
]上掲）と一致した。血漿でインキュベートしたＦＸａ及びアッセイで使用され
る他の全ての化合物の標準曲線から、阻害のない条件下で8.6nM±0.9ＦＸａ/分
（±Ｓ.Ｄ.）の平均が得られることが算出された。 数種の凝固因子、例えば因子ＩＩａ、ＶＩＩａ、ＩＸａ及びＸＩａのアミド分
解活性は、反応の間に生成される他の凝固因子がアッセイの第２段階に測定され
るアミド分解活性に寄与するかどうかを試験するために同一のアッセイ条件下で
試験された。因子ＸＩａのみが、Ｓ２７６５に対して十分なアミド分解活性を示
し、約25%のＦＸａ活性であった。我々のアッセイ方法での因子ＸＩａの可能な
寄与を評価するために、Ｄ３抗体の阻害活性を因子ＸＩ欠損血漿（George King
Bio-Medical, Overland Park, KS）において試験した。5.2±0.1μg/ml（±ＳＤ
、ｎ＝４）のＩＣ５０値は、正常なヒト血漿で測定される値と等しかった。更に
、因子ＩＩ-及び因子ＶＩＩＩ-欠損血漿（American Diagnostica）で実施された
試験も同様の結果（それぞれ6.4±0.9μg/mlと7.6±1.5μg/ml）であった。共に
、これらの結果は、Ｓ２７６５切断の割合が血漿中の再脂質化ＴＦ１−２４３：
ＦＶＩＩａ複合体により生成されたＦＸａの濃度を正確に反映することを強く示
唆していた。
【００６３】 可溶性ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体のアミド分解活性 クロモザイムｔ-ＰＡの添加前に、5mMのＣａＣｌ２を含有するＨＢＳ緩衝液中
でｓＴＦ及びＦＶＩＩａと共に抗体を２０分間インキュベートした。反応物の最
終濃度は次の通りであった：10nM ｓＴＦ、10nM ＦＶＩＩａ、0.5mM クロモザイ
ムｔ-ＰＡ。アミド分解活性率は比色マイクロリーダー（Molecular Devices）に
おいて405nmで測定した。基礎活性はｓＴＦの無い状態でのＦＶＩＩａのアミド
分解活性と定められ、得られた値から差し引いた。
【００６４】 ヒト生体外血栓症モデル 組織因子発現ヒトＪ８２細胞（上皮癌腫、ATCC HTB1）を、記載されるように
して（Kirchhofer等, [1995] Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 15: 1098-11
06）Thermanoxプラスティックカバーガラス上に生育した。次いで細胞の単層を
有するカバーガラスを平板潅流槽におき、チュービング、撹拌器及び平板槽を含
む全てのシステムをＤＭＥＭ-1%（w/v）ＢＳＡで満たした。実験システムの詳細
は最近記載された（Kirchhofer等, [1995]上掲; Kirchhofer等, [1994] J. Clin
. Invest. 93: 2073-2083）。次いで、血液を1mL/分の割合で健康なドナーの肘
前静脈から取り出した。撹拌槽に入れる直前に、流血に注入ポンプ（Infu 362、
Datex AG、スイス）を使用して50μL/分の割合で抗体を注入した。次いで、均質
な血液抗体混合物をＪ８２細胞の単層を含む３つの平板潅流装置に入れた。1mL/
分の血流は、静脈血流条件に一致するカバーガラス上で65s-1の剪断速度となっ
た。３．５分の潅流時間の後、細胞層を洗浄し、沈殿したフィブリンの目視検査
のためにカバーガラスをはずした。フィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）のレベルを
、先に記載される（Kirchhofer等, [1994]及び[1995]上掲）ようにして潅流装置
に残った血液で測定した。
【００６５】 結果 機能的に異なる抗ＴＦ抗体 図１ａに見られるように、抗体７Ｇ１１、６Ｂ４及びＨＴＦ１は、クロモザイ
ムｔ-ＰＡに対するｓＴＦ：ＦＶＩＩａ依存性の活性を完全に抑制し、適切な形
態のｓＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の阻害を示した。対照的に、５Ｇ６抗体は全てに
おいて阻害はなかったが、Ｄ３は約20%まで活性を減少させ、より高い濃度でプ
ラトーに達した。また、Ｄ３による阻害はより小さい抗体Ｆａｂを使用した場合
に見られた（図１ａ）。モル過剰の抗体の存在下での高いｓＴＦ濃度（120-200n
M）で阻害は起こらないので、Ｄ３の阻害作用は、低いｓＴＦ濃度に依存してい
た（データは示さず）。確かに、Ｄ３は、再脂質化ＴＦ１−２４３を使用した場
合にアミド分解活性に影響しなかったが、それはｓＴＦよりも非常に高い親和性
を有するＦＶＩＩａに結合する（データは示さず）。しかしながら、Ｄ３及び５
Ｇ６は共に、巨大分子基質並びに他の抗体のＴＦ：ＦＶＩＩａ媒介活性を阻害し
た。これは、抗体をＴＦ試薬と共に先にインキュベートした凝固アッセイから得
られる結果によって示された（図１ｂ）。
【００６６】 抗ＴＦ抗体の抗凝固能 アミド分解アッセイの結果は、抗ＴＦ抗体の２つの基本的に異なるタイプを示
した。各グループ（Ｄ３及び５Ｇ６対６Ｂ４及びＨＴＦ１）の２つの抗体を選択
し、ヒト生体外血液流動システムにおける抗凝固能を測定した（Kirchhofer等,
[1994]及び[1995]上掲）。このシステムにおいて、流動している非抗凝固ヒト血
液に抗体を注入し、次いでＴＦ発現Ｊ８２細胞の単層を含む平板装置に入れた。
細胞層での剪断速度は静脈血液流動状態と同様の６５ｓ−１であった。コントロ
ールにおいてこれはフィブリノペプチドＡ（ＦＰＡ）の生成及び重合したフィブ
リンの細胞単層への沈着という結果となった。３６のコントロール試料の平均Ｆ
ＰＡレベルは1348±46.1ng/ml血漿（±ＳＥＭ）であったが、同じシステムを用
いた以前に報告されているＦＰＡ濃度（1192±69ng/ml; （Kirchhofer等, [1995
] 上掲））と同様であった。Ｄ３及び５Ｇ６の注入は、それぞれ16μg/ml及び50
μg/mlのＩＣ５０値でＦＰＡ生成を強力に阻害した（図２）。全長Ｄ３に比較し
てＤ３ Ｆａｂによる阻害は弱く（ＩＣ５０ 36μg/ml）、恐らく二価の全長Ｄ３
抗体と比較して表面ＴＦに対する減少した親和力に依存している。驚くべきこと
に、ＨＴＦ１抗体は50μg/mlの最も高い試験濃度での阻害はなかったが、６Ｂ４
は、150μg/mlで約40%阻害での弱い阻害活性を示した（図２）。観察されたＤ３
、Ｄ３ Ｆａｂ及び５Ｇ６によるＦＰＡレベルの減少と一致して、細胞層の目視
検査は、殆どのフィブリンが沈着しないことを示したが、ＨＴＦ１及び６Ｂ４処
理試料はコントロールと見分けがつかなかった。 次に、ヒト血漿でのＦＸ活性の測定を、抗体の抗凝固能の定量のための他の方
法として使用した。血流システムと同様に、抗体がＴＦで前もって平衡化されず
、流れる血液に注入される場合には、抗体を血漿に添加し、凝固を再脂質化ＴＦ１−２４３ で誘発した。我々は、試験した抗体が濃度に依存してＦＸ活性の初期
率を阻害することを見出した（図３）。抗体Ｄ３及び５Ｇ６は、ＨＴＦ１、６Ｂ
４及び７Ｇ１１よりも強力であった。50%の率まで阻害した濃度は、次の通りで
あった：Ｄ３については7.2±1.0μg/ml（±ＳＤ、ｎ＝５）、５Ｇ６については
15.5±1.3μg/ml（±ＳＤ、ｎ＝５）、６Ｂ４については43.4±6.8μg/ml（±Ｓ
Ｄ、ｎ＝４）、７Ｇ１１については147.8±8.6μg/ml（±ＳＤ、ｎ＝５）、ＨＴ
Ｆ１については150.0±31.1μg/ml（±ＳＤ、ｎ＝４）。 さらに、抗体間の同様の能力の差は、ＦＸ活性率アッセイのものと同じインキ
ュベーションプロトコールを用いてＰＴアッセイで凝固時間を測定して分かった
（図４）。凝固時間が１．５倍に延びた抗体濃度は、Ｄ３で10μg/ml、５Ｇ６で
27μg/ml、６Ｂ４で133μg/ml及び７Ｇ１１で500μg/mlであった。ＨＴＦ１は最
も高い試験濃度（40μg/ml）で効果はなかった（図４）。
【００６７】 抗ＴＦ抗体の速度定数の測定 試験した抗体の阻害能が単なるｓＴＦに対する結合親和性の影響であり得るの
で、各抗体の速度定数を測定した。計算されたＫＤ値（表２）と各抗体の阻害活
性の比較により、親和性と抗凝固能の間に関係がないことが示された。実際、Ｄ
３は一貫して最も強力な抗凝固能を有し、また、ＴＦに対して最も弱い親和性を
示したが、ＨＴＦ１及び７Ｇ１１は最も強く結合し、最も弱い抗凝固活性を有し
ていた。またこの関連性の欠如は、結合(ｏｎ)速度を比較した場合にＨＴＦ１以
外は同じ範囲（2.3x105-6.0x105M-1秒-1）であることにも見られた。
【００６８】
【表２】 更に、ＦＶＩＩａとｓＴＦの競合実験は、モル過剰のＦＶＩＩａ（＞100x）の
存在下で、抗体７Ｇ１１、６Ｂ４及びＨＴＦ１がＴＦに結合しないのに対して、
Ｄ３及び５Ｇ６の親和性は４−５倍までにしか減少しないことを示した。これは
アミド分解アッセイ（図１ａ）による結果と一致しており、Ｄ３及び５Ｇ６は他
の抗体とは基本的に異なる阻害機構を有していることを示唆する。
【００６９】 抗体エピトープの測定 結果はこれまで、抗体の抗凝固能が特定の阻害機構に関連し、従ってＴＦ上の
正確な結合部位に関連しうることを示唆した。抗体エピトープを決定するために
、多数のｓＴＦ突然変異体を、大腸菌での発現、続いてＤ３カラムでの親和性精
製により生成した（Kelley等, [1995] 上掲）。抗体の各ｓＴＦ突然変異体に対
する結合をＢＩＡコア計器によって測定した。その結果は図５にまとめられ、親
和性の欠如をｓＴＦ突然変異体及び野生型ｓＴＦのＫＤ値の割合として表した。
３倍を超える割合で増加した残基を抗体結合に重要であるとした。２つの二重突
然変異体ｓＴＦ Ｎ１９９Ａ：Ｒ２００Ａ及びｓＴＦ Ｋ２０１Ａ：Ｄ２０４Ａは
Ｄ３親和性カラムに結合せず、７Ｇ１１抗体親和性カラムで精製した。予想され
たとおり、Ｄ３はこれら２つの突然変異体に対する親和性において最も大きな欠
如があった（ＫＤ(ｍｕｔ)/ＫＤ(ｗｔ)＞５０００）。ｓＴＦ Ｄ２０４Ａ単独で
は野生型ｓＴＦと同様の抗体に対する親和性を有しており、Ｋ２０１Ａ：Ｄ２０
４Ａ二重突然変異体におけるＫ２０１は抗体結合に重要な残基であるという結論
に至った。Ｄ３結合に重要であることが分かった他の残基は、Ｉ１５２、Ｙ１５
６及びＫ１６５：Ｋ１６６であった。Ｙ１５６Ｌ以外は、同じｓＴＦ突然変異体
もまた、５Ｇ６抗体に対して減少した結合を示した。 Ｃ末端ＴＦドメインに結合するＤ３及び５Ｇ６とは対照的に、３つの抗体７Ｇ
１１、６Ｂ４及びＨＴＦ１はＮ末端ＴＦドメインに位置する残基に結合した。７
Ｇ１１に対して最も大きく欠如した親和性を有するＴＦ突然変異体は、Ｋ４６Ａ
（5000x）及びＹ５１Ａ（32x）であった。重大な親和性欠如のある更なる抗体は
Ｓ４７Ａ、Ｋ４８Ａ、Ｆ５０Ａ及びＴ５２Ａであった。６Ｂ４抗体の結合に影響
したｓＴＦ突然変異体はＹ１０Ａ、Ｆ７６Ａ、Ｙ９４Ａ、Ｅ９９Ａ及びＬ１０４
Ａ：Ｅ１０５Ａであった。これらの突然変異体のうち３つ、Ｆ７６Ａ、Ｙ９４Ａ
及びＥ９９Ａはまた、ＨＴＦ１抗体の結合親和性も減少させた（図５）。
【００７０】 ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の結晶構造上の抗体エピトープの位置 ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の結晶構造に見られるように（Banner等, [1996] 上
掲）、397Å2の計算された溶媒接近可能領域を有する表面露出残基の明確に定義
されるパッチにより７Ｇ１１結合部位が形成される（図６）。これは典型的な抗
体の埋没した表面領域と比較的僅かにしか比較されておらず（Huang等, [1998]
上掲）、従って、抗体の結合領域は完全に同定されていないようである。この領
域はＦＶＩＩａ結合に重要であり、Ｆ５０残基はＦＶＩＩａの第２の表皮成長因
子ドメインへの重要な疎水性接点を作る（Banner等, [1996] 上掲）。 ６Ｂ４結合に重要であったＴＦ残基は、７Ｇ１１エピトープに対してＴＦの「
裏面」にある大きな表面領域を決定した（図６）。エピトープが同定したＴＦ残
基により定義される周辺にあるとすると、仮定されるエピトープの領域は594Å2 であることが計算された。エピトープはＦＶＩＩａの触媒ドメインに接触するＴ
Ｆ領域にあり、残基Ｆ７６及びＹ９４を含んでいた。ＨＴＦ１については関連す
る少数のＴＦ突然変異体のみが試験され、エピトープはあまり決定されなかった
（図６）。にもかかわらず、Ｆ７６及びＹ９４を含む３つの同定された結合領域
は両方の抗体に共通であったので、ＨＴＦ１及び６Ｂ４エピトープは大体同じで
あった。 Ｄ３及び５Ｇ６抗体のエピトープは非常に類似し、ＦＶＩＩａ-ＴＦ接触領域
の外側にあった。図６に見られるように、エピトープはＣ末端ＴＦドメインの下
側から先端に走り、主なＴＦ-ＦＶＩＩａ接触領域の殆ど反対側にある。従って
、抗体の結合はＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体形成を妨げないようである。
【００７１】 検討 ｓＴＦ突然変異体の大きなパネルを使用して、５つの抗ＴＦ抗体の結合エピト
ープを決定し、どのようにそれらがその抗凝固作用を発揮するのかという明確な
図式を得た。それらはＴＦの３つの識別可能な領域に結合し、それぞれＦＶＩＩ
ａ-ＴＦ結合（７Ｇ１１、６Ｂ４及、ＨＴＦ１）又はＴＦ-巨大分子基質相互作用
（Ｄ３、５Ｇ６）を妨げた。抗凝固能を、抗体及び凝固因子がＴＦと同時に相互
作用する血漿ベースシステム及び完全な血液で測定した。初めに、ヒト生体外血
流システムにおいて、Ｄ３及び５Ｇ６は強力にＦＰＡの生成及びＪ８２細胞層へ
のフィブリンの沈着を阻害した。対照的に、抗体６Ｂ４及びＨＴＦ１は少なくと
も１桁小さい能力であり、ＨＴＦ１の場合には、実質的に不活性であった。第２
に、血流システムでの凝固は、直接ＴＦ：ＦＶＩＩａが媒介するＦＸの活性化に
より進むことが示されたので（Kirchhofer等, [1995] 上掲）、ＦＰＡ精製での
異なる作用はヒト血漿でのプロトロンビン時間及びＦＸ活性化率の抑制に関係が
あると結論づけることができた。実際に、Ｄ３及び５Ｇ６が試験されたはるかに
強力な抗体であることがわかった。 抗凝固活性の明白な違いは、抗体の結合親和性の違いにより説明することがで
きない。実際、Ｄ３は最も弱い（ＫＤ7nM）、７Ｇ１１は最も強い（ＫＤ0.2nM）
結合体であり、また、Ｄ３はＦＸ活性化の阻害において約２０倍以上強力であっ
た。ＴＦによる凝固は急速な作用であるので、能力の違いが結合（ｏｎ）速度で
の違いを反映することが可能であるようであった。しかしながら、ＨＴＦ１を除
いては、実験的に決定された結合速度（ｏｎ）は狭い範囲内にあり、観察された
抗凝固能に関連性がないことを示した。これらの結論から、結合（ｏｎ）速度定
数や結合親和性ではなくエピトープ位置が抗ＴＦ抗体の抗凝固能の主要な決定因
子であることが示唆された。
【００７２】 ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の結晶構造上のエピトープの調査は、全ての抗体がＴ
Ｆの機能的に重要な領域に結合することを明らかにした。Ｄ３及び５Ｇ６の結合
エピトープはＦＶＩＩａに接触しないＴＦ領域と重複していたが、巨大分子基質
結合と相互作用する。このことは、抗体が小合成基質に対するアミド分解活性に
なぜ全く又は殆ど影響しないのかを説明した。エピトープ残基Ｋ１６５及びＫ１
６６は、ＴＦ：ＦＶＩＩａが媒介性するＦＸ（Ruf等, [1992] 上掲; Roy 等, [1
991] 上掲; Kelley 等, [1995] 上掲）及びＦＩＸ（Huang 等, [1996] 上掲）の
活性化に重要であることが以前から分かっている。これら２つの残基及び更なる
エピトープ残基Ｙ１５６及びＫ２０１は、全て基質ＦＸ及びＦＩＸと直接相互作
用する識別可能な表面露出ＴＦ領域の部分である（Kirchhofer 等, [1999] Thro
mb. Haemost. Suppl. [abstract], 300; Kirchhofer 等, (2000) Biochemistry
39:7380-7387)。この領域は、ＦＶＩＩａ Ｇｌａドメイン中にあり（Martin等,
[1993] 上掲; Ruf等, [1999] 上掲）、基質のＧｌａドメインと殆どが接してい
る（Huang 等, [1996] 上掲; Martin 等, [1993] 上掲）。従って、これらの領
域と結合するＤ３及び５Ｇ６は、基質ＧｌａドメインのＴＦとの結合を立体的に
抑制し、よって生産的な３つの部分からなるＴＦ-ＦＶＩＩａ-基質複合体を形成
する適切な基質配向性を妨げる。さらにこのことは、Ｄ３及び５Ｇ６の優れた抗
凝固能を説明する根拠を提供した。第１に、エピトープはＴＦ-ＦＶＩＩａ接触
領域内にないので、これらの抗体は、血漿中のＴＦ：ＦＶＩＩ及びＴＦ：ＦＶＩ
Ｉａ複合体の素早い形成の間及び後にＴＦと結合することができる。第２に、そ
れらはかなり低い親和性のＴＦ-基質相互作用の現象と競り合う。更に、エピト
ープ残基Ｋ１６５及びＫ１６６はＴＦ：ＦＶＩＩのＦＶＩＩａ及びＦＸａに依存
する活性に重要であることが示された（Dittmar 等, [1997] Biochem. J. 321:
787-793）。従って、どちらの抗体も、ＴＦ結合酵素前駆体ＦＶＩＩの活性化、
全ての可能性において血漿での（Rapaport and Rao [1995] Thromb. Haemost. 7
4: 7-17)、並びにＪ８２細胞での使用された血流システムでの（Sakai 等, [198
9] J. Biol. Chem. 264: 9980-9988)凝固のための第１活性化段階である反応を
妨げることができた。実際に、 Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２は酵素前駆体ＦＶＩＩ
のＦＸａ媒介性の活性化を強く阻害することが分かった（Kirchhofer 等, (2001
) Biochemistry 40:675-682）。同じように、同じＴＦ領域に結合する（Huang
等, [1998] 上掲）近似した関係の抗体ＴＦ８-５Ｇ９（Morrissey 等, [1988]
上掲; Ruf and Edgington [1991] 上掲; Huang 等, [1998] 上掲; Fiore 等, [1
992] 上掲）は、血漿凝固アッセイにおいて強力な抗凝固物質であり（Ruf and E
dgington [1991] 上掲）、ＴＦ依存性のＦＶＩＩのＦＶＩＩａへの変換を阻害す
る（Fiore 等, [1992] 上掲）。ＴＦ８-５Ｇ９との比較は、同定されたＤ３及び
５Ｇ６エピトープ残基の全てが可溶性ＴＦに結合するＴＦ８-５Ｇ９ Ｆａｂの結
晶構造の定常領域としても見られることを明らかにした（Huang 等, [1998] 上
掲）。また、明らかに同一のエピトープを有するにもかかわらず、Ｄ３及びＴＦ
８-５Ｇ９（Fiore 等, [1992] 上掲）抗体は、低いｓＴＦ濃度でｓＴＦ：ＦＶＩ
Ｉａ複合体のアミド分解活性（クロモザイムｔ-ＰＡ）を阻害する弱い能力の５
Ｇ６とは異なっていた。これらの結果は、明らかに同じエピトープに結合する抗
体に微妙な違いがあることを示唆した。
【００７３】 血漿凝固アッセイにおいてＴＦに先に結合させる場合にＤ３及び５Ｇ６と同様
の能力があるので、弱い抗凝固能の７Ｇ１１、ＨＴＦ１及び６Ｂ４をスプライシ
ングした。ＴＦ上の抗体結合部位の同定は、これらの結果を説明するための根拠
を提供した。７Ｇ１１はＦＶＩＩａの軽鎖に近接したＴＦ領域に結合した。一つ
の結合残基、Ｆ５０は、ＦＶＩＩａの第２の表皮成長因子ドメインへの重要な接
点を作り（Banner 等, [1996] 上掲; Zhang 等, [1999] J. Mol. Biol. 285: 20
89-2104)、抗体がＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の形成を妨げることを示唆する。６Ｂ
４及びＨＴＦ１のどちらも、共有するＦＶＩＩａ接触部位を妨げ、７Ｇ１１エピ
トープとは異なる。同じように、６Ｂ４は交差阻害(cross-blocking)実験におい
て７Ｇ１１のＴＦへの結合を抑制しなかった（データは示さず）。エピトープ残
基Ｆ７６及びＹ９４はＦＶＩＩａ触媒ドメイン残基Ｍｅｔ３０６に直接接点を作
る。このＭｅｔ３０６又はＴＦ残基Ｙ９４の変異は、巨大分子基質活性化を強力
に改善し（Dickinson 等, [1996] 上掲; Kelley 等, [1995] 上掲; Ruf等, [199
5] Biochemistry 34: 6310-6315)、従って６Ｂ４又はＨＴＦ１の結合は悪影響も
有しうる。この接触部位はまた、小合成基質に関するＦＶＩＩａ活性のＴＦ依存
性促進に重要であり（Dickinson 等, [1996] 上掲）、従って、アミド分解アッ
セイにおいて観察される６Ｂ４及びＨＴＦ１の阻害効果を説明する。また、結果
は、ＨＴＦ１がＴＦのＦＶＩＩａへの結合を妨げることを示す先の報告と一致す
る（Carson 等, [1987] 上掲）。６Ｂ４が巨大分子基質-ＴＦ相互作用に更なる
影響がある可能性がある。６Ｂ４は、Ｋ１６５及びＫ１６６周辺の主な基質相互
作用領域に結合しなかったが（図６）、エピトープ残基Ｌ１０４：Ｅ１０５は、
ＦＸ認識領域の一部である残基Ｎ１９９：Ｒ２００に近位にあった（Kirchhofer
等, [1999] 上掲）。従って、６Ｂ４結合は基質-ＴＦ相互作用での更なる立体
効果となり得た。
【００７４】 抗体７Ｇ１１、６Ｂ４及びＨＴＦ１の異なる特徴は、大きな接触表面全体内で
の局所的ＦＶＩＩａ接触部位とのそれらの競合（Banner 等, [1996] 上掲）及び
高親和性ＦＶＩＩ-ＴＦ相互作用である。この阻害機構はインキュベーション前
の実験において強力な阻害を与えるが（図１ｂ）、我々の実験システムの非平衡
状態下ではそうではなかった。ある適切な実験では一旦ＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体
が形成され、阻害が主にＦＶＩＩａ／ＴＦ解離(off)速度により決定されるため
、抗体は小さい阻害作用を有していた。同様の結果が、Ruf and Edgington (199
1, 上掲）及び Fiore 等 (1992, 上掲）により異なるインビトロシステムを用い
てＴＦ-ＦＶＩＩａ結合を妨げる２つの抗体を調べた。にもかかわらず、適切な
投与量では、このような抗体の型は動物実験において凝固システムの阻害を明ら
かにした（Taylor 等, [1991] Circulatory Shock 33: 127-134; Himber 等, [1
997] Thromb. Haemostasis 78: 1142-1149; Pawashe 等, [1994] Circ. Res. 74
: 56-63; Ragni 等, [1996] 93: 1913-1918; Thomas 等, [1993] Stroke 24: 84
7-854; Golino 等, [1996] Nature Med. 2: 35-40)。この比較の注意点は、動物
実験に使用される抗体があまり詳細に特徴づけられておらず、利用できるエピト
ープマップの情報もないということである。さらに、実験では、抗体様Ｄ３又は
５Ｇ６が非常に低い投与量で効果的であり得ることが予測された。この見解と一
致して近い関係にあるＴＦ８-５Ｇ９抗体はチンパンジーの研究での凝固阻害に
おいて極めて強力であるようであり（Levi 等, [1994] J. Clin. Invest. 93: 1
14-120）、腫瘍転移モデルでもまた非常に効果的であった（Mueller 等, [1992]
上掲）。しかしながら、２つのよく定義された、異なる型の抗体の直接比較も
またなされるべきである。 結論は、抗ＴＦ抗体の抗凝固能は結合親和性によって本来決定されないが、エ
ピトープ位置によって、従って阻害の特定のモデルによって決定されることを示
唆した。血液／血漿ベースのインビトロシステムから得られた結果のインビボ設
定への転換は、明らかな限定を有するが、やはり結論は抗凝固療法での抗ＴＦ抗
体の使用に関していくらか関係を有しうる。この研究によって示唆されるように
、エピトープ位置は血栓症を抑制する抗体の能力に強く影響しうるので、抗ＴＦ
抗体の選択は期待される効果の点で重要であり得る。
【００７５】 実施例２ マウス抗ヒト組織因子モノクローナル抗体Ｄ３のヒト化 材料と方法 マウスＤ３のクローニング マウス抗ヒトＴＦ ｍＡｂ Ｄ３をジェネンテック社で生成し、クローン化した
（Paborsky 等, [1990] Prot. Engineering 3: 547-553)。精製した抗体のタン
パク質配列分析により、重鎖のＮ末端配列、EVQLQQSGAELVRPGALVKLSCKASGFNIKD
（配列番号：19）、及び軽鎖のＮ末端配列、DIKMTQSPSSMSASLGESVTITCKASRDIK（
配列番号：20)を得た。全てのＲＮＡはＤ３ハイブリドーマ細胞株（1D4(14)_D3
）から標準的なＲＮＡ ＳＴＡＴプロトコール（Tel-Test-Inc., Friendswood, T
X）を用いて精製した。ｃＤＮＡは製造業者の使用説明に従ってオリゴｄＴ及び
スーパースクリプトＩＩ ＲＮａｓｅ Ｈ-逆転写酵素を用いて作成した（Gibco B
RL社, Gaithersburg, MA）。ＰＣＲ増幅を、１ｘ緩衝液、4mMのＭｇＣｌ、40μM
のｄＮＴＰｓ、及び0.7-1.0μMの正方向及び逆方向プライマーを含有する３ユニ
ットのＵＩＴｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（パーキンエルマー(Perkin Elmer)社, F
oster City, CA) を用いて50μlの反応で実施した。使用された特定のプライマ
ーは、重鎖正方向、5'-TACAAACGCGTACGCTGARGTNCARYTNCARCARWSNGGNGC-3'（配列
番号：21）、重鎖逆方向、5'-CAGTGGATAGACAGATGGGCCCGTCGTTTTGGC-3'（配列番
号：22）、軽鎖正方向、5'-GCATACGCTGAYATHAARATGACNCARWSNCC-3'（配列番号：
23）、軽鎖逆方向、5'-TGGTGCAGCCACGGTCCGTTTKAKYTCCARYTTKGT-3'（配列番号：
24)であった。別々の反応が重鎖及び軽鎖に開始され、次の条件を繰り返した：
９５°で２分間、３０サイクル（９５°２０秒、６０°３０秒、７２°１分）、
４°、Perkin Elmer 9600で維持。Qiaquick カラム（キアゲン社）での精製の後
、ＰＣＲ反応の１／１０がpCR-Blunt (Invitrogen社)にクローン化された。クロ
ーンの配列分析によって、重鎖及び軽鎖ともアミノ酸７が予想されるＳｅｒに代
わってＡｒｇであることが明らかとなり；プライマーに使用されたコドンＷＳＮ
はＡｒｇ又はＳｅｒとなりうる。ＰＣＲをpCR-Bluntで別々のクローンにおいて
繰り返し、ＡｒｇをＳｅｒに変えた。同じ逆方向プライマーを使用し、新しい重
鎖正方向プライマー、5'-AGGTACAAACGCGTACGCTGAAGTGCAACTCCAGCAAAGTGG-3'（配
列番号：25）、及び軽鎖正方向プライマー、5'-GCATACGCTGATATAAAAATGACGCAGTC
GCCATCC-3' （配列番号：26）。ＰＣＲはＵＩＴｍａ及び上記と同じ条件を用い
た。重鎖ＰＣＲ断片は、ＢｓｉＷＩ及びＡｐａＩで消化し、軽鎖ＰＣＲ断片はＥ
ｃｏＲＶ及びＲｓｒＩＩで消化した。生じたそれぞれの消化した断片を先に記載
されるＦ(ａｂ)キメラ発現プラスミド中にクローン化した（Presta 等, Cancer
Res. 57: 4593-4599 [1997]）。
【００７６】 重鎖断片ＢｓｉＷＩ〜ＡｐａＩのＤＮＡ配列（配列番号：27)： 5,-GTACGCTGAAGTGCAACTCCAGCAAAGTGGCGCTGAGCTTGTGAGGCCAGGGCCTTAGTCAAGTTGTCC
TGCAAAGCTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGCACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTG
GAGTTGATTGGATGGATTGATCCTGAGAATGGTAATACTATTTATGACCCGAAGTTCCAGGACAAGGCCAGT
ATAACAGCAGACACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGCTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTC
TATTACTGTGCTAGAGATACTGCGGCATACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCA
GCCAAAACGACGGGCCC-3' 軽鎖断片ＥｃｏＲＶ〜ＲｓｒＩＩのＤＮＡ配列（配列番号： 28)： 5'-GATATCAAAATGACGCAGTCGCCATCCTCCATGTCTGCATCGCTGGGAGAGAGTGTCACTATCACTTGC
AAGGCGAGTCGGGACATTAAAAGCTATTTAAGCTGGTACCAGCAGAAACCATGGAAATCTCCTAAGACCCTG
ATCTATTATGCCACAAGCTTGGCGGATGGGGTCCCATCAAGATTCAGTGGCAGTGGATCTGGGCAAGATTAT
TCTCTAACCATCAGCAGCCTGGAGTCTGACGATACAGCAACTTATTACTGTCTACAGCATGGTGAGAGCCCA
TTCACGTTCGGCTCGGGGACAAAGTTGGAACTCAAACGGACCG-3'
【００７７】 マウス及びヒト化Ｆ(ａｂ)のコンピュータグラフィックモデル。 ＶＬ及びＶＨドメインの配列（それぞれ配列番号：３及び１）をマウスＤ３
ＶＬ-ＶＨドメインのコンピュータグラフィックモデルの構築に使用した。この
モデルを、フレームワーク残基がヒト化抗体に取り込まれうるものの決定に使用
した。また、ヒト化Ｆ(ａｂ)のモデルを構築して、マウスフレームワーク残基の
正確な選択を確認した。モデルの構築を既に記載されているようにして実施した
（Carter 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 4285-4289 [1992]; Eigenbrot
等, J. Mol. Biol. 229: 969-995 [1993]）。
【００７８】 ヒト化Ｆ(ａｂ)の構築 大腸菌のＦ(ａｂ)の変異及び発現に使用されるプラスミドｐＥＭＸ１は、既に
記載されている（Werther 等, J. Immunol. 157: 4986-4995 [1996]）。簡単に
いうと、プラスミドはコンセンサスヒトκサブグループＩ軽鎖（ＶＬκＩ-ＣＬ
）、コンセンサスヒトサブグループＩＩＩ重鎖（ＶＨＩＩＩ-ＣＨ１）及びアル
カリホスファターゼプロモーターをコードするＤＮＡ断片を含む。ＶＬ及びＶＨ
のコンセンサス配列の使用は既に記載されている（Carter 等, 上掲）。 ヒト化Ｄ３の第一のＦ(ａｂ)変異体、Ｆ(ａｂ)-１の構築のために、部位特異
的突然変異誘発（Kunkel, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 82: 488-492 [1985]）を
ｐＥＭＸ１のデオキシウリジン含有鋳型で実施した。６のＣＤＲをマウスＤ３配
列に変え；各ＣＤＲに含まれる残基は、配列に基づくＣＤＲの定義づけによる（
Kabat 等, Sequences of proteins of immunological interest, Ed. 5, Public
Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD [1991]、そ
れ以外、ＣＤＲ-Ｈ１は Kabat 等（上掲）及び Chothia 等, Nature 342:877-83
3 (1989)によるＣＤＲ-Ｈ１の定義付けの組み合わせを用いて定義される、即ち
ＣＤＲ-Ｈ１は重鎖の残基Ｈ２６-Ｈ３５にあるものとして定義した)。従って、
Ｆ(ａｂ)-１は、６つの完全なマウスＣＤＲ配列を有する完全なヒトフレームワ
ーク（ＶＬκサブグループＩ及びＶＨサブグループＩＩＩ）からなる。他の全て
のＦ(ａｂ)変異体のプラスミドをＦ(ａｂ)-１のプラスミド鋳型から構築した。
二本鎖及び一本鎖ＤＮＡの生成のために、プラスミドを大腸菌株ＸＬ-１ Ｂｌｕ
ｅ（Stratagene社, San Diego, CA）に形質転換した。各変異体について、軽鎖
及び重鎖をコードするＤＮＡをジデオキシヌクレオチド法（Sequenase, U.S. Bi
ochemical Corp., Cleveland, OH）を用いて完全に配列決定した。プラスミドを
大腸菌株１６Ｃ９、ＭＭ２９４の派生体に形質転換し、50μg/mlのカルベニシリ
ンを含有するＬｕｒｉａブロスプレート上に撒き、単一のコロニーをタンパク質
発現のために選択した。単一のコロニーは、5mlのＬｕｒｉａブロス-100μg/ml
のカルベニシリン中、３７℃で５−８時間生育した。5mlの培地を500mlのＡＰ５
-50μg/mlのカルベニシリンに添加し、4Lのバッフル(buffled)振とうフラスコで
３０℃で２０時間育成させた。ＡＰ５培地は：1Lの水に対して、1.5gのグルコー
ス、11.0gのＨｙｃａｓｅ ＳＦ、0.6gの酵母抽出物（食用）、0.19gのＭｇＳＯ
４（無水）、1.07gのＮＨ４Ｃｌ、3.73gのＫＣｌ、1.2gのＮａＣｌ、120mlの１
Ｍトリエタノールアミン、ＰＨ７．４からなり、さらに0.1μmのSealkeenフィル
ターを通してフェイルター滅菌。細胞を1Lの遠心管で3000xgにおいて遠心分離す
ることによって回収し、上清を捨てた。１時間凍結させた後、ペレットを25mlの
冷たい10mMトリス-1mMＥＤＴＡ-20%スクロース、ｐＨ８．０に再懸濁した。250
μlの0.1Mベンズアミジン（Sigma社, St. Louis, MO）を加えて、タンパク質分
解を抑制した。３時間氷上で穏やかに撹拌した後、試料を40,000xgで１５分間遠
心分離した。次いで上清を、10mMのトリス-1mMＥＤＴＡ、ｐＨ７．５で平衡化し
たタンパク質Ｇ-セファロースＣＬ-４Ｂ（ファルマシア社、Uppsala, Sweden）
カラム（0.5ml総容積）に適用した。カラムを10mlの10mMトリス-1mMＥＤＴＡ、
ｐＨ７．５を洗浄し、3mlの0.3Mグリシン、ｐＨ３．０を1.25mlの１Ｍトリス、
ｐＨ８．０中に析出した。次いでＦ(ａｂ)をCentricon-30（Amicon社, Beverly,
MA）を用いてＰＢＳ中に緩衝液交換し、0.5mlの最終体積に濃縮した。全てのＦ
(ａｂ)のＳＤＳ-ＰＡＧＥゲルを純度の確認を行い、各変異体の濃度をアミノ酸
分析により測定した。Ｆ(ａｂ)をＯＤ２８０の測定及びアミノ酸分析により定量
し；アッセイに使用された濃度をアミノ酸分析から得た。 キメラＦ(ａｂ)を結合アッセイにおいて基準として使用した。このキメラＦ(
ａｂ)は、アミノ酸ＳｅｒＨ１１３でヒトＣＨ１ドメインに融合したマウスＤ３
ＶＨドメイン全体及びアミノ酸ＬｙｓＬ１０７でヒトＣＬドメインに融合したマ
ウスＤ３ ＶＬドメインの全体からなる。キメラＦ(ａｂ)の発現及び精製をヒト
化Ｆ(ａｂ)のものと一致した。
【００７９】 Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２の構築及び精製 Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２をＤ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ)のＣ末端に重鎖ヒンジ（ＣＰ
ＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧ）を、続いて精製のためにＧＣＮ４ロイシンジッパー（５
１）及び（ｈｉｓ）６タグを加えることにより作成した。Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')
２を大腸菌で発現させ、細胞ペーストを20mMのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４50
mMのＮａＣｌで１：５（w/v）に希釈し、次いでM110Y microfluidizer（マイク
ロフルイディクス社(Microfluidics Corp.), Newton, MA）を用いて溶解した。
ポリエチレンイミン（ＢＡＳＦ社, Rensselaer, NY）を最終濃度0.2%まで加え、
続いて遠心分離（4300xg、３０分）し、細胞片を取り除いた。上清を濾過（0.2
μm）してＦ(ａｂ')２が貫流する条件下でＳＰセファロースＦＦ（アマシャムフ
ァルマシアバイオテク社(Amersham Pharmacia Biotech, Uppsala, スウェーデン
）に入れた。ＳＰセファロースＦＦを通した分画をキレート化セファロースＦＦ
（アマシャムファルマシアバイオテク社, Uppsala, スウェーデン）に適用して
Ｃｕ２＋で荷電し、2mMのイミダゾール、ｐＨ７．０、250mMのＮａＣｌで平衡化
した。Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２を200mMのイミダゾール、ｐＨ７．０を用いて溶
出した。キレート化セファロースＦＦ溶出プールをｐＨ４．０に調節し、ロイシ
ンジッパー/（ｈｉｓ）６タグをペプシンを用いて切断した。ペプシン切断に続
いて、Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２をＳＰセファロース高性能(SP Sepharose High P
erformance)（アマシャムファルマシアバイオテク社, Uppsala, スウェーデン）
に適用し、25mMのＭＥＳ、ｐＨ５．６中の0〜0.12Mの酢酸ナトリウムの直線勾配
を用いて溶出させた。ＳＰセファロース高性能勾配分画をＳＤＳ-ＰＡＧＥによ
り分析してプールした。最後に、Ｄ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２を10kDaの再生成した
セルロース膜（ミリポア社(Millipore), Bedford, MA）を用いて限外濾過し、続
いて20mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５、0.14MのＮａＣｌ中にダイアフィルト
レーションして作成した。作成したＤ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ')２の純度は大腸菌タン
パク質不純物アッセイにより、＞99.9%であった。作成したＤ３Ｈ４４-Ｆ(ａｂ'
)２のエンドトキシンレベルは＜0.01EU/mgであった。
【００８０】 キメラ及びヒト化ＩｇＧの構築 ヒト化Ｄ３のヒトＩｇＧ２及びＩｇＧ４の生成のために、（Ｆ(ａｂ)-Ｄ３Ｈ
４４）由来のヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをヒトＩｇＧ２又はＩｇＧ４の定常ド
メインを含む、以前に説明されるｐＲＫベクター（Eaton等, Biochemistry 25:
8343-8347[1986]）中にサブクローニングした。ＩｇＧ４ｂ変異体は、ヒンジの
重鎖内ジスルフィドの構成を改善するＳｅｒ Ｈ２４１ Ｐｒｏの変化を含み、Ｉ
ｇＧ４抗体のより均質な生成となった（Angal S, King DJ, Bodmer MW, Turner
A, Lawson AD, Roberts G, Pedley b, Adair JR. A single amino acid substit
ution abolishes the heterogeneity of chimeric mouse/human (IgG4) antibod
y. Molec. Immunol. 1993; 30:105-108; Bloom JW, Madanat MS, Marriot D, Wo
ng T, Chan S-Y. Intrachain disulfide bond in the core hinge region of hu
man IgG4. Port. Sci. 1997; 6:407-415）。各変異体の軽鎖全体及び重鎖全体を
コードするＤＮＡを、ジデオキシヌクレオチド配列決定により確認した。ＩｇＧ
変異体をタンパク質Ａセファロースを用いて精製した。
【００８１】 ＩｇＧ１の構築及び精製 組織因子結合アッセイ Maxisorpプレート（Nunc社, Roskilde, デンマーク）を、コートバッファー(c
oat buffer)（50mMの炭酸緩衝液、ｐＨ９．６）中の10μg/mlのヒト可溶性組織
因子、100μl/ウェルを用いて４℃で一晩コートした。プレートを150μl/ウェル
の阻害緩衝液（ＰＢＳ、0.5%ＢＳＡ、ｐＨ７．２）を用いて室温で１時間阻害し
た。基準及び試料をアッセイ緩衝液（ＰＢＳ、0.5%ＢＳＡ、0.05%Ｔｗｅｅｎ２
０、ｐＨ７．２）で希釈し、プレートを室温で２時間インキュベートした。100
μl の1:10,000ヤギ抗ヒトＦ(ａｂ)-ＨＲＰ（Cappel社, Costa Mesa, CA）を添
加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。100μl の基質３,３',５,
５'-テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）（Kirkegaard & Perry社, Gaithersburg
, MD）を添加した。５分後、100μlの1MのＨ３ＰＯ４を添加して反応を停止した
。各工程の間にプレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ、0.05%Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７
．２）で洗浄した。吸光度をTiterek stackerリーダー（ICN社、Costa Mesa, CA
）の450nmで読み取った。基準及び試料を、回帰曲線に合う４つのパラメータを
用いたカレイダグラフ３.０.８（Synergy Software, Reading, PA）に当てはめ
た。ＩＣ５０の標準でのＯＤ４５０を測定した。このＯＤを得るのに必要なサン
プルの濃度を測定し、ＩＣ５０の標準に対するこの値の割合を計算した。
【００８２】 ビアコア(BIAcore)(登録商標)バイオセンサーアッセイ ヒト化及びキメラＦ(ａｂ)のＴＦ結合をビアコア(登録商標)バイオセンサー（
Karlsson等, 1994）を用いて比較した。Ｆ(ａｂ)の濃度を定量アミノ酸分析によ
り測定した。ＴＦを製造業者の使用説明（ファルマシア社）に従って主なアミノ
酸グループに通してＣＭ-５バイオセンサーチップに結合させた。チップにＦ(ａ
ｂ)（35mlの2μM Ｆ(ａｂ)、流速20μl/分で）を染み込ませて解離(off)速度の
速度論を測定し、次いで緩衝液（ＰＢＳ-0.05%のポリソルベート２０）と交換し
た。０−４５００秒のデータポイントを解離(off)速度の速度論解析に使用した
。解離速度定数（ｋｏｆｆ）を時間に対するｌｎ（Ｒ０/Ｒ）のプロットの勾配
から得た、ここでＲ０はｔ＝０での符号であり、Ｒは各時点での符号である。 結合(on)速度の速度論をＦ(ａｂ)の２倍の連続希釈法（0.0625 - 2μM）を用
いて測定した。勾配、Ｋｓは、ファルマシアバイオセンサーマニュアルに記載さ
れるようにしてビアコア(商品名)速度論評価を用いて各Ｆ(ａｂ)濃度間の時間ｔ
に対するｌｎ（-ｄＲ/ｄｔ）のプロットから得た。Ｒは時間ｔでの符号である。
８０と１６８、１４８、１２８、１１４、１０２、及び９２秒の間のデータは、
それぞれ0.0625、0.125、0.25、0.5、1、及び2μMのＦ(ａｂ)を用いた。結合速
度定数（ｋｏｎ）はＦ(ａｂ)濃度に対するＫＳのプロットの勾配から得た。各サ
イクルの終わりに、流速20μl/分で5μlの50mMＨＣｌを注入することによって結
合したＦ(ａｂ)を取り除き、チップを再生成した。
【００８３】 バイオアッセイ 試薬 Ｆ.ＩＸはHaematologic Technologies社（Essex Jct., VT）から、Ｆ.ＸはEn
zyme Research Laboratories 社(South Bend, IN)からのものである。ジオレオ
イル１,２-ジアシル-ｓｎ-グリセロ-３-(ホスホ-Ｌ-セリン)（ＰＳ）及びオレオ
イル１,２-ジアシル-ｓｎ-グリセロ-３-ホスホコリン（ＰＣ）はAvanti Polar L
ipids Inc. (Alabaster, AL)からのものである。Ｆ.ＩＸａ色素生産性基質＃２
９９はAmerican Diagnostica(Greenwich, CT)から、ＦＸａ色素生産性基質Ｓ-２
７６５はDiapharma Group社(Columbus, Ohio)からのものである。インノビンはD
ade International社（Miami, FL）から入手した。エチレングリコール（分析用
グレード）はMallinckrodt社（Paris, KY）からのものである。無脂肪酸ＢＳＡ
はCalbiochem（Calbiochem-Novabiochem社, La Jolla, CA）。細胞質ドメインの
ないＴＦ(１−２３４)は記載されるようにして（Paborsky等, (1989) Biochemis
try 28:8072; Paborsky等, (1991) J. Biol. Chem. 266:1911）入手し、Mimms等
, (1981) Biochemistry 20:833-840に従ってＰＣ/ＰＣ（７：３モル比）で再脂
質化した。
【００８４】 膜組織因子（ｍＴＦ）：ＦＶＩＩａ複合体によるＦＩＸの活性化 全長ＴＦ（１−２６３）を発現するヒト胎児腎細胞株（２９３）から膜ＴＦ（
ｍＴＦ）を用意した（Kelley等, Blood 89: 3219-3227[1997]）。細胞をＰＢＳ
で洗浄し、10mMのＥＤＴＡで分離し、２回遠心分離した（2500rpm、１０分間）
。細胞のペレット（４−５ｘ１０７細胞/ml）をトリス、ｐＨ７．５に再懸濁し
、ＰＢＳ中にペッスルホモジナイザーを用いて均質化し、続いて４℃で４０分間
遠心分離した（Beckman GSAにおいて2500rpm）。細胞膜分画のタンパク質濃度を
測定し、膜を使用するまで等分して−８０℃で保存した。 Ｆ.ＩＸを添加する前に、抗体をマイクロタイターチューブ（8.8x45mm、ＯＰ
Ｓ、Petaluma、CA）でＨＢＳＡ（20mMのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、150mMのＮａ
Ｃｌ、5mMのＣａＣｌ２、0.5mg/mlのＢＳＡ）中のｍＴＦ及びＦＶＩＩａと共に
室温で２０分間インキュベートした。反応混合物中の反応物の最終濃度は次のと
おりであった：ＨＢＳＡ中、150μg/mlのｍＴＦ（膜タンパク質濃度）、2nMのＦ
ＶＩＩａ及び400nMのＦ.ＩＸ。100μlに等分した反応混合物を３０秒間隔で採取
し、30mMのＥＤＴＡ-緩衝液-60%(v/v)エチレングリコールを125μl含む９６穴プ
レート（Costar, Corning社, Corning, NY）で停止させた。5mMのＦ.ＩＸ基質＃
２９９を25μl加えた後、Ｆ.ＩＸａアミド分解活性を比色マイクロプレートリー
ダー（Molecular Devices, Menlo Park, CA）において405nmで測定した。試験し
た抗体による阻害をＦ.ＩＸａ生成の配分率（ｖｉ/ｖｏ）として表した。
【００８５】 ｍＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体によるＦＸの活性化 Ｆ.ＩＸ活性化について記載されるものと同様の方法で実験を実施した。反応
混合物中の反応物の濃度は次の通りであった：ＨＢＳＡ中、200nMのＦＸ、150μ
g/mlのｍＴＦ、30pMのＦＶＩＩａ。３０秒間隔で50μlのアリコットを150μlの2
0mMＥＤＴＡで停止させ、ＦＸａアミド分解活性を1.5mMのＳ-２７６５を50μl加
えて測定した。
【００８６】 結果 ヒトフレームワーク（ＶＬκサブグループＩ、ＶＨサブグループＩＩＩ）にマ
ウスＤ３ ＣＤＲｓを移すことにより（Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
89:4285-4289[1992]; Presta等, Cancer Res. 57:4593-4599[1997]）ヒトＴＦへ
の結合を欠くＦ(ａｂ)となった。マウスＤ３ Ｆ(ａｂ)のコンピューターグラフ
ィックモデルに基づき（図７）、軽鎖及び重鎖のフレームワーク領域及びＣＤＲ
ｓの幾つかのアミノ酸残基を、部位特異的突然変異誘発により抗原結合を最大に
するために変化させた。従って作成した抗体は、Ｄ３Ｈ４４ Ｆ(ａｂ)となり、
プロトロンビン時間アッセイ、図１０−１２を含む生物学的なアッセイのすべて
において適した結合及び効果を示した。Ｄ３Ｈ４４は、重鎖のフレームワークで
ヒトからマウスへの４つの変化を有する：Ｇｌｙ Ｈ４９、Ａｌａ Ｈ６７、Ａｌ
ａ Ｈ７１、及びＡｌａ Ｈ７８（図８）。また、Ｄ３Ｈ４４は、ヒトからマウス
への軽鎖のフレームワークにおいて１つの変化、Ｔｙｒ Ｌ７１を有し、並びに
一つの変化はヒト又はマウスのどちらでもない変化、Ｖａｌ Ｌ４６を有する。
ＣＤＲｓにおいて、Ｄ３Ｈ４４はマウスＤ３の親と７つの違い：Ｇｌｕ Ｈ３１
（ＣＤＲ-Ｈ１）、Ｌｅｕ Ｈ５０及びＧｌｎ Ｈ５４（ＣＤＲ-Ｈ２）、Ａｒｇ
Ｌ２４及びＡｓｎ Ｌ３４（ＣＤＲ-Ｌ１）、Ｇｌｕ Ｌ５６（ＣＤＲ-Ｌ２）、
及びＴｒｐ Ｌ９６（ＣＤＲ-Ｌ３）を有していた（図８、９）。 ｈｕＴＦ-ＴＦ８-５Ｇ９の結晶構造（Huang等, J.Mol. Biol. 275: 873-894[1
998]）は公的なプロテインデータバンク結晶構造データベース（座標ＰＤＢ１Ａ
ＨＷ）で入手可能であるので、キメラＤ３ Ｆ(ａｂ)の配列の幾つかをＴＦ８-５
Ｇ９のものに変える影響が調査された。まず、ＣＤＲ-Ｈ３の３つの残基を変え
た：Ｄ３Ｃｈ Ｔｈｒ９６-Ａｌａ９７-Ａｌａ９８からＴＦ８ Ａｓｎ９６-Ｓｅ
ｒ９７-Ｔｙｒ９８。これは、結合において２０倍減少させるという結果となっ
た（20.3±0.69、ｎ＝２）。これらのＣＤＲ-Ｈ３残基は結晶構造中のｈｕＴＦ
と相互作用し、結合の重大な減少は意外であった。第２に、ＣＤＲ-Ｈ２ Ｄ３Ｃ
ｈにおいて、Ａｓｐ Ｈ６５はＴＦ８ Ｇｌｙに変化し；結合は１４倍まで減少し
た（14.2±2.7、ｎ＝３）。ｈｕＴＦ-ＴＦ８結晶構造の検査では、残基Ｈ６５が
ｈｕＴＦと接していないことが示され、Ｇｌｙへの変化は結合に影響していなか
った。まとめると、これらのデータは、Ｄ３抗体がＴＦ８-５Ｇ９と同じ方法で
はｈｕＴＦと結合しないことを示唆する。 抗組織因子抗体（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４及びＩｇＧ４ｂ）の組織因子
への結合は、図１６に示す。各大腸菌は、ＩｇＧ１を産生し、ＣＨＯはＩｇＧ２
、ＩｇＧ４及びＩｇＧ４ｂを産生し、固定したＴＦに結合していた。
【００８７】 Ｄ３Ｈ４４抗体の全長バージョン及びＦ(ａｂ')２バージョンによるＦ.Ｘ及び
Ｆ.ＩＸ活性化率の抑制を表３に示す。
【表３】 抗体をrelip.ＴＦ(１−２３４)（0.04nM）及びＦ.ＶＩＩａ（0.04nM）と２０
分間インキュベートし、Ｆ.Ｘ（200nM）を添加して反応を開始させた。異なる時
点で等分量を採り、ＥＤＴＡで停止した。アッセイの第２の段階で、Ｆ.Ｘａの
活性を色素生産性基質Ｓ２７６５を添加することによって測定し、比色マイクロ
プレートリーダーにおいて405nMで吸光度を測定した。ＩＣ５０値を、抗体濃度
に対する初期基質活性化率の部分活性（ｖｉ/ｖｏ）を用いて非直線曲線に当て
はめることにより計算した。Ｆ.ＩＸアッセイにおいて、反応物の濃度は1nMのre
lip.ＴＦ(１−２３４)、1nMのＦＶＩＩａ、400nMのＦ.ＩＸであった。等分量の
反応物をＥＤＴＡ-60%（ｖ/ｖ）エチレングリコールで停止した。アッセイの第
２段階で、Ｆ.ＩＸａ活性を色素生産性基質＃２９９を添加して測定し、比色マ
イクロプレートリーダーにおいて405nMで吸光度を測定した。ＩＣ５０値をＦ.Ｘ
について前述するようにして計算した。 Ｄ３Ｈ４４の全長バージョン及びＦａｂ及びＦ(ａｂ')２バージョンの凝固時
間の延長は図１７に示す。 実施例を含む明細書を通して記載される全ての文献、及びその中に記載される
全ての文献を、明示によりここに取り込む。
【図面の簡単な説明】
【図１】 抗組織因子抗体の阻害特性。（ａ）小さな合成基質クロモザイム
（Chromozym）ｔ-ＰＡに対するｓＴＦ：ＦＶＩＩａのアミド分解活性。抗体を、
ＨＢＳ緩衝液中のｓＴＦ（10nM）及びＦＶＩＩａ（10nM）、５ｍＭのＣａＣｌ２ と共に１５分間インキュベートした。クロモザイムｔ-ＰＡ（0.5mM）を加え、基
質切断率を測定した。結果は、コントロール割合のパーセンテージで表した（３
実施例の平均±ＳＤ）。（ｂ）抗ＴＦ抗体によるヒト血漿凝固の延長。抗体をＴ
Ｆ試薬（インノビン(Innovin)）と共に１５分間インキュベートし、ヒトクエン
酸血漿に加えた。凝固時間の増加は、抗体存在下での凝固時間と基準値の比率と
して記載している。結果は２つの独立した実験の平均値である。（塗り潰した円
）Ｄ３、（白抜きの円）Ｄ３ Ｆａｂ、（ｘ）５Ｇ６、（塗り潰した四角）７Ｇ
１１、（白抜きの四角）６Ｂ４、（塗り潰した三角）ＨＴＦ１、（白抜きの三角
）アイソタイプに整合させたコントロールＡｂ。
【図２】 ヒトエキソビボ血流システムにおける抗ＴＦ抗体による線維素ペ
プチドＡ合成の阻害（ＦＰＡ）。血漿中のＦＰＡ濃度をコントロールの値に対す
る割合で表す。各値はＤ３ Ｆａｂ及び５Ｇ６の最も高い濃度（それぞれｎ＝１
及びｎ＝２）及び２つの６Ｂ４の濃度（1.5μg/ml及び15μg/mlについてｎ＝２
）以外は３−８の実験の平均値である。全てのコントロール値の平均（ｎ＝３６
）は、1348.6±46.1ng/ml（±ＳＥＭ）であった。塗り潰した円、Ｄ３；白抜き
の円、Ｄ３ Ｆａｂ；ｘ、５Ｇ６；白抜きの四角、６Ｂ４；塗り潰した三角、Ｈ
ＴＦ１。
【図３】 ヒト血漿中のＴＦ依存性ＦＸ活性化における抗組織因子抗体の影
響。４５秒の初期フェーズの間のＦＸａ生成の阻害率を計算し、分画の活性（ｖ
ｉ/ｖｏ）として表した。（塗り潰した円）Ｄ３、（ｘ）５Ｇ６、（塗り潰した
四角）７Ｇ１１、（白抜きの四角）６Ｂ４、（塗り潰した三角）ＨＴＦ１、（白
抜きの三角）アイソタイプに整合させたコントロールＡｂ。
【図４】 抗組織因子抗体によるプロトロンビン時間（ＰＴ）の延長。凝固
時間の延長は、抗体存在下の凝固時間と基準値の割合として記載する。結果は２
つの独立した実験の平均値である。（塗り潰した円）Ｄ３、（ｘ）５Ｇ６、（塗
り潰した四角）７Ｇ１１、（白抜きの四角）６Ｂ４、（塗り潰した三角）ＨＴＦ
１。
【図５】 抗体結合のｓＴＦ突然変異の影響。結合親和性における変化をｓ
ＴＦ突然変異及びｓＴＦ野生型のＫＤ率（ＫＤ(mut)/ＫＤ(wt)）として表す。ＫＤ 値は固定した抗体での表面プラスモン共鳴測定から計算した。
【図６】 ｓＴＦ：ＦＶＩＩａ複合体の結晶構造における抗体エピトープの
局在性。ＦＶＩＩａは軽鎖を橙に及び重鎖を緑に着色した。活性部位阻害剤（Ｄ
-Ｐｈｅ-Ｌ-Ｐｈｅ-Ａｒｇクロロメチルケトン）が赤、カルシウム原子が黄色で
ある。組織因子（灰色）は提示に利用できる溶媒中にあり、抗体エピトープ残基
は赤色で示される。図はInsight II（MSI社、サンディエゴ）を用いて作成した
。
【図７】 マウスＤ３ Ｆ(ａｂ)の結晶構造。ＶＨ（濃い灰色）及びＶＬ（薄
い灰色）骨格のリボン図を示す。ヒト化の間に変化した又は調査した残基の側鎖
を示し、標識した；側鎖窒素及び酸素は濃い灰色である。球形は、２つの内部水
分子を表す。
【図８】 マウスＤ３（Ｄ３Ｍｕｒ）、コンセンサスヒトサブグループＩＩ
Ｉ（ＨｕｍＶＨＩＩＩ）、及びヒト化Ｄ３Ｈ４４のＶＨドメインの配列。ＣＤＲ
は下線で示し、配列間の違いは*で記載される。ＣＤＲは、ＣＤＲ-Ｈ１を除いて
はKobat等, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Publi
c Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD(1991)により
定義され、ＣＤＲ-Ｈ１はKobat等, (上掲)とChothia等, Nature 342:877-833(19
89)のＣＤＲ-Ｈ１の定義の組み合わせを用いて定義し、即ち、ＣＤＲ-Ｈ１は重
鎖の残基Ｈ２６−Ｈ３５の範囲として定義した。
【図９】 マウスＤ３（Ｄ３Ｍｕｒ）、コンセンサスヒトκサブグループＩ
（ＨｕｍκＩ）、及びヒト化Ｄ３Ｈ４４のＶＬドメインの配列。ＣＤＲは下線で
示し、配列間の違いは*で記載される。残基の番号付けは、Kobat等(1991), 上掲
に従う。
【図１０】 膜ＴＦ（ｍＴＦ）：ＦＶＩＩａ複合体を用いた抗体Ｆ(ａｂ)に
よるＦＸ活性化率の抑制。抗体をｍＴＦと共にインキュベートし、ＦＸの２０分
前にＦＶＩＩａを加えた。等分量を異なる時点で採取し、20mMのＥＤＴＡで停止
させた。アッセイの第２段階では、染色基質Ｓ-２７６５を添加し、アミド分解
活性を比色マイクマイクロプレートリーダー、405nmで測定した。初期率が計算
され、抑制はＦＸａ生成の配分率（vi/vo）として表した。
【図１１】 膜ＴＦ（ｍＴＦ）：ＦＶＩＩａ複合体を用いた抗体Ｆ(ａｂ)に
よるＦ.ＩＸ活性化率の抑制。抗体は、ｍＴＦを用いてインキュベートしＦ.ＩＸ
の２０分前にＦＶＩＩａを加えた。等分量を異なる時点で採取し、30mMのＥＤＴ
Ａ-６０％のエチレングリコールで停止した。アッセイの第２段階では、染色基
質＃２９９を添加し、アミド分解活性を比色マイクマイクロプレートリーダー、
405nmで測定した。初期率が計算され、抑制はＦＩＸａ生成の配分率（vi/vo）と
して表した。
【図１２】 ヒト血漿でのプロトロンビン時間（ＰＴ）における抗体Ｆ(ａ
ｂ)及びＦ(ａｂ')２の影響。Ｄ３Ｃ２（キメラＦ(ａｂ)）、Ｄ３Ｈ１８、Ｄ３Ｈ
３１、Ｄ３Ｈ４４のＦ(ａｂ)及びＤ３Ｈ４４のＦ(ａｂ')２を発現する大腸菌を
、ヒト血漿中で５分間インキュベートした。ヒト組織因子剤（Ｉｎｎｏｖｉｎ）
の添加により凝固が開始された。凝固時間をＡＣＬ３００機で測定した。凝固時
間の延長を、抑制された凝固（抗体有り）と非抑制の凝固時間（緩衝液コントロ
ール）の割合として表す。示される抗体濃度は血漿中の濃度である。
【図１３】 ヒト組織因子（ｈＴＦ）のアミノ酸配列（配列番号：１３）。
【図１４】 ヒト組織因子の細胞外部分の構造のリボン図。
【図１５】 マウス抗ＴＦ抗体５Ｇ６の重鎖可変ドメイン配列（配列番号：
５）。マウス抗ＴＦ抗体５Ｇ６の軽鎖可変ドメイン配列（配列番号：６）。
【図１６】 抗組織因子抗体の組織因子への結合。ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、Ｉ
ｇＧ４及びＩｇＧ４ｂ。
【図１７】 Ｄ３Ｈ４４の全長バージョンとＦａｂ及びＦ(ａｂ')２バージ
ョンのヒト血漿凝固時間（ＰＴ）の延長。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 9/10 9/10 １０１ １０１ 11/00 11/00 29/00 29/00 31/04 31/04 35/04 35/04 43/00 １１１ 43/00 １１１ Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 19/00 19/00 Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｎ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 5/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ， ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，Ｊ Ｐ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ， ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 プレスタ，レオナード，ジー． アメリカ合衆国 カリフォルニア 94109， サン フランシスコ，ガウ ストリート 1900 206号室 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA53 BA61 CA04 CA07 CA20 DA06 EA04 GA11 HA03 4B064 AG26 CA02 CA19 CC01 CC24 CE02 CE12 DA01 DA13 4B065 AA26X AA58X AA72X AA87X AA91Y AA93Y AB01 AC14 BA02 BB01 BC03 BC26 BD01 BD14 CA25 CA44 CA46 4C085 AA13 AA14 AA16 BB11 CC22 CC23 EE01 GG01 GG03 GG06 4H045 AA11 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA76 EA20 EA50 FA74 GA01 GA26

Claims (43)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 増強された抗凝固能を持つ抗組織因子（抗ＴＦ）抗体を同定
    する方法であって、（ａ）複数の抗ＴＦ抗体でエピトープマッピングを行い、（
    ｂ）組織因子（ＴＦ）のＣ末端巨大分子基質結合領域の少なくとも部分を含むエ
    ピトープに結合する抗体を前記複数の中から選択することを含む方法。
  2. 【請求項２】 前記ＴＦが、ヒト（ｈＴＦ）である請求項１の方法。
  3. 【請求項３】 前記巨大分子基質が、因子Ｘ（Ｆ.Ｘ）又は因子ＩＸ（Ｆ.Ｉ
    Ｘ）である請求項２の方法。
  4. 【請求項４】 前記エピトープが、Ｆ.Ｘ又はＦ.ＩＸと直接相互作用するｈ
    ＴＦ領域を含む請求項３の方法。
  5. 【請求項５】 前記領域が、前記Ｆ.Ｘ又はＦ.ＩＸのＧｌａドメインと相互
    作用する残基を含む請求項４の方法。
  6. 【請求項６】 前記エピトープが、ｈＴＦの残基Ｋ１６５、Ｋ１６６及びＫ
    ２０１を含む請求項２の方法。
  7. 【請求項７】 前記エピトープが、更にｈＴＦの残基Ｎ１９９、Ｒ２００及
    びＩ１５２を含む請求項６の方法。
  8. 【請求項８】 前記エピトープが、更にｈＴＦの残基Ｙ１５６を含む請求項
    ６の方法。
  9. 【請求項９】 選択された少なくとも１つの抗体が、Ｄ３、５Ｇ６及びＴＦ
    ８-５Ｇ９からなる群から選択される抗体と本質的に同じｈＴＦエピトープに結
    合する請求項２の方法。
  10. 【請求項１０】 選択された少なくとも１つの抗体が、抗体Ｄ３と本質的に
    同じｈＴＦエピトープに結合する請求項２の方法。
  11. 【請求項１１】 選択された少なくとも１つの抗体が、抗体５Ｇ６と本質的
    に同じｈＴＦエピトープに結合する請求項２の方法。
  12. 【請求項１２】 選択された少なくとも１つの抗体が、ｈＴＦ-因子ＶＩＩ
    ａ（ＦＶＩＩａ）結合を妨げない請求項２の方法。
  13. 【請求項１３】 前記抗体がヒト化である請求項２の方法。
  14. 【請求項１４】 前記抗体がヒトである請求項２の方法。
  15. 【請求項１５】 請求項２の方法に従って同定された抗体を製薬的に許容可
    能な担体との混合物中に含む組成物。
  16. 【請求項１６】 請求項２の方法に従って同定された抗体の投与を含む、Ｔ
    Ｆ-ＦＶＩＩａが関連する過程又は現象を阻害するための方法。
  17. 【請求項１７】 請求項２の方法に従って同定された抗ＴＦ抗体の有効量を
    個体に投与することを含む、ＴＦ-ＶＩＩａ関連疾患又は障害を治療するための
    方法。
  18. 【請求項１８】 前記疾患又は障害が、血栓症又は凝固障害である請求項１
    ７の方法。
  19. 【請求項１９】 配列番号：１又は配列番号：２のアミノ酸配列を含む、抗
    組織因子（抗ＴＦ）抗体重鎖可変ドメイン。
  20. 【請求項２０】 配列番号：３又は配列番号：４のアミノ酸配列を含む、抗
    組織因子（抗ＴＦ）軽鎖可変ドメイン。
  21. 【請求項２１】 配列番号：５のアミノ酸配列を含む、抗組織因子（抗ＴＦ
    ）重鎖可変ドメイン。
  22. 【請求項２２】 配列番号：６のアミノ酸配列を含む、抗組織因子（抗ＴＦ
    ）軽鎖可変ドメイン。
  23. 【請求項２３】 配列番号：１、２又は５の抗ＴＦ抗体重鎖可変ドメインを
    コードする配列を含む単離された核酸。
  24. 【請求項２４】 配列番号：３、４又は６の抗ＴＦ抗体軽鎖可変ドメインを
    コードする配列を含む単離された核酸。
  25. 【請求項２５】 重鎖及び軽鎖可変ドメインを含むヒト化抗組織因子（抗Ｔ
    Ｆ）抗体であって、重鎖可変ドメインがＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨ（配列番号：７）
    の配列を有する超可変領域ＣＤＲ-Ｈ１、ＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤ
    （配列番号：８）の配列を有するＣＤＲ-Ｈ２及びＤＴＡＡＹＦＤＹ（配列番号
    ：９）の配列を有するＣＤＲ-Ｈ３である抗体。
  26. 【請求項２６】 超可変領域が、ヒトフレームワーク領域に提供される、請
    求項２５のヒト化抗ＴＦ抗体。
  27. 【請求項２７】 配列番号：２の重鎖可変ドメインを含む、請求項２６のヒ
    ト化抗ＴＦ抗体。
  28. 【請求項２８】 前記軽鎖可変ドメインが、ＲＡＳＲＤＩＫＳＹＬＮ（配列
    番号：１０）の配列を有する超可変領域ＣＤＲ-Ｌ１、ＹＡＴＳＬＡＥ（配列番
    号：１１）の配列を有するＣＤＲ-Ｌ２及びＬＱＨＧＥＳＰＷＴ（配列番号：１
    ２）の配列を有するＣＤＲ-Ｌ３を含む、請求項２５のヒト化抗ＴＦ抗体。
  29. 【請求項２９】 前記超可変領域が、ヒトフレームワーク領域に提供される
    、請求項２８のヒト化抗ＴＦ抗体。
  30. 【請求項３０】 配列番号：４の軽鎖可変ドメインを含む、請求項２９のヒ
    ト化抗ＴＦ抗体。
  31. 【請求項３１】 （ａ）マウス抗体Ｄ３（Ｄ３Ｍｕｒ）、（ｂ）ヒト化抗体
    Ｄ３Ｈ４４、（ｃ）マウス抗体５Ｇ６、及び（ｄ）（ａ）−（ｃ）の抗体の何れ
    か１つと本質的に同一の超可変領域を含む抗体からなる群から選択される抗体。
  32. 【請求項３２】 ＧＦＮＩＫＥＹＹＭＨ（配列番号：７）の配列を有する超
    可変領域ＣＤＲ-Ｈ１、ＬＩＤＰＥＱＧＮＴＩＹＤＰＫＦＱＤ（配列番号：８）
    の配列を有するＣＤＲ-Ｈ２及びＤＴＡＡＹＦＤＹ（配列番号：９）の配列を有
    するＣＤＲ-Ｈ３を含むヒト化抗体重鎖可変ドメイン、又はＲＡＳＲＤＩＫＳＹ
    ＬＮ（配列番号：１０）の配列を有する超可変領域ＣＤＲ-Ｌ１、ＹＡＴＳＬＡ
    Ｅ（配列番号：１１）の配列を有するＣＤＲ-Ｌ２及びＬＱＨＧＥＳＰＷＴ（配
    列番号：１２）の配列を有するＣＤＲ-Ｌ３を含むヒト化抗体軽鎖可変ドメイン
    をコードする配列を含む単離された核酸分子。
  33. 【請求項３３】 請求項３２の核酸を含み、発現能力のあるベクター。
  34. 【請求項３４】 請求項３３のベクターで形質転換した組み換え宿主細胞。
  35. 【請求項３５】 組み換え宿主細胞に、抗体の重鎖又は軽鎖をコードし、請
    求項３２の超可変領域を含む核酸を発現させることを含む、ヒト化抗体重鎖又は
    軽鎖を作成する方法。
  36. 【請求項３６】 抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子が、前記組み換
    え宿主細胞に共発現される請求項３５の方法。
  37. 【請求項３７】 請求項１の方法により同定可能な抗組織因子（抗ＴＦ）抗
    体を、製薬的に許容可能な担体との混合物中に含む組成物。
  38. 【請求項３８】 前記抗体が、抗ヒトＴＦ（抗ｈＴＦ）抗体である請求項３
    ７の組成物。
  39. 【請求項３９】 前記抗体が、ヒト化されている請求項３８の組成物。
  40. 【請求項４０】 （ａ）マウス抗体Ｄ３（Ｄ３Ｍｕｒ）、（ｂ）ヒト化抗体
    Ｄ３Ｈ４４、（ｃ）マウス抗体５Ｇ６、及び（ｄ）抗体（ａ）−（ｃ）の何れか
    １つと本質的に同一の超可変領域を含む抗体からなる群から選択される抗体を、
    製薬的に許容可能な担体との混合物として含む組成物。
  41. 【請求項４１】 請求項２５の抗組織因子（抗ＴＦ）抗体の有効量を対象に
    投与することを含む、ＴＦ-ＦＶＩＩａ関連疾患又は障害の予防又は治療の方法
    。
  42. 【請求項４２】 前記障害が、血栓症及び凝固障害である請求項４１の方法
    。
  43. 【請求項４３】 前記障害が：深部脈管血栓症、動脈血栓症、発作、腫瘍転
    移、血栓溶解、動脈硬化症及び血管形成術後の再狭窄、急性および慢性の徴候、
    例えば炎症、敗血症ショック、毒血症、低血圧、成人呼吸困難症候群（ＡＲＤＳ
    ）、及び汎発性血管内血液凝固（ＤＩＣ）からなる群から選択される請求項４２
    の方法。
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