PT771216E - Metodos e composicoes para a coagulacao especifica da vasculatura tumoral - Google Patents

Metodos e composicoes para a coagulacao especifica da vasculatura tumoral Download PDF

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Thomas S Edgington
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Description

70." & A' 3
HUH
Descrição “Métodos e composições para a coagulação específica da vasculatura tumoral” ANTECEDENTES DA INVENÇÃO 1. Campo da Invenção A presente invenção diz respeito, de uma forma geral, ao domínio dos vasos sanguíneos e da coagulação. Mais particularmente, a invenção proporciona um conjunto de reagentes imunológicos à base de factor de crescimento, incluindo os anticorpos biespecíficos, utilizáveis para se conseguir obter uma coagulação específica. 2. Descrição da Técnica Congénere
Durante os últimos 30 anos foram realizados avanços na quimioterapia de doenças neoplásicas. Isto inclui algum progresso no desenvolvimento de novos agentes quimioterapêuticos e mais particularmente o desenvolvimento de regimes para a administração simultânea de fármacos. Um conhecimento significativo dos processos neoplásicos no nível celular e tecidual e do mecanismo de acção dos agentes antineoplásicos básicos, também permitiu avanços na quimioterapia de diversas doenças neoplásicas, incluindo o coriocarcinoma, o tumor de Wilm, a leucemia aguda, o rabdomiossarcoma, o retinoblastoma, a doença de Hodgkin e o linfoma de Burkitt. Apesar dos progressos que foram feitos em alguns tumores, há no entanto muitas da maior parte das formas predominantes de cancro humano que ainda resistem a uma intervenção quimioterapêutica eficaz.
Um problema significativo fundamental a que deve ser dada atenção em qualquer regime de tratamento é o conceito de “aniquilação celular total”. Este conceito pressupõe que para se ter um regime de tratamento eficaz, quer seja um método cirúrgico quer seja quimio-terapêutico ou ambos, deve haver uma aniquilação celular total das chamadas células malignas “clonogénicas”, isto é, as células que têm capacidade para se desenvolverem de forma não controlada e para substituir qualquer massa tumoral que possa ser removida. Devido à necessidade absoluta de se desenvolver agentes terapêuticos e regimes que permitam obter uma aniquilação celular total, certos tipos de tumores têm sido mais sensíveis do que outros à terapia. Por exemplo, os tumores de tecidos moles (v.g., linfomas) e os tumores do sangue e dos órgãos onde é produzido o sangue (v.g., leucemias) têm respondido melhor, de um modo geral, à quimioterapia do que os tumores sólidos, tais como os carcinomas.
Uma razão para a susceptibilidade dos tumores de tecidos moles e dos associados ao sangue à quimioterapia é a maior acessibilidade física do linfoma e das células leucémicas à intervenção quimioterapêudca. Dito de forma mais simples, é muito mais difícil para a maioria dos agentes quimioterapêuticos atingir todas as células de uma massa tumoral sólida do que atingir os tumores moles e os tumores associados ao sangue e portanto é muito mais dificil conseguir nesses casos uma aniquilação celular total. O aumento da dose dos agentes quimioterapêuticos tem frequentemente efeitos secundários tóxicos, o que geralmente limita a eficácia dos agentes antitumorais convencionais. A estratégia para o desenvolvimento bem sucedido de agentes antitumorais implica a concepção de agentes que aniquilem selectivamente as células tumorais, exercendo simultaneamente efeitos desfavoráveis relativamente pequenos, se os houver, contra os tecidos normais No entanto, não tem sido possível alcançar este objectivo, pelo facto de existirem poucas diferenças qualitativas entre os tecidos neoplásicos e os normais. Por causa disto, muita marcadores” específicos de tumores, que possam servir como alvos imunológicos tanto para a quimioterapia como para o diagnóstico. Têm sido identificados muitos marcadores específicos para tumores, ou quase específicos para tumores (“associados aos tumores”), como antigéoios de célula tumorais, que podem ser identificados por anticoipos específicos. Infelizmente, é regra geral que os anticorpos específicos para tumores não irão exercer em si próprios e por si próprios efeitos an ti tumorais suficientes que façam com que sejam úteis na terapia do cancro.
Mais recentemente foram utilizadas imunotoxinas numa tentativa para atingir selectivamente as células cancerosas. As imunotoxinas são conjugados de um agente encaminhador específico, tipicamente um anticorpo, ou um seu fragmento, dirigido para um tumor, com um agente citotóxico, tal como um radical de toxina. O agente encaminhador é concebido para conduzir a toxina para as células, transportando o antigénio relevante, para aniquilar tais células. Foram agora desenvolvidas imunotoxinas de “segunda geração”, por exemplo, aquelas em que se utiliza a cadeia de ricina A desglicosilada, para evitar que a imunotoxina seja aprisionada pelo fígado e para reduzir a hepatotoxicidade (Blakey et al., 1987a;b), e as que possuem novos interligadores para conferir maior estabilidade às imunotoxinas in vivo (Thorpe et cd., 1988).
Comprovou-se que as imunotoxinas são eficazes para o tratamento dos linfomas e leucemias nos murganhos (Thorpe et al., 1988; Ghetie et al., 1991; Griffin et al., 1988a;b) e no homem (Vitetta et al., 1991). No entanto, as neoplasias linfóides são particularmente sensíveis à terapia com imunotoxinas porque as células tumorais são relativamente acessíveis às imunotoxinas transportadas pelo sangue. Além disso, é possível encaminhar os antigénios linfóides normais porque os linfócitos normais, que são aniquilados conjuntamente com as células malignas durante a terapia, são rapidamente regenerados a partir de células progenitoras que não possuam os antigenios destinatários.
Era contraste com sua eficácia nos linfomas, comprovou-se que as imunotoxinas são relalivaiuente ineficazes no tratamento de tumores sólidos (Weiner et cã., 1989; Byers et cã., 1989). A razão principal para isso é o facto de os tumores sólidos serem geralmente impermeáveis às moléculas do tamanho do anticorpo: os valores específicos inferiores a 0,001% de incorporação da dose injectada/g de tumor não são invulgares nos estudos com seres humanos (Sands et cã., 1988; Epenetos et ai, 1986). Um outro problema significativo é que os mutantes com insuficiência de antigénios podem não ser aniquilados pela imunotoxina e podem desenvolver-se novamente (Thorpe et al., 1988).
Ademais, os anticorpos que penetram na massa tumoral não se distribuem uniformemente por diversas razões. Em primeiro lugar, o volume denso de células tumorais e de estromas tumorais fibrosos constitui uma barreira física enorme ao transporte macromolecular e cria, combinadamente com a ausência de drenagem linfática, uma pressão intersticial elevada no núcleo do tumor, o que reduz a extravasação e a convecção de fluidos (Baxter et cã., 1991; Jain, 1990). Em segundo lugar, a distribuição dos vasos sanguíneos na maioria dos tumores é desorganizada e heterogénea, pelo que algumas células tumorais ficam separadas dos anticorpos extravasantes por grandes distâncias de difusão (Jain, 1990). Em terceiro lugar, qualquer anticorpo que penetre no tumor pode ficar adsorvido nas regiões perivasculares pelas primeiras células tumorais encontradas, não deixando chegar nenhum às células tumorais nos locais mais distantes (Baxter et ai, 1991; Kennel et al., 1991).
Assim, é bem claro que existe uma necessidade significativa de conceber novas estratégias para o tratamento dos tumores sólidos. Uma solução consiste em encaminhar os agentes para a vasculatura do tumor, em vez de os conduzir para as células tumorais. O desenvolvimento de um tumor sólido é altamente dependente da vascularização do tumor e o desenvolvimento das células tumorais apenas pode ser mantido se o fornecimento de oxigénio, nutrientes e outros factores de crescimento e o efluxo de produtos metabólicos forem satisfatórios. De facto, concluiu-se já que muitas terapias existentes podem ter, como parte de sua acção, um mecanismo de acção por via vascular (Denekamp, 1990).
Os inventores da presente invenção sugerem que o ataque à vasculatura irá privar provavelmente o tumor dos fenómenos que sustentam a vida e que daí resultará uma taxa reduzida de desenvolvimento do tumor ou a morte das células tumorais. Esta forma de resolver o problema tem por objecto proporcionar diversas vantagens sobre o ataque directo às células tumorais. Em primeiro lugar, as células destinatárias estão directamente acessíveis aos agentes terapêuticos administrados por via intravenosa, permitindo a rápida localização de uma alta percentagem da dose injectada (Kennel et al., 1991). Em segundo lugar, uma vez que cada capilar transporta oxigénio e nutrientes para milhares de células na estrutura anatómica tumoral envolvente, até mesno estragos limitados provocados à vasculatura do tumor poderiam produzir uma avalancha de morte de células tumorais (Denekamp, 1990; Denekamp, 1984). Finalmente, é improvável a renovação do crescimento das células endoteliais mutantes, às quais falta um antigénio destinatário, dado que são células normais.
No momento presente é geralmente aceite que são necessários anticorpos para que haja êxito no ataque à vasculatura tumoral, que identifiquem as células endoteliais tumorais, mas não as dos tecidos normais. Embora tenham sido produzidos diversos anticorpos (Duijvestijn et al., 1987; Hagemeier et cã., 1986; Bruland et al., 1986; Munray et al., 1989; Schlingemann et al., 1985), nenhum revelou um alto grau de especificidade. Além disso, parece não haver descrições de nenhum agente particular, diferente das toxinas anteriormente mencionadas, que possa sei promissor como segundo agente num conjugado com um anticorpo de ataque vascular.
Assim, infelizmente, embora o ataque vascular apresente certas vantagens teóricas, ainda têm de ser desenvolvidas as estratégias eficazes que integrem estas vantagens.
DESCRIÇÃO ABREVIADA DA INVENÇÃO A presente invenção supera as limitações da técnica anterior proporcionando novas composições e métodos utilizáveis para a obtenção de coagulação específica, por exemplo, a coagulação na vasculatura do tumor, com efeitos secundários limitados. A invenção, em sentido geral e global, refere-se às diversas composições biespecíficas imunológicas à base de factor de crescimento, capazes de estimular a coagulação na vasculatura associada à doença, e aos métodos para a sua preparação e utilização. A invenção proporciona ligandos de ligação que podem ser descritos genericamente como “ligandos de ligação biespecíficos” Tais ligandos compreendem uma “primeira região de ligação” que se liga tipicamente a uma célula destinatária relacionada com a doença, tal como uma célula tumoral, ou a um componente associado a uma célula desse tipo; a algum componente associado à vasculatura relacionada com a doença, v.g., a vasculatura do tumor; ou a um componente associado ao estroma associado à doença ou a um componente desse estroma. A primeira região de ligação está eficazmente associada ou ligada a um “agente coagulante” que pode ser quer um factor de coagulação propriamente dito quer uma segunda região de ligação que seja capaz de se ligar a um factor de coagulação.
Os ligandos de ligação da invenção são qualificados como “biespecíficos”, uma vez que são “pelo menos” biespecíficos, isto é, possuem pelo menos duas regiões funcionalmente distintas. As composições e os métodos em que são utilizados outros arquétipos, tais como os ligandos de ligação pluriespecíficos, estão também incluídos no âmbito da invenção. As composições combinadas, os estojos e os métodos de utilização dos ligandos de coagulação biespecíficos aqui descritos, cm conjunto com outros efectores, tais como outras composições imunológicas à base de factores de crescimento, agentes indutores de antigénios, imuno-estimuladores, imunossupressores, fármacos quimioterapêuticos e similares estão também aqui contemplados.
As primeiras regiões de ligação, e quaisquer segundas regiões de ligação, podem ser anticorpos ou fragmentos dos mesmos. Conforme aqui utilizado, o termo “anticorpo” designa genericamente qualquer agente de ligação imunológico, tal como IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. De um modo geral, são preferidos os agentes IgG e IgM por serem os anticorpos mais vulgares de natureza fisiológica e por serem mais facilmente obtidos em laboratório. Sabe-se que os anticorpos monoclonais (AcM, o mesmo que MAb) possuem determinadas vantagens, v.g., reprodutibilidade e produção em grande escala, sendo a sua utilização geralmente preferencial. Os anticorpos obtidos por técnicas da engenharia genética, tais como os anticorpos recombinantes e os anticorpos humanizados, também estão contemplados no âmbito da invenção.
No caso de serem utilizadas regiões de anticorpos de ligação de antigénios, como agentes de ligação e de encaminhamento, então pode ser utilizada uma molécula de anticorpo completa. Em alternativa, é possível utilizar uma região funcional de ligação do antigénio, conforme exemplificada por um dos fragmentos Fv, Fvcs (Fv de cadeia singular) (o mesmo que scFv), Fac’, Fac, Dac ou F(ac’)2 (respectivamente o mesmo que Fab\ Fab, Dab ou F(ab’)2) de um anticorpo. As técnicas para a preparação e utilização dos diversos arquétipos à base de anticorpos são bem conhecidas na especialidade e também são aqui descritas. A parcela de factor de coagulação dos ligandos de ligação forma-se de modo a manter uma capacidade funcional significativa, isto é, está numa forma tal que ao ser administrada à região destmatária ainda conserva a sua capacidade para favorecer a coagulação do sangue ou a formação de coágulos. No entanto, em determinados casos, a parcela do factor de coagulação dos ligandos de ligação irá ser, por exemplo, menos activa do que a parte equivalente natural do coagulante e o factor irá atingir o nível desejado de aedvidade apenas ao ser administrado à zona visada. Como um exemplo deste tipo rcfcrc-sc o factor dc coagulação dependente da vitamina K ao qual falta a modificação Gla, o qual irá, não obstante, realizar uma actividade funciona] significativa após a ligação da primeira região de ligação do ligando biespedfico a um sistema membranar.
No caso dc se utilizar uma segunda região de ligação, para ligar um factor de coagulação, ela é geralmente escolhida de modo a reconhecer um local no factor de coagulação que não dificulte de forma significativa a sua capacidade para induzir a coagulação. De igual modo, se um factor de coagulação for ligado de forma covalente a um primeiro agente de ligação, utiliza-se geralmente, para unir as moléculas, um local distinto do seu local de coagulação funcional. A “primeira região de ligação” dos ligandos biespecíficos da invenção pode ser qualquer componente que se ligue a um local destinatário específico, isto é, um local associado à região tumoral ou outro local patológico onde seja desejada a coagulação. A molécula destmatária, no caso de ataque a um tumor, irá estar geralmente presente com uma concentração no local do tumor mais elevada do que nos locais sem tumores. Em determinados casos preferidos* as moléculas destinatárias, quer estejam associadas a células tumorais, a células vasculares dos tumores, a estromas associados a tumores, quer estejam associadas a outros componentes, irão ficar limitadas a essas células ou a outras entidades associadas aos tumores, mas isto não é uma exigência da invenção. A propósito disto, faz-se observar que a vasculatura tumoral é ‘protrombótica’ e está predisposta para a coagulação. Assim, pievê-se que um coagulante dc ataque vá coagular
Λ •ύ-
provavelmente e de forma preferencial a vasculatura tumoral sem coagular a vasculatura dos tecidos normais, mesmo que outras células ou componentes normais do corpo, em particular as células endoteliais normais ou mesmo os estromas, exprimam níveis significativos de molécula destmatáiia. Assim sendo, esta forma de resolver o problema tem por objecto vir a ser utilizada nos seres humanos, v.g., como meio de tratamento do cancro, de uma forma mais segura do que aquela que consiste em enviar uma toxina para a vasculatura do tumor.
Em determinados casos, as primeiras regiões de ligação previstas para utilização na presente invenção podem ser conduzidas para um componente de uma célula tumoral ou para um componente associado a uma célula tumoral. De um modo geral, no encaminhamento para uma célula tumoral, admite-se que o primeiro ligando de ligação irá fazer com que o componente do factor de coagulação do ligando de ligação biespecífico se concentre nas células tumorais perivasculares mais próximas do vaso sanguíneo e irá desencadear consequentemente a coagulação dos vasos sanguíneos do tumor, conferindo ao ligando de ligação biespecífico uma utilidade significativa.
Posto isto, uma primeira região de ligação pode ser um componente, tal como um anticorpo ou um outro agente, que se ligue a uma célula tumoral. Os agentes que se “ligam a uma célula tumoral” são aqui definidos como sendo ligandos que se ligam a um ou vários componentes acessíveis de uma célula tumoral, ou que se ligam a um componente que por sua vez está ligado ou de alguma outra forma está associado a uma célula tumoral, conforme adiante melhor se descreve.
Pressupõe-se que a maior parte dos ligandos que se ligam a tumores são agentes, em particular anticorpos, que se ligam a um marcador ou a um antigénio da superfície das células tumorais. Há muitos desses antigenios que são conhecidos, c o mesmo sucede com inúmeros anticorpos, para utilização na ligação de antigénios e no ataque a tumores. Assim, a invenção compreende primeiras regiões de ligação, tais como as regiões de anticorpos que se ligam aos antigénios, que se ligam a um antigénio da superfície celular do tumor identificado, por exemplo, os que estão enumerados no quadro I, e primeiras regiões de ligação que se ligam de forma preferencial ou específica a uma célula intacta de um tumor, por exemplo, a ligação a células de tumores que constam do quadro Π.
Como exemplos vulgarmente preferidos de regiões de ligação a células tumorais refere-se as que compreendem uma região de um anticorpo de ligação a um antigénio, que se ligue ao antigénio plBS™^2 da superfície das células tumorais, à proteína do núcleo da mucina do leite, ao TAG-72, ao Lewis a (Lea) ou ao antigénio carcinoembriónico (ACE, o mesmo que CEA). Um outro grupo de regiões de ligação às células tumorais, presentemente preferidas, é constituído pelas regiões que possuem uma região de um anticorpo de ligação a um antigénio, que se liga a um antigénio, associado a um tumor, que se liga a um dos anticoipos 9.2.27, OV-TL3, MOvl8, B3, KS1/4,260F9 ou D612. O anticorpo 9.2.27 liga-se aos antigénios destacados do melanoma Mr, os OV-TL3 e Movi 8 ligam-se ambos aos antigénios associados aos ovários, ο B3 e o KS1/4 ligam-se aos antigénios dos carcinomas, o 260F9 liga-se ao carcinoma da mama e o D612 liga-se ao carcinoma colorrectal. Os radicais de ligação de antigénios, que se ligam ao mesmo antigénio, tais como D612, B3 ou KS1/4, são particularmente preferidos. O D612 está descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 183 756 e possui o n° HB 9796 de admissão na instituição ‘ATCC’; ο B3 está descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 242 813 e possui o n° HB 10573 de admissão na instituição ‘ATCC’; e os anticorpos KS1/4 recombinantes e quiméricos estão descritos na patente de invenção norte-americana n° 4 975 369, considerando-se qualquer destes documentos aqui incorporado por referência.
No combate às células tumorais, no caso de o marcador tumoral ser um componente, tal como um receptor, para o qual tenha sido identificado um ligando biológico, também é possível utilizar o próprio ligando como agente de encaminhamento, em vez de um anticorpo. Também é possível utilizar os fragmentos activos ou as regiões de ligação de tais ligandos.
As primeiras regiões de ligação utilizáveis na presente invenção também podem sei componentes que se liguem a um ligando que esteja associado a um marcador das células tumorais. Por exemplo, se o antigénio tumoral em questão for um receptor da superfície celular, as células tumorais irão ter in vivo o correspondente ligando biológico, v.g., uma hormona, uma citoquina ou um factor de crescimento, ligado à sua superfície e disponível como alvo. Isto compreende tanto os ligandos circulantes como os ligandos de tipo “paracrina” que podem ser gerados pela célula tumoral e ligados depois à superfície da célula.
Assim, a presente invenção compreende também primeiras regiões de ligação, tais como anticorpos e os seus fragmentos, que se ligam a um ligando que se liga a um antigénio da superfície das células do tumor identificado, tais como os que constam do quadro I, ou que se ligam de uma forma preferencial ou específica a uma ou várias células tumorais intactas. Além disso, o próprio receptor, ou preferencialmente uma forma concebida por técnicas da engenharia genética ou qualquer outra forma solúvel do receptor ou do domínio de ligação do receptor, poderia também ser utilizado como região de ligação de um ligando de coagulação biespedfico.
No presente contexto é este o significado da expressão “célula doente”, isto é, é uma célula que está associada a uma doença ou patologia, exprimindo essa célula um componente elegível como alvo, ou estando essa célula de alguma forma associada a esse componente, que esteja presente nas células doentes e nos locais da patologia com uma concentração mais elevada quando comparada com os seus níveis de concentração em células e locais sem nenhuma patologia. Estão aqui incluídos os componentes que possam servir de alvo e que se encontram associados à vasculatura nos locais da patologia.
Como exemplos de primeiras regiões de ligação utilizáveis para encaminhar e administrar um coagulante a outros locais de patologias refere-se os anticorpos tais como os seleccionados entre anti-AEP (HPB) (o mesmo que anti-PSA (BPH)) e os FC82 e FC67 3H3 (o mesmo que GF82 e GF67 3H3, respectivamente) que se ligam ao FCF (o mesmo que FGF). Também é possível utilizar os ligandos de ligação biológicos, tais como o FCF, que se ligam aos receptores relevantes, no caso vertente o receptor de FCF. Também é possível utilizar anticorpos contra alvos vasculares, conforme adiante descrito. O encaminhamento de células de estromas ou endoteliais constitui uma ferramenta poderosa para tratar outras doenças em que a própria “célula doente” não esteja associada a um antigénio marcador forte ou exclusivo.
De acordo com outras variantes, as primeiras regiões de ligação da invenção irão ser componentes que são capazes de se ligarem a um componente da vasculatura associada a uma doença, isto é, uma região da vasculatura em que a coagulação específica poderia ser vantajosa para o animal ou para o paciente. Presentemente são preferidas as primeiras regiões de ligação capazes de se ligarem a um componente associado de forma específica ou preferencial à vasculatura do tumor. Os “componentes da vasculatura do tumor” são quer as moléculas da superfície das células endoteliais da vasculatura tumoral quer quaisquer outros componentes, tais como os factores de crescimento, que possam ser ligados a essas moléculas ou a esses receptores da superfície das células.
Determinados ligandos de ligação preferenciais são anticorpos, e os seus fragmentos, que se ligam aos receptores da superfície das células e anticorpos que se ligam aos correspondentes ligandos biológicos desses receptores. Como exemplos de anticoipos refere-se aqueles que se ligam às proteínas de Classe Π do CPH (o mesmo que MHC), aos receptores de FCF.V/FPV (o mesmo que VEGF/VPF), aos receptores de FCF, aos receptores de FpCT, a um receptor de tirosina-cmase-imunoglobulina-factor de crescimento epideimal (TIE), incluindo o TEE-l e o TIE-2), à M-l ACV (o mesmo que VCAM-1), à selectina P, à selectina E, à integrina ανβ3, à pleiotropina, à endossialina e à endoglina.
As primeiras regiões de ligação que compreendem uma região de um anticorpo, de ligação de um antigénio, que se liga à endoglina, constituem um grupo de agentes preferidos. Estes agentes são exemplificados por anticorpos e fragmentos que se ligam ao mesmo epítopo a que se liga o anticorpo monoclonal CET-4 ou o anticorpo monoclonal CET-11. A região dos anticorpos, de ligação do antigénio, que se ligam ao receptor de FCEV constituem outro grupo de agentes preferidos. Estes agentes são exemplificados, em particular, pelos anticorpos e fragmentos que se ligam ao mesmo epítopo a que se ligam os anticorpos monoclonais 3E11, 3E7, 5G6, 4D8, 10B10 ou CET-110. Também podem ser utilizados anticorpos anti-FCEV com especificidades de ligação praticamente idênticas às de qualquer um dos anticorpos seleccionados entre 1B4, 4B7, 1B8, 2C9, 7D9, 12D2, 12D7,12E10, 5E5, 8E5, 5E11, 7E11, 3F5, 10F3, 1F4, 2F8, 2F9, 2F10, 1G6, 1G11, 3G9, 9G11, 10G9, GV97, GV39, GV97y, GV39y, GV59 ou GV14. Como exemplos de outros anticorpos adequados anti-FCEV refere-se os anticorpos 4.6.1, A3.13.1, A4.3.1 e B2.6.2 (Kim et d, 1992); SBS94.1 (Oncogeue Science), e os anticoipos G143-264 e G143-856 (Pharmingcn).
Outros anticorpos também úteis são aqueles que se ligam a um ligando que se liga a um receptor da superfície das células da vasculatura tumoral. Os anticorpos que se ligam aos FCEV/FPV, FCF, FPCT, um ligando que se liga a um receptor de ΉΕ (ou simplesmente ΊΤΕ), uma isoforma de fibronectina associada a um tumor, um factor dispersor, um factor de crescimento dos liepatócitos (FCIL, o mesmo que HGF), o factor 4 das plaquetas (F4P, o mesmo que PF4), o FCPD (o mesmo que PDGF) (incluindo o FaCPD e o FbCPD) e um ΓΓΜΡ (o mesmo que ITMP) (um inibidor tecidual de metaloproteinases, incluindo os ΓΓΜΡ-l, ITMP-2 e ΓΓΜΡ-3) também são pois úteis nestes casos, sendo frequentemente preferíveis os anticorpos que se ligam aos FCEV/FPV, FCF, FPCT, um ligando que se ligue a um ΊΊΕ ou uma isoforma de fibronectina associada a um tumor.
Ainda de acordo com outros casos, está previsto que os marcadores específicos para a vasculatura tumoral possam ser aqueles que tenham sido induzidos em primeiro lugar, isto é, a sua expressão tenha sido manipulada, de forma específica, artificialmente por um ser humano, permitindo o subsequente encaminhamento mediante a utilização de um ligando de ligação, tal como um anticorpo.
Como exemplos de antigénios induzíveis refere-se aqueles que são induzíveis por uma citoquina, v.g., IL-1, IL-4, FaNT, ΡβΝΤ ou IFN-γ, eventualmente libertada por monócitos, macrófagos, mastócitos, células T auxiliares, células T positivas às CD8, células aniquiladoras naturais (AN) ou mesmo células tumorais. Como exemplos de alvos induzidos refere-se os seleccionados entre selectina E, M-1ACV (o mesmo que VCAM-1), M-1AIC (o mesmo que ICAM-1), endoglina e antigénios de Classe Π do CPH. No caso de se praticar a indução da Classe Π do CPH, é geralmente necessária a supressão da Classe Π do CPH nos tecidos normais, o que pode ser conseguido utilizando uma ciclosporino, tal como a ciclosporina A (CsA), 011 utilizando um agente fúncionalmente equivalente.
Outros antigénios induzíveis são aqueles que podem ser induzidos por um coagulante, tal como a trombina, o Factor IX/EXa, o Factor X/Xa, a plasmina ou uma metaloproteinase (metaloproteinase matricial, MPM). De um modo geral, serão utilizados os antigénios induzíveis pela trombina. Este grupo de antigénios é constituído por selectina P, selectina E, FCDP e M-1AIC, sendo geralmente preferível a indução e o encaminhamento de selectina P e/ou selectina E.
Também é possível utilizar anticorpos que se liguem a epítopos que se encontrem presentes nos complexos de tipo ligando-receptor, mas que não existam nem no ligando nem no receptor considerados individualmente. Tais anticorpos vão reconhecer um complexo de tipo ligando-receptor. tal como apresentado à superfície celular, e vão ligar-se a ele, mas não se ligam ao ligando livre ou ao receptor que não faça parte do complexo. A expressão “complexo de tipo ligando-receptor”, tal como aqui utilizada, designa pois o complexo resultante que é obtido quando um ligando, tal como um factor de crescimento, se liga de forma específica ao seu receptor, por exemplo, um receptor de factor de crescimento. Isto é exemplificado pelo complexo de FCEV/receptor de FCEV.
Prevê-se também que tais complexos de tipo ligando-receptor também estejam presentes nas células endoteliais associadas aos tumores em número significativamente superior ao das células endoteliais não associadas a tumores e por tal motivo também possam ser atacados por anticorpos anti-complexos. Entre os anticorpos anti-complexos estão os anticorpos e os seus fragmentos que se ligam ao mesmo epítopo a que se ligam os anticorpos monoclonais 2E5, 3E5 ou 4E5.
Noutros casos, as primeiras regiões de ligação previstas para utilização na presente invenção irão ligar-se a um componente do esUorna associado a uma doença, tal como um componente de um estroma associado a um tumor. Entre estas estão as regiões de anticorpos, de ligação de antigénios, que se ligam aos componentes das membranas pavimentares, os componentes de plaquetas activadas e de estromas tumorais induzíveis, em especial os que são induzíveis por um coagulante, tal como a trombina. A expressão “plaquetas activadas” aqui utilizada designa um componente de um estroma tumoraf motivo pelo qual se ligam ao estroma quando activadas.
Os elementos preferidos de estromas associados a tumores, que podem servir de alvos, são vulgarmente as isoformas de fibroneclina associadas aos tumores. As isoformas de fíbronectina são ligandos que se ligam a uma família de receptores da integrina. As isoformas de fíbronectina associadas aos tumores são acessíveis, v.g., ao serem reconhecidas pelo AcM BC-1. Este AcM, e outros de especificidade idêntica, constituem pois agentes preferíveis para utilização na presente invenção. As isoformas de fíbronectina, embora sejam componentes de estromas, ligam-se às células endoteliais e por isso podem ser consideradas como um ligando ligado às células endoteliais vasculares, que pode servir de alvo, no contexto da invenção.
Um outro grupo de anticorpos anti-estromas preferidos é constituído por aqueles que se ligam ao LLIR (o mesmo que RIBS), ou seja, o local de ligação induzida pelo receptor, no fibrinogénio. O LLIR é um antigénio que pode servir de alvo, cuja expressão no estroma é determinada pelas plaquetas activadas. Também são úteis os anticorpos que se ligam ao LLIL (o mesmo que LB3S), ou seja, o local de ligação induzido pelo ligando, nas plaquetas activadas. Há ainda um outro grupo de anticorpos úteis, que é constituído por aqueles que se ligam à tenascina, que é uma glicoproteína extracelular de grande peso molecular expressa no estroma de diversos tumores benignos e malignos. Os anticorpos do tipo descrito por Shrestha et al. (1984) e os anticorpos 143DB7C8 descritos por Tuominen e KaUioinen (1994) podem pois ser utilizados como parcelas de ligação dos coaguligandos. “Os componentes de estromas associados a doenças e a tumores” podem ser diversos tipos dc células, componentes matriciais, efectores e outros componentes de moléculas que possam por alguém ser considerados fora do âmbito da definição mais rigorosa de “estroma”, mas que sejam mesmo assim entidades que possam servir de alvos que estejam preferencialmente associados a uma região patológica, tal como um tumor.
Assim sendo, a primeira região de ligação pode ser um anticorpo ou um ligando que se ligue a uma célula da musculatura lisa, um perídto, um fíbroblasto, um macrõfago, um leucócito ou um linfócito infiltrante. As primeiras regiões de ligação também podem ligar-se a componentes do tecido conjuntivo e compreendem anticorpos e ligandos que se ligam, v.g., a substâncias seleccionadas entre fibrina, proteoglicanos, glicoproteínas, colagénios e polissacáridos aniónicos, tais como a heparina e os compostos semelhantes à hepaiina.
Noutros casos preferenciais, os ligandos da invenção que se ligam à vasculatura e aos estromas irão ser as regiões de ligação que são, por si próprias, ligandos biológicos, ou então partes suas, em vez dos anticorpos. A expressão “ligandos biológicos”, tomada neste sentido, designa o conjunto das moléculas que se ligam ou que se associam às moléculas da superfície das células, tais como os receptores, que estão acessíveis nos estromas ou nas células vasculares, conforme exemplificado por citoquinas, hormonas, factores de crescimento e não só. É possível utilizar qualquer desses ligandos ou factores de crescimento desde que se ligue à vasculatura ou ao estroma associado à doença, v.g., desde que se ligue a um receptor biológico específico presente sobre a superfície de uma célula endotelial da vasculatura tumoral.
Os factores de crescimento convenientes para utilização nestes casos da presente invenção compreendem, por exemplo, o FCEV/FPV (factor de crescimento endotelial vascular/factor de permeabilidade vascular), o FCF (a família de proteínas de factores de crescimento dos fibroblastos), o FPCT (factor β do crescimento transformante), um ligando que se ligue a um ΊΊΕ, uma isoforma de fibronectina associada a um tumor, um factor dispersor, um factoi de crescimento dos hepatóáto (FCH), o factor 4 plaquetário (F4P), o FCDP (factor de crescimento derivado das plaquetas), ο ΓΓΜΡ ou mesmo a IL-8, a IL-6 ou o Factor XlIIa Mais vulgarmente são preferidos os FCEV/FPV e FCF.
Também está previsto encaminhar um componente ligado a uma célula endotelial, v.g., uma citoquina ou um factor de crescimento, com um arquétipo ligado a um ligando que tenha por base um receptor conhecido. De um modo geral, no caso de se utilizar um receptor como componente encaminhador, recorrer-se-á a uma forma truncada ou solúvel desse receptor. Em tais casos é particularmente preferível que o componente ligado à célula endotelial propícia seja um ligando dimérico, tal como o FCEV. Isto é preferível porque um componente do dímero irá estar já ligado ao receptor da superfície celular in situ, ficando o outro componente do dímero disponível para se ligar a parcela do receptor solúvel do ligando de coagulação biespecífico. A utilização de ligandos biespecíficos ou triespedficos ou multiespedficos, que possuam pelo menos uma região propícia capaz de se ligar a um componente da vasculatura associada à doença, tem a vantagem de as células endoteliais vasculares e os agentes associados à patologia, tais como as plaquetas activadas, serem semelhantes em doenças diferentes e em particular em tumores diferentes. Este fenómeno faz com que seja possível tratar inúmeras doenças e diversos tipos de cancro com um produto farmacêutico, em vez de ter de se adaptar o agente a cada caso de doença ou a cada tipo específico de tumor.
Os conjugados de tipo ligando de ligação biespecífico-factor de coagulação da presente invenção podem ser conjugados em que dois ou vários componentes estão ligados de fonna covalente, por exemplo, utilizando um agente interligador bioquímico e preferencialmente um que seja razoavelmente estável no sangue, conforme exemplificado pelo ‘SMPT’. Os componentes também podem ser ligados utilizando a combinação bem conhecida de avidina (ou estreptavidina) e biotina. São conhecidas na especialidade diversas composições e combinações de agentes interligadores e de avidina:biotina e também as técnicas para a preparação de conjugados, conforme melhor se descreve adiante.
Em alternativa, tais agentes de coagulação biespecíficos podem ser proteínas de fusão preparadas por meio de técnicas da biologia molecular, isto é, juntando um gene (ou um ADNc) que codifique uma região ou um ligando de ligação a um gene (ou um ADNc) que codifique um factor de coagulação. Esta metodologia é bem conhecida na especialidade e descreve-se adiante mais minuciosamente. De forma típica, prepara-se um vector de expressão que compreende, no mesmo bloco de leitura, um segmento de ADN que codifica a primeira região de ligação funcionalmente ligada a um segmento de ADN que codifica o factor de coagulação e que exprime o vector muna célula hospedeira recombinante, por forma a que seja produzida a proteína de fusão codificada.
Os factores de coagulação utilizáveis na presente invenção podem ser seleccionados entre factores coagulantes dependentes da vitamina K, tais como Factor Π/IIa, Factor Vn/VTIa, Factor K/EXa ou Factor X/Xa. Também é possível utilizar o Factor V/Va, Vm/VHIa, o Factor Xl/XIa, o Factor ΧΠ/XIIa e o Factor ΧΙΠ/XHIa. Há aspectos particulares que dizem respeito aos factores de coagulação dependentes da vitamina K aos quais falta a modificação Gla. Tais factores podem ser preparados exprimindo um gene codificador de um factor de coagulação dependente da vitamina K numa célula hospedeira procariótica (células essas que são incapazes de realizar a modificação de Glu para Gla). Os factores também podem ser preparados produzindo artificialmente um gene do factor de coagulação que codifique um fartar de coagulação dependente da vitamina K a que faltem os necessários ou “correspondentes” resíduos de ácido glutâmico e realizando depois a expressão desse gene assim concebido, virtualmente em qualquer célula hospedeira recombinante. De igual modo, é possível preparar um desses factores de coagulação tratando a proteína do factor de coagulação dependente da vitamina K para se lhe remover ou alterar os correspondente resíduos de ácido glutâmico.
Os factores de coagulação preferíveis para utilização nos ligandos de ligação da invenção são o Factor Tecidual e os derivados de Factor Tecidual. Há um grupo de Factores Teciduais úteis que é constituído pelos mutantes que não têm capacidade para activar o Factor VH. É possível fazer com que um Factor Tecidual passe a ser incapaz de activar o Factor VII alterando um ou vários aminoácidos da região compreendida gerahnente e de forma aproximada entre a posição 157 e a posição 167 da sequência dos aminoácidos. Como exemplos de mutantes refere-se aqueles em que se troca um resíduo Trp na posição 15S por um resíduo Aig; aqueles em que se troca um resíduo Ser na posição 162 por um resíduo Ala; aqueles em que se troca um resíduo Gli na posição 164 por um resíduo Ala; e o mutante duplo em que se troca o resíduo Trp na posição 158 pelo resíduo Arg e se troca o resíduo Ser na posição 162 pelo resíduo Ala
Outros derivados preferenciais do Factor Tecidual são os Factores Teciduais truncados, os Factores Teciduais diméricos ou mesmo poliméricos e os Factores Teciduais diméricos ou mesmo poliméricos truncados.
Nestes dúneros, trímeros e polímeros de Factores Teciduais da presente invenção, cada um dos Factores Teciduais ou seus derivados pode ser fimcionahnente ligado, v.g., através de uma ponte dissulfúreto, tioéter ou peptídica Em alguns casos, as unidades de Factores Teciduais irão estar ligadas através de uma ligação que é praticamente estável no plasma ou no ambiente fisiológico em que se pretende utilizar. Isto tem por base o conceito dos inventores de que é possível conOmiai que a forma dimcrica do Factor Tecidual é a forma mais biologicamente activa. No entanto, não há nenhuma exigência para uma ligação estável, uma vez que se sabe que os monómeros de Factores Teciduais são activos nos métodos da invenção.
Também é possível modificar um ou vários Factores Teciduais ou as formas truncadas de Factores Teciduais nos dímeros e nos polímeros, de modo a conterem um resíduo cisteína terminal ou outro resíduo que seja adequado para a ligação do arquétipo de Factor Tecidual a um segundo agente, tal como uma região de ligação.
Os monómeros de Factores Teciduais, os Factores Teciduais truncados e os dímeros e polímeros de Factores Teciduais podem conter um péptido que possua uma sequência de aminoácidos clivável selectivamente. São particularmente preferidos os ligadores peptídicos que possuam um local de clivagem para a urocinase, a plasmina, a trombina, o Factor IXa, o Factor Xa ou uma metaloproteinase, tal como uma estromelisina, uma gelatinase ou uma colagenase intersticial.
Os monómeros de Factores Teciduais, os Factores Teciduais truncados, os dímeros e polímeros de Factores Teciduais e realmente qualquer coagulante, podem pois ser ligados a um segundo agente, tal como um anticorpo, uma região de um anticorpo de ligação a um antigénio, um ligando ou um receptor, através de uma ponte biologicamente separável. A preferência pelos ligadores peptídicos, que possuam um local de clivagem para as proteinases enumeradas supra, baseia-se na presença de tais proteinases, v.g., num ambiente tumoral. Supõe-se que a administração de um ligando ou de um agente biespecífico ao local do tumor tenha como consequência a clivagem, dai resultando a libertação relativamente específica do factor de coagulação.
Os arquétipos particulares da presente invenção são aqueles que possuem um conjunto funoioualmente ligado de unidades, pela sequência seguinte: um resíduo cisteína, um ligador peptídico clivável de forma selectiva, um segmento de aminoácidos hidrofóbicos, um primeiro Factor Teci dual truncado e um segundo Factor Tecidual truncado; ou pela sequência seguinte: um primeiro resíduo cisteína, um ligador peptídico selectivamente clivável, um primeiro segmento dc aminoácidos hidrofóbicos, um primeiro Factor Tecidual truncado, um segundo Factor Tecidual truncado e um segundo segmento de aminoácidos hidrofóbicos; podendo cada arquétipo ser ou nâo ligado a um segundo agente, tal como um anticorpo, um ligando ou um receptor.
Outros factorcs de coagulação convenientes são o activador do Factor X do veneno da víbora de Russell (Vipera russellii)·, os compostos activadores das plaquetas, tais como o tromboxano A2ea sintase do tromboxano A2; e os inibidores da fibrinólise, tais como a antiplasmina o2. A presente invenção também tem por objecto os ligandos de ligação em que o factor de coagulação não está ligado de fornia covalente ao conjugado, mas está-lhe ligado de forma não covalente por meio de uma ligação a uma segunda região de ligação que está fimcianalmente ligada ao agente de encaminhamento do arquétipo. As “segundas regiões de ligação” adequadas compreendem os locais de anticorpos, de combinação de antigénios, que possuem especificidade de ligação para o factor de coagulação, incluindo as partes funcionais de anticorpos, tais como os fragmentos Fvcs, Fv, Fac’, Fac e F(ac’)2 (respectivamente o mesmo que scFv, Fv, Fáb\ Fab e F(ab’)2).
Os ligandos de ligação que contêm anticorpos, ou os seus fragmentos, dirigidos contra os factores coagulantes dependentes da vitamina K, tais como Factor Mia, Factor VD/VIIa,
Factor EX/IXa ou Factor X/Xa; o factor de coagulação dependente da vitamina K ao qual falta a modificação Gla; o Factor Tecidual, um Factor Tecidual mutante, um Factor Tecidnal truncado, um Factor Tecidual dimérico, um Factor Tecidual polimérico, um Factor Tecidual truncado dimérico; Precaliqueína; Factor V/Va, VUI/VHIa, Factor Xl/XIa, Factor XU/XIIa, Factor XI I I/XIIIa; activador do Factor X do veneno da víbora de Russell, tromboxano A2 ou antiplasmina a2 também estão aqui contemplados.
Os agentes de coagulação que não estão ligados de forma covalente podem ser ligados ou “pré-combinados” com um factor de coagulação, v.g., de modo a que possam ser utilizados para fornecer um factor de coagulação exógeno a um local patológico, v.g., a vasculatura tumoral, de um animal onde foi realizada a administração. De igual modo, os ligandos de ligação que possuam uma segunda região de ligação que seja específica para um factor de coagulação também podem ser administrados a um animal numa forma “não combinada” e continuarem a ser úteis para se conseguir uma coagulação específica, caso este em que o agente iria guardar o factor de coagulação circulante (endógeno) e concentrá-lo no interior do local tumoral ou da patologia.
Os “factores de coagulação” ou agentes de coagulação podem ser factores de coagulação endógenos e seus derivados ou então são a versão de tais factores acrescentados exogenamente, incluindo as versões recombinantes. Os coagulantes (no caso presente designados por “coaguligandos”) têm sobre as toxinas (nas imunotoxinas) a vantagem distinta de não produzirem efeitos secundários adversos significativos após o encaminhamento para um marcador que seja restrito à doença em menos de 100%. Além disso, os coagulantes utilizados irão ser na maior partes das vezes de origem humana e por tal motivo colocam menos problemas de imunogenicidade do que as toxinas exógenas, tais como a cadeia A da iicina.
Embora não haja limitações para tais composições, os exemplos importantes de composições de acordo com a presente invenção são os anticorpos biespecíficos, possuindo esses anticorpos uma primeira região de ligação do antigénio que se liga a uma célula patológica ou a um componente de um marcador da vasculatura associada à patologia e uma segunda região de ligação do antigénio que se liga a um factor de coagulação. A invenção também proporciona os fragmentos Fvcs, Fv, Fac’, Fac e F(ac’)2 de tais anticoipos biespecíficos. Um exemplo vulgarmente preferível de um tal anticoipo biespecífico é um anticorpo que possui um local de ligação dirigido contra um antigénio de Classe Π do CPH e outro local de ligação dirigido contra o Factor Tecidual.
Noutras variantes, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas e estojos terapêuticos que compreendem um qualquer ou uma combinação dos ligandos de ligação e dos anticorpos biespecíficos anteriormente enumerados, em formas aceitáveis sob o ponto de vista farmacológico. Isto inclui as composições farmacêuticas e os estojos em que o ligando de ligação possui uma primeira região de ligação que está ligada de forma covalente um factor de coagulação e também os ligandos de ligação em que a primeira região de ligação está ligada de forma covalente a uma segunda região de ligação que por sua vez se liga ao factor de coagulação - quer a ligação ocorra antes ou após a administração a um animal.
Também estão previstas as composições farmacêuticas e os estojos terapêuticos que contenham uma combinação de ligandos de ligação biespecíficos, triespecíficos ou pluri-específicos, em conformidade com a invenção. Isto inclui as combinações em que um ligando de ligação é dirigido contra uma célula afectada pela doença ou contra uma célula tumoral e em que outro é dirigido contra um marcador das células endoteliais da vasculatura ou um componente do estroma associado à doença. Também é possível incorporar outros componentes distintos nas composições e nos estojos da invenção, tais como anticorpos, imunotoxinas, imunoefectores, agentes quimioterapêuticos e outros que tais.
Os estojos também podem possuir um supressor de antigénios, tal como uma ciclosporina, utilizável para suprimir a expressão de antigénios em células endoteliais de tecidos normais; e/ou um “agente indutor” utilizável para induzir os estromas ou as células endoteliais da vasculatura, associados à doença, a exprimirem um antigénio favorável, tal como a selectina E, selectina P ou um antigénio de Classe Π do CPH. Como exemplos de agentes indutores refere-se os clones de células T que se ligam aos antigénios do tumor ou da doença e que produzem o IFN-γ, embora seja vulgarmente preferível que tais clones sejam isolados a partir do animal que se pretende tratar, utilizando o estojo.
Os agentes indutores preferidos são os anticorpos biespecíficos que se 1igam aos antigénios das células tumorais ou da doença, ou mesmo os componentes dos estromas, e às células efectoras capazes de produzirem citoquinas, coagulantes ou outros factores, que induzam a expressão dos antigénios destinatários desejados. Um grupo preferido de anticorpos biespecíficos é constituído normalmente por aqueles que se ligam a um antigénio do tumor e aos antigénios CD14 ou CD16 de activação, para estimularem a produção de IL-1 pelos monócitos, macrófagos ou mastócitos; e aqueles que se ligam a um antigénio do tumor e aos antigénios CD2, CD3 ou CD28 de activação, de preferência ao CD28, para estimularem a produção de IFN-γ pelas células AN ou de preferência pelas células T. Há um segundo grupo preferido de anticorpos biespecíficos que é constituído por aqueles que se ligam a um antigénio do tumor, ou a um componente do estroma tumoral, e ao Factor Teci dual, a um derivado do Factor Tecidual, à protrombina, a um dos factores seleccionados entre Factor VH/VIIa, Factor IX/IXa, Factor X/Xa, Factor Xl/Xla ou ao activador do Factor X do veneno de víbora de Russell, para estimularem a produção de Uouibina. Os estojos que contem tais anticorpos biespecifícos, enquanto primeira composição “indutora”, irão conter geralmente uma segunda composição farmacêutica que incorpore um ligando de ligação que compreende uma primeira região de ligação que se liga à selectina P ou à selectina E.
Os ligandos biespecifícos da invenção, e outros componentes desejáveis, podem ser distribuídos convenientemente por aliquotas e embalados, utilizando para tal um ou vários reservatórios convenientes, sendo cada um desses reservatórios fornecido numa única embalagem. As composições farmacêuticas e os estojos serão melhor descritos adiante.
Embora a presente invenção tenha uma utilidade clínica significativa para o fornecimento de coagulantes e para o tratamento de doenças, também possui muitas utilizações m vitro. Entre estas refere-se, por exemplo, as diversas experiências com base na capacidade de ligação do anticorpo particular, do ligando ou do receptor aos compostos biespecifícos. Assim, os ligandos coagulantes biespecifícos da presente invenção podem ser utilizados em experiências e protocolos convencionais de ligação, tal como sucede com os protocolos de imunorradiografias, autorradiografías à Western, autorradiografías pontilhadas, RIE, EISLE, imunoistoquímica, classificação de células activadas pela fluorescência (SCAF), imunoprecipitação, cromatografia por afinidade e outros que tais, também adiante descritos mais minuciosamente.
Ainda de acordo com outras variantes, a invenção diz respeito a métodos para se administrar um coagulante à vasculatura associada a um tumor. Tais métodos consistem genericamente em administrar a um animal, incluindo um ser humano, uma composição farmacêutica que contenha pelo menos um ligando de ligação biespecífico do tipo dos anteriormente descritos.
As composições são administradas em quantidades eficazes e pelas vias convenientes pai a favorecer a coagulação do sangue na vasculatura do local da patologia, v.g., um tumor sólido. As doses eficazes irão ser determinadas pelos especialistas na matéria, tendo em conta a presente memória descritiva, designadamente a informação que consta das Variantes Preferenciais e dos Exemplos Minuciosos. Muitas vezes é adequada a administração por via parentérica, mas também são adequados outros métodos tais como, v.g., a injecçâo num local de um tumor vascularizado.
Os métodos da invenção prevêem o fornecimento de factores de coagulação exógenos, por administração de um ligando de ligação que possua um factor de coagulação ligado de forma covalente e por administração de um ligando de ligação que possua um factor de coagulação ligado de forma não covalente e que esteja combinado com uma segunda região de ligação do anticorpos ou do ligando biespedfico. Há outros métodos da invenção entre os quais se salienta aqueles que prevêem a administração de um factor de coagulação endógeno na vasculatura tumoral ou da patologia. Consegue-se isto administrando a um animal ou a um paciente um ligando de ligação que possua uma segunda região de ligação que se ligue ao factor de coagulação endógeno e que concentre o factor na vasculatura tumoral ou associada à patologia.
Ainda de acordo com outras variantes metodológicas, também está previsto que os marcadores de estromas tumorais ou da vasculatura tumoral possam ser induzidos de uma forma específica e aproveitados depois utilizando um ligando de ligação, tal como um anticorpo. Como exemplos de antigénios induzíveis refere-se os seleccionados entre selectina E, selectina P, antigénios de Classe Π do CPH, M-1ACV, M-1AIC, endogUna, ligandos reactivos com a LAM-1, adressmas vasculares e outras moléculas de adesão, soído vulgaimente preferíveis os antigénios selectina E e os da Classe Π do CPH.
Ao fazer-se a indução e o aproveitamento subsequente das proteínas de Classe Π do CPH, é geralmente necessário suprimir a Classe Π do CPH nos tecidos normais. A supressão da Classe Q do CPH pode ser conseguida recorrendo a uma ciclosporína ou a um agente funcionalmente equivalente. As moléculas de Classe Π do CPH podem ser depois induzidas nas células endoteliais vasculares associadas a patologia, utilizando sistemas independentes da ciclosporína, por exemplo, efectuando a exposição da vasculatura associada à patologia a uma célula efectora, geralmente uma célula T auxiliar ou uma célula AN, do animal que liberta a
citoquina indutora IFN-γ.
Os monócitos, os macrófagos e mesmo os mastócitos activados são células efectoras com capacidade para produzirem citoquinas (IL-1; FocNT; FpNT) que induzem a selectina E, ao passo que as células T auxiliares, as células T positivas às CD8 e as células AN são capazes de produzir IFN-γ que induz a Classe Π do CPH. A activação de monócitos/macrófagos no local da patologia para a produção de IL-1, ou a activação das células T auxiliares associadas à patologia ou a activação das células AN para a produção de IFN-γ, podem ser
conseguidas administrando ao animal um anticorpo activador que se ligue a um antigénio activador da superfície da célula efectora. Como exemplos de antigénios activadores refere-se os CD14 e CD16 (FcR para a IgE) para os monócitos/macrófagos, e os CD2, CD3 e CD28 para as células T, sendo os CD14 e CD28 respectivamente preferíveis aquando da sua utilização em determinados casos.
Para se conseguir a activação específica e a indução, um método vulgannente preferível consiste em utilizar um anticorpo biespecífico que se ligue ao antigénio activador das células efectoras, tal como um antigénio CD14 ou CD28, e a um antigénio das células tumorais ou da patologia Estes anticorpos biespecífícos irão localizar-se no local do tumor ou da patologia e 29 . s? / i " \ vão activar respectivamente os monócitos/macrófagos e as células T. As células efectoras activadas na vizinhança do componente da patologia ou do tumor visado irão produzir citoquinas indutoras, neste caso respectivamente a IL-1 e o IFN-γ. A supressão da Classe Π do CPH nos tecidos normais também pode ser conseguida administrando a um animal um anticorpo anti-CD4; isto serve para suprimir a produção de IFN-γ pelas células T do animal, daí resultando a inibição da expressão da Classe Π do CPH. As moléculas da Classe II do CPH podem ser novamente induzidas de forma específica em células endoteliais vasculares associadas à patologia, expondo apenas o local da patologia ao IFN-γ. Uma forma de se conseguir isto consiste em administrar ao animal um clone de células T produtor de IFN-γ, que se ligue a um antigénio no local da patologia. As células T produtoras de IFN-γ irão ser preferencialmente os leucócitos infiltrantes provenientes do local da patologia do animal, tais como os leucócitos infiltrantes tumorais (LIT) multiplicados in vitro. A invenção proporciona também métodos de utilização de anticorpos biespecíficos para induzir a produção de um coagulante, tal como a trombina, apenas num ambiente local, por exemplo, no local de um tumor. Repetindo, isto consegue-se geralmente administrando a um animal uma composição farmacêutica que contenha um anticorpo biespecífico que se ligue a uma célula tumoral ou a um componente do estroma tumoral e a uma substância seleccionada entre Factor Tecidual, um derivado do Factor Tecidual, protrombina, Factor VD/VIIa, Factor IX/EXa, Factor X/Xa, Factor Xl/XIa ou activador do Factor X do veneno da víbora de Russell. Os anticorpos que se ligam à selectina E ou à selectina F são depois ligados a um factor de coagulação ou a uma segunda região de ligação que se liga a um factor de coagulação e são introduzidos na corrente sanguínea do animal.
Também é possível praticar regimes de tratamentos combinados mais convencionais, por exemplo, nos casos em que se combina um elemento da presente invenção, de coagulação de um tumor, com uma terapia antitumoral já existente, por exemplo, com a radioterapia ou a quimioterapia, ou através da utilização de um segundo reagente imunológico, tal como uma imunotoxina antitumoral. Os novos métodos de tratamento para doenças benignas também podem ser combinados com outras terapias presentemente utilizadas.
DESCRIÇÃO ABREVIADA DOS DESENHOS
Os seguintes desenhos constituem uma parte da presente memória descritiva e são aqui incluídos para com eles se demonstrar melhor determinados aspectos da presente invenção. E possível compreender melhor a presente invenção tomando por referência um ou vários desses desenhos em combinação com a descrição minuciosa dos casos específicos aqui apresentados. FIG. 1. Fixação de FTt (o mesmo que tTF) às células A20 através do anticorpo bi-específico B21-2/10H10. As células A20 são incubadas com concentrações variáveis de B21-2/ /10H10 (□), SFR8/10H10 (·) ou B21-2/OX7 (O) mais um excesso de 125I-FTt durante 1 hora a 4°C na presença de azida de sódio. A quantidade de 125I-FTt associada às células foi determinada confoime descrito no Exemplo Π. FIG. 2. Relação entre o número de moléculas FTt fixadas por cada célula A20 e a capacidade para induzir a coagulação do plasma. As células A20 foram incubadas com concentrações variáveis de B21-2/10H10 mais um excesso de FTt durante 1 hora a 4°C na presença de azida de sódio. As células foram lavadas, aquecidas a 37°C e foi-lhes acrescentado cálcio e plasma de murganho, tendo sido registado o período decorrido (em ábcissas) até à formação dos primeiros cadeias de fibrina. Efectuou-se um estudo idêntico em que células A20 foram incubadas durante 1 hora a 4°C com o anticorpo biespecífico mais 12DI-FTt, tendo o número de moléculas FTt (em ordenadas) cspeciflcamcntc ligadas às células sido determinado conforme descrito no Exemplo Π. O plasma acrescentado às células A20 não tratadas (isto é, nenhuma molécula de FTt/célula) coagulou ao fim de 190 segundos. F1G. 3A, FIG. 3B, FIB. 3C e FIG. 3D. Evolução temporal da trombose vascular e da necrose tumoral após a administração do coaguligando. Administrou-se a grupos de 3 murganhos portadores de tumores C1300 (Muy) com 0,8 cm de diâmetro uma injecção intravenosa de um coaguligando constituído por 14 pg de B21-2/10H10 e 11 pg de FTt. FIG. 3A; Antes da injecção: os vasos sanguíneos estão intactos e as células tumorais são saudáveis. FIG. 3B; 0,5 horas: os vasos sanguíneos que atravessam o tumor revelam já sintomas de trombose; as células tumorais estão saudáveis. FIG. 3C; 4 horas: há trombos densos em todos os vasos tumorais e há células tumorais em separação e desenvolvendo núcleos picnóticos. São visíveis eiitrócitos nos interstícios do tumor. FIG. 3D; 24 horas: necrose tumoral avançada em todo o tumor. As setas indicam os vasos sanguíneos. FIG. 4. Regressão do tumor sólido induzida pela terapia com o coaguligando dirigido contra a vasculatura tumoral. Administrou-se a murganhos da estirpe nu/nu, portadores de tumores 0300 (Muy) com um diâmetro aproximado de 0,8 cm, duas injecções intravenosas de B21-2/10H10 (10 pg) misturado com FTt (11 pg), separadas entre si por um período de 1 semana (setas) (□). Os murganhos dos grupos de contraprova receberam doses equivalentes apenas de FTt (·), apenas de B21-2/10H10 (O) ou de diluente (). Os outros grupos de contraprova que receberam doses equivalentes de anticorpos biespecíficos de contraprova de isotipo adaptado (SFR8/10H10, OX7/10H10 ou B21-2/OX7) e de FTt revelaram respostas tumorais semelhantes às dos animais que apenas receberam FTt O número de murganhos em cada grupo foi de 7 ou 8. FIG. 5. Exemplos de arquétipos de anticorpo-FTt. Esta figura mostra os conjugados sintetizados pela união do anticorpo, obtido por via química, a uma molécula de FTt obtida por via química, através de uma ponte dissulfiireto, e mostra também a união de diversos FT ou dímeros de FT aos anticoipos e aos seus fragmentos. FIG. 6. Actividade coagulante dos conjugados de FTt quando ligados a células A20. As células A20 foram incubadas com concentrações variáveis de B21-2/10H10 biespecífíco + HétFTt] numa proporção molar de 1:1, com mistura prévia durante 1 hora (□), com anticorpo B21-2-FEC [FTt] (·) e com anticorpo B21-2-H6C[FTt] (A) durante 1 hora a 4°C na presença de azida de sódio. As células foram lavadas e aquecidas até 37°C, tendo-lhes sido acrescentado cálcio e plasma de murganho e tendo sido registado o período decorrido até à formação das primeiras cadeias de fibrina. Os resultados são expressos em termos de período de coagulação como uma percentagem (%) do período de coagulação na ausência de FTt. FIG. 7. Actividade coagulante dos conjugados de FTt e anti-células tumorais. Células LS174T (), células Widr (·) e células H460 (A), previamente incubadas com os anticorpos FT9-6B4 e FT8-5G9 (respectivamente o mesmo que TF9-6B4 e TF8-5G9), foram incubadas com concentrações variáveis de anticorpo D612TT,C[FTt] (), anticorpo KSl/4-FyFTt] (·) e anticorpo XMMC0791-H6[FTt] (A) durante 1 hora a 4°C na presença de azida de sódio. Efectuou-se a lavagem das células que foram aquecidas a 37°C, tendo-lhes sido acrescentado cálcio e plasma de murganho e tendo sido registado o período decorrido até à formação das primeiras cadeias de fibrina. Os resultados são expressos pelo período de coagulação em termos percentuais (%) em relação ao período de coagulação na ausência de FTt FIG. 8. Domínios Gla (ácido γ-carboxiglutâmico) de Factor Mia, Factor VMIa, Factor IX/IXa e Factor X/Xa. As setas representam os locais de clivagem e os locais de activação da clivagem (setas inclinadas) do pró-péptido e do péptido de sinal.
DESCRIÇÃO MINUCIOSA DOS CASOS PREFERENCIAIS
Embora se admita que venham a ser altamente promissores na terapia de linfomas e leucemias (Lowder et al., 1987; Vitetta et ai, 1991), os anticorpos monoclonais (AcM) e as imunotoxinas (ΓΓ) têm sido até ao momento presente relativamente ineficazes em experiências clinicas de combate a carcinomas e a outros tumores sólidos (Byers e Baldwin, 1988; Alnauis e Oldham, 1985), os quais constituem mais de 90% de todos os cancros nos seres humanos (Shocldey et al., 1991). Uma razão principal para isto reside no facto de as macromoléculas não extravasarem facilmente para dentro dos tumores sólidos (Sands, 1988; Epenetos et ai, 1986) e não serem capazes, depois de terem penetrado na massa tumoral, de se distribuírem uniformemente devido à presença de junções muito apertadas entre as células tumorais (Dvorak et al., 1991), devido aos estromas fibrosos (Baxter et al., 1991), devido aos gradientes de pressão intersticial (Jain, 1990) e devido às barreiras dos locais de ligação (Juweid et al., 1992).
Ao serem estudadas novas estratégias para o tratamento de tumores sólidos, parece concluir-se que os métodos que implicam o ataque à vasculatura do tumor, em vez do ataque às próprias células tumorais, proporciona determinadas vantagens. A indução de um bloqueio do fluxo sanguíneo através do tumor, v.g., através da formação de fibrina específica da vasculatura do tumor, poderia interferir com os processos de influxo e efluxo num local de um tumor, daí resultando pois um efeito antitumoral. A interrupção do fornecimento de sangue a um tumor pode ser conseguida alterando o equilíbrio procoagulante-fi bnnolítico nos vasos associados ao tumor, a favor dos processos de coagulação por exposição específica a agentes coagulantes. A presente invenção proporciona diversos métodos para realizar uma coagulação sanguínea específica, por exemplo, uma coagulação específica de um tumor. Consegue-se isto utilizando ligandos de ligação biespecíficos ou multiespecíficos em que pelo menos um componente é uma substância de ataque, feita à base de um factor de crescimento ou de um factor imunológico, e em que há pelo menos outro componente que é capaz de estimular a coagulação directa ou indirectamente. A. Locais de patologias propícios ao ataque
As composições e os métodos proporcionados pela presente invenção são generaliza-damente aplicáveis ao tratamento de qualquer doença, tal como um tumor benigno ou maligno, que possua um componente vascular. As doenças associadas a sistemas vasculares são seleccionadas entre HPB, rednopatia diabética, restenose vascular, mal-formações arteriovenosas (MAV), meningioma, hemangioma, glaucoma neovascular e psoríase; e também as seleccionadas entre angiofibromas, artrite, placas ateroscleróticas, neovasculaiização do enxerto comeano, articulações hemofílicas, escaras hipertróficas, síndroma de Osler-Weber, fibroplasia retrolental do granuloma piogénico, esclerodermas, tracomas, aderências vasculares, sinovites, dermatites e as próprias endometrioses.
Os tumores vascularizados típicos são os tumores sólidos, em particular os carcinomas, que necessitem de um componente vascular para receberem oxigénio e nutrientes. Como exemplos de tumores sólidos que é possível tratar utilizando a presente invenção refere-se, mas sem que isso constitua qualquer limitação, os carcinomas do pulmão, mama, ovários, estômago, pâncreas, laringe, esófago, testículos, fígado, parótidas, tracto biliar, cólon, recto, colo do útero, útero, endométrio, rim, bexiga, próstata, tiróide, os carcinomas das células escamosas, adenocarcinomas, carcinomas de células pequenas, melanomas, gliomas, neuro-blastomas e outros que tais.
Uma região de ligação dos agentes biespecífícos da invenção irá ser um componente que seja capaz dc levar o agente coagulantc até à região tumoral, isto é, capaz de se localizar dentro de um local de um tumor, tal como os anteriormente descritos. Tendo em conta que uma distribuição rclativamcnte mais ampla do agente coagulante não irá estar associada a efeitos secundários graves, tal como se sabe que sucede com um radical de uma toxina, irá haver uma exigência menos rigorosa imposta ao elemento de ataque do ligando biespecifico. Assim, o agente de ataque pude ser encaminhado para componentes das células tumorais; para componentes da vasculatura tumoral; para componentes que se ligam às células tumorais, ou que estão geralmente associados com elas; para componentes que se ligam à vasculatura tumoral, ou que estão geralmente associados com ela, para componentes do estroma ou da matriz extracelular tumoral; e mesmo para tipos de células existentes dentro da vasculatura tumoral. A responsabilidade de um ataque muito rigoroso, v.g., tal como sucede quando são utilizadas imunotoxinas, também passa a ser menor devido ao facto de a vasculatura do tumor ser ‘pró-trombótica’ e estar predisposta para a coagulação. Assim sendo, conseguir realizar um ataque específico significa que a coagulação é favorecida na vasculatura do tumor comparativamente com a vasculatura de locais não tumorais. Assim, a expressão ‘ataque especifico’ corresponde a uma terminologia funcional e não a um termo puramente físico que descreva as propriedades de biodistribuição do agente de ataque e não é improvável que os alvos úteis que se pretende atingir possam não ser totalmente limitados aos tumores e que os ligandos de ataque que são eficazes para favorecer a coagulação específica do tumor possam, não obstante, ser encontrados noutros locais do corpo a seguir à administração. 1. Alvos de Células tumorais
As células malignas que fazem parte do tumor podem ser atacadas utilizando um ligando biespecifico que possua uma região capaz de se ligar a um marcador relativamente especifico da célula do tumor. Na medida em que essa ligação às células tumorais venha a localizar o agente de coagulação associado ao tumor, assim se conseguirá uma coagulação específica. Além disso, presume-se que isto venha a constituir um sistema particularmente eficaz de favorecer a coagulação, uma vez que os agentes biespecíficos, devido à acessibilidade lisica das células tumorais perivasculares, irá ficar provavelmente concentrado em tomo das células tumorais que se encontram mais próximas de um vaso sanguíneo.
Foram já descritos muitos dos chamados “antigénios tumorais”, podendo qualquer deles ser utilizado como um alvo para efeitos da prática da presente invenção. No quadro I subsequente estão enumerados muitos antigénios exemplificativos associados a tumores sólidos. A preparação e a utilização de anticorpos contra tais antigénios é da competência dos especialistas na matéria, estando também enumerados no quadro I anticorpos exemplificativos.
Outro processo para se definir um tumor elegível como alvo consiste em recorrer às características das próprias células tumorais, em vez da descrição das propriedades bioquímicas de um antigénio expresso por essas células. Em consequência, apresenta-se o quadro Π com a finalidade de exemplificar linhagens de células de tumores dos seres humanos que se encontram publicamente disponíveis (no Catálogo da instituição ‘ATCC’). A informação que consta do quadro Π é apresentada por meio de um exemplo, não tendo por finalidade ser limitativa, nem pelo ano nem pelo âmbito. Qualquer pessoa pode consultar o Catálogo da instituição ‘ATCC’ de qualquer ano subsequente para identificar outras linhas celulares adequadas. Além do mais, no caso de se pretender um tipo particular de células, o modo de obtenção dessas células e/ou das suas fontes imediatamente disponíveis é conhecido pelos especialistas nesta matéria Assim, uma análise da literatura científica indicará uma opção correcta sobre as células que devem ser atacadas em qualquer tipo de células tumorais.
QUADROI
ANTIGÉNIOS MARCADORES DE TUMORES SÓLIDOS E ANTICORPOS MONOCLONAIS CORRESPONDENTES
Local do Tumor Identidade/Características do antigénio Anticorpos Monodonais Referência A: ‘CA 125’>200kD OC 125 Kabawat et al., 1983; Ginecológico GY MucinaGP Szymendera, 1986 ovários 80 Kd GP OC 133 Masuko et al, Câncer Rews., 1984 ovários ‘SGA’ 360 Kd GP OMI de Krester et al., 1986 ovários Mudna de alto M, Movi Mictti et al., Câncer Res., 1985 ovários Mucina de alto Mr /glicolipídeo Mo v2 Miotti et al., 1985 ovários NS 3C2 Tsuji etal., Câncer Res., 1985 ovários NS 4C7 Tsuji et al., Câncer Res., 1985 ovários Mucina de alto Mr Π>3 Gangopadhyay et al., 1985 ovários Mucina de alto Mr DU-PAN-2 Lan etal., 1985 GY 7700 Kd GP F 36/22 Croghan etal., 1984 ovários ‘gp 68’ 48 KdGP 4F7/7A10 Bhattacharya etal., 1984 GY 40, 42kD GP OV-TL3 Poels etal., 1986 GY ‘TAG-72’ Mucina de alto Mr B72.3 Thor etal., 1986 ovários 300-400 KdGP df3 Kufeetal., 1984 ovários 60 KdGP 2Cj/2F7 Bhattacharya et al., 1985 GY 105 KdGP MF 116 Mattes etal., 1984 ovários 38-40 kDGP Movi 8 Miotti etal., 1987 GY ‘CEA’ 180 KdGP CEA11-H5 Wagener et al., 1984 ovários CA 19-9 ou GICA CA 19-9 (1116NS19-9) Atkinson et al., 1982 ovários ‘PLAP’67 Kd GP H17-E2 McDicken et ai, 1985 ovários 72 Kd 791T/36 Perkins et al., 1985 ovários 69 Kd PLAP ndog2 Sunderland et al., 1984 ovários PLAP de M, desconhecido H317 Johnson et al., 1981 QUADRO I (continuação)
Local do Tumor Identidade/Caraclerísticas do antigénio Anticorpos Monodonais Referência ovários pieS1®82 4D5, 3H4, 7C2,6E9, 2C4,7F3,2H11,3E8, 5B8,7D3, SB8 Shepardeta/., 1991 útoro ovário HMFG-2 HMFG2 Epenetos et al., 1982 GY HMFG-2 3.14.A3 Burchell et al., 1983 B: MAMA 330-450 kD GP DF3 Hayes et al., 1985 NS NCRC-11 Ellis et al., 1984 37kD 3C6F9 Mandeville et al., 1987 NS MBE6 Teramcto etal., 1982 NS CLNH5 Glassy et al., 1983 47 Kd GP MAC 40/43 Kjeldsen etal., 1986 GP de alto M, EMA Sloane et al., 1981 GP de alto Mr HMFG1HFMG2 Aridie et al., 1981 NS 3.15.C3 Aiklieetal., 1981 NS M3, M8, M24 Foster et al., 1982 Ags de grupo sanguíneo 1 (Ma) M18 Foster etal., 1984 NS 67-D-ll Rasmussen etal., 1982 receptor de estrogênio D547Sp, D75P3, H222 Kinsel et al., 1989 receptor de EGF anti-EGF Sainsbury et al., 1985 recetor de lamina LR-3 Horan Hand et al., 1985 erb B-2pl85 TA1 Gusterson et al., 1988 NS H59 Hendler et al., 1981 126 Kd GP 10-3D-2 Soule etal., 1983 NS HmABl,2 Imam etal., 1984; Schlom et al., 1985 NS MBR 1,2,3 Menard et al., 1983 95 Kd 24.17.1 Thompson etal., 1983 100 Kd 24.17.2 (3E1.2) Croghan et al., 1983 NS F36/22.M7/10 5 Croghan et al., 1984 24 Kd C11,G3,H7 Adams etal., 19 83 QUADRO I (continuação)
Local do Tumor Identídade/Caracterútícas do antigénio Anticorpos Monodonais Referenda 90 Kd GP B6.2 Colcher et al., 1981 CEA & 180 Kd GP Bl.l Coldier et al., 1983 mudna do cólon e do pâncreas, semelhante a Ca 19-9 Cam 17.1 Impenal Câncer Research Technology MaB Listing proteína do núcleo da mucina do leite SM3 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing proteína do núcleo da mucina do leite SM4 Imperial Câncer Resea rch Technology MaB Listing mucina do leite purificada por afinidade C-Mul (566) Imperial Câncer Research Technology MaB Listing pl8 5«^ 4D5,3H4,7C2,6E9, 2C4,7F3,2H11,3E8, 5B8,7D3,5B8 Shepard et al., 1991 GP CA 125 > 200 Kd OC 125 Kabawat et al., 1985 mucina de alto M,/ glicolipido MO v2 Miotti et al, 1985 mucina de alto Mr DU-PAN-2 Lan etal., 1984 GP ‘gp48’ 48 Kd 4F7/7A,0 Bhattacharya et al., 1984 GP de 300-400 Kd df3 Kufe et al., 1984 mucina de alto Mrde ‘TAG-72’ B72.3 Thor etal., 1986 ‘CEA’ 180 KdGP cccccCEA 11 Wagener et al., 1984 ‘PLAP’ 67 Kd GP H17-E2 McDicken et al., 1985 HMFG-2 > 400 Kd GP 3.14.A3 Burchell et al., 1983 NS F023C5 Riva et al., 1988 £i Colorrectal mucina de alto Mrde ‘TAG-72’ B72.3 Colcher et al., 1987 GP37 (17-1 A) 1083-17-1A Paul et al., 1986 QUADRO I (continuação)
Local do Tumor Identidade/Características do antigénio Anticorpos Monodonais Referência GP da superfície C017-1A LoBuglioetal., 1988 CEA ZCE-025 Patt etal., 1988 CEA AB2 Griffin etal., 1988a AG da superfície celular HT-29-15 Cohn et al., 1987 epitélio secretário 250-30.6 Leydem et al., 1986 glicoproteina da superfície 44X14 Gallagher et al., 1986 NS A7 Takahashi etal., 1988 NS GA73.3 Munz etal., 1986 NS 791T/36 Farrans et al., 1982 Ag da membrana celular e citoplásmico 28A32 Smith etal., 1987 CEA e vindesina 28.19.8 Corvalen, 1987 gp72 X MMCO-791 Byers etal., 1987 Mucina de alto Mr DU-PAN-2 Lan etal., 1985 Mucina de alto Mr id3 Gangopadhyay et al., 1985 CEA 180 Kd GP CEA11-H5 Wagener et al., 1984 60 Kd GP 2C8/2F7 Bhattacharya et al., 1985 CA-19-9 (ou GICA) CA-19-9 (1116NS 19-9) Atkinson et al., 1982 Lewis a PR5C5 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing Lewis a PR4D2 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing Muco do cólon PR4D1 Imperial Câncer Research Technology Mab Listing D: Melanoma p97a 4.1 Woodbury et al., 1980 P97 a 8.2 M17 Brown etal.. 1981a QUADRO I (continuação)
Local do I dentidade/Car acterísticas Anticorpos Referência Tumor do antigénio Monodonais P97b 96.5 Brown et al., 1981a 118.1, p97c 133.2, Brown eia/., 1981a (113.2) Li, Lio, p97c RlO,(Rl9) Brown et al., 1981b p97d 112 Brown eia/., 1981b p97e K5 Brown et al., 198 lb p 155 6.1 Loop etal., 1981 Dissialogangliósido Gd3 R24 Dippold et al., 1980 p210, p60, p250 5.1 Loop etal., 1981 p280 p440 225.28S Wilson ef al., 1981 GP 94, 75, 70 & 25 465.12S Wilson etal., 1981 p240-p250, p450 9.2.27 Reisfeld etal., 1982 100,77,75 Kd Fll Cheeeia/., 1982 94 Kd 376.96S Imai et al., 1982 Imai etal., 1982; 4 cadeias GP 465.12S Wilson et al., 1981 GP 74 15.75 Johnson & Reithmuller, 1981 GP 49 15.95 Johnson & Reithmuller, 1981 230 Kd Mel-14 Carrel et al., 1982 92 Kd Mel-12 Carrel et al., 1982 70 Kd Me3-TB7 Carrel etal., 1:387, 1982 HMW MAA semelhante a 9.2.27 AG 225.28SD Kantor et al., 1982 HMW MAA semelhante a 9.2.27 AG 763.24TS Kantoreia/., 1982 GP95 semelhante a 376.96S 465.12S 705F6 Stuhlmiller et al., 1982 GP125 436910 Saxton et al., 1982 QUADRO I (continuação)
Local do Tumor Identidade/Características do antigénio Anticorpos Monoclonais Referência CD41 M148 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing Ei Gastrointestinal mucina de alto Mr ID3 Gangopadhyay et ai, 1985 pâncreas, estômago vesícula biliar, pâncreas, estômago mucina de alto Mr DU-PAN-2 Lan et ai, 1985 pâncreas NS OV-TL3 Poels et ai, 1984 pâncreas, estômago, esófago mucina de alto Mrde ‘TAG-72’ B72.3 Thor et ai, 1986 estômago ‘CEA’ 180 Kd GP CEA11-H5 Wagener et ai, 1984 pâncreas HMFG-2 > 400 Kd GP 3.14.A3 Burchell et ai, 1983 G.I. NS CCOLI Lemkin et ai, 1984 pâncreas, estômago CA 19-9 (ou GICA) CA-19-9 (1116NS 19-9) e CA50 Szymendera, 1986 pâncreas CA125 GP OC125 Szymendera, 1986 F: PULMÃO 4D5, 3H4, 7C2,6E9, 2C4, 7F3,2H11,3E8, 5B8, 7D3, SB8 Shepard et ai, 1991 carcinoma pulmonar das células não pequenas mucina de alto M,/ /glicolípido MO v2 Miotti et ai, 1985 mucina de alto Mrde ‘TAG-72’ B72.3 Thoret ai, 1986 mucina de alto Mr DU-PAN-72 Lan et ai, 1985 QUADRO I (continuação)
Local do Tumor Identidade/Características do antigénio Anticorpos Monodonais Referência ‘CEA’ 180kDGP CEA11-H5 Wagener etal., 1984 Gliomas Malignos antigénio citoplásmico das células 85HG-22 MUC 8-22 Stavrou, 1990 Ag da superficie celular das células 85HG-63 MUC2-63 Stavrou, 1990 Ag da superficie celular das células 86HG-39 MUC 2-39 Stavrou, 1990 Ag da superficie celular das células 86HG-39 MUC 7-39 Stavrou, 1990 G: DIVERSOS p53 PAb 240 PAb 246 PAb 1801 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing tumores pequenos de células redondas molécula de adesão de células neurais ERIC.l Imperial Câncer Research Technology MaB Listing meduloblastoma, neuroblastoma, rabdomiossarcoma M148 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing neuroblastoma FMH25 Imperial Câncer Research Technology MaB Listing cancro renal e glioblastomas pl55 6.1 Loop etal., 1981 cancro da bexiga e da laringe “Antigénio Ca” 350-390 kD CAI Ashall et al., 1982 neuroblastoma GD2 3F8 Cheung et al., 1986 próstata gp48 48 kD GP 4F7/7A,o Bhattachaiya et al., 1984 próstata 60kDGP 2Cg/2F7 Bhattacharya et al., 1985 tiróide ‘CEA’ 180 kD GP CEA11-H5 Wagener et al., 1984
Abreviaturas: Abs, anlicuipus, Ags, auligénios, EOF, factor de crescimento cpidcrmal, G.I., gastrointestinal; GICA, antigénio associado ao tracto gastrointestinal; GP, glicoproteína; GY, ginecológico; HMFG, glóbulo da gordura do leite humano; Kd, quilodaltons; Mabs, anticorpos monoclonais; Mr, peso molecular, NS, não especificada; PLAP, fosfatase alcalina placentária, TAG, glicoprotóna associada a tumor; CEA, antigénio carcinoembriónico.
Nota de rodapé: o CAI 9-9 Ag(GICA) é uma ãalosil-flucosil-lactotetraosil-ceramida, também denominada pentagjicosfl-ceramida de Lewis sialilada ou lacto-N-fucopentaose Π sialilada; acredita-se que o p97 Ags sejam sulfato de condroítina-proteoglicano; acredita-se que os antigénios reactivos com o Mab 9.2.27 sejam glicoproteínas sialiladas associadas com sulfato de condroítina-proteoglicano; salvo quando especificado, GY pode significar cancros do cérvix, endocérvix, endométrio, trompas de falópio, ovários, vagina ou tumor misto de Mullerian; salvo quando especificado G.I. pode significar cancros do fígado, intestino delgado, baço, pâncreas, estômago e esófago. QUADRO Π
FONTES E LINHAGENS DE CÉLULAS DE TUMORES HUMANOS Número HTB da ATTC Linhagem de células Tipo de Tumor 1 J82 carcinoma de células transicionais, bexiga 2 RT4 papilomas de células transicionais, bexiga 3 ScaBER carcinoma escamoso, bexiga 4 T24 carcinoma de células transicionais, bexiga 5 TCCSUP carcinoma de células transicionais, bexiga, grau IV primário 9 5637 carcinoma, bexiga, primário 10 SK-N-MC neuroblastoma, metástases para a zona supraorbital 11 SK-N-SH neuroblastoma, metástases para a medula óssea 12 SW1088 astrocitoma 13 SW 1783 astrocitoma 14 U-87 MG glioblastoma, astrocitoma, grau III 15 U-118MG glioblastoma 16 U-138MG glioblastoma 17 U-373 MG glioblastoma, astrocitoma, grau ΙΠ 18 Y79 retinoblastoma 19 BT-20 carcinoma, mama 20 BT-474 carcinoma ductal, mama 22 MCF7 adenocarcinoma da mama, efusão pleural 23 MDA-MB-134-VI mama, carcinoma ductal, efusão pleura 24 MDA-MD-157 medula da mama, carcinoma, efusão pleural 25 MDA-MB-175-VII mama, carcinoma ductal, efusão pleural 27 MDA-MB-361 adenocarcinoma, mama, metástases para o cérebro 30 SK-BK-3 adenocarcinoma, mama, efiisão pleural maligna 31 C-33 A carcinoma, cervix 32 HT-3 carcinoma, cervix, metástase para os nodos linfáticos <6-- QUADRO Π (Cont.) Número HTB da ATTC Linhagem de células Tipo de Tumor 33 ME-180 carcinoma epidermóide, cervix, metástase para o omaito 34 MS751 carcinoma epidermóide, cervix, metástase para os nodos linfáticos 35 SiHa carcinoma escamoso, cervix 36 JEG-3 coriocarcinoma 37 Caco-2 adenocarcinoma, cólon 38 HT-29 adenocarcinoma, cólon, grau Π moderadamente bem diferenciado 39 SK-CO-1 adenocarcinoma, cólon, ascite 40 HuTu 80 adenocarcinoma, duodeno 41 A*253 carcinoma epidermóide, glândula submandibular 43 FaDu carcinoma de células escamosas, faringe 44 A-498 carcinoma, rim 45 A-704 adenocarcinoma, rim 46 Caki-1 carcinoma de células claras, consistente com o primário renal, metástases para a pele 47 Caki-2 carcinoma de células claras, consistente com o primário raiai 48 SK-NEP-1 tumor de Wilm, efusão pleural 49 SW 839 adenocarcinoma, rim 52 SK-HEP-1 adenocarcinoma, fígado, ascite I 53 A-427 carcinoma, pulmão 54 Calu-1 grau ΠΙ de carcinoma epidermóide, pulmão, metástases para a pleura 55 Calu-3 adenocarcinoma, pulmão, efusão pleural 56 Calu-6 carcinoma anaplástico, provavelmente pulmonar 57 SK-LU-1 adenocarcinoma, pulmão, consistente com grau ΙΠ pouco diferenciado 58 SK-MES-1 carcinoma escamoso, pulmão, efusão pleural 9<Ã ?' 47 QUADRO Π (Cont.) Número HTB da ATTC Linhagem de células Tipo de Tumor 59 SW 900 carcinoma de células escamosas, pulmão 60 EB1 linfoma de Burkitt, maxilar superior 61 EB2 linfoma de Burkitt, ovário 62 P3HR-1 linfoma de Burkitt, ascite 63 HT-144 melanoma maligno, metástases para o tecido subcutâneo 64 Malme-3M melanoma maligno, metástases para o pulmão 66 RPMI-7951 melanoma maligno, metástases para os nodos linfáticos 67 SK-MEL-1 melanoma maligno, metástases para o sistema linfático 68 SK-MEL-2 melanoma maligno, metástases para a pele das coxas 69 SK-MEL-3 melanoma maligno, metástases para os nodos linfáticos 70 SK-MEL-5 melanoma maligno, metástases para os nodos axiliares 71 SK-MEL-24 melanoma maligno, metástases para os nodos 72 SK-MEL-28 melanoma maligno 73 SK-MEL-31 melanoma maligno 75 Caov-3 adenocarcinoma, ovário, consistente com o primário 76 Caov-4 adenocarcinoma, ovário, metástases para as subserosas das trompas de fálópio 77 SK-OV-3 adenocarcinoma, ovário, ascite maligna 78 SW 626 adenocarcinoma, ovário 79 Capan-1 adenocarcinoma, pâncreas, metástases para o fígado 80 Capan-2 adenocarcinoma, pâncreas 81 DU 145 carcinoma, próstata, metástases para o cérebro 82 A-204 Rabdomiossarcoma 85 Saos-2 sarcoma osteogénico, primário 86 Sk-ES-1 osteossarcoma anaplástico versus sarcoma de Ewing, osso 88 SK-LMS-1 leiomiossarcoma, vulva, primário - /. - 48-' QUADRO Π (Cont.) Número HTB da ATTC Linhagem de células Tipo de Tumor 91 SW 684 fibrossarcoma 92 SW 872 lipossarcoma 93 SW 982 sarcoma sinovial da axila 94 SW 1353 condrossarcoma, úmero 96 U-2 0S sarcoma osteogénico, osso, primário 102 Malme-3 fibroblasto da pele 103 KATO III carcinoma gástrico 104 Cate-IB carcinoma embrional, testículos, metástases para os nodos linfáticos 105 Tera-1 carcinoma embrional, malignidade consistente com as metástases para os pulmões 106 Tera-2 carcinoma embrional, malignidade consistente com as metástases para os pulmões 107 SW579 carcinoma da tiróide 111 AN3 CA adenocarcinoma do endométrio, metastático 112 HEC-l-A adenocarcinoma do endométrio 113 HEC-l-B adenocarcinoma do endométrio 114 SK-UT-1 tumor mesodérmico misto, uterino, consistente com o grau 111 de leiomiossarcoma 115 SK-UT-1B tumor mesodérmico misto, uterino, consistente com o grau III de leiomiossarcoma 117 SW 954 carcinoma de células escamosas, vulva 118 SW 962 carcinoma, vulva, metástases para os nodos linfáticos 119 NCI-H69 carcinoma das células pequenas, pulmão 120 NCI-H128 carcinoma das células pequenas, pulmão 121 BT-483 carcinoma ductal, mama 122 BT-549 carcinoma ductal, mama QUADRO Π (Cont) Número HTB da ATTC Linhagem de células Tipo de Tumor 1 123 DU4475 nódulo cutâneo metastático, carcinoma da mama 124 HBL-100 mama 125 Hs 578Bst mama .normal 126 Hs 578T carcinoma ductal, mama 127 MDA-MB-330 carcinoma, mama 128 MDA-MB-415 adenocarcinoma, mama 129 MDA-MB-435S carcinoma ductal, mama 130 MDA-MB-436 adenocarcinoma, mama 131 MDA-MB-453 carcinoma, mama 132 MDA-MB-468 adenocarcinoma, mama 133 T-47D carcinoma ductal, mama, efusão pleural 134 Hs 766T carcinoma, pâncreas, metástases para os nodos linfáticos 135 Hs 746T carcinoma, estômago metástases para a perna esquerda 1 137 Hs 695T melanoma amelanótico, metástases para os nodos linfáticos 138 Hs 683 glioma I 140 Hs 294T Melanoma, metástases para os nodos linfáticos 142 Hs 602 linfoma, cervical 144 JAR coriocarcinoma, placenta 146 Hs 445 linfóide, doença de Hodgkin 147 Hs 700T adenocarcinoma, metástases para o pélvis 148 H4 neuroglioma, cérebro 151 Hs 696 adenocarcinoma primário, desconhecido, metástases para o osso sacro 152 Hs 913T fibrossarcoma, metástases para os pulmões 153 Hs 729 rabdomiossarcoma, perna esquerda 157 FHs 738Lu pulmão, feto normal 158 FHs 173We embrião inteiro, normal 160 FHs 738B1 bexiga, feto normal 161 NIHOVCAR-3 ovário, adenocarcinoma 163 Hs 67 timo, normal QUADRO Π (Cont.) Númeru HTB da ATTC Linhagem dc células Tipo de Tumor 166 RD-ES sarcoma de Ewing 168 ChaGo K-l carcinoma broncogénico, metástases subcutâneas, humano 160 WERI-Rb-1 retinoblastoma 171 NCI-H446 carcinoma das células pequenas, pulmão 172 NCI-H209 carcinoma das células pequenas, pulmão 173 NCI-H146 carcinoma das células pequenas, pulmão 174 NCI-H441 adenocarcinoma papilar, pulmão 175 NCI-H82 carcinoma das células pequenas, pulmão 176 H9 linfoma das células T 177 NC1-H460 carcinoma das células grandes, pulmão 178 NCI-H596 carcinoma adenoescamoso, pulmão 179 NC1-H676B adenocarcinoma, pulmão 180 NC1-H345 carcinoma das células pequenas, pulmão 181 NCI-H820 adenocarcinoma papilar, pulmão 182 NC1-H520 carcinoma de célula escamosas 183 NCI-H661 carcinoma das células grandes, pulmão 184 NCI-H510A carcinoma das células pequenas, origem extrapulmonar, metastático 185 D283 Med meduloblastoma 186 Daoy meduloblastoma 187 D341 Med meduloblastoma 188 AML-193 leucemia monocítica aguda 189 MV4-11 bifenótipo leucémico (a) Anticorpos Anti-Células Tumorais
Um processo correcto para reconhecer um alvo antigénico tipnoral consiste em utilizar um anticorpo que possua afinidade de ligação com o antigénio particular. Há um número bastante grande de anticorpos conhecidos que são dirigidos contra antigénios de tumores sólidos. No quadro I anterior estão enumerados alguns anticorpos antitumorais úteis. No entanto, conforme é facilmente compreensível pelos especialistas na matéria, alguns dos anticorpos enumerados no quadro I não possuem as propriedades bioquímicas adequadas ou podem não possuir uma especificidade tumoral suficiente para serem utilizados terapeuticamente. Como exemplos refere-se o anticorpos MUC8-22 que reconhece um antigénio citoplásmico. Os anticorpos deste tipo irão ser utilizados geralmente apenas nos casos de investigação, tal como sucede nas experiências de pesquisa ou com sistemas modelares.
Dito de uma forma geral, os anticorpos utilizáveis nestes aspectos da presente invenção irão reconhecer preferencialmente antigénios que se encontrem acessíveis sobre a superfície das células e que sejam expressos, preferencialmente ou de forma específica, pelas células tumorais. Tais anticorpos também devem possuir preferencialmente propriedades de elevada afinidade, por exemplo, devem ter uma constante Kj <200 nM e preferencialmente <100 nM e não devem ter uma reactividade significativa com os tecidos normais que servem de suporte à vida, tais como um ou vários tecidos de órgãos seleccionados entre coração, rins, cérebro, fígado, medula óssea, cólon, mama, próstata, tiróide, vesícula biliar, pulmão, glândulas supra-renais, músculos, fibras nervosas, pâncreas, pele ou de outros órgãos ou tecidos que sirvam de sustentáculo à vida no corpo humano. Os tecidos mais importantes de “suporte de vida” para os efeitos da presente invenção, do ponto de vista de uma exígua reactividade, são os tecidos do coração, rins, sistema nervoso central e periférico e do fígado. A expressão “reactividade significativa”, tal como aqui utilizada, designa um anticorpo ou um fragmento de um anticorpo que ao ser aplicado a um tecido particular em condições adequadas para imunoistoquímica irá fazer com que não haja nenhuma contrastação ou haja uma contrastação desprezável apenas com algumas células positivas dispersas por um campo de células quase todas negativas.
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Os anticorpos particulaimente promissores enumerados no quadro I, utilizáveis nos termos da presente invenção, são os que possuam uma selectividade elevada para o tumor sólido. Por exemplo, os anticorpos de ligação ao TAG 72 e à proteína protoncogénica HER-2 que se encontram de forma selectiva sobre as superfícies de muitos cancros da mama, do pulmão e colorrectais (Thor et al., 1986; Colcher et al., 1987; Shepard et al., 1991); os anticorpos MOvl8 e OV-TL3 e os anticorpos que se ligam àproteína do núcleo damucina do leite e o glóbulo de gordura do leite de mulher (Miotti et al, 1985; Burchell et al., 1983); e o anticorpo 9.2.27 que se liga aos antigénios do melanoma de elevado Mr (Reisfeld et al., 1982). Outros anticorpos úteis são os utilizáveis contra a proteína de ligação do folato, sobre a qual se sabe que é expressa de forma homogénea em quase todos os carcinomas ovarianos; os anticoipos contra a família de oncogenes erb que são expressos excessivamente nos carcinomas de células escamosas e na maior parte dos gliomas; e os outros anticorpos sobre os quais se sabe que estão a ser objecto de avaliação preclínica e clínica.
Admite-se que os anticorpos B3, KSI/4, CC49, 260F9, XMMCO-791, D612 e SM3 sejam particularmente adequados para utilização em casos clínicos, em conformidade com protocolos convencionais de ensaios preclínicos praticados na especialidade. O anticorpo B3 (patente de invenção norte-americana n° 5 242 813; Brinkmarm et al., 1991) possui o número HB 10573 de admissão na instituição ‘ATCC’; o anticorpo KSl/4 pode ser produzido conforme descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 975 369; e o anticorpo D612 (patente de invenção norte-americana n° 5 183 756) possui o número HB 9796 de admissão na instituição ‘ATCC’.
Outro processo para se definir um alvo associado a um tumor consiste em recorrer às características das células tumorais em vez de se recorrer à explicação das propriedades
bioquímicas de um antigénio expresso por essas células. Assim sendo, os inventores prevêem que qualquer anticorpo que preferencialmente se ligue a uma célula tumoral enumerada no quadro II possa ser utilizado como componente de ataque de um ligando biespecífico. A ligação preferencial da célula tumoral baseia-se mais uma vez no facto de o anticorpo exibir uma elevada afinidade para a célula tumoral e não possuir uma reactividade significativa com os tecidos ou células normais de apoio à vida, conforme definido antes.
Posto isto, a invenção proporciona diversas metodologias para a geração de um anticorpo utilizável nos métodos de coagulação propícios aqui descritos. Para se gerar um anticorpo específico de uma célula tumoral, poder-se-ia imunizar um animal com uma composição que contivesse um antigénio da célula tumoral e seleccionar, conforme adiante se descreve mais minuciosmente, um anticorpo resultante com especificidade adequada. A composição imunizante pode conter uma preparação purificada ou parcialmente purificada de qualquer dos antigénios enumerados no quadro I; uma composição, tal como uma preparação membranar, enriquecida com qualquer dos antigénios enumerados no quadro I; quaisquer das células enumeradas no quadro Π; ou uma mistura ou uma população de células que contenha qualquer dos tipos de células enumerados no quadro Π.
Como é evidente, independentemente da fonte do anticorpo, na prática da invenção para o tratamento de seres humanos, será preferível garantir antecipadamente que o tumor clinicamente relevante exprime o antigénio seleccionado em última instância. Isto é conseguido por meio de um ensaio razoavelmente rigoroso, implicando a realização de testes, por via antigénica, com uma amostra de tecido tumoral, por exemplo, uma biópsia cirúrgica, ou talvez realizando testes para pesquisa do antigénio disseminado na circulação. Isto pode ser efectuado facilmente por meio de um ensaio imuuológico de pesquisa, tal como um EISLE (ensaio .νϋ. / imunossoTvente ligado a enzimas), em que a afinidade de ligação dos anticorpos de um “banco” de bibiidomas é testada para sc pesquisar a sua reactividade contra o tumor. Os anticorpos que demonstrem uma selectividade e uma afinidade tumorais adequadas são então seleccionados para a preparação dos anticorpos biespecíficos da presente invenção.
Devido ao fenómeno bem conhecido da inteneactividade, está previsto que os anticorpos úteis possam ser o resultado de protocolos de imunização em que os antigénios utilizados originalmente foram obtidos a partir de um animal, por exemplo, um murganho ou um primata, para além daqueles em que os antigénios originais foram obtidos a partir de uma célula humana. No caso de serem utilizados antigénios de origem humana, então podem ser obtidos a partir de uma linhagem de células tumorais humanas, ou podem ser preparados mediante a obtenção de uma amostra biológica proveniente de um paciente particular em questão. Com efeito, são conhecidos os métodos para o desenvolvimento e exploração de anticorpos “feitos por medida” para o tumor do paciente (Stevenson et al., 1990), estando prevista a sua utilização no âmbito da presente invenção. (b) Outros alvos de células tumorais e ligandos de ligação
Para além de serem utilizados anticorpos, também é possível utilizar outros ligandos para encaminhar um agente coagulante para um local de um tumor, por ligação a um antigénio da célula tumoral. No caso dos antigénios de tumores que sejam receptores expressos de forma excessiva (o receptor de estrogénio ou o receptor de FCE), ou receptores mutantes, poder-se--ia utilizar os correspondentes ligandos como agentes de encaminhamento para o ataque.
De um modo análogo à dos ligandos de receptores das células endoteliais, pode haver componentes que são ligados de forma específica ou preferencial às cclulas tumorais. Por exemplo, se um antigénio de um tumor for um receptor expresso em excessivo, a célula tumoral pode ser recoberta com um ligando específico m vivo. Presume-se que o ligando possa ser então atacado quer com um anticorpo contra o ligando quer com uma forma do próprio receptor. Como exemplos específicos destes tipos de agentes de ataque refere-se os anticorpos contra os ligandos TIE-1 ou T1E-2, os anticorpos contra o factor 4 plaquetário e a proteína de ligação para adesão dos leucócitos. 2. Outros alvos patológicos
De acordo com outras variantes, a primeira região de ligação pode ser um componente que se liga a uma molécula destinatária que é específica ou preferencialmente expressa num local patológico diferente de um local de um tumor.
Como exemplos de moléculas destinatárias associadas a outras células afectadas patologicamente refere-se, por exemplo, as moléculas de adesão dos leucócitos, que estão associadas à psoríase; o FCF que está associado à retinopatia diabética proliferativa; o factor 4 plaquetário que está associado ao endotélio activado de diversas doenças; e o FCEV que está associado à doença vascular proliferativa. Pressupõe-se que um animal ou um paciente afectado por uma das doenças anteriormente enumeradas possa beneficiar da indução específica da coagulação no local afectado patologicamente.
As doenças sobre as quais se sabe que têm uma patologia angjodependente, conforme descrito por Klagsbum e Folkman (1990), também podem ser tratadas com os ligandos bi-específicos, tal como aqui descrito. Em particular, para se conseguir obter coagulação no local afectado patologicamente utilizar-se-á um ligando propício da célula endotelial vascular ou um ligando propício do estrema. No momento presente são partieularmente contemplados os tratamentos de HBP, retinopatia diabética, restenose vascular, adesões vasculares, MAV, meningioma, hemangioma, glaucuma neovascular, artrite reumatóide e psoiiase. 3. Alvos celulares da vasculatura associada a uma patologia
As células da vasculatura são elegíveis como alvos utilizáveis na presente invenção. Nestes casos, uma região de ligação do ligando biespecífico irá ser capaz de se ligar a um marcador acessível expresso preferencialmente pelas células endoteliais da vasculatura associada à patologia. A exploração dos marcadores vasculares é possibilitada pela proximidade das células endoteliais vasculares junto à zona patológica e junto aos produtos dos processos fisiológicos locais aberrantes. Por exemplo, as células endoteliais vasculares tumorais são expostas às células tumorais e aos produtos resultantes dos tumores que modificam o perfil fenotípico das células endoteliais.
Sabe-se que as células tumorais elaboram produtos oriundos dos tumores, tais como linfoquinas, monoqumas, factores estimuladores das colónias, fàctores de crescimento e factores angiogénicos que actuam nas células endoteliais vasculares (Kandel et ed., 1991; Folkman, 1985a,b) e nas citoquinas (Burrows et cã., 1991; Ruco et cã., 1990; Borden et cã., 1990) das proximidades. Os produtos tumorais ligam-se às células endoteliais e servem para induzir de forma selectiva a expressão de determinadas moléculas. São estas moléculas induzidas que podem ser atingidas recorrendo à administração do coagulante específico do endotélio tumoral, em conformidade com determinados aspectos da presente invenção. As células endoteliais vasculares nos tumores proliferam a uma velocidade 30 vezes superior à das células de diversos tecidos normais (Denekamp et cã., 1982), sugerindo que os determinantes associados à proliferação também poderiam servir de marcadores para as células endoteliais vasculares dos tumores.
Em determinados casos da presente invenção, o componente de encaminhamento dos ligandos biespecíficos irá ser um componente que possua um grau relativamente elevado de especificidade para a vasculatura do tumor. Estes componentes de encaminhamento podem ser definidos como sendo componentes que se ligam às moléculas expressas sobre o endotélio do tumor, mas que têm fraca ou nenhuma expressão à superfície das células endoteliais normais. Tal especificidade pode ser avaliada por meio de procedimentos convencionais de imunocontrastaçào de secções de tecidos, conforme é perfeitamente conhecido pelos especialistas na matéria.
No entanto, conforme se disse antes, há uma vantagem da presente invenção que tem a ver com o facto de exigência de selectividade não ser tão rigorosa quanto aquela que era necessária nos métodos da técnica anterior, em especial nos métodos em que se recorre às imunotoxinas, uma vez que os efeitos secundários associados aos erros de combate com um agente coagulante irão ser mínimos quando comparados com aqueles que resultam dos erros de combate com uma toxina.
Posto isto, como princípio geral propõe-se que as moléculas que irão ser atacadas utilizando os ligandos ou os anticorpos biespecíficos da presente invenção são aquelas que são expressas na vasculatura tumoral com um nível mais elevado do que nas células endoteliais normais. (a) Marcadores de células endoteliais vasculares na patologia
As moléculas sobre as quais se sabe que são expressas preferencialmente à superfície das células endoteliais vasculares num ambiente ou num local de uma patologia recebem aqui a designação de “marcadores naturais de células endoteliais vasculares associada à patologia”.
Utiliza-se esta designação por razões de simplicidade para identificar os componentes de células cndoteliois que são expressos em doenças associadas a uma proliferação das células endoteliais ou a uma angiogénese maior ou inconveniente. Como exemplo particular refere-se o caso dos componentes de células endoteliais que são expressos in situ em resposta aos factores que derivam de tumores. Estes componentes também recebem a designação de “marcadores de células endoteliais de tumores induzidos naturalmente”.
Quer o FCEV/FPV (factor de crescimento endotelial vascular/factor da permeabilidade vascular) quer os componentes do FCF (factor de crescimento dos fibroblastos) pertencem a famílias que se encontram concentradas na vasculatura do tumor ou sobre ela. Assim sendo, os receptores correspondentes constituem um alvo potencial para o ataque na vasculatura tumoral. Por exemplo, sabe-se que o número de receptores de FCEV aumenta por extemalização nas células endoteliais dos tumores, ao contrário das células endoteliais dos tecidos normais, quer nos roedores quer nos seres humanos (Thieme et al., 1995). Isto é possivelmente uma consequência da hipoxia - uma característica do microambiente tumoral (Leith et al., 1992). O número de receptores de FCF também aumenta por extemalização para o triplo nas células endoteliais expostas à hipoxia e por tal motivo admite-se que esse número aumente por extemalização nos tumores (Bicknell e Hanis et al., 1992). O número de receptores (endoglina) do F3CT (factor β de crescimento transformante) nas células endoteliais aumenta por extemalização nas células em divisão, constituindo outro alvo. Um dos inventores da presente invenção descobriu que a endoglina aumenta por extemalização nas CEUVH (o mesmo que HUVEC) activadas e em divisão, sendo é fortemente expressa em tecidos humanos sobre as células endoteliais em locais de neovascularização, incluindo um grande conjunto de tumores sólidos e de placentas fetais. Pelo contrário, as células endoteliais da maior parte de diversos tecidos de adultos, de tipo não maligno, incluindo lesões pre-ncoplásicas, contêm muito pouca ou mesmo nenhuma endoglina. Acima de tudo, o que é mais importante, é o facto de se considerar que a expressão da endoglina está correlacionada com a evolução neoplásica mamária, conforme comprovado pela ligação de níveis diminutos de anticorpos CET-4 e CET-11 aos tíbroadenomas benignos e aos carcinomas nas suas fases iniciais e também pelos elevados níveis de ligação destes anticorpos aos carcinomas intraductais, na sua fase mais avançada, e aos carcinomas invasivos. Há outros marcadores naturais de células endoteliais vasculares, associados a patologias, entre os quais se salienta as moléculas ΊΊΕ, M-1ACV, selectina P, selectina E, integrina 0^3, pleiotropina e endossialina, podendo qualquer destes marcadores ser propício utilizando a invenção. (b) Marcadores endoteliais vasculares induzíveis por dtoquinas
Devido à natureza dos processos patológicos, que fiequentemente têm como consequência disfunções localizadas dentro do corpo, há métodos disponíveis para se manipular o local da patologia deixando simultaneamente outros tecidos relativamente incólumes. Isto é particularmente significativo nos tumores malignos e benignos que existem como entidades distintas no interior do corpo de um animal. Por exemplo, é possível manipular o ambiente tumoral para se criar outros marcadores que sejam específicos para as células endoteliais vasculares tumorais. Estes métodos simulam geralmente aqueles que ocorrem natnralmente nos tumores sólidos e implicam também a produção local de agentes sinalizadores, tais como os factores de crescimento ou as citoquinas, que induzem a expressão específica de determinadas moléculas à superfície das células endoteliais vasculares das proximidades. V'\ 60 — O grupo de moléculas cuja expressão pode ser induzida artificialmente à superfície das células cndoteliais vasculares num ambiente tumoral ou patológico recebe aqui a designação de “grupo de marcadores de células endoteliais induzíveis” ou, dito de fornia específica, grupo de marcadores de células endoteliais tumorais induzíveis. Esta designação tem por objecto identificar os marcadores que são induzidos artifícialmente, isto é, induzidos em consequência da manipulação feita por uma pessoa, em vez daqueles que são induzidos como parte do processo de desenvolvimento do tumor ou da patologia num animal. Λ designação “marcador induzível”, tal como definida antes, é utilizada para se fazer uma referência simples no contexto da presente memória descritiva,, não obstante o facto de também serem induzidos os “marcadores naturais”, v.g., por agentes derivados de tumores.
Assim sendo, embora não sejam necessárias para a prática da invenção, há técnicas que suscitam de forma selectiva os alvos antigénicos endoteliais vasculares da superfície da vasculatura associada à patologia, que podem ser, se desejado, utilizadas em conjunto com a invenção. Tais técnicas implicam a manipulação da expressão antigénica, ou a apresentação da superfície da célula, de tal modo que um antigénio propício seja expresso ou passe a ficar disponível sobre a superfície da vasculatura associada à patologia e não seja expresso ou não fique acessível ou disponível para ligação ou então, se isso acontecer, então que o seja pelo menos com menor intensidade, sobre a superfície do endotélio normal.
Os marcadores endoteliais tumorais podem ser induzidos por citoquinas derivadas de tumores (Burrows et al., 1991; Ruco et al, 1990) e por factores angiogénicos (Mignatti et al., 1991). Como exemplos de marcadores da superfície das células que é possível induzir de forma específica no endotélio do tumor e que é possível atacar depois utilizando um ligando de coagulação biespecífico, conforme é privilégio da presente invenção, refere-se os enumerados no quadro ΠΙ (Bevilacqua et al., 1987; Dustin et al., 1986; Osbom et al., 1989; Collins et al., 1984).
Também estão indicados no quadro ΠΙ os mecanismos para a indução dos marcadores propostos, a citoquina indutora ou “citoquina intermediária”, tal como a IL-1 e o IFN-γ; e o tipo de células leucocitárias e de moléculas associadas acdvadoras das citoquinas, de cujo ataque resulta a libertação da citoquina. Para a indução de um marcador específico é geralmente necessário um anticorpo biespecífico “indutor de citoquinas” ou “indutor de antigénios”. liste anticorpo irá induzir de forma selectiva a libertação da citoquina adequada no local do tumor, induzindo pois selectivamente a expressão, pelas células endoteliais vasculares, do antigénio propício desejado. O anticorpo biespecífico vai fazer a interligação de células da massa tumoral e dos leucócitos produtores de citoquinas, activando assim os leucócitos para que libertem a citoquina. A preparação e a utilização de anticorpos biespecíficos, tais como os enumerados, pressupõe em parte o facto de previamente se to* comprovado que os anticorpos de interligação que reconhecem as CD3, CD14, CD16 e CD28 suscitam uma produção de citoquinas de forma selectiva ao serem interligados com o segundo antigénio (Qian et al., 1991). No contexto da presente invenção, uma vez que apenas os leucócitos que tenham ficado interligados com êxito às células tumorais irão ser activados no sentido de libertarem a citoquina, então a libertação da citoquina irá ficar limitada ao local do tumor. Assim, a expressão do marcador desejado, tal como a selectina E, irá ficar igualmente limitada ao endotélio da vasculatura do
V 62·
QUADRO ΙΠ
POSSÍVEIS ALVOS VASCULARES INDUZÍVEIS MOLÉCULAS DE ACRÓNIMO SUBTIPOSALIASES C1TOQUINAS LEUCÓCITOS QUE MOLÉCULAS DE LEUCÓCITOS CÉLULAS (FAMÍLIA INDUTORAS PRODUZEM TAIS QUE AO SEREM INTERLIGADAS ENDOTF.IJALS MOLECULAR) CITOQUINAS PC* ANTICORPOS INDUZÍVEIS MONOCLONAEACnVAMAS CÉLULASPARAPRODU23R CITOQUINAS motócula-l de ELAM.-1 - ILrl CD14 adesão dut> selectina E (selectina) FaNT(ouTNF<x) Fpsrr(aiTNFP) maoóâgps CD14 lflirrSfftnR qryWpjink [endotaxinabacteriana ngrtódtnK FcRpaialgE rodécula-llOde (endotocdna mmnritns CD14 molécula-1 de adesão das células bacteriana) maoáÊgoe CD14 adesão de M-1ACV induavas(lNCAM-l 10] IDl.FaNT mastócitos FcRparalgE células vasculares (ÊnnUade F|JNT,IL4 célulasTauxflÊoes CD2,CD3,CD28 mmnoglobinas) FNT oâulasAN (ou NK) FcRpara^3(CD16) IL-l,FaNT ιτ¥τηήτ3ίηκ CD14 molécula-1 — (endotoxina bacteriana] maaófàgps CD15 de adesão M-1AIC (família de FPNT,IFN-y mastócitos FcRparalgE intocdular imunoglobulinas) câulas Tauxiliares CD2,CD3,CD28 oâulasAN FcRparaIgG(CDlQ agente para agente agente MEL-14 ILrl monódtos CD14 molécula-1 de adesão LAM-1 (mmganho) FaNT maoóíãgos CD14 das leucócitos [endotoxinabactenana mastócitos FcRparalgE antigénioda dasell HLA-DR IFN-γ câulas T auxiliares CD2,CD3,CD28 do amplexo dLA-DP -humano pmrapalde HLA-DQ hi^ncnmpdiHlúWfe rA -rrmrfflnho oâulasAN FcRparaIgG(CD16) (£ É importante observar que a partir dos possíveis marcadores induzíveis enumerados no quadro ΙΠ, a selectina E e os antigénios de Classe Π do CPH, tais como HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ (Collins et al., 1984), são de longe os alvos mais preferenciais utilizáveis em termos de casos clínicos. Parece que as outras moléculas de adesão indicadas no quadro ΙΠ são expressas em graus variáveis em tecidos normais, geralmente em órgãos linfóides e no endotélio, fazendo com que o ataque contra elas talvez seja adequado apenas em modelos de animais ou nos casos em que a sua expressão nos tecidos normais possa ser inibida sem efeitos secundários significativos. É preferível o encaminhamento de selectina E ou de um antigénio de Classe Π do CPH, na medida em que a expressão destes antígénios irá ser provavelmente a forma mais directa de favorecer a selectividade no endotélio associado ao tumor.
Selectina E 0 encaminhamento de um antigénio que não seja expresso sobre as superfícies do endotélio normal é a forma mais directa dos métodos de indução. A selectina E é uma molécula de adesão que não é expressa na vasculatura endotelial normal ou noutros tipos de células humanas (Cotran et al., 1986), mas que pode ser induzida sobre a superfície de células endoteliais através da acção de citoquinas, tais como a IL-1, o FNT, a linfotoxina e a endotoxina bacteriana (Bevilacqua et al., 1987). Não é induzida pelo IFN-γ (Wu et al., 1990). Assim sendo, a expressão da selectina E pode ser induzida selectivamente no endotélio tumoral mediante a administração selectiva de uma dessas citoquinas, ou mediante a utilização de uma composição que determine a libertação selectiva dessas citoquinas no ambiente tumoral.
Os anticorpos biespecíficos constituem um exemplo de uma composição capaz de determinar a libertação selectiva de uma ou várias das citoquinas anteriormente enumeradas ou de outras citoquinas adequadas no local do tumor, mas não em mais nenhuma parte do corpo. Tais anticorpos biespecíficos recebem aqui a designação de “anticorpos indutores de antígénios” e são, como é evidente, distintos de quaisquer outros anticorpos biespecíficos da invenção que possuam componentes de ataque e de coagulação. Os anticorpos indutores dc
y-V // Λ •64 antigénios são concebidos para interligarem células efectoras dtoquimcas, tais como as linhagens de células de monócitos/macrófagos, as células T e/ou as células AN ou os mastócitos, com células tumorais da massa tumoral sólida atacada. Esta interligação poderia efectuar então a libertação da citoquina que se encontra localizada no local de interligação, isto é, no tumor.
Os anticorpos indutores de antigénios eficazes reconhecem, por um lado, um antigénio seleccionado da superfície da célula tumoral (v.g., os indicados no quadro I) e reconhecem, por outro lado. um antigénio seleccionado “activador de citoquinas” sobre a superfície de um φ tipo seleccionado de células leucocitárias. A designação “antigénio activador de citoquinas” é aqui utilizada para identificar qualquer uma das diversas moléculas conhecidas sobre as superfícies de leucócitos que favoreçam, quando ligados por uma molécula efectora, tal como um anticorpo ou um seu fragmento ou um agente que ocorra naturalmente ou um seu análogo sintético, quer seja um factor solúvel quer seja um contrarreceptor ligado a uma membrana sobre outra célula, a libertação de uma citoquina pela célula leucocitáiia. Como exemplos de moléculas activadoras de citoquinas refere-se as CD14 (o receptor do LPS) e as FcR para IgE, que irão activar a libertação de EL-1 e de FaNT; e as CD16, CD2 ou CD3 ou CD28 que irão activar respectivamente a libertação de IFN-γ e de FpNT.
Uma vez introduzidos na corrente sanguínea de um animal portador de um tumor, tais anticorpos biespecíficos indutores de antigénios irão ligar-se às células tumorais dentro do tumor, vão interligar essas células tumorais com as células efectoras, v.g., monócitos/macrófagos, que se tenham infiltrado no tumor e vão realizar depois a libertação selectiva da citoquina dentro do tumor. No entanto, o que é importante é que sem ter sido efectuada a interligação do tumor e dos leucócitos, o anticorpo indutor dos antigénios não irá realizar a libertação da citoquina Assim, não haverá nenhuma libertação de citoquinas nas partes do corpo distantes do tumor e por tal motivo a expressão das moléculas induzidas pelas citoquinas, a selectma E, irá ocorrer apenas dentio do endotélio do tumor. São conhecidos diversos antigénios úteis “activadores de citoquinas” que ao serem interligados com um anticorpo biespedfico adequado, irão dar origem à libertação de citoquinas pelos leucócitos interligados. O alvo geralmente preferido para este efeito é constituído pelas CD14 que existem sobre a superfície de monócitos e de macrófagos. Quando uma CD14 se encontra interligada estimula os monócitos/macrófagos a libertarem a DL-1 (Schutt et al., 1988; Chen et al., 1990) e possivelmente outras citoquinas que por sua vez estimulam o aparecimento da selectina E na vasculatura das proximidades. Outros alvos possíveis para interligação no âmbito da indução da selectina E e do encaminhamento compreendem as FcR para IgE, existentes nos mastócitos; as FcR para IgG (CD16), existentes nas células AN; e também as CD2, CD3 ou CD28, existentes sobre as superfícies das células T. Entre estas, é geralmente preferível o ataque com a CD 14 devido à prevalência relativa da infiltração de monócitos/ /macrófagos dos tumores sólidos, em contraposição a outros tipos de células leucocitárias.
De acordo com um caso exemplificativo de indução, injecta-se um animal portador de um tumor sólido com um anticorpo biespecífico anti-CD 14/antitumoral (Fac’ - Fac’, o mesmo que Fab’ - Fab’) (tal como o anticorpo anti-CE (o mesmo que anti-CEA), o anticorpo 9.2.27 contra os antigénios OV-TL3 do melanoma de elevado Mr (peso molecular) ou os anticorpos MOv 18 contra os antigénios assodados ao ovário). O anticorpo localiza-se no tumor, devido à sua actividade de ligação tumoral, e depois activa os monócitos e os macrófagos no tumor por interligação com os seus antigénios CD 14 (Schutt et al., 1988; Chen et al., 1990). Os monócitos/macrófagos activados têm actividade tumoiicida (Palleroni et al., 1991) e libertam IL-1 e FNT que induzem rapidamente os antigénios de selectina E nas células endoteliais vasculares do tumor (Bevilacqua et al., 1987; Pober et al., 1991).
Antigénios de Classe II do CPH O segundo gtupo preferido de marcadores induzíveis com aplicação na presente invenção são os antigénios de Classe Π do CPH (Collins et ai., 1984), incluindo os HLA-DR, HLA-DP e HLA-DQ. Os antigénios de Classe Π são expressos nas células endoteliais vasculares na maior parte dos tecidos normais de diversas espécies, incluindo os seres humanos. Estudos realizados in vitro (Collins et al., 1984; Daar et al., 1984; 0’Connel et aJ., 1990) e in vivo (Groenewegen et al., 1985) demostraram que a expressão dos antigénios de Classe Π pelas células endoteliais vasculares exige a presença permanente do IFN-γ que é produzido pelas células Thi e em menor intensidade pelas células AN e pelas células T CD8+.
Os antigénios de Classe Π do CPH não são exclusivos das células endoteliais vasculares e também são expressos de forma constitutiva nas células B, nas células T activadas, nas células de linhagens de monócitos/macrófagos e em determinadas células epiteliais, tanto nos murganhos (Hammerling, 1976) como nos seres humanos (Daar et cd., 1984). Devido à expressão dos antigénios de Classe Π do CPH no endotélio “normal”, a sua subordinação não é tão directa como no caso da selectina E. No entanto, faz-se com que seja possível a indução e a subordinação dos antigénios de Classe Q do CPH utilizando conjuntamente um imunossupressor, tal como a ciclosporina A (CsA), que tem a capacidade de inibir eficientemente a expressão das moléculas de Classe Π em tecidos normais (Groenewegen et al., 1985). A CsA actua evitando a activação das células T e das células AN (Groenewegen et al., 1985; DeFranco, 1991), reduzindo assim os níveis básicos de IFN-γ abaixo dos valores necessários para se manter a expressão de Classe Π no endotélio. Há outras ciclosporinas relacionadas com a CsA, incluindo as ciclosporinas A, B, C, D, G e outras que tais, que também possuem acção imunossupressora e que vão demonstrar naturalmente a sua capacidade para suprimirem a expressão de Classe Π. Outros agentes que eventualmente também podem vir a ser úteis são o agente FK506 e a rapamicina.
Assim, a prática da modalidade de indução e subordinação de Classe Π do CPH exige um pretratamento do animal portador do tumor com uma dose de CsA ou com outro agente imunossupressor de Classe II que seja eficaz para suprimir a expressão de Classe II. Mo caso da CsA, a dose irá estar tipicamente compreendida entre cerca de 10 e cerca de 30 mg/kg de peso corporal. Uma vez suprimidos nos tecidos normais, os antigénios de Classe Π podem ser então induzidos sclcctivamente no endotélio do tumor, mais uma vez mediante a utilização de um anticorpo bicspecifico.
Neste caso, o anticorpo biespecífico indutor de antigénios irá ter especificidade para um marcador das células tumorais e para um antigénio activador existente sobre a superfície de uma célula efectora que seja capaz de induzir a produção do IFN-γ. Tais células efectoras são geralmente as células T auxiliares (Ta, o mesmo que Th) ou as células aniquiladoras naturais (AN, o mesmo que NK). Nestes casos, é necessário que as células T, ou então as células AN se forem utilizadas as CD16, estejam presentes no tumor para produzirem a citoquina intermediária para que seja conseguida a expressão do antigénio de Classe Π utilizando o IFN-γ, mas não seja conseguida com as outras citoquinas. Assim, para a prática deste aspecto da invenção, será desejável seleccionar as CD2, CD3, CD28, ou mais preferencialmente as CD8, como antigénio activador das citoquina para o ataque pelo anticorpo biespecífico indutor dos antigénio.
As células T que têm de ser activadas no tumor são as que estão adjacentes à vasculatura, uma vez que esta é a região mais acessível às células e é também a região onde o anticorpo biespecífico irá ficar mais concentrado. Assim, as células T activadas devem segregar o IFN-γ que induz os antigénios de Classe Π na vasculatura tumoral adjacente.
Presentemente é preferível a utilização de um anticorpo biespecífico (Fac’ - Fac’, o mesmo que Fab' -Fab’) que tenha um braço dirigido contra um antigénio tumoral e o outro braço dirigido contra uma CD28. Este anticorpo irá interligar os antigénios CD28 nas células T no tumor, tendo sido demonstrado que ao ser combinado com um segundo sinal (fornecido, por exemplo, pela EL-1 que é vulgarmente segregada pelas células tumorais (Burrows et al., 1991; Ruco et al., 1990)), activa as células T através de um circuito não imbível pela CsA independente do Ca2+ (Hess et al., 1991; June et al., 1987; Bjomdahl et al., 1989). A preparação de anticorpos contra diversas moléculas activadoras das citoquinas também é bem conhecida na especialidade. Por exemplo, a preparação e a utilização de anticorpos monoclonais anti-CD14 e anti-CD28, com capacidade para induzirem a produção de citoquinas pelos leucócitos, foi já descrita por diversos laboratórios (compilados por Schutt et al., 1988; Chen et al., 1990, e June et al., 1990, respectivamente). Além disso, também é conhecida a preparação de anticorpos monoclonais que vão estimular a libertação de citoquinas pelos leucócitos através de outros mecanismos e de outros antigénios activadores (Clark et al., 1986; Geppert et al., 1990).
Ainda de acordo com outras variantes, os inventores prevêem uma solução alternativa para suprimir a expressão de moléculas de Classe Π e para suscitar de forma selectiva a expressão de moléculas de Classe Π no local do tumor. Esta solução, que evita a utilização da CsA e de um anticorpo activador biespecífico, tira partido do facto de a expressão das moléculas de Classe Π poder ser inibida eficientemente mediante a supressão da produção de IFN-γ pelas células T, v.g., mediante a utilização de um anticorpo anti-CD4 (Street et al., 1989). Utilizando esta variante, a produção de IFN-γ é inibida pela administração do anticorpo anti-CD4, dai resultando a supressão geral da expressão de Classe Π. A Classe fl é então induzida apenas no local do tumor, v.g., utilizando células T específicas do tumor que apenas são activáveis dentro do tumor.
Nesta modalidade de tratamento, de um modo geral, tratar-se-á previamente um animal ou paciente humano com uma dose de anticorpos anti-CD4 que seja eficaz para suprimir a produção de IFN-γ e para assim suprimir a expressão das moléculas de Classe Π. Anlevc-sc que as doses eficazes estejam compreendidas, por exemplo, entre cerca de 4 e cerca de 10 mg/kg de peso corporal. Depois de suprimida a expressão de Classe Π, preparar-se-á e introduzir-se-á então na corrente sanguínea um clone de células T produtor de IFN-γ (v.g., TH1 ou linfócitos T citotóxicos, LTC) específico para um antigénio expresso sobre a superfície das células tumorais. As células T localizam-se na massa tumoral devido à sua capacidade de reconhecimento do antigénio e após tal reconhecimento libertam então o IFN-γ. Deste modo, a libertação de citoquinas é mais uma vez confinada ao tumor, limitando assim a expressão de moléculas de Classe Π na vasculatura do tumor. O clone de células T produtor de IFN-γ pode ser obtido a partir do sangue periférico (Mazzocchi et al., 1990), constituindo no entanto uma fonte preferida a própria massa tumoral (Fox et ai, 1990). O processo presentemente preferido para a preparação de um tal clone de células T consiste em remover uma parte da massa tumoral de um paciente; isolar células, recorrendo à digestão com colagenase, se necessário; efectuar o enriquecimento em leucócitos de infiltração tumoral, recorrendo à centrifugação por gradiente de densidade, seguindo-se o exaurimento de outros subconjuntos de leucócitos, v.g., por tratamento com anticorpos específicos e com o complemento; aumentando-se depois o número de leucócitos de infiltração tumoral in vitro para se obter o clone produtor de IFN-γ. Este clone irá ser necessariamente compatível, sob o ponto de vista imunológico, com o paciente, e por tal motivo deve ser bem tolerado pelo paciente. ;<r s >·<
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Também se apresenta como proposta a hipótese de serem obtidos benefícios particulares seleccionando ainda um clone importante de células T produtoras dc IFN-γ a partir dos leucócitos cujo número foi aumentado, mediante a determinação do padrão de secreção de citoquinas de cada um dos clones em cada 14 dias. No final deste procedimento, os clones em repouso irão ser estimulados por via mitogénica ou antigénica durante cerca de 24 horas, sendo então investigados os sobrenadantes da cultura, v.g., recorrendo ao protocolo específico de EISLE em sanduíche (Cherwinski et al, 1989), para se procurar a presença de IL-2, IFN-γ, IL-4, DL-5 e IL-10. Serão seleccionados os clones que segreguem níveis elevados de IL-2 e IFN-γ, que constituem o padrão característico de secreção de citoquinas dos clones ΤΗι· A especificidade tumoral irá ser confirmada recorrendo aos ensaios de proliferação.
Além do mais, será preferível utilizar como anticorpo anti-CD4 um Fac (o mesmo que Fáb) anti-CD4, uma vez que irá ser eliminado do corpo em menos de 24 horas após a injecção e por isso não irá provocar a supressão dos clones de células T que reconhecem o tumor, que venham a ser administrados subsequentemente. A preparação de clones de células T possuidores de especificidade tumoral é genericamente conhecida na especialidade, conforme exemplificado pela produção e pela caracterização de clones de células T a partir de linfócitos infiltrardes de tumores de melanomas sólidos (Maeda et al., 1991). A utilização de quaisquer dos métodos de supressão-indução de Classe Π do CPH irá proporcionar provavelmente outros benefícios devido ao facto de os anticorpos anti-Classe Π injectados por via intravenosa não chegarem a alcançar as células epileliais ou os monócitos/ /macrófagos em órgãos normais para além do fígado e do baço. Isto deve-se presumivelmente ao lacto de o endotélio vascular na maior parte dos órgão normais ser muito denso, sem aberturas de passagem, tal como sucede no fígado e no baço, tendo os anticorpos, por esse motivo, de se difundir através das membranas pavimentares para chegarem às células positivas de Classe II. Além disso, é improvável que qualquer eliminação de células B que eventunlmente possa ocorrer, v.g., a seguir à interligação, coloque um problema significativo, uma vez que estas células são reconstituídas a partir de progenitores negativos de Classe Π (Lowe et al., 1986). A própria aniquilação das células B, tal como sucede nos pacientes com linfoma B, não origina nenhum prejuízo grave (Vitetta et al., 1991).
Dito dc forma abreviada, embora as composições e os anticorpos da presente invenção para coagular tumores sejam elegantemente simples e não exijam a indução de antigénios para serem funcionais, está prevista também a utilização combinada de um anticorpo biespecífico indutor de antigénios, conjuntamente com a presente invenção. De um modo geral, tais anticorpos poderiam ser administrados antes dos ligandos de coagulação biespecíficos da presente invenção.
Em termos gerais, os tumores mais “imunogénicos” poderiam ser mais convenientes para a solução proposta de Classe Π do CPH envolvendo, v.g., a interligação das células T no tumor através de um anticorpo biespecífico anti-CD28/anti-tumor, uma vez que estes tumores são mais provavelmente infiltrados pelas células T, o que constitui um pré-requisito para que este método seja eficaz. Como exemplos de tumores sólidos imunogénicos refere-se os seleccionados entre carcinomas renais, melanomas, um número diminuto de cancros da mama e do cólon e também possivelmente os cancros pancreáticos, gástricos, hepáticos, pulmonares e gliais. Estes tumores recebem a designação de “imunogénicos” porque há provas de suscitarem uma resposta imunitária no hospedeiro e descobriu-se que são sensíveis à imunoterapia celular (Yamaue et al., 1990). No caso dos melanomas e dos grandes cancros intestinais, os anticorpos mais preferíveis para utilização em tais casos seriam os anticorpos B72.3 (anti--TAG-72) e PRSC5/PR4C2 (antí-Lewis a) ou 9.2.27 (antigénio and-melanoma de elevado Mr).
Para a maior parte dos tumores sólidos de todas as origens, seria mais conveniente a forma de abordagem com o anti-CD 14 em que sc reconrc a um intermediário macrófago/monócito. Isto deve-se ao facto de a maior parte dos tumores serem ricos em macrófagos. Como exemplos de tumores ricos em macrófagos refere-se a maior parte dos carcinomas da mama, do cólon e dos pulmões. Como exemplos de anticorpos antitumorais preferidos, utilizáveis em tais casos, poder-se-ia indicar os anticorpos anti-HER-1, B72.3, SM-3, HMFG-2, e SWA11 (Smith et al., 1989). (c) Marcadores induzíveis pelos coagulantes
Os coagulantes, tais como a trombina, o Factor IX/EXa, o Factor X/Xa, a plasmina e as metaloproteinases, tais como as colagenases intersticiais, as estromelisinas e as gelatinases, também induzem determinados marcadores. Em particular, a selectina E, a selectina P, o FCDP e a M-l AIC são induzidos pela trombina (Sugama et cã., 1992; Shankar et al., 1994).
Assim, para esta indução, utilizar-se-á um anticorpo biespecífico anticoagulante/ /antitumoral. O anticorpo irá localizar-se no tumor graças à sua actividade de ligação ao tumor. O anticorpo biespecífico irá então concentrar o coagulante, v.g., a trombina, no tumor, daí resultando a indução da selectina E e da selectina P nas células endoteliais vasculares do tumor (Sugama et al., 1991; Shankar et al., 1994).
Em alternativa, o encaminhamento de factor tecidual truncado para as células tumorais ou para o endotelio irá induzir a deposição de trombina dentro do tumor. A medida que a trombina se vai depositando, a selectina E e a selectina P irão sendo induzidas nas células endoteliais vasculares do tumor. (d) Anticorpos para os marcadores das células endoteliais vasculares
Uma via directa para se reconhecer um alvo de vasculatura associada a lima patologia, quer seja induzido no ambiente natural quer seja obtido por meios artificiais, consiste em recorrer à utilização de um anticorpo que tenha afinidade de ligação para o receptor, molécula ou antigénio particular da superfície da célula. Isto inclui os anticorpos dirigidos contra todos os componentes da superfície das células sobre os quais se sabe que se encontram presentes, v.g., sobre as células endoteliais vasculares dos tumores, inclui também aqueles que são induzidos ou expressos excessivamente em resposta a factores derivados dos tumores e inclui também aqueles que são induzidos a seguir à manipulação feita pelos seres humanos. O quadro IV e o quadro V agrupam de forma resumida os anticorpos úteis e as suas propriedades.
QUADRO IV
RESUMO DOS PADRÕES DE CONTRASTAÇÃO DA VASCULATURA DE DETERMINADOS ANTICORPOS PARA A VASCULATURA DE TUMORES HUMANOS
Anticorpo Ant^énio Referência % de tipos de tumores (contrastados) % de vasos de tumores (contrastados) Reactividade do vaso normal anti-vWF VIIIRAg 100 100 forte em todos FB5 endosãalina JtetàgetaL 30 10-20 órgãos linfóides TP3 proteína antigénica relacionada como osteossarcoma de 80 kDa Bruland 50 10-30 forte nos VS pequenos BC-1 isoforma de fibranectina Zardi 60 10-30 nenhum TV-1 fibronectina Epstan 100 100 forte em todos LM 609 receptor de vitronectina cxv-Pc Cheneoh 85 70-80 média em todos CET11 endoglina Thorpe;_ 100 100 fraca na maioria CET 110 VEGF Thorpe, 100 100 fraca na maioria
QUADRO V
COMPARAÇÃO DE AcM ‘ ΑΝΤΊ-EC’ EM TUMORES HUMANOS
Tipo de Tumor n CET 110 CET 11 FB-5 TP-3 BC-1 TV-1 LM 609 DIGESTIVO Gastrointestinal 9 -H- -H- +— ++ + ++ -H- Parótida 3 -H- ++ - ++ (pequeno) - ND ND REPRODUTOR Mama 1 + ++ - ND -H- ++ - Ovário 4 ++ ++ - ++(pequeno) -H- ++ + Útero 2 -H- ++ - ++ ++ + RESPIRATÓRIO Pulmão 3 ++ ++ + ND ++ ++ + UNPÓIDE Hodgkins 2 ++ ++ - + - -h+t
Outros dois anticorpos que é possível utilizar na presente invenção são os que foram descritos por Rettig ei al. (1992) c Wang et cã. (1993) e que são dirigidos contra antigénios não congéneres de função desconhecida expressos na vasculatura dos tumores humanos, mas não na maior parte dos tecidos normais.
Também é possível utilizar na presente invenção o anticorpo descrito por Kim et al. (1993), particularmente devido ao facto de este anticorpo inibir a angiogénese e suprimir o crescimento tumoral in vivo.
Também é possível utilizar anticorpos sobre os quais nunca antes se tenha demonstrado que sejam específicos para os tumores humanos. Por exemplo, Venkateswaran et cd. (1992) descreveram a produção de diversos AcM anti-FCF. Xu et al. (1992) desenvolveram e caracterizaram um painel de 16 isoformas e anticorpos policlonais e monoclonais, específicos de domínios, contra as isoformas dos receptores de FCF (flg). Massoglia et al. (1987) também estudaram diversos AcM contra o FCF. (e) Geração de anticorpos para a vasculatura das patologias
Para além de se utilizar um anticorpo conhecido, do tipo dos anteriormente descritos e outros conhecidos e publicados na literatura científica, também é possível gerar um anticorpo novo recorrendo a procedimentos convencionais de imunização, conforme adiante se descreve mais minuciosamente. Para se gerar um anticorpo contra um antigénio de marcador vascular associado à patologia, poder-se-ia imunizar um animal com uma composição imunogénica que contivesse o antigénio Essa composição pode ser uma preparação membranar que contenha o antigénio ou que tenha sido enriquecida com esse antigénio; uma forma relativamente purificada do antigénio, por exemplo, uma forma isolada a paiiii de células ou membranas; uma forma altamente purificada do antigénio, por exemplo, obtida mediante a aplicação de diversos passos de purificação utilizando, v.g., um extracto antigénico natural ou uma forma recombinante do antigénio, obtida a partir de uma célula hospedeira recombinante. A presente invenção ainda proporciona outros métodos para a geração de um anticorpo contra um antigénio presente nas células endoteliaís da vascuiatura associada à patologia, sendo tais métodos utilizados convenientemente mesmo quando a identidade bioquímica do antigénio seja desconhecida Tais métodos são exemplificados através da geração de um anticorpo contra as células endoteliais da vascuiatura do tumor. Uma primeira via para se conseguir gerar um anticorpo, conforme se disse, consiste em utilizar uma preparação de células endoteliais vasculares obtidas a partir do local do tumor de um animal ou de um ser humano. O especialista irá simplesmente imunizar um animal experimental com uma preparação de tais células e irá recolher os anticorpos assim produzidos. A forma mais útil deste método é o caso em que são seleccionados subsequentemente anticorpos específicos, do tipo que é possível obter utilizando a tecnologia convencional dos hibrídomas e a tecnologia de pesquisa em presença de células endoteliais da vascuiatura tumoral.
Um aperfeiçoamento do método anterior é a possibilidade de se simular in vitro o fenómeno da vascuiatura tumoral, não sendo necessária a purificação celular. Ao ser utilizado este método, as células endoteliais são sujeitas a produtos derivados dos tumores, como poderia eventualmente ser obtido a partir de meios condicionados pelos tumores, em cultura celular, em vez da prática num animal Este método implica geralmente a estimulação das células endoteliais com o meio condicionado pelo tumor e a utilização, como imunogénios, das células endoteliais estimuladas, para se preparar um conjunto de anticorpos. Repetindo, os anticorpos específicos devem ser seleccionados, vg., utilizando a tecnologia convencional dos anticorpos monoclonais ou utilizando outras técnicas, tais como as técnicas combinatórias de bancos de fagomídeos da imunoglobulina, preparados a partir de ARN isolado a partir do baço do animal imunizado. Poder-se-ia seleccionar o anticorpo específico que reconhecesse preferencialmente o endotélio vascular estimulado pelo tumor e reagisse com as células endoteliais associadas ao tumor mais fortemente do que com os tecidos humanos de pessoas adultas.
As células endoteliais estimuladas, com possibilidade de virem a ser utilizadas neste contexto, compreendem, por exemplo, as células endoteliais da veia umbilical humana (EVUH, o mesmo que HUVE), as células endoteliais microvasculares da derme humana (CEMDH, o mesmo que HDEMC), as células endoteliais da veia safena humana, as células endoteliais da gordura do omento humano, outras células endoteliais microvasculares humanas, células endoteliais dos capilares do cérebro humano e outras que tais. Também se admite que células endoteliais de outras espécies possam ser estimuladas pelos meios condicionados pelos tumores e utilizadas como imunógenios para a geração de hibridomas para a produção de um anticorpo em conformidade com o que foi dito, isto é, para a produção de anticorpos que interreajam com as células endoteliais vasculares humanas estimuladas pelos tumores» e/ou para a produção de anticorpos utilizáveis em modelos preclínicos. A expressão “meio ou meios condicionados pelos tumores” identifica aqui as composições ou os meios, tais como os meios de cultura, que contenham uma ou várias citoquinas, linfoquinas ou outras moléculas efectoras derivadas dos tumores. De forma mais típica, prepara-se o meio condicionado pelo tumor a partir de um meio de cultura onde cresceram as células tumorais seleccionadas e que por isso irá estar enriquecido nesses produtos derivados do tumor. Pressupõe-se que o tipo de meio não seja partículamiente importante, na medida em que inicialmente contém pelo menos os nutrientes adequados e está cm condições de suportar o crescimento das células tumorais. Como é evidente, também é possível extrair e mesmo separar materiais α partir dos meios condicionados pelos tumores e utilizar um ou vários dos produtos extraídos para aplicação às células endoteliais.
Tal como sucede com o tipo de tumor utilizado para a preparação do referido meio ou dos referidos meios, é evidente que será pretèrível utilizar tumores que imitem ou simulem o tumor que em última instância irá ser sujeito a análise ou a tratamento utilizando a presente invenção. Assim, por exemplo, no caso de se pretender desenvolver um protocolo para o tratamento do cancro da mama, será desejável utilizar células do cancro da mama, tais como as células ZR-75-1, T47D, SKBR3, MDA-MB-231. No caso dos tumores colorrectais, a título de exemplo é possível mencionar as células do carcinoma HT29 e também as células DLD-1, HCT116 ou mesmo SW48 ou SW122. No caso dos tumores pulmonares, é possível referir, a título de exemplo, as células NCI-H69, SW2, NCI H23, NCI H460, NCI H69 ou NCIH82. No caso dos melanomas, são exemplos razoáveis as células DX3, A375, SKMEL-23, HMB-2, MJM, T8 ou mesmo VUP. Em todos os casos anteriores, admite-se mesmo que seja possível utilizar células produzidas pelo tumor que se pretende tratar, isto é, células obtidas por biópsia
Uma vez preparado, o meio condicionado pelo tumor é então utilizado para estimular o aparecimento de marcadores) específico(s) do endotélio tumoral sobre as superfícies celulares das células endoteliais, v.g., criando em cultura células endoteliais seleccionadas na presença de meios condicionados pelo tumor (ou produtos daí resultantes). Repetindo, admite-se que o tipo de célula endotelial que se utiliza não tem uma importância crítica, desde que seja genericamente representativa do endotélio associado à vasculatura do tumor particular que em última instância se pretende tratar ou diagnosticar. Os inventores preferem utilizar cclulas endoteliais da veia umbilical humana (EVUH) ou células endoteliais microvasculares da derme humana (CEMDH, Karasek, 1989), na medida em que tais células são de origem humana, respondem aos factores de crescimento das citoquinas e aos factores angiogénicos e são fáceis de obter. No entanto, considera-se que todas as células endoteliais que seja possível criar em cultura in vitro possam ser utilizadas na pratica da invenção para serem produzidos, não obstante, resultados benéficos. A título de exemplo é possível referir células tais como as EA.hy9.26, ECV304, as células endoteliais da veia safena humana e outras que tais.
Uma vez estimuladas, utilizando os produtos derivados dos tumores, as células endoteliais são então utilizadas como imunógenios para a preparação de anticorpos monoclonais (AcM). A técnica para a preparação de AcM contra marcadores da superfície de células antigénicas é bastante simples e directa e pode ser executada facilmente recorrendo a técnicas bem conhecidas pelos especialistas na matéria, conforme exemplificado pela técnica de Kohler & Milstein (1975) e conforme adiante descrito mais minuciosamente.
Dito de uma forma genérica, um método preferido para a preparação dos AcM, utilizando células endoteliais estimuladas, implica os procedimentos seguintes: deixa-se crescer durante > 4 dias as células ou as linhagens celulares derivadas dos tumores humanos, num meio de cultura de tecidos; remove-se o sobrenadante da cultura de tecidos (‘meio condicionado pelo tumor’), retirando-o das culturas de células tumorais, e acrescenta-se às culturas de CEVUH com uma concentração final de 50% (v/v); após 2 dias de cultura, efectua-se a colheita das CEVUII de uma forma não enzimática e injecta-se no murganho por via intraperitoneal 1-2 x 106 células; repete-se este processo três vezes com intervalos de duas semanas, sendo a imunização final efectuada por via intravenosa; decorridos três dias efectua-se a colheita dos esplenócitos que são fundidos com células do mieloma SP2/0 em conformidade com protocolos convencionais (Kohler & Milstein, 1975) e efectua-se a clonagem, por diluição limitante, dos hibridomas produtores de anticorpos com a rcactividadc adequada. A partir da colheita resultante de hibridomas, será desejável então seleccionar um ou vários hibridomas que produzam um anticorpo que reconheça o endotélio vascular activado com uma intensidade maior do que aquela com que reconheceria o endotélio vascular não activado. Um objectivo é a identificação de anticorpos que não tenham virtualmente nenhuma afinidade de ligação com o endotélio normal. No entanto, ao contrário da técnica anterior, na presente invenção esta propriedade não é crítica. Em qualquer dos casos, identificar--se-á genericamente os hibridomas produtores de anticorpos adequados por um processo de pesquisa, tal como um imunoensaio de tipo EISLE, RIE, EIRM (o mesmo que IRMA), QF ou semelhante, em presença de um ou vários tipos de células endoteliais activadas pelo tumor. Logo que tenham sido identificados os hibridomas elegíveis, é desejável testar a ausência de reactividade com o endotélio não activado ou “normal” ou com outro tipo de células ou tecidos normais. Deste modo, podem ser excluídos os hibridomas produtores de anticoipos que tenham um nível indesejavelmente elevado de interreactividade normal para a aplicação particular prevista. (f) Anticorpos anti-endoglina
Utilizando a técnica anterionnente descrita, foram preparados e isolados anticorpos que possuem uma especificidade relativa para o endotélio vascular tumoral. De acordo com um exemplo particular, foram utilizadas células de carcinoma HT29 para a preparação do meio condicionado que foi depois aplicado para estimular células EVUH em cultura. As células resultantes EVUH activadas pelo ΗΊ29 foram depois utilizadas como muuiogcnios para a preparação de um banco de hibridomas que foi pesquisado segundo o protocolo de EISLE utilizando as células de EVUH activadas pelo IIT29 c por análise imunoistológica de secções de tumores e de tecidos normais humanos. A partir deste banco de hibridomas foram seleccionados os anticorpos que reconheceram um antigénio de células endoteliais vasculares tumorais.
Os AcM conhecidos pela designação de anticorpo 4 das células endoteliais de tumores e anticorpo 11 de células endoteliais de tumores (CET4 e CET11) foram obtidos utilizando o método descrito supra. Por fim determinou-se que o antigénio reconhecido pelos CET4 e CET11 era a endoglina molecular. Os epítopos sobre a endoglina reconhecidos pelo CET4 e pelo CET11 encontram-se presentes sobre a superfície celular das células EVUH estimuladas e apenas se encontram minimamente presentes (ou imunologicamente acessíveis) sobre a superfície de células não estimuladas. Os AcM haviam crescido previamente em presença de endoglina. No entanto, a análise da reactividade com os determinantes da superfície celular das CEVUH ou das CEVUH activadas com TCM, por SCAS (o mesmo que FACS) ou por imunofluorescência indirecta, revela que os epítopos reconhecidos pelo CET4 e pelo CET11 eram distintos dos epítopos de um anticorpo já conhecido designado por 44G4 (Gougos e Letarte, 1988).
Embora seja possível utilizar qualquer dos anticorpos conhecidos anti-endoglina (v.g., Gougos e Letarte, 1988; Gougos et ai, 1992; 0’Connell et al., 1992; Buhring et al. 1991) em conjunto com a presente invenção, considera-se que os AcM CET-4 e CET-11 são particu-larmente convenientes. Isto deve-se ao facto de marcarem para identificação as células endoteliais capilares e venulares, de uma forma variável entre moderada e forte, num grande conjunto de tumores sólidos (e em várias doenças inflamatórias crónicas e na placenta fetal), mas revelarem uma contrastação relativamente fraca dos vasos da maior parte dos tecidos de seres humanos adultos e normais. O CET11 é particularmente preferível na medida em que não revela virtualmente nenhuma reactividade com as células não endoteliais. Além disso, tanto o CET4 como o CET11 são fixadores do complemento, o que lhes confere potencial para induzirem também a lise selectiva das células endoteliais no leito vascular tumoral.
Os anticorpos que são inteneactivos com os AcM CET4 e CET11, isto é, aqueles que se ligam à endoglina ao mesmo tempo que o CET4 ou CET11, também são utilizáveis no âmbito da presente invenção. A identificação de um ou vários anticorpos que se liguem à endoglina ao mesmo tempo que epítopos tais como o CET4 ou o CET11 é uma matéria bastante simples. Isto pode ser determinado facilmente utilizando qualquer dos inúmeros ensaios imunológicos de pesquisa em que é avaliada a competição de anticorpos. Por exemplo, no caso de os anticorpos que se pretende examinar nos testes serem provenientes de uma fonte diferente da fonte dos CET4 ou CET11, v.g., um coelho, ou no caso de serem mesmo de um isotipo diferente, por exemplo, IgGl ou IgG3, é possível recorrer à utilização de um EISLE de competição. Na variante de se recorrer a um EISLE de competição, poder-se-ia misturar previamente o CET4 ou o CET11 com quantidades variáveis dos anticoipos que se pretende analisar nos testes, antes da aplicação às cavidades, revestidas com o antigénio, na placa de EISLE. Utilizando anticorpos secundários, quer anti-murinos quer anti-IgM, poder-se-ia detectar apenas os anticorpos CET4 ou CET11 ligados (cuja ligação seria reduzida pela presença de um anticorpo de teste que reconhecesse o mesmo epítopo que qualquer dos CET4 ou CET11.
Para se realizar um estudo de competição de anticorpos entre os CET4 ou CET11 e qualquer anticorpo que se pretenda testar, poder-se-ia marcar em primeiro lugar os CET4 ou CET11 com um identificador deleclável, tal como v.g. a biotina ou um marcador enzimótico ou radioactivo, para facilitar a identificação subsequente. Em tais casos, poder-se-ia incubar os anticorpos marcados conjuntaincnte com os anticorpos que se pretende testar, para serem examinados em diversas proporções (v.g., 1:1, 1:10 e 1:100) e ao fim de um intervalo de tempo adequado poder-se-ia então pesquisar a reactividade dos anticorpos CET4 ou CET11 marcados e efectuar a comparação com um valor de contraprova em que não estivesse incluído, na incubação, nenhum anticorpo competitivo (a testar). O ensaio pode ser um qualquer de um conjunto vasto de experiências imunológicas que tenham por base a ligação de anticorpos, podendo os anticorpos CET4 ou CET11 ser detectados graças ao marcador para a sua detecção, v.g., utilizando estreptavidina no caso dos anticorpos biotinilados ou utilizando um substrato cromogénico conjuntamente com um marcador enzimático ou detectando simplesmente o marcador radioactivo. Um anticorpo que se ligue ao mesmo epítopo a que se ligam os CET4 ou CET11 irá ser capaz de competir eficientemente pela ligação e por tal motivo irá ser capaz de reduzir de forma significativa a ligação dos CET4 ou CET11, conforme evidenciado por uma redução na ligação dos anticorpos marcados. No caso vertente, depois de os anticorpos CET4 ou CET11 marcados toem sido misturados com os anticorpos que se pretende analisar nos testes, para a determinação da reactividade remanescente, os ensaios adequados são, v.g. EISLE, RIE ou método das autorradiografias de Western, utilizando a endoglina humana; imunoprecipitação da endoglina; EISLE, RIE ou contrastação por imunofluorescência de células recombinantes que exprimam a endoglina humana; contrastação por imunofluorescência indirecta de células endoteliais da vasculatura do tumor; reactividade com as CEVUH ou com a imunofluorescência indirecta dos determinantes da superfície celular das CEVUH activada com os TCM ou a análise com um SCAF. Este último método é o mais preferível e foi utilizado para comprovar que os epítopos reconhecidos pelos CET4 e CET11 são distintos do epítopo do 44G4 (Gougos e Le tarte, 1988). A reactividade dos anticorpos CET4 ou CET11 marcados, na ausência de qualquer anticorpo a testar, é um valor elevado de controlo. O valor baixo de controlo obtém-se fazendo a incubação dos anticorpos marcados conjuntamente com anticorpos do mesmo tipo não marcados, ocorrendo a competição entre eles e havendo redução da ligação dos anticorpos marcados. Uma redução significativa da reactividade dos anticorpos marcados, na presença de um anticorpo a testar, é um sinal indicativo da existência de um anticorpo a testar que reconhece o mesmo epítopo, isto é, um que “interreaja” com o anticorpo marcado. A designação “redução significativa”, no âmbito da presente memória descritiva, pretende qualificar uma redução reproduzível (isto é, observada de forma consistente) na ligação segundo uma proporção variável pelo menos entre cerca de 10% e 50% para uma razão de cerca de 1:1 ou então, mais preferencialmente, igual ou superior a cerca de 90% para uma razão de cerca de 1:100. O recurso aos “ensaios de interreactividade”, conforme descrito antes a propósito dos anticorpos CET4 e CET11, pode ser feito com qualquer anticorpo utilizável na presente invenção. Assim sendo, qualquer anticorpo que se ligue a um componente de uma célula tumoral, a um componente da vasculatura tumoral, a um componente associado às células tumorais, a um componente associado à vasculatura tumoral, a um componente da matriz extracelular do tumor ou a qualquer outro tipo de células aqui enumeradas, no mesmo epítopo de qualquer um dos anticorpos aqui enumerados, conforme determinado por um ensaio de competição de anticorpos, é qualquer anticorpo que esteja abrangido no âmbito da presente invenção quando combinado com um agente coagulaule para formar um ligando bicspccífico. (g) Utilização de ligandos de ligação às células endoteliais vasculares
Como componente propício de ataque também é possível utilizar qualquer dos ligandos biológicos conhecidos pelo facto de se ligarem ou interactuarem com moléculas da superfície das células endoteliais, tais como os receptores de factores do crescimento.
Os factores de crescimento ou ligandos, considerados úteis como alvos no sentido agora explicado, compreendem os FCEV/FPV, FCF, FpCT, os ligandos que se liguem a um ΊΊΕ, as isoformas de fibronectina associadas aos tumores, o factor dispersor, o factor de crescimento dos hcpatócitos (FCH), o factor 4 plaquetário (F4P), o FCDP e ΓΓΜΡ.
Os alvos particularmente preferidos são os FCEV/FPV, a família de proteínas FCF e os FpCT. Abraham et al. (1986) clonaram o FCF, pelo que este se encontra disponível como proteína recombinante. Conforme descrito por Ferrara et al. (1991), foram já clonadas quatro espécies de FCEV que possuem 121,165,189 e 206 aminoácidos. (h) Encaminhamento de ligandos ligados
Os anticorpos ou os ligandos específicos de encaminhamento também podem ser dirigidos para qualquer componente que se ligue à superfície das células endoteliais vasculares no local de uma patologia, tal como um tumor. Tais componentes são exemplificados por antigénios e ligandos obtidos a partir de tumores, por exemplo, factores de crescimento, que se ligam a receptores específicos da superfície das células, estando esses receptores já presentes nas células endoteliais, ou a receptores que tenham sido induzidos ou expressos excessivamente em tais células em resposta ao ambiente tumoral. Os alvos associados à vasculatura do tumor também podem receber a designação de factores de ligação às células endoteliais derivadas dos tumores.
Alcançar-se-á parcialmenle um nível de especificidade, necessário para o ataque correcto à patologia, porque as células endoteliais locais irão ser induzidas de forma a exprimirem ou a revelarem os receptores que não se encontrem presentes ou então são subexpressas ou dissimuladas, nas células endoteliais uormais. No caso dos tumores, obter-se-á uma maior especificidade devido ao facto de as células endoteliais no tumor irem capturar os factores derivados do tumor e irem ligar-se a eles à superfície das células, reduzindo a quantidade de ligando disponível para outros tecidos. Quando combinadas com uma maior diluição do factor ou do ligando, devido à distribuição no sangue ou na mistura fluída tecidual, as células endoteliais nos tecidos normais irão presumivelmente ligar-se relativamente pouco a esses factores. Assim, de uma forma operacional, os factores ou os ligandos ligados à superfície das células poderão ser utilizados como marcadores de células endoteliais dos tumores.
Para além de serem produzidos pelas próprias células tumorais, os factores de ligação às células endoteliais dos tumores também podem ser originados por outros tipos de células, tais como os macrófagos e os mastócitos, que se tenham infiltrado nos tumores, ou podem ser produzidos por plaquetas que fiquem activadas dentro do tumor. Há ainda outros ligandos ou factores de crescimento, considerados como alvos úteis associados à vasculatura tumoral, entre os quais se salienta FCE, FCF, FCEV, FpCT, FCH (NaKamura, 1991), angiotropina, FaCT, FaNT, FCCE-DP e os ligandos de ligação aos ΤΊΕ (Bicknell e Harris, 1992). Os alvos presentemente preferidos são os FCEV/FPV, a família de proteínas FCF, o factor β do crescimento transformante (FpCT); o FaCT; o factor α da necrose tumoral (FaNT); a angiotropina; o factor de crescimento das células endoteliais derivados das plaquetas (FCCE-DP); os ligandos de ligação aos 1ΊΕ; e a pleiotropina.
Um outro aspecto da presente invenção consiste na utilização de anticorpos de ataque, ou as regiões de ligação correspondentes, que são específicos para os epítopos presentes apenas nos complexos de ligando-rcceptor, estando esses epítopos ausentes quer no ligando individual (livre) quer no receptor na sua foima não ligada. Estes anticorpos reconhecem e ligam-se à conformação única que se obtém quando um ligando, tal como um factor de crescimento, se liga ao seu receptor, tal como um receptor de um factor de crescimento, para formarem um complexo especificamente ligado. Tais epítopos não se encontram presentes nas formas não combmadas de ligandos ou receptores.
Os inventores previram também o caso em que os complexos de ligando-receptor aos quais estes anticorpos se ligam se encontram presentes nas células endoteliais associadas ao tumor num número significativamente maior do que nas células endoteliais não associadas ao tumor. Por tal motivo esses anticorpos irão ser úteis como agentes de ataque e vão servir para aumentar ainda mais a especificidade dos coagulantes biespecíficos da invenção. (i) Arquétipos de receptores
Os domínios de ligação solúveis dos receptores da superfície das células endoteliais também podem ser utilizados como ligandos de ataque na presente invenção. Este conceito baseia-se genericamente no fenómeno de ligação em sanduíche bem conhecido que foi já explorado em diversos protocolos de ligação in vitro e in vivo. Basicamente, como as células endoteliais exprimem receptores específicos, as células ligam-se aos ligandos correspondentes e adsorvem-nos, ficando então os ligandos disponíveis para ligação a outros arquétipos de receptores se vierem a ser introduzidos no sistema.
Foi já identificado um conjunto útil de receptores de células endoteliais nas secções descritivas anteriores, constituindo alvos particularmente preferidos os receptores de FCEV/FPV, FCF, FPCT, ΉΕ-1 e ΉΕ-2. Cada um destes receptores poderia ser manipulado para formar um domínio de ligação solúvel utilizável como ligando de ataque.
V ' 88 V ' 88 4.
Alvos de células de estromas associados à patologia (a) Alvos de estromas/matrizes exlracelulares A utilidade dos marcadores das membranas pavimentares na patologia tumoral foi descrita por Birembaut et al. (1985). Estes estudos revelaram que a distribuição dos marcadores da membrana pavimentar (MP, o mesmo que BM), do colágenio de tipo IV, da laminina (LM), do proteoglicano do sulfato de heparano (PSH, o mesmo que HSP) e de fíbronectiiia (FN) se encontra desfeita na patologia tumoral. Burtin et al. (1983) também descreveram alterações dos antigénios das membranas pavimentares e do tecido conjuntivo em nodos linfáticos metastáticos humanos. O LLIR constitui um alvo preferido utilizável na presente invenção. Ugarova et al. (1993) afirmam que há modificações conformacionais no fibrinogénio e que são solicitadas pela sua interacção com a glicoproteína da membrana plaquetária GPUb-Illa. A ligação do fibrinogénio à glicoproteína GPIIb-IIIa membranar nas plaquetas activadas determina a agregação das plaquetas. Esta interacção resulta de modificações conformacionais no fibrinogénio, conforme evidenciado pela expressão dos locais de ligação induzidos pelo receptor, LLIR (o mesmo que RIBS), epítopos estes que são expressos pelo ligando ligado mas não pelo ligando livre. Há dois epítopos do LLIR que foram localizados por Ugarova et al. (1993). Uma das suas sequências reside em γΐ 12-119 e é reconhecida pelo AcM 9F9; a segunda é a sequência RGDF em Aa 95-98 e é reconhecida pelo AcM 155B16. Estes epítopos também são expostos por adsorção do fibrinogénio sobre uma superfície de plástico e digestão da molécula por acção da plasmina. A exposição proteolítica dos epítopos coincide com a clivagem dos resíduos do terminal carboxilo das cadeias Aa para se formar o fragmento X2. A inacessibilidade da sequência RGDF em Αα 95-98 no fibrinogénio sugere que esta sequência não participa na ligação inicial da molécula à gjicoproteina GPIIb-IHa. A ligação do fibrinogénio ao seu receptor altera a conformação dos resíduos do terminal carboxilo das cadeias Αα, expondo as sequências que residem nos segmentos ligadores espiralados entre os domínios D e E da molécula, gerando assim os epítopos de LLIR. Em termos práticos, as sequências de LLIR são consideradas como epítopos utilizáveis no encaminhamento com um coaguligando. Assim, os AcM 9F9 e 155B16 podem ser utilizados de forma vantajosa, o mesmo sucedendo com os anticorpos descritos por Zamarron et al. (1991). (b) Outros alvos celulares A presente invenção também tem a vantagem de poder ser utilizada para dirigir coagulantes para a vasculatura associada a uma patologia, encaminhando-os para os tipos de células existentes dentro da região da patologia.
As plaquetas participam na hemostase e na trombose por aderirem às paredes dos vasos sanguíneos lesionados e por se acumularem no local da lesão. Embora a deposição de plaquetas nos locais de lesões dos vasos sanguíneos seja responsável pela interrupção imediata da hemorragia em condições fisiológicas, pode conduzir à oclusão vascular com a consequente danificação do tecido isquémico e embolização trombótica em condições patológicas.
As interacções das plaquetas com o seu ambiente e umas com as outras representam processos complexos que são iniciados à superfície das células. Assim, a membrana superficial constitui uma interface reactiva entre o meio externo, incluindo os componentes das paredes do vaso sanguíneo e do plasma, e o interior das plaquetas. A p-155, que é uma proteína plaquetária polimérica expressa sobre plaquetas activadas (Hayward et al., 1991), pode ser atacada utilizando a presente invenção. As plaquetas respondem a um grande número de estímulos devido'ao facto de experimentarem complexas modificações bioquímicas e morfológicas. Estas modificações estão implicadas em processos fisiológicos, tais como a adesão, a agregação e a coagulação. A activação das plaquetas produz alterações membranares que podem ser reconhecidas por anticorpos monoclonais. O anticorpo monoclonal JS-1 (Hayword ct al., 1991) é um dos possíveis anticorpos que podem ser utilizados como parte de um coaguligando.
Os locais de ligação induzidos pelos ligandos (LLIL, o mesmo que LIBS) são locais expressos sobre os receptores da superfície das células apenas depois de a ligação dos ligandos ter feito com que o receptor tenha mudado de forma, com intervenção indirecta dos fenómenos biológicos subsequentes. Tais locais podem ser considerados como contrapartes equivalentes dos LLER. e constituem também alvos preferidos para utilização com a presente invenção.
Foram já desenvolvidos 13 anticorpos anti-LLIL por Frelinger et al. (1990; 1991), podendo qualquer deles ser utilizado para levar um coagulante até um local de uma patologia ou de um tumor que seja compatível com esse anticorpos. Também é possível utilizar os anticorpos MA-TSPI-1 antiplaquetários monoclonais dos murinos (dirigidos contra a trombospondina humana) e os anticorpos MA-PMJ-2, MA-PMI-1 e MA-LLIL-1 (o mesmo que MA-LIBS-1) (dirigidos contra os LLIL na ghcoproteína Db/llla plaquetária humana) de Dewerchin et al (1991) , e ainda os RUU 2.41 e LLIL-1 de Heynen et al. (1994); OP-G2, de Tomiyama et al. (1992) ; e o Ac-15 (o mesmo que Ab-15).
Também é possível utilizar muitos outros alvos, tais como os antigénios sobre células da musculatura lisa, pericitos, fibroblastos, macrófagos e leucócitos e linfócitos infiltrantes. B. Agentes coagulantes O segundo braço ou elemeulu dos agentes biespccíficos da invenção irá ser um componente capaz de favorecer a coagulação. Os “agentes favorecedores da coagulação” podem ser factores de coagulação, factores que estimulem indirectamente a coagulação ou podem assumir a forma de uma segunda região de ligação que seja capaz de se ligar a um factor de coagulação ou a um factor que indirectamente estimule a coagulação ou de libertar um desses factores. 1. Factores de coagulação É possível utilizar uma grande variedade de factores de coagulação a propósito da prática da presente invenção, conforme exemplificado pelos agentes adiante enumerados. Se um factor de coagulação estiver ligado de forma covalente a um primeiro agente de ligação, para unir as moléculas utiliza-se um local distinto do seu local de coagulação funcional. Nas secções subsequentes descreve-se também as regiões de união adequadas que são distintas dos locais activos, ou regiões funcionais, dos factores de coagulação. (a) Factor tecidual O factor tecidual (FT) é um agente capaz de iniciar a coagulação sanguínea. O FT é o activador do circuito extrínseco da coagulação do sangue e não está em contacto directo com o sangue em condições fisiologicamente normais (Osterud et d, 1986; Nemerson, 1988; Broze, 1992; Ruf & Edington, 1994). No entanto, nas lesões vasculares ou na actfvação por determinadas citoquinas ou endotoxinas, o FT irá ficar exposto ao sangue, quer pelas células (sub)endoteliais (Weiss et al., 1989) quer por determinadas células do sangue (Warr et d., 1990). Assim, o FT irá formar um complexo com o factor Vila, o qual em condições normais vai circular em concentrações diminutas no sangue (Wildgoose et al., 1992) e depois o complexo de FT/factor Vila inicia a cascata da coagulação mediante a activação do factor X para factor Xa. A cascata irá finalmente terminar na formação de fibrina.
Para que ocorra esta sequência de fenómenos, o complexo FT: Vila tem de estar associado a uma superfície fosfolipidica sobre a qual os complexos com os factores IX ou X de inicio da coagulação possam agregar-se (Ruf et al., 1991; Paborsky et al., 1991; Bach et al., 1986). Por este motivo, o FT truncado (ou FTt, o mesmo que tTF), do qual foram removidas as regiões transmembranarcs c citoplásmicas truncando o gene, é uma proteína solúvel que possui uma centésima milésima pane da actividade do FT natural de activação do factor X (Ruf et cd., 1991). (b) Factores coagulantes A trombina, o Factor V/Va e seus derivados, o Factor VHI/VIIIa e seus derivados, o Factor IX/IXa e seus derivados, o Factor X/Xa e seus derivados, o Factor Xl/XIa e seus derivados, o Factor ΧΠ/XUa e seus derivados, o Factor Xlll/XIIIa e seus derivados, o activador do Factor X e o activador do Factor V também podem ser utilizados na presente invenção. (c) Coagulantes existentes nos venenos
Williams e Esnouf demonstraram em 1962 que o veneno da víbora de Russel contém uma proteína coagulante. Kisiel (1979) isolou uma glicoproteína de veneno que activa o Factor V; e Di Scipio et al. (1977) demonstraram que a protease do veneno activa o Factor X humano O activador do Factor X é o componente previsto para utilização na presente invenção.
Também foram já produzidos anticorpos monoclonais específicos para o activador do Factor X existente no veneno da víbora de Russel (v.g., ο MP1 de Pukrittayakamee et al., 1983), podendo ser utilizados para administrar o agente a um local destinatário específico dentro do corpo. (d) Prostaglandfnas e enzimas sintéticas O tromboxano A2 foima-sc a partir dc cndoperóxidos pelas acções sequenciais das enzimas ciclo-oxigenase e tromboxano-sintetase nos microssomas das plaquetas. O tromboxano A2 é gerado facilmente pelas plaquetas e é um vasoconstritor poderoso devido à sua capacidade para determinar a agregação das plaquetas (Whittle et al., 1981).
Tanto o tromboxano A2 como os seus análogos activos podem ser utilizados na presente invenção. Há um protocolo de síntese para gerar tromboxano que foi descrito por Bhagwat et al. (1985). Em particular, na presente invenção prevê-se a utilização de análogos do tromboxano A2 descritos por Ohuchida et al. (1981) (em especial o composto 2).
No contexto da presente invenção também é possível utilizar como “coagulantes” a tromboxano-sintase e outras enzimas que sintetizem as prostaglandinas activadoras das plaquetas. Shen e Tai (1986a;b) descrevem anticorpos monoclonais para a tromboxano-sintase e para a sua purificação por imunoafinidade; Wang et al. (1991) descrevem o ADNc para a tromboxano--sintase humana. (e) Inibidores da fibrinólise A antiplasmina ot2, ou inibidor da plasmina a2, é um inibidor de proteinases que existe naturalmente no plasma humano e que serve para inibir de forma eficiente a lise dos coágulos de fibrina induzidos pelo activador do plasminogénio (Moroi e Aoki, 1976). A antiplasmina al é um inibidor paiticularmente potente e também está previsto que pode ser utilizado na presente invenção. <c-
É possível purificar a antiplasmina oc2 conforme descrito pela primeira vez por Moroi e Aoki (1976). Há outros esquemas de purificação que tambcm se encontram disponíveis, por exemplo, o recurso à cromatografia por afinidade sobre ‘plasminogénio-Sepbarose’, a cromatografia de permuta iónica sobre ‘DEAE-Sephadex’ e a cromatografia sobre c Concanavalina-A-•Sepharosc'; ou recorrendo à cromatografia por afinidade sobre uma coluna de ‘Sepharose’ carregada com uma formulação de plasminogénio digerido com elastase que contenha as três estruturas de anel triplo do terminal N na cadeia A da plasmina (LLIL), seguindo-se a filtração através de gel (conforme descrito respectivamente por Wiman & Collen, 1977; Wiman, 1980).
Uma vez que a sequência do ADNc para a antiplasmina oc2 já está disponível (Tone et cã., 1977), um método preferível para a produção de antiplasmina a2 pode ser o recurso à expressão recombinante.
Os anticorpos monoclonais contra a antiplasmina oc2 também se encontram já disponíveis e podem ser utilizados nos casos da presente invenção em que são utilizados os ligandos de ligação biespecíficos. Por exemplo, Hattey et al. (1987) descreveram dois AcM contra a antiplasmina cã, designados por MPW2AP e MPW3AP. Uma vez que foi afirmado que estes dois AcM reagem igualmente bem com a antiplasmina a2 natural, poderiam ser utilizados para fornecer antiplasmina <x2 exógena a um local destinatário ou para armazenar antiplasmina <x2 endógena e concentrá-la dentro da região visada. Também seria possível utilizar outros anticorpos, tais como o JTPI-2, descritos por Mimuro et cã.,. 2. Agentes que se ligam aos factores de coagulação Há um outro grupo de ligandos de coagulação biespecíficos da presente invenção que é constituído pelos ligandos em que a região de ataque não está directamente ligada a um factor de coagulação, estando antes ligada a uma segunda região de ligação que se liga a um factor de coagulação.
No caso de se utilizar uma segunda região de ligação para efectuar a ligação e para administrar um factor de coagulação, escolhe-se essa região de ligação de modo a que reconheça um local no tactor de coagulação que não dificulte de forma significativa a sua capacidade para induzir a coagulação. As regiões dos factores de coagulação adequadas para a ligação assim realizada irão ser geralmente as mesmas regiões que são adequadas para a ligação covalente à região propícia de ataque, conforme descrito nas secções anteriores.
No entanto, tendo em conta que é previsível que os ligandos biespecíficos desta classe libertem o factor de coagulação após a administração à região ou ao local do tumor, consegue-se obter maior flexibilidade nas regiões do factor de coagulação adequadas para a ligação a um segundo agente de ligação ou anticorpo. Outra vantagem reside no facto de os anticorpos biespecíficos poderem ser pré-localizados antes da infusão do FTt, o que eventualmente poderia reduzir a quantidade de FTt necessária e consequentemente a toxicidade.
As segundas regiões de ligação adequadas para utilização pela forma descrita irão ser geralmente os locais de anticorpos para a combinação de antigénios, que tenham especificidade de ligação com o factor de coagulação, incluindo as parcelas funcionais dos anticorpos, tais como os fragmentos Fvcs, Fv, Fac\ Fac e F(ac’)2-
Os ligandos de ligação biespecíficos que contenham anticorpos, ou os seus fragmentos, dirigidos contra o Factor Tecidual, a trombina, a precaliqueína, o Factor V/Va, o Factor VnWHIa, o Factor EX/lXa, o Factor X/Xa, o Factor Xl/Xla, o Factor ΧΠ/XDa, o Factor Xm/XDIa, o veneno da víbora de Russel, o tromboxano A2 ou a antiplasmina a2 constituem casos exemplificativas deste aspecto da invenção. ζ7 96' ζ7 96'
C. Sistemas de acoplamento A primeira região de encaminhamento e a segunda região coagulante irão ficar funcionalmente ligadas para que seja possível que cada região desempenhe a função que se pretende sem que haja dificuldades significativas. Assim, a região de encaminhamento é capaz de se ligar ao alvo visado, conforme seleccionado entre um conjunto de alvos do ambiente tumoraL, e a região coagulante é capaz de favorecer a coagulação do sangue ou a formação de coágulos, directa ou indirectamente, v.g., através da libertação de um factor de ligação.
Para se avaliar a função de ligação da região de encaminhamento, tudo quanto é necessário é realizar um ensaio de ligação para se garantir que o ligando biespecífico continue a ligar-se ao componente visado de uma forma praticamente idêntica à da primeira região de ligação que não faz parte do complexo. Os ensaios de ligação adequados são do tipo vulgarmente praticado nas experiências de ligação imunológicas, em que a primeira região de encaminhamento é um anticorpo, e/ou outras experiências de ligação bioquímicas, v.g., quando são utilizadas proteínas marcadas com 12SI ou outros componentes marcados radioactívamente, tal como se faz para avaliar a ligação de tipo ligando-receptor, assim se gerando os gráficos de Scatehard e outros que tais. O componente ou antigénio visado nessas experiências pode ser fornecido em inúmeras formas, incluído as proteínas purificadas a partir de fontes naturais ou recombinantes, preparações membranares enriquecidas, células intactas e secções de tecidos. De um modo geral, no caso de serem utilizadas composições de proteínas, estas irão ficar imobilizadas sobre um suporte sólido, por exemplo, uma placa de microtitulação, uma membrana ou mesmo uma matriz de coluna Geralmente também é preferível utilizar uma composição de ataque que reflicta o alvo fisiológico, pelo que também é preferível, uma vez que o alvo irá estar normalmente associado a células, a utilização de composições que contenham células intactas, incluindo tecidos e as próprias células.
Os diversos ensaios imunológicos existentes para a confirmação da ligação funcional de um complexo biespecífico compreendem, v.g., o método das autoiradiografias de Western e os protocolos de EISLE, os protocolos de EISLE com células imobilizadas, os métodos imunoisto-químicos e a selecçào de células activadas pela fluorescência (SCAF). A realização de todas estas experiências é geralmente conhecida pelos especialistas na matéria, mas serão melhor descritos neste texto. A avaliação da função de um composto biespecífico de ligação à região de encaminhamento, em qualquer dos ensaios de ligação referidos antes ou noutros, é uma matéria simples e directa, em que o ligando biespecífico e a primeira região de ligação que não faz parte do complexo irão participar mais vulgarmente num ensaio paralelo, nas mesmas condições, para permitir uma comparação fácil. Os ligandos biespecíficos eficazes ligar-se-ão ao alvo sem dificuldades significativas, isto é, praticamente da mesma maneira da primeira região de ligação que não faz parte do complexo. Tomando o índice de 100% como valor de referência no ensaio da região de ligação que não faz parte do complexo, então a expressão ‘ligação substancial” do ligando biespecífico, tal como aqui utilizada, significa que o ligando biespecífico manifesta pelo menos uma ligação de cerca de 50%, mais preferencialmente manifesta uma ligação entre cerca de 50% e cerca de 80% e muito mais preferencialmente manifesta uma ligação entre cerca de 80% e cerca de 100%.
Se o ligando biespecífico contiver uma segunda região de ligação que se liga a um coagulante, v.g., se for um anticorpo biespecífico, há outros ensaios úteis que são aqueles do tipo que permite avaliar simultaneamente as funções de ligação dos dois braços do ligando biespecífico. Por exemplo, isto pode ser conseguido avaliando a ligação de um coagulante, marcado radioaclivamente, a uma cclula do alvo através da formação de pontes com o ligando biespecífico ou anticorpo. Como exemplo de uma experiência destas refere-se a ligação do FTt às células destinatárias utilizando o anticorpo biespecífico B21-2/10H10, conforme descrito no Exemplo Π. A determinação da função do ligando biespecífico como agente coagulante é também uma questão simples e directa. Neste caso, tudo quanto é necessário é efectuar um ensaio de coagulação utilizando o ligando biespecífico para se garantir que ele vai funcionar de modo a favorecer a coagulação de uma maneira pradcamente idêntica à do agente de coagulação que não faz parte do complexo. Isto é verdadeiro para os “agentes coagulantes” que sejam, eles próprios, factores de coagulação e para aqueles que sejam segundas regiões de ligação que se ligam a um factor de coagulação. Naturalmente, neste último caso, num ensaio in vitro ou ex vivo, o ligando biespecífico irá formar um pré-complexo com o factor de coagulação para permitir a ligação à segunda região de ligação.
Um ensaio de coagulação adequado é aquele em que os ligandos biespecíficos, previamente combinados para formarem um complexo com o coagulante, se necessário, são misturados com uma amostra de plasma. O aspecto das cadeias de fibrina é um sinal indicativo de coagulação nesta experiência. Assim, seria de esperar que os ligandos biespecíficos eficazes reduzissem o tempo necessário para o aparecimento das cadeias de fibrina e particularmente seria de esperar que reduzissem de forma significativa o tempo decorrido em comparação com os níveis de controlo. Há uma variação do ensaio referido anteriormente que consiste em expor, em primeiro lugar, células destinatárias adequadas ao ligando biespecífico em condições eficazes, durante
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iC 99 um período suficiente para permitir a ligação, em efectuar a lavagem das células para se lhes remover os componentes ligados de forma não específica e em recolocar novamente essas células lavadas em suspensão no plasma. É de prever que apenas as células recobertas eficientemente com o ligando biespecífico venham a reduzir o tempo necessário para que as cadeias de fibrina apareçam nesta experiência. Este tipo de ensaio é preferível na medida em que é, em si mesmo, um ensaio que permite avaliar ambas as funções do arquétipo biespecífico, isto é, o encaminhamento inicial para a célula e a subsequente coagulação localizada.
Para se efectuar a comparação da função de coagulação de um composto biespecífico com a correspondente função de um agente de coagulação que não participe num complexo, é possível realizar outra vez ensaios paralelos. Os ligandos biespecíficos eficazes irão servir para favorecer a coagulação sem dificuldades significativas, isto é, vão funcionar praticamente da mesma maneira do agente de coagulação que não faz parte de nenhum complexo. Atribuindo o valor de referência de 100% ao resultado de um ensaio com coagulante sem estar combinado num complexo, a expressão aqui utilizada “função substancial” significa que o ligando biespecífico é responsável pelo menos por cerca de 50% da coagulação, mais preferencialmente é responsável por cerca de 50% a cerca de 80% da coagulação e mais preferencialmente é responsável por cerca de 80% a cerca de 100% da coagulação.
As duas regiões funcionais dos ligandos biespecíficos podem ser unidas recorrendo a técnicas da química de síntese ou a técnicas do ADN recombinante. Qualquer destas técnicas é vulgarmente utilizada e é perfeitamente conhecida pelos especialistas na matéria, estando todavia melhor exemplificada no Exemplo I e pelos pormenores do texto subsequente. 1. Interligadores bioquímicos O acoplamento de um anticorpo, ou de outro componente de ataque, a um agente coagulante será feito geralmente com recurso à mesma tecnologia que foi desenvolvida para a preparação de imunotoxinas. No entanto, na presente tecnologia há vantagens consideráveis que são evidentes, uma vez que se concluiu que não são particularmente graves as consequências de uma determinada quantidade de agente coagulante que não faça parte do complexo ficar disponível fisiologicamente. Assim, as exigências de estabilidade para todos os interligadores não são tão rigorosas como o são para os ligadores utilizados noutros arquétipos, tais como as imunotoxinas. Posto isto, é possível admitir como directriz geral que qualquer interligador bioquímico que seja adequado para utilização numa imunotoxina também será adequado para utilização no presente contexto, podendo ainda ser considerados outros ligadores.
Para além das toxinas há um conjunto de outros agentes quimioterapêuticos e farmacológicos que foram já ligados a anticorpos para formarem conjugados que revelaram ser farmacologicamente funcionais (ver, v.g., Vaickus et d., 1991). Como exemplos de agentes antineoplásicos que foram já investigados refere-se os seleccionados entre doxonubicina, daunomicina, metotrexato e ‘vinblastina’, entre outros (Dilhnan et d, 1988; Pietersz et d., 1988). Além do mais, foi já descrito o acoplamento de outros agentes, tais como a neocarcinostatina (Kimura et al., 1983), a macromicina (Manabe et al., 1984), a trenimona (Ghose, 1982) eaa-amanitina (Davis & Preston, 1981). A tecnologia de acoplamento descrita em cada um dos documentos científicos anteriormente referidos também pode ser utilizada no contexto da presente invenção.
Os reagentes de interligação são utilizados para formarem pontes moleculares que unam entre si grupos funcionais de duas moléculas diferentes, v.g., um agente de ligação e um agente coagulante. Para se fazer a ligação progressiva de duas proteínas diferentes, é possível utilizai iiileiligadores heterobifimcionais que eliminem a formação de homopolúneros indesejados (Quadro VI). ÍÒ2 /
QUADRO VI
INTERLIGADORESIIETEROBIFUNCIONAIS | Ligador Reactivo com Vantagens e Aplicações Comprimento do braço separador após a interligação SMPT aminas primárias gaipos sulfidrilo . Maior estabilidade 11,2 A SPDP aminas primárias grupos sulfidrilo . Tiolação . Interligação divávd 6,8 Â LC-SPDP aminas primárias grupos sulfidrilo . Braço separador prolongado 15,6 Â SuIfo-LC-SPDP aminas primárias grupos sulfidrilo . Braço separador prdor^ado . Solúvel em água 15,6 Â SMCC aminas primárias grupos sulfidrilo . Grupo reactivo maleimida estável Qrrgugação enzima-anlioorpo . Cbrgugaçãohapteno-protdna portadora U,6Â Sulfo-SMCC aminas primárias grupos sulfidrilo . Grupo reactivo maleimida estável . Solúvel em água . Cbnjugação enzima-anticorpo 11,6 A MBS aminas primárias grupos sulfidrilo . Conjugação enzima-anticorpo . Conjugação hapteno-proteína portadora 9,9 Â SuHo-MBS aminas primárias grupos sulfidrilo . Solúvel em água 9,9 Â SIAB aminas primárias grupos sulfidrilo . Conjugação enzima-anticoipo 10,6 A SulfoSIAB aminas primárias grupos sulfidrilo . Solúvel em água 10,6 Â SMPB aminas primárias grupos sulfidrilo . Braço separador prolongado . Conjugação enzima-anticorpo 14,5 Â 103 QUADRO VI (Cont)
Ligador Reactivo com Vantagens e Aplicações Comprimento do braço separador após a interligação Sulfò-SMPB aminas primárias grupos sulfidrilo . Braço separador prolongado . Solúvel em água 14,5 Â EDC/Sulfo-NHS aminas primárias grupos sulfidrilo . Conjugação haplaiu-puitadoia 0 ABH Hidrates de caibono não sdectivos . Reage com grupos de açúcar 11,9 A
Um interligador heterobifuncional exemplifícativo contém dois grupos reactivos: um que reage com o grupo amina primária (v.g., N-hidroxi-succinimida) e o outro que reage com um grupo tiol (v.g., dissulfureto de piridilo, maleimidas, halogénios, etc.). Através do grupo reactivo amina primária, o interligador pode reagir com o(s) resíduo(s) lisina de uma proteína (v.g., o anticorpo ou um fragmento seleccíonado) e através do grupo reactivo tiol esse interligador, já unido à primeira proteína, reage com o resíduo cisteína (grupo sulfidrilo livre) da outra proteína (v.g., o coagulante).
Assim, é possível verificar que os coagulantes preferidos ou as regiões preferidas de ligação dos coagulantes irão ter geralmente um grupo funcional disponível para efeitos de interligação, ou irão ser transformados para que o tenham. Esta exigência não é considerada como sendo limitativa, na medida em que é possível utilizar um grande conjunto de grupos desta maneira. Por exemplo, os grupos amina primária ou secundária, os grupos hidrazida ou hidrazina, os grupos álcool carboxílico, fosfato ou alquilantes podem ser utilizados para ligação ou interligação. Para um estudo geral sobre a tecnologia de ligações recomenda-se a obra de
Gbose & Rlair (1987)
104' O braço separador entre os dois grupos reactivos de um interiigador pode ter diferentes comprimentos e composições químicas. Um braço separador mais comprido permite uma melhor flexibilidade dos componentes do conjugado, ao passo que determinados componentes particulares existentes na ponte (v.g., o grupo benzeno) podem conferir uma maior estabilidade ao grupo reactivo ou uma maior resistência à ligação química contra a acção de diversos agentes (v.g., uma ponte dissulfureto resistente aos agentes redutores). Também está prevista a utilização de separadores peptídicos, tais como L-Leu-L-Ala-L-Leu-L-Ala. É preferível utilizar um interiigador que seja razoavelmente estável no sangue. Há diversos tipos de ligadores que possuem pontes dissulfureto sobre os quais se sabe que podem ser utilizados com êxito para a conjugação de agentes de encaminhamento e ligação de coagulação. Os ligadores que possuem uma ponte dissulfureto que esteja espacialmente obstruída podem conferir maior estabilidade in vivo, impedindo a libertação do coagulante antes da ligação ao local de acção. Assim, tais ligadores constituem um grupo preferido de agentes de ligação.
Um dos reagentes de interligação mais preferidos para utilização nas imunotoxinas é o SMPT que é um interiigador bifuncional que possui uma ponte dissulfureto que está “espacialmente obstruída” por um anel benzeno adjacente e por grupos metilo. Admite-se que a obstrução espacial da ponte dissulfureto desempenhe uma função de protecção da ligação contra ataques pelos aniões tiolato, tais como a glutationa, que possam estar presentes nos tecidos e no sangue, auxiliando assim a evitar o desacoplamento do conjugado antes de o agente acoplado ser administrado ao local do tumor. Prevê-se que também possa ser utilizado o agente SMPT em conjunto com os ligandos de coagulação biespecíficos da presente invenção. O reagente de interligação SMPT, tal como sucede com muitos outros reagentes de interligação conhecidos, confere α capacidade para interligar grupos funcionais, tais como o grupo SH da cisteína ou animas primárias (v.g., o grupo animo ε (épsilon) da lisina). Um outro tipo possível de interligadores c constituído pelas fenilazidas fotorreactivas hetero-bifuncionais que contêm uma ponte dissulfiireto clivável, por exemplo, etil-1,3 ’-ditiopropionato de sulfossuccimmidil-2-(p-azido-salicilamido). O grupo N-hidroxi-succinimidilo reage com o grupo amina pnmáriã e a fenilazida (após a fotõlise) reage de fomia não sclcctiva com qualquer resíduo aminoácido.
Para além dos interligadores obstruídos, de acordo com a presente invenção, também é possível utilizar ligadores não obstruídos. Há outros interligadores úteis, que não contêm nem geram uma ponte dissulfúreto protegida, entre os quais se salienta os interligadores SATA, SPDP e 2-iminotiolano (Wawrzynczak & Thoipe, 1987). A utilização de tais interligadores é perfeitamente conhecida na especialidade.
Uma vez conjugado, o agente biespecífico irá ser geralmente purificado para se separar o conjugado dos coagulantes ou agentes de ataque não conjugados e de outros contaminantes. E importante remover o agente de ataque não conjugado para se evitar a possibilidade de competição pelo antigénio entre as espécies conjugadas e as espécies imo conjugadas. Há um grande número de técnicas de purificação que é possível utilizar na obtenção de conjugados com um grau suficiente de pureza para que sejam clinicamente úteis. De um modo geral, utilizar-se-á mais frequentemente métodos de purificação que se baseiam na separação dimensional, tais como a filtração através de gel, a impregnação em gel ou a cromatografia em líquido de elevado rendimento. Também é possível utilizar outras técnicas cromatográficas, tais como a separação em coluna dc ‘Bluc-Scpharose1 2. 1
Proteínas de fusão recombinantes 2
Os coagulantes propícios biespecíficos da presente invenção também podem ser proteínas de fusão preparadas por técnicas da biologia molecular. A utilização de técnicas do ADN recombinante para se alcançar os objectivos aqui enunciados constitui presentemente uma prática convencional dos especialistas na matéria. Estes métodos compreendem, por exemplo, as técnicas do ADN recombinante in vitro, as técnicas de síntese e a recombinação in v/vo/recombinação genética. Além disso, é possível efectuar a síntese de ADN e de ARN utilizando apajcllios sinletizadorcs automáticos (ver, por exemplo, as técnicas descritas por Sambrook et ai.. 1989; e Ausubel et al., 1989).
Em geral, para a preparação de uma proteína de fusão poder-se-ia unir uma região de codificação de ADN, tal como um gene ou um ADNc, que codifique um ligando de ligação ou outra região de encaminhamento, a uma região de codificação de ADN (isto é, um gene ou um ADNc) que codifique um factor de coagulação ou uma região de ligação coagulante. Isto implica tipicamente a preparação de um vector de expressão que compreenda, no mesmo bloco de leitura, um primeiro segmento de ADN que codifique a primeira região de ligação funcionalmente ligada a um segundo segmento de ADN que codifique um factor de coagulação. As sequências são acopladas de tal modo que a tradução do ácido nucleico total gere os compostos biespecífícos desejados da presente invenção. Os vectores de expressão contêm um ou vários promotores a montante das regiões do ADN inserido que actuam no sentido de favorecer a transcrição do ADN e de favorecer consequentemente a expressão da proteína recombinante codificada. É este o significado do teimo “expressão recombinante”.
Se for preferível um coagulante ou uma região de ligação particulares e se o ADN codificador não estiver imediatamente disponível, é possível obtê-lo recorrendo a técnicas de “clonagem molecular” em que uma molécula de ADN que codifica a proteína desejada é obtida a partir de um banco de ADN (v.g., um banco de ADNc ou genómico). Em tais procedimentos efectua-se uma pesquisa num banco adequado de ADN, v.g., utilizando um protocolo de pesquisa de expressão em que são utilizados anticorpos dirigidos contra a proteína, ou recomendo a ensaios de actividade. Em alternativa, a pesquisa pode basear-se na hibridação de sondas oligonucleotídicas, concebidas a partir de um conjunto de parcelas da sequência de aminoácidos da proteína, ou a partir das sequências de ADN dos genes que codificam proteínas congéneres. A prática de tais protocolos de pesquisa é perfeitamente conhecida pelos especialistas na matéria e encontra-se descrita mmucíosamente na literatura científica, por exemplo, na obra de Sambrook ei al. (1989).
Quando produzidos por técnicas do ADN recombinante, os compostos de agente de encaminhamento/agente coagulante da presente invenção recebem aqui a designação de “proteínas de fusão”. Faz-se observar que tais proteínas de fusão contêm, pelo menos, um agente de encaminhamento e um agente coagulante, tal como definidos na presente invenção, e que esses agentes se encontram funcionalmente acoplados. As proteínas de fusão também podem conter outras sequências peptídicas, tais como separadores peptídicos que liguem funcionalmente os compostos de agente de encaminhamento e de agente coagulante, desde que essas sequências não afectem de forma sensível as actividades de encaminhamento ou coagulantes da proteína de fusão resultante.
Faz-se observar que os ligandos de proteína biespecífica recombinantes podem ser diferentes dos arquétipos biespecíficos obtidos por interligação química das chamadas proteínas produzidas naturalmente. Em particular, o grau das modificações pós-traducionais tais como, por exemplo, a glicosilação e a fosforilação, pode ser diferente entre fusões recombinantes e fusões químicas das mesmas duas proteínas. Não se prevê aqui que isso seja um problema significativo; no entanto, os especialistas na matéria saberão como confirmar se uma proteína de fusão recombinante funciona conforme pretendido e conforme previsível a partir de outros dados, antes de ser utilizada num trabalho clínico.
Uma vantagem da expressão recombinante reside no facto de as regiões de ligação poderem ser manipuladas facilmente, v.g., por forma a que se faça variar facilmente o seu comprimento e/ou a sua composição em aminoácidos. Se desejado, é possível utilizar separadores pcptídicos não cliváveis para o acoplamento funcional dos dois agentes da invenção. De igual modo, poder-se-ia inserir entre os dois componentes péptidos com locais de clivagem exclusivos.
Se desejado, num caso específico, é possível utilizar um separador peptídico que realize o acoplamento funcional do agente de encaminhamento e do agente coagulante, susceptível de ser dobrado dentro de uma estrutura de espira ligada por uma ponte dissulfineto. Λ clivagem proteolítica dentro da espira poderia então proporcionar um polipeptido heterodimérico em que o agente de encaminhamento e o agente coagulante ficariam ligados apenas por uma única ponte dissulfureto (ver, por exemplo, Lord et al, 1992). Há muitas técnicas convencionais para a construção de vectores de expressão que contêm os ácidos nucleicos adequados e as sequências de controlo transcricional/traducional com a finalidade de se conseguir a expressão de proteínas num conjunto de sistemas de expressão em hospedeiros. Os tipos de células disponíveis para a expressão são, sem que isso constitua qualquer limitação, de microorganismos, tais como as bactérias (v.g., E. coli, B. subtilis) transformados com o ADN recombinante de bacteiiófagos, ADN plasmídico ou vectores de expressão de ADN de cosmídeos contendo as sequências de codificação do agente encaminhador/ /agente coagulante; de leveduras (v.g., Saccharomyces, Pichia) transformadas com vectores recombinantes de expressão de leveduras contendo as sequências de codificação do agente encaminhador/agente de coagulação; de sistemas de células de insectos infectados com vectores recombinantes da expressão de vírus (v.g., baculovírus) contendo as sequências codificadoras do agente encaminhador/agente coagulante; de sistemas de células dc plantas infectadas com vedores recombinantes de expressão de vírus (v.g., o vírus do mosaico da couve-flor, designado por VMCf (o mesmo que CaMV)); o vírus do mosaico do tabaco, designado por VMT, o mesmo que TMV) ou transformadas com vectores recombinantes da expressão de plasmídeos (v.g., o plasmídeo Ti) contendo a sequência codificadora do agente encaminhador/agente coagulante; e de sistemas de células de mamíferos (v.g., COS, OCC (o mesno que CHO), KCB (o mesmo que BIIK), 293, 3T3) que albergam arquétipos recombinantes de expressão e que contêm os promotores derivados do genoma de células de mamíferos (v.g., o promotor da metalotioncína) ou provenientes de vírus de mamíferos (v.g., o promotor de adenovírus de expressão derradeira; e o promotor de 7,5 K do vírus de vaccirúa).
Nos sistemas bacterianos é possível seleccionar de forma vantajosa diverso vectores de expressão, dependendo isso da utilização prevista para o arquétipo de agente encaminhador/ /agente coagulante que se pretende exprimir. Por exemplo, no caso de se pretender produzir grandes quantidades de agente biespecífico, podem ser desejáveis vectores que comandem a expressão de níveis elevados de produtos de proteínas de fusão que sejam facilmente purificados. Tais vectores compreendem, sem que isso constitua qualquer limitação, o vector de expressão pUR278 de E. coli (Ruther et al., 1983), em que a sequência codificadora do agente encaminhador/agente coagulante pode ser ligada individualmente dentro do vector, concatenada com a região de codificação de lac Z por forma a que seja obtida uma proteína de fusão que contenha também uma parte do produto de lac Z; os vectores de pIN (Inouye et al., 1985; Van Heeke et al, 1989); e outros que tais. Também é possível utilizar os vectores de pGEX para exprimir polipeptidos exógenos, tais como as combinações de agente encaminhador/ /agente coagulante, como proteínas de fusão que contenham também a glutaliona-S-transferase (GST). Em geral, tais proteínas de fusão são solúveis e podem ser purificadas facilmente a partir de células desmembradas, por adsorção em esférulas de glutationa-agarose, seguindo-se a eluição na presença de glutationa livre. Os vectores de pGEX são concebidos de forma a conterem locais de clivagem da protease da trombina ou do factor Xa, de modo que a proteína de agente de ligação/agente coagulante da proteína global de fusão possa ser libertada a partir do radical de GST.
Num sistema útil de insectos, utiliza-se o vírus da poliidrose nuclear àe Autograph califomica (VPNAc, o mesmo que AcNPV) como vedor para a expressão de genes exógenos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. As sequências codificadoras do agente encaminhador/agente coagulante podem ser clonadas dentro de regiões não essenciais (por exemplo, o gene da poliedrina) do vinis e podem ser colocadas sob o controlo de um promotor do VPNAc (por exemplo, o promotor de poliedrina). A inserção bem sucedida das sequências codificadoras do ligando biespecífico irá ter como consequência a inactivação do gene da poliedrina e a produção de vírus recombinantes não oclusos (isto é, vírus aos quais falta a camada proteinácea codificada pelo gene da poliedrina). Estes vírus recombinantes são depois utilizados para infectar células de Spodoptera frugiperda nas quais é expresso o gene inserido (v.g., ver a obra de Smith et al., 1983; * patente de invenção norte-americana n° 4 215 051 de Smitb).
Nas células hospedeiras de mamíferos é possível utilizar diversos sistemas de expressão de base virai. Nos casos em que se utiliza o adenovírus como vector de expressão, as sequências codificadoras do agente encaminhador/agente coagulante podem ser ligadas a um complexo de controlo de transcrição/tradução de adenovírus, v.g:, o promotor de expressão derradeira e a sequência lido- tripartida. Este gene quimérico pode ser inserido então no genoma do adenovírus por recombmação in vitro ou tn vtvo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (v.g., a região EI ou a região E3) irá ter como consequência um vírus recombinante que é viável e capaz de exprimir proteínas biespecíficas cm hospedeiros infectados (v.g., ver a obra de Logan eí al., 1984).
Eventualmente também podem ser necessários sinais específicos de iniciação para a tradução eficiente das sequências codificadoras inseridas de agente encaminhador/agente coagulante. Estes sinais compreendem o codão de iniciação ATG e as sequências adjacentes. E possível que seja pode ser necessário fornecer também sinais de controlo traducionais exógenos, incluindo o codão de iniciação ATG. Um especialista na matéria poderia determinar isto facilmente e fornecer os sinais necessários. Sabe-se perfeitamente que o codão de iniciação tem de estar em fase (ou concatenado) com o bloco de leitura da sequência de codificação desejada para garantir a tradução de todo o segmento intercalar. Estes sinais de controlo traducionais exógenos e estes codões de iniciação podem ser provenientes de diversas origens, tanto naturais como sintéticos. A eficiência da expressão pode ser reforçada pela inclusão de elementos adequados de reforço da transcrição, terminadores da transcrição, etc. (ver a obra de Bittner et al., 1987).
Além disso, é possível escolher uma estirpe de células hospedeiras que modulem a expressão das sequências inseridas ou que modifiquem e transformem o produto gémeo pela forma específica desejada. Tais modificações (v.g., a gheosilação) e transformações (v.g., a clivagem) dos produtos proteínicos podem ser importantes para a actividade da proteína. Células hospedeiras diferentes possuem características e mecanismos específicos para a transformação pós-traducional e para a modificação de proteínas. É possível seleccionar linhagens de células ou sistemas hospedeiros adequados que garantam a modificação e a transformação conectas da proteína exógena expressa. Para o efeito, é possível utilizar células hospedeiras eucarióticas que possuam os maquinianos celulares para a transformação conecta do transcrito primário, da glicosilação e da fosforilação do produto gémeo. Tais células hospedeiras de mamíferos compreendem, sem que isso constitua qualquer limitação, as seleccionadas entre células OCC, VERO, RCB, HeLa, COS, ‘MDCK’, 293, 3T3, WI38, etc..
Para uma produção a longo prazo e de elevado rendimento de proteínas recombinantes, é preferível uma expressão estável. Por exemplo, é possível engendrar linhagens de células que exprimam de forma estável arquétipos que codifiquem os ligandos de agente encaminhador/agente coagulante. Em vez de se utilizar vectores de expressão que contenham as origens virais de replicação, é possível transformar as células hospedeiras com ADN de agente encaminhador/ /agente coagulante, controlado pelos elementos adequados de controlo da expressão (y.g., promotor, intensificador, sequências, terminadores de transcrição, locais de poliadenilação, etc.) e por um marcador seleccionável. A seguir à introdução o ADN exógeno, as células engendradas artificialmente podem ficar a crescer durante 1 ou 2 dias num meio enriquecido e depois podem ser transferidas para um meio selectivo. O marcador seleccionável no plasmídeo recombinante confere resistência à selecção e permite que as células integrem de forma estável o plasmídeo nos seus cromossomas e cresçam para formarem focos que por sua vez podem ser clonados e aumentados em número em linhagens celulares. E possível utilizar diversos sistemas de selecção, incluindo, sem que isso constitua qualquer limitação, os genes da timidina-cinase do vírus do herpes simplex (Wigler et d, 1977), da fosfonibosil-transferase da hipoxantína-guanina (Szybalska et ai, 1962) e de fosforribosil--transferase da adenina (Lowy et ai, 1980) respectivamente nas células tk, hgprt ou aprt Além disso, também é possível utilizar a resistência antimetabolitos como base de selecção de dhfr, o que confere resistência ao metotrexato (Wigler et cd., 1980; 0’IIarc et al., 1981); de gpt, o que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan et al., 1981); de neo, o que confere resistência ao aminoglicósido G-418 (Colberre-Garapin et al, 1981); e de higro, o que confere resistência à higromicina (Santerre et al, 1984). D. Anticorpos
No caso de serem utilizados anticorpos que constituam uma ou as duas partes de um ligando bicspecífico, a escolha do anticorpo irá depender geralmente do tipo de tumor e do ligando coagulantc escolhido. No entanto, é possível obter determinadas vantagens mediante a aplicação de tipos particulares de anticorpos. Por exemplo, é previsível que os anticorpos à base de IgG revelem uma melhor capacidade de ligação e um menor período de depuração sanguínea do que as suas partes equivalentes Fac’, ao passo que as composições à base de fragmentos de Fac’ irão revelar geralmente uma melhor capacidade de penetração nos tecidos. 1. Anticorpos Monodonais Métodos para preparar e caracterizar anticorpos bem conhecidos na especialidade (ver, por exemplo, Antibodies: A Laboratoiy Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
Os métodos para gerar anticorpos monodonais (AcM) começam geralmente de forma idêntica aos utilizados para a preparação de anticorpos policlonais. Dito de forma abreviada, prepara-se um anticorpo policlonal imunizando um animal com uma composição imunogénica de acordo com a presente invenção, fazendo ou não com que fique previamente imunotolerante, dependendo isso da composição antigénica e do protocolo praticado (v.g., conferir tolerância a uma população de células normais e imunizá-lo depois com uma população de células tumorais), efectuando-se depois a recolha dos anti-soros a partir desse animal imunizado. É possível utilizar uma grande variedade de espécies animais para a produção de anti-soros. De forma típica, o auiuial utilizado para a produção dc anti-anti-soros é um coelho, um murganho, um rato, um criceto, uma cobaia ou uma cabra. Devido ao volume de sangue relativamente grande dos coelhos, este animal constitui a melhor escolha preferida para a produção de anticorpos policlonais.
Conforme é perfeitamente sabido na especialidade, uma determinada composição pode ter uma imunogenicidade variável. Por esse motivo é ffequentemente necessário estimular o sistema imunitário do hospedeiro, o que pode ser efectuado acoplando um péptido ou um imunogénio polipeptídico a um veículo. Como exemplos de veículos preferidos refere-se a hemocianina de Armorica rusíicana (HAR) e a albumina do soro de bovinos (ASB). Também é possível utilizar como veículos outras albuminas, tais como a ovalbumina, a albumina do soro do murganho ou a albumina do soro de coelho. Os métodos para conjugar um polipeptido com uma proteína portadora são bem conhecidos na especialidade e compreendem os métodos do glutaraldeído, do éster de m-maleimidobencoíl-N-hidroxi-succinimida, da carbodiimida e das bis-benzidina biazotada.
Conforme se sabe também na especialidade, é possível reforçar a imunogenicidade de uma composição imunogénica mediante a utilização de estimuladores não específicos da resposta imunitária, conhecidos pela designação de adjuvantes. Como exemplos de adjuvantes preferidos refere-se o adjuvante completo de Freund (um estimulador não específico da resposta imunitária que contém o microrganismo Mycobacterium tuberculosis morto), os adjuvantes incompletos de Freund e o adjuvante de hidróxido de alumínio. A quantidade de composição imunogénica utilizada para a produção de anticorpos policlonais varia com a natureza do agente imunogénico e também com o animal utilizado para a imunização. É possível recorrer a inúmeras vias para a administração do agente imunogénico (subcutânea, intramuscular, intradermal, intravenosa e introperitoneal). A produção dc anticorpos policlonais pode ser verificada retirando amostras de sangue do animal imunizado, em diversos momentos a seguir à imunização. Também é possível administrar ao animal uma segunda injecção de reforço estimulador. Repete-se o processo de estimulação e titulação até sc obter uma titulação conveniente. Depois de obtido o nível desejado de titulação, é possível retirar sangue do animal imunizado e isolar o soro e guardá-lo, e/ou o animal pode ser utilizado para gerar os AcM. É possível preparar facilmente os AcM mediante a utilização de técnicas bem dominadas, tais como as que vêm exemplificadas na patente de invenção norte-americana n° 4 196 265, documento que aqui se considera incorporado por referência. De forma típica, esta técnica implica a imunização de um animal adequado com uma composição imunogénica escolhida, v.g., uma célula tumoral purificada ou parcialmente purificada ou uma proteína de uma célula endotelial vascular, um polipeptido, um péptido ou uma composição de células intactas. Administra-se a composição imunizante de uma forma eficaz para estimular as células produtoras de anticorpos. Os roedores como os murganhos e os ratos são os animais preferidos; no entanto, também é possível utilizar células de coelhos, ovelhas e rãs. A utilização de ratos pode proporcionar determinadas vantagens (*Goding, 1986, pág. 60-61), mas são preferíveis os murganhos, sendo mais preferível a estirpe de murganhos BALB/c, na medida em que é a estirpe mais vulgarmente utilizada e permite obter geralmente uma percentagem mais elevada de fusões estáveis. A seguir à imunização, as células somáticas com potencial para a produção de anticorpos, especificamente os lmfócxtos B (células B), são seleccionadas para serem utilizadas no protocolo de geração dos AcM. Estas células podem ser obtidas a partir de biópsias de baços, amígdalas ou nodos linfáticos, ou a partir de uma amostra do sangue periférico. São preferíveis os esplenócitos e as células do sangue periférico, os primeiros porque constituem uma fonte rica de células produtoras de anticorpos que se encontram na fase de divisão plasmablástica, e as últimas porque o sangue periférico é facilmente acessível. Frequentemente imunizar-se-á um painel dc animais, retirar-se-á o baço do animal com a mais elevada concentração de anticorpos e proceder-se-á à obtenção dos linfócitos do baço por meio de uma seringa após homogeneização do baço. De forma típica, o baço de um murganho imunizado contém aproximadamente entre 5 x 107 a 2 x 10* linfócitos.
Os linfócitos B produtores de anticorpos, retirados de um animal imunizado, são então fundidos com células de um mieloma imortal, geralmente um mieloma da mesma espécie do animal que foi imunizado. As linhagens celulares de mielomas, adequadas para utilização nos procedimentos de fusão produtores de hibridomas, são preferencialmente não produtoras de anticorpos, possuem uma elevada eficiência de fusão e insuficiências enzimáticas que fazem com que sejam incapazes de crescerem em determinados meios selectivos que suportam apenas o crescimento das células fundidas desejadas (hibridomas). É possível utilizar uma qualquer de entre as inúmeras linhagens de células de mielomas, conforme é perfeitamente sabido pelos especialistas na matéria (*Goding, págs. 65-66, 1986; ♦Campbell, págs. 75-83, 1984). Por exemplo, se o animal imunizado for um murganho, é possível utilizar P3-X63/Ag8, X63-Ag-Ag8.653, NSl/l.Ag 4 1, Sp210-Agl4, FO, NNSO/U, MPC-11-X45-GTG 1.7 e S194/5XX0 Bul; se for um rato, é possível utilizar R210.RCY3, Y3-Ag 1.2.3, IR983F, 4B210 ou uma das linhagens celulares de murganhos anteriormente enumeradas; e também IJ-266, GGM1500-GRG2, LICR-LON-HMy2 e UC729-6, sendo todas estas linhagens úteis para efeitos de fusão com células humanas.
Uma célula preferida de mieloma dos murinos é a A63-A68, da linhagem de células do mieloma 653, que se pode obter facilmente na instituição ATCC. Outra linhagem de células de mieloma do murganho que pode ser utilizada é a linhagem de células não produtoras SP2/0 do mieloma dos murinos (murganhos) resistente à 8-azaguanina.
Os métodos para gerar híbridos de células de mielomas, células de nodos linfáticos ou de linfócitos produtores de anticorpos, compreendem geralmente a mistura de células somáticas com células de mieloma numa proporção de 4:1, embora a proporção possa variar entre cerca de 20:1 e cerca de 1:1, na presença de um ou vários agentes (químicos ou eléctricos) que favoreçam a fusão de membranas celulares. Foram já descritos métodos de fusão utilizando o vírus de Sendai, na obra de Kohler e Milstein (1975; 1976), e também os métodos em que se utiliza o polietileno-glicol (PEG), tal como o PEG a 37% (v/v), conforme consta na obra de Gefter et cd. (1977). Também é adequada a utilização de métodos de fusão induzida electricamente (*Goding, pág. 71-74, 1986).
Os procedimentos de fusão produzem normalmente híbridos viáveis em frequências baixas, da ordem de cerca de 1 x IO-6 a 1 x 10*. No entanto, isto não constitui nenhum problema, na medida em que os híbridos viáveis fundidos são diferenciados a partir de células progenitoras não fundidas (em particular as células não fundidas de mieloma que normalmente prosseguiriam a sua divisão indefinidamente), por criação em cultura num meio selectivo. O meio selectivo é geralmente um meio que contém o agente que bloqueia a síntese de novo de nucleótidos nos meios de cultura de tecidos. Como exemplos de agentes preferidos refere-se a aminopterina, o metotrexato e a aza-serina. A aminopterina e o metotrexato bloqueiam a síntese de novo quer das purinas quer das pirimidinas, ao passo que a aza-serina bloqueia apenas a síntese das purinas. No caso de se utilizai' aminopterina ou metotrexato, os meios são enriquecidos com hipoxantina e timidina como fontes de nucleótidos (meio HAT). No caso de se utilizar aza-serina, o meio é enriquecido eom liipoxantina. O meio de selecção preferido é o meio HAT. Apenas as células que são capazes de actuar cm circuitos de recuperação nucleotídicos conseguem sobreviver no meio HAT. As células dos mielomas são defectívas em enzimas fundamentais do circuito de recuperação, v.g., a hipoxantina-fosforribosil-transferase (HPRT), e não conseguem sobreviver. As células B podem actuar neste circuito, mas possuem um período de vida limitado em cultura e geralmente morrem em menos de cerca de duas semanas. Por tal motivo, as únicas células que conseguem sobrevivo* nos meios selecti vos são os híbridos formados a partir das células B e das células do mieloma.
Este processo de cultura permite obter uma população de hibridomas a partir dos quais é possível seleccionar hibridomas específicos. De foima típica, efectua-se a selecção de hibridomas criando em cultura as células por diluição de clones em placas de microtitulação, seguindo-se os testes efectuados a cada um dos sobrenadantes dos clones (ao fim de cerca de duas a três semanas) para pesquisa da reactividade desejada O ensaio deve ser de natureza sensível, simples e rápido, por exemplo, deve ser um radioimunoensaio, um ensaio enzimático, um ensaio de citotoxicidade, um ensaio em placa, um imunoensaio autorradiográfico de ligação e outros que tais.
Os hibridomas seleccionados poderiam então ser diluídos em série e clonados dentro de linhagens de células produtoras de anticorpos individuais, podendo tais clones ser propagados indefinidamente para a obtenção dos AcM. As linhagens celulares podem ser exploradas para a produção dos AcM de duas maneiras elementares. E possível injectar uma amostra do hibridoma (normalmente na cavidade peritoneal) num animal histocompatível do tipo que foi utilizado para se obter as células somáticas e de mieloma para a fusão original O animal injectado desenvolve tumores que segregam o anticorpo monoclonal específico produzido pelo híbrido de células fundidas. Os fluidos corporais do animal, tais como o soro ou o fluido ascítico, podem ser então drenados para se obter os AcM com uma concentração elevada As linhagens de células individuais também poderiam ser criadas em cultura in vitro, sendo os AcM segregados naturalmente para dentro do meio de cultura a partir do qual podem ser facilmente obtidos com concentrações elevadas. Os AcM produzidos por qualquer das vias podem ser, se desejado, purificados ainda mais recorrendo a métodos de filtração, centrifugação e diversos processos cromatográficos, tais como a CLER ou a cromatografiapor afinidade.
Os inventores também prevêem a utilização de uma clonagem molecular para a geração de anticorpos monoclonais. Para tal, efectua-se a preparação de bancos de fagomídeos de imunoglobulinas combinatoriais a partir do ARN isolado a partir do baço de um animal imunizado, sendo os fagomídeos que exprimem os anticorpos adequados seleccionados por escolha criteriosa, utilizando células que exprimam o antigénio e células de contraprova, v.g., células tumorais em presença de células normais. As vantagens desta forma de resolver a questão, comparativamente com as técnicas convencionais dos hihridomas, residem no facto de neste caso serem obtidos e pesquisados cerca de 104 vezes mais anticorpos numa única experiência e no facto de serem geradas novas especificidades pela combinação das cadeias H e L, o que aumenta ainda mais a probabilidade de serem encontrados anticorpos adequados.
Se na presente invenção forem utilizados AcM, estes podem ser provenientes de seres humanos, murinos, macacos, ratos, cricetos, galinhas ou coelhos. A invenção prevê a utilização de anticorpos humanos, anticorpos “humanizados” ou quiméricos provenientes de espécies tais como murganhos, ratos e outras, portadoras de domínios de regiões humanas constantes e/ou variáveis, c ainda prevê a utilização de outros anticorpos rccombinantcs e seus fragmentos.
Como é evidente, devido à facilidade de preparação e de obtenção dos reagentes, são tipicamente preferidos os anticorpos monoclonais dos murinos. 2. Regiões de ligação de anticorpos funcionais A origem rm proveniência do anticorpo ou do fragmento de anticorpo (v.g., Fac\ Fac, F(ac’)2, Fv ou Fvcs) do agente de encaminhamento não é particulannente crítica para a prática da invenção, na medida em que o anticorpo ou o fragmento que presentemente é utilizado para a preparação do ligando biespecífico possui as propriedades de ligação desejadas.
Evcntualmcnte pode ser necessário utilizar preparações de anticorpos em que tenha sido removida a parcela Fc. É possível conseguir a fragmentação de moléculas de imunoglobulina por proteólise controlada, embora as condições possam variar consideravelmente com a espécie e a classe ou subclasse de imunoglobulinas. Os fragmentos bivalentes F(ac’)2 são normalmente preferíveis comparativamente com os fragmentos univalentes Fac ou Fac’.
Fac É possível obter fragmentos Fac por proteólise da imunoglobulina intacta por acção da tiol-protease não especifica, a papaína. Em primeiro lugar é necessário activar a papaína mediante a redução do grupo sulfidrilo no local activo com cisterna, 2-mercaptoetanol ou ditiotreitol. Os metais pesados existentes na provisão de enzimas de armazenagem têm de ser removidos por quelação com EDTA (2 mM), para se garantir a máxima actividade enzimática. Normalmente mistura-se entre si a enzima e o substrato numa proporção em peso igual a 1:100. A seguir à incubação é possível interromper a reacção por alquilação irreversível do grupo tiol com iodoacetamida ou simplesmente por diálise. A perfeição e a qualidade da digestão têm de ser verificadas por EGPA-DSS e as diversas fraeções têm de ser separadas por cromatografia de permuta iónica ou em coluna de proteína ‘A-Sepharose’.
F(ac’)2 O procedimento vulgar para a preparação de fragmentos de F(ac’)2 a partir de IgG de coelho ou de origem humana está limitado à proteólise pela enzima pepsina (protocolo 7.3.2). As condições de trabalho, designadamente 100 vezes um excesso de anticorpo (p/p) em tampão acetato a pH 4,5 e à temperatura de 37°C sugerem que o anticorpo é clivado no lado do terminal C da ponte dissulfureto da intercadeia pesada. Os regimes e ritmos de digestão da IgG de murganho podem variar consoante a subclasse e eventualmente pode ser difícil conseguir rendimentos elevados na obtenção de fragmentos activos F(ac’)2 sem que alguma IgG fique por digerir ou seja completamente degradada Em particular, a IgGa é altamente sensível a uma degradação completa. Com as outras subclasses são necessárias condições de incubação diferentes para a obtenção dos melhores resultados. A digestão da IgG de rato pela pepsina impõe condições entre as quais se salienta a diálise em tampão acetato 0,1 M a pH 4,5 e a subsequente incubação durante 4 horas com pepsina a 1% p/p; a digestão de IgGi e de IgG2a é melhorada se for efectuada em primeiro lugar a sua diálise em tampão formato 0,1 M a pH 2,8 e à temperatura de 4°C durante 16 horas, seguindo-se a substituição por tampão acetato. A IgG^ dá origem a resultados mais consistentes com incubação em protease V8 estafilocócica (a 3% p/p) em tampão de fosfato de sódio 0,1 M a pH 7,8 durante 4 horas à temperatura de 37°C. 3. Anticorpos bíespecíficos
Em geral, a preparação de anticorpos bíespecíficos é bem conhecida na especialidade, conforme exemplificado por Glennie et al. (1987). Os anticorpos bíespecíficos foram já utilizados para fins clínicos, por exemplo, para o tratamento de pacientes com cancro (Bauer et al, 1991). Há um método para a preparação de anticorpos biespecíficos que implica a preparação independente de anticoipos que possuam, por um lado, especificidade para o antigénio das células tumorais visadas, e possuam, por outro lado, especificidade para o agente coagulante (ou outro alvo desejado, tal como um antigénio activador).
Também foram já desenvolvidos anticoipos biespecíficos, em particular para utilização como agentes imunoterapêuticos. Conforme se disse anteriormente, a propósito da indução de antigénios, foram já desenvolvidos determinados anticorpos que efectuam a interligação de linfócitos e antigénios tumorais (Nelson, 1991; Segai et al, 1992). Como exemplos refere-se as moléculas quiméricas que ligam as células T, v.g., às CD3, e os antigénios tumorais e que desencadeiam a activação de linfócitos ao interligarem fisicamente o complexo de TCR/CD3 em grande proximidade com as células visadas (Staerz et al., 1985; Perez et al., 1985; 1986a; 1986b; Tinge/ al., 1988).
Com efeito, foi já afirmado que as células tumorais de carcinomas, linfomas, leucemias e melanomas são sensíveis à aniquilação por acção das células T, mediada por anticorpos biespecíficos (Nelson, 1991; Segai et al., 1992; deLeij et al., 1991). Este tipo de anticorpos biespecíficos foi já utilizado em várias experiências clínicas de Fase I contra diversos alvos tumorais. Embora não sejam composições novas, segundo a presente invenção, também está prevista a utilização combinada de anticoipos de interligação biespecíficos conjuntamente com os ligandos de coagulação biespecíficos aqui descritos. Os anticorpos de interligação biespecíficos podem ser administrados conforme descrito nas obras de referência de deLeij et al. (1991); Clark et al. (1991); Rivoltini et al. (1992); Bolhuis et al. (1992): e Nitta et al. (1990).
Embora sejam conhecidos muitos métodos na especialidade para a preparação de anticoipos biespecíficos, o método de Glennie et al. (1987) implica a preparação de fragmentos pépticos F(ac’y)2 a partir de dois anticorpos escolhidos, seguindo-se a redução de cada um para se obter fragmentos independentes Fac’ysH (° mesmo que Fab’ysH). Os grupos SII dc um dos dois elementos do par que se pretende acoplar são então alquilados com um reagente de interligação, tal como a o-fenileno-dimaleimida, para proporcionar grupos maleimida livres num dos elementos do par. Este elemento do para pode ser então conjugado com o outro por meio dc uma ponte tioéter para se obter o heteroconjugado desejado F(ac’y)2.
Devido à facilidade de preparação, elevado rendimento e reprodutibilidade, o método de Glennie et al. (1987) é muitas vezes preferido para a preparação de anticorpos biespecíficos; no entanto, é possível utilizar muitas outras soluções, o que está previsto pelos inventores. Por exemplo, são conhecidas outras técnicas em que se efectua a interligação com SPDP ou proteína A, ou em que se prepara um arquétipo triespecífico (Titus et d., 1987; Tutt et d, 1991).
Outro método para a produção de anticorpos biespecíficos é a fusão de dois hibridomas para formarem um quadroma (Flavell et al., 1991, 1992; Pimm et al., 1992; French et d, 1991; Embleton et al., 1991). Tal como aqui utilizado, o termo “quadroma” tem por objecto descrever a fusão produtiva de dois hibridomas de células B. Utilizando agora técnicas convencionais, efectua-se a fusão de dois hibridomas produtores de anticorpos para se obter células descendentes, sendo então seleccionadas as células que tenham mantido a expressão dos dois conjuntos de genes de imunoglobulina do clonotipo.
Um método preferido para a geração de um quadroma implica a selecção de um mutante, deficiente cm enemas, pelo menos dc um dos hibridomas progenitores. Esta primeira linhagem de células de hibndoma mutante é depois fundida com as células de um segundo hibridoma que tenha sido exposto letalmente, v.g., à iodoacetamida, obstando à sua sobrevivência ininterrupta. A fusão de células permite salvar o primeiro hibridoma mediante a aquisição do :7 124 // gene para a sua deficiência enzimátíca, a partir do hibridoma tratado letalmente, e permite salvar o segundo hibridoma através da fusão com o primeiro hibridoma. E preferível, mas não necessário, a fusão de imunoglobulinas do mesmo isodpo, mas de uma subclasse diferente. Um anticorpo de uma subclasse mista permite o recurso a um ensaio alternativo para o isolamento de um quadroma preferido.
Explicado de forma mais minuciosa, há um método para o desenvolvimento e pesquisa de quadromas que implica a obtenção de uma linhagem de hibridomas que segregue o primeiro AcM escolhido e fazer com que este passe a ser deficiente em enzima metabólica essencial, a hipoxantina-giianina-fosforribosil-transferase (HGPRT). Para se obter os mutantes deficientes do hibridoma, deixa-se as células crescer na presença de concentrações cada vez maiores de 8-azaguanina (1 x 10" M a 1 x 10' M). Os mutantes são subclonados por diluição limitante e testados para pesquisa da sua sensibilidade à hipoxantma/aminopterina/timidina (HAT). O meio de cultura pode ser, por exemplo, o MEMD enriquecido com 10% de SFV, L-glutamina 2 raM e penicilma-estreptomicina 1 mM.
Utiliza-se uma linhagem de células de hibridoma, complementar, que produza o segundo AcM desejado para se gerar os quadromas por técnicas convencionais de fusão de células (Galfie et cã., 1981) ou utilizando o protocolo descrito por Clark et cã. (1988). Dito de forma resumida, mistura-se 4,5 x 107 primeiras células sensíveis a HAT com 2,8 x 107 segundas células resistentes a HAT que tenham sido previamente tratadas com uma dose letal de iodoacetamida, enquanto imbidor bioquímico irreversível (5 mM em soluto salino tamponado com fosfato), durante 30 minutos sobre gelo antes da fusão. A fusão celular é induzida utilizando polietileno-glícol (PEG) e depois as células são distribuídas por placas de microcultura de 96 cavidades. Efectua-se a selecção dos quadromas utilizando um meio que contem HAT. As culturas que contêm os anticorpos biespecíficos são identificadas recorrendo, por exemplo, a um protocolo de EISLE em fase sólida especifico do isotipo e recorrendo também à contrastação por imunofluorescência específica do isotipo.
De acordo com uma variante de identificação para se identificar o anticorpo biespecífico, electua-se o revestimento das cavidades das placas de microtitulaçáo (Falcon, Becton Dickinson Labware) com um reagente que interactue de forma especifica com um dos anticorpos primitivos do hibridoma e ao qual falte interreactividade com os dois anticorpos. Depois as placas são lavadas e bloqueadas e os sobrenadantes (SN) que se pretende testar são acrescentados a cada cavidade. Efectua-se a incubação das placas à temperatura ambiente durante 2 horas, deita-se fora os sobrenadantes, efectua-se a lavagem das placas e acrescenta-se o conjugado diluído de fosfatase alcalína-anti-anticorpo durante 2 horas à temperatura ambiente. Efectua-se nova lavagem das placas e acrescenta-se um substrato de fosfatase, v.g., fosfato de p-nitrofenilo (Sigma, St. Louis) a cada cavidade. Depois, as placas ficam a incubar, acrescenta-se a cada cavidade NaOH 3N para interromper a reacção e determina-se os valores DO410 utilizando para tal um leitor para 0 protocolo de EISLE.
De acordo com outra variante de identificação, são utilizadas placas de microtitulação previamente tratadas com poli-L-lisina para ligar uma das células destinatárias a cada cavidade e depois as células são estabilizadas, v.g., utilizando glutaraldeído a 1%, e os anticorpos biespecíficos são testados para pesquisa da sua capacidade para se ligarem à célula intacta. Além disso, é possível recorrer a métodos de SCAF, contrastação por imunofluoFescência, ensaio com anticorpos específicos de idíotipos, ensaios de competição pela ligação com o antigénio e outros métodos vulgares na especialidade de caracterização de anticorpos, em conjunto com a presente invenção, para a identificação dos quadromas preferidos. A seguir ao isolamento do quadroma, efectua-se a purificação dos anticorpos biespecíficos separando-os de outros produtos celulares. Isto pode ser realizado por diversos procedimentos de isolamento de proteínas, conhecidos pelos especialistas em purificação de imunoglobulinas. A metodologia para a preparação e caracterização de anticorpos é bem conhecida na especialidade (ver, v.g., Antibodies: A Laboratory Manual, 1988).
Por exemplo, faz-se passar os sobrenadantes de quadromas selecdonados sobre colunas de ‘Sepharose’ de proteína A ou de proteína G para a ligação da IgG (consoante o isotipo). A eluição dos anticorpos ligados tem então lugar, v.g., em tampão citrato a pH 5,0. As fracções eluídas que contêm os AcLs (o mesmo que BsAbs) são submetidas a um processo de diálise em presença de um tampão isotónico. Em alternativa, também é possível fazer passar o eluído sobre uma coluna de anti-imunoglobulina-‘Sepharose ’. Realiza-se então a eluição dos AcLs com cloreto de magnésio 3,5 M. Os AcLs assim purificados são depois testados para pesquisa da sua actividade de ligação, v.g., segundo um protocolo de EISLE específico do isotipo e por meio de um ensaio de contrastação por imunofluorescência das células destínatárias, conforme descrito supra.
Os AcLs purificado e os anticorpos originais (progenitores) também podem ser caracterizados e isolados por um protocolo de electroforese (EGPA-DSS), seguindo-se a contrastação com prata ou corante de Coomassie. Isto é possível se um dos anticorpos originais tiver um peso molecular superior ao do outro, caso em que a banda dos AcLs migra a meio caminho entre os dos dois anticorpos originais. A redução das amostras verifica a presença de cadeias pesadas com dois pesos moleculares aparentes diferentes.
Além do mais, está agora disponível tecnologia recombinante para a preparação de anticorpos em geral, permitindo a preparação de genes de anticorpos rccombinantcs que codificam um anticorpo que possui a especificidade dupla desejada (Van Duk et al., 1989). Assim sendo, a seguir à selecção dos anticorpos monoclonais que possuem as características de ligação mais preferenciais, é possível isolar os correspondentes genes para esses anticorpos, v.g., por pesquisa imunológica de um banco de expressão de bacteriófagos (Oi e Morrison, 1986; Wrnter & Milstem, 1991). Depois, através do rearranjo dos domínios de codificação do Fac, é possível obter facilmente o arquétipo quimérico adequado. E. Ensaios de Ligação
Embora a presente invenção tenha uma utilidade significativa nos regimes de tratamento de animais e de seres humanos, tem também muitas outras aplicações práticas. Tais aplicações estão geralmente relacionadas com a capacidade de ligação específica dos compostos bi-específicos. Na medida em que todos os compostos da invenção possuem pelo menos um componente de ataque e de ligação, v.g., um anticorpo, um ligando, um receptor ou outro componente congénere, o arquétipo biespecífico resultante pode ser usado virtualmente em todos os casos de ligação em que seja possível utilizar o anticorpo, o ligando ou o receptor (etc.) originais. A presença do coagulante, ou de outras regiões de ligação, não anula a utilidade das primeiras regiões de ligação em nenhum ensaio de ligação.
Posto isto, é possível utilizar os ligandos de coagulação biespecíficos em ensaios de ligação convencionais, tais como os ensaios de imunotransferência, as autorradiografias à Western e outros ensaios em que um antigénio fique imobilizado sobre uma matriz de suporte sólido, v.g., nitrocelulose, ‘nylon’ ou uma sua combinação. Esses ligandos podem ser utilizados simplesmente como um “substituto de anticorpos” ou podem ser utilizados para proporcionarem um meio dc dctccção mais específico utilizável na dctecção dc antigenios contra os quais os reagentes secundários convencionais geram um nível autónomo inaceitavelmente elevado. Isto é particularmente útil quando os próprios antigénios estudados são imunoglobulinas ou quando são utilizados outros anticorpos no procedimento, conforme adiante exemplificado no caso dos protocolos de EISLE.
Us iigandos de ligação biespecíficos também podem ser utilizados em conjunto com blocos de tecidos embebidos em parafina, quer recém-congelados quer estabilizados em formalina, em imunoi stoquímica, em selecção de células activadas pela fluorescência, em citometria de fluxo ou microfluorometria de fluxo, em imunoprecipitação para separar de uma mistura complexa um antigénio destinatário, caso em que podem mesmo, devido ao seu potencial para formarem matrizes moleculares, chegar à precipitação sem um reagente secundário acoplado à matriz, em variantes de purificação de antigénios ou de células, tais como a cromatografia por afinidade, incluindo mesmo, em determinados casos, a purificação rápida, de um só passo, de uma ou várias populações de células ao mesmo tempo, e ainda em muitos outros ensaios de ligação que passarão a ser conhecidos pelos especialistas na matéria tendo em conta a informação aqui apresentada.
Como exemplo, os Iigandos biespecíficos da invenção podem ser utilizados em protocolos de EISLE. São conhecidos muitos protocolos de EISLE que são vulgarmente praticados na especialidade.. Os Iigandos biespecíficos podem ser utilizados em todos os passos de ligação, dependendo isso do tipo particular do protocolo de EISLE que esteja a ser praticado e do “antigénio” (componente) que se pretenda detectar. Assim sendo, os Iigandos poderiam ser utilizados para recobrir a placa, para competir por locais de ligação, como um antigénio para se obter uma curva normalizada, como um ligando de ligação primário, como um ligando de ligação secundário ou mesmo como um ligando de ligação terciário ou dc outra ordem. Os inúmeros modos de executar os protocolos de EISLE são conhecidos pelos especialistas na matéria, tendo em conta os novos esclarecimentos do modo exemplifícarivo adiante descrito.
De acordo com uma forma de um protocolo de EISLE, os alvos de ligação, geralmente os próprios anticorpos, são imobilizados sobre uma superfície escolhida, de preferência «ma superfície que revele uma afinidade com proteínas, por exemplo, as cavidades dc uma placa de microtitulação feitas de poliestireno. Depois da lavagem para se efectuar a remoção material incomplctamcnte adsorvido, é desejável ligar às cavidades da placa de ensaio, ou recobri-las, com uma proteína não específica sobre a qual se saiba que é neutra sob o ponto de vista antigénico, tendo em conta os anti-soros testados, tais como a albumina do soro de bovinos (ASB), a caseína ou soluções de leite em pó. Isto permite bloquear os locais de adsorção não específicos sobre a superfície imobilizadora e reduzir assim o nível autónomo gerado pela ligação não específica dos anti-soros sobre a superfície.
Nestes tipos de protocolos de EISLE, geralmente designados por protocolos de EISLE em sanduíche, o anticorpo ligado à placa serve para “capturar” o antigénio. Depois da ligação do primeiro anticorpo à cavidade, do revestimento com um material não reactivo para reduzir o nível autónomo e da lavagem para se remover o material não ligado, faz-se contactar a superfície imobilizadora, nesta variante exemplificativa, com uma amostra de teste contendo o material antigénico que se pretende detectar e/ou titular de uma maneira que conduza à formação do complexo imunitário (antigénio/anticorpo). Estes casos são particularmente úteis para a detecção de ligandos em amostras clinicas ou em extractos biológicos. De preferência, as amostras são diluídas com soluções de ASB, globulina γ de bovinos (GGB, o mesmo que BGG) e soluto salino tamponado com fosfato (STP) e com um detergente, v.g., um ‘Tween\
Os anti-soros aplicados em camadas ficam depois a incubar durante 2 a 4 horas a temperaturas compreendida de preferência entre 25° e 37°C. A seguir á incubação, lava-se a --) x ç
Λ. A /· . 130 superfície de contacto com os anti-soros por forma a remover-lhe o material que não fonnou o imunocomplexo. Segundo um procedimento de lavagem preferido, prevê-se a lavagem com uma solução de tipo STP/Tween ou tampão borato.
A seguir à formação dos imunocomplexos específicos entre o antigénio ligado e a aiuosUa dc leste, c após a subsequente lavagem, c possível determinar a ocorrência da formação do imunocomplexo e a quantidade formada, submetendo o mesmo a um componente de ligação específico secundário, que é geralmente um componente à base do anticorpo. Segundo uma variante particular, os ligandos biespecíficos da presente invenção podem ser utilizados neste passo. Depois dão executados outros passos de ligação específica e de lavagem.
Para se dispor de um sistema de detecção, nesta variante exemplificativa, utiliza-se um terceiro anticoipo que é ligado a um marcador detectável, por exemplo, uma enzima associada que irá dar origem à formação de uma cor após incubação com um substrato cromogénico adequado. O terceiro anticorpo marcado, ou anticorpo terciário, possui afinidade de ligação com um componente do ligando biespecífico. Determina-se o imunocomplexo resultante, após os passos adequados de ligação e de lavagem, detectando o marcador, v.g., mediante incubação com um substrato cromogénico, por exemplo, ureia e bromocresol púrpura ou ácido 2^’-azino-di-3-etil-benztiazolina-6-sulfónico [ABTS] e H202. Depois efectua-se a quantificação medindo o grau de geração de cor, v.g., recorrendo a um espectrofotómetro de espectros visíveis. A utilização de um ligando de coagulação biespecífico como reagente de detecção secundário em conjunto com o tipo de protocolo de EISLE descrito supra, tem vantagens distintas. Por exemplo, permite utilizar um anticorpo terciário marcado que seja específico para uma parte do ligando biespecífico que seja distinta das regiões constantes do anticorpo típico normalmente visadas. Em particular, é possível utilizar um ligando de ligação terciário que seja específico para α parte coagulante (ou região de ligação coagulante) do arquétipo bi-específico. Este novo sistema de detecção da formação de imunocomplexos confere uma melhor especificidade que é particularmente útil nos protocolos de EISLE em sanduíche em que o anticorpo terciário pode interreagir com o material original utilizado para recobrir a placa, ou pode ligar-se a esse material, isto é, o anticorpo original, em vez de se ligar apenas ao anticorpo secundário em causa. Ao enviar-se orientadamente o componente terciário marcado para uma parte de um ligando biespecífico não pertencente a um anticorpo, evitar-se-á o problema da ligação não específica e o nível autónomo invulgarmente elevado. Há outras utilizações práticas dos ligandos biespecíficos que são evidentes ao explorar a sua capacidade coagulante. Uma vez que todos os compostos sugeridos são capazes de induzir a coagulação, podem ser utilizados, v.g., como elementos de contraprova num ensaio em que um dos componentes seja a coagulação. A presença de componentes de ataque não anula a utilidade do coagulante nesses ensaios, uma vez que cada componente funciona independentemente do outro. F. Utilização eficaz dos anticorpos biespecíficos de ligação ao factor tecidual
Conforme se disse antes, o factor tecidual (TF) é um agente capaz de iniciar a coagulação do sangue. O FT fica exposto ao sangue nas lesões vasculares ou a seguir à activação por determinadas citoquinas. O FT disponível vai formar então complexos com o factor Vila para dar início à cascata da coagulação que dará origem, em última instância, à formação de fibrina.
De acordo com uma variante exemplificativa, os inventores sintetizaram um anticorpo biespecífico com especificidade para anligéuios uas células endolcliais da vasculatura tumoral num local de combinação dos antigénios e com especificidade para os domínios extracelulares do FT humano noutros locais de combinação de antigénios. Já anteriormente havia sido demonstrado que o anticorpo com especificidade para o FT humano se ligava ao FT com elevada afinidade, sem interferir com o fenómeno de formação de complexos com o factor Vila ou com a actividade do FT/Vlla (Momssey et al., 1988). iim vez de terem utilizado o FT humano de comprimento completo, os inventores utilizaram uma forma truncada (FTt), que não possui domínio citoplásmico nem domínio transmembranar. Ao FT truncado falta-lhe a actividade indutora da coagulação, sendo no entanto capaz de formar complexos com o factor VHa, devido provavelmente ao facto de não ser capaz de formar complexos com uma superfície membranar sobre a qual se poderiam estabelecer os complexos de coagulação/inidação, incluindo o Factor X. O modelo de murganho utilizado para a análise da eficácia deste arquétipo específico de ataque de células endoteliais da vasculatura tumoral foi um modelo recentemente definido em que os antigénios de classe Π do CPH, que estão ausentes da vasculatura dos tecidos normais, são expressos na vasculatura tumoral através da indução pelo IFN-γ que é segregado pelas células tumorais (Burrows et al., 1992; Burrows e Thoipe, 1993). Demonstrou-se que o anticorpo anti-classe Π administrado por via intravenosa se localiza rápida e fortemente na vasculatura tumoral (Burrows et al., 1992).
Os inventores da presente invenção demonstraram que num murganho portador de um tumor C1300 (Muy) o anticorpo biespecífico anti-classe Π do CPH/anti-FT é capaz de induzir a coagulação de uma forma específica na vasculatura do tumor quando administrado em conjunto com o FTt Com efeito, a administração intravenosa do complexo de anticorpo.FTt induziu a trombose rápida da vasculatura tumoral e as regressões tumorais completas em 70% dos animais. Nem o anticorpo biespecífico por si só, nem o FTt por si só, nem nenhum dos anticorpos de controlo adaptados ao isotipo, na presença ou na ausência de FTt, foi capaz de suscitar o mesmo efeito. Isto significa que o anticorpo biespecífico B21-2/10H10 actua como um “coaguligando” que é capaz de estabelecer a ligação entre as células destinatárias e o FTt de modo a que o FTt possa activar o factor X e dar início à cascata da coagulação. Demonstra também o sucesso evidente do coaguligando no tratamento dos tumores sólidos. G. Composições farmacêuticas e estojos
As composições farmacêuticas da presente invenção irão conter geralmente uma quantidade eficaz do ligando coagulante biespecífico dissolvido ou disperso num meio aquoso ou num veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico.
As frases “aceitável sob o ponto de vista farmacêutico ou farmacológico” designam entidades moleculares e composições que não produzam uma reacção adversa, alérgica ou de qualquer outra forma indesejável quando administradas a um animal ou a um ser humano, consoante os casos. A frase aqui utilizada “veículo aceitável sob o ponto de vista farmacêutico” designa todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e anti-fungicos, agentes isotónicos e para retardar a absorção e outros que tais. A utilização de tais meios e agentes para substâncias activas sob o ponto de vista farmacêutico é bem conhecida na especialidade. Desde que não haja nenhum meio convencional ou nenhum agente que seja incompatível com o ingrediente activo, está aqui prevista a sua utilização em composições terapêuticas. Também é possível incorporar nas composições outros ingredientes activos.
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134- 1. Formulações parentéricas
Os ligandos biespecíficos da presente invenção irão ser formulados frequentemente para administração parentérica, v.g., irão ser formulados para injecção pelas vias intravenosa, intramuscular, subcutânea ou através de outras vias, incluindo a instilação directa num local de um tumor ou de uma patologia. A preparação de uma composição aquosa que contenha um agente coagulantc destinado ao tumor, enquanto ingrediente activo, é um processo bem conhecido pelos especialistas na matéria, tendo em conta os preceitos explicitados na presente memória descritiva. Dc forma típica, tais composições podem ser preparadas como formulações injectáveis, quer sejam soluções no estado líquido ou suspensões; também é possível preparar formulações no estado sólido adequadas para a preparação de soluções ou suspensões após a adição de um liquido antes da injecção; as preparações também podem ser emulsionadas. É possível preparar soluções aquosas dos compostos activos, como bases livres ou como sais farmacologicamente aceitáveis, misturados convenientemente com um agente tensioactivo, por exemplo, a hidroxipropil-celulose. Também é possível preparar dispersões em glicerol, polietileno-glicóis líquidos e suas misturas e também em óleos. Em condições normais de armazenagem e utilização, estas preparações contêm um agente conservante para evitar o desenvolvimento de microrganismos.
As formas farmacêuticas adequadas para injecção são as soluções ou as dispersões aquosas estéreis; as formulações que contenham óleo de sésamo, óleo de amendoim ou propileno-glicol aquoso; e os pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Em todos os casos a formulação tem de ser estéril e deve ser fluida para que seja fácil utilizá-lã por meio de uma seringa. Deve ser estável nas condições de fabrico e armazenamento e tem de ser protegida contra a acção contaminante de microrganismos, tais como bactérias e fungos.
Os ligandos ou anticorpos biespecífícos podem ser formulados numa composição sob a forma de um sal ou neutra. Os sais aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico são os sais de adição de ácidos (formados com os grupos amino livres da proteína) e os que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos, tais como os ácidos acético, oxáiico, tartánco, mandélico e outros que tais. Os sais formados com os grupos carboxilo livres também podem ser obtidos a partir de bases inorgânicas tais como, por exemplo, os hidróxidos de sódio, potássio, amónio, cálcio ou fémeos, e também a partir de bases orgânicas, tais como as seleccionadas entre isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e não só. O veículo também pode ser um solvente ou um meio de dispersão que contenha, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, ghcerol, propileno-glicol e polietileno-glicol líquido e substâncias idênticas), as suas misturas adequadas e ainda óleos vegetais. É possível manter uma fluidez conveniente, por exemplo, mediante a utilização de um revestimento, tal como a lecitina, mediante a manutenção do tamanho adequado das partícula no caso de uma dispersão e mediante a utilização de agentes tensioactivos. A prevenção da acção dos microiganismos pode ser conseguida por meio de diversos agentes antibacterianos e antifungicos, por exemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal e outros que tais. Em muitos casos, é preferível incorporar agentes isotónicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. É possível conseguir uma absorção prolongada das composições injectáveis, incorporando nas composições agentes para retardar a absorção, por exemplo, monoestearalo de alumínio e gelatina
As soluções injectáveis estéreis são preparadas incorporando os compostos activos, na quantidade necessária, no solvente adequado com vários dos outros ingredientes anterionnente enumerados, conforme necessário, seguindo-se a esterilização por filtração. De um modo geral, as dispersões são preparadas incorporando os diversos ingredientes activos esterilizados num veículo estéril que contenha o meio básico de dispersão e os outros ingredientes necessários escolhidos entre os enumerados supra. No caso dos pós estéreis para a preparação de soluções mjectàveis estéreis, os métodos preferidos de preparação são as técnicas de secagem em ambiente hipobárico e as técnicas de liofílização que permitem obter um pó do ingrediente activo mais qualquer outro ingrediente desejado, a partir de uma sua solução previamente filtrada e esterilizada.
Depois de formuladas as soluções irão ser administradas de um modo compatível com a formulação de dosagem e numa quantidade tal que sejam terapeuticamente eficazes. As formulações são administradas facilmente segundo um conjunto de formas de dosagem, tais como os tipos de soluções injectáveis descritos antes, mas também é possível utilizar cápsulas de libertação de fármacos e não só.
As composições farmacêuticas adequadas de acordo com a invenção irão conter geralmente uma quantidade do ligando biespecífico misturado com um diluente ou um excipiente farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma solução aquosa estéril, para se conseguir obter um conjunto de concentrações finais, dependendo isso do fim em vista. As técnicas de preparação são geralmente bem conhecidas na especialidade, conforme exemplificado por ‘Remington’s Phannaceutical Sciences’, 16a Ed. “Mack Publishing Company”, 1980, obra que aqui se considera incorporada por referência. Faz-se observar que a contaminação com endotoxinas deve ser mantida a um nível mínimo de segurança, por exemplo, deve ser inferior a 0,5 ng/mg de proteína. Além disso, para a administração aos seres humanos, as preparações devem satisfazer normas de esterilidade, pirogenicidade, segurança geral e pureza, tal como exigido pela instituição ‘FDA Office of Biological Standards”.
As doses terapeuticamente eficazes são determináveis facilmente utilizando um modelo de animais, conforme comprovado nos estudos pormenorizados aqui descritos (ver, v.g., o Exemplo III). Frequentemente são utilizados animais experimentais portadores de tumores sólidos para se optimizar as doses terapêuticas convenientes, antes de se fazer a extrapolação para um ambiente clinico. Sabe-se que tais modelos são muito fiáveis no estudo de estratégias eficazes contra o cancro. Por exemplo, em ensaios pré-clínicos são vulgarizadamenle utilizados murganhos portadores de tumores sólidos, tais como os utilizados no Exemplo ΠΙ.
Os inventores utilizaram murganhos portadores de tumores C1300 (Mo8) para determinarem os limites de toxicidade e os domínios úteis de variação do ligando biespecífico que proporcionam efeitos antitumorais óptimos com uma toxicidade mínima
Presentemente aceita-se como princípio que as doses eficazes utilizáveis no tratamento do cancro irão estar compreendidas entre cerca de 0,1 mg/kg e cerca de 2 mg/kg e de preferência entre cerca de 0,8 mg/kg e cerca de 1,2 mg/kg, quando administradas por via i.v. com uma frequência aproximada de 1 vez por semana Irá ocorrer necessariamente uma certa variação do regime de dosagem, dependendo isso do estado do paciente que se pretenda tratar. A pessoa responsável pela administração ira determinar, em qualquer dos casos, a dose conveniente para cada paciente. Tal optimização e tal ajustamento são correntemente praticados na especialidade e não reflectem de modo algum a necessidade de levar a cabo experiências desnecessárias.
Faz-se observar que um dos aspectos da presente invenção diz respeito à administração de um agente coagulante a um local tumoral mediante a administração de um ligando de ligação biespecífico, que não faça parte de nenhum complexo, que retenha em si um factor de coagulação endógeno proveniente da circulação e o concentre dentro do local tumoral. Em tais casos, as composições farmacêuticas utilizadas irão conter um ligando que possua uma região de encaminhamento e de ligação do coagulante, mas em todos os outros aspectos serão genericamente idênticas às anteriormente descritas.
Para além dos compostos formulados para administração parentérica, por exemplo, para mjecção intravenosa ou intramuscular, também estão previstas outras formas aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico, v.g. os comprimidos ou outras formas sólidas para administração oral, as cápsulas de libertação temporizada, as formulaçõess lipossómicas e outras que tais. Também é possível utilizar outras formulações farmacêuticas, dependendo isso da patologia que se pretenda tratar. Por exemplo, as formulações tópicas são convenientes para o tratamento de estados patológicos, tais como a dermatite e a psoríase, e as formulações oftálmicas são adequadas para tratar a retinopatia diabética. 2. Formulações ingeríveis
Em determinados casos, os compostos activos podem ser administrados por via oral. Isto aplica-se aos agentes que são geralmente resistentes ou aos quais se fez com que ficassem resistentes à proteólise por acção das enzimas digestivas. Entre tais compostos estão os agentes concebidos ou modificados por via química, os agentes peptidílicos de moléculas dextrógiras, as formulações lipossómicas e as formulações em cápsulas temporizadas para se evitar a degradação pelas peptidases e lipases.
Para efeitos de administração oral, é possível administrar os compostos activos bi-específicos, por exemplo, com um diluente inerte ou com um veículo edível e assimilável, ou podem ser encerrados em cápsulas de gelatina duras ou moles, ou podem ser formulados em comprimidos ou incorporados directamcnte com os alimentos da dieta alimentar Para efeitos de administração terapêutica oral, os compostos activos podem ser incorporados com excipientes e utilizados como formulações ingeríveis, tais como comprimidos, pastilhas bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, bolachas e não só. Tais composições e preparações devem conter pelo menos 0,1% de coagulante biespecífico activo. A percentagem dos compostos activos nas composições e preparações, como é evidente, pode variar e pode estar convenientemente compreendida entre cerca de 2% e cerca de 60% em peso da unidade. A quantidade de compostos activos em tais composições terapeuticamente úteis é tal que se consiga uma dosagem conveniente.
Os comprimidos, os trociscos, as pílulas, as cápsulas e formulações quejandas também podem conter os ingredientes seguintes: um aglutinante, tal como a goma de alcatira, acácia, amido de milho ou gelatina; excipientes, tais como o fosfato de dicálcio; um agente desintegrador, tal como o amido de milho, amido de batata, ácido algínico e outros que tais; um lubrificante, tal como o estearato de magnésio; sendo possível adicionar também um agente edulcorante, tal como sacarose, lactose ou sacarina, ou um agente aromatizante, tal como hortelã-pimenta, óleo de gualtéria ou aroma de cereja. No caso de a forma unitária de dosagem ser uma cápsula, então poderá conter também um veículo líquido, para além dos materiais dos tipos referidos antes. É possível recorrer também a outros materiais que irão estar presentes como revestimentos ou para de algum modo modificarem a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, os comprimidos, as pílulas ou as cápsulas podem ser recobertos com goma-laca, açúcar ou ambos. Um xarope ou elixir pode conter, para além dos compostos activos, sacarose como um agente edulcorante, metilparabeno e propilparabeno como agentes conservantes, um corante e um agente aromatizante, por exemplo, aroma a cereja ou a laranja. Como é evidente, todos os materiais utilizados para a preparação de qualquer forma unitária de dosagem devem ser farmaceuticamente puros e praticamente não tóxicos nas quantidades utilizadas. Além disso, os compostos activos podem ser incorporados em preparações e formulações de libertação prolongada. 3. Formulações lipossómicas
Se desejado, os ligandos de coagulação biespecíficos da presente invenção também podem ser foimulados em preparações lipossómicas. A informação adiante apresentada pode ser utilizada para a preparação de formulações lipossómicas que incorporem os coagul antes da presente invenção. Os fosfolípidos formam lipossomas quando dispersos em água, dependendo isso da razão molar entre os lípidos e a água. As características físicas dos lipossomas dependem do valor do pH, da força iónica e da presença de catiões divalentes. Os bpossomas podem apresentar uma permeabilidade exígua às substâncias iónicas e polares, mas a temperaturas elevadas sofrem uma transição de fase que altera extraordinariamente a sua permeabilidade. A transição de fase implica a mudança de uma estrutura ordenada e coerente, conhecida pela designação de estado de gel, para uma estrutura menos ordenada e menos coerente conhecida pela designação de estado fluido. Isto ocorre a uma temperatura de transição de fase característica e tem como resultado um aumento da permeabilidade aos iões, açúcares e fármacos.
Para além da temperatura, a exposição a proteínas pode alterar a permeabilidade dos lipossomas. Determinadas proteínas solúveis, tais como o citocromo c, ligam-se à bicamada, deformam-na e penetram-na, provocando assim alterações de permeabilidade. O colesterol inibe esta penetração das proteínas, aparentemente por acondicionar os fosfolípidos mais compactamente. Considera-se que as formulações lipossómicas mais úteis para a prática da presente invenção contenham colesterol ou mesmo PEG. A capacidade de aprisionar solutos varia entre os diferentes tipos de lipossomas. Por exemplo, os vesículas multilamelares (VML) são moderadamente eficientes na captura de solutos, mas as vesículas unilamelares pequenas (VUP) são ineficientes. As VUP têm no entanto a vantagem de proporcionar homogeneidade e reprodutibilidade em termos de distribuição dimensional, sendo o compromisso entre dimensões e eficiência do aprisionamento proporcionado pelas vesículas unilamelares grandes (VUG). Estas são preparadas por evaporação do éter e são três a quatro vezes mais eficientes do que as VML em tennos de aprisionamento de solutos.
Para além das caractcrísticas dos lipossomas, um elemento determinante, importante no aprisionamento de compostos, é o conjunto das propriedades físico-químicas do próprio composto. Os compostos polares são aprisionados nos espaços aquosos e os compostos não polares ligam-se à bicamada lipídica da vesícula. Os compostos polares são libertados por infiltração ou quando a bicamada se rompe, mas os compostos não polares permanecem ligados à bicamada a não ser se esta seja destruída pela temperatura ou exposta às lipoproteínas. Os dois tipos apresentam velocidades máximas de efluxo à temperatura de transição de fase.
Os lipossomas interactuam com as células através de quatro mecanismos diferentes: endocitose por acção das células fagocíticas do sistema reticuloendotelial, tais como macrófagos e neutrófilos; adsorção à superfície das células, quer por forças electrostáticas quer por forças hidrofóbicas fracas não específicas ou por interaeções específicas com os componentes da superfície celular; fusão com a membrana das células do plasna por inserção da bicamada lipídica do lipossoma dentro da membrana do plasma, com libertação simultânea dos conteúdos lipossómicos para dentro do citoplasma; e por transferência dos lípidos lipossómicos para as membranas celulares ou subcelularcs, ou vice-versa, sem nenhuma associação com os conteúdos lipossómicos. Por vezes é difícil determinar qual é o mecanismo operativo e pode haver mais do que um α produzir efeitos ao mesmo tempo. O destino e a disposição dos lipossomas injectados por via intravenosa dependem das suas propriedades físicas, tais como tamanho, fluidez e carga superficial. Os lipossomas podem perdurar nos tecidos durante horas ou dias, dependendo isso da sua composição e variando os seus períodos de semi-vida no sangue entre minutos e várias horas. Os lipossomas de maiores dimensões, tais como as VML e os VUG, são incorporados rapidamente pelas células fagocíticas do sistema reticulendotelial, mas a fisiologia do sistema circulatório limita a saída de tais espécies grandes em muitos locais. Apenas podem sair nos locais onde haja poros ou orifícios grandes no endotélio capilar, tal como sucede nas sinusoides do fígado ou do baço. Assim, estes órgãos são o local preponderante de incorporação. Por outro lado, os VUP revelam uma distribuição tecidual mais ampla, mas continuam a ser fortemente sequestrados no fígado e no baço. Em geral, este comportamento in vivo determina que os lipossomas se concentrem apenas nos órgãos e tecidos acessíveis às suas grandes dimensões. Uma vez que isto compreende nitidamente o sangue, tal facto não é uma limitação à sua utilização combinada com a presente invenção.
Noutros casos, é possível misturar os componentes biespecíficos da invenção com a superfície do lipossoma para encaminhar os conteúdos farmacológicos para os receptores antigénicos específicos localizados sobre a superfície das células destinatárias. Os determinantes hidratos de carbono (glicoproteínas ou componentes ghcohpídicos da superfície celular que desempenham um papel no reconhecimento, interaeção e adesão de tipo célula-célula) também podem ser utilizados como locais de reconhecimento, na medida em que possuem potencial para encaminhar os lipossomas para tipos particulares de células. Acima de tudo, prevê-se que possa ser praticada a injecção intravenosa de preparações lipossómicas, mas também são concebíveis outras vias de administração. 4. Formulações tópicas
Também estão previstas formulações de coagulantes biespecíiicos para utilização tópica, tais como cremes, unguentos e geles. A preparação de bases para unguentos, solúveis em óleos ou em água, também é conhecida pelos especialistas na matéria. Por exemplo, tais composições podem conter óleos vegetais, gorduras animais e mais preferencialmente hidro-carbonetos semi-sólidos obtidos a partir do petróleo. Os componentes particulares utilizados podem ser unguentos incolores, unguentos amarelos, ceras de ésteres cetílicos, ácido oleico, azeite, parafina, petrolato, petrolato incolor, espennacete, glicerite de amido, ceras incolores, ceras amarelas, lanolina, lanolina anidra e monoestearato de glicerilo.
Também é possível utilizar diversas bases para unguentos, solúveis em água, incluindo éteres glicólicos e seus derivados, polietileno-glicóis, estearato polioxílico 40 e polissorbatos. Se desejado, é possível efectuar a administração através da pele, v.g., utilizando emplastros transdérmicos e os processos de iontoforese ou electrotransporte. 5. Formulações oftálmicas
Os ligandos de coagulação biespecíficos da presente invenção também podem ser formulados em composições farmacêuticas adequadas para soluções oftálmicas. Tais soluções oftálmicas são importantes, por exemplo, no tratamento da retinopatia diabética. Assim, para o tratamento da retinopatia diabética poder-se-ia administrar um conjugado biespecífico da presente invenção direclanienle sobre o olho de uiu pacieutc que necessitasse de tal Uatauiculo, sob a forma de uma preparação oftálmica obtida em conformidade com a prática farmacêutica convencional, por exemplo, conforme descrito em “Remington's Pharmaceutical Sciences”, 15a edição, páginas 1488 a 1501 (Mack Publishing Co., Easton, PA). A preparação oftálmica irá conter um novo coagulante biespecífico ou um seu sal farmaceuticamente aceitável com uma concentração compreendida entre cerca de 0,01% e cerca de 1% em peso e de preferência compreendida entre cerca de 0,05% e cerca de 0,5% numa solução, suspensão ou unguento aceitáveis sob o ponto de vista farmacêutico. Necessariamente irá haver uma certa variação da concentração, dependendo isso do composto particular utilizado, do estado de saúde do paciente que se pretenda tratar e de factores idênticos, competindo à pessoa responsável pelo tratamento determinar qual é a concentração mais conveniente para o paciente em causa. De um modo preferencial, a preparação oftálmica irá ser apresentada como uma solução aquosa estéril contendo, se desejado, outros ingredientes, por exemplo, agentes conservantes, tampões, agentes para ajustar a tonicidade, antioxidantes e estabilizadores, agentes humectantes ou clarificadores não iónicos, agentes para aumentar a viscosidade e outros que tais.
Os agentes conservantes adequados para utilização numa solução desse tipo compreendem os seleccionados entre cloreto de benzalcónio, cloreto de benzetónio, clorobutanol, timerosal e quejandos. Como exemplos de tampões adequados refere-se os seleccionados entre ácido bórico, bicarbonatos de sódio e de potássio, boratos de sódio e de potássio, carbonatos de sódio e de potássio, acetato de sódio, bifosfato de sódio e não só, em quantidades suficientes para que o valor do pH seja mantido entre cerca de 6 e cerca de 8 e de preferência entre cerca de 7 e cerca de 7,5. Os agentes adequados para ajustar a tonicidade são seleccionados entre dextrano 40, dextrano 70, dexUose, glicerina, cloreto de potássio, propilcno-glicol, cloreto dc sódio e outros que tais, de tal modo que o equivalente de cloreto de sódio existente na solução oftálmica seja da ordem de 0,9% ± 0,2%.
Os agentes antioxidantes e estabilizadores adequados são seleccionados entre bissulfito de sódio, metabissulfito de sódio, tiossulfito de sódio, tioureia e outros. Os agentes humectantes e clarificadores adequados são seleccionados entre polissorbalo 80, polissorbato 20, poloxâmero 282 e tiloxapol. Os agentes convenientes para fazer aumentar a viscosidade são seleccionados entre dextrano 40, dextrano 70, gelatina, glicerina, hidroxietil-celulose, hidroximetil-propil--celulose, lanolina, metil-celulose, petrolato, polietileno-glicol, álcool polivinílico, polivinil--pirrolidona, carboximetil-celulose e outros que tais. A preparação oftálmica será administrada topicamente ao olho do paciente que necessite de tratamento por métodos convencionais, por exemplo, sob a forma de gotas ou então lavando o olho com a solução oftálmica. 6. Estojos terapêuticos A presente invenção também proporciona estojos terapêuticos contendo os ligandos de coagulação biespecíficos aqui descritos. Tais estojos irão conter geralmente, num sistema de embalagem adequado, uma formulação farmaceuticamente aceitável que incorpore pelo menos um ligando biespecífico de acordo com a invenção. Estes estojos também podem conter outras formulações farmaceuticamente aceitáveis, tais como as que possam conter outros ligandos de coagulação biespecíficos, de um modo geral as que possuam um componente de encaminhamento distinto; outros factores de coagulação que não façam parte de complexos; anticorpos biespecíficos, células T ou outros componentes funcionais utilizáveis, v.g., na indução dos aníigénios; componentes utilizáveis na supressão dos antigénios, tais como uma ciclosporina; imunotoxinas ou anticorpos de locais antitumorais distintos; e um ou vários fármacos seleccionados num conjunto de fármacos quimioterapêuticos.
Os agentes preferidos utilizáveis nos estojos de várias formulações são os agentes indutores capazes dc induzir as células endoteliais da vasculatura associada à patologia a exprimirem um antigénio elegível como alvo, tal como um antigénio de selectina E ou de Classe Π do CPH. Os agentes indutores podem ser clones de células T que se liguem aos antigénios da patologia ou do tumor e que produzam IFN-γ. Os agentes indutores preferidos são os anticorpos biespecíficos que se ligam aos antigénios da patologia ou do tumor e às células efectoras capazes de induzir a expressão do antigénio destinatário através da elaboração de citoquinas.
Assim sendo, a presente invenção também diz respeito a estojos que contenham, num sistema de embalagem conveniente, uma primeira composição farmacêutica constituída por um anticorpo biespecífíco que se ligue a um antigénio activador sobre uma superfície das células efectoras, isto é, um monócito/macrófago, um mastócito, uma célula T ou uma célula AN, e a um antigénio sobre a superfície celular de uma célula doente; e uma segunda composição farmacêutica constituída por um ligando biespecífíco que possua uma primeira região de ligação que se ligue a um antigénio das células endoteliais induzido por uma célula efectora activada, ou na sua forma de citoquina, em que a primeira região de ligação se encontra funcionalmente ligada a um factor de coagulação, ou uma segunda região de ligação que se ligue a um factor de coagulação. - São preferíveis os estojos que possuem uma primeira composição farmacêutica constituída por um anticorpo biespecífíco que se ligue a um antigénio activador CD14, CD16 (FcR para IgE), CD2, CD3 ou CD28 ou ao antigénio do receptor das células T, sendo mais preferíveis os anticorpos biespecíficos que se ligam aos antigénios CD14 ou CD28. A activação de monócitos/rnacrófagos ou de mastócitos através da ligação aos antigénios CD14 ou CD16 dá origem à produção de IL-1 que induz a selectma E; a activação das células T através da ligação aos antigénios CD2, CD3 ou CD28 dá origem à produção dc IFN-^y que induz a classe Π do CPH. Por tal motivo, também são preferíveis os estojos que possuam uma segunda composição farmacêutica constituída por um ligando biespecífico que tenha uma primeira região de ligação que se ligue à selectina E ou ao antigénio de Classe Π do CPH.
Os estojos podem dispor de um sistema de embalagem simples que contenha o ligando de coagulação biespecífico, eventualmente com quaisquer outros componentes, ou podem dispor de sistemas de embalagem distintos para cada agente desejado. Também estão previstos estojos que contenham os componentes independentes necessários para se fazer um ligando de coagulação biespecífico. No caso de os componentes contidos no estojo serem fornecidos em uma ou várias soluções líquidas, então cada solução líquida é uma solução aquosa, sendo particularmente preferível uma solução aquosa estéril. No entanto, os componentes do estojo podem ser fornecidos sob a forma de pó(s) seco(s). Se os reagentes ou os componentes forem fornecidos como pós secos, qualquer desses pós pode ser reconstituído por adição de um solvente adequado. Admite-se que esse solvente possa ser fornecido noutro sistema de embalagem. O sistema de embalagem do estojo irá ser constituído geralmente pelo menos por um fiasco, um tubo de ensaio, um balão, uma garrafa, uma seringa ou qualquer outro sistema de embalagem, dentro do qual se possa colocar o ligando de coagulação biespecífico e quaisquer outros agentes desejados, de preferência convenientemente divididos em aliquotas. No caso de estarem contidos no estojo outros componentes, então o estojo irá conter também geralmente um segundo fiasco ou outro dispositivo de embalagem onde possam ser colocados tais componentes, permitindo assim a administração de doses calibradas independentes. Os estojos também podem conter um segundo/terceiro sistema de embalagem onde irá ficar contido um tampão ou qualquer outro diluente estéril c farmaceuticamente aceitável.
Os estojos também podem conter um dispositivo que permita administrar o ligando biespecífico a um animal ou a um ser humano, v.g., uma ou várias agulhas ou seringas, ou mesmo um conta-gotas ou uma pipeta para administração ocular ou quaisquer outros dispositivos idênticos a partir dos quais a formulação possa ser injectada ao animal ou aplicada numa zona afectada do corpo. Dc forma típica, os estojos da presente invenção também irão possuir um sistema para conter os fiascos, ou outros dispositivos idênticos, e outros componentes, mim confinamento perfeito para apresentação comercial, v.g., reservatórios de plástico moldados por injecção ou sopro onde os referidos fiascos e outros dispositivos são colocados e ficam imobilizados.
Os exemplos adiante descritos têm por objecto ilustrar as variantes preferenciais da presente invenção. Faz-se observar aos especialistas na matéria que as técnicas explicitadas nos exemplos subsequentes são técnicas sobre as quais os inventores concluíram que se ajustavam bem à prática da invenção e por tal motivo podem ser consideradas como modalidades preferenciais para a sua prática. No entanto, à luz dos preceitos aqui descritos, os especialistas na matéria podem conceber inúmeras modificações susceptíveis de serem introduzidas nas variantes específicas aqui descritas, sem deixarem de obter um resultado idêntico ou semelhante que não constitua nenhum afastamento do espírito e do âmbito da presente invenção.
EXEMPLO I
SÍNTESE DE UM ANTICORPO DE COAGULAÇÃO BIESPECÍFICO
Este exemplo descreve a síntese de um anticorpo biespecífico capaz de orientar de forma específica um coagulante para um local de um tumor, isto é, um "coaguligando". A. Materiais e Métodos 1. Reagentes A pepsina (A; EC 3.4.23.1), o reagente de Ellmans (RE; ácido 5,5'-ditio-bis-2-nitro-benzóico, DNTB), o 2-mercaptoetanol (2-ME), o arsenito de sódio (NaAs02) e atromboplastina de cérebro do coelho (pó de acetona) foram adquiridos a ‘Sigma Chemical Co.\ St Louis MO. Os produtos ‘Sephadex G-25 e G-100’ foram adquiridos a “Pharmacia LKB” (Piscataway, NJ). 2. Factor tecidual truncado humann ÍFTtl
Preparou-se o FT truncado (FTt) humano recombinante em conformidade com um de dois métodos diferentes. Método I: construção do Vector de Expressão de E. coli. O ADNc que codifica o FTt (resíduos 1-218) foi amplificado por RCP utilizando os iniciadores 5’-GAAGAAGGGATCCTGGTGCCTCGTGGTTCTGFCACTACAAATACT-3’ (iniciador de 5’; SEQID NO: 28) e 5’-CTGGCCTCAAGCTTAACGGAATTCACCTTT-3’ (iniciador de 3’; SEQ ID NO: 29), o que permitiu a adição da sequência codificadora de um local de clivagem da trombina a montante do ADNc. Os produtos da RCP foram clivados utilizando BamHI e Hindm e foram ligados entre os locais de BamHI e Hindin do vcctor de expressão pTrcHisC (Invitrogen).
As células DH5a foram transformadas com a mistura de ligação e os plasmídeos recombinantes foram isolados após a selecção na presença de ampicilina. A estirpe BL21 de E coli foi transformada com o plasmídeo recombinante pTrcHisC-FTt (o mesmo que pTrcHisC-tTF) e os transformantes resultantes foram utilizados para expressão das proteínas. Método I: expressão, redobramento e purificação do FTt a partir de E. coli. A proteína de fusão poli(his)-FTt foi expressa utilizando células BL21 transformadas com pTrc-HisC-FTt As culturas inoculantes (10 mL em meio ‘LB’) cresceram de um dia para o outro em meio agitado a 37°C.
Juntou-se as culturas inoculantes ao meio de crescimento e depois ficaram a crescer em meio agitado a 37°C. No momento em que a densidade óptica a 550 nm atingiu cerca de 0,5, acrescentou-se 10 mL de isopropil-p-D-tiogalactopiranósido 100 mM. A agitação prosseguiu a 37°C durante cerca de 20 horas (até se atingir a fase estacionária).
Efectuou-se a colheita das células por centrifugação (10000 xg 20 minutos) e realizou-se o isolamento dos corpos de inclusão conforme a seguir se descreve (as quantidades de reagentes são dadas por grama de massa de células). Colocou-se a massa de células em suspensão em 4 mL de Tris 10 mM a pH 7,5, NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, PMSF na concentração de 0,17 mg/mL e lisozima da clara do ovo de galinha, na concentração de 2 mg/mL (Sigma). Acrescentou-se 250 unidades de benzonase (EM Science), misturou-se a suspensão suavemente à temperatura ambiente durante 1,5 horas e depois centrifugou-se a 12000 x g durante 15 minutos.
Com a massa obtida preparou-se nova suspensão em Tris 10 mM a pH 7,5, EDTA 1 mM com 3% de NP40 (2 inL), tratou-se com ultra-sons durante 1 minuto a 50% da potência e centrifugou-se a 12000 x g durante 20 minutos. Com a massa obtida preparou-se nova suspensão em água, tratou-se com ultra-sons durante 20 a 30 segundos com 50% da potência e centrifugou-se a 12000 x g durante 20 minutos. Repetiu-se a lavagem com água e colocou-se a massa final, fortemente enriquecida em corpos de inclusão, em suspensão em cloreto de guanidínio 6 M, NaCl 0,5 M, fosfato 20 mM, β-mercaptoetanol 10 mM a pH 8,0 (9 mL por grama de corpos de inclusão) com mistura suave à temperatura ambiente, de um dia para o outro.
Centrifugou-se a suspensão a 12000 x g durante 20 minutos e carregou-se o sobrenadante sobre uma coluna de níquel-ácido nitriloacético (Ni-NTA Qiagen). Lavou-se a coluna sucessivamente com o mesmo tampão de cloreto de guanidínio 6 M a pH 8 e depois a pH 7, tendo depois sido realizada a eluição da proteína fazendo baixar o valor do pH para 4.
As fiacções da coluna de Ni-NTA que continham a proteína de fusão foram combinadas e juntou-se-lhes ditiotreitol 50 mM. Manteve-se a solução à temperatura ambiente de um dia para o outro e depois diluiu-se até se obter uma concentração em proteínas de coca de 1 mg/mL em ureia 6 M, Tris 50 mM, com 0,02% de azida de sódio a pH 8,0 e realizou-se a diálise a 4°C de um dia para o outro em presença de 10-20 volumes do mesmo tampão. Substituiu-se o tampão por ureia 2 M, Tris 50 mM, NaCl 300 mM, glutationa reduzida 2,5 mM, glutationa oxidada 0,5 mM com 0,02% de azida de sódio a pH 8,0 (tampão de dobragem). A diálise prosseguiu durante niais 2 dias, substituiu-se o tampão por novo tampão de dobragem recente e a diálise prosseguiu durante mais 2 dias. A seguir efectuou-se a diálise da solução de forma exaustiva em presença de TEA 20 mM (pH 7,5), retirou-se do saco de diálise, tratou-se com trombina humana (cerca de 1 parte por cada 500 partes de proteína recombinante, p/p) de um dia para o outro à temperatura ambiente e aplicou-se sobre uma coluna de permuta aniónica de tipo ‘HR-10/10 mono-Q’. A eluição da proteína FTt foi realizada em tampão de TEA 20 mM contendo NaCl numa concentração que foi aumentando linearmente desde 0 até 150 mM durante 30 minutos (caudal de trabalho igual a 3 mL/minuto). Método Π: preparação do ADN complementar (ADNc) do FTt. Utilizou-se ARN retirado de células J-82 (carcinoma da bexiga dos seres humanos) para a clonagem do FTt Isolou-se ARN total utilizando o reagente de microisolamento de ARN ‘GlassMax™’ (Gibco BRL). Efectuou-se a transcrição reversa do ARN para ADNc utilizando o estojo de RCP para ARN de ‘GeneAmp’ (Peridn Elmer). Amplificou-se o ADNc do FTt utilizando o mesmo estojo com os dois iniciadores seguintes:
iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG CTT CTG GCA CTA CAA ATA CT iniciador de 3’: 5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (SEQ ff) NO: 2)
As sequências sublinhadas codificam o terminal N e o terminal C do FTt O resto da sequência no iniciador de 5’ é o local de restrição para Ncol que permite a clonagem do FTt no vector de expressão e que codifica um local de clivagem para a trombina. A sequência no iniciador de 3’ é o local HindIII para clonagem do FTt no vector de expressão. Efectuou-se a amplificação por RCP conforme sugerido pelo fabricante. Dito de forma abreviada, utilizou-se dNTP 75 μΜ; iniciador 0,6 μΜ e MgCl2 1,5 mM em 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 30 segundos a 72UC Método Π. Arquétipos vectoriais. Utilizou-se o vector de expressão Hg pQE-60 de R coli para exprimir o FTt (Lee et al., 1994). O ADNc do FTt auipliOcado por RCP foi inserido entre os locais de Ncol e Hindm. O vector Hg pQE-60 possui uma sequência codificadora inserida (His)g, de tal modo que a proteína expressa possui a sequência de (His)g no terminal N, que pode ser purificada numa coluna de ‘Ni-NTA’. Método Π. Purificação do FTt O FTt que contém o ADN do vector Hg pQE-60 foi transformado em células TG-1 de R coli. Deixou-se as células crescer até ao valor de DOgoo = 0,5 e juntou-se IPTG até à concentração de 30 μΜ para se induzir a produção do FTt Realizou-se a colheita das células após agitação durante 18 horas a 30°C. Desnaturou-se a massa celular em Gu-HCl 6 M e com o lisado carregou-se uma coluna de ‘Ni-NTA’ (Qiagen). Lavou-se o FTt ligado utilizando para tal ureia 6 M e redobrou-se 0 FTt com um gradiente de ureia a variar entre 6 M e 1 M à temperatura ambiente durante 16 horas. Lavou-se a coluna com tampão de lavagem (NaH2PC>4 0,05 M, NaCl 0,3 M e 10% de glicerol) e efectuou-se a eluição do FTt com imidazol 0,2 M em tampão de lavagem.
Concentrou-se o FTt resultante da eluição e carregou-se numa coluna de ‘G-75’. Efectuou-se a colheita dos monómeros de FTt que foram tratados com trombina para se remover o péptido de Hg. Isto foi efectuado mediante a adição de 1 parte de trombina (Sigma) a 500 partes de FTt (p/p) e realizou-se a clivagem à temperatura ambiente durante 18 horas. Retirou-se a trombina do FTt fazendo passar a mistura através de uma coluna de afinidade de trombina e benzamidina com ‘Sepharose 6B’ (Pharmacia). O FTt tinha uma capacidade idêntica à do FTt recombinante obtido a partir de leveduras ou de células de ovário do criceto (fêmea) chinês para se ligar ao factor Vila e para aumentar a actívidade catalítica do factor Vila (Ruf et al., 1991). Ao ser analisado por electroforese em gel de poliacrilaniida cm dodecil-sulfato dc sódio, comportou-se como um componente singular com um peso molecular aproximado de 24 kD. 3. Anticorpos monoclonais O hibridoma B21-2 (TIB-229) e o hibridoma SFR8-B6 (HB-152, doravante aqui designado por SFR8) foram obtidos na instituição ATCC. Os dois hibridomas segregaram anticorpos de IgG2b do rato que foram purificados a partir do sobrenadante da cultura por cromatografia de afinidade com proteína G. O anticorpo B21-2 reage com o antigénio I-A^ expresso em células A20 e também na vasculatura dos tumores transfectantes C1300 (Mugama) desenvolvidos em murganhos BALB/c/nu/nu. O anticorpo SFR8 é orientado contra o epítopo HLA-Bw6 e serve de contraprova negativa adaptada ao isotipo para o anticorpo B21-1. O FT9/10H10 (o mesmo que TF9/10H10) (designado por 10H10), que é uma IgGl de murganho, é reactivo com o FT humano sem interferência com a actívidade do FT/factor Wa e foi produzido conforme descrito por Monissey et al. (1988). A linhagem de células MRC 0X7 (designada por 0X7) foi obtida junto do Dr. A F. Williams (MRC CelMar Immunology Unit, Universidade de Oxford, Oxford, Inglaterra). Esta linhagem segrega o anticorpo 0X7 que é um anticorpo de IgGl de murganho que reconhece o antigénio Thy 1.1 nos linfócitos T. Foi utilizada como contraprova negativa adaptada ao isotipo para o TF9/10H10.
Todos os anticorpos foram purificados a partir do sobrenadante da cultura por cromatografia de afinidade com a proteína G. 4. Síntese de anticorpos biesnecíficos
Os fragmentos F(ac')2 f01"3111 obtidos fazendo digerir os suas respectivas IgG com pepsina a 2% (p/v) durante 5 a 9 horas a 37°C e subsequente purificação dos fragmentos por cromatografia em coluna dc ‘Sephadex G100’. A síntese dos anticorpos biespecíficos B21-2/10H10, SFR8/10H10 e B21 -2/0X7 foi realizada em conformidade com o método de Brennan et al. (1985) com modificações irrelevantes.
Os anticorpos biespecíficos B21-2/10H10, SFR8/10H10, OX7/10H10 e B21-2/OX7 foram sintetizados em conformidade com o método de Brennan et cd. (1985) com modificações irrelevantes. Dito de forma abreviada, os fragmentos F(ac')2 foram obtidos a partir de anticorpos de IgG por digestão com pepsina e foram purificado até se conseguir a sua homogeneidade por cromatografia em coluna de ‘Sephadex G100’. Os fragmentos F(ac')2 foram reduzidos durante 16 horas a 20°C com 2-mercaptoetanol 5 mM em tampão de fosfato de sódio 0,1 M a pH 6,8 contendo EDTA 1 mM (tampão PBSE) e NaAs02 9 mM. Juntou-se reagente de Ellman (RE) para se obter uma concentração final de 25 mM e após 3 horas a 20°C, os fragmentos Fac' resultantes do reagente de Ellman (Fac’-RE, o mesmo que Fab'-ER) foram separados do RE que não reagiu nas colunas de ‘Sephadex G25’ em tampão de ‘PBSE’.
Para se formar o anticorpo biespecífico, concentrou-se o Fac'-RE, obtido a partir de um anticorpo, até cerca de 2,5 mg/mL num dispositivo de ultrafiltração e reduziu-se com 2-mercaptoetanol 10 mM durante 1 hora a 20°C. Filtrou-se o Fac-SH resultante através de uma coluna de ‘Sephadex G25’ em ‘PBSE’ e misturou-se com quantidades molares iguais de Fac'-RE preparado a partir do segundo anticorpo. Efecíuou-se a concentração das misturas por ultrafiltração até ao valor aproximado de 3 mg/mL e realizou-se a agitação durante 16 horas a 20°C. Efectuou-se o fraccionamento dos produtos da reacção em colunas de ‘Sephadex G100’ e realizou-se a concentração das fracções que continham o anticorpo biespecífico (110 kDa) até ao valor de 1 mg/mL, tendo sido depois guardadas a 4°C em azida de sódio a 0,02%. B. Resultados 1. Análise dos anticorpos biesnecíficos
Determinou-se o peso molecular dos fiagmentos F(ac')2 e das preparações biespecíficas segundo um protocolo de EGPA-DSS (electroforese) em geles de gradientes variáveis entre 4% e 15%!, utilizando a metodologia ‘Pharmacia LKB-Phastsystem’ (Pharmacia LKB, Piscataway, NJ). Por análise de SCAF detenninou-se a biespecificidade e também a percentagem de heterodímeros comparativamente com a dos homodímeros (Exemplo ΙΤΙΑ análise dos anticorpos biespecíficos pelo protocolo de EGPA-DSS (e por SCAF, Exemplo Π) demonstrou que o anticorpo B21-2/10H10 biespecífico continha menos de 4% de homodímeros de qualquer origem e menos de 10% de fragmentos com um peso molecular de 140 kD ou de 55 kD. Aproximadamente 10% da preparação era constituída por fragmentos de 140 kD, sendo provavelmente um arquétipo de F(ac')2 com uma cadeia leve extraordinária acoplada (de qualquer origem). EXEMPLO Π LIGAÇÃO DE ANTICORPOS COAGULANTES E ACT1YIDADE IN VITRO Este exemplo ilustra a biespecificidade do anticorpo coagulante (coaguligando) e demonstra que a ligação específica, o fornecimento celular e a coagulação são possíveis in vitro utilizando o coaguligando. A. Materiais e Métodos 1. Células A linhagem de células A20, que é um linfoma de células B de murganhos BALB/c positivos ao I-A^, foi adquirida na Colecção Americana de Culturas Tipo (ATCC; Rockville, MD; TIB-208). As células A20 cresceram em MEMD enriquecido com 10% (v/v) de soro fetal de vitelo (SFV), L-glutamina 0,2 mM, penicilina na concentração de 200 unidades/mL e estreptomicina na concentração de 100 pg/mL, tampão Hepes 18 mM, mistura de aminoácidos não essenciais 0,1 mM e piruvato de sódio 1 mM (meio doravante aqui designado por MEMD completo; todos os reagentes foram adquiridos a ‘Life Technologies’, Gaitherburg, MD). Junta-se 2-ME ao MEMD completo até uma concentração final de 0,064 mM para as células A20. Manteve-se as culturas a 37°C em atmosfera humidificada constituída por 90% de ar/10% de CC>2. A linhagem de células J82, que é uma linhagem do carcinoma da vesícula biliar humana que exprime o FT, foi obtida na instituição ATCC (HTB-1). As células cresceram de forma aderente em MEMD completo. A linhagem de células do neuroblastoma 0300 foi instituída a partir de um tumor espontâneo que surgiu num murganho A/Jax (Dunham & Stewart, 1953). A linhagem 12 de 0300 (Muy), doravante aqui designada por 0300 (Muy), foi obtida por transfecção das células do neuroblastoma 0300 com o gene de IFN-γ dos murinos, tendo para tal sido utilizado o retrovírus pSVX de expressão do IFN-γ (Muy AAs) (Watanabe et al., 1989). 0 retrovírus de expressão do IFN-γ foi cedido pelo Dr. Y. Watanabe (Departamento de Microbiologia Molecular da Universidade de Quioto no Japão).
Manteve-se as células C1300 (Muy) em Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (MEMD) enriquecido com 10% (v/v) de soro fetal de vitelo (SFV), L-glutamina 2,4 mM, penicilina à razão de 200 unidades/mL, estreptomicina na concentração de 100 pg/mL, aminoácidos não essenciais 100 pM, pimvato de sódio 1 pM, tampão Hepes 18 μΜ e G418 na concentração de 1 mg/mL (Geneticin; Sigma). Manteve-se as culturas a 37°C em atmosfera humidificada constituída por 90% de ar/10% de CO2. A linhagem de células do linfoma T do murganho AKR-A que exprime o Thy 1.1 foi cedida pelo Prof. Dr. 1. MacLennam (Departamento de Patologia Experimental da Universidade de Birmingham, Birmingham, Inglaterra), tendo as células crescido em MEMD completo. 2. Imunoflimrescência indirecta
Preparou-se nova suspensão de células A20 em STP/ASB a 0,2%/azida de Na a 0,02% (doravante aqui designado por tampão de SCAF), à razão de 4 x 10^ células/mL. As células J82 foram retiradas do balão em condições suaves utilizando STP/EDTA (0,2%peso/volume) e foram novamente colocadas em suspensão à razão de 4 x 10^ células/mL em tampão SCAF. Juntou-se 50 pL de suspensão de células a 50 pL de diluições sequenciais óptimas do anticorpo primário nas cavidades de uma placa de 96 cavidades de fundo redondo. Após incubação à temperatura ambiente (TA) durante 15 minutos, efectuou-se a lavagem das células com tampão de SCAF três vezes. Após a remoção do sobrenadante final juntou-se às células 50 pL do anticorpo secundário conjugado com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) numa diluição de 1 para 20 em tampão de SCAF. Realizou-se a incubação das células durante mais 15 minutos à TA e efectuou-se a sua lavagem 3 vezes com tampão de SCAF. Mediu-se a fluorescência associada às células num classificador de SCAF (Becton, Dickenson, Fullerton, CA). Os dados foram analisados utilizando o programa informático ‘Lysis Π\ Ao ser utilizado o conjugado dc nCF-anti-imunoglobulina do rato como anticorpo secundário, juntou-se soro normal de murganho (10% v/v) para bloquear a interreactividade não específica com as células do murganho. 3. Marcação radioactiva das poteínas
As proteínas foram marcadas com 125^ em conformidade com o protocolo da cloramina T descrito por Mason e Williams (1980), (protocolo 2). Purificou-se o produto iodado numa coluna de ‘G25’ e guardou-se a - 70°C na presença de DMSO a 5% e de IgG de bovino na concentração de 5 mg/mL, no caso dos fragmentos monoclonais, e na presença de DMSO a 5% e de ASB na concentração de 5 mg/mL, no caso do FTt A actividade específica variou entre 2,5 pCi/pg e 4,8 pCi/pg. 4. Estudos de Ligação
Marcou-se o FTt humano com 125j até se obter uma actividade específica entre 2,5 e 4,8 pCi/pg, utilizando para tal o procedimento da cloramina T (Protocolo 2) descrito por Mason e Williams (1980). Utilizou-se uma suspensão de células A20 à razão de 2 x 10^ células/mL em STP contendo ASB na concentração de 2 mg/mL e 0,02% de azida de sódio, tendo sido depois distribuída em volumes de 50 pL para dentro de cavidades de placas de microtitulação de 96 cavidades de fundo redondo. Juntou-se às cavidades 25 pL de anticorpos biespecílícos preparados num determinado intervalo de concentrações (8 a 0,02 pg/mL) no mesmo tampão.
Juntou-se a cada cavidade 25 pL de 125I-FTt à razão de 8 pg/mL no mesmo tampão, para se obter um excesso molar de FTt. Manteve-se as placas sob agitação e a incubação prosseguiu durante 1 hora a 4°C. Depois efectuou-se a lavagem das células 3 vezes nas placas cum NaCl a 0,9% (p/v) contendo ASD na concentração dc 2 mg/mL. Pipetou-se o conteúdo das cavidades sobre uma mistura a 10:11 (v/v) de óleos de ftalato de dibudlo e ftalato de bis(2-etil-hexilo) em tubos de uma microcentrifugadora. Realizou-se a centrifugação dos tubos durante 1,5 minutos a 7500 x g e realizou-se o seu congelamento instantâneo em azoto bquido. Cortou-se as pontas das pipetas que continham as células. Mediu-se num contador de radiação γ a radioactividade da massa celular e do sobrenadante. 5. Ensaio de coagulação
Na mesma ocasião preparou-se uma microplaca idêntica à que foi utilizada para o ensaio de bgação anteriormente descrito, com a excepção de se ter acrescentado FTt não marcado em vez de 125j_pjt Ao fim de 1 hora de incubação a 4°C efectuou-se a lavagem das células 3 vezes, conforme descrito antes, tendo sido novamente colocadas em suspensão em 75 pL de NaCl a 0,9% contendo ASB na concentração de 2 mg/mL e CaCl2 12,5 mM.
Transferiu-se os conteúdos das cavidades para tubos de plástico transparente, com a capacidade de 5 mL, que foram aquecidos a 37°C. A cada tubo juntou-se 30 pL de plasma de murganho citrado a 37°C. Registou-se o tempo decorrido até à formação das primeiras cadeias de fibrina. B. Resultados 1. Bi-esneficidade dos anticorpos
No caso do SFR8/10H10 demonstrou-se a bi-espefícidade por SCAF, utilizando como células destinatárias as células J82 (positivas ao ΓΓ) e utilizando o conjugado de ITCF-anti--imunoglobulina de murganho para se demonstrar a presença de 10H10. Utilizou-se o conjugado 161 de ITCF-anti- imunoglobulina do rato para se demonstrar a presença do SFR8. A intensidade da fluorescência média em função das curvas de concentração foi coincidente para as duas contrastações, demonstrando isso que estão presentes na preparação biespecífica quer o braço do anticorpo do murganho quer o do rato. 2. Ligação de anticorpos
Estudos de ligação efectuados com Fac’ de B21-2 e Fac’ de SFR8 marcados com 125j revelaram que a concentração a que se atinge a saturação de ligação do Fac’ de B21-2 às células A20 é de 21,5 nM. O Fac’ de SFR8 ligou-se de forma não específica às células A20, sendo o número de moléculas ligadas por cada célula inferior a 50000 à concentração de 21,5 nM comparativamente com o valor de 530000 para o Fac’ de B21-2. 3. Administração e fixação do coagulante
Para se estudar a capacidade de ligar o FTt às células A20 através do anticorpo biespecífico B21-2/10H10, comparativamente com os anticorpos biespedficos de contraprova, efectuou-se a incubação de células A20 com o anticorpo biespecífico e trabalhou-se com uma concentração de 125j_pj^ conforme indicado. A saturação foi atingida para concentrações de anticorpo biespecífico de 10 nM (1 pg/mL) ou superiores, momento em que havia uma média de 310000 moléculas de FTt ligadas a cada célula A20. A ligação foi específica, uma vez que não houve nenhuma ligação de FTt mediada por nenhum dos anticorpos biespecíficos dc contraprova adaptados ao isotipo, os SFR8/10H10 ou B21-2/OX7, os quais possuíam apenas uma das duas especificidades necessárias para a fixação do FTt (figura 1).
4. Coagulação
Para sc investigar se o FTt ligado às células A20 através de um anticorpo biespecífico era capaz de induzir a coagulação, os inventores realizaram em primeiro lugar a incubação de células A20 com o anticorpo biespecífico na concentração de 21,5 nM e com FTt 69 nM. O efeito resultante sobre o período de coagulação está indicado no quadro Vil. listes primeiros estudos revelaram que as células A20 recobertas com um complexo de B21-2/10H10 e FTt eram capazes de induzir a formação de fibrina: encurtaram o período de coagulação de 140 segundos (o período para que o plasma de murganho em CaCl·? coagule na ausência de anticorpos acrescentados ou FT nas condições específicas utilizadas) para 60 segundos. Pelo contrário, os anticorpos bicspccíficos de contraprova não induziram a activação da coagulação: nestes casos o período de coagulação foi de 140 segundos.
Estudos posteriores confirmaram e reforçaram os resultados iniciais. O plasma de murganho acrescentado às células A20 às quais havia sido fixado o FTt com o anticorpo B21-2/10H10 coagulou rapidamente. Ficaram visíveis cadeias de fibrina ao fim de 36 segundos após a adição do plasma, comparativamente com os 164 segundos para o plasma acrescentado às células A20 não tratadas (Quadro VII). Apenas nos casos em que o FTt havia sido fixado às células houve coagulação induzida: não foi observado nenhum efeito sobre o período de coagulação com as células incubadas apenas com o FTt, com os fragmentos homodiméricos F(ac')2 e Fac' ou com anticorpos biespecíficos que apenas possuíam uma das duas especificidades necessárias para a fixação do FTt
Comprovou-se a existência de uma relação linear entre o logaritmo do número médio de moléculas de FTt fixadas a cada célula A20 e a rapidez com que essas células induziram a coagulação do plasma de murganho (figura 2). As células portadoras de 300000 moléculas de FTt por célula induziram a coagulação em 40 segundos, mas mesmo à razão de 20000 moléculas por célula a coagulação foi significativamente mais rápida (140 segundos) do que no caso das células não tratadas (190 segundos).
Quadro VII. Coagulação do plasma de murganho, induzida pela fixação do FTt ãs células A20 com um anticorpo biespecífico.
Reagentes acrescentados1 Período de coagulação2 (segundos) Nenhum 164 ±4 B21-2/10H10 + FTt 36 ±2 B21-2/10H10 163 ±2 FTt 163 + 2 B21-2/OX7 + FTt 165 ±3 SFR8/10H10 + FTt 164 ±4 10H10 F(ac’)2 + FTt 160 + 3 10H10 Fac’+ FTt 162 + 2 B21-2 F(ac’)2 + FTt 168 ±4 B21-2 Fac’+ FTt 165 ±4 1 Os fragmentos F(ac')2 e Fac' dos anticorpos biespedficos (0,33 pg/105 células/100 pL) e o FTt (0,17 pg/105 células/100 pL) foram incubados com células A20 durante 1 hora a 4°C em azida de sódio a 0,2% p/v. As células foram lavadas, aquecidas a 37°C, adicionou-se-lhes cálcio e plasma e registou-se o momento da formação das primaras cadeias de fibrina. 2 Média aritmética de determinações feitas em triplicado ± desvio padrão
EXEMPLO III
COAGULAÇÃO IN VIVO ESPECÍFICA DA VASCULATURA TUMORAL
Este exemplo descreve a coagulação específica da vasculatura tumoral in vivo que se consegue após a administração do coaguligando de anticorpo biespecífico como veículo de transporte do factor tecidual humano. A. Materiais e Métodos 1. Reagentes
Obteve-se o sangue de murganho por perfuração cardíaca, tendo sido recolhido na concentração de 1/10 (em volume) em citrato tamponado a 3,8%. Centrifugou-se o sangue durante 10 minutos a 3000 x g e congelou-se o plasma instantaneamente em pequenas aliquotas que foram guardadas a -70°C. 2. Animais
Os murganhos da estirpe BALB/c nu/nu foram obtidos em ‘Simonsen’ (Gilroy, CA) e foram mantidos em condições ‘SPF’. 3. Modelo de murganho com 0300 ÍMuvl e seu tratamento O modelo tumoral foi um já anteriormente descrito (Burrows et al, 1992; Binrows & Thoipe, 1993) com três aperfeiçoamentos. Em primeiro lugar, utilizou-se um anticorpo diferente, ο B21-2. Este anticorpo reconhece a molécula I-A^ mas não reconhece a molécula I-E^, ao contrário do anticorpo M3/114 anteriormente utilizado que reconhece as duas moléculas. O anticorpo B21-2 possui uma afinidade aproximariam ente 10 vezes melhor do que o anticorpo r, V ✓ ; / \ 165' " M5/114. Em segundo lugar, utilizou-se uma sublinhagem da linhagem C1300 (Muy)12 já anteriormenle utilizada que cresceu coulinuainente num murganho da estirpe BALB/c nu/nu. As células da linhagem 0300 (Muy) 12, já anteriormente utilizadas, tiveram de ser misturadas com células C1300 não transfectadas para que se formassem tumores que crescessem contínuamente.
Esta nova sublinhagem, designada por 0300 (Muy) tlP3, será doravante aqui designada por 0300 (Muy). Em terceiro lugar, não foi necessário adicionar tetraciclina à água potável fornecida aos murganhos para evitar que as bactérias intestinais induzissem a molécula I-A^ no epitélio gastrointestinal. Ao contrário das imunotoxinas, os coaguligandos não danificam o epitélio intestinal que exprime a molécula I-A^. “7
Para a instituição de tumores sólidos, injectou-se 1,5 x 10 células de 0300 (Muy) por via subcutânea no flanco anterior direito de murganhos da estirpe BALB/c nu/nu Assim que os tumores atingiram um diâmetro de 0,8 cm, efectuou-se uma distribuição aleatória dos murganhos por diferentes grupos de tratamento, ficando em cada grupo 7-8 murganhos.
Efectuou-se a preparação de coaguligandos misturando anticorpos biespecíficos (140 pg) e FTt (110 pg) num volume total de 2,5 mL de NaCl a 0,9% e deixando-os em repouso a 4°C durante uma hora. Depois aplicou-se aos murganhos injecções de 0,25 mL desta mistura (isto é, 14 pg de anticorpo biespecífico mais 11 pg de FTt) por via intravenosa. Outros murganhos receberam apenas 14 pg de anticorpos biespecíficos ou 11 pg de FTt As injecções foram administradas lentamente numa das veias caudais durante aproximadamente 45 segundos e foram seguidas por uma segunda injecção de 200 pL de soluto salino na mesma veia. Este procedimento de injecção teve por objecto evitar a trombose da veia caudal que teria ocorrido se as injecções tivessem sido administradas aos murganhos rapidamente (1-2 segundos). Os tratamentos foram repetidos 7 dias mais tarde. •166'' ç
Efectuou-se a medição dos diâmetros tumorais perpendiculares a intervalos regulares e fez-se uma estimativa dos volumes dos tumores de acordo com a equação seguinte: volume = diâmetro menor2 x diâmetro maior x π/6
Estudou-se a significância estatística das diferenças dos volumes tumorais utilizando para tal o teste não paramétrico de ‘Mann-Whitney-Wilcoxon’ para duas amostras independentes (Gibbons, 1976).
Para efeitos das análises histopatológicas os animais foram anestesiados com metofano em diversos momentos após o tratamento e foram sangrados por perfusão com soluto salino heparinizado. Lnjectou-se 500 UI de heparina por via iv., anestesiou-se o animal com metofano e efectuou-se a perfusão da circulação sistémica com STP com um caudal de 0,6 mL/minuto, até já não haver sangue no fígado. Efectuou-se a excisão de tecidos tumorais e normais, tendo sido estabilizados em formalina (4% v/v). Efectuou-se o corte de secções de tecidos em parafina que foram contrastados por meio da técnica convencional tricromática com o corante Azul-de-Martius Scarlet (AMS) para detecção da fibrina e com os corantes hematoxilina e eosina para a inspecção da morfologia celular. B. Resultados 1. Modelo turnoral aperfeiçoado
Para o aperfeiçoamento do modelo tumoral de C1300 (Muy), conforme já anteriormente descrito (Buitows e/ «/., 1992), os inventores subclonaram a linhagem de células C1300 (Muy) dentro de uma linhagem celular que pode crescer sem ser misturada com as sua células progenitoras C1300, mas que ainda exprimem o antigénio I-A^ de Classe Π do CPH sobre as células endoteliais do tumor. Os inventores utilizaram um anticorpo anti-I-A^ (B-21-2) que possui uma afinidade para com o seu antigénio que é 5-10 vezes superior à do anticorpo inicial and-I-A^ (M5/114.15.2) utilizado neste modelo, conforme determinado por SCAF.
Os estudos de distribuição in vivo efectuados com este novo anticorpo anti-I-A^ revelaram o mesmo padrão de distribuição tecidual obtido com o anticorpo M5/114.15.2. Foi observada uma contrastação intensa com ο B21-2 no endotélio da vasculatura tumoral, uma contrastação entre ligeira e moderada nas células de Kuppfer no fígado, nas zonas marginais no baço e em algumas áreas dos intestinos delgado e grosso. Os vasos dos outros tecidos normais não foram contrastados. 2. Determinação das doses adequadas in vivo A dose máxima tolerada foi de 16 pg de B21-2/10H10 mais 11 pg de FTt injectados por via intravenosa na veia caudal dos murganhos. Com esta dose, os murganhos não perderam peso e mantiveram o seu aspecto normal e os seus níveis normais de actividade. A dose mais elevada de 20 pg de B21-2/10H10 mais 16 pg de FTt, 2 entre 10 murganhos desenvolveram hemorragias dermais localizadas que eventualmente foram resolvidas. Adoptou-se a dose menor para os estudos in vivo. O próprio FT truncado não revelou ser tóxico à dose de 50 pg administrada por via intravenosa. 3. Coagulação específica e enfarto na vasculatura tumoral A administração intravenosa de ura coaguligando constituído por Β21-2/10ΙΙ10 (30 pg) e FTt (16 pg) a murganhos portadores de tumores sólidos Cl300 (Muy) fez com que os tumores adquirissem um aspecto enegrecido e contundido em menos de 30 minutos. Um estudo histológico da evolução temporal de fenómenos dentro do tumor revelou que 30 minutos após *7< - 16i' a injecção do coaguligando todos os vasos em todas as regiões do tumor apersentavam sinais de trombose (figura 3B). Os vasos sanguíneos continham agregados de plaquetas, eritrócitos aglutinados e fibrina. Nesta altura, as células dos tumores eram saudáveis, sendo indistinguíveis morfologicamente das células tumorais dos murganhos não tratados (figura 3 A).
Ao fim de 4 horas, eram evidentes os sinais de destruição das células tumorais. As células tumorais, na sua maior parte, haviam começado a separar-se umas das outras e tinham desenvolvido núcleos picnóticos (figura 3C). Foram observados vulgarmente eritrócitos no interstício tumoral. Ao fim de 24 horas, era visível uma avançada necrose tumoral em todo o tumor (figura 3D). Ao fim de 72 horas, toda a região central do tumor havia sido compactada em resíduos fragmentários morfologicamente indistintos.
Num dos três tumores examinados era visível um rebordo viável de camadas celulares de 5-10 células tumorais nas zonas limítrofes do tumor onde se infiltravam para dentro dos tecidos normais envolventes. O exame imunoistoquímico de secções sequenciais do mesmo tumor revelou que aos vasos sanguíneos nas regiões de infiltração tumoral lhes faltavam os antigénios de classe Π.
Os tumores dos murganhos de contraprova que haviam recebido apenas 20 pg de anticorpo biespecífico B21-2/10H10, 30 minutos ou 24 horas antes, não revelaram nenhuns sinais de enfarto. Os tumores de murganhos que receberam 16 pg de FTt, por si só ou em combinação com B21-2/OX7 ou SFR8/10H10, não revelaram nenhuns sinais de enfarto 30 minutos após a injecção, mas decorridas 24 horas após α injecção havia alguns vasos (cerca de 20% de todos os vasos) do tumor onde havia enfarto. Aparentemente isto era mais predominante no núcleo do tumor. Não eram visíveis nenhuns trombos nem anomalias morfológicas nas secções parafínicas dc fígado, rim, pulmão, intestino, coração, cérebro, supra-renais, pâncreas e baço obtidas a partir de murganhos portadores de tumores ao fim de 30 minutos, 4 horas e 24 horas após a administração de coaguligando ou FTt. 4. Regressões de tumores sólidos A figura 4 mostra os resultados de estudos representativos antitumorais em que se administrou um coaguligando constituído por B21-2/10H10 e FTt a murganhos portadores de tumores com o diâmetro dc 0,8 cm. Os tumores regrediram para aproximadamente metade do tamanho que tinham antes do tratamento. A repetição do tratamento ao T dia fez regredir os tumores ainda mais, normalmente de forma completa. Em 5 de 7 animais foram obtidas regressões completas. Houve 2 dos murganhos que a seguir tiveram recaídas 4 e 6 meses mais tarde. Estes efeitos antitumorais são altamente significativos sob o ponto de vista estatístico (P < 0,001) quando comparados com todos os outros grupos.
Os tumores dos murganhos tratados apenas com o FTt ou com o FTt misturado com anticorpos biespecíficos de contraprova adaptados ao isotipo, SFR8/10H10 ou B21-2/OX7, cresceram mais lentamente do que nos grupos que recebem anticorpos ou apenas diluente. Estas diferenças foram estatisticamente significativas (P< 0,05) entre os dias 12° e 14°. Assim, parte dos efeitos antitumorais observados com o coaguligando B21-2/10H10 são atribuíveis a uma ligeira acção não específica do próprio FTt.
No finai do estudo, a dois murganhos que haviam sido tratados apenas com diluente e que tinham tumores muito grandes com cerca de 2,0 cm^ e 2,7 cm^ (isto é, entre 10% e 15% de seu peso corporal) efectuou-se uma terapia com coaguligandos. Ambos tiveram remissões : 170 completas, embora os seus tumores voltassem a crescer mais tarde no local original do crescimento tumoral. C. Discussão
Estes estudos comprovam que o FTt humano solúvel, que praticamente não possui nenhuma capacidade para induzir a coagulação, passa a ser um poderoso trombogénio para a vasculatura tumoral quando encaminhado por meio de um anticorpo biespecífico para as células endoteliais dos tumores. Os estudos de coagulação in vitro demonstraram que o restabelecimento da actividade trombótica do FTt é mediado pela sua interligação aos antigénios sobre a superfície das células. O FTt liga-se aos factores VII e Vila com elevada afinidade e reforça a actividade catalítica do factor Vila, mas não induz a coagulação do plasma porque o complexo de FTt:VIIa tem de estar associado a uma superfície membranar para que haja uma activação eficiente dos factores IX e X (Ruf et al., 1991; Krishnaswanmy et ai, 1992). A fixação do complexo de FTt: Vila à superfície celular por meio de um anticorpo biespecífico restabelece a sua capacidade para induzir a coagulação graças ao facto de colocar o complexo de FTt: Vila muito próximo da membrana: o fosfolípido membranar proporciona a superfície sobre a qual os complexos de coagulação-iniciação formados com os factores IX ou X podem ser construídos e produz eficientemente intermediários no processo de coagulação. A administração de um coaguligando dirigido contra a classe Π de murganhos portadores de tumores com uma vasculatura que exprima a classe Π provocou a trombose rápida dos vasos sanguíneos por todo o tumor. Seguiu-se a isto o enfarto do tumor e regressões tumorais completas na maioria dos animais. Nos animais cm que não foram obtidas regressões completas, os tumores voltaram a crescer a partir de uma coroa sobrevivente de células tumorais na periferia do tumor onde se havia infiltrado nos tecidos normais envolventes. Aos vasos desse rebordo periférico em crescimento do tumor faltavam-lhes os antigénios de classe Π, o que explica pois a inexistência de trombose desses vasos por acção do coaguligando. É provável que essas células sobreviventes pudessem ter sido aniquiladas pela co-administração de um lànnaco que actuassc sobre as próprias células tumorais, conforme havia sido concluído anteriormente (Bunrows & Thorpe, 1993).
Os efeitos antitumorais do coaguligando foram de uma amplitude idêntica aos efeitos obtidos no mesmo modelo de tumor com uma imunotoxina constituída por anticorpos anti-classe Π e cadeia de ricina A desghcosilada (Burrows & Thorpe, 1993). Uma diferença entre os dois agentes é a sua rapidez de acção. O coaguligando induziu a trombose dos vasos tumorais em menos de 30 minutos ao passo que a imunotoxina levou 6 horas para conseguir o mesmo efeito. A imunotoxina actua mais lentamente porque a trombose é secundária relativamente aos danos das células endoteliais provocados pela interrupção das sínteses de proteínas.
Uma segunda e importante diferença entre a imunotoxina e o coaguligando reside no facto de possuírem efeitos secundários tóxicos diferentes. A imunotoxina provocou uma destruição letal do epitélio gastrointestinal que exprime a classe Π, salvo quando foram administrados antibióticos para suprimir a indução de classe Π pelas bactérias intestinais. O coaguligando não provocou nenhuns danos gastrointestinais, o que era previsível devido à ausência de factores de coagulação exteriores ao sangue, mas provocou coagulopatias em alguns murganhos ocasionais, quando administrado segundo uma dose elevada.
Os resultados descritos no texto presente demonstram o potencial terapêutico, nos seres luuuauos, do encaminhamento de proteínas indutoras da coagulação para a vasculatura tumoral. Para aplicações clínicas, são necessários anticorpos ou outros ligandos que se liguem a moléculas que se encontrem presentes sobre a superfície das células endoteliais vasculares nos tumores sólidos mas que não existam nas células endoteliais de tecidos normais. Os marcadores endoteliais tumorais poderiam ser induzidos directamente por factores de angiogénese resultantes dos tumores (Folkman, 19985) ou por citoquinas (Buirows et al., 1991; Ruco et al., 1990) ou poderiam dizer respeito à rápida proliferação (Denekamp & Hobson, 19982) e migração (Folkman, 1985) das células endoteliais durante a neovascularização.
Foram já descritos diversos anticorpos elegíveis. O anticorpo CET-11 contra a endoglina constitui um exemplo particular que se liga de forma selectiva às células endoteliais dos tumores humanos.
Como exemplos de outros anticorpos refere-se o FB5 contra a endossialina (Rettig et al., 1992), o E-9 contra uma molécula de tipo endoglina (Wang et al., 1993), o BC-1 contra uma isofortna de fíbronectina (Camemolla et al., 1989) e o TP-1 e o TP-3 contra um antigénio relacionado com o osteossarcoma (Bruland et al., 1988). Concluiu-se já que o número de CD34 aumenta por extemalização sobre as células endoteliais migratórias e nos processos abluminais de capilares em formação nos tecidos tumorais e fetais (Schilingematm et al., 1990). O número de receptores para o factor de crescimento das células endoteliais vasculares (FCEV) aumenta por extemalização nos vasos sanguíneos dos tumores (Plate et al., 1993; Brown et al., 1993), provavelmente em resposta à hipoxia (Thieme et al., 1995), e concentram de forma selectiva o FCEV nos vasos dos tumores (Dvorak et al., 1991). A indução do enfarto tumoral mediante o encaminhamento de proteínas indutoras da coagulação para estes e outros marcadores de células endoteliais de tumores é considerada como uma forma nova e valiosa para o tratamento de tumores sólidos. Prevê-se particulanncntc o acoplamento de anticorpos humanos (ou humanizados) a proteínas de coagulação humanas para a produção de coaguligandos intcgralmcnte humanos, o que irá permitir pois a realização repetitiva de tratamentos para combater os tumores primários e as suas metástases.
EXEMPLO IV
SÍNTESE DE ARQUÉTIPOS DE FACTOR TECIDUAL TRUNCADO (TTU O FTt é aqui concebido como um domínio extracelular da proteína de factor tecidual plenamente desenvolvida (aminoácidos 1-219 da proteína perfeitamente desenvolvida (madura); SEQID NO:23). A SEQID NO:23 é codificada, v.g., pela SEQID NO:22. A. HJFTtl 1¾ Ala Met Ala [FTt],
Preparou-se ADN complementar (ADNc) do FTt conforme a seguir se descreve. Utilizou--se A RN de células J-82 (carcinoma da bexiga humana) para a clonagem do FTt. Isolou-se ARN total utilizando o reagente de microisolamento de ARN ‘GlassMax™’ (Gibco BRL). Realizou-se a transcrição reversa do ARN para ADNc utilizando o estojo de RCP para ARN de ‘GeneAmp’ (Peridn Elmo). Amplificou-se o ADNc do FTt utilizando o mesmo estojo com os dois iniciadores seguintes: iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCT CAG GCA CTA CAA (SEQ IDNO:l) iniciador de 3’: 5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (SEQ ID NO:2)
As sequências sublinhadas codificam o terminal N do FTt O resto da sequência no iniciador de 5’ é o local de restrição para Ncol que permite a clonagem do FTt dentro do vector de expressão. A sequência no iniciador 3’é o local HindlH para a clonagem do FTt dentro do vector de expressão. Efectuou-se a amplificação por RCP em conformidade com as instruções do fabricante. Dito de foima abreviada, utilizou-se dNTP 75 pM, iniciador 0,6 pM, MgCk 1,5 mM e foram executados 30 ciclos de 30 segundos a 95°C, 30 segundos a 55°C e 30 segundos a 72°C.
Utilizou-se o vector He pQE-60 de expressão de E. coli para exprimir o FTt (Lee et ai, 1994). O ADNc do FTt amplificado por RCP foi inserido entre os locais Ncol e HindíTT O vector Hó pQE-60 contém em si uma sequência codificadora (His)6 tal que a proteína expressa possui a sequência de (His)6 no terminal N, podendo ser purificada numa coluna de ‘Ni-NTA’.
Para a purificação do FTt, o ADN de 1¾ pQE-60 que contém o FTt foi transformado em células TG-1 de E. coli. Deixou-se as células crescer até ao valor DC>6oo= 0,5 e acrescentou-se IPTG até à concentração de 30 pM para se induzir a produção do FTt. Realizou-se uma colheita de células após agitação durante 18 horas a 30°C. Desnaturou-se a massa celular em Gu-HCl 6 M e carregou-se o lisado numa coluna de ‘Ni-NTA’ (Qiagen). O FTt ligado foi lavado com ureia 6 M e depois esse FTt foi redobrado com um gradiente de ureia entre 6 M e 1 M à temperatura ambiente durante 16 horas. Lavou-se a coluna com tampão de lavagem (NaH2P04 0,05 M, NaCl 0,3 M com 10% de glicerol) e efectuou-se a eluição do FTt com imidozol 0,2 M em tampão de lavagem. Concentrou-se o FTt eluído e com ele carregou-se uma coluna de ‘G-75\ Foram recolhidos monómeros de FTt B. FTí
Gli[FTt], Preparou-se ADN complementar (ADNc) de GliFTt de um modo idêntico ao descrito na secção anterior, com a excepção de se ter substituído na RCP o iniciador de 5’ pelo iniciador a seguir indicado:
iniciador de 5’: 5’ GTC ATGCCATGGCCCTGG TGC CTCGTG CTTÇTGGÇACTA CAA ATA CT (SEQ Π) NO:3) A sequência sublinhada codifica o terminal M do FTt. A sequência restante codifica um local de restrição para a Ncol e um local de clivagem para a trombina. O vector de expressão 1¾ pQE60 e o procedimento para a purificação das proteínas foram idênticos aos descritos antes, com a excepção de se ter tratado o produto proteínico final com trombina para se remover o péptido H6. Fez-se isso adicionando 1 parte de trombina (Sigma) a 500 partes de FTt (p/p) e efectuou-se a clivagem à temperatura ambiente durante 18 horas. Removeu-se a trombina do FTt fazendo passar a mistura através de uma coluna de afinidade para a trombina carregada com ‘benzamidina-Sepharose 6B’ (Pharmacia). C. Os FTt modificados com cisteína
Efectuou-se a modificação de arquétipos de FTt com um resíduo cisteína nos terminais N ou C para que fosse mais fácil a conjugação com o anticorpo transformado por uma ponte dissulfureto.
He C[FTt]. (Hisjó Ala Met Ala Cis-[FTt]. Preparou-se o ADN conforme descrito na secção anterior, com a excepção de se ter substituído o iniciador de 5’ pelo iniciador seguinte, na RCP. iniciador de 5’: 5’GTC ATG CCA TGG CCT GCT CAG GCA CTA CAA ATA CTG TG (SEQ ID NO:4)
Todos os procedimentos praticados foram idênticos aos descritos supra, com a excepção de o resíduo Cis no terminal N ter sido protegido com um reagente permutável oxidante/redutor.
CfFTt]. Gli Sei Cis [FTt2-219]. Preparou-sc o ADN conforme descrito na secção anterior, com a excepção de se ter substituído o iniciador de 5’ pelo iniciador seguinte na RCP. iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (SEQID NO:5) O arquétipo vcctorial e o procedimento para a purificação das proteínas foram idênticos aos descritos a propósito do arquétipo (His)6 Ala Met Ala Cis [FTt], com a excepção de se ter recorrido ao tratamento com trombina para a remoção de (Hisjô, conforme descrito antes. Hô [FTt]C. (His),, Ala Met Ala [FTt] Cis. Preparou-se o ADN de uma forma idêntica à descrita nas secções respeitantes a (His)6 AMA [FTt], com a excepção de se ter substituído o iniciador de 3’ pelo iniciador a seguir indicado. iniciador de 3’: 5’TGA CAA CGC TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (SEQ ID NO:6) A sequência sublinhada codifica o terminal C do FTt. O resto da sequência contém o local de restrição HindIIl para clonar o FTt no vector de expressão.
Todos os procedimentos são idênticos aos descritos na secção respeitante ao FTt, com a excepção de se ter utilizado β-ΜΕ 10 mM na solução desnaturante de HCl-Gu 6M e de o resíduo cisterna do terminal C ter sido protegido com um reagente permutável oxidante/redutor.
Também foram produzidos outros monómeros de [FTt]Cis, tais como [FTt 1-220] Cis, [FTt l-221]Cis e [FTt l-222]Cis (e seus conjugados), utilizando a mesma metodologia. D. Ligador C I Frtl
Construiu-se também o ligador C[FTt], de sequência Gli-Ser-Cis-(Gli)4-Ser-(Gli)4-Ser- -(Gli)4-Ser-[FTt]. Preparou-se o ADNc recorrendo a um procedimento de RCP em dois passos, conforme a seguir se descreve . RCP 1: amplificação do ADN do ligador O ADNc que codifica o local Ncol, o local de clivagem da trombina, a cisterna, o ligador e o terminal N do FTt foi amplificado utilizando os iniciadores seguintes: iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCGGAGGC GGT GGA TCA GGC (SEQID NO:7) iniciador de 3 ’: 5 ’ AGT ATT TGT AGT GCC TGA GGA TCC GCC ACC TCC ACT (SEQ ID NO:8)
As sequências sublinhadas codificam o péptido ligador. A matriz de ADN utilizada na RCP era de ADN de cadeia dupla codificador do ligador seguinte: sequência: GGA GGC GGT GGA TCA GGC GGT GGA GGT AGT GGA GGT GGC GGA TCC (SEQ ED NO:9)
Foram utilizadas as mesmas condições de RCP descritas na secção respeitante ao FTt O produto amplificado de 95 pb foi ligado ao ADN do FTt na RCP 2. RCP 2: ligação de Cis-ADN do ligador ao ADN do FTt As matrizes de ADN utilizadas na RCP foram dois ADN sobrepostos: o ADN de 95 pb proveniente da RCP 1, conforme descrito supra, e o ADN do FTt Os iniciadores utilizados foram os seguintes: iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TG (SEQ ID NO:10) iniciador de 3’: 5’ TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCC TTT CT (SEQ ID NO: 11)
Fcz-sc digerir o produto final da RCP de 740 pb com Ncol c HindlH c inseriu-se no
178' vector H6 pQE 60, confonne descrito na secção respeitante ao FTt.
Os arquétipos vectoiiais e os procedimentos de purificação das proteínas foram todos idênticos aos descritos na secção respeitante a C[FTt].
EXEMPLO V
SÍNTESE PE FACTOR TECIDUAL D1MÉRICO
Os inventores concluíram que os dímeros do factor tecidual podem ser mais potentes do que os monómeros para iniciar a coagulação. É possível que o factor tecidual natural sobre a superfície das células do carcinoma da bexiga J82 possa existir como dímero (Fair et al, 1987). A ligação de uma molécula de factor VII ou VTIa a uma molécula de factor tecidual também pode facilitar a ligação de outro factor VII ou Vila a outro factor tecidual (Fair et al., 1987; Bach et al., 1986). Além disso, o factor tecidual possui homologia estrutural com os membros da família dos receptores das citoquinas (Edigington et al., 1991), alguns dos quais dimerizam para formarem receptores activos (Davies e Wlodawer, 1995). Posto isto, os inventores sintetizaram dímeros de FT, confonne a seguir se descreve. A. IFTtl Ligador fFTtl
Preparou-se Gli [FTt] Ligador [FTt] com a estrutura GliJTTt] (Gli)4 Ser (Gli)4 Ser (Gli)4 Ser [FTt]. Foram amplificadas separadamente duas peças de ADN por RCP, tendo sido ligadas e inseridas no vector, conforme a seguir se descreve. RCP 1: preparação de FTt e da metade do ADN do ligador de 5’. As sequências do iniciador na RCP são as seguintes;
iniciador de 5': 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (SEQID NO: 12)
iniciador dc 3’: 5’ CGC GGA TCC ACC GCC ACC AGA TCC ACC GC.C TCC TTC. TCT GAA TTC CCC TTT CT (SEQ ID NO:13).
Utilizou-se ADN de Gli[FTt] como matriz de ADN. As outras condições de RCP foram as descritas na secção respeitante ao FTt RCP 2: preparação da metade do ADN do ligador de 3’ e do ADN de FTt. As sequências do iniciador na RCP foram as seguintes: iniciador de 5’: 5’ CGC GGA TCC GGC GGT GGA GGC TCT TCA GGC ACT ACA AAT ACT GT (SEQ ID NO: 14) iniciador de 3’: 5’TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T (SEQ ID NO: 15) Utilizou-se ADN de FTt como matriz na RCP. Fez-se digerir o produto da RCP 1 com Ncol e BamH. Fez-se digerir o produto da RCP 2 com HindIII e BamHl. O ADN de RCP 1 e RCP 2 foi ligado com ADN de F^ pQE 60 digerido com Ncol e HindIII.
Os arquétipos vectoriais e os procedimentos de purificação das proteínas foram os mesmos descritos na secção respeitante a Gli[FTt], B. Cis IFTtl Ligador IFTtl
Construiu-se também o Cis [FTt] Ligador [FTt] com a estrutura Ser Gli Cis [FTt 2-219] (Gli)4 Ser (di)4 Ser (Gli)4 Ser [FTt]. Preparou-se o ADN por RCP utilizando os iniciadores seguintes: iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG TTT CTT GCG GCA CTA CAA ATA CT (SEQ ID NO: 16) iniciador de 3’: 5’TGA CAA GCT TAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T (SEQID NO: 17) Utilizou-sc como motriz o ADN de [FTt] ligador [FTt]. As outras condições de RCP foram idênticas às descritas na secção respeitante ao FTt Os arquétipos vectoiiais e os procedimentos de purificação das proteínas foram também os mesmos descritos a propósito da purificação de H^CjFTt]. C. IFTtl Ligador ÍFTtl cis
Preparou-se também o dímero de [FTt] Ligador [FTt] cis com a estrutura proteínica [FTt] (Gli)4 Ser (Gli)4 Ser (Gli)4 Ser [FTt] Cis. Preparou-se o ADN por RCP utilizando os iniciadores seguintes: iniciador de 5’: 5’ GTC ATG CCA TGG CCC TGG TGC CTC GTG GTT GCA CTA CAA ATA CT (SEQ ID NO: 18) iniciador de 3’: 5’ TGA CAA GCT TAG CAT TCT CTG AAT TCC CCT TTC T (SEQ DD NO: 19).
Utilizou-se como matriz ADN de [FTt] ligador [FTt]. As outras condições de RCP foram idênticas ás descritas na secção respeitante ao FTt Os arquétipos vectoiiais e os procedimentos de purificação das proteínas foram mais uma vez os mesmos que foram descritos na secção de purificação de [FTt] cis. D. Dímeros conjugados Quimicamente
Os monómeros [FTt] Cis são conjugados quimicamente para formarem dímeros [FTt] Cis-Cis [FTt]. Faz-se isto juntando uma quantidade molar igual de DTT a um monómero protegido [FTt] Cis à temperatura ambiente durante 1 hora para o desproteger e expor o resíduo cisterna no terminal C desse [FTt] Cis. Acrescenta-se uma quantidade molar igual de [FTt] Cis protegido à mistura de DTT/[FTt] Cis e deixa-se a incubação prosseguir durante 18 horas à temperatura ambiente. Os dímeros são então purificados numa coluna de filtração através de gel ‘G-75\ O monómero Cis [FTt] é conjugado quimicamente para formar dímeros, utilizando o mesmo método.
EXEMPLO VI SÍNTESE DE MUTANTES DE FACTOR TECIDUAL Efectua-se a descrição de dois mutantes de FTt aos quais falta a capacidade para converterem em factor Vila o factor VII ligado ao FTt No plasma há 300 vezes menos factor Vila do que factor VII (Morrissey et al., 1993). Por tal motivo, o FTt o mutante em circulação deve ser menos capaz de iniciar a coagulação e por isso deve ter uma toxicidade muito fiaca. Nos coaguligandos, logo que o FTt mutante se tenha localizado, através do anticorpo acoplado, no local do tumor, injectar-se-á Factor VHa para permuta com o factor VII ligado ao FTt Os mutantes são activos na presença de factor Vila.
A. ÍFR1G164A O “[FTt]G164A” possui a estrutura proteínica mutante em que o aminoácido 164 (Gli) do FTt foi substituído por Ala. Para se gerar o mutante utiliza-se o estojo de mutagénese (Stratagene) dirigido ao local de cadeia dupla de Chameleon. A matriz de ADN é constituída por ADN de Gli[FTt] e a sequência do iniciador mutagenizante é: 5’ CAA GTT CAG CCA AGA AAAC (SEQID NO:20)
Os arquétipos vectoriais e os procedimentos de purificação das proteínas anteriormente descritos foram tambcm utilizados para a purificação de Gli[FTt],
B. fFTtl W158R S162A O [FTt]W258R S162A é um mutante duplo em que o aminoàcido 158 (lrp) do FTt é substituído por Arg e o aminoácido 162 (Ser) é substituído por Ala. Utiliza-se o mesmo método de mutagénese descrito a propósito do [FTt] G164A. O iniciador de mutagenizante é: 5’ ACA CTT TAT TAT CGG AAA TCT TCA GCT TCA GGA AAG (SEQID NO:21).
Para a purificação de Gli[FTt] foram utilizados os arquétipos vectoriais e os procedimentos de purificação de proteínas anteriormente referidos.
EXEMPLO VH
SÍNTESE DE CONJUGADOS DE FACTORES TECIDUAIS A. Síntese química e cnniugacão de anticorpos
Efectuou-se a síntese de conjugados de anticorpos-FTt ligando anticorpos, obtidos por via química, a FTt obtido por via química, por meio de uma ponte dissulfureto (como exemplificado na figura 5).
Fez-se reagir o anticorpo com um excesso molar 5 vezes superior de succinimidil--oxicarboml-a-metil-a-(2-piridilditio)-tolueno (SMPT) durante 1 hora à temperatura ambiente para se obter um anticorpo transformado com uma média de 2 grupos dissulfureto de piridilo por cada molécula de anticorpo. O anticorpo transformado foi purificado por cromatografia de impregnação através de gel.
Fez-se reagir um excesso molar 2,5 vezes superior de FTt, em relação ao anticorpo, com um excesso molar 45 vezes superior de 2-iminotiolano (2ΓΓ) durante 1 hora à temperatura ambiente, para se obter os FTt com tuna média de 1,5 grupos sulfidrilo por cada molécula de FTt. O FTt transformado também foi purificado por cromatografia de impregnação em gel e foi imediatamente misturado com o anticorpo transformado.
Deixou-se a mistura reagir durante 72 horas à temperatura ambiente e depois aplicou-se a uma coluna de Scphacryl S-300’, para se separar o conjugado de anticorpo-FTt do FTt livre e para se libertar a piridina-2-tiona Separou-se o conjugado do anticorpo livre por cromatografia de afinidade numa coluna de anti-FTt A espécie molecular predominante do produto conjugado final era o conjugado de anticorpo-FTt, singularmente substituído (Mr aproximado de 176000) com quantidades inferiores de conjugados multiplamente substituídos (Mr > 202000), tal como confirmado por EGPA-DSS. B. Conjugação de FTt, modificado com cisterna, com o anticorpo transformado
Efectuou-se a síntese de conjugados de anticorpo-C[FTJ e [FTt]C por acoplamento directo do FTt, modificado com cisterna, ao anticorpo transformado quimicamente, por meio de uma ponte dissulfureto (tal como exemplificado na figura 5).
Fez-se reagir o anticorpo com um excesso molar 12 vezes superior de 2ΓΓ durante 1 hora à temperatura ambiente para se obter o anticorpo transformado com uma média de 1,5 grupos sulfidrilo por cada molécula de anticorpo. O anticorpo transformado foi purificado por cromatografia de impregnação em gel e foi misturado imediatamente com um excesso molar 2 vezes superior de FTt modificado com cisterna. Deixou-se a mistura reagir durante 24 horas a temperatura ambiente e depois purificou-se o conjugado por cromatografia de afinidade e de impregnação em gel, conforme descrito supra. A espécie molecular predominante do conjugado final foi o conjugado singularmente substituído (Mr aproximado 176000) com quantidades inferiores de conjugados multiplamente substituídos (Mr > aprox. 202000), conforme confirmado por EGPA-DSS. C. Conjugação do FTt, modificado com cisteína. com fragmentos Fac’
Efectuou-se a preparação de conjugados de fragmento de anticorpo Fa’-C[FTt] e [FTt]C. Tais conjugados podem ser mais potentes in vivo uma vez que devem manter-se sobre a superfície das células durante mais tempo do que os conjugados bivalentes, devido à sua capacidade limitada de intemalização. Misturou-se os fragmentos Fac’ com um excesso molar 2 vezes superior de FTt modificado com cisteína, durante 24 horas, e depois purificou-se o conjugado por cromatografia de afinidade e de impregnação em gel, conforme descrito supra. D. Actividade coagulante dos conjugados de FTt
Efectuou-se a preparação de conjugados de FTt com o anticorpo monoclonal B21-2 que se liga aos antigénios de Classe II expressos sobre a superfície das células A20. Efectuou-se a preparação de conjugados com o FTt transformado quimicamente e com o FTt modificado com cisteína e determinou-se a capacidade dos conjugados para coagularem plasma de murganho em CaCl2 após a sua ligação à superfície das células A20.
Qualquer dos conjugados com B21-2 reduziu o período de coagulação do plasma de murganho em CaCl2 (contraprova) de uma forma dependente da dose. Os conjugados com FTt proporcionaram um reforço idêntico de coagulação, tal como sucedia quando o FTt era fixado à superfície das células A20 com o anticorpo biespecífico B21-2/10H10 (figura 6). E. Conjugados de FTt-célnlas antftnmnrais
Foi já comprovado que o FTt, ao ser enviado para as células endoteliais da vasculatura tumoral, induz a coagulação no interior dos vasos do tumor (Exemplos I a ΙΠ) Os inventores previram a hipótese de a coagulação poder ser induzida nos vasos tumorais se o FTt for encaminhado para a superfície das células tumorais.
Efectuou-se a conjugação de três anticorpos de células antitumorais, os KS1/4, D612 e XMMCO-791, com o FTt, conforme descrito na secção anterior “Preparação de conjugados com FTf\ O anticorpo KS1/4 foi fornecido pelo Dr. R. Reisfeld do Departamento de Imunologia da Instituição ‘Scripps Research Institute’, La Jolla, Califórnia, estando também descrito na patente de invenção norte-americana n° 4 975 369; o anticorpo D612 foi fornecido pelo Dr. J. Schlom do Laboratório de Biologia e Imunologia Tumoral da instituição ‘NCI\ Bethesda, Maiyland, está descrito na patente de invenção norte-americana n° 5 183 756 e pode ser obtido a partir dos sobrenadantes de culturas da linhagem de células do hibridoma que se encontra na instituição ATCC com o n° de admissão HB 9796; o anticorpo XMMCO-791 foi purificado a partir do sobrenadante de uma cultura da linhagem de células de hibridoma adquirida na instituição ATCC.
Utilizou-se a linhagem de células Widr do carcinoma do cólon humano como células elegíveis para o ataque com o anticorpo KS1/4. As células de Widr foram adquiridas na instituição ATCC e foram mantidas em MEMD enriquecido com 10% (v/v) de soro fetal de vietlo, L-glutamina e antibióticos numa atmosfera que continha 10% (v/v) de CO2 em ar. Utilizou-se a linhagem de células LS147T do carcinoma do cólon humano como células elegíveis para o ataque com o anticorpo D612. As células LS147T foram adquiridas na instituição ATCC c foram mantidas cm meio RPMI enriquecido com 10% (v/v) de soro fetal dc vitelo, L-glutamina e antibióticos numa atmosfera com 5% (v/v) de CO2 em ar. Utilizou-se a linhagem de células H460 do cancro do pulmão de células não pequenas dos seres humanos como células elegíveis para o ataque com 0 anticorpo XMMCO-791. As células H460 foram fornecidas pelo Dr. Adi Gazdar, ‘Simmons Câncer Center’ da Universidade do Texas, Southwestem Medicai Center, Dali as, Texas, e foram mantidas em MEMD enriquecido com 10% (v/v) de soro fetal de vitelo, L-glutamina e antibióticos numa atmosfera com 10% (v/v) de CO2 em ar. Qualquer destas três linhagens celulares cresceu em monocamadas aderentes.
Efectuou-se um teste aos conjugados para se investigar a sua capacidade para aumentarem o período de coagulação do plasma de murganho em CaCl2 quando ligados a células tumorais expressoras dos andgénios destinatários relevantes. Retirou-se as células tumorais dos balões das culturas de tecidos com 0,05% (p/v) de EDTA em STP. Efectuou-se a incubação prévia das células com os anticorpos TF9-6B4 e TF8-5G9 para se neutralizar a actividade do factor tecidual natural (Morrisey et al., 1988) e depois realizou-se o ensaio de coagulação conforme descrito para as células A20.
Quando ligados à sua linhagem de células destinatárias, qualquer dos três conjugados reduziu o período de coagulação no plasma de murganho em CaCl2 (contraprova) de uma forma dependente da dose (figura 7), significando isso que a coagulação havia sido acelerada à superfície das células tumorais quando o FTt foi enviado para a superfície das células.
EXEMPLO VIU
SÍNTESE DE PROFÁRMACOS PE FACTORES TECTOUAIS
Como exemplos de profármacos de FTt refere-se o conjunto representado pela estrutura geral seguinte: FTti.219 (X)ni (Y)n2 Z Ligando, cm que FTti.219 representa o FT ./ ,>· 187·· menos os domínios citossólico e transmembranar; o símbolo X representa um domínio transmembranar hidrofóbico cujo comprimento (1-20 AA) é de nl aminoácidos (AA); o símbolo Y representa uma sequência hidrofílica de reconhecimento de proteases cujo comprimento é de n2 AA (AA suficientes para garantirem o reconhecimento adequado das proteases); o símbolo Z representa um tioéster dissulfureto ou outro grupo de ligação, tal como (Cis)i_2; o termo ‘Ligando’ designa um anticorpo ou outras células de tumores que reconheçam o radical de ataque, CE tumorais, tecido conjuntivo (estromas) ou marcadores da lâmina basal.
Está previsto que o profármaco de FTt seja utilizado por injecção intravenosa, o que vai permitir que se localize no tecido doente (isto é, no tumor). Uma vez localizado no tecido da patologia, as proteases endógenas (isto é, metaloproteinases, trombina, factor Xa, factor VHa, factor IXa, plasmina) vão clivar a sequência de reconhecimento das proteases hidrofilicas a partir do profármaco, o que irá permitir que a sequência transmembranar bidrofóbica se insira numa membrana celular local. Logo que este apêndice se tenha inserido na membrana, o FTt irá readquirir as suas propriedades de coagulação-indução, daí resultando a formação de coágulos na vasculatura do tecido da patologia.
EXEMPLO IX
SÍNTESE DE FACTORES DE COAGULAÇÃO AOS QUAIS FALTA A MODIFICAÇÃO Gla A modificação dos factores de coagulação dependentes da vitamina K (Factor Π/IIa. Factor Vn/VIIa, Factor IX/IXa e Factor X/Xa) a que falta o resíduo Gla (ácido γ-carboxiglutâmico), é útil para a formação de coaguligandos. Os factores de coagulação aos quais falta a modificação Gla são coagulantes fracos porque os factores não modificados se associam de forma ineficiente com as membranas lipídicas: o encaminhamento do factor por meio de um ligando para a vasculatura dos tumores ou para outros locais deveria levar o factor de regresso à proximidade da superfície celular e facilitar o prosseguimento da coagulação nesse local. A modificação “Gla” é feita pós-traducionalmente mediante a modificação dos resíduos existentes Glu (ácido glutâmico). Os factores de coagulação dependentes da vitamina K (Factor Il/Ila, Factor VH/VHa, Factor IX/IXa e Factor X/Xa) aos quais falta a modificação Gla podem ser feitos mediante a expressão de genes que os codifiquem num hospedeiro, por exemplo, bacteriano que não faça a modificação de Glu para Gla. As sequências de ADN codificadoras de qualquer dos factores seleccionados entre Factor Mia, Factor VH/VIIa, Factor DÍ/IXa e Factor X/Xa são aqui designadas respectivamente por SEQID NO:24, SEQ DD NO:25, SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27. Assim sendo, a expressão procariótica é simples e directa.
Os referidos factores aos quais falta a modificação Gla também podem ser obtidos mutacionando qualquer das sequências descritas supra (SEQ ID NO:24, SEQ ID NO:25, SEQ ID NO:26 e SEQ ID NO:27) de fornia a que os correspondentes resíduos Glu sejam substituídos por outros resíduos aminoácidos antes da expressão dos genes, desta vez virtualmente em todas as células hospedeiras. O codão que irá ser modificado é o codão GAG (o codão GAA também codifica o resíduo Glu e deve ser evitado). Por exemplo, utilizando o Factor VH, o “domínio” Gla fica localizado geralmente na região 216-325. O primeiro tripleto codificador de Gla ocorre na posição 231 da SEQ ID NO:25 e o último desenvolve-se a partir da posição 318 da SEQ ID NO:25. Os codões GAG podem ser modificados facilmente recorrendo a técnicas da biologia molecular. A figura 8 mostra que os domínios Gla de cada um dos factores de coagulação dependentes da vitamina K se encontra numa região análoga. Posto isto, a mutação dos chamados resíduos Glu “correspondentes” em qualquer uma das sequências seleccionadas entre SEQ Π) NO:24, SEQID NO:26 e SEQID NO:27 também irá ser simples e directa.
Seguidamente apresenta-se um quadro onde estão indicados os codões que permitem lazer com facilidade as escolhas sobre mutações quando se pretende modificar uma dada sequência ou um codão codificador de Gla.
Aminoácidos Codões
Alanina Ala A GCA GCC GCG GCU Cisterna Cis C UGC UGU Ácido aspártico Asp D GAC GAU Ácido glutâmico Glu E GAA GAG Fenilalanina Phe F UUC uuu Glicina Gb G GGA GGC GGG GGU Histidina His H CAC CAU Isoleucina De I AUA AUC AUU Lisina Lis K AAA AAG Leucina Leu L UUA UUG CUA CUC CUG CUU Metionina Met M AUG Asparagina Asn N AAC AAU Prolina Pro P CCA CCC CCG CCU Glutamina Gin Q CAA CAG Arginina Arg R AGA AGG CGA CGC CGG CGU Serina Ser S AGC AGU UCA UCC UCG UCU Treonina Thr T ACA ACC ACG ACU Valina Vai V GUA GUC GUG GUU Triptofano Trp W UGG Tirosina Tir Y UAC UAU A mutagénese específica do local é a técnica que se utiliza para a preparação de cada um dos factorcs de coagulação dependentes da vitamina K aos quais falte a modificação Gla, através da mutagénese específica do ADN subjacente e através da introdução, no ADN, de uma ou várias substituições da sequência nucleotídica. A mutagénese específica do local permite a produção de mutantes mediante a utilização de sequências oligonucleotídicas específicas que codifiquem a sequência de ADN da mutação desejada, e também um número suficiente de nucleótidos adjacentes, para se obter uma sequência iniciadora com um comprimento suficiente e com uma complexidade bastante para se formar uma hélice dupla estável nos dois lados da junção de superssão que irá ser atravessada. De forma típica, é preferível um iniciador com cerca de 17 a 25 nucleótidos de comprimento, com cerca de 5 a 10 resíduos nos dois lados da junção da sequência que irá ser alterada.
Em geral, a técnica de mutagénese específica do local é bem conhecida na especialidade, conforme exemplificado em obras publicadas, tais como as de Adelman et al. (1983), e pelos estudos anteriormente descritos respeitantes aos mutantes de FT. Esta técnica utiliza tipicamente um vector bacteriófago que existe quer sob a forma de cadeia singular quer sob a forma de cadeia dupla. Os vectores típicos úteis na mutagénese dirigida ao local compreendem vectores tais como o fago M13 (Messin et al , 1981). Este fago é relativamente fácil de se obter nos circuitos comerciais e a sua utilização é geralmente bem conhecida pelos especialistas na matéria. Também se utiliza vulgarmente plasmídeos de cadeia dupla na mutagénese dirigida ao local, o que elimina o passo de transferência do gene relevante de um plasmídeo para um fago.
Em geral, a mutagénese dirigida ao local, em conformidade com os preceitos da presente invenção, realiza-se obtendo em primeiro lugar um vector de cadeia singular ou fundindo separadanicnte as duas cadeias dc um vector de cadeia dupla que contenha na sua sequência uma outra sequência de ADN que codifique o factor de coagulação dependente da vitamina K. Prepara-se um iniciador oligonucleotídico portador da sequência mutacionada desejada, geralmente por via sintética, por exemplo, pelo método de Crea et al (1978). Este iniciador é depois recombinado com o vector de cadeia singular e é submetido à acção de enzimas polimerizadoras do ADN, tais como o fragmento de Klenow da polimerase I de E. colt, com a finalidade de se completar a síntese da cadeia portadora da mutação. Assim, forma-se uma hélice dupla heterogénea em que uma cadeia codifica a sequência original não mutacionada e a outra cadeia é portadora da mutação pretendida. Este vector heterodúplex vai servir depois para transformar as células adequadas, tais como as células de E. coli, e procede-se à selecção de clones que possuam os vectores recombinantes portadores do ananjo da sequência mutacionada.
EXEMPLO X
OUTROS ANTICORPOS ANTIVASCULATURA TUMORAL
Este exemplo descreve a geração de anticorpos dirigidos contra “factores de ligação” de células endoteliais resultantes de tumores, utilizáveis na distinção entre vasculatura tumoral e vasculatura de tecidos normais. Em particular, descreve-se a geração de anticorpos dirigidos contra o factor da permeabilidade vascular (FPV), também designado por factor de crescimento das células do endotélio vascular (FCEV) e contra o factor de crescimento dos fibroblastos básicos (FCFb).
Para estudo de outros pormenores respeitantes ao FCF recomenda-se a obra de Gomez--Pinilla e Cotman (1992); recomenda-se também os trabalhos de Nishikawa et al. (1992) que descrevem a localização do factor de crescimento dos fibroblastos básicos; a obra de Xu et cd. (1992) que descreve α expressão e a analise imunoquímica do FCF; a obra dc Rcilly et al. (1989) que diz respeito a anticorpos monoclonais; a obra de Dixon et al. (1989) que descreve a dctccção e a caracterização do FCF; os trabalhos de Matsuzaki et al. (1989) que dizem respeito a anticorpos monoclonais contra o factor de crescimento que se liga à heparina; e ainda os textos de Herblin e Gross (1992) que abordam os locais de ligação para os FCFb, nos tumores sólidos, associados à vasculatura.
Nos estudos da presente invenção, efectuou-se a hiperimunização de coelhos com péptidos do terminal N dos FCEV humano, FCEV do murganho, FCEV das cobaias, FCFb humano, FCFb de murganho e FCFb de cobaias, acoplados à tuberculina (derivado proteínico purificado, DPP) ou aos portadores da tiroglobulina. Os péptidos tinham um comprimento de 25 a 26 aminoácidos e foram sintetizados num sintetizador de péptidos em que a cisterna era o resíduo do terminal C. Os and-soros foram purificados por afinidade em colunas de péptidos acoplados a matrizes de ‘Sepharose’.
Os anticorpos para o FCEV foram identificados por meio de um protocolo de EISLE e pelos seus padrões de contrastação de secções congeladas de tumores e de tecidos normais de cobaias. Os anticorpos policlonais para o FCEV das cobaias e para o FCEV dos seres humanos reagiram com a maior parte das células endoteliais vasculares nas secções congeladas de tumores LIO de cobaias e em diversos tumores humanos (carcinomas da parótida, dos ovários e mamários), respectivamente. O anticorpo anti-FCEV humano contrastou as células mesangianas, envolventes das células endoteliais nos glomérulos dos rins humanos normais, e as células endoteliais do fígado, mas não contrastou os vasos sanguíneos no estômago humano normal, nos músculos das pernas e no baço. O anticorpo anti-FCEV da cobaia não contrastou as células endoteliais em nenhum dos tecidos normais, incluindo os tecidos dos rins, cérebro, baço, coração, vesícula seminal, pulmão, intestino grosso, timo, próstata, fígado, testículo e músculos do esqueleto.
Os anticorpos policlonais para o FCF humano contrastaram as células endoteliais nos carcinomas das parótidas e dos ovários, mas não nos carcinomas mamários. Os anticoipos anti-FCF humano contrastaram as células endoteliais gomerulares no rim humano, mas não contrastaram as células endoteliais no estômago normal, nos músculos das pernas e no baço.
Os anticorpos monoclonais contra o FCEV da cobaia, contra o FCEV humano e contra o FCFb da cobaia, foram preparados imunizando murganhos da estirpe BALB/c com os péptidos da sequência do terminal N (com o resíduo cisteína no terminal C do péptido) acoplados ao DPP ou à tiroglobulina Os imunogénios peptídicos sintéticos de sequência definida são ilustrados a seguir e representados por SEQIDNO:30, SEQID NO:31 e SEQ DD NO:32, respectivamente: FCEV de cobaia APM AEGEQKPRE V VKFMDVYKRSYC
FCEV humano APM AEGGGQNHHE V VKFMDVYKRSYC FCFb de cobaia Μ A AGSITTLP ALP EGGDGGAF AP GC.
Os péptidos foram conjugados com tiroglobuilina ou com DPP mediante a transformação da tiroglobulína com ciclo-hexano-1 -carboxilalo de succinimidil-4-{N-maleimidometilo) (SMCC) e fazendo reagir o derivado com o péptido. Isto gera um conjugado que possui uma ou mais várias sequências peptídicas ligadas através de uma ponte tioéter à tiroglobulina.
Dito de forma específica, foi possível gerar anticorpos monoclonais contra as sequências anteriores recorrendo ao procedimento a seguir descrito. Efectuou-se a imunização de murganhos da estirpe BALB/c mediante injecções sequenciais com péptido-DPP ou com péptido-tiro-globulina em vários locais. Decorridos quatro ou cinco dias após a última injecção efectuou-se a remoção dos baços e realizou-se a fusão dos esplenócitos com células do mieloma P3xG3Ag8.653 utilizando pnlietileno-glicol, em conformidade com os procedimentos publicados por Morrow A pesquisa dos sobrenadantes de cada hibridoma foi efectuada do modo seguinte: Primeira pesquisa: protocolo dc EISLE em placas recobertas com péptido-tiroglobulina;
Segunda pesquisa: protocolo de EISLE ELISA sobre cisterna ligada por meio de SMCC à tiroglobulina;
Terceira pesquisa: contrastação indirecta com imunoperoxidase realizada sobre secções
Quarta pesquisa: congeladas do tumor da linhagem 10 de cobaia ou de carcinoma da parótida humana; contrastação indirecta com imunoperoxidase realizada sobre secções congeladas de diversos tecidos malignos e normais de cobaias e de seres humanos.
Foram seleccionados os anticoipos que se ligaram ao péptido-tiroglobulina mas não à cisteina-tiroglobulina e os que se ligaram às células endoteliais em tumores malignos mais fortemente do que se ligaram às células endoteliais em tecidos normais (quadro VIII). /7 iy 195—^ QUADRO Vffl
Keactividade dos anticorpos munoclonais (AcMo)
AcMo Imunogénio+ Classe Reactividade com o endotélio tumoral Padrão de reactividade tumoral Cobaias Seres humanos GV14 FCEV da cobaia (cb) IgM + + VS + algumas células tumorais GV35 FCEV cb IgM ± ± Células tumorais, ftaca nos VS GV39 FCEV cb IgM + + VS e algumas células tumorais GV59 FCEV cb IgM + + VS e algumas células tumorais GV97 FCEV cb IgM + + VS, fraca nas células tumorais HV55 FCEV humano (hu) IgG ? + Membrana pavimentar, alguns VS GF67 FCEV cb IgM + + VS e células tumorais 1 GF82 FCEV cb IgM + + VS e células tumorais * VS = vasos sanguíneos +cb = cobaia hu = humano r? /1 ^ \ 196 A. Contrasta cão de secções de tecidos humanos e de cobaiais com GV97 O anticorpo GV97 conda o terminal N do FCEV da cobaia liga-se às células endoteliais em diversos tecidos malignos dos seres humanos (quadro IX) e em diversos tecidos normais dos seres humanos (quadro X). A ligação às células endoteliais nos tumores malignos teve tendência para exceder a ligação às células endoteliais nos tecidos normais. A contrastação das células endoteliais dos tecidos tumorais de cobaias (carcinoma hepatocelular de linhagem 10) e nos tecidos normais teve uma distribuição e uma intensidade idênticas às que foram observadas nos tecidos humanos (quadro XI).
Nos quadros os símbolo + indica um resultado positivo, por contraposição a um resultado negativo. Os números 2+, 3+ e 4+ designam a um sinal positivo de intensidade cada vez maior, conforme se admite vulgarmente neste domínio de estudo. e? / 197
QUADRO IX. ANTI-FCEVcb NOS TUMORES HUMANOS GV97 Purificado Tecido Tumoral 20 pgfaiL 10 (jg/mL 5 pg/mL 1 pg/mLou 2pgftnL 0,5 pgAnL GV97 supt GV14 GV39 GV59 supt. TRACTO DIGESTIVO 92-01-A073 cardnoma do csófiup 2+ 1+ +/- -vo 4+ 4+ parótidaM4 4+ 187-07-AI34 1 cardnoma da paióoct] 3+ 2+ +h -vo 3+ 4+ parótidaMS 4+ 88-04-A010 adenocaronoma da paictida 1-2+ 1+ -to -TO 1-3+ 90-11-B319 adaxcarcanoma do cóícn para o fiando 34+ 34+ 94-02-B021C adenocainnonradocólcn 34+ 34+ 93-10-A333 admocaidnoma do cólon oomnoimais 4+ 2-4+ 14+ -vo-l+ 4+ 3+ 93-02-B004 pdqxsvOosose adencmatosos do cólon 4+ 3-4+ 24+ 1-2+ 34+ 2-3+ 93-02-A130 3+ 2+ +/-1+ -TO 4+ 4+ 34+ 93-02-BQ20 caranoma gástrico 4+ 2+ 2-3+ -TO- 1+ 1-2+ 4+ 93-04-A221 adenocarancxna do pâncreas 3-4+ 2-3+ 1-2+ -vo- 05+ 4+ 4+ 94-04-A390 adaiocarancmadorecto 4+ 3+ 1-2+ 1+ 3+ 93-12-A160 adenocarcinama da língua 1-2+ +/- -TO -TO 3+ 3+ QUADRO IX (cont.) GV97 Purificado Tecido Tumoral 20 H^nL 10 |jg/mL 5 Hg/mL 1 pgrinLou 2\igJrcL· 0,5 |ag/mL GV97 supL GV14 GV39 GV59 supL 101-84a carcinoma dos anãs ‘Signet’ doestômagp (101-84bpar) 3+ 2+ -vo-l+ -vo maioria 1-2+ mas alguns 34+ 3+ 90-05-A172 adenocarcinoma do estômago 4+ 3+ 1-2+ -vo- 1+ -vo 3+ TRACTO REPRODUTOR 91-10-A115 carcinoma das células escamosas da vulva 14+ 1-3+ 1-2+ 1-2+ 14+ 1-3+ 93-03-A343 adenocarcinoma da próstata +/- 34+ +!-a 2-3+ -h/-a 1-2+ +/- 34+ 34+ MÚSCULOS SISTEMA IMUNITÁRIO SISTEMA URINÁRIO 93-10-B002 carcincma das células renais 2+ 3+ 90-01-A225 carcinoma das células raiais 4+ 4+ 34+da maioria 1-3+de alguns 34+ 3+ 34+ 93-01-A257 carcincma da bexiga de células transiacnais 34+ 2-3+ 1-2+ +!- 2-3+ 2-3+ SISTEMA ENDÓCRINO 94-01-A246 4+ 4+ 34+ 3+ 4+ 34+ feocromoctforna das aipra- -raiais QUADRO IX (cont) GV97 Purificado Tecido Tumoral 20 pg/mL 10 pg/mL 5 pg/mL 1 pgtaLou 2pgtaL 0,5 pg/mL GV97 supL GV14 GV39 GV59 supt 93-11-A074 Carcinoma do cóitice supra-renal 3-4+ 3-4+ 2-3+ 1+ 34+ 4+ SISTEMA RESPIRATÓRIO 93-08-N009 admocarcincma do pulmão 34+ 34+ 34+ 92-10-A316 caranoma das células escamosas do pulmão 4+ 34+ 1-2+ -vo- op- 4+ 4+ 03-05-A065 adenocarancma pulmonar 4+ 3-4+ -vo-l+ 1+ 3+ 3+ SISTEMA NERVOSO CENTRAL 94-01-A299 Schwanoma maligio com metástases para os nodos linfãtioos 4+ 4+ 4+ 34+ 4+ 34+ 92-10-A139 moiingioma 4+ 3-4+ 2-3+ 1-2+ 4+ 34+ 91-12-A013 maiingioma 4+ 2-3+ λο-3+ +/- 4+ 3+ 93-03-A361 maiingicma atípico 4+ 4+ 3+ 2+ 4+ T+ SISTEMA INTEGUMENTAR 94-04-V037 Carcinoma das células escamosas da pele c/noimais -wa 4+ -voa 3+ ^*>al+ -vo 2-3+ 2-3+ 89-02-225 sarccmadapema 4+ 3-4+ 1+ 1+ 4+ 2+ TUMORES DIVERSOS _1_
QUADRO X. ANTI-FCEVcb NOS TECIDOS HUMANOS NORMAIS GV97 Purificado TeddoTumoral 20 pgfaiL 10 pgtnL 5 pgteL 1 pgtoLou 2pgfaiL 0,5 GV97 supt GV14 GV39 GV59 supt SISTEMA DIGESTIVO 91-01-A128 bexiga com cistite 3+ 2+ 1+ •vo 2-3+ 2-3+ 94-02-B020 cólon não envolto 2-3+ 2-3+ 92-01-A292 N. Cólon 4+ 4+ 4+ 3-4+ 4+ 3-4+ 93-10-A116N. Cólon Z-4+ 14+ 1-3+ -vo-2+ -vo 3-4+ 2-3+ 3-4+ 90-06-A116 N. Cólcn 3+de muitos 2+ 93-02-A350N. esófago 3-4+ 3+ 1+ -tf- 4+ 4+ 93-05-A503N. íleo 4+ 4+ 94-03-A244N. fij^do 4+ 1-3+ -\o-l+ -vo 4+ 4+ 90-02-B132 N. fiffldo 1+de poucos +/- -vo -vo -vo 1-3+ 2-3+ 2-3+ 2-3+ 94-01-A181N. Pâncreas 1-4+ 1-3+ 1-3+de alguns -vo 3-4+ 90-05-D008N. Pâncreas 2-4+ 1-3+ +/- -vo 2-3+ 2-3+ 93-05-A174N. Paredda 2+de alguns 1-2+de alguns 1+de alguns -vo -vo 3+de alguns 2-3+ 94-04-A391N. jntffdmniijffylr» 1-3+ ΛΟ-2+ -vo -vo 3+ 88-06-107N. Estômago 3+ 2+ +/- -vo 3-4+ 3+ QUADRO X(cont) GV97 Purificado Tecido Tumoral 20 pgfaiL lOpg/mL 5pg/mL lpgftnLou 2pgtaL 0,5pg4nL GV97 supt GV14 GV3S GV59 srçt 101-84ÒN. estômago (101 = 84a par) 3-4+na parte préicpal e naperiÊria 2-3+na parte prriopal e naperiÊria +/-na parte principal e naperiÊria ao na parte principal e naperiÊria 3+ 3-4+ 90-11-B337N. estômago 2-3+ +/-1+ -vo AO 3+ 3+ TRACTO REPRODUTOR 93-04-A041N. mama 4+ 3+ 94-02-A197N. mama com alterações fíbrodstkas 4+ 3+ 93-Q2-A051 mama com alterações fibroristicas -vo-l+ -vo -vo AO n- -4/-2+ 93-Q2-A103 mama ccm alterações fibrodsticas 4+ 3+ 2+ 1+ 92-11-A006N. ectocóvix 2+da 1-2+da maiona 0,5+ AO -vo 1-24-de alguns 3+da makna maiona 91-03-A207N. ectocóvix 2j5+ 1,5+ 1+ 54- 2-34- 92-02-A139N. ovário ccm orapo amarelo 1+na ao na maioria mas 1+numa área AO AO ao na mainria mas3-4+ mna área ΛΌΙΗ maioro mas 3-4+ raima área mas2+ niima área 93-06-A11BN. próstata 1+de alguns AO AO AO 3+ 93-ll-A317d secção da próstata 3-4+ 2-3+ -vo-3+ -VO-1+ 3-4+ 3-4+ 202QUADRO X (cont.) GV97 Purificado TeodoTumoraJ 20 PgánL lOpgfrnL 5 pg/mL 1 pgúnLou 2 pgriíL 0,5 pgrinL GV97 aipt GV14 GV39 GV59 supt 93-02-A315 vesícula seminal 0,5-1+ 0,5+ -vo -vo 1+ 1,2+ 92-04-A069N. testículos 1+ 47- +/- 1-2+ 91-04-A117 uretra com inflamação 1+ +/- -VO -vo +7- 1+ 34+ MÚSCULOS 94-01-A065N. coração 34+ 2+ 47- -vo 34+ 4+ 91-07-D007N. músculos do esqueleto 1-4+ 1-3+ 1-2+ -vo -vo 1-3+ 1-3+ 95-03-A395 N. músculos do esqueleto 4+ 3-4+ 1-2+ 0,5-1+ 4+ 4+ SISTEMA IMUNITÁRIO 90-01-A077 N. nodos Imêticos 2-3+ 2+ 1+de alguns -vo -vo 2-3+ 34+ 90-08-A022 N. noctoslmfiticos maioria 1+ mas alguns 4+ maioria 0,5+mas alguns 2+ maioria -vomas alguns 2+ maioria-vo masa^uns 0,5-1+ 3+ 34 91-03-A057N. nodos linfáticos 2+ 1+ 47- -vo 34+ 34+ 91-09-B017E nodos linfãtioos não aivdtos 3+ 2+ 47-1+ -vo 2-3+ 2-3+ 93-07-A236N. ‘Spicm’ 3-4+ 34+ -w>3+ -vo 24+ 93-07-252 N. ‘Spkai’ 3+ 1+ +/- -vo 2-3+ SISTEMA ENDÓCRINO 94-04-A252N. Supra-renais ccm medula eccrtex 4+ 4+ 34+ 1-2+ 4+ 3+ QUADRO X(cont) GV97 Purificado TeadoTumoral 20 fj^mL 10pg/niL 5 pgfaiL lpgfaiLou 2pgfaiL 0,5 (igfaiL GV97 siçL GV14 GV39 GV59 supt 93-05-A086N. Medula das siqua-renais maioria -vo alguns 1-2+ maioria -vo alguns 1-2+ -vo -vo 2-3+ 34+ 92-03-A157 tiróidehipeqjlásica 1+ 47- +/- -vo 4+ 4+ 91-03-B019N. Tiróide -vo-3+ -vo-2+ -vo-l+ -vo 2-3+ 2-3+ SISTEMA URINÁRIO 93-09-A048N. rim 4+ 2-3+ 91-11-A075N. rim 4+ 3+ 2+ 1+ 4+no garé-mb 4+no gbmó-mb 4+no gtamé- ndo 93-10-B001N. rim 4+ 3+ 47- -vo 4+no gnmó-rub 4+no gjomó- ndo 4+no gomé- ndo SISTEMA INTEGUMENTA] R 92-08-A029N. pde da mama +/- a 4+ 47-a 3+ 47-al+ 47- 2+ 2+ 89-02-257 ‘CaitOedgp marches 2SS’ 4+ 34+ 2-3+ 1-2+ 1+ 34+ SISTEMA RESPIRATÓRIO 93-05-A203 N. pulmão -vb2+ ^νο1+ +/- -vo 2+ 3+ 92-12-A263N. brônquios 2-3+ contestação ocm duetos 34+ 1-2+ -vo -vo 2-3+ oGrtrastaçao ocm duetos 2-3+
QUADRO XI
PADRÕES DE CONTRASTAÇÃO DO 9F7 ΑΝΤΊ-FCEV POR CONIRASTAÇÃO IMUNOISTOQUÍMICA DIRECTA DE TECIDOS DE CB COM 6 A 8 SEMANAS GV97 Purificado 20 10 5 με/mL l|igfaiLou2 9F7 3F9 5F9 Tecido Timoral Hg/mL p^oiL |ig/mL supt supt supt SISTEMA DIGESTIVO FÍGADO 2+ 1-2+ +/- +/- 1-2+ 1-2+ 4+m, 4+m, INTESTINO 4+ 3+ 2+ 1+ finfiidet, linfôide, resto di£ resto dif. de de 1+de muitose3+ PÂNCREAS cm ilhas de células 2-3+de 1-2+de +/-demuiose muitos e mutese 4+embnfiàd^ 4+de 4+am 4+em resto áf de 3+de 3+de INTESTINO muitose4+ linfôide, linfôide, FVffl algunse a^unse DELGADO emlinfõide resto di£ resto di£ 4+em 4+en deFVm deFVffl finfõide 1-2+nas +/-nas +/-nas mais 34+ 34+ mais mais ocasionais 1+ (a|guns (a|gnns ESTÔMAGO 34+ ocasonais ocasionais FVm-w) FVIII-w) 3+ 2+ SISTEMA REPRODUTIVO TESTÍCULOS MÚSCULOS E SISTEMA LNTEGUMENTAR 34+ 34+ (alguns (alguns CORAÇÃO -vo -vo -\C -\o rVHI-vo) FVin-vo) +'205--^ QUADRO XI (cont) CV97 Purificado Tecido Tumoral 20 ΙΟμ^ηύ 5 μ§/ηιΕ ^j^nLou2 0,5 9Γ7 supt 3Ϊ9 supL 5F9 supL MÚSCULOS PELE 1-2+nacamacb adiposae 3-4+na camada celular 1+nacamadi acíposae 3-4+ na camada nphitar +/-na camada adiposae 34+ dsafepmsna camada cdular +/-na camada adiposae 1-2+db alguns na camada adular 3+ 3+ SISTEMA IMUNITÁRIO BAÇO 4+ 3+ 2+ -vo 4+ 4+ ΉΜ0 SISTEMA URINÁRIO RIM gkjménik>4+ glomérulo 3-4+ glomérulo 2-3+ gjomóulo 1-2+ gcmóiic 34+ gjanáJo 34+ SISTEMA ENDÓCRINO SUPRA-RENAIS 1 SISTEMA RESPIRATÓRIO PULMÃO | SISTEMA NERVOSO CEREBELO 4+ 2+ -tf-da maioriae 1+de alguns +/-da maioria e 1+dealgims 4+ 4+ TUMORES TUMOR | 4+ 4+ 3-4+ 2-3+(2) 4+ 3+ Β.
Falta de reactividade do GV97 com o FCEV humano solúvel
Para a identificação de anticorpos que são específicos para o FCEV, para o receptor de FCEV (Flk-1) ou para o FCEV ligado (ou combinado) com o receptor, desenvolveu-se um protocolo de pesquisa por EISLE. O procedimento é o que a seguir se descreve. biiciahnentc rccobriu-sc uma placa dc 96 cavidades para a prática de um protocolo de EISLE (cavidades de fundo redondo) (as cavidades do lado de fora ficaram vazias) com ‘FLK/Seap’ à razão de 100 pL/cavidade para uma diluição de 10 pg/mL em tampão de sensibilização. Após uma incubação de um dia para o outro, lavou-se a placa duas vezes com STP de um dia para o outro a 4°C. Seguidamente, a placa recoberta com ‘FLK/Seap’ foi bloqueada com uma solução de STP + CAH (a 5%) à razão de 250 pL/cavidade, durante 1 hora a 37°C. Removeu-se a solução de bloqueio e bateu-se com a placa vigorosamente sobre toalhas de papel.
As placas bloqueadas foram então incubadas com FCEV-165 à razão de 100 pL/cavidade (fornia aa de FCEV 165 produzida em levedura, cedida pelo Dr. Ramakrishnan da Universidade do Minnesota), na diluição de 2 pg/mL em ligante mais heparina à razão de 0,1 pg/mL durante 4 horas à temperatura ambiente ou de um dia para o outro a 4°C. Recolheu-se a solução de FCEV e efectuou-se a lavagem da placa 2 vezes com STP-Tween (0,10%). A seguir juntou-se às cavidades o sobrenadante da fusão do hibridoma, à razão de 100 pL/cavidade, e efectuou-se a incubação durante 1 hora a 32°C. A seguir a esta incubação do sobrenadante efectuou-se a lavagem da placa 3 vezes com STP-Tween e depois realizou-se a incubação com o anticorpo secundário à razão de 100 pL/cavidade (KPL, anti-IgG de murganho (Gt) à razão de 1:1000 em STP-Tween + CAH (a 5%) durante 1 hora a 37°C. A seguir à incubação do anticorpo secundário efectuou-se a lavagem das placas 4 vezes com STP-Tween, efectuou-se a incubação com substrato à razão de 100 pL/cavidade (‘Substrato Sigma OPD’ dissolvido em tampão citrato + H2O2) durante 20 minutos e com leitura a 490 nm num leitor de mciroplacas da ‘Cambridge Technology’ (Modelo 7520). As cavidades com uma absorvência superior à das cavidades de contraprova adequadas foram escolhidas, por serem positivas, para subsequente caracterização.
Concluiu-sc que o GV97 não sc ligou às placas de EISLE recobertas com o FCEV recombinante, nem o FCEV humano recombinante se ligou às placas de EISLE recobertas com o GV97. O FCEV humano recombinante solúvel não bloqueou a ligação do GV 97, à razão de 5 pg/mL, ao endotélio tumoral em seções histológicas, mesmo quando acrescentado com uma concentração de 50 pg/mL.
Estes dados sugerem que o GV97 reconhece um epítopo do FCEV que está dissimulado no FCEV humano recombinante, mas que passa a ficar acessível quando 0 FCEV se liga ao seu receptor nas céllas endoteliais. C. Localização do GV97 nas cobaias portadoras da linhagem 10
Em contraposição com os dados de contrastação obtidos a partir das secções histológicas, o anticorpo GV97 localizou-se de forma selecdva nas células endoteliais do tumor após injecção nas cobaias portadoras do tumor de linhagem 10 (quadro ΧΠ). A contrastação das células endoteliais no tumor foi moderadamente forte, ao passo que a contrastação do endotélio normal em diversos órgãos foi indetectável. D. O anti-FCFb liga-se selectivaineiite às células endoteliais do tumor O GV97 e o GF82, que são anticorpos que foram criados contra 0 terminal N do FCFb da cobaia, ligaram-se fortemente às células endoteliais em secções congeladas de tumor de linhagem 10 da cobaia e às células endoteliais em dois tipos de tumores malignos humanos
(quadro XIII). Pelo contrário, observou-se uma contrastação relativamente fiaca das células endoteliais em diversos tecidos normais de cobaia. 7< y 209 v QUADRO ΧΠ
GV97 INJECTADO EM CB PORTADORAS DE TUMORES TECIDO GVlOpg^nL GV 97 20 μ^ηί de volume de soro injedado SISTEMA DIGESTIVO fígado 2+ -vo intestino 3+ possível 0,5-1+ de alguns PÂNCREAS +/- de muitos e 2+ em ilhas de células possívd 0,5-1+ de alguns INTESTINO DELGADO 2-3+ de muitos 4+ em linféãde resto dif deFVIII +/- ESTÔMAGO 1-2+nas mais ocasionais 3+ possivelmente 0,5+ de alguns SISTEMA REPRODUTC IR TESTÍCULOS +/- MÚSCULOS E SISTEMA INTEGUMENTAR CORAÇÃO -vo -vo MÚSCULO -vo PELE 1+na camada adiposa e 3-4+na camada celular SISTEMA IMUMTÁRIC BAÇO 3+ possivelmente alguns 1+ TTMO SISTEMA URINÁRIO RIM gkmáufo3-4+ SISTEMA ENDÓCRINO ADRENAL 4+ -vo SISTEMA RESPIRATÓRIO PUUVÍÃO 2+ -vo SISTEMA NERVOSO CEREBELO 2+ -vo TUMORES TUMOR 4+ 2-3+
QUADRO XIII
ANTICORPO FCF ANTÍ-CB QUE CONTRASTA SOBRE TECIDOS DE CB
TECIDO DE CB GF67 GF82 SISTEMA DIGESTIVO FÍGADO ND ND INTESTINO +/- +/- PÂNCREAS 2-3+ 2+ INTESTINO DELGADO +/- H- ESTÔMAGO ND ND SISTEMA REPRODUTOR TESTÍCULOS ND ND MÚSCULOS E SISTEMA INTEGUMENTAR CORAÇÃO 2-3+ 1+ MÚSCULOS +/- 1+ PELE ND ND SISTEMA IMUNITÁRIO BAÇO 3+ ΛΟ ΉΜΟ SISTEMA URINÁRIO RIM 1-2+ -vo SISTEMA ENDÓCRINO SUPRA-RENAIS 1-2+ +/- SISTEMA RESPIRATÓRIO PULMÃO 1-2+ 2-3+ SISTEMA NERVOSO CEREBELO 1+ -1+ TUMORES TUMORDE UNHA 1 4+ 4+ TUMORES HUMANOS FEOCROMOCrrOMA 4+ 4+ SCHWANOMA
EXEMPLO XI
PROTOCOLOS DE TRATAMENTO PE SERES HUMANOS
Este exemplo diz respeito aos protocolos de tratamento de seres humanos utilizando os ligandos de ligação biespecíficos e de coagulação da presente invenção. Estes ligandos serevem para o tratamento clinico de diversos cancros dos seres humanos e também para o tratamento de outras doenças, tais como a hiperplasia prostáíica benigna e a artrite reumatóide, em que possa ser vantajosa a paragem durante um período intermédio, ou a longo prazo, do fluxo sanguíneo.
Os ligandos biespecíficos são ferramentas particularmente úteis na terapia antitumoral. A partir dos dados aqui apresentados, incluindo os estudos efectuados com animais, e tendo em conta os conhecimentos da especialidade sobre o tratamento de linfomas (Glennie et ai., 1988), o encaminhamento de células T (Nolan & Kennedy, 1990) e o encaminhamento de fánnacos (Paulus, 1985), é possível desenvolver de uma forma simples e directa doses adequadas e regimes de tratamento.
Naturalmente, antes de a utilização passar a ser generalizada, é necessário efectuar outros estudos com animais e outras experiências clínicas. Os diversos elementos para a realização de uma experiência clínica, incluindo o tratamento e a observação de pacientes, irão ser determinados pelos especialistas na matéria à luz dos preceitos da presente invenção. A informação subsequente destina-se a definir as linhas gerais para levar a cabo tais experiências.
Pressupõe-se que os pacientes escolhidos para o estudo venham a ser aqueles que não tenham sido capazes de responder pelo menos a uma tentativa de terapia convencional e padeçam objectivamente de uma doença perfeitamente confirmada de acordo com exames físicos, técnicas laboratoriais ou procedimentos radiográficos. No caso de serem utilizadas partes de anticorpos monoclonais dos murinos, não deve constai do historial dos pacientes nenhuma alergia à imunoglobulina dos murganhos. Qualquer tratamento quimioterapêutico cm curso tem de ser interrompido pelo menos 2 semanas antes de o paciente começar a participar no estudo.
No que diz respeito à administração de um ligando biespecífico, considera-se que há determinadas vantagens na utilização de um catéter venoso central permanente com um orifício triplo no lúmen. Os ligandos biespecíficos têm de ser filtrados, por exemplo, utilizando um filtro de 0,22 pm, e têm de ser diluídos convenientemente, por exemplo, com um soluto salino, até se obter um volume final de 100 mL. Antes da sua utilização, a amostra de teste também tem de ser filtrada de uma maneira idêntica e a sua concentração tem de ser avaliada antes e após a filtração, mediante a determinação do valor A^. As quantidades recuperadas previsíveis devem estar compreendidas entre 87 % e 99% e é necessário tomar em devida conta os ajustamentos para compensar a perda de proteínas.
Os ligandos biespecíficos podem ser administrados durante um período aproximado de 4 a 24 horas, recebendo cada paciente entre 2 e 4 infusões com um intervalo de 2 a 7 dias. A administração também pode ser efectuada em regime estacionário de infusão ao longo de um período de 7 dias. A infusão administrada segundo um nível qualquer de dosagem deve depender de todos os sintomas de toxicidade observados. Assim, se for atingida uma toxicidade de Grau Π após uma infusão única ou após um determinado intervalo de tempo em regime estacionário de infusão, as outras doses devem ser sustidas ou o regime estacionário de infusão deve ser interrompido, a não ser que a toxicidade melhore. Têm de ser administradas doses cada vez maiores de ligandos de coagulação biespecíficos a grupos de pacientes, até que cerca de 60% deles revelem uma toxicidade inaceitável de Graus ΠΙ ou IV em qualquer das categorias. Pode-se definir como doses seguras as que correspondam a 2/3 deste valor. 0 exame físico, as medições tumorais e os testes de laboratório devem ser realizados, como c evidente, antes do tratamento e a intervalos que se prolongam até 1 mês mais tarde. Os testes laboratoriais devem compreender as contagens sanguíneas completas, os exames de creatinina sérica, creatinina-cinase, electrólitos, ureia, azoto, SGOT, bilirrubina, albumina e proteínas totais no soro. As amostras de soro retiradas até ao período de 60 dias após o tratamento devem ser avaliadas por meio de radioimunoensaios (RJE) para pesquisar a presença de ligandos biespecíficos intactos, ou seus componentes, e anticorpos contra uma ou as duas partes do ligando. As análises imunológicas dos soros, recorrendo a qualquer ensaio convencional, por exemplo, um protocolo de EISLE ou de RIE, irão permitir a avaliação da farmacocinética e da depuração do agente terapêutico.
Para efeitos de avaliação das respostas antitumorais, prevê-se que os pacientes devam ser examinados entre as 48 horas e 1 semana e novamente 30 dias após a última infusão. Havendo presente um tumor palpável, devem ser medidos dois diâmetros perpendiculares de todas as massas observadas, diariamente durante o tratamento, na primeira semana após ter sido completada a terapia e nos 30 dias subsequentes. Para se medir um tumor não palpável, poderiam ser realizadas pesquisas sequenciais por TC por meio de varrimentos electrónicos com intervalos de 1 cm através do peito, abdómem e pélvis no período que medeia entre 48 horas e 1 semana e novamente aos 30 dias. As amostras de tecidos também devem ser avaliadas por via histológica e/ou por citometria de fluxo, devendo ser feitas biópsias dos locais da patologia ou retiradas amostras de sangue e de fluidos, se isso for adequado.
As respostas clínicas podem ser definidas por medições aceitáveis. Por exemplo, define-se uma resposta completa como sendo o desaparecimento de todos os tumores mensuráveis ao fim de 1 mês após o tratamento. Alem disso, c possível definir uma resposta parcial sc houver uma redução de 50% ou superior na soma dos produtos de diâmetros perpendiculares de todos os nódulos tumorais avaliáveis ao fim de 1 mês após o tratamento, sem que haja nenhum aumento dos locais tumorais. De igual modo, é possível definir uma resposta mista por uma redução do produto dos diâmetros perpendiculares de todas as lesões mensuráveis se essa redução for de 50% ou supenor ao fim de 1 mês após o tratamento, com progressão em um ou em vários locais.
REFERÊNCIAS
As obras seguintes, na medida em que proporcionam procedimentos exemplificativos ou outros pormenores complementares daqueles que foram aqui descritos, consideram-se aqui incorporadas por referência.
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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS
(1) INFORMAÇÕES GERAIS (i) REQUERENTE: NOME: BOARD OF REGENTS, THE UNIVERSITY OF TEXAS SYSTEM RUA: 201 West 7th Street CIDADE: Austin ESTADO: Texas PAÍS: Estados Unidos da América CÓDIGO POSTAL: 78701 TELEFONE: (512)499-4462 TELEFAX: (512)499-4523 e
NOME: THE SCRIPPS RESEARCH INST1TUTE RUA: 10666 Norlh Torrey Pines Road CIDADE: LaJolla ESTADO: Califórnia PAÍS: Estados Unidos da América CÓDIGO POSTAL: 92037 (ii) INVENTORES: THORPE, Philip E. EDGINGTON, Thomas S. (iii) TÍTULO DA INVENÇÃO: Métodos e composições para a coagulação específica da vasculatura tumoral (iv) NÚMERO DE SEQUÊNCIAS: 32 (v) ENDEREÇO PARA CORRESPONDÊNCIA: (A) ENDEREÇO: Amold, White & Durkee (B) RUA: P.O. Box4433 (C) CIDADE: Houston (D) ESTADO: Texas (E) PAÍS: E.UA. (F) CÓDIGO POSTAL: 77210 (vi) FORMA LEGÍVEL POR COMPUTADOR: (A) SUPORTE: disquete
(B) COMPUTADOR: CP compatível com IBM
(C) SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS, ASCII (vii) DADOS ACTUAIS DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: PCT/US95/07439 (B) DATA DE DEPÓSITO: 07-JUN-1995 (C) CLASSIFICAÇÃO: Desconhecida (viii) DADOS ANTERIORES DO PEDIDO: (A) NÚMERO DO PEDIDO: US 08/273 567 (B) DATA DE DEPÓSITO: ll-JUL-1994 (ix) INFORMAÇÃO SOBRE O REPRESENTANTE/AGENTE: (A) NOME: PARKER, DAVID L. (B) NÚMERO DE REGISTO: 32 165
(C) REFERÊNCIA/NÚMERO DO PROCESSO: UTFD433P (ix) INFORMAÇÃO PARA TELECOMUNICAÇÕES: (A) TELEFONE: (512) 418-3000 (B) TELEFAX: (713) 789-2679 (C) TELEX: 79-0924 (2) INFORMAÇÃO PARA A SEQUÊNCIA Π) NO: 1: (i) CARACTF.R ÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 27 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:l GTCATGCCAT GGCCTCAGGC ACTACAA (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:2: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:2: TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTT CT (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:3: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 47 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc - “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:3: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGCTT CTGGCACTAC AAATACT 47 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:4: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 38 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) ΊΠΡΟ DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:4: GTCATGCCAT GGCCTGCTCA GGCACTACAA ATACTGTG 38 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:5: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:5: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT 50 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:6: (i) C ARACTERÍ STIC AS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 35 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:6: TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCC TTTCT 35 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:7: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico : 245-^ (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:7: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCGGAGGCGG TGGATCAGGC 50 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:8: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:8: AGTATTTGTA GTGCCTGAGG ATCCGCCACC TCCACT 36 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:9: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:9: GGAGGCGGTG GATCAGGCGG TGGAGGTAGT GGAGGTGGCG GATCC 45 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 17 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 10: GTCATGCCAT GGCCCTG 17 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 11: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 32 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 11: TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTT CT 32 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 12: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 12: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT 50 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 13: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 53 pares de bases (B) ΤΊΡΟ: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 13: CGCGGATCCA CCGCCACCAG ATCCACCGCC TCCTTCTCTG AATTCCCCTT TCT 53 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 14: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 14: CGCGGATCCG GCGGTGGAGG CTCTTCAGGC ACTACAAATA CTGT 44 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” 249' (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO: 15: TGAC AAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T 31 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 16: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 50 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 16: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCAC TACAAATACT 50 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 17: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 31 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 17: 31
TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCTTTC T (2) INFORMAÇÕES PARA SEQID NO: 18: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 44 pares de bases (B) ΤΊΡΟ: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO: 18: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT GCACTACAAA TACT 44 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO: 19: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 34 pares de bases (B) ΊΤΡΟ: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) ΉΡΟ DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID ΝΟ.Τ9:
TGACAAGCTT AGCATTCTCT GAATTCCCCT TTCT 34 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQID NO:20: (i) CA RACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 19 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ED NO:20: CAAGTTCAGC CAAGAAAAC (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:21: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 36 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:21: ACACTTTATT ATCGGAAATC TTCAGCTTCA GGAAAG (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:22: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 657 pares de bases (B) ΤΊΡΟ: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:22:
TCAGGCACTA CAATACIGT GGCAGCATAT ΑΑΓΤΤΑΑΟΤ GGAAATCAAC TAATTTCAAG ACAATnTGG AGTGGGAAOC CAAAOOOGTC AATCAAGTCT ACACIGITCA AATAAGCACT AAGICAGGAG ATTGGAAAAG CAAATQCnT TACACAACAG ACACAGAGIG TGAOCTCACC GAOGAGAITG TGAAGGATCT GAAGCAGAOG TACTTGGCAC GGGICTICIC CTACGCX3GCA GGGAAIGTGG AGAGCACOGG TICTGCIOGG GAGCCICTGT ATGAGAACIC aXAGAGITC ACAOCTTACC TGGAGACAAA OCIOGGACAG CXAACAATTC AGAGITTTGA ACAGGTCGGA ACAAAAGTGA ATGTGACCGrT AGAAGATGAA CXjGACTITAG TCAGAAGGAA CAACACnTC CTAAGCCTTX GGGATC1TTT TGGCAAGGAC ΤΤΑΑΤΠΑΓΑ CACrTTAITA TTGGAAATCT TCAAGITCAG GAAAGAAAAC AGCXAAAACA AACACTAAIG AGmTTCAr TGATGIGGAT AAAGGAGAAA ACTACIGITT CACJIXjTTCAA GCAGIGAITC OCICXXGAAC AGITAAODGG AAGAGTACAG ACAGCCCGGT AGAGTGTATG GGGCAGGAGA AAGGGGAATT CAGAGAA (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:23: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 219 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CORDÃO: (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ Π) NO:23: ____, „ />'
> ' V ' "\/\ -253 J,
Ser GE Thr Thr Asn Thr Vai Ala Ala Tir Asn Leu Thr Trp Lis Ser 1 5 10 15 Thr Asn Phe Lis Thr He Leu Ou Trp Ou Pro Lis Pro Vai Asn Gin 20 25 30 Vai Ur Thr Vai Gin He Sa· Thr Lis Ser Gfi Asp Tip Lis Ser Lis 35 40 45 Cis Phe Tir Thr Thr Asp Thr Glu α Asp Leu Thr Αφ Giu He Vai 50 55 60 Lis Asp Val Lb Gin Thr Tir Leu Ala Aig Vai Phe Ser Tir Pro Ala 65 70 75 80 Qi Aai Vai Glu Ser Thr Gfi Ser Ala ca G3u Pro Leu Tn- Ou Asn 85 90 95 Ser Pro Qu Rie Thr Pro Tir Leu Ou Thr Asn Leu Gffi C2n Pro Thr 100 105 110 He Gin Ser Phe Giu On Vai Gfi Thr Lis Vai Asn Vai Thr Vai Ou 115 120 125 Asp Ou Arg Thr Leu Vai Aig Aig Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Vai Phe Gfi Lis Asp Leu He Tir Thr Leu Tir Tir Tip Lis Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser GE Lis Lis Thr Ala Lis Thr Asn Thr Asn Giu Phe Leu 165 170 175 He Asp Vai Asp Lis Gfi Glu Asn Tir Cis Phe Ser Vai Gin Ala Vd 180 185 190 He Pro Sa Aig Th Vai Asn Aig Lis Ser Thr Αφ Ser Pro Vai Gb 195 200 205 Cis Met GS On Ou Lis Gfi Ou Phe Aig C3u 210 215 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ED NO:24: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1947 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ DD NO:24: TQCAGCTGOC TCGCTOCCTG GCGCIGGCIG aXIGICrTAG OOTGTGCAC AGOCAGCATG 60 TCTTOCTGGC TCXTCAGCAA GCACGGTCGC TGCTOCAGCXS GGTDOGGOGA GCCAACACCT 120 TCTTGGAGGA GCjTGOGCAAG GGCAACCTAG AGCGAGAGTG CGIX3GAGGAG ACGTGCAGCr 180 ADGAGGAGGC CITOGAGGCr CTGGAGrTCCr (XACGGCTAC GGATGTGrTC TOGGCCAAGT 240 ACACAGCTTG TGAGACAGCG AGGADGOCTC GAGATAAGCT TCCTGCAror CTGGAAGGTA 300 ACTCTGCrGA GGGICTGGGT AGGAACTACr. GAGGGTATGT GAACATCADC CGGIGAGGCA 360 TTCAGTGCCA GCTATGGAGG AGTOGCTACC CACATAAGOC TGAAAIGAAC TCCACTAOX 420 ATGCTGGGGC CGACCTACAG GAGAAITIUr GOOGCAADOC CGACAGCAGC AACAGGGGAC 480 (XIGGTGCTA CACTACAGAC aXAOOGTGA GGAGGCAGGA ATGCAGCATC GCIGTCIUIG 540 GCOGGATCA AGmCACrCTA GCGATGACTC CACGCTOOGA AGGCTOCAGT GIGAATGIGT 600 CACXTTCCATT GGAGCAGKjT GTCCCTGATC GGGGGCAGCA GTAGCAGGGG CGCCTGGCGG 660 TGACCACACA TCGGCTCCCC TGOCTGGOCT GGGOCAGOGC ACAGGOCAAG GOCCTGAGCA 720 AGCAOCAGGA CTTCAACTCA GCIGTQCAGC TCGTCGAGAA CTICTGCOGC AAOOCAGAOG 780 GGGATGAGGA GGGCXjIXjTGG TGCTATGTGG CCGGGAAGCC TGGOGACnT GGGTACTGCG 840 ACCICAACTA TTXjTGAGGAG GCOCTGGAGG AGGAGACAGG AGATGGGCIG GATGAGGACT 900 CAGACAGGGC catcgaaggg CCTACCGCCA CAAGTGAGTA OCAGACrmC TIGAATOOGA 960 GGACCITTGG CTOGGGAGAG GCAGACIUIG GGCIGCGACC TCTCnCGAG AAGAAGTOGC 1020 TGGAGGACAA AACOGAAAGA GAGCTCCTGG AATCCTACAT OGAOGGGCGC ATTGTGGAGG 1060 GCKXjGATGC AGAGATCGGC ATGIGAGCIT GGCAGGTGAT GCmTCCGG AAGAGIOX 1140 AGGAGCTGCT GIUTGGGGCC AGCCTCATCA GTGACCGCTG GCHtCTCACC GCCGCGCACT 1200 GCCrCCIXJTA CXXXjCCCTGG GACAAGAACT TCACCGAGAA TGACCITCrG GIXjOGCATTG 1260 GCAAGCACTC CCGCACCAGG TAOGAGCGAA ACATTGAAAA GATATCCATG TTGGAAAAGA 1320 TCTACATCCA CCCCAGGTAC AACICGOGGG AGAADCTGGA OCGGGACATT GCXXTGATGA 1380 AGCTGAAGAA GCCIUnGCC TIGAGIGACr ACAITCAOX TGIGIGICrG OOCXjACAGGG 1440 AGADGGCAGC CAGCITGCrC CAGGCTGGAT ACAAGGGGOG GGIGACAGGC TCGGGCAAGC 1500 TGAAGGAGAC GIGGACAGCC AAOGrlTGGrA AGGGGCAGCC CAGIXJrCCTG CAGGTGGTGA 1560 ACCTGCCCAT TCTGGAGGGG CCGGIUIGCA AGGACIGCAC CCGGATCCGC ATCACIGACA 1620 ACATGTIOG TGCTGGITAC AAGCCTGATG AAGGGAAAflj AGGGGATGCC TGTGAAGGIO 1680 ACAGK3GGGG AQXTTKjIG ATGAAGAGCC CCTITAACAA CCGCIGGTAT CAAATCGGCA 1740 TOGTCICATG GGGIGAAGGC TCIGACCGGG AIGGGAAATA TGGCITCrAC ACACATGTGr 1800 TOCGCCIGAA GAAGFTGGATA CAGAAGGTCA TIGAIGAGIT TGGAGAGTAG GGGGOCACIC 1860 AiAilCTCQG CTOCTGGAAC CAATDCXXjTG AAAGAATTAT τπτστσπτ CTAAAACTAT 1920 GGTTCXXAAT AAAAGTGACT CTCAGOG 1947 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:25: (i) CARACTERISTICAS DA SEQUENCIA: (A) COMPRIMENTO: 2462 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:25: TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGT CTCCCAGG(X CTCAGGCTCC eo TCTGCCITCr GCTTGGGCIT CAGGGCIGCC TGGCTGCAGG CGGGGTCGCT AAGGCCTCAG 120 GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCA CAGAGIUITC GTAACOCAGG 180 AGGAAGCCCA CGGCGIGCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAA CGOGITOCTC GAGGAGCTGC 240 GGCCGGGCTC OCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGIG CTCCITOGAG GAGGOOCGGG 300 AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGITCrGGAT TICTEACAGr GATGGGGAGC 360 AGiurcccrc AAGIGCATGC CAGAATGGGG GCTOCTGCAA GGADCAGCTC CAGTOCTATA 420 tctcctiukj CCTGGCTGGC TTCGAGGGCC GGAACIGTGA GACGCACAAG GATOACCAGC 480 TGATCIXJrCir GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTG CAGTGAOCAC ADGGGCACCA 540 AGCGCTCCTG TCGCTGCCAC GAGGGGTACT CTCrGCTOGC AGACGGGGTG TOCTGCACAC 600 (XACAGITGA ATATOCATUT GGAAAAATAC CTAnCTAGA AAAAAGAAAT GOCAGCAAAC 660 CCCAAGGCOG AATTGIGGGG GGCAAGGTGT GOCCCAAAGG GGAGIUTOCA TOGCAGGTOC 720 TCJnUTTGGT GAATGGAGCT CAGITGIUIXj GGGGGACCCT GAIGAACACC ATCrGGGTGG 780 TUIGCGCGGC CCACrGITTC GACAAAATCA AGAACTGGAG GAACCTGATC GCGGIUCIGG 810 GCGAGCAGGA CCIGAGOGAG CAOGAOGGGG ATGAGCAGAG COGGOGGGIG GCX3CAGGTCA 900 1GATCOOCAG CACGTACGTC CCGGGCAOCA CCAACCACGA CAICGOGCTG CTOOGGCIGC 960 ADCAGCCCGT GGITXJICACr GADCATGTGG TGCCCCTCTG CCTGCXXXjAA CGGAGGITCr 1020 CPGAGAGGAC GCIGGCCmC GTOOGCITCr CATIOGICAG OGGCIOGGGC OOCTGCTGG 1080 ADOGTGGOGC CAGGGOOCTG GAGCTCATGG TOCTCAAOGT aXOOGGCIG ATGAOOCAGG 1140 ACTGOCTGCA GCAGTCACGG AAGGIGGGAG ACTCCCCAAA TATCADGGAG TACAroncr 1200 GIGCOGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGG GGACAGTGGA GGCCCACATG 1260 CXAOOCACYA COGGGGCADG TGGTADCTGA OGGGCAIOGT CAGCIGGGGC CAGGGCIGCG 1320 CAACCGTGGG OCACnTGGG GIUTACACCA GGGICTOCCA GTACATCGAG TGGCIOCAAA 1380 AGCIGA7GCG CIGAGAGOCA OGCCCAGGAG TOCTOCIGCG AGOCOCAnT COCTAGCCEA 1440 GCAGCCOGG CCTGTGGAGA GAAAGOCAAG GCIGCGTOGA ACIGTOCTGG CAOCAAAICC 1500 CATATATTCr TCTGCAGITA ATGGGGTAGA GGAGGGCATG GGAGGGAGGG AGAGGTGGGG 1560 AGGGAGACAG AGACAGAAAC AGAGAGAGAC AGAGACAGAG AGAGACFGAG GGAGAGACIG 1620 TGAGGACATG GAGAGAGACT CAAAGAGACT CCAAGTFCA AAGAGACTAA TAGAGACACA 1680 GAGATGGAAT AGAAAAGATG AGACGCAGAG GGAGAGAGGG GCIGGACAGA GGGGCAGGGG 1740 AGTGOCAAGG TTOTOCTGGA GGCAGACAGC CCAGCTGAGC crcciTACcr axrrcAGCc 1800
AAGCCCCACC TGCACGIGAT CTGCTGGOOC TCAGGCIGCT GCIUPGCCIT CATIOCIOGA 1860 GACAGTAGAG GCATGAACAC ACATGGATOC ACACACACAC ACGCCAATGC ACACACACAG 1920 AGATATGCAC ACACACGGAT GCACACACAG ATGGTCACAC AGAGA1ACGC AAACACACCG 1980 ATGCACACGC ACATAGAGAT ATGCACACAC AGATQCACAC ACAGATATAC ACATGGATGC 2010 ACGCACATGC CAATGCACGC ACACATCAGT GCACACGGAT GCACAGAGAT ATGCACACAC 2100 CGATCJIGCGC ACACACAGAT ATGCACACAC ATGGATGAGC ACACACACAC CAAGIGCGCA 2160 CACACACCGA TCTACACACA CAGATGCACA CACAGATGCA CACACACCGA TGCTGACTCC 2220 ATGiurccrG TCCTCKjAAG GCGGrTGTIT AGCIUTCACT TnOGGITC TTATGCATTA 2280 TCATUITCAC TTCAGACAAT TCAGAAGCAT CAOCAIOCAT GGIGGCGAAT GOOOOCAAAC 2340 TUIXXXXCAA ATCTATTTCT COCTTOGCrG GGTGOOGGGC TQCACAGACT ATTOOOCACC 2400 TGCITCOCAG CITCACAATA AAGGGCIGCG TCTOCTDOGC ACAOCTGTGG TGOCTGCCAC 2460 CC 2462 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQID NO:26: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1437 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:26: ATGCAGCGCG TGAACATGAT CATGGCAGAA TCACCAAGCC TCATCACCAT CTGCCmTA 60 GGATATCTAC TCAGrTGCTGA ATCTACAGIT imcriGAic ATGAAAACGC CAACAAAATT 120 CIGAATOGGC CAAAGAGGTA TAATTCAGGT AAATTGGAAG AGITIGITCA AGGGAACCIT 180 GAGAGAGAAT GTATGGAAGA AAAGTGTAGT TITGAAGAAC CAOGAGAAGT TmGAAAAC 240 ACIGAAAAGA CAACTGAATT TTGGAAGCAG ΤΑΠΉΤΌΑΙΌ GAGATCAGTG TGAGfTOCAAT 300 CCAIUnTAA ATGGOGGCAG TTGCAAGGAT GACATTAAIT CCTATGAATG TTGGIUTOCC 360 TTTGGATTTG AAGGAAAGAA CrGTGAAITA GATOTAACAT GTAACATTAA GAATGGCAGA 420 TGCGAGCAGT TnUTAAAAA TAGTGCTGAT AACAAGGTGG TrrccrccrG TACTGAGGGA 480 TAICGACTTG CAGAAAAOCA GAAGTCCTGT GAACCAGCAG TGCCATITCC AIXjTGGAAGA 510 GITTCrGITT CACAAACITC TAAGCICADC CXjTGCTGAGG ciurmrGc TGATGTGGAC 600 TATCTAAATC CTACIGAAGC TGAAAGCATT TTGGATAACA TCACTCAAGG CACCCAATCA 660 1TTAATOACT TCACTOGGCT TXJTTGGTGGA GAAGATCOCA AAOCAGGTCA ATTCOCTTCG 720 CAGGTIGTIT TGAATGGTAA AGTTGATGCA TTOGIOGAG GCICTArOGT TAATGAAAAA 780
TGGATTGIAA CTGCFGCCJCA CTGTCnTGAA ACTGGrcnTA AAATTACAGT TUTOGCAGGT 840 GAACATAATA TTGAGGAGAC AGAACATACA GAGCAAAAGC GAAATGTGAT TOGAGCAATT 900 ATTCCTCACC ACAACTACAA TGCAGClAli AATAAGTACA ACCATGACAT TCXXCITCrG 960 GAACTGGACG AACXXTTAGT GCTAAACAGC TACGTTACAC CTATmXAT TGCTGACAAG 10» GAATACACGA ACATCrrOCT CAAAITrGGA TCTGGCTATG TAAGIGGCIG GGCAAGAGTC 1080 TTCCACAAAG GGAGATCAGC τπΆσποτ CAGTACCITA GAGTTCCACT TGITGAOOGA 1140 GCTACATOTC TTGGATCTAC AAAGITCACC ATCTATAACA ACAIUITCrG TGCTGGCTTC 1200 CAIGAAGGAG GTAGAGATTC ATGTCAAGGA GATAGIGGGG GACCECATGT TACTGAAGTG 1260 GAAGGGAGCA GTTTCTTAAC TGGAATTATT AGCTGGGGTG AAGAGTGIGC AATGAAAGGC 1320 AAATATGGAA TATATAOCAA GGTATCCCGG TATGrTCAACT GGATTAAGGA AAAAACAAAG 1380 CTCACITAAT GAAAGATGGA ΤΠΤΧΑΑΟΟΓ TAATTCATTG GAATTGAAAA TTAACAG 1437 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQID NO:27: (i) CARACTERJSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 1126 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:27: GGATTOGAAG GCAAAAACTG TGAATTATIC ACACGGAAGC TUTGCAGCCT GGACAADGGG 60 GACIGTGACC AGITCIGCCA CGAGGAACAG AACIOGIGG TGrTGCTDCIG CGCOGGOGGG 120 TACACCCIGG CTGACAACGG CAAGGCCTGC ATTCCCACAG GGCCCTACCC CKjTGGGAAA 180 CAGACCCIGG AACGCAGGAA GAGGTCAGTG GCXXAGGOCA CCAGCAGCAG CGGGGAGGCC 240 CCTGACAGCA TCACAIGGAA GCCATATGAT GCAGGOGAOC TGGADOOCAC CGAGAACOCC 300 TTOGACCTGC TTGACTTCAA (XAGADGCAG OCTGAGAGGG GCGACAACAA CCICAGCAGG 360 ATOGIGGGAG GCCAGGAATG CAAGGAOGGG GAGIGKXrr GGCAGGOCCT GCTCATCAAT 420 GAGGAAAACG AGGGmUTG TGGIGGAACC AITCrGAGCG AGITCTACAT OCTAAGGGCA 480 GCOCACIGTC TCTACCAAGC CAAGAGATTC GAAGGGGAOC GGAACACGGA GCAGGAGGAG 540 GGCGGIGAGG CGGIGCADGA GGTGGAGGIG GIGATCAAGC ACAAOOGGIT CACAAAGGAG 600 AGCTArGACT TOGACATCGC OGIGCTCOGG CTCAAGACCC CCATCACCIT CCGCATGAAC 660 GIGGOGGCIG CCTGOCrCOC OGAGCGTGAC TGGGCCGAGT CCACGCTGAT GADGCAGAAG 720 AOGGGGATTG TQAGCOGCrr CGGGCGCACC CACGAGAAGG GCXX3GCAGTC rAfTAfiGCTC 780 AAGAIGCTGG AGGIGCOCTA CGTGGACCGC AACAGCIGCA AGCIGTOCAG CAGCTTCAIC 840 258 ATCACCCAGA ACATXjITCrG TGCOGGCTAC GACACCAAGC AGGAGGATGC CTGOCAGGGG 900 GACAGCGGGG GCCCGCACXjr CACCCGCTTC AAGGACACCT ACTrOGIGAC AGGCATOGTC 960 AGCTGGGGAG AGGGCTGTGC CCGTAAGGGG AAGTACUGGA TCTACACCAA OCnCACCOCC 1020 TTCCrCAAOT GGATCGACAG GTCCATGAAA ACCAGGGGCT TGCCCAAGGC CAAGAGCTAT 1080 GCCCCGGAGG TCATAACGTC CrCTCCATTA AAGIGAGATC CCACTC 1126 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQID NO:28: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 45 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:28: GAAGAAGGGA TCCTGGTGCC TCGTGGTTCT GGCACTACAA ATACT 45 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:29: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 30 pares de bases (B) TIPO: ácido nucleico (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: outro ácido nucleico (A) DESCRIÇÃO: /desc = “ADN” 'C Jp* '259.; (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:29: CTGGCCTCAA GCTTAACGGA ATTCACCTTT 30 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:30: (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:30:
Ala 1 Pro Met Ala Gíu 5 Gii Glu Qn Tis Pro Arg Gto Vai Vai 10 Lis Phe 15 Met Asp Vai Tir 20 Lis Aig Ser Tff Os 25 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:31 : (i) CARACTERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (A) COMPRIMENTO: 26 aminoácidos (B) ΊΊΡΟ: aminoácido (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido 260 (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQID NO:31:
Ala 1 Pro Met Ala Gu 5 GB GB GB On Asn Hs 10 Phe Met Asp Vai 20 Tw GSn Aig Ser Tir 25 Cis 15 (2) INFORMAÇÕES PARA SEQ ID NO:32: (i) CARA(TERÍSTICAS DA SEQUÊNCIA: (Λ) COMPRIMENTO: 25 aminoácidos (B) TIPO: aminoácido (C) TIPO DE CORDÃO: simples (D) TOPOLOGIA: linear (ii) TIPO DE MOLÉCULA: péptido (xi) DESCRIÇÃO DA SEQUÊNCIA: SEQ ID NO:32:
Met 1 AJa Ala GE Ser 5 De Thr Thr Leu Piro Ala Leu Pro GEi 10 GE GE 15 Asp GE GE Ala 20 Phe Ala Pro GB Qs 25 Lisboa, 11 de Abril de o /· 2001 * V” Oficia! Proorie OQCÍí? ίΓ.Οϋβ'ίΤίΟ;

Claims (59)

  1. Reivindicações Ligando de ligação que compreende: (a) uma primeira região de ligação que se liga a uma célula tumoral, a um componente da vasculaluia associada ao tumor ou a um componente do estroma associado ao tumor, estando a primeira região de ligação funcionalmente ligada a (b) um factor tecidual ou derivado de um factor tecidual ou a uma segunda região de ligação que se liga a um factor tecidual ou a um derivado de um factor tecidual. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que a referida primeira região de ligação compreende um ligando ou um receptor que se liga a uma célula tumoral, a um componente da vasculatura associada ao tumor ou a um componente de estroma associado ao tumor. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 1, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo de IgG, um anticorpo de IgM, uma região de um anticorpo de ligação ao antigénio, um fragmento Fvcs, Fv, Fac’, Fac ou F(ac’)2 de um anticorpo. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida primeira região de ligação se liga a um antigénio da superfície celular de uma célula tumoral de um tumor vascularizado. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 4, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação ao antigénio, que se liga ao antigénio plSS1®82 tumoral da superfície da célula, à proteína do núcleo da mucina do leite, ao TAG-72, ao Lewis a, ao antigénio carrinoembriónico (ACE) ou um antigénio associado ao tumor que se liga a um anticoipo seleccionado entre o conjunto constituído pelos anticorpos 9.2.27, OV-TL3, Movl8, B3, KS1/4, 260F9 e D612. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida primeira região de ligação se liga a um componente da vasculatura tumoral. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 6, em que a referida primeira região de ligação se liga a um receptor da superfície das células da vasculatura tumoral. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 7, em que a referida primeira região de união se liga a uma proteína de Classe Π do CPH, a um receptor de FCEV/FPV, a um receptor de FCF, a um receptor do FpCT, a um ΤΊΕ, a uma M-1ACV, a uma M-1AIC, a uma selectina P, a uma selectina E, a uma integrina θνβ3, a uma pleiotropina, a uma endossíatina ou a uma endogtina. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 8, em que a referida primeira região de ligação compreende um FCEV/FPV, um FCF, um F3CT, um ligando que se liga a um T1E, uma isoforma de fibronectma associada a um tumor, um factor dispersor, um factor de crescimento dos hepatócitos (FCH), o factor 4 plaquetário (F4P), um FCDP ou um ITMP.
    \ .-r Λ /7 / 3 10. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 8, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga a uma proteína de Classe Π do CPH, um receptor de FCEV/FPV, um receptor de FCF, um receptor do FPCT, um TÍE, uma M-l ACV, uma M-1AIC, uma selectina P, uma selectina E, uma integrina θνβ3, uma pleiotropina, uma endossialina ou uma endoglina.
  2. 11. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 8, em que a referida primeira região de ligação compreende um FCEV/FPV ou um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga ao receptor de FCEV/FPV.
  3. 12. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 8, em que a referida primeira região de ligação compreende um F3CT ou um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga à endoglina.
  4. 13. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 8, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga à M-l ACV.
  5. 14. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 8, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga à selectina E. /?K y
  6. 15. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 6, em que a referida primeira região dc ligação se liga a um ligando que se liga a um receptor da superfície das células da vasculatura tumoral.
  7. 16. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 15, em que a referida primeira região de ligação se liga ao FCEV/FPV, ao FCF, ao FpCT, a um ligando que se liga a um ΊΠΕ, a uma isoforma de fibronectina associada ao tumor, ao factor dispersar, um factor de crescimento dos hepatócitos (FCH), ao factor 4 plaquetário (F4P), ao FCDP ou ao ITMP.
  8. 17. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 16, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga ao FCEV/FPV.
  9. 18. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 16, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que se liga ao FCF.
  10. 19. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 6, em que a referida primeira região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um antigénio que sc liga a um complexo de ligando:receptor mas não se liga ao ligando ou ao receptor quando o ligando ou o receptor não fizer parte do complexo de ligandoireceptur. 20. ligando de ligação de acordo com a reivindicação 6, em que a reténda primeira região '-J S (/ ~ 1,S ,-yv de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um auligénio que se liga a um complexo de FCEVrreceptor de FCEV mas não se liga ao FCEV ou ao receptor de FCEV quando qualquer deles não fizer parte do complexo de FCEVrreceptor de FCEV.
  11. 21. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 3, em que a referida primeira região de ligação se liga a um componente do estroma tumoral.
  12. 22. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 21, em que a referida primeira região de ligação se liga à tenascina, a um componente da membrana pavimentar, a um componente do tecido conjuntivo ou a uma plaqueta activada.
  13. 23. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 6 a 22, em que a referida primeira região de ligação se liga a um componente induzível do estroma tumoral ou da vasculatura tumoral.
  14. 24. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 23, em que a referida primeira região de ligação se liga a um componente do estroma tumoral ou da vasculatura tumoral induzível por um coagulante ou por uma citoquina.
  15. 25. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 24, em que a referida primeira região de ligação se liga a um componente da vasculatura tumoral induzível pela trombina, induzível por uma citoquina libertada por monócitos, macrófagos, mastócitos, células T 'ν 6' auxiliares, células T ou células AN positivas às CD8, ou induzível pelas citoquinas IL-1 IL-4, FcxNT, ΡβΝΤ ou IFN-γ.
  16. 26. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 25, em que a referida primeira região de ligação se liga à selectina P, à selectina E, à M-1ACV, à M-1AIC, à endoglina ou a um antigénio de Classe Π do CPH.
  17. 27. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 24, em que a referida primeira região de ligação se liga a um componente do estroma tumoral induzível pela trombina.
  18. 28. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 27, em que a referida primeira região de ligação se liga ao LLIR.
  19. 29. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida primeira região de ligação está funcionalmente ligada a um factor tecidual ou a um derivado do factor tecidual.
  20. 30. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 28, em que a referida primeira região de ligação está funcionalmente ligada a uma segunda região de ligação que se liga a um factor tecidual ou a um derivado do factor tecidual.
  21. 31. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 30, em que a referida segunda região de ligação compreende um anticorpo ou uma região de um anticorpo de ligação de um 7 antigénio que se liga ao referido factor tecidual ou ao referido derivado de factor tecidual.
  22. 32. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 31, o qual é definido também como sendo um anticorpo biespecífico.
  23. 33. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 30 a 32, o qual compreende também um factor tecidual ou um derivado de factor tecidual ligado à referida segunda região de ligação.
  24. 34. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que a referida primeira região de ligação está funcionalmente ligada ao referido factor tecidual ou ao referido derivado de factor tecidual ou à referida segunda região de ligação por meio de uma ligação covalente.
  25. 35. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 34, em que a referida primeira região de ligação está ligada ao referido factor tecidual ou ao referido derivado de factor tecidual por meio de tuna ponte peptídica clivável de forma selectiva.
  26. 36. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 35, em que a referida primeira região de ligação está ligada ao referido factor tecidual ou ao referido derivado de factor tecidual por meio de um ligador peptídico que possui um local de clivagem para a urocinase, para a plasmina, para a trombina, para o Factor IXa, para o Factor Xa ou para uma metaloproteinase. / Λ ' ^ ί-
  27. 37. Ligando de ligação de acordo com mna qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de ligação c uma proteína de fusão preparada por expressão de um vector recombinante numa célula hospedeira, em que o referido vector compreende, no mesmo bloco de leitura, um segmento de ADN que codifica a referida primeira região de ligação funcionalmente ligada a um segmento de ADN que codifica o referido factor tecidual, o referido derivado de factor tecidual ou uma segunda região de ligação.
  28. 38. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 33, em que a referida primeira região de ligação é funcionalmente ligada ao referido factor tecidual ou ao referido derivado de factor tecidual ou à referida segunda região de ligação utilizando uma combinação de avidina:biotina.
  29. 39. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores* em que o referido factor tecidual ou o referido derivado de factor tecidual é um factor tecidual truncado ou um derivado de factor tecidual truncado.
  30. 40. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido factor tecidual ou o referido derivado de factor tecidual é um factor tecidual dimérico, trimérico ou polimérico ou um correspondente derivado de factor tecidual.
  31. 41. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido factor tecidual ou o referido derivado de factor tecidual é um factor tecidual mutante que não tem capacidade para activar o f actor VII. 9
  32. 42. Ligando de ligação de acordo com a reivindicação 41, em que o referido factor de coagulação compreende um factor teci dual mutante em que o resíduo Tip na posição 15R é trocado pelo resíduo Arg; em que o resíduo Ser na posição 162 é trocado pelo resíduo Ala; em que o resíduo Gli na posição 164 é trocado pelo resíduo Ala ou em que o resíduo Trp na posição 158 é trocado pelo resíduo Arg e o resíduo Ser na posição 162 é trocado pelo resíduo Ala.
  33. 43. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de ligação compreende também um factor coagulante dependente da vitamina K, seleccionado entre de Factor Mia, Factor VD/VIIa, Factor IX/EXa ou Factor X/Xa.
  34. 44. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de ligação compreende também um factor de coagulação, dependente da vitamina K, ao qual falta a modificação Gla.
  35. 45. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de ligação compreende também o activador do factor X do veneno da víbora de Russell, um composto activador das plaquetas ou um inibidor da fibrinólise.
  36. 46. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores, em que o referido ligando de ligação compreende também o tromboxano A2, a sintase do tromboxano A2 ou a antiplasmina oc2.
  37. 47. Composição farmacêutica que contenha, numa forma aceitável sob o ponto de vista farmacológico, um ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações anteriores.
  38. 48. Estojo que contém, num sistema de acondicionamento adequado: (a) uma primeira composição farmacêutica que incorpora um anticorpo ou uma célula T que sc liga a uma célula tumoral, à vasculatura associada ao tumor ou ao estroma associado ao tumor, e produz uma citoquina ou um coagulante no local do tumor, induzindo assim a expressão de um antigénio relevante, induzível pela citoquina ou induzível pelo coagulante, na vasculatura associada ao tumor ou no estroma associado ao tumor; e (b) uma segunda composição farmacêutica que incorpora um ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46; em que a primeira região de ligação do referido ligando de ligação se liga ao antigénio propício, induzível pela citoquina ou induzível pelo coagulante, induzido pela referida primeira composição farmacêutica.
  39. 49. Estojo de acordo com a reivindicação 48, em que a referida primeira composição farmacêutica incorpora um anticorpo biespecífico que se liga a um antigénio da superfície das células do tumor vascularizado e a um antigénio activador sobre a superfície celular de uma célula leucocitária.
  40. 50. Estojo de acordo com a reivindicação 49, em que a referida primeira composição farmacêutica incorpora um anticorpo biespecífico que se liga ao antigénio tumoral 11 pl85HER^, a proteína do núcleo da mucina do leite, ao TAG-72, ao Lewis a, ao antigénio carcinoembriónico (ACE) ou a um antigénio associado ao tumor que se liga a um anticorpo seleccionado entre o conjunto constituído pelos anticorpos 9.2.27, OV-TL3, Movi 8, B3, KS1/4,260F9 e D612.
  41. 51. Estojo de acordo com uma qualquer das reivindicações 49 ou 50, em que a referida primeira composição farmacêutica incorpora um anticorpo biespecífico que se liga ao φ antigénio activador CD2, CD3, CD14, CD16 (FcR para IgE), CD28 ou ao antigénio receptor das células T.
  42. 52. Estojo de acordo com a reivindicação 51, em que a referida primeira composição farmacêutica incorpora um anticorpo biespecífico que se liga às CD 14 e em que a referida segunda composição farmacêutica incorpora um ligando de ligação que possui uma primeira região de ligação que se liga à selectina E.
  43. 53. Estojo de acordo com a reivindicação 51, em que a referida primeira composição farmacêutica incorpora um anticorpo biespecífico que se liga às CD 14 e em que a referida segunda composição farmacêutica incorpora um ligando de ligação que compreende uma primeira região de ligação que se liga a um antigénio de Qasse Π do CPH.
  44. 54. Estojo de acordo com a reivindicação 53, o qual contém também uma terceira composição farmacêutica que compreende uma ciclosporina ou um agente capaz de suprimir a expressão do antigénio de Classe 11 do CPH nas células endoteliais vasculares de tecidos normais. 55.
    12--' Estojo de acordo com a reivindicação 48, em que a referida primeira composição farmacêutica incorpora um anticorpo biespecífico que se liga a uma célula tumoral, a um antigénio da vasculatura tumoral ou do estroma tumoral e a um coagulante.
  45. 56. Estojo de acordo com a reivindicação 55, em que a referida segunda composição farmacêutica incorpora um ligando de ligação que compreende uma primeira região de ligação que se liga à selectina E ou à selectina P.
  46. 57. Ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46, utilizável terapeuticamente para se administrar um factor teddual ou um derivado de factor teci dual à vasculatura associada a um tumor.
  47. 58. Utilização de um ligando de ligação de acordo com uma qualquer das reivindicações 1 a 46 para a produção de um medicamento para tratar o cancro, mediante a administração de factor tecidual ou de um derivado de factor teddual à vasculatura associada a um tumor.
  48. 59. Utilização de acordo com a reivindicação 58, para administrar um factor teddual exógeno ou um derivado de factor tecidual exógeno à vasculatura associada a um tumor.
  49. 60. Utilização de acordo com a reivindicação 58, para se administrar um factor tecidual endógeno à vasculatura associada a um tumor num animal, em que o referido ligando de ligação possui uma primeira região de ligação ligada de forma covalente a uma segunda região de ligação que se liga a um factor tecidual endógeno e concentra esse factor tecidual 8
    Λ 13 na referida vasculatura associada ao tumor após a administração do referido medicamento ao referido animal.
  50. 61. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 58 a 60, em que o referido medicamento se destina a ser utilizado após a indução da expressão de um componente elegível como alvo numa vasculatura associada a um tumor ou num estroma associado a um tumor num animal, em que o referido medicamento incorpora um ligando de ligação que possui uma primeira região de ligação que se liga ao componente induzido elegível como alvo.
  51. 62. Utilização de acordo com a reivindicação 61, em que a expressão do componente elegível como alvo é induzida por uma citoquina.
  52. 63. Utilização de acordo com a reivindicação 62, em que a expressão do componente elegível como alvo é induzida administrando ao animal uma composição farmacêutica que incorpore um anticorpo biespecífíco que se liga a um antigénio da superfície das células do tumor vascularizado e a um antigénio activador da superfície das células leucocitárias.
  53. 64. Utilização dc acordo com a reivindicação 63, em que o anticorpo biespecífíco se liga a um antigénio da superfície das células de um tumor vascularizado e às CD 14 ou CD28.
  54. 65. Utilização de acordo com a reivindicação 64, em que a expressão dos antigénios de >1»
    Classe Π do CPH nos tecidos normais do animal é suprimida com uma ciclosporina ou com um composto funcionalmente equivalente e em que a expressão dos antigénios de Classe Π do CPH na vasculatura associada ao tumor do animal é induzida subsequentemente administrando ao animal um anticorpo biespecífico que se liga a um antigénio da superfície das células do tumor vasculanzado e às CD28.
  55. 66. Utilização de acordo com a reivindicação 61, em que a expressão do componente elegível como alvo é induzida por um coagulante.
  56. 67. Utilização de acordo com a reivindicação 66, em que a expressão do componente elegível como alvo é induzida administrando ao animal uma composição farmacêutica que incorpore um anticorpo biespecifíco que se liga a uma célula tumoral, a um antigénio da vasculatura tumoral ou do estroma tumoral e a um coagulante.
  57. 68. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 58 a 67, em que o referido medicamento é formulado para administração parentérica.
  58. 69. Utilização de acordo com uma qualquer das reivindicações 58 a 68, em que o referido medicamento é adequado para ser utilizado num ser humano.
  59. 70. Utilização de acordo com a reivindicação 62, em que a expressão dos antigénios de Classe Π do CPH nos tecidos normais do animal é suprimida administrando um anticorpo anti-CD4 ou um fragmento Fac anti-CD4 ao animal e em que a expressão dos anligcuios de 15 Classe Π do CPH na vasculatura associada ao tumor do animal é induzida subsequentemente administrando ao animal uma célula T, produtora de IFN-γ, que se infiltre no tumor. Lisboa, 11 de Abril de 2001 bd 'Cbí';fÍQi
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