JP5438880B2 - 機能蛋白質を代替する二種特異性抗体 - Google Patents

Description

本発明は、酵素反応を増強する補因子の作用を代替する二種特異性抗体、および該抗体を有効成分として含有する医薬組成物に関する。

抗体は血中での安定性が高く、抗原性も低いことから医薬品として注目されている。その中には二種類の抗原を同時に認識できる二種特異性抗体がある。二種特異性抗体は提唱されて久しい。しかしながらこれまでに、ＮＫ細胞、マクロファージ、Ｔ細胞のｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇを目的とするなど、二種類の抗原を単に繋ぐだけの抗体しか報告されていない（非特許文献７参照）。例えば、臨床試験が行なわれているＭＤＸ−２１０は、ＦｃγＲＩを発現しているｍｏｎｏｃｙｔｅ等をＨＥＲ−２／ｎｅｕを発現している癌細胞にｒｅｔａｒｇｅｔｉｎｇする二種特異性抗体であるに過ぎない。従って現在まで、二種特異性抗体を、酵素反応を増強する補因子の代替手段として利用した例はなかった。

補因子としては、例えば、組織因子（ＴＦ）、血液凝固第Ｖ因子（Ｆ．Ｖ）、活性化血液凝固第Ｖ因子（Ｆ．Ｖａ）、血液凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩ）、活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子（Ｆ．ＶＩＩＩａ）、トロンボモデュリン（ＴＭ）、プロテインＳ（ＰＳ）、プロテインＺ（ＰＺ）、ヘパリン、補体Ｃ４ｂ、補体制御タンパクＨ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ）、Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｏｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＰ）、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＣＲ１）等が挙げられる。

これらのうち、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａは、十分な活性化血液凝固第ＩＸ因子（Ｆ．ＩＸａ）の活性発現に必要な補因子である。Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ Ｆらは、ある種の抗Ｆ．ＩＸ／Ｆ．ＩＸａ抗体に、ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ ａｓｓａｙにおいてＦ．ＩＸａによる血液凝固第Ｘ因子（Ｆ．Ｘ）活性化を促進する作用があることを見出している（特許文献１参照）。しかしながら、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿の凝固回復能測定においては、この抗体単独による凝固回復能は示されておらず、外来的にＦ．ＩＸａを添加した状態でのみ凝固回復能を示している。

Ｆ．ＶＩＩＩａは、Ｆ．ＩＸａと相互作用するだけでなくＦ．Ｘとも相互作用することが知られている（非特許文献５および６参照）。この点で、Ｓｃｈｅｉｆｌｉｎｇｅｒ Ｆらの抗体は、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの機能を十分に代替しているといえず、その活性も不十分であると推測される。

本発明者らは、鋭意研究の結果、酵素活性を増強する補因子の作用を代替する二種特異性抗体の作製に成功し、本発明に至った。

国際公開第０１／１９９９２号 米国特許第４，４７４，８９３号公報 ＥＰ４０４，０９７号 国際公開第９３／１１１６１号 特願２００２−１１２３６９号公報 特願２００３−０１２６４８号公報 特開平５−３０４９９２号公報 特開平２−１４５１８７号公報 特開平５−２１３７７５号公報 特開平１０−１６５１８４号公報 特開平１１−７１２８８号公報 特表２００２−５１８０４１号公報 特表平１１−５０６３１０号公報 特開平５−１９９８９４号公報 特表平１０−５１１０８５号公報 特開平５−１８４３８３号公報 Ｎｉｌｓｓｏｎ ＩＭら著、「Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．」、１９９２年、Ｖｏｌ．２３５、ｐ．２５−３２ Ｌｏｆｑｖｉｓｔ Ｔら著、「Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．」、１９９７年、Ｖｏｌ．２４１、ｐ．３９５−４００（左記「Ｌｏｆｑｖｉｓｔ Ｔ」の「ｏ」はウムラウトがつく文字である） 第２４回日本血栓止血学会学術集会 学術専門部会 血友病標準化検討部会 ミニシンポジウム、２００１年、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｊｓｔｈ．ｏｒｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ＃１９３ １９９４ Ｍｅｒｔｅｎｓ Ｋら著、「Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．」、１９９９年、Ｖｏｌ．８２、ｐ．２０９−２１７ Ｌａｐａｎ ＫＡら著、「Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．」、１９９８年、Ｖｏｌ．８０、ｐ．４１８−４２２ Ｓｅｇａｌ ＤＭら著、「Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ」、２００１年、Ｖｏｌ．２４８、ｐ．１−６ Ｂｏｓ ＲおよびＮｉｅｕｗｅｎｈｕｉｔｚｅｎ Ｗ著、「Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ」、１９９２年、Ｖｏｌ．１１、Ｎｏ．１、ｐ．４１−５１ Ｂｒｅｎｎａｎ Ｍら著、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９８５年、Ｖｏｌ．２２９、Ｎｏ．１７０８、ｐ．８１−３ Ｋａｒｐｏｖｓｋｙ Ｂら著、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」、１９８４年、Ｖｏｌ．１６０、Ｎｏ．６、ｐ．１６８６−７０１ Ｓｕｒｅｓｈ ＭＲら著、「Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．」、１９８６年、Ｖｏｌ．１２１、ｐ．２１０−２８ Ｍａｓｓｉｍｏ ＹＳら著、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」、１９９７年、Ｖｏｌ．２０１、ｐ．５７−６６ Ｂｒｅｎｎａｎ Ｍら著、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９８５年、Ｖｏｌ．２２９、ｐ．８１ Ｓｈａｌａｂｙ ＭＲら著、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」、１９９２年、Ｖｏｌ．１７５、ｐ．２１７−２５ Ｈｏｌｌｉｎｅｒ Ｐら著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９３年、Ｖｏｌ．９０、ｐ．６４４４−８ Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢら著、「Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．」、１９９６年、Ｖｏｌ．９、ｐ．６１７−２１ Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ Ｕら著、「Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．」、１９６８年、Ｖｏｌ．１２８、ｐ．１４６１−７３ Ｋｕｒｏｋａｗａ Ｔら著、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９８９年、Ｖｏｌ．７、ｐ．１１６３ Ｌｉｎｋ ＢＫら著、「Ｂｌｏｏｄ」、１９９３年、Ｖｏｌ．８１、ｐ．３３４３ Ｎｉｔｔａ Ｔら著、「Ｌａｎｃｅｔ」、１９９０年、Ｖｏｌ．３３５、ｐ．３６８−７１ ｄｅＬｅｉｊ Ｌら著、「Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ Ｎａｔｉｏｎａｌｅ ｄｅ Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｓａｎｇｕｉｎｅ，Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ Ｆｒａｎｃｅ」、１９９０年、ｐ．２４９−５３ Ｌｅ Ｄｏｕｓｓａｌ ＪＭら著、「Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．」、１９９３年、Ｖｏｌ．３４、ｐ．１６６２−７１ Ｓｔｉｃｋｎｅｙ ＤＲら著、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」、１９９１年、Ｖｏｌ．５１、ｐ．６６５０−５ Ｗｅｉｎｅｒ ＬＭら著、「Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．」、１９９３年、Ｖｏｌ．５３、ｐ．９４−１００ Ｋｒｏｅｓｅｎ ＢＪら著、「Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ」、１９９４年、Ｖｏｌ．７０、ｐ．６５２−６１ Ｗｅｉｎｅｒ ＧＪら著、「Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９４年、Ｖｏｌ．１５２、ｐ．２３８５ Ｓｕｒｅｓｈ ＭＲら著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９８６年、Ｖｏｌ．８３、ｐ．７９８９−９３ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ ＣおよびＣｕｅｌｌｏ ＡＣ著、「Ｎａｔｕｒｅ」、１９８３年、Ｖｏｌ．３０５、ｐ．５３７ Ｘｉａｎｇ Ｊら著、「Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」、１９９０年、Ｖｏｌ．２７、ｐ．８０９ Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ＣＲら著、「Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、１９９２年、Ｖｏｌ．１０、ｐ．１６９ Ｈｕｓｅ ＷＤら著、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」、１９８９年、Ｖｏｌ．２４６、ｐ．１２７５ ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ Ｊら著、「Ｎａｔｕｒｅ」、１９９０年、Ｖｏｌ．３４８、ｐ．５５２ Ｋａｎｇ ＡＳら著、「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」、１９９１年、Ｖｏｌ．８８、ｐ．４３６３

本発明は、酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体の提供を課題とする。

本発明者らは鋭意研究を行った結果、Ｆ．ＩＸ／Ｆ．ＩＸａ及びＦ．Ｘの双方に特異的に結合し、Ｆ．ＶＩＩＩａの補因子作用、すなわちＦ．ＩＸａによるＦ．Ｘ活性化を促進する作用を代替する二種特異性抗体を見出すことに成功した。即ち、本発明者らは、酵素および該酵素の基質の両者を認識し、該酵素の補因子の機能を代替し得る二種特異性抗体の作製に成功した。

即ち本発明は、酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体に関し、より具体的には、
〔１〕酵素、および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体、
〔２〕酵素が蛋白質分解酵素である、〔１〕に記載の抗体、
〔３〕蛋白質分解酵素、基質ならびに補因子が血液凝固線溶関連因子である、〔２〕に記載の抗体、
〔４〕血液凝固線溶関連因子の酵素が血液凝固第ＩＸ因子および／または活性化血液凝固第ＩＸ因子で、基質が血液凝固第Ｘ因子で、補因子が血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子である、〔３〕に記載の抗体、
〔５〕抗血液凝固第ＩＸ／ＩＸａ因子抗体における下記（ａ１）もしくは（ａ２）のＣＤＲ３のアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域と、抗血液凝固第Ｘ因子抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ９）のいずれかに記載のＣＤＲ３のアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域とを含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗体、
（ａ１）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：１６に記載のアミノ酸配列
（ａ２）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：２０に記載のアミノ酸配列
（ｂ１）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：２４に記載のアミノ酸配列
（ｂ２）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：２８に記載のアミノ酸配列
（ｂ３）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：３２に記載のアミノ酸配列
（ｂ４）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：３６に記載のアミノ酸配列
（ｂ５）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：４０に記載のアミノ酸配列
（ｂ６）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：４４に記載のアミノ酸配列
（ｂ７）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：４８に記載のアミノ酸配列
（ｂ８）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：５２に記載のアミノ酸配列
（ｂ９）Ｈ鎖ＣＤＲ３が配列番号：５６に記載のアミノ酸配列
〔６〕抗血液凝固第ＩＸ／ＩＸａ因子抗体における下記（ａ１）もしくは（ａ２）のＣＤＲのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域と、抗血液凝固第Ｘ因子抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ９）のいずれかに記載のＣＤＲのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域とを含む、〔１〕〜〔４〕のいずれかに記載の抗体、
（ａ１）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：１４、１５、１６に記載のアミノ酸配列
（ａ２）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：１８、１９、２０に記載のアミノ酸配列
（ｂ１）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：２２、２３、２４に記載のアミノ酸配列
（ｂ２）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：２６、２７、２８に記載のアミノ酸配列
（ｂ３）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：３０、３１、３２に記載のアミノ酸配列
（ｂ４）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：３４、３５、３６に記載のアミノ酸配列
（ｂ５）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：３８、３９、４０に記載のアミノ酸配列
（ｂ６）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：４２、４３、４４に記載のアミノ酸配列
（ｂ７）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：４６、４７、４８に記載のアミノ酸配列
（ｂ８）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：５０、５１、５２に記載のアミノ酸配列
（ｂ９）Ｈ鎖ＣＤＲ１，２，３が配列番号：５４、５５、５６に記載のアミノ酸配列
〔７〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物、
〔８〕出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および／または治療に用いられる医薬組成物である、〔７〕に記載の組成物、
〔９〕出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患が、血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性の低下ないし欠損によって発症および／または進展する疾患である、〔８〕に記載の組成物、
〔１０〕血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性の低下ないし欠損によって発症および／または進展する疾患が、血友病Ａである、〔９〕に記載の組成物、
〔１１〕血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性の低下ないし欠損によって発症および／または進展する疾患が、血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子に対するインヒビターが出現している疾患である、〔９〕に記載の組成物、
〔１２〕血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性の低下ないし欠損によって発症および／または進展する疾患が、後天性血友病である、〔９〕に記載の組成物、
〔１３〕血液凝固第ＶＩＩＩ因子および／または活性化血液凝固第ＶＩＩＩ因子の活性の低下によって発症および／または進展する疾患が、フォンビルブランド病である、〔９〕に記載の組成物、
〔１４〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体、または〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を予防および／または治療する方法、
〔１５〕〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体の、〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載した組成物の製造のための使用、
〔１６〕少なくとも〔１〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体、または〔７〕に記載の組成物を含む、〔１４〕に記載の予防および／または治療する方法に用いるためのキット、
〔１７〕〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体、または〔７〕〜〔１３〕のいずれかに記載の組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を、血液凝固第ＶＩＩＩ因子と併用して、予防および／または治療する方法、
〔１８〕少なくとも〔４〕〜〔６〕のいずれかに記載の抗体、または〔７〕に記載の組成物を含み、かつ血液凝固第ＶＩＩＩ因子を含む〔１７〕に記載の予防および／または治療する方法に用いるためのキット、を提供するものである。

図１はｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｈの挿入領域を表した図である。 図２はｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＬおよびｐＩＮＤ−ｇ４Ｌの挿入領域を表した図である。 図３はｐＩＮＤ−ｇ４Ｈの挿入領域を表した図である。 図４は抗Ｆ．ＩＸａ抗体ＸＢ１２と抗Ｆ．Ｘ抗体ＳＢ０４、ＳＢ２１、ＳＢ４２、ＳＢ３８、ＳＢ３０、ＳＢ０７、ＳＢ０５、ＳＢ０６、ＳＢ３４により作製した抗Ｆ．ＩＸａ／抗Ｆ．Ｘ二種特異性抗体の、Ｆ．ＶＩＩＩａ様活性を測定した結果を示している。抗体溶液の濃度は１０μｇ／ｍＬ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）である。結果、９種の二種特異性抗体でＦ．ＶＩＩＩａ様活性の上昇を示し、ＸＢ１２／ＳＢ０４、ＸＢ１２／ＳＢ２１、ＸＢ１２／ＳＢ４２、ＸＢ１２／ＳＢ３８、ＸＢ１２／ＳＢ３０、ＸＢ１２／ＳＢ０７、ＸＢ１２／ＳＢ０５、ＸＢ１２／ＳＢ０６、ＸＢ１２／ＳＢ３４の順に活性が強かった。 図５は抗Ｆ．ＩＸａ抗体ＸＴ０４と抗Ｆ．Ｘ抗体ＳＢ０４、ＳＢ２１、ＳＢ４２、ＳＢ３８、ＳＢ３０、ＳＢ０７、ＳＢ０５、ＳＢ０６、ＳＢ３４により作製した抗Ｆ．ＩＸａ／抗Ｆ．Ｘ二種特異性抗体またはＸＴ０４抗体の、Ｆ．ＶＩＩＩａ様活性を測定した結果を示している。抗体溶液の濃度は１０μｇ／ｍＬ（最終濃度１μｇ／ｍＬ）である。結果、ＸＴ０４／ＳＢ０４、ＸＴ０４／ＳＢ２１、ＸＴ０４／ＳＢ４２、ＸＴ０４／ＳＢ３８、ＸＴ０４／ＳＢ３０、ＸＴ０４／ＳＢ０７、ＸＴ０４／ＳＢ０５、ＸＴ０４／ＳＢ０６、ＸＴ０４／ＳＢ３４はＦ．ＶＩＩＩａ様活性の上昇を示した。 図６は、図４の中で最も活性の高かったＸＢ１２／ＳＢ０４について、様々な濃度でのＦ．ＶＩＩＩａ様活性を測定した結果を示している。結果、ＸＢ１２／ＳＢ０４は濃度依存的にＦ．ＶＩＩＩａ様活性の上昇を示した。 図７はＸＢ１２／ＳＢ０４、ＸＢ１２／ＳＢ２１、ＸＢ１２／ＳＢ４２、ＸＢ１２／ＳＢ３８、ＸＢ１２／ＳＢ３０、ＸＢ１２／ＳＢ０７、ＸＢ１２／ＳＢ０５、ＸＢ１２／ＳＢ０６、ＸＢ１２／ＳＢ３４存在下での、血漿凝固時間（ＡＰＴＴ）を測定した結果を示している。抗体溶液とＦ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を混合後の濃度はＸＢ１２／ＳＢ０６に関しては１．７μｇ／ｍＬ、それ以外は１０μｇ／ｍＬである。結果、ＸＢ１２／ＳＢ０４、ＸＢ１２／ＳＢ２１、ＸＢ１２／ＳＢ４２、ＸＢ１２／ＳＢ３８、ＸＢ１２／ＳＢ３０、ＸＢ１２／ＳＢ０７、ＸＢ１２／ＳＢ０５、ＸＢ１２／ＳＢ０６、ＸＢ１２／ＳＢ３４は、抗体非存在下と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。 図８はＸＴ０４／ＳＢ０４、ＸＴ０４／ＳＢ２１、ＸＴ０４／ＳＢ４２、ＸＴ０４／ＳＢ３８、ＸＴ０４／ＳＢ３０、ＸＴ０４／ＳＢ０７、ＸＴ０４／ＳＢ０５、ＸＴ０４／ＳＢ０６、ＸＴ０４／ＳＢ３４存在下での、血漿凝固時間（ＡＰＴＴ）を測定した結果を示している。抗体溶液とＦ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を混合後の濃度はＸＴ０４／ＳＢ０６に関しては５μｇ／ｍＬ、それ以外は１０μｇ／ｍＬである。結果、ＸＴ０４／ＳＢ０４、ＸＴ０４／ＳＢ２１、ＸＴ０４／ＳＢ４２、ＸＴ０４／ＳＢ３８、ＸＴ０４／ＳＢ３０、ＸＴ０４／ＳＢ０７、ＸＴ０４／ＳＢ０５、ＸＴ０４／ＳＢ０６は、抗体非存在下と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。ＸＴ０４／ＳＢ３４は凝固時間の短縮は認められなかった。 図９は図７、図８の中で最も凝固時間（ＡＰＴＴ）の短縮効果の高かったＸＢ１２／ＳＢ０４について、様々な濃度での凝固時間を測定した結果を示している。結果、ＸＢ１２／ＳＢ０４は濃度依存的に凝固時間の短縮効果を示した。図中の抗体濃度は抗体溶液とＦ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を混合後の数値を表す。 図１０はＳＢ０４またはＳＢ０６のＧＳＴ−ＡＰウェスタンブロッティングの結果を示している。転写されたＧＳＴ−ＡＰに対し、１はＳＢ０４、２はＳＢ０６、３は抗体を含まないサンプルと反応させたものである。結果、ＳＢ０４のみＧＳＴ−ＡＰとの結合反応が検出された。 図１１はｐＥＬＢＧｌａｃＩベクターを表した図である。ＣｏｌＥ１ｏｒｉ：ＣｏｌＥ１系プラスミド複製開始領域、ｆ１ｏｒｉ：ｆ１ファージ複製開始領域、ｌａｃＩ：ラクトースリプレッサータンパク質コード領域、Ｐ_ｌａｃ：ラクトースプロモーター、ｐｅｌＢｓｓ：大腸菌ＰｅｌＢタンパクシグナル配列、ｓｃＦｖ：一本鎖抗体分子コード領域、ｇｅｎｅ ＩＩＩ：ｆ１ファージＧｅｎｅＩＩＩタンパク質コード領域、Ａｍｐ^ｒ：アンピシリン耐性遺伝子。Ｓｆｉ Ｉ：制限酵素Ｓｆｉ Ｉ切断部位。 図１２は抗Ｆ．ＩＸａ抗体（Ａ１９，Ａ２５，Ａ３１，Ａ３８，Ａ３９，Ａ４０，Ａ４１，Ａ４４，Ａ５０，Ａ６９，ＸＢ１２）と抗Ｆ．Ｘ抗体（Ｂ２，Ｂ５，Ｂ９，Ｂ１０，Ｂ１１，Ｂ１２，Ｂ１３，Ｂ１４，Ｂ１５，Ｂ１６，Ｂ１８，Ｂ１９，Ｂ２０，Ｂ２１，Ｂ２３，Ｂ２５，Ｂ２６，Ｂ２７，Ｂ３１，Ｂ３４−１，Ｂ３４−２，Ｂ３５，Ｂ３６，Ｂ３８，Ｂ４２，ＳＢ０４，ＳＢ１５，ＳＢ２７）とを組み合わせて発現させた二種特異性抗体の培養上清を用いてＦ．ＶＩＩＩａ様活性を測定した結果を示す。＋はＦ．ＶＩＩＩａ様活性が０．１以上である場合を表す。 図１３は、抗Ｆ．ＩＸａ抗体（Ａ１９，Ａ２５，Ａ３１，Ａ３８，Ａ３９，Ａ４０，Ａ４１，Ａ４４，Ａ５０，Ａ６９，ＸＢ１２）と抗Ｆ．Ｘ抗体（Ｂ２，Ｂ５，Ｂ９，Ｂ１０，Ｂ１１，Ｂ１２，Ｂ１３，Ｂ１４，Ｂ１５，Ｂ１６，Ｂ１８，Ｂ１９，Ｂ２０，Ｂ２１，Ｂ２３，Ｂ２５，Ｂ２６，Ｂ２７，Ｂ３１，Ｂ３４−１，Ｂ３４−２，Ｂ３５，Ｂ３６，Ｂ３８，Ｂ４２，ＳＢ０４，ＳＢ１５，ＳＢ２７）とを組み合わせて発現させた二種特異性抗体の精製物を用いて血漿凝固アッセイを行った結果を示す。抗体無添加時と比較し、抗体添加時の凝固時間の短縮が１０秒〜２０秒を＋、２０秒〜４０秒を＋＋、４０秒〜５０秒を＋＋＋、そして５０秒以上を＋＋＋＋で表す。 図１４は図１３の中で凝固時間（ＡＰＴＴ）の短縮効果の高かったＡ４４／Ｂ２６について、様々な濃度での凝固時間を測定した結果が示されている。抗体無添加時の凝固時間は１１３秒である。結果、Ａ４４／Ｂ２６は濃度依存的に凝固時間の短縮効果を示した。図中の抗体濃度は抗体溶液とＦ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を混合後の数値を表す。 図１５は図１３の中で凝固時間（ＡＰＴＴ）の短縮効果の高かったＡ６９／Ｂ２６について、様々な濃度での凝固時間を測定した結果が示されている。抗体無添加時の凝固時間は１０９．６秒である。結果、Ａ６９／Ｂ２６は濃度依存的に凝固時間の短縮効果を示した。図中の抗体濃度は抗体溶液とＦ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を混合後の数値を表す。 図１６はＡ４４／Ｂ２６またはＸＢ１２／ＳＢ０４とＦ．ＶＩＩＩの共存下での、血漿凝固時間（ＡＰＴＴ）を測定した結果を示している。結果、Ａ４４／Ｂ２６またはＸＢ１２／ＳＢ０４とＦ．ＶＩＩＩの混合溶液は、Ｆ．ＶＩＩＩ単独と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。 図１７はＡ４４／Ｂ２６またはＸＢ１２／ＳＢ０４存在下での、インヒビター血漿における凝固時間（ＡＰＴＴ）を測定した結果を示している。結果、Ａ４４／Ｂ２６またはＸＢ１２／ＳＢ０４は抗体非存在下と比較して、凝固時間の短縮効果を示した。 図１８はＸＢ１２／ＳＢ０４とヒト化ＸＢ１２／ヒト化ＳＢ０４について、様々な濃度での凝固時間を測定した結果を示している。抗体無添加時の凝固時間は１１１．３秒である。測定の結果、ヒト化ＸＢ１２／ヒト化ＳＢ０４はＸＢ１２／ＳＢ０４と同程度の凝固時間の短縮効果を示した。図中の抗体濃度は抗体溶液とＦ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を混合後の数値を表す。

本発明における二種特異性抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ抗体）は、異なる抗原に対して特異性を有する２種類の抗体もしくは抗体断片からなる分子である。二種特異性抗体は特に制限されないが、モノクローナルであることが好ましい。

本発明の二種特異性抗体は、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型抗体であることが好ましい。（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ＣＡＫ ａｎｄ Ｌａｒｒｉｃｋ ＪＷ，ＴＨＥＲ ＡＰＥＵＴＩＣ ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｉｎ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ ｂｙ ＭＡＣＭＩＬＬＡＮ ＰＵＢＬＩＳＨＥＲＳ ＬＴＤ，１９９０参照）。組換え型抗体は、それをコードするＤＮＡをハイブリドーマ、または抗体を産生する感作リンパ球等の抗体産生細胞からクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得ることができる。

さらに、本発明における抗体は、その抗体断片や抗体修飾物であってよい。抗体断片としては、ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ；Ｄｂ）、線状抗体、一本鎖抗体（以下、ｓｃＦｖとも記載する）分子などが含まれる。ここで、「Ｆｖ」断片は最小の抗体断片であり、完全な抗原認識部位と結合部位を含む。「Ｆｖ」断片は１つの重（Ｈ）鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）および軽（Ｌ）鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）が非共有結合により強く連結されたダイマー（Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマー）である。各可変領域の３つの相補鎖決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ；ＣＤＲ）が相互作用し、Ｖ_Ｈ−Ｖ_Ｌダイマーの表面に抗原結合部位を形成する。６つのＣＤＲが抗体に抗原結合部位を付与している。しかしながら、１つの可変領域（または、抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

また、Ｆａｂ断片（Ｆ（ａｂ）とも呼ばれる）はさらに、Ｌ鎖の定常領域およびＨ鎖の定常領域（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体のヒンジ領域からの１またはそれ以上のシステインを含むＨ鎖ＣＨ１領域のカルボキシ末端由来の数残基を付加的に有する点でＦａｂ断片と異なっている。Ｆａｂ’−ＳＨとは、定常領域の１またはそれ以上のシステイン残基が遊離のチオール基を有するＦａｂ’を示すものである。Ｆ（ａｂ’）断片は、Ｆ（ａｂ’）_２ペプシン消化物のヒンジ部のシステインにおけるジスルフィド結合の切断により製造される。化学的に結合されたその他の抗体断片も当業者には知られている。

ダイアボディは、遺伝子融合により構築された二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）の抗体断片を指す（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：６４４４−６４４８（１９９３）、ＥＰ４０４，０９７号、ＷＯ９３／１１１６１号等）。ダイアボディは、２本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーであり、ポリペプチド鎖は各々、同じ鎖中でＬ鎖可変領域（Ｖ_Ｌ）及びＨ鎖可変領域（Ｖ_Ｈ）が、互いに結合できない位に短い、例えば、５残基程度のリンカーにより結合されている。同一ポリペプチド鎖上にコードされるＶ_ＬとＶ_Ｈとは、その間のリンカーが短いため単鎖可変領域フラグメントを形成することが出来ず二量体を形成するため、ダイアボディは２つの抗原結合部位を有することとなる。

一本鎖抗体またはｓｃＦｖ抗体断片には、抗体のＶ_ＨおよびＶ_Ｌ領域が含まれ、これらの領域は単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ＦｖポリペプチドはさらにＶ_ＨおよびＶ_Ｌ域の間にポリペプチドリンカーを含んでおり、これによりｓｃＦｖは、抗原結合のために必要な構造を形成することができる（ｓｃＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ『Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ』Ｖｏ．１１３（Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）ｐｐ．２６９−３１５，１９９４）を参照）。本発明におけるリンカーは、その両端に連結された抗体可変領域の発現を阻害するものでなければ特に限定されない。

ＩｇＧタイプ二種特異性抗体はＩｇＧ抗体を産生するハイブリドーマ二種を融合することによって生じるｈｙｂｒｉｄ ｈｙｂｒｉｄｏｍａ（ｑｕａｄｒｏｍａ）によって分泌させることが出来る（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ Ｃ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ １９８３，３０５：５３７−５４０）。また目的の二種のＩｇＧを構成するＬ鎖及びＨ鎖の遺伝子、合計４種の遺伝子を細胞に導入することによって共発現させることによって分泌させることが出来る。

しかし、これらの方法で産生されるＩｇＧのＨ鎖とＬ鎖の組合せは理論上１０通りにもなる。１０種類のＩｇＧから目的の組み合わせのＨ鎖Ｌ鎖からなるＩｇＧを精製することは困難である。さらに目的の組み合わせのものの分泌量も理論上著しく低下するため、大きな培養規模が必要になり、製造上のコストはさらに増大する。

この際Ｈ鎖のＣＨ３領域に適当なアミノ酸置換を施すことによってＨ鎖についてヘテロな組合せのＩｇＧを優先的に分泌させることも出来る（Ｒｉｄｇｗａｙ ＪＢ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ １９９６，９：６１７−６２１、Ｍｅｒｃｈａｎｔ ＡＭ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １９９８，１６：６７７−６８１）。

また、Ｌ鎖に関しては、Ｈ鎖可変領域に比べてＬ鎖可変領域の多様性が低いことから、両Ｈ鎖に結合能を与え得る共通のＬ鎖が得られることが期待される。この共通Ｌ鎖と両Ｈ鎖遺伝子を細胞に導入することによってＩｇＧを発現させることで効率の良い二種特異性ＩｇＧの発現が可能となる（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９８，１６，６７７−６８１）。しかし任意に２種の抗体を選んだ場合、同じＬ鎖を含む可能性は低く上記のアイデアを実行することは困難であり、任意の異なるＨ鎖に対応し高い結合能を示す共通Ｌ鎖を選択する方法も提案されている（ＷＯ２００４／０６５６１１）。上記変異（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．１９９８，１６，６７７−６８１）ＣＨ３を有するＨ鎖は、相手側のＨ鎖が存在しない場合ほとんど分泌されない。この特徴を利用してまず右腕のＬ鎖とＨ鎖を誘導発現させ、これを止めた後、左腕のＬ鎖とＨ鎖を誘導発現させることによって目的の組み合わせのＩｇＧの発現比率を高めることが出来る（ＰＣＴ／ＪＰ２００４／００８５８５）。
Ｆａｂ’を化学的に架橋することによっても二種特異性抗体を作製し得る。例えば一方の抗体から調製したＦａｂ’をｏ−ＰＤＭ（ｏｒｔｈｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉ−ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）にてマレイミド化し、これともう一方の抗体から調製したＦａｂ’を反応させることにより、異なる抗体由来Ｆａｂ’同士を架橋させ二種特異性Ｆ（ａｂ’）_２を作製することが出来る（Ｋｅｌｅｒ Ｔ ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９７，５７：４００８−４０１４）。またＦａｂ’−チオニトロ安息香酸（ＴＮＢ）誘導体とＦａｂ’−チオール（ＳＨ）等の抗体断片を化学的に結合する方法も知られている（Ｂｒｅｎｎａｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９８５，２２９：８１−８３）。

化学架橋の代りにＦｏｓ，Ｊｕｎなどに由来するロイシンジッパーを用いることも出来る。Ｆｏｓ，Ｊｕｎはホモダイマーも形成するが、ヘテロダイマーを優先的に形成することを利用する。Ｆｏｓロイシンジッパーを付加したＦａｂ’とＪｕｎのそれを付加したもう一方のＦａｂ’を発現調製する。温和な条件で還元した単量体Ｆａｂ’−Ｆｏｓ，Ｆａｂ’−Ｊｕｎを混合し反応させることによって二種特異性Ｆ（ａｂ’）_２が形成できる（Ｋｏｓｔｅｌｎｙ ＳＡ ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１４８：１５４７−５３）。この方法はＦａｂ’には限定されず、ｓｃＦｖ，Ｆｖなどにおいても応用可能である。

ダイアボディにおいても二種特異性抗体を作製し得る。二種特異性ダイアボディは二つのｃｒｏｓｓ−ｏｖｅｒ ｓｃＦｖ断片のヘテロダイマーである。つまり二種の抗体Ａ，Ｂ由来のＶ_ＨとをＶ_Ｌを５残基前後の比較的短いリンカーで結ぶことによって作製されたＶ_Ｈ（Ａ）−Ｖ_Ｌ（Ｂ），Ｖ_Ｈ（Ｂ）−Ｖ_Ｌ（Ａ）を用いてヘテロダイマーを構成することによって出来る（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ＵＳＡ １９９３，９０：６４４４−６４４８）。

この際、二種のｓｃＦｖを１５残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶ（一本鎖ダイアボディ：Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ ＳＭ ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．１９９９，２９３：４１−５６）、適当なアミノ酸置換（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ：Ｚｈｕ Ｚ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９７，６：７８１−７８８）を行うことによって目的の構成を促進させることも出来る。

二種のｓｃＦｖを１５残基程度の柔軟な比較的長いリンカーで結ぶことによって作製できるｓｃ（Ｆｖ）_２も二種特異性抗体となり得る（Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ ＷＤ ｅｔ ａｌ．Ｊ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，２６９：１９９−２０６）。

抗体修飾物としては、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の各種分子と結合した抗体を挙げることができる。本発明の抗体修飾物においては、結合される物質は限定されない。このような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。これらの方法はこの分野において既に確立されている。

本発明の抗体は、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体など、その由来は限定されない。またキメラ抗体やヒト化抗体などの遺伝子改変抗体でもよい。

ヒト抗体の取得方法は既に知られており、例えば、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物を目的の抗原で免疫することで目的のヒト抗体を取得することができる（国際特許出願公開番号ＷＯ ９３／１２２２７，ＷＯ ９２／０３９１８，ＷＯ ９４／０２６０２，ＷＯ ９４／２５５８５，ＷＯ ９６／３４０９６，ＷＯ ９６／３３７３５参照）。

遺伝子改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。具体的には、たとえばキメラ抗体は、免疫動物の抗体のＨ鎖、およびＬ鎖の可変領域と、ヒト抗体のＨ鎖およびＬ鎖の定常領域からなる抗体である。免疫動物由来の抗体の可変領域をコードするＤＮＡを、ヒト抗体の定常領域をコードするＤＮＡと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることによって、キメラ抗体を得ることができる。

ヒト化抗体は、再構成（ｒｅｓｈａｐｅｄ）ヒト抗体とも称される改変抗体である。ヒト化抗体は、免疫動物由来の抗体のＣＤＲを、ヒト抗体の相補性決定領域へ移植することによって構築される。その一般的な遺伝子組換え手法も知られている。

具体的には、マウス抗体のＣＤＲとヒト抗体のフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ；ＦＲ）を連結するように設計したＤＮＡ配列を、末端部にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドからＰＣＲ法により合成する。得られたＤＮＡを、ヒト抗体定常領域をコードするＤＮＡと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これを宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号ＥＰ ２３９４００、国際特許出願公開番号ＷＯ ９６／０２５７６参照）。ＣＤＲを介して連結されるヒト抗体のＦＲは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい（Ｓａｔｏ Ｋ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １９９３，５３：８５１−８５６）。また、様々なヒト抗体由来のフレームワーク領域に置換してもよい（国際特許出願公開番号ＷＯ ９９／５１７４３参照）。

本発明は、酵素および該酵素の基質の両方を認識するような補因子の機能を代替する二種特異性抗体を提供する。

本発明における補因子は、酵素に作用し酵素反応を増強し得るものであれば特に制限されない。本発明における補因子としては、例えば、蛋白質分解酵素の補因子を挙げることができる。蛋白質分解酵素の補因子の具体例としては、血液凝固線溶関連因子における補因子（Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ、Ｆ．Ｖ／Ｆ．Ｖａ、ＰＺ、ＴＭ、ＴＭ／ＰＳシステム）や補体反応の補因子（Ｃ４ｂ、ＭＣＰ、ＣＲ１、Ｈ因子）等を挙げることができる。

本発明における酵素、および該酵素の基質、および該酵素の補因子の具体例としては、例えば、以下の組合せを挙げることができる。
（ａ）血液凝固線溶関連因子における補因子の例１
酵素：Ｆ．ＩＸａ
基質：Ｆ．Ｘ
補因子：Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ
補因子Ｆ．ＶＩＩＩａは、Ｆ．ＩＸａとＦ．Ｘの両方に結合することによって、Ｆ．ＩＸａによるＦ．Ｘの活性化を増強する。上記の酵素Ｆ．ＩＸａ、基質Ｆ．Ｘの両方を認識する二種特異性抗体の中には、Ｆ．Ｘの活性化を増強する作用を有するものがある。このような抗体の中には、補因子Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの作用機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられる。

（ｂ）血液凝固線溶関連因子における補因子の例２
酵素：ＺＰＩ
基質：Ｆ．Ｘ／Ｆ．Ｘａ
補因子：ＰＺ
補因子ＰＺは、ｓｅｒｐｉｎファミリーのＺＰＩと活性化血液凝固第Ｘ因子（Ｆ．Ｘａ）に結合することで、ＺＰＩによるＦ．Ｘａ阻害活性を増強する。すなわち、ＺＰＩとＦ．Ｘ／Ｆ．Ｘａの両方を認識する二種特異性抗体の中には、ＰＺの機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられる。

（Ｃ）血液凝固線溶関連因子における補因子の例３
酵素：トロンビン
基質：ＴＡＦＩ
補因子：ＴＭ
補因子ＴＭは、トロンビンによるＴＡＦＩの活性化を増強する。すなわち、トロンビンとＴＡＦＩの両方を認識する二種特異性抗体の中には、ＴＭの機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられる。

（ｄ）血液凝固線溶関連因子における補因子の例４
酵素：トロンビン
基質：ＰＣ
補因子：ＴＭ／ＰＳ
ＴＭ／ＰＳシステムは、トロンビンによるＰＣの活性化を増強する。すなわち、トロンビンとＰＣの両方を認識する二種特異性抗体の中には、ＴＭ／ＰＳシステムの機能を代替するものが存在すると考えられる。

（ｅ）血液凝固線溶関連因子における補因子の例５
酵素：Ｆ．Ｘａ
基質：プロトロンビン
補因子：Ｆ．Ｖ／Ｆ．Ｖａ
補因子Ｆ．Ｖａは、Ｆ．Ｘａとプロトロンビンの両方に結合することによって、Ｆ．Ｘａによるプロトロンビンの活性化を増強する。上記の酵素Ｆ．Ｘａ、基質プロトロンビンの両方を認識する二種特異性抗体の中には、プロトロンビンの活性化を増強する作用を有するものがある。このような抗体の中には、補因子Ｆ．Ｖ／Ｆ．Ｖａの作用機能を代替する作用を有するものが存在すると考えられる。

（ｆ）補体反応の補因子の例１
酵素：Ｃ１ｓ
基質：Ｃ２
補因子：Ｃ４ｂ
Ｃ４ｂはＣ１ｓによるＣ２の分解促進作用を有する。すなわちＣ１ｓとＣ２の両方を認識する二種特異性抗体の中には、Ｃ４ｂの機能を代替するものが存在すると考えられる。

（ｇ）補体反応の補因子の例２
酵素：補体制御タンパクＩ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｉ）
基質：Ｃ３ｂ
補因子：補体制御タンパクＨ因子（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ）
Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｃｏｆａｃｔｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＭＣＰ）
Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ １（ＣＲ１）
Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ、ＭＣＰ、ＣＲ１は、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ ＩによるＣ３ｂ分解促進作用を有する。すなわち、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ ＩとＣ３ｂの両方を認識する二種特異性抗体の中には、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｆａｃｔｏｒ Ｈ、ＭＣＰ、ＣＲ１の機能を代替するものが存在すると考えられる。

上記補因子の中で、特に好ましいのはＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａである。Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａは、トロンビン等の蛋白分解酵素により限定分解を受けるが、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの補因子活性を有している限り、その形態は問わない。また、変異Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａや、遺伝子組換技術により人為的に改変したＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａに関しても、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの補因子活性を有している限り、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａに含まれる。

本発明の補因子機能代替二種特異性抗体を得る方法は特に制限されず、どのような方法で取得されてもよい。例えば、酵素Ａ及び基質Ｂに対する補因子機能代替二種特異性抗体を得る場合、酵素Ａ、基質Ｂそれぞれを免疫動物に免疫し、抗酵素Ａ抗体及び抗基質Ｂ抗体を取得する。その後、抗酵素Ａ抗体のＨ鎖とＬ鎖及び抗基質Ｂ抗体のＨ鎖とＬ鎖を含む二種特異性抗体を作製する。ここで、抗酵素Ａ抗体と抗基質Ｂ抗体はそれぞれ複数種得られていることが望ましく、これらを用いてなるべく多くの組合せの二種特異性抗体を作製することが好ましい。二種特異性抗体を作製後、補因子機能代替活性を有する抗体を選択する。

酵素あるいは基質に対する抗体は、当業者に公知の方法により得ることができる。例えば、免疫動物に対して抗原を免疫することにより調製することができる。動物を免疫する抗原としては、免疫原性を有する完全抗原と、免疫原性を有さない不完全抗原（ハプテンを含む）が挙げられる。本発明においては、本発明の補因子機能代替抗体が補因子として作用すると考えられる酵素あるいは基質を、上記抗原（免疫原）として使用する。免疫する動物として、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ニワトリまたはアカゲザル等を用いることができる。これら動物に対して、抗原を免疫することは、当業者においては、周知の方法によって行うことができる。本発明において好ましくは、免疫された動物または該動物の細胞から抗体のＬ鎖およびＨ鎖の可変領域の回収を行う。この操作は、当業者においては一般的に公知の技術を用いて行うことができる。抗原によって免疫された動物は、とりわけ脾臓細胞において該抗原に対する抗体を発現する。従って、例えば、免疫された動物の脾臓細胞からｍＲＮＡを調製し、該動物の可変領域に対応するプライマーを用いて、ＲＴ−ＰＣＲによりＬ鎖およびＨ鎖の可変領域の回収を行うことができる。

詳細には、動物に酵素、基質それぞれを免疫する。免疫原とする酵素、基質は、蛋白質全体、もしくは該蛋白質の部分ペプチドであってもよい。また、動物を免疫するのに用いる免疫原としては、場合により抗原となるものを他の分子に結合させ可溶性抗原とすることも可能であり、また、場合によりそれらの断片を用いてもよい。

免疫されたマウスの脾臓から脾細胞を単離し、マウスミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを作製する。抗原に結合するハイブリドーマをそれぞれ選択し、可変領域に対応するプライマーなどを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖の可変領域を回収することが出来る。ＣＤＲに対応するプライマー、ＣＤＲよりも多様性の低いフレームワークに対応するプライマー、あるいはシグナル配列とＣＨ１もしくはＬ鎖定常領域（Ｃ_Ｌ）に対応するプライマーを用いることもできる。

あるいは、免疫された動物の脾細胞からｍＲＮＡを抽出し、可変領域付近に対応するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖可変領域のｃＤＮＡを回収する。また、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてリンパ球を免疫することもできる。これを用いてｓｃＦｖもしくはＦａｂを提示するライブラリーを構築する。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮・クローン化し、可変領域を得ることが出来る。この際、ヒトや免疫していない動物の末梢血単核球、脾臓、扁桃腺などに由来するｍＲＮＡを材料とする同様のライブラリーを用いてスクリーニングを行うことも可能である。

その可変領域を用いて抗体発現ベクターを作製する。抗酵素抗体発現ベクターと抗基質抗体発現ベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二種特異性抗体を得ることができる。

補因子機能代替活性を有する抗体の選択は、例えば、以下のような方法により行うことができる。
（１）該酵素・該基質を含む反応系を用い、該抗体を加えることによる該酵素活性（基質分解能）の上昇を指標とし、選択する。
（２）該酵素・該基質・該補因子が関わる生体機能を測定するあるいは模倣する系（例えば、血漿凝固測定系）を用い、該補因子非存在条件下にて該抗体を加えることによる機能回復活性を指標とし、選択する。

得られた抗体は、均一にまで精製することができる。抗体の分離、精製は通常の蛋白質で使用されている分離、精製方法を使用すればよい。例えばアフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動等を適宜選択、組合せれば、抗体を分離、精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８）が、これらに限定されるものではない。アフィニティークロマトグラフィーに用いるカラムとしては、プロテインＡカラム、プロテインＧカラムなどが挙げられる。

本発明の二種特異性抗体は、例えば代替する補因子がＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａである場合、すなわち酵素および基質の組合せが、血液凝固線溶関連因子のＦ．ＩＸａ、及びＦ．Ｘである場合には、好ましくは、抗Ｆ．ＩＸａ抗体における可変領域と、抗Ｆ．Ｘ抗体における可変領域とを含む構造を有する。

本発明のＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ機能代替二種特異性抗体は以下の方法で作製した。市販のＦ．ＩＸａ及びＦ．Ｘをそれぞれマウスの皮下に免疫した。抗体価の上昇した免疫マウスの脾臓から脾細胞を単離し、マウスミエローマ細胞と融合し、ハイブリドーマを作製した。抗原（Ｆ．ＩＸａ、Ｆ．Ｘ）に結合するハイブリドーマをそれぞれ選択し、可変領域に対応するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖の可変領域を回収した。Ｌ鎖可変領域はＣ_Ｌを含むＬ鎖発現ベクターに、Ｈ鎖可変領域はＨ鎖定常領域を含むＨ鎖発現ベクターにそれぞれ組み込んだ。また、この免疫マウスの脾臓からｍＲＮＡを抽出し、可変領域に対応するプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲにてＬ鎖、Ｈ鎖可変領域のｃＤＮＡを回収した。これら可変領域を用いてｓｃＦｖを提示するファージライブラリーを構築した。パンニングによって抗原結合抗体クローンを濃縮・クローン化し、その可変領域を用いて抗体発現ベクターを作製した。抗Ｆ．ＩＸａ抗体（Ｈ鎖、Ｌ鎖）の発現ベクターとＦ．Ｘ抗体（Ｈ鎖、Ｌ鎖）の発現ベクターを同一の細胞に導入し、抗体を発現させることにより二種特異性抗体を得た。

得られた二種特異性抗体に関しては、Ｆ．ＸＩａ（Ｆ．ＩＸ活性化酵素）、Ｆ．ＩＸ、Ｆ．Ｘ、Ｆ．Ｘａの合成基質（Ｓ−２２２２）、リン脂質から成る測定系で、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ（Ｆ．ＩＸａによるＦ．Ｘ活性化の補因子）を代替する活性を評価した。その結果を以って、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ代替活性を有する二種特異性抗体として、原則本測定系で０．１以上のＦ．ＶＩＩＩａ様活性を示したものを選択した。なお、ここでいうＦ．ＶＩＩＩａ様活性とは、抗体溶液または抗体発現培養上清の３０分間または６０分間の吸光度変化値から、溶媒または抗体非発現培養上清の３０分間または６０分間の吸光度変化値を引いた値である。

上記で選択された二種特異性抗体あるいはその類縁の二種特異性抗体に関しては、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿を用いた凝固時間測定系を用い、凝固回復能を測定した。その結果、抗体無添加時に比べて、凝固時間を短縮する二種特異性抗体を得た。ここでいう凝固時間は実施例７に示したように、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏ヒト血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間を測定したものである。それら二種特異性抗体の中で、好ましい二種特異性抗体は１０秒以上の、より好ましい二種特異性抗体は２０秒以上の、さらに好ましい二種特異性抗体は４０秒以上の、最も好ましい二種特異性抗体は５０秒以上の凝固時間短縮能を有していた。

本発明の抗体のＨ鎖ＣＤＲ３は、特に制限されないが、具体的には、後述の実施例に記載のＸＢ１２、ＸＴ０４、Ａ１９、Ａ２５、Ａ３１、Ａ３８、Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４４、Ａ５０、もしくはＡ６９のＨ鎖ＣＤＲ３配列（配列番号：１６、２０、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２もしくは９６）のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有し、且つ、ＳＢ０４、ＳＢ０５、ＳＢ０６、ＳＢ０７、ＳＢ２１、ＳＢ３０、ＳＢ３４、ＳＢ３８、ＳＢ４２、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１８、Ｂ１９、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２３、Ｂ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３１、Ｂ３４−１、Ｂ３４−２、Ｂ３５、Ｂ３６、Ｂ３８、Ｂ４２、ＳＢ１５もしくはＳＢ２７のＨ鎖ＣＤＲ３配列（それぞれの配列番号：２４、２８、３２、３６、４０、４４、４８、５２、５６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００もしくは２０４）のいずれかに記載のアミノ酸配列からなる相補性決定領域またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有する。

さらに、本発明の上記抗体は具体例としては、ＸＢ１２、ＸＴ０４、Ａ１９、Ａ２５、Ａ３１、Ａ３８、Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４４、Ａ５０、もしくはＡ６９（配列番号：１４〜１６、１８〜２０、５８〜６０、６２〜６４、６６〜６８、７０〜７２、７４〜７６、７８〜８０、８２〜８４、８６〜８８、９０〜９２もしくは９４〜９６）のＨ鎖ＣＤＲ配列のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域、またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有するものと、ＳＢ０４、ＳＢ０５、ＳＢ０６、ＳＢ０７、ＳＢ２１、ＳＢ３０、ＳＢ３４、ＳＢ３８、ＳＢ４２、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１８、Ｂ１９、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２３、Ｂ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３１、Ｂ３４−１、Ｂ３４−２、Ｂ３５、Ｂ３６、Ｂ３８、Ｂ４２、ＳＢ１５もしくはＳＢ２７のＨ鎖ＣＤＲ配列（配列番号：２２〜２４、２６〜２８、３０〜３２、３４〜３６、３８〜４０、４２〜４４、４６〜４８、５０〜５２、５４〜５６、９８〜１００、１０２〜１０４、１０６〜１０８、１１０〜１１２、１１４〜１１６、１１８〜１２０、１２２〜１２４、１２６〜１２８、１３０〜１３２、１３４〜１３６、１３８〜１４０、１４２〜１４４、１４６〜１４８、１５０〜１５２、１５４〜１５６、１５８〜１６０、１６２〜１６４、１６６〜１６８、１７０〜１７２、１７４〜１７６、１７８〜１８０、１８２〜１８４、１８６〜１８８、１９０〜１９２、１９４〜１９６、１９８〜２００もしくは２０２〜２０４）のいずれかのアミノ酸配列からなる相補性決定領域、またはこれと機能的に同等の相補性決定領域を有するものとの組合せによる抗体を好適に示すことができる。

本発明記載のＸＢ１２、ＸＴ０４、Ａ１９、Ａ２５、Ａ３１、Ａ３８、Ａ３９、Ａ４０、Ａ４１、Ａ４４、Ａ５０、Ａ６９、ＳＢ０４、ＳＢ０５、ＳＢ０６、ＳＢ０７、ＳＢ２１、ＳＢ３０、ＳＢ３４、ＳＢ３８、ＳＢ４２、Ｂ２、Ｂ５、Ｂ９、Ｂ１０、Ｂ１１、Ｂ１２、Ｂ１３、Ｂ１４、Ｂ１５、Ｂ１６、Ｂ１８、Ｂ１９、Ｂ２０、Ｂ２１、Ｂ２３、Ｂ２５、Ｂ２６、Ｂ２７、Ｂ３１、Ｂ３４−１、Ｂ３４−２、Ｂ３５、Ｂ３６、Ｂ３８、Ｂ４２、ＳＢ１５もしくはＳＢ２７のＨ鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：１３、１７、５７、６１、６５、６９、７３、７７、８１、８５、８９、９３、２１、２５、２９、３３、３７、４１、４５、４９、５３、９７、１０１、１０５、１０９、１１３、１１７、１２１、１２５、１２９、１３３、１３７、１４１、１４５、１４９、１５３、１５７、１６１、１６５、１６９、１７３、１７７、１８１、１８５、１８９、１９３、１９７ならびに２０１で示される。

本発明記載のＡ４４、Ｂ２６、ＸＢ１２、ＳＢ０４のＬ鎖可変領域のアミノ酸配列は、配列番号：２０５、２０９、２１３、２１７で示される。また、Ａ４４、Ｂ２６、ＸＢ１２、ＳＢ０４のＬ鎖ＣＤＲ配列は、配列番号：２０６〜２０８、２１０〜２１２、２１４〜２１６、２１８〜２２０で示される。また、ＸＢ１２、ＳＢ０４、Ａ４４、Ｂ２６のＨ鎖ＣＤＲの塩基配列（括弧内は該塩基配列によってコードされるアミノ酸配列）は、配列番号：２２１（２２２）、２２３（２２４）、２２５（２２６）、２３３（２３４）、２３５（２３６）、２３７（２３８）、２４５（２４６）、２４７（２４８）、２４９（２５０）、２５７（２５８）、２５９（２６０）、２６１（２６２）で示され、Ｌ鎖ＣＤＲの塩基配列は、配列番号：２２７（２２８）、２２９（２３０）、２３１（２３２）、２３９（２４０）、２４１（２４２）、２４３（２４４）、２５１（２５２）、２５３（２５４）、２５５（２５６）、２６３（２６４）、２６５（２６６）、２６７（２６８）で示される。

なお、配列番号：５８、６２、６６、７０、７４、７８、８２、８６、９０、９４、９８、１０２、１０６、１１０、１１４、１１８、１２２、１２６、１３０、１３４、１３８、１４２、１４６、１５０、１５４、１５８、１６２、１６６、１７０、１７４、１７８、１８２、１８６、１９０、１９４、１９８、２０２、２０６、２１０、２１４、２１８、２２２、２２８、２３４、２４０、２４６、２５２、２５８、２６４は、ＣＤＲ１を表す。

配列番号：５９、６３、６７、７１、７５、７９、８３、８７、９１、９５、９９、１０３、１０７、１１１、１１５、１１９、１２３、１２７、１３１、１３５、１３９、１４３、１４７、１５１、１５５、１５９、１６３、１６７、１７１、１７５、１７９、１８３、１８７、１９１、１９５、１９９、２０３、２０７、２１１、２１５、２１９、２２４、２３０、２３６、２４２、２４８、２５４、２６０、２６６は、ＣＤＲ２を表す。

配列番号：６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２６、２３２、２３８、２４４、２５０、２５６、２６２、２６８は、ＣＤＲ３を表す。

本発明の抗体は、特に制限されないが、好ましくは上記抗体と同じもしくは近傍のエピトープを有する抗体で、抗Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ抗体と抗Ｆａｃｔｏｒ Ｘ抗体による組合せの二種特異性抗体が挙げられる。ここでいう同じもしくは近傍のエピトープを有する抗体とは、例えば、競合ＥＬＩＳＡなどで結合が拮抗する抗体等を指す。この競合ＥＬＩＳＡの手法は特に制限はされないが、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ／ＩＸａもしくはＦａｃｔｏｒ Ｘを９６−ｗｅｌｌマイクロウェルプレートに固相化させ、適当な標識をした該抗体と評価すべき抗体を同時に添加し、標識を利用して結合している抗体を検出する。この標識は特に制限はされないが、アルカリホスファターゼ標識、ペルオキシダーゼ標識、ビオチン標識−ストレプトアビジン結合酵素（アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ等）、あるいはＦＩＴＣなどが挙げられる。該抗体に対して、評価すべき抗体の１００，０００倍過剰までの濃度において少なくとも５０％の競合が見られる場合、エピトープ重なりが存在する。

本発明で開示されている可変領域を用いて全長抗体を作製する場合、定常領域は特に限定されず、当業者に公知の定常領域を用いることが可能であり、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ，（１９９１），Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈや、Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｒｏｕｔｅ ｔｏ ｈｕｍａｎ ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ＩｇＧ，（１９９８）．Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１６，６７７−６８１、等に記載されている定常領域を用いることができる。

本発明における抗体の１つの態様としては、補因子の機能を代替する作用を有することから、本発明の抗体は、該補因子の活性（機能）低下に起因する疾病に対して、有効な薬剤となることが期待される。本発明の抗体の代替する補因子が血液凝固線溶関連因子である場合には、上記疾病として、例えば、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患等を挙げることができる。特に、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ、Ｆ．ＩＸ／Ｆ．ＩＸａ、Ｆ．ＸＩ／Ｆ．ＸＩａの機能低下や欠損は、血友病と呼ばれる出血異常症を引き起こすことで知られる。

血友病のうち、先天性のＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ機能低下または欠損による出血異常症は、血友病Ａと呼ばれる。血友病Ａ患者が出血した場合、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤の補充療法が行われる。また、激しい運動や遠足の当日、頻回に関節内出血を来たす場合、あるいは重症血友病に分類される場合には、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤の予防投与が行われることがある（非特許文献１および２参照）。このＦ．ＶＩＩＩ製剤の予防投与は、血友病Ａ患者の出血エピソードを激減させるため、近年、大きく普及しつつある。出血エピソードを減らすことは、致死性及び非致死性の出血の危険及びそれに伴う苦痛を低下させるだけでなく、頻回の関節内出血に起因する血友病性関節障害を未然に防ぐ。その結果、血友病Ａ患者のＱＯＬ向上に大きく寄与する。

Ｆ．ＶＩＩＩ製剤の血中半減期は短く、約１２〜１６時間程度である。それ故、継続的な予防のためには、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤を週に３回程度投与する必要がある。これは、Ｆ．ＶＩＩＩ活性として、概ね１％以上を維持することに相当する（非特許文献３および４参照）。また、出血時の補充療法においても、出血が軽度な場合を除き、再出血を防ぎ、完全な止血を行うため、一定期間、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤を定期的に追加投与する必要がある。

また、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤は、静脈内に投与される。静脈内投与実施には、技術的な困難さが存在する。特に年少の患者に対する投与においては、投与に用いられる静脈が細い故、困難さが一層増す。

前述の、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤の予防投与や、出血の際の緊急投与においては、多くの場合、家庭療法・自己注射が用いられる。頻回投与の必要性と、投与の際の技術的困難さは、投与に際し患者に苦痛を与えるだけでなく、家庭療法・自己注射の普及を妨げる要因となっている。
従って、現存の血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤に比し、投与間隔が広い薬剤、あるいは投与が簡単な薬剤が、強く求められていた。

さらに、血友病Ａ患者、特に重症血友病Ａ患者には、インヒビターと呼ばれるＦ．ＶＩＩＩに対する抗体が発生する場合がある。インヒビターが発生すると、Ｆ．ＶＩＩＩ製剤の効果がインヒビターにより妨げられる。その結果、患者に対する止血管理が非常に困難になる。

このような血友病Ａインヒビター患者が出血を来たした場合は、通常、大量のＦ．ＶＩＩＩ製剤を用いる中和療法か、複合体製剤（ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ）あるいはＦ．ＶＩＩａ製剤を用いるバイパス療法が、実施される。しかしながら、中和療法では、大量のＦ．ＶＩＩＩ製剤の投与が、逆に、インヒビター（抗Ｆ．ＶＩＩＩ抗体）力価を上げてしまう場合がある。また、バイパス療法では、複合体製剤やＦ．ＶＩＩａ製剤の短血中半減期（約２〜８時間）が問題となっている。その上、それらの作用機序が、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの機能、すなわちＦ．ＩＸａによるＦ．Ｘ活性化を触媒する機能に非依存であるため、場合によっては、止血機構をうまく機能させられず、不応答になってしまうケースがある。そのため、血友病Ａインヒビター患者では、非インヒビター血友病Ａ患者に比し、十分な止血効果を得られない場合が多いのである。

従って、インヒビターの存在に左右されず、且つＦ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａの機能を代替する薬剤が、強く求められていた。

ところで、Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａに関係する出血異常症として、血友病、抗Ｆ．ＶＩＩＩ自己抗体を有する後天性血友病のほかに、ｖＷＦの機能異常または欠損に起因するフォンビルブランド病が知られている。ｖＷＦは、血小板が、血管壁の損傷部位の内皮下組織に正常に粘着するのに必要であるだけでなく、Ｆ．ＶＩＩＩと複合体を形成し、血漿中Ｆ．ＶＩＩＩレベルを正常に保つのにも必要である。フォンビルブランド病患者では、これらの機能が低下し、止血機能異常を来たしている。

さて、（ｉ）投与間隔が広く、（ｉｉ）投与が簡単であり、（ｉｉｉ）インヒビターの存在に左右されず、（ｉｖ）Ｆ．ＶＩＩＩ／Ｆ．ＶＩＩＩａ非依存的にその機能を代替する医薬品の創製には、抗体を利用する方法が考えられる。抗体の血中半減期は、一般に、比較的長く、数日から数週間である。また、抗体は、一般に、皮下投与後に血中に移行することが知られている。すなわち、一般に抗体医薬品は、上記の（ｉ）、（ｉｉ）を満たしている。

本発明では、本発明の抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。例えば、本発明の抗体がＦ．ＩＸもしくはＦ．ＩＸａ、およびＦ．Ｘの両方を認識する抗体のうち、Ｆ．ＶＩＩＩａの機能を代替する抗体である場合には、該抗体は、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防あるいは治療のための医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤となることが期待される。また、Ｆ．ＸもしくはＦ．Ｘａ、およびプロトロンビンの両方を認識する抗体のうち、Ｆ．Ｖａの機能を代替する抗体である場合には、該抗体は、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防あるいは治療のための医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤となることが期待される。

一方で、ＺＰＩとＦ．Ｘに結合してＰＺの機能を代替する抗体は抗血栓作用を有する医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤、トロンビンとＴＡＦＩに結合してＴＭの機能を代替する抗体は止血促進作用を有する医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤、トロンビンとＰＣに結合してＰＳ／ＴＭシステムの機能を代替する抗体は凝固調節作用を有する医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤となることが期待される。

また、補体Ｃ４の欠損は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を引き起こすことから、Ｃ４ｂの作用を代替する抗体はＳＬＥ発症抑制作用を有する医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤となることが期待される。Ｈ因子の欠損は易化膿性感染症、自己免疫性の糸球体腎炎を引き起こすことから、Ｈ因子の作用を代替する抗体はこれら疾患の発症抑制作用を有する医薬品（医薬組成物）もしくは薬剤となることが期待される。

治療または予防目的で使用される本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物は、必要に応じて、それらに対して不活性な適当な薬学的に許容される担体、媒体等と混和して製剤化することができる。例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、酸化防止剤（アスコルビン酸等）、緩衝剤（リン酸、クエン酸、他の有機酸等）、防腐剤、界面活性剤（ＰＥＧ、Ｔｗｅｅｎ等）、キレート剤（ＥＤＴＡ等）、結合剤等を挙げることができる。また、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチンや免疫グロブリン等の蛋白質、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン及びリシン等のアミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、マンニトールやソルビトール等の糖アルコールを含んでいてもよい。注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えば、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール（エタノール等）、ポリアルコール（プロピレングリコール、ＰＥＧ等）、非イオン性界面活性剤（ポリソルベート８０、ＨＣＯ−５０）等と併用してもよい。

また、必要に応じ本発明の抗体をマイクロカプセル（ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ［メチルメタクリル酸］等のマイクロカプセル）に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシステム（リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル等）とすることもできる（″Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １６ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｏｓｌｏ Ｅｄ．（１９８０）等参照）。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明の抗体に適用し得る（Ｌａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：２６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ，Ｃｈｅｍｔｅｃｈ．１２：９８−１０５（１９８２）；米国特許第３，７７３，７１９号；欧州特許出願公開（ＥＰ）第５８，４８１号；Ｓｉｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ ２２：５４７−５５６（１９８３）；ＥＰ第１３３，９８８号）。

本発明の抗体または医薬組成物は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子と併用することができる。本発明の抗体または医薬組成物は、血液凝固第ＶＩＩＩ因子と同時に投与してもよく、または、時期をずらして投与してもよい。また、本発明の抗体または医薬組成物と血液凝固第ＶＩＩＩ因子を組み合わせたキットとして実施してもよい。さらに、本発明の抗体または医薬組成物と血液凝固第ＶＩＩＩ因子を併用する場合は、いずれかを単独で用いる場合に比べて、所望により各々の投与量を少なくすることも可能である。

本発明の医薬組成物の投与量は、剤型の種類、投与方法、患者の年齢や体重、患者の症状、疾患の種類や進行の程度等を考慮して、最終的には医師の判断により適宜決定されるものであるが、一般に大人では、１日当たり、０．１〜２０００ｍｇを１〜数回に分けて投与することができる。より好ましくは１〜１０００ｍｇ／日、更により好ましくは５０〜５００ｍｇ／日、最も好ましくは１００〜３００ｍｇ／日である。これらの投与量は患者の体重や年齢、投与方法などにより変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。投与期間も、患者の治癒経過等に応じて適宜決定することが好ましい。

また、本発明の抗体をコードする遺伝子を遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与方法としては、ｎａｋｅｄプラスミドによる直接投与の他、リポソーム等にパッケージングするか、レトロウィルスベクター、アデノウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、ポックスウィルスベクター、アデノウィルス関連ベクター、ＨＶＪベクター等の各種ウィルスベクターとして形成するか（Ａｄｏｌｐｈ『ウィルスゲノム法』，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｆｌｏｒｉｄ（１９９６）参照）、または、コロイド金粒子等のビーズ担体に被覆（ＷＯ９３／１７７０６等）して投与することができる。しかしながら、生体内において抗体が発現され、その作用を発揮できる限りいかなる方法により投与してもよい。好ましくは、適当な非経口経路（静脈内、腹腔内、皮下、皮内、脂肪組織内、乳腺組織内、吸入または筋肉内の経路を介して注射、注入、またはガス誘導性粒子衝撃法（電子銃等による）、点鼻薬等粘膜経路を介する方法等）により十分な量が投与される。ｅｘ ｖｉｖｏにおいてリポソームトランスフェクション、粒子衝撃法（米国特許第４，９４５，０５０号）、またはウィルス感染を利用して血液細胞及び骨髄由来細胞等に投与して、該細胞を動物に再導入することにより本発明の抗体をコードする遺伝子を投与してもよい。遺伝子治療では、本発明の抗体をコードする任意の遺伝子を使用することが可能であり、例えば、前述のＸＢ１２、ＳＢ０４、Ａ４４、Ｂ２６のＣＤＲの塩基配列を含む遺伝子が挙げられる。

また本発明は、本発明の抗体もしくは組成物を投与する工程を含む、出血、出血を伴う疾患、または出血に起因する疾患の予防および／または治療するための方法を提供する。抗体もしくは組成物の投与は、例えば、前記の方法により実施することができる。

また本発明は、本発明の抗体の、本発明の（医薬）組成物の製造のための使用に関する。

さらに本発明は、少なくとも本発明の抗体もしくは組成物を含む、上記方法に用いるためのキットを提供する。該キットには、その他、注射筒、注射針、薬学的に許容される媒体、アルコール綿布、絆創膏、または使用方法を記載した指示書等をパッケージしておくこともできる。

なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、本発明を実施例により具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に制限されるものではない。
〔実施例１〕 Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ（Ｆ．ＩＸａ）に対する非中和抗体の作製
１−１．免疫およびハイブリドーマ作製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）８匹およびＭＲＬ／ｌｐｒマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）５匹に、ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ β（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を以下の通り免疫した。初回免疫としてＦＣＡ（フロイント完全アジュバントＨ３７ Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でエマルジョン化したＦａｃｔｏｒ ＩＸａ βを４０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。２週間後にＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でエマルジョン化したＦａｃｔｏｒ ＩＸａ βを４０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。以後１週間間隔で追加免疫を３〜７回行った。Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ βに対する血清抗体価の上昇を１−２に示したＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）で確認後、最終免疫としてＰＢＳ（−）（カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に希釈したＦａｃｔｏｒ ＩＸａ βを４０μｇ／ｈｅａｄ静脈内投与した。最終免疫の３日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部は実施例１０−２で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８Ｕ．１（Ｐ３Ｕ１と称す、ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５９７）を、ＰＥＧ１５００（ロシュ・ダイアグノスティックス）を用いた常法に従い細胞融合した。
１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（以下、１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０と称す）に懸濁した融合細胞を９６ ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに播種し、融合１，２，３，５日後にＨＡＴ選択培地（１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０／２％ＨＡＴ ５０ｘ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ（大日本製薬）／５％ＢＭ−Ｃｏｎｄｉｍｅｄ Ｈ１（ロシュ・ダイアグノスティックス））への置換を行うことにより、ハイブリドーマの選択培養を行った。融合後８日目または９日目に採取した培養上清を用いて、１−２に示したＥＬＩＳＡによりＦａｃｔｏｒ ＩＸａに対する結合活性を測定することにより、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ結合活性を有するハイブリドーマを選択した。続いて１−３に示した方法でＦａｃｔｏｒ ＩＸａの酵素活性に対する中和活性を測定し、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａに対する中和活性を有さないハイブリドーマを選択した。ハイブリドーマは、９６ ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに１ｗｅｌｌあたり１個の細胞を播種することによる限界希釈を２回行ってクローン化した。顕微鏡観察により単一コロニーであることが確認された細胞について、１−２、１−３に示したＥＬＩＳＡおよび中和活性測定を行い、クローンを選択した。１−４に示した方法により、クローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）を延長させないことを、１−５に示した方法で確認した。

１−２．Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ ＥＬＩＳＡ
Ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ（１００ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ，ｐＨ９．６，０．０２％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）で１μｇ／ｍＬに希釈したＦａｃｔｏｒ ＩＸａ βを、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅ（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ^ＴＭ ９６ ＭｉｃｒｏＷｅｌｌ^ＴＭ ｐｌａｔｅｓ ＭａｘｉＳｏｒｐ^ＴＭ（Ｎａｌｇｅ Ｎｕｎｃ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ））に１００μＬ／ｗｅｌｌで分注後、４℃で一晩インキュベーションした。Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．１，１％ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，０．０５％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０，０．０２％ ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ）でｐｌａｔｅを室温で２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。Ｂｕｆｆｅｒを除去後、ｐｌａｔｅにｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間インキュベーションした。Ｐｌａｔｅを３回洗浄後、ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒで１／２０００希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で１時間インキュベーションした。Ｐｌａｔｅを６回洗浄後、発色基質Ｂｌｕｅ−Ｐｈｏｓ^ＴＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２０分インキュベーションした。Ｂｌｕｅ−Ｐｈｏｓ^ＴＭ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した後、５９５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。

１−３．Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ中和活性測定
Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射用蒸留水で溶解し、超音波処理を施すことにより、４００μｇ／ｍＬのｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ溶液を調製した。０．１％ウシ血清アルブミンを含むトリス緩衝生理食塩液（以下、ＴＢＳＢ）４０μＬと３０ｎｇ／ｍＬ Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ β（Ｅｎｙｚｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０μＬと４００μｇ／ｍＬ ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ溶液５μＬと１００ｍＭ ＣａＣｌ_２、２０ｍＭＭｇＣｌ_２を含むＴＢＳＢ５μＬとハイブリドーマ培養上清１０μＬを９６穴プレート中で混和し、室温で１時間インキュベーションした。この混合溶液に、５０μｇ／ｍＬ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２０μＬおよび３Ｕ／ｍＬ Ｆａｃｔｏｒ ＶＩＩＩａ（Ａｍｒｉｃａｎ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ）１０μＬを加え、室温で３０分間反応させた。これに１０μＬの０．５Ｍ ＥＤＴＡを添加することにより反応を停止させた。この反応溶液に、５０μＬのＳ−２２２２溶液（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を添加し、室温で３０分間インキュベーションした後、測定波長４０５ｎｍ、対照波長６５５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）により測定した。

１−４．腹水の作製および抗体の精製
樹立したハイブリドーマの腹水作製は常法に従って行った。すなわち、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養したハイブリドーマ２ ｘ １０^６個を、あらかじめプリスタン（２，６，１０，１４−ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｐｅｎｔａｄｅｃａｎｅ；和光純薬工業）を２回腹腔内に投与しておいたＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、実験開始時５〜７週齢、日本チャールス・リバー）またはＢＡＬＢ／ｃヌードマウス（雌、実験開始時５〜６週齢、日本チャールス・リバーおよび日本クレア）の腹腔内に移植した。移植後１〜４週目で腹部が肥大したマウスから腹水を回収した。

腹水からの抗体精製はＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ ４ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）カラムを用いて行った。Ｂｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭ ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ，ｐＨ５．０）にて２倍希釈した腹水をカラムにアプライし、１０カラム容量のＢｉｎｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒで洗浄した。５カラム容量のＥｌｕｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（０．１Ｍ ｇｌｙｃｉｎｅ−ＨＣｌ，ｐＨ２．５）にて抗体を溶出し、Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ９．０）で中和した。これをＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ^ＴＭ １０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）にて濃縮し、ＴＢＳ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）に溶媒を置換した。抗体濃度は、２８０ｎｍの吸光度から、Ａ（１％，１ｃｍ）＝１３．５として算出した。吸光度の測定は、ＤＵ−６５０（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にて測定した。

１−５．ＡＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）の測定
ＡＰＴＴはＣＲ−Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）を接続したＫＣ１０Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）により測定した。ＴＢＳＢで希釈した抗体溶液５０μＬ、標準ヒト血漿（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬ及びＡＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬの混合液を３７℃で３分間加温した。２０ｍＭのＣａＣｌ_２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬを同混合液に加えることにより凝固反応を開始させ、凝固時間を測定した。

〔実施例２〕 Ｆａｃｔｏｒ Ｘ（Ｆ．Ｘ）に対する非中和抗体の作製
２−１．免疫およびハイブリドーマ作製
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）８匹およびＭＲＬ／ｌｐｒマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）５匹に、ｈｕｍａｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を以下の通り免疫した。初回免疫としてＦＣＡでエマルジョン化したＦａｃｔｏｒ Ｘを４０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。２週間後にＦＩＡでエマルジョン化したＦａｃｔｏｒ Ｘを２０または４０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。以後１週間間隔で追加免疫を合計３〜６回行った。Ｆａｃｔｏｒ Ｘに対する血清抗体価の上昇を２−２に示したＥＬＩＳＡで確認後、最終免疫としてＰＢＳ（−）に希釈したＦａｃｔｏｒ Ｘを２０または４０μｇ／ｈｅａｄ静脈内投与した。最終免疫の３日後、マウスの脾臓を摘出し、その一部を実施例１０−２で使用し、残りの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞Ｐ３Ｕ１を、ＰＥＧ１５００を用いた常法に従い細胞融合した。１０％ＦＢＳ／ＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁した融合細胞を９６ｗｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｌａｔｅに播種し、融合１，２，３，５日後にＨＡＴ選択培地への置換を行うことにより、ハイブリドーマの選択培養を行った。融合後８日目に採取した培養上清を用いて２−２に示したＥＬＩＳＡによりＦａｃｔｏｒ Ｘに対する結合活性を測定した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘ結合活性を有するハイブリドーマを選択し、２−３に示した方法でＦａｃｔｏｒ Ｘａの酵素活性に対する中和活性を測定した。Ｆａｃｔｏｒ Ｘａに対する中和活性を有さないハイブリドーマを、限界希釈を２回行うことによりクローン化した。１−４に示した方法により、クローン化した抗体の腹水を作製し、腹水から抗体を精製した。精製抗体が、ＡＰＴＴを延長させないことを、２−５に示した方法で確認した。

２−２．Ｆａｃｔｏｒ Ｘ ＥＬＩＳＡ
Ｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１μｇ／ｍＬに希釈したＦａｃｔｏｒ Ｘを、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅに１００μＬ／ｗｅｌｌで分注後、４℃で一晩インキュベーションした。Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＰＢＳ（−）で３回洗浄後、ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒでｐｌａｔｅを室温で２時間ｂｌｏｃｋｉｎｇした。Ｂｕｆｆｅｒを除去後、ｐｌａｔｅにｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を添加し、室温で１時間インキュベーションした。Ｐｌａｔｅを３回洗浄後、ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒで１／２０００希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）を添加し、室温で１時間インキュベーションした。Ｐｌａｔｅを６回洗浄後、発色基質Ｂｌｕｅ−Ｐｈｏｓ^ＴＭ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加し、室温で２０分インキュベーションした。Ｂｌｕｅ−Ｐｈｏｓ^ＴＭ Ｓｔｏｐ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を１００μＬ／ｗｅｌｌ添加した後、５９５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。

２−３．Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ中和活性測定
ＴＢＳＢで１／５希釈したハイブリドーマ培養上清１０μＬと４０μＬの２５０ｐｇ／ｍＬ Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を含むＴＢＣＰ（２．７８ｍＭ ＣａＣｌ_２、２２．２μＭリン脂質（フォスファチジルコリン：フォスファチジルセリン＝７５：２５、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含むＴＢＳＢ）を混和し、室温で１時間インキュベーションした。この混合溶液に、２０μｇ／ｍＬプロトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１００ｎｇ／ｍＬ活性化凝固第Ｖ因子（Ｆａｃｔｏｒ Ｖａ（Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））を含むＴＢＣＰを５０μＬ添加して室温で１０分間反応させた。０．５Ｍ ＥＤＴＡを１０μＬ添加することにより反応を停止させた。この反応溶液に、１ｍＭ Ｓ−２２３８溶液（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）を５０μＬ添加し、室温で３０分間インキュベーションした後、４０５ｎｍにおける吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ Ｍｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で測定した。

〔実施例３〕 キメラ二種特異性抗体発現ベクターの構築
３−１．ハイブリドーマからの抗体可変領域をコードするＤＮＡ断片の調製
抗Ｆ．ＩＸａ抗体あるいは抗Ｆ．Ｘ抗体を産生するハイブリドーマから、ＱＩＡＧＥＮ^（Ｒ） ＲＮｅａｓｙ^（Ｒ） Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて説明書記載の方法に従い全ＲＮＡを抽出した。全ＲＮＡを４０μＬの滅菌水に溶解した。精製されたＲＮＡ１〜２μｇを鋳型に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ｃＤＮＡ合成システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて説明書記載の方法に従いＲＴ−ＰＣＲ法により一本鎖ｃＤＮＡを合成した。

３−２．抗体Ｈ鎖可変領域のＰＣＲによる増幅と配列解析
マウス抗体Ｈ鎖可変領域（ＶＨ）ｃＤＮＡの増幅用プライマーとして、Ｋｒｅｂｂｅｒらの報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７；２０１：３５−５５）に記載のＨＢプライマー混合物、およびＨＦプライマー混合物を用意した。各０．５μＬの１００μＭ ＨＢプライマー混合物および１００μＭ ＨＦプライマー混合物を用いて、反応液２５μＬ（３−１で調製したｃＤＮＡ溶液２．５μｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．７５ ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績））を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、ｃＤＮＡ断片の増幅の効率性に応じて、条件Ａ（９８℃で３分間加熱後、９８℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３２サイクル）ないし条件Ｂ（９４℃で３分間加熱後、９４℃ ２０秒、４６℃ ２０秒、６８℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして５サイクル、さらに９４℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３０サイクル）のいずれかの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１％ アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μｌで溶出した。各ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決定した配列群を解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣＶｅｒｓｉｏｎ ６．１（Ｇｅｎｅｔｙｘ）にて比較解析し、異なる配列を有するものを選択した。

３−３．クローニング用抗体可変領域ＤＮＡ断片の調製
クローニング用制限酵素Ｓｆｉ Ｉ切断サイトを抗体可変領域増幅断片の両末端へ付加するために、以下の操作を行った。

Ｓｆｉ Ｉ切断部位付加ＶＨ断片（Ｓｆｉ Ｉ−ＶＨ）増幅のために、プライマーＨＢの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）２−リンカー配列をＳｆｉ Ｉ切断部位を有するに示す配列（配列番号：５）へ変更したもの（プライマーＶＨ−５’ｅｎｄ）を用意した。各０．５μｌの１０μＭ配列特異的プライマーＶＨ−５’ｅｎｄおよび１０μＭ プライマーｓｃｆｏｒ（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７；２０１：３５−５５）を用いて、反応液２０μＬ（３−２で調製した精製ＶＨ ｃＤＮＡ増幅断片溶液１μｌ，ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績））を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、断片の増幅の効率性に従い、条件Ａ（９８℃で３分間加熱後、９８℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３２サイクル）ないし条件Ｂ（９４℃で３分間加熱後、９４℃ ２０秒、４６℃ ２０秒、６８℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして５サイクル、さらに９４℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３０サイクル）のいずれかの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１％ アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μＬで溶出した。

マウス抗体Ｌ鎖可変領域（ＶＬ）ｃＤＮＡ断片増幅のために、まずＫｒｅｂｂｅｒらの報告（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １９９７；２０１：３５−５５）記載の各０．５μＬの１００μＭ ＬＢプライマー混合物および１００μＭ ＬＦプライマー混合物を用いて、反応液２５μＬ（３−１で調製したｃ−ＤＮＡ溶液２．５μＬ，ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．７５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績））を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、断片の増幅の効率性に従い、９４℃で３分間加熱後、９４℃ ２０秒、４６℃ ２０秒、６８℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして５サイクル、さらに９４℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１％ アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｃｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μＬで溶出した。該断片はそのＣ末端にプライマーＬＦ由来の（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−リンカー配列が付加された状態にある。該断片Ｃ末端へＳｆｉ Ｉ切断部位を付加する目的で、プライマーＬＦの（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３−リンカー配列をＳｆｉ Ｉ切断部位を有するに示す配列（配列番号：６）へ変更したもの（プライマーＶＬ−３’ｅｎｄ）を用意した。Ｓｆｉ Ｉ切断部位付加ＶＬ断片（Ｓｆｉ Ｉ−ＶＬ）増幅のために、各０．５μＬの１０μＭ ＶＬ−３’ｅｎｄプライマー混合物および１０μＭ ｓｃｂａｃｋプライマーを用いて、反応液２０μＬ（精製ＶＬ ｃＤＮＡ増幅断片溶液１μＬ，ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，０．５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績））を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９４℃で３分間加熱後、９４℃ ２０秒、４６℃ ２０秒、６８℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして５サイクル、さらに９４℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３０サイクルの条件で行った。ＰＣＲ後、反応液を１％ アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μＬで溶出した。

精製Ｓｆｉ Ｉ−ＶＨおよびＳｆｉ Ｉ−ＶＬ断片はＳｆｉ Ｉ（タカラバイオ）にて添付説明書記載の方法に従い反応液を調製し、５０℃で一晩消化を行った。その後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて添付説明書記載の方法で精製し、該キット添付のＢｕｆｆｅｒ ＥＢ ３０μＬで溶出した。

３−４．二種特異性ＩｇＧ抗体発現用プラスミド
目的の二種特異性ＩｇＧ抗体を産生する際に、各Ｈ鎖のヘテロ分子を形成させるためにＩｇＧ１のｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ技術（Ｒｉｄｇｗａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１９９６；９：６１７−６２１）を参考にＩｇＧ４のＣＨ３部分へのアミノ酸置換体を作製した。タイプａ（ＩｇＧ４γａ）はＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｗ置換体であり、タイプｂ（ＩｇＧ４γｂ）はＥ３５６Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖの置換体である。さらに、両置換体のヒンジ領域にも置換（−ｐｐｃｐＳｃｐ−−＞−ｐｐｃｐＰｃｐ−）を導入した。本技術により、殆どヘテロ体となり得るが、Ｌ鎖についてはその限りでなく、不必要な抗体分子の生成がその後の活性測定へ影響を及ぼしかねない。そのため、本方策では各特異性を有する抗体分子片腕（ＨＬ分子と称する）を別々に発現させ細胞内で目的型二種特異性ＩｇＧ抗体を効率的に作らせる為に各ＨＬ分子に対応する発現ベクターとして異なる薬剤で誘導がかかるものを用いた。

抗体分子片腕（便宜上右腕ＨＬ分子と称する）の発現用として、テトラサイクリン誘導型ベクターｐｃＤＮＡ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へＨ鎖ないしＬ鎖それぞれの該領域（図１ないし図２）、すなわち動物細胞用シグナル配列（ＩＬ３ｓｓ）（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９８４；８１：１０７５）の下流に適当なマウス抗体可変領域（ＶＨないしＶＬ）とヒトＩｇＧ４γａ定常領域（配列番号：７）ないしκ定常領域（配列番号：８）を組み込んだもの（ｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＨないしｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｌ）を作製した。まず、ｐｃＤＮＡ４をそのマルチクローニングサイトに存在する制限酵素切断サイトＥｃｏ ＲＶおよびＮｏｔ Ｉ（タカラバイオ）で消化した。適当な抗体可変領域を有するキメラ二種特異性抗体右腕Ｈ鎖ないしＬ鎖発現ユニット（それぞれ約１．６ｋｂないし約１．０ｋｂ）をＸｈｏ Ｉ（タカラバイオ）で消化した後に、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて添付説明書記載の方法で精製し、ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ（東洋紡績）を用いて添付説明書記載の反応液組成にて７２℃１０分間反応させ、末端を平滑化した。該平滑化末端断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて添付説明書記載の方法で精製し、Ｎｏｔ Ｉ（タカラバイオ）で消化した。該Ｎｏｔ Ｉ−ｂｌｕｎｔ断片（それぞれ約１．６ｋｂないし１．０ｋｂ）と該Ｅｃｏ ＲＶ−Ｎｏｔ Ｉで消化したｐｃＤＮＡ４を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績）を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸菌ＤＨ５α株（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（東洋紡績））を形質転換した。得られたアンピシリン耐性クローンよりＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて各々プラスミドＤＮＡを単離した。

もう一方の片腕（便宜上左腕ＨＬ分子と称する）はエクダイソン類似体誘導型ベクターｐＩＮＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へＨ鎖ないしＬ鎖それぞれの（図２ないし図３）、すなわち動物細胞用シグナル配列（ＩＬ３ｓｓ）（ＥＭＢＯ．Ｊ．１９８７；６：２９３９）の下流に適当なマウス抗体可変領域（ＶＨないしＶＬ）とヒトＩｇＧ４γｂ定常領域（配列番号：９）ないしκ定常領域（配列番号：８）を組み込んだもの（ｐＩＮＤ−ｇ４ＨないしｐＩＮＤ−ｇ４Ｌ）を前述の方法に則り作製し、各々のプラスミドＤＮＡを単離した。

３−５．二種特異性抗体発現ベクター構築
３−４で調製されたテトラサイクリン誘導型発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＨないしｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｌ）をＳｆｉ Ｉで消化し、反応液を１％ アガローズゲル電気泳動に供した。もともと有していた抗体可変領域部分（ＶＨないしＶＬ（図１ないし図２参照））が除かれた断片（約５ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μＬで溶出した。該断片と、それぞれに対応する３−３で調製されたＳｆｉ Ｉ消化抗Ｆ．ＩＸａ抗体由来Ｓｆｉ Ｉ−ＶＨないしＳｆｉ Ｉ−ＶＬ断片をＱｕｉｃｋ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いて添付説明書記載の方法に従い連結反応を行った。該反応液により大腸菌ＤＨ５α株（Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｈｉｇｈ ＤＨ５α（東洋紡績））を形質転換した。また、３−４で調製されたＳｆｉ Ｉ消化エクダイソン類似体誘導型発現プラスミド（ｐＩＮＤ−ｇ４ＨないしｐＩＮＤ−ｇ４Ｌ）から、上述と同様の手法で抗体可変領域部分（ＶＨないしＶＬ（図２ないし図３参照））を除いた断片と、それぞれに対応する３−３で調製されたＳｆｉ Ｉ消化抗Ｆ．Ｘ抗体由来Ｓｆｉ Ｉ−ＶＨないしＳｆｉ Ｉ−ＶＬ断片を、同様の手法にて組込んだ。

得られた各々のアンピシリン耐性形質転換体は、挿入断片を挟み込むようなプライマーを用いて、コロニーＰＣＲ法にて目的断片の挿入を確認した。まず、抗Ｆ．ＩＸａ抗体キメラＨ鎖ないしＬ鎖発現ベクターのために、挿入部位上流に存在するＣＭＶ Ｆｏｒｗａｒｄ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅへアニールする２１−ｍｅｒのプライマーＣＭＶＦ（配列番号：１０）と挿入部位下流に存在するＢＧＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅへアニールする１８−ｍｅｒのプライマーＢＧＨＲ（配列番号：１１）を合成した（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）。抗Ｆ．Ｘ抗体キメラＨ鎖ないしＬ鎖発現ベクターのために、挿入部位上流へアニールする２４−ｍｅｒのプライマーＥｃｄＦ（配列番号：１２）と挿入部位下流に存在するＢＧＨ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｐｒｉｍｉｎｇ ｓｉｔｅへアニールする１８−ｍｅｒのプライマーＢＧＨＲ（配列番号：１１）を合成した（Ｓｉｇｍａ Ｇｅｎｏｓｙｓ）。コロニーＰＣＲのために、反応液２０μＬ（各１０μＭプライマー０．２μＬ、ＫＯＤ ｄａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ、０．７５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｄａｓｈ（東洋紡績））を調製した。該反応液へ、形質転換株細胞を適量投入しＰＣＲを行った。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９６℃で１分間加熱後、９６℃ １０秒、５５℃ １０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３０サイクル反応させる条件より行った。ＰＣＲ後、反応液を１％ アガローズゲル電気泳動に供し、目的サイズの増幅断片が得られたクローンを選択した。該ＰＣＲ産物は、ＥＸｏＳＡＰ−ＩＴ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて添付説明書に従い、過剰のプライマーとｄＮＴＰｓの不活性化を行った。各ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３１００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて添付説明書記載の方法に従い決定した。本方法により決定した配列群を解析ソフトＧＥＮＥＴＹＸ−ＳＶ／ＲＣ Ｖｅｒｓｉｏｎ ６．１（Ｇｅｎｅｔｙｘ）にて解析し、ＶＨについて挿入欠失変異等の入っていない目的クローンを、また、ＶＬについてハイブリドーマで使用されたＰ３Ｕ１由来偽ＶＬ遺伝子とは異なり挿入欠失変異等のはいっていない目的クローンを選択した。

該目的クローンから、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて各々プラスミドＤＮＡを単離し、１００μＬの滅菌水へ溶解した。抗Ｆ．ＩＸａ抗体キメラＨ鎖発現ベクター、抗Ｆ．ＩＸａ抗体キメラＬ鎖発現ベクター、抗Ｆ．Ｘ抗体キメラＨ鎖発現ベクター、そして抗Ｆ．Ｘ抗体キメラＬ鎖発現ベクターを、それぞれｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＩＸａＨｎ、ｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＩＸａＬｎ、ｐＩＮＤ−ｇ４ＸＨｎそしてｐＩＮＤ−ｇ４ＸＬｎと名付けた。各プラスミド溶液は、使用するまで４℃で保存した。

〔実施例４〕 キメラ二種特異性抗体の動物細胞での発現
４−１．ＤＮＡ溶液の調製
抗体右腕ＨＬ分子発現用ベクター（ｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＩＸａＨｎそしてｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＩＸａＬｎ）はテトラサイクリンにより発現誘導がかかる。テトラサイクリンが存在しない状況下で発現を完全に抑制する為にＴｅｔリプレッサーをコードするプラスミドｐｃＤＮＡ６／ＴＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が要求される。また、抗体左腕ＨＬ分子発現用ベクター（ｐＩＮＤ−ｇ４ＸＨｎそしてｐＩＮＤ−ｇ４ＸＬｎ）は昆虫ホルモンであるエクダイソン類似体（ポナステロンＡ）により発現誘導がかかる。このとき、ポナステロンＡと反応し誘導を行うエクダイソンレセプターとレチノイドＸレセプターをコードするプラスミドｐＶｇＲＸＲ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が要求される。従って、動物細胞のトランスフェクションの為に計６種類のプラスミドＤＮＡ混液を調製した。細胞培養液１ｍＬの為に、ｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＩＸａＨｎ、ｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＩＸａＬｎ、ｐＩＮＤ−ｇ４ＸＨｎそしてｐＩＮＤ−ｇ４ＸＬｎを各２１８．８ｎｇ、ｐｃＤＮＡ６／ＴＲそしてｐＶｇＲＸＲを各１３１２．５ｎｇ用いた。

４−２．動物細胞のトランスフェクション
ヒト胎児腎癌細胞由来ＨＥＫ２９３Ｈ株（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を１０％ＦＣＳ（ＭＯＲＥＧＡＴＥ）を含むＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ懸濁し、５×１０^５個／ｍＬの細胞密度で接着細胞用１２−ｗｅｌｌプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ）の各ｗｅｌｌへ１ｍＬずつ蒔きこみＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で培養した。４−１で調製したプラスミドＤＮＡ混液をトランスフェクション試薬、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）７μＬとＯｐｔｉ−ＭＥＭ Ｉ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）２５０μＬの混液へ加えて室温２０分間静置したものを各ｗｅｌｌの細胞へ投入し、４〜５時間、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃にて５％ＣＯ_２）内でインキュベートした。

４−３．二種特異性ＩｇＧ抗体の発現誘導
前項のようにトランスフェクションした細胞培養液から培地を吸引除去し、１μｇ／ｍＬのテトラサイクリン（和光純薬工業）を含む１ｍＬ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地を投入し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ＣＯ_２）内で１日培養して、抗体右腕ＨＬ分子の第一次発現誘導を行った。その後、培地を吸引除去し、一旦１ｍＬ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地にて洗浄した後、５μＭのポナステロンＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１ｍＬ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ−ＩＩ培地を投入し、ＣＯ_２インキュベーター（３７℃、５％ ＣＯ_２）内で２日ないし３日培養して、抗体左腕ＨＬ分子の第ニ次発現誘導を行い培地中へ二種特異性ＩｇＧ抗体を分泌させた。培養上清は回収された後、遠心分離（約２０００ｇ、５分間、室温）して細胞を除去し、必要に応じてＭｉｃｒｏｃｏｎ^（Ｒ） ＹＭ−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮を行った。該サンプルは使用するまで４℃で保存した。

〔実施例５〕 ヒトＩｇＧ濃度の定量
Ｇｏａｔ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ（Ｃａｐｐｅｌ）をｃｏａｔｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒにて１μｇ／ｍＬに調製し、Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ ｐｌａｔｅに固相化した。Ｄｉｌｕｅｎｔ ｂｕｆｆｅｒ（Ｄ．Ｂ．）にてブロッキング処理した後、Ｄ．Ｂ．を用いて適当に希釈した培養上清サンプルを添加した。また、抗体濃度算出のためのスタンダードとして、１０００ｎｇ／ｍＬから２倍系列でＤ．Ｂ．にて１１段階希釈したヒトＩｇＧ４（ヒト型化抗ＴＦ抗体、ＷＯ ９９／５１７４３参照）を同様に添加した。３回洗浄したのち、Ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ＩｇＧ，ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を反応させた。５回洗浄したのち、Ｓｉｇｍａ １０４^（Ｒ） ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として発色させ、吸光度リーダーＭｏｄｅｌ ３５５０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により、参照波長６５５ｎｍとして４０５ｎｍの吸光度を測定した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒｅｔｏｒｉｅｓ）ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を算出した。

〔実施例６〕 Ｆ．ＶＩＩＩａ（活性化凝固第ＶＩＩＩ因子）様活性アッセイ
二種特異性抗体のＦ．ＶＩＩＩａ様活性は、以下の酵素アッセイで評価した。また、以下の反応は全て室温で行った。３．７５μｇ／ｍＬのＦａｃｔｏｒ ＩＸ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）４０μＬと抗体溶液１０μＬの混合液を９６穴プレート中で１時間インキュベーションした。さらにその混合液に、１０ｎｇ／ｍＬのＦａｃｔｏｒ ＸＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０μＬ，５０μｇ／ｍＬのＦａｃｔｏｒ Ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２０μＬ，４００μｇ／ｍＬのｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ（実施例１−３参照）５μＬ，５ｍＭ ＣａＣｌ_２と１ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＴＢＳＢ（以下、ＴＢＳＢ−Ｓと称す）１５μＬを添加し、酵素反応を開始させた。３０分間反応させたのち、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μＬを加えることにより停止させた。

発色基質溶液５０μＬをそれぞれのウェルに加えた後、０分、３０分の４０５ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）における吸光度をＭｏｄｅｌ ３５５０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。Ｆ．ＶＩＩＩａ様活性は、抗体添加の３０分間の吸光度変化値から抗体無添加の３０分間の吸光度変化値を引いた値で表した（図４および５参照）。

Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄの溶媒にはＴＢＳＢ、Ｆａｃｔｏｒ ＸＩａ、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ及びＦａｃｔｏｒ Ｘの溶媒にはＴＢＳＢ−Ｓを用いた。発色基質溶液は、添付説明書に従い溶解したテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）とポリブレン液（０．６ｍｇ／Ｌ ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ））の１：１混合液である。

さらに、最も活性の高かったＸＢ１２／ＳＢ０４について、Ｆ．ＶＩＩＩａ様活性の濃度依存性を測定した（図６）。

〔実施例７〕 血漿凝固アッセイ
血友病Ａ血液の凝固能を二種特異性抗体が是正するか明らかにするために、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対する同抗体の影響を検討した。様々な濃度の抗体溶液５０μＬ、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）５０μＬ及びＡＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬの混合液を３７℃で３分間加温した。凝固反応は２０ｍＭのＣａＣｌ_２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬを同混合液に加えることにより開始させた。ＣＲ−Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）が接続されたＫＣ１０Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）により凝固するまでの時間を測定した（図７および８）。

さらに、最も凝固時間の短縮効果の高かったＸＢ１２／ＳＢ０４について濃度依存性を測定した（図９）。

〔実施例８〕 抗体精製
実施例４に記載の方法で得られた１０ｍＬの培養上清をＣｅｎｔｒｉｃｏｎ^（Ｒ） ＹＭ−５０（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）により、１ｍＬまで濃縮した。これに１０μＬの１０％ＢＳＡ、１０μＬの１％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０及び１００μＬのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、４℃で一晩転倒混和した。その溶液を０．２２μｍのフィルターカップＵｌｔｒａｆｒｅｅ^（Ｒ）−ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＴＢＳ５００μＬにて３回洗浄後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ樹脂を１００μＬの０．０１％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含む１０ｍＭ ＨＣｌ，ｐＨ２．０に懸濁して３分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を加えて中和した。Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒｅｔｏｒｉｅｓ）ソフトウェアを用いて、スタンダードの検量線から培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を算出した。抗体濃度は実施例５に従い定量した。

〔実施例９〕抗Ｆ．Ｘ抗体のＧＳＴ−ＡＰ ウエスタンブロッティング
Ｆ．Ｘの活性化ペプチド（ＡＰ）とグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク（ＧＳＴ−ＡＰ）を発現する組換え大腸菌を構築した。ヒトＦ．Ｘの全長翻訳領域をカバーするｃＤＮＡをヒト肝臓Ｍａｒａｔｈｏｎ−Ｒｅａｄｙ ｃＤＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からＰＣＲ法により増幅後、これを鋳型にさらにＡＰ領域（Ｌｅｙｔｕｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １９８６；２５：５０９８）をコードする領域をＰＣＲ法により増幅しｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）へサブクローニングしＧＳＴ−ＡＰをコードするｐＧＥＸ−Ｆ１０ＡＰを得た。該プラスミドを形質転換した大腸菌を培養し、ＯＤ＝０．８にて１ｍＭ ＩＰＴＧを添加しＧＳＴ−ＡＰの発現誘導を行った。培養液を遠心（３，０００ ｘ ｇ，３０分間、４℃）後、菌体を回収し使用に供するまで−２０℃にて保存した。

その菌体ペレットを培養量の１／２０量のＰＢＳで再懸濁し、懸濁液０．１ｍＬに対し、２．４ｍＬの割合でＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（ＩＷＡＫＩ）を加え、９５℃、５分間ボイルした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ｍｉｎｉ（１４％）ゲル（旭テクノグラス）の各ウェルにその反応溶液１０μＬを加え、電気泳動を行った。電気泳動後のゲルをセミドライブロッター（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を用いてＩｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ^ＴＭ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｍｅｍｂｒａｎｅ（ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ）へ転写し、ＢＴ−ＰＢＳ（２％ ＢＳＡと０．０５％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＰＢＳ）でブロッキングした。ブロッキング終了後、実施例１−４で精製された抗Ｆ．Ｘマウス抗体ＳＢ０４またはＳＢ０６をＢＴ−ＰＢＳで２μｇ／ｍＬに希釈したものと１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＰＢＳで洗浄後、ＢＴ−ＰＢＳで２０００倍希釈したアルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＰＢＳで洗浄後、発色基質ＢＣＩＰ／ＮＢＴＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｋｉｒｋｅｇａａｄ ＆ Ｐｅｒｒｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で発色させた（図１０を参照）。

〔実施例１０〕 免疫マウス脾臓由来ｓｃＦｖライブラリーからの二種特異性抗体の取得
１０−１．抗原および免疫
ＢＡＬＢ／ｃマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）３匹、ＭＲＬ／ｌｐｒマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）３匹、およびＣ５７ＢＬ／６Ｎマウス（雄、免疫開始時６週齢、日本チャールス・リバー）３匹に、抗原であるＦａｃｔｏｒ ＩＸａ β（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）もしくはＦａｃｔｏｒ Ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を以下の通り免疫した。初回免疫としてＦＣＡ（フロイント完全アジュバントＨ３７ Ｒａ（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でエマルジョン化した抗原を４０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。２週間後にＦＩＡ（フロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））でエマルジョン化した抗原を４０μｇ／ｈｅａｄ皮下投与した。以後１週間間隔で追加免疫を３回行い、最終免疫の８日後にマウスより脾臓を摘出した。

１０−２．ファージライブラリーの構築
実施例１−１および２−１で作出した免疫マウス摘出脾臓の一部、ならびに実施例１０−１にて作出した免疫マウスからの摘出脾臓をＴｒｉｚｏｌ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）へ投入（５０ｍｇ ｓｐｌｅｅｎ／ｍｌ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅａｇｅｎｔ）し、ガラスホモジナイザーを用いて均質化した。その後、試薬添付マニュアル記載の方法に従い、Ｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出した。抽出溶液からＰｏｌｙＡＴｒａｃｔ Ｓｙｓｔｅｍ １０００キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて添付マニュアル記載の方法に従いｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを抽出した。ＲＴ−ＰＣＲ（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＩＩ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＲＴ−ＰＣＲ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にてｃ−ＤＮＡを合成し、使用に際するまで−２０℃で保存した。

マウス抗体重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）ｃＤＮＡの増幅用プライマーとして、実施例３−２および３−３で用いたＨＢプライマー混合物、ＨＦプライマー混合物、ＬＢプライマー混合物、そしてＬＦプライマー混合物を用意した。ＶＨ増幅用として各１μＬの１００μＭ ＨＢプライマー混合物および１００μＭ ＨＦプライマー混合物を用いて、反応液５０μＬ（ｃＤＮＡ溶液２．５μｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２，３．７５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績））を調製した。また、ＶＬ増幅用として各１μＬの１００μＭ ＬＢプライマー混合物および１００μＭ ＬＦプライマー混合物を用いて、上記と同様の組成反応液（５０μＬ）を調製した。ＰＣＲは、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐａｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて、９８℃で３分間加熱後、９８℃ ２０秒、５８℃ ２０秒、７２℃ ３０秒からなる反応を１サイクルとして３２サイクルを行った。ＰＣＲ後、反応液を２％ アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水５０μｌで溶出した。次にｓｃＦｖ断片を増幅するために、反応液１００μＬ（ＶＨ断片溶液３μｌ、ＶＬ断片溶液３μｌ、ＫＯＤ ｐｌｕｓ ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績）、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ，１ｍＭ ＭｇＣｌ_２，５ｕｎｉｔｓ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＫＯＤ ｐｌｕｓ（東洋紡績））を１０本調製し、１ｓｔＰＣＲ（９４℃で３分間加熱後、９４℃ １分、６３℃ ４分、からなる反応を１サイクルとして７サイクル）を行った後、６３℃に保温した状態で各チューブへ１０μＭ ｓｃｆｏｒプライマー、および１０μＭ ｓｃｂａｃｋプライマーを各２．５μｌずつ添加し、さらに２ｎｄ ＰＣＲ（９４℃で３５秒加熱後、９４℃ ２分、６３℃ ２分、からなる反応を１サイクルとして３０サイクル）を行った。ＰＣＲ後、反応液をＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）にて精製し、精製産物を制限酵素Ｓｆｉ Ｉ（タカラバイオ）にて５０℃で一晩消化を行った。消化物は２％ アガローズゲル電気泳動に供した後、目的のサイズ（約８００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付説明書記載の方法で精製し適量の滅菌水にて溶出した。ファージｇｅｎｅ ＩＩＩタンパク上にｓｃＦｖを提示させるため、ファージミドベクターとして、ｐＥＬＢＧｌａｃＩ（図１１参照）を用いた。該ベクター１０μｇを制限酵素Ｓｆｉ Ｉ（タカラバイオ）にて５０℃で一晩消化を行った後、目的のサイズ（約５ｋｂ）の切断断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用い、添付説明書記載の方法で精製し適量の滅菌水にて溶出した。精製ＰＣＲ産物と精製ベクター断片を、Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｈｉｇｈ（東洋紡績）を用いて添付説明書記載の方法に従い、１６℃一晩連結反応を行った。該反応液により大腸菌ＸＬ１ｂｌｕｅ ｅｌｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）あるいはエレクトロマックスＤＨ１２ｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を添付説明書記載の方法に従いエレクトポレーション法による形質転換を行った。得られたアンピシリン耐性形質転換体を全て回収し、組換え大腸菌ライブラリーとして使用に供するまで−２０℃にて保存した。

該大腸菌ライブラリー（２ ｘ １０^９ｃｆｕ）を５０ｍＬ ２ｘＹＴＡＧ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２％グルコースを含む２ｘＴＹ）に植菌し、ＯＤ ６００ ０．４〜０．５まで３７℃にて培養した。４ ｘ １０^１１のヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加え３７℃、１５分間静置して感染させた。ここに４５０ｍＬ ２ｘＹＴＡＫ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン、２５μｇ／ｍＬカナマイシンを含む２ｘＴＹ）、２５μＬ １ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧを添加し、３０℃１０時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、１００ｍＬ ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液（１０％ポリエチレングリコール８０００，２．５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ）を混合後、４℃、６０分間静置した。１０，８００ ｘ ｇ、３０分間遠心にてファージを沈殿させ、沈殿物を４０ｍＬの水に懸濁し、８ｍＬ ＰＥＧ−ＮａＣｌ溶液を混合後、４℃、１時間静置した。１０，８００ ｘ ｇ、３０分間遠心にてファージを沈殿させ５ｍＬ ＰＢＳに懸濁しファージライブラリーを得た。該ファージは使用に際するまで、４℃にて保存した。

１０−３．パンニング法による結合ファージ濃縮
Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ βもしくはＦａｃｔｏｒ ＸをＮｏ−Ｗｅｉｇｈ Ｐｒｅｍｅａｓｕｒｅｄ ＮＨＳ−ＰＥＯ_４−Ｂｉｏｔｉｎ Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅｓ（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いてビオチン標識した。１０−２で作成されたファージライブラリー溶液６００μｌに１００ｐｍｏｌのビオチン標識Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａ βもしくはＦａｃｔｏｒ Ｘを加え、６０分間抗原と接触させた。５％ Ｍ−ＰＢＳ（５％ｗ／ｖスキムミルクを含むＰＢＳ）で洗浄したＤｙｎａｂｅａｄｓ Ｍ−２８０ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＤＹＮＡＬ）６００μＬを加え、１５分間結合させた。ビーズ結合ファージを１ｍＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）にて何回か洗浄した後、ＰＢＳにて洗浄した。０．８ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）中にビーズを５分間懸濁し、ファージを溶出した。

あるいは、イムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）へ固相化したＦａｃｔｏｒ ＩＸａ βもしくはＦａｃｔｏｒ Ｘ（１０μｇ／ｗｅｌｌ ｘ ５）に、２．５％ｗ／ｖスキムミルクで１５分間インキュベートしたファージライブラリー（８０μｌ／ｗｅｌｌ ｘ ５）を加え、６０分間抗原と接触させた。抗原結合ファージを１ｍＬのＰＢＳＴ（０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ）にて何回か洗浄した後、ＰＢＳにて洗浄した。０．８ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌグリシン／ＨＣｌ（ｐＨ２．２）にて５分間インキュベートし、ファージを溶出した。

回収したファージ溶液に４５μＬ ２ｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓを添加して中和し、対数増殖期（ＯＤ６００＝０．４〜０．５）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ １０ｍＬに添加、３７℃、３０分間静置することで感染させた。これを２ｘＹＴＡＧプレートに広げ、３０℃で培養した。コロニーを回収し、２ｘＹＴＡＧに植菌、ＯＤ ６００＝０．４〜０．５まで３７℃にて培養した。培養液１０ｍＬに５μＬ １ｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ、１０^１１ｐｆｕヘルパーファージ（ＶＣＳＭ１３）を添加し３７℃３０分間静置した。遠心集菌後、２ｘＹＴＡＫ １００ｍＬに再懸濁し、３０℃、１０時間培養した。遠心分離にて培養上清を回収し、２０ｍＬ １０％ＰＥＧ−５ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ溶液を混合後、４℃、２０分間静置した。１０，８００ ｘ ｇ、３０分間遠心にてファージを沈殿させ、２ｍＬ ＰＢＳに懸濁したものを次のパンニングに供した。

１０−４．ファージＥＬＩＳＡ
上記のシングルコロニーを１００μＬ ２ｘＹＴＡＧに植菌し、３０℃で一晩培養した。この５μＬを５００μＬ ２ｘＹＴＡＧに植菌、３７℃、５時間培養後、ヘルパーファーシ２ ｘ １０^８ｐｆｕを投入し３７℃にて３０分間静置、さらに３７℃にて３０分間攪拌培養後、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを含む２ｘＹＴＡＫを１２０μＬ添加した。３０℃にて一晩培養し、遠心上清をＥＬＩＳＡに供した。ビオチン標識抗原のパンニングにて得られたクローンのＥＬＩＳＡのために、１．０μｇ／ｍＬのビオチン標識抗原でコートしたＳｔｒｅｐｔａＷｅｌｌ ９６マイクロタイタープレート（Ｒｏｃｈｅ）を用いた。また、ネイティブ抗原のパンニングにて得られたクローンのＥＬＩＳＡのために、１．０μｇ／ｍＬのネイティブ抗原を固相化したイムノプレート（ＭａｘｉＳｏｒｐ，Ｎｕｎｃ）を用いた。
ＰＢＳＴにて洗浄し抗原を除いた後、ブロッキングバッファーとして２％ Ｍ−ＰＢＳ ２００μＬあるいは２％ ＢＳＡ−ＰＢＳ（２％ｗ／ｖ ＢＳＡを含むＰＢＳ）で室温１時間ブロッキングした。バッファーを除き、ここに培養上清を加え６０分間静置しファージを結合させた。洗浄後、結合ファージはブロッキングバッファーにて希釈したＨＲＰ結合抗Ｍ１３抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ）とＴＭＢ基質（Ｚｙｍｅｄ）で検出し、１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ_２ＳＯ_４添加により反応を停止した後、プレートリーダーにてＡ４５０の値を測定した。

１０−５．配列決定とクローン選択
ＥＬＩＳＡにて陽性であったクローンの組換え大腸菌２ｘＹＴＡＧ培養液からプライマーＰＢＧ３−Ｆ１（５’−ＣＡＧＣＴＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＡＴＴＧＣＣ−３’／配列番号：１）とＰＢＧ３−Ｒ１（５’−ＣＴＴＴＴＣＡＴＡＡＴＣＡＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧ−３’／配列番号：２）を用いてＰＣＲにてｓｃＦｖ領域を増幅し、その塩基配列決定した。培養液１μＬ、１０ ｘ ＫＯＤ Ｄａｓｈ緩衝液１．５μＬ、１０μｍｏｌ／Ｌプライマーを０．２μＬづつ、ＫＯＤ Ｄａｓｈポリメラーゼ（東洋紡績、２．５Ｕ／μＬ）０．３μＬを含むＰＣＲ反応液１５μＬを、サーマルサイクラーＧｅｎｅＡｍｐ ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ ９７００（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）で９６℃、１０秒、５５℃、１０秒、７２℃、３０秒、３０サイクルの増幅を行った。ＰＣＲ後、５μＬの反応液にＥｘｏＳＡＰ−ＩＴ（アマシャム）を３μＬ添加し、３７℃、１５分間、引き続き８０℃、１５分間保温した。このサンプルについてＰＢＧ３−Ｆ２（５’−ＡＴＴＧＣＣＴＡＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＴ−３’／配列番号：３）あるいはＰＢＧ３−Ｒ２（５’−ＡＡＡＴＣＡＣＣＧＧＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣ−３’／配列番号：４）をプライマーとしてＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて反応を行い、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒで泳動した。塩基配列から推定されるアミノ酸配列のＣＤＲ３の異なるクローンを抗Ｆａｃｔｏｒ ＩＸａについて５２クローン、及び抗Ｆａｃｔｏｒ Ｘについて３３クローンを選択した。

１０−６．二種特異性ＩｇＧ抗体発現ベクターの構築
ｓｃＦｖ抗体をＩｇＧ型として発現させるために、実施例３−３、３−４、そして３−５に示す同様の方策にて抗体可変領域（ＶＨ，ＶＬ）を誘導型発現ベクターにクローニングを行った。抗Ｆ．ＩＸａ抗体可変領域（ＶＨおよびＶＬ）はテトラサイクリン誘導型ベクター（それぞれｐｃＤＮＡ４−ｇ４ＨおよびｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｌ）へ組み込まれた。抗Ｆ．Ｘ抗体可変領域（ＶＨおよびＶＬ）はエクダイソン類似体誘導型ベクター（それぞれｐＩＮＤ−ｇ４ＨおよびｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｌ）へ組み込まれた。目的クローンからＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて各々プラスミドＤＮＡを単離し、１００μＬの滅菌水へ溶解した。

１０−７．キメラ二種特異性抗体の動物細胞での発現
実施例４−１に示す同様の方策で調製されたＤＮＡ溶液を用いて、実施例４−２および４−３に示す同様の方策にて動物細胞で発現させ、培養上清を回収した。該サンプルは使用するまで４℃で保存した。

〔実施例１１〕 抗体精製
実施例１０−７に記載の方法で得られた１０ｍＬの培養上清に１００μＬのｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を添加し、４℃で一晩転倒混和した。その溶液を０．２２μｍのフィルターカップＵｌｔｒａｆｒｅｅ^（Ｒ）−ＭＣ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、０．０１％Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含むＴＢＳ ５００μＬにて３回洗浄後、ｒＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ^ＴＭ樹脂を１００μＬの０．０１％ Ｔｗｅｅｎ^（Ｒ） ２０を含む１０ｍＭ ＨＣｌ，ｐＨ２．０に懸濁して３分間静置したのち、抗体を溶出させた。直ちに、５μＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０を加えて中和した。
Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｍａｎａｇｅｒ ＩＩＩ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒｅｔｏｒｉｅｓ）ソフトウェアを用いて、ヒトＩｇＧ４（ヒト型化抗ＴＦ抗体、ＷＯ ９９／５１７４３参照）の検量線から培養上清中のヒトＩｇＧ濃度を算出した。抗体濃度は実施例５に従い定量した。

〔実施例１２〕 Ｆ．ＶＩＩＩａ（活性化凝固第ＶＩＩＩ因子）様活性アッセイ
二種特異性抗体のＦ．ＶＩＩＩａ様活性は、以下の酵素アッセイで評価した。また、以下の反応は全て室温で行った。１５μｇ／ｍＬのＦａｃｔｏｒ ＩＸ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０μＬと１００ｍＭ ＣａＣｌ_２と２０ｍＭ ＭｇＣｌ_２を含むＴＢＳＢ ５μＬと実施例１０−７記載の方法で得られた培養上清５０μＬの混合液を９６穴プレート中で１時間インキュベーションした。さらにその混合液に、１０ｎｇ／ｍＬのＦａｃｔｏｒ ＸＩａ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）１０μＬ，５０μｇ／ｍＬのＦａｃｔｏｒ Ｘ（Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）２０μＬ，４００μｇ／ｍＬのｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ ５μＬを添加し、酵素反応を開始させた。３０分間反応させたのち、０．５Ｍ ＥＤＴＡ １０μＬを加えることにより停止させた。

発色基質溶液５０μＬをそれぞれのウェルに加えた後、０分、６０分の４０５ｎｍ（参照波長６５５ｎｍ）における吸光度をＭｏｄｅｌ ３５５０ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。Ｆ．ＶＩＩＩａ様活性は、抗体発現培養上清の６０分間の吸光度変化値から抗体非発現培養上清の６０分間の吸光度変化値を引いた値で表した（図１２を参照）。

Ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ、Ｆａｃｔｏｒ ＸＩａ、Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ及びＦａｃｔｏｒ Ｘの溶媒にはＴＢＳＢを用いた。発色基質溶液は、添付説明書に従い溶解したテストチーム発色基質Ｓ−２２２２（Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｘ）とポリブレン液（０．６ｍｇ／Ｌ ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅ ｂｒｏｍｉｄｅ（Ｓｉｇｍａ））の１：１混合液である。

〔実施例１３〕 血漿凝固アッセイ
実施例１１の方法に従い調製した二種特異性抗体が血友病Ａ血液の凝固能を回復するか明らかにするために、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を用いた活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）に対する同抗体の影響を、実施例７で示す同様の方法で評価した（図１３を参照）。さらに、凝固時間の短縮効果の高かったＡ４４／Ｂ２６、Ａ６９／Ｂ２６について濃度依存性を測定した（図１４、図１５を参照）。

〔実施例１４〕 二種特異性ＩｇＧ抗体とＦ．ＶＩＩＩとの併用検討
二種特異性抗体とＦ．ＶＩＩＩとの併用検討は、以下の血漿凝固アッセイ条件で評価した。２５μｇ／ｍＬ 抗体溶液 ４０μＬ、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）５０μＬの混合液を室温で、３０分間インキュベーションした。さらにその混合液に、０．１Ｕ／ｍＬの遺伝子組換え型血液凝固第ＶＩＩＩ因子製剤コージネイト^（Ｒ）ＦＳ（ＢＡＹＥＲ）１０μＬ及びＡＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬを加え、３７℃で３分間加温した。凝固反応は２０ｍＭのＣａＣｌ_２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬを同混合液に加えることにより開始させた。ＣＲ−Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）が接続されたＫＣ１０Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）により凝固するまでの時間を測定した（図１６を参照）。

〔実施例１５〕 インヒビター血漿における二種特異性ＩｇＧ抗体の効果
インヒビター血漿における二種特異性ＩｇＧ抗体の効果は、以下の血漿凝固アッセイ条件で評価した。Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿（Ｂｉｏｍｅｒｉｅｕｘ）５０μＬに１００μｇ／ｍＬ 抗ヒトＦ．ＶＩＩＩ中和抗体（Ｃａｔａｌｏｇ Ｎｕｍｂｅｒ：ＭＡＢ３４４０、ＣＨＥＭＩＣＯＮ）１０μＬの混合液を室温で、３０分間インキュベーションした。この血漿をインヒビター血漿として用いた。このインヒビター血漿に、２５μｇ／ｍＬ抗体溶液 ４０μＬ及びＡＰＴＴ試薬（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬを加え、３７℃で３分間加温した。凝固反応は２０ｍＭのＣａＣｌ_２（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）５０μＬを同混合液に加えることにより開始させた。ＣＲ−Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）が接続されたＫＣ１０Ａ（Ａｍｅｌｕｎｇ）により凝固するまでの時間を測定した（図１７を参照）。

〔実施例１６〕 二種特異性抗体のヒト化
実施例１〜７で取得した二種特異性抗体の中で、血液凝固時間の短縮効果が最も高かったＸＢ１２（マウス抗ＦａｃｔｏｒＩＸａ抗体）／ＳＢ０４（マウス抗ＦａｃｔｏｒＸ抗体）について、以下のようにヒト化を実施した。

１６−１．ヒト抗体の相同性検索
一般公開されているＫａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｕｂ／ｄａｔａｂａｓｅｓ／ｋａｂａｔ／）およびＩＭＧＴ Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）よりヒト抗体アミノ酸配列データを入手し、構築したＤａｔａｂａｓｅを用いてマウスＸＢ１２−Ｈ鎖可変領域、マウスＸＢ１２−Ｌ鎖可変領域、マウスＳＢ０４−Ｈ鎖可変領域、マウスＳＢ０４−Ｌ鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、以下に示すヒト抗体配列と高い相同性を持つことが確認されたことからヒト化抗体のフレームワーク領域（以下、ＦＲ）に使用することにした。

（１）ＸＢ１２−Ｈ鎖可変領域：ＫＡＢＡＴＩＤ−０２０６１９（Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ）
（Ｍａｒｉｅｔｔｅら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．１９９３；３６：１３１５−１３２４）
（２）ＸＢ１２−Ｌ鎖可変領域：ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｘ６１６４２（ＩＭＧＴ Ｄａｔａｂａｓｅ）
（Ｍａｒｋら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．１９９１；２２２：５８１−５９７．）
（３）ＳＢ０４−Ｈ鎖可変領域：ＫＡＢＡＴＩＤ−０２５２５５（Ｋａｂａｔ Ｄａｔａｂａｓｅ）
（Ｄｅｍａｉｓｏｎら、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｔｅｔｉｃｓ １９９５；４２：３４２−３５２）
（４）ＳＢ０４−Ｌ鎖可変領域：ＥＭＢＬ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＢ０６４１１１（ＩＭＧＴ Ｄａｔａｂａｓｅ）
（Ｕｎｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｄａｔａ）
（１）−（４）のヒト抗体のＦＲに各マウス抗体の相補性抗原決定領域（以下、ＣＤＲ）を移植したヒト化抗体を作製した。

また、ＮＣＢＩより一般公開されている相同性検索Ｗｅｂ ｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）を使用して、（１）−（４）のヒト抗体に相同性の高いヒト抗体の分泌シグナル配列を検索した。検索により得られた以下に示す分泌シグナル配列を使用した。
（１）ＸＢ１２−Ｈ鎖可変領域：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＦ０６２１２０
（２）ＸＢ１２−Ｌ鎖可変領域：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ７４０１９
（３）ＳＢ０４−Ｈ鎖可変領域：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＢＣ０１９３３７
（４）ＳＢ０４−Ｌ鎖可変領域：ＧｅｎＢａｎｋ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．ＡＹ２０４７５６

１６−２．ヒト化抗体遺伝子発現ベクターの構築
分泌シグナル配列から抗体可変領域にいたるアミノ酸配列をコードする塩基配列において、５０ｂａｓｅ程度の合成オリゴＤＮＡを３’末端側が約２０ｂａｓｅ程度ハイブリダイズするように交互に１２本作製した。さらに、抗体可変領域遺伝子の５’末端側にハイブリダイズし、ＸｈｏＩ切断配列を有するプライマーと抗体可変領域遺伝子の３’末端側にハイブリダイズし、ＳｆｉＩ切断配列を有するプライマーを作製した。

２．５μＭに調製した合成オリゴＤＮＡを各１μＬで混合し、１ｘ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ Ｂｕｆｆｅｒ，０．４ｍＭ ｄＮＴＰｓ，０．５ｕｎｉｔｓ ＴａＫａＲａ Ｅｘ Ｔａｑ（全て宝酒造）を加え、反応液４８μＬになるように調製した。９４℃ ５分保温した後に、９４℃ ２分、５５℃ ２分、７２℃ ２分からなる反応を２サイクル行い、各合成オリゴＤＮＡのアッセンブルおよび伸長反応を実施した。次に、抗体遺伝子の５’末端側および３’末端側にハイブリダイズするプライマー（各１０μＭ）を１μＬ添加し、９４℃ ３０秒、５５℃ ３０秒、７２℃ １分からなる反応を３５サイクル行い、７２℃５分反応させ、抗体可変領域遺伝子を増幅した。ＰＣＲ後、反応液全量を１％ アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）の増幅断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μｌで溶出した。該断片をｐＧＥＭ−Ｔ Ｅａｓｙ Ｖｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、添付説明書記載の方法でクローニングを行った。各ＤＮＡ断片の塩基配列は、ＢｉｇＤｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ３７００ ＤＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。

正しいヒト化抗体可変領域遺伝子配列であることが確認されたプラスミドをＸｈｏＩおよびＳｆｉＩで消化した後に、反応液を１％アガローズゲル電気泳動に供した。目的のサイズ（約４００ｂｐ）のＤＮＡ断片をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μｌで溶出した。また、実施例３−４で作製したテトラサイクリン誘導型発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｈ、ｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｌ）およびエグダイソン類似体誘導型発現プラスミド（ｐＩＮＤ−ｇ４Ｈ、ｐＩＮＤ−ｇ４Ｌ）をＸｈｏＩおよびＳｆｉＩで消化した後に、抗体定常領域を含む断片（約５ｋｂ）をＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて、添付説明書記載の方法で精製し、滅菌水３０μｌで溶出した。ＸｈｏＩおよびＳｆｉＩで消化したヒト化ＸＢ１２抗体遺伝子断片（Ｈ鎖可変領域（以下ＶＨ）またはＬ鎖可変領域（以下ＶＬ））とＸｈｏＩおよびＳｆｉＩで消化したテトラサイクリン誘導型発現プラスミド（ｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｈ、ｐｃＤＮＡ４−ｇ４Ｌ）をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて添付説明書記載の方法で連結反応を行った。また、ＸｈｏＩおよびＳｆｉＩで消化したヒト化ＳＢ０４抗体遺伝子断片（Ｈ鎖可変領域またはＬ鎖可変領域）とＸｈｏＩおよびＳｆｉＩで消化したエグダイソン類似体誘導型発現プラスミド（ｐＩＮＤ−ｇ４Ｈ、ｐＩＮＤ−ｇ４Ｌ）をＲａｐｉｄ ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて添付説明書記載の方法で連結反応を行った。各反応液の一部を用いて大腸菌ＤＨ５α株（東洋紡績）を形質転換した。

１６−３．ヒト化二種特異性抗体の調製
４種類のヒト化抗体発現ベクターとｐｃＤＮＡ６／ＴＲ、ｐＶｇＲＸＲを用いて、実施例４−２、４−３に示す方法でＨＥＫ２９３Ｈへ遺伝子導入および発現誘導を行った。さらに、実施例８、５に示す方法で抗体精製および抗体濃度の定量を実施した。

１６−４．ヒト化二種特異性抗体の活性評価および抗体配列の改変
調製したヒト化ニ種特異性抗体およびキメラニ種特異性抗体（ＸＢ１２／ＳＢ０４）の血漿凝固能を評価するために、実施例７の方法に従って、Ｆ．ＶＩＩＩ欠乏血漿を用いてＡＰＴＴに対する抗体の影響を検討した。血液凝固能が低下したヒト化ニ種特異性抗体について、活性上昇を目指して、ヒト抗体ＦＲのアミノ酸の改変した。また、熱安定性低下などが危惧されるＸＢ１２抗体ＶＨのＣＤＲ３のシステイン残基についてもアラニン残基に改変した。具体的には、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて、添付説明書記載の方法でヒト化抗体発現ベクターに変異を導入した。ＦＲ配列のアミノ酸改変および血液凝固能の評価を繰り返すことでＸＢ１２／ＳＢ０４と同等の活性を有するヒト化ニ種特異性抗体（ヒト化ＸＢ１２抗体（ＶＨ：ｈＸＢ１２ｆ−Ａ，ＶＬ：ｈＸＢＶＬ）／ヒト化ＳＢ０４抗体（ＶＨ：ｈＳＢ０４ｅ，ＶＬ：ｈＳＢＶＬ−Ｆ３ｆ）を取得した（図１８）。

本発明により酵素および該酵素の基質の両方を認識する抗体であって、酵素活性を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体が提供された。
本発明の二種特異性抗体は、血中での安定性が高く、抗原性も低いと考えられることから、医薬品となるものと大いに期待される。

Claims (12)

1. 酵素、および該酵素の基質の両方を認識し、酵素反応を増強する補因子の機能を代替する二種特異性抗体であって、該酵素が活性化血液凝固第IX因子で、該基質が血液凝固第X因子で、該補因子が活性化血液凝固第VIII因子である抗体。
2. 抗血液凝固第IXa因子抗体における下記（ａ１）もしくは（ａ２）のＣＤＲのアミノ酸配列からなる相補性決定領域と、抗血液凝固第X因子抗体における下記（ｂ１）〜（ｂ９）のいずれかに記載のＣＤＲのアミノ酸配列からなる相補性決定領域とを含む、請求項１に記載の抗体。
   （ａ１）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：１４、１５、１６に記載のアミノ酸配列
   （ａ２）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：１８、１９、２０に記載のアミノ酸配列
   （ｂ１）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：２２、２３、２４に記載のアミノ酸配列
   （ｂ２）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：２６、２７、２８に記載のアミノ酸配列
   （ｂ３）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：３０、３１、３２に記載のアミノ酸配列
   （ｂ４）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：３４、３５、３６に記載のアミノ酸配列
   （ｂ５）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：３８、３９、４０に記載のアミノ酸配列
   （ｂ６）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：４２、４３、４４に記載のアミノ酸配列
   （ｂ７）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：４６、４７、４８に記載のアミノ酸配列
   （ｂ８）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：５０、５１、５２に記載のアミノ酸配列
   （ｂ９）Ｈ鎖CDR1, 2, 3が配列番号：５４、５５、５６に記載のアミノ酸配列
3. 請求項１または２に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む組成物。
4. 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患の予防および/または治療に用いられる医薬組成物である、請求項３に記載の組成物。
5. 出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患である、請求項４に記載の組成物。
6. 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血友病Aである、請求項５に記載の組成物。
7. 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子に対するインヒビターが出現している疾患である、請求項５に記載の組成物。
8. 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下ないし欠損によって発症および/または進展する疾患が、後天性血友病である、請求項５に記載の組成物。
9. 血液凝固第VIII因子および/または活性化血液凝固第VIII因子の活性の低下によって発症および/または進展する疾患が、フォンビルブランド病である、請求項５に記載の組成物。
10. 請求項１または２に記載の抗体の、請求項３〜９のいずれかに記載した組成物の製造のための使用。
11. 少なくとも請求項１または２に記載の抗体、または請求項３に記載の組成物を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を予防および/または治療する方法に用いるためのキット。
12. 少なくとも請求項１または２に記載の抗体、または請求項３に記載の組成物を含み、かつ血液凝固第VIII因子を含む、出血、出血を伴う疾患、もしくは出血に起因する疾患を、血液凝固第VIII因子と併用して、予防および/または治療する方法に用いるためのキット。

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