HU220347B - Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához - Google Patents

Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához Download PDF

Info

Publication number
HU220347B
HU220347B HU9700084A HU9700084A HU220347B HU 220347 B HU220347 B HU 220347B HU 9700084 A HU9700084 A HU 9700084A HU 9700084 A HU9700084 A HU 9700084A HU 220347 B HU220347 B HU 220347B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
binding
tumor
ligand
factor
antigen
Prior art date
Application number
HU9700084A
Other languages
English (en)
Other versions
HU9700084D0 (en
HUT76970A (hu
Inventor
Thomas S. Edgington
Philip E. Thorpe
Original Assignee
Board Of Regents The University Of Texas System
The Scripps Research Institute
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=23044480&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HU220347(B) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Board Of Regents The University Of Texas System, The Scripps Research Institute filed Critical Board Of Regents The University Of Texas System
Publication of HU9700084D0 publication Critical patent/HU9700084D0/hu
Publication of HUT76970A publication Critical patent/HUT76970A/hu
Publication of HU220347B publication Critical patent/HU220347B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
    • A61K47/6875—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin
    • A61K47/6877—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody being a hybrid immunoglobulin the antibody being an immunoglobulin containing regions, domains or residues from different species
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/08—Drugs for disorders of the urinary system of the prostate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2833—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against MHC-molecules, e.g. HLA-molecules
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2896—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against molecules with a "CD"-designation, not provided for elsewhere
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

A találmány olyan kötőligandumra vonatkozik, amely a) egy elsőkötőszakaszt tartalmaz, amely beteg sejthez, betegséggel asszociáltérrendszer egyik komponenséhez vagy betegséggel asszociált sztrómaegyik komponenséhez kötődik, és működőképesen megkötve b) egykoaguláló faktort vagy egy koaguláló faktorhoz kötődő másodikkötőszakaszt tartalmaz. A találmány kiterjed a fenti kötőligandumottartalmazó készítményre, valamint az ilyen készítményt tartalmazókészletre. ŕ

Description

A találmány tárgya készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához. A találmány közelebbről olyan készítményekre vonatkozik, amelyek különböző növekedésifaktor-alapú és immunológiai reagenseket, így bispecifikus antitesteket tartalmaznak, és amelyek specifikus koagulálást váltanak ki.
Az elmúlt 30 évben nyilvánvalóvá váltak a daganatos betegségek kemoterápiás kezelésének előnyei. Ez együtt járt új kemoterápiás szerek kifejlesztésével, és különböző hatóanyagok együttes adagolására vonatkozó speciális útmutatások kidolgozásával. A daganatos betegségek celluláris és szöveti szintű megértése, valamint daganatellenes szerek fő hatásmechanizmusának megismerése lehetővé tette különböző daganatos betegségek elleni kemoterápia kidolgozását. Ezekre példaként említhető a chorionrák, Wilm-féle tumor, akut leukémia, harántcsíkolt izomszarkóma, retinaglioma, Hodgkin-betegség és Burkitt-limfóma. A néhány tumorfélénél elért előnyök ellenére a humán rákos betegségek legfontosabb formái továbbra is ellenállnak a kemoterápiás beavatkozásnak.
A kezelési útmutatókban megcélzott legfontosabb probléma a „sejt teljes elpusztításának” elve. Ez az elv azt jelenti, hogy a hatékony kezeléshez, ami lehet sebészeti kezelés, kemoterápiás kezelés vagy mindkettő, teljes egészében el kell pusztítani az úgynevezett „klonogén” rosszindulatú sejteket, vagyis azokat a sejteket, amelyek képesek a szabályozatlan növekedésre, és arra, hogy az eltávolított daganat helyére lépjenek. A sejtek teljes elpusztítására alkalmas terápiás szerek és módszerek kifejlesztésére vonatkozó folyamatos igény mellett léteznek olyan tumortípusok, amelyek terápiásán jobban kezelhetők, így például, a lágy szövettumorok (például a limfómák), és a vérben vagy a vérképző szervekben kialakuló tumorok (például leukémiák) kemoterápiás módszerekkel általában jobban kezelhetők, mint a szilárd tumorok, így a karcinómák.
A lágy és véralapú tumorok kemoterápiás kezeléssel szemben mutatott érzékenységének egyik oka, hogy a limfóma- és leukémia sejtek a kemoterápiás beavatkozás során fizikailag jobban hozzáférhetők. Egyszerűbben kifejezve, a legtöbb kemoterápiás szeméi általában sokkal nehezebben biztosítható a szilárd tumor összes sejtjének elérése, mint a lágy tumorok vagy véralapú tumorok összes sejtjének elérése, és így sokkal nehezebb a sejt teljes elpusztításának biztosítása. A kemoterápiás szer dózisának növelése gyakran toxikus mellékhatásokat okoz, ami korlátozza a szokásos tumor elleni szerek hatékonyságát.
Hatásos tumor elleni szerek kifejlesztésének stratégiai elve, hogy olyan szereket kell kidolgozni, amelyek szelektíven elpusztítják a tumorsejteket, és a normálszövetekre egyáltalán nem, vagy legfeljebb csak kismértékben hatnak. A cél elérését nehezíti, hogy a daganatos és a normálszövetek között csak kevés kvalitatív különbség található. Ennek következtében, az elmúlt években több kutatás irányult tumorspecifikus „markerantigének” azonosítására, amelyek immunológiai célpontként használhatók mind a kemoterápia, mind a diagnózis vonatkozásában. Több olyan tumorspecifikus vagy kvázi tumorspecifikus („tumorral asszociált”) markert azonosítottak, amelyek tumorsejtantigénként specifikus antitestek által felismerhetők. A tumorspecifikus antitestek azonban általában nem rendelkeznek kielégítő tumor elleni hatékonysággal ahhoz, hogy a rák terápiájában alkalmazhatók legyenek.
Rákos sejtek szelektív támadásához legutóbb immunotoxinokat alkalmaztak. Az immunotoxinok specifikus célzóanyagok, általában tumorra vonatkozó antitestek vagy ezek fragmensei és egy citotoxikus szer, így toxinegység konjugátumai. A célzószer feladata, hogy a toxint a megcélzott antigént hordozó sejthez irányítsa, és így az az ilyen sejteket elpusztítsa. Kifejlesztették már az immunotoxinok „második generációját”, például az olyan immunotoxinokat, amelyek deglikozilált ricin A láncot tartalmaznak, ami egyrészt megakadályozza, hogy a máj befogja az immunotoxint, másrészt csökkenti a hepatotoxicitást (Blakey és munkatársai idézett műve, 1987 a és b), és az új keresztkötéseket biztosító anyagot tartalmazó immunotoxinok, amelyek nagyobb in vivő stabilitással rendelkeznek (Thorpe és munkatársai idézett műve, 1988).
A vizsgálatok szerint az immunotoxinok hatékonyan alkalmazhatók limfómák és leukémiák kezelésére egerekben (Thorpe és munkatársai idézett műve, 1988; Ghetie és munkatársai idézett műve, 1991; Griffin és munkatársai idézett műve, 1988 a és b) és emberekben (Vitetta és munkatársai idézett műve, 1991). A limfoid daganatok azonban különösen érzékenyek az immunotoxin-terápiára, mivel a vérbe juttatott immunotoxin viszonylag könnyen eléri a tumorsejteket. Lehetőség van továbbá arra is, hogy normál limfoid antigéneket célozzunk meg, mivel a terápia során a rosszindulatú sejtekkel együtt elpusztított normállimfómák gyorsan regenerálódnak a célantigénektől mentes elődökből.
A limfómákkal szemben mutatott hatékonyságukkal ellentétben az immunotoxinok viszonylag hatástalanok szilárd tumorok kezelésében (Weiner és munkatársai idézett műve, 1989; Byers és munkatársai idézett műve, 1989). Ennek elsődleges oka, hogy a szilárd tumorokon általában nem képesek áthatolni az antitestméretű molekulák: a humán vizsgálatokban a bevitt dózis tumor tömegére vonatkoztatott specifikus felvétele általában kisebb, mint 0,001% (Sands és munkatársai idézett műve, 1988; Epenetos és munkatársai idézett műve, 1986). Egy másik alapvető probléma, hogy az antigének ellenálló mutánsok megmenekülnek az immunotoxin pusztító hatásától, és újbóli növekedésnek indulnak (Thorpe és munkatársai idézet műve, 1988).
További probléma, hogy a tumorba bejutó antitestek különböző okok miatt nem oszlanak el egyenletesen. Először, a tumorsejtek sűrű elhelyezkedése, és a tumor rostos váza jelentős fizikai gátat jelent a makromolekulák transzportjával szemben, és a nyirokváladék elvezetésének hiányával kombinálódva fokozott szövetközi nyomást eredményez a tumor magjában, ami csökkenti a folyadék behatolását és áramlását (Baxter és munkatársai idézett műve, 1991; Jain idézett műve, 1990). Másodszor, a véredények eloszlása a legtöbb tumorban rendezetlen és heterogén, így ezeket néhány tumorsejtben
HU 220 347 Β nagy diffúziós távolság választja el a behatoló antitestektől (Jain idézett műve, 1990). Harmadszor, a tumorba bejutó antitestek nagy része adszorbeálódik az ér körüli szakaszokban található első tumorsejtekben, és így nem marad antitest, amely eléri a távolabb lévő helyeken található tumorsejteket (Baxter és munkatársai idézett műve, 1991; Kennel és munkatársai idézett műve, 1991).
A fentiekből következik, hogy új stratégiát kell kidolgozni a szilárd tumorok kezelésére. Az egyik lehetőség olyan szerek alkalmazása, amelyek a tumor érrendszerét célozzák meg a tumorsejtek helyett. A szilárd tumor növekedése nagymértékben függ a tumor érrendszerétől, és a tumorsejtek növekedése csak akkor tartható fenn, ha elegendő az oxigénellátás, tápanyagellátás és más növekedési faktorok ellátása, valamint a bomlástermékek elvezetése. Megfigyelték, hogy több meglévő terápiánál a hatás egy része az érrendszer által közvetített hatásmechanizmuson keresztül játszódik le (Denekamp idézett műve, 1990).
Azt találtuk, hogy az érrendszer célbavételével a tumortól megvonhatok az életben maradás feltételei, és ennek eredményeként csökken a tumor növekedése vagy elpusztulnak a tumorsejtek. Ez a megoldás több előnnyel jár a tumorsejtek közvetlen célbavételéhez képest. Először, a célsejtek intravénásán adagolt terápiás szerrel közvetlenül elérhetők, és így a bejuttatott dózis nagy százalékban gyorsan lokalizálódik (Kennel és munkatársai idézett műve, 1991). Másodszor, mivel minden egyes kapilláris az őt körülvevő tumorban található sejtek ezreihez szállítja az oxigént és a tápanyagokat, a tumor érrendszerének korlátozott mértékű károsodása is nagyszámú tumorsejt pusztulását okozhatja (Denekamp idézett műve, 1990; Denekamp idézett műve, 1984). Végül, nem valószínű a megcélzott antigéntől mentes mutáns endotéliás sejtek kialakulása, mivel ezek normálsejtek.
A jelenlegi felfogás szerint a tumor érrendszerének hatásos célbavételéhez olyan antitestekre van szükség, amelyek a tumor endotéliás sejteket ismerik fel, és nem a normálszövetből származókat. Számos ilyen antitestet dolgoztak ki (Duijvestijn és munkatársai idézett műve, 1987; Hagemeier és munkatársai idézett műve, 1986; Bruland és munkatársai idézet műve, 1986; Murray és munkatársai idézett műve, 1989; Schlingemann és munkatársai idézett műve, 1985), de ezek egyike sem rendelkezik megfelelő mértékű specifikussággal. Emellett, a fent említett toxinokon kívül nem ismertek olyan szerek, amelyek második szerként alkalmazhatók az érrendszert megcélzó antitestkonjugátumban. Ez azt jelenti, hogy az érrendszer célbavételének elméleti előnyei ellenére nem ismert olyan megoldás, amely kihasználná ezeket az előnyöket.
A találmány feladata a fenti korlátok kiküszöbölése olyan új készítmények és módszerek kidolgozásával, amelyek lehetővé teszik specifikus koagulálás (alvadás) elérését például a tumor érrendszerében, és emellett korlátozott mellékhatásokkal rendelkeznek. A találmány általános értelemben különböző új immunológiai és növekedésifaktor-alapú bispecifikus készítményekre vonatkozik, amelyek képesek koagulálás stimulálására a betegséggel összefüggő érrendszerben. A találmány kiteljed a fenti készítmények előállítására és alkalmazására.
A találmány tárgyát képezik tehát az olyan kötőligandumok, amelyek általánosságban „bispecifikus kötőligandum”-ként írhatók le. Az ilyen ligandumok egy első kötőszakaszt tartalmaznak, amely általában a betegséggel összefüggő megcélzott sejthez, így egy tumorsejthez vagy valamely, egy ilyen sejttel asszociált komponenshez; a betegséggel összefüggő érrendszerrel asszociált komponenshez, például tumor érrendszerhez; vagy a betegséggel asszociált szerkezet egyik komponenséhez vagy ezzel asszociált komponenshez kötődik. Az első kötőszakasz működőképes módon egy koaguláló szerrel van asszociálva vagy ilyenhez van kötve, ahol a koaguláló szer lehet valamely koaguláló faktor vagy egy második kötőszakasz, amely képes egy koaguláló faktor megkötésére.
A találmány szerinti kötőligandumokat bispecifikus kötőligandumként írjuk le, mivel legalább bispecifikusak, vagyis minimálisan két, funkcionálisan megkülönböztethető szakaszból állnak. A találmány szerinti megoldás kiterjed más szerkezetekre is, így trispecifikus és multispecifikus kötóligandumokra. A találmány kiterjed továbbá az olyan kombinált készítményekre, készletekre és alkalmazásokra, amelyek során a találmány szerinti bispecifikus koaguláló ligandumokat más hatóanyagokkal, így más immunológiai és növekedésifaktor-alapú készítményekkel, antigén indukálószerekkel, immunostimulátorokkal, immunelnyomó anyagokkal és kemoterápiás hatóanyagokkal kombináljuk.
Az első kötőszakasz és a második kötőszakasz lehet valamely antitest vagy ennek fragmense. Az antitest kifejezés itt széles körűen értendő, vagyis kiteljed bármely immunológiai kötőanyagra, amelyre példaként említhető az IgG, IgM, IgA, IgD és IgE. Előnyösen alkalmazható az IgG és IgM, mivel ezek az antitestek fiziológiai helyzetekben általánosan előfordulnak, és laboratóriumi eszközökkel könnyen előállíthatok. Előnyösen alkalmazhatók a monoklonális antitestek (az angol „monoclonal antibody” kifejezés után rövidítve MAb), mivel ezek könnyen reprodukálhatók, és nagymértékben előállíthatok. A találmány szerinti megoldásban alkalmazhatók módosított antitestek, így rekombináns antitestek és humanizált antitestek.
Ha kötő- és célzószerként antitestek antigénkötő szakaszait használjuk, akkor felhasználható a teljes antitestmolekula. Alternatív módon, használható a funkcionális antigénkötő szakasz, például egy antigén Fv, ScFv (egyláncú Fv), Fab’, Fab, Dab vagy F(ab’)2 fragmense. A különböző antitestalapú szerkezetek előállítására és alkalmazására vonatkozó technikák közismertek.
A kötőligandum koagulációsfaktor-szakaszát úgy alakítjuk ki, hogy az megőrizze funkcionális kapacitását. Ez azt jelenti, hogy a megcélzott szakaszba eljuttatva megőrzi azt a képességét, hogy elősegíti a vér koagulálódását vagy alvadását. Egyes megvalósítási módoknál azonban a kötőligandum koagulációsfaktor-szakasza kevésbé aktív, mint például a koaguláns természetes megfelelője, és a faktor aktivitásának kívánt szintjét csak a célterületre
HU 220 347 Β történő eljuttatás után éri el. Erre példaként említhető az olyan K-vitamintól függő koagulációs faktor, amelynél hiányzik a Gla-módosítás, és amely szignifikáns funkcionális aktivitását csak akkor éri el, ha a bispecifikus ligandum első kötőszakasza egy membránhoz kötődik.
Ha a koagulációs faktor megkötéséhez egy második kötőszakaszt alkalmazunk, akkor azt előnyösen úgy választjuk meg, hogy a koagulációs faktoron található felismerő helye jelentős mértékben ne gyengítse a faktor koagulációt kiváltó képességét. Hasonlóképpen, ha a koagulációs faktort kovalens kötéssel egy első kötőszerhez kapcsoljuk, akkor a molekulák összekapcsolásához a funkcionális koaguláló helytől eltérő helyet használunk.
A találmány szerinti bispecifikus ligandumok első kötőszakasza bármely olyan komponens lehet, amely a kívánt célhelyhez kötődik. Az ilyen célhely lehet például a tumor vagy más betegség környezete, ahol szükség van a koagulálásra. Egy tumor megcélzása esetén a célmolekula általában nagyobb koncentrációban található meg a tumor helyén, mint a nem tumoros helyeken. A megcélzott molekula előnyösen a tumorsejtekhez, tumorérrendszersejtekhez, tumorhoz kapcsolódó sztrómához vagy más komponensekhez asszociálódik, de a találmány szerinti megoldás nem korlátozódik az ilyen sejtekre.
Megjegyezzük, hogy a tumor érrendszere „protrombotikus”, vagyis koagulációra hajlamos. Feltételezhető tehát, hogy a megcélzott koaguláns inkább a tumor érrendszerét koagulálja, és nem a normálszövetek érrendszerét, még akkor is, ha a normálsejtek, például a normál endotéliás sejtek vagy akár a sztróma (vagy vázfehérje, a továbbiakban egyszerűen váz) jelentős mennyiségű célmolekulát fejez ki. Ez a megoldás, vagyis a rák célbavétele embereknél biztonságosabban alkalmazható, mint egy toxinnak a tumor érrendszerébe történő eljuttatása.
A találmány szerinti megoldásban az első kötőszakaszt például valamely tumorsejtkomponenshez vagy a tumorsejttel asszociált komponensre irányítjuk. Egy tumorsejt célbavétele esetén feltételezzük, hogy az első kötőligandum hatására a bispecifikus kötőligandum koagulációsfaktor-komponense a véredényhez legközelebbi ér körüli tumorsejteken koncentrálódik, és így kiváltja a tumoros véredények koagulációját, és ezért a bispecifikus kötőligandum előnyösen alkalmazható.
Első kötőszakaszként ezért olyan komponens, például antitest vagy más szer alkalmazható, amely a tumoros sejthez kötődik. A tumoros sejthez kötődő szer olyan ligandum lehet, amely a tumoros sejt bármely megközelíthető komponenséhez vagy a tumoros sejthez kötődő vagy másképpen asszociálódó egyéb komponenshez kötődik.
Tumorhoz kötődő ligandumként előnyösen alkalmazhatók az olyan szerek, például antitestek, amelyek sejtfelületi tumorantigénhez vagy -markerhez kötődnek. Számos ilyen antigén ismert, és ezért nagyszámú antitest alkalmazható az ilyen antigének megkötésére vagy a tumor megcélzására. A találmány értelmében ezért első kötőszakaszként előnyösen alkalmazhatók antitestek antigénkötő szakaszai, amelyek egy adott tumorsejt felületű antigénhez kötődnek. Ilyeneket ismertet az I. táblázat. Első kötőszakaszként előnyösen alkalmazhatók továbbá az olyan komponensek, amelyek előnyösen és specifikusan egy ép tumorsejthez kötődnek, ilyen tumorsejteket ismertet a II. táblázat.
A tumorsejtkötő szakaszokra előnyös példaként említhetők az olyan antitestek antigénkötő szakaszai, amelyek pl85HER2 sejtfelületi tumorantigénhez, tej mucinmag fehérjéhez, TAG-72-höz, Lewis a vagy karcinoembrionális antigénhez (CEA) kötődnek. Előnyösek továbbá azok a tumorsejtkötő szakaszok, amelyek olyan antitest antigénkötő szakaszát tartalmazzák, amelyek 9.2.27, OV-TL3, MOvl8, B3, KS1/4, 260F9 vagy D612 antitesthez kötődő, tumorhoz asszociált antigénhez kötődnek.
A 9.2.27 antitest nagy Mr melanóma antigénhez kötődik, az OV-TL3 és M0vl8 antitest petefészekhez asszociált antigénekhez kötődik, a B3 és KS1/4 antitest karcinómaantigénekhez kötődik, a 260F9 antitest mellrákhoz kötődik és a D612 antitest vastagbél-végbél karcinómához kötődik. Különösen előnyösek azok az antigénkötő szakaszok, amelyek ugyanahhoz az antigénhez kapcsolódnak, mint a D612, B3 vagy KS1/4. A D612 antitestet az US 5.183.756 számú irat ismerteti, és az antitest az ATCC HB 9796 számon van deponálva; a B3 antitestet az US 5.242.813 számú irat ismerteti és az antitest az ATCC HB 10573 számon van deponálva; a rekombináns és kimér KS1/4 antitestet az US 4.975.369 számú irat ismerteti.
Olyan tumorsejt esetében, amelynél a tumormarker olyan komponens, például receptor, amelynek biológiai ligandumát azonosították, célba juttató szerként az antitest helyett alkalmazható maga a ligandum vagy a ligandum aktív fragmense vagy kötőszakasza.
A találmány értelmében első kötőszakaszként alkalmazható olyan komponens is, amely a tumorsejtmarkerhez asszociált ligandumhoz kötődik. Ha például a kérdéses tumorantigén egy sejtfelületi receptor, akkor a tumorsejthez in vivő kapcsolódik a megfelelő biológiai ligandum, például hormon, citokin vagy növekedési faktor, és ez a sejtfelülethez kötődő ligandum célpontként alkalmazható. Az ilyenekre példaként említhetők a keringő ligandumok és az „parakrin típusú” ligandumok, amelyeket a tumorsejt generál, majd a sejtfelülethez köt.
A találmány értelmében tehát alkalmazhatók továbbá olyan első kötőszakaszok, így antitestek vagy ezek ffagmensei, amelyek olyan ligandumhoz kötődnek, ahol a ligandum egy azonosított tumorsejt felületi antigénhez, előnyösen I. táblázat szerinti antigénhez kötődik, vagy előnyösen vagy specifikusan egy vagy több ép tumorsejthez kötődik. A bispecifikus koaguláló ligandum kötőszakaszaként alkalmazható továbbá maga a receptor, ennek módosított vagy másképpen oldhatóvá tett formája vagy a receptorkötő dómén.
Első kötőszakaszként alkalmazható továbbá olyan komponens, amely a tumorhelytől eltérő beteg helyen specifikusan vagy előnyösen kifejeződő célmolekulához kötődik. Más beteg sejtekhez asszociált célmoleku4
HU 220 347 B laként említhető például a jóindulatú prosztatahiperpláziához (BPH) asszociált PSA, és a proliferatív diabetikus recehártya-betegséggel asszociált FGF. Feltételezzük, hogy a fenti betegségek valamelyikében szenvedő betegnek hasznára válna a koagulációnak a betegség helyén történő specifikus kiváltása.
A beteg sejt kifejezés valamely betegséggel vagy rendellenességgel összefüggő sejtet jelent, amely sejt kifejezi vagy más módon összefüggésbe hozható a célkomponenssel, amely a betegség helyén és a beteg sejtekben nagyobb koncentrációban fordul elő, mint a nem beteg helyeken és nem beteg sejtekben. Ilyen célkomponens lehet például a beteg hely érrendszerével asszociált komponens.
A koagulánsnak a beteg helyre történő eljuttatását biztosító első kötőszakaszként alkalmazhatók például antitestek, így anti-PSA (BPH), valamint GF82, GF67 3H3, amely FGF-hez kötődik. Alkalmazható továbbá biológiai kötőligandum, így FGF, amely a megfelelő receptorhoz, jelen esetben az FGF-receptorhoz kapcsolódik. Alkalmazhatók továbbá az érrendszeri célpont elleni antitestek is. A váz- vagy endotéliás sejtek célbavételével hatékonyan kezelhetők más betegségek, ahol a beteg sejt önmagában nincs összefüggésben egy erős vagy különleges markerantigénnel.
Első kötőszakaszként alkalmazhatók továbbá olyan komponensek, amelyek a betegséggel összefüggő érrendszer, vagyis azon szakasz egyik komponenséhez kötődik, ahol a specifikus koaguláció előnyös lenne a betegre. Ebből a szempontból előnyös a specifikusan vagy előnyösen tumor érrendszerrel összefüggő komponenshez kötődő első kötőszakasz. A tumorérrendszer komponense lehet tumor érrendszer endotéliás sejtfelületi molekula vagy bármely olyan komponens, így növekedési faktor, amely az ilyen sejtfelületi receptorokhoz vagy molekulákhoz kötődik.
Kötőligandumként előnyösen alkalmazhatók az olyan antitestek és ezek fragmensei, amelyek sejtfelületi receptorokhoz kötődnek, valamint olyan antitestek, amelyek az ilyen receptorok megfelelő biológiai ligandumaihoz kötődnek. Az ilyen antitestekre példaként említhetők az MHC II osztályba tartozó fehérjékhez, VEGF/VPF receptorokhoz, FGF-receptorokhoz, TGFPreceptorokhoz, TIE-receptorhoz (tirozin-kináz-immunoglobulin epidermális növekedési faktorhoz hasonló receptor, így TIE-1 és TIE-2), VCAM-1-receptorhoz, Pszelektinhez, E-szelektinhez, avp3-integrinhez, pleiotropinhoz, endoszialinhoz és endoglinhez kötődő antitestek.
Ezen belül előnyösek az endoglinhez kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazó első kötőszakaszok. Ezekre példaként említhetők az olyan antitestek és ezek fragmensei, amelyek ugyanahhoz az epitóphoz kötődnek, mint a monoklonális TEC-4 antitest vagy a monoklonális TEC-11 antitest.
Előnyösek továbbá a VEGF-receptorhoz kötődő antitestek antigénkötő szakaszai. Ezekre példaként említhetők az olyan antitestek és ezek fragmensei, amelyek ugyanahhoz az epitóphoz kötődnek, mint a monoklonális 3E11, 3E7, 5G6, 4D8, 10B10 vagy TEC-110 antitest. Alkalmazhatók továbbá az olyan anti-VEGF antitestek, amelyek kötődési specifikussága lényegében azonos az 1B4, 4B7, 1B8, 2C9, 7D9, 12D2, 12D7, 12E10, 5E5, 8E5, 5E11, 7E11, 3F5, 10F3, 1F4, 2F8, 2F9, 2F10, 1G6, 1G11, 3G9, 9G11, 10G9, GV97, GV39, GV97y, GV39y, GV59 vagy GV14 antitest ilyen irányú tulajdonságaival. Anti-VEGF antitestként alkalmazható továbbá a 4.6.1, A3.13.1, A4.3.1 és B2.6.2 (Kim és munkatársai idézett műve, 1992), SBS94.1 (Oncogene Science), G143-264 és G143-856 (Pharmingen).
Antitestként alkalmazhatók továbbá azok, amelyek egy tumor érrendszer sejtfelületi receptorhoz kötődő ligandumhoz kötődnek. Ilyenekre példaként említhetők a VEGF/VPF, FGF, TGFp, TIE-hez kötődő ligandumhoz, tumorral asszociált fibronektin izoformhoz, szóródásfaktorhoz, hepatocita növekedési faktorhoz (HGF), vérlemezke 4 faktorhoz (PF4), PDGF-hez (így PDGFa és PDGFb) és metalloproteináz szövetinhibitorhoz (TIMP, így TIMP-1, TIMP-2 és TIMP-3) kötődő antitest, ezen belül előnyösen a VEGF/VPF, FGF, TGFp, TIE-hez kötődő ligandumhoz vagy tumorral asszociált fibronektin izoformhoz kötődő antitest.
Alkalmazhatók továbbá olyan, tumor érrendszerre specifikus markerek, amelyek először indukálhatok, vagyis kifejeződésük emberi beavatkozással kiváltható, majd kötőligandummal, így antitesttel célba vehetők.
Az indukálható antigénekre példaként említhetők a citokinnal indukálható antigének, így IL-1, IL-4, TNF-a, TNF-β vagy IFN-γ, ami megvalósítható monocitákkal, makrofágokkal, hízósejtekkel, helper-T-sejtekkel, CD8-pozitív T-sejtekkel, NK-sejtekkel vagy akár tumorsejtekkel. Az indukálható célpontokra példaként említhető az E-szelektin, VCAM-1, ICAM-1, endoglin és MHC II csoportba tartozó antigén. Az MHC II csoportba tartozó indukció alkalmazása esetén a normálszövetekben általában el kell nyomni az MHC II csoportba tartozó antigént, ami megvalósítható ciklosporin, így ciklosporin A (CsA) vagy funkcionálisan ekvivalens szer alkalmazásával.
Az indukálható antigénekre további példaként említhető a koagulánssal indukálható antigének, így a trombin, IX/IXa faktor, X/Xa faktor, plazmin vagy metalloproteináz (mátrix metalloproteináz, MMP). Előnyösen alkalmazható a trombinnal indukálható antigén. Az ilyen antigénekre példaként említhető a P-szelektin, Eszelektin, PDGF és ICAM-1, ezen belül előnyösen a Pszelektin és E-szelektin.
Alkalmazhatók továbbá olyan antitestek, amelyek a ligandum/receptor komplexen jelen lévő, de mind az egyedi ligandumon, mind az egyedi receptoron hiányzó epitópokhoz kötődnek. Az ilyen antitestek felismerik és megkötik a ligandum/receptor komplexet, például a sejt felületén, de nem kötik meg a szabad ligandumot vagy a komplexen kívüli receptort. A ligandum/receptor komplex itt azt a komplexet jelenti, ami akkor keletkezik, amikor a ligandum, így a növekedési faktor specifikusan kötődik a saját receptorához, így a növekedésifaktor-receptorhoz. Ilyen például a VEGF/VEGF receptor komplex.
Megemlítjük, hogy az ilyen ligandum/receptor komplexek lényegesen nagyobb számban fordulhat5
HU 220 347 B nak elő a tumorral asszociált endotéliás sejtekben, mint a tumortól független endotéliás sejtekben, és ezért az antikomplex antitestekkel megcélozhatók. Antikomplex antitestként olyan antitestek és ezek fragmensei alkalmazhatók, amelyek ugyanahhoz az epitóphoz kötődnek, mint a monoklonális 2E5, 3E5 vagy 4E5 antitest.
Egy másik megvalósítási mód szerint az első kötőszakasz a betegséggel asszociált váz, így a tumorral asszociált váz egyik komponenséhez kapcsolódik. Ez lehet egy olyan antitest antigénkötő szakasza, amely az alapvető membránkomponensekhez, aktivált vértestekhez és indukálható tumorvázkomponensekhez kötődik, ahol az indukció megvalósítható például egy koagulánssal, így trombinnal. Az aktivált vértestecske a tumorváz egyik komponense, és ez az oka annak, hogy aktivált állapotban a vázhoz kötődik.
A tumorral asszociált váz célba vehető eleme előnyösen a tumorral asszociált fibronektin izoform. A fibronektin izoformok olyan ligandumok, amelyek a receptorok integrin családjához kötődnek. A tumorral asszociált fibronektin izoformok hozzáférhetők, ezeket felismeri például az MAb BC-1. A találmány értelmében ezért előnyösen alkalmazható az Mab és más hasonló specifitású anyag. A fibronektin izoformok vázkomponensek, de az endotéliás sejtekhez kötődnek, és ezért a találmány szempontjából célba vehető érrendszeri endotéliás sejtkötő ligandumnak minősülnek.
Antivázantitestként előnyösen alkalmazhatók továbbá a fibrinogén receptor által indukált kötőhelyéhez (RIBS) kapcsolódó antitestek. Az RIBS egy célba vehető antigén, amelynek a vázban bekövetkező kifejeződését az aktivált vértestecskék irányítják. Alkalmazhatók továbbá a vértestecskék ligandum által indukált kötőhelyeihez (LIBS) kapcsolódó antitestek is.
Antitestként alkalmazhatók továbbá a tenaszcinhez kötődő antitestek. A tenaszcin egy nagy móltömegű extracelluláris glikoprotein, amely különböző jóindulatú és rosszindulatú tumorok vázában fejeződik ki. A koaguligandum kötőszakaszában antitestként alkalmazhatók tehát a Shrestha és munkatársai által ismertetett antitestek (Shrestha és munkatársai idézett műve, 1994), valamint a 143DB7C8 antitest (Tuominen és Kallioinen idézett műve, 1994).
A betegséghez és tumorhoz asszociált váz komponensére példaként említhetők különböző sejttípusok, mátrixkomponensek, effektorok és más molekulakomponensek, amelyek bizonyos mértékben kívül esnek a váz legszélesebb definícióján, de ennek ellenére olyan célba vehető elemek, amelyek összefüggésben vannak a beteg területtel, így a tumorral.
Ennek megfelelően, az első kötőszakasz lehet olyan antitest vagy ligandum, amely egy simaizomsejthez, pericita, fibroblaszt, makrofág, beszivárgó limfocita vagy leukocita. Az első kötőszakasz a kötőszövet valamely komponenséhez is kötődhet, ezért lehet olyan antitest és ligandum, amely például fibrinhez, proteoglikánhoz, glikoproteinhez, kollagénhez és anionos poliszaccharidhoz, így heparinhoz vagy heparinhoz hasonló vegyülethez kötődik.
Egy másik előnyös megvalósítási mód értelmében az érrendszerhez és vázhoz kapcsolódó találmány szerinti ligandum olyan kötőszakasz, amely önmagában egy biológiai ligandum vagy ennek egy szakasza, és nem egy antitest. A biológiai ligandum ebben az értelemben olyan molekula, amely a vázban vagy a vaszkuláris sejteken megtalálható sejtfelületi molekulákhoz, így receptorokhoz kötődik vagy asszociálódik. Példaként említhetők a citokinok, hormonok, növekedési faktorok és más hasonló anyagok. Bármely ilyen növekedési faktor vagy ligandum felhasználható, amennyiben a betegséggel asszociált vázhoz vagy érrendszerhez kötődik. Példaként említhető a tumor érrendszer endotéliás sejtjeinek felületén jelen lévő specifikus biológiai receptor.
Az ilyen növekedési faktorokra példaként említhető a VEGF/VPF (érrendszeri endotéliás növekedési faktor/érrendszeri permeabilitás faktor), FGF (fibroblaszt növekedési faktor a fehérjék családjából), TGFp (B transzformáló növekedési faktor), a TIE-hez kötődő ligandum, tumorhoz asszociált fibronektin izoform, szóródási faktor, HGF (hepatocita növekedési faktor), PF4 (4 vértestecskefaktor), PDGF (vértestecskéből származó növekedési faktor), TIMP vagy akár IL-8, IL-6 vagy XHIa faktor. Ezenbelül előnyös a VEGF/VPF és FGF.
Eljárhatunk úgy is, hogy egy endotéliás sejthez kötött komponenst, például citokint vagy növekedési faktort célzunk meg egy ismert receptoron alapuló kötőligandum-szerkezettel. Ha célba juttató komponensként receptort használunk, akkor a receptor csonkolt vagy oldható formáját alkalmazzuk. Ilyen esetben különösen előnyösen megcélozhatók a dimer ligandum formájú endotéliás sejthez kötött komponensek, így a VEGF. Előnyös, ha a dimer egyik komponense már in situ a sejtfelületi receptorhoz kötődik, és a dimer másik komponense hozzáférhető a bispecifikus koaguláló ligandum oldható receptorrésze szempontjából.
A betegséggel asszociált érrendszer egyik komponensének megkötésére képes legalább egy célba juttató szakaszt tartalmazó bispecifikus, illetve tri- vagy multispecifikus ligandum alkalmazásának előnye, hogy a vaszkuláris endotéliás sejtek, és a betegséggel asszociált szerek, például aktivált vértestecskék a különböző betegségekben, például a különböző tumorokban azonosak. Ez lehetővé teszi, hogy nagyszámú betegséget és ráktípust azonos gyógyszerrel kezeljünk, és nincs szükség arra, hogy minden egyes betegséghez vagy specifikus tumortípushoz külön szert dolgozzunk ki.
A találmány szerinti megoldás alkalmazható olyan jóindulatú és rosszindulatú betegségekre, amelyeknek vaszkuláris komponense van. Az ilyen érrendszerrel asszociált betegségekre példaként említhető a jóindulatú növekedés, így BPH, diabetikus recehártya-betegség, az érrendszer újbóli beszűkülése, artériás-vénás fejlődési rendellenesség (AVM), agyhártyadaganat, vérérdaganat, neovaszkuláris glaukóma és psoriasis. Ugyanebbe a csoportba tartozik az ízületihártya-gyulladás, bőrgyulladás, méhnyálkahártya-gyulladás, érfibróma, reumás ízületi gyulladás, atherosclerotikus plakk, szaruhártya6
HU 220 347 Β beültetés neovaszkularizációja, hemofíliás ízület, hipertrófiás sebhely, Osler-Weber-szindróma, gennyes granulóma, lencse mögötti rostszövetképződés, bőrkeményedés, trachoma és vaszkuláris összenövés. A fenti betegségek mindegyike közös, vérrendszertől függő patológiával rendelkezik, ezért feltételezhető, hogy a betegség helyén kiváltott koaguláció kedvező eredményt vált ki.
A találmány szerinti bispecifikus kötőligandum/koagulációs faktor konjugátum lehet például olyan konjugátum, amelyben két vagy több komponenst kovalens kötés kapcsol össze. Ez megvalósítható például biokémiai keresztkötések kialakítására alkalmas anyaggal, amelyek közül előnyösen a vérben stabil anyagot alkalmazunk. Ilyen például az SMPT. A komponensek összekapcsolhatók továbbá az ismert avidin (vagy sztreptavidin) és biotin kombinációval. A konjugátumok előállításához alkalmazott különböző keresztkötések kialakítására alkalmas anyagok, avidin/biotin készítmények és kombinációk, valamint ezek alkalmazása ismert.
Alternatív módon, a bispecifikus koaguláló szer lehet valamely biotechnológiai úton előállított fúziós fehérje. Ez megvalósítható például a kötőligandumot kódoló gén (vagy cDNS) és a koaguláló faktort kódoló génszakasz (vagy cDNS) egyesítésével. Az ilyen módszerek szakember számára ismertek. Ennek során előnyösen úgy járunk el, hogy olyan kifejezővektort állítunk elő, amely közös leolvasókeretben tartalmazza az első kötőszakaszt kódoló DNS-szegmenst és ehhez működőképesen hozzákapcsolva a koaguláló faktort kódoló DNS-szegmenst, majd a vektort egy rekombináns gazdasejtben kifejezve előállítjuk a kódolt fúziós fehéijét.
A találmány értelmében koagulációs faktorként alkalmazható például K-vitamintól függő koagulációs faktor, így II/IIa faktor, VlI/VIIa faktor, IX/IXa faktor vagy X/Xa faktor. Alkalmazható továbbá az V/Va faktor, VlII/VIIIa faktor, Xl/XIa faktor, XII/XIIa faktor és XlII/XIIIa faktor.
Különösen előnyösen alkalmazhatók olyan K-vitamin-függő koagulációs faktorok, amelyeknél hiányzik a Gla-módosítás. Az ilyen faktorok előállításához a Kvitamin-függő koagulációs faktort kódoló gént egy prokarióta gazdasejtben fejezzük ki (ahol a sejt nem képes a Glu-»Gla-módosításra). A faktor előállítható továbbá olyan biotechnológiailag módosított koagulációsfaktorgén kifejlesztésével, amely olyan K-vitamin-függő koagulációs faktort kódol, amelyben hiányzik a szükséges vagy „megfelelő” glutaminsavmaradék, majd a kifejlesztett gént gyakorlatilag tetszőleges rekombináns gazdasejtben kifejezzük. Végül, az ilyen koagulációs faktor előállítható úgy, hogy a K-vitamin-függő koagulációsfaktor-fehérjét kezelve eltávolítjuk vagy megváltoztatjuk a megfelelő glutaminsavmaradékokat.
A találmány szerinti kötőligandumban koagulációs faktorként alkalmazható továbbá szövetfaktor és szövetfaktor-származék. Előnyösen alkalmazhatók a szövetfaktorok olyan mutánsai, amelyek nem képesek a VII faktor aktiválására. A VII faktor aktiválására vonatkozó képesség úgy szüntethető meg, hogy a szövetfaktorban megváltoztatunk egy vagy több aminosavat az aminosavszekvencia mintegy 157-167 pozíciója közötti szakaszban. A mutánsokra példaként említhetők azok, amelyekben a 158 helyzetű Trp helyett Arg található, a 162 helyzetű Ser helyett Alá található, a 164 helyzetű Gly helyett Alá található, valamint az olyan kettős mutáns, ahol a 158 helyzetű Trp helyett Arg található és a 162 helyzetű Ser helyett Alá található.
Szövetfaktor-származékként alkalmazhatók például csonkolt szövetfaktorok, dimer vagy polimer szövetfaktorok, és dimer vagy polimer csonkolt szövetfaktorok.
A találmány kiteljed az olyan új szövetfaktor-szerkezetekre, amelyek egy szövetfaktorból vagy ennek származékából, és ehhez működőképesen hozzákapcsolva legalább egy továbbá szövetfaktorból vagy ennek származékából állnak. Előnyösen alkalmazhatók a csonkolt szövetfaktorok és ezen belül az olyan csonkolt szövetfaktorok, amelyek egy hidrofób membrán inszert egységet tartalmaznak.
A hidrofób membrán inszert egység olyan egy vagy több részből álló egység, amelynek hatására a szövetfaktor egy membránnal inszertálódik vagy funkcionális kontaktusba lép. A hidrofób membrán inszert egység lehet például lényegében hidrofób aminosavakból álló szekvencia, például mintegy 3-20 hidrofób aminosavból álló szekvencia, valamint zsírsavakból álló szekvencia.
A hidrofób aminosavak elhelyezkedhetnek a csonkolt szövetfaktor N- vagy C-terminális végén vagy a molekula más megfelelő pontján. A hidrofób aminosavakat előnyösen biotechnológiai módszerekkel visszük be a molekulába. Eljárhatunk úgy is, hogy szintetikus kémiai módszerekkel adjuk hozzá a hidrofób aminosavakat vagy zsírsavakat a szövetfaktorhoz.
A dimer, trimer és polimer szövetfaktor vagy annak származéka működőképes összekapcsolása megvalósítható például diszulfidkötéssel, tioéterkötéssel vagy peptidkötéssel. A szövetfaktoregységeket előnyösen olyan kötéssel kapcsoljuk össze, amely a plazmában vagy abban a fiziológiai környezetben, amelyben használni akarjuk, stabil. Biológiai szempontból a szövetfaktor dimer formája bizonyult a legaktívabbnak. A stabil kapcsolat azonban nem kötelező a hatékony szövetfaktormonomereknél.
A dimer vagy multimer formákban egy vagy több szövetfaktor vagy csonkolt szövetfaktor előfordulhat módosított formában, amely például terminális ciszteinmaradékot vagy más csoportot tartalmaz, amely alkalmas arra, hogy a szövetfaktor-szerkezetet egy második szerhez, például kötőszakaszhoz kapcsolja.
Alkalmazhatók továbbá olyan szövetfaktor-monomerek, csonkolt szövetfaktorok és dimer vagy multimer szövetfaktorok, amelyek a peptiden belül szelektíven hasítható aminosavszekvenciát tartalmaznak. Ebből a szempontból különösen előnyösek az olyan peptidlinkerek, amelyek urokináz, plazmin, trombin, IXa faktor, Xa faktor vagy metalloproteináz, így szövetközi kollagenáz, zselatináz vagy sztromelizin hasítási helyet tartalmaznak.
A szövetfaktor-monomerek, csonkolt szövetfaktorok, szövetfaktordimerek vagy multimerek és bármely koaguláns egy második szerhez, így antitesthez, egy anti7
HU 220 347 Β test antigénkötő szakaszához, ligandumhoz vagy receptorhoz kapcsolhatók biológiailag felszabadítható kötésen keresztül. Előnyösen alkalmazhatók az olyan peptidlinkerek, amelyek valamely fent említett proteináz hasítóhelyet tartalmaznak, mivel az ilyen proteinázok előfordulnak például a tumor környezetében. A bispecifikus szer vagy ligandum tumorhoz történő elszállítása a hasítás következménye, ezért a koagulációs faktor felszabadulása viszonylag specifikus módon következik be.
A találmány szerinti szerkezet működőképesen összekapcsolt módon például a következő egységekből áll: egy ciszteinmaradék, egy szelektíven hasítható peptidlinker, hidrofób aminosavak szekvenciája, egy első csonkolt szövetfaktor és egy második csonkolt szövetfaktor; vagy egy első ciszteinmaradék, egy szelektíven hasítható peptidlinker, hidrofób aminosavak első szekvenciája, első csonkolt szövetfaktor, második csonkolt szövetfaktor és hidrofób aminosavak második szekvenciája; amely szerkezetek adott esetben egy második szerhez, így antitesthez, ligandumhoz vagy receptorhoz kötődnek.
Koagulációs faktorként alkalmazható továbbá Russell-féle viperaméreg X faktor aktivátor, vértestecskeaktiváló vegyület, így A2 tromboxán és A2 tromboxán szintáz, valamint fibrinolízis inhibitor, így a2-antiplazmin.
Előnyösek továbbá az olyan kötőligandumok, amelyekben a koagulációs faktor nem kovalens kötéssel kapcsolódik a konjugátumhoz. A kötés ilyenkor megvalósítható egy második kötőszakaszon keresztül, amely működőképesen kötődik a szerkezet célba juttató szeréhez. Második kötőszakaszként alkalmazható antitestek antigénkombináló helye, amely specifikus kötést mutat a koagulációs faktorhoz, például antitestek funkcionális szakaszai, így scFv, Fv, Fab’, Fab és F(ab’)2 fragmens.
Ennek megfelelően, előnyösek az olyan kötőligandumok, valamely K-vitamintól függő koaguláns II/IIa faktor, VH/VIIa faktor, IX/IXa faktor vagy X/Xa faktor; Gla-módosítástól mentes K-vitamin-függő koaguláns faktor; szövetfaktor, mutáns szövetfaktor, csonkolt szövetfaktor, dimer szövetfaktor, polimer szövetfaktor, dimer csonkolt szövetfaktor, prekallikein; V/Va faktor, VlII/VIIIa faktor, Xl/XIa faktor, XII/XIIa faktor, XlII/XIIIa faktor; Russell-féle viperaméreg X faktor aktivátor, A2 tromboxán vagy a2-antiplazmid elleni antitestet vagy ennek fragmensét tartalmazzák.
A nem kovalens módon kötött koagulációs szer és a koaguláló faktor közötti kapcsolat vagy „előkomplex” forma kialakítható minden olyan módon, amely lehetővé teszi, hogy adagolás után a szervezet az exogén koaguláló faktort a betegség helyére, például a tumor érrendszerébe szállítsa. Emellett, a koaguláló faktorral specifikus, második kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumok adagolhatok nem komplexált formában is, és így is biztosítják a specifikus koagulálást, amikor is a szer összegyűjti a keringő (endogén) koaguláló faktort és a betegség vagy tumor helyén koncentrálja.
A koaguláló faktor vagy koaguláló szer lehet tehát endogén koaguláló faktor vagy ennek származéka vagy az ilyen faktorok exogén módon adagolt változatai, például rekombináns változatai. A koagulánsok (jelen esetben „koaguligandumok”) előnye a toxinokkal, például immunotoxinokkal szemben, hogy nem váltanak ki jelentős mellékhatásokat akkor, ha a célba vett marker nem korlátozódik 100%-osan a betegségre. Emellett, az alkalmazott koaguláns általában humán eredetű, és ezért kevesebb immunológiai problémát okoz, mint az idegen toxin, így ricin A lánc.
A találmány szerinti megoldás nem korlátozó jellegű, de fontos megvalósítási formája az olyan bispecifikus antitest, amely a beteg sejtekhez vagy a betegséggel asszociált érrendszerimarker-komponenshez kötődő első antigénkötő szakaszból és a koaguláló faktorhoz kötődő második antigénkötő szakaszból áll. Az ilyen bispecifikus antitestek tartalmazhatnak scFv, Fv, Fab’, Fab és F(ab’)2 fragmenst. Az ilyen bispecifikus antitestekre előnyös példaként említhető az olyan antitest, amely MHC II csoportba tartozó antigén elleni kötőhelyet és szövetfaktor elleni kötőhelyet tartalmaz.
A találmány tárgya továbbá gyógyszerkészítmény és terápiás készlet, amely valamely fent említett kötőligandumot és bispecifikus antitestet vagy ezek tetszőleges kombinációját tartalmazza farmakológiailag alkalmazható formában. Előnyösek az olyan gyógyszerkészítmények és készletek, amelyekben a kötőligandum kovalens kötéssel egy koaguláló faktorhoz kapcsolódó első kötőszakaszból áll, vagy az első kötőszakasz kovalens kötéssel egy második kötőszakaszhoz kapcsolódik, amely megköti a koaguláló faktort, ahol a kötés kialakulhat az adagolás előtt vagy után.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmény vagy terápiás készlet tartalmazhatja továbbá a fent említett bispecifikus, trispecifikus vagy multispecifikus kötőligandumok kombinációját. Ezekben a kombinációkban például az egyik kötőligandum a beteg sejtre vagy tumorsejtre irányul, és a másik kötőligandum érrendszeri endotéliás sejtmarkerre vagy a betegséggel asszociált váz egyik komponensére irányul. A találmány szerinti készítményben és készletben további komponensként alkalmazható antitest, immunotoxin, immunoeffektor vagy kemoterápiás szer.
A készlet tartalmazhat továbbá egy antigén szuppresszort, így ciklosporint, amellyel elnyomjuk az antigén kifejeződését a normálszövetek endotéliás sejtjeiben; és/vagy egy indukálószert, amellyel a betegséggel asszociált érrendszeri endotéliás sejtekben vagy vázban kiváltjuk a megfelelő antigén, így E-szelektin, B-szelektin vagy MHC II csoportba tartozó antigén kifejeződését. Az indukálószerekre példaként említhetők a beteg vagy tumorantigénhez kötődő és IFN-y-t termelő Tsejt-klónok, amely kiónokat előnyösen a kezelendő betegből izoláljuk.
Indukálószerként előnyösen alkalmazhatók az olyan bispecifikus antitestek, amelyek a beteg- vagy tumorsejt antigénjeihez vagy vázkomponenseihez, vagy citokint, koagulánst vagy a kívánt antigén kifejeződését kiváltó más faktort termelő effektorsejtekhez kötődik. Előnyösek azok a bispecifikus antitestek, amelyek egy tumorantigénhez és CD 14 vagy CD 16 aktiváló antigé8
HU 220 347 B nekhez kötődnek, és így stimulálják a monociták, makrofágok vagy hízósejtek IL -1 termelését; valamint amelyek egy tumorantigénhez és CD2, CD3 vagy CD28 aktiváló antigénhez, előnyösen CD28 aktiváló antigénhez kötődnek, és stimulálják az NK-sejtek és előnyösen a T-sejtek IFN-γ termelését.
Előnyösek továbbá azok a bispecifíkus antitestek, amelyek egy tumorantigénhez vagy a tumorváz egyik komponenséhez, és szövetfaktorhoz, szövetfaktor-származékhoz, protrombinhoz, VII/VHa faktorhoz, IX/IXa faktorhoz, X/Xa faktorhoz, Xl/XIa faktorhoz vagy Russell-féle viperaméreg X faktor aktivátorhoz kötődnek, és így stimulálják a trombintermelést. Az első „indukáló” készítményként ilyen bispecifíkus antitesteket tartalmazó készletek általában tartalmaznak egy második gyógyszerkészítményt is, amely P-szelektinhez vagy E-szelektinhez kötődő első kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumból áll.
A találmány szerinti bispecifíkus ligandumok és más kívánt komponensek egy vagy több megfelelő tárolóeszközbe kimérhetők, és abban tárolhatók, és a külön tárolóeszközöket egyetlen csomagban egyesítjük. A gyógyszerkészítményt és a készletet később részletesen ismertetjük.
A találmány szerinti megoldás elsősorban klinikai területeken alkalmazható a koaguláns szállítása és a betegség kezelése céljából, de alkalmazható in vitro felhasználási területeken is. Ezekre példaként említhetők az adott antitest, ligandum vagy receptor, vagy bispecifíkus vegyület kötőképességén alapuló vizsgálatok. A találmány szerinti bispecifíkus koaguláló ligandumok tehát felhasználhatók a szokásos kötődési vizsgálatokban, így immunfolt, Westem-folt, dot-blot, RIA, ELISA, immunohisztokémiai, fluoreszcens aktivált sejtszétválogatás (FACS), immunokicsapás, affinitáskromatográfiás és más hasonló ismert vizsgálat.
A találmány szerinti megoldás felhasználható egy koagulánsnak betegséggel asszociált érrendszerbe történő eljuttatására és így a betegség kezelésére. Az ilyen betegségekre példaként említhető a diabetikus recehártya-betegség, az érrendszer újbóli beszűkülése, AVM, vérérdaganat, neovaszkuláris glaukóma, psoriasis és reumás ízületi gyulladás, valamint az érrendszerrel ellátott tumort tartalmazó tumoros betegségek. A kezeléshez a humán vagy állati betegnek legalább egy bispecifikus kötőligandumot tartalmazó gyógyszerkészítményt adagolunk.
A készítményt olyan mennyiségben és módszerrel adagoljuk, amely elősegíti a vér koagulálását a beteg terület, például szilárd tumor érrendszerében. A hatékony dózis meghatározása a leírásban és a példákban adott kitanítás alapján szakember feladata. Az adagolást előnyösen parenterális adagolással, vagy közvetlenül az érrendszerrel ellátott tumorba történő befecskendezéssel végezzük.
A találmány értelmében exogén koagulációs faktorokat viszünk be, amelyhez kovalensen kötött koagulációs faktort tartalmazó kötőligandumot és nem kovalensen kötött koagulációs faktort tartalmazó kötőligandumot adagolunk, ahol a nem kovalensen kötött koagulációs faktor komplex formájában a bispecifikus ligandum vagy antitest második kötőszakaszához kapcsolódik.
A találmány szerinti megoldás megvalósítható úgy is, hogy egy endogén koagulációs faktort juttatunk el a beteg vagy tumor érrendszerbe. Ehhez a betegnek olyan második kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumot adagolunk, amely az endogén koagulációs faktorhoz kötődik, és azt a betegséggel asszociált vagy tumor érrendszerben koncentrálja.
Egy további megvalósítási mód szerinti specifikusan indukáljuk a tumor érrendszer vagy váz markereit, és ezeket egy kötóligandummal, így antitesttel vesszük célba. Az indukálható antigénekre példaként említhető az E-szelektin, P-szelektin, MHC II csoportbeli antigén, VCAM-1, ICAM-1, endoglin, LAM-l-gyel reakcióképes ligandumok, érrendszerbeli adresszin, és más adhéziós molekula, ezen belül előnyösen az E-szelektin és MHC II csoportba tartozó antigén.
Az MHC II csoportba tartozó fehérjék indukálása és ezt követő célbavétele esetén általában szükség van arra, hogy a normálszövetekben elnyomjuk az MHC II csoportba tartozó fehérjét. Ez megvalósítható például ciklosporinnal vagy funkcionális ekvivalensével. Az MHC II csoportba tartozó molekulák ezután a betegséggel asszociált érrendszer endotéliás sejtjeiben ciklosporintól független szerekkel indukálhatok. Ez megvalósítható például úgy, hogy a betegséggel asszociált érrendszert effektorsejttel, általában Helper-T-sejttel vagy NK-sejttel kezeljük, ami kiváltja a citokin IFN-γ indukálását.
Effektorsejtként aktiválhatok monociták, makrofágok és hízósejtek, amelyek citokint (IL-1, TNF-a, TNF-β) termelnek, amely E-szelektint indukál; valamint Helper-T-sejtek, CD8-pozitív T-sejtek és NK-sejtek, amelyek IFN-y-t termelnek, amely MHC II csoportba tartozó fehérjét indukál. A beteg területen található monociták és makrofágok aktiválása az IL-1 termelése érdekében, vagy a betegséggel asszociált Helper-T-sejtek vagy NK-sejtek aktiválása az IFN-γ termelése érdekében megvalósítható például úgy, hogy a betegnek olyan aktiváló antitestet adagolunk, amely effektorsejt felületi aktiváló antigénhez kötődik. Az aktiváló antigénekre példaként említhető a CD14 és CD16 (FcR az IgE számára) monociták és makrofágok vonatkozásában, valamint CD2, CD3 és CD28 a T-sejtek vonatkozásában. Ezen belül előnyös a CD14 és CD28.
A specifikus aktiválás és indukálás előnyösen megvalósítható olyan bispecifikus antitesttel, amely kötődik mind az effektorsejt-aktiváló antigénhez, így CD 14 vagy CD28 antigénhez, mind a beteg- vagy tumorsejtantigénhez. Az ilyen bispecifikus antitest a betegség vagy tumor helyén lokalizálódik, és aktiválja a monocitákat és makrofágokat vagy T-sejteket. Az aktivált effektorsejt a célba vett betegség vagy tumorkomponens környezetében indukálja a citokinokat, jelen esetben az IL-l-et és IFN-y-t.
Az MHC II csoport normálszövetekben történő elnyomása megvalósítható úgy, hogy a betegnek antiCD4 antitestet adagolunk, amely a T-sejtek IFN-γ ter9
HU 220 347 Β melését az MHC II csoport kifejeződésének gátlásával csökkenti. Az MHC II csoportba tartozó molekulák ezután specifikusan indukálhatok a betegséggel asszociált érrendszer endotéliás sejtjeiben, ha a betegség környezetét IFN-y-val kezeljük. Ez megvalósítható például úgy, hogy a betegnek olyan IFN-y-t termelő T-sejt-klónokat adagolunk, amelyek a betegség helyén található antigénhez kötődnek. IFN-y-t termelő T-sejtként előnyösen alkalmazhatók a betegség környezetéből nyert beszűrődő leukociták, így a tumorból nyert és in vitro expandált beszűrődő leukociták (TIL). A találmány kiterjed az olyan bispecifikus antitestekre, amelyek a koaguláns, így a trombin termelését lokalizált környezetben, így egy tumor helyén indukálják. Ez megvalósítható például úgy, hogy a betegnek olyan gyógyszerkészítményt adagolunk, amely egy bispecifikus antitestet tartalmaz, ahol az antitest egy tumorsejthez vagy a tumorváz egyik komponenséhez és szövetfaktorhoz, szövetfaktor-származékhoz, protrombinhoz, VII/VIIa faktorhoz, IX/IXa faktorhoz, X/Xa faktorhoz, Xl/XIa faktorhoz, vagy Russell-féle viperaméreg X faktor aktivátorhoz kötődik. Az E-szelektinhez vagy P-szelektinhez kötődő antitestet ezután egy koagulációs faktorral vagy a koagulációs faktor megkötésére alkalmas második kötőszakasszal kapcsoljuk, és bejuttatjuk a beteg véráramába.
Alkalmazhatók továbbá a szokásos kombinációs kezelések, amelynek során például a találmány szerinti tumor koagulációs elemet ismert tumor elleni terápiával, így radioterápiával vagy kemoterápiával, vagy egy második immunológiai reagens, így tumor elleni immunotoxin alkalmazásával kombináljuk. A jóindulatú betegségek kezelésére szolgáló új módszer is kombinálható az ismert terápiákkal.
A találmány szerinti megoldás ismertetését segítik a mellékelt ábrák:
1. ábra: A20 sejtekhez tTF-t kötünk B21-2/10H10 bispecifikus antitesttel. Az A20 sejteket különböző koncentrációjú B21-2/10H10 antitesttel (□), SFR8/10H10 antitesttel (·) vagy B21-2/0X7 antitesttel (O) inkubáljuk 125I-tTF-felesleg jelenlétében egy órán keresztül és 4 °C hőmérsékleten és nátrium-azid jelenlétében. A sejtekhez asszociált 125I-tTF-molekulák mennyiségét a II. példában leírt módon határozzuk meg, és a koncentráció függvényében ábrázoljuk.
2. ábra: Vizsgáljuk az A20 sejtenként megkötött tTF-molekulák mennyisége és a plazma koagulálásának indukálása közötti összefüggést. A20 sejteket különböző koncentrációjú B21-2/10H10 antitesttel inkubálunk tTF-felesleg jelenlétében 1 órán keresztül és 4 °C hőmérsékleten és nátrium-azid jelenlétében. A sejteket ezután mossuk, 37 °C hőmérsékletre melegítjük, kalciumot és egérplazmát adunk hozzá, és mérjük az első fibrinszál kialakulásához szükséges időt (függőleges tengely). Azonos vizsgálatot végzünk A20 sejtekkel, amelyeket 1 órán keresztül és 4 °C hőmérsékleten bispecifikus antitesttel inkubálunk I25I-tTf jelenlétében, és a II. példában leírt módon meghatározzuk a sejtekhez specifikusan hozzákötött tTF-molekulák számát (vízszintes tengely). Kezeletlen A20 sejtekhez (vagyis nulla tTF-molekulaszám/sejt) adott plazma 190 másodperc alatt koagulálódik.
3A., 3B., 3C. és 3D. ábra: Az ábrák az érrendszeri trombózis és a tumor elpusztulásának időbeli lefolyását mutatják a koaguligandum adagolása után. Három darab 0,8 cm átmérőjű 0300 (Muy) tumort hordozó egérnek intravénás injekció formájában 14 pg B21-2/10H10 és 11 pg tTF összetételű koaguligandumot adunk. A 3A. ábra szerint az injekció előtt a véredények épek és a tumorsejtek egészségesek. A 3B. ábra szerint fél óra elteltével a tumoron áthaladó véredényekben trombózis következik be, a tumorsejtek egészségesek. A 3C. ábra szerint 4 óra elteltével tömör vérrög található az összes tumoron belüli érben, a tumorsejtek szeparálódnak, és összezsugorodott magok alakulnak ki. A tumorban szövetközi eritrociták láthatók. A 3D. ábra szerint 24 óra elteltével a tumor nagy része elhalt. A nyilak a véredényeket mutatják.
4. ábra: Az ábra szilárd tumor visszahúzódását mutatja a tumor érrendszerére irányuló koaguligandumterápia hatására. Mintegy 0,8 cm átmérőjű 0300 (Muy) tumort hordozó Nu/nu egereknek két intravénás injekciót adunk 14 pg B21-2/10H10 és 11 pg tTF kombinációjából egyhetes időközben (nyilak) (□). A kontrollegereknek önmagában azonos dózisú tTF-injekciót (·), B21-2/1 OH 10 injekciót (O) vagy hígítószert () adunk. Egy másik kontrollcsoport, amely azonos dózisú izotípus alapján kiválasztott kontroll bispecifikus antitest (SFR8/10H10, OX7/10H10 vagy B21-2/OX7) és tTF kombinációt kapta, hasonló tumorválaszt mutat az önmagában tTF-fel kezelt állatokhoz viszonyítva. Az egerek száma csoportonként 7-8.
5. ábra: Az ábra egy antitest-tTF-szerkezetet mutat be. Az ábra mutatja a kémiailag származékká alakított antitest és kémiailag származékká alakított tTF diszulfid hídkötéssel történő összekapcsolását, valamint a különböző TF vagy TF-dimerek antitestekhez vagy ezek ffagmenseihez történő hozzákapcsolását. Az ábrán a hullámos vonal a membrán inszertáló egységet jelöli.
6. ábra: Az ábra az A20 sejtekhez kötött tTF-konjugátumok véralvadási aktivitását mutatja. A20 sejteket különböző koncentrációban B21-2/1 OH 10 bispecifikus antitest és H6[tTF] 1:1 mólarányú kombinációval 1 órán keresztül keverve (□), B21-2 antitest/H6C[tTF] kombinációval (·) és B21-2 antitest/H6[tTF] kombinációval (▲) inkubálunk 1 órán keresztül a 4 °C hőmérsékleten és nátrium-azid jelenlétében. A sejteket ezután mossuk, 37 °C hőmérsékletre melegítjük, kalciumot és egérplazmát adunk hozzá, és méljük az első fibrinszál megjelenéséig eltelt időt. Az eredményeket a tTF nélküli kontroll százalékában kifejezve adjuk meg.
7. ábra: Az ábra antitumorsejt tTF-konjugátum véralvadási aktivitását mutatja. LSI74 sejteket (), Widr sejteket (·) és H460 sejteket (A) TF9-6B4 és TF85G9 antitestekkel előinkubálunk, majd különböző koncentrációjú D612 antitest/H6C[tTF] kombinációval (), KS1/4 antitest/H6[tTF] kombinációval (·) és XMMCO791 antitest/H5[tTF] kombinációval (A) órán keresztül és 4 °C hőmérsékleten és nátrium-azid jelenlétében inkubáljuk. A sejteket ezután mossuk,
HU 220 347 Β °C hőmérsékletre melegítjük, kalciumot és egérplazmát adunk hozzá, és mérjük az első fibrinszál megjelenéséig eltelt időt. Az eredményeket a tTF nélkül mért kontroll százalékában kifejezve adjuk meg.
8. ábra: Az ábra Π/IIa faktor, VH/IIa faktor, IX/IXa faktor és X/Xa faktor Gla-doménjét (γ-karboxi-glutaminsav) mutatja. A nyilak a szignálpeptid és propeptid hasítási helyeket és aktiváló hasítási helyeket (ferde nyilak) mutatják.
A monoklonális antitestek (MAb) és immunotoxinok (IT) hatásosnak bizonyultak limfómák és leukémiák kezelésében (Lowder és munkatársai idézett műve, 1987; Vitetta és munkatársai idézett műve, 1991), a klinikai kísérletek szerint viszonylag hatástalanok a karcinómák és más szilárd tumorok ellen (Byers és Baldwin idézett műve, 1988; Abrams és Oldham idézett műve, 1985), amelyek azonban az összes rákos betegség több, mint 90%-át képezik (Shockley és munkatársai idézett műve, 1991). Ennek elvi oka, hogy a makromolekulák nehezen hatolnak be a szilárd tumorokba (Sands idézett műve, 1988; Epenetos és munkatársai idézett műve, 1986), és behatolás után nem oszlanak el egyenletesen, amelynek oka a tumorsejtek közötti szoros kapcsolat (Dvorak és munkatársai idézett műve, 1991), a rostos váz (Baxter és munkatársai idézett műve, 1991), a szövetközi nyomásgradiens (Jain idézett műve, 1990) és a kötőhelyek által kialakított gát (Juweid és munkatársai idézett műve, 1992).
Úgy tűnik ezért, hogy szilárd tumorok kezelésénél előnyösebb az a megoldás, ha a tumor érrendszerét célozzuk meg a tumor sejtjei helyett. Ha gátoljuk a vér átáramlását a tumoron keresztül, például a tumor érrendszerére specifikus fibrinképzéssel, akkor megzavarjuk a tumor kiáramlását és beáramlását, és ez tumor elleni hatást vált ki. Egy tumor vérellátása gátolható, ha a prokoaguláns-fibrinolítikus egyensúlyt a tumorral asszociált erekben specifikus koaguláns szerekkel a koagulálási folyamat irányába toljuk el.
A találmány olyan eszközökre vonatkozik, amelyek hatékonyan és specifikus módon lehetővé teszik a vér koagulálását, például a tumorspecifikus koagulálást. Ezt olyan bispecifikus vagy multispecifikus kötóligandumokkal érjük el, amelyeknek legalább egyik komponense egy immunológiai vagy növekedésifaktor-alapú célba juttató komponens, és legalább egy másik komponense képes a koagulálás közvetlen vagy közvetett stimulálására.
A) Célba vehető beteg helyek
A találmány szerinti készítmények és módszerek széles körűen alkalmazhatók olyan betegségek, így jóindulatú vagy rosszindulatú tumorok kezelésére, amelyek vaszkuláris komponenssel rendelkeznek. Az ilyen érrendszerrel asszociált betegségekre példaként említhető a BPH, diabetikus recehártya-betegség, érrendszeri újbóli beszűkülés, artériás-vénás fejlődési rendellenesség (AVM), agyhártyadaganat, vérérdaganat, neovaszkuláris glaukóma és psoriasis, valamint érfibróma, ízületi gyulladás, ateroszklerotikus plakk, szaruhártya-beültetés neovaszkularizációja, hemofiliás ízület, túltengő sebhely, Osler-Weber-szindróma, gennyes granulóma, lencse mögötti rostszövetképződés, bőrkeményedés, trachoma, érösszenövés, ízületihártya-gyulladás, bőrgyulladás és méhnyálkahártya-gyulladás.
Az érrendszerrel ellátott tumorokra példaként említhetők a szilárd tumorok, így karcinómák, amelyek esetében a vaszkuláris komponens biztosítja az oxigén- és tápanyagellátást. A találmány szerinti megoldással kezelhető szilárd tumorokra példaként említhetők a tüdő-, mell-, petefészek-, gyomor-, hasnyálmirigy-, gége-, nyelőcső-, here-, máj-, fultőmirigy-, epetraktus-, vastagbél-, végbél-, méhnyak-, méh-, méhbelhártya-, vese-, hólyag-, prosztata- és pajzsmirigy-karcinóma, valamint a pikkelysejt-karcinóma, adenokarcinóma, kissejt-karcinóma, melanóma, glióma, neuroblasztóma és hasonló szilárd daganatok.
A találmány szerinti bispecifikus szer egyik kötőszakasza olyan komponens, amely a koaguláló szert a tumor helyére szállítja, vagyis a tumor helyén belül lokalizálja. A koaguláló szer kismértékben szélesebb körű szétosztása nem okoz olyan súlyos mellékhatásokat, mint a toxinoknál ismert mellékhatások, ezért a bispecifikus ligandum célba juttató elemének kevésbé szigorú követelményeket kell kielégíteni. A célba juttató szer ezért a tumorsejt valamely komponensére, a tumor érrendszer valamely komponensére, a tumorsejtekhez kötött vagy általában azokkal asszociált valamely komponensre, a tumor érrendszerhez vagy általában azzal asszociált valamely komponensre, a tumorextracelluláris mátrix vagy váz valamely komponensére, vagy a tumor érrendszeren belül található valamely sejttípusra irányul.
Az immunotoxinoknál megszokott nagyon pontos célba juttatás szigorúságát az is enyhíti, hogy a tumor érrendszere „protrombikus” állapotban van, ezért eleve hajlamos a koagulálódásra. Ez azt jelenti, hogy specifikus célba juttató eszközök alkalmazásával a tumor érrendszerén belüli koagulálódás jobban gyorsítható, mint a nem tumoros érrendszeren belüli koagulálódás. Ezért a specifikus célba juttatás inkább funkcionális jellemző és nem tisztán fizikai jellemző a célba juttató eszköz biológiai eloszlása vonatkozásában, és ezért nem lehetetlen, hogy a hasznos célba juttató szer nem korlátozódik teljes mértékben a tumorra, hanem a célba juttató ligandum, amely hatékonyan elősegíti a tumorspecifikus koagulálást, adagolás után a szervezetben máshol is megtalálható.
1. Tumorsejtcélpontok
A tumorban található rosszindulatú sejtek célba vehetők olyan bispecifikus ligandummal, amelynek egyik szakasza a tumorsejt viszonylag specifikus markereihez kötődik. A tumorsejthez történő kötődés az asszociált koaguláló szert a tumorban lokalizálja, és így specifikus koagulálást vált ki. Feltételezhető, hogy ez különösen hatékony megoldás a koagulálás gyorsítására, mivel a perivaszkuláris tumorsejtek könnyű hozzáférhetősége miatt a bispecifikus szer nagy valószínűséggel a véredényekhez legközelebb eső tumorsejtek környezetében koncentrálódik.
Sok úgynevezett „tumorantigén” ismert, amelyek közül valamennyi felhasználható célpontként a találmány szerinti megoldásban. A szilárd tumorral asszo11
HU 220 347 B ciált antigénekre több példát adunk meg az I. táblázatban. Az ilyen antigének elleni antitestek előállítása és alkalmazása szakember köteles tudása. Az I. táblázatban megadjuk az antitesteket is.
A megcélzott tumor azonosítására felhasználhatók 5 továbbá a tumorsejt jellemzői is a sejt által kifejezett antigén biokémiai tulajdonságai helyett. Ennek megfelelően, a II. táblázatban példaszerűen felsorolunk néhány olyan humán tumorsejtvonalat, amelyek a köz számára hozzáférhetők (például ATCC katalógus). 10
A II. táblázatban megadott információ csupán bemutató jellegű, a találmány szerinti megoldás alkalmazhatósága nem korlátozódik ezekre a példákra. Az évenként felújított ATCC katalógusból más megfelelő sejtvonalak is azonosíthatók. Emellett, ha egy adott sejttípusra van szükség, akkor az ilyen sejtek előállításának módszerei és/vagy az ezekhez felhasználható források szakember számára ismertek. A szakirodalomból ismertek az olyan analitikai módszerek, amelyekkel könnyen kiválaszthatók a célba vett tumorsejttípusnak megfelelő sejtek.
I. táblázat
Szilárd tumorok markerantigénjei és ezekre vonatkozó monoklonált antitestek
Tumor helye Antigén azonosítás/jellemző Monoklonális antitest Referencia
A: Nőgyógyászati GY ‘CA 125’>200 kD mucin GP OC 125 Kabawat és munkatársai, 1983; Szymendera, 1986
Petefészek 80 Kd GP OC 133 Masuko és munkatársai. Cancer Rés. 1984
Petefészek ‘SGA’ 360 Kd GP OMI de Krester és munkatársai, 1986
Petefészek nagy Μγ mucin Mo vl Miotti és munkatársai, Cancer Rés. 1985
Petefészek nagy Μγ mucin/glikolipid Mo v2 Miotti és munkatársai, Cancer Rés. 1985
Petefészek NS 3C2 Tsuji és munkatársai, Cancer Rés. 1985
Petefészek NS 4C7 Tsuji és munkatársai, Cancer Rés. 1985
Petefészek nagy Μγ mucin id3 Gangopadhyay és munkatársai, 1985
Petefészek nagy Μγ mucin DU-PAN-2 Lan és munkatársai, 1985
GY 7700 Kd GP F 36/22 Croghan és munkatársai, 1984
Petefészek ‘gp 68’ 48 Kd GP 4F7/7A10 Bhattacharya és munkatársai, 1984
GY 40,42 kD, GP OV-TL3 Poels és munkatársai, 1986
GY ‘TAG-72’ nagy Μγ mucin B72.3 Thor és munkatársai, 1986
Petefészek 300-400 Kd GP df3 Kufe és munkatársai, 1984
Petefészek 60 Kd GP 2C8/2F7 Bhattacharya és munkatársai, 1985
GY 105 Kd GP MF116 Mattes és munkatársai, 1984
Petefészek 38-40 kD GP M0vl8 Miotti és munkatársai, 1987
GY ‘CEA’180 KdGP CEA 11-H5 Wagener és munkatársai, 1984
Petefészek CA 19-9 vagy GICA CA 19-9(1116NS 19-9) Atkinson és munkatársai, 1982
Petefészek ‘PLAP’ 67 Kd GP H17-E2 McDicken és munkatársai, 1985
Petefészek 72 Kd 791T/36 Perkins és munkatársai, 1985
Petefészek 69 Kd PLAP ndog2 Sunderland és munkatársai, 1984
Petefészek ismeretlen Mr PLAP H317 Johnson és munkatársai, 1981
Petefészek p185HER2 4D5,3H4, 7C2,6E9, 2C4, 7F3, 2H11, 3E8, 5B8, 7D3, SB8 Shepard és munkatársai, 1991
Méh-petefészek HMFG-2 HMFG2 Epenetos és munkatársai, 1982
GY HMFG-2 3.14.A3 Bruchell és munkatársai, 1983
HU 220 347 Β
I. táblázat (folytatás)
Tumor helye Antigén azonosítás/jellemző Monoklonális antitest Referencia
B: Mell 330-450 Kd GP DF3 Hayes és munkatársai, 1985
NS NCRC-11 Ellis és munkatársai, 1984
37kD 3C6F9 Mandeville és munkatársai, 1987
NS MBE6 Teramoto és munkatársai, 1982
NS CLNH5 Glassy és munkatársai, 1983
47 Kd GP MAC 40/43 Kjeldsen és munkatársai, 1986
nagy Mr GP EMA Sloane és munkatársai, 1981
nagy Mr GP HMFG1 HFMG2 Arklie és munkatársai, 1981
NS 3.15.C3 Arklie és munkatársai, 1981
NS M3, M8, M24 Foster és munkatársai, 1982
l(Ma) vércsoport Ags M18 Foster és munkatársai, 1984
NS 67-D-ll Rasmussen és munkatársai, 1982
ösztrogénreceptor D547Sp, D75P3, H222 Kinsel és munkatársai, 1989
EGF-receptor Anti-EGF Sainsbury és munkatársai, 1985
Laminin receptor LR-3 Horan Hand és munkatársai, 1985
erbB-2pl85 TA1 Gusterson és munkatársai, 1988
NS H59 Hendlerés munkatársai, 1981
126 Kd GP 10-3D-2 Soule és munkatársai, 1983
NS HmABl,2 Imám és munkatársai 1984; Schlom és munkatársai, 1985
NS MBR1,2,3 Menard és munkatársai, 1983
95 Kd 27.17.1 Thompson és munkatársai, 1983
100 Kd 24.17.2 (3E1.2) Croghan és munkatársai, 1983
NS F36/22.M 7/10 5 Croghan és munkatársai, 1984
24 Kd Cll, G3,H7 Adams és munkatársai, 1983
90 Kd GP B6.2 Colcher és munkatársai, 1981
CEA& 180KdGP Bl.l Colcher és munkatársai, 1983
Vastagbél és hasnyálmirigy mucin, Ca 19-9-hez hasonló Cam 17.1 Imperial Cancer Research Technology MAb Listing
tej mucin mag fehéije SM3 Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
tej mucin mag fehérje SM4 Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
affinitás-tisztított tej mucin C-Mul (566) Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
pl85HER2 4D5, 3H4, 6C2, 6E9, 2C4, 7F3,2H11, 3E8, 5B8, 7D3, 5B8 Shepard és munkatársai, 1991
CA125>200 Kd GP OC 125 Kabawat és munkatársai, 1985
nagy Mr mucin/glikolipid M0v2 Miotti és munkatársai, 1985
nagy Mr mucin DU-PAN-2 Lan és munkatársai, 1984
‘gp48’ 48 Kd GP 4F7/7A,0 Bhattacharya és munkatársai, 1984
HU 220 347 Β
1. táblázat (folytatás)
Tumor helye Antigén azonosítás/jcllemző Monoklonális antitest Referencia
300-400 Kd GP df3 Kufe és munkatársai, 1984
‘TAG-72’ nagy Mr mucin B72-3 Thor és munkatársai, 1986
‘CEA’ 180 Kd GP cccccCEA 11 Wagener és munkatársai, 1984
‘PLAP’ 67 Kd GP H17-E2 McDicken és munkatársai, 1985
HMFG-2>400 Kd GP 3.14.A3 Burchell és munkatársai, 1983
NS FO23C5 Ríva és munkatársai, 1988
c. Vastagbél-végbél TAG-72 nagy Mr mucin B72.3 Colcher és munkatársai, 1987
GP37 (17-1A) 1083-17-1A Paul és munkatársai, 1986
felületi GP CO17-1A LoBuglio és munkatársai, 1988
CEA ZCE-025 Patt és munkatársai, 1988
CEA AB2 Griffin és munkatársai, 1988a
sejtfelületi AG HT-29-15 Cohn és munkatársai, 1987
kiválasztóhám 250-30.6 Leydem és munkatársai, 1986
felületi glikoprotein 44X14 Gallagher és munkatársai, 1986
NS A7 Takahashi és munkatársai, 1988
NS GA73.3 Munz és munkatársai, 1986
NS 791T/36 Farrans és munkatársai, 1982
sejtmembrán és citoplazma Ag 28A32 Smith és munkatársai, 1987
CEA és vindezin 28.19.8 Corvalen, 1987
gp72 X MMCO-791 Byers és munkatársai, 1987
nagy Mr mucin DU-PAN-2 Lan és munkatársai, 1985
nagy Mr mucin id3 Gangopadhyay és munkatársai, 1985
CEA 180 KdGP CEA 11-H5 Wagener és munkatársai, 1984
60 Kd GP 2C8/2F7 Bhattacharya és munkatársai, 1985
CA-19-9 (vagy GICA) CA-19-9 (1116NS 19-9) Atkinson és munkatársai, 1982
Lewis a PR5C5 Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
Lewis a PR4D2 Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
vastagbélnyálka PR4D1 Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
D: Melanoma p97a 4.1 Woodbury és munkatársai, 1980
p97a 8.2 M17 Brown és munkatársai, 1981a
p97b 96.5 Brown és munkatársai, 1981a
p97c 118.1, 133.2,(113.2) Brown és munkatársai, 1981a
p97c Lb Llo, R,o(R,9) Brown és munkatársai, 1981b
p97ő ^12 Brown és munkatársai, 1981b
p97e K5 Brown és munkatársai, 1981b
pl55 6.1 Loop és munkatársai, 1981
GD3 diszialogan-gliozid R24 Dippold és munkatársai, 1980
HU 220 347 Β
I. táblázat (folytatás)
Tumor helye Antigén azonosítás/jellemző Monoklonális antitest Referencia
p210, p60, p250 5.1 Loop és munkatársai, 1981
p280, p440 225.28S Wilson és munkatársai, 1981
GP 94, 75, 70 és 25 465.12S Wilson és munkatársai, 1981
P240-P250, P450 9.2.27 Reisfeld és munkatársai, 1982
100, 77, 75 Kd FII Chee és munkatársai, 1982
94 Kd 376.96S Imái és munkatársai, 1982
4 GP lánc 465.12S Imái és munkatársai 1981; Wilson és munkatársai, 1981
GP 74 15.75 Johnson és Reithmuller, 1982
GP 49 15.95 Johnson és Reithmuller, 1982
230 Kd Mel-14 Carrel és munkatársai, 1982
92 Kd Mel-12 Carrel és munkatársai, 1982
70 Kd Me3-TB7 Carrel és munkatársai, 1:387, 1982
HMW MAA, hasonló 9.2.27 AG-hez 225.28SD Kantor és munkatársai, 1982
HMW MAA, hasonló 9.2.27 AG-hez 763.24TS Kantor és munkatársai, 1982
GP95, hasonló 376.96S 465.12S-hez 705F6 Stuhlmiller és munkatársai, 1982
GP125 436910 Saxton és munkatársai, 1982
CD41 M148 Imperial Cancer Research Technology Mab Listing
E: Gasztrointesztinális traktus nagy Mr mucin ID3 Gangopadhyay és munkatársai, 1985
Hasnyálmirigy, gyomor
Epehólyag, hasnyálmirigy, gyomor nagy Mr mucin DU-PAN-2 Lan és munkatársai, 1985
Hasnyálmirigy NS OV-TL3 Poels és munkatársai, 1984
Hasnyálmirigy, gyomor, nyelőcső ‘TAG 72’ nagy Mr mucin B72.3 Thor és munkatársai, 1986
Gyomor ‘CEA’ 180KdGP CEA 11-H5 Wagener és munkatársai, 1984
Hasnyálmirigy HMFG-2>400 Kd GP 3.14.A3 Burchell és munkatársai, 1983
G. I. NS CCOLI Lemkin és munkatársai, 1984
Hasnyálmirigy, gyomor CA 19-9 (vagy CIGA) CA-19-9 (1116NS 19-9)ésCA50 Szymendera, 1986
Hasnyálmirigy CA125 GP OC125 Szymendera, 1986
F: Tüdő nem kissejt tüdőkarcinóma p185HER2 4D5, 3H4, 7C2, 6E9, 2C4, 7F3,2H11, 3E8, 5B8, 7D3, SB8 Shepard és munkatársai, 1991
nagy Mrmucin/glikolipid MOv2 Miotti és munkatársai, 1985
‘TAG 72’ nagy Mr mucin B72.3 Thor és munkatársai, 1986
nagy Mr mucin DU-PAN-2 Lan és munkatársai, 1985
‘CEA’ 180kDGP CEA 11-H5 Wagener és munkatársai, 1984
HU 220 347 Β
I. táblázat (folytatás)
Tumor helye Antigén azonosítás/jellemző Monoklonális antitest Referencia
Rosszindulatú glioma 85HG-22 sejtek citoplazmaantigénje MUC 8-22 Stavrou, 1990
sejtfelületi AG 85HG-63 sejtekből MUC2-63 Stavrou, 1990
sejtfelületi AG 86HG-39 sejtekből MUC 2-39 Stavrou, 1990
sejtfelületi AG 86HG-39 sejtekből MUC 7-39 Stavrou, 1990
G: Egyéb p53 PAb 240, PAb 246, PAb 1801 Imperial Cancer Research Technology MaB Listing
Kis kerek sejttumor Idegsejt adhéziós molekula ERIC.l Imperial Cancer Research Technology MaB Listing
Medulloblasztoma, neuroblasztoma, rabdomioszarkóma M148 Imperail Cancer Research Technology MaB Listing
Neuroblasztoma FMH25 Imperial Cancer Research Technology MaB Listing
Veserák és glioblasztoma pl55 6.1 Loop és munkatársai, 1981
Hólyag és gégerák “Ca Antigén” 350-390 kD CA1 Ashall és munkatársai, 1982
Neuroblasztoma GD2 3F8 Cheung és munkatársai, 1986
Prosztata gp48 48 kD GP 4F7/7A|0 Bhattacharya és munkatársai, 1984
Prosztata 60 kD GP 2C8/2F7 Bhattacharya és munkatársai, 1985
Pajzsmirigy ‘CEA’ 180 kDGP CEA11-H5 Wagener és munkatársai, 1984
Rövidítések:
Abs = antitestek
Ags = antigének
EGF = epidermális növekedési faktor
GI gasztrointesztinális traktus
GICA = gasztrointesztinális traktushoz asszociált antigén
GP = glikoprotein
GY = nőgyógyászati
HMFG = humán tej-zsír globulin
Kd = kilodalton
Mabs = monoklonális antitestek
Mr = móltömeg
NS = nincs meghatározva
PLAP = méhlepény lúgos foszfatáz
TAG = tumorral asszociált glikoprotein
CEA = karcinoembriogén antigén.
Megjegyzések:
a CA 19-9 Ag (GICA) jelentése szialozil-fiikozil-laktotetraozil-ceramid, vagy más néven szililezett Lewis pentaglikozil-ceramid vagy szililezett lakto-N-fukopentaóz II;
a p97 Ags a feltételezések szerint kondroitin-szul40 fát-proteoglikán;
az Mab 9.2.27 antitesttel reakcióképes antigén feltehetően kondroitin-szulfát-proteoglikánnal asszociált szililezett glikoprotein;
ellenkező értelmű megjelölés hiányában Gy jelenté45 se lehet méhnyak, méhnyakbelhártya, méhbelhártya, petefészek, petefészek- vagy hüvelyrák vagy vegyes Mullerian-tumor;
ellenkező értelmű megjelölés hiányában GI jelentése lehet máj-, vékonybél-, lép-, hasnyálmirigy-, gyomor-és nyelőcsőrák.
11. táblázat
Humán tumorsejtvonalak és források
ATCC HBT szám Sejtvonal Tumortípus
1. J82 átmenetisejt-karcinóma, hólyag
2. RT4 átmenetisejt-papilloma, hólyag
3. ScaBER pikkelyes karcinóma, hólyag
HU 220 347 Β
II. táblázat (folytatás)
ATCC HBT szám Sejtvonal Tumortípus
4. T24 átmenetisejt-karcinóma, hólyag
5. TCCSUP átmenetisejt-karcinóma, hólyag, primer, IV fokozat
9. 5637 karcinóma, hólyag, primer
10. SK-N-MC neuroblasztoma, szemgödör feletti területre történő áttétellel
11. SK-N-SH neuroblasztoma, csontvelő áttétellel
12. SW 1088 asztrocitoma
13. SW 1783 asztrocitoma
14. U-87 MG glioblasztoma, asztrocitoma, III fokozat
15. U-118MG glioblasztoma
16. U-138MG glioblasztoma
17. U-373 MG glioblasztoma, asztrocitoma, III fokozat
18. Y79 retinoblasztoma
19. BT-20 karcinóma, mell
20. BT-474 vezetékes karcinóma, mell
22. MCF7 mell adenokarcinóma, mellűri folyadékgyülem
23. MDA-MB-134-VI mell, vezetékes karcinóma, mellűri folyadékgyülem
24. MDA-MD-157 mell medulla, karcinóma, mellűn folyadékgyülem
25. MDA-MD-175-VII mell, vezetékes, karcinóma, mellűri folyadékgyülem
27. MDA-MB-361 adenokarcinóma, mell, áttétel az agyba
30. SK-BR-3 adenokarcinóma, mell, rosszindulatú mellűri folyadékgyülem
31. C-33 A karcinóma, méhnyak
32. HT-3 karcinóma, méhnyak, áttétel a nyirokcsomókra
33. ME-180 epidermoid karcinóma, méhnyak, áttétel a csepleszre
34. MS751 epidermoid karcinóma, méhnyak, áttétel a nyirokcsomókra
35. SiHa pikkelyes karcinóma, méhnyak
36. JEG-3 koriokarcinóma
37. Caco-2 adenokarcinóma, vastagbél
38. HT-29 adenokarcinóma, vastagbél, közepesen diferenciált II fokozat
39. SK-CO-1 adenokarcinóma, vastagbél, ascites
40. HuTu 80 adenokarcinóma, nyombél
41. A-253 epidermoid karcinóma, állcsont alatti mirigy
43. FaDu pikkelyes sejtkarcinóma, garat
44. A-498 karcinóma, vese
45. A-704 adenokarcinóma, vese
46. Caki-1 tisztasejt-karcinóma, primer veseelem, áttétel bőrre
47. Caki-2 tisztasejt-karcinóma, primer veseelemmel
48. SK-NEP-2 Wilm-féle tumor, mellűri folyadékgyülem
49. SW 839 adenokarcinóma, vese
52. SK-HEP-1 adenokarcinóma, máj, ascites
53. A-427 karcinóma, tüdő
54. Calu-1 epidermoid karcinóma, III fokozat, tüdő, áttétel a mellüregbe
55. Calu-3 adenokarcinóma, tüdő, mellűri folyadékgyülem
56. Calu-6 anaplasztikus karcinóma, feltehetően tüdő
57. SK-LU-1 adenokarcinóma, gyengén megkülönböztetett tüdőelemmel, III fokozat
HU 220 347 Β
II. táblázat (folytatás)
ATCC HBT szám Sejtvonal Tumortípus
58. SK-MES-1 pikkelyes karcinóma, tüdő, mellűn folyadékgyülem
59. SW900 pikkelyes sejtkarcinóma, tüdő
60. EBI Burkitt-limfóma, felső állcsont
61. EB2 Burkitt-limfóma, petefészek
62. P3HR-1 Burkitt-limfóma, ascites
63. HT-144 rosszindulatú melamoma, áttétel a bőr alatti szövetekre
64. Malme-3M rosszindulatú melanoma, áttétel a tüdőre
66. RPMI-7951 rosszindulatú melanoma, áttétel a nyirokcsomókra
67. SK-MEL-1 rosszindulatú melanoma, áttétel a nyirokrendszerre
68. SK-MEL-2 rosszindulatú melanoma, áttétel a comb bőrére
69. SK-MEL-3 rosszindulatú melanoma, áttétel a nyirokcsomókra
70. SK-MEL-5 rosszindulatú melanoma, áttétel a hónaljmirigyre
71. SK-MEL-24 rosszindulatú melanoma, áttétel a mirigyekre
72. SK-MEL-28 rosszindulatú melanoma
73. SK-MEL-31 rosszindulatú melanoma
75. Caov-3 adenokarcinóma, petefészek, primer elemmel
76. Caov-4 adenokarcinóma, petefészek, áttétel a méhkürt alsó savóhártyájára
77. SK-OV-3 adenokarcinóma, petefészek, rosszindulatú ascites
78. SW 626 adenokarcinóma, petefészek
79. Cápán-1 adenokarcinóma, hasnyálmirigy, áttétel a májra
80. Capan-2 adenokarcinóma, hasnyálmirigy
81. DU 145 karcinóma, prosztata, áttétel az agyba
82. A-204 rabdimio szarkóma
85. Saos-2 csont eredetű szarkóma, primer
86. SK-ES-1 anaplasztikus oszteoszarkóma/Ewing-szarkóma, csont
88. SK-LMS-1 leiomioszarkóma, vulva, primer
91. SW 684 fibroszarkóma
92. SW 872 liposzarkóma
93. SW 982 hónalj szinoviális szarkóma
94. SW 1353 kondroszarkóma, felkarcsont
96. U-2 OS csont eredetű szarkóma, csont, primer
102. Malme-3 bőr fibroblaszt
103. KATÓ III gyomorkarcinóma
104. Cate-IB embrionális karcinóma, here, áttétel a nyirokcsomókra
105. Tera-1 embrionális karcinóma, rosszindulatú, áttétel tüdőre
106. Tera-2 embrionális karcinóma, rosszindulatú elemmel, áttétel a tüdőre
107. SW579 pajzsmirigy-karcinóma
111. AN3 CA endometriál adenokarcinóma, áttétel
112. HEC-l-A endometriál adenokarcinóma
113. HEC-l-B endometriál adenokarcinóma
114. SK-UT-1 méh, vegyes mezodermális tumor, III fokozatú leiomioszarkóma elemmel
115. SK-UT-1B méh, mezodermális tumorral vegyes, III fokozatú leiomioszarkóma elemmel
117. SW 954 pikkelyes sejtkarcinóma, vulva
HU 220 347 Β
II. táblázat (folytatás)
ATCC HBT szám Sejtvonal Tumortipus
118. SW 962 karcinóma, vulva, áttétel nyirokcsomókra
119. NCI-H69 kissejt-karcinóma, tüdő
120. NCI-H128 kissejt-karcinóma, tüdő
121. BT-483 vezetékes karcinóma, mell
122. BT-549 vezetékes karcinóma, mell
123. DU4475 áttételes bőrcsomó, mellkarcinóma
124. HBL-100 mell
125. Hs 578Bst mell, normál
126. Hs 578T vezetékes karcinóma, mell
127. MDA-MB-330 karcinóma, mell
128. MDA-MB-415 adenokarcinóma, mell
129. MDA-MB-435S vezetékes karcinóma, mell
130. MDA-MB-436 adenokarcinóma, mell
131. MDA-MB-453 karcinóma, mell
132. MDA-MB-468 adenokarcinóma, mell
133. T-47D vezetékes karcinóma, mell, mellűri folyadékgyülem
134. Hs 766T karcinóma, hasnyálmirigy, áttétel nyirokcsomókra
135. Hs 746T karcinóma, gyomor, áttétel bal lábra
137. Hs 695T amelanotikus melanoma, áttétel a nyirokcsomókra
138. Hs 683 glioma
140. Hs 294T melanoma, áttétel nyirokcsomókra
142. Hs 602 limfóma, nyak
144. JÁR koriokarcinóma, méhlepény
146. Hs 445 limfoid, Hodgkin-betegség
147. Hs 700T adenokarcinóma, áttétel medencére
148. H4 neuroglioma, agy
151. Hs 696 adenokarcinóma, primer, ismeretlen, áttétel keresztcsontra
152. Hs913T fibroszarkóma, áttétel tüdőre
153. Hs 729 rabdomioszarkóma, bal láb
157. FHs 738Lu tüdő, normál méhmagzat
158. FHs 173We teljes embrió, normál
160. FHs 738B1 hólyag, normál méhmagzat
161. NIH: OVCAR-3 petefészek, adenokarcinóma
163. Hs 67 csecsemőmirigy, normál
166. RD-ES Ewing-szarkóma
168. ChaGo K-l bronchogén karcinóma, bőr alatti áttétel, humán
169. WERI-Rb-1 retinoblasztóma
171. NCI-H446 kissejt-karcinóma, tüdő
172. NCI-H209 kissejt-karcinóma, tüdő
173. NCI-H146 kissejt-karcinóma, tüdő
174. NCI-H441 papilláris adenokarcinóma, tüdő
175. NCI-H82 kissejt-karcinóma, tüdő
176. H9 T-sejt-limfóma
177. NCI-H460 nagysejt-karcinóma, tüdő
178. NCI-H596 adenopikkelyes karcinóma, tüdő
HU 220 347 Β
11. táblázat (folytatás)
ATCC HBT szám Sejtvonal Tumortípus
179. NCI-H676B adenokarcinóma, tüdő
180. NCI-H345 kissejt-karcinóma, tüdő
181. NCI-H820 papilláris adenokarcinóma, tüdő
182. NCI-H520 pikkelyes sejtkarcinóma, tüdő
183. NCI-H661 nagysejt-karcinóma, tüdő
184. NCI-H510A kissejt-karcinóma, tüdőn kívüli eredet, áttétel
185. D283 Med medulloblasztoma
186. Daoy medulloblasztoma
187. D341 Med medulloblasztoma
188. AML-193 akut monocitás leukémia
189. MV4-11 leukémia bifenotípus
a) Tumorsejt elleni antitestek
Egy tumorantigén felismerésének legegyszerűbb 20 módja egy olyan antitest alkalmazása, amely kötődési affinitást mutat az adott antigénre. Nagyszámú olyan antitest ismert, amelyek szilárd tumorantigének ellen vonatkoznak. Néhány használható tumor elleni antitestet sorol fel az I. táblázat. Szakember számára nyilván- 25 való, hogy az I. táblázatban megadott antitestek közül néhány nem rendelkezik megfelelő biokémiai tulajdonságokkal, vagy elegendő tumorspecifikussággal, és így terápiásán nem használható. Ilyen példa az MUC8-22, amely citoplazma-antigént ismer fel. Az ilyen antiteste- 30 két általában csak vizsgálatokhoz és modellrendszerekben használják.
Általánosságban elmondható, hogy a találmány értelmében ilyen szempontból alkalmazott antitest előnyösen olyan antigént ismer fel, amely a sejtfelületen 35 hozzáférhető, és amelyet a tumorsejt előnyösen vagy specifikusan fejez ki. Az ilyen antitestek előnyösen megfelelő affinitással rendelkeznek, amelynek értéke Kd<200 nmol/1, előnyösen Kd<100 nmol/1, és szignifikáns reakciót nem mutatnak az életfontosságú normál- 40 szövetekkel, így a szív, vese, agy, máj, csontvelő, vastagbél, mellkas, prosztata, pajzsmirigy, epehólyag, tüdő, mellékvese, izom, ideg, hasnyálmirigy, bőr vagy más életfontosságú szerv szöveteivel. A találmány célkitűzése szempontjából az alacsony reaktivitás vonatko- 45 zásában legfontosabb „életfontosságú” szövetek a szív, vese, központi és perifériás idegrendszer és máj szövetei. A szignifikáns reaktivitás kifejezés olyan antitestre vagy antitestfragmensre utal, a mely az adott szöveten az immunohisztokémia szokásos körülményei között al- 50 kalmazva nem okoz elszíneződést vagy a főként negatív sejtek között szétszóródott kevés pozitív sejttel elhanyagolható elszíneződést vált ki.
Az I. táblázatban felsorolt antitestek közül a találmány értelmében különösen előnyösen alkalmazhatók 55 azok, amelyek nagy szelektivitást mutatnak a szilárd tumorok vonatkozásában. Ilyenekre példaként említhetők a TAG 72 és HER-2 proto-onkogén fehérjékhez kötődő antitestek, ahol az említett fehérjék szelektíven fordulnak elő több mell-, tüdő- és vastagbél-végbélrák felüle- 60 tén (Thor és munkatársai idézett műve, 1986; Colcher és munkatársai idézett műve, 1987; Shepard és munkatárai idézett műve, 1991); az M0vl8 és OV-TL3 antitest és a tej mucin mag fehérjéhez és humán tej-zsír gömböcskéhez kötődő antitest (Miotti és munkatársai idézett műve, 1985; Burchell és munkatársai idézett műve, 1983); valamint a Mrmelanoma antigénhez kötődő 9.2.27 antitest (Reisfeld és munkatársai idézett műve, 1982). Előnyösek továbbá a folátkötő fehérje elleni antitestek, amely fehérje homogén módon kifejeződik szinte valamennyi petefészek-karcinómában; az erb csoportba tartozó onkogének elleni antitestek, amely onkogének nagy mennyiségben kifejeződnek a pikkelysejt-karcinómákban és a legtöbb gliomában; valamint a folyamatban lévő preklinikai és klinikai fejlesztések tárgyát képező antitestek.
A standard preklinikai vizsgálatok szerint klinikai célból különösen előnyösek a B3, KSI/4 CC49, 260F9, XMMCO-791, D612 és SM3 antitestek. A B3 antitest (US 5 242 813 számú irat; Brinkmann és munkatársai idézett műve, 1991) ATCC száma HB 10573; a KS1/4 antitestet az US 4 975 369 számú irat ismerteti; a D612 antitest (US 5 183 756 számú irat) ATCC száma HB 9796.
Egy tumorral asszociált célpont meghatározható a tumorsejt jellemzői alapján is, a sejt által kifejezett antigén biokémiai tulajdonságai helyett. Ennek megfelelően, a találmány értelmében alkalmazható minden olyan antitest, amely előnyösen kötődik valamely, II. táblázatban felsorolt tumorsejthez. Ezen belül előnyösek azok az antitestek, amelyek nagy affinitást mutatnak a tumorsejt vonatkozásában, és nem rendelkeznek szignifikáns reaktivitással az életfontosságú normálsejtek és -szövetek vonatkozásában.
A találmány értelmében ezért többféle módon előállítható az olyan antitest, amely felhasználható az ismertetett, célzott koaguláláshoz. Egy tumorsejtre specifikus antitest előállításához egy állatot egy tumorsejtantigént tartalmazó készítménnyel immunizálunk, majd szelektáljuk a megfelelő specifikussággal rendelkező antitesteket. Az immunizáló készítmény lehet az I. táblázatban felsorolt valamely antigén tisztított vagy rész20
HU 220 347 B legesen tisztított preparátuma, az I. táblázatban felsorolt valamely antigén vonatkozásában feldúsított membránpreparátum, a II. táblázatban felsorolt valamely sejt vagy a II. táblázatban felsorolt sejttípust tartalmazó sejtkeverék vagy populáció.
Az antitest eredetétől függetlenül a találmány humán kezelésben történő megvalósítása során előnyösen olyan antigént választunk ki, amit a klinikailag célba vett tumor kifejez. Ez megvalósítható egyszerű vizsgálatokkal, így egy tumorszövetminta, például sebészeti biopszia antigéntesztelésével vagy a keringő elszabadult („seb”) antigének vizsgálatával. Az ilyen vizsgálatokat a szokásos immunológiai vizsgálatokkal végezzük, amelyre példaként említhető az ELISA vizsgálat (enzimmel kapcsolt immunoszorbens vizsgálat), ahol hibridómabankból származó antitestek kötési affinitását a tumorral szemben vizsgáljuk. A megfelelő tumorszelektivitással és -affinitással rendelkező antitesteket szelektáljuk, és felhasználjuk a találmány szerinti bispecifikus antitestek előállításához.
A közismert keresztreaktivitás alapján feltételezhető, hogy a humán sejtekből nyert eredeti antigének mellett hasznos antitestek állíthatók elő állatokból, így egérből vagy főemlősből származó antigének felhasználásával végzett immunizálással is. A humán eredetű antigén előállítható humán tumorsejtvonalból vagy a kezelendő betegből vett biológiai mintából. A kezelendő tumornak megfelelő „testre szabott” antitestek előállítására szolgáló eljárások ismertek [Stevenson és munkatársai idézett műve (1990)], és a találmány szerinti megoldás megvalósításához felhasználható.
b) További tumorsejtcélpontok és kötöligandumok
Az antitestek mellett a koaguláló szemek a tumor helyére történő eljuttatásához más ligandumok is felhasználhatók a tumorsejtantigénhez történő kötődés alapján. Az olyan tumorantigénekre, amelyek nagy mennyiségben kifejezett receptorok (ösztrogénreceptor, EGFreceptor) vagy mutáns receptorok, célba juttató eszközként felhasználhatók a megfelelő ligandumok.
Az endotéliás sejtreceptor-ligandumokhoz analóg módon léteznek olyan komponensek, amelyek specifikusan és előnyösen kötődnek a tumorsejtekhez, így például, ha a tumorantigén egy nagy mennyiségben kifejezett receptor, akkor a tumorsejt egy specifikus ligandummal in vivő bevonható. A ligandum ilyenkor célba juttatható a ligandum elleni antitesttel vagy a receptor egyik formájával. Az ilyen típusú célba juttató szerekre speciális példaként említhetők az TIE-1 vagy TIE-2 ligandumokra vonatkozó antitestek, a 4 vértestecskefaktorra vonatkozó antitestek, és a leukocita adhéziós kötőfehéije.
2. Más betegségek célbavétele
Első kötőszakaszként alkalmazható továbbá olyan komponens, amely tumortól eltérő betegség környezetében specifikusan vagy előnyösen kifejeződő célmolekulához kötődik.
Az ilyen beteg sejtekkel asszociált célmolekulákra példaként említhető a psoriasisszal asszociált leukocita adhéziós molekula; a proliferatív diabetikus recehártya-betegséggel asszociált FGF; különböző betegségek aktivált endotéliumával asszociált 4 vértestecskefaktor;
és vaszkuláris proliferatív betegséggel asszociált VEGF. A fenti betegségekben szenvedő humán vagy állati beteg állapota javítható a betegség helyén specifikusan indukált koagulálással.
Az erekkel összefüggő patológiával rendelkező betegségek [Klagsbum és Folkman idézett műve (1990)] szintén kezelhetők a találmány szerinti bispecifikus ligandummal. A koagulálásnak a betegség helyén történő kiváltásához előnyösen érrendszeri endotéliás sejteket vagy a vázat célbavevő ligandumot használunk. Ebbe a körbe tartozik a BPH, diabetikus recehártyabetegség, érrendszeri újbóli beszűkülés, érrendszeri összenövés, AVM, agyhártyadaganat, vérérdaganat, neovaszkuláris glaukóma, reumás izületi gyulladás és psoriasis kezelése.
3. Betegséggel asszociált érrendszeri sejtek célbavétele
A találmány szerinti megoldásban célpontként alkalmazhatók az érrendszer sejtjei. Ilyen esetben a bispecifikus ligandum egyik kötőszakasza olyan hozzáférhető markerhez kötődik, amelyet előnyösen a betegséggel asszociált érrendszer endotéliás sejtjei fejeznek ki. A vaszkuláris markerek kihasználását az teszi lehetővé, hogy a beteg területen nagy mennyiségben találhatók vaszkuláris endotéliás sejtek, és a helyi abnormális fiziológiai folyamatok termékei. így például a tumor vaszkuláris endotéliás sejtek ki vannak téve a tumorsejteknek, és a tumorból származó termékeknek, amelyek megváltoztatják az endotéliás sejtek fenotípusos profilját.
Ismert, hogy a tumorsejtek tumorból származó termékeket szabadítanak fel, ilyenek a limfokinok, monokinok, telepstimuláló faktorok, növekedési faktorok és angiogén faktorok, amelyek hatnak a közeli vaszkuláris endotéliás sejtekre [Kandel és munkatársai idézett műve (1991); Folkman idézett műve (1985 a és b)] és citokinokra [Burrows és munkatársai idézett műve (1991); Ruco és munkatársai idézett műve (1990); Borden és munkatársai idézett műve (1990)]. A tumortermékek az endotéliás sejtekhez kötődnek, és szelektíven indukálják bizonyos molekulák kifejeződését. A tumorendotéliumra specifikus koaguláns találmány szerinti célba juttatásához ezeket az indukált molekulákat vesszük célba. A vaszkuláris endotéliás sejtek a tumorban harmincszor gyorsabban szaporodnak, mint a különböző normálszövetekben [Denekamp és munkatársai idézett műve (1982)], ami arra utal, hogy a szaporodással összefüggő jellemzők is felhasználhatók markerként a tumor vaszkuláris endotéliás sejtek vonatkozásában.
A találmány szerinti bispecifikus ligandum célba juttató komponenseként alkalmazható továbbá olyan komponens, amely viszonylag nagymértékű specifikusságot mutat a tumorérrendszerre. Ezek a célba juttató komponensek olyan anyagok, amelyek a tumorendotélium által kifejezett, de normál endotéliás sejtek felületén nem vagy kismértékben kifejeződő molekulákhoz kötődnek. Az ilyen specifikusság a szakember számára ismert immunomegfestési eljárásokkal könnyen mérhető.
Mint fent említettük, a találmány szerinti megoldás egyik előnye, hogy a szelektivitás nem olyan szigorú követelmény, mint az ismert eljárásoknál, elsősorban
HU 220 347 Β az immunotoxinokat alkalmazó eljárásoknál, mivel a koaguláló szer téves célbajuttatásából származó bármely mellékhatás minimális a toxinok téves célbajuttatásából származó mellékhatásokhoz képest.
Ezért általánosan kijelenthető, hogy a találmány szerinti bispecifikus ligandummal vagy antitesttel olyan molekulákat veszünk célba, amelyek nagyobb mértékben kifejeződnek a tumorérrendszerben, mint a normál endotéliás sejtekben.
a) Betegségek helyén előforduló vaszkuláris endotéliás sejtmarkerek
A betegség környezetében található érrendszer endotéliás sejtjeinek felületén előnyösen kifejeződő molekulákat természetes, betegséggel asszociált vaszkuláris endotéliás sejtmarkereknek nevezzük. Ez a kifejezés az egyszerűség kedvéért olyan endotéliás sejtkomponensekre vonatkozik, amelyek a fokozott vagy nem megfelelő érképződéssel vagy endotéliás sejtszaporodással járó betegségek során fejeződnek ki. Példaként említhetők az olyan tumor endotéliás sejtkomponensek, amelyek in situ a tumorból származó faktorok hatására fejeződnek ki. Ezeket a komponenseket természetes módon indukált tumor endotéliás sejtmarkereknek is nevezzük.
A tumor érrendszerében felhalmozódnak a VEGF/VPF (vaszkuláris endotéliás növekedési faktor/vaszkuláris permeabilitás faktor) és FGF (fibroblasztnövekedési faktor) csoportba tartozó komponensek. A megfelelő receptorok ezért potenciális célpontok a tumorérrendszer megtámadásához, így például ismert, hogy a VEGF-receptorok túl vannak vezérelve (upregulated) a tumor endotéliás sejteken a normálszövetek endotéliás sejtjeihez viszonyítva, és ez igaz mind embereknél, mind rágcsálóknál [Thieme és munkatársai idézett műve (1995)]. Ez feltehetően a hipoxia következménye, ami a tumor mikrokömyezetének egyik jellemzője [Leith és munkatársai idézett műve (1992)]. Az FGF-receptorok is háromszorosan túl vannak szabályozva a hipoxiás endotéliás sejteken, és ezért feltételezhető, hogy a tumorban is [Bicknell és Harris idézett műve (1992)].
Az endotéliás sejtek TGFp (transzformáló növekedési faktor β) receptora (endoglin) az osztódó sejteken van túlvezérelve, és így egy másik célpontként szolgál. Azt találtuk, hogy az endoglin túl van vezérelve az aktivált és osztódó HUVEC tenyészetben, és a humán szövetekben erősen kifejeződik a neovaszkularizáció helyén található endotéliás sejteken, ilyen sejtek találhatók a különböző szilárd tumorokban és a magzati méhlepényben. Ezzel ellentétben, a különböző, nem rosszindulatú felnőttszövetekben, így daganatképződés előtti sérülésekben található endotéliás sejtek nem vagy csak nagyon kevés endoglint tartalmaznak. Feltételezhető, hogy az endoglinkifejeződés összhangban van a mellkasban lejátszódó daganatképződési folyamatokkal, amit a TEC-4 és TEC-11 antitesteket alacsony szinten megkötő jóindulatú fibroadenoma és korai karcinóma, valamint a fenti antitesteket nagy szinten megkötő intraduktális karcinóma késői állapota és a szétterjedő karcinóma mutatja.
A természetes, betegséggel asszociált vaszkuláris endotéliás sejtmarkerekre további példaként említhető a
TIE, VCAM-1, p-szelektin, E-szelektin, a^3-integrin, pleiotropin és endoszialin, amelyek a találmány szerinti megoldással célba vehetők.
b) Citokinnal indukálható vaszkuláris endotéliás markerek
A beteg folyamatok jellegére támaszkodva, amelynek során a szervezeten belül gyakran alakul ki lokális diszfunkció, léteznek olyan módszerek, amelyekkel manipulálható a beteg hely, de ez nem érinti a többi szövetet. Ez különösen igaz a rosszindulatú és jóindulatú tumorokra, amelyek külön egységként léteznek a szervezeten belül, így például, a tumor manipulálható úgy, hogy olyan további markert termeljen, amely specifikus a tumor vaszkuláris endotéliás sejtekre. Ezek a módszerek általában utánozzák a szilárd tumorban lejátszódó természetes folyamatokat, és kiterjednek olyan jeladó szerek, így növekedési faktorok vagy citokinok lokális termelésére, amelyek a közeli érrendszer endotéliás sejtjeinek felületén bizonyos molekulák specifikus kifejeződését váltják ki.
Az olyan molekulákat, amelynek kifejeződése a betegség vagy tumor környezetében található érrendszer endotéliás sejtjeinek felületén mesterségesen indukálható, a továbbiakban indukálható endotéliás sejtmarkereknek, vagy közelebbről indukálható tumorendotéliás sejtmarkereknek nevezzük. Ez a kifejezés olyan markerekre vonatkozik, amelyek mesterségesen, például emberi beavatkozás hatására indukálódnak, és az indukció nem képezi a betegség vagy tumor kifejlődésének részét. Az indukálható marker kifejezést a találmány szerinti megoldással összefüggésben alkalmazzuk, nem feledve azt a tényt, hogy a természetes markereket is indukálják, például tumorból származó szerek.
Ismertek olyan módszerek, amelyekkel kiváltható a vaszkuláris endotéliális antigén célpontok szelektív megjelenése a betegséggel asszociált érrendszer felületén. Ezek a módszerek nem szükségesek a találmány megvalósításához, de előnyösek lehetnek. Az említett módszerekkel manipuláljuk az antigén kifejeződését, vagy a sejt felületén történő megjelenését, és így a célba vett antigént kifejezzük vagy hozzáférhetővé tesszük a betegséggel asszociált érrendszer felületén, de ez a normál endotélium felületén nem vagy legfeljebb kisebb mértékben következik be.
A tumor endotéliás markerek indukálhatok a tumorból származó citokinnal [Burrows és munkatársai idézett műve (1991); Ruco és munkatársai idézett műve (1990)] és angiogén faktorokkal [Mignatti és munkatársai idézett műve (1991)]. A tumorendotéliumban specifikusan indukálható és a találmány szerinti bispecifikus koaguláló ligandummal célbavehető sejtfelületi markerek példáit a III. táblázatban adjuk meg [Bevilacqua és munkatársai idézett műve (1987); Dustin és munkatársai idézett műve (1986); Osbom és munkatársai idézett műve (1989); Collins és munkatársai idézett műve (1984)].
A III. táblázatban megadjuk továbbá az adott marker indukálásának mechanizmusát, az indukálószert, az intermedier citokint, így IL—1 és IFN-γ komponenseket, a leukocita sejttípust, és az asszociált citokinakti22
HU 220 347 Β citokin felszabadulását. A specifikus marker indukálásához általában egy bispecifikus „citokinindukáló” vagy „antigénindukáló” antitestre van szükség. Ez az antitest szelektíven kiváltja a megfelelő citokin felszabadulását a tumor környezetében, és így szelektíven indukálja a ki- 5 vánt célantigén vaszkuláris endotéliás sejtek által történő kifejeződését. A bispecifikus antitest összekapcsolja a tumor sejtjeit és a citokintermelő leukocitákat, és így a leukocitákat citokin termelésére készteti.
Az ilyen bispecifikus antitestek előállítása során abból a tényből indulunk ki, hogy a CD3, CD14, CD16 és
CD28 felismerésére alkalmas és keresztkötéseket kialakító antitestekről korábban kimutatták, hogy a második antigénnel történő összekapcsolódással szelektíven kiváltja a citokin termelését [Quian és munkatársai idézett műve (1991)]. A találmány szerinti megoldásban a citokin felszabadulása a tumor környezetére korlátozódik, mivel csak a tumorsejttel sikeresen összekapcsolódott leukocitákat aktiváljuk a citokin termelése érdekében. Ennek következtében a kívánt marker, így E10 szelektin kifejeződése szintén a tumorérrendszer endotéliumára korlátozódik.
III. táblázat
Lehetséges indukálható vaszkuláris célpontok
Indukálható endotéliás sejtmolekula Név Altípus/Felvett név (molekulacsalád) Indukáló citokin Citokint termelő leukocita A monoklonális antitesttel összekötve a sejtet citokin termelésére ösztönző leukocitamolekula
Endotéliás leukocita adhéziós molekula-1 ELAM-1 (E-szelektin) (Szelektin) IL-1, TNF-a, (TNF-β) (bakteriális endotoxin) monocita CD14
makrofág CD14
hízósejt IgE-re vonatkozó FcR
Vaszkuláris sejt adhéziós molekula-1 VCAM-1 Indukálható sejt adhéziós molekula110 (INCAM-110) (Immunoglobulin család) (bakteriális endotoxin) IL-1, TNF-a monocita CD 14
makrofág CD14
hízósejt IgE-re vonatkozó FcR
TNF-a, IL-4 helper-T- sejt CD2, CD3, CD28
TNF NK-sejt IgG-re vonatkozó FcR (CD 16)
Intercelluláris adhéziós molekula-1 ICAM-1 (Immunoglobulin család) IL-1, TNF-a (bakteriális endotoxin) monocita CD14
makrofág CD15
hízósejt IgE-re vonatkozó FcR
TNF-β, IFN-γ helper-T- sejt CD2, CD3, CD28
NK-sejt IgG-re vonatkozó FcR (CD 16)
Leukocita adhéziós molekula-1-re vonatkozó szer LAM-1 szer MEL-14 szer (egér) IL-1, TNF-a (bakteriális endotoxin) monocita CD14
makrofág ' CD14
hízósejt IgE-re vonatkozó FcR
II csoportbeli fő hisztokompatibilitás komplex antigén MHC, II csoport HLA-DR HLA-DP humán HLA-DQ I-A egér I-E IFN-γ helper-T- sejt CD2, CD3, CD28
NK-sejt IgG-re vonatkozó FcR (CD 16)
HU 220 347 Β
Megjegyezzük, hogy a III. táblázatban felsorolt lehetséges indukálható markerek közül klinikai megvalósításhoz az E-szelektin és az MHC II csoportba tartozó antigének, így a HLA-DR, HLA-DP és HLA-DQ [Collins és munkatársai idézett műve (1984)] alkalmazhatók a legjobban. A III. táblázatban szereplő többi adhéziós molekula különböző mértékben kifejeződik a normálszövetekben, általában a limfoid szervekben, és az endotéliumon, ezért feltehetően csak állati modellekben és olyan esetekben alkalmazható, amikor a normálszövetekben történő kifejeződés jelentős mellékhatás nélkül gátolható. Előnyösen alkalmazható az E-szelektin vagy az MHC II csoportba tartozó antigén, mivel ezek az antigének fejeződnek ki tumorral asszociált endotéliumban a legszelektívebb módon.
E-szelektin
Az indukció a legjobban olyan antigén célbavételével váltható ki, amely nem fejeződik ki a normálendotélium felületén. Az E-szelektin olyan adhéziós molekula, amely normálendotéliás érrendszeren, vagy más humán sejttípusban nem fejeződik ki [Cotran és munkatársai idézett műve (1986)], de az endotéliás sejtek felületén citokinokkal, így IL— 1, TNF, limfotoxin és bakteriális endotoxin segítségével indukálható [Bevilacqua és munkatársai idézett műve (1987)]. Nem indukálja az IFN-γ [Wu és munkatársai idézett műve (1990)]. Az Eszelektin kifejeződése szelektíven indukálható a tumorendotéliumban, ha egy ilyen citokint szelektíven eljuttatunk a tumor környezetébe, vagy olyan készítményt alkalmazunk, amely kiváltja az ilyen citokin szelektív felszabadulását a tumor környezetében.
A bispecifíkus antitestek például olyan készítmények, amelyek felhasználhatók egy vagy több fent említett, vagy más megfelelő citokin szelektív felszabadítására a tumor helyén, de nem a szervezet más részein. Az ilyen bispecifíkus antitesteket antigénindukáló antitestnek nevezzük, és ezek természetesen eltérnek a célba juttató komponensből és koaguláló komponensből álló találmány szerinti bispciftkus antitestektől. Az antigénindukáló antitest feladata, hogy a citokin effektorsejtet, például a monocita/makrofág vonalba tartozó sejtet, T-sejtet és/vagy NK-sejtet vagy hízósejtet a célba vett szilárd tumor tumorsejtjeihez kösse. Az összekötés hatására felszabadul a citokin, amely a kapcsolat helyére, vagyis a tumor helyére lokalizálódik.
A hatékony antigénindukáló antitest egyrészt egy kiválasztott tumorsejt felületi antigént (lásd az I. táblázatot), másrészt egy kiválasztott „citokinaktiváló” antigént ismer fel a kiválasztott leukocita sejttípus felületén. A citokinaktiváló antigén kifejezés olyan ismert, leukociták felületén található molekulát jelent, amely az effektormolekulához, így egy antitesthez vagy annak fragmenséhez, vagy természetes eredetű szerhez vagy annak szintetikus analógjához, például oldható faktorhoz vagy egy másik sejten található membránhoz kötött ellenreceptorhoz kötődve elősegíti a leukocita sejt citokintermelését. A citokinaktiváló molekulákra példaként említhető a CD 14 (LPS receptor), IgEre vonatkozó FcR, amely aktiválja az IL— 1 és TNFa felszabadítását, valamint a CD16, CD2, CD3 vagy
CD28, amelyek aktiválják az IFNy és TNF0 felszabadulását.
Egy tumort hordozó állat vérkeringésébe bejuttatva az ilyen antigénindukáló bispecifíkus antitest a tumoron belül a tumorsejtekhez kötődik, a tumorsejteket hozzáköti az effektorsejtekhez, például a tumorba beszűrődő monocita/makrofág sejtekhez, és ezután kiváltja a citokin szelektív felszabadulását a tumorba. Fontos azonban, hogy a tumor és a leukocita összekapcsolása nélkül az antigénindukáló antitest nem váltja ki a citokin felszabadulását. Ezért a citokinfelszabadulás nem következik be a test tumortól távolabbi részein, és ezért a citokin által indukált molekula, például E-szelektin kifejeződése csak a tumorendotéliumon belül játszódik le.
Számos olyan citokinaktiváló antigén ismert, amelyek megfelelő bispecifíkus antitesttel összekapcsolva a megkötött leukocitában kiváltják a citokin felszabadulását. Ebből a szempontból előnyösen alkalmazható a CD 14, amely monociták és makrofágok felületén található. A CD14 megkötése után a monocitákban és makrofágokban stimulálja az IL-1 felszabadulását [Schutt és munkatársai idézett műve (1988); Chen és munkatársai idézett műve (1990)], és feltehetően más citokinok felszabadulását, amelyek viszont stimulálják az E-szelektin megjelenését a közeli érrendszerben. Az E-szelektin indukálásához szükséges kötés kialakításához felhasználható továbbá az IgE-re vonatkozó FcR, amely a hízósejteken található; az IgG-re vonatkozó FcR (CD 16), amely az NK-sejteken található; valamint a CD2, CD3 vagy CD28, amelyek a T-sejtek felületén találhatók. Ezek közül általában előnyösebb a CD14, mivel a szilárd tumorba történő beszűrődés következtében viszonylag nagyobb valószínűséggel találhatók monociták és makrofágok, mint más leukocita sejttípusok.
Ha egy szilárd tumort hordozó állatnak például bispecifíkus (Fab’-Fab’) anti-D14/antitumor antitestet (például anti-CEA 9.2.27 antitest az OV-TL3 nagy Mr melanoma antigén ellen vagy MOv 18 antitest petefészekkel asszociált antigén ellen) fecskendezünk be, akkor az antitest a tumorra vonatkozó kötődési aktivitás következtében a tumorban lokalizálódik, majd a tumorban a CD14 antigének megkötésével aktiválja a monocitákat és makrofágokat [Schutt és munkatársai idézett műve (1988); Chen és munkatársai idézett műve (1990)]. Az aktivált monociták és makrofágok tumor elleni hatással rendelkeznek [Pallérom és munkatársai idézett műve (1991)], és felszabadítják az IL-1 és TNF-molekulákat, amelyek gyorsan E-szelektin antigéneket indukálnak a tumorérrendszer endotéliás sejtjein [Bevilacqua és munkatársai idézett műve (1987); Pober és munkatársai idézett műve (1991)].
II csoportbeli MHC antigének
A. találmány szerint alkalmazható indukálható markerek másik előnyös csoportját képezik a II csoportba tartozó MHC antigének [Collins és munkatársai idézett műve (1984)], így a HLA-DR, HLA-DP és HLA-DQ. A II csoportba tartozó antigének a vaszkuláris endotéliás sejteken több faj, így az ember legtöbb normálszövetében kifejeződnek. Az in vitro vizsgálatok [Collins és munkatársai idézett műve (1984); Daar és munkatár24
HU 220 347 Β sai idézett műve (1984); O’Connell és munkatársai idézett műve (1990)] és az in vivő vizsgálatok [Groenewegen és munkatársai idézett műve (1985)] kimutatták, hogy a II csoportba tartozó antigének vaszkuláris endotéliás sejtek által történő kifejezéséhez IFN-γ folyamatos jelenlétére van szükség, amit a TH1 sejtek, és kisebb mértékben az NK-sejtek és CD8+ T-sejtek szabadítanak fel.
A II csoportba tartozó MHC antigének nem korlátozódnak a vaszkuláris endotéliás sejtekre, hanem kifejeződnek a B-sejteken, aktivált T-sejteken, monocita/makrofág vonalhoz tartozó sejteken és bizonyos epitéliás sejteken mind egerekben [Hammerling idézett műve (1976)], mind emberben [Daar és munkatársai idézett műve (1984)]. Mivel a II csoportba tartozó MHC antigének normális endotéliumon is kifejeződnek, ezek célbavétele nem annyira egyenes, mind az E-szelektiné. A II csoportba tartozó MHC antigének indukciója és célbavétele megvalósítható azonban egy immunoszupresszáns, például Ciklosporin A (CsA) alkalmazásával, amelyek hatékonyan gátolják a II csoportba tartozó molekulák kifejeződését a normálszövetekben [Groenewegen és munkatársai idézett műve (1985)]. A CsA hatása azon alapszik, hogy megakadályozza a T-sejtek és NK-sejtek aktiválását [Groenewegen és munkatársai idézett műve (1985); DeFranco idézett műve (1991)], és így az IFN-γ alapszintjét olyan érték alá csökkenti, amely szükséges lenne a II csoportba tartozó molekulák endotéliumon történő kifejezéséhez.
A CsA mellett ciklosporinszármazékok, így Ciklosporin A, B, C, D és G is felhasználhatók, mivel immunoszupresszív hatással rendelkeznek, és elnyomják a II csoportba tartozó molekulák kifejeződését. Az alkalmazható szerekre további példaként említhető az FK506 és rapamicin.
Ez azt jelenti, hogy a II csoportba tartozó MHC antigének indukálása és célbavétele előtt a tumort hordozó állatot megfelelő dózisú CsA-val vagy más II csoportra vonatkozó immunoszupresszív szenei kell kezelni, amely hatékonyan elnyomja a II csoportba tartozó molekulák kifejeződését. A CsA esetében a hatékony dózis általában mintegy 10-30 mg/kg testtömeg. A normálszövetekben történő elnyomás után II csoportba tartozó antigén szelektíven indukálható a tumorendotéliumban egy bispecifikus antitest segítségével.
Ebben az esetben olyan antigénindukáló bispecifikus antitestet kell alkalmazni, amely specifikus a tumorsejtmarkerre, és az effektorsejt felületén található aktiváló antigénre, amely képes az IFN-γ termelésének indukálására. Ilyen effektorsejt például a helper-T-sejt (TH) vagy természetes killersejt (NK). Ennél a megvalósítási módnál CD 16 alkalmazása esetén szükség van arra, hogy T-sejtek vagy NK-sejtek legyenek jelen a tumorban, és olyan citokinintermediert termeljenek, amelyben a II csoportba tartozó antigén kifejeződése IFN-γ hatására bekövetkezik, de nem játszódik le más citokinokban. Ehhez citokinaktiváló antigénként CD2-t, CD3-t vagy CD28-at, előnyösen CD28-at használhatunk.
A tumorban azokat a T-sejteket kell aktiválni, amelyek az érrendszer szomszédságában találhatók, mivel ez az a terület, amit a sejtek a legjobban elérhetnek, és ahol a bispecifikus antitest koncentrálódik. Az aktivált T-sejt ezután IFN-γ-ί választ ki, amely a szomszédos tumorérrendszeren indukálja a II csoportba tartozó antigént.
Ebben az esetben előnyösen alkalmazható az olyan bispecifikus (Fab’-Fab’) antitest, amelynek egyik karja egy tumorantigén ellen, másik kaqa CD28 ellen irányul. Az ilyen antitest a CD28 antigént a tumorban található T-sejtekhez köti, és egy második jellel (például a tumorsejtek által általában kiválasztott IL-1 által termelt jellel [Burrows és munkatársai idézett műve (1991); Ruco és munkatársai idézett műve (1990)] a Tsejteket CA2+-tól független CsA-val nem gátolható módon aktiválja (Hess és munkatársai idézett műve (1991); June és munkatársai idézett műve (1987); Bjomdahl és munkatársai idézett műve (1989)].
A különböző citokinaktiváló molekulák elleni antitestek előállítása ismert. Több laboratóriumban előállították például a citokinok leukociták által történő termelését indukáló anti-CD14 és anti-CD28 monoklonális antitesteket [Schutt és munkatársai idézett műve (1988); Chen és munkatársai idézett műve (1990); June és munkatársai idézett műve (1990)]. Ismert továbbá az olyan monoklonális antitestek előállítása, amelyek a citokinok leukociták által történő felszabadítását más mechanizmuson keresztül vagy más aktiváló antigéneken keresztül stimulálja [Clark és munkatársai idézett műve (1986); Geppert és munkatársai idézett műve (1990)].
Egy másik megvalósítási mód során alternatív úton éljük el a II csoportba tartozó molekulák kifejeződésének elnyomását, és a II csoportba tartozó molekulák tumor környezetében történő szelektív kifejezését. Ennél a módszernél sem CsA-t, sem bispecifikus aktiváló antitestet nem használunk. A módszer azon alapszik, hogy a II csoportba tartozó molekulák kifejeződése hatékonyan gátolható, ha elnyomjuk a T-sejtek IFN-y-termelését, például anti-CD4 antitest segítségével [Street és munkatársai idézett műve (1989)]. Ennél a megoldásnál tehát az IFN-γ termelését anti-CD4 antitest adagolásával gátoljuk, amely általánosan elnyomja a II csoportba tartozó antigének kifejeződését. AII csoportba tartozó antigéneket ezután csak a tumor helyén indukáljuk, például tumorspecifikus T-sejtek alkalmazásával, amelyek aktiváló hatásukat csak a tumoron belül fejtik ki.
Ennél a megoldásnál a humán vagy állati beteget általában anti-CD4 antitesttel előkezeljük olyan dózisban, amely elnyomja az IFN-γ termelését, és így a II csoportba tartozó molekulák kifejeződését. A hatékony dózis általában mintegy 4-10 mg/kg testtömeg nagyságrendbe esik. A II csoportba tartozó molekulák kifejeződésének elnyomása után a véráramba IFN-γ-ί termelő T-sejtklónt (például Thl vagy citotoxikus T-limfocita (CTL) kiónt) juttatunk, amely az antigén kifejeződését specifikusan a tumorsejtek felületén váltja ki. Ezek a T-sejtek antigénfelismerő képességük következtében a tumor tömegében lokalizálódnak, és a felismerés hatására IFNγ-ί szabadítanak fel. így a citokinfelszabadulás ismét a tumorra korlátozódik, és II csoportba tartozó molekulák kifejeződése a tumor érrendszerére korlátozódik.
HU 220 347 Β
Az IFN-y-t termelő T-sejt-klón előállítható perifériás vérből [Mazzocchi és munkatársai idézett műve (1990)], vagy előnyösen a tumor tömegéből [Fox és munkatársai idézett műve (1990)]. Az ilyen T-sejt-klón előállítását előnyösen a betegből eltávolított tumorrészletből végezzük, amelynek során a sejteket izoláljuk, kívánt esetben kollagenázzal emésztjük, a tumorba beszűrődő leukocitákat sűrűséggradiens-centrifugálással feldúsítjuk, majd leukocitaülepítővel, például specifikus antitesttel és komplementjével elválasztjuk, és a tumorba beszűrődött leukocitákat in vitro elszaporítva IFN-y-t termelő kiónt állítunk elő. Ez a klón az eredetéből következően immunológiailag kompatibilis a beteggel, és ezáltal jól elviselhető.
Különösen előnyös eredmények érhetők el nagy IFN-y-termelő képességgel rendelkező T-sejt-klónok kiválasztásával, amelyhez az egyes kiónoknál 14 napon keresztül vizsgáljuk az expandált leukociták citokintermelő képességét. Ehhez a kiónokat mitogénnel vagy antigénnel stimuláljuk mintegy 24 órán keresztül, és a tenyészet felülúszóját például specifikus szendvics ELISA vizsgálattal [Cherwinski és munkatársai idézett műve (1989)] IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-5 és IL-10 jelenlétére vizsgáljuk. A nagy mennyiségben IL-2-t és IFNγ-t kiválasztó kiónokat, vagyis a jellemző citokinkiválasztó mintát mutató TH) kiónokat kiválasztjuk. A tumorspecifikusságot szaporodási vizsgálattal ellenőrizzük.
Anti-CD4 antitestként előnyösen alkalmazható az anti-CD4 Fab, mivel a szervezetből a befecskendezést követő 24 órán belül kiürül, és így nem nyomja el a később adagolt, tumort felismerő T-sejt-klónokat. A tumorra specifikus T-sejt-klónok előállítása ismert, példaként említhető a szilárd melanoma tumorba beszűrődő limfocitákból nyert T-sejt-klónok előállítása és jellemzése [Maeda és munkatársai idézett műve (1991)].
AII csoportba tartozó MHC antigének elnyomására és indukálására szolgáló módszerek valamelyikének alkalmazása esetén további előny származik abból a tényből, hogy az intravénásán befecskendezett anti-II csoportbeli antitestek a normál szervek közül csak a máj és lép esetében érik el az epitéliás sejteket vagy a monocita/makrofág sejteket. Ennek oka feltehetően az, hogy az érendotélium a legtöbb normál szervben tömör, és nem olyan lyukacsos, mint a májban és lépben, és ezért az antitesteknek alapmembránokon kell átdiffiindálni ahhoz, hogy elérjék a II csoportba tartozó antigénekre pozitív sejteket. Emellett, feltehetően a B-sejt-eliminálás, ami például a keresztkötés kialakulása következtében fordul elő, sem okoz jelentős problémát, mivel ezek a sejtek feltöltődnek a II csoportbeli antigénekre negatív elődöktől [Lowe és munkatársai idézett műve (1986)]. A B-sejtek pusztulása, ami B-limfómás betegeknél fordul elő, sem okoz nyilvánvaló károsodást [Vitetta és munkatársai idézett műve (1991)].
Összefoglalva megállapítható, hogy a találmány szerinti tumorkoaguláló készítmények és antitestek elegánsak egyszerűek, és működésükhöz nem igénylik antigének indukálását, a találmány azonban kiterjed az antigénindukáló bispecifikus antitestek kombinációjára is. Az ilyen antitesteket általában a találmány szerinti bispecifikus koaguláló ligandum előtt kell adagolni.
Általánosságban kijelenthető, hogy az erősebben „immunogén” tumor esetében nagyobb szükség van a II csoportba tartozó MHC antigének igénybevételére, például a tumorban található T-sejtek anti-CD28/antitumor bispecifikus antitest által történő megkötésével, mivel az ilyen tumorokba általában jobban beszűrődnek a T-sejtek, ami az ilyen módszer hatékonyságának feltétele. Az immunogén szilárd tumorokra példaként említhető a vesekarcinóma, melanoma, egyes mell- és vastagbélrákos megbetegedések, valamint esetlegesen a hasnyálmirigy-, gyomor-, máj-, tüdő- és gliatumor. Ezeket a tumorokat „immunogén” tumornak nevezik, mivel immunválaszt váltanak ki a gazdaszervezetben, és celluláris immunoterápiával kezelhetők [Yamaue és munkatársai idézett műve (1990)]. Melanoma és nagykiteijedésű bélrák esetében ilyen antitestként előnyösen alkalmazható a B72.3 antitest (antiTAG-72) és a PRSC5/PR4C2 antitest (anti-Lewis a) vagy 9.2.27 antitest (anti-nagy Mr melanoma antigén).
A legtöbb szilárd tumor esetében a tumor eredetétől függetlenül előnyösebb az anti-CD14 alkalmazása a makrofág/monocita intermedieren keresztül. Ennek oka, hogy a legtöbb tumor makrofágokban dús. A makrofágokban dús tumorokra példaként említhető a legtöbb mell-, bél- és tüdőkarcinóma. Ebben az esetben antitumor-antitestként előnyösen alkalmazható például az anti-HER-2, B72.3, SM-3, HMFG-2, SWA11 [Smith és munkatársai idézett műve (1989)].
c) Koaguláns által indukálható marker
A koagulánsok, így a trombin, IX/IXa faktor, X/Xa faktor, plazmin és metalloproteinázok, például szövetközi kollagenázok, stromelizinek és zselatinázok, működésük közben bizonyos markereket is indukálnak, így például az E-szelektin, P-szelektin, PDGF és ICAM-1 indukálását a trombin is kiváltja [Sugama és munkatársai idézett műve (1992); Shankar és munkatársai idézett műve (1994)].
Ezért a fenti indukcióhoz egy antikoaguláns/antitumor bispecifikus antitestet használunk. Az antitest a tumorhoz kötődő képessége miatt a tumorban lokalizálódik. A bispecifikus jelleg miatt a koaguláns, például a trombin a tumorban koncentrálódik, és a tumorérrendszer endotéliás sejtjeiben indukálja az E-szelektint és P-szelektint [Sugama és munkatársai idézett műve (1991); Shankar és munkatársai idézett műve (1994)].
Alternatív módon, ha csonkolt szövetfaktorral tumorsejteket vagy endotéliumot célzunk meg, akkor a trombin a tumoron belül rakódik le. A trombin lerakódása után a tumorérrendszer endotéliás sejtjeiben indukálódik az E-szelektin és P-szelektin.
d) Érrendszeri endotéliás sejtmarkerekre vonatkozó antitestek
Természetes környezete vagy mesterséges beavatkozás hatására indukálódott, betegséggel összefüggő érrendszeri célpont felismerésének legegyszerűbb eszköze az olyan antitest, amely kötési affinitással rendelkezik az adott sejtfelületi receptor, molekula vagy antigén vonatkozásában. Ezek lehetnek olyan antitestek, ame26
HU 220 347 B lyek a jelenleg ismert sejtfelületi komponensek, például tumorérrendszeri endotéliás sejtek felületén található komponensek ellen irányulnak, ahol a sejtfelületi komponensek tumorból származó faktorok hatására indukálódnak vagy fejeződnek ki, vagy emberi beavatkozás hatására indukálnak. A IV. és V. táblázatban felsorolunk néhány előnyösen alkalmazható antitestet és ezek tulajdonságait.
IV. táblázat
Humán tumorérrendszerre vonatkozó antitestek érrendszert elszínező képessége
Antitest Antigén Irodalom Megfestett tumortípusok (%) Megfestett tumoredények (%) Normál edényekkel szembeni reakcióképesség
anti-vWF VIII RAg 100 100 valamennyire erős
FB5 endoszialin Rettig és Old 30 10 20 nyirokszervek
TP3 80 kD oszteoszarkomával rokon antigénfehéije Bruland 50 10-30 kis BV-re erős
BC-1 fibronektin izoform Zardi 60 10-30 nincs
TV-1 fibronektin Epstein 100 100 valamennyire erős
LM 609 ανβε vitronektin receptor Cheneoh 85 70-80 valamennyire közepes
TEC 11 endoglin Thorpe 100 100 legtöbbre gyenge
TEC 110 VEGF Thorpe 100 100 legtöbbre gyenge
V. táblázat
Anti-EC monoklonális antitestek összehasonlítása
Tumor típusa n TEC 110 TEC 11 FB-5 TP-3 BC-1 TV-1 LM 609
Emésztőrendszer: gasztrointesztinális trak- 9 + + + + + + + + + + +
tus fültőmirigy 3 + + + + + + (kicsi) ND ND
Nemzőszervek: mell 1 + + + ND + + + +
petefészek 4 + + + + - + + (kicsi) + + + + +
méh 2 + + + + - + + + + +
Légzőszervek: tüdő 3 + + + + ND + + + + +
Nyirokmirigyek: Hodgkin 2 + + + + + + - + + +
ND - nincs adat
A találmány szerint alkalmazható két további antitestet ismertet Rettig és munkatársai idézett műve (1992), valamint Wang és munkatársai idézett műve (1993), amelyek humán tumorok érrendszerében kifejeződő, de a legtöbb normálszövetben nem kifejeződő ismerteden funkció nem rokon antigénjei ellen irányulnak.
Alkalmazható továbbá a Kim és munkatársai idézett művében (1993) ismertetett antitest, amely in vivő gátolja az érképződést és elnyomja a tumomövekedést.
Alkalmazhatók továbbá olyan antitestek, amelyekről korábban nem volt ismert, hogy humán tumorokra specifikusak, így például Venkateswaran és munkatársai idézett műve (1992) anti-FGF MAb előállítását ismerteti. Xu és munkatársai idézett műve (1992) 16 izoform és doménspecifikus poliklonális és monoklonális antitest kifejlesztéséről és jellemzéséről számol be FGF-receptor (flg) izoformák ellen. Massoglia és munkatársai idézett műve (1987) szintén FGF elleni MAb-t ismertet.
e) Betegség érrendszerére vonatkozó antitestek előállítása
Ismert, például fent említett vagy más ismert és szakirodalomban publikált antitest alkalmazása mellett eljárhatunk úgy is, hogy a szokásos immunizáló eljárásokkal új antitestet állítunk elő. Ismert, betegséggel asszociált érrendszeri markerantigén elleni antitest előállításához egy állatot az antigént tartalmazó immunogén készítménnyel immunizálunk. Ez lehet olyan membránpreparátum, amely tartalmazza vagy feldúsítva tartalmazza az antigént; sejtekből vagy membránokból izolált, és relatív tiszta antigén; vagy különböző tisztítási lépésekkel nyert nagy tisztaságú antigén, például természetes antigénextraktum vagy rekombináns gazdasejtből nyert rekombináns antigén.
HU 220 347 Β
A találmány értelmében eljárhatunk úgy is, hogy egy antigént fejlesztünk ki a betegséggel asszociált érrendszer endotéliás sejtjein jelen lévő antigén ellen, amely megoldás akkor is alkalmazható, amikor az antigén biokémiai azonossága ismeretlen. Ebben az esetben például tumorérrendszeri endotéliás sejtek elleni antitestet generálunk. Ez megvalósítható úgy, hogy a tumorból érrendszeri endotéliás sejtpreparátumot állítunk elő. Egy kísérleti állatot egyszerűen ezzel a sejtpreparátummal immunizálunk, és a kapott antitesteket összegyűjtjük. Ennek során előnyösen úgy járunk el, hogy a specifikus antitesteket szétválogatjuk, például a szokásos hibridómatechnológiával, majd tumorérrendszeri endotéliás sejtek ellen vizsgáljuk.
A fenti módszer előnye, hogy in vitro utánozzuk a tumorérrendszer tulajdonságait, és nincs szükség sejttisztításra. A módszer alkalmazása során az endotéliás sejteket tumorból származó termékekkel kezeljük, amelyek tumorral kondicionált közegből sejttenyészetben könnyebben előállíthatok, mint állatban. A megoldás során az endotéliás sejteket általában tumorral kondicionált közeggel stimuláljuk, és a stimulált endotéliás sejteket immunogénként alkalmazzuk antitestek előállításához. A specifikus antitesteket itt is szétválogathatjuk, például a szokásos monoklonális antitest technológiával vagy más módszerekkel, például az immunizált állat lépéből előállított RNS-ből kapott kombinált immunoglobulin fágmid tár segítségével. Előnyösen olyan specifikus antitestet választunk ki, amely felismeri a tumorral stimulált vaszkuláris endotéliumot, és erősebben reagál tumorral asszociált endotéliás sejtekkel, mint a normál felnőtt humán szövetekkel.
Stimulált endotéliás sejtként alkalmazható például humán köldökvéna endotéliás sejt (HUVE), humán bőrhajszálér endotéliás sejt (HDEMC), humán véna-szaféna endotéliás sejt, humán cseplesz zsír endotéliás sejt, más humán hajszálér endotéliás sejt vagy humán agykapilláris endotéliás sejt. Más fajból származó endotéliás sejtek is felhasználhatók a tumorral kondicionált közeggel végzett stimuláláshoz, és antitestek hibridómán keresztül történő generálásához, vagyis tumorral stimulált humán érrendszeri endotéliás sejtekkel reakcióba lépő antitestek és/vagy preklinikai modellben alkalmazható antitestek előállításához.
A tumorral kondicionált közeg olyan tenyészközeget jelent, amely egy vagy több, tumorból származó citokint, limfokint vagy más effektormolekulát tartalmaz. A tumorral kondicionált közeget általában szelektált tumorsejtek növesztéséhez használt tenyészközegből állítjuk elő, és ezért ez nagy mennyiségben tartalmaz tumorból származó termékeket. A közeg típusa nem lényeges, amennyiben tartalmazza a szükséges tápanyagokat és elősegíti a tumorsejtek növekedését. Eljárhatunk úgy is, hogy a tumorral kondicionált közegből a megfelelő anyagokat kivonjuk és izoláljuk, és az endotéliás sejteket egy vagy több így előállított anyaggal kezeljük.
A közeg előállításához előnyösen olyan tumortípust alkalmazunk, amely utánozza a kezelendő vagy analizálandó tumort, így például, mellrák kezelésének előkészítéséhez előnyösen mellráksejteket, így ZR-75-1, T47D, SKBR3, MDA-MB-231 sejteket használunk. Kolorektál tumor esetében alkalmazható például HT29 karcinóma, valamint DLD-1, HCT116, SW48 vagy SW122. Tüdőrák esetében alkalmazható például NCI-H69, SW2, NCI H23, NCI H460, NCI H69 vagy NCI H82. Melanoma esetében alkalmazható például DX.3, A375, SKMEL-23, HMB-2, MJM, T8 vagy VUP. A fenti esetekben természetesen alkalmazhatók a kezelendő tumorból előállított sejtek, például biopsziából nyert sejtek is.
Előállítása után a tumorral kondicionált közeggel stimuláljuk a tumorendotéliumra specifikus markerek megjelenését az endotéliás sejtek felületén. Ehhez például szelektált endotéliás sejteket tumorral kondicionált közeg (vagy ilyenből nyert anyagok) jelenlétében tenyésztünk. Az endotéliás sejt típusa tetszőleges lehet, amennyiben általánosságban reprezentálja a kezelendő vagy diagnosztizálandó tumor érrendszerével asszociált endotéliumot. Különösen előnyösen alkalmazhatók a humán köldökvéna endotéliás sejtek (HUVE) vagy humán bőrhajszálér endotéliás sejtek (HDMEC) [Karasek idézett műve (1989)], mivel ezek a sejtek humán eredetűek, citokin növekedési faktorokkal és angiogén faktorokkal kezelhetők, és könnyen előállíthatok. A találmány szerinti megoldásban azonban minden olyan endotéliás sejt felhasználható, amely in vitro tenyészethető. Ilyenekre példaként említhető az EA-hy9-26 és ECV304 sejt, valamint a humán véna-szaféna endotéliás sejt.
A tumorból származó termékekkel történő stimulálás után az endotéliás sejteket immunogénként alkalmazzuk monoklonális antitestek (MAb) előállításához. A sejtfelületi markerantigén elleni MAb előállítása ismert, és a szokásos módszerekkel könnyen megvalósítható. Példaként említhető a Kohler és Mustéin idézett művében (1975) ismertetett eljárás.
Monoklonális antitestek stimulált endotéliás sejtek segítségével történő előállítása során előnyösen úgy járunk el, hogy humán tumorból származó sejteket vagy sejtvonalakat növesztünk egy szövettenyészetben legalább 4 napon keresztül. A szövettenyészet felülúszóját (tumorral kondicionált közeg) a tumorsejttenyészetről eltávolítjuk, és HUVEC tenyészetre visszük 50 tömeg% végső koncentrációban. A HUVEC tenyésztését 2 napon keresztül folytatjuk, majd nem enzimatikus módon betakarítjuk, és egerekbe intraperitoneálisan l-2xl06 sejtet fecskendezünk. A folyamatot kéthetes időközökben háromszor megismételjük, amikor is a végső immunizálást intravénásán végezzük. Három nap elteltével a lépsejteket begyűjtjük, és SP2/0 mielomasejtekkel fuzionáltatjuk a szokásos módon [Kohler és Milstein idézett műve (1975)], és a megfelelő reakcióképességgel rendelkező antitesteket termelő hibridómákat korlátozott hígítással klónozzuk.
A kapott hibridómagyűjteményből kívánt esetben egy vagy több olyan hibridóma szelektálható, amely az aktivált vaszkuláris endotélium és a nem aktivált vaszkuláris endotélium közül az aktivált vaszkuláris endotéliumot jobban felismerő antitestet termel. Előnyösen olyan antitesteket azonosítunk, amelyek a normál endotéliumhoz gyakorlatilag nulla kötődési affinitást mutat28
HU 220 347 Β nak. A technika állásával ellentétben azonban ez a tulajdonság a találmány szerinti megoldás vonatkozásában nem kritikus. A megfelelő antitestet termelő hibridómák azonosítása megvalósítható például ELISA, RIA, IRMA, IIF, vagy hasonló immuno-assay vizsgálatokkal, és így egy vagy több, tumorral aktivált endotéliás sejttípus elleni antitestet termelő hibridómákat kapunk. Azonosítás után kívánt esetben ellenőrizhetjük a nem aktivált vagy „normál” endotélium, vagy más normálszövet vagy sejttípus vonatkozásában mutatott reakcióképesség hiányát, így kizárhatjuk a túl erős normál reakcióképességgel rendelkező antitesteket termelő hibridómákat.
f) Antiendoglin antitestek
A fent ismertetett módszerrel a tumor vaszkuláris endotéliumra viszonylag nagy specifitással rendelkező antitesteket tudunk előállítani és izolálni. Az egyik megvalósítási mód szerint HT29 karcinómasejteket használunk a kondicionált közeg előállításához, amivel HUVE sejteket stimulálunk a tenyészetbe. A kapott HT29 sejtekkel aktivált HUVE sejteket ezután immunogénként használjuk hibridómabank előállításához. A hibridómabankból ELISA vizsgálattal és a humán tumor és normálszövetek metszeteinek immunohisztológiai analízisével a tumor vaszkuláris endotéliás sejt antigéneket felismerő antitesteket szelektálunk.
A fenti módszerrel állíthatók elő a 4 számú tumor endotéliás sejt antitestnek (TEC4) és 11 számú tumor endotéliás sejt antitestnek (TEC11) nevezett monoklonális antitestek. A TEC4 és TEC11 által felismer antigén az utólagos meghatározások szerint endoglinmolekula. A TEC4 és TECH által felismert endoglin epitópjai megtalálhatók a stimulált HUVE sejtek felületén, míg ezek az epitópok csak minimális mennyiségben (vagy immunológiailag hozzáférhető mennyiségben) vannak jelen a nem stimulált sejtek felületén. Az endoglin ellen már korábban fejlesztettek ki monoklonális antitesteket. A HUVEC vagy TCM-mel aktivált HUVEC sejtfelületi determinánsokkal szembeni reakcióképesség FACS vagy indirekt immunofluoreszcencia vizsgálattal történő analízise szerint a TEC4 és TECH által felismert epitópok eltérnek a korábban 44G4 antitestnek nevezett antitest [Gougos és Letarde idézett műve (1988)] által felismert epitópoktól.
A találmány szerinti megoldásban bármely ismert antiendoglin antitest [például Gougos és Letarte idézett műve (1988); Gougos és munkatársai idézett műve (1992); O’Connell és munkatársai idézett műve (1992); Bühring és munkatársai idézett műve (1991)] felhasználható, előnyösen azonban TEC4 vagy TECH monoklonális antitestet használunk. Ennek oka, hogy ezek az antitestek a kapilláris és venuláris endotéliás sejteket közepes-erős mértékben jelölik meg különböző szilárd tumorokban (és különböző krónikus-gyulladásos állapotokban és magzati méhlepényben), de viszonylag gyenge megfestést okoznak a normál- és egészséges felnőttszövetek edényeiben. Különösen előnyös a TECH, mivel gyakorlatilag reakciómentes a nem endotéliás sejtekre. Emellett, a TEC4 és TECH komplement fixáló antitestek, és ezért a tumor vaszkuláris ágyban potenciálisan indukálják az endotéliás sejtek szelektív roncsolását.
A TEC4 és TECH monoklonális antitestekkel keresztreakcióra képes antitestek, vagyis az endoglinhoz ugyanazon epitópon át kötődő antitestek szintén alkalmazhatók a találmány szerinti megoldásban. Az olyan antitest vagy antitestek azonosítása, amelyek az endoglinhoz ugyanazon epitópon keresztül kötődnek, mint a TEC4 vagy TECH, ismert eljárások. Megvalósítható az olyan immunológiai vizsgálatokkal, amelyek az antitestek versengését vizsgálja. így például a TEC4 vagy TECH antitestek forrásától eltérő forrásból nyert antitestek, például nyúl antitestek, vagy eltérő izotípusú antitestek, például IgGl vagy IgG3 vizsgálatához kompetitív ELISA vizsgálat ajánlható. A kompetitiv ELISA vizsgálat megvalósítható például úgy, hogy TEC4 vagy TECH antitestet különböző mennyiségű vizsgált antitesttel keverünk, majd a keveréket az ELISA-lemez antigénnel bevont mérőhelyeire visszük fel. Antiegér vagy anti-IgM szekunder antitesttel csak a megkötött TEC4 vagy TEC11 antitestek detektálhatok, és ezek kötődését csökkenti az olyan vizsgált antitest jelenléte, amely ugyanazt az epitópot ismeri fel, mint a TEC4 vagy TECH.
A TEC4 vagy TECH és egy vizsgált antitest közötti kompetitiv vizsgálat megvalósítható úgy is, hogy a TEC4 vagy TECH antitestet detektálható jellel, például biotinnal vagy enzimatikus vagy radioaktív jellel jelöljük meg, és így megkönnyítjük annak későbbi azonosítását. Ebben az esetben a jelölt antitestet a vizsgált antitesttel inkubáljuk különböző arányok (például 1:1, 1:10 és 1:100) mellett és megfelelő időn keresztül, és így meghatározzuk a jelölt TEC4 vagy TECH antitestek reakcióképességét, és ezt a kontrollértékhez viszonyítjuk, amit kompetitiv (vizsgált) antitest nélkül végzett inkubálással határozunk meg.
A vizsgált elvégezhető bármely, antitestek megkötődésén alapuló immunológiai vizsgálattal és TEC4 vagy TECH antitesteket a jelölés detektálása alapján mutatjuk ki. Ez megvalósítható például biotinilezett antitestek esetén sztreptavidinnel vagy enzimatikus jel esetén kromogén szubsztrátummal vagy a rádió jelölés egyszerű detektálásával. Az az antitest, amely azonos epitóphoz kötődik, mint a TEC4 vagy TEC11, a kötődés szempontjából hatékony versengésre képes, és így jelentős mértékben csökkenti a TEC4 vagy TECH kötődését, ami a jelölt antitestek kötődésének csökkenésében jelenik meg. A vizsgálat során a TEC4 vagy TECH antitest és a vizsgált antitest összekeverése után a maradék reaktivitás meghatározásához alkalmazható például ELISA, RIA vagy Western foltanalízis humán endoglin segítségével; immunokicsapás endoglin segítségével; ELISA, RIA vagy immunofluoreszcens analízis humán endoglint kifejező rekombináns sejttel történő megfestés alapján; a tumor vaszkuláris endotéliás sejtek indirekt immunofluoreszcens megfestése; a HUVEC vagy TCM-mel aktivált HUVEC sejtfelületi determinánsokkal szembeni reakcióképesség indirekt immunofluoreszcens vagy FACS analízissel történő mérése. Előnyösen alkalmazható az utóbb említett módszer,
HU 220 347 Β amivel igazolható az is, hogy a TEC4 és TECH antitestek által felismert epitópok eltérnek a 44G4 által felismert epitópokból [Gougos és Letarte idézett műve (1988)].
Ajelölt TEC4 vagy TEC11 antitestek vizsgált antitest nélkül mért reakcióképessége a kontroll felső érték. A kontroll alsó érték meghatározásához a jelölt antitesteket azonos típusú jelöletlen antitestekkel inkubáljuk, amikor is a bekövetkező versengés csökkenti ajelölt antitestek kötődését. Ha a jelölt antitest reakcióképessége a vizsgált antitest jelenlétében jelentős mértékben csökken, ez arra utal, hogy a vizsgált antitest ugyanazt az epitópot ismeri fel, vagyis „keresztreakcióra” képes a jelölt antitesttel. A jelentős csökkenés jelen esetben azt jelenti, hogy a kötődés reprodukálható (vagyis folyamatosan ismétlődő) módon legalább mintegy 10-50%-kal csökken mintegy 1:1 arány esetén, és előnyösen legalább mintegy 90%-kal csökken mintegy 1:100 arány esetén.
A TEC4 és TECH antitestekkel összefüggésben fent ismertetett „keresztreakció-vizsgálat” felhasználható minden találmány szerint alkalmazható antitestnél. Ez azt jelenti, hogy a találmány értelmében koaguláló szerrel kombinálva bispeciftkus ligandum előállítására alkalmas antitestnek minősül minden olyan antitest, amely antitestkompetitív vizsgálat szerint a fent felsorolt antitestekkel azonos epitópokon keresztül kötődik egy tumorsejtkomponenshez, tumorérrendszer-komponenshez, tumorsejttel asszociált komponenshez, tumorérrendszerrel asszociált komponenshez, tumor extracelluláris mátrixkomponenshez vagy bármely más, fent felsorolt sejttípushoz.
g) Érrendszeri endotéliás sejtkötö ligandumok alkalmazása
Célba juttató komponensként alkalmazhatók továbbá olyan biológiai ligandumok, amelyek endotéliás sejtfelületi molekulákhoz, így növekedésifaktor-receptorokhoz kötődnek, vagy ilyenekkel kölcsönhatásba lépnek.
Az ilyen értelemben célpontként alkalmazható növekedési faktorokra vagy ligandumokra példaként említhető a VEGF/VPF, FGF, TGFp, a TIE-hez kötődő ligandum, tumorral asszociált fibronektin izoform, szóródásfaktor, hepatocita növekedési faktor (HGF), 4 vértestecskefaktor (PF4), PDGF és TIMP.
Célpontként előnyösen alkalmazható a VEGF/VPG, a fehéijék FGF családja, valamint TGFp. Rekombináns fehéijeként alkalmazható klónozott FGF is [Abraham és munkatársai idézett műve (1986)]. A VEGF-nek négy klónozott fajtája ismert, amelyek 121,165,189 és 206 aminosavat tartalmaznak [Ferrara és munkatársai idézett műve (1991)].
h) Kötőligandumok célbavétele
Az antitestekkel vagy specifikus célba juttató ligandumokkal célbavehető továbbá minden olyan komponens, amely a betegség helyén, például a tumor helyén az érrendszeri endotéliás sejtek felületéhez kötődik. Ilyen komponens például a tumorból származó minden olyan ligandum és antigén, így növekedési faktor, amely az endotéliás sejten már jelen lévő specifikus sejtfelületi receptorhoz vagy az ilyen sejteken a tumoros környezet hatására indukálódó vagy kifejeződő receptorhoz kötődik. A tumor érrendszerével asszociált célpont tumorból származó endotéliás sejtkötő faktornak is nevezhető.
A betegség hatékony célbavételéhez szükséges specifikusságot részben az biztosítja, hogy a lokális endotéliás sejtek az indukció hatására olyan receptorokat fejeznek ki vagy szabadítanak fel, amelyek a normál endotéliás sejteken nem fordulnak elő, vagy kifejezésük el van nyomva, vagy el vannak fedve. Tumor esetében további specifikusság származik abból a tényből, hogy az endotéliás sejtek a tumorban tumorból származó faktorokat szabadítanak fel, amelyek a sejtfelülethez kötődnek és csökkentik a más szövetek számára hozzáférhető ligandum mennyiségét. Ha figyelembe vesszük a faktor vagy ligandum további hígulását, ami a véráramban vagy a szövetek közötti folyadékban történő eloszlásból ered, akkor feltételezhetjük, hogy a normálszövetek endotéliás sejtjei viszonylag kevés ilyen faktort kötnek meg. Ez azt jelenti, hogy a sejtfelülethez kötött ligandumok vagy faktorok tumor endotéliás sejtmarkerként alkalmazhatók.
A tumoros sejteken kívül a tumor endotéliás sejtkötő faktorok származhatnak más sejttípusokból is, így a tumorba beszűrődött makrofágokból és hízósejtekből, valamint a tumoron belül aktiválódott vértestecskékből.
A tumorérrendszerrel asszociált célpontként alkalmazható növekedési faktorokra vagy ligandumokra további példaként említhető az EGF, FGF, VEGF, TGFp, HGF [Nakamura idézett műve (1991)], angiotropin, TGF-α, TNF-a, PD-ECGF és TIE-t kötő ligandum [Bicknell és Harris idézett műve (1992)]. Célpontként előnyösen alkalmazható a VEGF/VPF, a fehérjék FGF családja, transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β), TGF-α, tumor nekrózis faktor-a (TNF-a), angiotropin, vértestecskéből származó endotéliás sejtnövekedési faktor (PD-ECGF), TIE-t kötőligandum és pleiotropin.
A találmány értelmében alkalmazható továbbá olyan célba juttató antitest vagy ennek kötőszakasza, amely csak a ligandum/receptor komplexen jelen lévő epitópokra specifikus, amely epitópok hiányoznak az egyedi (szabad) ligandumból, és a megfelelő receptor kötetlen formájából. Ezek az antitestek egy olyan különleges konformációt ismernek fel és kötnek meg, amely akkor keletkezik, amikor a ligandum, így a növekedési faktor a saját receptorához, így növekedésifaktor-receptorhoz kötődik, és kialakul a specifikusan kötött komplex. Az ilyen epitópok hiányoznak a ligandum vagy receptor komplexen kívüli formáiból.
Feltételezhető, hogy azok a ligandum/receptor komplexek, amelyekhez az ilyen antitestek kötődnek, szignifikánsan nagyobb számban fordulnak elő tumorral asszociált endotéliás sejtekben, mint nem tumorral asszociált endotéliás sejtekben. Az ilyen antitestek ezért célba juttató szerként használhatók, és tovább növelik a találmány szerinti bispecifikus koaguláns specifikusságát.
i) Receptorszerkezetek
A találmány értelmében célba juttató ligandumként alkalmazhatók továbbá az endotéliás sejtfelületi receptorok oldható kötődoménjei. Ez a megoldás azon a közis30
HU 220 347 Β mert szendvics kötődési folyamaton alapszik, ami különböző in vitro és in vivő kötődési vizsgálatokban megfigyelhető. Röviden, amikor az endotéliás sejt specifikus receptort fejez ki, a sejt megköti és abszorbeálja a megfelelő ligandumot, és a ligandum alkalmassá válik a rendszerbe bevitt további receptorszerkezetek megkötésére.
A fentiekben több alkalmazható endotéliás sejtreceptort ismertettünk, ezek közül előnyös a VEGF/VPF, FGF, TGFp, TIE-1 és TIE-2. Valamennyi ilyen receptor felhasználható a célba juttató ligandumként alkalmazható oldható kötődőmén előállítására.
4. Betegséggel asszociált vázsejtek célbavétele
a) Extracelluláris mátrix/νάζ célpontok
Az alapvető membránmarkerek tumorpatológiában betöltött szerepe ismert [Birembaut és munkatársai idézett műve (1985)]. A vizsgálatok kimutatták, hogy az alapvető membrán (BM) markerek, IV típusú kollagén, laminin (LM), heparán-szulfát-proteoglikán (HSP) és fibronektin (FN) eloszlása sérül a tumorpatológiában. Az alapvető membrán- és kötőszövet-antigének humán áttételes nyirokcsomókban megváltoznak [Burtin és munkatársai idézett műve (1983)].
A találmány szerinti megoldásban célpontként előnyösen alkalmazható az RIBS. A fibrinogénben konformációs változások jelennek meg a GPIIb-IIIa vértestecskemembrán glikoproteinnel gyakorolt kölcsönhatás következtében [Ugarova és munkatársai idézett műve (1993)]. Ha a fibrinogén aktivált vértestecskéken GPIIbIIIa membrán glikoproteinhez kötődik, akkor bekövetkezik a vértestecske aggregációja. A kölcsönhatás eredményeként konformációs változások játszódnak le a fibrinogénben, amit igazol a receptor által indukált kötőhelyeik (RIBS) kifejeződése, ezek olyan epitópok, amelyek csak a kötődés hatására fejeződnek ki, de a szabad ligandumban nem.
Két RIBS epitóp ismert [Ugarova és munkatársai idézett műve (1993)]. Az egyik szekvencia a γΐ 12-119 helyen található, és jele MAb 9F9, a másik egy RGDF szekvencia az Aa 95-98 helyen, és jele MAb 155B16. Ezek az epitópok előállíthatok, ha a fibrinogént műanyag felületen abszorbeáljuk, és a molekulát plazminnal emésztjük. Az epitópok proteolítikus kezelésének hatására az Αα-lánc karboxil-terminális része lehasad és X2 fragmens képződik. A fibrinogén Aa 95-98 helyén található RGDF szekvencia nem hozzáférhető, ami arra utal, hogy ez a szekvencia nem vesz részt a molekula GPIIb-IIIa glikoproteinhez történő kötődésében.
A fibrinogénnek a receptorához történő kötődése megváltoztatja az Αα-lánc karboxil-terminális részének konformációját, feltárja a molekula D és E doménjei között az összecsavarodott-fonal (coiled-coil) kapcsolódó szegmensekben található szekvenciákat, és előállítja az RIBS epitópokat. Gyakorlatilag az RIBS szekvenciák azok az epitópok, amiket célba veszünk a koaguligandummal. Ez azt jelenti, hogy előnyösen alkalmazható a 9F9 és 155B16 MAb, valamint a Zamarron és munkatársai idézett művében (1991) ismertetett antitestek.
b) További celluláris célpontok
A találmány szerinti megoldás további előnye, hogy lehetővé teszi a koagulánsnak a betegséggel asszociált érrendszerbe történő juttatását oly módon, hogy a beteg környezetben található sejttípust célzunk meg.
Hemosztázis és trombózis esetében a vértestecskék úgy csapódnak ki, hogy a sérült érfalhoz tapadnak, és a sérülés helyén felhalmozódnak. A vértestecskéknek az érsérülés helyén történő felhalmozódása fiziológiás körülmények között megakadályozza a vérzést, de ez patológiás körülmények között érelzáródáshoz vezethet, ami ischaemiás szövetkárosodást és vérrögképződést okozhat.
A vérlemezkék környezetükkel és egymás közt gyakorolt kölcsönhatása olyan komplex folyamat, ami a sejt felületén indul. A felületi membrán ezért egy reakcióképes összekötő felületet képez a külső közeg, így az érfal és plazma, valamint a vértestecske között.
A találmány szerinti megoldással célbavehető az aktivált vértestecskén kifejeződő p-155 multimer vértestecske fehérje [Hayward és munkatársai idézett műve (1991)]. A vértestecskék különböző módszerekkel stimulálhatók, amelyek hatására komplex biokémiai és morfológiai változások következnek be. Ezek a változások lehetnek fiziológiai folyamatok, például adhézió, aggregáció és koaguláció. A vértestecskék aktiválása változást okoz a membránban, ami monoklonális antitestekkel felismerhető. Ilyen antitest például a JS-1 monoklonális antitest [Hayward és munkatársai idézett műve (1991)], amely a koaguligandumban felhasználható.
A ligandummal indukált kötőhelyek (LIBS) olyan helyek, amelyek a sejtfelületi receptorokon csak akkor fejeződnek ki, amikor a ligandum megkötése megváltoztatja a receptor alakját, és így biológiai folyamatokat indít be. Ez az RIBS ellenpárjának tekinthető, és a találmány szerinti megoldásban célpontként alkalmazható.
anti-LIBS antitest ismert Frelinger és munkatársai idézett műveiből (1990; 1991), amelyek közül bármelyik felhasználható a koagulánsnak a betegség vagy tumor helyére történő elszállítására. Alkalmazható továbbá az MA-TSPI-1 egér monoklonális antivértestecske antitest (humán trombospondin ellen) és MA-PMI-2, MA-PMI1 és MA-LIBS-1 antitest (Ilb/lIIa humán vértestecske glikoproteinen található LIBS ellen) [Dewerchin és munkatársai idézett műve (1991)], valamint az RUU 2.41 és LIBS-1 antitest [Heynen és munkatársai idézett műve (1994)], az OP-G2 antitest [Tomiyama és munkatársai idézett műve (1992)] és az Ab-15 antitest.
Alkalmazható továbbá sok egyéb célpont is, így simaizomsejteken található antigének, periciták, fibroblasztok, makrofágok és beszűrődő limfociták és leukociták.
B) Koaguláló szer
A találmány szerinti bispecifikus szer második karja vagy eleme olyan komponens, amely képes a koagulálás kiváltására. Koagulálást elősegítő szerként alkalmazható koaguláló faktor, a koagulálást indirekt módon stimuláló faktor, vagy olyan második kötőszakasz, amely képes egy koaguláló faktor vagy a koagulálást indirekt módon stimuláló faktor megkötésére és felszabadítására.
1. Koaguláló faktor
A találmány szerint számos koaguláló faktor felhasználható. Ha a koaguláló faktor kovalens kötéssel
HU 220 347 B kapcsolódik az első kötőszerhez, akkor a funkcionális koaguláló helytől eltérő helyet alkalmazunk a molekulák csatlakoztatására. A koaguláló faktor aktív helyétől vagy funkcionális szakaszától eltérő kapcsolódási szakaszokat részletesen megadjuk a következő ismertetésben.
a) Szövetfaktor
A vér koagulálódásának megindítására alkalmas szer a szövetfaktor (az angol „tissue factor” név alapján rövidítve TF). A TF a vérkoagulálás külső útvonalában részt vevő aktivátor, ami fiziológiailag normál körülmények között nem érintkezik közvetlenül a vérrel [Osterud és munkatársai idézett műve (1986); Nemerson idézett műve (1988); Broze idézett műve (1992); Ruf és Edington idézett műve (1994)]. Az érrendszer sérülése esetén vagy bizonyos citokinok vagy endotoxinok által történő aktiválás hatására azonban a TF bekerül a véráramba vagy a (szub)endotéliás sejteken keresztül [Weiss és munkatársai idézett műve (1989)] vagy bizonyos vérsejteken keresztül [Warr és munkatársai idézett műve (1990)]. A TF ezután komplexet képez a Vlla faktorral, ami normál körülmények között kis koncentrációban kering a véráramban [Wildgoose és munkatársai idézett műve (1992)], és a TF/VIIa faktor komplex megindítja a koagulálás folyamatát a X faktor Xa faktorrá történő átalakításával. A folyamat végeredménye a fibrin kialakulása.
A folyamat megindításához az kell, hogy a TF/VIIa faktor komplex egy foszfolipid felületére asszociálódjon, amellyel a koagulációt megindító IX és X faktorok összegyűjthetők [Ruf és munkatársai idézett műve (1991); Paborsky és munkatársai idézett műve (1991); Bach és munkatársai idézett műve (1986)]. Ezért, a gén csonkolásával a transzmembrán- és citoplazmaszakaszoktól megfosztott, csonkolt TF (vagy tTF) olyan oldható fehérje, amelynek X faktort aktiváló képessége egy-százezrede a természetes TF aktiváló képességének [Ruf és munkatársai idézett műve (1991)].
b) Alvadásfaktorok
A találmány szerinti megoldásban alkalmazható továbbá a trombin, V/Va faktor és származékai, VlII/VIIIa faktor és származékai, IX/IXa faktor és származékai, X/Xa faktor és származékai, Xl/XIa faktor és származékai, XII/XIIa faktor és származékai, XlII/XIIIa faktor és származékai, X faktor aktivátor és V faktor aktivátor.
c) Méregkoagulánsok
A Russell-féle viperaméreg-faktor koaguláló fehérjét tartalmaz [Williams és Esnouf idézett műve (1962)]. A méregből olyan glikoprotein izolálható, amely aktiválja az V faktort [Kisiel idézett műve (1979)], míg a méreg egyik proteázkomponense aktiválja a humán X faktort [Di Scipio és munkatársai idézett műve (1977)]. A találmány szerinti megoldásban alkalmazható a X faktort aktiváló komponens.
A Russell-féle viperaméregben található X faktort aktiváló komponensre specifikus az MP1 monoklonális antitest [Pukrittayakamee és munkatársai idézett műve (1983)], és felhasználható a szemek a szervezeten belüli specifikus célponthoz történő elszállítására.
d) Prosztaglandinok és szintetikus enzimek
A vértestecske-mikroszómákban az endoperoxidokból tromboxán A2 képződik a ciklooxigenáz és tromboxánszintetáz enzimek sorozatos hatására.
A tromboxán A2 a vértestecskékkel könnyen előállítható, és potenciális érszűkítő szer, mivel képes a vértestecskék aggregációjának kiváltására [Whittle és munkatársai idézett műve (1981)].
A tromboxán A2 és aktív analógjai ezért a találmány szerinti megoldásban felhasználhatók. A tromboxán A2 szintetikus előállítása ismert [Bhatwat és munkatársai idézett műve (1985)]. Előnyösen alkalmazhatók a tromboxán A2 analógok is [Ohuchida és munkatársai idézett műve (1981)], különösen az ott említett 2 számú vegyület.
Koagulánsként alkalmazhatók továbbá a vértestecskéket aktiváló prosztaglandinokat szintetizáló tromboxánszintáz és más hasonló enzimek. Ismert a tromboxánszintázra vonatkozó monoklonális antitest és annak immunoaffinitív tisztítása [Shen és Tai idézett művei (1986a;b)], valamint a humán tromboxánszintáz cDNS-e [Wang és munkatársai idézett műve (1991)].
e) A fibrinolízis inhibitorai
Az a2-antiplazmin vagy az a2-plazmin inhibitor a humán plazmában természetesen előforduló proteináz inhibitor, amelynek feladata, hogy hatékonyan gátolja a fibrinrögök plazminogén aktivátor által indukált roncsolását [Moroi és Aoki idézett műve (1976)]. Az a2-antiplazmin egy különösen hatékony inhibitor, és ezért a találmány szerinti megoldásban alkalmazható.
Az a2-antiplazmin tisztítását először Moroi és Aoki ismertette [idézett mű (1976)]. Ismertek más tisztítási eljárások is, így a plazminogén-Sepharose tölteten végzett affinitáskromatográfia, a DEAE-Sephadex tölteten végzett ioncserélő kromatográfia és a Concanavalin-ASepharose tölteten végzett kromatográfia, valamint a plazmin-A láncban (LBSI) található három N-terminális hármas hurokszerkezetet tartalmazó, elasztázzal emésztett plazminogén készítményt hordozó Sepharose oszlopon végzett affinitáskromatográfia, és ezt követő gélszűrés [Wiman és Collen idézett műve (1977); Wiman idézett műve (1980)].
Ismert az a2-antiplazmin cDNS-ének szekvenciája [Tone és munkatársai idézett műve (1977)], ezért az a2-antiplazmin rekombináns eljárással is előállítható.
Ismertek továbbá az a2-antiplazmin elleni monoklonális antitestek, amelyek a találmány szerinti bispecifikus kötőligandumban felhasználhatók, így például, Hattey és munkatársai a2-antiplazmin elleni két monoklonális antitestet ismertetnek [idézett mű (1987)], amelyek neve MPW2AP és MPW3AP. Mindkét antitest azonosan jól reagál a természetes a2-antiplazminnal, és ezért mindkettő felhasználható az exogén a2-antiplazmin célba juttatására, vagy az endogén a2-antiplazmin összegyűjtésére és célpontban történő koncentrálására. Használhatók továbbá más antitestek is, így JTPI2 antitest (Mimuro és munkatársai idézett műve).
2. Koaguláló faktorokat megkötő szerek
A találmány szerinti bispecifikus koaguláló ligandum másik csoportját képezik azok, amelyekben a cél32
HU 220 347 Β ba juttató szakasz nincs közvetlenül egy koaguláló faktorhoz kapcsolva, hanem egy olyan második kötőszakaszhoz kapcsolódik, amely egy koaguláló faktorhoz kötődik.
A koaguláló faktor megkötésére és szállítására alkalmas második kötőszakaszként olyan kötőszakasz használható, amely a koaguláló faktor olyan szakaszát ismeri fel, amely szignifikánsan nem gyengíti annak koagulációt kiváltó képességét. A koaguláló faktor ilyen módon történő megkötésére azok a szakaszok használhatók, amelyek a célba juttató szerhez történő kovalens hozzákapcsolásra is alkalmasak, és amelyeket fent részletesen ismertettünk.
Feltételezhető azonban, hogy az ilyen típusú bispecifikus ligandumok a koaguláló faktort felszabadítják a tumor helyére történő elszállítás után, ezért a második kötőszerhez vagy antitesthez történő hozzákötéshez szükséges szakasz a koaguláló faktoron rugalmasabban választható meg. További előny, hogy a bispecifikus antitest a tTF bejuttatása előtt lokalizálható, ami csökkenti a tTF szükséges mennyiségét és így a toxicitást.
Az ilyen megoldásnál második kötőszakaszként általában az antitest antigénkombináló helyét használjuk, amely kötési specifikusságot mutat a koaguláló faktor vonatkozásában, ilyen például az antitest funkcionális szakasza, így scFv, Fv, Fab’, Fab és F(ab’)2 fragmensek.
A találmány szerinti megoldás fenti megvalósítási módjára példaként említhető az olyan bispecifikus kötőligandum, amely szövetfaktor, trombin, prekallikein, V/Va faktor, VlII/VIIIa faktor, IX/IXa faktor, X/Xa faktor, Xl/XIa faktor, XII/XIIa faktor, XlII/XIIIa faktor, Russell-féle viperaméreg, tromboxán A2 vagy a2-antiplazmin elleni antitestet vagy ennek fragmensét tartalmazza.
C) Összekötő szakasz
Az első, célba juttató szakaszt és a második, koaguláló szakaszt működőképesen kapcsoljuk össze, ami lehetővé teszi, hogy az egyes szakaszok szignifikáns csökkenés nélkül kifejtsék a kívánt hatást. így a célba juttató szakasz képes a kívánt célhoz, így a tumor környezetében lévő célponthoz történő kötődésre, és a koaguláló faktor közvetlenül vagy közvetve, például egy megkötött faktor felszabadítása által képes a véralvadás vagy koaguláció kiváltására.
A célba juttató szakasz kötőképességének ellenőrzésére kötődési vizsgálattal ellenőrizzük, hogy a bispecifikus ligandum lényegében ugyanolyan módon kötődik a célba vett komponenshez, mint a komplexen kívüli első kötőszakasz. Kötődési vizsgálatként általában immunológiai kötődési vizsgálatot végzünk, ahol az első célba juttató szakasz egy antitest, és/vagy más biokémiai kötődési vizsgálatot végzünk, például 125jóddal jelölt fehérjével vagy más radiojelölésű komponenssel, amely ligandum/receptor kötődést vált ki, és így Scatchardfoltokat generál vagy más módon detektálható.
Az ilyen vizsgálatokban a célba vett antigén vagy komponens különböző formákban előállítható. Ilyen lehet például természetes vagy rekombináns forrásból tisztított fehérje, dúsított membránpreparátum, valamint ép sejt- és szövetszakasz. A fehéijekészítményeket általában szilárd hordozón, így mikrotitráló lemezen, membránon vagy oszlopmátrixon immobilizáljuk. Előnyösen olyan célkészítményt használunk, amely a fiziológiai célpontot utánozza. Mivel a célpont általában sejttel asszociált formában található, előnyösek az ép sejteket, például szöveteket vagy magukat a sejteket tartalmazó készítmények.
A bispecifikus komplex funkcióképes kötődését ellenőrző immunológiai vizsgálatokra példaként említhető a Westem-folt, ELISA, fixált sejtekkel végzett ELISA, immunohisztokémiai és fluoreszcens aktivált sejtválogató (FACS) módszerek. Az ilyen módszerek megvalósítása ismert.
A bispecifikus vegyület célba juttató szakaszának kötőképességét ellenőrző valamely fenti vagy más kötődési vizsgálat elvégzése tehát ismert eljárás, amelynek során a bispecifikus ligandumot és a komplexen kívüli első kötőszakaszt általában párhuzamosan és azonos körülmények között vizsgáljuk az összehasonlítás megkönnyítése érdekében. A hatékony bispecifikus ligandum a célponthoz szignifikáns gyengülés nélkül kötődik, vagyis lényegében ugyanolyan módon, mint a komplexen kívüli első kötőszakasz. Ha a komplexen kívüli első kötőszakasz vizsgálati eredményét referenciaértékként 100%nak tekintjük, akkor a bispecifikus ligandum lényeges kötődése azt jelenti, hogy a bispecifikus ligandum legalább mintegy 50%-os, előnyösen mintegy 50-80%-os, különösen előnyösen mintegy 80-100%-os kötődést mutat.
Ha a bispecifikus ligandum egy koagulánshoz kötődő második kötőszakaszt tartalmaz, vagyis ha bispecifikus antitestről van szó, akkor ellenőrző vizsgálatként előnyösen alkalmazhatók az olyan eljárások, amelyek egyidejűleg mérik a bispecifikus ligandum mindkét karjának kötőképességét. Ez megvalósítható például, ha a radiojelölésű koagulánst egy bispecifikus ligandumon vagy antitesten keresztül kötjük a célsejthez. Az ilyen vizsgálatra példaként említhető a tTF célsejthez történő kötése B21-2/10H10 bispecifikus antitesten keresztül, amit a II. példa ismertet.
A bispecifikus ligandumban található koaguláló szer hatásának ellenőrzése is ismert eljárás. A bispecifikus ligandum koagulációs vizsgálatánál azt ellenőrizzük, hogy a koagulációt lényegében ugyanolyan módon váltja ki, mint a komplexen kívüli koaguláló szer. Ez igaz az olyan koaguláló szerekre, amely egy koaguláló faktor, vagy egy koaguláló faktorhoz kötődő második kötőszakasz. Természetesen ez utóbbi esetben az in vitro vagy ex vivő vizsgálat során a bispecifikus ligandumot először a koaguláló faktorral komplexáljuk a második kötőszakaszhoz történő hozzákötődés elősegítése érdekében.
Koagulációs vizsgálatként előnyösen alkalmazhatók az olyan eljárások, amelyek során a bispecifikus ligandumot, kívánt esetben prekomplex formájában, egy plazmamintához adagoljuk. A vizsgálat során a koaguláció lejátszódását a fibrinszálak megjelenése mutatja. Hatékony bispecifikus ligandumnak tekinthető az, amely a kontrollszinthez képest csökkenti, előnyösen szignifikánsan csökkenti a fibrinszálak megjelenéséig eltelt időt.
HU 220 347 Β
A fenti vizsgálatok egyik változatánál a megfelelő célsejteket először bispecifikus ligandummal kezeljük a megfelelő körülmények között és a szükséges időn keresztül, majd a kötődés lejátszódása után a sejteket mosva eltávolítjuk a nem specifikusan kötődött komponen- 5 seket, majd a mosott sejteket plazmában ismét szuszpendáljuk. Csak a bispecifikus ligandummal megfelelően bevont sejtek csökkentik a fibrinszálak megjelenéséig szükséges időt. Az ilyen vizsgálat előnye, hogy egyidejűleg ellenőrzi a bispecifikus szerkezet mindkét 10 funkcióját, vagyis a sejt célbavételét és az ezt követő lokalizált koagulációt.
A bispecifikus vegyület koaguláló funkciójának a komplexen kívüli koaguláló szerhez történő hasonlításához ismét párhuzamos vizsgálatot végzünk. A hatékony bispecifikus ligandum a koagulációt szignifikáns csökkenés nélkül váltja ki, vagyis lényegében ugyanolyan hatást gyakorol, mint a komplexen kívüli koaguláló szer. Ha a komplexen kívüli koaguláns vizsgálati eredményét referenciaértékként 100%-nak vesszük, akkor a lényegében változatlan hatás azt jelenti, hogy a bispecifikus ligandum legalább mintegy 50%-os, előnyösen mintegy 50-80%-os, különösen előnyösen mintegy 80-100%-os koagulációt okoz.
A bispecifikus ligandum két funkcionális szakasza 25 szintetikus kémiai módszerekkel vagy rekombináns DNS-eljárásokkal egyesíthető. Ezeket az eljárásokat a szokásos módon végezzük. Az ilyen eljárások egyik megvalósítási módját az 1. példában részletezzük.
1. Biokémiai keresztkötések kialakítására alkal- 30 más szerek
Az antitest vagy más célba juttató komponens és a koaguláló szer összekapcsolását általában az immunotoxin preparátumok előállítására kifejlesztett technológiával végezzük. A találmány szerinti megoldás jelentős előnye azonban, hogy a fiziológiailag hozzáférhetővé vált bizonyos mennyiségű komplexen kívüli koaguláló szer nem vált ki súlyos következményeket. Ezért a keresztkötések kialakítására alkalmas szer stabilitása nem olyan szigorú követelmény, mint más szerkezetek, így immunotoxinok esetében. Általános útmutatóként megállapítható tehát, hogy jelen esetben felhasználható az immunotoxinok előállítására alkalmas valamennyi biokémiai keresztkötések kialakítására alkalmas szer, valamint további kapcsolóelemek.
A toxinokon kívül egy sor más kemoterápiás és farmakológiái szert kapcsoltak antitestekhez farmakológiái hatással rendelkező konjugátumok előállítása érde15 kében [Vaickus és munkatársai idézett műve (1991)]. Példaként említhetők az olyan antineoplasztikus szerek, mint a doxorubicin, daunomicin, metotrexát és vinblasztin [Dillman és munkatársai idézett müve (1988); Pietersz és munkatársai idézett műve (1988)]. 20 Megkötöttek más szereket is, így a neokarzinosztatint [Kimura és munkatársai idézett műve (1983)], a makromicint [Manabe és munkatársai idézett műve (1984)], a trenimont [Ghose idézett műve (1982)], és az a-amanitint [Davis és Preston idézett műve (1981)]. A találmány szerinti megoldáshoz felhasználható a fent idézett iratok bármelyikében ismertetett kapcsolási eljárás.
A keresztkötések kialakítására alkalmas reagensek olyan molekulahidat képeznek, amely két különböző molekula, például a kötőszer és a koaguláló szer funkcionális csoportjait köti össze. Két különböző fehérje lépésenként történő összekapcsolására olyan heterobifunkcionális keresztkötések kialakítására alkalmas szert kell használni, amely elkerüli a nemkívánatos homopolimer-képződést (VI. táblázat).
VI. táblázat
Heterobifunkcionális keresztkötések kialakítására alkalmas szerek
Kapcsoló szer Felhasznált funkciós csoportok Előnyök és alkalmazás Az összekötés hossza (Angström)
SMPT primer amin és szulfhidril Nagy stabilitás 11,2
SPDP primer amin és szulfhidril Tiolálás; hasítható összekötés 6,8
LC-SPDP primer amin és szulfhidril Megnyújtott összekötés 15,6
szulfo-LC-SPDP primer amin és szulfhidril Megnyújtott összekötés; vízben oldható 15,6
SMCC primer amin és szulfhidril Stabil maeimid reakcióképes csoport; enzim/antitest konjugáció; haptén/hordozó fehére konjugáció 11,6
szulfo-SMCC primer amin és szulfhidril Stabil maleimid reakcióképes csoport; vízben oldható; enzim/antitest konjugáció 11,6
MBS primer amin és szulfhidril Enzim/antitest konjugáció; haptén/hordozó fehéije konjugáció 9,9
szulfo-MBS primer amin és szulfhidril Vízben oldható 9,9
SIAB primer amin és szulfhidril Enzim/antitest konjugáció 10,6
szulfo-SIAB primer amin és szulfhidril Vízben oldható 10,6
SMPB primer amin és szulfhidril Megnyújtott összekötés; enzim/antitest konjugáció 14,5
szulfo-SMPB primer amin és szulfhidril Megnyújtott összekötés; vízben oldható 14,5
EDC/szulfo-NHS primer amin és karboxil Haptén/hordozó fehéije konjugáció 0
ABH szénhidrátok, nem szelektív Cukorcsoportokkal reagál 11,9
HU 220 347 Β
A heterobifunkcionális keresztkötések kialakítására alkalmas szer például két reakcióképes csoportot tartalmaz: az egyik primer amincsoportokkal reagál (például N-hidroxi-szukcinimid), és a másik tiolcsoportokkal reagál (például piridil-diszulfid, maleimid és halogén). A primer amincsoportokon keresztül a keresztkötések kialakítására alkalmas szer a fehérje (például kiválasztott antitest vagy fragmens) lizinmaradékával reagál, míg a tiolcsoporton keresztül az első fehéréhez kötött keresztkötések kialakítására alkalmas szer egy másik fehérje (például koaguláns) ciszteinmaradékával (szabad szulfhidrilcsoport) reagál.
Látható, hogy előnyösen alkalmazható az olyan koaguláns vagy koagulánskötő szakasz, amely, vagy melynek származéka a keresztkötés kialakítására alkalmas funkciós csoportot hordoz. Ez a követelmény azonban nem megszorító jellegű, mivel nagyszámú csoport felhasználható a fenti módon. A csoportokra példaként említhetők a primer vagy szekunder amincsoportok, hidrazid- vagy hidrazincsoportok, karboxil-alkoholok, foszfátok és alkilezőcsoportok. Az összekötéshez alkalmazható technológiák általános áttekintését tartalmazza Ghose és Blair idézett műve (1987).
A keresztkötések kialakítására alkalmas szer két reakcióképes csoportja közötti kar hossza és kémiai összetétele eltérő lehet. A hosszabb összekötő kar nagyobb rugalmasságot biztosít a konjugált komponenseknek, míg a hídban található egyes komponensek (például benzolcsoportok) extra stabilitást kölcsönöznek a reakcióképes csoportnak, vagy növelik a kémiai kötés ellenállását (például a diszulfidkötés redukálószerekkel szemben mutatott ellenállása). Összekötő karként alkalmazható például egy peptid, például L-Leu-L-Ala-LLeu-L-Ala.
Előnyösen olyan keresztkötések kialakítására alkalmas szert használunk, amely a vérben megfelelő stabilitással rendelkezik. Számos olyan, diszulfídkötést tartalmazó linker ismert, amely eredményesen alkalmazható a célba juttató szer és a koaguláló szer konjugálására. A szterikusan gátolt diszulfídkötést tartalmazó linkerek in vivő nagyobb stabilitást mutatnak, ami megakadályozza, hogy a koaguláns a hatás helyéhez történő kötődés előtt felszabaduljon. Összekötőszerként ezért előnyösen alkalmazhatók az ilyen linkerek.
Az immunotoxinoknál leggyakrabban alkalmazott keresztkötések kialakítására alkalmas szer az SMPT, amely olyan diszulfídkötést tartalmazó bifünkcionális linker, amely egy szomszédos benzolgyűrű és metilcsoport miatt szterikusan gátolt állapotban van. Feltételezhető, hogy a diszulfidkötés szterikus gátlása megvédi a kötést a tiolát anionok, így glutation támadásától, amely jelen van a szövetekben és a vérben, és ezáltal elősegíti a konjugátum megvédését az összekapcsolt szereknek a tumorhoz történő szállítása előtt. A találmány szerinti bispecifikus koaguláló ligandumhoz ezért az SMPT is felhasználható.
Az SMPT és több más ismert keresztkötések kialakítására alkalmas szer az összekötéshez a cisztein SH csoportját és primer amint (például a lizin epszilon aminocsoportját) használja. Keresztkötések kialakítására alkalmas szerként alkalmazható továbbá a heterobifunkcionális fotoreaktív fenil-azid, amely egy hasítható diszulfidkötést tartalmaz, ilyen például a szulfoszukcinimidil-2-(p-azido-szalicil-amido)-etil-l,3’-ditio-propionát. Az N-hidroxi-szukcinimidil-csoport primer aminocsoportokkal reagál, és a fenil-azid (fotolízisen keresztül) nem szelektív módon bármely aminosavmaradékkal reakcióba lép.
A gátolt keresztkötések kialakítására alkalmas szerek mellett felhasználhatók nem gátolt linkerek is. Védett diszulfidkötés kialakítására képtelen keresztkötések kialakítására alkalmas szerekre példaként említhető az SATA, SPDP és a 2-imino-tiolán [Wawrzynczak és Thorpe idézett műve (1987)]. Az ilyen keresztkötések kialakítására alkalmas szerek felhasználása a szakterületen ismert.
Konjugálás után a bispecifikus szert általában tisztítjuk, és így a konjugátumot elválasztjuk a konjugálatlan célba juttató szertől vagy koagulánstól és más szennyező anyagoktól. A konjugálatlan célba juttató szer eltávolítása azért fontos, hogy elkerüljük a konjugált és konjugálatlan formájú antigének közötti esetleges versengést. A klinikailag felhasználható tisztasággal rendelkező konjugátum előállításához felhasználható tisztítási eljárások ismertek. Előnyösen alkalmazhatók a méret szerint szétválasztáson alapuló tisztítási eljárások, így a gélszűrés, gélpermeáció vagy nagynyomású folyadékkromatográfia. Alkalmazhatók továbbá egyéb kromatográfiás eljárások is, így a kék-Sepharose elválasztás.
2. Rekombináns fúziós fehérjék
A találmány szerinti bispecifikus célba juttatott koaguláns lehet molekulárbiológiai módszerekkel előállított fúziós fehérje is. Az ehhez szükséges rekombináns DNS-technikák szakember számára ismertek. Ezekre a módszerekre példaként említhető az in vitro rekombináns DNS-technika, szintetikus technika és in vivő rekombináció vagy genetikus rekombináció. A DNS és RNS szintézise megvalósítható továbbá automatikus szintetizálóberendezésen [például Sambrook és munkatársai idézett műve (1989); Ausubel és munkatársai idézett műve (1989)].
Általánosságban, egy fúziós fehérje előállításához egy kötőligandumot vagy más célba juttató eszközt kódoló DNS-szakaszt, így gént vagy cDNS-t egy koaguláló faktort vagy koagulánskötő szakaszt kódoló DNSszakaszhoz (így génhez vagy cDNS-hez) kapcsolunk. Ennek során általában egy kifejezővektort állítunk elő, amely azonos leolvasókeretben egy első kötőszakaszt kódoló első DNS-szegmenst, és ehhez működőképesen hozzákapcsolva a koaguláló faktort kódoló második DNSszegmenst tartalmaz. A szekvenciákat oly módon kapcsoljuk össze, hogy a teljes nukleinsavszekvencia transzlációja a kívánt találmány szerinti bispecifikus vegyületet eredményezze. Az expressziós vektorok általában egy vagy több promotert tartalmaznak a kívánt DNSszakaszok felett, amelyek elősegítik a DNS transzkripcióját, és így a kódolt rekombináns fehérje kifejeződését. Ezt a folyamatot rekombináns kifejeződésnek nevezzük.
Ha a felhasználni kívánt kötőszakaszt vagy koagulánst kódoló DNS nem ismert, akkor az előállítható a
HU 220 347 B molekuláris klónozás módszerével, amelynek során a kívánt fehérjét kódoló DNS-molekulát egy DNS-tárból (például cDNS- vagy genomtárból) nyerjük ki. Ennél az eljárásnál egy megfelelő DNS-tárat vizsgálunk, például a fehérje ellen kifejlesztett antitestek segítségével vagy aktivitásvizsgálattal. Alternatív módon, a vizsgálat megvalósítható oligonukleotidpróbákkal végzett hibridizálással is, ennek során a fehérje aminosavszekvenciája részleteinek megfelelő próbákat vagy rokon fehérjéket kódoló gének DNS-szekvenciájából származó próbákat használunk. A fenti eljárások megvalósítása szakember számára ismert [például Sambrook és munkatársai idézett műve (1989)].
A rekombináns DNS-technikával előállított találmány szerinti célba juttató szer/koaguláló szer vegyület egy fúziós fehérje. Az ilyen fúziós fehéije tehát legalább egy találmány szerinti célba juttató szert és legalább egy találmány szerinti koaguláló szert tartalmaz, amelyek működőképesen vannak összekapcsolva. A fúziós fehérje további peptidszekvenciákat is, például spacer pepiidet tartalmazhat, amely működőképesen van hozzákötve a célba juttató szerhez és a koaguláló szerhez, amenynyiben a további szekvenciák nem befolyásolják a kapott fúziós fehérje célba juttató vagy koaguláló hatását.
A rekombináns bispecifikus fehéijeligandum eltérhet az úgynevezett természetes eredetű fehérjék kémiai úton történő összekötésével kapott bispecifikus szerkezetektől. Közelebbről, két azonos fehéijéből rekombináns fúzióval vagy kémiai fúzióval előállított termék különbözhet például a transzláció utáni módosítás, így glikozilezés és foszforilezés mértékében. Ez általában nem jelent problémát, de ismert eljárásokkal ellenőrizhető, hogy a rekombináns fúziós fehérje a kívánt módon működik.
A rekombináns kifejezés egyik előnye, hogy az összekötő szakaszok könnyen manipulálhatók, vagyis az összekötő szakaszok hossza és/vagy aminosav összetétele változtatható. A találmány szerinti két szer közé kívánt esetben nem hasítható peptid spacer, vagy különleges hasítóhellyel rendelkező peptid illeszthető.
A célba juttató szer és a koaguláló szer összekötésére alkalmazható például olyan peptid spacer, amely diszulfidkötéseken keresztül hurokszerkezet kialakítására képes. A hurkon belüli proteolitikus hasítással olyan heterodimer polipeptidet kapunk, amelyben a célba juttató szer és a koaguláló szer egyetlen diszulfidkötéssel van összekötve [például Lord és munkatársai idézett műve (1992)].
A megfelelő nukleinsavakat és transzkripciós/ /transzlációs szabályozó szekvenciákat tartalmazó expressziós vektorok előállítására és különböző gazdarendszerekben történő kifejezésére számos eljárás ismert. Az expresszióhoz sejttípusként alkalmazhatók például mikroorganizmusok, így baktériumok (például E. coli vagy B. subtilis), amelyeket rekombináns bakteriofág DNS-sel, plazmid DNS-sel vagy kozmid DNS expressziós vektorral transzformálunk, amelyek tartalmazzák a célba juttató szert és koagulánst kódoló szekvenciákat. Alkalmazhatók továbbá élesztők (például Saccharomyces vagy Pichia), amelyeket a célba juttató szert és koaguláló szert kódoló szekvenciákat tartalmazó rekombináns élesztő expressziós vektorral transzformálunk, valamint rovarsejtrendszerek, amelyeket a célba juttató szert és koaguláló szert kódoló szekvenciákat tartalmazó rekombináns vírus expressziós vektorral (például baculovírus) fertőzünk; növényi sejtek, amelyeket a célba juttató szert és koagulánst kódoló szekvenciákat tartalmazó rekombináns vírus expressziós vektorral (például karfiol-mozaikvírus, CaMV; dohány-mozaikvírus, TMV) fertőzünk, vagy rekombináns plazmid expressziós vektorral (például Ti-plazmid) transzformálunk; valamint emlőssejtrendszerek (például COS, CHO, BHK, 293, 3T3), amelyek emlőssejtek genomjából származó promotert (például metallotionein promoter) vagy emlősvírusból származó promotert (például adenovírus késői promoter vagy 7.5K vakcinavírus promoter) tartalmazó rekombináns expressziós szerkezetet hordoz.
Baktériumok esetén különböző expressziós vektorok alkalmazhatók a kifejezni kívánt célba juttató szer/koaguláló szer szerkezettől függően, így például, nagy mennyiségű bispecifikus szer előállításához olyan vektort alkalmazunk, amely a fúziós fehérjét nagy mennyiségben kifejezi, és lehetővé teszi annak tisztítását. Az ilyen vektorokra példaként említhető a pUR278 E. coli expressziós vektor [Ruther és munkatársai idézett műve (1983)], amelybe a célba juttató szer/koaguláló szer kódoló szekvencia egyedileg ligálható a vektorkeretben a lac Z kódolószakasszal együtt, és így a fúziós fehéije további komponensként lac Z terméket tartalmaz. További példaként említhető a pIN vektor [Inouye és munkatársai idézett műve (1985); Van Heeke és munkatársai idézett műve (1989)]. Idegen polipeptid, így fúziós fehéqeként célba juttató szer/koaguláló szer kombinációt, és emellett glutation-S-transzferázt (GST) tartalmazó polipeptid kifejezése megvalósítható továbbá pGEX vektorral. Az ilyen fúziós fehérjék általában oldhatók, és a roncsolt sejtből könnyen tisztíthatok, például glutationagaróz gyöngyökkel végzett adszorpcióval, és ezután szabad glutation jelenlétében végzett elúcióval. A pGEX vektorok úgy vannak megtervezve, hogy trombin vagy Xa faktor proteáz hasítóhelyet tartalmaznak, így a teljes fúziós fehéqe kötőszer/koaguláló fehérje része a GST egységtől elválasztható.
Rovarok esetében az idegen gének kifejezésére vektorként előnyösen alkalmazható az Autograph californica mag polihidrózis vírus (AcNPV). A vírus Spodoptera frugiperda sejtekben növekszik. A célba juttató szer/koaguláló szer kódoló szekvenciák a vírus szempontjából nem esszenciális szakaszokba (például polihedrin gén) klónozhatok, és szabályozásuk megvalósítható egy AcNPV promoterrel (például polihedrin promoter). A bispecifikus ligandumot kódoló szekvenciák sikeres inszertálása inaktiválja a polihedrin gént, és a burok nélküli rekombináns vírus (vagyis a polihedrin gén által kódolt fehéijeburok nélküli vírus) termelését. Ezekkel a rekombináns vírusokkal Spodoptera frugiperda sejteket fertőzünk, amelyekben kifejeződnek az inszertált gének [Smith és munkatársai idézett műve (1983); US 4 215 051 számú irat].
HU 220 347 Β
Emlős gazdasejtekben különböző vírusalapú kifejezőrendszerek alkalmazhatók. Ha expressziós vektorként adenovírust használunk, akkor a célba juttató szer/koaguláló szer kódolószekvenciákat egy adenovírus transzkripciós/transzlációs kontroll komplexbe, például késői promoterbe vagy három részből álló leader szekvenciába ligáljuk. Ezt a kimér gént ezután adenovírus genomba inszertáljuk in vitro vagy in vivő rekombinálással. A vírusgenom nem esszenciális részébe (például El vagy E3 szakasz) történő inszertálás hatására a rekombináns vírus életképes, és fertőzött gazdasejtekben képes a bispecifikus fehéijék kifejezésére [Logan és munkatársai idézett műve (1984)].
Specifikus iniciátorszignál szükséges az inszertált célba juttató szer/koaguláló szer hatékony transzlációjához. Ilyen szignálok az ATG iniciátor kodon és a szomszédos szekvenciák. Alkalmazhatók exogén transzlációs kontroll szignálok is, így a ATG iniciátor kodon. A szükséges szignálokat a szokásos módon választjuk ki és alkalmazzuk. Ismert, hogy az iniciátor kodon a kívánt kódolószekvencia leolvasókeretén belül helyezkedik el, mivel csak így biztosítható a teljes inszertált szakasz transzlációja. Ezek az exogén transzlációs kontroll szignálok és iniciátor kodonok különböző eredetűek lehetnek, így lehet természetes vagy szintetikus eredetű. A kifejeződés hatásossága fokozható megfelelő transzkripciós kisegítőelemek, transzkripciós terminátorok és hasonlók alkalmazásával [Bittner és munkatársai idézett műve (1987)].
Emellett, választható olyan gazdasejttörzs, amely modulálja az inszertált szekvenciák kifejeződését, vagy kívánt specifikus módon módosítja vagy feldolgozza a génterméket. A fehérje ilyen módosítása (például glikozilálása) és feldolgozása (például hasítása) fontos lehet a fehéije működése szempontjából. A különböző gazdasejtek jellemző és specifikus mechanizmussal rendelkeznek a fehéijék poszttranszlációs feldolgozása és módosítása vonatkozásában. A kifejezett idegen fehérje megfelelő módosításához és feldolgozásához megfelelő sejtvonalat vagy gazdarendszert választunk. Ebből a célból alkalmazható olyan eukarióta gazdasejt, amely rendelkezik a géntermék primer átírásához, glikozilálásához és foszforilezéséhez szükséges celluláris mechanizmusokkal. Az ilyen emlős gazdasejtekre példaként említhető a CHO, VERŐ, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38.
A rekombináns fehérjék hosszan tartó és nagy kitermeléssel történő előállításához stabil kifejeződés szükséges. Ehhez előállíthatok például olyan sejtvonalak, amelyek stabilan kifejezik a célba juttató szert és a koaguláló ligandumot kódoló szerkezeteket. Víruseredetű replikátumokat tartalmazó expressziós vektorok alkalmazása helyett inkább olyan célba juttató szer/koaguláns DNS-sel transzformáljuk a gazdasejteket, amelyek megfelelő expressziós kontrollelemek (például promoter, kisegítő, transzkripciós terminátor, poliadenilező helyek) és szelektálható marker szabályoznak. Az idegen DNS bevitele után a transzformált sejteket egykét napon keresztül dúsított közegben tenyésztjük, majd szelektív közegre visszük. A rekombináns plazmidban található szelektálható marker megfelelő rezisztenciát biztosít a szelektáláshoz, és lehetővé teszi, hogy a sejt stabilan integrálja a plazmidot a kromoszómáiban, és olyan telepeket neveljen, amelyek klónozhatok, és sejtvonalakká fejleszthetők ki.
Erre a célra különböző szelekciós rendszerek alkalmazhatók. Példaként említhető a herpesz simplex vírus timidin-kináz [Wigler és munkatársai idézett műve (1977)], hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz [Szybalska és munkatársai idézett műve (1962)] és adenin-foszforibozil-transzferáz gén [Lowy és munkatársai idézett műve (1980)], amelyek tk-, hgprt- vagy aprtsejtekben alkalmazhatók. A szelekció alapja lehet továbbá az antimetabolit rezisztencia, ahol a dhlt rezisztenciát biztosít a metotrexáttal szemben [Wigler és munkatársai idézett műve (1980); O’Hare és munkatársai idézett műve (1981)], a gpt, amely rezisztenciát biztosit a mikofenolsavval szemben [Mulligan és munkatársai idézett műve (1981)], a neo, amely rezisztenciát biztosít a G418 aminoglikoziddal szemben [Colberre-Garapin és munkatársai idézett műve (1981)], és a hygro, amely rezisztenciát biztosít a hidromicinnel szemben [Santerre és munkatársai idézett műve (1984)].
D) Antitestek
Ha a bispecifikus ligandum egyik vagy mindkét részeként antitestet használunk, akkor a megfelelő antitesteket a tumor típusától és az alkalmazott koaguláló ligandumtól függően választjuk meg. Egyes antitesttípusokkal azonban különleges előnyök biztosíthatók, így például, az IgG-alapú antitesteknél feltételezhető a jobb kötődési képesség, és a vérből történő lassúbb kiürülés, mint a megfelelő Fab’ ellentétpároktól, míg az Fab’ fragmensen alapuló készítmények általában jobban áthatolnak a szöveteken.
1. Monoklonális antitestek
Az antitestek előállítására és jellemzésére szolgáló eljárások ismertek [Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)].
Monoklonális antitestek (MAb) előállításához általában ugyanazokból a lépésekből indulunk ki, mint poliklonális antitestek előállítása során. Röviden, poliklonális antitestet állítunk elő úgy, hogy egy állatot találmány szerinti immunogén készítménnyel immunizálunk, az antigén készítménytől és az alkalmazott eljárástól függően adott esetben előzetes immunoszoktatás mellett (normálsejt-populációhoz szoktatunk, majd az immunizálást tumorsejt-populációval végezzük), majd az immunizált állatból összegyűjtjük az antiszérumot. Az antiszérum előállításához különböző állatfajok alkalmazhatók. Az antiszérumot általában nyúlból, egérből, patkányból, hörcsögből, tengerimalacból vagy kecskéből nyerjük. A nyúl viszonylag nagy mennyiségű vére miatt a poliklonális antitest előállításához előnyösen nyulat használunk.
Ismert, hogy egy adott készítmény immunogén tulajdonsága változhat. Gyakran szükség lehet ezért a gazdaimmunrendszer felerősítésére, amelyhez egy hordozóhoz peptid vagy polipeptid immunogént kapcsolunk. Hordozóként előnyösen alkalmazható például a kulcsluk-limpet-hemocianin (KLH) és boíjú-szérumalbumin
HU 220 347 Β (BSA). Hordozóként alkalmazhatók továbbá más albuminok, így ovalbumin, egér-szérumalbumin vagy nyúlszérumalbumin. A polipeptidet a szokásos módon konjugáljuk a hordozó fehérjével. Ez megvalósítható például glutár-aldehiddel, m-maleimido-benzoil-N-hidroxi-szukcinimid-észterrel, karbodiimiddel vagy biszbiazotizált benzidinnel.
Ismert továbbá, hogy egy adott immunogén készítmény immunogén tulajdonságai javíthatók az immunválasz nemspecifikus stimulátoraival, így adjuvánsokkal. Adjuvánsként előnyösen alkalmazható például a Freundféle adjuváns (elpusztult Mycobacterium tuberculosist tartalmazó nemspecifikus immunválasz-stimulátor), nemkomplett Freund-féle adjuváns, és alumínium-hidroxid-adjuváns.
A poliklonális antitest előállításához alkalmazott immunogén készítmény mennyisége az immunogén típusától, valamint az immunizáláshoz használt állattól függ. Az immunogén adagolása különböző eljárásokkal megvalósítható, így adagolható például szubkután, intramuszkuláris, intradermális, intravénás és intraperitoneális úton. A poliklonális antitest termelésének ellenőrzéséhez vérmintát veszünk az immunizált állattól a folyamat különböző időpontjaiban. Kívánt esetben egy második, megerősítő injekciót is beadunk. A megerősítés és titrálás folyamatát a kívánt titer eléréséig ismételjük. A kívánt titer elérése után az immunizált állatot kivéreztetjük, a szérumot izoláljuk és tároljuk, és/vagy az állatot MAb előállítására használjuk.
Az MAb előállítását a szokásos módon végezzük (például US 4 196 265 számú irat). Ennek során általában úgy járunk el, hogy megfelelő állatot a kiválasztott immunogén készítménnyel, például tisztított vagy részlegesen tisztított tumorsejt vagy érrendszeri endotéliás sejtfehérjével, polipeptiddel, pepiddel vagy ép sejtkészítménnyel immunizáljuk. Az immunizáló készítményt az antitestet termelő sejtek stimulálásának megfelelő módon adagoljuk. Előnyösen alkalmazhatók a rágcsáló-, így egér- és patkány-, továbbá nyúl-, juh- és békasejtek. Patkány alkalmazása bizonyos előnyökkel járhat [Goding idézett müve (1986), 60-61. oldal], de előnyösen egereket, elsősorban BALB/C egereket használunk, mivel ezek alkalmazása általánosan elterjedt, és általában nagy százalékban eredményezi a stabil fúziót.
Az immunizálás után általában antitesttermelő képességgel rendelkező szomatikus sejteket, előnyösen B-limfocitákat (B-sejteket) használunk a monoklonális antitestek termelésére szolgáló ismert módszerek szerint. Ezeket a sejteket az eltávolított lépből, mandulából vagy nyirokcsomókból, vagy perifériás vérmintából nyerjük. Előnyösen alkalmazhatók a lépsejtek és a perifériás vérsejtek, az előző azért, mert nagy mennyiségben tartalmaz antitestet termelő sejteket, amelyek az osztódó plazmablaszt állapotban vannak, míg az utóbbi azért, mert a perifériás vér könnyen hozzáférhető. Gyakran több állatot immunizálunk, és a legnagyobb antitesttitert mutató állat lépét távolítjuk el, és a homogenizált lépből fecskendővel elkülönítjük a limfocitákat. Egy immunizált egér lépe általában mintegy 5 χ 107—2 χ 108 limfocitát tartalmaz.
Az immunizált állatból nyert antitestet termelő Blimfocitákat ezután örök életű mielómasejtekkel fuzionáljuk, amelyeket általában az immunizáláshoz használt állattal azonos fajba tartozó állatból nyerünk. A hibridómatermelő fúzióhoz előnyösen antitestet nem termelő, és nagy fúziós hatékonyságot mutató, valamint enzimhiánnyal rendelkező mielomasejteket használunk, amelyek ezért bizonyos szelektív közegen nem képesek növekedni, és ezért a közeg csak a kívánt fuzionált sejtek (hibridómák) növekedését támogatja.
Bármely ismert mielomasejt felhasználható [Goding idézett műve (1986), 65-66. oldal; Campbell idézett műve (1984), 75-83. oldal], így például, ha immunizált állatként egeret használunk, alkalmazható P3X63/Ag8, X63-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NSO/U, MPC-11, MPC11-X45-GTG 1.7 és S194/5XX0 Bul; míg patkány esetében alkalmazható az R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 vagy bármely, fent említett egérsejtvonal, és humán sejtfúzió esetében alkalmazható az U-266, GM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 és UC729-6.
Egér- és patkány-mielomasejtként előnyösen alkalmazható az A63-A68, 653 mieloma-sejtvonal, amely az ATCC gyűjteményben hozzáférhető. Egy másik egér-mielomasejtvonal a 8-azaguanin-rezisztens SP2/0 egér mieloma, nemtermelő sejtvonal.
Antitestet termelő lép- vagy nyirokcsomósejtekből és mielomasejtekből álló hibridek előállításához általában szomatikus sejteket mielómasejtekkel keverünk mintegy 20:1-1:1 arányban, előnyösen 4:1 arányban, a sejtmembránok fúzióját (kémiai vagy elektromos módon) elősegítő egy vagy több szer jelenlétében. A fúzió megvalósítható Sendai vírus alkalmazásával [Kohler és Milstein idézett művei (1975, 1976)] és polietilénglikol (PEG), így 37 térfogat% PEG alkalmazásával [Gefter és munkatársai idézett műve (1977)]. Alkalmazható továbbá az elektromosan indukált fúziós módszer [Goding idézett műve (1986), 71-74 oldalak],
A fúziós eljárásoknál az életképes hibridek gyakorisága viszonylag kicsi, mintegy 1 χ ΙΟ-6— 1 χ 10-8 érték. Ez azonban nem okoz problémát, mivel az életképes fuzionált hibridek szelektív közegen végzett tenyésztéssel megkülönböztethetők a kiindulási, nem fuzionált sejtektől (elsősorban az olyan nem fuzionált mielomasejtektől, amelyek általában meghatározhatatlan módon osztódnak tovább). A szelektív közeg általában tartalmaz egy olyan szert, amely blokkolja a nukleotidok szintézisét a szövettenyésztő közegben. Az ilyen szerekre előnyös példaként említhető az aminopterin, metotrexát és azaszerin. Az aminopterin és a metotrexát a purinszármazékok és pirimidinszármazékok szintézisét, míg az azaszerin csak purinszármazékok szintézisét blokkolja. Aminopterin vagy metotrexát alkalmazása esetén a közeget hipxantinnal és timidinnel egészítjük ki nukleotidforrásként (HAT közeg). Azaszerin alkalmazása esetén a közeghez hipoxantint adunk.
Szelekciós közegként előnyösen alkalmazható a HAT. HAT közegben csak azok a sejtek maradnak életben, amelyek képesek a nukleotidmentés-útvonal mű38
HU 220 347 Β ködtetésére. A mielomasejtekből hiányoznak a mentési útvonalhoz szükséges kulcsenzimek, például a hipoxantin-foszforibozil-transzferáz (HPRT), ezért ezek a sejtek nem maradnak életben. A B-sejteknél ez az útvonal működik, de élettartamuk tenyészetben korlátozott, és ezért általában mintegy 2 héten belül elpusztulnak. Szelektív közegen tehát csak a mielomasejtekből és B-sejtekből képzett hibridek maradnak életben.
Ezzel a tenyésztési eljárással olyan hibridómapopulációt kapunk, amelyből kiválogathatok a specifikus hibridómák. A hibridómák szelektálásához a sejteket általában egyetlen klón hígításban mikrotitráló lemezeken tenyésztjük, majd az egyedi kiónok felülúszóját (mintegy 2-3 hét elteltével) a kívánt reakcióképességre vizsgáljuk. Ehhez érzékeny, egyszerű és gyors vizsgálatot használunk, ilyen például a radioimmuno-assay, enzimimuno-assay, citotoxikus vizsgálat, plakkvizsgálat, valamint a folt immunokötődési vizsgálat.
A kiválasztott hibridómát ezután sorozatban hígítjuk, és egyedi antitesttermelő sejtvonalakba klónozzuk, amely kiónok ezután függetlenül szaporíthatok az MAb termelése érdekében. A sejtvonalakban az MAb-termelés két alapvető módon váltható ki. Az egyik eljárásnál hibridómamintát fecskendezünk (gyakran a hasüregbe) egy olyan állatba, amely hisztokompatibilis azzal az állattal, amelyet az eredeti fúzióhoz szükséges szomatikus és mielomasejtek előállításához használtunk. A befecskendezett állat a fuzionált sejthibrid által termelt specifikus monoklonális antitestet kiválasztó tumort fejleszt ki. Az állat összegyűjtött testfolyadéka, így széruma vagy hasvize nagy koncentrációban tartalmazza az MAb-t. Az egyedi sejtvonalak in vitro is tenyészthetők, amelynek során az MAb természetes módon a tenyészközegbe választódik ki, ahol nagy koncentrációban összegyűlik. A fenti módszerek valamelyikével előállított MAb kívánt esetben tovább tisztítható, például szűréssel, centrifugálással vagy különböző kromatográfiás módszerekkel, így HPLC vagy affinitáskromatográfiával.
A monoklonális antitestek előállíthatok molekuláris klónozással is. Ehhez immunizált állat lépéből izolált RNS-ből kombinált immunoglobulin phagemid tárat állítunk elő, és a megfelelő antitesteket kifejező phagemideket az antigént kifejező sejtek és kontrollsejtek, például normál/tumorsejtek segítségével szelektáljuk. Az eljárás előnye a szokásos hibridómatechnikával szemben, hogy mintegy 104-szeres mennyiségben képes az antitest termelésére és vizsgálatára egy körön belül, és a H és L láncok kombinálásával új tulajdonságok alakíthatók ki, amelyek tovább növelik a megfelelő antitest megtalálásának esélyét.
A találmány szerint alkalmazott MAb lehet humán, patkány, egér, majom, hörcsög, csirke és nyúl eredetű. Előnyösen alkalmazhatók a humán antitestek, valamint az egérből, patkányból vagy más fajból származó, humán állandó és/vagy változó szakaszdoméneket tartalmazó humanizált vagy kimér antitestek vagy más rekombináns antitestek és ezek ffagmensei. A könnyű előállíthatóság és a reagensek hozzáférhetősége miatt különösen előnyös az egér monoklonális antitest.
2. Funkcionális antitestkötő szakasz
A találmány szempontjából nem kritikus a célba juttató szerként alkalmazott antitest vagy antitestffagmens [például Fab’, Fab, F(ab’)2, Fv vagy scFv] eredete vagy származása, amennyiben a bispecifikus ligandum előállításához alkalmazott antitest vagy fragmens rendelkezik a kívánt kötődési tulajdonságokkal.
Egyes esetekben olyan antitestkészítményt használunk, amelyben hiányzik az Fc szakasz. Az immunoglobulinmolekulák fragmentálása megvalósítható szabályozott proteolízissel, de ennek körülményei a fajtól és immunoglobulinosztálytól és -alosztálytól függően változnak. A kétértékű F(ab’)2 lfagmensek általában előnyösebbek, mint az egyértékű Fab vagy Fab’ lfagmensek.
Az Fab ffagmensek előállíthatok a teljes immunoglobulin nemspecifikus tiol-proteáz papainnal végzett proteolízisével. A papaint először aktiválni kell az aktív helyen található szulfhidrilcsoport ciszteinnel, 2-merkapto-etanollal vagy ditio-treitollal történő redukálásával. Az alapenzimben található nehézfémeket EDTAval (2 mmol/1) történő kelátképzéssel távolítjuk el az enzimaktiválás maximalizálása érdekében. Az enzimet és a szubsztrátumot általában 1:1000 tömegarányban keverjük össze. Inkubálás után a reakciót a tiolcsoport jód-acetamiddal történő irreverzibilis alkilezésével vagy egyszerű dialízissel állítjuk meg. Az emésztés mértékét SDS-PAGE vizsgálattal ellenőrizzük, és a különböző frakciókat A-fehérje-Sepharose vagy ioncserélő kromatográfiával választjuk szét.
Az F(ab’)2 ffagmensek előállításához nyúl vagy humán IgG-t pepszinenzimmel proteolizálunk (7.3.2 receptúra). Az előírás szerint a százszoros tömegfeleslegben acetátpufferben felvett antitestet pH=4,5 értéknél 37 °C hőmérsékleten emésztjük, amikor is az antitest a középső nehéz lánc diszulfidkötésénél a C-terminális szakaszon hasad. Az egér-IgG emésztésének mértéke az alosztálytól függően változhat, és nehéz nagy mennyiségben olyan aktív F(ab’)2 fragmens előállítása, amely bizonyos mennyiségű emésztetlen vagy teljesen elroncsolt IgG-től mentes. Különösen az IgG2b érzékeny nagyon a teljes roncsolásra. Más alosztályokhoz eltérő inkubálási körülményekre van szükség az optimális eredmények eléréséhez.
Patkány-IgG pepszinnel történő emésztését 0,1 mol/1 acetátpufferben (pH=4,5) végezzük dialízissel, majd 4 órán keresztül 1 tömeg% pepszinnel inkubáljuk. Az IgGj és IgG2a emésztés javítható, ha az előzetes dialízist 0,1 mol/1 formiátpufferben (pH=2,8) végezzük 4 °C hőmérsékleten és 16 órán keresztül, majd ezt követi az acetátpufferes dialízis. Még jobb eredményeket kapunk IgG2b-vel, ha az inkubálást 3 tömeg% Staphylococcus V8 proteázzal végezzük 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-pufferben (pH=7,8) 4 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten.
3. Bispecifikus antitestek
A bispecifikus antitestek előállítása ismert [például Glennie és munkatársai idézett műve (1987)]. Bispecifikus antitesteket alkalmaznak például a klinikai gyakorlatban rákos betegek kezelésére [Bauer és munkatársai idézett műve (1991)]. Bispecifikus antitest előállítására alkalmas egyik módszer szerint külön előállítjuk a cél39
HU 220 347 Β ba vett tumorsejtantigénre specifikus antitestet és a koaguláló szerre (vagy más kívánt célpontra, így aktiváló antigénre) specifikus antitestet.
Bispecifikus antitestek alkalmazhatók továbbá immunoterápiás szerként. Mint az antigén indukciójával kapcsolatosan korábban említettük, ezeket az antitesteket azért fejlesztették ki, hogy összekössék a limfocitákat és a tumorantigéneket [Nelson idézett műve (1991); Segal és munkatársai idézett műve (1992)]. Példaként említhetők az olyan kimér molekulák, amelyek T-sejtekhez kötődnek, például CD3, és tumorantigénekhez kötődnek, és kiváltják a limfocita aktiválását, amelyhez a TCR/CD3 komplex a célba vett sejt közvetlen szomszédságában fizikailag megkötődik [Staerz és munkatársai idézett műve (1985); Perez és munkatársai idézett művei (1985, 1986a és 1986b); Ting és munkatársai idézett műve (1988)].
Karcinómák, limfómák, leukémiák és melanomák tumoros sejtjei T-sejtek által bispecifikus antitestekkel közvetített módon elpusztíthatok [Nelson idézett műve (1991); Segal és munkatársai idézett műve (1992); deLeij és munkatársai idézett műve (1991)]. Ezeket a bispecifikus antitesteket felhasználták különböző I fázisú klinikai kísérletekben is különböző tumoros célpontok ellen. Ezek a találmány értelmében nem új készítmények, de a bispecifikus keresztkötések kialakítására alkalmas antitestek és a bispecifikus koaguláló ligandumok kombinált alkalmazása az oltalmi körhöz tartozik. A bispecifikus keresztkötések kialakítására alkalmas antitesteket a szokásos módon adagoljuk [deLeij és munkatársai idézett műve (1991); Clark és munkatársai idézett műve (1991); Rivoltini és munkatársai idézett műve (1992); Bolhuis és munkatársai idézett műve (1992); Nitta és munkatársai idézett műve (1990)].
Bispecifikus antitestek előállítására különböző eljárások alkalmazhatók, így például eljárhatunk úgy, hogy a két kiválasztott antitestből F(ab’y)2 peptikus fragmenset készítünk, majd mindkettőt redukálva külön Fab’ySH fragmenseket állítunk elő [Glennie és munkatársai idézett műve (1987)]. A két összekapcsolandó partner egyikének SH csoportját ezután keresztkötések kialakítására alkalmas szerrel, például o-fenilén-dimalein-imiddel alkilezzük, és így az egyik partneren szabad malein-imid-csoportot kapunk. Ezt a partnert ezután tioéterkötésen keresztül a másikhoz konjugáljuk, és így a kívánt F(ab’y)2 heterokonjugátumot kapjuk.
Bispecifikus antitestek előállítására előnyösen alkalmazható a fenti eljárás, mivel könnyen megvalósítható, nagy kitermeléssel jár, és könnyen reprodukálható, de erre a célra ismertek más eljárások is. így például, a keresztkötés kialakítható SPDP vagy A fehérje segítségével is, vagy előállítható trispecifikus szerkezet is [Titus és munkatársai idézett műve (1987); Tutt és munkatársai idézett műve (1991)].
Bispecifikus antitestek előállítására alkalmas másik lehetőség, hogy két hibridóma fuzionálásával kvadrómát alakítunk ki [Flavell és munkatársai idézett művei (1991, 1992); Pimm és munkatársai idézett műve (1992); French és munkatársai idézett műve (1991); Embleton és munkatársai idézett műve (1991)]. A kvadróma kifejezés két B-sejt-hibridóma produktív fúzióját jelenti. A szokásos módszerekkel két antitesttermelő hibridómát fuzionálva utódsejteket hozunk létre, és ezeket mindkét klóntípushoz tartozó immunoglobulingének kifejezésével fenntartjuk, és szelektáljuk.
Kvadróma előállításához előnyösen úgy járunk el, hogy legalább egy szülőhibridómából enzimhiányos mutánst szelektálunk. Ezt az első mutáns hibridómasejtvonalat egy olyan második hibridóma sejtjeivel fuzionáljuk, amelyet letálisan, például jód-acetamiddal kezeltünk, és így megakadályozzuk a folyamatos túlélést. A sejtfúzió biztosítja az első hibridóma túlélését, mivel az enzim hiányához szükséges géneket a letálisan kezelt hibridómából megszerzi, míg a második hibridóma azért marad életben, mert fúziónál az első hibridómával. Előnyös, ha a fúziót azonos izotípusú, de különböző alosztályokhoz tartozó immunoglobulinokkal végezzük. A vegyes alosztályú antitest alternatív vizsgálatot tesz lehetővé az előnyös kvadróma izolálásához.
Közelebbről, a kvadróma kifejlesztésének és vizsgálatának egyik lehetősége, hogy olyan hibridómavonalat fejlesztünk ki, amely kiválasztja az első kiválasztott MAb-t, és az esszenciális metabolikus enzimként szolgáló hipoxantin-guanin-foszforibozil-transzferáz (HGPRT) vonatkozásában hiányossá teszi. A hibridóma hiányos mutánsának előállításához a sejteket növekvő koncentrációjú 8-azaguanin (1 x 10~7 mol/1-1 χ 10~5 mol/1) jelenlétében növesztjük. A mutánsokat korlátozott hígítással szubklónozzuk, és vizsgáljuk a hipoxantin/aminopterin/timidin (HAT) érzékenységet. Tenyészközegként alkalmazható például 10% FCS-sel, 2 mmol/1 L-glutaminnal és 1 mmol/1 penicillin-sztreptomicinnel kiegészített DMEM.
A második kívánt MAb-t termelő komplementer hibridóma-sejtvonalból a szokásos sejtfuziós módszerrel [Galfre és munkatársai idézett műve (1981)] vagy más ismert módon [Clark és munkatársai idézett műve (1988)] állítjuk elő a kvadrómát. Röviden, 4,5 xlO7 HAT érzékeny első sejtet 2,8 χ 107 HAT rezisztens második sejttel keverünk, ahol a második sejteket előzetesen letális dózisú irreverzibilis biokémiai inhibitorral, így jód-acetamiddal (5 mmol/1 foszfát-pufferolt sóoldatban) előkezeljük 30 percen keresztül és jeges hűtés mellett. A sejtfúziót polietilénglikollal (PEG) indítjuk, és a sejteket 96 mérőhelyes mikrotitráló lemezekre visszük. A kvadrómákat HAT-t tartalmazó közegen szelektáljuk. A bispecifikus antitestet tartalmazó tenyészeteket azonosítjuk, például szilárd fázisú izotípusra specifikus ELISA vagy izotípusra specifikus immunofluoreszcens megfestési vizsgálattal.
A bispecifikus antitest azonosítására alkalmas egyik módszer szerint mikrotitráló lemezeket (Falcon, Becton Dickinson Labware) olyan reagenssel vonunk be, amely specifikus kölcsönhatást gyakorol a szülőhibridóma-antitestek egyikére, és mindkét antitestre vonatkozó keresztreakció-képességtől mentes. A lemezeket mossuk, blokkoljuk, és az egyes mérőhelyekhez hozzáadjuk a vizsgálandó felülúszót. A lemezeket 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd
HU 220 347 B a felülúszót eldobjuk, a lemezeket mossuk, és hígított lúgos foszfatáz/antitest konjugátummal 2 órán keresztül szobahőmérsékleten kezeljük. A lemezeket mossuk, és minden mérőhelyhez foszfatáz szubsztrátumot, például p-nitrofenil-foszfátot (Sigma, St. Louis) adunk. A lemezeket inkubáljuk, és a reakció megállításához minden mérőhelyhez 3n nátrium-hidroxid-oldatot adunk. Az OD410 értéket ELISA leolvasóval határozzuk meg.
Az azonosítás megvalósítható úgy is, hogy mikrotitráló lemezeket poli-L-lizinnel előkezelünk, majd minden mérőhelyhez hozzákötjük a kívánt célsejtet. A sejteket fixáljuk, például 1% glutár-aldehid segítségével, és a bispecifikus antitesteket az ép sejtekhez történő kötődés mértékére vizsgáljuk. Emellett, az előnyös kvadrómák azonosítására alkalmazhatók az antitestek jellemzésére szokásos egyéb eljárások is, így FACS, immunofluoreszcens megfestés, idio-típusú specifikus antitestek, antigénkötő kompetitív vizsgálat, és más hasonló megoldás.
A kvadróma izolálása után a bispecifikus antitesteket megtisztítjuk a többi sejttermékektől. Ez különböző fehérjeizolációs módszerekkel megvalósítható, példaként említhető a szokásos immunoglobulintisztítás. Antitestek előállítására és jellemzésére alkalmas módszerek ismertek [például Antibodies: A Laboratory Manual (1988)].
így például, a szelektált kvadrómákból származó felülúszót A fehéije vagy G fehérje szefaróz oszlopon áthajtva megkötjük az IgG-t (az izotípustól függően). A kötött antitesteket ezután eluáljuk, például pH=5,0 értékű citrátpufferrel. A bispecifikus antitesteket tartalmazó frakciókat izotónikus pufferrel szemben dializáljuk. Alternatív módon, az eluátumot antiimmunoglobulin szefaróz oszlopon hajtjuk át. A bispecifikus antitesteket 3,5 mol/1 magnézium-kloriddal eluáljuk. A tisztított bispecifikus antitesten vizsgáljuk a kötődési aktivitást, például izotípusra specifikus ELISA vizsgálattal, vagy a célsejt immunofluoreszcens megfestésével.
A tisztított bispecifikus antitestek és a szülőantitestek jellemzésére és izolálására alkalmazható továbbá az SDS-PAGE elektroforézis, és ezt követő megfestés ezüsttel vagy Coomassie festékkel. Ez akkor lehetséges, ha a szülőantitestek egyike nagyobb móltömegű, mint a másik, és ilyenkor a bispecifikus antitest sávja a két szülőantitest sávja között található. A minták redukálásával ellenőrizhetjük a két különböző látszólagos móltömegű nehéz lánc jelenlétét.
Antitestek előállítása megvalósítható továbbá rekombináns technológiával, amelynek során a kívánt kettős specifitással rendelkező antitestet kódoló rekombináns antitestgéneket állítunk elő [Van Duk és munkatársai idézett műve (1989)]. Ilyenkor a legelőnyösebb kötődési tulajdonságokkal rendelkező monoklonális antitestek szelektálása után izoláljuk az adott antitestekre vonatkozó géneket, ami megvalósítható például egy tág kifejezőtár immunológiai vizsgálatával [Oi és Morrison idézett műve (1986); Winter és Mustéin idézett műve (1991)]. Ezután a Fab kódoló domének átrendezésével könnyen előállítható a kívánt kimér szerkezet.
E) Kötődési vizsgálatok
A találmány szerinti megoldás elsősorban humán és állatkezelési eljárásokban alkalmazható, de felhasználható több más gyakorlati célból is. Ezek a felhasználási területek általában összefüggésben vannak a bispecifikus vegyületek speciális kötődési képességével. Mivel a találmány szerinti vegyületek legalább egy célba juttató és kötőkomponenst tartalmaznak, ami lehet például antitest, ligandum, receptor, vagy más hasonló, a kapott bispecifikus szerkezet gyakorlatilag minden olyan kötéssel járó eljárásban felhasználható, ahol alkalmazható az eredeti antitest, ligandum, receptor vagy más felhasznált komponens. A koaguláns vagy más kötőszakaszok jelenléte nem befolyásolja az első kötőszakaszok alkalmazhatóságát bármely kötődési vizsgálatban.
A bispecifikus koaguláló ligandum önmagában felhasználható a standard kötődési vizsgálatokban, így az immunfolt, Westem-folt és más vizsgálatokban, amelyekben egy antigént immobilizálunk egy szilárd hordozó mátrixon, például nitrocellulózon, nejlonon vagy ezek kombinációján. Felhasználhatók egyszerűen „antitesthelyettesítőként” vagy egy különlegesen specifikus detektálóeszközként olyan antigének kimutatására, amelyek szokásos szekunder reagensei túl nagy háttérjelet adnak. Ez különösen hasznos akkor, ha a tanulmányozott antigén önmagában immunoglobulin vagy az eljárásban más antitesteket használunk, például ELISA vizsgálatban.
A bispecifikus kötőligandum felhasználható továbbá friss-fagyasztott vagy formaimban fixált, paraffinba beágyazott szövetblokkok immunohisztokémiai vizsgálatánál; fluoreszcens módon aktivált sejtválogatásnál, áramló citometriás vizsgálatnál vagy áramló mikrofluorimetriás vizsgálatnál; immunokicsapásnál a kívánt antigénnek a komplexelegyből történő elválasztásához, amikor is a molekularács képzésére való hajlamuk miatt ezekkel szekunder mátrixképző reagens nélkül is elérhetjük a kicsapást; antigén vagy sejttisztító eljárásoknál, így affinitáskromatográfiánál, bizonyos esetekben, beleértve egy vagy több sejtpopuláció egy időben történő egylépéses gyors tisztítását is; és sok más ismert kötődési vizsgálatban.
A találmány szerinti bispecifikus ligandumok felhasználhatók például az ELISA vizsgálatban. A gyakorlatban az ELISA vizsgálatnak különböző típusai ismertek és elterjedtek. A bispecifikus ligandum bármely kötődési lépésnél felhasználható az alkalmazott ELISA vizsgálat adott típusától és a detektálandó „antigén” (komponens) típusától függően. A ligandum felhasználható tehát a lap bevonására, alternatív kötőhelyek biztosítására, standard görbe felvételére szolgáló antigénként, primer kötőligandumként, szekunder kötőligandumként vagy akár tercier vagy későbbi kötőligandumként. A különböző ELISA vizsgálatokat a szokásos módon hajtjuk végre, néhányat a későbbi példákban bemutatunk.
Az ELISA vizsgálatok egyik változatánál a kötésre kiszemelt célpontot, általában antitestet, szelektált felületen, előnyösen fehérjeaffmitással rendelkező felületen, például egy polisztirol mikrotitráló lemez mérőhe41
HU 220 347 B lyein immobilizáljuk. A tökéletlenül adszorbeált anyag mosással történő eltávolítása után a vizsgálati lemez mérőhelyeit előnyösen olyan nemspecifikus fehérjével kötjük meg vagy fedjük be, amely antigénszempontból semleges a vizsgált antiszérumra, ilyen a borjú-szérumalbumin (BSA), kazein vagy tejporoldat. Ez lehetővé teszi az immobilizált felület nemspecifikus adszorpciós helyeinek blokkolását, és így csökkenti az antiszérum nemspecifikus kötődéséből eredő háttérzajt.
Ezeknél az ELISA vizsgálatoknál, amelyeket általában szendvics ELISA vizsgálatnak nevezünk, a lemezhez kötött antitestet használjuk az antigén „csapdájaként”. Az első antitest mérőhelyekhez történő megkötése, a háttér csökkentése érdekében nem reakcióképes anyaggal történő bevonás és a kötetlen anyag eltávolítása érdekében végzett mosás után az immobilizált felületet a példaszerűen jelenleg tárgyalt esetben a detektálandó és/vagy titrálandó antigén anyagot tartalmazó vizsgálati mintával érintkeztetjük immunkomplex (antigén/antitest) képzését biztosító körülmények között. Ezek az eljárások különösen alkalmasak ligandumoknak klinikai mintákban vagy biológiai extraktumokban történő kimutatására. A mintát előnyösen BSA, borjú-gammaglobulin (BGG) és foszfátpufferolt sóoldat (PBS) és detergens, például Tween oldatával hígítjuk.
A felvitt antiszérumot ezután 2-4 órán keresztül előnyösen 25-37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Az inkubálás után az antiszérummal érintkeztetett felületet mossuk az immunokomplexből kimaradt anyag eltávolítása érdekében. A mosást előnyösen PBS/Tween oldattal vagy borátpufferrel végezzük.
A kötött antigén és a vizsgálati minta közötti specifikus immunokomplex kialakítása és az ezt követő mosás után ellenőrizzük az immunokomplex képződését, és mérjük annak mennyiségét. Ez megvalósítható úgy, hogy a komplexet egy szekunder specifikusan kötődő komponenssel, általában egy antitestalapú komponenssel kezeljük. A jelen esetben, a találmány szerinti bispecifikus ligandum ebben a lépésben használható. Ezután további specifikus kötési és mosási lépéseket végzünk.
A detektáláshoz jelen esetben egy harmadik antitestet használunk, amelyhez detektálójel, így megfelelő kromogén szubsztrátummal inkubálva elszíneződést kiváltó enzim csatlakozik. A harmadik vagy tercier, jelölt antitest a bispecifikus ligandum egyik komponenséhez kötődik. Az immunokomplexet a megfelelő kötési és mosási lépések után a jelölés detektálásával azonosítjuk, például kromogén szubsztrátumon végzett inkubálással, ahol a szubsztrátum lehet karbamid, bróm-krezol-bíbor vagy 2,2’-azino-di(3-etil-benztiazolin)-6-szulfonsav (ABTS) és víz. A mennyiségi meghatározáshoz mérjük az elszíneződés mértékét, ami megvalósítható például látható spektrumú spektrofotométerrel.
További előnnyel jár, ha a fenti ELISA vizsgálatban szekunder detektálóreagensként bispecifikus koaguláló ligandumot használunk. Ez lehetővé teszi egy olyan tercier, jelölt antitest alkalmazását, amely a bispecifikus ligandumnak az általában megcélzott antitest konstans szakaszoktól eltérő részére specifikus. Felhasználható például olyan tercier kötőligandum, amely a bispecifikus szerkezet koaguláló részére (vagy koagulánst megkötő részére) specifikus. Az immunkomplex képződésének detektálására alkalmas fenti új eszköz fokozott specifitással rendelkezik, amely különösen előnyös olyan szendvics ELISA vizsgálatban, ahol a tercier antitest esetleg keresztreakcióba lép vagy hozzákötődik a lemez bevonására alkalmazott eredeti anyaghoz, vagyis az eredeti antitesthez, ami csökkenti a kívánt szekunder antitesthez történő kötődést. Ajelölt tercier komponensnek egy bispecifikus ligandum nem antitest szakaszához vagy akár annak új antigénkombináló szakaszához történő irányításával kiküszöbölhető a nemspecifikus kötődés által okozott tévedés és szokatlanul nagy háttérzaj.
A bispecifikus ligandum további gyakorlati felhasználásai annak koaguláló képességén alapulnak. Mivel valamennyi vegyület képes koagulálás kiváltására, ezek felhasználhatók például koagulációval járó vizsgálatok kontrollanyagaként. A célba juttató szer jelenléte nem befolyásolja a koaguláns ilyen vizsgálatokban történő alkalmazhatóságát, mivel az egyes komponensek egymástól függetlenül funkcionálnak.
F) Szövetfaktorhoz kötődő bispecifikus antitestek hatékony felhasználása
Mint fent említettük, a szövetfaktor (TF) a vér koagulálásának kiváltására alkalmas egyik szer. A TF érsérülés vagy bizonyos citokinok aktiválásának hatására kerül a vérbe. A hozzáférhető TF ezután komplexet képez a Vlla faktorral, ami megindítja a koagulációs sorozatot, és ez végeredményként fibrinképzódéshez vezet.
A találmány szerinti megoldás egyik megvalósítási módja az olyan bispecifikus antitest, amelynek egyik antigénkombináló helye tumorérrendszer endotéliás sejtjein található antigénre specifikus, és másik antigénkombináló helye a humán TF extracelluláris doménjeire specifikus. Ismert, hogy a humán TF-re specifikus antitest nagy affinitással köti meg a TF-t anélkül, hogy befolyásolná a VHa faktorral történő komplexképzést vagy a TF/VIIa faktor aktivitását [Morrissey és munkatársai idézett műve (1988)]. Teljes hosszúságú humán TF helyett a találmány értelmében inkább csonkolt TF-t (tTF) használunk, amely mentes a citoplazma és transzmembrán doménektől. A csonkolt TF nem rendelkezik koagulációt kiváltó hatással, de továbbra is képes arra, hogy komplexet képezzen a Vlla faktorral. Ennek oka feltehetően az, hogy a csonkolt TF nem képes komplexet képezni a membrán felületével, ami hozzáférhetővé tenné a koagulációt megindító komplexeket, így a X faktort.
A tumorérrendszeri endotéliás sejtekre specifikus célba juttató szerkezet hatékonyságának mérésére egy újonnan kifejlesztett egérmodellt használunk, amelyben a normálszövetek érrendszeréből hiányzó MHC II osztályba tartozó antigéneket a tumor érrendszere fejezi a tumorsejtek által kiválasztott IFN-γ hatására [Burrows és munkatársai idézett műve (1992); Burrows és Thorpe idézett műve (1993)]. Kimutatták, hogy az intravénásán adagolt antill osztálybeli antitest gyorsan és kifejezetten a tumorérrendszerben lokalizálódik [Burrows és munkatársai idézett műve (1992)].
HU 220 347 Β
Kimutattuk, hogy a 0300 (MUy) tumort hordozó egérben az antiMHC II osztály/antiTF bispecifikus antitest a koagulációt specifikusan a tumor érrendszerében váltja ki, ha a bispecifikus antitestet tTF-fel együtt adagoljuk. Az antitest/tTF komplex intravénás adagolása gyors trombózist okoz a tumor érrendszerében és kiváltja a tumor elpusztulását az állatok 70%-ában. Sem a bispecifikus antitest önmagában, sem a tTF önmagában, sem a tTF alkalmazásával vagy anélkül képzett kontrollantitest-izotípusok nem képesek ugyanilyen hatás kiváltására. Ez arra utal, hogy a B21-2/1 OH 10 bispecifikus antitest koaguligandumként működik, vagyis a célba vett sejteket oly módon köti össze a tTF-fel, hogy a tTF képes a X faktor aktiválására, és a koagulációs folyamat megindítására. Ez egyidejűleg igazolja, hogy a koaguligandum előnyösen alkalmazható szilárd tumorok kezelésére.
G) Gyógyszerkészítmények és készletek
A találmány szerinti gyógyszerkészítmények általában hatékony mennyiségben bispecifikus koaguláló ligandumot tartalmaznak gyógyszerészeti hordozóanyagban vagy vizes oldatban oldva vagy diszpergálva.
A „gyógyszerészeti” kifejezés olyan anyagokra és készítményekre vonatkozik, amelyek embernek vagy állatnak adagolva nem váltanak ki káros, allergiás vagy más nemkívánt reakciókat. A gyógyszerészeti hordozóanyag lehet például valamely oldószer, diszperziós közeg, bevonóanyag, antibakteriális és gomba elleni szer, valamint izotónikus és abszorpciót késleltető szer. Az ilyen hordozóanyagok és ezek alkalmazása közismert. A készítményekben minden olyan hordozóanyag felhasználható, amely összeférhető a hatóanyaggal. A találmány szerinti készítményekben kívánt esetben kiegészítő hatóanyagok is felhasználhatók.
1. Parenterális készítmények
A találmány szerinti bispecifikus ligandumot gyakran parenterális adagolásra alkalmas készítmény, így intravénás, intramuszkuláris, szubkután vagy más módon beadható injekció vagy közvetlenül a tumor vagy betegség helyére juttatható készítmény formájában szereljük ki. A hatóanyagként tumort célbavevő koaguláló szert tartalmazó vizes készítményt a szokásos módon állítjuk elő. A készítmény lehet befecskendezhető folyékony oldat vagy szuszpenzió, vagy a befecskendezés előtt folyadék hozzáadásával oldattá vagy szuszpenzióvá alakítható szilárd készítmény, valamint emulzió.
Az oldatokban a hatóanyag alkalmazható szabad bázis vagy farmakológiailag alkalmazható só formájában. Az oldatok előállításához a hatóanyagot vízzel keverjük felületaktív anyag, így hidroxi-propil-cellulóz jelenlétében. Alkalmazhatók továbbá diszperziók is, ezek előállíthatok például glicerinben, folyékony polietilénglikolban, ezek elegyében vagy olajban. Normálkörülmények között történő tároláshoz és alkalmazáshoz ezek a készítmények további komponensként mikroorganizmusok növekedését gátló tartósítószert tartalmaznak.
Az injektálható készítmény lehet például steril vizes oldat vagy diszperzió, szezámolajban, mogyoróolajban vagy vizes propilénglikolban felvett készítmény, valamint steril, injektálható oldat vagy diszperzió utólagos előállítására alkalmas steril por. Valamennyi készítményforma steril és oly mértékben folyékony, ami lehetővé teszi a könnyű fecskendezhetőséget. Fontos továbbá, hogy a gyártás és tárolás körülményei között stabil legyen, és megvédjük mikroorganizmusok, így baktériumok és gombák szennyező hatásától.
A bispecifikus ligandum vagy antitest a készítményben alkalmazható semleges formában vagy só formájában. A farmakológiailag alkalmazható só lehet például savaddíciós só (amit a fehérje szabad aminocsoportjával alakítunk ki), ahol savként alkalmazhatók szervetlen savak, így sósav vagy foszforsav, valamint szerves savak, így ecetsav, oxáisav, borkősav és mandulasav. A sóképzés megvalósítható továbbá a szabad karboxilcsoportokkal, amikor is bázisként alkalmazhatunk szervetlen bázist, így nátrium-hidroxidot, kálium-hidroxidot, ammónium-hidroxidot, kalcium-hidroxidot vagy vas-hidroxidot, valamint szerves bázist, így izopropilamint, trimetil-amint, hisztidint vagy prokaint.
A hordozóanyag lehet oldószer vagy diszpergáló közeg, például víz, etanol, poliol (így glicerin, propilénglikol és folyékony polietilénglikol), ezek elegye vagy növényi vagy állati olaj. A folyadékjelleg fenntartható például diszperzió esetén megfelelő szemcseméretet biztosító bevonóanyaggal, így lecitinnel, vagy felületaktív anyaggal. A mikroorganizmusok hatása megelőzhető különböző antibakteriális és gomba elleni szerekkel, amelyekre példaként említhető a parabén, klór-butanol, fenol, szorbinsav és timerozál. További komponensként előnyösen alkalmazhatók izotonizálószerek, például cukor vagy nátrium-klorid. Az injektálható készítmény abszorpciója elnyújtható abszorpciót késleltető szer, így alumínium-monosztearát vagy zselatin alkalmazásával.
Steril injektálható oldat előállításához a kívánt mennyiségű hatóanyagot a megfelelő oldószerben vesszük fel a kívánt esetben alkalmazott, fent említett további komponensekkel együtt, majd az oldatot sterilen szűrjük. Diszperzió előállításához a sterilizált hatóanyagot steril hordozóban vesszük fel, amely tartalmazza az alap diszpergálóközeget és a kívánt esetben alkalmazott, fent említett további komponenseket. Steril injektálható oldattá átalakítható steril por előállításához előnyösen vákuumszárítást és fagyasztva szárítást használunk, amelynek során a hatóanyagot és a kívánt esetben alkalmazott további komponenseket tartalmazó sterilen szűrt oldatot porrá alakítjuk.
Formulázás után az oldatot a dóziskészítménnyel kompatibilis módon és terápiásán hatékony mennyiségben adagoljuk. A készítmények különböző dózisformákban könnyen adagolhatok, példaként említhető a fent ismertetett injektálható oldat, valamint a hatóanyagot felszabadító kapszula.
A találmány szerinti gyógyszerkészítmény a gyógyszerészeti hígítóanyag és segédanyag mellett a bispecifikus ligandumot általában olyan mennyiségben tartalmazza, amely a kívánt alkalmazásnak megfelelő végső koncentráció tartományába esik. A készítmények előállítását ismert módon végezzük [például Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, Mack Publishing
HU 220 347 Β
Company (1980)]. Megjegyezzük, hogy az endotoxinszennyezés mértékét a minimális biztonsági szinten tartjuk, amelynek értéke például legfeljebb 0,5 ng/mg fehérje. Emellett, a humán adagolásra szánt készítményeknek ki kell elégíteni a szokásos sterilitási, pirogenitási, biztonsági és tisztasági követelményeket.
A terápiásán hatékony dózist állatkísérletekkel könnyen meghatározhatjuk (lásd a III. példát). A klinikai alkalmazás előtt a megfelelő terápiás dózist gyakran szilárd tumort hordozó állatok segítségével optimalizáljuk. Ilyen modellekkel a hatékony rák elleni stratégia jól tervezhető. A preklinikai vizsgálatokban előnyösen alkalmazhatók a szilárd tumort hordozó egerek (lásd a III. példát).
A bispecifíkus szerkezet toxikus szintjének és optimális tumor elleni hatást és minimális toxikusságot biztosító hatékony tartományának meghatározásához Cl300 (Mo8) tumort hordozó egeret használunk.
Rák kezelése esetén hatékony dózis mintegy 0,1-2 mg/kg, előnyösen mintegy 0,8-1,2 mg/kg a IV úton hetente egy alkalommal adagolva. A dózis mértéke a kezelendő beteg állapotától függően változhat. A megfelelő dózist a kezelést végző személy az egyedi beteg figyelembevételével határozza meg. Az ilyen optimalizálást és adaptálást a szokásos módon végezzük.
A találmány szerinti megoldás egyik megvalósítási módja, hogy a koaguláló szemek a tumor helyére történő szállításához komplexen kívüli bispecifíkus kötőligandumot adagolunk, amely a keringésből endogén koaguláló faktort szabadít fel, és azt a tumor helyén koncentrálja. Ebben az esetben az adagolt gyógyszerkészítmény célba juttató és koaguláns kötőszakaszt tartalmazó ligandumot tartalmaz, és egyéb szempontból azonos a fent ismertetett készítménnyel.
A parenterális adagolásra, így intravénás vagy intramuszkuláris injektálásra alkalmas készítmény mellett használhatók más gyógyszerformák is, például tabletta vagy más orális adagolásra alkalmas szilárd készítmény, nyújtott hatóanyag-leadású kapszula vagy liposzómakészítmény. A kezelendő beteg állapotától függően más gyógyszerkészítmények is felhasználhatók. Ezekre példaként említhetők a helyi kezelésre alkalmas készítmények dermatitis és psoriasis kezelésére, valamint diabetikus recehártya-betegség kezelésére alkalmas szemészeti készítmények.
2. Lenyelhető készítmények
A hatóanyag bizonyos esetekben orálisan is adagolható. Ezt olyan hatóanyagoknál használhatjuk, amelyek rezisztensek vagy rezisztenssé tehetők az emésztőenzimek proteolízisével szemben. Ezek a vegyületek általában kémiailag előállított vagy módosított szerek, jobbraforgató peptideken alapuló szerek, liposzómakészítmények és peptidázok és lipázok hatását elkerülő, nyújtott hatóanyag-leadású kapszulák.
Orális adagoláshoz a hatékony bispecifíkus vegyületet például inért hígítóanyaggal vagy emészthető hordozóanyaggal szereljük ki, kemény- vagy lágyhéjú zselatinkapszulába zárjuk, tablettává préseljük, vagy közvetlenül a táplálékba keverjük. Orális adagoláshoz a hatóanyaghoz segédanyagok keverhetők, és a készítmény kiszerelhető emészthető tabletta, bukkális tabletta, kapszula, elixír, szuszpenzió, szirup vagy más hasonló készítmény formájában. Az ilyen készítmények legalább 0,1% hatékony bispecifíkus koagulánst tartalmaznak. A készítmény hatóanyag-tartalma természetesen változhat, értéke általában mintegy 2-60 tömeg%. A hatóanyag mennyiségének megfelelő megválasztásával hatékony dózisú készítményt állítunk elő.
A tabletta, pirula, kapszula és más hasonló készítmény további komponensként például segédanyagot tartalmaz. Ilyenre példaként említhető a kötőanyag, így tragakant gumi, akácia, kukoricakeményítő vagy zselatin; töltőanyag, így dikalcium-foszfát, szétesést elősegítő szer, így kukoricakeményítő, burgonyakeményítő vagy alginsav; csúsztatószer, így magnézium-sztearát; valamint édesítőanyag, így szaccharóz, laktóz vagy szaccharin, vagy ízesítőszer, így borsmenta, gaultériaoldat vagy cseresznyeíz. A kapszula formájában kiszerelt dózisegység a fenti anyagok mellett tartalmazhat folyékony hordozóanyagot is.
Különböző további anyagok alkalmazhatók a dózisegység bevonására vagy fizikai formájának más módon történő módosítására, így például, a tabletta, pirula vagy kapszula bevonására alkalmazható shellak és/vagy cukor. A szirup vagy elixír a hatóanyag mellett tartalmazhat édesítőszert, így szaccharózt, tartósítószert, így metil- vagy propil-parabént, színezéket és ízesítőanyagot, így cseresznye- vagy narancsízt. A dózisegységek előállításához természetesen csak gyógyszerészeti tisztaságú és lényegében nemtoxikus anyag használható. A hatóanyag kiszerelhető továbbá nyújtott hatóanyag-leadású készítmény formájában is.
3. Liposzómakészítmények
A találmány szerinti bispecifíkus koaguláló ligandum kiszerelhető liposzómakészítmény formájában is. A koagulánst tartalmazó liposzómakészítmény előállítását az alábbiakban ismertetjük. A foszfolipid formájú liposzómát vízben diszpergáljuk, különböző lipid/víz mólarányban. A liposzóma fizikai tulajdonságai a pHértéktől, az ionerősségtől és kétértékű kationok jelenlététől függnek. A liposzómák alacsony permeabilitást mutatnak ionos és poláros anyagok esetén, de megemelt hőmérsékleten fázisváltozás következik be, amely jelentősen megváltoztatja a permeabilitást. A fázisváltás hatására a szorosan elrendezett és szigorú szerkezet, amit gélállapotnak nevezünk, laza elrendezésű és kevésbé rendszerezett szerkezetté alakul át, amit folyadékállapotnak nevezünk. Ez egy jellemző fázisváltási hőmérsékleten következik be, és növeli a permeabilitást az ionok, cukrok és hatóanyagok vonatkozásában.
A hőmérséklet mellett a liposzómák permeabilitását befolyásolják a fehérjék is. Bizonyos oldható fehérjék, így a citokrom c a kettős réteghez kötődik, azt deformálja, és abba behatol, és így megváltoztatja a permeabilitást. A koleszterin gátolja a fehérjék behatolását, és így látszólag szorosabban elrendezi a foszfolipideket. A találmány szerinti megoldáshoz előnyösen alkalmazhatók a koleszterint vagy PEG-et tartalmazó liposzómakészítmények.
HU 220 347 Β
Az oldatmegkötő képesség a különböző liposzómatípusoknál változik, így például a multilamerális vezikulum (MLV) közepes mértékben képes az oldat megkötésére, míg a kis unilamerális vezikulum (SUV) hatástalan. Az SUV előnye viszont a szemcseméret-eloszlás homogenitása és reprodukálhatósága, és a szemcseméret és megkötőképesség közötti kompromisszum a nagy unilamerális vezikulum (LUV). Ez előállítható például éteres bepárlással és hatékonysága 3-4-szerese az MLV oldatmegkötő képességének.
A liposzóma oldatmegkötő képességét annak jellemzői mellett a hatóanyag fizikokémiai tulajdonságai is befolyásolják. A poláros vegyület a vizes térben kötődik meg, míg az apoláros vegyület a vezikulum lipid kettős rétegében kötődik meg. A poláros vegyületek permeáció vagy a kettős réteg feltörésének hatására szabadulnak fel, míg az apoláros vegyületek a kettős rétegen belül kötött állapotban maradnak addig, amíg a kettős réteget hőmérséklet emelésével vagy lipoproteinek segítségével feltörjük. Maximális hatóanyag-felszabadítás mindkét esetben fázisváltási hőmérsékleten érhető el.
A liposzómák négy különböző mechanizmuson keresztül lépnek kölcsönhatásba a sejtekkel. Ezek a retikuloendotéliás rendszer falósejtjei, így makrofágok és neutrofilek által végzett zárványképzés; sejtfelületen történő adszorpció, amely lehet nemspecifikus gyenge hidrofób vagy elektrosztatikus kötésen keresztül, vagy a sejt és felületi komponens specifikus kölcsönhatásán keresztül; plazma sejtmembránnal történő fúzió, amelynek során a liposzómalipid kettős rétege beépül a plazma membránjába, és ezzel egyidejűleg a citoplazmába kerül a liposzóma tartalma; tetszőleges irányú transzfer folyamatok játszódnak le a liposzóma lipidjei és a celluláris vagy szubcelluláris membránok között anélkül, hogy a liposzóma tartalma asszociálódnak. Gyakran nehéz meghatározni, hogy melyik mechanizmus érvényesül, és egyidejűleg több is működhet.
Az intravénásán befecskendezett liposzóma sorsa és viselkedése annak fizikai tulajdonságaitól, így méretéről, fluiditásától és felületi töltésétől függ. A liposzóma az összetételtől függően órákon vagy napokon keresztül a szövetekben maradhat, és a vérben mutatott felezési ideje néhány perctől több óráig terjed. A nagyméretű liposzómákat (például MLV és LUV) a retikuloendotéliás rendszer falósejtjei gyorsan felveszik, de a keringőrendszer fiziológiája az ilyen nagyméretű komponensek eltávozását a legtöbb helyen gátolja. Ezek csak olyan helyeken távozhatnak, ahol a kapilláris endotéliumban nagyméretű nyílások vagy pólusok találhatók, ilyenek a májban vagy lépben lévő üreges nyílások. A kiürülés ezért főként ezekben a szervekben játszódik le. Másrészről azonban, az SUV szélesebb körű szöveteloszlást mutat, de a májban és lépben gyorsan kiválasztódik. Általánosságban, a liposzómák in vivő viselkedéséből az következik, hogy ezek csak olyan szervekben és szövetekben koncentrálódnak, amelyek képesek ezek nagy méretét felvenni. Az ilyenekre nem korlátozó jellegű példaként említhető a vér.
Egy másik megvalósítási módnál a találmány szerinti bispecifikus komponenst a liposzóma felületéhez adagoljuk, és így a hatóanyag-tartalmat a célba vett sejt felületén található specifikus antigén receptorokhoz irányítjuk. Felismerőheiyként alkalmazhatók szénhidrátdeterminánsok (glikoprotein vagy glikolipid sejtfelületi komponensek, amelyek a sejt-sejt felismerésben, kölcsönhatásban és adhézíóban játszanak szerepet), mivel ezek potenciálisan adott sejttípusokhoz irányítják a liposzómákat. A liposzómakészítményeket előnyösen intravénás injekció formájában alkalmazzuk, de adagolhatok más módon is.
4. Helyi készítmények
A bispecifikus koaguláns adagolható helyi készítmény, így krém, kenőcs vagy gél formájában is. Az olajos vagy vizes kenőcsalapot a szokásos módon állítjuk elő. Ezek a készítmények tartalmazhatnak például növényi vagy állati olajokat, állati zsírokat és előnyösen petróleumból előállított, félig szilárd szénhidrogéneket. Előnyösen alkalmazható komponensek a fehérkenőcs, sárga kenőcs, cetil-észter-viasz, oleinsav, olívaolaj, paraffin, petrolátum, fehér petrolátum, cetvelő, keményítő-glicerit, fehér viasz, sárga viasz, lanolin, vízmentes lanolin és gliceril-monosztearát.
Vízben oldható kenőcsalapként alkalmazható például glikol-éter és származékai, polietilénglikol, polioxil-40-sztearát és poliszorbát. A bőrön keresztül történő adagolás elősegíthető például transzdermális tapasz, iontoforézis vagy elektrotranszportáció segítségével.
5. Szemészeti készítmények
A találmány szerinti bispecifikus koaguláló ligandum kiszerelhető szemészeti készítmény, így szemészeti oldat formájában is. Ilyen szemészeti oldatot alkalmazunk például diabetikus recehártya-betegség kezeléséhez. Ez azt jelenti, hogy a diabetikus recehártya-betegség kezeléséhez a találmány szerinti bispecifikus konjugátumot a kezelendő beteg szemébe adagoljuk a szokásos módon (például Remington’s Pharmaceutical Sciences, 15. kiadás, 1488-1501. oldal, Mack Publishing Co.) előállított szemészeti készítmény formájában.
A szemészeti készítmény az új bispecifikus koagulánst vagy ennek farmakológiailag alkalmazható sóját mintegy 0,01-1 tömeg%, előnyösen mintegy 0,05-0,5 tömeg% mennyiségben tartalmazza gyógyszerészeti oldat, szuszpenzió vagy kenőcs formájában. A hatóanyag-koncentráció az alkalmazott vegyülettől függően, a kezelt beteg állapotától és hasonló feltételektől függően változhat, a konkrét érték meghatározása a kezelőszemély feladata. A szemészeti készítmény előnyösen steril vizes oldat, amely kívánt esetben további komponenseket tartalmazhat. Ezekre példaként említhető a tartósítószer, puffer, tónusbeállító szer, antioxidáns és stabilizátor, nemionos nedvesitőszer és viszkozitásnövelő szer.
Az ilyen oldatokban tartósítószerként alkalmazható például benzalkónium-klorid, benzetónium-klorid, klór-butanol vagy timerozál. Pufferként alkalmazható például bórsav, nátrium- és kálium-hidrogén-karbonát, nátrium- és kálium-borát, nátrium- és kálium-karbonát, nátrium-acetát és nátrium-hidrogén-foszfát, amellyel mintegy pH=6-8, előnyösen mintegy pH=7-7,5 értéket tartunk fenn. A tónusbeállító szer lehet például dext1
HU 220 347 Β rán 40, dextrán 70, dextróz, glicerin, kálium-klorid, propilénglikol, nátrium-klorid, ahol a szemészeti oldat nátrium-klorid ekvivalense 0,9+0,2% lehet.
Antioxidánsként és stabilizátorként alkalmazható például nátrium-hidrogén-szulfit, nátrium-metabiszulfit, nátrium-tioszulfit és tiokarbamid. Nedvesítőszerként alkalmazható például poliszorbát 80, poliszorbát 20, poloxamer 282 és tiloxapol. Viszkozitásfokozó szerként alkalmazható például dextrán 40, dextrán 70, zselatin, glicerin, hidroxi-etil-cellulóz, hidroxi-metil-propilcellulóz, lanolin, metil-cellulóz, petrolátum, polietilénglikol, poli(vinil-alkohol), poli(vinil-pirrolidon) és karboxi-metil-cellulóz. A szemészeti készítményt helyileg adagoljuk a kezelendő beteg szemébe. Az adagolást a szokásos módon, például csepegtetéssel vagy szemfürdővel végezzük.
6. Terápiás készletek
A találmány kiterjed a fenti bispecifikus koaguláló ligandumokat tartalmazó terápiás készletekre. Az ilyen készletek általában megfelelő tárolóeszközökben legalább egy találmány szerinti bispecifikus ligandum gyógyszerészetileg alkalmazható készítményét tartalmazzák. A készlet tartalmaz továbbá más gyógyszerészetileg alkalmazható készítményeket, így további bispecifikus koaguláló ligandumot tartalmazó készítményt, amely általában eltérő célpontra irányul; külön komplexen kívüli koaguláló faktort; bispecifikus antitestet, T-sejtet vagy más funkcionális komponenst, például antigén indukálására alkalmas komponenst; antigén elnyomására alkalmas komponenst, így ciklosporint; további tumor elleni antitestet vagy immunotoxint; és egy vagy több kemoterápiás szert.
A kombinált készletben további szerként előnyösen alkalmazhatók azok a szerek, amelyek a betegséggel asszociált érrendszer endotéliás sejtjeiben indukálják a célba vett antigén, így E-szelektin vagy MHC II osztályba tartozó antigén kifejeződését. Az indukálószer lehet T-sejt-klón, amely a betegség vagy tumor antigénjéhez kötődik, és így kiváltja az IFN-γ termelését. Indukálószerként előnyösen alkalmazhatók az olyan bispecifikus antitestek, amelyek a betegség vagy tumorsejt antigénjéhez kötődnek, és olyan effektorsejtekhez kapcsolódnak, amelyek citokinok kifejlesztésével indukálják a célba vett antigén kifejeződését.
Az oltalmi körhöz tartozik továbbá az olyan készlet, amely megfelelő tárolóeszközökben egy első gyógyszerkészítményt tartalmaz, amely egy effektorsejt felületén, így monocitán vagy makrofágon, hízósejten, T-sejten vagy NK-sejten található aktiváló antigénhez vagy a beteg sejt felületén található antigénhez kötődő bispecifikus antitestet tartalmaz; valamint egy második gyógyszerkészítményt tartalmaz, amely az aktivált effektorsejt vagy a belőle származó citokin által indukált endotéliás sejt antigénhez kötődő első kötőszakasszal rendelkező bispecifikus ligandumot tartalmaz, ahol az első kötőszakasz működőképes módon egy koaguláló faktorhoz vagy koaguláló faktorhoz kötődő második kötőszakaszhoz van kapcsolva.
A fent említett első gyógyszerkészítmény előnyösen olyan bispecifikus antitestet tartalmaz, amely CD 14,
CD16 (IgE-re vonatkozó FcR), CD2, CD3, CD28 aktiváló antigénhez vagy T-sejt receptor antigénhez kötődik, ezen belül különösen előnyös a CD 14 vagy CD28 antigénhez kötődő bispecifikus antitest. A monocita/makrofág vagy hízósejt CD14 vagy CD16 megkötése által kiváltott aktiválása IL-1 termelést okoz, ami indukálja az E-szelektint; míg a T-sejtek CD2, CD3 vagy CD28 megkötésével történő aktiválása IFN-γ termelést okoz, ami indukálja az MHC II osztályt. Második gyógyszerkészítményként előnyösen alkalmazható az olyan bispecifikus ligandumot tartalmazó készítmény, ahol a ligandum első kötőszakasza E-szelektinhez vagy MHC II osztálybeli antigénhez kötődik.
A készlet állhat továbbá egyetlen tárolóeszközből, amely bispecifikus koaguláló ligandumot tartalmaz, adott esetben további komponensek mellett, vagy ahol különböző tárolóeszközök vannak a kívánt szerek mindegyikéhez. Eljárhatunk úgy is, hogy a készlet a bispecifikus koaguláló ligandum előállításához szükséges külön komponenseket tartalmazza.
Ha a készlet egyes komponensei egy vagy több oldat formájában vannak jelen, akkor az oldat előnyösen vizes oldat, különösen előnyösen steril vizes oldat. A készlet egyes komponensei lehetnek azonban száraz por alakjában is. A száraz por formájában kiszerelt reagenseket vagy komponenseket megfelelő oldószer hozzáadásával alakítjuk oldattá. Eljárhatunk úgy is, hogy az oldószert további tárolóeszközben szereljük ki.
A találmány szerinti készletben alkalmazott tárolóeszköz lehet például legalább egy fiola, kémcső, üveg, palack, fecskendő vagy más olyan tárolóeszköz, amelybe a bispecifikus koaguláló ligandum és bármely egyéb kívánt komponens elhelyezhető és megfelelő mennyiségben kiszerelhető. További komponensek alkalmazása esetén a készlet előnyösen második vagy további fiolát vagy más tárolóeszközt tartalmaz, amely lehetővé teszi az elkülönített dózisok adagolását. A készlet adott esetben egy második vagy harmadik tárolóeszközt tartalmaz steril gyógyászati puffer vagy más hígítóanyag tárolására.
A készlet tartalmazhat továbbá olyan eszközt, amely lehetővé teszi a bispecifikus ligandum humán vagy állat betegnek történő adagolását. Éne példaként említhető egy vagy több tű vagy fecskendő, valamint szemcsepegtetó, pipetta vagy más hasonló eszköz, amellyel a készítmény a test kívánt részén befecskendezhető. A találmány szerinti készlet általában tartalmaz olyan eszközt is, amely lehetővé teszi a fiolák és más komponensek kereskedelmi forgalmazásra alkalmas elkülönítését és bezárását, ami lehet például olyan műanyag tartó, amelybe a kívánt fiolák és más eszközök elhelyezhetők, és megőrizhetők.
A találmányt közelebbről az alábbi példákkal mutatjuk be anélkül, hogy az oltalmi kör a példákra korlátozódna. A példákban bemutatott eljárások a találmány szerinti megoldás alapját képező technológiákat reprezentálják, és bemutatják az előnyös megvalósítási módokat. Szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a bemutatott megvalósítási módok sokféleképpen változtathatók és módosíthatók anélkül, hogy eltérnénk a találmány szerinti megoldás lényegétől.
HU 220 347 Β
I. példa
Bispecifikus koaguláló antitest szintézise
A jelen példában olyan bispecifikus antitest szintézisét ismertetjük, amely egy koagulánst specifikusan egy tumor helyére képes irányítani. Az ilyen antitestet koaguligandumnak nevezzük.
A) Anyagok és módszerek
1. Reagensek
A Sigma Chemical Co. cégtől (St. Louis, MO, USA) szerezhetők be a következő reagensek: Pepszin (A; EC 3.4.23.1), Ellmans-reagens (ER; 5,5’-ditiobisz(2-nitro-benzoesav), DNTB), 2-merkapto-etanol (2-ME), nátrium-arzenit (NaAsO2) és nyúlagy tromboplasztin (acetonpor). A Pharmacia LKB cégtől (Piscataway, NJ, USA) szerezhető be a Sephadex G-25 és G-100.
2. Humán csonkolt szövetfaktor (tTF)
Rekombináns humán csonkolt TF-t (tTF) állítunk elő az alábbi két eljárás egyikével:
I. módszer : E. coli expressziós vektor előállítása
A tTF-t (1-218 maradék) kódoló cDNS-t PCR technikával az alábbi primerekkel egészítjük ki: 5’-GAAGAAGGGATCCTGGTGCCTCGTGGTTCTGGC ACT AC AAATACT-3 ’ (5’-primer; szekvenciaazonosítási szám 28) és
5’-CTGGCCTCAAGCTTAACGGAATTCACCTTT-3’ (3’-primer; szekvenciaazonosítási szám 29), amelyek lehetővé teszik, hogy a cDNS felett egy trombinhasítási helyet kódoló szekvenciát illesszünk be. A PCR termékeket BamHl és Hindlll enzimekkel emésztjük, és a pTrcHisC expressziós vektor (invitrogén) BamHl és Hindlll helyei közé ligáljuk.
DH5a-sejteket transzformálunk a ligálóeleggyel, és a rekombináns plazmidokat ampicillin jelenlétében végzett szelektálás után izoláljuk. A BL21 E. coli törzset a pTrcHisC-tTF rekombináns plazmiddal transzformáljuk, és a kapott transzformánsokat használjuk a fehérje kifejezésére.
I. módszer: Kifejezés, hajtogatás és a tTF tisztítása
A poli(his)-tTF fúziós fehéijét pTrc-HisC-tTF plazmiddal transzformált BL21 sejtekkel fejezzük ki. Az inokulált tenyészetet (10 ml, LB közegben) egy éjszakán keresztül rázás közben és 37 °C hőmérsékleten növesztjük.
Az inokulált tenyészetet növesztőközeghez adjuk, és 37 °C hőmérsékleten rázzuk. Amikor az optikai sűrűség 550 nm hullámhosszon megközelíti a 0,5 értéket, 10 ml 100 mmol/1 izopropil-p-D-tiogalaktopiranozidot adunk a tenyészethez. A rázást 37 °C hőmérsékleten mintegy 20 órán keresztül (a stacionárius fázis eléréséig) folytatjuk.
A sejteket 20 percen keresztül 10 000 g értéken centrifugálva begyújtjuk, és a zárványtesteket az alábbiak szerint izoláljuk (a reagensek mennyiségét 1 g sejtmasszára vonatkoztatva adjuk meg). A sejtmasszát 4 ml 10 mmol/1 Trisz (pH=7,5), 150 mmol/1 NaCl, 1 mmol/1 MgCl2, 0,17 mg/ml PMSF és 2 mg/ml tyúktojásfehérje-lizozim (Sigma) elegyében szuszpendáljuk. A szuszpenzióhoz 250 egység benzonázt (EM Science) adunk, és szobahőmérsékleten 1,5 órán keresztül óvatosan kevertetjük, majd 15 percen keresztül 12,000 g értéken centrifugáljuk.
A pelletet 2 ml 10 mmol/1 Trisz (pH=7,5), 1 mmol/1 EDTA és 3% NP40 elegyben újra szuszpendáljuk, 1 percen keresztül 50%-os energiával ultrahanggal besugározzuk, majd 20 percen keresztül 12 000 g értéken centrifugáljuk. A pelletet vízben újra szuszpendáljuk, 20-30 másodpercen keresztül 50%-os energiával ultrahanggal besugározzuk, és 20 percen keresztül 12 000 g értéken centrifugáljuk. A vizes mosást megismételjük, és a végső pelletet, amely nagy mennyiségű zárványtestet tartalmaz, 1 g zárványtestre vonatkoztatva 9 ml 6 mol/1 guanidinium-klorid, 0,5 mol/1 NaCl, 20 mmol/1 foszfát és 10 mmol/1 β-merkapto-etanol elegyében (pH=8,0) szuszpendáljuk, és szobahőmérsékleten egy éjszakán keresztül óvatosan rázzuk.
A szuszpenziót 20 percen keresztül 12 000 g értéken centrigugáljuk, és a felülúszót nikkel-nitril-ecetsav(Ni-NTA, Quiagen) töltettel töltött oszlopra visszük. Az oszlopot egymás után 6 mol/1 guanidiníum-kloridpufferrel először pH=8, utána pH=7 értéken mossuk, majd a fehéijét pH=4 értékig történő csökkentéssel eluáljuk.
A fúziós fehérjét tartalmazó frakciókat egyesítjük, és 50 mmol/1 koncentrációig ditio-treitollal elegyítjük. Az oldatot egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten tartjuk, majd mintegy 1 mg/ml fehéijekoncentrációig hígítjuk 6 mol/1 karbamid, 50 mmol/1 Trisz és 0,02% nátrium-azid elegyével (pH=8,0), majd 4 °C hőmérsékleten egy éjszakán keresztül 10-20 térfogatrész fenti pufferrel szemben dializáljuk. A puffért 2 mol/1 karbamid, 50 mmol/1 Trisz, 300 mmol/1 NaCl, 2,5 mmol/1 redukált glutation, 0,5 mmol/1 oxidált glutation és 0,02% nátrium-azid-elegyre (pH=8,0) (hajtogatópuffer) cseréljük. A dialízist további 2 napon keresztül folytatjuk, a puffért friss haj tóga tópufferrel helyettesítjük, és a dialízist további 2 napon keresztül folytatjuk.
Az oldatot ezután gyorsan 20 mmol/1 TEA(pH=7,5) eleggyel szemben dializáljuk, a dializáló edényből eltávolítjuk, a rekombináns fehéijére vonatkoztatva mintegy 1/500 tömegarányban humán trombinnal kezeljük egy éjszakán keresztül szobahőmérsékleten, majd HR-10/10 mono-Q anioncserélő oszlopra visszük. A tTF fehérjét 30 perc alatt 20 mmol/1 TEApufferrel eluáljuk, amely lineárisan növekvő mennyiségben 0-150 mmol/1 nátrium-kloridot tartalmaz (áramlási sebesség 3 ml/perc).
II. módszer: tTF cDNS előállítása
A tTF klónozására J-82 sejtekből (humán hólyagkarcinóma) származó RNS-t használunk. Az ossz RNS-t GlassMax RNS mikroizoláló reagenssel (Gibco BRL) izoláljuk. Az RNS-t reverz átírással cDNS-sé alakítjuk GeneAmp RNS PCR készlet (Perkin Elmer) felhasználásával. A tTF cDNS-t ugyanezen készlet felhasználásával kiegészítjük az alábbi két primerrel:
5'primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CTT CTG GCA CTA CAA ATA CT
HU 220 347 Β 'primer:
5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AT TCC CCC TTT CT (szekvanciaazonosítási szám: 2)
A fenti szekvenciákban aláhúzással jelölt részek kódolják a tTF N-terminális és C-terminális részét. Az 5’ primerben található maradék szekvencia Ncol hasítóhely, ami lehetővé teszi, hogy a tTF-t expressziós vektorba klónozzuk, és trombin hasítóhelyet kódol. A 3’ primer maradék szekvenciája HindlII helyet tartalmaz, amely lehetővé teszi, hogy a tTF-t expressziós vektorba klónozzuk. A PCR kiterjesztést a gyártó előírásai szerint végezzük. Röviden, 75 pmol/l dNTP-t, 0,6 pmol/l prímért és 1,5 mmol/1 MgCl2-t használunk, és a kezelést 30 cikluson át 30 másodpercen keresztül 95 °C hőmérsékleten, 30 másodpercen keresztül 55 °C hőmérsékleten, és 30 másodpercen keresztül 72 °C hőmérsékleten végezzük.
II. módszer: Vektorszerkezet
A tTF kifejezésére H6 pQE-60 E. coli expressziós vektort [Lee és munkatársai idézett műve (1994)] használunk. A PCR-rel kiterjesztett tTF cDNS-t az Ncol és HindlII helyek közé inszertáljuk. A H6 pQE-60 vektor egy beépített (His)6 kódolószekvenciát tartalmaz, ezért a kifejezett fehérje N-terminális részén (His)6 szekvenciát tartalmaz, és így Ni-NTA oszlopon tisztítható.
II. módszer: tTF tisztítása
A tTF-t tartalmazó H6 pQE-60 DNS-t TG-1 E. colisejtekbe transzformáljuk. A sejteket OD6(K)=0,5 értékig növesztjük, majd a tTF termelés indukálására 30 pmol/l végső koncentrációig IPTG-t adunk hozzá. A sejteket 18 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten rázzuk, majd begyújtjuk. A sejtpelletet 6 mol/1 Gu-HCl-lel denaturáljuk, és a lizátumot Ni-NTA oszlopra (Quiagen) visszük. A kötött tTF-t 6 mol/1 karbamiddal mossuk, majd 6 mol/1-1 mol/1 karbamidgradienssel szobahőmérsékleten 16 órán keresztül hajtogatjuk. Az oszlopot mosópufferrel (0,05 mol/1 NaH2PO4, 0,3 mol/1 NaCl és 10% glicerin) mossuk, és a tTF-t 0,2 mol/1 imidazolt tartalmazó mosópufferrel eluáljuk.
Az eluált tTF-t koncentráljuk, és G-75 oszlopra viszszük. A tTF monomereket összegyűjtjük, és trombinnal kezelve eltávolítjuk a H6 peptidet. Ehhez 1 tömegrész trombint (Sigma) adunk 500 tömegrész tTF-hez, és a hasítást szobahőmérsékleten végezzük 18 órán keresztül. A trombin eltávolítása érdekében az elegyet benzamidin Sepharose 6B trombin affinitásoszlopon (Pharmacia) hajtjuk át.
A tTF azonos tulajdonságokkal rendelkezik, mint az élesztőből vagy aranyhörcsög-petefészeksejtekből nyert rekombináns tTF, és ugyanúgy képes a Vlla faktor megkötésére, és a Vlla faktor katalitikus hatásának fokozására [Ruf és munkatársai idézett műve (1991)]. Poliakrilamid gélelektroforézissel nátrium-dodecil-szulfáttal analizálva egyetlen sávot kapunk mintegy 24 kD móltömegnek megfelelő értéknél.
3. Monoklonális antitestek
Az ATCC-gyűjteményből B21-2 (TIB-229) hibridómát és SFR8-B6 hibridómát (HB-152, a továbbiakban SFR8) használunk. Mindkét hibridóma patkány
IgG2b antitesteket választ ki, amelyek a tenyészet felülúszójából G fehérje-affinitáskromatográfiával tisztíthatok. A B21-2 antitest A20 sejteken és BALB/c/nu/nu egerekben növesztett C1300 (Muy) transzfektáns tumorérrendszerén kifejezett I-Ad antigénnel reagál. Az SFR8 antitest a HLA-Bw6 epitópra vonatkozik, és izotípusosan irányított negatív kontrollként szolgál a B21-2 antitest vonatkozásában.
A TF9/10H10 (a továbbiakban 10H10) egy egérIgGl, és a humán TF-vel a TF/VIIa faktor aktivitás befolyásolása nélkül reagál, és előállítható Morrissey és munkatársai idézett műve (1988) szerint.
Az MRC OX7 (továbbiakban OX7) sejtvonal (Dr. A. F. Williams, MRC Cellular Immunology Unit, University of Oxford, Oxford, Anglia) OX7 antitestet, egy egér-IgGl antitestet választ ki, amely a T-limfocitákon felismeri a Thy 1.1 antigént. Ezt izotípusosan ellenőrzött negatív kontrollként használjuk a TF9/10H10 vonatkozásában.
Az összes antitestet a tenyészet-felülúszóból tisztítjuk G fehérje-affinitáskromatográfiával.
4. Bispecifikus antitestek szintézise
A megfelelő IgG-t 2 vegyes% pepszinnel 5-9 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten emésztve F(ab’)2 ffagmenseket állítunk elő, és a fragmenseket Sephadex G100 tölteten kromatografálva tisztítjuk. A B21-2/10H10, SFR8/10H10 és B21-2/0X7 bispecifikus antitestek szintézisét kis módosítással Brennan módszerével [Brennan és munkatársai idézett műve (1985)] végezzük.
Röviden, az F(ab’)2 fragmenseket 16 órán keresztül és 20 °C hőmérsékleten 5 mmol/1 2-merkapto-etanollal redukáljuk í mmol/1 EDTA-t tartalmazó 0,1 mol/1 nátrium-foszfát-pufferben (pH = 6,8) (PBSE puffer) 9 mmol/1 NaAsO2 jelenlétében. Az elegyhez 25 mmol/1 végső koncentrációig Ellman’s reagenst (ER) adunk, és 3 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten reagáltatjuk. Az Fab’ ffagmensek Ellman’s származékát (Fab’-ER) a reagálatlan ER-től Sephadex G25 oszlopon választjuk el PBSE alkalmazásával.
A bispecifikus antitest előállításához az egyik antitestből kapott Fab’-ER-t ultraszűrősejtben mintegy 2,5 mg/ml koncentrációig besűrítjük, majd 10 mmol/12merkapto-etanollal redukáljuk 1 órán keresztül és 20 °C hőmérsékleten. A kapott Fab’-SH származékot Sephadex G25 oszlopon szűrjük PBSE alkalmazásával, majd azonos moláris mennyiségben a második antitestből kapott Fab’-ER származékkal keverjük. A keveréket ultraszűréssel mintegy 3 mg/ml koncentrációra besűrítjük, és 16 órán keresztül 20 °C hőmérsékleten kevertetjük. A reakciótermékeket Sephadex G100 oszlopon ffakcionáljuk, és a bispecifikus antitestet (110 kD) tartalmazó frakciókat 1 mg/ml értékre koncentráljuk, és 4 °C hőmérsékleten 0,02% nátrium-azid-oldatban tároljuk.
B) Eredmények
1. A bispecifikus antitest analízise
Az F(ab’)2 fragmensek és a bispecifikus preparátumok móltömegét SDS-PAGE elektroforézissel határozzuk meg 4-15% gradiensű gélen Pharmacia LKB Phastsystem (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ, USA) használatával. A bispecifikus jelleget, valamint a heterodi48
HU 220 347 Β mer/homodimer százalékos arányt FACS analízissel (II. példa) határozzuk meg.
A bispecifikus antitestek SDS-PAGE elektroforézissel (és FACS vizsgálattal, II. példa) végzett analízise azt mutatja, hogy a B21-2/10H10 bispecifikus antitest legfeljebb 4% tetszőleges eredetű homodimert és legfeljebb 10% 140 kD vagy 55 kD móltömegű fragmenst tartalmaz. A preparátum mintegy 10%-a egy 140 kD fragmens, amely feltehetően F(ab’)2 szerkezet, amely (tetszőleges eredetű) extrakönnyű láncot tartalmaz.
II. példa
Koaguláló antitest in vitro kötődése és funkciója
A példában a koaguláló antitest (koaguligandum) bispecifikus jellegét vizsgáljuk, és igazoljuk, hogy a koaguligandum in vitro körülmények között specifikusan kötődik, adott sejtekhez szállítódik és kiváltja a koagulációt.
A) Anyagok és módszerek
1. Sejtek
Az A20 sejtvonal egy I-Ad pozitív BALB/c B-sejtlimfóma, amely megtalálható az American Type Culture Collection gyűjteményben (ATCC, Rockville, MD, USA; TIB-208). Az A20 sejteket 10 térfogat% magzati boqúszérummal (FCS), 0,2 mmol/1 L-glutaminnal, 200 egység/ml penicillinnel, 100 pgramm/ml streptomicinnel, 18 mmol/1 Hepes-sel, 0,1 mmol/1 nemesszenciális aminosavkeverékkel és 1 mmol/1 nátriumpiruváttal kiegészített DMEM közegben (továbbiakban komplett DMEM közeg; a reagensek beszerezhetők a Life Technologies, Gaitherburg, MD, USA cégtől) növesztjük. A komplett DMEM közeghez 0,064 mmol/1 végső koncentrációig 2-ME-t adunk. A tenyészetet 37 °C hőmérsékleten 90% levegő/10% CO2 nedves atmoszférában tartjuk fenn.
Az ATCC gyűjteményben megtalálható J82 sejteket (HTB-1), TF-t kifejező humán epehólyag-karcinóma, komplett DMEM közegben tartjuk fenn.
A/Jax egerekben kifejlesztett spontán tumorból 0300 neuroblasztoma-sejtvonalat preparálunk [Dunham és Stewart idézett műve (1953)]. A 0300 neuroblasztoma-sejteket egér-IFN-γ génnel transzfektáljuk pSVX IFN-γ expressziós retrovírus (Muy AAs) alkalmazásával [Watanabe és munkatársai idézett műve (1989)], amelynek során 0300 (Muy) 12 sejtvonalat (a továbbiakban 0300 Muy) kapunk. Az IFN-γ expressziós retrovírus beszerezhető Dr. Y. Watanabe-től (Department of Molecular Microbiology, Kyoto University, Japán).
A 0300 (Muy) 12 sejteket 10 tömeg% FCS-sel, 2,4 mmol/1 L-glutaminnal, 200 egység/ml penicillinnel, 100 pgramm/ml streptomicinnel, 100 pmol/l nemesszenciális aminosavkeverékkel, 1 pmol/l nátrium-piruváttal, 18 pmol/l Hepes-sel és 1 mg/ml G418-cal (Geneticin, Sigma) kiegészített, Dulbecco szerint módosított Eagle közegen (DMEM) tartjuk fenn. A tenyésztést 37 °C hőmérsékleten végezzük 90% levegő/10% szén-dioxid nedvesített atmoszférában.
A Thy 1.1 expresszáló AKR-A egérT-limfóma-sejtvonalat (Dr. 1. MacLennan, Department of Experimental Pathology, Birmingham University, Birmingham, Anglia) komplex DMEM közegen tartjuk fenn.
2. Indirekt immunofluoreszcencia
Az A20 sejteket PBS/0,2% BSA/0,02% nátriumazid-elegyben (a továbbiakban FACS puffer) szuszpendáljuk 4 χ 106 sejt/ml koncentrációban. A J82 sejteket az edényből enyhe körülmények között 0,2 vegyes% PBS/EDTA eleggyel felszabadítjuk, és 4xl06 sejt/ml koncentrációban FACS pufferben szuszpendáljuk. Egy 96 mérőhelyes lemez lekerekített aljú mérőhelyeihez 50 μΐ sejtszuszpenziót és 50 μΐ optimális hígítású primer antitestet adunk. Szobahőmérsékleten 15 percen keresztül inkubáljuk, majd a sejteket háromszor FACS pufferrel mossuk. A végső felülúszó eltávolítása után 50 μΐ fluoreszcens izotiocianáttal (FITC) konjugált szekunder antitestet adagolunk FACS pufferben felvett 1/20 hígításban. A sejteket 15 percen keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd háromszor FACS pufferrel mossuk. A sejtekkel asszociált fluoreszcens anyagot FACScan készülékkel (Becton Dickenson, Fullerton, CA, USA) mérjük. A mérési adatokat Lysis II programmal analizáljuk. Ha szekunder antitestként FITC antipatkány-immunoglobulint használunk, akkor az egérsejtekkel szembeni nemspecifikus keresztreaktivitás blokkolására 10 térfogat% normál egérszérumot adagolunk.
3. A fehérjék radiojelölése
A fehérjéket ,25jóddal jelöljük a klór-amin T előírás (2. számú előírás) szerint [Mason és Williams idézett műve (1980)]. A jódozott terméket G25 tölteten tisztítjuk, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk monoklonális fragmensek esetében 5% DMSO és 5 mg/ml boíjú-IgG jelenlétében, és tTF esetében 5% DMSO és 5 mg/ml BSA jelenlétében. A specifikus aktivitás 2,5-4,8 pCi/pg.
4. Kötődési vizsgálatok
A humán tTF-t 125jóddal jelöljük 2,5-4,8 pCi/pg specifikus aktivitással a klór-amin T módszerrel (2. előírás) [Mason és Williams idézett műve (1980)]. Az A20 sejtek 2xl06 sejt/ml koncentrációjú, 2 mg/ml BSA-t és 0,02% nátrium-azidot tartalmazó PBS-ben felvett szuszpenzióját 50 μΐ-es részletekben 96 mérőhelyes mikrotitráló lemez lekerekített aljú mérőhelyeihez adagoljuk. A mérőhelyekhez 25 μΐ bispecifikus antitestet adagolunk, amit azonos pufferben veszünk fel 8-0,02 μ g/ml koncentrációban.
μΐ 8 μg/ml koncentrációjú, azonos pufferben felvett 125I-tTF-oldatot adunk minden mérőhelyhez, amellyel a tTF-t mólfeleslegben adagoljuk. A lemezeket összerázzuk, és 1 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A sejteket a lemezeken háromszor 2 mg/ml BSA-t tartalmazó 0,9 vegyes%-os NaCl-oldattal mossuk. A mérőhelyek tartalmát mikrocentrifugáló csövekbe töltött 10:11 térfogatarányú dibutil-ftalát és bisz(2-etil-hexil)-ftalát-olaj-elegyre pipettázzuk. A csöveket 1,5 percen keresztül 7500 g értéken centrifugáljuk, és folyékony nitrogénnel hirtelen megfagyasztjuk. A sejteket tartalmazó csúcsot levágjuk. A sejtpellet és a felülúszó radioaktivitását gamma-számlálóval mérjük.
5. Koagulációs vizsgálat
A kötődési vizsgálatnál ismertetett módon mikrotitráló lemezeket készítünk elő azzal a különbséggel,
HU 220 347 Β hogy 125I-tTF helyett jelöletlen tTF-t használunk. A lemezeket 1 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd a sejteket háromszor mossuk a fent leírt módon, és 75 μΐ 2 mg/ml BSA-t és 12,5 mmol/1 CaCl2-t tartalmazó 0,9 vegyes% NaCl-oldatban szuszpendáljuk. A lemezek tartalmát 5 ml tiszta műanyagcsövekbe visszük, és 37 °C hőmérsékletre melegítjük. Minden csőhöz 30 μΐ citrátozott egérplazmát adunk 37 °C hőmérsékleten. Mérjük az első fibrinszálak megjelenéséig eltelt időt.
B) Eredmények
\.Az antitest bispecifikus jellege
Az SFR8/10H10 bispecifikus jellegét FACS vizsgálattal mérjük célsejtként J82 sejteket (TF pozitív) alkalmazva FITC antiegér-immunoglobulint használva a 10H10 jelenlétében kimutatására. Az SFR8 jelenlétét FITC antipatkány-immunoglobulinnal mutatjuk ki. A fluoreszcencia átlagos intenzitását a koncentráció függvényében ábrázoljuk mindkét megfestésnél, ami azt igazolja, hogy a bispecifikus preparátumban mind az egér-, mind a patkánykar megtalálható.
2. Az antitest kötődése
A kötődési vizsgálatokat 125jóddal jelölt B21-2 Fab’ és SFR8 Fab’ ffagmensen végezzük, ahol a vizsgálatok szerint a B21-2 Fab’ A20 sejtekhez történő kötődése 21,5 nmol/1 koncentrációnál telítődik. Az SFR8 Fab’ nemspecifikus módon kötődik az A20 sejtekhez, ahol a sejtekként kötött molekulák száma 21,5 nmol/1 koncentrációnál kisebb, mint 50 000, szemben a B212 Fab’-nél elérhető 530 000-es számmal.
3. Koaguláns szállítása és megkötése
Vizsgáljuk a B21-2/10H10 bispecifikus antitest azon képességét, hogy a tTF-t A20 sejtekhez köti, és ezt a kontroll bispecifikus antitest azonos képességéhez viszonyítjuk. A vizsgálathoz A20 sejteket bispecifikus antitesttel és 125I-tTF-fel inkubálunk a fent megadott koncentrációtartományban. A bispecifikus antitest telítési koncentrációja 10 nmol/1 (1 pg/ml) vagy ennél nagyobb, amikor is az A20 sejtekhez kötött tTF-molekulák átlagos száma 310 000/sejt. A kötődés specifikus, mivel a tTF kötődését nem közvetíti egyik izotípusosan ellenőrzött kontroll bispecifikus antitestként alkalmazott SFR8/10H10 és B21-2/OX7 antitest sem, amelyek a tTF megkötéséhez szükséges két specifikusság közül csak az egyiket tartalmazzák (1. ábra).
4. Koaguláció
Vizsgáljuk, hogy a bispecifikus antitesten keresztül az A20 sejtekhez kötött tTF képes-e a koaguláció megindítására. Ehhez A20 sejteket először 21,5 nmol/1 bispecifikus antitesttel, és 69 nmol/1 tTF-fel inkubálunk. Az eredményként kapott koagulációs időt a VII. táblázat tartalmazza. Az első vizsgálatok szerint a B21-2/1 OH 10 komplexszel és tTF-fel bevont A20 sejtek képesek a fibrinképzódés kiváltására: a koagulációs idő 140 másodpercről (egérplazma koagulálásához szükséges idő CaCl2 jelenlétében, antitest és TF távollétében, az alkalmazott körülmények között) 60 másodpercre csökken. Ezzel ellentétben, a kontroll bispecifikus antitest nem aktiválja a koagulációt: a koagulációs idő ebben az esetben 140 másodperc.
Az utóbbi vizsgálatok igazolják és kiterjesztik a kezdeti értékeket. Az egérplazma olyan A20 sejtek jelenlétében, amelyekhez B21-2/10H10 hídon keresztül tTF-et kapcsolunk, gyorsan koagulálódik. Összekeverés után a fibrinszálak 36 másodperc elteltével láthatók, szemben a kezeletlen A20 sejtekkel kevert plazmánál mért 164 másodperccel (VII. táblázat). A koaguláció csak akkor indukálódik, ha a sejtekhez tTF kapcsolódik: a koagulációs idő nem változik, ha a sejteket önmagában tTF-fel, homodimer F(ab’)2, Fab’ fragmensekkel vagy a tTF megkötéséhez szükséges két specifikusság közül csak az egyikkel rendelkező bispecifikus antitesttel inkubáljuk.
Lineáris összefüggés van az egyes A20 sejtekhez kötött tTF-molekulák átlagos száma és az egérplazmában ilyen sejtekkel indukált koaguláció gyorsasága között (2. ábra). A sejtenként 300 000 tTF-molekulát hordozó sejtekkel indukált koaguláció ideje 40 másodperc, míg a sejtenként 20 000 molekulát hordozó sejtek által indukált koaguláció is szignifikánsan gyorsabb (140 másodperc), mint a kezeletlen sejtek esetében (190 másodperc).
VII. táblázat
Egérplazma koagulációs ideje bispecifikus antitesttel A20 sejtekhez kötött tTF által indukálva
Felhasznált reagens1 Koagulációs idő2 (másodperc)
Reagens nélkül 164+4
B21-2/1 OH 10+tTF 36+2
B21-2/10H10 163+2
tTf 163+3
B21-2/OX7+tTf 165+4
SFR8/10H10+tTF 154+5
10H10 F(ab’)2+tTf 160+3
10H10 Fab’+tTf 162+2
B21-2 F(ab’)2+tTf 168+4
B21-2 Fab’+tTf 165+4
1: Bispecifikus antitestek F(ab’)2 és Fab’ fragmenseit (0,33 pg/105 sejt/100 μΐ) és tTF-t (0,17 pg/105 sejt/100 pg) inkubálunk A20 sejtekkel 0,2 vegyes% nátrium-azidban 1 órán keresztül és 4 °C hőmérsékleten. A sejteket mossuk, 37 °C hőmérsékletre melegítjük, kalciumot és plazmát adunk hozzá, és mérjük az első fibrinszálak megjelenéséig eltelt időt.
2: Három párhuzamos meghatározás számtani közepei standard szórás
III. példa
Tumorérrendszer in vivő specifikus koagulálása A példában tumorérrendszer in vivő specifikus koagulálását mutatjuk be, ami a humán szövetfaktor szállítóeszközeként szolgáló bispecifikus antitest koaguligandum adagolásának hatására következik be.
A) Anyagok és módszerek 1. Reagensek
A szív megcsapolásával egérvért gyűjtünk egytized térfogatrész 3,8% pufferolt citrátoldatba. A vért 10 per50
HU 220 347 Β cen keresztül 3000 g értéken centrifugáljuk, és a plazmát kis részletekben hirtelen megfagyasztjuk, és -70 °C hőmérsékleten tároljuk.
2. Állatok
A kísérleteket SPF körülmények között tartott BALB/c nu/nu egereken (Simonsen, Gilroy, CA, USA) végezzük.
3. Cl300 (Mwj) egérmodell és kezelés
Három eltéréssel a fent ismertetett tumormodellt [Burrows és munkatársai idézett műve (1992); Burrows és Thorpe idézett műve (1993)] alkalmazzuk. Először, antitestként B21-2 antitestet használunk. Ez az antitest felismeri az I-Ad-t, de nem ismeri fel I-Ed-t, és ennyiben eltér a korábban alkalmazott M5/114 antitesttől, amely mindkét molekulát felismeri. A B21-2 antitest közel tízszer jobb affinitással rendelkezik, mint az M5/114. Másodszor, a fenti 0300 (Muy) 12 vonal egyik alvonalját használjuk, amely BALB/c nu/nu egerekben folyamatosan növekszik. A fenti 0300 (Muy) 12 sejteket transzfektálás nélkül 0300 sejtekkel kell keverni a tumor folyamatos növekedésének biztosításához. Az új alvonal jele 0300 (Muy) tlP3 (továbbiakban 0300 (Muy)]. Harmadszor, nincs szükség arra, hogy az egerek itatóvizébe tetraciklint adagoljunk annak megakadályozására, hogy a bélbaktériumok indukálják a gasztrointesztinális epitéliumon található I-Adt. Az immunotoxinoktól eltérően a koaguligandum nem károsítja az I-Ad-t kifejező bélepitéliumot.
A szilárd tumor kialakításához 1,5 xlO7 0 300 (Muy) sejtet fecskendezünk szubkután a BALB/c nu/nu egerek jobb első csípőjébe. Amikor a tumor eléri a 0,8 cm átmérőt, akkor az állatokat véletlenszerűen egyenként 7-8 egeret tartalmazó kezelési csoportokra osztjuk.
A koaguligandum előállításához 140 pg bispecifikus antitestet és 110 pg tTF-t összesen 2,5 ml 0,9% nátrium-klorid-oldatban összekeverünk, és 1 órán keresztül 4 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. Az egereknek 0,25 ml fenti elegyet (vagyis 14 pg bispecifikus antitestet és 11 pg tTF-t) adagolunk intravénás injekció formájában. A másik kezelési csoportnak önmagában 14 pg bispecifikus antitestet vagy 11 pg tTF-t adagolunk. Az injekciót lassan, mintegy 45 másodperc alatt adagoljuk a farki vénába, majd ugyanebbe a vénába második injekcióként 200 pl sóoldatot adagolunk. Ezzel az eljárással elkerülhető a farokvéna trombózisa, ami gyakran előfordul, ha az egereknek az injekciót gyorsan (1-2 másodperc) adagoljuk. 7 nap elteltével a kezelést megismételjük.
A függőleges tumorátmérőket szabályos időközökben méljük, és a tumor térfogatát az alábbi egyenlet alapján becsüljük:
térfogat=kisebb átmérő2 x nagyobb átmérő χ π/6.
A tumortérfogatnál jelentkező eltérés statisztikai szignifikanciáját két független minta Mann-Whitney-Wilcoxon-féle nemparametrikus vizsgálatával [Gibbons idézett műve (1976)] teszteljük.
A hisztopatológiás vizsgálatokhoz az állatokat a kezelés különböző időpontjaiban metofánnal elaltatjuk, és heparinozott sóoldat bevezetésével kivéreztetjük. Intravénás injekció formájában 500 NE heparint adagolunk, és a szisztemikus keringést PBS-sel tartjuk fenn 0,6 ml/perc áramlási sebesség mellett. Ezt addig végezzük, míg a máj a vértől kiürül. A tumort és a normálszöveteket kivágjuk, és 4 térfogat% formaiinban fixáljuk. A szövetek paraffinszekcióját eltávolítjuk, és standard Martius Scarlet Blue (MSB) trikróm technikával színezzük a fibrin detektálása érdekében, és hematoxilinnal és eozinfestékkel színezzük a sejtmorfológia megállapítása érdekében.
B) Eredmények
1. Javított tumormodell
A fent ismertetett Cl300 (Muy) turmormodell [Burrows és munkatársai idézett műve (1992)] javítása érdekében Cl300 (Muy) sejtvonalat olyan sejtvonalba szubklónozzuk, amely az eredeti Cl300 sejtekkel történő összekeverés nélkül növekszik, de továbbra is kifejezi az I-Ad MHC II osztályba tartozó antigént a tumor endotéliás sejtjein. Az alkalmazott anti I-Ad antitest (B21-2) 5-10-szer nagyobb affinitást mutat a saját antigénjével szemben, mint a modellben kezdetben alkalmazott anti I-Ad antitest (M5/114.15.2), ahol az affinitást FACS módszerrel méljük. A fenti új anti I-Ad antitesttel végzett in vivő eloszlási vizsgálatok ugyanazt a szöveteloszlási mintát mutatják, mint az M5/114.15.2 esetében. A B21-2-vel intenzív elszíneződés látható a tumorérrendszer endotéliumában, enyhe-közepes elszíneződés látható a máj Kuppfer-sejtjeiben, a lép kerületi zónájában, és a vékonybél és vastagbél bizonyos területein. Más normálszövetek edényei nem színeződnek meg.
2. Megfelelő in vivő dózis meghatározása
Az egerek farokvénájába történő intravénás befecskendezéssel bevitt maximális tolerálható dózis 16 pg B21-2/10H10+11 p tTF. Ennél a dózisnál az egérnél súlycsökkenés nem jelentkezik, és a vizsgálati állat normális megjelenést és aktivitást mutat. Nagyobb dózisú 20 pg B21-2/10H10+16 pg tTF adagolása esetén tíz egér közül kettőnél lokalizált bőrvérzések jelennek meg, amelyek esetenként feloldódnak. Az in vivő vizsgálatokhoz a kisebb dózis felel meg. A csonkolt TF 50 pg mennyiségben intravénásán adagolva önmagában nem toxikus.
3. Specifikus koaguláció és infarktus a tumor érrendszerében pg B21-2/10H10 és 16 pg tTF összetételű koaguligandum intravénás adagolásával szilárd Cl 300 (Muy) tumort hordozó egereknél a tumor 30 percen belül megfeketedik és összezúzódik. A tumorban lejátszódó események idő függvényében történő hisztológiás vizsgálata szerint 30 perccel a koaguligandum befecskendezése után a tumor teljes terjedelmében trombózisos erek találhatók (3B. ábra). Az erek vértestecske-aggregátumokat, lerakodott vörös vérsejteket és fibrint tartalmaznak. Ebben az időpontban a tumorsejtek egészségesek, és a kezeletlen egerek tumorsejtjeitől morfológiailag nem különböztethetők meg (3A. ábra).
óra elteltével a tumorsejtek pusztulása egyértelművé válik. A tumorsejtek nagy része egymástól elválik, és piknotikus magot fejleszt (3C. ábra). A tumorban szövetközi eritrociták figyelhetők meg. 24 óra eltelté51
HU 220 347 B vei a tumor előrehaladott pusztulása látható a tumor teljes keresztmetszetében (3D. ábra). 72 óra elteltével a tumor teljes központi szakasza morfológiailag egységes törmelékké alakul át.
A vizsgált három tumor közül az egyiknél 5-10 sejtvastagságú látható perem alakul ki a tumor szegélyén, amely beszűrődik a környező normálszövetekbe. A tumor immunohisztokémiai vizsgálata szerint a beszűrődő tumorszakaszok edényeiben hiányoznak a II osztályba tartozó antigének.
Az önmagában 20 pg B21-2/1 OH 10 bispecifikus antitesttel kezelt kontroliegerek tumorjában 30 perc vagy 24 óra elteltével infarktus nem mutatható ki. A 16 pg tTF-fel önmagában vagy B21-2/OX7 vagy SFR8/10H10 antitesttel kombinálva kezelt egerek tumorjában 30 perc elteltével infarktus nem mutatható ki, 24 óra elteltével egyes edényekben (mintegy 20%) infarktus észlelhető. Ez elsősorban a tumor magjában jelentkezik.
A koaguligandum vagy tTF adagolását követő 30 perc, 4 óra és 24 óra elteltével a tumort hordozó egerek paraffinszekciójában, májában, veséjében, tüdejében, belében, szívében, agyában, mellékveséjében, hasnyálmirigyében és lépében trombusz vagy morfológiai abnormalitás nem mutatható ki.
4. Szilárd tumor visszafejlődése
A 4. ábra egy reprezentatív vizsgálat eredményeit mutatja, amelyben B21-2/10H10 és tTF összetételű koaguligandumot adagolunk 0,8 cm átmérőjű tumort hordozó egereknek. A tumor kezelés előtti méretének mintegy felére fejlődött vissza. A kezelést 7 nap elteltével megismételve a tumor visszafejlődése folytatódik, és általában végeredményben teljesen eltűnik. Az állatok 5/7 részénél teljes visszafejlődés figyelhető meg. Két egérnél 4 és 6 hónap elteltével visszaesés jelentkezett. Ez a tumor elleni hatás statisztikailag erősen szignifikáns (p< 0,001) más csoportokkal összehasonlítva.
Az önmagában tTF-fel vagy tTF és izotípusosan ellenőrzött kontroll bispecifikus antitest, így SFR8/10H10 vagy B21-2/0X7 antitest keverékével kezelt egerekben a tumor sokkal lassabban fejlődik, mint az önmagában antitesttel vagy hígítóanyaggal kezelt kontrollállatoknál. Az eltérés a 12-14. napon statisztikailag szignifikáns (p<0,05). A vizsgálat végén két olyan egérnek, amelyek önmagában hígítóanyagot kaptak, és amelyek nagyméretű 2,0 cm3 és 2,7 cm3 kiterjedésű (vagyis testtömegük 10—15%-át kitevő) tumort hordoznak, koaguligandumterápiát adtunk. Mindkét állatban visszafejlődött a tumor, de később eredeti helyén újból kialakult.
C) Értékelés
A vizsgálatok szerint az oldható humán tTF, amely gyakorlatilag nem képes a koaguláció kiváltására, a tumor érrendszere vonatkozásában hatásos trombogén anyaggá válik, ha bispecifikus antitesttel a tumor endotéliás sejtjeihez juttatjuk. Az in vitro koagulációs vizsgálatok igazolják, hogy a tTF trombotikus aktivitása a sejtfelületen található antigénekkel kialakított keresztkötések hatására alakul ki.
A tTF nagy affinitása megköti a VII és Vlla faktorokat, és fokozza a Vlla faktor katalitikus hatását, de a plazmában nem okoz koagulációt, mert a tTF/VIIa komplexnek egy membránfelületen kell asszociálódni a IX és X faktor hatásos aktiválásához [Ruf és munkatársai idézett műve (1991); Krishnaswamy és munkatársai idézett műve (1992)]. Ha a tTF/VIIa komplexet egy bispecifikus antitesttel a sejt felületéhez kapcsoljuk, akkor a komplex képessé válik a koaguláció indukálására, mivel a tTF/VIIa komplex közeli szomszédságba kerül a membránnal, és a membrán foszfolipidjei biztosítják azt a felületet, amelyen a koagulációt megindító IX vagy X faktorral kialakított komplexek hozzáférhetővé válnak, és megkezdik az alvadási folyamat intermedierjeinek hatékony termelését.
Ha II osztályba tartozó antigének elleni koaguligandumot adagolunk olyan egereknek, amelyek érrendszerében II osztályba tartozó antigént kifejező tumort hordoznak, akkor a tumor véredényeiben gyors trombózis alakul ki. Ezt a legtöbb állatnál a tumor infarktusa és teljes visszafejlődése követi. Azoknál az állatoknál, amelyeknél nem következik be a teljes visszafejlődés abból a megmaradó keretből, amit a tumor környezetében található normálszövetekbe beszűrődő tumorsejtek képeznek. A tumor növekvő szegélyén található edények nem fejeznek ki II osztályba tartozó antigéneket, és ezért a koaguligandum az ilyen edényekben nem vált ki trombózist. Feltételezhető, hogy ezek a túlélősejtek önmagában a tumorsejtekre ható anyagok együttes adagolásával elpusztíthatok [Burrows és Thorpe idézett műve (1993)].
A koaguligandum tumor elleni hatása hasonló mértékű, mint az azonos tumormodellben anti II osztályba tartozó antitestből és deglikozilált ricin A láncból kialakított immunotoxin hatása [Burrows és Thorpe idézett műve (1993)]. A két szer között különbség van azonban a hatás gyorsaságában. A koaguligandum a tumor edényeiben a trombózist 30 percen belül kiváltja, míg az immunotoxinnak 6 órával van szüksége azonos hatás eléréséhez. Az immunotoxin hatása azért lassabb, mivel a trombózis csak szekunder következménye az endotéliás sejtek pusztulásának, amit a fehérjeszintézis elnyomása vált ki.
Az immunotoxin és a koaguligandum közötti második fontos különbség, hogy eltérő toxikus mellékhatásokat okoznak. Az immunotoxin letális mértékben roncsolja a II osztályba tartozó antigéneket kifejező gasztrointesztinális epitéliumot, ami csak olyan antibiotikum adagolásával kerülhető el, ami elnyomja a II osztályba tartozó antigének bélbaktériumok által történő indukálását. A koaguligandum nem okoz gasztrointesztinális sérülést, mivel a véren kívül nem tartalmaz véralvadást kiváltó faktorokat, de egyes egereknél nagy dózisban adagolva kóros alvadást okoz.
Az ismertetett vizsgálatok igazolják a tumor érrendszerébe juttatott humán koagulációt kiváltó fehérjék terápiás potenciálját. A klinikai alkalmazáshoz olyan antitestekre vagy más ligandumokra van szükség, amelyek a szilárd tumor érrendszerének endotéliás sejtjei felületén jelen lévő, de a normálszövetek endotéliás sejtjeiről hiányzó molekulákhoz kötődnek. Tumor endotéliás markerek indukálhatok közvetlenül a tumorból származó angiogenetikus faktorokkal [Folkman idézett műve
HU 220 347 Β (1985)] vagy citokinokkal [Burrows és munkatársai idézett műve (1991); Ruco és munkatársai idézett műve (1990)], vagy neovaszkularizációval kiváltható az endotéliás sejtek gyors szaporodása [Denekamp és Hobson idézett műve (1982)] és migrációja [Folkman idézett műve (1985)].
Az ilyen antitestekre számos példát ismertettünk. Előnyös példaként említhető az endoglin elleni TEC11 antitest, amely szelektíven kötődik a humán tumor endotéliás sejtekhez.
További példaként említhetők az endoszialin FB5 antitest [Rettig és munkatársai idézett műve (1992)], az endoglinszerű molekulák elleni E-9 antitest [Wang és munkatársai idézett műve (1993)], a fibronektin izoform elleni BC1 antitest [Camemolla és munkatársai idézett műve (1989)] és az oszteoszarkómával összefüggő antigén elleni TP-1 és TP-3 antitest [Bruland és munkatársai idézett műve (1988)]. A CD34 antitestről kimutatták, hogy túlszabályozódik a migráló endotéliás sejteken és a tumorban és magzati szövetekben lejátszódó kapillárisképző abluminális folyamatokban [Schlingemann és munkatársai idézett műve (1990)}. A vaszkuláris endotéliás sejtnövekedési faktor (VEGF) receptorai túlszabályozódnak a tumor véredényeiben [Plate és munkatársai idézett műve (1993); Brown és munkatársai idézett műve (1993)], feltehetően hipoxia következtében [Thieme és munkatársai idézett műve (1995)] és szelektíven koncentrálják a VEGF-t a tumorerekben [Dvorák és munkatársai idézett műve (1991)].
A tumor infarktusának koagulációját kiváltó fehérjék ilyen és más tumor endotéliás sejtmarkerekhez történő eljuttatásával végzett indukálása tehát egy értékes új megoldásnak tekinthető a szilárd tumorok kezeléséhez. A humán (vagy humanizált) antitestek humán koaguláló fehéijékhez történő kapcsolásával kialakított teljesen humán koaguligandum lehetővé teszi a primer tumor és áttétel elleni ismételt kezelést.
IV. példa
Csonkolt szövetfaktor (tTF) szintézise
A tTF az érett szövetfaktor-fehéije extracelluláris doménje (az érett fehéije 1-219 aminosavja, szekvenciaazonosítási szám 23). A 23. számú szekvenciát például a 22. számú szekvencia kódolja.
A)H6[tTF]
H6 Alá Met Alá [tTF]: A tTF komplementer DNS (cDNS) előállításához J82 sejtek (humán hólyagkarcinóma) RNS-éből indulunk ki. Az össz-RNS-t GlassMax RNS mikroizolációs reagenssel (Gibco BRL) izoláljuk. Az RNS-t reverz transzkripcióval cDNS-sé alakítjuk a GeneAmp RNS PCR készlet (Perkin Elmer) felhasználásával. A tTF cDNS-t ugyanezen készlettel kiegészítjük a következő két printerrel:
5' primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCT CAG GCA CTA CAA (szekvenciaazonosítási szám: 1) ‘primer:
5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (szekvenciaazonosítási szám: 2)
Az aláhúzott szekvenciarész kódolja a tTF N-terminális részét. Az 5’ printerben található maradék szekvencia Ncol hasítóhely, amely lehetővé teszi a tTF expressziós vektorba történő klónozását. A 3’ printerben található maradék szekvencia Hindin hasítóhely, amely lehetővé teszi a tTF expressziós vektorba történő klónozását. A PCR kiterjesztést a gyártó előírásai szerint végezzük. Röviden, 75 pmol/l dNTP-t, 0,6 pmol/l prímért és 1,5 mmol/1 MgCl2-t használunk, 30 ciklust végzünk 30 másodpercen keresztül 95 °C hőmérsékleten, 30 másodpercen keresztül 55 °C hőmérsékleten és 30 másodpercen keresztül 72 °C hőmérsékleten.
A tTF kifejezésére H6 pQE-60 E. coli expressziós vektort [Lee és munkatársai idézett műve (1994)] használunk. A PCR-kiteijesztett tTF cDNS-t az Ncol és Hindin helyek közé inszertáljuk. A H6 pQE-60 expressziós vektor tartalmaz egy beépített (His)6 kódolószekvenciát, és ezért a kifejezett fehérje N-terminális részén (His)6 szekvenciát tartalmaz, ami Ni-NTA oszlopon tisztítható.
A tTF tisztításához a tTF-t tartalmazó H6 pQE60 DNS-t TG-1 E. colisejtekbe transzformáljuk. A sejteket OD600 = 0,5 értékig növesztjük, majd 30 pmol/l koncentrációig IPTG-t adunk hozzá a tTF-termelés megindításához. A sejteket 18 órán keresztül 30 °C hőmérsékleten rázzuk, majd összegyűjtjük. A sejtpelletet 6 mol/1 Gu-HCl-oldattal denaturáljuk, és a lizátumot Ni-NTA-oszlopra (Quiagen) visszük. A kötött tTF-t 6 mol/1 karbamiddal mossuk, majd 6 mol/1-1 mol/1 karbamidgradienssel szobahőmérsékleten 16 órán keresztül hajtogatjuk. Az oszlopot mosópufferrel (0,05 mol/1 NaH2PO4,0,3 mol/1 NaCl és 10% glicerin) mossuk, és a tTF-t 0,2 mol/1 imidazolt tartalmazó mosópufferrel eluáljuk. Az eluált tTF-t koncentráljuk, és G-75 oszlopra visszük. A tTF monomereket összegyűjtjük.
B) tTF
Gly[tTF]: GlytTF komplementer DNS-t (cDNS) állítunk elő a fent leírt módon azzal az eltéréssel, hogy a PCR kiterjesztésnél a következő 5’ prímért használjuk:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CTT CTG GCA CTA CAA ATA CT (szekvenciaazonosítási szám: 3)
A fenti szekvenciában aláhúzott rész a tTF N-terminális részét kódolja. A maradék szekvencia Ncol restrikciós helyet és trombinhasító helyet kódol.
A kifejezéshez H6 pQE-60 expressziós vektort használunk, és az eljárást a fent leírt módon végezzük azzal a különbséggel, hogy a végső fehérjeterméket trombinnal kezelve eltávolítjuk a H6 pepidet. Ehhez 1 tömegrész trombint (Sigma) adagolunk 500 tömegrész tTF-re számolva, és a hasítást szobahőmérsékleten és 18 órán keresztül végezzük. A trombin eltávolításához az elegyet benzamidin Sepharose 6B trombin affinitásoszlopon (Pharmacia) hajtjuk át.
C) Ciszteinnel módosított tTF
A tTF szerkezetet N-terminális vagy C-terminális részén ciszteinnel módosítjuk, ami megkönnyíti, hogy a szerkezet diszulfidhídon keresztül az antitestszármazékhoz konjugáljon.
HU 220 347 Β
H6 C[tTF]: (His)6 Alá Met Alá Cys-[tTF] előállításához DNS-t állítunk elő a fent leírt módon azzal az eltéréssel, hogy az alábbi 5’ prímért használjuk a PCR kiterjesztéshez:
5’ GTC ATG CCA TGG CCT GCT CAG GCA CTA CAA ATA CTG TG (szekvenciaazonosítási szám: 4)
Az eljárás összes lépését a fent leírt módon végezzük azzal az eltéréssel, hogy az N-terminális cisz-maradékot lecserélhető oxidáló/redukáló reagenssel védjük.
C[tTF]: Gly Ser Cys [tTF2-219] DNS-t állítunk elő a fent leírt módon azzal az eltéréssel, hogy az alábbi 5’ prímért használjuk a PCR kiterjesztéshez:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (szekvenciaazonosítási szám: 5).
Ugyanazt a vektorszerkezetet használjuk, és a fehérjetisztítást ugyanúgy végezzük, mint a (His)6 Alá Met Alá Cys [tTF] esetében azzal az eltéréssel, hogy a (His)6 eltávolításához trombinos kezelést végzünk a fent leírt módon.
H6[tTF]C: (His)6 Alá Met Alá [tTF] Cys DNS-t állítunk elő a (His)6 AMA [tTF] szakaszban leírt módon azzal az eltéréssel, hogy az alábbi 3’ prímért használjuk: 5’ TG A CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (szekvenciaazonosítási szám: 6).
A szekvencia aláhúzott része a tTF C-terminális részét kódolja. A szekvencia maradéka HindlII restriciós helyet tartalmaz a tTF expressziós vektorba történő klónozásához.
Az eljárás összes lépését tTF szakaszban leírt módon végezzük azzal az eltéréssel, hogy 10 pmol/l βME-t tartalmazó 6 mol/g Gu-HCl denaturáló oldatot használunk, és a C-terminális ciszteint lecserélhető oxidáló/redukáló reagenssel védjük. A fenti eljárással más [tTF] Cys monomerek is előállíthatok, például a [tTF 1-220] Cys, [tTF 1-221] Cys és [tTF 1-222] Cys, amelyek a fentiekhez hasonló módon konjugálhatók.
D) C linker [tTF]
C liner [tTF]: Gly-Ser-Cys-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser(Gly)4-Ser-[tTF] cDNS-t állítunk elő, és kétlépéses PCR eljárással kiteijesztjük:
PCR 1: Linker DNS kiterjesztése
Ncol helyet, trombinhasító helyet, ciszteint, linkért és tTF N-terminális részét kódoló cDNS-t terjesztünk ki a következő primerekkel:
'primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCG GA GGC GGT GGA TCA GGC (szekvenciaazonosítási szám: 7)
3'primer:
5’ AGT ATT TGT AGT GCC TGA GGA TCC GCC ACC TCC ACT (szekvenciaazonosítási szám: 8).
A szekvencia aláhúzott része a linkerpeptidet kódolja. A PCR eljárásnál DNS-templátként kettős szálú DNS-t használunk, amely a következő linkért kódolja: GGA GGC GGT GGA TCA GGC GGT GGA GGT AGT GGA GGT GGC GGA TCC (szekvenciaazonosítási szám: 9).
A PCR eljárást a tTF szakaszban ismertetett körülmények között végezzük. A 95 b.p. kiterjesztett terméket a PCR2 lépésben tTF DNS-hez kapcsoljuk.
PCR 2: Cys-linker DNS és tTF DNS-összekapcsolása
A PCR eljárásnál DNS-templátként két átfedő DNS-t használunk, a PCR 1 lépésben kapott 95 b.p. DNS-t és a tTF DNS-t. A kiterjesztéshez a következő primereket használjuk:
5’ primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TG (szekvenciaazonosítási szám: 10) 'primer:
5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (szekvenciaazonosítási szám: 11).
A PCR eljárással kapott 740 b.p. terméket Ncol és HindlII enzimekkel emésztjük, és H6 pQE-60 expressziós vektorba inszertáljuk a tTF szakaszban leírt módon.
A vektorszerkezet alkalmazását és a fehérje tisztítását a C[tTF] szakaszban leírt módon végezzük.
V. példa
Dimer szövetfaktor szintézise
Feltételezhető, hogy a szövetfaktor dimer hatásosabban kiváltja a koagulációt, mint a monomer. Feltételezhető továbbá, hogy a J82 hólyagkarcinóma-sejtek felületén található természetes szövetfaktor dimer formájában létezik [Fair és munkatársai idézett műve (1987)]. Egy molekula VII vagy Vlla faktor egy molekula szövetfaktorhoz történő kötődése gyorsíthatja egy másik VII vagy Vlla faktor egy másik szövetfaktorhoz történő kötődését (Fair és munkatársai idézett műve (1987); Bach és munkatársai idézett műve (1986)]. Emellett, a szövetfaktor szerkezeti homológiát mutat a citokin receptorcsaládba tartozó vegyületekkel [Edgington és munkatársai idézett műve (1991)], amelyek közül néhány dimerizálódás útján alakul aktív receptorrá [Davies és Wlodawer idézett műve (1995)]. A fentiek alapján ezért TF-dimert szintetizálunk.
A) [tTF] linker [tTF]
Gly[tTF] linker [tTF] szerkezetet állítunk elő, amelynek pontos összetétele Gly-[tTF]-(Gly)4-Ser(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-[tTF]. Két DNS-darabot PCR technikával egymástól külön kiterjesztünk, ligáljuk és vektorba inszertáljuk az alábbiak szerint:
PRC1: A tTF és a linker DNS 5’ felének előállításához a PCR eljárásban az alábbi primer szekvenciákat használjuk:
5’ primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (szekvenciaazonosítási szám: 12) ‘primer:
5’ CGC GGA TCC ACC GCC ACC AGA TCC ACC GCC TCC TTC TCT GAA TTC CCC TTT CT (szekvenciaazonosítási szám: 13).
HU 220 347 Β
DNS templátként Gly[tTF] DNS-t használunk. A PCR eljárást a tTF szakaszban leírt körülmények között végezzük.
PCR 2: A linker DNS 3’ felének éa tTF DNS előállításához a PCR eljárásban az alábbi primer szekvenciákat használjuk:
'primer :
5’ CGC GGA TCC GGC GGT GGA GGC TCT TCA GGC ACT ACA AAT ACT GT (szekvenciaazonosítási szám: 14) ‘primer:
5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTCT (szekvenciaazonosítási szám: 15).
A PCR eljárásban templátként tTF DNS-t használunk. A PCR 1 lépés termékét Ncol és BanH enzimekkel emésztjük. A PCR 2 lépés termékét HindlII és BamHI enzimekkel emésztjük. A hasított PCR 1 és PCR 2 DNSeket Ncol és HindlII enzimekkel hasított H6 pQE-60 expressziós vektorba ligáljuk.
A vektorszerkezet alkalmazását és a fehérjetisztítást a Gly [tTF] szakaszban leírt módon végezzük.
B) Cys [tTF] linker [tTF]
Cys [tTF] linker [tTF] szerkezetet állítunk elő, amelynek pontos összetétele Ser-Gly-Cys-[tTF 2-219]-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-[tTF], A PCR eljáráshoz a következő primereket használjuk:
'primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (szekvenciaazonosítási szám: 16) ‘primer:
5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTCT (szekvenciaazonosítási szám: 17).
Templátként [tTF] linker [tTF] DNS-t használunk. A PCR eljárást a tTF szakaszban leírt körülmények között végezzük. A vektorszerkezet alkalmazását és a fehérje tisztítását H6C[tTF] szakaszban leírt módon végezzük.
C) [tTF] linker [tTF]cys
A [tTF] linker [tTF]cys dimer fehérjeszerkezete [tTF]-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-(Gly)4-Ser-[tTF]-Cys. A DNS-t PCR eljárással terjesztjük ki az alábbi primerek alkalmazásával:
5’ primer:
5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCA CTA CAA ATA CT (szekvenciaazonosítási szám: 18)
3' primer:
5’ TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T (szekvenciaazonosítási szám: 19).
Az eljárásnál templátként [tTF] linker [tTF] DNS-t használunk. A PCR eljárást a tTF szakaszban leírt körülmények között végezzük. A vektorszerkezet alkalmazását és a fehéije tisztítását a [tTF]cys szakaszban leírt módon végezzük.
D) Kémiailag konjugált dimerek [tTF] Cys monomer kémiai konjugálásával [tTF]Cys-Cys-[tTF] dimert állítunk elő. Ehhez ekvimoláris mennyiségben DTT-t adunk védett [tTF] Cys szerkezethez szobahőmérsékleten, majd 1 óra elteltével a védőcsoportot eltávolítjuk, és feltáquk a [tTF] Cys szerkezet C-terminális részén található ciszteint. Ekvimoláris mennyiségű védett [tTF] Cys szerkezetet adunk a DTT/[tTF] Cys elegyhez, és 18 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáljuk. A dimert G-75 gélszűrő oszlopon tisztítjuk.
Cys [tTF] monomert kémiai konjugálással azonos módon dimerré alakítunk.
VI. példa
Szövetfaktormutánsok szintézise
Két tTF mutáns ismert, amelyből hiányzik az a képesség, hogy a tTF-hez kötött VII faktort Vlla faktorrá alakítsa. A plazmában 300-szor kevesebb Vlla faktor található a VII faktorhoz viszonyítva [Morrissey és munkatársai idézett műve (1993)]. Ezért a keringő mutáns tTF kevésbé képes a koaguláció megindítására, és ezért nagyon alacsony toxicitással rendelkezik. A koaguligandumban lévő mutáns tTF a kapcsolódó antitesten keresztül a tumor helyén lokalizálódik, majd Vlla faktort befecskendezve kicseréljük a tTF-hez kötött VII faktort. A mutánsok Vlla faktor jelenlétében aktívak.
A) [tTF]G164A
A,[tTF]G164A” egy mutáns fehéijeszerkezet, amelyben a tTF 164 helyzetű Gly aminosavját Alá aminosavra cseréltük. A mutáns előállításához kaméleon kettős szálú, helyspecifikus mutációkészletet (Stratagene) használunk. DNS templátként Gly[tTF] DNS-t használunk, és a mutációs primer szekvenciája:
5’ CAA GTT CAG CCA AGA AAAC (szekvenciaazonosítási szám: 20).
A vektorszerkezet alkalmazását és a fehéije tisztítását a Gly[tTF] szakaszban leírt módon végezzük.
B) [tTF] W158R S162A
A [tTF] W158R SÍ62A egy kettős mutáns szerkezet, amelyben a tTF 158 helyzetű Trp aminosavját Arg aminosav, és 162 helyzetű Ser aminosavját Alá aminosav helyettesíti. A mutációt a [tTF] G164A szakaszban leírt módon végezzük. Mutációs primerként az alábbi prímért használjuk:
5’ ACA CTT TAT TAT CGG AAA TCT TCA GCT TCA GGA AAG (szekvenciaazonosítási szám: 21).
A vektorszerkezet alkalmazását és a fehéije tisztítását a Gly[tTF] szakaszban leírt módon végezzük.
VII. példa
Szövetfaktor-konjugátumok szintézise
A) Kémiai származékképzés és antitest konjugálása
Antitest tTF konjugátumokat állítunk elő úgy, hogy kémiailag előállított antitestszármazékot kémiailag előállított tTF származékhoz kapcsolunk diszulfidkötés segítségével (lásd az 5. ábrát).
Az antitestet ötszörös moláris feleslegben szukcinimidil-oxikarbonil-a-metil-a-(2-piridil-ditio)-toluollal (SMPT) reagáltatjuk 1 órán keresztül és szobahőmérsékleten, amelynek során molekulánként átlag 2-piridil-diszulfid-csoportot tartalmazó antitestszármazékot
HU 220 347 B kapunk. Az antitestszármazékot gélpermeációs kromatográfiával tisztítjuk.
Az antitestre vonatkoztatva 2,5-szörös moláris feleslegé tTF-t 45-szörös moláris feleslegé 2-imino-tiolánnal (2IT) reagáltatunk 1 órán keresztül és szobahőmérsékleten, amelynek során molekulánként átlag 1,5 szulfhidrilcsoportot tartalmazó tTF-származékot kapunk. A tTFszármazékot gélpermeációs kromatográfiával tisztítjuk, és azonnal összekeverjük az antitestszármazékkal.
Az elegyet 72 órán keresztül szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd Sephacryl S-300 oszlopra visszük, és az antitest/tTF konjugátumot elválasztjuk a szabad tTF-től, és felszabadítjuk a piridin-2-tiont. A konjugátumot anti tTF oszlopon végzett affinitáskromatográfiával elválasztjuk a szabad antitesttől. A végső konjugált tennék fő molekuláris összetevője az egyszeresen szubsztituált antitest/tTF konjugátum (móltömeg mintegy 176 000), és kisebb mennyiségben többszörösen szubsztituált konjugátumot (móltömeg nagyobb mint 202 000) tartalmaz SDS-PAGE vizsgálat szerint.
B) Ciszteinnel módosított tTF és antitestszármazék összekapcsolása
Antitest/C[TF] és antitest/[tTF]C konjugátumokat állítunk elő úgy, hogy ciszteinnel módosított tTF-t közvetlenül kémiailag előállított antitestszármazékhoz kapcsolunk diszulfidkötésen keresztül (lásd az 5. ábrát).
Az antitestet 12-szeres moláris feleslegé 2IT-vel reagáltatjuk 1 órán keresztül és szobahőmérsékleten, amelynek során molekulánként átlag 1,5 szulfhidrilcsoportot tartalmazó antitestszármazékot kapunk. Az antitestszármazékot gélpermeációs kromatográfiával tisztítjuk, és azonnal kettőszörös moláris feleslegben ciszteinnel módosított tTF-fel keverjük. A keveréket 24 órán keresztül szobahőmérsékleten reagáltatjuk, majd a konjugátumot a fent leírt módon gélpermeációs és affinitáskromatográfiával tisztítjuk.
A kapott konjugátum fő molekuláris összetevőként egyszeresen szubsztituált konjugátumot (móltömeg mintegy 176 000) és kisebb mennyiségben többszörösen szubsztituált konjugátumot (móltömeg legalább 202 000) tartalmaz az SDS-PAGE vizsgálat szerint.
C) Ciszteinnel módosított tTF és Fab’ fragmensek összekapcsolása
Fab’/C[tTF] és Fab’/[tTF]C konjugátumokat állítunk elő. Az ilyen konjugátumok feltehetően nagyobb in vivő potenciállal rendelkeznek, mivel korlátozott internalizációs képességük miatt hosszabb időn keresztül maradnak a sejt felületén, mint a bivalens konjugátumok. Fab’ íragmenseket kétszeres moláris feleslegben ciszteinnel módosított tTF-fel keverünk 24 órán keresztül, majd a konjugátumot a fent leírt módon gélpermeációs és affinitáskromatográfiával tisztítjuk.
D) tTF konjugátumok véralvadást kiváltó képessége tTF konjugátumokat állítunk elő A20 sejtek felületén kifejeződő II osztályba tartozó antigénekhez kötődő B21-2 monoklonális antitesttel. A konjugátumokat kémiailag előállított tTF származékkal és ciszteinnel módosított tTF-fel állítjuk elő, és A20 sejtek felületéhez történő kötődés után CaCl2-ben felvett egérplazmában méljük a konjugátumok koaguláló képességét.
Az egérplazma CaCl2-ben (kontroll) mérhető alvadási idejét mindkét B21-2 konjugátum dózistól függő mértékben csökkenti. A tTF konjugátumok hasonló módon elősegítik a koagulációt, mint az A20 sejtek felületéhez B21-2/10H10 bispecifikus antitesttel kötött tTF (6. ábra).
E) Tumorsejt elleni tTF-konjugátumok
Korábban már bemutattuk, hogy a tumorérrendszer endotéliás sejtjeihez eljuttatott tTF koagulációt vált ki a tumor ereiben (I—III. példa). Feltételezhető, hogy a koaguláció akkor is kiváltható a tumor ereiben, ha a tTFfel a tumorsejtek felületét vesszük célba.
Három tumorsejt elleni antitestet, a KS1/4, D612 és XMMCO-791 antitestet tTF-fel konjugálunk a tTF konjugátumok előállításánál ismertetett módon. A KS1/4 antitestet az US 4.975.369 számú irat ismerteti, és beszerezhető Dr. Reisfeldtől (Scripps Research Institute, Department of Immunology, La Jolla, California, USA). A D612 antitestet az US 5.183.756 számú irat ismerteti, előállítható az ATCC gyűjteményben HB 9796 számon letétbe helyezett hibridóma-sejtvonal tenyészetének felülúszójából, és beszerezhető Dr. J. Schlomtól (NCI, Laboratory of Tumor Immunology and Biology, Bethesda, Maryland, USA). Az XMMCO-791 antitest az ATCC gyűjteményben található hibridóma-sejtvonal szövettenyészetének felülúszójából tisztítható.
A KS1/4 antitest célsejtjeként Widr humán vastagbélkarcinóma-sejtvonalat használunk. A Widr sejtvonal megtalálható az ATCC gyűjteményben. A sejtvonalat 10 térfogat% magzati borjúszérummal, L-glutaminnal és antibiotikumokkal kiegészített DMEM közegben tartjuk fenn 10 térfogat% CO2-t tartalmazó levegőatmoszférában. A D612 antitest célsejtje az LS147T humán vastagbélsejtvonal. Az LS147T sejtek megtalálhatók az ATCC gyűjteményben. A sejteket 10 térfogat% magzati borjúszérummal, L-glutaminnal, és antibiotikumokkal kiegészített RPMI közegben tartjuk fenn 5 térfogat% szén-dioxidot tartalmazó levegőatmoszférában. Az XMMCO-791 antitest célsejtje H460 humán nem-kissejt tüdőráksejtvonal. A H460 sejtek beszerezhetők Dr. Adi Gazdartól (Simmons Cancer Center, University of Texas, Southwestem Medical Center, Dallas, Texas, USA), és a sejteket 10 térfogat% magzati borjúszérummal, L-glutaminnal és antibiotikumokkal kiegészített DMEM közegen tartjuk fenn 10 térfogat% szén-dioxidot tartalmazó levegőatmoszférában. Mindhárom sejtvonal tapadó monoréteggé fejlődik.
A konjugátumokon mérjük az egérplazma CaCl2ben mutatott alvadási idejének gyorsítását, amikor a konjugátumok a megfelelő célantigéneket kifejező tumorsejtekhez kötődnek. A tumorsejteket a szövettenyésztő edényből 0,05 vegyes EDTA-t tartalmazó PBS-sel távolítjuk el. A sejteket előzetesen TF9-6B4 és TF8-5G9 antitestekkel inkubáljuk a természetes szövetfaktor-aktivitás [Morrissey és munkatársai idézett műve (1988)] semlegesítésére, majd a koagulációs vizsgálatot az A20 sejteknél ismertetett módon végezzük.
A célsejtvonalhoz kötődve mindhárom konjugátum dózistól függő módon rövidíti az egérplazma CaCl2ben (kontroll) mutatott alvadási idejét (7. ábra), ami
HU 220 347 B arra utal, hogy a tumorsejt felületén történő koaguláció meggyorsul, ha tTF-t irányítunk a sejtfelületre.
VIII. példa
Szövetfaktor prodrug szintézise
A tTF prodrug például a következő szerkezettel jellemezhető :
tTF,_219-(X)ni-(Y)n2-Z-ligandum, ahol tTFl-219 jelentése a citoszólikus és transzmembrán doméntől megfosztott TF,
X jelentése hidrofób transzmembrán doménből származó ni aminosavak, amelyek hossza 1-20 aminosav,
Y jelentése hidrofil proteázfelismerő n2 aminosavszekvencia,
Z jelentése diszulfid-tio-észter vagy más kapcsolócsoport, így (Cys)j _2, ligandum jelentése antitest vagy más, tumorsejtet, tumor endotéliás sejtet, kötőszövetet (vázszövetet) vagy alaplemezke-markert felismerő célba juttató eszköz.
A tTF intravénásán befecskendezhető, és a beteg szövetben (például tumorban) lokalizálódik. A beteg szövetben történő lokalizálódás után az endogén proteázok (például metalloproteináz, trombin, Xa faktor, Vlla faktor, IXa faktor és plazmin) lehasítják a hidrofil proteázfelismerő szekvenciát, és így a hidrofób transzmembránszekvencia a helyi sejtmembránba inszertálódik. A farok membránba történő inszertálódása után a tTF kiváltja a koagulációt, amelynek hatására a beteg szövet érrendszerében vérrög képződik.
IX. példa
Gla-módosítás nélküli koagulációs faktorok szintézise
A Gla- (gamma-karboxi-glutaminsav) módosítás nélküli, K-vitamintól függő koagulációs faktorok (II/IIa faktor, VlI/VIIa faktor, IX/IXa faktor, X/Xa faktor) szintén felhasználhatók koaguligandum előállításához. A Gla-módosítás nélküli koagulációs faktorok gyenge koagulánsok, mivel a módosítatlan faktorok hatástalanul asszociálódnak a lipidmembránokhoz, és ezért a faktort egy ligandummal a tumor vagy más hely érrendszerébe juttatva a faktor visszakerül a sejtfelületre, és az adott helyen kiváltja a koagulációt.
A Gla-módosítás egy poszttranszlációs módosítás a meglévő Glu- (glutaminsav) maradékokon. A Gla-módosítás nélküli, K-vitamintól függő koagulációs faktorok (II/IIa faktor, VlI/VIIa faktor, IX/IXa faktor és X/Xa faktor) előállíthatók olyan gének kifejezésével, amelyek a faktort megfelelő gazdaszervezetben, így baktériumban kódolják, de nem végzik el a glutaminsav gamma-karboxi-glutaminsavvá történő módosítását. A II/IIa faktort, VlI/VIIa faktort, IX/IXa faktort és X/Xa faktort kódoló DNS-szekvenciát a 24 azonosítási számú, 25 azonosítási számú, 26 azonosítási számú és 27 azonosítási számú szekvenciák mutatják. A prokarióta kifejezés ezek alapján könnyen megvalósítható.
A Gla nélküli faktorok előállíthatók a fent említett szekvenciák (24, 25, 26 és 27 számú szekvenciák) mutációjával, amellyel a megfelelő Glu-maradékokat más aminosavra cseréljük a gén kifejezése előtt. A kifejezés ezután gyakorlatilag bármely gazdasejtben megvalósítható. A megváltoztatandó kodon a GAG kodon (a Glu-t a GAA kodon is kódolja és ezt is meg kell változtatni). A VII faktor esetében a Gla „dómén” általában a 216-325 szakaszon belül található. A 25 számú szekvenciában az első Gla kódoló triplett a 231 helyen, az utolsó a 318 helyen jelenik meg. A GAG kodon a szokásos molekulárbiológiai módszerekkel könnyen cserélhető.
A 8. ábra mutatja, hogy a fent említett K-vitaminfüggő koagulációs faktorok mindegyikében analóg szakaszon belül található a Gla dómén. Ezért a 24, 26 és 27 számú szekvenciákban ugyanígy megvalósítható az úgynevezett „megfelelő” Glu-maradékok mutációja.
Egy adott Gla kódoló kodon vagy szekvencia módosítására felhasználható kodonokat a következő táblázat tartalmazza:
Aminosav Kodon
Alanin Alá A GCA GCC GCG GCU
Cisztein Cys C UGC UGU
Aszparaginsav Asp D GAC GAU
Glutaminsav Glu E GAA GAG
Fenil-alanin Phe F UUCUUU
Glicin Gly G GGA GGC GGG GGU
Hiszti din His H CAC CAU
Izoleucin Ile I AUA AUC AUU
Lizin Lys K AAA AAG
Leucin Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionin Met M AUG
Aszparagin Asn N AAC AAU
Prolin Pro P CCA CCC CCG CCU
HU 220 347 Β
Aminosav Kodon
Glutamin Gin Q CAA CAG
Arginin Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU
Szerin Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU
Treonin Thr T ACA ACC ACG ACU
Valin Val V GUA GUC GUG GUU
Triptofán Trp w UGG
Tirozin Tyr Y UAC UAU
Az egyes, Gia-módosítás nélküli, K-vitamin-függő koagulációs faktorok könnyen előállíthatok helyspecifikus mutációval a megfelelő DNS specifikus mutánsával, és egy vagy több nukleotidszekvencia bevitelével.
A helyspecifikus mutáció lehetővé teszi a mutánsok előállítását a kívánt mutációt kódoló DNS-szekvenciáknak megfelelő specifikus oligonukleotidszekvenciák, valamint megfelelő számú szomszédos nukleotid fel- 20 használásával, amelynek során kívánt méretű és a deléciós csatlakozó helyeken stabil duplexet képező primer szekvencia kapható. Általában előnyösen mintegy 17-25 nukleotid hosszúságú primert használunk, ahol a csatlakozás két pontján mintegy 5-10 maradékot vál- 25 toztatunk meg.
A helyspecifikus mutáció ismert eljárás [Adelman és munkatársai idézett műve (1983)]. Ennek során általában egy fágvektort használnak, amely létezik egyszálú és kétszálú formában. A helyspecifikus mutációhoz vektorként előnyösen alkalmazható az Ml3 fág vektor [Messing és munkatársai idézett műve (1981)]. A fágvektorok a kereskedelmi forgalomban kaphatók, és felhasználási módjuk ismert. A helyspecifikus mutációhoz rutinszerűen alkalmazzák a kettősszálú plazmido- 35 kát is, amelyek előnye, hogy nincs szükség a kívánt génnek plazmidból fágba történő átvitelére.
A helyspecifikus mutáció során általában úgy járunk el, hogy először egy egyszálú vektort állítunk elő vagy egy kétszálú vektor két szálát szétválasztjuk, 40 amely szekvenciájában tartalmazza a K-vitamin-fuggő koagulációs faktort kódoló DNS-szekvenciát. Ezután a kívánt mutált szekvenciát hordozó oligonukleotidprimert állítunk elő, amit általában szintetikusan végzünk [például Crea és munkatársai idézett műve (1978)]. 45 A primert az egyszálú vektorral kapcsoljuk, és DNS polimerizáló enzimekkel, így E. coli I polimeráz Klenowffagmensével kezeljük a mutációt hordozó szál szintézisének befejezése érdekében, így egy heteroduplexet kapunk, amelynek egyik szála az eredeti, nem mutált szék- 50 venciát kódolja, és másik szála tartalmazza a kívánt mutációt. Ezzel a heteroduplex vektorral megfelelő sejtet, így E. coli sejtet transzformálunk, és szelektáljuk a mutált szekvenciát hordozó rekombináns vektort tartalmazó kiónokat.
X. példa
További anti-tumorérrendszeri antitestek
Ebben a példában tumorból származó endotéliás sejtekhez „kötődő faktorok” elleni antitestek előállítását mutatjuk be, amelyek felhasználhatók a tumorérrendszer és normálszövetek érrendszere megkülönböztetésé15 re. A példában elsősorban érrendszeri permeabilitásfaktor (VPF) vagy más néven érrendszeri endotéliás sejtnövekedési faktor (VEGF) elleni, és alap fibroblasztnövekedési faktor (bFGF) elleni antitestek előállítását ismertetjük.
A fibroblasztnövekedési faktort Gomez-Pinilla és Cotman idézett műve (1992); az alap fibroblasztnövekedési faktor lokalizálódását Nishikawa és munkatársai idézett műve (1992); az FGF kifejeződését és immunokémiai analízisét Xu és munkatársai idézett műve (1992); a megfelelő monoklonális antitesteket Reilly és munkatársai idézett műve (1989); az FGF detektálását és jellemzését Dixon és munkatársai idézett műve (1989); a heparinkötő növekedési faktor elleni monoklonális antitestet Matsuzaki és munkatársai idézett 30 műve (1989); és a bFGF érrendszerrel ellátott szilárd tumoron található kötődési helyeit Herblin és Gross idézett műve (1992) ismerteti.
A vizsgálatok során nyulakat hiperimmunizálunk humán VEGF, egér VEGF, tengerimalac-VEGF, humán bFGF, egér bFGF vagy tuberkulin (tisztított fehérjeszármazék, PPD) vagy tiroglobulinhordozóval kapcsolt tengerimalac bFGF N-terminális pepiiddel. A peptidek hossza 25-26 aminosav, és C-terminális végükön ciszteint tartalmaznak. A peptideket peptidszintetizátorban állítjuk elő. Az antiszérumot Sepharose hordozón kötött peptiden tisztítjuk affinitáskromatográfiásan.
A VEGF elleni antitesteket ELISA vizsgálattal azonosítjuk, és tengerimalac tumor és normálszövetek fagyasztott metszetein végzett megfestési vizsgálattal ellenőrizzük. A tengerimalac VEGF és humán VEGF elleni poliklonális antitestek a tengerimalac L10 tumor és több humán tumor (fültőmirigy-, petefészek- és emlőkarcinóma) fagyasztott metszetein az érrendszeri endotéliás sejtek fő tömegével reagál. Az antihumán VEGF antitest megfesti a normál humán vese glomerulában található endotéliás sejteket és a májban található endotéliás sejteket körülvevő mezangiális sejteket, de nem festi meg a véredényeket a normál humán gyomorban, 55 lábszárizomban és lépben. Az anti-tengerimalac VEGF antitest nem okoz megfestést a normálszövetek endotéliás sejtjeiben, ahol a vizsgált normálszövet kiterjed a vesére, agyra, lépre, szívre, ondóhólyagra, tüdőre, vastagbélre, csecsemőmirigyre, prosztatára, májra, herére 60 és vázizomzatra.
HU 220 347 B
A humán FGF elleni poliklonális antitest megfesti az endotéliás sejteket a fultőmirigy- és petefészek-karcinómában, de nem okoz megfestést az emlőkarcinómában. Az antihumán FGF antitestek megfestik a glomeruláris endotéliás sejteket a humán vesében, de nem okoznak megfestést a normál gyomor, lábszárizom és lép endotéliás sejtjeiben.
A tengerimalac VEGF, humán VEGF és tengerimalac bFGF elleni monoklonális antitestek előállításához BALB/c egereket PPD-hez vagy tiroglobulinhoz kap- 10 csőit N-terminális peptidszekvenciával (amely C-terminális részén ciszteint tartalmaz) immunizálunk. A szintetikus peptidimmunogének szekvenciáját az alábbiakban adjuk meg, amelyek rendre a 30, 31 és 32 azonosítási számú szekvenciának felelnek meg: 15 tengerimalac VEGF:
APMAEGEQKPREVVKFMDVYKRSYC humán VEGF:
APMAEGGGQNHHEVVKFMDVYQRS YC tengerimalac bFGF:
MAAGSITTLPALPEGGDGGAFAPGC
A peptideket tiroglobulinnal vagy PPD-vel konjugáljuk, amelyhez a tiroglobulint szukcinimidil-4-(N-malein-imido-metil)-ciklohexán-l-karboxiláttal (SMCC) 25 reagáltatjuk, és a kapott származékot a peptiddel reagáltatjuk. így a tiroglobulinhoz tioéterkötésen keresztül egy vagy több peptidszekvenciát tartalmazó konjugátumot kapunk.
A fenti szekvenciák elleni monoklonális antitestek előállítását az alábbiak szerint végezzük: BALB/C egereket több helyen és sorozatban peptid PPD vagy pepiid tiroglobulin injekcióval immunizálunk. Az utolsó in5 jekció után 4 vagy 5 nap elteltével a lépet eltávolítjuk, és a lépsejteket P3xG3Ag8.653 mielómasejtekkel fuzionáljuk polietilénglikol segítségével [Morrow és munkatársai idézett műve (1991)].
Az egyedi hibridóma felülúszókat az alábbi vizsgálatokkal analizáljuk:
Első vizsgálat:
Peptid-tiroglobulinnal bevont lemezekkel végzett ELISA vizsgálat.
Második vizsgálat:
SMCC segítségével tiroglobulinhoz kötött ciszteinen végzett ELISA vizsgálat.
Harmadik vizsgálat:
L10 tengerimalac-tumor vagy humán fultőmirigykarcinóma fagyasztott metszeteinek közvetett immuno20 peroxidáz megfestése.
Negyedik vizsgálat:
Különböző rosszindulatú és normál tengerimalac és humán szövetek fagyasztott metszeteinek közvetett immunoperoxidáz megfestése.
Szelektáljuk azokat az antitesteket, amelyek kötődnek a peptid tiroglobulinhoz, de nem kötődnek a cisztein tiroglobulinhoz, és amelyek erősebben kötődnek a rosszindulatú tumor endotéliás sejtjeihez, mint a normálszövetek endotéliás sejtjeihez (VIII. táblázat).
VIII. táblázat
Monoklonális antitestek reakcióképessége
MoAB Immunogén+ Osztály Reakció a tumorendotéliummal Reakció jellege
tengerimalac humán
GV14 gp VEGF IgM + + BV+néhány tumorsejt
GV35 gp VEGF IgM ± Tumorsejt, BV-n gyenge
GV39 gp VEGF IgM + + BV+néhány tumorsejt
GV59 gp VEGF IgM + + BV+néhány tumorsejt
GV97 gp VEGF IgM + + BV tumorsejten gyenge
HV55 hu VEGF IgG ? + alapmembrán, néhány BV
GF67 gpFGF IgM + + B V+tumorsej tek
GF82 gpFGF IgM + + BV+tumorsej tek
BV=vérerek + gp=tengerimalac hu=humán
A) Humán- és tengerimalac-szövetmetszetek GV97 megfestése
A tengerimalac VEGF N-terminális elleni GV97 antitest endotéliás sejtekhez kötődik különböző hu- 55 mán rosszindulatú szövetekben (IX. táblázat) és normálszövetekben (X. táblázat). A rosszindulatú tumor endotéliás sejtjeihez történő kötődés általában meghaladja a normálszövetek endotéliás sejtjeihez történő kötődést. 60
A tengerimalac-tumor (L10 hepatocelluláris karcinóma) és normálszövetek endotéliás sejtjeinek megfestése az eloszlás és intenzitás szempontjából hasonló a humán szöveteknél megfigyelt megfestéshez (XI. táblázat).
A táblázatokban+pozitív, vagyis negatívval ellentétes eredményt jelöl. A 2+, 3+és 4+ számok növekvő erősségű pozitív jelet jelentenek.
HU 220 347 B
IX. táblázat
AntiGPVEGF vizsgálata humán tumoron
GV59 szupt. Emésztőtraktus + 4+ 4- m I + 4- *4 t + +4 + Tt 4- m + rC 3 4 3 +
GV39 + 4 4- 3-4+ 3-4+ 4- re 1 n 4+ 1-2+ 4+ 4 -ve
GV14
GV97 szupt. 4+ + 3-4+ 3-4+ 4+ 3-4+ 4- főként 1-2+ kevés 3-4+
0,5 pg/nil -ve -ve -ve -ve - ve - 1 + - ve - 0,5 + 4- -ve -ve -ve-l +
1 pg/ml vagy 2 pg/ml -/+ -/+ -ve + ( <υ > + CM 1 3/- -1 + 2-3 + 1-2 + 4· CM 1 -ve -ve- 1 + 1-2+
Tisztított GV97 I + 2+ + r—t 1-4+ 2-4+ 2+ 4- CM + m 1 CM 4- cn -/+ 2+ 4-
10 pg/ml 4- CM +ε 1-2+ 2-4+ 4- ^4 1 4- 4+ 3-4+ 4+ 4- CM 1 Γ*Ί 4+
20 pg/ml 4+ 4- *4
Tumor Szövet 92-01-A073 nyelőcső-karcinóma M4 fültömirigy 87-07-A134 fültőmirigykarcinóma M5 fültömirigy 88-04-A010 fultőmirigyadenokarcinóma 90-11-B319 adenokarcinóma a béltől a májig 94-02-B021C bél-adenokarcinóma 93-10-A333 normálbéladenokarcinóma 93-02-B004 bolyhos és adenomás polip a bélen 93-02-A130 leiomioszakoma a bélben 93-02-B020 gyomorkarcinóma 93 - 04 - A221 hasnyálmirigyadenokarcinóma 94-04-A390 végbéladenokarcinóma 93-12-A160 nyelvkarcinóma/adeno karcinóma 101-84a gyomor gyűrűs karcinóma (101-84b pár) 90-05-A172 gyomoradenokarcinóma
HU 220 347 B
IX. táblázat (folytatás)
GV59 szupt. Nemzőszervek 1-3 + 3-4+ Izmok Immunrendszer Vizeletvezető rendszer 3 + 3-4+ 2-3 + Endokrin rendszer 3-4+ 1- : 4-1- Légzőszervek 3-4+ 4+ + CO Központi idegrendszer 3-4+
GV39 + 1 co + co 3-4+ 4+ + co
GV14
GV97 szupt. 1-4+ + CM 3-4+ 2-3 + + 3-4+ 3-4+ 4+
0,5 pg/ml i + néhány 1-3+ i - ve - 0,5 + +
1 pg/ml vagy 2 pg/ml 1-2+ +/- -1-2+ főként 3-4+ I + 3 + + 1-2+ -ve- 1 + 3-4+
Tisztított GV97 ε 'öb <Cí + CM 1 +/-- Í2-3 + 4+ 1-2+ 3-4+ + co t CM 3-4+ 3-4+ 4+
10 pg/ml + CO 1 ' + + CO + 2-3 + 4+ 3-4+ 4+ 4+ 4+
ε o CM 1-4+ 3-4+ 4+ 3-4+ +
Tumor Szövet 91-10-A115 pikkelysejt-karcinóma a vulván 93-03-A343 prosztata- j adenokarcinóma 93-10-B002 vesesejt-karcinóma 90-01-A225 vesesejt-karcinóma 93-01-A257 hólyagtranzitsejtkarcinóma 94-01-A246 feokromocitoma a mellékvesében 93-11 - A074 mellékvesekéregkarcinóma 93-08-N009 tüdő-adenokarcinóma 92- 10-A316 pikkelysejttüdőkarcinóma 03-05-A065 tüdő-adenokarcinóma 94-01-A299 rosszindulatú áttételes velőshüvely-daganat a nyirokcsomókon
HU 220 347 B
OS > 3
CZ) θ' Q. > 3 fL N ιΛ
Ί
a.
IX. táblázat (folytatás) <
a.
E 'eh
a.
Os >
Ü £
*0Ϊ)
a.
=L ©
O £
a
É-
a
3
V3
os + + + + +
> CC rf + + + CC a
o CM re CC ’St a* a CM re
Os + + + +
> cc cc cc + + + CC
o CM CM CM CM Tj- a CM
a- +
> cc
o CM
zup + fC
97 s + + C + cc 1
> cc + Tj- $O ^4-1 +
ü CM Tj- CC a
E
Üfl
a. 1
O <υ -i. o <υ
©“ > 1 > 1 + > 1 1 1
E
a.
fM
δ + cc
> + + 1
CM
E
ab +
a + *3- 1 O > + o > <u > 1)
CC 1 1
'ml + + +
r*> Ofl cc fC cc
> a. + + 1 + 1 O 1
o •ΖΊ CM •’Φ re r-4 *“*
o
N
ΙΛ
H £
Ό) a. 4+ + I 4+
© + + 1 a- +
re a- re a + ^-4
+
£ ,-1
a. -4+ vés
© + 1 o
CM a· CM
N
Szőve SZtitií irigy
O *o E
u. ólyag w iyenes 1 bél bél bél nyelőcs csípőbe máj ‘C? E hasnyál
ü N ja z 'z. Z Z Z z Z Z
Vi 00 © CM S© © © cc a CM
Ό CM CM Os —H •—4 */“) © a 00
C © CM —M CC V> CM
o 1— < co < < < < < < oa <
-4-J ) 1 1 1 1 1 1 1 1
N CM © © CM re CM
o ε a t/5 kQ E 1-0 4-0 2-0 i cc © 1 © © 1 re 3-0 4-0 0 0 4-0
l·- w Os Os Os Os Os os Os Os Os Os
HU 220 347 B
X. táblázat (folytatás)
GV59 szupt. 2-3 + 2-3 + + CC + CC 3-4+ + cC Nemzőszervek +/- - 2+ főként 3 + + CC CN főként - ve, egy területen 3-4+ 3 + 3-4+ + cN 3-4+
O\ rC > Ü 2-3+ kevés 3 + + CC 3 + + CC 3-4+ + 1-2+ 4- t ! 1 +
GV14
GV97 szupt. -ve 3-4+ + cc 4 + 4+ néhány 1- 2+ főként - ve, egy területen 3-4+
0,5 pg/ml 1-, S -ve -ve -ve ...... i középen -ve, periférián 1 + Ü > 1 -, -ve -ve 0,5 + -ve -ve - 1+ -ve 7+ -ve
1 pg/ml vagy 2 pg/ml 1 + kevés 1 + -ve -ve középen +/-, periférián 2+ -ve -ve + -ve + -ve 1 -ve + cc 1 aj > « -ve +/- -ve
Tisztított GV97 £ *00 3. 1-3 + kevés 1-2 + ' - ve - 2+ 1 + középen 23 +, periférián 3-4+ + 1 + -ve 2+ 0,5 + + in -ve -ve 2-3 + 0,5 + 1 + +/-
10 pg/ml 2-4+ kevés 2+ 1-3 + 2 + középen és periférián 34 + 2-3+ -ve - 1 + + CC főként 1-2+ + in CN főként - ve, egy területen 1 + kevés 1 + 3-4+ 0,5-1 + + +
£ 'eb X o CN + cc 4+ + CN C -aj ?O <4-1 főként 1+, egy területen 2+
Tumor Szövet 90-05-D008N hasnyálmirigy 93-05-A174N fültőmirigy 94-04-A391N vékonybél 88-06-107N gyomor 101 - 84bN gyomor (101 - 84a pár) 90-11-B337N gyomor 1 93-04-A041N mell 94-02-A197N mell, w/fíbroblaszt változás 93-02-A051 mell, w/fibroblaszt változás 93-02-A103 mell, w/fibroblaszt változás Λ >» C -C £ tO t/i 3 Z \o © © < 1 1 CN 91 -03-A207N külső méhnyak 92-02-A139N petefészek w/corp. luteum 93-06-Α11ΒΝ prosztata 93-ll-A317d prosztatadarab 93-02-A315 ondóhólyag I 92-04-A069N here 91-04-Al 17 húgyvezeték w/gyulladás
HU 220 347 B
X. táblázat (folytatás)
GV59 szupt. Izmok 4+ 1-3 + 4+ Immunrendszer 3-4+ | ' 3 + 3-4+ 2-3 + 2-4+ 1 Endokrin rendszer + ΓΟ 3-4+ 4+ + Vizeletvezető rendszer 2-3 + 4+ a csomó- kon 4+ a csomó- kon
GV39 3-4 + 4+ . j + 3-4+ 2-3 + 2-3+, 2-3 + 4+ 2-3+ 4+ a csomó- kon 4+ a csomó- kon
GV14
GV97 szupt. 1-3 + 2-3 + + 4+ 4+ a csomó- kon 4+ a csomó- kon
0,5 pg/ml j > t 1 + i θ' > t főként - ve, kevés 0,5-1 + ω > 1 <υ > I ω > > 1 > <υ o > + ω 1
ε 'Sű a. Γ4 Ss ee > ε *03) a. 1 + O > 1 1-2+ ω > főként - ve, kevés 2+ 1 + +t - -/+ - ve - 3 + 1 1 + 1-2+ > 1 + -ve - 1 + 2+ 1 +
Tisztított GV97 l 5 pg/ml + Γ4 1-2+ I 3-4+ néhány 1 + főként 0,5+,kevés 2+ 2+ 3-4+ + 3-4+ főként ve, kevés 1-2 + + + C4 1 <□ > 1 + £ + Γ*Ί
10 pg/ml 3-4+ 1-3 + 4 + + Γ4 főként 1 +, kevés 4+ + (N + 3-4+ + <*> + főként - ve, kevés 1-2+ + - ve - 3 + 4+ 4+ !
20 pg/ml 1-4+ 2-3 + 4+
Tumor Szövet 94-01-A065N szív 91-07-D007 N vázizom 95-03-A395N vázizom 90-01-A077N nyirokcsomó 90-08-A022N nyirokcsomó 91-03-A057N nyirokcsomó 91-09-B017E egyenes nyirokcsomó 93-07-A236N spicen 93-07-252N spicen 94-04-A252N mellékvese w/velő és kéreg 93-05-A086N mellékvesevelő 92-03-A157 túlfejlődött pajzsmirigy 91-03-B019N pajzsmirigy 93-09-A048N vese 91-11-A075N vese 93-10-B001N vese
HU 220 347 B
X. táblázat (folytatás)
GV59 szupt. Kültakaró rendszer CM + fO j Légzőszervek + m 2-3+
GV39 + CM + 2+
GV14
GV97 szupt.
0,5 pg/ml 1 + 1-2+ > 1 4) > 1
ε *0h 3- CM > ε 'eh + 1 1 + 2-3 + 1 + Ü >
Tisztított GV97 ~0Ű 3. KI +/- - 3 + 3-4+ + o > 1 1-2+ w/vezetés megfestés 2-3 +
ε *0ű 3. © + M· 1 + + - ve - 2+ 2- 3+ w/vezeték megfestés 3- 4+
20 pg/ml
Tumor Szövet 92 -08 A029N mellbőr j 89-02-257 2SS porcos perem 93-05-A203N tüdő 92-12-A263N hörgő
Q c
+-»
1) >
:O
N «J ε
ö bű
C <L>
<υ
J3
I bű c
c«
5F9 szupt. Emésztőrendszer 1-2+ 4+ a nyirokban, a többi eltér néhány 3 +, nyi- rokban 4+
3F9 szupt. 1-2 + 4+ a nyirokban, a többi eltér néhány 3 +, nyi- rokban 4+
9F7 szupt.
1 3. K8 θ' í +
1 pg/ml vagy 2 pg/ml 1 + főként +/-, nyirokban 4+, a többi eltér az fVIII-től
Tisztított GV97 5png/ml 1-2+ + CM főként 12 +, nyirokban 4+, a többi eltér az fVIII-től
10 pg/ml + CM + főként 23+, nyirokban 4+, a többi eltér az fVIII-től
20 pg/ml + Ti- főként 1+, 3 + a szigetsejtekben főként 4+, nyirokban 4+
Szövet '23* s Bél Hasnyálmirigy Vékonybél
HU 220 347 B £
Γ*Ί Cm >» c
-Λ
JS •ü <~ <D s > + ώ τΤ £7
A
J3
ΓΊ ζϊ >> q *<Q J= Ό .
+ :
tJ* !
ε 'Ö)
a.
X. táblázat (folytatás) ε
'eb
a.
&
a.
C
Ό M q
?P '8 «•o >
. Ü + JZ q c o 53 _o ja öű üó o o
-s
S5 «3
P P ε
'eb
1 w
q
+ Ό ^4
q Ό C o>
-i4 4>
to co
<M <L>
> q , o + X TiOf) Js 4) ΓΠ co 'ü >
o ε
eb
a.
<7 q
Λ KÜ
ZZ ** c g 'O 1*5 0) tó CO «μ ü fn u 5T_g ««-a fc- . ω
CO _i tT*
O .ί= q
CO 1) DJ
N X) m fC +
Tf <□ fi +- <u 60 + s τ « Λ ‘2 A + ε 1 g § o .£>
o ε
o
X
O
Kisagy 4+ 2+ főként +/- főként +/- kevés kevés 1+ 1 +
HU 220 347 Β
Β) A GV97 és oldható humán VEGF közötti reakció hiánya
A VEGF-re specifikus antitestek azonosításához VEGF-receptort (Flk-1) vagy receptorhoz kötött (vagy komplexált) VEGF-t vizsgálunk ELISA eljárással.
Egy 96 mérőhelyes ELISA lemezeket (kerek aljú mérőhelyekkel) mérőhelyenként 100 μΐ mennyiségben 10 μg/ml, érzékenységet fokozó pufferben felvett FLK/Seap eleggyel vonunk be (a mérőhelyeken kívüli felület üres marad). A lemezeket egy éjszakán keresztül inkubáljuk, majd 4 °C hőmérsékleten és egy éjszaka alatt kétszer PBS-sel mossuk. A bevont lemezeket mérőhelyenként 250 μΐ PBS+5% CAH oldattal egy órán keresztül 37 °C hőmérsékleten kezelve blokkoljuk. A blokkolóoldatot eltávolítjuk, és a lemezt papírtörülközővel lefedjük.
A blokkolt lemezeket mérőhelyenként 100 μΐ VEGF 165-tel (élesztőben előállított VEGF 165 aa forma, Dr. Ramakrishnan, University of Minnesota, USA) inkubáljuk. A VEGF 165-t 2 pg/ml mennyiségben 0,1 pg/ml heparinnal kiegészített kötőpufferben vesszük fel, és az inkubálást 4 órán keresztül szobahőmérsékleten vagy egy éjszakán keresztül 4 °C hőmérsékleten végezzük. A VEGF oldatot összegyűjtjük, és a lemezeket kétszer 0,10% PBS-Tween-eleggyel mossuk. Ezután mérőhelyenként 100 μΐ hibridómafuzió-felülúszót adunk a lemezhez, és 1 órán keresztül 32 °C hőmérsékleten inkubáljuk. A felülúszós inkubálás után a lemezeket háromszor PBS-Tween-oldattal mossuk, majd mérőhelyenként 100 μΐ szekunder antitesttel (KPL, Gt antiegér IgG 1:1000 arányban PBS-Tween+5% CAH elegyben felvéve) 1 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk.
A második antitesttel végzett inkubálás után a lemezeket négyszer PBS-Tween-oldattal mossuk, mérőhelyenként 100 μΐ szubsztrátummal (Sigma OPD szubsztrátum, citrátpuffer és hidrogén-peroxid elegyében oldva) 20 percen keresztül inkubáljuk, és 490 nm hullámhosszon Cambridge Technology Microplate Reader (Modell 7520) készülékkel leolvassuk. A megfelelő kontrollmérőhelyek feletti abszorpcióval rendelkező mérőhelyeket pozitív mintaként kiválogatjuk, és tovább vizsgáljuk.
Azt találtuk, hogy a GV97 nem kötődik a rekombináns VEGF-fel bevont ELISA lemezekhez, és a rekombináns humán VEGF sem kötődik GV97-tel bevont ELISA lemezekhez. Az oldható rekombináns humán VEGF nem blokkolja 5 μ g/ml GV97 tumor endotéliumhoz történő kötődését a hisztológiai szakaszban, még 50 μg/ml mennyiségben adagolva sem.
Ezek az adatok arra utalnak, hogy a GV97 olyan VEGF epitópot ismer fel, amely rejtve van a rekombináns humán VEGF-ben, de hozzáférhetővé válik, ha a VEGF az endotéliás sejteken található receptorához kötődik.
C) GV97 lokalizálódása L-10 tumort hordozó tengerimalacokban
A hisztológiás szakaszban kapott megfestést adatokkal ellentétben a GV97 antitest szelektíven lokalizálódik a tumor endotéliás sejteknél, ha L-10 tumort hordozó tengerimalacoknak fecskendezzük be (XII. táblázat). A tumorban található endotéliás sejtek megfestése közepes erősségű, míg az egyéb szervekben található normálendotélium megfestése nem mutatható ki.
D) Anti-bFGF szelektív kötődése tumor endotéliás sejtekhez
A tengerimalac bFGF N-terminális része ellen kifejlesztett GV97 és GF82 antitestek erősen kötődnek az endotéliás sejtekhez L-10 tengerimalac-tumor fagyasztott metszeteiben, valamint két humán rosszindulatú tumor endotéliás sejtjeihez (XIII. táblázat). Ezzel ellentétben, viszonylag gyenge megfestés észlelhető különböző normáltengerimalac-szövetek endotéliás sejtjeiben.
XII. táblázat
Tumort hordozó tengerimalacok kezelése GV97 antitesttel
Szövet GV97 (10 pg/ml) GV97 (20 pg/ml)
Emésztőrendszer
Máj 2+ -ve
Bél 3 + esetleg kevés 0,5-1 +
Hasnyálmirigy főként +/-, 2+ a szigetsejtekben esetleg kevés 0,5-1 +
Vékonybél főként 2-3+, nyirokban 4+, többi eltér fVIII-től +/-
Gyomor főként 1-2 + , esetenként 3 + esetleg kevés, 0,5 +
Nemzőszervek
Here +/-
Izmok és kültakaró rendszer
Szív -ve -ve
Izom -ve
Bőr zsíros rétegben 1+, sejtes rétegben 3-4+
Immunrendszer
Lép 3 + esetleg kevés 1 +
Pajzsmirigy
Vizeletelvezető rendszer
Vese csomókban 3- 4+
Endokrin rendszer
Mellékvese 4+ -ve
Légzőszervek
Tüdő 2+ -ve
Idegrendszer
Kisagy 2+ -ve
Tumor
Tumor 4+ 2-3 +
HU 220 347 Β
XIII. táblázat
Tengerimalac-szövetek kezelése anti-GP FGF antitesttel
Szövet GF67 GF82
Emésztőrendszer
Máj ND ND
Bél +/- +/-
Hasnyálmirigy 2-3 + 2+
Vékonybél +/- +/-
Gyomor ND ND
Nemzőszervek
Here ND ND
Izmok és kültakaró rendszer
Szív 2-3 + 1 +
Izom +/- 1 +
Bőr ND ND
Immunrendszer
Lép 3 + -ve
Pajzsmirigy
Vizeletelvezető rendszer
Vese 1-2+ -ve
Endokrin rendszer
Mellékvese 1-2+ +/-
Légzőszervek
Tüdő 1-2+ 2-3 +
Idegrendszer
Kisagy 1 + -1 +
Tumor
L1 tumor 4+ 4+
Humán tumorok
Feokromocitoma 4+ 4+
V előshüvely-daganat 4+ 4+
ND=nincs adat
XI. példa
Humán beteg kezelése
Ebben a példában humán beteg kezelési eljárását ismertetjük találmány szerinti bispecifikus kötő- és koaguláló ligandum alkalmazásával. Ezek a ligandumok alkalmasak különböző humán rákos betegségek és más rendellenességek, így jóindulatú prosztatahiperplázia és reumás ízületi gyulladás klinikai kezelésére, amely betegségeknél előnyös a vérkeringés hosszabb vagy rövidebb ideig tartó gátlása.
A bispecifikus ligandumok különösen hasznos eszköznek bizonyulnak a tumor elleni terápiában. A megfelelő dózisok és kezelési előírások könnyen meghatározhatók a bemutatott adatokból, így állatkísérletekből, és az ismert limfóma kezelése [Glennie és munkatársai idézett műve (1988)], T-sejt-célbajuttatás [Nolan és
Kennedy idézett műve (1990)] és hatóanyag-célbajuttatás [Paulus idézett műve (1985)] alapján.
A széles körű felhasználás előtt természetesen további állatkísérleteket és klinikai vizsgálatokat kell végezni. A klinikai vizsgálatok egyes részeit, például a beteg kezelését és megfigyelését a jelen leírásban foglaltak figyelembevételével a szokásos módon végezzük. Az ilyen vizsgálatok általános útmutatójaként szolgáló legfontosabb információkat az alábbiakban foglaljuk össze:
A vizsgálatokhoz előnyösen olyan beteget választunk, akinél legalább egy szokásos terápia hatástalan maradt, és aki objektíven mérhető, így fizikai vizsgálatokkal, laboratóriumi eljárásokkal vagy radiográfiás vizsgálatokkal mérhető betegségben szenved. Egér monoklonális antitest alkalmazása esetén ügyelni kell arra, hogy a beteg ne legyen allergiás az egérimmunoglobulinra. A kemoterápiás kezelést a vizsgálatok megkezdése előtt legalább két héttel be kell fejezni.
A bispecifikus ligandum adagolása előnyösen megvalósítható egy állandó központivéna-katéteren keresztül, amely három adagolónyílással rendelkezik. A bispecifikus ligandumot szűrjük, például 0,22 pm-es szűrőn, és megfelelően hígítjuk, például sóoldattal, és előnyösen 100 ml végső térfogatra. Felhasználás előtt a mintát hasonló módon szűrjük, és koncentrációját az Azgo-érték meghatározásával szűrés előtt és után is ellenőrizzük. A várható felépülés 87-99%, amelynek során a fehérjeveszteség is figyelembe vehető.
A bispecifikus ligandumot mintegy 4-24 órán keresztül adagoljuk, és minden betegnek 2-4 infúziót adunk 2-7 napos intervallumokban. Az adagolás megvalósítható állandó ütemű infúzióval is 7 napos perióduson keresztül. Az adagolt infúzió dózisszintjét a megfigyelt toxicitás alapján állítjuk be. Ha valamely infúzió adagolása után vagy az állandó ütemű infúzió adott periódusa után II fokozatú toxicitás figyelhető meg, akkor a további dózisokat visszatartjuk, vagy az állandó ütemű infúziót szüneteltetjük a toxicitás megszűnéséig. Betegek vizsgált csoportjánál a bispecifikus koaguláló ligandum dózisát addig növeljük, míg a betegek mintegy 60%-ánál III vagy IV fokozatú toxicitás jelentkezik. Biztonságos dózisnak az így kapott dózis 2/3 értékét tekinthetjük.
A kezelés előtt és a kezelés során legfeljebb 1 hónapos intervallumokban fizikai vizsgálatokat, tumormérést és laboratóriumi teszteket végzünk. A laboratóriumi teszt során a következőket mérjük: teljes vérkép, szérum kreatinin, kreatin-kináz, elektrolit, karbamid, nitrogén, SGOT, bilirubin, albumin és össz-szérumfehéije. A szérummintákat a kezelés után 60 napon keresztül vesszük, és radioimmuno-assay vizsgálattal ellenőrizzük az ép bispecifikus ligandum vagy annak komponensei vagy a ligandum bármely része elleni antitestek jelenlétét. Az alkalmazott terápiás szer farmakokinetikáját és kiürülését immunológiai analízissel, így ELISA vagy RIA vizsgálattal ellenőrizzük a szérumban.
A tumor elleni hatás ellenőrzéséhez a beteget az utolsó infúziótól számított 48 óra, 1 hét és 30 nap elteltével megvizsgáljuk. Tapintható betegség esetében a két függőleges átmérőt a kezelés során naponta, majd a
HU 220 347 Β kezelés befejezése után 1 hét és 30 nap elteltével mérjük. Nem tapintható betegség esetében sorozatos CTvizsgálatot végzünk 1 cm-es intervallumokban a mellkason, alhason és medencén 48 óra, 1 hét és 30 nap elteltével. Ezenkívül szövetmintákat vizsgálunk hisztológiai és/vagy áramló citometriás eljárással, ahol a szövetminta lehet a beteg helyről kivett biopszia, vérminta vagy más folyadékminta.
A klinikai hatást megfelelő mérésekkel ellenőrizzük. így például, teljes hatásnak minősül, ha a kezelést követően egy hónap elteltével az összes mérhető tumor eltűnik. Részleges hatásnak minősül, ha a kezelést követően egy hónapon belül az összes mérhető tumor átmérője legalább 50%-kal csökken, és egyetlen tumor sem mutat növekedést. Hasonlóképpen, részleges hatásnak minősül, ha a kezelést követő egy hónapon belül az összes mérhető sérülés átmérői legalább 50%-kal csökkennek, és növekedés vagy egy, vagy több helyen tapasztalható.
A leírásban kimutatott kitanítás lehetővé teszi az ismertetett készítmények és módszerek túlzott kísérletezés nélküli megvalósítását. A találmány szerinti készítménynél és eljárásnál bemutattuk az előnyös megvalósítási módokat, szakember számára azonban nyilvánvaló, hogy a készítmények, eljárások, eljárási lépések és azok sorozata változtatható anélkül, hogy eltérnénk a találmány lényegétől, így például, az ismertetett anyagok azonos vagy hasonló hatást biztosító kémiailag és fiziológiailag rokon anyagokkal helyettesíthetők. Az ilyen helyettesítések és módosítások szakember számára nyilvánvalóak, és az oltalmi körhöz tartoznak.
Irodalmi hivatkozások;
A leírás során idézett irodalmi helyeket a következő listában adjuk meg: Abbassi és munkatársai: J. Clin. Invest. 92(f>), 2719-2730 (1993);
Abraham és munkatársai: Science, 233, 545-548 (1986);
Abrams és Oldham: Monoclonal Antibody Therapy of
Humán Cancer, Foon és Morgan kiadó, Martinus
Nijhoff Publishing, Boston, 103-120. oldalak (1985);
Adams és munkatársai: Cancer Rés., 43, 6297 (1983); Adelman és munkatársai: DNA 2, 183 (1983);
Alvarez és munkatársai: Modern Pathology, 5(3),
303-307, (1992);
Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory (1988);
Arklie és munkatársai: Int. J. Cancer, 28, 23 (1981); Ashall és munkatársai: Láncét, 2(8288), 7-10 (1982); Atkinson és munkatársai: Cancer Rés., 62, 6820 (1982);
Ausubel és munkatársai: Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N. Y., (1989);
Bach és munkatársai: Biochemistry, 25, 4007-4020 (1986);
Bauer és munkatársai: Vox Sang, 61, 156-157(1991); Baxter és munkatársai: Micro. Rés. 47(1), 5-23 (1991); Bevilacqua és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
84, 9238-9242 (1987);
Bhagwa és munkatársai: Natúré, 316, 511-513 (1985); Bhattacharya és munkatársai: Hybridoma, 4, 153 (1985);
Bhattacharya és munkatársai: Cancer Rés., 44, 4528 (1984);
Bicknell és Harris: Seminars in Cancer Biology, 3, 399-407, (1992);
Bikvalfi és munkatársai: Exp. Cell Rés., 181, 75-84 (1989);
Birembaut és munkatársai: J. Pathology, 145, 283-296 (1985);
Bittner és munkatársai: Methods in Enzymol., 153, 516-544 (1987);
Bjorndahl és munkatársai: Eur. J. Immunoi. 19, 881-887 (1989);
Blakey és munkatársai: Biochem. Biophys. ACTA 923Y(1), 59-65, (1987b);
Blakey és munkatársai: Cancer Rés., 47, 947-952 (1987a);
Bolhuis és munkatársai: J. Immunoi., 149, 1840-1846 (1992);
Borden és munkatársai: Cancer, 65, 800-814 (1990); Brennan és munkatársai: Science, 229, 81-83 (1985); Brinkmann és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci.,
33(19), 8618-8620(1991);
Brooks és munkatársai: Cell, 79, 1157-1164 (1994); Brooks és munkatársai: Science, 264, 569-571 (1994); Brown és munkatársai: J. Exp. Med., 176, 1375-1379 (1992);
Brown és munkatársai: PNAS, 78, 539 (1981a);
Brown és munkatársai: J. Immunoi., 127, 539 (1981b); Brown és munkatársai: Cancer Rés., 53, 4727-4735 (1993);
Broze: Seminars in Hematol., 29, 159-169 (1992); Bruland és munkatársai: Cancer Research, 48,
5302-5309 (1988);
Bruland és munkatársai: Int. J. Cancer, 33(1), 27-31 (1986);
Bühring és munkatársai: Leukémia, 5, 841-847 (1991); Burchell és munkatársai: J. Immunoi., 131(1),
508-513 (1983);
Burrows és Thorpe: PNAS, 90, 8996-9000 (1993); Burrows és munkatársai: Cancer Rés., 52, 5954-5962 (1992);
Burrows és munkatársai: Cancer Rés., 51, 4768-4775 (1991);
Burrows és munkatársai: Clin. Cancer Rés., (1995) (nyomdában);
Burtin és munkatársai: Cancer, 31, 719-726 (1983); Byers és Baldwin: Immunoi., 65, 329-335 (1988); Byers és munkatársai: Cancer Rés., 49, 6153-6160 (1989);
Byers és munkatársai: 2nd Int. Conf. Mab Immunocon., Cancer, 41, (1987);
Campbell: Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, 13. kötet, Burden és Von Knippenberg kiadó, Elseview, Amsterdam, 75-83. oldal (1984);
Carnemolla és munkatársai: J. Cell Bioi., 108, 1139-1148(1989);
HU 220 347 Β
Camemolla és munkatársai: J. Bioi. Chem., 267(34), 24689-24692 (1992);
Carrel és munkatársai: Hybridoma, 1, 387 (1982); Cavenagh és munkatársai: Br. J. Haematol., 85(2),
285-291 (1993);
Chapman és munkatársai: Arthritis Rheum., 37(12), 1752-1756(1994);
Chee és munkatársai: Cancer Rés., 43, 3142 (1982); Chen és munkatársai: J. ImmunoL, 145, 8-12 (1990); Cherwinski és munkatársai: J. Exp. Med., 166,
1229-1244(1989);
Cheung és munkatársai: Proc. AACR, 27, 318 (1986); Clark és munkatársai: Biochim. Biophys. ACTA, 867,
244-251 (1986);
Clark és munkatársai: Cancer Rés., 51, 944-948 (1991);
Clark és munkatársai: Int. J. Cancer, 2, 15-17 (1988); Clauss és munkatársai: J. Exp. Med., 172,
1535-1545 (1990);
Cohn és munkatársai: Arch. Surg., 122, 1425 (1987); Colberre-Garapin és munkatársai: J. Mól. Bioi., 150, (1981);
Colcher és munkatársai: Cancer Invest, 1,127 (1983); Colcher és munkatársai: Cancer Rés., 47, 1185 és 4218 (1987);
Colcher és munkatársai: PNAS, 78, 3199(1981); Collins és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
81, 4917-4921 (1984);
Conn és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 2628-2632 (1990);
Connolly és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264(33), 20017-20024,(1989);
Corgon-Cardo és munkatársai: Laboratory Investigation, 63(6), 832-840 (1990);
Corvalen: Cancer Immuno. 24, 133 (1987);
Cotran és munkatársai: J. Exp. Med. 164, 661-666 (1986);
Crea és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 5765, (1987);
Croghan és munkatársai: Cancer Rés., 43, 4980 (1983); Croghan és munkatársai: Cancer Rés., 44, 1954 (1984); Daar és munkatársai: Transplantation, 38(3),
293-298 (1984);
Davies és Wlodawer: FASEB J„ 9, 50-56(1995); Davis és Prés tón: Analytical Biochemistry, 116(2),
402-407 (1981);
de Krester és munkatársai: Int. J. Cancer, 37, 705 (1986);
De Vries és munkatársai: Science, 255, 989-991 (1992);
DeFranco: Natúré, 352, 754-755 (1991);
deLaij és munkatársai: Bispecific Antibodies and
Targeted Cellular Cytotoxicity, Romet-Lemonne és munkatársai, 249, (1991);
Denekamp és munkatársai: Brit. J. Cancer, 461, 711-720(1982);
Denekamp: Cancer Méta. Rév., 9, 267-282 (1990); Denekamp: Prog. Appl. Microcirc. 4, 28-38 (1984); Detmar és munkatársai: J. Exp. Med., 180, 1141-1146 (1994);
Dewerchin és munkatársai: Blood, 78(4), 1005-1018 (1991);
De Scipio és munkatársai: Biochemistry, 16, 5253-5260 (1977);
Dillman és munkatársai: Antibody, Immunocon. Radiopharm., 1, 65-77 (1988);
Dippold és munkatársai: PNAS, 77, 6115 (1980); Dixon és munkatársai: Mól. & Cell Bioi, 7, 4896-4902 (1989);
Duiivestiin és munkatársai: J. Immunoi, 138, 713-719 (1987);
Dunham és Stewart: J. Natl. Cancer Inst., 13, 1299-1377 (1953);
Dustin és munkatársai: J. Immunoi. 137, 245-254 (1986);
Dvorak és munkatársai: J. Exp. Med., 174, 1275-1278 (1991);
Dvorak és munkatársai: Cancer Cells, 3(3), 77-85 (1991);
Edelman és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1513-1517(1993);
Edginton és munkatársai: Thrombosis and Haemostasis, 66(1), 67-79 (1991);
Ellis és munkatársai: Histopathol., 8, 501, (1984); Embleton és munkatársai: Br. J. Cancer, 63(5),
670-674 (1991);
Epenetos és munkatársai: Cancer Rés., 46, 3183 -3191 (1986);
Epenetos és munkatársai: Láncét, Nov. 6,2, 1000-1004 (1982);
Fair és munkatársai: J. Bioi. Chem., 262, 11692-11698 (1987);
Farrans és munkatársai: Láncét, 2, 397 (1982); Febbraio és Silverstein: J. Bioi. Chem., 265(30),
18531-18537(1990);
Ferrara és munkatársai: J. Cell. Biochem., 47, 211-218 (1991);
Ferrara és munkatársai: Endocrine Reviews, 13(1), 18-32(1992);
Fisher és munkatársai: Thrombosis Research, 48, 89-99(1987);
Flavell és munkatársai: Br. J. Cancer, 65, 545-551 (1992);
Flavell és munkatársai: Br. J. Cancer, 64(2), 274-280 (1991);
Folkman: Adv. Cancer Rés., 43, 175-230 (1985a); Folkman és munkatársai: Ann. Surg. 214(4), 414-427 (1991);
Folkman: Important Advances in Oncology, I. rész, DeVita és munkatársai kiadó, JB Lippincott, Philadelphia, 42-62. oldal (1985b);
Foster és munkatársai: Virchows Arch. (Pathol. Anat. Histophatol), 394, 295 (1982);
Foster és munkatársai: Humán Pathol., 15, 502 (1984); Fox és munkatársai: J. Bioi. Resp., 9, 499-511 (1990); Frelinger III és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(26),
106-17 111 (1991);
Frelinger III és munkatársai: J. Bioi. Chem., 265(11), 6346-6352(1990);
HU 220 347 Β
French és munkatársai: Cancer Rés., 51, 2358-2361 (1991);
Gailani és Broze Jr.: Science, 253, 909-912 (1991); Galfre és munkatársai: Methods Enzymol., 73, 1-46 (1981);
Gallagher és munkatársai: J. Surg. Rés., 40, 159(1986); Galland és munkatársai: Oncogene., 8, 1233-1240 (1993);
Gangopadhyay és munkatársai: Cancer Rés., 45, 1744 (1985);
Gefter és munkatársai: Somatic Cell Génét., 3, 231-236 (1977);
Geppert és munkatársai: Immunological Reviews, 117, 5-66(1990);
Ghetie és munkatársai: Cancer Rés., 51, 5876-5880 (1991);
Ghose: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 3, 262-359 (1982);
Ghose és Blair: CRC Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 3, 262-359 (1987);
Gibbons: J. D. Gibbons kiadó: Nonparametric Methods fór Quantitative Analysis, 160. oldal, New York, Holt, Rinehart és Winston, (1976);
Gitoy-Goren és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Comm., 190, 702, (1993);
Glassyés munkatársai: PNAS, 80, 63227 (1983); Glennie és munkatársai: J. Immunoi. 747(10),
3662-3670 (1988);
Glennie és munkatársai: J. Immunoi., 139, 2367-2375 (1987);
Goding: Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 2. kiadás, Academic Press, Orlando, FL, USA, 60-61, 65-66 és 71-74. oldal, (1986);
Gomez-Pinilla és Cotman: Neuroscience 49, 771-780 (1992);
Gosset és munkatársai: Int. Arch. Allergy Immunoi., 106(1), 69-77 (1995);
Gougos és munkatársai: Int. Immunoi., 4, 83-92 (1992);
Gougos és Letarte: J. Immunoi. 141, 1925-1933 (1988); Griffin és munkatársai: Treat. Rés., 37, 433-455 (1988b);
Griffin és munkatársai: Proc. 2nd Conf. on Radioimmunodetection and Therapy of Cancer, 82, (1988a);
Groenewegen és munkatársai: Natúré, 316, 361-363 (1985);
Groves és munkatársai: Br. J. Pharmacol., 124(2), 117-123(1991);
Gusterson és munkatársai: Br. J. Cancer, 58, 453 (1988);
Hagemeier és munkatársai: Int. J. Cancer, 38, 481-488 (1986);
Hakkert és munkatársai: Blood, 78(10), 2721-2726 (1991);
Hammerling: Transplant. Rév., 30, 64-82 (1976); Hattey és munkatársai: Thrombosis Research, 45(5),
485-495 (1987);
Hayes és munkatársai: J. Clin. Invest., 75, 1671 (1985); Hayward és munkatársai: Biological Chemistry,
266(11), 7114-7120 (1991);
Hendler és munkatársai: Trans. Assoc. Am. Physicians, 94,211 (1981);
Herblin és Gross: Angiogenesis: Key Principles Science - Technology - Medicine, 214-218 (1992);
Hess és munkatársai: Transplantation, 6, 1232-1240 (1991);
Heynen és munkatársai: J. Clin. Invest., 94, 1098-1112 (1994);
Horan Hand és munkatársai: Cancer Rés., 45, 2713 (1985);
Howard és munkatársai: Developmental Biology, 146, 325-338 (1991);
Huang és munkatársai: Anticancer Research, 13, 887-890 (1993);
Imái és munkatársai: JNCI, 68, 761 (1982);
Imám és munkatársai: J. Immunobioi., (1984);
Inouye és munkatársai: Nucleic Acids Rés., 13,
3101-3109(1985);
Jain: Cancer Méta. Rév., 9(3), 253-266 (1990); Jakeman és munkatársai: J. Clin. Invest., 89,
244-253 (1992);
Johnson és Reithmuller: Hybridoma, 1, 381 (1982); Johnson és munkatársai: Am. J. Repród. Immunoi., 1,
246 (1981);
June és munkatársai: Molecular Cell Biology, 12, 4472-4481 (1987);
June és munkatársai: Immunology Today, 77(6), 211-216(1990);
Jutila és munkatársai: J. Exp. Med., 175(6), 1565-1573 (1992);
Juweid és munkatársai: Cancer Rés., 52, 5144-5153 (1992);
Kabawat és munkatársai: Int. J. Gynecol. Pathol., 4, 245 (1985);
Kabawat és munkatársai: Int. J. Gynecol. Pathol., 4, 265 (1983);
Kandel és munkatársai: Cell, 66, 1095-1104 (1991); Kantor és munkatársai: Hybridoma, 1, 473 (1982); Karasek: J. Invest. Derm., 93((2), 335-385 (1989); Keelan és munkatársai: Am. J. Physiol., 266(1 Pt 2), pH278-290 (1994a. január);
Keelan és munkatársai: J. Nucl. Med., 35(2), 276-281 (1994b. február);
Kennel és munkatársai: Cancer Rés., 51, 1529-1536 (1991);
Kim és munkatársai: Growth Factors, 7, 53-64 (1992); Kim és munkatársai: Natúré, 362, 841-844 (1993); Kimura és munkatársai: Immunogenetics, 11,
373-381 (1983);
Kinsel és munkatársai: Cancer Rés., 49, 1052 (1989); Kishimoto és munkatársai: Blood, 78(3), 805 - 811 (1991);
Kisiel: J. Bioi. Chem., 254(23), 12230-12234 (1979); Kjeldsen és munkatársai: 2ndInt. Wkshop of MAbs &
Breast Cancer, San Francisco, USA, (1986. november);
Klagsbrun és Folkman: Angiogenesis Handbook of Experimental Pharmacology, 95. kötet, Spom és Roberts, Springer Verlag, Berlin, 549-586. oldalak (1990);
HU 220 347 Β
Kohler és Milstein: Natúré, 256, 495-497 (1975); Kohler és Milstein: Eur. J. Immunoi., 6, 511-519 (1976);
Kondo és munkatársai: Biochem. and Biophys. Rés. Comm. 194(3), 1234-1241 (1993);
Krishnaswamy és munkatársai: J. Bioi. Chem., 267(36), 26 110-26 120 (1992);
Krishnaswamy és munkatársai: J. Bioi. Chem., 267(33), 23 696-23 706 (1992),
Kufe és munkatársai: Hybridoma, 3, 223 (1984);
Lan és munkatársai: Cancer Rés., 44, 1953 (1984); Lan és munkatársai: Cancer Rés., 45, 305 (1985);
Lee és munkatársai: Methods in Enzymology, 237,
146-164(1994);
Leith és munkatársai: British J. Cancer, 66(2), 345-348 (1992);
Lemkin és munkatársai: Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 3, 47 (1984);
Leung és munkatársai: Science, 246, 1306-1309 (1989);
Leydem és munkatársai: Cancer, 57, 1135 (1986); LoBuglio és munkatársai: JNCI, 80, 932 (1988);
Logan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81,
3655-3659 (1984);
Loop és munkatársai: Int. J. Cancer, 27, 775 (1981); Lord és munkatársai: Genetically Engineered Toxins,
Frank (kiadó), M. Dekker Publ., 183. oldal (1992);
Lowder és munkatársai: Blood, 69, 199-210 (1987); Lowe és munkatársai: Immunoi. Lett., 12, 263-269 (1986);
Lowy és munkatársai: Cell, 22, 817 (1980);
Maeda és munkatársai: J. Invest Derm., 97, 183-189 (1991);
Manabe és munkatársai: J. Láb. Clin. Med., 104(3), 445-454 (1984);
Mandeville és munkatársai: Cancer Detect. Prev. 10, 89, (1987);
Mann: TIBS, 12, 229-233 (1987);
Mason és Williams: Biochem. J, 187, 1-20 (1980); Massoglia és munkatársai: J. Cell. Phys., 132, 531-537 (1987);
Masuko és munkatársai: Cancer Rés., 44, 2813 (1984); Mattes és munkatársai: PNAS, 81, 568 (1984); Mazzocchi és munkatársai: Cancer Immunoi. Immunother., 32, 13-21 (1990);
McDicken és munkatársai: Br. J. Cancer, 52, 59 (1985); Menard és munkatársai: Cancer Rés., 63, 1295 (1983); Messing és munkatársai: Third Cleveland Symposium on Macromoleculesand Recombinant DNA, A. Walton kiadó, Elsevier, Amsterdam (1981);
Metzelaar és munkatársai: Blood, 79(2), 372-379 (1992);
Metzelaar és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(5), 3239-3245 (1991);
Mignatti és munkatársai: J. Cell. Bioi., 113, 1193-1201 (1991);
Millauer és munkatársai: Cell, 72, 835-846 (1993); Miotti és munkatársai: Cancer Rés., 65, 826 (1985); Miatti és munkatársai: Int. J. Cancer, 39, 297 (1987);
Montefort és munkatársai: Eur. Respir. J., 5(7), 815-823 (1992);
Moroi és Aoki: J. Bioi. Chem., 251(19), 5956-5965 (1976);
Morrissey és munkatársai: Blood, 81, 734-744 (1993);
Morrissey és munkatársai: Cell, 50, 129-135 (1987); Morrissey és munkatársai: Thrombosis Rés., 52,
247-261 (1988);
Moughal és munkatársai: J. Periodontal Rés., 27(6), 623-630 (1992);
Mulligan és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 2072 (1981);
Mulligan és munkatársai: J. Clin. Invest., 88, 1396-1406(1991);
Munz és munkatársai: J. Nucl. Med., 27, 1739 (1986); Murray és munkatársai: Rádió. One. 16, 221-234 (1989);
Nabel és munkatársai: Natúré, 362, 844-846 (1993); Nakamura: Prog. Growth FactorRes., 3, 67-86 (1991); Nelson: (1991);
Nemerson: Blood, 71(1), 1-8 (1988);
Neumann és munkatársai: Arch. Dermatol., 130(7), 879-883 (1994);
Nieuwenhuis és munkatársai: Blood, 70(3), 838-845 (1987);
Nishikawa és munkatársai: Advances in Experimental Medicine and Biology, 324, 131-139(1992);
Nitta és munkatársai: Láncét, 335, 368-371 (1990); Nolan és Kennedy: Biochemica et Biophysica Acta,
1040, 1-11 (1990);
Norton és munkatársai: Biochem.-Biophys. Rés. Commun., 195(1), 250-258 (1993);
O’Connell és munkatársai: Clin. Exp. Immunoi., 90, 154-159(1992);
O’Connell és munkatársai: J. Immunoi., 144(2), 521-525 (1990);
O’Hare és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527(1981);
Ogawa és munkatársai: British J. Haematology, 75, 517-524(1990);
Ohuchida és munkatársai: J. Am. Chem. Soc. 103(15), 4597-4599 (1981);
Oi és Morrison: Met. Sinai J. Med., 53(3), 175-180 (1986);
Olander és munkatársai: Biochem. and Biophys. Rés. Comm., 175(1), 68-76 (1991);
Olofsson és munkatársai: Blood, 84(8), 2749-2758 (1994);
Osborn és munkatársai: Cell, 59, 1203-1211 (1989); Osterűd és munkatársai: Thrombosis Rés., 42,
323-329 (1986);
Paborsky és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(32), 21 911-21 916(1991);
Palleroni és munkatársai: Int. J. Cancer., 49, 296-302 (1991);
Patt és munkatársai: Cancer Bull., 40, 218 (1988); Paul és munkatársai: Hybridoma, 5, 171 (1986); Paulus: BehriniInst. Miit., 78, 118-132 (1985);
HU 220 347 Β
Perez és munkatársai: J. Exp. Med., 163, 166-178 (1986);
Perez és munkatársai: J. Immunoi., 137, 2069-2072 (1986);
Perez és munkatársai: Natúré, 316, 354-356 (1985); Perkins és munkatársai: Eur. J. Nucl. Med., 10, 296 (1985);
Pietersz és munkatársai: Antibody, Immunoconj. Radiopharm., 1, 79-103 (1988);
Pimm és munkatársai: J. Cancer Rés., Clin. Oncol., 118, 367-370 (1992);
Plate és munkatársai: Cancer Rés., 53, 5822-5827 (1993);
Plate és munkatársai: Natúré, 359, 845-848 (1992); Pober és munkatársai: J. Exp. Med., 157, 1339-1353 (1991);
Poels és munkatársai: J. Natl. Cancer Rés., 44, 4528 (1984);
Poels és munkatársai: J. Natl. Cancer, 76, 781 (1986); Pukrittayakamee és munkatársai: Mól. Bioi. Med., 1,
123-135 (1983);
Qian és munkatársai: Cancer Rés., 140, 3250 (1991); Rao és Rapaport: Biochemistry, 85, 6687-6691 (1988); Rasmussen és munkatársai: Breast Cancer Rés. Treat.,
2, 401 (1982);
Rehemtulla és munkatársai: Thrombosis and Haemostasis, 65(5), 521-527 (1991);
Reilly és munkatársai: Biochem. Biophys. Rés. Commun., 164, 736-743 (1989);
Reisfeld és munkatársai: Melanoma Antigens and Antibodies, 317. oldal, (1982);
Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16. kiadás, Mack Publishing Company (1980);
Rétiig és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10 832-10 836(1992);
Ríva és munkatársai: Int. J. Cancer, 2, 114 (1988); Rivoltini és munkatársai: 3rd Int. Conf. Bispecific Antibodies and Targeted Cellular Cytotoxicity (1992); Rowinsky: Clinical Investigation, Abstracts írom Chemotherapy Foundation Symposium X. Innovative
Cancer Chemotherapy fór Tomorrow, 6—9. oldal (1992);
Ruco és munkatársai: Am. J. PathoL, 137(5), 1163-1171 (1990);
Ruf és Edgington: Thrombosis and Haemostasis, 66(5), 529-533 (1991);
Ruf és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(24), 15 719-15 725 (1991);
Ruf és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(4), 2158-2166 (1991);
Ruf és munkatársai: JBC, 266, 2158-2166 (1991); Ruf és Edgington: FASEB J., 8, 385-390 (1994); Ruther és munkatársai: EMBOJ., 2, 1791 (1983); Safran és munkatársai: Oncogene, 5, 635-643 (1990); Sainsbury és munkatársai: Láncét, 1, 364 (1985); Sambrook és munkatársai: Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. (1989);
Sands: Immunoconjugates and Radiopharmaceuticals, 1, 213-226(1988);
Santerre és munkatársai: Gene, 30, 147 (1984);
Saxton és munkatársai: Hybridoma, 1, 433 (1982); Scarpati és munkatársai: Biochemistry, 26,
5234-5238 (1987);
Schlingemann és munkatársai: Láb. Invest., 52, 71-76 (1985);
Schlingemann és munkatársai: Láb. Invest., 62, 690-696 (1990);
Schlom és munkatársai: Adv. Cancer Rés., 43, 143 (1985);
Schutt és munkatársai: Immunoi. Lett., 19, 321-328 (1988);
Schweigerer és munkatársai: Natúré, 325, 257-259 (1987);
Sedmak és munkatársai: Transplantation, 58(12), 1379-1385 (1994);
Segal és munkatársai: (1992);
Senger és munkatársai: Cancer és metastasis Reviews, 12, 303-324 (1993);
Senger és munkatársai: Cancer Research, 50, 1774-1778(1990);
Shanker és munkatársai: J. Bioi. Chem., 269(19), 13 936-13 941 (1994);
Shen és Tai: J. Bioi. Chem., 261(25), 11 585-11 591 (1986);
Shepard és munkatársai: J. Clin. Immunoi., 11, 117-127 (1991);
Shockley és munkatársai: Ann. N. Y. Acad. Sci., 617, 367-382 (1991);
Shrestha és munkatársai: Eur. J. Cancer B. Órai. Oncol., 305(6), 393-399 (1994);
Shweiki és munkatársai: Natúré, 359, 843-847 (1992); Silber és munkatársai: J. Clin. Invest., 93(4),
1554-1563(1994);
Silverstein és Febbraio: Blood, 80(6), 1470-0475 (1992);
Sioussat és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys., 301(1), 15-20(1993);
Sloane: Cancer, 17, 1786(1981);
Smith és munkatársai: J. Virol., 46, 584 (1983);
Smith és munkatársai: (1989);
Smith és munkatársai: Proc. Am. Soc. Clin. O. col., 6, 250, (1987);
Soule és munkatársai: PNAS, 80, 1332 (1983);
Span és munkatársai: Immunology, 72(3), 355-360 (1991);
Spicer és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 5148-5152(1987);
Sporn és munkatársai: Blood, 81(9), 2406-2412 (1993);
Staerz és munkatársai: Natúré, 374(6012), 628-631 (1985);
Stavrou: Neurosurg. Rév., 13, 7 (1990),
Stefanik és munkatársai: Cancer Research 51, 5760-5765 (1991);
Steinberg és munkatársai: J. Heart Lung Transplant., 13(2), 306-318 (1994. március-április);
Stern és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4119-4123(1982);
HU 220 347 Β
Stern és munkatársai: J. Bioi. Chem., 160(11), 6717-6722 (1985);
Stevenson és munkatársai: Chem. Immunoi. 48, 126-166(1990);
Street és munkatársai: Cell. Immunoi. 120, 75-81 (1989);
Stuhlmiller és munkatársai: Hybridoma, 1, 447, (1982); Sugama és munkatársai: J. Cell. Bioi., 119(4),
935-944 (1992);
Sunderland és munkatársai: Cancer Rés., 44, 4496 (1984);
Szybalska és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48, 2026 (1962);
Szymendera: Tumour Biology, 7, 333 (1986); Takahashi és munkatársai: Cancer, 61, 881, (1988); Teramoto és munkatársai: Cancer, 50, 241 (1982); Tessler és munkatársai: J. Bioi. Chem., 269(17),
12456-12461 (1994);
Thieme és munkatársai: Diabetes, 44(1), 98-103 (1995);
Thompson és munkatársai: J. Natl. Cancer Inst., 70, 409 (1983);
Thor és munkatársai: Cancer Rés., 46, 3118 (1986); Thorpe és munkatársai: Cancer Rés., 48, 6396-6403 (1988);
Ting és munkatársai: J. Immunoi., 141, 741-748 (1988);
Tischer és munkatársai: Biochem. and Biophys. Rés. Comm., 165(3), 1198-1206 (1989);
Tischer és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(18), 11 947-11 954(1991);
Titus és munkatársai: J. Immunoi. 138, 4018-4022 (1987);
Tomiyama és munkatársai: Blood, 79(9), 2303-2302 (1992);
Tone és munkatársai: J. Biochem. 102(5), 1033-1941 (1987);
Tsuji és munkatársai: Cancer Rés., 45, 2358 (1985); Tuominen és Kallioinen: J. Cutan. Pathol., 21(5),
424-429 (1994);
Tuttés munkatársai: Eur. J. Immunoi. 21, 1351-1358 (1991); Ugarova és munkatársai: J. Bioi. Chem., 268(28), 21 080-21 087 (1993);
Ulich és munkatársai: Inflammation, 18(4), 389-398 (1994);
Vaickus és munkatársai: Cancer Invest., 9, 195-209 (1991);
Vaisman és munkatársai: J. Bioi. Chem., 265(32), 19461-19 466(1990);
Van Heeke és munkatársai: J. Bioi. Chem., 264, 5503-5509 (1989);
Szekvencialista (2) Információ az 1. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 27 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav
Van Duk és munkatársai: Int. J. Cancer, 43, 344-349 (1989);
Veale és munkatársai: Arthritis Rheum, 36(7), 893-900 (1993);
Venkateswaran és munkatársai: Hybridoma, 11(6), 729-739 (1992);
Vitetta és munkatársai: Cancer Rés.,15, 4052-4058 (1991);
von Asmuth és munkatársai: Eur. J. Immunoi., 22(10), 2519-2526 (1992);
Wagener és munkatársai: Int. J. Cancer, 33, 469 (1984);
Wang és munkatársai: Int. J. Cancer, 54, 363-370 (1993);
Wang és munkatársai: Biochem. and Biophys. Rés. Comm., 177(1), 286-291 (1991);
Warr és munkatársai: Blood, 75, 1481-1489 (1990), Watanabe és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86, 9456-9460 (1989);
Wawrzynchak és Thorpe: Methods fór Preparing Immunotoxins: Effect of the Linkage on Activity and Stability, Immunoconjugates: Antibody Conjugates in Radioimaging and Therapy of Cancer, Vogel kiadó, New York, Oxford University Press, 28-55. oldal (1987);
Weiner és munkatársai: Cancer Rés., 49, 4062-4067 (1989);
Weiss és munkatársai: Blood, 73, 968-975 (1989); Whittle és munkatársai: Natúré, 292, 472-474 (1981); Wigler és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
77, 3567, (1980);
Wigler és munkatársai: Cell, 11, 223, (1977); Wildgoose és munkatársai: Blood, 80, 25-28 (1992); Williams és Esnouf: Biochem. J., 84, 52-62 (1962); Wilson és munkatársai: Int. J. Cancer, 28, 293, (1981); Wiman és Collen: Eur. J. Biochem., 78, 19-26 (1977); Wiman: Biochem. J., 191, 229-232 (1980);
Winter és Milstein: Natúré, 349, 293-299 (1991); Woodbury és munkatársai: PNAS, 77, 2183 (1980); Wu és munkatársai: Int. J. Pharm., 12, 235-239 (1990);
Xu és munkatársai: J. Bioi. Chem., 267(25), 17 792-17 803(1992);
Yamaguchi és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 484-488 (1994);
Yamaue és munkatársai: Biotherapy, 2, 247-259 (1990);
Zamarron és munkatársai: J. Bioi. Chem., 266(24}, 16 193-16 199(1994);
Zhang és munkatársai: Int. J. Cancer, 59(6), 823-829 (1994).
HU 220 347 B (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 1
GTCATGCCAT GGCCTCAGGC ACTACAA 27 (2) Információ a 2. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 32 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egy szálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 2
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTT CT 32 (2) Információ a 3. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 47 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) >1 molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 3
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGCTT CTGGCACTAC AAATACT 47 (2) Információ a 4. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 38 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 4
GTCATGCCAT GGCCTGCTCA GGCACTACAA ATACTGTG 38 (2) Információ az 5. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 50 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 5
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT 50 (2) Információ a 6. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 35 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa : más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 6
TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCC TTTCT 35
HU 220 347 Β (2) Információ a 7. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 50 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 7
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCGGAGGCGG TGGATCAGGC 50 (2) Információ a 8. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 36 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi)4 szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 8
AGTATTTGTA GTGCCTGAGG ATCCGCCACC TCCACT 36 (2) Információ a 9. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 45 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 9
GGAGGCGGGTG GATCAGGCGG TGGAGGTAGT GGAGGTGGCG GATCC 45 (2) Információ a 10. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 17 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 10
GTCATGCCAT GGCCCTG 1 7 (2) Információ a 11. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 32 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A)leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 11
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTT CT 32 (2) Információ a 12. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 50 bázispár (B) típus: nukleinsav
HU 220 347 Β (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 12
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT 50 (2) Információ a 13. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 53 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszáiú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 13
CGCGGATCCA CCGCCACCAG ATCCACCGCC TCCTTCTCTG AATTCCCCTT TCT 53 (2) Információ a 14. számú szekvenciáról (1) ?l szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 44 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc - „DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 14
CGCGGATCCG GCGGTGGAGG CTCTTCAGGC ACTACAAATA CTGT 44 (2) Információ a 15. számú szekvenciáról (ί)Λ szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 31 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 15
TGACAAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T 31 (2) Információ a 16. számú szekvenciáról (í)j4 szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 50 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi)ri szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 16
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT 50 (2) Információ a 17. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 31 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS”
HU 220 347 B (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 17
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T 31 (2) Információ a 18. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 44 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) ^4 szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 18
GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCACTACAAA TACT 44 (2) Információ a 19. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 34 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) Λ molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 19
TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCT TTCT 34 (2) Információ a 20. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 19 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (χί)Λ szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 20
CAAGTTCAGC CAAGAAAAC 19 (2) Információ a 21. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 36 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A)leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 21
ACACTTTATT ATCGGAAATC TTCAGCTTCA GGAAAG 36 (2) Információ a 22. számú szekvenciáról (fi) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 657 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 22
TCAGGCACTA CAAATACTGT GGCAGCATAT AATTTAACTT GGAAATCAAC TAATTTCAAG ACAATTTTGG AGTGGGAACC CAAACCCGTC AATCAAGTCT ACACTGTTCA AATAAGCACT AAGTCAGGAG ATTGGAAAAG CAAATGCTTT TACACAACAG ACACAGAGTG TGACCTCACC GACGAGATTG TGAAGGATGT GAAGCAGACG TACTTGGCAC GGGTCTTCTC CTACCCGGCA GGGAATGTGG AGAGCACCGG TTCTGCTGGG GAGCCTCTGT ATGAGAACTC CCCAGAGTTC ACACCTTACC TGGAGACAAA CCTCGGACAG CCAACAATTC AGAGTTTTGA ACAGGTGGGA
120
180
240
300
360
HU 220 347 B
ACAAAAGTGA ATGTGACCGT CTAAGCCTCC GGGATGTTTT TCAAGTTCAG GAAAGAAAAC AAAGGAGAAA ACTACTGTTT AAGAGTACAG ACAGCCCGGT
AGAAGATGAA CGGACTTTAG TGGCAAGGAC TTAATTTATA AGCCAAAACA AACACTAATG CAGTGTTCAA GCAGTGATTC AGAGTGTATG GGCCAGGAGA
TCAGAAGGAA CAACACTTTC CACTTTATTA TTGGAAATCT AGTTTTTGAAT TGATGTGGAT CCTCCCGAAC AGTTAACCGG AAGGGGAATT CAGAGAA
420
480
540
600
657 (2) Információ a 23. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 219 aminosav (B) típus: aminosav (C) szál:
(D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 23
Ser 1 Gly Thr Thr As n 5 Thr Val Al a Al a Tyr 10 Asn Leu Thr Trp Ly s 15 Ser
Thr As n Phe Ly s Thr I le Leu Glu Trp Glu Pro Ly s Pro Val Asn Gin
20 25 30
Val Tyr Thr Val Gin I le Ser Thr Ly s Ser Gly As p Trp Ly s Ser Ly s
35 40 45
Cy s Phe Tyr Thr Thr As p Thr Glu Cys Asp Leu Thr As p Glu I le Van
50 55 60
Ly s As p Va 1 Ly s Gin Thr Tyr Leu Al a Arg Val Phe Ser Tyr Pro Al a
65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gyl Ser Al a Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn
85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Le u Glu Thr As n Leu Gly Gin Pro Thr
100 105 110
I le G1 n Ser Phe Glu Gin Val Gly Thr Ly s Va 1 Asn Va 1 Thr Val Glu
115 120 125
As p Glu Arg Thr Leu Va 1 Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
130 135 140
Asp Val Phe G1 y Ly s As p Leu I le Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Ly s Ser
145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Ly s Ly s Thr Al a Ly s Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
165 170 175
I le As p Val Asp Ly s Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Va 1 Gin Al a Val
180 185 190
I le Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Ly s Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
195 200 205
Cys Me t Gly Gin Glu Ly s Gly Glu Phe Arg Glu
210 215
(2) Információ a 24. számú szekvenciáról (i)4 szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 1947 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 24
TGCAGCTGCC TGGCTGCCTG GCCCTGGCTG TGTTCCTGGC TCCTCAGCAA GCACGGTCGC TCTTGGAGGA GGTGCGCAAG GGCAACCTAG ACGAGGAGGC CTTCGAGGCT CTGGAGTCCT ACACAGCTTG TGAGACAGCG AGGACGCCTC ACTGTGCTGA GGGTCTGGGT ACGAACTACC TTGAGTGCCA GCTATGGAGG AGTCGCTACC ATCCTGGGGC CGACCTACAG GAGAATTTCT CCTGGTGCTA CACTACAGAC CCCACCGTGA GCCAGGATCA AGTCACTGTA GCGATGACTC CACCTCCATT GGAGCAGTGT GTCCCTGATC
CCCTGTGTAG CCTTGTGCAC AGCCAGCATG TGCTCCAGCG GGTCCGGCGA GCCAACACCT AGCGAGAGTG CGTGGAGGAG ACGTGCAGCT CCACGGCTAC GGATGTGTTC TGGGCCAAGT GAGATAAGCT TGCTGCATGT CTGGAAGGTA GAGGGCATGT GAACATCACC CGGTCAGGCA CACATAAGCC TGAAATCAAC TCCACTACCC GCCGCAACCC CGACAGCAGC AACACGGGAC GGAGGCAGGA ATGCAGCATC CCTGTCTGTG CACGCTCCGA AGGCTCCAGT GTGAATCTGT GGGGGCAGCA GTACCAGGGG CGCCTGGCGG
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
HU 220 347 Β
TGACCACACA TGGGCTCCCC TGCCTGGCCT GGGCCAGCGC ACAGGCCAAG GCCCTGAGCA AGCACCAGGA CTTCAACTCA GCTGTGCAGC TGGTGGAGAA CTTCTGCCGC AACCCAGACG GGGATGAGGA GGGCGTGTGG TGCTATGTGG CCGGGAAGCC TGGCGACTTT GGGTACTGCG ACCTCAACTA TTGTGAGGAG GCCGTGGAGG AGGAGACAGG AGATGGGCTG GATGAGGACT CAGACAGGGC CATCGAAGGG CGTACCGCCA CAAGTGAGTA CCAGACTTTC TTCAATCCGA GGACCTTTGG CTCGGGAGAG GCAGACTGTG GGCTGCGACC TCTGTTCGAG AAGAAGTCGC TGGAGGACAA AACCGAAAGA GAGCTCCTGG AATCCTACAT CGACGGGCGC ATTGTGGAGG GCTCGGATGC AGAGATCGGC ATGTCACCTT GGCAGGTGAT GCTTTTCCGG AAGAGTCCCC AGGAGCTGCT GTGTGGGGCC AGCCTCATCA GTGACCGCTG GGTCCTCACC GCCGCCCACT GCCTCCTGTA CCCGCCCTGG GACAAGAACT TCACCGAGAA TGACCTTCTG GTGCGCATTG GCAAGCACTC CCGCACCAGG TACGAGCGAA ACATTGAAAA GATATCCATG TTGGAAAAGA TCTACATCCA CCCCAGGTAC AACTGGCGGG AGAACCTGGA CCGGGACATT GCCCTGATGA AGCTGAAGAA GCCTGTTGCC TTCAGTGACT ACATTCACCC TGTGTGTCTG CCCGACAGGG AGACGGCAGC CAGCTTGCTC CAGGCTGGAT ACAAGGGGCG GGTGACAGGC TGGGGCACC TGAAGGAGAC GTGGACAGCC AACGTTGGTA AGGGGCAGCC CAGTGTCCTG CAGGTGGTGA ACCTGCCCAT TGTGGAGCGG CCGGTCTGCA AGGACTCCAC CCGGATCCGC ATCACTGACA ACATGTTCTG TGCTGGTTAC AAGCCTGATG AAGGGAAACG AGGGGATGCC TGTGAAGGTG ACAGTGGGGG ACCCTTTGTC ATGAAGAGCC CCTTTAACAA CCGCTGGTAT CAAATGGGCA TCGTCTCATG GGGTGAAGGC TGTGACCGGG ATGGGAAATA TGGCTTCTAC ACACATGTGT TCCGCCTGAA GAAGTGGATA CAGAAGGTCA TTGATCAGTT TGGAGAGTAG GGGGCCACTC ATATTCTGGG CTCCTGGAAC CAATCCCGTG AAAGAATTAT TTTTGTGTTT CTAAAACTAT GGTTCCCAAT AAAAGTGACT CTCAGCG (2) Információ a 25. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 2462 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 25
TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGT CTCCCAGGCC CTCAGGCTCC TCTGCCTTCT GCTTGGGCTT CAGGGCTGCC TGGCTGCAGG CGGGGTCGCT AAGGCCTCAG GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCA CAGAGTCTTC GTAACCCAGG AGGAAGCCCA CGGCGTCCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAA CGCGTTCCTG GAGGAGCTGC GGCCGGGCTC CCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGTG CTCCTTCGAG GAGGCCCGGG AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGTTCTGGAT TTCTTACAGT GATGGGGACC AGTGTGCCTC AAGTCCATGC CAGAATGGGG GCTCCTGCAA GGACCAGCTC CAGTCCTATA TCTGCTTCTG CCTCCCTGCC TTCGAGGGCC GGAACTGTGA GACGCACAAG GATGACCAGC TGATCTGTGT GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTG CAGTGACCAC ACGGGCACCA AGCGCTCCTG TCGGTGCCAC GAGGGGTAC CTCTGCTGGC AGACGGGGTG TCCTGCACAC CCACAGTTGA ATATCCATGT GGAAAAATAC CTATTCTAGA AAAAAGAAAT GCCAGCAAAC CCCAAGGCCG AATTGTGGGG GGCAAGGTGT GCCCCAAAGG GGAGTGTCCA TGGCAGGTCC TGTTGTTGGT GAATGGAGCT CAGTTGTGTG GGGGGACCCT GATCAACACC ATCTGGGTGG TCTCCGCGGC CCACTGTTTC GACAAAATCA AGAACTGGAG GAACCTGATC GCGGTGCTGG GCGAGCACGA CCTCAGCGAG CACGACGGGG ATGAGCAGAG CCGGCGGGTG GCGCAGGTCA TCATCCCCAG CACGTACGTC CCGGGCACCA CCAACCACGA CATCGCGCTG CTCCGCCTGC ACCAGCCCGT GGTCCTCACT GACCATGTGG TGCCCCTCTG CCTGCCCGAA CGGACGTTCT CTGAGAGGAC GCTGGCCTTC GTGCGCTTCT CATTGGTCAG CGGCTGGGGC CAGCTGCTGG ACCGTGGCGC CACGGCCCTG GAGCTCATGG TGCTCAACGT GCCCCGGCTG ATGACCCAGG ACTGCCTGCA GCAGTCACGG AAGGTGGGAG ACTCCCCAAA TATCACGGAG TACATGTTCT GTGCCGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGG GGACAGTGGA GGCCCACATG CCACCCACTA CCGGGGCACG TGGTACCTGA CGGGCATCGT CAGCTGGGGC CAGGGCTGCG CAACCGTGGG CCACTTTGGG GTGTACACCA GGGTCTCCCA GTACATCGAG TGGCTGCAAA AGCTCATGCG CTCAGAGCCA CGCCCAGGAG TCCTCCTGCG AGCCCCATTT CCCTAGCCCA GCAGCCCTGG CCTGTGGAGA GAAAGCCAAG GCTGCGTCGA ACTGTCCTGG CACCAAATCC CATATATTCT TCTGCAGTTA ATGGGGTAGA GGAGGGCATG GGAGGGAGGG AGAGGTGGGG AGGGAGACAG AGACAGAAAC AGAGAGAGAC AGAGACAGAG AGAGACTGAG GGAGAGACTC TGGGACATG GAGAGAGACT CAAAGAGACT CCAAGATTCA AAGAGACTAA TAGAGACACA GAGATGGAAT AGAAAAGATG AGAGGCAGAG GCAGACAGGC GCTGGACAGA GGGGCAGGGG AGTGCCAAGG TTGTCCTGGA GGCAGACAGC CCAGCTGAGC CTCCTTACCT CCCTTCAGCC
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
1860
1920
1947
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
1260
1320
1380
1440
1500
1560
1620
1680
1740
1800
HU 220 347 Β
AAGCCCCACC TGCACGTGAT CTGCTGGCCC TCAGGCTGCT GCTCTGCCTT CATTGCTGGA 1860 GACAGTAGAG GCATGAACAC ACATGGATGC ACACACACAC ACGCCAATGC ACACACACAG 1920 AGATATGCAC ACACACGGAT GCACACACAG ATGGTCACAC AGAGATACGC AAACACACCG 1980 ATGCACACGC ACATAGAGAT ATGCACACAC AGATGCACAC ACAGATATAC ACATGGATGC 2040 ACGCACATGC CAATGCACGC ACACATCAGT GCACACGGAT GCACAGAGAT ATGCACACAC 2100 CGATGTGCGC ACACACAGAT ATGCACACAC ATGGATGAGC ACACACACAC CAAGTGCGCA 2160 CACACACCGA TGTACACACA CAGATGCACA CACAGATGCA CACACACCGA TGCTGACTCC 2220 ATGTGTGCTG TCCTCTGAAG GCGGTTGTTT AGCTCTCACT TTTCTGGTTC TTATCCATTA 2280 TCATCTTCA TTCAGACAAT TCAGAAGCAT CACCATGCAT GGTGGCGAAT GCCCCCAAAC 2340 TCTCCCCCAA ATGTATTTCT CCCTTCGCTG GGTGCCGGGC TGCACAGACT ATTCCCCACC 2400 TGCTTCCCAG CTTCACAATA AACGGCTGCG TCTCCTCCGC ACACCTGTGG TGCCTGCCAC 2460 CC 2462 (2) Információ a 26. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 1437 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (χϊ)Λ szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 26
ATGCAGCGCG TGAACATGAT CATGGCAGAA GGATATCTAC TCAGTGCTGA ATGTACAGTT CTGAATCGGC CAAAGAGGTA TAATTCAGGT GAGAGAGAAT GTATGGAAGA AAAGTGTAGT ACTGAAAAGA CAACTGAATT TTGGAAGCAG CCATGTTTAA ATGGCGGCAG TTGCAAGGAT TTTGGATTTG AAGGAAAGAA CTGTGAATTA TGCGAGCAGT TTTGTAAAAA TAGTGCTGAT TATCGACTTG CAGAAAACCA GAAGTCCTGT GTTTCTGTTT CACAAACTTC TAAGCTCACC TATGTAAATC CTACTGAAGC TGAAACCATT TTTAATGACT TCACTCGGGT TGTTGGTGGA CAGGTTGTTT TGAATGGTAA AGTTGATGCA TGGATTGTAA CTGCTGCCCA CTGTGTTGAA GAACATAATA TTGAGGAGAC AGAACATACA ATTCCTCACC ACAACTACAA TGCAGCTATT GAACTGGACG AACCCTTAGT GCTAAACAGC GAATACACGA ACATCTTCCT CAAATTTGGA TTCCACAAAG GGAGATCAGC TTTAGTTCTT GCCACATGTC TTCGATCTAC AAAGTTCACC CATGAAGGAG GTAGAGATTC ATGTCAAGGA GAAGGGACCA GTTTCTTAAC TGGAATTATT AAATATGGAA TATATACCAA GGTATCCCGG CTCACTTAAT GAAAGATGGA TTTCCAAGGT
TCACCAAGCC TCATCACCAT CTGCCTTTTA 60 TTTCTTGATC ATGAAAACGC CAACAAAATT 120 AAATTGGAAG AGTTTGTTCA AGGGAACCTT 180 TTTGAAGAAC CACGAGAAGT TTTTGAAAAC 240 TATGTTGATG GAGATCAGTG TGAGTCCAAT 300 GACATTAATT CCTATGAATG TTGGTGTCCC 360 GATGTAACAT GTAACATTAA GAATGGCAGA 420 AACAAGGTGG TTTGCTCCTG TACTGAGGGA 480 GAACCAGCAG TGCCATTTCC ATGTGGAAGA 540 CGTGCTGAGG CTGTTTTTCC TGATGTGGAC 600 TTGGATAACA TCACTCAAGG CACCCAATCA 660 GAAGATGCCA AACCAGGTCA ATTCCCTTGG 720 TTCTGTGGAG GCTCTATCGT TAATGAAAAA 780 ACTGGTGTTA AAATTACAGT TGTCGCAGGT 840 GAGCAAAAGC GAAATGTGAT TCGAGCAATT 900 AATAAGTACA ACCTGACAT TGCCCTTCTG 960 TACGTTACAC CTATTTGCAT TGCTGACAAG 1020 TCTGGCTATG TAAGTGGCTG GGCAAGAGTC 1080 CAGTACCTTA GAGTTCCACT TGTTGACCGA 1140 ATCTATAACA ACATGTTCTG TGCTGGCTTC 1200 GATAGTGGGG GACCCCATGT TACTGAAGTG 1260 AGCTGGGGTG AAGAGTGTGC AATGAAAGGC 1320 TATGTCAACT GGATTAAGGA AAAACAAAG 1380 TAATTCATTG GAATTGAAAA TTAACAG 1437 (2) Információ a 27. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 1126 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (xi)ri szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 27
GGATTCGAAG GCAAAAACTG TGAATTATTC ACACGGAAGC TCTGCAGCCT GGACAACGGG 60
GACTGTGACC AGTTCTGCCA CGAGGAACAG AACTCTGTGG TGTGCTCCTG CGCCCGCGGG 120
TACACCCTGG CTGACAACGG CAAGGCCTGC ATTCCCACAG GGCCCTACCC CTGTGGGAAA 180
CAGACCCTGG AACGCAGGAA GAGGTCAGTG GCCCAGGCCA CCAGCAGCAG CGGGGAGGCC 240
CCTGACAGCA TCACATGGAA GCCATATGAT GCAGCCGACC TGGACCCCAC CGAGAACCCC 300
TTCGACCTGC TTGACTTCAA CCAGACGCAG CCTGAGAGGG GCGACAACAA CCTCACCAGG 360
ATCGTGGGAG GCCAGGAATG CAAGGACGGG GAGTGTCCCT GGCAGGCCCT GCTCATCAAT 420
GAGGAAAACG AGGGTTTCTG TGGTGGAACC ATTCTGAGCG AGTTCTACAT CCTAACGGCA 480
HU 220 347 B
GCCCACTGTC TCTACCAAGC CAAGAGATTC GAAGGGGACC GGAACACGGA GCAGGAGGAG GGCGGTGAGG CGGTGCACGA GGTGGAGGTG GTCATCAAGC ACAACCGGTT CACAAAGGAG ACCTATGACT TCGACATCGC CGTGCTCCGG CTCAAGACCC CCATCACCTT CCGCATGAAC GTGGCGCCTG CCTGCCTCCC CGAGCGTGAC TGGGCCGAGT CCACGCTGAT GACGCAGAAG ACGGGGATTG TGAGCGGCTT CGGGCGCACC CACGAGAAGG GCCGGCAGTC CACCAGGCTC AAGATGCTGG AGGTGCCCTA CGTGGACCGC AACAGCTGCA AGCTGTCCAG CAGCTTCATC ATCACCCAGA ACATGTTCTG TGCCGGCTAC GACACCAAGC AGGAGGATGC CTGCCAGGGG GACAGCGGGG GCCCGCACGT CACCCGCTTC AAGGACACCT ACTTCGTGAC AGGCATCGTC AGCTGGGGAG AGGGCTGTGC CCGTAAGGGG AAGTACGGGA TCTACACCAA GGTCACCGCC TTCCTCAAGT GGATCGACAG GTCCATGAAA ACCAGGGGCT TGCCCAAGGC CAAGAGCCAT GCCCCGGAGG TCATAACGTC CTCTCCATTA AAGTGAGATC CCACTC (2) Információ a 28. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 45 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 28
GAAGAAGGGA TCCTGGTGCC TCGTGGTTCT GGCACTACAA ATACT (2) Információ a 29. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 30 bázispár (B) típus: nukleinsav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: más nukleinsav (A) leírás: /desc=“DNS” (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 29
CTGGCCTCAA GCTTAACGGA ATTCACCTTT (2) Információ a 30. számú szekvenciáról (1) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 25 aminosav (B) típus: aminosav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ΐι)Λ molekula típusa: peptid (xi)A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 30
Alá Pro Met Alá Glu Gly Glu Gin Lys Pro Arg Glu Val Val Lys Phe 5 10 15
Met Asp Val Tyr Lys Arg Ser Tyr Cys 20 25 (2) Információ a 31. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 26 aminosav (B) típus: aminosav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) >1 molekula típusa: peptid (χί)Λ szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 31
Alá Pro Met Alá Glu Gly Gly Gly Gin Asn His His Glu Val Val Lys 5 10 15
Phe Met Asp Val Tyr Gin Arg Ser Tyr Cys 20 25
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1126
HU 220 347 Β (2) Információ a 32. számú szekvenciáról (i) A szekvencia jellemzői:
(A) hosszúság: 25 aminosav (B) típus: aminosav (C) szál: egyszálú (D) topológia: lineáris (ii) A molekula típusa: peptid (xi) A szekvencia leírása: a szekvencia azonosítási száma: 32
Me t Alá Alá Gly Ser Ile Thr Thr Leu Pro Alá Leu Pro Glu Gly Gly 5 10 15
Asp Gly Gly Alá Phe Alá Pro Gly Cys 20 25

Claims (76)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Kötőligandum, azzal jellemezve, hogy
    a) egy első kötőszakaszt tartalmaz, amely egy beteg 20 sejthez, a betegséggel asszociált érrendszer egyik komponenséhez vagy a betegséggel asszociált sztróma egyik komponenséhez kötődik, és az első kötőszakaszhoz működőképesen hozzákapcsolva,
    b) egy koaguláló faktort vagy egy koaguláló faktorhoz 25 kötődő második kötőszakaszt tartalmaz.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy ligandumot vagy receptort tartalmaz.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jel- 30 lemezve, hogy az első kötőszakasz egy IgG-antitestet, IgM-antitestet, egy antitest antigénkötő szakaszát vagy egy antitest scFv, Fv, Fab’, Fab vagy F(ab’)2 fragmensét tartalmazza.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kötőli- 35 gandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy érrendszerrel ellátott tumor sejtjein található sejtfelületi antigénhez kötődik.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz pl85HER2 sejtfelületi 40 tumorantigénhez, tej mucin mag fehéréhez, TAG 72höz, Lewis a antigénhez, karcinoembrionális antigénhez (CEA) vagy 9.2.27, OV-TL3, M0vl8, B3, KS1/4, 260F9 és/vagy D612 antitesthez kötődő, tumorral asszociált antigénhez kötődő antitest antigénkötő szakaszát 45 tartalmazza.
  6. 6. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz tumorérrendszer egyik komponenséhez kötődik.
  7. 7. A 6. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jelle- 50 mezve, hogy az első kötőszakasz tumorérrendszeri sejtfelületi receptorhoz kötődik.
  8. 8. A 7. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz MHC II osztályba tartozó fehérjéhez, VEGF/VPF receptorhoz, FGF recep- 55 torhoz, TGFp receptorhoz, TIE-hez, VCAM-1-hez, Pszelektinhez, E-szelektinhez, avP3-integrinhez, pleiotropinhoz, endoszialinhoz vagy endoglinhez kötődik.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz VEGF/VPF-t, FGF-t, 60
    TGFp-t, TIE-hez kötődő ligandumot, tumorral asszociált fíbronektin izoformot, szóródási faktort, hepatocita növekedési faktort (HGF), 4 vértestecske-faktort (PF4), PDGF-t vagy TIMP-t tartalmaz.
  10. 10. A 8. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz MHC II osztályba tartozó fehérjéhez, VEGF/VPF receptorhoz, FGF receptorhoz, TGFp receptorhoz, TIE-hez, VCAM-l-hez, Pszelektinhez, E-szelektinhez, avp3-integrinhez, pleiotropinhoz, endoszialinhoz vagy endoglinhez kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
  11. 11. A 8. igénypont szerinti kötőligandum, azzaljellemezve, hogy a kötőszakasz VEGF/VPF-t vagy VEGF/VPF receptorhoz kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
  12. 12. A 11. igénypont szerinti kötőligandum, azzaljellemezve, hogy az első kötőszakasz egy olyan antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza, amely ugyanahhoz az epitóphoz kötődik, mint a 3E11, 3E7, 5G6, 4D8, 10B10 vagy TEC-110 monoklonális antitest.
  13. 13. A 8. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz TGFp-t vagy endoglinhez kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
  14. 14. A 13. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy olyan antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza, amely ugyanahhoz az epitóphoz kötődik, mint a TEC-4 vagy TEC-11 monoklonális antitest.
  15. 15. A 6. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz tumorérrendszeri sejtfelületi receptorhoz kötődő ligandumhoz kötődik.
  16. 16. A 15. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz VEGF/VPF-hez, FGF-hez, TGFp-hoz, vagy TIE-hez kötődő ligandumhoz vagy tumorral asszociált fíbronektin izoformhoz kötődik.
  17. 17. A 16. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy VEGF/VPF-hez kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
  18. 18. A 6. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy ligandum/receptor komplexhez kötődő, de a ligandum/receptor komplexen kívüli ligandumhoz vagy receptorhoz nem kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
    HU 220 347 Β
  19. 19. A 18. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy VEGF/VEGF receptor komplexhez kötődő, de a VEGF/VEGF receptor komplexen kívüli VEGF-hez vagy VEGF-receptorhoz nem kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
  20. 20. A 19. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy olyan antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza, amely ugyanahhoz az epitóphoz kötődik, mint a 2E5, 3E5 vagy 4E5 monoklonális antitest.
  21. 21. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy tumorsztróma-komponenshez kötődik.
  22. 22. A 21. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz tenaszcinhoz, alapmembrán-komponenshez vagy aktivált vértestecskéhez kötődik.
  23. 23. A 6-21. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy indukálható tumorérrendszeri vagy tumorsztrómakomponenshez kötődik.
  24. 24. A 23. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz egy koagulánssal vagy citokinnal indukálható tumorérrendszeri vagy tumorsztróma-komponenshez kötődik.
  25. 25. A 24. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz trombinnal indukálható, monociták, makrofágok, hízósejtek, helper-Tsejtek, CD8-pozitív T-sejtek vagy NK-sejtek által felszabadított citokin által indukálható, vagy IL— 1, IL-4, TNF-a, TNF-β vagy IFN-γ citokin által indukálható tumorérrendszeri komponenshez kötődik.
  26. 26. A 25. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz P-szelektinhez, Eszelektinhez, VCAM-l-hez, ICAM-l-hez, endoglinhoz vagy MHC II osztályba tartozó antigénhez kötődik.
  27. 27. A 24. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz trombin által indukálható tumorsztróma-komponenshez kötődik.
  28. 28. A 27. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz RIBS-hez kötődik.
  29. 29. Az 1-28. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz működőképesen egy koaguláló faktorhoz van kapcsolva.
  30. 30. Az 1-29. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz működőképesen egy koagulációs faktort megkötő második kötőszakaszhoz van kapcsolva.
  31. 31. A 30. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a második kötőszakasz egy koagulációs faktorhoz kötődő antitest antigénkötő szakaszát tartalmazza.
  32. 32. A 31. igénypont szerinti kötőligandum, amely egy bispecifikus antitest.
  33. 33. A 30-32. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy további komponensként a második kötőszakaszhoz kötött koagulációs faktort tartalmaz.
  34. 34. Az 1-33. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz működőképesen és kovalens kötésen keresztül a koagulációs faktorhoz vagy a második kötőszakaszhoz van kapcsolva.
  35. 35. A 34. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz szelektíven hasítható peptidkötéssel egy koagulációs faktorhoz van kapcsolva.
  36. 36. A 35. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz a koagulációs faktorhoz olyan peptidlinkeren keresztül kapcsolódik, amely urokináz, plazmin, trombin, IXa faktor, Xa faktor vagy metalloproteináz hasítási helyet tartalmaz.
  37. 37. Az 1-33. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy az első kötőszakasz működőképesen és egy avidin/biotin kombináción keresztül a koagulációs faktorhoz vagy a második kötőszakaszhoz van kapcsolva.
  38. 38. Az 1-37. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor K-vitamin-függő II/IIa faktor, VH/VIIa faktor, IX/IXa faktor vagy X/Xa faktor koagulánst tartalmaz.
  39. 39. A 38. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor Gla-módosítás nélküli K-vitamin-fiiggó koagulációs faktort tartalmaz.
  40. 40. Az 1-39. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor Russell-féle viperaméreg X faktor aktivátort, vértestecskét aktiváló vegyületet vagy fibrinolízis inhibitort tartalmaz.
  41. 41. A 40. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor tromboxán A2-t, tromboxán A2 -szintázt vagy a2-antiplazmint tartalmaz.
  42. 42. Az 1-41. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor szövetfaktort vagy szövetfaktor-származékot tartalmaz.
  43. 43. A 42. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor csonkolt szövetfaktort tartalmaz.
  44. 44. A 42. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor dimer vagy multimer szövetfaktort tartalmaz.
  45. 45. A 42. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor a VII faktor aktiválására képtelen mutáns szövetfaktort tartalmaz.
  46. 46. A 45. igénypont szerinti kötőligandum, azzal jellemezve, hogy a koagulációs faktor olyan mutáns szövetfaktort tartalmaz, amelyben a 158 pozícióban Trp helyett Arg áll; amelyben a 162 pozícióban Ser helyett Alá áll, amelyben a 164 pozícióban Gly helyett Alá áll, vagy amelyben a 158 pozícióban Trp helyett Arg áll és a 162 pozícióban Ser helyett Alá áll.
  47. 47. Gyógyszerkészítmény, azzaljellemezve, hogy farmakológiailag alkalmazható formában egy 1-46. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandumot tartalmaz.
  48. 48. Szövetfaktor-szerkezet, azzal jellemezve, hogy egy első szövetfaktort vagy szövetfaktor-származékot és működőképesen ehhez kapcsolva legalább egy második szövetfaktort vagy szövetfaktor-származékot tartalmaz.
  49. 49. A 48. igénypont szerinti szövetfaktor-szerkezet, azzal jellemezve, hogy működőképesen összekapcsolva
    HU 220 347 Β mintegy 2-20 szövetfaktort vagy szövetfaktor-származékot tartalmaz.
  50. 50. A 48. vagy 49. igénypont szerinti szövetfaktorszerkezet, azzal jellemezve, hogy legalább egy csonkolt szövetfaktort tartalmaz.
  51. 51. A 48-50. igénypontok bármelyike szerinti szövetfaktor-szerkezet, azzal jellemezve, hogy hidrofób aminosavakból vagy zsírsavakból legalább egy hidrofób membráninszertáló egységet tartalmazó szövetfaktort tartalmaz.
  52. 52. A 48-51. igénypontok bármelyike szerinti szövetfaktor-szerkezet, azzal jellemezve, hogy további komponensként szelektíven hasítható peptidlinkert tartalmaz.
  53. 53. Az 52. igénypont szerinti szövetfaktor-szerkezet, azzal jellemezve, hogy urokináz, plazmin, trombin, IXa faktor, Xa faktor, metalloproteináz, szövetközi kollagenáz, zselatináz, vagy sztromelizin hasítóhelyet tartalmazó szelektíven hasítható peptidlinkert tartalmaz.
  54. 54. A 48-53. igénypontok bármelyike szerinti szövetfaktor-szerkezet, azzal jellemezve, hogy működőképesen egy antitesthez vagy egy antitest antigénkötő szakaszához kapcsolódik.
  55. 55. Készlet, azzal jellemezve, hogy megfelelő tárolóeszközökben
    a) egy első gyógyszerkészítményt tartalmaz, amely egy célantigénnek a betegséggel asszociált érrendszerben vagy a betegséggel asszociált sztrómában történő kifejeződését indukáló biológiai anyagot tartalmaz, és
    b) egy 47. igénypont szerinti második gyógyszerkészítményt tartalmaz.
  56. 56. Az 55. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az első gyógyszerkészítmény érrendszerrel ellátott tumorsejtfelületi antigénjéhez és egy leukocitasejt felületén található aktiváló antigénhez kötődő bispecifikus antitestet tartalmaz.
  57. 57. Az 56. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az első gyógyszerkészítmény egy pl85HER2 tumorantigénhez, tej mucin mag fehérjéhez, TAG-72höz, Lewis a antigénhez, karcinoembrionális antigénhez (CEA) vagy 9.2.27, OV-TL3, MOvl8, B3, KS1/4, 260F9 és/vagy D612 antitesthez kötődő tumorral asszociált antigénhez kötődő bispecifikus antitestet tartalmaz.
  58. 58. Az 56. vagy 57. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az első gyógyszerkészítmény egy CD2, CD3, CD14, CD16 (IgE-re vonatkozó FcR), CD28 aktiváló antigénhez vagy T-sejt receptor antigénhez kötődő bispecifikus antitestet tartalmaz.
  59. 59. Az 58. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az első gyógyszerkészítmény CD 14-hez kötődő bispecifikus antitestet és a második gyógyszerkészítmény E-szelektinhez kötődő első kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumot tartalmaz.
  60. 60. Az 58. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az első gyógyszerkészítmény CD28-hoz kötődő bispecifikus antitestet és a második gyógyszerkészítmény MHC II osztályba tartozó antigénhez kötődő első kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumot tartalmaz.
  61. 61. A 60. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy további komponensként egy harmadik gyógyszerkészítményt tartalmaz, amely ciklosporint vagy az MHC II osztályba tartozó antigén normálszövetek érrendszeri endotéliás sejtjeiben történő kifejeződését elnyomó szert tartalmaz.
  62. 62. Az 55. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy az első gyógyszerkészítmény tumorsejt-, tumorérrendszer- vagy tumorsztróma-antigénhez és koagulánshoz kötődő bispecifikus antitestet tartalmaz.
  63. 63. A 62. igénypont szerinti készlet, azzal jellemezve, hogy a második gyógyszerkészítmény E-szelektinhez vagy P-szelektinhez kötődő első kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumot tartalmaz.
  64. 64. Az 1 -46. igénypontok bármelyike szerinti kötőligandum alkalmazása egy koaguláló faktor betegséggel asszociált érrendszerbe történő célzott és szelektív elszállítására vagy rák kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
  65. 65. A 64. igénypont szerinti alkalmazás egy exogén koagulációs faktor betegséggel asszociált érrendszerbe történő célzott és szelektív elszállítására alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására.
  66. 66. A 64. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy egy endogén koagulációs faktornak a betegséggel asszociált érrendszerbe történő célzott és szelektív elszállítására alkalmas gyógyszerkészítmény előállításához egy első kötőszakaszt és kovalensen ehhez kapcsolva egy második kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumot használunk, ahol a második kötőszakasz endogén koagulációs faktorhoz kötődik, és a kezelendő betegnek adagolva a faktort a betegséggel asszociált érrendszerben koncentrálja.
  67. 67. A 64-66. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy jóindulatú prosztatahiperplázia (BPH), diabetikus recehártya-betegség, az érrendszer újbóli elzáródása, artériás-vénás fejlődési rendellenesség (AVM), vérérdaganat, neovaszkuláris glaukóma, reumás ízületi gyulladás vagy psoriasis kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
  68. 68. A 64-66. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy tumorral asszociált érrendszerben vagy tumorral asszociált sztrómában található és célbavehető komponens kifejeződésének indukálása után adagolható gyógyszerkészítményt állítunk elő, ahol a gyógyszerkészítmény az indukált célbavehető komponenshez kötődő első kötőszakaszt tartalmazó kötőligandumot tartalmaz.
  69. 69. A 68. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a célbavehető komponens kifejeződését citokinnal indukáljuk.
  70. 70. A 69. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a célbavehető komponens kifejeződését az érrendszerrel ellátott tumorsejtfelületi antigénjéhez és leukocita sejtfelületi aktiváló antigénhez kötődő bispecifikus antitestet tartalmazó gyógyszerkészítmény adagolásával indukáljuk.
  71. 71. A 70. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az érrendszerrel ellátott tumor sejtfelületi
    HU 220 347 Β antigénjéhez és CD14 vagy CD28 antigénhez kötődő bispecifikus antitestet alkalmazunk.
  72. 72. A 71. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy MHCII osztályba tartozó antigének kifejeződését a normálszövetekben elnyomjuk, és az MHC II osztályba tartozó antigének kifejeződését a tumorral asszociált érrendszerben az érrendszerrel ellátott tumor sejtfelületi antigénjéhez és CD28 antigénhez kötődő bispecifikus antitest adagolásával indukáljuk.
  73. 73. A 68. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jelle- 10 mezve, hogy a célbavehető komponens kifejeződését koagulánssal indukáljuk.
  74. 74. A 73. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a célbavehető komponens kifejeződését tumorsejt-, tumorérrendszer- vagy tumorsztróma-antigénhez és koagulánshoz kötődő bispecifikus antitestet tartal5 mazó gyógyszerkészítmény adagolásával indukáljuk.
  75. 75. A 64-74. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy parenterálisan adagolható vagy az érrendszerrel ellátott tumorba befecskendezhető gyógyszerkészítményt állítunk elő.
  76. 76. A 64-75. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy humán beteg kezelésére alkalmas gyógyszerkészítményt állítunk elő.
HU9700084A 1994-07-11 1995-06-07 Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához HU220347B (hu)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US27356794A 1994-07-11 1994-07-11
PCT/US1995/007439 WO1996001653A1 (en) 1994-07-11 1995-06-07 Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature

Publications (3)

Publication Number Publication Date
HU9700084D0 HU9700084D0 (en) 1997-02-28
HUT76970A HUT76970A (hu) 1998-01-28
HU220347B true HU220347B (hu) 2001-12-28

Family

ID=23044480

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU9700084A HU220347B (hu) 1994-07-11 1995-06-07 Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához

Country Status (17)

Country Link
EP (1) EP0771216B9 (hu)
JP (5) JP4361133B2 (hu)
CN (1) CN1162184C (hu)
AT (1) ATE198712T1 (hu)
AU (1) AU702250B2 (hu)
BR (1) BR9508402A (hu)
CA (1) CA2194369C (hu)
DE (1) DE69519929T2 (hu)
DK (1) DK0771216T3 (hu)
ES (1) ES2153483T3 (hu)
GR (1) GR3035617T3 (hu)
HK (1) HK1014496A1 (hu)
HU (1) HU220347B (hu)
MX (1) MX9700312A (hu)
NZ (1) NZ288883A (hu)
PT (1) PT771216E (hu)
WO (1) WO1996001653A1 (hu)

Families Citing this family (85)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6022541A (en) * 1991-10-18 2000-02-08 Beth Israel Deaconess Medical Center Immunological preparation for concurrent specific binding to spatially exposed regions of vascular permeability factor bound in-vivo to a tumor associated blood vessel
US6749853B1 (en) 1992-03-05 2004-06-15 Board Of Regents, The University Of Texas System Combined methods and compositions for coagulation and tumor treatment
EP0862742B1 (en) * 1995-11-22 2003-06-11 Oklahoma Medical Research Foundation Assay for blood clotting factors viii and ix
BR9806793A (pt) * 1997-01-22 2000-05-16 Univ Texas Processos e composições de fator tissular para coagulação e tratamento de tumores.
US6524553B2 (en) 1998-03-31 2003-02-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Quinolone vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6537520B1 (en) 1998-03-31 2003-03-25 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Pharmaceuticals for the imaging of angiogenic disorders
BR9909420A (pt) 1998-03-31 2001-09-25 Du Pont Pharm Co Composto, kit, composição metalofarmacêutica de diagnóstico ou terapêutica, composição de agente de contraste de ultrassom, composição radiofarmacêutica terapêutica e composição radiofarmacêutica de diagnóstico
US6548663B1 (en) 1998-03-31 2003-04-15 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Benzodiazepine vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6534035B1 (en) 1998-05-29 2003-03-18 President And Fellows Of Harvard College Methods of inhibiting clot formation
AU750414B2 (en) 1998-07-13 2002-07-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
US6406693B1 (en) 1998-07-13 2002-06-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment methods using antibodies to aminophospholipids
EP1520588B1 (en) * 1998-07-13 2014-12-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Uses of antibodies to aminophospholipids for cancer treatment
US6818213B1 (en) 1998-07-13 2004-11-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Cancer treatment compositions comprising therapeutic conjugates that bind to aminophospholipids
EP2311490A3 (en) 1998-07-13 2011-05-04 Board of Regents, The University of Texas System Uses of antibodies to aminophospholipids for cancer treatment
CA2348781A1 (en) * 1998-11-12 2000-05-25 Novolytics Inc. Compositions and methods for producing vascular occlusion
US6569402B1 (en) 1998-12-18 2003-05-27 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
EP1140864A2 (en) 1998-12-18 2001-10-10 Du Pont Pharmaceuticals Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6794518B1 (en) 1998-12-18 2004-09-21 Bristol-Myers Squibb Pharma Company Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
US6511649B1 (en) 1998-12-18 2003-01-28 Thomas D. Harris Vitronectin receptor antagonist pharmaceuticals
CN1356913A (zh) 1998-12-18 2002-07-03 杜邦药品公司 玻连蛋白受体拮抗剂药物
US6858598B1 (en) 1998-12-23 2005-02-22 G. D. Searle & Co. Method of using a matrix metalloproteinase inhibitor and one or more antineoplastic agents as a combination therapy in the treatment of neoplasia
US6833373B1 (en) 1998-12-23 2004-12-21 G.D. Searle & Co. Method of using an integrin antagonist and one or more antineoplastic agents as a combination therapy in the treatment of neoplasia
IT1307864B1 (it) * 1999-04-20 2001-11-19 Istituto Naz Per La Ricerca Su Metodo diagnostico per il riconoscimento di neoplasie umane attraversola determinazione dell'isoforma ctn-c della tn-c, frammenti di
BR0010017A (pt) 1999-04-28 2002-06-11 Univ Texas Composições e processos para o tratamento de câncer por inibição seletiva de vegf
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US6924359B1 (en) 1999-07-01 2005-08-02 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
CA2377381C (en) * 1999-07-01 2013-06-11 Yale University Neovascular-targeted immunoconjugates
DE19947559A1 (de) * 1999-09-24 2001-04-19 Schering Ag Antikörper-Farbstoffkonjugate gegen Zielstrukturen der Angiogenese zur intraoperativen Tumorranddarstellung
PT1719528E (pt) * 2000-02-24 2012-01-06 Philogen Spa Composições e métodos para tratamento de angiogénese em lesões patológicas
AU2006200762B2 (en) * 2000-02-24 2008-08-21 Philogen S.R.L. Compositions and methods for treatment of angiogenesis in pathological lesions
DE60238435D1 (de) 2001-10-26 2011-01-05 Scripps Research Inst Gezielte thrombose durch gewebefaktor polypeptiden
CA2491310C (en) 2002-07-15 2015-10-06 Board Of Regents, The University Of Texas System Compositions comprising cell-impermeant duramycin derivatives
US7425328B2 (en) 2003-04-22 2008-09-16 Purdue Pharma L.P. Tissue factor antibodies and uses thereof
TWI353991B (en) 2003-05-06 2011-12-11 Syntonix Pharmaceuticals Inc Immunoglobulin chimeric monomer-dimer hybrids
US8597911B2 (en) 2003-06-11 2013-12-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for producing antibodies
JP5490734B2 (ja) * 2003-10-10 2014-05-14 中外製薬株式会社 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
AU2003271174A1 (en) 2003-10-10 2005-04-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Double specific antibodies substituting for functional protein
JP5438880B2 (ja) * 2003-10-10 2014-03-12 中外製薬株式会社 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
CA2549840C (en) 2003-12-09 2012-03-20 Engeneic Molecular Delivery Pty Ltd. Targeted gene delivery to non-phagocytic mammalian cells via bacterially derived intact minicells
US8420783B2 (en) 2004-12-08 2013-04-16 Immunomedics, Inc. Method and compositions for immunotherapy of inflammatory and immune-dysregulatory diseases
US10206998B2 (en) 2005-01-12 2019-02-19 Proteonova, Inc. Modular targeted therapeutic agents and methods of making same
WO2006076417A1 (en) * 2005-01-12 2006-07-20 Proteonova, Inc. Method for making targeted therapeutic agents
EP3623473A1 (en) 2005-03-31 2020-03-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Process for production of polypeptide by regulation of assembly
US9670269B2 (en) 2006-03-31 2017-06-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods of modifying antibodies for purification of bispecific antibodies
JP5624276B2 (ja) 2006-03-31 2014-11-12 中外製薬株式会社 抗体の血中動態を制御する方法
US7939632B2 (en) 2006-06-14 2011-05-10 Csl Behring Gmbh Proteolytically cleavable fusion proteins with high molar specific activity
PL3896090T3 (pl) * 2006-06-14 2022-05-02 Csl Behring Gmbh Rozszczepialne proteolitycznie białko fuzyjne zawierające czynnik krzepnięcia krwi
EP1867660A1 (en) * 2006-06-14 2007-12-19 CSL Behring GmbH Proteolytically cleavable fusion protein comprising a blood coagulation factor
WO2008077616A1 (en) 2006-12-22 2008-07-03 Csl Behring Gmbh Modified coagulation factors with prolonged in vivo half-life
EP3689912A1 (en) 2007-09-26 2020-08-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substitution in cdr
CA2705152C (en) 2007-11-09 2016-10-11 Peregrine Pharmaceuticals, Inc. Anti-vegf antibody compositions and methods
CA2718869C (en) 2008-03-19 2018-10-30 China Synthetic Rubber Corporation Methods and agents for the diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma
TWI564021B (zh) 2008-04-11 2017-01-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Repeated binding of antigen to antigen binding molecules
CN102112144A (zh) * 2008-05-16 2011-06-29 拜耳医药保健有限公司 靶向性凝固因子及其使用方法
UA109633C2 (uk) 2008-12-09 2015-09-25 Антитіло людини проти тканинного фактора
EP2417155B1 (en) * 2009-04-06 2013-06-19 Novo Nordisk A/S Targeted delivery of factor viii proteins to platelets
JP2009292822A (ja) * 2009-07-23 2009-12-17 Chugai Pharmaceut Co Ltd 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体
BR112012012983A2 (pt) * 2009-12-04 2020-09-15 Genentech Inc método para sintetizar um anticorpo multiespecífico, método para sintetizar um painel de anticorpos multiespecíficos, método para sintetizar um análogo de anticorpo, método para sintetizar um painel de análogos de anticorpo e composições
NO2582728T3 (hu) 2010-06-15 2018-01-20
MX2013000301A (es) 2010-07-09 2013-05-09 Biogen Idec Hemophilia Inc Factores quimericos de coagulacion.
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
MX365235B (es) 2010-11-30 2019-05-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno.
CN103969228A (zh) * 2013-02-04 2014-08-06 百奥泰生物科技(广州)有限公司 一种整合素GP IIb/IIIa特异性结合分子巴替非班的生物学效应检测方法
KR102049991B1 (ko) 2013-03-28 2019-12-02 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 Her2 이중 특이 항체
KR102074421B1 (ko) 2013-03-29 2020-02-10 삼성전자주식회사 항 c-Met/항 EGFR 이중 특이 항체
DK3050896T3 (da) 2013-09-27 2021-07-19 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af en polypeptid-heteromultimer
US9493552B2 (en) 2013-11-15 2016-11-15 China Synthetic Rubber Corporation Therapeutic biologic for treatment of hepatocellular carcinoma
CN104045717B (zh) * 2014-07-08 2016-07-06 北京华安科创生物技术有限公司 一种肿瘤血管阻断剂多肽、基因、表达载体及其应用
TWI700300B (zh) 2014-09-26 2020-08-01 日商中外製藥股份有限公司 中和具有第ｖｉｉｉ凝血因子（ｆｖｉｉｉ）機能替代活性的物質之抗體
TWI701435B (zh) 2014-09-26 2020-08-11 日商中外製藥股份有限公司 測定ｆｖｉｉｉ的反應性之方法
WO2016159213A1 (ja) 2015-04-01 2016-10-06 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
AU2016248817A1 (en) * 2015-04-17 2017-08-17 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy with coagulation factors and multispecific antibodies
JP7219005B2 (ja) 2015-12-28 2023-02-07 中外製薬株式会社 Ｆｃ領域含有ポリペプチドの精製を効率化するための方法
CN109661241A (zh) 2016-09-06 2019-04-19 中外制药株式会社 使用识别凝血因子ix和/或活化凝血因子ix以及凝血因子x和/或活化凝血因子x的双特异性抗体的方法
AU2017331739A1 (en) * 2016-09-23 2019-03-07 Csl Limited Coagulation factor binding proteins and uses thereof
EP3617316A4 (en) * 2017-04-27 2020-12-23 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha COAGULATION FACTOR IX WITH IMPROVED PHARMACOKINETICS
MX2020002710A (es) 2017-09-29 2020-07-20 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula de union al antigeno multiespecifica que tiene actividad de sustitucion de la funcion de cofactor del factor viii de coagulacion de sangre (fviii) y formulacion farmaceutica que contiene tal molecula como ingrediente activo.
KR20210069639A (ko) 2018-08-30 2021-06-11 에이치씨더블유 바이올로직스, 인크. 단일-사슬 키메라 폴리펩타이드 및 이의 용도
AU2019328290A1 (en) * 2018-08-30 2021-02-25 HCW Biologics, Inc. Multi-chain chimeric polypeptides and uses thereof
CN113015744A (zh) * 2018-08-30 2021-06-22 Hcw生物科技公司 单链嵌合多肽和多链嵌合多肽以及其用途
CN109453383A (zh) * 2018-11-12 2019-03-12 陈慧慧 免疫检查点的抑制剂在制备治疗青光眼及其他眼部免疫损伤机制相关疾病药物中的应用
CN109999182B (zh) * 2019-03-29 2023-03-07 四川大学华西医院 凝血因子在制备抗肿瘤药物中的应用
WO2020212415A1 (en) 2019-04-17 2020-10-22 Novo Nordisk A/S Bispecific antibodies
IL295083A (en) * 2020-02-11 2022-09-01 Hcw Biologics Inc Methods for activating regulatory t cells
US12024545B2 (en) 2020-06-01 2024-07-02 HCW Biologics, Inc. Methods of treating aging-related disorders

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1981001145A1 (en) * 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
TW212184B (hu) * 1990-04-02 1993-09-01 Takeda Pharm Industry Co Ltd
US5504064A (en) * 1991-04-10 1996-04-02 Oklahoma Medical Research Foundation Treatment of bleeding with modified tissue factor in combination with an activator of FVII
WO1993008210A1 (en) * 1991-10-18 1993-04-29 Beth Israel Hospital Association Vascular permeability factor targeted compounds
WO1993017715A1 (en) * 1992-03-05 1993-09-16 Board Of Regents, The University Of Texas System Diagnostic and/or therapeutic agents, targeted to neovascular endothelial cells
AU5093593A (en) * 1992-08-28 1994-03-29 Scripps Research Institute, The Inhibition of tumor metastasis via neutralization of tissue factor function

Also Published As

Publication number Publication date
JPH10505327A (ja) 1998-05-26
CA2194369A1 (en) 1996-01-25
EP0771216A1 (en) 1997-05-07
ES2153483T3 (es) 2001-03-01
JP2007016033A (ja) 2007-01-25
DK0771216T3 (da) 2001-02-05
AU702250B2 (en) 1999-02-18
JP4361133B2 (ja) 2009-11-11
JP2009298805A (ja) 2009-12-24
EP0771216B1 (en) 2001-01-17
CN1162184C (zh) 2004-08-18
HU9700084D0 (en) 1997-02-28
JP2008297319A (ja) 2008-12-11
BR9508402A (pt) 1997-10-21
NZ288883A (en) 1998-12-23
HUT76970A (hu) 1998-01-28
HK1014496A1 (en) 1999-09-30
DE69519929T2 (de) 2001-05-23
PT771216E (pt) 2001-07-31
GR3035617T3 (en) 2001-06-29
DE69519929D1 (de) 2001-02-22
JP4932883B2 (ja) 2012-05-16
CA2194369C (en) 2004-08-31
EP0771216B9 (en) 2003-01-02
MX9700312A (es) 1997-07-31
ATE198712T1 (de) 2001-02-15
CN1162267A (zh) 1997-10-15
WO1996001653A1 (en) 1996-01-25
JP2003055398A (ja) 2003-02-26
AU2824995A (en) 1996-02-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU220347B (hu) Készítmény az érrendszer specifikus koagulálásához
US6093399A (en) Methods and compositions for the specific coagulation of vasculature
US6036955A (en) Kits and methods for the specific coagulation of vasculature
US6004555A (en) Methods for the specific coagulation of vasculature
US7691380B2 (en) Combined methods for tumor coagulation and tumor treatment
US5877289A (en) Tissue factor compositions and ligands for the specific coagulation of vasculature
US7112317B2 (en) Combined methods and compositions for tumor vasculature targeting and tumor treatment
EP0988056B1 (en) Tissue factor methods and compositions for coagulation and tumor treatment
US6004554A (en) Methods for targeting the vasculature of solid tumors
US5660827A (en) Antibodies that bind to endoglin

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees