BR112012031727B1 - Conjugado de droga-anticorpo, composição farmacêutica, e, uso do conjugado de droga- anticorpo - Google Patents

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Abstract

CONJUGADO DE DROGA-ANTICORPO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, E, USOS DO CONJUGADO DE DROGA-ANTICORPO. São revelados os conjugados de droga-anticorpo contra o fator tecidual. São também reveladas as composições farmacêuticas que compreendem os anticorpos e os conjugados de droga- anticorpo, e métodos terapêuticos e de diagnósticos para usar os anticorpos e os conjugados de droga-anticorpo.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção se refere aos conjugados de droga- anticorpo (ADCs), onde os anticorpos se ligam a um epítopo no fator tecidual. Tais ADCs são usados, em particular, no tratamento de câncer, inflamação e doenças vasculares.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] O fator tecidual (TF), também denominado tromboplastina, fator III ou CD142, é uma proteína presente no tecido subendotelial, plaquetas e leucócitos necessários para o início da formação de trombina a partir do zimogênio protrombina. A formação de trombina, por fim, leva à coagulação do sangue. O fator tecidual possibilita que as células iniciem a cascata de coagulação do sangue e as suas funções como o receptor de alta afinidade para o fator de coagulação VII (FVII), uma serina protease. O complexo resultante fornece um evento catalítico que é responsável pelo início da protease das cascatas de coagulação por proteólise limitada específica. Diferentes de outros cofatores destas cascatas de protease, que circulam como precursores não funcionais, este fator é um iniciador potente que é completamente funcional quando expresso em superfícies celulares.
[0003] O fator tecidual é o receptor de superfície celular para o fator serina protease VIIa (FVIIa). A ligação de FVIIa ao fator tecidual inicia os processos de sinalização dentro da célula, a dita função de sinalização desempenhado um papel na angiogênese. Ao passo que a angiogênese é um processo normal no crescimento e desenvolvimento, bem como na cicatrização de ferida, também é uma etapa fundamental na transição de tumores de um estágio latente para um estágio maligno: quando as células cancerígenas adquirem a capacidade de produzir proteínas que participam da angiogênese, os assim denominados fatores de crescimento angiogênicos, estas proteínas são liberadas pelo tumor em tecidos próximos e estimulam novos vasos sanguíneos a brotar a partir de vasos sanguíneos saudáveis existentes e no tumor. Uma vez que novos vasos sanguíneos entram no tumor, este pode expandir rapidamente seu tamanho e invadir o tecido e órgãos locais. Através dos novos vasos sanguíneos, as células cancerígenas podem escapar adicionalmente na circulação e se alojar em outros órgãos para formar novos tumores (metástases).
[0004] Adicionalmente, TF desempenha um papel na inflamação. Entende-se que o papel de TF deve ser mediado por coagulação do sangue (A. J. Chu: "Tissue factor mediates inflammation" em Archives of biochemistry and biophysics, 2005, vol. 440, No. 2, pp. 123-132). Dessa maneira, a inibição de TF, por exemplo, por um anticorpo anti-TF monoclonal é significativa na interrupção do ciclo coagulação-inflamação em contribuição não apenas para anti-inflamação, mas também para as doenças vasculares.
[0005] A expressão de TF é observada em muitos tipos de câncer e está associada com doença mais agressiva. Além do mais, o TF humano também existe em uma forma solúvel alternativamente ligada, asHTF. Observa-se recentemente que asHTF promove o crescimento de tumor (Hobbs et al., 2007 Thrombosis Res. 120(2) S13-S21).
[0006] Embora muito progresso tenha sido realizado, ainda permanece uma necessidade por melhores métodos de tratar doenças graves, por exemplo, melhor tratamento de câncer, inflamação e doença vascular baseado em anticorpos terapêuticos.
[0007] Dessa maneira, é um objetivo da presente invenção fornecer conjugados de droga-anticorpo anti-TF muito específicos e eficientes, em particular para o uso no tratamento de câncer.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] A presente invenção se refere aos conjugados de droga- anticorpo anti-TF inéditos que são usados para o tratamento de câncer, inflamação e doenças vasculares. Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção são muito eficientes em matar células que expressam o fator tecidual (TF). Além do mais, os conjugados de droga-anticorpo anti-TF são vantajosos por apresentarem nenhuma ou inibição de coagulação limitada. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[0009] A figura 1 mostra o alinhamento de sequências dos anticorpos da presente invenção. As SEQ ID NOs são listadas entre parênteses à direita da sequência. As CDR1, CDR2 e CDR3 de acordo com Kabat são indicadas da maneira a seguir: sequências em itálico e negrito representam a região CDR1, as sequências sublinhadas representam a região CDR2, as sequências em negrito representam a região CDR3.
[00010] A figura 2 mostra as sequências de IgG4 (SEQ ID NO: 81-82). SEQ ID NO: 81 mostra a sequência de aminoácidos da região CH tipo selvagem de IgG4 humana. As sequências em itálico representam a região CH1, as sequências destacadas representam a região de dobradiça, as sequências regulares representam a região CH2 e as sequências sublinhadas representam a região CH3. SEQ ID NO: 82 mostra a sequência de aminoácidos da região CH sem eixo de uma IgG4 humana.
[00011] A figura 3 mostra a ligação de HuMabs anti-TF ao domínio extracelular de TF. A ligação foi determinada por ELISA. Os valores de EC50 são a média de 3 experimentos.
[00012] A figura 4 mostra a ligação de HuMabs anti-TF ao TF ligado à membrana em células MDA-MD-231. A ligação foi determinada por análise FACS, e os anticorpos foram divididos em três grupos mostrados em a), b) e c), ver também WO 10/066803 onde os anticorpos foram divididos em grupos de bloqueios cruzados.
[00013] A figura 5 mostra a inibição da ligação FVIIa em HuMabs anti-TF, foi medida por análise FACS. Os dados mostrados são intensidades médias de fluorescência (MFI) para a ligação FVIIa na presença de concentrações crescentes de HuMabs anti-TF. A MFI para FVIIa 100 nM na ausência de HuMabs anti-TF foi 149.942. Um experimento representativo é mostrado.
[00014] A figura 6 mostra a indução dose-dependente de eliminação celular por HuMabs anti-TF conjugado com anti-capa-ETA’.
[00015] A figura 7 mostra a ligação de HuMabs anti-TF e ADCs à proteína recombinante do domínio extracelular de TF, determinada por ELISA, Um experimento representativo é mostrado.
[00016] A figura 8 mostra a indução dose-dependente in vitro de eliminação celular por ADCs anti-TF. Um experimento representativo é mostrado para cada linhagem celular: A431 (a), HPAF-II (b) e NCI-H441 (c). Os dados mostrados são sobrevivência percentual ± S.E.M. de poços duplicados de células tratadas com ADCs anti-TF.
[00017] A figura 9 mostra a eficiência in vivo de ADCs anti-TF no tratamento terapêutico de xenoenxertos de A431 e HPAF-II em camundongos SCID. Os camundongos com tumores estabelecidos por A431 (a) ou HPAF-II (B) foram tratados com ADCs anti-TF. Os dados mostrados são volumes de tumor médio ± S. E. M por grupo (n = 7 camundongos por grupo),
[00018] A figura 10 mostra a análise SDS-PAGE de ADCs e IgG1 não conjugada para testar a estabilidade. As amostras foram analisadas por SDS- PAGE no início do estudo (t=0) (a-d), ou após armazenamento a 5 °C e < -65 °C por três meses (e-h), (a, c) canaleta 1, 9: marcador de peso molecular (MW), canaleta 2: controle interno com IgG1, canaleta 3: HuMab-TF-098, canaleta 4: HuMab-TF-098-vcMMAE, canaleta 5; HuMab-TF-098- mcMMAF, canaleta 6: HuMab-TF-0U, canaleta 7: HuMab-TF-011- vcMMAE, canaleta 8: HuMab-TF-mcMMAF. (b, d) canaleta 1, 9, 10: marcador MW, canaleta 2: controle interno com IgG1, canaleta 3: HuMab- TF-111, canaleta 4: HuMab-TF-111-vcMMAE, canaleta 5: HuMab-TF-111- mcMMAF, canaleta 6: IgG1-b12, canaleta 7: IgG1 -b12-vcMMAE, canaleta 8: IgG1 -b 12 -mcM M AF. (e, g) canaleta 1, 11: marcador MW, canaleta 2: controle interno com IgG1, canaleta 3; HuMab-TF-098-vcMMAE após 3 meses a < -65 °C, canaleta 4: HuMab-TF-098-vcMMAE após 3 meses a 5 °C, canaleta 5: HuMab-TF-098-mcMMAF após 3 meses a < -65 °C, canaleta 6; HuMab-TF-098-mcMMAF após 3 meses a 5 °C, canaleta 7: HuMab-TF-011- vcM MAE após 3 meses a < -65 °C, canaleta 8: HuMab-TF-011-vcMMAE após 3 meses a 5 °C, canaleta 9: HuMab-TF-011-mcMMAF após 3 meses a < -65 °C, canaleta 10: HuMab-TF-011-mcMMAF após 3 meses a 5 °C. (f, h) canaleta 1, 11, 12: marcador MW, canaleta 2: controle interno com IgG1, canaleta 3: HuMab-TF-111-vcMMAE após 3 meses a < -65 °C, canaleta 4: HuMab-TF-111-vcMMAE após 3 meses a 5 °C, canaleta 5: HuMab-TF-111- mcMMAF após 3 meses a < -65 °C, canaleta 6: HuMab-TF-111 -mcMMAF após 3 meses a 5 °C, canaleta 7: IgG1-b12-vcMMAE após 3 meses a < -65 °C, canaleta 8: IgG1-b12-vcMMAE após três meses a 5 °C, canaleta 9: IgG1- b12-mcMMAF após 3 meses a < -6S °C, canaleta 10: IgG1-b12-mcMMAF após 3 meses a 5 °C. Para condições não redutoras, os tamanhos de diferentes combinações de cadeia pesada (H) -cadeia leve (L) são indicados: 148 kDa (HHLL), 125 kDa (HHL), 99 kDa (HH), 67 kDa (ML), 51 kDa (H) e 25 kDa (L).
[00019] A figura 11 mostra os perfis de cromatografia de exclusão por tamanho de alto desempenho (HP-SEC) de HuMab-TF-098-vcMMAE (a), HuMab-TF-098-mcMMAF (b), HuMab-TF-011-vcMMAE (c), HuMab-TF- 011-mcMMAF (d), HuMab-TF-111-vcMMAE (e), HuMab-TF-111- mcMMAF (f), IgG1-b12-vcMMAE (g) e IgG1-b12-mcMMAF (h) no início do estudo e após armazenamento a < -65 °C ou 5 °C por três meses.
[00020] A figura 12 mostra o ensaio de ligação de ADCs e IgG1 não conjugada a TF-ECDHis para testar a estabilidade. As amostras foram analisadas por ligação no início do estudo (t=0) ou após armazenamento a 5 °C e < -65 °C por três meses.
[00021] A figura 13 mostra a resposta à dose in vivo de ADCs anti-TF no tratamento terapêutico de xenoenxertos de HPAF-II em camundongos SCID. Os camundongos com tumores estabelecidos por HPAF-II foram tratados com ADCs vcMMAE anti-TF. Os dados mostrados são volumes médios do tumor ± S.E.M. por grupo (n = 8 camundongos por grupo).
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Definições
[00022] Os termos "fator tecidual", "TF", "CD142", "antígeno de fator tecidual", "antígeno de TF" e "antígeno de CD142" são usados aqui indiferentemente e, a menos que de outra forma especificada, incluem quaisquer variantes, isoformas e homólogos de espécie de fator tecidual humano, que são naturalmente expressos por células ou são expressos em células transfectadas com o gene de fator tecidual. O fator tecidual pode ser a sequência de acesso ao Genbank NP_001984 usada no exemplo 1.
[00023] O termo "imunoglobulina" refere-se a uma classe de glicoproteínas estruturalmente relacionadas, que consistem em dois pares de cadeias de polipeptídeo, um par de cadeias leves (L) de baixo peso molecular e um par de cadeias pesadas (H), todas as quatro interconectadas por pontes dissulfeto. A estrutura de imunoglobulinas é bem caracterizada. Ver, por exemplo, Fundamental Immunology Ch. 7 (Paul, W., ed., 2a ed. Raven Press, N.Y. (1989)). Resumidamente, cada cadeia pesada é compreendida tipicamente de uma região variável de cadeia pesada (aqui abreviada como VH ou VH) e uma região constante de cadeia pesada (CH ou CH). A região constante de cadeia pesada é compreendida tipicamente de três domínios, CH1, CH2, e CH3. Cada cadeia leve é compreendida tipicamente de uma região variável de cadeia leve (aqui abreviada como VL ou VL) e uma região constante de cadeia leve (CL ou CL). A região constante de cadeia leve é compreendida tipicamente de um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade (ou regiões hipervariáveis, que podem ser hipervariáveis na sequência e/ou forma de alças definidas estruturalmente), também denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), intercaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões de estrutura (FRs). Cada VH e VL é composta tipicamente de três CDRs e quatro FRs, arranjadas a partir da terminação amino para a terminação carbóxi na seguinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4 (ver também Chothia e Lesk J. Mot. Biol. 195, 901-917 (1987)). Tipicamente, a numeração de resíduos de aminoácido nesta região é realizada pelo método descrito em Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) (as frases aqui tais como numeração do resíduo de domínio variável como em Kabat, ou de acordo com Kabat, referem-se a este sistema de numeração para domínios variáveis de cadeia pesada ou domínios variáveis de cadeia leve). Usando este sistema de numeração, a sequência de aminoácidos linear atual de um peptídeo pode conter poucos ou adicionais aminoácidos que correspondem a um encurtamento de, ou inserção em, uma FR ou CDR do domínio variável. Por exemplo, um domínio variável de cadeia pesada pode incluir um inserção de aminoácido único (resíduo 52a de acordo com Kabat) após o resíduo 52 de CDR2 VH e resíduos (por exemplo, resíduos 82a, 82b, e 82c, etc. de acordo com Kabat) após o resíduo 82 da FR de cadeia pesada. A numeração de Kabat de resíduos pode ser determinada para um dado anticorpo por alinhamento em regiões de homologia da sequência do anticorpo com uma sequência numerada Kabat "padrão".
[00024] O termo "anticorpo" (Ab) no contexto da presente invenção refere-se a um molécula de imunoglobulina, um fragmento de uma molécula de imunoglobulina, ou um derivado de cada um destes, que apresenta a capacidade se ligar especificamente a um antígeno em condições fisiológicas típicas com uma meia vida de períodos de tempo significativos, tais como pelo menos cerca de 30 minutos, pelo menos cerca de 45 minutos, pelo menos cerca de uma hora, pelo menos cerca de duas horas, pelo menos cerca de quatro horas, pelo menos cerca de 8 horas, pelo menos cerca de 12 horas, cerca de 24 horas ou mais, cerca de 48 horas ou mais, cerca de 3, 4, 5, 6, 7 ou mais dias, etc., ou qualquer outro período definido funcionalmente relevante (tal como um período suficiente para induzir, promover, melhorar e/ou modular uma resposta fisiológica associada ao anticorpo que se liga ao antígeno, e/ou tempo suficiente para o anticorpo recrutar uma atividade efetora). As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves da molécula de imunoglobulina contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticorpos (Abs) podem mediar a ligação da imunoglobulina com tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (tais como células efetoras) e componentes do sistema complemento tal como C1q, o primeiro componente na via clássica de ativação do complemento. Da maneira indicada anteriormente, o termo anticorpo aqui, a menos que de outra forma declarada ou claramente contradita pelo contexto, inclui fragmentos de um anticorpo que mantêm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno. Observa-se que a função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de tamanho completo. Exemplos de fragmentos de ligação incluídos no termo "anticorpo" incluem (i) um fragmento Fab' ou Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1, ou um anticorpo monovalente da maneira descrita em WO2007059782 (Genmab A/S); (ii) fragmentos F(ab')2, fragmentos bivalentes que compreendem dois fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) um fragmento Fd que consiste essencialmente nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv, que consiste essencialmente nos domínios VL e VH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste essencialmente em um domínio VH e também os denominados anticorpos de domínio (Holt et al; Trends Biotechnol, 2003 Nov;21(11):484-90); (vi) camelídeo ou nanocorpos (Revets et al; Expert Opin Biol Ther. 2005 Jan;5(1): 111-24) e (vii) uma região de determinação de complementaridade (CDR) isolada. Além do mais, embora os dois domínios do fragmento Fv, VL e VH, sejam codificados por genes separados, eles podem ser unidos usando métodos recombinantes por um ligante sintético, que possibilita-os serem preparados como uma cadeia de proteína simples na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas monovalentes (conhecidas como anticorpos de cadeia única ou Fv de cadeia simples (scFv), ver, por exemplo Bird et al., Science 242, 423-426 (1988) e Huston et al., PNAS USA 85, 5879-5883 (1988)). Tais anticorpos de cadeia única são incluídos no termo anticorpo, a menos que de outra forma notada ou claramente indicada pelo contexto. Embora tais fragmentos sejam geralmente incluídos no significado de anticorpo, eles são seletivamente e cada qual independentemente características exclusivas da presente invenção, exibindo diferentes propriedades biológicas e utilidades. Estes e outros fragmentos de anticorpo usados no contexto da presente invenção são discutidos adicionalmente aqui. Pode-se entender também que o termo anticorpo, a menos que de outra forma especificada, inclui também anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais (mAbs), polipeptídeos do tipo anticorpo, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, e fragmentos de anticorpo que mantêm a capacidade de se ligar especificamente ao antígeno (fragmentos de ligação de antígeno) fornecidos por qualquer técnica conhecida, tais como clivagem enzimática, síntese de peptídeo, e técnicas recombinantes. Um anticorpo da maneira gerada pode possuir qualquer isotipo.
[00025] No contexto da presente invenção, o termo "ADC" refere-se a um conjugado de droga-anticorpo, que no contexto da presente invenção refere-se a um anticorpo anti-TF, que é acoplado a uma outra fração da maneira descrita no presente pedido.
[00026] Um "anticorpo anti-TF" é um anticorpo da maneira descrita anteriormente, que se liga especificamente ao fator tecidual no antígeno ou antígeno de fator tecidual.
[00027] Pretende-se que o termo "anticorpo humano", da maneira aqui usada, inclua anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácidos não codificados por sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas mutagênese aleatória ou sítio- específica in vitro, ou por mutação somática in vivo). Entretanto, não pretende-se que o termo "anticorpo humano", da maneira aqui usada inclua anticorpos nos quais as sequências de CDR derivadas da linhagem germinativa de uma outra espécie de mamífero, tal como um camundongo, foram enxertadas em sequências de estrutura humana.
[00028] Em uma modalidade preferida, o anticorpo do conjugado de droga-anticorpo, ou o conjugado de droga-anticorpo da invenção é isolado. Um "anticorpo isolado" ou "conjugado de droga-anticorpo isolado", da maneira aqui usada, é pretendido para se referir a um anticorpo ou conjugado de droga-anticorpo que é substancialmente livre de outros anticorpos com diferentes especificidades antigênicas (por exemplo, um anticorpo isolado que se liga especificamente ao fator tecidual é substancialmente livre de anticorpos que se ligam especificamente a antígenos sem ser o fator tecidual). Pretende-se que um conjugado de droga-anticorpo isolado, da maneira aqui usada, se refira a um conjugado de droga-anticorpo que também é substancialmente livre de "toxina livre", em que a "toxina livre" é pretendida para significar que não é conjugada ao anticorpo. O termo "substancialmente livre de", da maneira usada em relação à toxina, pode significar em particular que menos de 5 %, tal como menos de 4 %, ou menos de 3 %, ou menos de 2 %, ou menos de 1,5 %, ou menos de 1 %, ou menos de 0,5 % de droga não conjugada está presente quando determinado da maneira descrita no exemplo 16. Um anticorpo isolado ou conjugado de droga-anticorpo isolado que se liga especificamente a um epítopo, isoforma ou variante de fator tecidual humano, entretanto, pode apresentar reatividade cruzada com outros antígenos relacionados, por exemplo, de outras espécies (tais como espécies homólogas ao fator tecidual). Além do mais, um anticorpo isolado ou conjugado de droga-anticorpo pode ser substancialmente livre de outro material celular e/ou compostos químicos. Em uma modalidade da presente invenção, dois ou mais anticorpos monoclonais "isolados" ou conjugados de droga-anticorpo com diferentes especificidades de ligação de antígeno são combinados em uma composição bem definida.
[00029] Quando aqui usado no contexto de dois ou mais anticorpos, o termo "compete com" ou "compete de maneira cruzada com" indica que os dois ou mais anticorpos competem pela ligação ao TF, por exemplo, competem pela ligação ao TF no ensaio da maneira descrita no exemplo 12 de WO 10/066803. Para alguns pares de anticorpos, a competição como no ensaio do exemplo 12 de WO 10/066803 é observada apenas quando um anticorpo é revestido na placa e o outro é usado para competir, e não vice- versa. O termo "compete com", quando aqui usado, também é pretendido para abranger tais combinações de anticorpos.
[00030] Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal", da maneira aqui usada, refere-se a uma preparação de moléculas de anticorpo de composição molecular única. O anticorpo monoclonal ou composição deste pode ser anticorpos conjugados a drogas de acordo com a presente invenção. Uma composição de anticorpo monoclonal exibe uma especificidade e afinidade de ligação simples para um epítopo particular. Dessa maneira, o termo "anticorpo monoclonal humano" refere-se aos anticorpos que exibem uma especificidade de ligação única, que apresenta regiões variáveis e constantes derivadas das sequências de imunoglobulinas da linhagem germinativa humana. Os anticorpos monoclonais humanos podem ser gerados por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humanos transgênico ou transcromossômico, tal como um camundongo transgênico, com um genoma que compreende um transgene de cadeia pesada humana e um transgene de cadeia leve fundidos a uma célula imortalizada.
[00031] Da maneira aqui usada, os termos "ligação" ou "se liga especificamente a", no contexto da ligação de um anticorpo em um antígeno pré-determinado, são tipicamente uma ligação com uma afinidade que corresponde a uma KD de cerca de 10-7 M ou menos, tal como cerca de 10-8 M ou menos, tal como cerca de 10-9 M ou menos, cerca de 10-10 M ou menos, ou cerca de 10-11 M, ou ainda menos quando determinada, por exemplo, por tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) em um instrumento BIAcore 3000, usando o antígeno como o ligante e o anticorpo como o analito, e se ligam ao antígeno pré-determinado com uma afinidade que corresponde a uma KD que é pelo menos vezes menor, tal como pelo menos 100 vezes menor, por exemplo, pelo menos 1.000 vezes menor, tal como pelo menos 10.000 vezes menor, por exemplo, pelo menos 100.000 vezes menor que sua afinidade por ligação a um antígeno não específico (por exemplo, BSA, caseína) sem ser o antígeno pré-determinado ou um antígeno muito relacionado. A quantidade com a qual a afinidade é menor, é dependente da KD do anticorpo, de maneira tal que quando a KD do anticorpo é muito baixa (isto é, o anticorpo é muito específico), então a quantidade com a qual a afinidade pelo antígeno é menor que a afinidade por um antígeno não específico pode ser pelo menos 10.000 vezes.
[00032] O termo "kd" (s-1), da maneira aqui usada, refere-se à constante de taxa de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular. O dito valor também é referido como o valor de kdissociação.
[00033] O termo "ka" (M-1 x s-1), da maneira aqui usada, refere-se à constante de taxa de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular.
[00034] O termo "KD" (M), da maneira aqui usada, refere-se à constante de equilíbrio de dissociação de uma interação anticorpo-antígeno particular.
[00035] O termo "KA" (M-1), da maneira aqui usada, refere-se à constante de equilíbrio de associação de uma interação anticorpo-antígeno particular, e é obtida dividindo o ka pelo kd.
[00036] Da maneira aqui usada, o termo "internalização", quando usado no contexto de um anticorpo de TF inclui qualquer mecanismo pelo qual o anticorpo é internalizado em uma célula que expressa TF a partir da superfície celular. A internalização de um anticorpo pode ser avaliada em um ensaio indireto ou direto, onde o efeito de um conjugado anticorpo-toxina internalizado ou complexo é medido (tal como, por exemplo, o ensaio anti- capa-ETA do exemplo 15 ou o ensaio de internalização e ensaio de eliminação celular do exemplo 18). Em geral, um ensaio direto é usado para medir a internalização dos conjugados de droga-anticorpo, tal como o ensaio descrito aqui no exemplo 18, enquanto os ensaios indiretos podem ser usados para medir a internalização de anticorpos que são então pré-incubados com um anticorpos conjugado secundário, tal como o ensaio descrito aqui no exemplo 15.
[00037] A presente invenção também fornece, em uma modalidade, anticorpos que compreendem variantes funcionais da região VL, região VH, ou uma ou mais CDRs dos anticorpos dos exemplos. Um variante funcional de um VL, VH, ou CDR usado no contexto de um anticorpo anti-TF permite ainda que o anticorpo mantenha pelo menos uma proporção substancial (pelo menos cerca de 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % ou mais) da afinidade/avidez, e/ou da especificidade/seletividade do anticorpo parental e, em alguns casos, um anticorpo anti-TF como este pode estar associado com maior afinidade, seletividade e/ou especificidade que o anticorpo parental.
[00038] Tais variantes funcionais mantêm tipicamente a identidade de sequência significativa com o anticorpo parental. A identidade percentual entre duas sequências é uma função do número de posições idênticas compartilhadas pelas sequências (isto é, % de homologia -# de posições idênticas/total # de posições x 100), levando-se em consideração o número de intervalos e o tamanho de cada intervalo que precisa ser introduzido para o alinhamento ideal das duas sequências. A comparação de sequências e determinação de identidade percentual entre as duas sequências pode ser realizada usando um algoritmo matemático, da maneira descrita nos exemplos não limitantes a seguir.
[00039] A identidade percentual entre as duas sequências de nucleotídeos pode ser determinada usando o programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://wvm.gcg. com), usando uma matriz NWSgapdna.CMP e um peso no intervalo de 40, 50, 60, 70, ou 80 e um peso no comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, ou 6. A identidade percentual entre duas sequências de nucleotídeos ou aminoácidos também pode ser determinada usando o algoritmo de E. Meyers e W. Miller, Comput. Appl. Biosci 4, 11-17 (1988)), que foi incorporado no programa ALIGN (versão 2.0), usando uma tabela de resíduo de peso PAM12.0, uma penalidade de tamanho de intervalo de 12 e uma penalidade de intervalo de 4. Além disso, a identidade percentual entre duas sequências de aminoácido pode ser determinada usando o algoritmo de Needleman e Wurtsch, J. Mol. Biol, 48, 444-453 (1970)), que foi incorporado no programa GAP no pacote de software GCG (disponível em http://www.gcg.com), usando tanto uma matriz Blossum 62 quanto uma matriz PAM250, e um peso de intervalo de 16, 14, 12, 10, 8, 6 ou 4, e um peso no tamanho de 1, 2, 3, 4, 5 ou 6.
[00040] A sequência de variantes de CDR pode diferir da sequência da CDR das sequências de anticorpos parentais principalmente por meio das substituições conservativas, por exemplo, pelo menos cerca de 35 %, cerca de 50 % ou mais, cerca de 60 % ou mais, cerca de 70 % ou mais, cerca de 75 % ou mais, cerca de 80 % ou mais, cerca de 85 % ou mais, cerca de 90 % ou mais, cerca de 95 % ou mais (por exemplo, cerca de 65-99 %, tal como cerca de 96 %, 97 % ou 98 %) das substituições no variante são substituições de resíduo de aminoácido conservativo.
[00041] A sequência de variantes de CDR pode diferir da sequência da CDR das sequências de anticorpos parentais principalmente por meio das substituições conservativas, por exemplo, pelo menos 10, tal como pelo menos 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 do substituições no variante são substituições de resíduo de aminoácido conservativo.
[00042] No contexto da presente invenção, as substituições conservativas podem ser definidas por substituições nas classes de aminoácidos refletidas em uma ou mais das três tabelas a seguir: Classes de resíduo de aminoácido para substituições conservativas
Figure img0001
Classes de substituição de resíduo de aminoácido conservativo alternativo
Figure img0002
Classificações físicas e funcionais alternativas de resíduos de aminoácido
Figure img0003
Figure img0004
[00043] Os agrupamentos de substituição mais conservativa incluem: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina e asparagina-glutamina.
[00044] Os grupos de aminoácidos adicionais também podem ser formulados usando os princípios descritos em, por exemplo, Creighton (1984) Proteins; Structure and Molecular Properties (2a Ed. 1993), W.H. Freeman and Company.
[00045] Em uma modalidade da presente invenção, a conservação em termos de propriedades hidropáticas/hidrofílicas e peso/tamanho do resíduo também é substancialmente mantida em um variante de CDR, comparada a uma CDR de um anticorpo dos exemplos (por exemplo, a classe de peso, classificação hidropática, ou ambas as sequências são pelo menos cerca de 50 %, pelo menos, cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 80 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou mais (por exemplo, cerca de 6599 %) mantidas). Por exemplo, as substituições conservativas de resíduo também podem ser, alternativamente, baseadas na substituição de peso com base em forte ou fraco, baseadas nos grupos de conservação, que são conhecidas na técnica.
[00046] A retenção de resíduos similares também pode ser, alternativamente, medida por uma classificação de similaridade, da maneira determinada por uso de um programa BLAST (por exemplo, BLAST 2.2.8 disponível por meio do NCBI, usando ajustes padrões BLOSUM62, abertura de intervalo = 11 e extensão de intervalo = 1). Os variantes adequados exibem tipicamente pelo menos cerca de 45 %, tal como pelo menos cerca de 55 %, pelo menos cerca de 65 %, pelo menos cerca de 75 %, pelo menos cerca de 85 %, pelo menos, cerca de 90 %, pelo menos cerca de 95 %, ou mais (por exemplo, cerca de 70-99 %) de similaridade com o peptídeo parental.
[00047] Da maneira aqui usada, "isotipo" refere-se à classe de imunoglobulina (por exemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM) que é codificada pelos genes da região constante de cadeia pesada.
[00048] O termo "epítopo" significa uma proteína determinante capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epítopos consistem em geral em agrupamentos de superfície de moléculas, tais como cadeias laterais de aminoácidos ou açúcar, e apresentam em geral características estruturais tridimensionais específicas, bem como características de carga específicas. Os epítopos conformacionais e não conformacionais são distinguidos, nos quais a ligação aos primeiros, mas não aos últimos, é perdida na presença de solventes desnaturantes. O epítopo pode compreender resíduos de aminoácido envolvidos diretamente na ligação (também denominado componente imunodominante do epítopo), e outros resíduos de aminoácido que não estão diretamente envolvidos na ligação, tais como resíduos de aminoácido que são bloqueados eficientemente pelo peptídeo de ligação de antígeno específico (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está na pegada do peptídeo de ligação de antígeno específico).
[00049] Da maneira aqui usada, um anticorpo humano é "derivado de" uma sequência de linhagem germinativa particular se o anticorpo for obtido de um sistema usando sequências de imunoglobulina humana, por exemplo, imunizando um camundongo transgênico que carrega genes de imunoglobulina humana, ou selecionando uma biblioteca de gene de imunoglobulina humana, e em que o anticorpo humano selecionado é pelo menos 90 %, tal como pelo menos 95 %, por exemplo, pelo menos 96 %, tal como pelo menos 97 %, por exemplo, pelo menos 98 %, ou tal como pelo menos 99 % idêntico na sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos codificada pelo gene da imunoglobulina da linhagem germinativa. Tipicamente, fora da cadeia pesada CDR3, um anticorpo humano derivado de uma sequência de linhagem germinativa humana particular exibirá não mais que 20 diferenças no aminoácido, por exemplo, não mais que 10 diferenças no aminoácido, tal como não mais que 9, 8, 7, 6 ou 5, por exemplo, não mais que 4, 3, 2, ou 1 diferenças no aminoácido da sequência de aminoácidos codificada pelo gene de imunoglobulina da linhagem germinativa.
[00050] Da maneira aqui usada, pretende-se que o termo "inibe o crescimento" (por exemplo, que se refere às células, tais como células tumorais) inclua qualquer diminuição mensurável no crescimento celular, quando colocada em contato com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF, comparado ao crescimento das mesmas células que não estão em contato com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF, por exemplo, a inibição de crescimento de uma cultura de células em pelo menos cerca de 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 99 % ou 100 %. Uma diminuição como esta no crescimento celular pode ocorrer por uma variedade de mecanismos exercidos pelo anticorpo anti-TF e droga, tanto individualmente quanto em combinação, por exemplo, fagocitose mediada pode célula dependente de anticorpo (ADCP), citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo (ADCC), citotoxicidade mediada por complemento (CDC) e/ou apoptose, ou interrupção do ciclo celular G2/M e apoptose tal como pode ser induzida por uma interação da auristatina com tubulina.
[00051] O termo "anticorpo IgG4 estabilizado" refere-se a um anticorpo IgG4 que foi modificado para reduzir a troca de metade da molécula (ver WO 2008/145142 (Genmab A/S) ou van der Neut Kolfschoten M et al., (2007) Science 14;317(5844) e suas referências).
[00052] Da maneira aqui usada, o termo "célula efetora" refere-se a uma célula imune que está envolvida na fase efetora de uma resposta imune, ao contrário das fases cognitivas e de ativação de uma resposta imune. As células imunes exemplares incluem uma célula de uma origem mielóide ou linfóide, por exemplo, linfócitos (tais como células B e células T, incluindo células T citolíticas (CTLs)), células exterminadoras, células exterminadoras naturais, macrófagos, monócitos, eosinófilos, células polimorfonucleares, tais como neutrófilos, granulócitos, mastócitos e basófilos. Algumas células efetoras expressam receptores Fc específicos (FcRs) e realizam funções imune específicas. Em algumas modalidades, uma célula efetora é capaz de induzir ADCC, tal como uma célula exterminadora natural, capaz de induzir ADCC. Por exemplo, monócitos, macrófagos, que expressam FcRs estão envolvidos na exterminação específica de células alvo e que apresentam antígenos a outros componentes do sistema imune, ou na ligação das células que apresentam antígenos. Em algumas modalidades, uma célula efetora pode fagocitar um antígeno alvo ou célula alvo. A expressão de um FcR particular em uma célula efetora pode ser regulada por fatores humorais tais como citocinas. Por exemplo, observa-se que a expressão de FcyRI é supra-regulada por interferon Y (IFN-y) e/ou fator estimulador de colônia de granulócito (G- CSF). Esta melhor expressão aumenta a atividade citotóxica de células que carregam FcyRI contra as células alvo. Uma célula efetora pode fagocitar ou lisar um antígeno alvo ou uma célula alvo.
[00053] Pretende-se que o termo "vetor", da maneira aqui usada, se refira a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar um outro ácido nucleico, no qual está ligada. Um tipo de vetor é um "plasmídeo", que se refere a uma alça de DNA dupla fita circular na qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Um outro tipo de vetor é um vetor viral, em que segmentos adicionais de DNA podem estar ligados no genoma viral. Certos vetores são capazes de replicação autônoma em uma célula hospedeira, na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais em mamífero). Outros vetores (tais como vetores não epissomais em mamífero) podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira mediante a introdução na célula hospedeira, e por meio disso são replicados junto com o genoma do hospedeiro. Além do mais, certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes nos quais estão operavelmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidade em técnicas de DNA recombinante estão frequentemente na forma de plasmídeos. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser usados indiferentemente, uma vez que o plasmídeo é a forma mais comumente usada de vetor. Entretanto, pretende-se que a presente invenção inclua tais outras formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (tais como retrovírus de replicação falha, adenovírus e vírus associado a adeno), que agem com funções equivalentes.
[00054] Pretende-se que o termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"), da maneira aqui usada, refira-se a uma célula em que um vetor de expressão foi introduzido. Entende-se que tais termos são pretendidos para se referir não apenas à célula particular em questão, mas também à progênie de uma célula como esta. Em decorrência de certas modificações poderem ocorrer em gerações posteriores, por causa tanto da mutação quanto das influências ambientais, tal progênie pode não ser, de fato, idêntica à célula parental, mas ainda está incluída no escopo do termo "célula hospedeira", da maneira aqui usada. As células hospedeiras recombinantes incluem, por exemplo, transfectomas, tais como células CHO, células HEK293, células NS/0 e células linfocíticas.
[00055] O termo "transfectoma", da maneira aqui usada, inclui células hospedeiras eucariotas recombinantes que expressam o anticorpo, tais como células CHO, células NS/0, células HEK293, células de planta ou fungos, incluindo células de leveduras.
[00056] O termo "animal não humano transgênico" refere-se a um animal não humano com um genoma que compreende um ou mais transgenes ou transcromossomos humanos de cadeias pesada e/ou leve (tanto integrados quanto não integrados no DNA genômico natural de animal), e que é capaz de expressar anticorpos completamente humanos. Por exemplo, um camundongo transgênico pode apresentar um transgene de cadeia leve humana, e tanto um transgene de cadeia pesada humana quanto transcromossomo de cadeia pesada humana, de maneira tal que o camundongo produza anticorpos anti-TF humanos quando imunizado com antígeno de TF e/ou células que expressam TP. O transgene de cadeia pesada humana pode ser integrado no DNA cromossômico do camundongo, como é o caso de camundongos transgênicos, por exemplo, camundongos HuMAb, tais como camundongos HCo7, HCo17, HCo20 ou HCo12, ou o transgene de cadeia pesada humana pode ser mantido extra-cromossomicamente, como é o caso de camundongos KM transcromossômicos, da maneira descrita em WO02/43478. Tais camundongos transgênicos e transcromossômicos (coletivamente referidos aqui como "camundongos transgênicos") são capazes de produzir isotipos múltiplos de anticorpos monoclonais humanos em um dado antígeno (tal como IgG, IgA, IgM, IgD e/ou IgE) submetendo-se à recombinação V-D-J e trocando o isotipo. O animal não humano transgênico também pode ser usado para a produção de anticorpos contra um antígeno específico introduzindo genes que codificam tal anticorpo específico, por exemplo, ligando operavelmente os genes a um gene que é expresso no leite do animal.
[00057] "Tratamento" refere-se à administração de uma quantidade eficiente de um composto terapeuticamente ativo da presente invenção, com o propósito de aliviar, melhorar, interromper ou erradicar (curar) os sintomas ou estágios da doença.
[00058] Uma "quantidade eficiente" ou "quantidade terapeuticamente eficiente" refere-se a uma quantidade eficiente, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para atingir um resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF pode variar de acordo com fatores tais como o estágio da doença, idade, sexo e peso do indivíduo, e a capacidade do conjugado de droga- anticorpo anti-TF elicitar uma resposta desejada no indivíduo. Uma quantidade terapeuticamente eficiente também é aquela na qual qualquer efeito tóxico ou prejudicial do anticorpo, ou porção do anticorpo, é compensado pelos efeitos terapeuticamente benéficos.
[00059] Um anticorpo "anti-idiotípico" (Id) é um anticorpo que reconhece determinantes exclusivos, em geral associados com o sítio de ligação de antígeno de um anticorpo, Aspectos adicionais e modalidades da invenção
[00060] A invenção fornece um conjugado de droga-anticorpo anti-TF.
[00061] Em um aspecto, a invenção fornece um conjugado de droga- anticorpo que compreende um anticorpo que se liga ao fator tecidual e que compreende: (i) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 6, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:46, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 47, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 48, ou (ii) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:34, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 35, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 74, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 75, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 76, ou (iii) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 38, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 39, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 40, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada Em SEQ ID NO: 78, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 79, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 80, ou (iv) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 2, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 4, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 42, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 43, e uma região CDR3 com região com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 44, ou (v) um variante de qualquer dos ditos anticorpos, em que o dito variante apresenta preferivelmente no máximo 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições conservativas de aminoácido nas ditas sequências, em que o anticorpo foi conjugado com uma auristatina ou um análogo de peptídeo funcional, ou derivado deste, por meio de um ligante.
[00062] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: (i) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 45, ou (ii) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 33 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 73, ou (iii) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 77, ou (iv) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 41.
[00063] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de tamanho completo.
[00064] Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG1 monoclonal completamente humano, tal como uma IgGl.K. Em uma outra modalidade, o anticorpo é um anticorpo IgG4 monoclonal completamente humano estabilizado.
[00065] Em uma modalidade, a auristatina é monometil auristatina E (MMAE):
Figure img0005
em que a linha ondulada indica o sítio de anexação com o ligante.
[00066] Em uma modalidade, a auristatina é monometil auristatina F (MMAF):
Figure img0006
em que a linha ondulada indica o sítio de anexação com o ligante.
[00067] Em uma modalidade, o ligante é anexado a resíduos de sulfidrila do anticorpo anti-TF obtidos por redução (parcial) do anticorpo anti- TF.
[00068] Em uma modalidade, o ligante-auristatina é MC-vc-PAB- MMAF (também determinado como vcMMAF) ou MC-vc-PAB-MMAE (também determinado como vcMMAE):
Figure img0007
em que p significa um número de 1 a 8, por exemplo, p pode ser de 3-5, S representa um resíduo de sulfidrila do anticorpo anti-TF, e Ab determina o anticorpo anti-TF. Em uma modalidade, o ligante-auristatina é vcMMAE.
[00069] Em uma modalidade, o ligante-conjugado é mcMMAF (onde mc/MC é uma abreviação de maleimido caproil):
Figure img0008
em que p significa um número de 1 a 8, por exemplo, p pode ser de 3-5, S representa um resíduo de sulfidrila do anticorpo anti-TF, e Ab determina o anticorpo anti-TF.
[00070] Em uma modalidade, o anticorpo bloqueia a ligação de FVIIa ao fator tecidual determinado, por exemplo, da maneira descrita no exemplo 14.
[00071] Em uma modalidade, o anticorpo inibe a ligação de FVIIa com o fator tecidual, preferivelmente com um valor máximo de inibição IC50 entre 0,01-3,0 μg/mL, ou tal como 0,1-2,0 μg/mL, ou tal como 0,2-1,2 μg/mL, quando determinado da maneira descrita no exemplo 14.
[00072] Em uma modalidade, o anticorpo compete pelo fator tecidual ligação com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 73, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO:1 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:41, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 5 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:45, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:49, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 13 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 57, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 21 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 61, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 2.5 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 65, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 29 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 69, ou com um anticorpo que compreende uma região VH compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:77. Em uma modalidade, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO; 34, 35 e 36 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 74, 75 e 76, ou b) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 2, 3 e 4 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:42, 43 e 44, ou c) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 6, 7 e 8 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:46, 47 e 48, ou d) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 10, 11 e 12 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 50, 51 e 52, ou e) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 14, 15 e 16 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 54, 55 e 56, ou f) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 18, 19 e 20 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 58, 59 e 60, ou g) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 22, 23 e 24 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:62, 63 e 64, ou h) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO; 26, 27 e 28 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO:66, 67 e 68, ou i) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 30, 31 e 32 e um VL. região que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 70, 71 e 72, ou j) uma região VH que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 38, 39 e 40 e uma região VL que compreende as sequências de CDR1, 2 e 3 de SEQ ID NO: 78, 79 e 80, ou k) um variante de qualquer dos ditos anticorpos, em que o dito variante apresenta preferivelmente no máximo 1, 2 ou 3 modificações de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições conservativas de aminoácido nas ditas sequências.
[00073] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VH com: a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade com uma sequência da região VH selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 33, 1, 5, 9, 13, 17, 2.1, 25, 37 e 29, ou b) no máximo 20, tal como 15, ou 10, ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificação de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições conservativas de aminoácido comparadas a uma sequência da região VH selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NQ: 33, 1, 5, 9, 13, 17, 21, 25, 37 e 29.
[00074] Em uma modalidade, o anticorpo compreende uma VL com: a) pelo menos 80 % de identidade, tal como pelo menos 90 %, pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % ou 100 % de identidade com uma sequência da região VL selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO:73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 e 69, ou b) no máximo 20, tal como 15, ou 10, ou 5, 4, 3, 2 ou 1 modificação de aminoácido, mais preferivelmente substituições de aminoácido, tais como substituições conservativas de aminoácido comparadas a uma sequência da região VH selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 73, 41, 45, 49, 53, 57, 61, 65, 77 e 59.
[00075] Em uma modalidade, o anticorpo compreende: a) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 33 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 73, ou b) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: l e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:41, ou c) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 5 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:45, ou d) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO:9 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:49, ou e) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 13 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 53, ou f) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 17 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 57, ou g) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 21 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO: 61, ou h) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 25 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:65, ou i) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 29 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:69, ou j) uma região VH que compreende a sequência de SEQ ID NO: 37 e uma região VL que compreende a sequência de SEQ ID NO:77.
[00076] Em uma modalidade, o anticorpo se liga ao domínio extracelular de fator tecidual com uma afinidade aparente (EC50) de 3,0 nM ou menos, tal como 0,50 nM ou menos, por exemplo 0,35 nM ou menos, tal como 0,20 nM ou menos, por exemplo, 0,1 nM ou menos, quando determinado da maneira descrita no ensaio no exemplo 12.
[00077] Em uma modalidade, o anticorpo se liga às células de mamífero que expressam fator tecidual, tais como células A431 transfectadas com um construto que codifica o fator tecidual, preferivelmente com uma afinidade aparente (EC50) de 10 nM ou menos, por exemplo, 8 nM ou menos, tal como 5 nM ou menos, por exemplo, 2 nM ou menos, tal como 1 nM ou menos, por exemplo, 0,5 nM ou menos, tal como 0,3 nM ou menos, quando determinado da maneira descrita no ensaio no exemplo 13.
[00078] Em um outro aspecto ou aspecto alternativo, o anticorpo é conjugado com uma fração terapêutica selecionada do grupo que consiste em taxol; citocalasina B; gramicidina D; brometo de etídio; emetina; mitomicina; etoposida; tenoposida; vincristina; vinblastina; colchicina; doxorubicina; daunorubicina; di-hidróxi antracina diona; um inibidor de tubulina, tal como maitansina ou um análogo ou derivado desta; mitoxantrona; mitramicina; actinomicina D; 1-desidrotestosterona; um glicocorticóide; procaína; tetracaína; lidocaína; propranolol; puromicina; caliqueamicina ou um análogo ou derivado deste, um antimetabólito tal como metotrexato, 6 mercaptopurina, 6 tioguanina, citarabina, fludarabina, 5 fluorouracil, decarbazina, hidroxiureia, asparaginasa, gencitabina ou cladribina; um agente de alquilação tal como mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina, carboplatina, duocarmicina A, duocarmicina SA, rachefinicina (CC-1065), ou um análogo ou derivado destes; pirrolo[2, 1-c] [1,4] benzodiazepinas (PDBs) ou análogos destas; um antibiótico tal como dactinomicina, bleomicina, daunorubicina, doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)); toxina da difteria e moléculas relacionadas, tais como cadeia A da difteria e fragmentos ativos destas, e moléculas híbridas, toxina ricina tal como ricina A ou uma toxina da cadeia de ricina A desglicosilada, toxina do cólera, uma toxina do tipo Shiga tal como SLT I, SLT II, SLT IIV, toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertussis, toxina tetânica, inibidor de protease Bowman-Birk de soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolacca americana tais como PAPI, PAPII, e PAPS, inibidor Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina e toxinas enomicina; ribonucfease (RNase); DNase I, enterotoxina A estafilocócica; proteína antiviral da fitolaca; toxina diftérica e endotoxina de Pseudomonas. Em uma modalidade alternativa adicional, o anticorpo é conjugado com uma fração citotóxica selecionada do grupo que consiste em dolastatina, maitansina, caliqueamicina, duocarmicina, raquelmicina (CC-1065), ou um análogo, derivado, ou pró-droga de qualquer um dos mesmos.
[00079] Em uma modalidade alternativa adicional, o anticorpo é conjugado com uma citocina selecionada do grupo que consiste em IL-2, IL- 4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNa, IPNβ, IFNy, GM-CSF, CD40L, ligante Flt3, fator de célula tronco, ancestim e TNFa.
[00080] Em uma modalidade alternativa adicional, o anticorpo é conjugado com um radioisótopo.
[00081] Em uma modalidade, o anticorpo é capaz de induzir citotoxicidade por internalização do anticorpo acoplado a uma toxina em A431, BxPC3 ou MDA-MB-23, da maneira descrita no exemplo 15.
[00082] Em uma modalidade, o anticorpo induz a citotoxicidade por internalização da maneira descrita no exemplo 15, com um valor de EC50 entre 9 x 10-5 e 4 x 10-4 μg/mL em células A431.
[00083] Em uma modalidade, a preparação do conjugado de droga- anticorpo resulta em menos de 2 %, tal como menos de 1,5 %, ou menos de 1 %, ou menos de 0,5 % do droga não conjugada, quando determinada da maneira descrita no exemplo 16.
[00084] Em uma modalidade, a preparação do conjugado de droga- anticorpo resulta em menos de 10 %, tal como menos de 8 %, ou menos de 7 % ou menos de 6 % ou menos de 5,5 % de agregados, quando determinada da maneira descrita no exemplo 16.
[00085] Em uma modalidade, a preparação do conjugado de droga- anticorpo resulta em menos de 1 %, tal como menos de 0,5 %, ou menos de 0,25 %, ou menos de 0,2 % de endotoxinas, quando determinada da maneira descrita no exemplo 16.
[00086] Em uma modalidade, a preparação do conjugado de droga- anticorpo resulta em uma concentração de conjugado de droga-anticorpo na faixa de 1-100 mg/mL, tal como na faixa de 2-50 mg/mL, ou na faixa de 5-25 mg/mL, ou na faixa de 5-15 mg/mL, ou na faixa de 7,5-15 mg/mL, ou na faixa de 8-12 mg/mL, ou na faixa de 9-11 mg/mL quando determinada da maneira descrita no exemplo 16.
[00087] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo se liga ao domínio extracelular do fator tecidual com uma afinidade aparente (EC50) de 600 ng/mL ou menos, tal como 550 ng/mL ou menor, ou 500 ng/mL ou menos, tal como com um valor de EC50 na faixa de 200-600 ng/mL, por exemplo, um valor de EC50 na faixa de 300-600 ng/mL, ou um valor de EC50 na faixa de 350-550 ng/mL, ou um valor de EC50 na faixa de 400-500 ng/mL, quando determinado da maneira descrita no exemplo 17.
[00088] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo induz a citotoxicidade por internalização, da maneira descrita no exemplo 18, com um valor de EC50 entre 1 e 100 ng/mL nas células A431.
[00089] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo induz a citotoxicidade por internalização da maneira descrita no exemplo 18, com um valor de EC50 entre 0,5 e 20 ng/mL em células HPAF-II.
[00090] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo induz a citotoxicidade por internalização da maneira descrita no exemplo 18, com um valor de EC50 entre 0,5 e 500 ng/mL, tal como entre 0,5 e 2,0 ng/mL em células NCI-H441.
[00091] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo induz a citotoxicidade por internalização da maneira descrita no exemplo 18, por exemplo, em células tumorais que expressam mais de 200.000 moléculas de fator tecidual por célula, tal como entre 200.000-1.000.000 moléculas de fator tecidual por célula, por exemplo, entre 200.000 e 500.000 moléculas de fator tecidual por célula. O valor de EC50 pode estar, em uma modalidade, entre 0,1 e 100 ng/mL.
[00092] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo induz a citotoxicidade por internalização da maneira descrita no exemplo 18,por exemplo, em células tumorais que expressam mais de 20.000 moléculas de fator tecidual por célula, tal como entre 20.000-200.000 moléculas de fator tecidual por célula. O valor de EC50 pode estar, em uma modalidade, entre 0,5 e 500 ng/mL, tal como entre 0,5 e 20 ng/mL.
[00093] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo inibe o crescimento do tumor da maneira descrita no exemplo 19.
[00094] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo inibe o crescimento tumoral de uma linhagem celular que expressa mais de 1.000 moléculas de fator tecidual por célula, tal como mais de 10.000 moléculas de fator tecidual por células, por exemplo, mais de 100.000 moléculas de fator tecidual por célula, ou tal como entre 1.000-20.000 moléculas de fator tecidual por célula, ou entre 20.000-200.000 moléculas de fator tecidual por célula, ou entre 200.000-500.000 moléculas de fator tecidual por célula, ou entre 200.000-1.000.000 moléculas de fator tecidual por célula, quando o crescimento de tumor é determinado da maneira descrita no exemplo 19.
[00095] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo é estável a -65 °C por pelo menos três meses, onde estável refere-se que pelo menos 95 % do conjugado de droga-anticorpo está presente como moléculas monoméricas, quando determinado da maneira descrita no exemplo 20.
[00096] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo é estável a 5 °C por pelo menos três meses, onde estável refere-se que pelo menos 95 % do conjugado de droga-anticorpo está presente como moléculas monoméricas, quando determinado da maneira descrita no exemplo 20.
[00097] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende o conjugado de droga-anticorpo da maneira definida em qualquer das modalidades anteriores. Em uma modalidade, a composição farmacêutica compreende adicionalmente um carreador farmaceuticamente aceitável.
[00098] Em um outro aspecto, a invenção fornece o conjugado de droga-anticorpo da maneira definida em qualquer das modalidades anteriores para uso como um medicamento.
[00099] Em um outro aspecto, a invenção fornece o conjugado de droga-anticorpo da maneira definida em qualquer das modalidades anteriores para uso no tratamento de um distúrbio.
[000100] Em um outro aspecto, a invenção fornece o conjugado de droga-anticorpo da maneira definida em qualquer das modalidades anteriores para uso no tratamento de inflamação.
[000101] Em um outro aspecto, a invenção fornece o conjugado de droga-anticorpo da maneira definida em qualquer das modalidades anteriores para uso no tratamento de câncer.
[000102] Em uma modalidade, o câncer é selecionado do grupo que consiste em tumores do sistema nervoso central, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão, tal como NSCLC, câncer de mama, especificamente câncer de mama triplo negativo, câncer no esôfago, câncer gástrico ou no estômago, câncer hepático e biliar, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de próstata, câncer endometrial, câncer no ovário, melanoma maligno, sarcoma, tumores de origem primária desconhecida, câncer na medula óssea, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica e linfoma não Hodgkin, câncer de pele, glioma, câncer do cérebro, útero, leucemia mielóide aguda e reto.
[000103] Em uma modalidade, o câncer é câncer pancreático.
[000104] Em uma modalidade, o câncer é câncer colorretal.
[000105] Em uma modalidade, o câncer é câncer no ovário.
[000106] Em uma modalidade, o câncer é câncer de mama,
[000107] Em uma modalidade, o câncer é câncer de próstata.
[000108] Em uma modalidade, o câncer é câncer de bexiga.
[000109] Em uma modalidade, o câncer é um câncer que é sensível ao tratamento com um inibidor de tubulina.
[000110] Em um outro aspecto, a invenção fornece o conjugado de droga-anticorpo de qualquer uma das modalidades anteriores, em que o medicamento é para o tratamento de câncer em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como um agente quimioterapêutico.
[000111] Em um outro aspecto, a invenção fornece o uso do conjugado de droga-anticorpo de qualquer das modalidades anteriores para a fabricação de um medicamento, para o tratamento de câncer. Em uma modalidade, o câncer pode ser selecionado de qualquer um dos cânceres descritos anteriormente.
[000112] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para induzir a eliminação celular, ou inibir o crescimento e/ou a proliferação de uma célula tumoral que expressa o fator tecidual, que compreende a administração a um indivíduo que precisa de uma quantidade eficiente do conjugado de droga-anticorpo de qualquer das modalidades anteriores.
[000113] Em um outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de qualquer das doenças cancerígenas anteriores pela administração a um indivíduo que precisa de uma quantidade eficiente do conjugado de droga-anticorpo de qualquer das modalidades anteriores. Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo é administrado em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como um agente quimioterapêutico.
Anticorpo
[000114] A presente invenção se refere a conjugados de droga-anticorpo anti-TF, que compreendem assim tanto um anticorpo quanto um medicamento, que podem ser conjugados em particular um com o outro por meio de um ligante,
[000115] Os anticorpos podem ser preparados por técnicas recombinantes bem conhecidas, usando sistemas de vetor de expressão e células hospedeiras bem conhecidos. Em uma modalidade os anticorpos são preparados em uma célula CHO usando o sistema de vetor de expressão GS discutido em De Sa Cruz Edmunds et al., 2006, Molecular Biotechnology 34: 179-190, EP216846, U.S.5981215, WO 87/04462, EP323997, U.S.5591639, U.S.5658759, EP338841, U.S.5879936 e U.S.5891693.
[000116] Após isolar e purificar os anticorpos a partir do meio celular, usando técnicas bem conhecidas, eles são conjugados com a auristatina por meio de um ligante da maneira revelada adicionalmente a seguir.
[000117] Os anticorpos monoclonais da presente invenção, por exemplo, podem ser produzidos pelo método de hibridoma descrito primeiro por Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante. Os anticorpos monoclonais também podem ser isolados de bibliotecas de anticorpo de fago usando as técnicas descritas em, por exemplo, Clackson et al., Nature 352, 62.4-628 (1991) e Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos a partir de qualquer fonte adequada. Assim, por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser obtidos de hibridomas preparados a partir de células B esplênicas de murino obtidas de camundongos imunizados com um antígeno de interesse, por exemplo, na forma de células que expressam o antígeno na superfície, ou um ácido nucleico que codifica um antígeno de interesse. Os anticorpos monoclonais também podem ser obtidos de hibridomas derivados de células que expressam anticorpo, de mamíferos humanos e não humanos imunizados tais como ratos, cachorros, primatas, etc.
[000118] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo humano. Os anticorpos monoclonais humanos direcionados contra o fator tecidual podem ser gerados usando camundongos transgênicos ou transcromossomais, que carregam partes do sistema imune humanos além do sistema do camundongo. Tais camundongos transgênicos ou transcromossômicos incluem camundongos aqui referidos como camundongos HuMAb e camundongos KM, respectivamente, e são aqui coletivamente referidos como "camundongos transgênicos".
[000119] O camundongo HuMAb contém um minilocus gênico da imunoglobulina humana que codifica sequências de imunoglobulina de cadeia pesada (μ e y) e K leve humana não reagida, junto com mutações alvejadas que inativam os loci endógenos da cadeia μ e K (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). Dessa maneira, os camundongos exibem menos expressão de IgM ou k de camundongo e, em resposta a imunização, os transgenes de cadeia pesada e leve humana introduzidos se submetem a troca de classe e mutação somática para gerar IgG humana de alta afinidade, anticorpos monoclonais k (Lonberg, N. et al. (1994), supra; revisado em Lonberg, N, Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N, e Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) e Harding, F. e Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). A preparação de camundongos HuMAb é descrita em detalhes em Taylor, L. et. al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Ver também U.S. 5.545.806, U.S. 5.569.82.5, U.S. 5.625.126, U.S. 5.633.425, U.S. 5.789.650, U.S. 5.877.397, U.S. 5.661.015, U.S. 5.814.318, U.S. 5.874.299, U.S. 5.770.429, U.S. 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 e WO 01/09187.
[000120] Os camundongos HCo7 apresentam uma interrupção JKD em seus genes endógenos de cadeia leve (capa) (da maneira descrita em Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção CMD em seus genes endógenos de cadeia pesada (da maneira descrita no exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve capa humana KCo5 (da maneira descrita em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), e um transgene HCo7 de cadeia pesada humana (da maneira descrita em U.S. 5.770.429).
[000121] Os camundongos HCo12 apresentam uma interrupção JKD em seus genes endógenos de cadeia leve (capa) (da maneira descrita em Chen et al., EMBO 3. 12, 821-830 (1993)), uma interrupção CMD em seus genes endógenos de cadeia pesada (da maneira descrita no exemplo 1 de WO 01/14424), um transgene de cadeia leve capa humana KCo5 (da maneira descrita em Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), e um transgene de cadeia pesada humana HCol2 (da maneira descrita no exemplo 2 de WO 01/14424).
[000122] A cepa de camundongo transgênico HCo17 (ver também U.S. 2010/0077497) foi gerada por co-injeção do inserto de 80 kb de pHC2 (Taylor et al. (1994) Int. Immunol., 6; 579-591), do inserto de 25 Kb ofpVX6, e um fragmento de cromossomo artificial de levedura de -460 kb do cromossomo yIgH24. Esta linhagem foi determinada (HCo17) 25950. A linhagem (HCo17) 25950 foi então produzida com camundongos que compreendem a mutação CMD (descritos no exemplo 1 da publicação PCT WO 01109187), a mutação JKD (Chen et al. (1993) EMBOJ12: 811-820), e o transgene (KC05) 9272 (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). Os camundongos resultantes expressam transgenes de cadeia pesada e leve capa de imunoglobulina humana em um antecedente homozigoto, para interrupção dos loci de cadeia leve capa e pesada endógenos de camundongo.
[000123] A cepa de camundongo transgênico HCo20 é o resultado de uma co-injeção de 39 minilocus de transgene pHC2 de cadeia pesada, o YAC ylgH10 contendo a região variável da linhagem germinativa (Vh), e o construto de minilocus pVx6 (descrito em WO09097006). A linhagem (HCo20) foi então produzida em camundongos que compreendem a mutação CMD (descrita no exemplo 1 da publicação de PCT WO 01/09187), a mutação JKD (Chen et al. (1993) EMBOJ. 12: 811-820), e o transgene (KC05) 9272 (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845-851). Os camundongos resultantes expressam transgenes de cadeia leve capa e pesada da imunoglobulina humana 10 em um antecedente homozigoto, para a interrupção dos loci de cadeia leve capa e pesada de camundongo endógeno.
[000124] A fim de gerar camundongos HuMab com os efeitos benéficos da cepa Balb/c, os camundongos HuMab foram cruzados com camundongos KC05 [MIK] (Balb), que foram gerados por retrocruzamento da cepa KC05 (da maneira descrita em Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14: 845851) com os camundongos Balb/c tipo selvagem para gerar camundongos da maneira descrita em WO09097006. Usando este cruzamento, os híbridos de Balb/c foram criados para as cepas HCo12, HCo17 e HCo20.
[000125] Na cepa de camundongo KM, o gene de cadeia leve capa de camundongo endógeno foi interrompido homozigoticamente da maneira descrita em Chen et al., EMBOJ. 12, 811-820 (1993), e o gene de cadeia pesada de camundongo endógeno foi interrompido homozigoticamente da maneira descrita no exemplo 1 de WO 01/09187. Esta cepa de camundongo carrega um transgene de cadeia leve capa humana, KCo5, da maneira descrita em Fishwild et al., Mature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de camundongo também carrega um transcromossomo de cadeia pesada humana composto do fragmento hCF do cromossomo 14 (SC20), da maneira descrita em WO 02/43478.
[000126] Os esplenócitos destes camundongos transgênicos podem ser usados para gerar hibridomas que secretam anticorpos monoclonais humanos de acordo com técnicas bem conhecidas. Os anticorpos monoclonais ou policlonais humanos da presente invenção, ou anticorpos da presente invenção que se originam destas outras espécies, também podem ser gerados transgenicamente por meio da geração de um outro mamífero não humano, ou planta, que é transgênico com relação às sequências de interesse de cadeia pesada e leve de imunoglobulina, e da produção do anticorpo em uma forma recuperável deste. Junto com a produção transgênica em mamíferos, os anticorpos podem ser produzidos e recuperados do leite de cabras, vacas ou outros mamíferos. Ver, por exemplo, U.S. 5.827.690, U.S. 5.756.687, U.S. 5.750.172 e U.S. 5.741.957.
[000127] Adicionalmente, os anticorpos humanos da presente invenção, ou anticorpos da presente invenção de outras espécies, podem ser gerados por meio de tecnologias do tipo exibição incluindo, sem limitação, exibição de fago, exibição retroviral, exibição ribossomal e outras técnicas, usando técnicas bem conhecidas na tecnologia, e as moléculas resultantes podem ser submetidas à maturação adicional, tal como maturação por afinidade, uma vez que tais técnicas são bem conhecidas na tecnologia (ver, por exemplo, Hoogenboom et al., 3. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (exibição de fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (exibição de fago), Hanes e Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (exibição ribossomal), Parmley e Smith, Gene 73, 305 -318 (1988) (exibição de fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PIMAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell e McCafferty TIBTECH 10, 80-84 (1992) e U.S. 5.733.743). Se as tecnologias de exibição forem utilizadas para produzir anticorpos que não são humanos, tais anticorpos podem ser humanizados.
[000128] O anticorpo da invenção pode ser de qualquer isotipo. A escolha do isotipo será tipicamente orientada pelas funções efetoras desejadas, tal como indução de ADCC. Os isotipos exemplares são IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Cada uma das regiões constante de cadeia leve, capa ou lambda, pode ser usada. Se desejado, a classe de um anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser trocada por métodos conhecidos. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que era originalmente IgM pode ter sua classe trocada para um anticorpo IgG da presente invenção. Adicionalmente, as técnicas de trocar classe podem ser usadas para converter uma subclasse IgG por uma outra, por exemplo, de IgG1 para IgG2. Assim, a função efetora dos anticorpos da presente invenção pode ser mudada trocando o isotipo, por exemplo, para um anticorpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE, ou IgM com vários usos terapêuticos. Em uma modalidade, um anticorpo da presente invenção é um anticorpo IgG1, por exemplo, um IgG1,K.
[000129] Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é um anticorpo de tamanho completo, preferivelmente um anticorpo IgG1, em particular um anticorpo IgG1,K. Pretende-se que o termo anticorpo de tamanho completo seja entendido como o que se refere ao que é conhecido em geral como um anticorpo natural, completo, isto é, não um fragmento ou outros tipos de anticorpos, onde as diferentes cadeias de um anticorpo foram rearranjadas pelo homem para gerar um novo tipo de anticorpo (ver, por exemplo Sidhu SS, Nature Biotechnology, 25, 5, 537-538, (2007) que revela anticorpos de tamanho completo na exibição). Em uma outra modalidade, o anticorpo da invenção é um fragmento de anticorpo ou um anticorpo de cadeia simples.
[000130] Os fragmentos de anticorpo, por exemplo, podem ser obtidos por fragmentação usando técnicas convencionais, e os fragmentos selecionados por utilidade da mesma maneira descrita aqui para os anticorpos completos. Por exemplo, os fragmentos F(ab')2 podem ser gerados tratando o anticorpo com pepsina. O fragmento F(ab')2 resultante pode ser tratado para reduzir as pontes de dissulfeto e produzir fragmentos Fab'. Os fragmentos Fab podem ser obtidos tratando um anticorpo IgG com papaína. Os fragmentos Fab' podem ser obtidos com digestão de pepsina do anticorpo IgG. Um fragmento F(ab') também pode ser produzido por ligação Fab' descrita a seguir, por meio de uma ligação tioéter ou uma ligação dissulfeto. Um fragmento Fab' é um fragmento de anticorpo obtido cortando uma ligação dissulfeto da região de dobradiça do F(ab')2. Um fragmento Fab' pode ser obtido tratando um fragmento F(ab')2 com um agente de redução, tal como ditiotreitol. Os fragmentos de anticorpo também podem ser gerados por expressão de ácidos nucleicos que codificam tais fragmentos em células recombinante (ver, por exemplo Evans et al., J, Immunol, Meth, 184, 12.3-38 (1995)). Por exemplo, um gene quimérico que codifica uma porção de um fragmento F(ab')2 pode incluir sequências de DNA que codificam o domínio CH1 e a região de dobradiça da cadeia H, seguido por um códon de parada translacional, para render uma molécula de fragmento de anticorpo truncado como esta.
[000131] Os anticorpos da presente invenção são revelados e caracterizados adicionalmente em WO 2010/066803 (Genmab A/S).
[000132] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TF é um anticorpo IgG4 estabilizado. Exemplos de anticorpos IgG4 estabilizados adequados são os anticorpos em que arginina na posição 409 em uma região constante de cadeia pesada de IgG4 humana, que é indicada no índice EU como em Kabat et al., é substituída por lisina, treonina, metionina ou leucina, preferivelmente lisina (descrita em WO2006033386 (Kirin)), e/ou em que a região de dobradiça compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys.
[000133] Em uma modalidade adicional, o anticorpo IgG4 estabilizado anti-TF é um anticorpo IgG4 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende uma região constante de IgG4 humana com um resíduo selecionado do grupo que consiste em: Lys, Ala, Thr, Met e Leu na posição que corresponde a 409, e/ou um resíduo selecionado do grupo que consiste em: Ala, Val, Gly, Ile e Leu na posição que corresponde a 405, e em que o dito anticorpo compreende opcionalmente uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções adicionais, mas não compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de dobradiça. Preferivelmente, o dito anticorpo compreende um resíduo Lys ou Ala na posição que corresponde a 409, ou a região CH3 do anticorpo foi substituída pela região CH3 de IgG1 humana, de IgG2 humana ou de IgG3 humana.
[000134] Em uma modalidade mais adicional, o anticorpo IgG4 estabilizado anti-TF é um anticorpo IgG4 que compreende uma cadeia pesada e uma cadeia leve, em que a dita cadeia pesada compreende uma região constante de IgG4 humana com um resíduo selecionada do grupo que consiste em: Lys, Ala, Thr, Met e Leu na posição que corresponde a 409, e/ou um resíduo selecionado do grupo que consiste em: Ala, Val, Gly, Ile e Leu na posição que corresponde a 405, e em que o dito anticorpo compreende opcionalmente uma ou mais substituições, deleções e/ou inserções adicionais, e em que o dito anticorpo compreende uma sequência Cys-Pro-Pro-Cys na região de dobradiça. Preferivelmente, o dito anticorpo compreende um resíduo Lys ou Ala na posição que corresponde a 409, ou a região CH3 do anticorpo foi substituída pela região CH3 de IgG1 humana, de IgG2 humana ou de IgG3 humana.
[000135] Em uma modalidade adicional, o anticorpo anti-TF é um anticorpo de um tipo não IgG4, por exemplo, IgG1, IgG2 ou IgG3 que foi mutada de maneira tal que a capacidade de mediar funções efetoras, tal como ADCC, foi reduzida ou mesmo eliminada. Tais mutações, por exemplo, foram descritas em Dall'Acqua WF et al., J Immunol. 177(2): 1129-1138 (2006) e Hezareh M, J Virol.; 75(24): 12161-12168 (2001).
Conjugados
[000136] A presente invenção fornece um conjugado de droga-anticorpo anti-TF.
[000137] Em um aspecto, os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção compreendem um anticorpo anti-TF revelado aqui, conjugado com auristatinas ou análogos e derivados do peptídeo auristatina (U.S.5635483; U.S.5780588). As auristatinas mostraram interferir com microtúbulos dinâmicos, hidrólise por GTP e divisão nuclear e celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents and Chemother. 45(12): 3580-3584) e apresentam atividade anti-câncer (U.S.5663149) e anti-fúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents and Chemother. 42: 2961-2965. A fração da droga auristatina pode ser anexada ao anticorpo por meio de um ligante, por meio da terminação N (amino) ou o C (terminação) da fração da droga peptídica.
[000138] As modalidades de auristatina exemplares incluem as frações DE e DF de droga monometil auristatina ligadas à terminação N, reveladas em Senter et al, Proceedings of the American Association for Cancer Research. Volume 45, resumo número 623, apresentadas em 28 de março de 2004, e descritas em U.S. 2005/0238649).
[000139] Uma modalidade exemplar de auristatina é MMAE (monometil auristatina E), em que a linha ondulada indica a anexação covalente ao ligante (L) de um conjugado de droga-anticorpo:
Figure img0009
[000140] Uma outra modalidade exemplar de auristatina é MMAF (monometil auristatina F), em que a linha ondulada indica a anexação covalente a um ligante (L) de um conjugado de droga-anticorpo (U.S.2005/0238649):
Figure img0010
[000141] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a invenção, compreendem uma unidade de ligante entre a unidade de droga citostática ou citotóxica e a unidade do anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante é clivável em condições intracelulares, de maneira tal que a clivagem do ligante libere a unidade de droga do anticorpo no ambiente intracelular. Ainda em uma outra modalidade, a unidade de ligante não é clivável e o droga, por exemplo, é liberado por degradação de anticorpo. Em algumas modalidades, o ligante é clivável por um agente clivável que está presente no ambiente intracelular (por exemplo, em um lisossomo, ou endossomo, ou cavéola). O ligante pode ser, por exemplo, um ligante peptidil que é clivado por uma peptidase intracelular ou enzima protease incluindo, mas sem limitação, uma protease lisossomal ou endossomal. Em algumas modalidades, o ligante peptidil tem pelo menos dois aminoácidos em tamanho, ou pelo menos três aminoácidos em tamanho. Os agentes de clivagem podem incluir catepsinas B e D e plasmina, todos os quais são conhecidos por hidrolisar os derivados de droga dipeptídeca, resultando na liberação da droga ativa dentro das células alvo (ver, por exemplo, Dubowchik e Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 83:67-123). Em uma modalidade específica, o ligante peptidil clivável por uma protease intracelular é um ligante Val-Cit (valina-citrulina) ou um ligante Phe-Lys (fenilalaninalisina) (ver, por exemplo, U.S.6214345, que descreve a síntese de doxorubicina com o ligante Val-Cit, e diferentes exemplos de ligantes Phe-Lys). Exemplos das estruturas de um ligante Val- Cit e um ligante Phe-Lys incluem, mas sem limitação, MC-vc-PAB descrito a seguir, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB ou MC-Phe-Lys-GABA, em que MC é uma abreviação para maleimido caproil, vc é uma abreviação para Val- Cit, PAB é uma abreviação para p-aminobenzilcarbamato e GABA é uma abreviação para ácido Y-aminobutírico. Uma vantagem de usar a liberação proteolítica intracelular do agente terapêutico é que o agente é atenuado tipicamente quando conjugado, e as estabilidades séricas dos conjugados são tipicamente elevadas.
[000142] Ainda em uma outra modalidade, a unidade de ligante não é clivável e a droga é liberada por degradação de anticorpo (ver U.S. 2005/0238649), Tipicamente, um ligante como este não é substancialmente sensível ao ambiente extracelular. Da maneira aqui usada, "não substancialmente sensível ao ambiente extracelular", no contexto de um ligante, significa que não mais que 20 %, tipicamente não mais que cerca de 15 %, mais tipicamente não mais que cerca de 10 %, e ainda mais tipicamente não mais que cerca de 5 %, não mais que cerca de 3 %, ou não mais que cerca de 1 % dos ligantes, em uma amostra de conjugado de droga-anticorpo composto, são clivados quando o composto do conjugado de droga-anticorpo apresenta-se em um ambiente extracelular (por exemplo, plasma). Se um ligante não for substancialmente sensível ao ambiente extracelular, este pode ser determinado, por exemplo, incubando o composto do conjugado de droga- anticorpo com plasma por um período de tempo pré-determinado (por exemplo, 2, 4, 8, 16 ou 24 horas), e a seguir quantificando a quantidade de medicamento livre presente no plasma.
[000143] As modalidades adicionais exemplares que compreendem MMAE ou MMAF, e vários componentes ligantes, apresenta as estruturas a seguir (em que Ab significa anticorpo e p, que representa a carga do medicamento (ou número médio de drogas citostáticas ou citotóxicas por molécula de anticorpo), é 1 a cerca de 8, por exemplo, p pode ser de 4-6, tal como de 3-5, ou p pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8)).
[000144] Os exemplos onde um ligante clivável é combinado com uma auristatina incluem MC-vc-PAB-MMAF (também determinado como vcMMAF) e MC-vc-PAB-MMAF (também determinado como vcMMAE), em que MC é uma abreviação para maleimido caproil, vc é uma abreviação para o ligante a base de Val-Cit (valina-citrulina), e PAB é uma abreviação para p-aminobenzilcarbamato:
Figure img0011
[000145] Outros exemplos incluem auristatinas combinadas com um ligante não clivável, tal como mcMMAF (mc (MC é o mesmo que mc neste contexto) é uma abreviação de maleimido caproil):
Figure img0012
[000146]
Figure img0013
[000147] A carga da droga citostática ou citotóxica é representada por p, e é o número médio de frações da droga citostática por anticorpo em uma molécula (também determinado como a razão droga para anticorpo, DAR). A carga de droga citostática ou citotóxica pode variar de 1 a 20 frações de droga por anticorpo, e pode ocorrer em aminoácidos com grupos funcionais usados tais como, mas sem limitação, grupos amino ou sulfidrila, como em lisina ou cisteína.
[000148] Dependendo da maneira da conjugação, p pode ser limitado pelo número de sítios de anexação no anticorpo, por exemplo, onde a anexação é um grupo sulfidrila, como na presente invenção. Em geral, os anticorpos não contêm muitos grupos sulfidrila (grupos de cisteína tiol livre e reativos) que podem ser ligados a uma fração de droga, uma vez que a maioria dos resíduos de cisteína tiol em anticorpos existe como pontes de dissulfeto. Portanto, em certas modalidades, um anticorpo pode ser reduzido com agente de redução tal como ditiotreitol (DTT) ou tricarboniletilfosfino (TCEP), em condições de redução parcial ou completa, para gerar resíduos reativos de sulfidrila. Em certas modalidades, a carga da droga para um ADC da invenção varia de 1 a cerca de 8, por exemplo, p pode ser de 4-6, tal como de 3-5, ou p pode ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, ou 8, uma vez que um máximo de 8 resíduos de sulfidrila se torna disponível após redução (parcial) do anticorpo (existem 8 cisteínas envolvidas na ligação dissulfeto entre cadeias).
[000149] Em uma modalidade, a fração de ligante de droga é vcMMAE. A fração de ligante de droga vcMMAE e os métodos de conjugação são revelados em WO20G4010957, U.S.7659241, U.S.7829531, U.S.7851437 e U.S. 11/833.028 (Seattle Genetics, Inc.), (que são aqui incorporados pela referência), e a fração do ligante de droga vcMMAE é ligada aos anticorpos anti-TF nas cisteínas usando um método similar àquele revelado anteriormente.
[000150] Em uma modalidade, a fração do ligante de droga é mcMMAF. A fração do ligante de droga mcMMAF e os métodos de conjugação são revelados em U.S.7498298, U.S.11/833.954 e WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.), (que são aqui incorporados pela referência), e a fração do ligante de droga mcMMAF está ligada aos anticorpos anti-TF nas cisteínas usando um método similar àqueles revelados anteriormente.
[000151] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-011-vcMMAE.
[000152] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-098-vcMMAE.
[000153] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-111-vcMMAE.
[000154] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-114-vcMMAE.
[000155] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-011-mcMMAF.
[000156] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-098-mcMMAF.
[000157] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-111-mcMMAF.
[000158] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é HuMab-TF-114-mcMMAF.
[000159] Em uma modalidade alternativa o anticorpo anti-TF é conjugado com uma fração terapêutica, tal como uma citotoxina, uma droga quimioterapêutica, uma citocina, um imunossupressor ou um radioisótopo. Tais conjugados são aqui referidos como "imunoconjugados".
[000160] Os imunoconjugados que incluem uma ou mais citotoxinas são referidos como "imuno-toxinas".
[000161] Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial (por exemplo, mata) para as células. Os agentes terapêuticos adequados para formar imunoconjugados da presente invenção incluem taxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorubicina, daunorubicina, di-hidróxi antracina diona, maitansina ou um análogo ou derivado destes, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1- desidrotestosterona, glicocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina; caliqueamicina ou análogos ou derivados desta; antimetabólitos (tais como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracil, decarbazina, hidroxiureia, asparaginase, gencitabina, cladribina), agentes de alquilação (tais como mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados da platina, tal como carboplatina; bem como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC-1055 (a.k.a. raquelmicina), ou análogos ou derivados de CC-1065), dolastatina, pirrolo[2,1-c][1,4] benzodiazepinas (PDBs) ou análogos desta, antibióticos (tais como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorubicina (anteriormente daunomicina), doxorubicina, idarubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), agentes anti-mitóticos (por exemplo, inibidores de tubulina), tais como toxina diftérica e moléculas relacionadas (tais como cadeia A de difteria e fragmentos ativos desta, e moléculas híbridas); toxina ricina (tal como ricina A ou uma toxina de cadeia A de ricina desglicosilada), toxina do cólera, uma toxina do tipo Shiga (SLT-I, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina pertussis, toxina tetânica, inibidor de protease Bowman-Birk da soja, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modecina, gelanina, cadeia A de abrina, cadeia A de modecina, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas diantina, proteínas de Phytolacca americana (PARI, PAPII, e PAP-S), inibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inibidor de Sapaonaria officinalis, toxinas gelonina, mitogelina, restritocina, fenomicina e enomicina. Outras moléculas conjugadas adequadas incluem peptídeos antimicrobianos/líticos tais como CLIP, Magainina 2, melitina, cecropina e P18; ribonuclease (RNAase), DNase I, enterotoxina A de Staphylococcus, proteína antiviral da fitolaca, toxina difterina e endotoxina de Pseudomonas. Ver, por exemplo, Pastan et al, Cell 47, 641 (1986) e Goldenberg, Calif, A Cancer journal for Clinicians 44, 43 (1994). Os agentes terapêuticos que podem ser administrados em combinação com conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, da maneira aqui descrita em qualquer parte, tais como, por exemplo, citocinas anti-câncer ou quimiocinas, também são candidatos para frações terapêuticas usadas para conjugação com um anticorpo revelado na presente invenção.
[000162] Em uma outra modalidade alternativa, um conjugado de droga- anticorpo anti-TF revelado na presente invenção compreende um ácido nucleico conjugado ou molécula associada ao ácido nucleico. Em uma modalidade como esta, o ácido nucleico conjugado é uma ribonuclease citotóxica, um ácido nucleico antissenso, uma molécula inibitória de RNA (por exemplo, uma molécula de RNAsi) ou um ácido nucleico imunoestimulatório (por exemplo, uma molécula de DNA contendo motivo CpG imunoestimulatório). Em uma outra modalidade alternativa, um anticorpo anti-TF da invenção é conjugado com um aptâmero ou uma ribozima, em vez de uma auristatina ou um análogo de peptídeo funcional, ou derivado deste.
[000163] Em uma outra modalidade alternativa, os conjugados de droga- anticorpo anti-TF que compreendem um ou mais aminoácidos radiomarcados são fornecidos. Um anticorpo anti-TF radiomarcado pode ser usado tanto para propósitos de diagnóstico quanto terapêuticos (a conjugação com moléculas radiomarcadas é uma outra característica possível). Exemplos não limitantes 3 14 15 35 90 99 125 131 de marcas para polipeptídeos incluem H, C, N, S, Y, Tc, I, I, e 186Re, Os métodos para preparar aminoácidos radiomarcados e derivados de peptídeo relacionado são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Junghans et al., em Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2a edição, Chafner and Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) e U.S. 4.681.581, U.S. 4.735.210, U.S. 5.101.827, U.S. 5.102.990 (U.S. RE35.500), U.S. 5.648.471 e U.S. 5.697.902. Por exemplo, um radioisótopo pode ser conjugado por um método de cloramina T.
[000164] Em uma modalidade, o anticorpo é conjugado com um radioisótopo ou com um quelato que contém radioisótopo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com um ligante-quelante, por exemplo, DOTA, DTPA ou tiuxetan, que permite que o anticorpo seja complexada com um radioisótopo. O anticorpo também pode compreender alternativamente ou ser conjugado com um ou mais aminoácidos radiomarcados ou outra molécula radiomarcada. Um anticorpo anti-TF radiomarcado pode ser usado tanto para propósitos de diagnóstico quanto terapêutico. Exemplos não limitantes de 3 14 15 35 90 99 125 111 131 186 213 radioisótopos incluem H, C, N, S, Y, Tc, I, In, I, Re, Bs, 225Ac e 227Th.
[000165] Os anticorpos anti-TF também podem ser quimicamente modificados por conjugação covalente com um polímero, por exemplo, para aumentar sua meia vida circulante. Os polímeros exemplares e métodos para anexá-los aos peptídeos são ilustrados, por exemplo, em U.S. 4.766.106, U.S. 4.179.337, U.S. 4.495.285 e U.S. 4.609.546. Os polímeros adicionais incluem polióis polioxietilados e polietileno glicol (PEG) (por exemplo, um PEG com um peso molecular entre cerca de 1.000 e cerca de 40.000, tal como entre cerca de 2.000 e cerca de 20.000). Isto pode ser usado, por exemplo, se o anticorpo anti-TF for um fragmento.
[000166] Qualquer método conhecido na técnica para conjugar o anticorpo anti-TF, revelado na presente invenção, com a(s) molécula(s) conjugada(s), tais como aquelas descritas anteriormente, pode ser empregado, incluindo os métodos descritos por Hunter et al., Nature 144, 945 (1962), David et al., Biochemistry 13, 1014 (1974), Pain et al., J. Immunol. Meth. 40, 219 (1981) e Nygren, 3. Histochem. and Cytochem, 30, 407 (1982). Tais anticorpos podem ser produzidos conjugando quimicamente a outra fração no lado N-terminal ou lado C-terminal do anticorpo anti-TF, ou fragmento deste (por exemplo, uma cadeia H ou L do anticorpo anti-TF) (ver, por exemplo, Antibody Engineering Handbook, editado por Osamu Kanemitsu, publicado por Chijin Shokan (1994)). Tais derivados de anticorpo conjugado também podem ser gerados por conjugação em resíduos internos ou açúcares, onde apropriado.
[000167] Os agentes podem ser acoplados tanto diretamente quanto indiretamente a um anticorpo anti-TF revelado na presente invenção. Um exemplo de acoplamento indireto de um segundo agente é o acoplamento por meio de uma fração espaçadora com os resíduos de cisteína ou lisina no anticorpo. Em uma modalidade, um anticorpo anti-TF é conjugado, por meio de um espaçador ou ligante, com uma molécula de pró-droga que pode ser ativada in vivo com uma droga terapêutica. Após a administração, os espaçadores ou ligantes são clivados por enzimas associadas a célula tumoral ou outras condições específicas do tumor, pelas quais a droga ativa é formada. Exemplos de tais tecnologias de pró-droga e ligantes são descritas em WO02083180, WO2004043493, WO2007018431, WO2007089149, WO2009017394 e WO201062171 por Syntarga BV, et al, (todos aqui incorporados pela referência). A tecnologia anticorpo-pró-droga adequada e os análogos de duocarmicina também podem ser encontrados na patente U.S. 6.989.452 (Medarex) (aqui incorporada pela referência).
[000168] Em uma modalidade, o anticorpo anti-TF da presente invenção é anexado a um ligante-quelante, por exemplo, tiuxetan, que permite que o anticorpo seja conjugado com um radioisótopo,
[000169] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um vetor de expressão que codifica um anticorpo da invenção. Por exemplo, se o anticorpo anti-TF da presente invenção for conjugado com uma fração terapêutica diferente de uma auristatina, ou um análogo de peptídeo funcional, ou derivado deste. Tais vetores de expressão podem ser usados, em uma modalidade, para expressar o anticorpo anti-TF da presente invenção, que pode ser então subsequentemente conjugado com uma fração da maneira aqui descrita.
[000170] Em uma modalidade, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais das sequências de aminoácidos selecionadas do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1-4, 5-8, 33-36, 37-40, 41-44, 45-48, 73-76 e 77-80.
[000171] Em uma outra modalidade particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeo que codifica uma ou mais das sequências de aminoácidos VH, selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 1, 5, 37 e 33.
[000172] Em uma modalidade particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais das sequências de aminoácidos VH CDR3, selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO 4, 8, 40 e 36.
[000173] Em uma outra modalidade particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais das sequências de aminoácidos VL, selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 41, 45, 77 e 73,
[000174] Em uma outra modalidade, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica uma ou mais das sequências de aminoácidos VL CDR3, selecionada do grupo que consiste em: SEQ ID NO: 44, 48, 80 e 76.
[000175] Em um modalidade particular, o vetor de expressão da invenção compreende uma sequência de nucleotídeos que codifica variantes de uma ou mais das sequências de aminoácidos anteriores, os ditos variantes com no máximo 25 modificações de aminoácido, tal como 20, tal como no máximo 15, 14, 13, 12 ou 11 modificações de aminoácido, tal como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 modificação de aminoácido, tais como deleções ou inserções, preferivelmente substituições, tais como substituições conservativas ou pelo menos 80 % de identidade com qualquer das ditas sequências, tal como pelo menos 85 % de identidade ou 90 % de identidade ou 95 % de identidade, tal como 96 % de identidade ou 97 % de identidade ou 98 % de identidade ou 99 % de identidade com qualquer das sequências de aminoácidos anteriormente mencionadas.
[000176] Em uma modalidade adicional, o vetor de expressão compreende adicionalmente uma sequência de nucleotídeos que codifica a região constante de uma cadeia leve, uma cadeia pesada ou tanto cadeias leves quanto pesadas de um anticorpo, por exemplo, um anticorpo humano.
[000177] Tais vetores de expressão podem ser usados para produção recombinante de anticorpos da invenção.
[000178] Um vetor de expressão, no contexto da presente invenção, pode ser qualquer vetor adequado, incluindo vetores de ácido nucleico cromossômicos, não cromossômicos e sintéticos (uma sequência de ácido nucleico que compreende um conjunto adequado de elementos de controle de expressão). Exemplos de tais vetores incluem derivados de SV40, plasmídeos bacterianos, DNA de fago, baculovírus, plasmídeos de levedura, vetores derivados de combinações de DNA plasmidial e de fago e vetores de ácido nucleico viral (RNA ou DNA). Em uma modalidade, um ácido nucleico que codifica anticorpo anti-TF é compreendido em um vetor de DNA ou RNA nú, incluindo, por exemplo, um elemento de expressão linear (da maneira descrita em, por exemplo, Sykes e Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), um vetor de ácido nucleico compactado (da maneira descrita em, por exemplo, U.S. 6.077.835 e/ou WO 00/70087), um vetor plasmidial tal como pBR322, pUC 19/18 ou pUC 118/119, um vetor de ácido nucleico com tamanho mínimo de “mosquito” (da maneira descrita em, por exemplo, Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), ou como um construto de vetor de ácido nucleico precipitado, tal como um construto precipitado em CaP04 (da maneira descrita em, por exemplo, WO 00/46147, Benvenisty and Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), e Coraro e Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Tais vetores de ácido nucleico e o uso destes são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, U.S. 5.589.466 e U.S. 5.973.972).
[000179] Em uma modalidade, o vetor é adequado para a expressão do anticorpo anti-TF em uma célula bacteriana. Exemplos de tais vetores incluem vetores de expressão tais como BlueScript (Stratagene), pIN vetores (Van Heeke & Schuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), pET vetores (Novagen, Madison WI) e similares.
[000180] Um vetor de expressão também pode ser alternativamente um vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura. Qualquer vetor adequado para a expressão em um sistema de levedura pode ser empregado. Os vetores adequados incluem, por exemplo, vetores que compreendem promotores constitutivos ou indutíveis, tais como fator alfa, álcool oxidase e PGH (revisados em: F. Ausubel et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley InterScience Nova Iorque (1987), e Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
[000181] Um ácido nucleico e/ou vetor também pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma sequência de secreção/localização, que pode alvejar um polipeptídeo, tal como uma cadeia de polipeptídeo nascente, com o espaço periplásmico ou em meio de cultura de célula. Tais sequências são conhecidas na técnica, e incluem secreção de peptídeos principais ou sinais, sequências que alvejam organelas (por exemplo, sequências de localização nuclear, sinais de retenção de ER, sequências de trânsito mitocondrial, sequências de trânsito de cloroplasto), localização de membrana/sequências âncora (por exemplo, sequências de transferência de parada, sequências âncora GPI) e similares.
[000182] Em um vetor de expressão da invenção, os ácidos nucleicos que codificam anticorpo anti-TF podem compreender ou estar associados com qualquer promotor, melhorador e outros elementos que facilitam a expressão adequados. Exemplos de tais elementos incluem promotores de expressão forte (por exemplo, promotor/melhorador CMV IE humano, bem como os promotores RSV, SV40, SL3-3, MMTV e HIV LTR), sequências de finalização (A) poli eficientes, uma origem de replicação para o produto de plasmídeo em E. coli, um gene de resistência a antibiótico como marcador selecionável, e/ou um sítio de clonagem conveniente (por exemplo, um poliligante). Os ácidos nucleicos também podem compreender um promotor indutível, ao contrário de um promotor constitutivo tal como CMV IE (os versados na técnica reconhecerão que tais termos são realmente descritores de um grau de expressão de gene em certas condições).
[000183] Em uma modalidade, o vetor de expressão que codifica anticorpo anti-TF pode ser posicionado e/ou distribuído na célula hospedeira, ou animal hospedeiro, por meio de um vetor viral.
[000184] Em um aspecto ainda adicional, a invenção se refere a uma célula hospedeira de eucarioto ou procarioto recombinante, tal como um transfectoma, que produz um anticorpo anti-TF da invenção da maneira aui definida, ou uma molécula bi-específica da invenção da maneira aqui definida. Exemplos de células hospedeiras incluem células de levedura, bacterianas e de mamífero, tais como células CHO ou HEK. Por exemplo, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma célula que compreende um ácido nucleico estavelmente integrado no genoma celular, que compreende uma sequência que codifica a expressão de um anticorpo anti-TF da presente invenção. Em uma outra modalidade, a presente invenção fornece uma célula que compreende um ácido nucleico não integrado, tal como um plasmídeo, cosmídeo, fagemídeo, ou elemento de expressão linear, que compreende uma sequência que codifica a expressão de um anticorpo anti-TF da invenção.
[000185] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um hibridoma que produz um anticorpo da invenção da maneira aqui definida. Ainda em um aspecto adicional, a invenção se refere a um animal não humano transgênico que compreende ácidos nucleicos que codificam uma cadeia pesada humana e uma cadeia leve humana, em que o animal ou planta produz um anticorpo da invenção. A geração de tais hibridomas e animais transgênicos foi descrita anteriormente.
[000186] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um método para produzir um anticorpo anti-TF da invenção, o dito método compreendendo as etapas de: a) cultivar um hibridoma ou um célula hospedeira da invenção da maneira aqui descrita anteriormente, e b) purificar o anticorpo da invenção a partir do meio de cultura, e opcionalmente c) transformar o anticorpo anti-TF em um ADC. Composição farmacêutica
[000187] Mediante purificação, os conjugados de droga-anticorpo anti- TF podem ser formulados em composições farmacêuticas usando carreadores ou excipientes farmacêuticos bem conhecidos.
[000188] As composições farmacêuticas podem ser formuladas com carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos de acordo com técnicas convencionais tais como aquelas reveladas em Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a Edição, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
[000189] Os carreadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis, bem como quaisquer outros adjuvantes e excipientes conhecidos, podem ser adequados para o conjugado de droga-anticorpo da presente invenção e o modo de administração de escolha. Adequadamente, com relação aos carreadores e outros componentes de composições farmacêuticas, determina- se com base na ausência de impacto negativo significativo, as propriedades biológicas desejadas do composto ou composição farmacêutica escolhida da presente invenção (por exemplo, menos de um impacto substancial (10 % ou menos com relação à inibição, 5 % ou menos com relação à inibição, etc.)) na ligação de antígeno.
[000190] Uma composição farmacêutica da presente invenção também pode incluir diluentes, cargas, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-20 ou Tween-80), estabilizantes (por exemplo, açúcares ou aminoácidos sem proteína), conservantes, tecido fixadores, solubilizantes, e/ou outros materiais adequados para a inclusão em uma composição farmacêutica.
[000191] As células cancerígenas que superexpressam TF podem ser alvos particularmente bons para os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da invenção, uma vez que mais anticorpos podem ser ligados por célula. Assim, em uma modalidade, um paciente com câncer a ser tratado com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da invenção é um paciente, por exemplo, um paciente com câncer pancreático, câncer de pulmão ou câncer colorretal, que foi diagnosticado por apresentar uma ou mais mutações em K-ras, e/ou uma ou mais mutações em p53 em suas células tumorais. A expressão de TF está no controle de dois principais eventos transformantes que direcionam a progressão da doença (ativação de oncogene K-ras e inativação do supressor de tumor p53), de uma maneira dependente de proteína quinase ativada por MEK/mitógeno (MARK) e fosfatidilinositol 3'-quinase (PI3K) (Yu et al. (2005) Blood 105: 1734).
[000192] Os níveis de dosecagem atuais do conjugado de droga- anticorpo nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados, de maneira a obter uma quantidade do conjugado de droga- anticorpo, que é eficiente para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente particular, composição e modo de administração, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosecagem selecionado dependerá de uma variedade de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições particulares da presente invenção empregada, ou a amida desta, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto particular que está sendo empregado, a duração do tratamento, outras drogas, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições particulares empregadas, a idade, sexo, peso, condição, saúde geral e histórico médico anterior do paciente que está sendo tratado, e fatores similares bem conhecidos na técnica médica.
[000193] A composição farmacêutica pode ser administrada por qualquer via ou modo adequado. As vias de administração adequadas um conjugado de droga-anticorpo da presente invenção são be conhecidas na técnica e podem ser selecionadas pelos versados na técnica.
[000194] Em uma modalidade, a composição farmacêutica da presente invenção é administrada parenteralmente.
[000195] Os termos "administração parenteral" e "administrado parenteralmente", da maneira aqui usada, significa modos de administração sem ser administração enteral e tópica, em geral por injeção, e incluem injeção e infusão epidérmica, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intraespinhal, intracraniana, intratorácica, epidural e intraesternal.
[000196] Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada por injeção ou infusão intravenosa ou subcutânea.
[000197] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem qualquer e todos os solventes adequados, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes de isotonicidade, antioxidantes e agentes de retardo de absorção, e similares que são fisiologicamente compatíveis com o conjugado de droga-anticorpo da presente invenção.
[000198] Exemplos de carreadores aquosos e não aquosos adequados, que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da presente invenção, incluem água, salina, salina tamponada com fosfato, etanol, dextrose, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares), e misturas adequados destes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão e óleo de gergelim, soluções coloidais de carboximetil celulose, goma tragacanto e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila e/ou vários tampões. Outros carreadores são bem conhecidos na técnica farmacêutica.
[000199] Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis, e pós estéreis, para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Exceto quando qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, o uso deste nas composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado.
[000200] A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersões, e pelo uso de agentes tensoativos.
[000201] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender antioxidantes farmaceuticamente aceitáveis, por exemplo, (1) antioxidantes solúveis em água, tais como ácido ascórbico, cloridrato de cisteína, bissulfato de sódio, metabissulfeto de sódio, sulfeto de sódio e similares; (2) antioxidantes solúveis em óleo, tais como palmitato de ascorbiça, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, galato de propila, alfa-tocoferol e similares; e (3) agentes de quelação de metal, tais como ácido cítrico, ácidos etilenodiamina tetra-acético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico e similares.
[000202] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem compreender agentes de isotonicidade, tais como açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol, glicerol ou cloreto de sódio nas composições.
[000203] As composições farmacêuticas da presente invenção também podem conter um ou mais adjuvantes apropriados para a via de administração escolhida, tais como conservantes, agentes de umectação, agentes emulsificantes, agentes dispersantes, conservantes ou tampões, que podem melhorar a vida em prateleira ou eficiência da composição farmacêutica. O conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser preparado com carreadores que protegerão o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, adesivos transdérmicos, e sistemas de distribuição microencapsulada. Tais carreadores podem incluir gelatina, monoestearato de glicerila, diestearato de glicerila, polímeros biodegradáveis e biocompatíveis tal como etileno acetato de vinila, polianidretos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático sozinho ou com uma cera, ou outros materiais bem conhecidos na técnica. Os métodos para a preparação de tais formulações são em geral conhecidos pelos versados na técnica. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, 1978.
[000204] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser formulado para garantir a distribuição adequada in vivo. Os carreadores farmaceuticamente aceitáveis para a administração parenteral incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersão injetáveis estéreis. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Com a exceção de que qualquer meio ou agente convencional é incompatível com o composto ativo, o uso destes na composições farmacêuticas da presente invenção é contemplado. Os compostos ativos suplementares também podem ser incorporados nas composições.
[000205] As composições farmacêuticas para injeção têm que ser tipicamente estéreis e estáveis nas condições de fabricação e armazenamento. A composição pode ser formulada como uma solução, micro-emulsão, lipossomo, ou outra estrutura ordenada adequada com concentração elevada de droga. O carreador pode ser um solvente aquoso ou não aquoso ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol e similares), e misturas adequadas destes, óleos vegetais, tais como óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tal como oleato de etila. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de dispersão e pelo uso de agentes tensoativos. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como glicerol, manitol, sorbitol, ou cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada das composições injetáveis pode ser ocorrer pela inclusão na composição de um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais monoestearato e gelatina. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o conjugado de droga-anticorpo anti-TF na quantidade exigida em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes, por exemplo, enumerados da maneira anteriormente, se exigido, seguido por esterilização por microfiltração. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o conjugado de droga-anticorpo anti-TF em um veículo estéril que contém uma meio de dispersão básico e os outros ingredientes exigidos, por exemplo, a partir daqueles enumerados anteriormente. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, exemplos de métodos de preparação são secagem à vácuo e secagem por congelamento (liofilização), que rendem um pó do ingrediente ativo e qualquer ingrediente desejado adicional, a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração destes.
[000206] As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o conjugado de droga-anticorpo anti-TF, na quantidade exigida, em um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados anteriormente, se desejado, seguido por esterilização por microfiltração. Em geral, as dispersões são preparadas incorporando o conjugado de droga-anticorpo anti-TF em um veículo estéril que contém um meio de dispersão básico, e os outros ingredientes exigidos a partir dos enumerados anteriores. No case de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, os exemplos de métodos de preparação são secagem à vácuo e secagem por congelamento (liofilização), que rendem um pó do conjugado de droga-anticorpo anti-TF, e qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução previamente esterilizada por filtração deste.
[000207] A composição farmacêutica da presente invenção pode conter um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, ou uma combinação de conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção.
[000208] Da maneira descrita anteriormente, em um outro aspecto, a invenção se refere ao conjugado de droga-anticorpo anti-TF da invenção, da maneira aqui definida, para uso como um medicamento.
[000209] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da invenção podem ser usados para inúmeros propósitos. Em particular, os conjugados de droga- anticorpo anti-TF da invenção podem ser usados para o tratamento de várias formas de câncer. Em um aspecto, os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da invenção são usados para o tratamento de vários tipos de câncer sólido, tais como: tumores do sistema nervoso central, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de célula não pequena), câncer de mama câncer (tal como câncer de mama triplo negativo), câncer no esôfago, câncer no estômago, câncer hepático e biliar, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de próstata, câncer endometrial, câncer no ovário, melanoma maligno, sarcoma (tecido macio, por exemplo, osso e músculo), tumores de origem primária desconhecida (isto é, primárias desconhecidas), leucemia, câncer na medula óssea (tal como mieloma múltiplo) leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica e linfoma não Hodgkin, leucemia mielóide aguda (AMI), câncer de pele, glioma, câncer do cérebro, útero e reto.
[000210] A inflamação autoimune adicional, tais como miopatias ou esclerose múltipla, pode ser alvejada com os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção.
[000211] Os distúrbios hemostáticos relacionados ao câncer também podem ser alvejados com a presente invenção.
[000212] As doenças com inflamação adicionais, tais como miopatias, artrite reumatoide, osteoartrite, espondilite anquilosante, gota, espondilartropatias, espondilite anquilosante, síndrome de Reiter, artropatia psoriática, espondilite enteropática, artropatia juvenil, artropatia reativa, artrite infecciosa ou pós-infecciosa, artrite tuberculosa, artrite viral, artrite fúngica, artrite sifilítica, glomerulonefrite, doença renal em estágio final, lúpus eritematoso sistêmico, mb. Crohn, colite ulcerativa, doença intestinal inflamatória, fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD), asma, asma alérgica, bronquite, bronquiolite aguda, bronquiolite aguda, fibrose pulmonar idiopática ou esclerose múltipla, pode ser alvejadas com os anticorpos anti-TF da presente invenção.
[000213] Igualmente, as doenças vasculares tais como restenose vascular, doença vascular do miocárdio, doença vascular cerebral, retinopatia e degeneração macular incluindo, mas sem limitação, AMD úmida, podem ser tratadas com conjugados de droga-anticorpo anti-TF.
[000214] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para o tratamento de pacientes com risco cardiovascular, tal como aterosclerose, hipertensão, diabetis, dislipidemia, e síndrome coronária aguda incluindo, mas sem limitação, infarto agudo do miocárdio, acidente vascular.
[000215] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para a inibição de trombose, tal como DVT, embolia renal, embolia pulmonar, trombose arterial, ou para tratar trombose que ocorre após cirurgia arterial, enxertos de desvio vascular periférico ou enxertos de desvio da artéria coronária, desvio arterio-venoso, remoção de uma implementação, tal como um stent ou cateter.
[000216] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para a inibição de lesão por reperfusão isquêmica renal.
[000217] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para o tratamento de hiper- lipoproteineimia ou hiper-paratiroidismo.
[000218] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para o tratamento de vasculite, vasculite positiva para ANCA ou doença de Behcet.
[000219] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para bloquear insuficiência respiratória induzida pelo trauma, tal como síndrome do estresse respiratório agudo ou lesão pulmonar aguda.
[000220] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para bloquear a disfunção de órgão induzida por infecção, tal como insuficiência renal, síndrome do estresse respiratório agudo, ou lesão pulmonar aguda.
[000221] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para tratar vários distúrbios tromboembólicos, tais como aqueles que surgem com a angioplastia, infarto do miocárdio, angina instável e estenoses da artéria coronária.
[000222] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados em um ajuste profilático para tratar complicações mediadas por TF em infecções sistêmicas, tal como sepse ou pneumonia.
[000223] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados como tratamento profilático de pacientes com vasos ateroscleróticos em risco de trombose.
[000224] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para tratamento de doença enxerto contra hospedeiro.
[000225] Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção também podem ser usados para aumentar a enxertia de célula beta em transplante de ilhota, para prevenir vasculopatia do aloenxerto cardíaco (CAV) e para prevenir a rejeição aguda ao enxerto.
[000226] Similarmente, a invenção se refere a um método para inibir o crescimento e/ou proliferação de uma célula tumoral que expressa TF, compreendendo a administração, a um indivíduo que precisa deste, de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da invenção. Em uma modalidade, a dita célula tumoral está envolvida no câncer, tal como câncer de próstata, câncer de pulmão (tal como câncer de pulmão de célula não pequena), câncer de mama (tal como câncer de mama triplo negativo), câncer colorretal (tal como câncer colorretal metastático), câncer pancreático, câncer endometrial, câncer no ovário, melanoma cutâneo, leucemia, câncer na medula óssea (tal como mieloma múltiplo), leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crônica e linfoma não Hodgkin, câncer de pele, câncer de próstata, glioma, câncer do cérebro, rins, útero, bexiga, leucemia mielóide aguda (AML) e reto.
[000227] Igualmente, a invenção se refere ao uso de conjugados de droga-anticorpo anti-TF que se ligam ao TF humano para a preparação de uma droga no tratamento de câncer, tal como aquele das indicações específicas de câncer mencionadas anteriormente.
[000228] Em uma modalidade, a seleção de pacientes a serem tratados com conjugado de droga-anticorpo anti-TF baseia-se no nível de TF em sua urina e/ou sangue. Em uma modalidade particular, o paciente a ser tratado apresenta um nível relativamente alto de TF na urina e/ou sangue. Por exemplo, o paciente a ser tratado pode apresentar um nível de TF na urina de mais de 20 ng/mL, tal como mais de 40 ng/mL, por exemplo, mais de 100 mg/mL, tal como mais de 200 ng/mL. Alternativamente, ou além disso, o nível de TF no soro doa pacientes pode ser mais de 100 pg/mL, tal como mais de 200 pg/mL. Isto pode ser, por exemplo, determinado usando um ELISA. Os métodos para realizar isto incluem, mas sem limitação, aqueles descritos a seguir, com relação aos usos diagnósticos.
[000229] Entretanto, também está no escopo da presente invenção tratar pacientes com conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção que apresente um menor nível de TF na urina e/ou sangue.
[000230] Em uma modalidade, a seleção de pacientes a serem tratados com conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser baseada no nível de expressão de TF. O nível de expressão de TF pode ser avaliado expondo os pacientes a um anticorpo anti-TF radiomarcado, e então medindo o nível de radioatividade nos pacientes. O anticorpo anti-TF radiomarcado pode ser um anticorpo anti-TF descrito na presente invenção, isto é, um anticorpo dos conjugados de droga-anticorpo anti-TF aqui descritos, ou it pode ser um outro anticorpo anti-TF. Exemplos de radiomarcas podem ser qualquer daquelas descritas anteriormente com à radiomarcação de anticorpos. Os métodos para realizar isto incluem, mas sem limitação, aqueles descritos a seguir, com relação aos usos diagnósticos.
[000231] Em uma modalidade adicional do métodos de tratamento da presente invenção, a eficiência do tratamento deve ser monitorada durante a terapia, por exemplo, em pontos de tempo pré-definidos. Em uma modalidade, a eficiência pode ser monitorada medindo o nível de TF na urina ou sangue, por exemplo, por ELISA. Os métodos para realizar isto incluem, mas sem limitação, aqueles descritos a seguir, com relação aos usos diagnósticos. Em uma outra modalidade, a eficiência pode ser determinada por visualização da área da doença, por exemplo, realizando uma ou mais varreduras PET-CT, por exemplo, usando uma anticorpo anti-TF marcado, tal como um anticorpo anti-TF marcado descrito na presente invenção. Além do mais, os anticorpos anti-TF marcados, tais como anticorpos anti-TF 011, 098, 114 e 111 marcados aqui revelados, podem ser usados para detectar tumores produzidos por TF, por exemplo, usando uma varredura PET-CT.
[000232] Os regimes de dosecagem nos métodos de tratamento e usos anteriores são ajustados para fornecer a resposta terapêutica desejada ideal. Por exemplo, uma dose única pode ser administrada, várias doses divididas podem ser administradas com o tempo, ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada, da maneira indicada pelas exigênciea da situação terapêutica. As composições parenterais podem ser formuladas na forma de dosage única para facilitar a administração e uniformidade da dosecagem. A forma de dosecagem única, da maneira aqui usada, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para os sujeitos a serem tratados; cada unidade contém uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o carreador farmacêutico exigido. A especificação para as formas de dosecagem única da presente invenção é determinada e diretamente dependente de: (a) as características exclusivas do composto ativo e o efeito terapêutico particular a ser atingido, e (b) as limitações inerentes na técnica de elaborar um composto ativo como este para o tratamento da sensibilidade em indivíduos.
[000233] As dosagens e os regimes de dosecagem eficientes para os conjugados de droga-anticorpo anti-TF dependem da doença ou condição a ser tratada, e podem ser determinadas pelos versados na técnica. Uma faixa não limitante exemplar para uma quantidade terapeuticamente eficiente de um composto da presente invenção é cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como cerca de 0,1 -50 mg/kg, por exemplo, cerca de 0,1 - 2,0 mg/kg, tal como cerca de 0,110 mg/kg, tal como cerca de 0,5-5 mg/kg, por exemplo, cerca de 5 mg/kg, tal como cerca de 4 mg/kg, ou cerca de 3 mg/kg, ou cerca de 2 mg/kg, ou cerca de 1 mg/kg, ou cerca de 0,5 mg/kg, ou cerca de 0,3 mg/kg. Uma faixa não limitante exemplar para uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção é cerca de 0,0230 mg/kg, tal como cerca de 0,1-20 mg/kg, ou cerca de 0,5-10 mg/kg, ou cerca de 0,5-5 mg/kg, por exemplo, cerca de 1-2 mg/kg, em particular dos anticorpos 011, 098, 114 ou 111, da maneira aqui revelada.
[000234] Os versados na técnica podem determinar e prescrever facilmente a quantidade eficiente exigida da composição farmacêutica. Por exemplo, os médicos podem iniciar as doses do conjugado de droga-anticorpo anti-TF, empregado na composição farmacêutica, em níveis menores que aqueles exigidos, a fim de atingir o efeito terapêutico desejado e aumentar gradualmente a dosecagem, até que o efeito desejado seja atingido. Em geral, uma dose diária adequada de uma composição da presente invenção será aquela quantidade do composto que é a menor dose eficiente para produzir um efeito terapêutico. Uma dose eficiente com esta dependerá, em geral, dos fatores descritos anteriormente. A administração, por exemplo, pode ser intravenosa, intramuscular, intraperitoneal ou subcutânea e, por exemplo, pode ser administrada próxima ao sítio do alvo. Se desejado, a dose diária eficiente de uma composição farmacêutica pode ser administrada como duas, três, quatro, cinco, seis ou mais subdoses administradas separadamente em intervalos apropriados durante todo o dia, opcionalmente nas formas de dosecagem única. Embora seja possível que um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção seja administrado sozinho, é preferível administrar o conjugado de droga-anticorpo anti-TF como uma composição farmacêutica da maneira descrita anteriormente.
[000235] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF pode ser administrado por infusão em uma dosecagem semanal de 10 a 1.500 mg/m2, tal como de 30 a 1.500 mg/m2, ou tal como de 50 a 1.000 mg/m2, ou tal como de 10 a 500 mg/m2, ou tal como de 100 a 300 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, por exemplo, 1 a 8 vezes, tal como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua, por um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas.
[000236] Em uma modalidade, os conjugados de droga-anticorpo anti- TF podem ser administrados por infusão a cada três semanas, em uma dosecagem de 30 a 1.500 mg/m2, tal como de 50 a 1.000 mg/m2 ou 100 a 300 mg/m2. Tal administração pode ser repetida, por exemplo, 1 a 8 vezes, tal como 3 a 5 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua por um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas,
[000237] Em uma modalidade, os conjugados de droga-anticorpo anti- TF podem ser administrados por infusão contínua lenta, por um longo período, tal como mais de 24 horas, a fim de reduzir os efeitos colaterais tóxicos.
[000238] Em uma modalidade, os conjugados de droga-anticorpo anti- TF podem ser administrados em uma dosecagem semanal de 50 mg a 2.000 mg, tal como, por exemplo, 50 mg, 100 mg, 200 mg, 300 mg, 500 mg, 700 mg, 1.000 mg, 1.500 mg ou 2.000 mg, por até 16 vezes, tal como de 4 a 10 vezes, tal como de 4 a 6 vezes. A administração pode ser realizada por infusão contínua por um período de 2 a 24 horas, tal como de 2 a 12 horas. Tal regime pode ser repetido uma ou mais vezes, se necessário, por exemplo, após 6 meses ou 12 meses. A dosecagem pode ser determinada ou ajustada medindo a quantidade de conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção no sangue mediante administração, por exemplo, levando-se em conta uma amostra biológica e usando anticorpos anti-idiotípicos que alvejam a região de ligação de antígeno dos conjugados de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção.
[000239] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF pode ser administrado por terapia de manutenção tal como, por exemplo, uma vez por semana por um período de 6 meses ou mais.
[000240] Em uma modalidade, os conjugados de droga-anticorpo anti- TF podem ser administrados por um regime, incluindo uma infusão de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, seguido por uma infusão de um anticorpo anti-TF da presente invenção, tais como anticorpo 011, 098, 114 ou 111 aqui revelados que contêm um radioisótopo. O regime pode ser repetido, por exemplo, 7 a 9 dias depois.
[000241] Como exemplos não limitantes, o tratamento de acordo com a presente invenção pode ser fornecido como uma dosecagem semanal, bi- semanal, tri-semanal ou mensal, de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, em um quantidade de cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como 0,3-3 mg/kg, por exemplo, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0, 1,1, 1,2, 1,3, 1,4, 1,5, 1,6, 1,7, 1,8, 1,9, 2, 2,1, 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 2,4, 25, 26, 27, 2,8, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 2.9, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40 dias, ou alternativamente pelo menos uma de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 semanas, ou em alguns casos 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 semanas após o ínício do tratamento, ou qualquer combinação destes, usando doses únicas ou divididas a cada 24, 12, 8, 6, 4, ou 2 horas, ou qualquer combinação destas.
[000242] Uma "quantidade eficiente" para a terapia do tumor também pode ser medida por sua capacidade de estabilizar a progressão da doença. A capacidade de um composto para inibir o câncer pode ser avaliada em um sistema de modelo animal, preditivo da eficiência em tumores humanos. Alternativamente, esta propriedade de uma composição pode ser avaliada examinando a capacidade do composto em inibir o crescimento celular, ou induzir apoptose por ensaios in vitro conhecidos pelos versados na técnica. Uma quantidade terapeuticamente eficiente de um composto terapêutico pode diminuir o tamanho do tumor, ou melhorar de outra forma os sintomas em um sujeito. Os versados na técnica podem ser capazes de determinar tais quantidades com base em tais fatores como o tamanho do sujeito, a gravidade dos sintomas do sujeito, e a composição particular ou via de administração selecionada.
[000243] Um conjugado de droga-anticorpo anti-TF também pode ser administrado profilaticamente, a fim de reduzir o risco de desenvolver câncer, retardar o início da ocorrência de um evento na progressão do câncer, e/ou reduzir o risco de recorrência quando um câncer está em remissão. Isto pode ser usado especialmente em pacientes em que é difícil localizar um tumor, que é conhecido por estar presente, em virtude de outros fatores biológicos.
[000244] O conjugado de droga-anticorpo anti-TF também pode ser administrado em terapia de combinação, isto é, combinado com outros agentes terapêuticos relevante para a doença ou condição a ser tratada. Dessa maneira, em uma modalidade, a droga com o conjugado de droga-anticorpo anti-TF é para a combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tais como um agente citotóxico, quimioterapêutico ou anti-angiogênico.
[000245] Tal administração combinada pode ser simultânea, separada ou sequencial. Para administração simultânea, os agentes podem ser administrados como uma composição ou como composições separadas, da maneira apropriada. A presente invenção, assim, também fornece métodos para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF da maneira descrita anteriormente, cujos métodos compreendem administração de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção combinado com um ou mais agente terapêuticos adicionais descritos a seguir.
[000246] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF em um sujeito, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, e pelo menos um agente quimioterapêutico, a um sujeito que precisa deste.
[000247] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga- anticorpo anti-TF da presente invenção, e pelo menos um agente quimioterapêutico, a um sujeito que precisa deste.
[000248] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF, da presente invenção, para a preparação de uma composição farmacêutica a ser administrada com pelo menos um agente quimioterapêutico para tratar o câncer.
[000249] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de um antimetabólito, tal como metotrexato, 6- mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluoruracil, decarbazina, hidroxiureia, asparaginase, gencitabina, cladribina e agentes similares.
[000250] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de um agente de alquilação, tal como mecloretamina, tioepa, clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatina e outros derivados de platina, tal como carboplatina, e agentes similares.
[000251] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de um agente anti-mitótico, tais como taxanos, por exemplo, docetaxel, e paclitaxel, e alcalóides da vinca, por exemplo, vindesina, vincristina, vinblastina e vinorelbina.
[000252] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de um inibidor de topoisomerase, tal como topotecano ou irinotecano.
[000253] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de uma droga citostática, tal como etoposida e teniposida.
[000254] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de um inibidor de fator de crescimento, tal como um inibidor de ErbB1 (EGFR) (tais como Iressa, erbitux (cetuximab), tarceva e agentes similares), um inibidor de ErbB2 (Her2/neu) (tais como herceptina e agentes similares) e agentes similares.
[000255] Em uma modalidade, um agente quimioterapêutico como este pode ser selecionado de um inibidor de tirosina quinase, tais como imatinib (Giivec, Gleevec STI571), lapatinib, PTK787/ZK222584 e agentes similares.
[000256] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF em um sujeito, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, e pelo menos um inibidor de angiogênese, neovascularização e/ou outras vascularização, a um sujeito que precisa deste.
[000257] Exemplos de tais inibidores de angiogênese são inibidores de uroquinase, inibidores da matriz metaloprotease (tais como marimastat, neovastat, BAY 12-9566, AG 3340, BMS-275291 e agentes similares), inibidores de migração e proligeração de célula endotelial (tais como TNP- 470, esqualamina, 2-metoxiestradiol, combretastatinas, endostatina, angiostatina, penicilamina, SCH66336 (Schering-Plough Corp, Madison, NJ), R1 15777 (Janssen Pharmaceutica, Inc, Titusville, NJ) e agentes similares), antagonistas de fatores de crescimento angiogênicos (tais como ZD6474, SU6668, anticorpos contra agentes angiogênicos e/ou seus receptores (tais como VEGF, bFGF e angiopoietina-1), talidomida, análogos de talidomida (tal como CC-5013), Sugen 5416, SU5402, ribozima antiangiogênica (tal como angiozima), interferon α (tal como interferon α 2a), suramina e agentes similares), inibidores de VEGF-R quinase e outros inibidores de tirosina quinase anti-angiogênica (tal como SU011248), inibidores de integrina específica endotelial/sinalização de sobrevivência (tais como vitaxina e agentes similares), antagonistas/quelantes de cobre (tais como tetratiomolibdato, captopril e agentes similares), carboxiamido-triazol (CAI), ABT-627, CM101, interleucina-12 (IL-12), IM862, PNU145156E, bem como moléculas de nucleotídeo que inibem a angiogênese (tal como VEGF-DNAc antissenso, DNAc que codifica angiostatina, DNAc que codifica p53 e DNAc que codifica receptor-2 de VEGF deficiente) e agentes similares.
[000258] Outros exemplos de tais inibidores de angiogênese, neovascularização e/ou outra vascularização são derivados de heparina anti- angiogênica e moléculas relacionadas (por exemplo, heparinase III), temozolomida, NK4, fator inibitório de migração de macrófago (MIF), inibidores de ciclo-oxigenase-2, inibidores de fator 1 induzido por hipóxia, isoflavonas de soja anti-angiogênicas, oltipraz, fumagilina e análogos desta, análogos de somatostatina, polissulfato de pentosana, tecogalan sódico, daiteparina, tunstatina, trombospondina, NM-3, combrestatina, canstatina, avastatina, anticorpos contra outros alvos relevantes (tais como integrina anti- alfa-v/beta-3 e mAbs anti-quininostatina) e agentes similares.
[000259] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser um imunógeno anti-câncer, tal como um antígeno de câncer/antígeno associado a tumor (por exemplo, molécula de adesão de célula epitelial (EpCAM/TACSTD1), mucina 1 (MUC1), antígeno carcinoembrionário (CEA), glicoproteína 72 associada a tumor (TAG-72), gp100, Melan-A, MART-1, KDR, RCAS1, MDA7, vacinas virais associadas a câncer (por exemplo, vacinas de papilomavírus humano), proteínas de choque térmico derivadas de tumor e agentes similares. Inúmeros outros antígenos de câncer/antígenos associados ao tumor adequados, descritos aqui em alguma parte, e moléculas similares conhecidas na técnica, também podem ser usados alternativamente em tal modalidade. Os peptídeos imunogênicos anti-câncer também incluem "vacinas" anti-idiotípicas, tais como anticorpos BEC2 anti- idiotípicos, Mitumomab, CeaVac e anticorpos anti-idiotípico relacionados, anticorpo anti-idiotipico para o anticorpo MG7, e outros anticorpos anti- idiotípicos anti-câncer (ver, por exemplo, Birebent et al., Vaccine, 21(15), 1601-12. (2003), Li et al., Chin Med J (Engl). 114(9), 962-6 (2001), Schmitt et al., Hybridoma. 13(5), 389-96 (1994), Maloney et al., Hybridoma. 4(3), 191-209 (1985). Raychardhuri et. al., 2 Immunol, 137(5), 1743-9 (1986), Pohl et al., Int J Cancer. 50(6), 958-67 (1992),. Bohlen et al., Cytokines Mol Ther. 2(4), 231-8 (1996) e Maruyama, J Immunol Methods. 264(1-2), 121-33 (2002.)). Tal Abs anti-idiotípico pode ser opcionalmente conjugado com um carreador, que pode ser uma molécula sintética (tipicamente inerte), uma proteína (por exemplo, hemocianina de lapa californiana (KLH) (ver, por exemplo, Ochi et al., Eur 3 Immunol. 17(11), 1645-8 (1987)), ou uma célula (por exemplo, uma célula vermelha do sangue, ver, por exemplo Wi et al., J Immunol Methods. 122(2), 227-34 (1989)).
[000260] Em uma modalidade da invenção, o conjugado de droga- anticorpo anti-TF é combinado com uma droga imuno-oncológica, tal como Yervoy (ipilimumab), que age potencialmente induzindo a imunidade de célula T contra o câncer. A citorredução com o conjugado de droga-anticorpo anti-TF, em combinação com uma droga imunoestimulatória, pode fornecer benefícios clínicos significativos aos pacientes.
[000261] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser uma citocina anti-câncer, quimiocina ou combinação destas. Exemplos de citocinas e fatores de crescimento adequados incluem TFNy, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-18, IL-23, IL-24, IL-27, IL-28a, IL-28b, IL-29, KGF, IFNα (por exemplo, INFα2b), IFNβ, GM-CSF, CD40L, ligante de Flt3, fator de célula tronco, ancestima e TNFα. As quimiocinas adequadas podem incluir quimiocinas negativas para Glu-Leu-Arg (ELR), tais como IP- 10, MCP-3, MIG e SDF-1α das família de quimiocina humana CXC e C-C. As citocinas adequadas incluem derivados de citocina, variantes de citocina, fragmentos de citocina e proteínas de fusão de citocina. Estes e outros métodos ou usos que envolvem aqui ácidos nucleicos que codificam peptídeo de ocorrência natural podem ser, alternativamente ou adicionalmente, realizados por "ativação de gene" e técnicas de supra-regulação de recombinação homóloga de gene, tais como as que são descritas em U.S. 5.968.502, U.S. 6.063.630 e U.S. 6.187.305 e EP 0505500.
[000262] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser um regulador do controle de ciclo celular/apoptose (ou "agente de regulação"). Um regulador de controle de ciclo celular/apoptose pode incluir moléculas que alvejam e modulam os reguladores de controle do ciclo celular/apoptose, tais como (i) cdc-25 (tal como NSC 663284), (ii) quinases dependentes de ciclina que superestimulam o ciclo celular (tal como flavopiridol (L868275, HMR1275), 7-hidroxi-estaurosporina (UCN-01, KW- 2401), e roscovitina (R-roscovitina, CYC202)), e (iii) moduladores de telomerase (tais como BIBR1532, SOT-095, GRN163 e composições descritas, por exemplo, em U.S. 6.440.735 e U.S. 6.713.055). Exemplos não limitantes de moléculas que interferem com as vias apoptóticas incluem ligante de indução de apoptose relacionado a TNF (TRAIL)/ligante 2 de apoptose (Apo-2L), anticorpos que ativam receptores TRAIL, IFNs e Bcl-2 antissenso.
[000263] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser um agente de regulação hormonal, tais como agentes usados para terapia anti-andrógena e anti-estrógena. Exemplos de tais agentes de regulação hormonal são tamoxifeno, idoxifeno, fulvestrant, droloxifeno, toremifeno, raloxifeno, dietilstilbestrol, etinil estradiol/estinil, um antiandrógeno (tal como flutaminda/eulexina), uma progestina (tal como hidróxi progesterona caproato, medroxiprogesterona/provera, megestrol acepato/megace), um adrenocorticosteróide (tal como hidrocortisona, prednisona), hormônio que libera o hormônio luteinizante (e análogos destes e outros agonistas de LHRH, tais como buserelina e goserelina), um inibidor de aromatase (tal como anastrazol/arimidex, aminoglutetimida/citradeno, exemestano), um inibidor de hormônio (tal como octreotida/sandostatina) e agentes similares.
[000264] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser um agente anti-alérgico (por exemplo, compostos de moléculas pequenas, proteínas, glicoproteínas, ou anticorpos que interrompem a tolerância aos antígenos de tumor e câncer). Exemplos de tais compostos são moléculas que bloqueiam a atividade de CTLA-4, tal como MDX-010/Yervoy (ipilimumab) (Phan et al, PNAS USA 100, 8372 (2003)), que age potencialmente induzindo a imunidade de célula T contra o câncer. A citorredução com o conjugado de droga-anticorpo anti-TF, em combinação com uma droga imunoestimulatória, pode fornecer benefícios clínicos significativos aos pacientes.
[000265] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser um ácido nucleico ou vetor contendo o gene supressor de tumor, tal como um adenovírus deficiente em replicação que codifica p53/SCH58500 tipo selvagem recombinante humano, etc.; ácidos nucleicos antissenso alvejados em oncogenes, genes mutados ou desregulados; ou genes de RNAsi alvejados, mutados ou desregulados. Exemplos de alvos supressores de tumor incluem, por exemplo, BRCA1, RB1, BRCA2, DPC4 (Smad4), MSH2, MLH1 e DCC.
[000266] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser um ácido nucleico anti-câncer, tal como genasense (augmerosen/G3139), LY900003 (ISIS 352.1), ISIS 2503, OGX-011 (ISIS 112.989), LE-AON/LEraf-AON (oligonucleotídeo antissenso c-raf encapsulado em lipossomo/ISIS-5132), MG98, e outros ácidos nucleicos antissenso que alvejam PKCa, clusterina, IGFBPs, proteína quinase A, ciclina D1, ou Bcl-2h.
[000267] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser uma molécula de RNA inibidora anti-câncer (ver, por exemplo, Lin et al., Curr Cancer Drug Targets. 1(3), 241-7 (2001), errata em: Curr Cancer Drug Targets. 3(3), 237 (2003), Lima et al., Cancer Gene Ther. 11(5), 309-16 (2004), Grzmil et al., Int J Oncol. 4(1), 97-105 (2004), Collis et al., Int. J Radiat Oncol Biol Phys. 57(2 Suppl), S144 (2003), Yang et al., Oncogene. 22(36), 5694-701 (2003) e Zhang et al., Biochem Biophys Res Commun. 303(4), 1169-78 (2003)).
[000268] Os métodos de administração de composições e combinação da presente invenção também incluem a administração de vacinas de ácido nucleico, tais como vacinas de DNA nú que codifica tais antígenos de câncer/antígenos associados ao tumor (ver, por exemplo U.S. 5.589.466, U.S. 5.593.972, U.S. 5.703.057, U.S. 5.879.687, U.S. 6.235.523 e U.S. 6.387.888). Em uma modalidade, o método de administração da combinação e/ou composição em combinação compreende uma composição de vacina autóloga. Em uma modalidade, o método de administração de composição em combinação e/ou combinação compreende uma vacina de célula completa ou célula que expressa citocina (por exemplo, um fibroblasto que expressa IL-2 recombinante, células dendríticas que expressam citocina recombinante e similares) (ver, por exemplo, Kowalczyk et al., Acta Biochim Pol. 50(3), 61324 (2003), Reilly et al., Methods Mol Med. 69, 233-57 (2002) e Tirapu et al., Curr Gene Ther. 2(1), 79-89 (2002). Um outro exemplo de uma abordagem celular autóloga como esta, que pode ser usada em métodos de combinação da presente invenção, é o método de imunoteraía personalizado MyVax® (previamente referido como GTOP-99) (Genitope Corporation -Redwood City, CA, USA).
[000269] Em uma modalidade, a presente invenção fornece métodos de administração de composições em combinação e combinação, em que um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção é combinado ou coadministrado com um vírus, proteínas virais e similares. O vírus deficiente em replicação, que em geral é capaz de uma ou apenas alguns ciclos de replicação in vivo e que é alvejado em células tumorais, por exemplo, pode ser usado como componente de tais composições e métodos. Tais agentes virais podem compreender ou estar associados aos ácidos nucleicos que codificam imunoestimulantes, tais como GM-CSF e/ou IL-2. Tanto os vírus naturalmente oncolítivos quanto tais vírus oncolíticos recombinantes (por exemplo, vírus HSV-1, reovírus, adenovírus sensível à replicação e deficiente à replicação, etc.) podem ser usados como componentes de tais métodos e composições. Dessa maneira, em uma modalidade, a presente invenção fornece composições em combinação e métodos de administração em combinação, em que um conjugado de droga- anticorpo anti-TF é combinado ou coadministrado com um vírus oncolítico. Exemplos de tais vírus incluem adenovírus oncolíticos e herpesvírus, que podem ou não ser vírus modificados (ver, por exemplo Shah et al., J Neurooncol. 65(3), 203-26 (2003), Stiles et al., Surgery. 134(2), 357-64 (2003), Sunarmura et al., Pancreas, 28(3), 326-9 (2004), Teshigahara et al., J Surg Oncol. 85(1), 42-7 (2004), Varghese et al., Cancer Gene Ther. 9(12), 967-78 (2002), Wildner et al., Cancer Res. 59(2), 410-3 (1999), Yamanaka, Int 3 Oncol. 24(4), 919-23 (2004) e Zwiebel et al., Semin Oncol. 28(4), 33643 (2001).
[000270] As composições em combinação e os métodos de administração de combinação da presente invenção também podem envolver métodos de imunoterapia de "célula completa" e "adotiva". Por exemplo, tais métodos podem compreender a infusão ou re-infusão de células do sistema imune (por exemplo, linfócitos que infiltram no tumor (TILs), tais como células T CD4+ e/ou CD8+ (por exemplo, células T expandidas com antígenos específicos do tumor e/ou melhoradores genéticos), células que expressam anticorpo B ou outras células que produzem/apresentam anticorpo, células dendríticas (DCs) (por exemplo, células dendríticas recombinantes que expressam anti-citocina, células dendríticas cultivadas com um agente de expansão de DC, tais como GM-CSF e/ou Flt3-L, e/ou células dendríticas carregadas com antígeno associado ao tumor), células NK anti-tumor, assim denominadas células híbridas, ou combinações destas. Os lisados celulares também podem ser usados em tais métodos e composições. As "vacinas" celulares, em testes clínicos que podem ser usados em tais aspectos, incluem Canvaxin™, APC-8015 (Dendreon), HSPPC-96 (Antigenics), e lisados celulares de Meiacine®. Os antígenos obtidos das células cancerígenas, e misturas destes (ver, por exemplo, Bystryn et al., Clinical Cancer Research Vol. 7, 1882-1887, julho de 2001), misturados opcionalmente com adjuvantes tal como alúmen, também podem ser componentes em tais métodos e nas composições em combinação.
[000271] Em uma modalidade, um conjugado de droga-anticorpo anti- TF de acordo com a presente invenção pode ser distribuído para um paciente em combinação com a aplicação de um método de vacinação interno. A vacinação interna refere-se à eliminação do tumor induzido ou da célula cancerígena, tal como eliminação celular induzida por droga ou induzida por radiação de células tumorais, em um paciente que tipicamente leva a elicitação de uma resposta imune direcionada para (i) as células tumorais como um todo, ou (ii) partes das células tumorais incluindo (a) proteínas secretadas, glicoproteínas ou outros produtos, (b) proteínas associadas à membrana, ou glicoproteínas, ou outros componentes associados ou inseridos nas membranas, e/ou (c) proteínas intracelulares ou outros componentes intracelulares. Uma resposta imune induzida por vacinação interna pode ser humoral (isto é, mediada por anticorpo-complemento) ou mediada por célula (por exemplo, o desenvolvimento e/ou aumento de linfócitos T citotóxicos endógenos que reconhecem as células tumorais mortas internamente, ou partes destes). Além disso, para radioterapia, exemplos não limitantes de drogas e agentes que podem ser usados para induzir a dita eliminação de célula tumoral e vacinação interna são agentes quimioterapêuticos convencionais, inibidores de ciclo celular, drogas anti-angiogênese, anticorpos monoclonais, agentes de indução de apoptose e inibidores de transdução de sinal.
[000272] Exemplos de outros agentes anti-câncer, que podem ser relevantes como agente terapêuticos para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, são agentes de indução da diferenciação, análogos de ácido retinóico (tal como todos os ácidos trans retinóicos, ácido 13-cis retinóico e agentes similares), análogos de vitamina D (tais como seocalcitol e agentes similares), inibidores de ErbB3, ErbB4, IGF-IR, receptor de insulina, PDGFRα, PDGFRbeta, Flk2, Flt4, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, TRKA, TRKC, c-met, Ron, Sea, Tie, Tie2, Eph, Ret, Ros, Alk, LTK, PTK7 e agentes similares.
[000273] Exemplos de outros agentes anti-câncer que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com o conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, são catepsina B, moduladores da atividade desidrogenase de catepsina D, glutationa-S- transferase (tais como glutacilcisteína sintetase e lactato desidrogenase) e agentes similares.
[000274] Exemplos de outros agentes anti-câncer que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, são estramustina e epirubicina.
[000275] Exemplos de outros agentes anti-câncer que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, são um inibidor HSP90 do tipo 17-alilamino geldanamicina, anticorpos direcionados contra um antígeno de tumor tais como PSA, CA125, KSA, etc, integrinas do tipo integrina β1, inibidores de VCAM e agentes similares.
[000276] Exemplos de outros agentes anti-câncer que podem ser relevantes como agentes terapêuticos para uso em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, são inibidores de calcineurina (tal como valspodar, PSC 833 e outro MDR-1 ou inibidores de p- glicoproteína), inibidores de TOR (tal como sirolimus, everolimus e rapamicina), e inibidores de mecanismos de "linfócito interno" (tal como FTY720), e agentes com efeitos na sinalização celular tal como inibidores de molécula de adesão (por exemplo, anti-LFA, etc.).
[000277] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF da invenção é para uso em combinação com um ou mais outros anticorpos terapêuticos, tal como bevacizumab (Avastin®), zalutumumab, cetuximab (Erbitux®), panitumumab (Vectibix™), ofatumumab (Arzerra®), zanolimumab, daratumumab (HuMax-CD38), ranibizumab (Lucentis®), daclizumab (Zenapax®), basiliximab (Simulect®), infliximab (Remicade®), adalimumab (Humira®), natalizumab (Tysabri®), omalizumab (Xolair®), efalizumab (Raptiva®), nimotuzumab, rituximab (Rituxan®/MabThera®) e/ou trastuzumab (Herceptin®). Outros anticorpos terapêuticos que podem ser usados em combinação com o conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção são aqueles revelados em WO98/40408 (anticorpos que se ligam ao TF humano natural), WO04/094475 (anticorpos capazes de ligação com o fator tecidual humano, que não inibe a coagulação do sangue mediada por fator, comparada com um plasma controle normal), WO03/093422 (anticorpos que se ligam com maior afinidade ao complexo TF:VIIa do que ao TF sozinho), WO03/037361 (agonista ou antagonista de TF para o tratamento relacionado à apoptose) ou WO 2010/066803 (anticorpos monoclonais humanos contra fator tecidual).
[000278] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF pode ser administrado junto com a distribuição de um ou mais agentes que promovem o acesso do conjugado de droga-anticorpo anti-TF, ou composição em combinação, ao interior de um tumor. Tais métodos, por exemplo, podem ser realizados em associação com a distribuição de uma relaxina, que é capaz de relaxar um tumor (ver, por exemplo U.S. 6.719.977). Em uma modalidade, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser ligado a um peptídeo que penetra na célula (CPP). Os peptídeos que penetram na célula e peptídeos relacionados (tais como anticorpos que penetram em células geneticamente modificadas) são descritos, por exemplo, em Zhao et al., J Immunol Methods. 254(1-2), 137-45 (2001), Hong et al., Cancer Res. 60(23), 6551-6 (2000), Lindgren et al., Biochem J. 377 (Pt 1), 69-76 (2004), Buerger et al., J Cancer Res Clin Oncol. 129(12), 669-75 (2003), Pooga et al, FASEB J. 12(1), 67-77 (1998) e Tseng et al., Mol Pharmacol. 62(4), 864-72 (2002).
[000279] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF em um sujeito, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, e pelo menos um agente anti-inflamatório a um sujeito que precisa deste.
[000280] Em uma modalidade, um agente anti-inflamatório como este pode ser selecionado de aspirina e outros salicilatos, inibidores da Cox-2 (tais como rofecoxib e celecoxib), NSAIDs (tais como ibuprofeno, fenoprofeno, naproxeno, sulindac, diclofenac, piroxlcam, cetoprofeno, diflunisal, nabumetona, etodolac, oxaprozina e indometacina), anticorpos anti-IL6R, anticorpos anti-IL8 (por exemplo, anticorpos descritos em WO2004058797, por exemplo, 10F8), anticorpos anti-IL15 (por exemplo, anticorpos descritos em WO03017935 e WO2004076620), anticorpos anti-IL15R, anticorpos anti- CD4 (por exemplo, zanolimumab), anticorpos anti-CD11a (por exemplo, efalizumab), anticorpos anti-alfa-4/beta-1 integrina (VLA4) (por exemplo, natalizumab), CTLA4-Ig para o tratamento de doenças inflamatórias, prednisolona, prednisona, drogas anti-reumáticas que modificam a doença (DMARDs) tal como metotrexato, hidroxicloroquina, sulfassalazina, inibidores de síntese de pirimidina (tal como leflunomida), agentes que bloqueiam o receptor IL-1 (tal como anaquinra), agentes que bloqueiam TNF- α (tal como etanercept, infliximab, e adalimumab) e agentes similares.
[000281] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF em um sujeito, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, e pelo menos um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório a um sujeito que precisa deste.
[000282] Em uma modalidade, um agente imunossupressivo e/ou imunomodulatório como este pode ser selecionado de ciclosporina, azatioprina, ácido micofenólico, micofenolato de mofetila, corticosteróides tais como prednisona, metotrexato, sais de ouro, sulfassalazina, antimalária, brequinar, leflunomida, mizoribina, 15-desoxispergualina, 6-mercaptopurina, ciclofosfamida, rapamicina, tacrolimus (FK-506), OKT3, globulina anti- timócito, timopentina, timosina-o e agentes similares.
[000283] Em uma modalidade, um agente imunossupressor e/ou imunomodulatório como este pode ser selecionado de anticorpos imunossupressores, tais como ligação de anticorpos ao p75 do receptor IL-2, anticorpos contra CD25 (por exemplo, aqueles descritos em WO2004045512, tais como AB1, AB7, AB11, e AB12), ou ligação de anticorpos, por exemplo, a MHC, CD2, CDS, CD4, CD7, CD28, B7, CD40, CD45, IFNyR, TNFaR ou TNFR (que consiste em duas subunidades: CD120a e CD120b), IL-4R, IL- 5R, IL-6R, IL-7R, IL-8R, IL-10R, CD11a ou CD58, ou ligação de anticorpos aos seus ligantes.
[000284] Em uma modalidade, um agente imunossupressor e/ou imunomodulatório como este pode ser selecionado de moléculas solúveis de IL-15R, IL-10R, B7 (B7-1, B7-2, variantes destas, e fragmentos destas), ICOS, e OX40, um inibidor de um regulador de célula T negativo (tal como um anticorpo contra CTLA4) e agentes similares.
[000285] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF em um sujeito, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, e um anticorpo anti-C3b(i) a um sujeito que precisa deste.
[000286] Em uma modalidade, um agente terapêutico para uso em combinação com os conjugados de droga-anticorpo anti-TF, para tratar os distúrbios da maneira descrita anteriormente, pode ser selecionado de inibidores de histona desacetilase (por exemplo, fenilbutirato), e/ou agentes de reparo de DNA (por exemplo, enzimas de reparo de DNA e composições relacionadas, tal como dimericina).
[000287] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-011-vcMMAE.
[000288] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-098-vcMMAE.
[000289] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-111-vcMMAE.
[000290] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-114-vcMMAE.
[000291] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-011-mcMMAF.
[000292] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-098-mcMMAF.
[000293] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-111-mcMMAF.
[000294] Em uma modalidade, o conjugado de droga-anticorpo anti-TF para uso em terapia de combinação com qualquer um dos agentes anteriormente mencionados é HuMab-TF-114-mcMMAF.
[000295] Os métodos da presente invenção para tratar um distúrbio, da maneira descrita anteriormente, que compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção, também pode compreender terapia fotodinâmica direcionada anti-câncer (por exemplo, terapia a laser anti-câncer, que opcionalmente pode ser praticada com o uso de agente fotossensibilizante, ver, por exemplo Zhang et al., J Control Release. 93(2), 141-50 (2.003)), terapias de onda sonora e onda de choque anti-câncer (ver, por exemplo, Kambe et al., Hum Cell. 10(1), 87-94 (1997)), e/ou terapia nutracêutica anti-câncer (ver, por exemplo, Roudebush et al., Vet Clin North Am Small Anim Pract. 34(1), 249-69, viii (2004) e Rafi, Nutrition, 20(1), 78-82 (2004). Do mesmo modo, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF pode ser usado para a preparação de uma composição farmacêutica, para tratar um distúrbio da maneira descrita anteriormente, a ser administrada com terapia fotodinâmica direta anti-câncer (por exemplo, terapia anti-câncer a laser, que pode ser opcionalmente praticada com o uso de agente fotossensibilizante, terapias de onda sonora e onda de choque anti-câncer, e/ou terapia nutracêutica anti-câncer.
[000296] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar um distúrbio envolvendo células que expressam TF em um sujeito, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF, tal como um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, e radioterapia a um sujeito que precisa desta.
[000297] Em uma modalidade, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, cujo método compreende a administração de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga- anticorpo anti-TF da presente invenção, e radioterapia a um sujeito que precisa desta.
[000298] Em uma modalidade, a presente invenção fornece o uso de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar câncer, a ser administrada em combinação com radioterapia.
[000299] A radioterapia pode compreender radiação ou administração de radiofármacos a um paciente. A fonte de radiação pode ser tanto externa quanto interna para o paciente que está sendo tratado (o tratamento de radiação, por exemplo, pode estar na forma de terapia de radiação de feixe externo (EBRT) ou braquiterapia (BT)). Os elementos radioativos que podem ser usados para praticar tais métodos incluem, por exemplo, rádio, césio-137, irídio-192, amerício-241, ouro-198, cobalto-57, cobre-67, tecnécio-99, iodoe- 123, iodo-131 e índio-111,
[000300] Em uma modalidade adicional, a presente invenção fornece um método para tratar ou prevenir câncer, cujo método compreende a administração a um sujeito que precisa deste de uma quantidade terapeuticamente eficiente de um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção, em combinação com cirurgia.
[000301] Da maneira descrita anteriormente, uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada em terapia de combinação, isto é, combinada com um ou mais agentes relevantes para a doença ou condição a ser tratada, tanto como composições farmacêuticas separadas quanto com um composto da presente invenção co-formulado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, da maneira descrita anteriormente. Tais terapias de combinação podem exigir menores dosagens do composto da presente invenção, e/ou os agentes coadministrados, evitando assim possíveis toxicidades ou complicações associadas com as várias monoterapias.
[000302] Além das anteriores, outras terapias de combinação relevantes incluem as seguintes:
[000303] Para o tratamento de câncer pancreático, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção em combinação com um antimetabólito, tal como 5-fluoruracil e/ou gencitabina, possivelmente em combinação com um ou mais compostos selecionados de: 90Y-hPAM4, ARC-100, ARQ-197, AZD-6244, bardoxolona metil, cixutumumab, (IMC-A12), folitixorina de cálcio, GVAX, ipilimumab, KRX- Q601, merbarone, MGCD-0103, MORAb-009, PX-12, Rh-Apo2L, TLN- 4601, trabedersen, volociximab (M200), WX-671, pemetrexed, rubitecan, ixabepilona, OCX-0191Vion, 216586-46-8, lapatinib, matuzumab, imatinib, sorafinib, trastuzumab, exabepilona, erlotinib, avastina e cetuximab.
[000304] Para o tratamento de câncer colorretal, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais compostos selecionados de: gencitabina, bevacizumab, FOLFOX, FOLFIPI, XELOX, IFL, oxalipiatina, irinotecan, 5 -FU/LV, capecitabina, UFT, agentes que alvejam EGFR, tais como cetuximab, panitumumab, nimotuzumab, zalutumumab; inibidores de VEGF, ou inibodores de tirosina quinase tal como sunitinib.
[000305] Para o tratamento de câncer de mama, um conjugado de droga- anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais compostos selecionados de: antimetabólitos, antraciclinas, taxanos, agentes de alquilação, epotilonas anti-hormonais (femar, tamoxifen etc), inibidores de ErbB2 (Her2/neu) (tais como herceptina e agentes similares), CAF/FAC (ciclofosfamida, doxorubicina, 5FU) AC (ciclo, doxo), CMF (ciclo, metotrexato, 5FU), Docetaxel + capecitabina, GT (paclitaxel, gencitabina) FEC (ciclo, epi, 5FU) em combinação com herceptina: Pactitaxel +/-carboplatina, Vinorelbina, Docetaxel, CT em combinação com Iapatinib; Capecitabina.
[000306] Para o tratamento de bexiga, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais compostos selecionados de: antimetabólitos (gencitabina, alimta, metotrexato), análogos d eplatina (cisplatina, carboplatina), inibidores de EGFr (tal como cetuximab ou zalutumumab), inibidores de VEGF (tal como avastina) doxorubicina, inibidores de tirosina quinase tal como gefitinib, trastuzumab, agente anti-mitótico tais como taxanos, por exemplo, paclitaxel, e alcalóides da vinca, por exemplo, vinblastina.
[000307] Para o tratamento de câncer de próstata, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais compostos selecionados de: terapias hormonais/anti- hormonais, tais como anti-andrógenos, agonistas do hormônio que libera o hormônio luteinizante (LHRH), e agentes quimioterapêuticos tais como taxanos, mitoxantrona, estramustina, 5FU, vinblastina, ixabepilona.
[000308] Para o tratamento de câncer no ovário, um conjugado de droga-anticorpo anti-TF de acordo com a presente invenção em combinação com um ou mais compostos selecionados de: um agente anti-mitótico, tais como taxanos, e alcalóides da vinca, Caelyx, topotecano. Usos diagnósticos
[000309] Os anticorpos anti-TF da invenção também podem ser usados com propósitos de diagnóstico. Os anticorpos anti-TF aqui descritos podem, em uma modalidade, ser conjugados com um agente de detecção ou marca em vez de uma droga, tornando-os por meio disso adequados para propósitos de diagnóstico. Em uma modalidade, o uso diagnóstico de um anticorpo anti-TF ou anticorpo anti-TF conjugado com um agente de detecção pode ser realizados em combinação com um dos outros métodos da presente invenção, em particular um uso farmacêutico do conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção. O anticorpo anti-TF conjugado com um agente de detecção, em alguns casos, pode permitir uma detecção direta de ligação do anticorpo anti-TF com TF. Os exemplos de "agente de detecção" ou "marca" são fornecidos a seguir e a referência a "anticorpo anti-TF" a seguir também pode incluir, onde relevante, referência ao "anticorpo anti-TF conjugado com um agente de detecção ou marca". O termo "uso diagnóstico" também inclui medir o nível de TF, por exemplo, no plasma, urina ou níveis de expressão de TF em biópsias com relação a selecionar pacientes para o tratamento ou mediar a eficiência de um tratamento da maneira descrita anteriormente, e o uso, por exemplo, de anticorpos anti-TF radiomarcados, por exemplo, para selecionar pacientes para o tratamento da maneira descrita anteriormente. Assim, em um aspecto adicional, a invenção se refere a uma composição de diagnóstico que compreende um anticorpo anti-TF da maneira aqui definida, em que a composição de diagnóstico, em uma modalidade particular, pode ser usada em combinação com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção,
[000310] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usados in vivo ou in vitro para diagnosticar doenças nas quais as células que expressam TF desempenham um papel ativo na patogênese, detectando níveis de TF, ou níveis de células que contêm TF em sua superfície de membrana. Isto pode ser atingido, por exemplo, colocando uma amostra a ser testada, opcionalmente junto com uma amostra controle, em contato com o anticorpo anti-TF em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo anti-TF e TF. A formação do complexo é então detectada (por exemplo, usando um ELISA). Durante o uso de uma amostra controle junto com a amostra teste, o complexo é detectado em ambas as amostras, e qualquer diferença estatisticamente significativa na formação de complexos entre as amostras é indicativo da presença de TF na amostra de teste.
[000311] Assim,, em um aspecto adicional, os anticorpos anti-TF da presente invenção também podem ser usados em um método para detectar a presença de antígeno de TF, ou uma célula que expressa TF, em uma amostra que compreende: -colocar a amostra em contato com um anticorpo anti-TF da invenção ou uma molécula bi-específica da invenção, em condições que permitem a formação de um complexo entre o anticorpo e TF; e -analisar se um complexo foi formado.
[000312] Em uma modalidade, o método é realizado in vitro.
[000313] Mais especificamente, os anticorpos anti-TF da presente invenção também podem ser usados em métodos para a identificação de, e diagnóstico de células e tecidos invasivos, e outras células alvejadas por anticorpos anti-TF da presente invenção, e para o monitoramento do progresso de tratamentos terapêuticos, estado após o tratamento, risco de desenvolver câncer, progressão do câncer e similares.
[000314] Em um exemplo de um ensaio de diagnóstico como este, os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usados em um método de diagnosticar o nível de células invasivas em um tecido. Um método como este compreende formar um imunocomplexo entre um anticorpo anti-TF e os potenciais tecidos que contém TF, e detectar a formação do imunocomplexo, em que a formação do imunocomplexo correlaciona-se com a presença de células invasivas no tecido. O contato pode ser realizado in vivo usando anticorpos isolados marcados e técnicas de formação de imagem padrão, ou pode ser realizado in vitro em amostras de tecido.
[000315] Os anticorpos anti-TF da presente invenção também podem ser usados para detectar peptídeos contendo TF e fragmentos de peptídeo em qualquer amostra biológica adequada, por qualquer técnica adequada. Exemplos de imunoensaios convencionais fornecidos pela presente invenção incluem, sem limitação, um ensaio de ELISA, um RIA, FACS, ensaios de ressonância de plasma, ensaios cromatográficos, imuno-histoquímica de tecido, Western blot, e/ou imunoprecipitação usando um anticorpo anti-TF. Os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usados para detectar TF e fragmentos de TF de humanos. As marcas adequadas para o anticorpo anti-TF e/ou anticorpos secundários usados em tais técnicas incluem, sem limitação, várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes e materiais radioativos. Exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano silvestre, fosfatase alcalina, β- galactosidase ou acetilcolinesterase; exemplos de complexos de grupo prostético adequados incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceín, cloreto de dansila ou ficoeritrina; um exemplo de um material luminescente inclui luminol; e exemplos de materiais radioativos adequados incluem 125I, 131I, 35S e 3H.
[000316] Os anticorpos anti-TF também podem ser usados para ensaiar uma amostra biológica por um imunoensaio de competição que utiliza padões de peptídeo TF marcados com uma substância detectável e um anticorpo anti- TF não marcado. Em um ensaio como este, a amostra biológica, o(s) padrão(s) de peptídeo(s) TF marcado(s) e os anticorpos anti-TF são combinados, e a quantidade de padrão de TF marcado ligado no anticorpo anti-TF não marcado é determinada. A quantidade de peptídeo TF na amostra biológica é inversamente proporcional à quantidade de padrão TF marcado ligado ao anticorpo anti-TF.
[000317] Os anticorpos anti-TF são particularmente usados na formação de imagem de tumores in vivo. A formação de imagem in vivo de tumores associados com TF pode ser realizado por qualquer técnica adequada. Por exemplo, o isótopo marcado com 99Tc ou marcado com um outro isótopo que emite raios gama pode ser usado para marcar os anticorpos anti-TF em tumores, ou os complexos de anticorpo anti-TF secundário marcado (por exemplo, marcado com FITC):TF de tumores, e pode ser convertido em imagem com uma câmara de gama cintilação (por exemplo, um dispositivo Eiscint Apex 409ECT), usando tipicamente colimador de baixa energia e alta resolução ou um colimador de baixa energia para todos os propósitos. Os tecidos corados podem então ser avaliados com relação à contagem da radioatividade como um indicador da quantidade de peptídeos associados a TF no tumor. As imagens obtidas pelo uso de tais técnicas podem ser usadas para avaliar a biodistribuição de TF em um paciente, mamífero ou tecido, por exemplo, no contexto de usar TF ou fragmentos de TF como um biomarcador com relação à presença de células cancerígenas invasivas. As variações nesta técnica podem incluir o uso de formação de imagem por ressonância magnética (MRI) para melhorar a formação de imagem com técnicas de câmara gama. Os métodos e princípios de imunocintigrafia similares são descritos em, por exemplo, Srivastava (ed.), Radiolabeled Monoclonal Antibodies For Imaging and Therapy (Plenum Press 1988), Chase, "Medical Applications of Radioisotopes," em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição, Gennaro et al., (eds.), pp. 624-652 (Mack Publishing Co., 1990), e Brown, "Clinical Use of Monoclonal Antibodies", em Biotechnology E Pharmacy 227-49, Pezzuto et al., (eds.) (Chapman & Hall 1993). Tais imagens também podem ser usadas para distribuição alvejada de outros agentes anti-câncer, exemplos dos quais são aqui descritos (por exemplo, agentes apoptóticos, toxinas, ou composições de quimioterapia CHOP). Além do mais, tais imagens também podem funcionar alternativamente como a base para técnicas cirúrgicas para remover tumores. Além do mais, tais técnicas de formação de imagem in vivo podem permitir a identificação e localização de um tumor em uma situação onde um paciente é identificado como com um tumor (em virtude da presença de outros biomarcadores, metástases, etc.), mas o tumor não pode ser identificado por técnicas analíticas tradicionais. Todos estes métodos são características da presente invenção e tais métodos podem ser, em particular, usados em combinação com o tratamento de um paciente com um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção.
[000318] A formação de imagem in vivo e outros métodos de diagnósticos fornecidos pela presente invenção são particularmente usados na detecção de micrometástases em um paciente humano (por exemplo, um paciente não diagnosticado previamente com câncer ou um paciente em um período de recuperação/remissão de um câncer). As células cancerígenas do carcinoma, que podem representar até 90 % de todas as células cancerígenas, por exemplo, demonstraram se corar muito melhor com as composições de anticorpo anti-TF. A detecção com anticorpos anti-TF monoclonais aqui descritos pode ser indicativa da presença de carcinomas que são agressivos/invasivos e também, ou alternativamente, fornece uma indicação da facilidade de usar anticorpo anti-TF monoclonal relacionado contra tais micrometástases.
[000319] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usados em um método de formação de imagem in vivo, em que um anticorpo anti-TF da presente invenção é conjugado com um agente rádio-opaco que promove a detecção, o anticorpo conjugado é administrado a um hospedeiro, tal como por injeção na corrente sanguínea, e a presença e local do anticorpo marcado no hospedeiro são ensaiados. Por meio desta técnica, e qualquer outro método de diagnóstico aqui fornecido, os anticorpos anti-TF da presente invenção podem ser usados em um método para selecionar a presença das células relacionadas à doença em um paciente humano, ou uma amostra biológica obtida de um paciente humano.
[000320] Para formação de imagem disgnóstica, os radioisótopos podem ser ligados a um anticorpo anti-TF tanto diretamente quanto indiretamente, usando um grupo funcional intermediário. Os grupos funcionais intermediários usados incluem quelantes, tais como ácido etilenodiaminotetraacético e ácido dietilenotriaminopentaacético (ver, por exemplo U.S. 5.057.313).
[000321] Além dos radioisótopos e agentes rádio-opacos, os métodos de diagnósticos podem ser realizados usando os anticorpos anti-TF que são conjugados com corantes (tal como com o complexo biotina-estreptavidina), agentes de contraste, compostos fluorescentes ou moléculas e agentes de melhora (por exemplo, íons paramagnéticos) para formação de imagem por ressonância magnética (MRI) (ver, por exemplo, patente U.S. 6.331.175, que descreve técnicas de MRI e a preparação de anticorpos conjugados com um agente de melhora de MRI). Tais agentes de diagnóstico/detecção podem ser selecionados de agentes para uso em formação de imagem por ressonância magnética e compostos fluorescentes. A fim de carregar um anticorpo anti-TF com metais radioativos ou íons paramagnéticos, pode ser necessário reagi-lo em um reagente com uma calda longa, na qual são anexadas um multiplicidade de grupos de quelação para ligar os íons. Uma calda como esta pode ser um polímero, tal como uma polilisina, polisacarídeo, ou outra cadeia derivada ou em derivação com grupos suspensos, aos quais podem ser ligados grupos de quelação tais como, por exemplo, porfirinas, poliaminas, éteres coroa, bis-tiosemicarbazonas, polioximas e grupos similares conhecidos por serem usados com este propósito. Os quelatos podem ser acoplados aos anticorpos anti-TF usando químicas padrões.
[000322] Assim, a presente invenção fornece conjugados de anticorpos anti-TF de diagnóstico, em que o anticorpo anti-TF é conjugado com um agente de contraste (tal como para formação de imagem por ressonância magnética, tumografia computadorizada, ou agente que melhora o contraste do ultrassom) ou um radionuclídeo que pode ser, por exemplo, um isótopo que emite gama-, beta-, alfa-, Auger elétron-, ou pósitron.
[000323] Em um aspecto adicional, a invenção se refere a um kit para detectar a presença de antígeno de TF, ou uma célula que expressa TF, em uma amostra que compreende:
[000324] -um anticorpo anti-TF da invenção ou uma molécula bi- específica da invenção; e
[000325] -instruções para uso do kit, em que o kit também contêm em particular um anticorpo anti-TF conjugado com um agente de detecção ou agente de contraste da presente invenção.
[000326] Em uma modalidade, os anticorpos anti-TF da presente invenção também podem ser usados em um kit para diagnóstico de câncer, que compreende um recipiente compreendendo um anticorpo anti-TF, e um ou mais reagentes para detectar a ligação do anticorpo anti-TF a um peptídeo TF. Um kit como este, em particular, pode compreender adicionalmente um conjugado de droga-anticorpo anti-TF da presente invenção. Os reagentes podem incluir, por exemplo, marcas fluorescentes, marcas enzimáticas, ou outras marcas detectáveis. Os reagentes também podem incluir anticorpos secundários ou terciários, ou reagentes para reações enzimáticas, em que as reações enzimáticas sintetizam um produto que pode ser visualizado. Em uma modalidade, a presente invenção fornece um kit de diagnóstico que compreende um ou mais anticorpos anti-TF da presente invenção, na forma marcada ou não marcada em recipiente(s) adequado(s), reagentes para as incubações para um ensaio indireto, e substratos ou agentes de derivação para a detecção em um ensaio como este, dependendo da natureza da marca. O(s) reagente(s) controle e as instruções para uso também podem ser incluídos.
[000327] Os kits de diagnósticos também podem ser fornecidos para uso com um anticorpo anti-TF, tal como um anticorpo anti-TF conjugado/marcado, para a detecção de uma atividade celular ou para detectar a presença de peptídeos TF em uma amostra de tecido ou hospedeiro. Em tais kits diagnósticos, bem como em kits para usos terapêuticos descritos aqui em alguma parte, um anticorpo anti-TF pode ser fornecido tipicamente em uma forma liofilizada em um recipiente, tanto sozinho ou junto com anticorpos adicionais específicos para uma célula alvo ou peptídeo. Tipicamente, um carreador farmaceuticamente aceitável (por exemplo, um diluente inerte) e/ou componentes destes, tal como um Tris, fosfato, ou tampão carbonato, estabilizantes, conservantes, biocidas, proteínas inertes, por exemplo, albumina sérica ou similares, também são incluídos (tipicamente em um recipiente separado para misturar) e os reagentes adicionais (também tipicamente em recipiente(s) separado(s)). Em certos kits, um anticorpo secundário capaz de se ligar ao anticorpo anti-TF, que está presente tipicamente em um recipiente separado, também é incluído. O segundo anticorpo é conjugado tipicamente com uma marca e é formulado de uma maneira similar ao anticorpo anti-TF da presente invenção. Usando os métodos aqui descritos anteriormente em alguma parte, os anticorpos anti-TF podem ser usados para definir subconjuntos de células cancerígenas/tumorais e caracterizar tais células e tecidos/crescimentos relacionados.
[000328] A detecção in situ pode ser realizada removendo um espécime histológico de um paciente, e fornecendo a combinação de anticorpos anti-TF marcados (anticorpo anti-TF conjugado com um agente de detecção) da presente invenção para um espécime como este. O anticorpo anti-TF da presente invenção pode ser fornecido aplicando ou sobrepondo o anticorpo anti-TF marcado da presente invenção com uma amostra biológica. Por meio do uso de um procedimento como este, é possível determinar não apenas a presença de TF ou fragmentos de TF, mas também o distribuição de tais peptídeos no tecido examinado (por exemplo, no contexto de avaliar a dispersão de células cancerígenas). Usando a presente invenção, os versados na técnica entenderão que qualquer um de uma ampla variedade de métodos histológicos (tais como procedimentos de coloração) pode ser modificado, a fim de atingir tal detecção in situ.
[000329] A presente invenção é ilustrada adicionalmente pelos exemplos a segui, que não devem ser interpretados como limitantes adicionais. EXEMPLOS Exemplo 1 Construtos de expressão para o fator tecidual (TF)
[000330] Os construtos para a expressão de TF com o códon completamente otimizado, ou seus domínios extracelulares em células HEK, NSO ou CHO, foram gerados. As proteínas codificadas por estes construtos são idênticas a acesso ao Genbank NP 001984 para TF. Os construtos continham sítios de restrição adequados para clonagem e uma sequência Kozak ideal (Kozak, 1987), Os construtos foram clonados no vetor de expressão pEE13.4 de mamífero (Lonza Biologics) (Bebbington, Renner et al. 1992), obtendo pEE13.4TF. A PCR foi usada para amplificar a parte que codifica o domínio extracelular (ECD) (aminoácido 1-251) de TF, a partir do construto sintético, adicionando uma His tag C-terminal que contêm 6 resíduos His (TFECDHis). O construto foi clonado em pEE13,4 e completamente sequenciado para confirmar a precisão do construto. Exemplo 2 Expressão transiente em células HEK-293F
[000331] As células Freestyle™ 293-F (um subclone HEK-293 adaptado ao crescimento em suspensão e meio Freestyle quimicamente definido, (HEK-293F)) foram obtidas da Invitrogen e transfectadas com o DNA plasmidial adequado usando 293fectin (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. No case da expressão do anticorpo, os vetores de cadeia pesada e cadeia leve apropriados, da maneira descrita no exemplo 10, foram co-expressos. Exemplo 3 Expressão semi-estável
[000332] pEE13.4TF foi transfectada estavelmente em células NS0 e os clones estáveis foram selecionados em crescimento na ausência de glutamina e na presença de metilsulfoximina 7,5 μM (MSX). Um agrupamento de clones foi crescido em cultura de suspensão, mantendo ao mesmo tempo a pressão da seleção. Os agrupamentos foram testados com relação à expressão de TF por análise FACS e assegurados para uso adicional. Exemplo 4 Expressão estável em células CHO
[000333] pEE13.4TF foi transfectada estavelmente em células CHO- K1SV (Lonza Bioiogics), e os clones estáveis foram selecionados em crescimento na ausência de glutamina e na presença de MSX 50 μM. Os clones simples foram escolhidos e expandidos e testados com relação à expressão de TF por análise FACS, da maneira descrita a seguir. Os clones de alta expressão foram escolhidos e assegurados para uso adicional. Exemplo 5 Purificação de TF marcado com His
[000334] TFECDhis foi expresso em células I HEK-293F. A marca his em TFECDHis possibilita a purificação com cromatografia de afinidade por metal imobilizado. Neste processo, um quelante fixo na resina cromatográfica é carregado com cátions Co2+. O sobrenadante contendo TFECDHis é incubado com a resina em modo de lotes (isto é, solução). A proteína marcada com His se liga fortemente às microesferas de resina, enquanto outras proteínas presentes no sobrenadante da cultura não se ligam fortemente. Após a incubação, as microesferas são recuperadas do sobrenadante e carregadas em uma coluna. A coluna é lavada, a fim de remover as proteínas ligadas de maneira fraca. As proteínas fortemente ligadas a TFECDHis são então eluídas com um tampão contendo imidazol, que compete com a ligação de His por Co2+. O eluente é removido da proteína por troca de tampão em uma coluna de dessalinização. Exemplo 6 Procedimento de imunização de camundongos transgênicos
[000335] Os anticorpos 042, 092-A09, 098 e 101 foram derivados das seguintes imunizações; três camundongos HCo20 (2 machos e 1 fêmea, cepa GG2713), três camundongos HCo17 (2 machos e 1 fêmea, cepa GG2714), três camundongos HCo12-BALB/c (3 machos, cepa GG2811), três camundongos HCo7 (3 machos, cepa GG2201) e três camundongos HCo12 (3 machos, cepa GG2198) (Medarex, San Jose, CA, USA; para referências ver parágrafo no camundongo HuMab anterior) foram imunizados a cada quinze dias, alternando com 5x106 células NS0-TF semi-estáveis transfectadas, ou com 20 pg de proteína TFECDHis. Oito imunizações foram realizadas no total, quatro imunizações intraperitoniais (IP) e quatro subcutâneas (SC) na base da calda. A primeira imunização com células foi realizada em adjuvante de Freunds completo (CFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Para todas as outras imunizações, as células foram injetadas IP em PBS e TFECDHis foi injetada SC usando adjuvante incompleto de Freunds (IFA; Difco Laboratories, Detroit, MI, USA). Quando observou-se que os títulos séricos eram suficientes (diluição de soro de 1/50 ou menos foi observada positiva no ensaio de seleção de antígeno específico, da maneira descrita no exemplo 7, em pelo menos 2 eventos de seleção sequenciais e bi-semanais), os camundongos foram revacinados adicionalmente duas vezes, intravenosamente (IV), com 10 μg de proteína TFECDHis, em 100 μL de PBS, 4 e 3 dias antes da fusão.
[000336] Os anticorpos 109, 111 e 114 foram derivados das seguintes imunizações: três camundongos HCo20 (3 fêmeas), três camundongos HCol7 (3 fêmeas), três camundongos HCo12-BALB/c (3 fêmeas), três camundongos HCo7 (3 machos) e três HCo12 (3 fêmeas) foram imunizados a cada quinze dias com 5x106 células NS0-TF semi-estáveis transfectadas. A primeira imunização com células foi realizada em CFA, para todas as outras (7) imunizações, as células foram injetadas IP em PBS. Quando as titulações séricas foram observadas como suficiente (da maneira definida anteriormente), os camundongos foram revacinados adicionalmente duas vezes IV com 1x106 células NS0-TF transientemente semi-estáveis transfectadas, em 100 μL de PBS, 4 e 3 dias antes da fusão.
[000337] Os anticorpos 011, 017-D12 e 025 foram derivados das seguintes imunizações: três camundongos HCo20 (3 machos), três camundongos HCo17 (2 machos e 1 fêmea), três camundongos HCo12- BALB/c (3 fêmeas), três camundongos HCo7 (3 machos) e três HCo12 (2 machos e 1 fêmea) foram imunizados a cada quinze dias com 20 μg de proteína TFECDHis. A primeira (intraperitoneal) imunização com proteína foi realizada em CFA, para todas as outras (7) imunizações, a proteína foi injetada alternando subcutaneamente e intraperitonealmente em IFA, Quando as titulações séricas foram observadas como suficientes (definido da maneira anterior), os camundongos foram revacinados adicionalmente duas vezes, intravenosamente (IV) com 10 μg de proteína TFECDHis, em 100 μL de PBS, 4 e 3 dias antes da fusão.
[000338] Exemplo 7 Ensaio de seleção específico para antígeno homogêneo
[000339] A presença de anticorpos anti-TF em soros de camundongos imunizados, ou hibridoma HuMab (anticorpo monoclonal humano), ou sobrenadante de cultura de transfectoma, foi determinada por ensaios de seleção específico para antígeno homogêneo (quadrante quatro), usando Fluorometric Micro Volume Assay Technology (FMAT; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
[000340] Para isto, foi usada uma combinação de 3 ensaios a base de célula e um ensaio a base de microesfera, nos ensaios a base de célula, a ligação à TH1015-TF (células HEK-293F que expressam transientemente TF; produzidas da maneira descrita anteriormente) e A431 (que expressa TF na superfície celular), bem como as células tipo selvagem HEK293 (não expressam TF, controle negativo) foi determinada. No ensaio a base de microesfera, a ligação à TF biotinilado acoplado em uma microesfera de estreptavidina (SB1015-TF) foi determinada.
[000341] As amostras foram adicionadas às células/microesferas para permitir a ligação à TF. Subsequentemente, a ligação de HuMab foi detectada usando um conjugado fluorescente (anti-humano IgG-Cy5 de cabra; Jackson ImmunoResearch). O anticorpo anti-TF humano de camundongo (ERL; acoplado a Aiexa-647 em Genmab) foi usado como controle positivo, os soros agrupados de HuMAb de camundongo e anticorpo camundongo-chrompure- Aiexa647 foram usados como controles negativos. Realizou-se varredura nas amostras usando um sistema de detecção celular Applied Biosystems 8200 (8200 CDS) e “contagens x fluorescência” foi usado como leitura. Exemplo 8 Geração de hibridoma HuMab
[000342] Os camundongos HuMab com desenvolvimento de titulações antígeno-específico suficiente (definido da maneira anterior) foram eutanizados, e o baço e linfonodos que flanqueiam a aorta abdominal e veia cava foram coletados. A fusão de esplenócitos e células do linfonodo a uma linhagem celular de mieloma de camundongo foi realizada por eletrofusão usando um sistema de eletrofusão CEEF 50 (Cyto Pulse Sciences, Glen Burnie, MD, USA), essencialmente de acordo com as instruções do fabricante. A seleção e cultivo dos hibridomas HuMab resultantes foi realizada com base nos protocolos padrões (por exemplo, da maneira descrita em Coligan J.E., Bierer, B,E., Margulies, D.H., Shevach, E.M. e Strober, W., eds. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Inc., 2006). Exemplo 9 Espectrometria de massa de anticorpos purificados
[000343] Pequenas alíquotas de 0,8 mL de sobrenadante contendo o anticorpo, de 6 poços ou estabelecidas de Hyperflask, foram purificadas usando colunas PhyTip contendo resina de proteína G (PhyNexus Inc., San Jose, USA) em uma estação de trabalho Sciclone ALH 3000 (Caliper Lifesciences, Hopkinton, USA). As colunas PhyTtip foram usadas de acordo com as instruções do fabricante, mas os tampões foram substituídos por: tampão PBS de ligação (B.Braun, Medical B.V., Oss, Holanda) e tampão de eluição 0,1M, glicina-HCl, pH 2,7 (Fluka Riedel-de Haen, Buchs, Alemanha). Após a purificação, as amostras foram neutralizadas com Tris-HCl 2M pH 9,0 (Sigma-Aldrich, Zwijndrecht, Holanda). Alternativamente, em alguns casos, volumes maiores do sobrenadante da cultura foram purificados usando cromatografia em coluna de afinidade com proteína A.
[000344] Após a purificação, as amostras foram colocadas em uma placa com 384 poços (Waters, placa de poço quadrado de 100 ul, part# 186002631). As amostras foram desglicosiladas por toda a noite a 37 °C com N-glicosidase F (Roche catálogo número 11365177001. DTT (15 mg/mL) foi adicionado (1 μL/poço) e incubado por 1 hora a 37 °C. As amostras (5 ou 6 ul) foram dessalinizadas em um Acquity UPLC™ (Waters, Milford, USA) com uma coluna 3EH300 C18, 1,7μm, 2,1x 50 mm a 50 °C. Agua MQ e acetonitrila grau LC-MS (Biosolve, cat no 01.204101, Valkenswaard, Holanda), ambas com 0,1 % de ácido fórmico (Fluka, cat no 56302, Buchs, Alemanha), foram usadas como eluentes A e B, respectivamente. Os espectros de massa de ionização em eletroaspersão por tempo de voo foram recuperados em tempo real em um espectrômetro de massas micrOTOF™ (Bruker, Bremen, Alemanha), funcionando no pode íon positivo. Antes da análise, uma escala de 900-3000 m/z foi calibrada com mistura de ajuste ES (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Os espectros de massa foram deconvoluídos com o software DataAnaiysis™ v. 3.4 (Bruker), usando o algoritmo de entropia máxima que pesquisa por pesos moleculares entre 5 e 80 kDa.
[000345] Após a deconvolução, as massas de cadeia pesada e leve resultantes, para todas as amostras foram comparadas, a fim de encontrar anticorpos duplicados. Na comparação das cadeias pesadas, a possível presença de variantes de lisina C-terminais foi levada em consideração. Isto resultou em uma lista de anticorpos exclusivos, onde exclusivo é definido como uma combinação exclusiva de cadeias pesadas e leves. No caso de anticorpos duplicados serem encontrados, os resultados de outros testes foram usados para decidir qual era o melhor material para continuar os experimentos.
[000346] A análise MS dos pesos moleculares das cadeias peadas e leves de 118 hibridomas específicos de TF rendeu 70 anticorpos exclusivos (combinação exclusiva de cadeia pesada/cadeia leve). Estes foram caracterizados em inúmeros ensaios funcionais, identificando os principais candidatos, anticorpos específicos de TF. Exemplo 10 Análise de sequência dos domínio variáveis anti-TF HuMab e clonagem em vetores de expressão
[000347] O RNA total dos HuMabs anti-TF foi preparado a partir de 5x105 células de hibridoma e o DNA complementar 5'-RACE (DNAc) foi preparado a partir de 100 ng do RNA total, usando o kit de amplificação de SMART RACE DNAc (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. As regiões codificantes VH (região variável de cadeia pesada) e VL (região variável de cadeia leve) foram amplificadas por PCR e clonadas no vetor pCR-Blunt II-TQPO (Invitrogen) usando o kit de clonagem Zero Blunt PGR (Invitrogen). Para cada HuMab, 16 clones VL e 8 clones VH foram sequenciados. As sequências são fornecidas na listagem de sequência e figura 1 aqui.
[000348] A tabela 1A e tabela 1B (a seguir) fornecem uma visão geral da informação das sequências de anticorpo e sequências de linhagem germinativa mais homólogas.
Figure img0014
Figure img0015
Referências à listagem de sequência: (sequências na figura 1)
[000349] Na figura 1, o clone 017-D12 é referido como "017" e o similar ao clone 092-A09 é referido como "092",
Figure img0016
Figure img0017
[000350] HuMab 092-AQ9 é um anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No: 17 e a sequência VL de SEQ ID No: 57.
[000351] HuMab 101 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No:21 e a sequência VL de SEQ ID No: 61.
[000352] HuMab 025 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No:25 e a sequência VL de SEQ ID No: 65.
[000353] HuMab 109 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No: 29 e a sequência VL de SEQ ID No: 69.
[000354] HuMab 017-D12 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No:9 e a sequência VL de SEQ ID No: 49.
[000355] HuMab 114 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No: 1 e a sequência VL de SEQ ID No: 41.
[000356] HuMab 042 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No: 13 e a sequência VL de SEQ ID No: 53.
[000357] HuMab 011 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No: 5 e a sequência VL de SEQ ID No: 45.
[000358] HuMab 098 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No:33 e a sequência VL de SEQ ID No: 73.
[000359] HuMab 111 anti-TF é um anticorpo IgG1,K monoclonal completamente humano e de tamanho completo que compreende a sequência VH de SEQ ID No:37 e a sequência VL de SEQ ID No: 77. Exemplo 11 Purificação de anticorpos
[000360] O sobrenadante da cultura foi filtrado em filtros convencionais de 0,2 μm, e carregado em colunas de proteína A de 5 mL (rProtein A FF, Amersham Bioscience) e eluído com ácido cítrico-NaOH 0, 1 M, pH 3. O eluído foi imediatamente neutralizado com Tris-HCl 2M, pH 9 e dialisado por toda a noite em NaH2PO4 12,6 mM, NaCl 140 mM, pH 7,4 (B.Braun). Após a diálise, as amostras foram esterilizadas por filtração com filtros convencionais de 0,2 μm. A pureza foi determinada por SDS-PAGE e a concentração foi medida por nefelometria e absorbância a 280nm. Os anticorpos purificados foram aliquotados e armazenados a -80 °C. Uma vez descongeladas, as alíquotas do anticorpo purificado foram mantidas a 4 °C. A espectrometria de massa foi realizada para identificar a massa molecular das cadeias pesadas e leves do anticorpo, expressas pelos hibridomas da maneira descrita no exemplo 9. Exemplo 12 Ligação de HuMabs anti-TF ao domínio extracelular de TF em ELISA
[000361] A especificidade dos HuMabs anti-TF obtidos foi avaliada por ELISA. As placas de ELISA (Microlon; Greiner Bio-One) foram revestidas por toda a noite a +4 °C com 0,5 μg/mL de TFECDHis em PBS, pH 7,4. As placas de ELISA revestidas foram esvaziadas e bloqueadas por uma hora em temperatura ambiente, com 2 % (v/v) de soro de galinha (Gibco, Paisley, Escócia) em PBS, e lavadas com PBS contendo 0,05 % de Tween 20 (PBST). Subsequentemente, HuMabs, diluídos em série em PBSTC (PBS suplementado com 2 % (v/v) de soro de galinha e 0,05 % (v/v) de Tween-20), foram incubados por 1 hora em RT, em condições de agitação (300 rpm). Os HuMabs ligados foram detectados usando anticorpos IgG anti-humano de cabra conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch) diluídos 1:5.000 em PBSTC, os quais foram incubados por 1 hora em RT em condições de agitação (300 rpm). A reação desenvolveu adicionalmente com ABTS (Roche Diagnostics) em RT no escuro, parou após 15-30 minutos adicionando 2 % (p/v) de ácido oxálico, e a seguir a absorbância a 405 nm foi medida. HuMab- KLH (um anticorpo monoclonal humano contra KLH (hemocianina de lapa californiana)) foi usado como um controle negativo. O TF anti-humano de camundongo (ERL) foi usado como controle positivo (IgG anti-camundongo marcado com HRP como conjugado). As curvas de ligação foram analisadas usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável), usando o software GraphPad Prism V4.03.
[000362] Como pode ser observado na figura 3, todos os anticorpos anti- TF se ligaram a TFECDHis. Os valores de EC50 para os HuMabs são a média de 3 experimentos e variou entre 0,13 e 0,17 nM (Tabela 2 a seguir).
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Exemplo 13 Ligação de HuMabs anti-TF Ao TF ligado à membrana
[000363] A ligação de HuMabs anti-TF ao TF ligado à membrana foi determinada por análise FACS, usando células CHO transfectadas com TF, ou linhagens de célula tumoral MDA-MB-231 que expressam TF, (luciferase transfectada) A431 e Bx-PC3.
[000364] As células foram ressuspensas em PBS (2 x 106 células/mL), colocadas em placas com fundo em V de 96 poços (50 pL/poço). 50 μL de HuMab diluído em série em tampão FACS (PBS suplementado com 0,1 % de BSA e 0,02 % de Na-azida) foram adicionados às células e incubados por 30 minutos no gelo. Após lavar três vezes com tampão FACS, foram adicionados 50 μL de IgGFc anti-humano de cabra conjugado com ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch), diluídos 1:100 em tampão FACS. Após 30 minutos no gelo (no escuro), as células foram lavadas três vezes, e a ligação específica dos HuMabs foi detectada por citometria de fluxo em um FACSCalibur (BD Biosciences). O HuMab-KLH foi usado como um controle negativo. O anti-TF de camundongo, seguido por IgGFc anti-humano de cabra conjugado com PE, foi usado como controle positivo. As curvas de ligação foram analisadas usando regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável), usando o software GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[000365] A figura 4 mostra um exemplo de curvas de ligação de HuMabs específicos de TF em células MDA-MB-231.
[000366] A tabela 3 fornece uma visão geral de valores de EC50 de ligação de HuMabs específicos de TF às células CHO transfectadas com TF
[000367), células MDA-MB-231, A431 e Bx-PC3.
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Tabela 3 - Visão geral dos valores de EC50 e média de intensidade de fluorescência máxima (max MFI), determinados por análise FACS da ligação de HuMabs específicos de TF aos diferentes tipos celulares.
[000368] Os valores de EC50 são em nM. MFI max para as células MDA-MB-231, BxPC3 e A431 em 30 μg/mL de anticorpo, para S1015-TF em 7,5 μg/mL de anticorpo. Exemplo 14 Inibição da ligação de FVIIa ao TF
[000369] A inibição de ligação de FVIIa ao TF, em células MDA-MB-231 por meio de HuMabs anti-TF, foi medida por análise FACS. As células MDA- MB-231 foram lavadas em PBS para remover o soro e plaqueadas em placas de 96 poços (100.000 células por poço). As células foram incubadas com HuMabs anti-TF em DMEM/0,1 % de BSA por 15 minutos, seguido por incubação com FVIIa 100 nM em DMEM/0,1 % de BSA a 4 °C por 30 minutos. As células foram lavadas com PBS/0,1 % de BSA/0,02 % de azida sódica (tampão FACS) e incubadas com 10 μg/mL de anti-FVIIa de coelho (Abcam [ab7053])). As células foram lavadas com tampão FACS e incubadas com IgG anti-coelho de cabra marcado com PE diluído 1:50 (Jackson [111-116-144]). As células foram lavadas com tampão FACS e a intensidade de fluorescência média (MFI) foi medida em um FACSCanto II (Becton Dickinson). A concentração de anticorpo necessária para obter 50 % de inibição (IC50) foi calculada usando GraphPad Prism (análise de regressão não linear).
[000370] A figura 5 e a tabela 4 mostram que HuMab-TF-098 (IC50: 1,2 μg/mL), -114 (IC50 não pode ser determinado) e -011 (IC50: 0,6 μg/mL) inibiram eficientemente a ligação de FVIIa com células MDA-MB-231, enquanto HuMab-TF-013, -044 e -111 não (ou em um grau muito menor) inibiram a ligação de FVIIa.
Figure img0021
a) não pode ser calculado Tabela 4 - Visão geral dos valores IC50 de anti-TF-HuMabs para inibir a ligação de FVIIa.
[000371] Os dados mostrados são valores de IC50 (em μg/mL) de HuMabs anti-TF para inibir a ligação de FVIIa 100 nM ao TF em células MDA-MB-231, medido em um experimento representativo. Exemplo 15 Internalização mediada por anticorpo e celiminação celular por HuMabs anti-TF em um ensaio anti-capa-ETA'
[000372] Para determinar se HuMabs anti-TF são adequados para uma abordagem de conjugado droga-anticorpo, um ensaio genérico de eliminação a base de célula in vitro usando exotoxina A de Pseudomonas direcionada a capa (anti-capa-ETA') foi usado. Neste ensaio, foi usado um domínio de cadeia leve anti-humano capa de alta afinidade, conjugado com uma forma truncada da exotoxina A de Pseudomonas. Mediante internalização, o conjugado anticorpo-domínio anti-capa-ETA' se submete à proteólise e redução de dissulfeto ligado, separando o domínio catalítico e o de ligação. O domínio catalítico é transportado a partir do complexo de Golgi para o retículo endoplasmático por meio do motivo de retenção KDEL, e é subsequentemente translocado para o citossol, onde inibe a síntese protéica e induz a apoptose (Kreitman RJ. BioDrugs. 2009; 23(1): 1-13. Recombinant Immunotoxins Containing Truncated Bacterial Toxins for the Treatment of Hematologic Malignancies).
[000373] A internalização medida por anticorpo e a eliminação celular pela toxina foram testadas com relação aos diferentes HuMabs anti-TF. Três linhagens celulares diferentes, com níveis comparáveis de expressão de TF, foram testadas. Estas células também expressaram EGFR (em diferentes níveis), permitindo o uso de um anticorpo como controle positivo (2F8) que se liga a EGFR, e que conhecido por introduzir internalização por EGFR. O número de moléculas de TF e EGFR expresso nas linhagens celulares foi determinado pelo kit Qifi (Dako, Glostrup, Dinamarca); células A431: média de moléculas de TF por célula aproximadamente 500.000, média de moléculas EGFR por célula aproximadamente 500.000; BxPC3: média de moléculas de TF por célula aproximadamente 500.000, média de moléculas EGFR por célula aproximadamente 200.000; MDA-MB-231: média de moléculas TF por célula aproximadamente 500.000, média de moléculas EGFR por célula aproximadamente 100.000. As células foram semeadas em concentração ideal (A431: 2.500 células/poço; BxPC3: 3.000 células/poço; MDA-MB-231: 5.000 células/poço) em meio de cultura de células, em lacas de cultura de tecido de 96 poços (Greiner Bio-one) e se aderiram naturalmente. Para identificar HuMabs anti-TF que possibilitam a internalização e eliminação por toxina, uma concentração fixa (0,5 μg/mL [A431 e BxPC3]; 0,25 μg/mL [MDA-MB-231]) de anti-capa-ETA', que não induziu a eliminação celular específica na ausência de anticorpo, foi incubada por 30 minutos com uma quantidade titulada de HuMabs anti-TF, antes da adição das células. Após três dias, a quantidade de células viáveis foi quantificada com AlamarBSue (BioSource International, São Francisco, U.S.) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência foi monitorada usando o leitor EnVision 2101 Muitilabel (PerkinElmer, Turku, Finland) com ajustes padrões AiamarBlue. 2F8 com o anti-capa-ETA' foi incluído como um controle positivo. Um anticorpo do isotipo controle (IgGi-b12) foi usado como controle negativo.
[000374] A figura 6 e a tabela 5 mostram que todos, exceto um, (HuMab-TF-087) os HuMabs anti-TF pré-incubados com anti-capa-ETA'- foram capazes de matar as células A431, BxPC3 e MDA-MB-231 de uma maneira dose-dependente. HuMab-TF-098, -114 e -011 pré-incubado com anti-capa-ETA', induziram a eliminação de maneira mais eficiente (EC50 entre 9 x 10-5 e 4 x 10-4 μg/mL em células A431 células) do que o HuMab-TF-013 , -111 e -044 pré-incubado com anti-capa-ETA' (EC5o entre 2,0 x 10-2 e 9,8 x 10-2 μg/mL em células A431). O HuMab-TF-087 pré-incubado com anti- capa-ETA' não induziu a eliminação celular.
[000375] Um experimento representativo é mostrado para cada linhagem celular: A431 (a), BxPC3 (b) e MDA-MB-231 (c). Os dados mostrados são intensidades médias de fluorescência (MFI) ± S.E.M. de poços em triplicata das células tratadas com HuMabs anti-TF pré-incubado com anti-capa-ETA'. A linha traçada superior indica o sinal máximo obtido na ausência de HuMabs anti-TF pré-incubado com anti-capa-ETA'; a linha traçada inferior indica a eliminação máxima obtida com estaurosporina. TABELA 5 - Visão geral dos valores de EC50 percentuais de eliminação induzidos por HuMabs ati-TF pré-incubados com anti-capa-ETA’. A431 BxPC3 MDA-MB-231
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a) Não pode ser calculado
[000376] Os dados mostrados são valores de EC50 (em μg/mL) e os percentuais máximos de eliminação das indicaram linhagens celulares tratadas com HuMabs anti-TF pré-incubado com anti-capa-ETA', medido em um experimento representativo. O percentual de eliminação celular (% de eliminação) foi calculado da maneira a seguir: Exemplo 16 Preparação de ADCs anti-TF
[000377] HuMab-011, HuMab-098 e HuMab-111 e o controle negativo IgG1-b12 foram produzidos transientemente em células HEK-293F (HuMab- 011, HuMab-111 e IgG1-b12), ou usando uma linhagem celular CHO estável (HuMab-098). Os anticorpos foram purificados por cromatografia com proteína A de acordo com procedimentos padrões, rendendo por fim aproximadamente 400 mg de anticorpo purificado. A seguir, os anticorpos foram conjugados com vcMMAE e mcMMAF, respectivamente. Aproximadamente 200 mg de de HuMab-011, HuMab-098 ou HuMab-111 foram conjugados tanto com vcMMAE quanto com mcMMAF. O ligante de droga vcMMAE ou mcMMAF foi alquiladi com as cisteínas dos anticorpos reduzidos de acordo com procedimentos descritos na literatura (Sun et al. (2005) Bioconjugate Chem. 16: 1282-1290; McDonagh et al., (2006) Protein Eng. Design Sel. 19: 299-307; Alley et at., (2008) Bioconjugate Chem. 19: 759-765). A reação foi finalizada pela adição de um excesso de N-acetilcisteína. Qualquer droga residual não conjugado foi removido por purificação e os conjugados de droga-anticorpo anti-TF finais foram formulados em PBS. Os conjugados de droga-anticorpo anti-TF foram analisados subsequentemente por concentração (por absorbância a 280 nm), pela razão droga para anticorpo (o 'DAR') por cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) e cromatografia de interação hidrofóbica (HIC), pela quantidade de droga não conjugada (por cromatografia de fase reversa), pela agregação percentual (por cromatografia de exclusão por tamanho, S-HPLC) e pelos níveis endotoxinas (por LAL). Os resultados são mostrados a seguir na tabela 6. Tabela 6 - Visão geral de diferentes características dos conjugados de droga-anticorpo
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Exemplo 17 Ligação dos ADCs anti-TF ao domínio extracelular recombinante de TF, determinado por ELISA
[000378] A ligação do ADCs anti-TF ao TF foi medida por ELISA (domínio extracelular recombinante revestido de TF) e comparada com ligação de HuMabs anti-TF não conjugado. As placas de ELISA (Greiner BioOne) foram revestidas O/N a 4 °C com 1,25 μg/mL, 100 μL por poço, de TFECDHis recombinante em PBS (B. Braun Melsungen AG). As placas de ELISA foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,05 % de Tween-20 (PBST), bloqueadas com 200 μL/poço de PBST em RT por 1 hora durante agitação (300 rpm), lavadas três vezes com PBST e esvaziadas. Subsequentemente, 100 μL de ADCs anti-TF ou HuMabs anti-TF não conjugados foram adicionados em diluições seriadas em PBST e incubadas durante agitação em RT por 90 minutos. As placas de ELISA foram lavadas três vezes com PBST e esvaziadas. ADCs anti-TF ligados e HuMabs não conjugados foram detectados adicionando IgG1 anti-humano de camundongo conjugado com HRP (100 μL; 0,015 μg/mL; Sanquin; # M1328) em tampão de ensaio, e em incubação com agitação em RT por 1 hora. As placas foram lavadas três vezes com PBST, esvaziadas e incubadas com 100 μL de solução ABTS (50 mL de tampão ABTS [Roche] e um comprimido de ABTS [50 mg; Roche]). Após a incubação no escuro em RT por 30 minutos, a reação foi parada por incubação com 100 μL por poço de ácido oxálico (2 % [p/v]; Riedel de Haen) no escuro por 10 minutos. As placas foram medidas em OD 405 nm em um leitor de ELISA (Biotek Instruments, EL808 Absorbance Microplate Reader).
[000379] IgG1-b12, um anticorpo que se liga a um antígeno não relacionado, foi usado como um controle negativo (tanto no formato conjugado quanto no formato ADC).
[000380] As curvas de ligação foram analisadas por regressão não linear (dose-resposta sigmoidal com inclinação variável) usando o software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA).
[000381] A figura 7 mostra as curvas de ligação, demonstrando que todos os HuMabs anti-TF e ADCs se ligaram em uma faixa similar ao domínio extracelular de TF em um ELISA (valores de EC50 entre 370 e 470 ng/mL). A tabela 7 mostra valores de EC50 de HuMabs anti-TF e ADCs para ligação no domínio extracelular de TF. Os valores de EC50 são em ng/mL.
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Exemplo 18 Internalização mediada por anticorpo e eliminação celular por ADCs anti-TF em um ensaio de eliminação in vitro
[000382] Para determinar a capacidade de ADCs anti-TF induzir a citotoxicidade, um ensaio de eliminação in vitro a base de células foi realizado.
[000383] A eliminação celular de três linhagens celulares foi testada para diferentes ADCs anti-TF. As células A431 foram obtidas de Deutsche Sammlung von Mikroorganimsmen und Zellkulturen GmbH (DSMZ: ACC 91), as células HPAF-II e NCI-H441 foram obtidas do American Type Culture Collection (ATCC: CRL-1997 e HTB-174). As células foram semeadas em concentração ideal (A431: 2,5 x 103 células/poço; HPAF-II e NCI-H441: 5 x 103 células/poço) em meio de cultura de células, em placas de cultura de tecido de 96 poços (Greiner Bio-one), e se aderiram naturalmente. As diluições seriadas de ADCs anti-TF foram adicionadas e incubadas a 37 °C por 72 horas (A431 e HPAF-II) ou 96 horas (NCI-H441). A quantidade de células viáveis foi quantificada com AiamarBlue (BioSource International, São Francisco, U.S.) de acordo com as instruções do fabricante. A fluorescência foi monitorada usando o leitor EnVision 2101 Multilabel (PerkinElmer, Turku, Finlândia) com ajustes padrões AiamarBlue. IgG1-b12 (um anticorpo que se liga a um antígeno não relacionado) e ADCs foram usados como controles negativos. A estaurosporina (Sigma, •# S6942.) foi usada para induzir a eliminação celular máxima.
[000384] As linhagens celulares A431 e HPAF-II expressam ambas mais de 200.000 moléculas de fator tecidual por célula e, portanto, podem estar relacionadas à expressão em níveis elevados de fator tecidual.
[000385] As células NCI-H441 expressam aproximadamente 80.000 moléculas de fator tecidual por célula e, portanto, podem estar relacionadas à expressão de níveis intermediários de fator tecidual.
[000386] A figura 8 e a tabela 8 mostram que todos os ADCs anti-TF foram capazes de eliminar as células A431, HPAF-II e NCI-H441 de uma maneira dose-dependente. HuMab-TF-098 e -011 induziram a eliminação um pouco mais eficiente (IC50 entre 9 e 22 ng/mL em células A431, entre 1 e 5 ng/mL em células HPAF-II e entre 1 e 10 ng/mL em células NCI-H441) que HuMab-TF-111 (IC50 entre 46 e 83 ng/mL em células A431, entre 4 e 15 ng/mL em células HPAF-II e 416 ng/mL em células NCI-H441). Um experimento representativo é mostrado para cada linhagem celular: A431 (a) e HPAF-II (b). Os dados mostrados são sobrevivência percentual ± S.E.M. de poços duplicados de células tratadas com ADCs anti-TF. Tabela 8 -visão geral de valores IC50 e percentuais de eliminação celular induzidos por ADCs anti-TF.
Figure img0026
[000387] a) Não pode ser calculado
[000388] Os dados mostrados são os valores IC50 (em ng/mL) e os percentuais de eliminação máxima (em uma concentração de 10 μg/mL) das linhagens celulares indicadas, tratadas com ADCs anti-TF, medidos em um experimento representativo. O percentual de eliminação celular (% de eliminação) foi calculado da maneira a seguir: (MFI não tratado-MFI ADC anti-TF tratado)/(MFI Exemplo 19 Tratamento terapêutico de xenoenxertos tumorais de A431 e HPSF-II em camundongos SCSD com ADCs anti-TF
[000389] A eficiência in vivo de ADCs anti-TF foi determinada em xenoenxertos tumorais de A431 e HPAF-II, estabelecidos subcutaneamente (SC), em camundongos SCID. 5 x 106 células tumorais A431 (obtidas da DSMZ) ou 2 x 106 células tumorais HPAF-II (obtidas da ATCC), em 200 μL de PBS, foram injetadas SC no flanco direito de camundongos fêmeas SCID, seguido por quatro injeções com ADCs anti-TF ou controles (IgG1-b12; tanto como ADC quanto não conjugado), iniciando quando os tamanhos dos tumores eram aproximadamente 200-250 mm3 para xenoenxertos de A431: dia 11, dia 14, dia 18 e dia 21, ou aproximadamente 100-150 mm3 para xenoenxertos de HPAF-II: dia 13, 16, 20 e 23 (60 μg/camundongo em 100 μL, intraperitonealmente (IP)). O volume do tumor foi determinado pelo menos duas vezes por semana. Os volumes do tumor (mm3) foram calculados a partir de medições em compasso (PLEXX) como: 0,52 x (comprimento) x (largura)2.
[000390] A figura 9 mostra que todo os ADCs anti-TF foram eficientes em inibir o crescimento de tumor de tumores de A431 (a) e HPAF-II (b) estabelecidos sc. Os dados mostrados são volumes médios do tumor ± S.E.M. por grupo (n = 7 camundongos por grupo). No modelo HPAF-II, os conjugados vcMMAE foram significativamente mais eficientes em inibir o crescimento de tumor do que os conjugados mcMMAF. Exemplo 20 Estabilidade de clone principal de ADCs anti-TF e ADCs IgG1-b12
[000391] A estabilidade dos materiais conjugados com MMAE e MMAF foi testada mediante armazenamento por 10 dias, 1, 2 e 3 meses a < - 65 °C e 5 °C. Neste exemplo, apenas os dados de três meses são mostrados, uma vez que resultados similares foram obtidos para todos os pontos de tempo intermediários. Além do mais, a estabilidade dos materiais foi testada em ciclos repetidos de congelamento-descongelamento.
[000392] Os lotes de ADC preparados (quatro lotes de IgG conjugados cada qual com dois ligantes diferentes, tabela 6) foram ultracongelados. Para testar a estabilidade, os lotes foram descongelados e diluídos em 1 mg/mL em PBS. O material diluído foi aliquotado em porções de 300 μL em criotubos e os frascos foram colocados a < -65 °C ou 5 °C para temperatura de armazenamento. Para o congelamento-descongelamento, três frascos de cada lote foram congelados a < -65 °C, O/N, e a seguir descongelados sem assistência em RT. O ciclo congela-descongela foi repetido mais duas vezes (as amostras foram congeladas-descongeladas três vezes no total). Todos os materiais foram analisados no início do estudo (t =0) por eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), cromatografia de exclusão por tamanho de alto desempenho (HP-SEC) e ligação ao fator tecidual (TFECDHis) em um ELISA de ligação. As mesmas análises foram realizadas para as amostras armazenadas por três meses (t=3 meses) a < -65 °C e 5 °C, e para as amostras congeladas-descongeladas.
[000393] SDS-PAGE foi realizado em condições de redução e não redução em 4-12 % de géis NuPAGE Bis-Tris (Invitrogen, Breda, Holanda), usando um método de Laemli modificado (Laemli 1970, Nature 227(5259): 680-5), onde as amostras foram corridas em pH neutro. Os géis de SDS- PAGE foram corados com Coomassie e convertidos em imagem digitalmente usando um sistema de formação de imagem Optigo (Isogen Life Science).
[000394] HP-SEC foi realizado usando um Waters Alliance 2695 ou unidade de separação 2795 (Waters, Etten-Leur, Holanda) conectado a uma coluna TSK HP-SEC (G3000SWxl; Tosoh Bioscience, via Omnilabo, Breda, Holanda), e um detector de absorbância Waters 2487 dual X (Waters). As amostras foram corridas a 1 mL/min. Os resultados foram processados usando software Empower, versão 2, e expresso por picos como percentual da altura total do pico.
[000395] A ligação à proteína recombinante do domínio extracelular de TF foi analisada por EL1SA, da maneira descrita supra no exemplo 17.
[000396] A figura 10 a-d mostra análises de SDS-PAGE de clones principais anti-TF, não conjugados e conjugados, e IgG1-b12 no início do estudo de estabilidade (t=0). Em SDS-PAGE não reduzido (a,b), IgG1 não conjugada migrou como uma banda de IgG intacta de cerca de 150 kDa. Da maneira esperada, ADCs dissociaram-se amplamente em fragmentos de IgG de tamanhos menores (125 kDa=HHL, 99 kDa = HH, 67 kDa = HL, 51 kDa = H e 25 kDa =L), em virtude das condições de desnaturação por SDS-PAGE e da natureza não covalente das moléculas de ADC (ligações dissulfeto interrompidas) (figura 10 a,b). A análise reduzida de SDS-PAGE (Figura 10 c,d) mostrou bandas da cadeia leve não conjugada (L0) e cadeia leve com uma droga (MMAE ou MMAF) anexado (L1). A resolução parcial foi observada para a cadeia pesada não conjugada (H0) e as formas conjugadas de MMAE (H1, H2 e H3). As formas de cadeia pesada conjugada com MMAF e não conjugada podem não ser bem resolvidas, mas aparecem como uma banda difusa em 50 kDa.
[000397] Os resultados de SDS-PAGE para as amostras após três meses de armazenamento em ambas as temperaturas (< -65 °C e 5 °C) foram comparáveis com os dados t=0, da maneira mostrada na figura 10 e-f. Igualmente, para as amostras de congelamento-descongelamento, nenhuma diferença foi observada, comparado ao material inicial por análise SDS- PAGE (dados não mostrados).
[000398] A figura 11 mostra as sobreposições do perfil de HP-SEC para os lotes de ADC em t=0 e t=3 meses em ambas as temperaturas. Nas condições de HP-SEC natural, o material ADC (t= 0) eluiu como um pico das moléculas de IgG monoméricas com menores quantidades de moléculas diméricas de IgG. Nenhuma mudança foi observada para o HuMab-TF-098 conjugado com MMAE e MMAF (a, b) e HuMab-TF-011 (c, d) em três meses de armazenamento. Entretanto, o material ADC de HuMab-TF-111 (e, f) e IgG1-b12 (g, h) mostrou uma diminuição na recuperação (altura do pico) em t=3 meses. Esta menor recuperação já tinha sido observada nas amostras de t= 10 dias, e permaneceu constante após armazenamento prolongado até três meses.
[000399] O percentual de moléculas de IgG monoméricas (% de monômero) foi calculado a partir do perfil de pico de HP-SEC, e os dados são resumidos na tabela 9. Para comparação, o % de monômero de material não conjugado é mostrado. Os dados mostraram que > 95 % do material ADC consistiu em moléculas monoméricas de IgG intactas. O % de monômero permaneceu não alterado após três meses de armazenamento a < -65 °C e 5 °C, indicando que nenhum agregado foi formado no período.
[000400] A análise HP-SEC das amostras congeladas/descongeladas mostrou que a recuperação do pico de IgG de todas as amostras foi similar às recuperações em t=0 (dados não mostrados). Entretanto, o congelamento/descongelamento do material de HuMab-TF-ADC resultou em um % de monômero um pouco menor (1,5-3,6 %), da maneira mostrada na tabela 9. Isto foi em virtude da formação de menos quantidades de agregados (moléculas diméricas de IgG, da maneira julgada por HP-SEC, dados não mostrados).
[000401] A ligação de HuMab-TF-098, 011 e 111 não conjugado e conjugado com a proteína recombinante do domínio extracelular de TF (TFECDHis) foi testada por ELISA. Após três meses de armazenamento a < - 65 °C e 5 °C, a capacidade de ligação não mudou comparada com aquela em t=0, da maneira mostrada na figura 12. Resultados similares foram obtidos para as amostras de congelamento-descongelamento (dados não mostrados).
[000402] Os experimentos de estabilidade mostraram que o material ADC, em 1 mg/mL, foi estável em < -65 °C e em 5 °C por pelo menos três meses, da maneira determinada por SDS-PAGE, HP-SEC, e ligação à TFECDHis. A menor formação de agregado foi induzida por congelamento e descongelamento repetido do material. Tabela 9 - Análise HP-SEC de amostras ADC
[000403] Os dados mostrados são percentuais de moléculas monoméricas
Figure img0027
Figure img0028
Exemplo 21 Resposta à dose de ADCs anti-TF no tratamento terapêutico de xenoenxertos tumorais de HPAF-II em camundongos SCID
[000404] A eficiência in vivo de ADCs anti-TF foi analisada adicionalmente por tratamento de xenoenxertos tumorais de SC HPAF-II estabelecidos em camundongos SCID, com diferentes doses de ADCs anti- TF. Os xenoenxertos tumorais de HPAF-II foram estabelecidos da maneira descrita supra, seguido por quatro injeções com ADCs vcMMAE anti-TF em duas doses diferentes (6 e 20 μg/camundongo [IgG1-b12 foi adicionado em uma dose final de 60 μg de IgG1 por camundongo] em 100 μL, IP), ou mAb controle não conjugado (IgG1-b12; 60 μg/camundongo em 100 μL, IP); iniciando quando os tamanhos dos tumores eram de aproximadamente 100150 mm3: dia 10, 13, 17 e 21. O volume do tumor foi determinado pelo menos duas vezes por semana. Os volumes de tumor (mm3) foram calculados a partir de medições de compasso (PLEXX) como: 0,52 x (comprimento) x (largura)2.
[000405] A figura 13 mostra que as doses de 20 μg de todos os três conjugados vcMMAE foram eficientes em inibir o crescimento de tumor ddos tumores de HPAF-II estabelecidos s.c.. A dose de 6 μg de todos os três vcMMAE conjugados foi capaz de retardar um pouco, mas não inibir, o crescimento de tumor.
[000406] EQUIVALENTES
[000407] Os versados na técnica reconhecerão, ou serão capazes de constatar usando não mais que experimentos de rotina, muitos equivalentes das modalidade específicas da invenção aqui descritas. Pretende-se que tais equivalentes sejam incluídos pelas reivindicações a seguir. Qualquer combinação das modalidades reveladas nas reivindicações dependentes também são contempladas para estar no escopo da invenção.

Claims (21)

1. Conjugado de droga-anticorpo que compreende um anticorpo que se liga a fator tecidual, caracterizado pelo fato de que compreende: (i) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:6, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 7, e uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 8, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:46, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 47, e uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 48, (ii) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:34, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 35, e uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 36, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 74, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 75, e uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 76, ou (iii) uma região VH que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 38, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 39, e uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 40, e uma região VL que compreende uma região CDR1 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 78, uma região CDR2 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 79 e uma região CDR3 com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 80, em que o anticorpo foi conjugado, por meio de um ligante, com uma auristatina selecionada dentre monometil auristatina E ou monometil auristatina F.
2. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende: (i) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 45, ou (ii) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 33 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 73, ou (iii) uma região VH que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 37 e uma região VL que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 77.
3. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de tamanho completo.
4. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo IgG1 monoclonal completamente humano, tal como uma IgG1,K.
5. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a auristatina é monometil auristatina E (MMAE):
Figure img0029
em que a linha ondulada indica o sítio de anexação com o ligante.
6. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a auristatina é monometil auristatina F (MMAF):
Figure img0030
em que a linha ondulada indica o sítio de anexação com o ligante.
7. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o ligante é anexado aos resíduos de sulfidrila do anticorpo anti-TF obtidos por redução (parcial) do anticorpo anti-TF.
8. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5 ou 7, caracterizado pelo fato de que o ligante- auristatina é vcMMAE:
Figure img0031
em que p significa um número de 1 a 8, S representa um resíduo de sulfidrila do anticorpo anti-TF, e Ab determina o anticorpo anti-TF.
9. Conjugado de droga-anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4 ou 6 a 7, caracterizado pelo fato de que o ligante- conjugado é mcMMAF:
Figure img0032
em que p significa um número de 1 a 8, S representa um resíduo sulfidrila do anticorpo anti-TF, e Ab determina o anticorpo anti-TF.
10. Conjugado anticorpo-droga, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende: uma região VH compreendendo uma região CDR1 tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 6, uma região CDR2 tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 7, e uma região CDR3 tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 8, e uma região VL compreendendo uma região CDR1 tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 46, uma região CDR2 tendo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO: 47, e uma região CDR3 tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO: 48, e em que o ligante-auristatina é vcMMAE:
Figure img0033
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) em que p significa um número de 1 a 8, S representa um resíduo sulfidrila do anticorpo anti-TF, e Ab determina o anticorpo anti-TF.
11. Conjugado anticorpo-fármaco, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o anticorpo compreende uma região VH compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 5 e uma região VL compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 45 e em que o ligante-auristatina é vcMMAE:
Figure img0034
Ab-MC-vc-PAB-MMAE (vcMMAE) em que p significa um número de 1 a 8, S representa um resíduo sulfidrila do anticorpo anti-TF, e Ab determina o anticorpo anti-TF.
12. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende o conjugado de droga-anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
13. Uso do conjugado de droga-anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que é para a fabricação de um medicamento para o tratamento de câncer.
14. Uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o medicamento é para o tratamento de câncer em combinação com um ou mais agentes terapêuticos adicionais, tal como um agente quimioterapêutico.
15. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado do grupo que consiste em tumores do sistema nervoso central, câncer de cabeça e pescoço, câncer de pulmão tal como NSCLC, câncer de mama, especificamente câncer de mama triplo negativo, câncer no esôfago, câncer gástrico ou no estômago, câncer hepático e biliar, câncer pancreático, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer renal, câncer de próstata, câncer endometrial, câncer no ovário, melanoma maligno, sarcoma, tumores de origem primária desconhecida, câncer na medula óssea, leucemia linfoblástica aguda, AML, leucemia linfoblástica crônica e linfoma não Hodgkin, câncer de pele, glioma, câncer do cérebro, útero e reto.
16. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer pancreático.
17. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer colorretal.
18. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer no ovário.
19. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de mama.
20. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de próstata.
21. Uso, de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de bexiga.
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Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004045512A2 (en) * 2002-11-15 2004-06-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd25
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
CN111012921A (zh) 2010-06-15 2020-04-17 根马布股份公司 针对组织因子的人抗体药物缀合物
UA117901C2 (uk) 2011-07-06 2018-10-25 Ґенмаб Б.В. Спосіб посилення ефекторної функції вихідного поліпептиду, його варіанти та їх застосування
AU2013285355A1 (en) 2012-07-06 2015-01-29 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EP3632462A1 (en) 2012-07-06 2020-04-08 Genmab B.V. Dimeric protein with triple mutations
EA201500741A1 (ru) 2013-01-10 2016-01-29 Генмаб Б.В. ВАРИАНТЫ Fc-ОБЛАСТИ IGG1 ЧЕЛОВЕКА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ
CN103342752B (zh) * 2013-05-16 2014-07-09 太原博奥特生物技术有限公司 一种抗人组织因子单链抗体及其制备方法
JP6590803B2 (ja) * 2013-11-21 2019-10-16 ゲンマブ エー／エス 抗体−薬物コンジュゲート凍結乾燥製剤
JP5957637B2 (ja) * 2014-02-03 2016-07-27 国立研究開発法人国立がん研究センター 抗ＴｉｓｓｕｅＦａｃｔｏｒモノクローナル抗体
CA2942101A1 (en) * 2014-03-21 2015-09-24 Abbvie Inc. Anti-egfr antibodies and antibody drug conjugates
MX2016012258A (es) * 2014-04-08 2017-01-06 Seattle Genetics Inc Dosificacion optima de un conjugado del farmaco del anticuerpo-cd19.
CA2929542A1 (en) * 2015-05-13 2016-11-13 Pfizer Inc. Treatment with anti-efna4 antibody-drug conjugates
KR20180021723A (ko) * 2015-06-29 2018-03-05 다이이찌 산쿄 가부시키가이샤 항체-약물 콘주게이트의 선택적 제조 방법
AU2016297178A1 (en) * 2015-07-22 2018-01-25 Iconic Therapeutics, Inc. Methods for treating disorders associated with angiogenesis and neovascularization
WO2017028823A1 (zh) * 2015-08-20 2017-02-23 复旦大学 靶向于组织因子的抗体、其制备方法和用途
WO2018036117A1 (zh) * 2016-08-22 2018-03-01 复旦大学 靶向于组织因子的抗体、其制备方法和用途
JP6978409B2 (ja) 2015-09-11 2021-12-08 ゲンマブ エー／エス 抗ｔｆ抗体薬物コンジュゲートの投薬レジメン
KR102445255B1 (ko) 2016-03-02 2022-09-22 에자이 알앤드디 매니지먼트 가부시키가이샤 에리불린-기반 항체-약물 콘주게이트 및 사용 방법
CA3017813C (en) * 2016-03-17 2021-12-07 Oslo Universitetssykehus Hf Fusion proteins targeting tumour associated macrophages for treating cancer
CA3018081A1 (en) 2016-03-22 2017-09-28 Bionomics Limited Administration of an anti-lgr5 monoclonal antibody
CN106938051B (zh) 2016-08-22 2019-10-11 复旦大学 靶向于组织因子的抗体-药物偶联物
KR20190070977A (ko) 2016-11-01 2019-06-21 젠맵 비. 브이 폴리펩티드 변이체 및 그의 용도
CA3051038C (en) * 2017-01-24 2022-07-26 Pfizer Inc. Calicheamicin derivatives and antibody drug conjugates thereof
NZ756224A (en) 2017-02-10 2024-02-23 Genmab Bv Polypeptide variants and uses thereof
CN113512111B (zh) * 2017-03-10 2023-08-15 北京天广实生物技术股份有限公司 抗埃博拉病毒单克隆抗体、其制备方法及用途
CA3080137A1 (en) * 2017-11-02 2019-05-09 Genmab A/S Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
AU2018371271A1 (en) * 2017-11-27 2020-06-11 Purdue Pharma L.P. Humanized antibodies targeting human tissue factor
JP2021509823A (ja) * 2018-01-04 2021-04-08 アイコニック セラピューティクス インコーポレイテッド 抗組織因子抗体、抗体薬物コンジュゲート、及び関連する方法
JP2021510740A (ja) 2018-01-24 2021-04-30 ゲンマブ ビー．ブイ． ポリペプチド変種およびそれらの用途
JP7471227B2 (ja) * 2018-03-07 2024-04-19 ジェンマブ エー／エス 抗組織因子抗体－薬物コンジュゲートおよびがんの治療におけるその使用
US20210015939A1 (en) * 2018-03-21 2021-01-21 Genmab A/S Methods of treating cancer with a combination of a platinum-based agent and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
KR20210008380A (ko) 2018-05-03 2021-01-21 젠맵 비. 브이 항체 변이체 조합물 및 그의 용도
BR112020022265A2 (pt) * 2018-05-07 2021-02-23 Genmab A/S método para tratar câncer em um indivíduo, e, estojo.
US20220088191A1 (en) * 2018-05-07 2022-03-24 Genmab A/S Methods of treating cancer with a combination of an anti-pd-1 antibody and an anti-tissue factor antibody-drug conjugate
SG11202101428UA (en) * 2018-08-16 2021-03-30 Genmab As Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
TW202034958A (zh) 2018-10-30 2020-10-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 使用抗血管內皮生長因子（ｖｅｇｆ）抗體與抗組織因子（ｔｆ）抗體－藥物共軛體之組合以治療癌症之方法
JP2022538908A (ja) * 2019-07-03 2022-09-06 アイコニック セラピューティクス インコーポレイテッド 抗組織因子抗体－薬物コンジュゲート及び関連方法
JP2023500701A (ja) 2019-11-06 2023-01-10 ジェンマブ ビー．ブイ． 抗体変種の組み合わせおよびその使用
KR20220113685A (ko) 2019-11-07 2022-08-16 젠맵 에이/에스 항-pd-1 항체와 항-조직 인자 항체-약물 접합체의 조합을 사용하여 암을 치료하는 방법
TW202131954A (zh) 2019-11-07 2021-09-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 利用鉑類劑與抗組織因子抗體－藥物共軛體之組合來治療癌症之方法
WO2021134045A1 (en) * 2019-12-26 2021-07-01 Ohio State Innovation Foundation Methods and compositions for inhibition of dihydroorotate dehydrogenase in combination with an anti-cd38 therapeutic agent
EP4171652A1 (en) 2020-06-29 2023-05-03 Genmab A/S Anti-tissue factor antibody-drug conjugates and their use in the treatment of cancer
KR20230084508A (ko) 2020-09-11 2023-06-13 얀센 바이오테크 인코포레이티드 베타 사슬 매개 면역을 조절하기 위한 방법 및 조성물
US20220089736A1 (en) * 2020-09-11 2022-03-24 Janssen Biotech, Inc. Immune targeting molecules and uses thereof
IL302402A (en) 2020-11-08 2023-06-01 Seagen Inc Combined treatment
CN113368232B (zh) * 2021-06-02 2022-08-26 上海交通大学 多特异性抗原结合蛋白及其应用
CN117730144A (zh) * 2021-07-29 2024-03-19 株式会社图尔金 具有血液相容性的间充质干细胞、其制备方法及用途
WO2023213960A1 (en) 2022-05-06 2023-11-09 Genmab A/S Methods of treating cancer with anti-tissue factor antibody-drug conjugates
WO2024083162A1 (en) * 2022-10-19 2024-04-25 Multitude Therapeutics Inc. Antibodies, antibody-drug conjugates, preparations and uses thereof

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US505731A (en) 1893-09-26 Ice oeeam feeezee
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
JPS5896026A (ja) 1981-10-30 1983-06-07 Nippon Chemiphar Co Ltd 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
US4609546A (en) 1982-06-24 1986-09-02 Japan Chemical Research Co., Ltd. Long-acting composition
US4681581A (en) 1983-12-05 1987-07-21 Coates Fredrica V Adjustable size diaper and folding method therefor
US5981216A (en) 1985-04-01 1999-11-09 Alusuisse Holdings A.G. Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
WO1986005807A1 (en) 1985-04-01 1986-10-09 Celltech Limited Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4766106A (en) 1985-06-26 1988-08-23 Cetus Corporation Solubilization of proteins for pharmaceutical compositions using polymer conjugation
US5101827A (en) 1985-07-05 1992-04-07 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US4735210A (en) 1985-07-05 1988-04-05 Immunomedics, Inc. Lymphographic and organ imaging method and kit
US5776093A (en) 1985-07-05 1998-07-07 Immunomedics, Inc. Method for imaging and treating organs and tissues
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US5057313A (en) 1986-02-25 1991-10-15 The Center For Molecular Medicine And Immunology Diagnostic and therapeutic antibody conjugates
US5589173A (en) 1986-11-04 1996-12-31 Genentech, Inc. Method and therapeutic compositions for the treatment of myocardial infarction
US5223427A (en) 1987-03-31 1993-06-29 The Scripps Research Institute Hybridomas producing monoclonal antibodies reactive with human tissue-factor glycoprotein heavy chain
US5437864A (en) 1987-03-31 1995-08-01 The Scripps Research Institute Method of inhibiting blood coagulation in extracorporeal circulation by inhibiting human tissue factor
US5750172A (en) 1987-06-23 1998-05-12 Pharming B.V. Transgenic non human mammal milk
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
US5648471A (en) 1987-12-03 1997-07-15 Centocor, Inc. One vial method for labeling antibodies with Technetium-99m
US5879936A (en) 1988-04-18 1999-03-09 Aluguisse Holding A.G. Recombinant DNA methods, vectors and host cells
GB8809129D0 (en) 1988-04-18 1988-05-18 Celltech Ltd Recombinant dna methods vectors and host cells
JP2749167B2 (ja) 1988-06-21 1998-05-13 ジェネンテク，インコーポレイテッド 心筋梗塞の処置のための方法および治療用組成物
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
WO1991001754A1 (en) 1989-08-09 1991-02-21 Rhodes Buck A Direct radiolabeling of antibodies and other proteins with technetium or rhenium
US5633076A (en) 1989-12-01 1997-05-27 Pharming Bv Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo
ES2104690T3 (es) 1989-12-22 1997-10-16 Applied Research Systems Modificaciones de la expresion de genes endogenos con un elemento regulador por medio de recombinacion homologa.
US5891693A (en) 1990-01-25 1999-04-06 Alusuisse Holdings A.G. Recombinant DNA methods vectors and host cells
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5874299A (en) 1990-08-29 1999-02-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5789650A (en) 1990-08-29 1998-08-04 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US6300129B1 (en) 1990-08-29 2001-10-09 Genpharm International Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5877397A (en) 1990-08-29 1999-03-02 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5506134A (en) 1990-10-22 1996-04-09 Corvas International, Inc. Hypridoma and monoclonal antibody which inhibits blood coagulation tissue factor/factor VIIa complex
JP3149960B2 (ja) 1991-01-24 2001-03-26 財団法人化学及血清療法研究所 ヒト組織因子を定量する方法
AU2235992A (en) 1991-06-14 1993-01-12 Genpharm International, Inc. Transgenic immunodeficient non-human animals
DE69224906T2 (de) 1991-07-08 1998-10-29 Univ Massachusetts Thermotropes flüssig-kristallines segment-blockcopolymer
US6063630A (en) 1991-11-05 2000-05-16 Transkaryotic Therapies, Inc. Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
EP0746609A4 (en) 1991-12-17 1997-12-17 Genpharm Int NON-HUMAN TRANSGENIC ANIMALS CAPABLE OF PRODUCING HETEROLOGOUS ANTIBODIES
JPH05244988A (ja) 1992-03-04 1993-09-24 Green Cross Corp:The 抗組織因子モノクローナル抗体、及びこれによる免疫抑制剤
US5733743A (en) 1992-03-24 1998-03-31 Cambridge Antibody Technology Limited Methods for producing members of specific binding pairs
AU5093593A (en) * 1992-08-28 1994-03-29 Scripps Research Institute, The Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function
US5635483A (en) 1992-12-03 1997-06-03 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Tumor inhibiting tetrapeptide bearing modified phenethyl amides
US5879677A (en) 1992-12-09 1999-03-09 The Scripps Research Institute Method for inhibition of cerebral tissue factor mediated reperfusion damage
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5780588A (en) 1993-01-26 1998-07-14 Arizona Board Of Regents Elucidation and synthesis of selected pentapeptides
JP3801196B2 (ja) 1993-03-09 2006-07-26 ジェンザイム・コーポレイション 乳からの対象化合物の単離
AU6819494A (en) 1993-04-26 1994-11-21 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US6214345B1 (en) 1993-05-14 2001-04-10 Bristol-Myers Squibb Co. Lysosomal enzyme-cleavable antitumor drug conjugates
US5827690A (en) 1993-12-20 1998-10-27 Genzyme Transgenics Corporatiion Transgenic production of antibodies in milk
US6077835A (en) 1994-03-23 2000-06-20 Case Western Reserve University Delivery of compacted nucleic acid to cells
US5879687A (en) 1994-04-22 1999-03-09 Corixa Corporation Methods for enhancement of protective immune responses
DE69519929T2 (de) 1994-07-11 2001-05-23 Univ Texas Verfahren und zusammensetzungen für die spezifische koagulation von tumorgefässen
US5663149A (en) 1994-12-13 1997-09-02 Arizona Board Of Regents Acting On Behalf Of Arizona State University Human cancer inhibitory pentapeptide heterocyclic and halophenyl amides
US5703057A (en) 1995-04-07 1997-12-30 Board Of Regents The University Of Texas System Expression library immunization
EP0833911B1 (en) 1995-06-07 2004-05-12 Ortho Pharmaceutical Corporation Cdr-grafted anti-tissue factor antibodies and methods of use thereof
KR970029803A (ko) 1995-11-03 1997-06-26 김광호 반도체 메모리장치의 프리차지 회로
JPH09302000A (ja) 1996-05-16 1997-11-25 Chemo Sero Therapeut Res Inst 抗組織因子モノクローナル抗体及び当該モノクローナル抗体を用いた組織因子凝固活性の測定法
US6593291B1 (en) 1997-02-06 2003-07-15 Entremed, Inc. Compositions and methods of use of ligands that bind components of the blood coagulation/clotting pathway for the treatment of cancer and angiogenic-based disease
US5986065A (en) 1997-03-10 1999-11-16 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US7749498B2 (en) 1997-03-10 2010-07-06 Genentech, Inc. Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US20040229282A1 (en) 1997-03-10 2004-11-18 Sunol Molecular Corporation Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
US6719977B1 (en) 1998-02-12 2004-04-13 The General Hospital Corporation Methods to potentiate cancer therapies
WO1999050392A1 (en) 1998-03-31 1999-10-07 Geron Corporation Methods and compositions for eliciting an immune response to a telomerase antigen
US6677436B1 (en) 1998-04-03 2004-01-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Humanized antibody against human tissue factor (TF) and process of production of the humanized antibody
EP1728865A1 (en) 1998-09-04 2006-12-06 Aventis Pasteur Limited Treatment of cervical cancer
US6387888B1 (en) 1998-09-30 2002-05-14 American Foundation For Biological Research, Inc. Immunotherapy of cancer through expression of truncated tumor or tumor-associated antigen
ATE276199T1 (de) 1999-02-03 2004-10-15 Biosante Pharmaceuticals Inc Methoden zur herstellung von therapeutische kalzium-phosphat partikeln
US6281005B1 (en) 1999-05-14 2001-08-28 Copernicus Therapeutics, Inc. Automated nucleic acid compaction device
JP2003516718A (ja) 1999-07-29 2003-05-20 メダレックス インク ＨＥＲ２／ｎｅｕに対するヒトモノクローナル抗体
CN1371416B (zh) 1999-08-24 2012-10-10 梅达里克斯公司 人ctla-4抗体及其应用
JP2001213804A (ja) 2000-01-31 2001-08-07 Chugai Pharmaceut Co Ltd 抗組織因子抗体の複合体
EP1263960A2 (en) 2000-03-16 2002-12-11 Genentech, Inc. Anti-tissue factor antibodies with enhanced anticoagulant potency
WO2002042468A2 (en) 2000-11-27 2002-05-30 Geron Corporation Glycosyltransferase vectors for treating cancer
US20040018194A1 (en) 2000-11-28 2004-01-29 Francisco Joseph A. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
KR100857943B1 (ko) 2000-11-30 2008-09-09 메다렉스, 인코포레이티드 인간 항체의 제조를 위한 형질전환 트랜스염색체 설치류
EP1243276A1 (en) 2001-03-23 2002-09-25 Franciscus Marinus Hendrikus De Groot Elongated and multiple spacers containing activatible prodrugs
EP1374896A4 (en) 2001-03-26 2005-04-06 Koji Suzuki MEANS TO IMPROVE THE FLUID CHARACTERISTICS OF BLOOD
US7129261B2 (en) 2001-05-31 2006-10-31 Medarex, Inc. Cytotoxic agents
US7247304B2 (en) 2001-08-23 2007-07-24 Genmab A/S Methods of treating using anti-IL-15 antibodies
SI1425389T1 (sl) 2001-08-23 2012-02-29 Genmab As Humana protitelesa, specifična za interlevkin 15 (IL-15)
WO2003020111A2 (en) 2001-08-30 2003-03-13 Mount Sinai School Of Medicine Of New York University Alternatively spliced circulating tissue factor
KR20040045478A (ko) * 2001-10-02 2004-06-01 노보 노르디스크 에이/에스 인간 조직인자 항체
TWI338009B (en) 2001-10-29 2011-03-01 Genentech Inc Antibodies for inhibiting blood coagulation and methods of use thereof
EP1443956A2 (en) 2001-11-02 2004-08-11 Novo Nordisk Health Care AG Use of tissue factor agonist or tissue factor antagonist for treatment of conditions related to apoptosis
WO2003070275A1 (en) 2002-02-22 2003-08-28 Prophy Med Ab Use of an inhibitor or antagonist against tissue factor
CN100412090C (zh) 2002-05-01 2008-08-20 舍林股份公司 作为抗凝剂的新的靶向组织因子的血栓调节蛋白融合蛋白
WO2004007557A2 (en) * 2002-07-12 2004-01-22 Novo Nordisk A/S Tf antagonist
EP1545613B9 (en) 2002-07-31 2012-01-25 Seattle Genetics, Inc. Auristatin conjugates and their use for treating cancer, an autoimmune disease or an infectious disease
AU2003277832A1 (en) 2002-10-31 2004-05-25 Novo Nordisk A/S Humanized tissue factor antibodies
WO2004041296A2 (en) 2002-11-06 2004-05-21 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist and protein c polypeptides
WO2004041302A1 (en) 2002-11-06 2004-05-21 Novo Nordisk A/S Pharmaceutical composition comprising a tissue factor antagonist and a blood glucose regulator
US7705045B2 (en) 2002-11-14 2010-04-27 Syntarga, B.V. Prodrugs built as multiple self-elimination-release spacers
WO2004045512A2 (en) 2002-11-15 2004-06-03 Genmab A/S Human monoclonal antibodies against cd25
ATE527278T1 (de) 2002-12-16 2011-10-15 Genmab As Humane monoklonale antikörper gegen interleukin 8 (il-8)
WO2004064870A2 (en) 2003-01-22 2004-08-05 Novo Nordisk A/S Radiolabelled tissue factor binding agent and the use thereof
US20060034846A1 (en) 2003-04-14 2006-02-16 Mirella Ezban Use of TF antagonists
US7425328B2 (en) * 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
AU2004251161A1 (en) 2003-05-30 2005-01-06 Genentech, Inc. Polypeptides that bind an anti-tissue factor antibody and uses thereof
US7605235B2 (en) * 2003-05-30 2009-10-20 Centocor, Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions
CN100528229C (zh) 2003-05-30 2009-08-19 森托科尔公司 用抗组织因子抗体抑制肿瘤生长的方法
KR100912381B1 (ko) 2003-06-19 2009-08-19 타녹스 인코퍼레이티드 응고 관련 질병을 치료하기 위한 조성물 및 방법
WO2005025623A2 (en) * 2003-07-28 2005-03-24 Emory University Ef-24-factor vii conjugates
AU2004268648A1 (en) 2003-08-29 2005-03-10 Centocor, Inc. Method of promoting graft survival with anti-tissue factor antibodies
SG195524A1 (en) 2003-11-06 2013-12-30 Seattle Genetics Inc Monomethylvaline compounds capable of conjugation to ligands
DK1691837T3 (da) 2003-12-10 2012-10-01 Medarex Inc IP-10-antistoffer og anvendelse heraf
EP1744734A2 (en) 2004-02-20 2007-01-24 Novo Nordisk A/S Therapeutic combination comprising a tissue factor antagonist and anti-cancer compounds
WO2005118646A2 (en) 2004-04-26 2005-12-15 Centocor, Inc. Epitope directed selection of antibodies to murine tissue factor
KR20120064120A (ko) 2004-06-01 2012-06-18 제넨테크, 인크. 항체 약물 접합체 및 방법
US8911726B2 (en) 2004-09-22 2014-12-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd Stabilized human Igg4 antibodies
EP1676574A3 (en) 2004-12-30 2006-07-26 Johnson &amp; Johnson Vision Care, Inc. Methods for promoting survival of transplanted tissues and cells
WO2007018431A2 (en) 2005-08-05 2007-02-15 Syntarga B.V. Triazole-containing releasable linkers and conjugates comprising the same
US20090214563A1 (en) 2005-10-21 2009-08-27 Genentech, Inc. Treatment for antiphospholipid-syndrome-related pregnancy complications
NZ568762A (en) 2005-11-07 2011-11-25 Scripps Research Inst Use of an inhibitor of tissue factor signaling in the manufacture of a medcament for inhibiting or suppressing tissue factor/tissue factor VIIa signaling involving protease activated receptor 2 in a mammal
US10155816B2 (en) 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
WO2008030260A2 (en) 2005-12-22 2008-03-13 Genentech, Inc. Treatment of variola viral infections using a tissue factor inhibitor
EP1994000B1 (en) 2006-02-02 2017-08-23 Syntarga B.V. Water-soluble cc-1065 analogs and their conjugates
PL2502938T3 (pl) * 2006-10-27 2015-07-31 Genentech Inc Przeciwciała i immunokoniugaty oraz ich zastosowanie
AR065271A1 (es) * 2007-02-09 2009-05-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-robo4 y sus usos
CA2685698A1 (en) * 2007-04-30 2008-11-13 Centocor Ortho Biotech Inc. Anti-tissue factor antibodies and compositions with enhanced effector function
CA2688275A1 (en) 2007-05-31 2008-12-04 Genmab A/S Stable igg4 antibodies
AU2007357156B2 (en) 2007-08-01 2013-01-10 Syntarga B.V. Substituted CC-1065 analogs and their conjugates
WO2009097006A2 (en) 2007-08-10 2009-08-06 Medarex, Inc. Hco32 and hco27 and related examples
ES2647317T3 (es) 2008-11-03 2017-12-20 Syntarga B.V. Análogos de CC-1065 y sus conjugados
BRPI0921947A2 (pt) * 2008-11-20 2018-10-16 Genentech, Inc. formulações de proteína terapêutica
UA109633C2 (uk) * 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
JP5172811B2 (ja) 2009-10-27 2013-03-27 株式会社ジェイエスピー 発泡性スチレン系樹脂粒子及び該樹脂粒子の製造方法、並びにスチレン系樹脂発泡粒子成形体
CN111012921A (zh) 2010-06-15 2020-04-17 根马布股份公司 针对组织因子的人抗体药物缀合物
JP5244988B1 (ja) 2012-02-20 2013-07-24 浜松ホトニクス株式会社 濃度測定装置および濃度測定方法
JP6590803B2 (ja) * 2013-11-21 2019-10-16 ゲンマブ エー／エス 抗体−薬物コンジュゲート凍結乾燥製剤

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