ES2647388T3 - Conjugados farmacológicos de anticuerpos humanos contra factor tisular - Google Patents

Conjugados farmacológicos de anticuerpos humanos contra factor tisular Download PDF

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Abstract

Un conjugado farmacológico de anticuerpo que comprende un anticuerpo que se une con un factor tisular, donde el anticuerpo se ha conjugado con una auristatina o un análogo peptídico funcional o derivado del mismo mediante un enlazador, y donde el anticuerpo del conjugado comprende una región VH que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 6, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 7 y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 8, y una región VL que comprende una región CDR1 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 46, una región CDR2 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 47 y una región CDR3 que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEQ ID NO: 48.

Description

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En una realización el conjugado farmacológico de anticuerpo es estable a 5 ºC durante al menos tres meses, donde estable se refiere a que al menos el 95 % del conjugado farmacológico de anticuerpo está presente como moléculas monoméricas cuando se determina como se describe en el Ejemplo 20.
5 En otro aspecto la invención proporciona una composición farmacológica que comprende el conjugado farmacológico de anticuerpo como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores. En una realización la composición farmacológica comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En otro aspecto la invención proporciona el conjugado farmacológico de anticuerpo como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores para su uso como un medicamento.
En otro aspecto la invención proporciona el conjugado farmacológico de anticuerpo como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores para uso en el tratamiento de un trastorno.
15 En otro aspecto la invención proporciona el conjugado farmacológico de anticuerpo como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores para uso en el tratamiento de inflamación.
En otro aspecto la invención proporciona el conjugado farmacológico de anticuerpo como se define en cualquiera de las realizaciones anteriores para uso en el tratamiento de cáncer.
En una realización, el cáncer se selecciona del grupo que consiste en tumores del sistema nervioso central, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de pulmón, tal como NSCLC, cáncer de mama, específicamente cáncer de mama triple negativo, cáncer esofágico, cáncer gástrico o de estómago, cáncer de hígado y biliar, cáncer pancreático, cáncer colorrectal, cáncer de vejiga, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer endometrial, cáncer ovárico, melanoma
25 maligno, sarcoma, tumores de origen primario desconocido, cáncer de médula ósea, leucemia linfoblástica aguda, leucemia linfoblástica crónica y linfoma no de Hodgkin, cáncer de piel, glioma, cáncer del cerebro, útero, leucemia mieloide aguda y recto.
En una realización el cáncer es cáncer pancreático.
En una realización el cáncer es cáncer colorrectal.
En una realización el cáncer es cáncer ovárico.
35 En una realización el cáncer es cáncer de mama.
En una realización el cáncer es cáncer de próstata.
En una realización el cáncer es cáncer de vejiga.
En una realización, el cáncer es un cáncer que es sensible a tratamiento con un inhibidor de tubulina.
En otro aspecto la invención proporciona el conjugado farmacológico de anticuerpo de una cualquiera de las realizaciones anteriores, donde el medicamento es para tratamiento de cáncer en combinación con uno o más
45 agentes terapéuticos adicionales, tales como un agente quimioterapéutico.
En otro aspecto la invención proporciona el uso del conjugado farmacológico de anticuerpo de una cualquiera de las realizaciones anteriores para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. En una realización, el cáncer puede seleccionarse de uno cualquiera de los cánceres descritos anteriormente.
En otro aspecto la invención proporciona un método para inducir muerte celular, o inhibir el crecimiento y/o la proliferación de una célula tumoral que expresa un factor tisular, que comprende la administración, a un individuo que lo necesite, de una cantidad eficaz del conjugado farmacológico de anticuerpo de cualquiera de las realizaciones anteriores.
55 En otro aspecto la invención proporciona un método de tratamiento de cualquiera de las enfermedades de cáncer anteriores mediante la administración a un individuo que lo necesita, de una cantidad eficaz del conjugado farmacológico de anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones anteriores. En una realización el conjugado farmacológico de anticuerpo se administra en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, tal como un agente quimioterapéutico.
Anticuerpo
La presente invención se refiere a conjugados farmacológicos de anticuerpo anti-FT, que comprende por lo tanto un 65 anticuerpo y un fármaco, que pueden conjugarse en particular entre sí mediante un enlazador.
15
Los anticuerpos pueden prepararse por técnicas recombinantes bien conocidas usando sistemas de vectores de expresión bien conocidos y células hospedadoras. En una realización los anticuerpos se preparan en una célula CHO usando el sistema de vector de expresión GS como se desvela en De la Cruz Edmunds et al., 2006, Molecular Biotechnology 34:179-190, documentos EP216846, US5981216, WO 87/04462, EP323997, US5591639,
5 US5658759, EP338841, US5879936 y US5891693.
Después de aislar y purificar los anticuerpos del medio celular usando técnicas bien conocidas, estos se conjugan con la auristatina mediante un enlazador como se desvela adicionalmente posteriormente.
Pueden producirse anticuerpos monoclonales de la presente invención, por ejemplo mediante el método de hibridoma descrito por primera vez en Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), o pueden producirse mediante métodos de ADN recombinante. Los anticuerpos monoclonales también pueden aislarse de bibliotecas de anticuerpos de fagos usando las técnicas descritas, por ejemplo, en Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) y Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991). Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de cualquier fuente adecuada. Por lo
15 tanto, por ejemplo, pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de hibridomas preparados a partir de linfocitos B esplénicos murinos obtenidos de ratones inmunizados con un antígeno de interés, por ejemplo en forma de células que expresan el antígeno en la superficie, o un ácido nucleico que codifica un antígeno de interés . También pueden obtenerse anticuerpos monoclonales de hibridomas derivados de células que expresan anticuerpos de seres humanos o mamíferos no humanos inmunizados tales como ratas, perros, primates, etc.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo humano. Los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra factor tisular pueden generarse usando ratones transgénicos o transcromosómicos que portan partes del sistema inmunitario humano en lugar del sistema de ratón. Dichos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones denominados en el presente documento ratones HuMAb y ratones KM, respectivamente, y se
25 denominan colectivamente en el presente documento "ratones transgénicos".
El ratón HuMAb contiene un minilocus de gen de inmunoglobulina humana que codifica secuencias de inmunoglobulina de cadena pesada (µ y γ) y ligera κ humanas no reordenadas, junto con mutaciones diana que inactivan los loci de cadena µ y κ endógenos (Lonberg, N. et al., Nature 368, 856-859 (1994)). En consecuencia, los ratones muestran expresión reducida de IgM o κ de ratón y en respuesta a inmunización, los transgenes de cadena pesada y ligera humana introducidos experimentan cambios de clase y mutaciones somáticas para generar anticuerpos monoclonales IgG,κ humanos de alta afinidad (Lonberg, N. et al. (1994), mencionado anteriormente; revisado en Lonberg, N. Handbook of Experimental Pharmacology 113, 49-101 (1994), Lonberg, N. y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. Vol. 13 65-93 (1995) y Harding, F. y Lonberg, N. Ann. N.Y. Acad. Sci 764 536-546 (1995)). La
35 preparación de ratones HuMAb se describe en detalle en Taylor, L. et al., Nucleic Acids Research 20, 6287-6295 (1992), Chen, J. et al., International Immunology 5, 647-656 (1993), Tuaillon et al., J. Immunol. 152, 2912-2920 (1994), Taylor, L. et al., International Immunology 6, 579-591 (1994), Fishwild, D. et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Véase también documentos US 5.545.806, US 5.569.825, US 5.625.126, US 5.633.425, US 5.789.650, US 5.877.397, US 5.661.016, US 5.814.318, US 5.874.299, US 5.770.429, US 5.545.807, WO 98/24884, WO 94/25585, WO 93/1227, WO 92/22645, WO 92/03918 y WO 01/09187.
Los ratones HCo7 tienen una alteración JKD en sus genes cadena ligera (kappa) endógenos (como se describe en Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes de cadena pesada endógenos (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén de cadena ligera kappa humana KCo5
45 (como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgén de cadena pesada humana HCo7 (como se describe en el documento US 5.770.429).
Los ratones HCo12 tienen una alteración JKD en sus genes de cadena ligera (kappa) endógenos (como se describe en Chen et al., EMBO J. 12, 821-830 (1993)), una alteración CMD en sus genes de cadena pesada endógenos (como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/14424), un transgén de cadena ligera kappa humana KCo5 (como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996)), y un transgén de cadena pesada humana HCo12 (como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO 01/14424).
La cepa de ratón transgénica HCo17 (véase también documento US 2010/0077497) se generó por coinyección del
55 inserto de 80 kb de pHC2 (Taylor et al. (1994) Int. Immunol., 6:579-591), el inserto de 25 Kb de pVX6, y un fragmento de cromosoma artificial de levadura de ~460 kb del cromosoma ylgH24. Esta línea se designó (HCo17) 25950. La línea (HCo17) 25950 se crio después con ratones que comprendían la mutación CMD (descrita en el Ejemplo 1 de la Publicación de PCT WO 01109187), la mutación JKD (Chen et al. (1993) EMBO J 12: 811-820), y el transgén 9272 (KC05) (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851). Los ratones resultantes expresan transgenes de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humana en un fondo homocigoto para alteración de los loci de cadena ligera kappa y pesada de ratón endógenos.
La cepa de ratón transgénico HCo20 es el resultado de una co-inyección de transgén de cadena pesada de minilocus 30 pHC2, YAC ylgH10 que contiene la región variable de línea germinal (Vh), y la construcción de 65 minilocus pVx6 (descrita en el documento WO09097006). La línea (HCo20) se crio después con ratones que comprendían la mutación CMD (descrita en el Ejemplo 1 de la Publicación de PCT WO 01/09187), la mutación JKD
16
(Chen et al. (1993) EMBO J. 12:811-820) y el transgén 9272 (KC05) (Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851). Los ratones resultantes expresan 10 transgenes de cadena ligera kappa y pesada de inmunoglobulina humanos en un fondo homocigoto para la alteración de los loci de cadena ligera kappa y pesada de ratón endógenos.
5 Para generar ratones HuMab con los efectos beneficiosos de la cepa Balb/c, se cruzaron ratones HuMab con ratones KC05 [MIK](Balb) que se generaron por entrecruzamiento de la cepa KC05 (como se describe en Fishwild et al. (1996) Nature Biotechnology 14:845-851) con ratones Balb/c de tipo silvestre para generar ratones como se describe en el documento WO09097006. Usando este cruce se crearon híbridos Balb/c para las cepas HCo12, HCo17 y HCo20.
En la cepa de ratón KM, el gen de cadena ligera kappa de ratón endógeno se ha alterado de forma homocigota como se describe en Chen et al., EMBO J. 12, 811-820 (1993) y el gen de cadena pesada de ratón endógeno se ha alterado de forma homocigota como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 01/09187. Esta cepa de ratón
15 porta un transgén de cadena ligera kappa humana, KCo5, como se describe en Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-851 (1996). Esta cepa de ratón también porta un transcromosoma de cadena pesada humana compuesto del fragmento hCF de cromosoma 14 (SC20) como se describe en el documento WO 02/43478.
Pueden usarse esplenocitos de estos ratones transgénicos para generar hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo con técnicas bien conocidas. También pueden generase anticuerpos monoclonales o policlonales humanos de la presente invención, o anticuerpos de la presente invención que se originan de otra especie de forma transgénica mediante la generación de otro mamífero no humano o planta que sea transgénico para la secuencia de cadena pesada y ligera de inmunoglobulina de interés y la producción del anticuerpo en una forma recuperable de los mismos. En relación con la producción transgénica en mamíferos,
25 pueden producirse anticuerpos en, y recuperarse de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véase por ejemplo documentos US 5.827.690, US 5.756.687, US 5.750.172 y US 5.741.957.
Además, pueden generarse anticuerpos humanos de la presente invención o anticuerpos de la presente invención de otra especie mediante tecnologías de tipo presentación, incluyendo, sin limitación, presentación en fagos, presentación retrovírica, presentación ribosómica y otras técnicas, usando técnicas bien conocidas en este campo y las moléculas resultantes pueden someterse a maduración adicional, tal como maduración de afinidad, ya que dichas técnicas se conocen bien en este campo. (Véase por ejemplo Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991) (presentación en fago), Vaughan et al., Nature Biotech 14, 309 (1996) (presentación en fago), Hanes y Plucthau, PNAS USA 94, 4937-4942 (1997) (presentación ribosómica), Parmley y Smith, Gene 73, 305-318 (1988)
35 (presentación en fago), Scott TIBS 17, 241-245 (1992), Cwirla et al., PNAS USA 87, 6378-6382 (1990), Russel et al., Nucl. Acids Research 21, 1081-1085 (1993), Hogenboom et al., Immunol. Reviews 130, 43-68 (1992), Chiswell y McCafferty TIBTCEH 10, 80-84 (1992) y documento US 5.733.743). Si se utilizan tecnologías de presentación para producir anticuerpos que no son humanos, dichos anticuerpos pueden humanizarse.
El anticuerpo de la invención puede ser de cualquier isotipo. La elección de isotipo típicamente estará guiada por las funciones efectoras deseadas, tales como inducción de ADCC. Son isotipos ejemplares IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. Puede usarse cualquiera de las regiones constantes de cadena ligera humana, kappa o lambda. Si se desea, la clase de un anticuerpo anti-FT de la presente invención puede cambiarse por métodos conocidos. Por ejemplo, un anticuerpo de la presente invención que fue originalmente IgM puede cambiarse de clase a un anticuerpo IgG de la
45 presente invención. Además, pueden usarse técnicas de cambio de clase para convertir una subclase de IgG en otra, por ejemplo de IgG1 a IgG2. Por lo tanto, la función efectora de los anticuerpos de la presente invención puede cambiarse por intercambio de isotipo a, por ejemplo, un anticuerpo IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgD, IgA, IgE o IgM para diversos usos terapéuticos. En una realización un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo IgG1, por ejemplo un IgG1,к.
En una realización, el anticuerpo de la invención es un anticuerpo de longitud completa, preferentemente un anticuerpo IgG1, en particular un anticuerpo IgG1,к. Se pretende que la expresión "anticuerpo de longitud completa" se entienda como referente a lo que se conoce en general como un anticuerpo natural, completo, es decir, no un fragmento u otros tipos de anticuerpos donde las cadenas diferentes de un anticuerpo se han reordenado por el
55 hombre para generar un nuevo tipo de anticuerpo (véase por ejemplo Sidhu SS, Nature Biotechnology, 25, 5, 537538, (2007) que desvela anticuerpos de longitud completa presentados). En otra realización, el anticuerpo de la invención es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.
Los fragmentos de anticuerpo pueden obtenerse, por ejemplo, por fragmentación usando técnicas convencionales, y los fragmentos pueden explorarse por su utilidad de la misma manera que se ha descrito en el presente documento para anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden generarse fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante puede tratarse para reducir enlaces disulfuro para producir fragmentos Fab'. Pueden obtenerse fragmentos Fab tratando un anticuerpo IgG con papaína; pueden obtenerse fragmentos Fab con digestión con pepsina de anticuerpo IgG. También puede producirse un fragmento F(ab') por unión de Fab' descrito 65 posteriormente mediante un enlace de tioéter o un enlace disulfuro. Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo obtenido cortando un enlace disulfuro de la región bisagra del F(ab')2. Puede obtenerse un fragmento
17
Fab' tratando un fragmento F(ab')2 con un agente reductor, tal como ditiotreitol. También pueden generarse fragmentos de anticuerpo mediante expresión de ácidos nucleicos que codifican dichos fragmentos en células recombinantes (véase por ejemplo Evans et al., J. Immunol. Meth. 184, 123-38 (1995)). Por ejemplo, un gen quimérico que codifica una parte de un fragmento F(abʹ)2 podría incluir secuencias de ADN que codifican el dominio
5 CH1 y la región bisagra de la cadena H, seguido de un codón de terminación de la traducción para producir dicha molécula de fragmento de anticuerpo truncada.
Los anticuerpos de la presente invención se desvelan adicionalmente y se caracterizan en el documento WO 2010/066803 (Genmab A/S).
10 En una realización el anticuerpo anti-FT es un anticuerpo IgG4 estabilizado. Son ejemplos de anticuerpos IgG4 estabilizados adecuados anticuerpos donde se sustituye arginina en la posición 409 en una región constante de cadena pesada de IgG4 humana, que se indica en el índice EU como en Kabat et al., con lisina, treonina, metionina
o leucina, preferentemente lisina (descrito en el documento WO2006033386 (Kirin)) y/o donde la región bisagra 15 comprende una secuencia Cys-Pro-Pro-Cys.
En una realización adicional, el anticuerpo anti-FT IgG4 estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde dicha cadena pesada comprende una región constante de IgG4 humana que tiene un resto seleccionado del grupo que consiste en: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición correspondiente a
20 409 y/o un resto seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Val, Gly, Ile y Leu en la posición correspondiente a 405, y donde dicho anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales, pero no comprende una secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys en la región bisagra. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende un resto de Lys o Ala en la posición correspondiente a 409 o la región CH3 del anticuerpo se ha remplazado por la región CH3 de IgG1 humano, de IgG2 humano o de IgG3 humano.
25 En una realización adicional más, el anticuerpo anti-FT IgG4 estabilizado es un anticuerpo IgG4 que comprende una cadena pesada y una cadena ligera, donde dicha cadena pesada comprende una región constante IgG4 humana que tiene un resto seleccionado del grupo que consiste en: Lys, Ala, Thr, Met y Leu en la posición correspondiente a 409 y/o un resto seleccionado del grupo que consiste en: Ala, Val, Gly, Ile y Leu en la posición correspondiente a
30 405, y donde dicho anticuerpo comprende opcionalmente una o más sustituciones, supresiones y/o inserciones adicionales y donde dicho anticuerpo comprende una secuencia de Cys-Pro-Pro-Cys en la región de bisagra. Preferentemente, dicho anticuerpo comprende un Lys o Ala en la posición correspondiente a 409 o la región CH3 del anticuerpo se ha reemplazado por la región CH3 de IgG1 humano, de IgG2 humano o de IgG3 humano.
35 En una realización adicional, el anticuerpo anti-FT es un anticuerpo de un tipo distinto de IgG4, por ejemplo IgG1, IgG2 o IgG3 que se ha mutado de modo que la capacidad para mediar en funciones efectoras, tales como ADCC, se ha reducido o incluso se ha eliminado. Dichas mutaciones se han descrito, por ejemplo en DallʹAcqua WF et al., J Immunol. 177(2):1129-1138 (2006) y Hezareh M, J Virol.;75(24):12161-12168 (2001).
40 Conjugados
La presente invención proporciona un conjugado farmacológico de anticuerpo anti-FT.
En un aspecto los conjugados farmacológicos de anticuerpo anti-FT de la presente invención comprenden un
45 anticuerpo anti-FT como se desvela en el presente documento conjugado con auristatinas o análogos y derivados peptídicos de auristatina (documentos US5635483; US5780588). Se ha mostrado que las auristatinas interfieren con dinámica de microtúbulos, hidrólisis de GTP y división nuclear y celular (Woyke et al (2001) Antimicrob. Agents y Chemother. 45(12): 3580-3584) y tienen actividad antineoplásica (documento US5663149) y anti-fúngica (Pettit et al., (1998) Antimicrob. Agents y Chemother. 42:2961-2965). El resto farmacológico de auristatina puede unirse con
50 el anticuerpo mediante un enlazador, a través del extremo N (amino) terminal o el extremo C (terminal) del resto farmacológico peptídico.
Las realizaciones de auristatina ejemplares incluyen los restos farmacológicos de monometil auristatina ligados al extremo N-terminal DE y DF, desvelados en Senter et al., Proceedings of the American Association for Cancer
55 Research. Volumen 45, número de resumen 623, presentado el 28 de marzo de 2004 y descrito en el documento US 2005/0238649).
Una realización de auristatina ejemplar es MMAE (monometil auristatina E), donde la línea ondulada indica la unión covalente con el enlazador (L) de un conjugado farmacológico de anticuerpo:
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Otra realización de auristatina ejemplar es MMAF (monometil auristatina F), donde la línea ondulada indica la unión covalente con un enlazador (L) de un conjugado farmacológico de anticuerpo (documento US2005/0238649):
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Los conjugados farmacológicos de anticuerpo anti-FT de acuerdo con la invención comprenden una unidad enlazadora entre la unidad farmacológica citostática o citotóxica y la unidad de anticuerpo. En algunas realizaciones, 10 el enlazador es escindible en condiciones intracelulares, de modo que la escisión del enlazador libera la unidad farmacológica del anticuerpo en el ambiente intracelular. En otra realización más, la unidad enlazadora no es escindible y el fármaco se libera por ejemplo por degradación de anticuerpo. En algunas realizaciones, el enlazador es escindible por un agente escindible que está presente en el ambiente intracelular (por ejemplo, dentro de un lisosoma o endosoma o caveola). El enlazador puede ser, por ejemplo, un enlazador de peptidilo que se escinde por 15 una enzima peptidasa o proteasa intracelular, incluyendo, pero sin limitación, una proteasa lisosómica o endosómica. En algunas realizaciones, el enlazador de peptidilo es de al menos dos aminoácidos de longitud o al menos tres aminoácidos de longitud. Los agentes de escisión pueden incluir catepsinas B y D y plasmina, todas las cuales se sabe que hidrolizan derivados farmacológicos dipeptídicos que dan como resultado la liberación de fármaco activo dentro de las células diana (véase por ejemplo Dubowchik y Walker, 1999, Pharm. Therapeutics 20 83:67-123). En una realización específica, el enlazador de peptidilo escindible por una proteasa intracelular es un Val-Cit (valina-citrulina) o un enlazador Phe-Lys (fenilalanina-lisina) (véase por ejemplo documento US6214345, que describe la síntesis de doxorrubicina con el enlazador Val-Cit y diferentes ejemplos de enlazadores Phe-Lys). Los ejemplos de las estructuras de un enlazador Val-Cit y un enlazador Phe-Lys incluyen pero sin limitación MC-vc-PAB descrito posteriormente, MC-vc-GABA, MC-Phe-Lys-PAB o MC-Phe-Lys-GABA, donde MC es una abreviatura de
25 maleimido caproílo, vc es una abreviatura de Val-Cit, PAB es una abreviatura de p-aminobenzilcarbamato y GABA es una abreviatura de ácido γ-aminobutírico. Una ventaja del uso de liberación proteolítica intracelular del agente terapéutico es que el agente se atenúa típicamente cuando se conjuga y las estabilidades en suero de los conjugados son típicamente altas.
30 En otra realización más, la unidad enlazadora no es escindible y el fármaco se libera por degradación de anticuerpo (véase documento US 2005/0238649). Típicamente, dicho enlazador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular. Como se usa en el presente documento, "no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular" en el contexto de un enlazador significa que no más del 20 %, típicamente no más de aproximadamente el 15 %, más típicamente no más de aproximadamente el 10 %, y aún más típicamente no más de aproximadamente el 5 %, no
35 más de aproximadamente el 3 %, o no más de aproximadamente el 1 % de los enlazadores, en una muestra de compuesto de conjugado farmacológico de anticuerpo, se escinden cuando el compuesto de conjugado farmacológico de anticuerpo se presenta en un ambiente extracelular (por ejemplo plasma). Puede determinarse si un es un enlazador no es sustancialmente sensible al ambiente extracelular por ejemplo incubando el compuesto de conjugado farmacológico de anticuerpo con plasma durante un periodo de tiempo predeterminado (por ejemplo, 2, 4,
40 8, 16 o 24 horas) y cuantificando después la cantidad de fármaco libre presente en el plasma.
Realizaciones ejemplares adicionales que comprenden MMAE o MMAF y diversos componentes enlazadores tienen las siguientes estructuras (donde Ab significa anticuerpo y p, que representa la carga farmacológica (o el número promedio de fármacos citostáticos o citotóxicos por molécula de anticuerpo), es de 1 a aproximadamente 8, por
45 ejemplo p puede ser de 4-6, tal como de 3-5, o p puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8).
Los ejemplos donde un enlazador escindible se combina con una auristatina incluyen MC-vc-PAB-MMAF (también designado vcMMAF) y MC-vc-PAB-MMAF (también designado vcMMAE), donde MC es una abreviatura de maleimido caproílo, vc es una abreviatura del enlazador basado en Val-Cit (valina-citrulina), y PAB es una
50 abreviatura de p-aminobencilcarbamato:
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imagen16
Otros ejemplos incluyen auristatinas combinadas con un enlazador no escindible, tal como mcMMAF (mc (MC es igual que mc en este contexto) es una abreviatura de maleimido caproílo):
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10 Las carga de fármaco citostático o citotóxico está representada por p y es el número promedio de restos farmacológicos citostáticos por anticuerpo en una molécula (también designado como la relación de fármaco con respecto a anticuerpo, DAR). La carga de fármaco citostático o citotóxico puede variar de 1 a 20 restos farmacológicos por anticuerpo y puede producirse en aminoácidos con grupos funcionales útiles tales como, pero sin limitación, grupos amino o sulfhidrilo, como en lisina o cisteína.
15 Dependiendo del modo de conjugación, p puede estar limitado por el número de sitios de unión en el anticuerpo, por ejemplo, cuando la unión es un grupo sulfhidrilo, como en la presente invención. En general, los anticuerpos no contienen muchos grupos sulfhidrilo (grupos tiol de cisteína libres y reactivos) que pueden estar unidos con un resto farmacológico, ya que la mayoría de restos tiol de cisteína en anticuerpos existen como enlaces disulfuro. Por lo
20 tanto, en ciertas realizaciones, un anticuerpo puede reducirse con un agente reductor tal como ditiotreitol (DTT) o tricarboniletilfosfina (TCEP), en condiciones parcial o completamente reductoras, para generar restos de sulfhidrilo reactivos. En ciertas realizaciones, la carga farmacológica para un ADC de la invención varía de 1 a aproximadamente 8, por ejemplo p puede ser de 4-6, tal como de 3-5, o p puede ser 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8, ya que un máximo de 8 restos de sulfhidrilo se hacen disponibles después de reducción (parcial) del anticuerpo (hay 8
25 cisteínas implicadas en el enlace disulfuro intercatenario).
En una realización, el resto enlazador farmacológico es vcMMAE. El resto enlazador farmacológico vcMMAE y los métodos de conjugación se desvelan en los documentos WO2004010957, US7659241, US7829531, US7851437 y US 11/833.028 (Seattle Genetics, Inc.) y el resto enlazador farmacológico vcMMAE se une con los anticuerpos anti
30 FT en las cisteínas usando un método similar a los desvelados en los mismos.
En una realización, el resto enlazador farmacológico es mcMMAF. El resto enlazador farmacológico mcMMAF y métodos de conjugación se desvelan en los documentos US7498298, US 11/833.954 y WO2005081711 (Seattle Genetics, Inc.) y el resto enlazador farmacológico mcMMAF se une a los anticuerpos anti FT en las cisteínas usando
35 un método similar a los desvelados en los mismos.
En una realización, el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT es HuMab-TF-011-vcMMAE.
También se desvela en el presente documento el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT HuMab-TF-09840 vcMMAE.
También se desvela en el presente documento el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT HuMab-TF-111vcMMAE.
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También se desvela en el presente documento el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT HuMab-TF-114vcMMAE.
En una realización, el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT es HuMab-TF-011-mcMMAF.
5 También se desvela en el presente documento el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT HuMab-TF-098mcMMAF.
También se desvela en el presente documento el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT HuMab-TF-111mcMMAF.
También se desvela en el presente documento el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT HuMab-TF-114mcMMAF.
15 En una realización alternativa el anticuerpo anti FT se conjuga con un resto terapéutico, tal como una citotoxina, un fármaco quimioterapéutico, una citocina, un inmunosupresor o un radioisótopo. Dichos conjugados se denominan en el presente documento “inmunoconjugados”. Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se denominan “inmunotoxinas”.
Una citotoxina o un agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para (por ejemplo, que destruya) células. Los agentes terapéuticos adecuados para formar inmunoconjugados de la presente invención incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxiantracindiona, maitansina o un análogo o derivado de los mismos, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, 25 propranolol y puromicina; calicheamicina o análogos o derivados de la misma; antimetabolitos (tales como metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, fludarabina, 5-fluorouracilo, decarbazina, hidroxiurea, asparaginasa, gemcitabina, cladribina), agentes alquilantes (tales como mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalán, carmustina (BSNU), lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfán, dibromomanitol, estreptozotocina, dacarbazina (DTIC), procarbazina, mitomicina C, cisplatino y otros derivados de platino, tales como carboplatino; así como duocarmicina A, duocarmicina SA, CC-1065 (también conocido como rachelmicina), o análogos o derivados de CC-1065), dolastatina, pirrolo [2,1-c] [1,4] benzodiazepinas (PDB) o análogos de las mismas, antibióticos (tales como dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, daunorrubicina (anteriormente daunomicina), doxorrubicina, idarrubicina, mitramicina, mitomicina, mitoxantrona, plicamicina, antramicina (AMC)), agentes antimitóticos (por ejemplo, inhibidores de tubulina), tales como toxina diftérica y moléculas relacionadas (tales como 35 cadena A de difteria y fragmentos activos de la misma y moléculas híbridas); toxina ricina (tal como ricina A o toxina de cadena A de ricina desglucosilada), toxina del cólera, una toxina de tipo Shiga (SLT-1, SLT-II, SLT-IIV), toxina LT, toxina C3, toxina Shiga, toxina de tos ferina, toxina del tétanos, inhibidor de proteasa de soja Bowman-Birk, exotoxina de Pseudomonas, alorina, saporina, modeccina, gelanina, cadena A de abrina, cadena A de modeccina, alfa sarcina, proteínas de Aleurites fordii, proteínas de diantina, proteínas de Phytolacca americana (PAPI, PAPII y PAP-S), inhibidor de Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina y enomicina. Otras moléculas conjugadas adecuadas incluyen péptidos antimicrobianos/líticos tales como CLIP, Magainina 2, melitina, Cecropina y P18; ribonucleasa (RNasa), DNasa I, enterotoxina A estafilocócica, proteína antivírica del ombú, toxina de difterina y endotoxina de Pseudomonas. Véase, por ejemplo, Pastan et al., Cell 47, 641 (1986) y Goldenberg, Calif. A Cancer Journal for Clinicians 44, 43 (1994). Los
45 agentes terapéuticos que pueden administrarse en combinación con conjugados farmacológicos de anticuerpo anti FT de la presente invención como se describe en otra parte del presente documento, tales como, por ejemplo, citocinas o quimiocinas antineoplásicas, también son candidatos para restos terapéuticos útiles para conjugación con un anticuerpo desvelado en la presente invención.
En otra realización alternativa, un conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT desvelado en la presente invención comprende un ácido nucleico conjugado o molécula asociada a ácido nucleico. En una de dichas realizaciones, el ácido nucleico conjugado es una ribonucleasa citotóxica, un ácido nucleico antisentido, una molécula de ARN inhibidora (por ejemplo, una molécula de ARNip) o un ácido nucleico inmunoestimulante (por ejemplo, una molécula de ADN que contiene motivo CpG inmunoestimulante). En otra realización alternativa, un anticuerpo anti FT de la
55 invención se conjuga con un aptámero o una ribozima en lugar de una auristatina o un análogo o derivado peptídico funcional de la misma.
En otra realización alternativa, se proporcionan conjugados farmacológicos de anticuerpo anti FT que comprenden uno o más aminoácidos radiomarcados. Un anticuerpo anti FT radiomarcado puede usarse para fines tanto de diagnóstico como terapéuticos (la conjugación con moléculas radiomarcadas es otro elemento posible). Los ejemplos no limitantes de marcadores para polipéptidos incluyen 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99TC y 125I, 131I y 186Re. Se conocen en la técnica métodos para preparar aminoácidos radiomarcados y derivados peptídicos relacionados (véase por ejemplo, Junghans et al., en Cancer Chemotherapy and Biotherapy 655-686 (2ª edición, Chafner y Longo, eds., Lippincott Raven (1996)) y documentos US 4.681.581, US 4.735.210, US 5.101.827, US
65 5.102.990 (US RE35.500), US 5.648.471 y US 5.697.902. Por ejemplo, un radioisótopo puede conjugarse por un método de cloramina T.
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imagen18
menos 25 modificaciones de aminoácidos, tal como 20, tal como como máximo 15, 14, 13, 12 u 11 modificaciones de aminoácidos, tales como 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 o 1 modificaciones de aminoácidos, tales como supresiones o inserciones, preferentemente sustituciones, tales como sustituciones conservativas o al menos 80 % de identidad con cualquiera de dichas secuencias, tal como al menos 85 % de identidad o 90 % de identidad o 95 % de identidad,
5 tal como 96 % de identidad o 97 % de identidad o 98 % de identidad o 99 % de identidad con cualquiera de las secuencias de aminoácidos anteriormente mencionadas.
También se desvela en el presente documento un vector de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la región constante de una cadena ligera, una cadena pesada o cadenas tanto ligeras como pesadas de un anticuerpo, por ejemplo un anticuerpo humano.
Dichos vectores de expresión pueden usarse para producción recombinante de anticuerpos de la invención.
Un vector de expresión en el contexto de la presente invención puede ser cualquier vector adecuado, incluyendo
15 vectores cromosómicos, no cromosómicos y de ácido nucleico sintético (una secuencia de ácido nucleico que comprende un conjunto adecuado de elementos de control de la expresión). Los ejemplos de dichos vectores incluyen derivados de SV40, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos de levadura, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN de fago, y vectores de ácido nucleico vírico (ARN o ADN). En una realización, un ácido nucleico que codifica anticuerpo anti FT está comprendido en un vector de ADN o ARN desnudo, incluyendo, por ejemplo, un elemento de expresión lineal (como se describe, por ejemplo, en Sykes y Johnston, Nat Biotech 17, 355-59 (1997)), un vector de ácido nucleico compactado (como se describe por ejemplo en los documentos US 6.077.835 y/o WO 00/70087), un vector plasmídico tal como pBR322, pUC 19/18 o pUC 118/119, un vector de ácido nucleico de tamaño mínimo “midge” (como se describe por ejemplo en Schakowski et al., Mol Ther 3, 793-800 (2001)), o como una construcción de vector de ácido nucleico precipitado, tal como una
25 construcción precipitada con CaP04 (como se describe por ejemplo en el documento WO 00/46147, Benvenisty y Reshef, PNAS USA 83, 9551-55 (1986), Wigler et al., Cell 14, 725 (1978), y Coraro y Pearson, Somatic Cell Genetics 7, 603 (1981)). Dichos vectores de ácido nucleico y el uso de los mismos se conocen bien en la técnica (véanse, por ejemplo, documentos US 5.589.466 y US 5.973.972).
También se desvela en el presente documento que el vector es adecuado para expresión del anticuerpo anti FT en una célula bacteriana. Los ejemplos de dichos vectores incluyen vectores de expresión tales como BlueScript (Stratagene), vectores pIN (Van Heeke y Shuster, J Biol Chem 264, 5503-5509 (1989), vectores pET (Novagen, Madison WI) y similares).
35 Un vector de expresión puede ser también o como alternativa un vector adecuado para expresión en un sistema de levadura. Puede emplearse cualquier vector adecuado para expresión en un sistema de levadura. Los vectores adecuados incluyen, por ejemplo, vectores que comprenden promotores constitutivos o inducibles tales como factor alfa, alcohol oxidasa y PGH (revisado en: F. Ausubel et al., Ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley InterScience Nueva York (1987)), y Grant et al., Methods in Enzymol 153, 516-544 (1987)).
Un ácido nucleico y/o vector también puede comprender una secuencia de ácido nucleico que codifica una secuencia de secreción/localización, que puede dirigirse a un polipéptido, tal como una cadena polipeptídica naciente, al espacio periplásmico o al medio de cultivo celular. Dichas secuencias se conocen en la técnica, e incluyen péptidos líder o señal de secreción, secuencias de dirección a orgánulos (por ejemplo, secuencias de
45 localización nuclear, señales de conservación en el RE, secuencias de tránsito mitocondrial, secuencias de tránsito de cloroplastos), secuencias de localización/anclaje de membrana (por ejemplo, secuencias de transferencia de terminación, secuencias de anclaje de GPI), y similares.
En un vector de expresión desvelado en el presente documento, los ácidos nucleicos que codifican anticuerpo anti FT pueden comprender o asociarse con cualquier promotor adecuado, potenciador y otros elementos facilitadores de la expresión. Los ejemplos de dichos elementos incluyen promotores de expresión fuertes (por ejemplo, promotor/potenciador de IE de CMV humano así como promotores de VSR, SV40, SL3-3, MMTV y LTR del VIH), secuencias de terminación de poli(A) eficaces, un origen de replicación para producto plasmídico en E. coli, un gen de resistencia a antibióticos como marcador seleccionable y/o un sitio de clonación conveniente (por ejemplo, un
55 polienlazador). Los ácidos nucleicos también pueden comprender un promotor inducible a diferencia de un promotor constitutivo tal como IE de CMV (el experto en la materia reconocerá que dichos términos son de hecho descriptores de un grado de expresión génica en ciertas condiciones).
También se desvela en el presente documento que el vector de expresión que codifica anticuerpo anti FT puede situarse en y/o suministrarse a la célula hospedadora o el animal hospedador mediante un vector vírico.
También se desvela en el presente documento una célula hospedadora eucariota o procariota recombinante, tal como un transfectoma, que produce un anticuerpo anti FT de la invención como se define en el presente documento
o una molécula biespecífica de la invención como se define en el presente documento. Los ejemplos de células
65 hospedadoras incluyen células de levadura, bacterianas y de mamífero, tales como células CHO o HEK. Por ejemplo, en una realización, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico
23
integrado de forma estable en el genoma celular que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti FT de la presente invención. En otra realización, la presente invención proporciona una célula que comprende un ácido nucleico no integrado, tal como un plásmido, cósmido, fagémido o elemento de expresión lineal, que comprende una secuencia que codifica la expresión de un anticuerpo anti FT de la invención.
5 También se desvela en el presente documento un hibridoma que produce un anticuerpo de la invención como se define en el presente documento. En un aspecto adicional más, la invención se refiere a un animal no humano transgénico que comprende ácidos nucleicos que codifican una cadena pesada humana y una cadena ligera humana, donde el animal o la planta produce un anticuerpo de la invención. La generación de dichos hibridomas y animales transgénicos se ha descrito anteriormente.
También se desvela en el presente documento un método para producir un anticuerpo anti FT de la invención, comprendiendo dicho método las etapas de
15 a) cultivar un hibridoma o una célula hospedadora de la invención como se ha descrito anteriormente en el presente documento y b) purificar el anticuerpo de la invención a partir del medio de cultivo y opcionalmente c) transformar el anticuerpo anti FT en un ADC.
Composición farmacéutica
Tras purificar los conjugados farmacológicos de anticuerpo anti FT estos pueden formularse en composiciones farmacéuticas usando vehículos o excipientes farmacéuticos bien conocidos.
25 Las composiciones farmacéuticas pueden formularse con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables así como cualquier otro adyuvante y excipiente conocido de acuerdo con técnicas convencionales tales como las desveladas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19ª edición, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1995.
Los vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, así como cualquier otro adyuvante y excipiente conocidos deberían ser adecuados para el conjugado farmacológico de anticuerpo de la presente invención y el modo de administración elegido. La conveniencia de vehículos y otros componentes de composiciones farmacéuticas se determina basándose en la falta de impacto negativo significativo en las propiedades biológicas deseadas del compuesto elegido o la composición farmacéutica de la presente invención (por ejemplo, una influencia menos que
35 sustancial (10 % o menos de inhibición relativa, 5 % o menos de inhibición relativa, etc.)) en la unión a antígeno.
Una composición farmacéutica de la presente invención también puede incluir diluyentes, cargas, sales, tampones, detergentes (por ejemplo, un detergente no iónico, tal como Tween-20 o Tween-80), estabilizadores (por ejemplo, azúcares o aminoácidos sin proteínas), conservantes, fijadores tisulares, solubilizantes y/u otros materiales adecuados para inclusión en una composición farmacéutica.
Las células cancerosas que sobreexpresan FT pueden ser dianas particularmente buenas para los conjugados farmacológicos de anticuerpo anti FT de la invención, ya que pueden unirse más anticuerpos por célula. Por lo tanto, en una realización, un paciente de cáncer para tratar con un conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT de la
45 invención es un paciente, por ejemplo un paciente de cáncer pancreático, cáncer de pulmón o cáncer colorrectal al que se ha diagnosticado una o más mutaciones en K-ras y/o una o más mutaciones en p53 en sus células tumorales. La expresión de FT está bajo el control de dos acontecimientos transformantes importantes que conducen la progresión de enfermedad (activación de oncogén de K-ras e inactivación del supresor de tumor p53), de una manera dependiente de la proteína quinasa activada por mitógeno/MEK (MAPK) y fosfatidilinositol 3’-quinasa (Pl3K) (Yu et al. (2005) Blood 105: 1734).
Los niveles de dosificación reales del conjugado farmacológico de anticuerpo en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variarse para obtener una cantidad del conjugado farmacológico de anticuerpo que es eficaz para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, una composición y un modo de
55 administración particulares, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o la amida de las mismas, la vía de administración, el momento de administración, la tasa de secreción del compuesto particular que se emplea, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales usados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, la salud general y el historial médico previo del paciente que se trate, y factores similares bien conocidos en la técnica médica.
La composición farmacéutica puede administrarse por cualquier vía y modo adecuados. Se conocen bien en la técnica vías adecuadas de administración de un conjugado farmacológico de anticuerpo de la presente invención y
65 pueden seleccionarse por los expertos habituales en la materia.
24
En una realización, la composición farmacéutica de la presente invención se administra por vía parenteral.
Las expresiones “administración parenteral” y “administrado por vía parenteral” como se usan en el presente documento significa modos de administración distintos de la administración entérica y tópica, habitualmente por
5 inyección, e incluyen inyección e infusión epidérmica, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, intratendinosa, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, intracraneal, intratorácica, epidural e intraesternal.
En una realización la composición farmacéutica se administra por inyección o infusión intravenosa o subcutánea.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes de isotonicidad, antioxidantes y agentes retardantes de la absorción adecuados, y similares que son fisiológicamente compatibles con el conjugado farmacológico de
15 anticuerpo de la presente invención.
Los ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, etanol, dextrosa, polioles (tales como glicerol, propilenglicol, polietilenglicol y similares), y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, aceite de maíz, aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón y aceite de sésamo, soluciones coloidales de carboximetilcelulosa, goma de tragacanto y ésteres orgánicos inyectables, tales como etil oleato y/o diversos tampones. Otros vehículos se conocen bien en las técnicas farmacéuticas.
25 Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT de la presente invención, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención.
Puede mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento, tales como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones, y mediante el uso de tensioactivos.
35 Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender antioxidantes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo (1) antioxidantes solubles en agua, tales como ácido ascórbico, clorhidrato de cisteína, bisulfato sódico, metabisulfito sódico, sulfito sódico y similares; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa tocoferol y similares; y (3) agentes quelantes metálicos, tales como ácido cítrico, ácido etilendiamintetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y similares.
Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender agentes de isotonicidad, tales como azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, glicerol o cloruro sódico en las composiciones.
45 Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden contener uno o más adyuvantes apropiados para la vía elegida de administración tales como conservantes, agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes de dispersión, conservantes o tampones, que pueden potenciar la vida útil o eficacia de la composición farmacéutica. El conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT de la presente invención puede prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra liberación rápida, tales como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Dichos vehículos pueden incluir gelatina, gliceril monoestearato, gliceril diestearato, polímeros biodegradables, biocompatibles tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico solos o con una cera, u otros materiales bien conocidos en la técnica. Los expertos en la materia conocen en general métodos para la preparación de dichas formulaciones. Véase, por ejemplo, Sustained and Controlled
55 Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978.
En una realización, el conjugado farmacológico de anticuerpo anti FT de la presente invención puede formularse para asegurar una distribución apropiada in vivo. Los vehículos farmacéuticamente aceptables para administración parenteral incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. El uso de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla uso del mismo en las composiciones farmacéuticas de la presente invención. También pueden incorporarse compuestos activos complementarios en las composiciones.
65
25
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imagen31
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imagen35
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Región VH
SEQ ID NO: 11
VH 017-D12, CDR2
SEQ ID NO: 12
VH 017-D12, CDR3
SEQ ID NO: 13
VH 042
SEQ ID NO: 14
VH 042, CDR1
SEQ ID NO: 15
VH 042, CDR2
SEQ ID NO: 16
VH 042, CDR3
SEQ ID NO: 17
VH 092-A09
SEQ ID NO: 18
VH 092-A09, CDR1
SEQ ID NO: 19
VH 092-A09, CDR2
SEQ ID NO: 20
VH 092-A09, CDR3
SEQ ID NO: 21
VH 101
SEQ ID NO: 22
VH 101, CDR1
SEQ ID NO: 23
VH 101, CDR2
SEQ ID NO: 24
VH 101, CDR3
SEQ ID NO: 25
VH 025
SEQ ID NO: 26
VH 025, CDR1
SEQ ID NO: 27
VH 025, CDR2
SEQ ID NO: 28
VH 025, CDR3
SEQ ID NO: 29
VH 109
SEQ ID NO: 30
VH 109, CDR1
SEQ ID NO: 31
VH 109, CDR2
SEQ ID NO: 32
VH 109, CDR3
SEQ ID NO: 33
VH 098
SEQ ID NO: 34
VH 098, CDR1
SEQ ID NO: 35
VH 098, CDR2
SEQ ID NO: 36
VH 098, CDR3
SEQ ID NO: 37
VH 111
SEQ ID NO: 38
VH 111, CDR1
SEQ ID NO: 39
VH 111, CDR2
SEQ ID NO: 40
VH 111, CDR3
SEQ ID NO: 41
VL 114
SEQ ID NO: 42
VL 114, CDR1
SEQ ID NO: 43
VL 114, CDR2
SEQ ID NO: 44
VL 114, CDR3
SEQ ID NO: 45
VL 011
SEQ ID NO: 46
VL 011, CDR1
SEQ ID NO: 47
VL 011, CDR2
44
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FT HuMab
CE50 nM
42
0,23
092-A09
0,18
101
0,28
98
0,13
114
0,17
25
0,34
109
0,27
Ejemplo 13
Unión de HuMab anti FT a FT unido a membrana
5 La unión de HuMab anti FT a FT unido a membrana se determinó mediante análisis de FACS, usando células CHO transfectadas con FT o líneas celulares tumorales que expresaban FT MDA-MB-231, A431 (transfectadas con luciferasa) y Bx-PC3.
10 Las células se resuspendieron en PBS (2 x 106 células/ml), se pusieron en placas de fondo en V de 96 pocillos (50 μl/pocillo). Se añadieron 50 μl de HuMab diluido en serie en tampón FACS (PBS complementado con BSA 0,1 % y azida Na 0,02 %) a las células y se incubaron durante 30 minutos en hielo. Después de lavar tres veces con tampón FACS, se añadieron 50 μl de IgGFc de cabra antihumano conjugado con ficoeritrina (PE) (Jackson ImmunoResearch), diluido 1:100 en tampón de FACS. Después de 30 minutos en hielo (en la oscuridad), las células
15 se lavaron tres veces y se detectó la unión específica de los HuMab por citometría de flujo en un FACSCalibur (BD Biosciences). Se usó HuMab-KLH como control negativo. Se usó anti FT de ratón seguido de anti IgGFc de ratón conjugado con PE como control positivo. Las curvas de unión se analizaron usando regresión no lineal (respuesta a dosis sigmoidea con pendiente variable) usando software GraphPad Prism V4.03 (Software GraphPad, San Diego, CA, Estados Unidos).
20 La Figura 4 muestra un ejemplo de curvas de unión de HuMab específicos de FT con células MDA-MB-231. La Tabla 3 proporciona una visión de conjunto de valores de CE50 de unión de HuMab específicos de FT con células CHO transfectadas con FT (S1015-TF), MDA-MB-231, A431 y Bx-PC3.
25 Tabla 3 -Visión de conjunto de valores de CE50 e intensidad de fluorescencia media máxima (IFM máx.)determinados por análisis de FACS de la unión de HuMab específicos de FT con diferentes tipos celulares.
MDA-MB-231
Bx-PC3 A431 S1015-TF-012
grupo
HuMab FT CE50 IFM Máx CE50 IFM Máx CE50 IFM Máx CE50 IFM Máx
I
13 1,58 2451 1,86 1305 8,04 3622 1,07 5207
I
44 0,87 1881 1,88 1136 1,45 2646 2,13 5021
I
87-Lg6 8,28 1107 7,19 1030 nt nt nt nt
II
11 0,47 2143 1,01 1280 0,20 2606 1,32 5654
II
017-D12 1,33 2401 1,61 1422 1,24 3296 1,21 5792
II
42 0,25 1518 2,45 1701 nt nt nt nt
II
092-A09 0,53 2290 0,84 1262 0,83 3137 1,32 5409
II
101 0,85 2071 2,25 1220 3,16 2934 1,77 5859
II/III
98 0,99 1956 1,38 1151 1,40 2755 0,96 5229
II/III
114 0,47 2438 0,80 1407 0,90 3433 1,72 6095
III
3 3,20 1798 4,98 1106 6,94 2530 2,06 4247
III
25 0,69 2254 0,88 1320 5,19 3170 0,73 5808
47
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Se ensayó internalización mediada por anticuerpos y destrucción celular por la toxina para diferentes HuMab anti FT. Se ensayaron tres líneas celulares diferentes, con niveles comparables de expresión de FT. Estas células también expresaron EGFR (a diferentes niveles), permitiendo el uso de un anticuerpo de control positivo (2F8), que se une con EGFR y se sabe que induce internalización de EGFR. El número de FT y moléculas de EGFR expresadas en las 5 líneas celulares se determinó por el kit Qifi (Dako, Glostrup, Dinamarca); células A431: moléculas de FT promedio por célula aproximadamente 500.000, moléculas de EGFR promedio por célula aproximadamente 500.000; BxPC3: moléculas de FT promedio por célula aproximadamente 500.000, moléculas de EGFR promedio por célula aproximadamente 200.000; MDA-MB-231: moléculas de FT promedio por célula aproximadamente 500.000, moléculas de EGFR promedio por célula aproximadamente 100.000. Las células se sembraron en concentración 10 óptima (A431: 2.500 células/pocillo, BxPC3: 3.000 células/pocillo, MDA-MB-231: 5.000 células/pocillo) en medio de cultivo celular en placas de cultivo tisular de 96 pocillos (Greiner Bio-one) y se permitió que se adhirieran. Para identificar HuMab anti FT que permitan la internalización de y destrucción por la toxina, se incubó una concentración fija (0,5 μg/ml [A431 y BxPC3]; 0,25 μg/ml [MDA-MB-231]) de anti kappa-ETA’, que no indujo muerte celular no específica en ausencia de anticuerpo, durante 30 minutos con una cantidad valorada de HuMab anti FT antes de la
15 adición a las células. Después de tres días, la cantidad de células viables se cuantificó con AlamarBlue (BioSource International, San Francisco, Estados Unidos), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La fluorescencia se supervisó usando el lector Multimarcador EnVision 2101 (PerkinElmer, Turku, Finlandia) con ajustes de AlamarBlue convencionales. Se incluyó 2F8 con el anti kappa-ETA’ como un control positivo. Se usó un anticuerpo de control de isotipo (IgG1-b12) como control negativo.
20 La Figura 6 y la Tabla 5 muestran que todos excepto uno (HuMab-TF-087) de los HuMab anti FT preincubados con anti Kappa-ETA’ fueron capaces de destruir células A431, BxPC3 y MDA-MB-231 de una manera dependiente de dosis. HuMab preincubado con anti kappa-ETA’ TF-098, -114 y -011 indujeron destrucción más eficaz (CE50 entre 9 x 10-5 y 4 x 10-4 μg/ml en células A431) que HuMab preincubado con anti kappa-ETA’ TF-013, -111 y -044 (CE50
25 entre 2,0 x 10-2 y 9,8 x 10-2 μg/ml en células A431). HuMab-TF-087 preincubado con anti kappa-ETA’ no indujo destrucción celular.
Se muestra un experimento representativo para cada línea celular: A431 (a), BxPC3 (b) y MDA-MB-231 (c). Los datos mostrados son intensidades de fluorescencia medias (IFM) ± E.T.M. de pocillos por triplicado de células
30 tratadas con HuMab anti FT preincubados con anti kappa-ETA’. La línea discontinua superior indica la señal máxima obtenida en ausencia de HuMab anti FT preincubados con anti kappa-ETA’; la línea discontinua inferior indica destrucción máxima obtenida con estaurosporina.
Tabla 5 -visión de conjunto de valores de CE50 y porcentajes de destrucción celular inducidos por HuMab 35 anti FT preincubados con anti kappa-ETA’.
A431
BxPC3 MDA-MB-231
Anticuerpo (HuMab-FT-)
% de destrucción CE50 μg/ ml % de destrucción CE50 μg/ ml % de destrucción CE50 μg/ ml
098
95 9,0 x 10-5 99 1,3 x 10-5 96 7,2 x 10-4
111
92 3,4 x 10-2 98 1,5 x 10-2 88 2,3 x 10-2
013
80 2,0 x 10-2 96 9,4 x 10-3 56 N.D.a
044
66 9,8 x 10-2 96 1,5 x 10-2 44 N.D.a
087
3 N.D.a 56 N.D.a 8 N.D.a
114
97 2,6 x 10-4 99 7,3 x 10-4 99 2,5 x 10-3
011
96 3,9 x 10-4 98 2,6 x 10-4 88 3,0 x 10-3
2F8
99 7,1 x 10-6 98 3,5 x 10-5 84 1,5 x 10-3
B12
5 N.D.a 22 N.D.a 0 N.D.a
a) No pudo calcularse.
Los datos mostrados son valores de CE50 (en μg/ml) y porcentajes máximos de destrucción de las líneas celulares indicadas tratadas con HuMab anti FT preincubados con anti kappa-ETA’, medidos en un experimento representativo. El porcentaje de destrucción celular (% de destrucción) se calculó de la siguiente manera:
(IFMno tratado – IFMtratado con HuMab conjugado)/(IFMno tratado – IFMtratado con estaurosporina).
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Claims (1)

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