JP2003055398A - 血管系の特異的凝固のための方法および組成物 - Google Patents

血管系の特異的凝固のための方法および組成物

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University of Texas System
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 特異的凝固、例えば、腫瘍血管系中の凝固を
達成する使用のための、副作用が制限された新規な組成
物および方法を提供することによる、先行技術の制限を
克服、および特定の血液凝固の達成に使用される種々の
組成物および方法の提供。 【解決手段】 以下の（ａ）および（ｂ）：（ａ）疾患
細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関連支質の成
分に結合する第１結合領域；該第１結合領域が作動可能
に連結した、（ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合す
る第２結合領域、を含むリガンド。

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明の属する技術分野】本発明は、一般に、血管およ
び凝固の分野に関する。より詳細には、本発明は、特異
的凝固を達成する使用のための、二重特異性抗体を含む
種々の増殖因子ベースの試薬および免疫学的試薬を提供
する。 【０００２】 【従来の技術】過去３０年間の間に、新生物形成疾患の
化学療法における進歩が実現されてきた。これは、新し
い化学療法剤の開発、より詳細には、薬物の同時投与の
ための処法の開発におけるいくつかの進歩を含む。細胞
レベルおよび組織レベルにおける新生物形成のプロセ
ス、および基礎となる抗新生物形成剤の作用のメカニズ
ムに対する重要な理解もまた、絨毛膜ガン腫、ウイルム
ス腫瘍、急性白血病、横紋筋腫、網膜芽腫、ホジキン病
およびバーキットリンパ腫を含む、多くの新生物形成疾
患の化学療法の進歩を可能にしてきた。いくつかの腫瘍
において進歩がなされてきたが、ヒトガンの最も普通の
形態の多くはまだ、有効な化学療法の介入に抵抗してい
る。 【０００３】いずれの処置処法でも言及しなければなら
ない重要な根本的な問題は、「全細胞殺傷」の概念であ
る。この概念は、有効な処置処法を有するために、それ
が外科的アプローチまたは化学療法的アプローチのいず
れかまたはその両方であるかどうかかかわらず、全ての
いわゆる「クローン原性」悪性細胞の全細胞殺傷が存在
しなければならないこと、すなわち、制御されずに増殖
しそして任意の腫瘍塊に入れ替える能力を有する細胞が
除去され得ることを確保する。全細胞殺傷を実現する治
療剤および治療処法を開発する究極の要求のためには、
特定のタイプの腫瘍が他の腫瘍より治療しやすい。例え
ば、軟組織腫瘍（例えば、リンパ腫）、および血液およ
び血液形成器官の腫瘍（例えば白血病）は、一般に、化
学療法治療に対してガン腫のような固形腫瘍よりも応答
しやすい。 【０００４】化学療法に対する軟組織腫瘍および血液ベ
ースの腫瘍のこの感受性についての１つの理由は、化学
療法的介入に対してリンパ球および白血球が物理的に接
近しやすいからである。単純な投与では、大部分の化学
療法剤は固形腫瘍塊の全ての細胞に到達することが軟腫
瘍および血液ベースの場合よりもはるかに難しく、そし
てそれゆえ全細胞殺傷を達成することがはるかに難し
い。化学療法剤の投与量を増大することにより、しばし
ば、毒性副作用が生じる。これは、一般に従来の抗腫瘍
剤の有効性を制限する。 【０００５】成功した抗腫瘍剤を開発する戦略は、腫瘍
細胞を選択的に殺すが、正常な組織に対しては、存在し
ても比較的小さな不都合な作用しか示さない薬剤の設計
を含む。新生物形成組織と正常組織との間には定性的相
違がほとんどないため、この目標の達成は困難である。
このために、多年にわたって多くの研究は、化学療法お
よび診断の両方のための免疫学的標的として供し得る腫
瘍特異的「マーカー抗原」を同定することに集中してき
た。多くの腫瘍特異的、または準腫瘍特異的（「腫瘍関
連の」）マーカーが、特異的抗体により認識され得る腫
瘍細胞抗原として同定されてきた。不幸にも、一般に、
腫瘍特異的抗体それ自体は、基本的にガン治療に有用で
あるように十分な抗腫瘍効果を発揮しない。 【０００６】つい最近、イムノトキシンが、ガン細胞を
選択的に標的とする試みに利用された。イムノトキシン
は、特異的な標的化剤、代表的には腫瘍特異的な抗体ま
たはフラグメント（ｆｒａｇｍｅｎｔ）と細胞毒性剤
（例えば、トキシン部分）との接合体（ｃｏｎｊｕｇａ
ｔｅ）である。標的化剤は、標的にされた抗原を有する
細胞にトキシンを向け、そしてこれらの細胞を殺すよう
に設計される。「第２世代」のイムノトキシン、例え
ば、脱グリコシル化されたリシンＡ鎖を利用して肝臓に
よるイムノトキシンの取り込みを防ぎ、そして肝臓毒性
を低減するような（Ｂｌａｋｅｙら、１９８７ａ；
ｂ）、およびイムノトキシンにインビボでより高い安定
性を与える新しい架橋剤を有するような（Ｔｈｏｒｐｅ
ら、１９８８）イムノトキシンが、現在開発されてい
る。 【０００７】イムノトキシンは、マウス（Ｔｈｏｒｐｅ
ら、１９８８；Ｇｈｅｔｉｅら、１９９１；Ｇｒｉｆｆ
ｉｎら、１９８８ａ；ｂ）およびヒト（Ｖｉｔｅｔｔａ
ら、１９９１）におけるリンパ腫および白血病を処置す
る際に有効であった。しかし、リンパ系新形成は、腫瘍
細胞が血液で運ばれるイムノトキシンに比較的に接近し
やすいため、特に、イムノトキシン療法を受けやすい。
また、正常なリンパ球抗原を標的にすることも可能であ
る。なぜなら、治療の間に悪性細胞とともに殺される正
常なリンパ球は、標的抗原を欠く始原細胞から迅速に再
形成されるからである。 【０００８】リンパ腫におけるこれらの効果とは対照的
に、イムノトキシンは固形腫瘍の処置において相対的に
有効ではない（Ｗｅｉｎｅｒら、１９８９；Ｂｙｅｒｓ
ら、１９８９）。これに対する主な理由は、固形腫瘍が
一般に抗体サイズ分子に対して不透過性であることであ
る：注入投与量／ｇ腫瘍の０．００１％未満の比取込み
値はヒトの研究にはまれではない（Ｓａｎｄｓら、１９
８８；Ｅｐｅｎｅｔｏｓら、１９８６）。別の重要な問
題は、抗原欠損変異体がイムノトキシンによる殺傷から
のがれ、そして再増殖し得ることである（Ｔｈｏｒｐｅ
ら、１９８８）。 【０００９】さらに、腫瘍塊に侵入する抗体は、いくつ
かの理由により均一に分布しない。第１に、腫瘍細胞の
密なパッキングおよび繊維状の腫瘍支質が、高分子輸送
に対して圧倒的な物理的バリアーを示し、そしてリンパ
球による排出がないことと組み合わされて、腫瘍コアで
浸出および液体対流を低減する高い割り込み圧力を作り
出す（Ｂａｘｔｅｒら、１９９１；Ｊａｉｎ、１９９
０）。第２に、大部分の腫瘍における血管の分布は、組
織化されておらずかつ不均一であり、これにより、いく
つかの腫瘍細胞は、大きな拡散距離により、浸出する抗
体から分離される（Ｊａｉｎ、１９９０）。第３に、腫
瘍に侵入する抗体の全てが、脈管周囲領域において、最
初に遭遇する腫瘍細胞により吸着され得、より遠い部位
の腫瘍細胞に到着するものをなくする（Ｂａｘｔｅｒ
ら、１９９１；Ｋｅｎｎｅｌら、１９９１）。 【００１０】従って、固形腫瘍の処置のための新規戦略
の開発に対する顕著な必要性が存在することは明らかで
ある。１つのアプローチは、腫瘍細胞よりもむしろ腫瘍
の血管系に薬剤を標的化することを含む。固形腫瘍の増
殖は、腫瘍の血管形成に高度に依存し、そして腫瘍細胞
の増殖は、酸素、栄養素および他の増殖因子の供給、お
よび代謝産物の流出が満足される場合のみ維持され得
る。実際、多くの現存する療法は、それらの作用の一部
として、血管媒介の作用メカニズムを有し得ることが既
に観察されている（Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９９０）。 【００１１】本発明者らは、血管系を標的にすること
は、腫瘍から生命維持事象を奪い、そして腫瘍の増殖速
度を低下させ、または腫瘍細胞の死をもたらすようであ
ることを提案する。このアプローチは、腫瘍細胞を直接
標的にすることに対していくつかの利点を与えることが
期待される。第１に、標的細胞は、静脈内投与された治
療剤に直接に接近し得、それにより、注入された投与量
の高い割合を迅速に局在化することを可能にする（Ｋｅ
ｎｎｅｓら、１９９１）。第２に、毛細管のそれぞれが
腫瘍を取り込む「コード（ｃｏｒｄ）」中で数千の細胞
に酸素および栄養素を提供するため、腫瘍血管系に対す
る限られた損傷でさえ、腫瘍細胞死の雪崩を生じる（Ｄ
ｅｎｅｋａｍｐ、１９９０；Ｄｅｎｅｋａｍｐ、１９８
４）。最後に、標的抗原を欠く変異体内皮細胞の外殖
（ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ）は有りそうもない。これらは正
常細胞だからである。 【００１２】現時点では、腫瘍血管の標的化を成功させ
るため、正常組織中の内皮細胞ではなく、腫瘍の内皮細
胞を認識する抗体が必要であることが一般に受け入れら
れている。数種の抗体が開発されたが（Ｄｕｉｊｖｅｓ
ｔｉｊｎら、１９８７；Ｈａｇｅｍｅｉｅｒら、１９８
６；Ｂｒｕｌａｎｄら、１９８６；Ｍｕｒｒａｙら、１
９８９；Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎら、１９８５）、い
ずれも高度な特異性を示さなかった。また、血管を標的
にする抗体接合体中の第２の薬剤として有望な任意の特
定の薬剤は、上記トキシン以外には報告されていないよ
うである。従って、不幸にも、血管を標的にすることは
一定の理論的利点を示すが、これらの利点を取り込む有
効な戦略はまだ開発されていない。 【００１３】 【発明が解決しようとする課題】本発明は、特異的凝
固、例えば、腫瘍血管系中の凝固を達成する使用のため
の、副作用が制限された新規な組成物および方法を提供
することにより、先行技術の制限を克服する。本発明
は、一般的および全体的意味では、疾患に関連する血管
系中の凝固を刺激し得る種々の新規な免疫学的因子およ
び増殖因子ベースの二重特異性組成物、ならびにこれら
の調製方法および使用方法を提供する。 【００１４】 【課題を解決するための手段】本発明は、一般に「二重
特異性結合リガンド」として記載され得る結合リガンド
を提供する。このようなリガンドは、代表的には、疾患
と関連する標的細胞（例えば、腫瘍細胞）、またはこの
ような細胞と関連する成分；疾患と関連する血管系（例
えば、腫瘍血管系）に関連する特定の成分；あるいは疾
患と関連する支質の成分またはそれと関連する成分に結
合する「第１結合領域」を含む。第１結合領域は、凝固
因子それ自身であり得るか、または凝固因子に結合し得
る第２結合領域であり得る「凝固剤」と作動可能に会合
するかまたは連結される。 【００１５】本発明の結合リガンドは、「二重特異性」
として記載される。なぜなら、これらは「少なくとも」
二重特異性であり、すなわち、これらは最小でも２つの
機能的に異なる領域を含むからである。他の構築物（例
えば、三重特異性および多重特異性の結合リガンド）を
使用する組成物および方法もまた、本発明の範囲内に含
まれる。本明細書中に記載の二重特異性凝固リガンド
を、他のエフェクター（例えば、他の免疫学的因子およ
び増殖因子ベースの組成物、抗原誘発剤、免疫刺激剤、
免疫抑制剤、化学療法薬物など）とともに使用する、組
み合わせ組成物、キットおよび方法もまた意図される。 【００１６】第１結合領域および任意の第２結合領域
は、抗体またはそのフラグメントであり得る。本明細書
中で使用される用語「抗体」とは、任意の免疫学的結合
剤（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩ
ｇＥ）を広く意味することが意図される。一般に、Ｉｇ
ＧまたはＩｇＭが好ましい。なぜなら、これらは、生理
学的状態で最も一般な抗体であり、そしてこれらは実験
室設定中で最も容易に作製されるからである。モノクロ
ーナル抗体（ＭＡｂ）は、一定の利点（例えば、再生産
性および大規模生産）を有し、そしてそれらの使用が一
般に好ましいことが認識されている。操作された抗体
（例えば、組換え抗体およびヒト化された抗体）もま
た、本発明の範囲内に入る。 【００１７】抗体の抗原結合領域が結合および標的化剤
として利用される場合、完全な抗体分子が利用され得
る。あるいは、抗体のＦｖ、ｓｃＦｖ（一重鎖Ｆｖ）、
Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＤａｂまたはＦ（ａｂ’）２フラグ
メントにより例示されるように機能的な抗原結合領域が
使用され得る。種々の抗体ベースの構築物を調製および
使用する技術は、該当分野で周知であり、そして本明細
書にさらに記載されている。 【００１８】結合リガンドの凝固因子部分は、それが有
意な機能的能力を維持するように形成され、すなわち、
結合リガンドの凝固因子部分は、標的領域に送達される
ときに、それがまだ血液凝固または血餅形成を促進する
その能力を保持するような形態である。しかし、特定の
実施態様では、結合リガンドの凝固因子部分は、例え
ば、コアギュラントの天然の相応物よりも活性が少な
く、そしてこの因子は、標的領域への送達に際してのみ
所望のレベルの活性を達成する。このような例の１つ
は、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子である
が、これは、膜環境への二重特異性リガンドの第１結合
領域の結合に際して有意な機能的活性を達成する。 【００１９】第２結合領域が凝固因子に結合するために
使用される場合、これは、一般に、凝固を誘導するその
能力を有意に損害しない凝固因子上の部位を認識するよ
うに選択される。同様に、凝固因子が第１結合剤に共有
結合する場合、その機能的凝固部位と異なる部位が、一
般に、分子を連結するために使用される。 【００２０】本発明の二重特異性リガンドの「第１結合
領域」は、指定の標的部位、すなわち、凝固が必要とさ
れる腫瘍領域または他の疾患部位と関連する部位に結合
する任意の成分であり得る。標的分子は、腫瘍を標的に
する場合、一般に、腫瘍部位中では非腫瘍部位中よりも
高い濃度で存在する。特定の好ましい実施態様では、標
的分子は、腫瘍細胞、腫瘍血管細胞、腫瘍関連支質、ま
たは他の成分と関連するかどうかにかかわらず、このよ
うな細胞または他の腫瘍関連の実体に制限される。しか
し、これは、本発明の要件ではない。 【００２１】この点に関して、腫瘍血管系は、「プロト
ロンボチック（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ）」であ
り、そして凝固する傾向にあることに注意されべきであ
る。従って、標的コアギュラントは、腫瘍血管系を優先
的に凝固させるが、たとえ他の正常細胞または体成分、
特に、正常な内皮細胞または支質でさえもが標的分子の
有意なレベルを発現しても、正常組織の血管系を凝固さ
せないことが意図される。従って、このアプローチは、
例えば、ガンの処置手段として、ヒトでの使用が、腫瘍
血管系にトキシンを標的づける使用よりも安全であると
考えられる。 【００２２】特定の実施態様では、本発明における使用
のために意図される第１結合領域は、腫瘍細胞成分また
は腫瘍細胞と関連する成分に関し得る。一般に、腫瘍細
胞を標的にする際、第１結合リガンドは、二重特異性結
合リガンドの凝固因子成分を、血管に最も近い血管周囲
の腫瘍細胞上に濃縮し、それにより、腫瘍血管の凝固の
引金となり、二重特異性結合リガンドに有意な有用性を
与えると考えられる。 【００２３】従って、第１結合領域は、腫瘍細胞に結合
する抗体または他の薬剤のような成分であり得る。「腫
瘍細胞に結合する」薬剤は、本明細書中で任意の接近可
能な成分または腫瘍細胞の成分に結合するリガンドとし
て、あるいは本明細書にさらに記載されるように、それ
自身が腫瘍細胞に結合するかまたは腫瘍細胞と関連する
成分に結合するリガンドとして定義される。 【００２４】このような腫瘍結合リガンドの大多数は、
細胞表面腫瘍抗原またはマーカーに結合する薬剤、特に
抗体であることが意図される。このような抗原の多く
は、抗原結合および腫瘍標的化における使用のための種
々の抗体が存在するように、公知である。従って、本発
明は、表Ｉに例示されるような同定された腫瘍細胞表面
抗原に結合する第１結合領域（例えば、抗体の抗原結合
領域）、および表ＩＩに例示される腫瘍細胞への結合の
ようなインタクトの腫瘍細胞に優先的にまたは特異的に
結合する第１結合領域を含む。 【００２５】現在、腫瘍細胞結合領域の好ましい例は、
細胞表面腫瘍抗原ｐ１８５ＨＥＲ２、乳汁ムチンコアタ
ンパク質（ｍｉｌｋ ｍｕｃｉｎ ｃｏｒｅ ｐｒｏｔ
ｅｉｎ）、ＴＡＧ−７２、ルイスａまたはガン胎児性抗
原（ＣＥＡ）に結合する抗体の抗原結合領域を含む領域
である。現在好ましい腫瘍細胞結合領域の別のグループ
は、抗体９．２．２７、ＯＶ−ＴＬ３、ＭＯｖ１８、Ｂ
３、ＫＳ１／４、２６０Ｆ９またはＤ６１２に結合す
る、腫瘍関連抗原に結合する抗体の抗原結合性領域を包
含する領域である。 【００２６】抗体９．２．２７は高分子量（Ｍｒ）のメ
ラノーマ抗原に結合し、ＯＶ−ＴＬ３およびＭＯｖ１８
の両方は卵巣関連の抗原に結合し、Ｂ３およびＫＳ１／
４はガン腫抗原に結合し、２６０Ｆ９は乳房ガン腫に結
合し、そしてＤ６１２は結腸直腸ガン腫に結合する。Ｄ
６１２、Ｂ３またはＫＳ１／４と同じ抗原に結合する抗
原結合部分が特に好ましい。Ｄ６１２は米国特許第５，
１８３，７５６号に記載されており、ＡＴＣＣ受託番号
ＨＢ９７９６を有し；Ｂ３は米国特許第５，２４２，８
１３号に記載されており、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ１０５
７３を有し；そして組換えおよびキメラＫＳ１／４抗体
は米国特許第４，９７５，３６９号に記載されており；
それぞれは参考として本明細書中に援用される。 【００２７】腫瘍細胞標的化において、腫瘍マーカー
が、生物学的リガンドが同定されている成分（例えば、
レセプター）である場合、抗体よりもむしろこのリガン
ド自体がまた標的化剤として利用され得る。このような
リガンドの活性フラグメントまたは結合領域もまた利用
され得る。 【００２８】本発明における使用のための第１結合領域
はまた、腫瘍細胞マーカーと関連するリガンドに結合す
る成分であり得る。例えば、目的の腫瘍抗原が細胞表面
レセプターである場合、インビボの腫瘍細胞は、それら
の表面に結合しそして標的として利用可能な、対応する
生物学的リガンド（例えば、ホルモン、サイトカインま
たは増殖因子）を有する。これは、腫瘍細胞によって生
成され、続いてこの細胞の表面に結合され得る循環性リ
ガンドおよび「パラ分泌型」リガンドの両方を含む。 【００２９】従って、本発明はさらに、同定された腫瘍
細胞表面抗原（表Ｉに例示されるような）に結合するリ
ガンドに結合するか、あるいは１つまたはそれ以上のイ
ンタクトの腫瘍細胞に優先的にまたは特異的に結合する
第１結合領域（例えば、抗体およびそのフラグメント）
を包含する。さらに、レセプター自体、または好ましく
はレセプターまたはレセプター結合ドメインの操作され
た形態または可溶性形態もまた二重特異性凝固リガンド
の結合領域として利用され得る。 【００３０】さらなる実施態様では、第１結合領域は、
腫瘍部位以外の疾患部位で特異的または優先的に発現さ
れる標的分子に結合する成分であり得る。他の疾患細胞
と関連する代表的な標的分子は、例えば、良性前立腺肥
大症（ＢＰＨ）と関連するＰＳＡおよび増殖性糖尿病性
網膜症と関連するＦＧＦを含む。上記の疾患の１つを有
する動物または患者は、疾患部位における凝固の特異的
誘発から恩恵を受け得ると考えられる。 【００３１】本明細書の文脈中では「疾患細胞」の意味
は、疾患または障害と関連した細胞である。この細胞
は、非疾患の部位および細胞中のレベルに比べて、疾患
の部位および細胞中でより高い濃度で存在する標的可能
な成分を発現するかまたはそれと関連する。これは、疾
患部位中の血管系と関連する標的可能な成分を含む。 【００３２】他の疾患部位にコアギュラントを標的づけ
かつ送達する使用のための代表的な第１結合領域は、抗
体（例えば、抗−ＰＳＡ（ＢＰＨ）、およびＦＧＦに結
合するＧＦ８２、ＧＦ６７ ３Ｈ３）を含む。対応する
レセプター（この場合はＦＧＦレセプター）に結合する
生物学的結合リガンド（例えば、ＦＧＦ）もまた使用さ
れ得る。以下に記載されるように、血管標的に対する抗
体もまた使用され得る。支質または内皮細胞の標的化
は、他の疾患を処置する強力な手段を提供し、ここで
「疾患細胞」自体は強力または独特なマーカー抗原と関
連しなくても良い。 【００３３】さらなる実施態様では、本発明の第１結合
領域は、疾患関連の血管系、すなわち、特異的凝固が動
物または患者に有利であり得る血管系の領域の成分に結
合し得る成分である。腫瘍血管系と特異的または優先的
に関連する成分に結合し得る第１結合領域が、現時点で
は好ましい。「腫瘍血管系の成分」は、腫瘍血管系内皮
細胞表面分子および細胞表面レセプターまたは分子に結
合し得る任意の成分（例えば増殖因子）の両方を含む。 【００３４】特定の好ましい結合リガンドは、細胞表面
レセプターに結合する抗体およびそのフラグメント、な
らびにこれらのレセプターの対応する生物学的リガンド
に結合する抗体である。代表的な抗体は、ＭＨＣクラス
ＩＩタンパク質、ＶＥＧＦ／ＶＰＥレセプター、ＦＧＦ
レセプター、ＴＧＦβレセプター、ＴＩＥ（ＴＩＥ−１
およびＴＩＥ−２を含む、チロシンキナーゼ−免疫グロ
ブリン−上皮増殖因子様レセプター）、ＶＣＡＭ−１、
Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、αｖβ３インテグリ
ン、プレイオトロピン（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｎ）、エ
ンドシアリン（ｅｎｄｏｓｉａｌｉｎ）およびエンドグ
リン（ｅｎｄｏｇｌｉｎ）に結合する抗体である。 【００３５】エンドグリンに結合する抗体の抗原結合領
域を含む第１結合領域は、好ましい薬剤の１群である。
これらは、モノクローナル抗体ＴＥＣ−４またはモノク
ローナル抗体ＴＥＣ−１１と同じエピトープに結合する
抗体およびフラグメントにより代表される。 【００３６】ＶＥＧＦレセプターに結合する抗体の抗原
結合領域は、好ましい薬剤の別の群である。これらは、
特に、モノクローナル抗体３Ｅ１１、３Ｅ７、５Ｇ６、
４Ｄ８、１０Ｂ１０またはＴＥＣ−１１０と同じエピト
ープに結合する抗体またはフラグメントにより代表され
る。以下のように名付けた抗体の任意の１つと実質的に
同じ結合特異性を有する抗−ＶＥＧＦ抗体もまた使用さ
れ得る：１Ｂ４、４Ｂ７、１Ｂ８、２Ｃ９、７Ｄ９、１
２Ｄ２、１２Ｄ７、１２Ｅ１０、５Ｅ５、８Ｅ５、５Ｅ
１１、７Ｅ１１、３Ｆ５、１０Ｆ３、１Ｆ４、２Ｆ８、
２Ｆ９、２Ｆ１０、１Ｇ６、１Ｇ１１、３Ｇ９、９Ｇ１
１、１０Ｇ９、ＧＶ９７、ＧＶ３９、ＧＶ９７γ、ＧＶ
３９γ、ＧＶ５９またはＧＶ１４。さらに適切な抗ＶＥ
ＧＦ抗体は、４．６．１．、Ａ３．１３．１、Ａ４．
３．１およびＢ２．６．２（Ｋｉｍら、１９９２）；Ｓ
ＢＳ９４．１（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）；
Ｇ１４３−２６４およびＧ１４３−８５６（Ｐｈａｒｍ
ｉｎｇｅｎ）を含む。 【００３７】さらに有用な抗体は、腫瘍血管系細胞表面
レセプターに結合するリガンドに結合する抗体である。
従って、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβに結合す
る抗体、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連のイソ型
フィブロネクチン、スキャッター因子（ｓｃａｔｔｅｒ
ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血小板
因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦ（ＰＤＧＦａおよびＰＤＧ
Ｆｂを含む）およびＴＩＭＰ（メタロプロテイナーゼの
組織インヒビター、ＴＩＭＰ−１、ＴＩＭＰ−２および
ＴＩＭＰ−３を含む）は、これらの実施態様で有用であ
り、そのうち、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβに
結合する抗体、ＴＩＥに結合するリガンドまたは腫瘍関
連イソ型フィブロネクチンがしばしば好ましい。 【００３８】さらに別の実施態様では、腫瘍血管系に特
異的なマーカーは、最初に誘導された、すなわち、それ
の発現が人間の手によって特異的に操作されたマーカー
であり得、それにより、結合リガンド（例えば、抗体）
を用いる次の標的化を可能にする。 【００３９】代表的な誘導性抗原は、単核細胞、マクロ
ファージ、肥満細胞、ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８−陽性Ｔ
細胞、ＮＫ細胞または腫瘍細胞によってさえ放出され得
るような、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−
４、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたはＩＦＮ−γ）により
誘導性抗原を含む。誘導された標的の例は、Ｅ−セレク
チン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、エンドグリンおよ
びＭＨＣクラスＩＩ抗原である。ＭＨＣクラスＩＩ誘導
を使用する場合、正常組織中のＭＨＣクラスＩＩの抑制
が、シクロスポリン（例えば、シクロスポリンＡ（Ｃｓ
Ａ）、または機能的に等価な薬剤）を用いて達成され得
るように、一般に必要とされる。 【００４０】さらに誘導性抗原は、コアギュラント（例
えば、トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因
子、プラスミンまたはメタロプロテイナーゼ（マトリッ
クスメタロプロテイナーゼ、ＭＭＰ））によって誘導性
抗原を含む。一般に、トロンビンによって誘導性抗原が
使用される。この群の抗原は、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セ
レクチン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−１を含み、そのう
ち、Ｐ−セレクチンおよび／またはＥ−セレクチンの誘
導および標的化が一般に好ましい。 【００４１】リガンド−レセプター複合体（ｃｏｍｐｌ
ｅｘ）に存在するが、個々のリガンドおよびレセプター
の両方には存在しないエピトープに結合する抗体もまた
使用され得る。このような抗体は、細胞表面に存在する
リガンド−レセプター複合体を認識し、かつそれに結合
するが、遊離のリガンドまたは複合体化されていないレ
セプターには結合しない。従って、本明細書中で使用さ
れる「リガンド−レセプター複合体」は、リガンド（例
えば、増殖因子）がそのレセプター（例えば、増殖因子
レセプター）に特異的に結合する場合に生成される結果
としての複合体を意味する。これは、ＶＥＧＦ／ＶＥＧ
Ｆレセプター複合体により代表される。 【００４２】このようなリガンド−レセプター複合体
は、腫瘍に関連しない内皮細胞よりも腫瘍関連の内皮細
胞上で有意に多い数で存在するようであり、それゆえ、
抗複合体抗体により標的化され得ることが期待される。
抗複合体抗体は、モノクローナル抗体２Ｅ５、３Ｅ５ま
たは４Ｅ５と同じエピトープに結合するような抗体およ
びそのフラグメントを含む。 【００４３】さらなる実施態様では、本発明における使
用のために意図される第１結合領域は、疾患関連の支質
の成分（例えば、腫瘍関連の支質の成分）に結合する。
これは、基底膜成分、活性された血小板および誘導性の
腫瘍支質成分、特にコアギュラント（例えば、トロンビ
ン）によって誘導性の成分に結合する抗体の抗原結合領
域を含む。「活性化された血小板」は、本明細書では腫
瘍支質の成分として定義され、その理由の１つは、それ
らが活性されるときに支質に結合することである。 【００４４】腫瘍関連支質の好ましい標的可能な要素
は、現在のところ、腫瘍関連イソ型フィブロネクチンで
ある。イソ型フィブロネクチンは、インテグリンファミ
リーのレセプターに結合するリガンドである。腫瘍関連
のイソ型フィブロネクチンは、例えば、ＭＡｂ ＢＣ−
１によって認識されるように利用可能である。従って、
このＭａｂ、および類似の特異性を有する他のＭａｂ
は、本発明における使用のために好ましい薬剤である。
イソ型フィブロネクチンは、支質成分であるが、内皮細
胞に結合し、それゆえ、本発明の文脈では標的可能な血
管内皮細胞結合リガンドとして考慮され得る。 【００４５】好ましい抗支質抗体の別の群は、フィブリ
ノーゲン上のＲＩＢＳ（レセプター誘導結合部位）に結
合する抗体である。ＲＩＢＳは、標的可能な抗原であ
り、支質におけるＲＩＢＳの発現は活性化された血小板
によって指示される。活性化された血小板上のリガンド
誘導結合部位であるＬＩＢＳに結合する抗体もまた有用
である。 【００４６】有用な抗体のさらなる群の１つは、種々の
良性および悪性の腫瘍の支質で発現される高分子量の細
胞外糖タンパク質であるテネイシンに結合する抗体であ
る。それゆえ、Ｓｈｒｅｓｔｈａら（１９９４）に記載
されるような抗体およびＴｕｏｍｉｎｅｎ ＆ Ｋａｌ
ｌｉｏｉｎｅｎ（１９９４）により記載される１４３Ｄ
Ｂ７Ｃ８は、コアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉｇａｎ
ｄ）の結合部分として使用され得る。 【００４７】「疾患および腫瘍関連の支質の成分」は、
種々の細胞型、マトリックス成分、エフェクター、およ
びそのいくつかが「支質」の最も狭い定義から外れると
考えられ得る他の分子成分を含むが、疾患領域（例え
ば、腫瘍）と優先的に関連する標的可能な実体である。 【００４８】従って、第１結合領域は、平滑筋細胞、周
囲細胞（ｐｅｒｉｃｙｔｅ）、繊維芽細胞、マクロファ
ージ、浸潤性リンパ球または白血球に結合する抗体また
はリガンドであり得る。第１結合領域はまた、結合組織
の成分に結合し得、そして例えば、フィブリン、プロテ
オグリカン、糖タンパク質、コラーゲン、およびアニオ
ン性ポリサッカライド（例えば、へパリンおよびへパリ
ン様化合物）に結合する抗体およびリガンドを含む。 【００４９】他の好ましい実施態様では、本発明の血管
系および支質結合リガンドは、それら自体が抗体である
よりもむしろ生物学的なリガンドまたはその一部分であ
る結合領域である。この意味では、「生物学的なリガン
ド」は、サイトカイン、ホルモン、増殖因子などにより
代表されるように、細胞表面分子（例えば、レセプタ
ー）に結合するかまたはこれと会合し、支質中または血
管細胞上に接近可能な分子である。任意のそのような増
殖因子またはリガンドが、それが疾患関連の支質または
血管系、例えば、腫瘍血管系内皮細胞の表面上に存在す
る特異的生物学的レセプターに結合する限り、使用され
得る。 【００５０】本発明のこれらの局面における使用のため
の適切な増殖因子は、例えば、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（血管
内皮増殖因子／血管透過性因子）、ＦＧＦ（タンパク質
の繊維芽細胞増殖因子ファミリー）、ＴＧＦβ（形質転
換増殖因子Ｂ）、ＴＩＥに結合するリガンド、腫瘍関連
のイソ型フィブロネクチン、スキャッター因子（ｓｃａ
ｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）、血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦ（血小板由来
の増殖因子）、ＴＩＭＰまたはＩＬ−８、ＩＬ−６また
はＸＩＩＩａ因子さえを含む。ＶＥＧＦ／ＶＰＦおよび
ＦＧＦがしばしば好ましい。 【００５１】公知のレセプターに基づいた結合リガンド
構築物を用いて内皮細胞結合成分（例えば、サイトカイ
ンまたは増殖因子）を標的にすることもまた意図され
る。一般に、レセプターが標的化成分として使用される
場合、レセプターの短縮型または可溶性形態が利用され
得る。このような実施態様では、標的化された内皮細胞
結合成分が二量体リガンド（例えば、ＶＥＧＦ）である
ことが特に好ましい。これが好ましい理由は、二量体の
１つ成分が既に細胞表面レセプターにインサイチュで結
合され、二量体の他の成分を二重特異性の凝固リガンド
の可溶性レセプター部分に結合するために利用されるよ
うに残すからである。 【００５２】疾患関連の血管系の成分に結合し得る少な
くとも１つの標的化領域を含む二重特異性、あるいは三
重または多重特異性リガンドは、血管内皮細胞、および
疾患関連の薬剤（例えば、活性化された血小板）が、異
なる疾患において（特に異なる腫瘍において）類似して
いるという利点を有する。この現象は、個々の疾患また
は特異的な腫瘍タイプのそれぞれに薬剤を合わせなけれ
ばならないよりも、多くの疾患およびガンのタイプを１
種の薬品で処置することを実行可能にする。 【００５３】それゆえ、本発明の組成物および方法は、
血管成分を有する良性および悪性疾患を処置するための
使用に適切である。このような血管系関連疾患は、良性
増殖（例えば、ＢＰＨ）、糖尿病性網膜症、血管再狭
窄、動静脈性奇形（ＡＶＭ）、髄膜腫、血管腫、血管新
生緑内障および乾癬を含む。さらにこの群に含まれるの
は、滑膜炎、皮膚炎、子宮内膜炎、血管繊維腫、慢性関
節リウマチ、アテロマ硬化斑、角膜移植新血管化、血友
病性関節、過形成性瘢痕、ｏｓｌｅｒ−ｗｅｂｅｒ症候
群、化膿性肉芽腫、水晶体後繊維増殖、硬皮症、トラコ
ーマおよび血管癒着である。上記疾患のそれぞれは、共
通の血管依存性病理学を有することが知られ、それゆ
え、これは、疾患部位において凝固を達成することが有
益であり得ることが意図される。 【００５４】本発明の二重特異性結合リガンド−凝固因
子接合体は、例えば、生化学的架橋剤、および好ましく
は、ＳＭＰＴにより代表されるように、血中においてか
なりの安定性を有するものを使用することにより、２つ
またはそれ以上成分が共有結合される接合体であり得
る。これらの成分はまた、周知のアビジン（またはスト
レプトアビジン）およびビオチンの組み合わせを使用し
て連結され得る。種々の架橋剤、アビジン：ビオチン組
成物および組み合わせ、ならびに接合体を調製する技術
は、当該分野で周知であり、そして本明細書にさらに記
載される。 【００５５】あるいは、このような二重特異性凝固剤
は、分子生物学的技術、即ち、結合リガンドまたは領域
をコードする遺伝子（またはｃＤＮＡ）を凝固因子をコ
ードする遺伝子（またはｃＤＮＡ）に連結することによ
り調製される融合タンパク質であり得る。このことは当
該技術分野で周知であり、そして本明細書でさらに記載
される。代表的には、凝固因子をコードするＤＮＡセグ
メントに作動可能に連結された第１の結合領域をコード
するＤＮＡセグメントを同じリーディングフレームで含
む発現ベクターが調製され、そして組換え宿主細胞がコ
ードされた融合タンパク質を産生するようにこのベクタ
ーを発現する。 【００５６】本発明で使用するための凝固因子は、第Ｉ
Ｉ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／Ｉ
Ｘａ因子または第Ｘ／Ｘａ因子のような、ビタミンＫ依
存性凝固因子の１つを含み得る。第Ｖ／Ｖａ因子、第Ｖ
ＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩ
Ｉ／ＸＩＩａ因子および第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因子も
また用いられ得る。 【００５７】特定の局面は、Ｇｌａ改変を欠くビタミン
Ｋ依存性凝固因子に関する。このような因子は、ビタミ
ンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子を、原核生物宿
主細胞中（この細胞はＧｌｕからＧｌａへの改変を行う
ことができない）で発現することにより調製され得る。
この因子はまた、必要なまたは「対応する」グルタミン
酸残基を欠いているビタミンＫ依存性凝固因子をコード
する遺伝子操作された凝固因子遺伝子を作成し、次い
で、この遺伝子操作された遺伝子を、実際に、任意の組
換え宿主細胞で発現することにより調製され得る。同様
に、このような凝固因子はまた、ビタミンＫ依存性凝固
因子タンパク質を処理して対応するグルタミン酸残基を
除去または改変することにより調製され得る。 【００５８】本発明の結合リガンドに使用される好まし
い凝固因子は、組織因子および組織因子誘導体である。
有用な組織因子の１つのグループは、第ＶＩＩ因子を活
性化する能力を欠く変異体である。組織因子は、一般に
アミノ酸配列の約１５７位と約１６７位との間の領域に
由来する１つまたはそれ以上のアミノ酸を改変すること
により第ＶＩＩ因子を活性化する能力における欠損を与
え得る。例示の変異体は、１５８位のＴｒｐがＡｒｇ
に；１６２位のＳｅｒがＡｌａに；１６４位のＧｌｙが
Ａｌａに変化した変異体；ならびに１５８位のＴｒｐが
Ａｒｇに、かつ１６２位のＳｅｒがＡｌａに変化した二
重変異体である。 【００５９】さらに好ましい組織因子誘導体は、短縮型
組織因子、二量体またはなお多量体の組織因子、および
二量体またはなお多量体の短縮型組織因子である。 【００６０】本発明は、少なくとも１つの他の組織因子
または誘導体に作動可能に連結された組織因子または誘
導体を含む新規な組織因子構築物をさらに提供する。短
縮型組織因子が好ましく、短縮型の組織因子が改変され
て疎水性膜挿入部分を含む場合が特に好ましい。 【００６１】本明細書で規定されるように「疎水性膜挿
入部分」は、組織因子の膜への挿入または膜との機能的
接触を指向する１つまたはそれ以上のユニットである。
本発明の疎水性膜挿入部分は、約３と約２０との間の疎
水性アミノ酸のような実質的に疎水性のアミノ酸の連続
部分により；および脂肪酸によっても例示される。 【００６２】疎水性アミノ酸は、短縮型組織因子のＮ末
端もしくはＣ末端に配置され得るか、または分子の別の
点に付加され得るかのいずれかである。疎水性アミノ酸
が用いられる場合、これらは、有利には、分子生物学的
技術により分子中に組み込まれ得る。同様に、疎水性ア
ミノ酸または脂肪酸は、合成化学技術を用いて組織因子
に付加され得る。 【００６３】本発明の組織因子二量体、三量体および多
量体では、組織因子または誘導体の各々は、例えば、ジ
スルフィド、チオエーテルまたはペプチド結合を介して
作動可能に連結され得る。ある実施態様では、組織因子
ユニットは、その使用が意図される血漿中、または生理
学的環境中で実質的に安定である結合を介して連結され
る。これは、組織因子の二量体形態が生物学的に最も活
性であることが証明され得るという本発明者らの思想に
基づく。しかし、本発明の方法では、組織因子単量体が
活性であることが知られているように、安定な結合が必
要な訳ではない。 【００６４】二量体および多量体中の１つまたはそれ以
上の組織因子または短縮型組織因子はまた、改変され
て、結合領域のような第２の薬剤に組織因子構築物を連
結するために適切である末端システイン残基または別の
部分を含み得る。 【００６５】従って、選択的に切断可能なアミノ酸配列
を含むペプチドを含む、組織因子単量体、短縮型組織因
子、および組織因子二量体ならびに多量体は、本発明の
別の局面を形成する。ウロキナーゼ、プラスミン、トロ
ンビン、第ＩＸａ因子、第Ｘａ因子、または間質コラゲ
ナーゼ、ゼラチナーゼ（ｇｅｌａｔｉｎａｓｅ）、また
はストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎ）のような
メタロプロテイナーゼに対する切断部位を含むペプチド
リンカーが特に好ましい。 【００６６】従って、組織因子単量体、短縮型組織因
子、組織因子二量体および多量体、ならびに実際任意の
コアギュラントを、生物学的に放出可能な結合を介し
て、抗体、抗体の抗原結合領域、リガンド、またはレセ
プターのような第２の薬剤に連結し得る。上記の列挙し
たプロテイナーゼに対する切断部位を含むペプチドリン
カーの選択は、例えば、腫瘍環境内のそのようなプロテ
イナーゼの存在に基づく。腫瘍部位に対する二重特異性
薬剤またはリガンドの送達は、切断を生じると予想さ
れ、凝固因子の相対的に特異的な放出を生じる。 【００６７】本発明の特定の構築物は、その配列中に作
動可能に連結した一連の以下のユニットを含む構築物で
ある：システイン残基、選択的に切断可能なペプチドリ
ンカー、疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮型組織
因子、および第２の短縮型組織因子；または配列中に：
第１のシステイン残基、選択的に切断可能なペプチドリ
ンカー、疎水性アミノ酸の第１の連続部分、第１の短縮
型組織因子、第２の短縮型組織因子、および疎水性アミ
ノ酸の第２の連続部分；ここで各構築物は、抗体、リガ
ンドまたはレセプターのような第２の薬剤に連結されて
もよく、または連結されなくてもよい。 【００６８】他の適切な凝固因子は、ラッセルクサリヘ
ビ蛇毒Ｘ因子アクチベーター；トロンボキサンＡ２およ
びトロンボキサンＡ２シンターゼのような血小板活性化
化合物；およびα２−抗プラスミンのようなフィブリン
溶解のインヒビターである。 【００６９】凝固因子が複合体に共有結合しないが、構
築物の標的化物に作動可能に連結している第２の結合領
域への結合手段により非共有結合する結合リガンドもま
た、本発明に包含される。適切な「第２の結合領域」
は、凝固因子に対して結合特異性を有する抗体の抗原結
合部位を含み、これには、ＳｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントのような、抗
体の機能的部分が含まれる。 【００７０】従って、ビタミンＫ依存性凝固第ＩＩ／Ｉ
Ｉａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因
子、または第Ｘ／Ｘａ因子；Ｇｌａ改変を欠くビタミン
Ｋ依存性凝固因子；組織因子、変異体組織因子、短縮型
組織因子、二量体組織因子、多量体組織因子、二量体短
縮型組織因子；プレカリクレイン；第Ｖ／Ｖａ因子、第
ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第Ｘ
ＩＩ／ＸＩＩａ因子、および第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因
子；ラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーター、ト
ロンボキサンＡ２またはα２−抗プラスミンに対して指
向された抗体、またはそれらのフラグメントを含む結合
リガンドが考慮される。 【００７１】非共有結合した凝固剤は、凝固因子に結合
され得るか、または凝固因子と「予め複合体化」され
得、それらを用いて、投与の際に、外因性凝固因子を動
物の疾患部位（例えば腫瘍血管系）に送達し得る。同様
に、凝固因子に特異的な第２の結合領域を含む結合リガ
ンドもまた、「非複合体化」形態および特異的凝固をな
お達成する機能で動物に投与され得る；この例では、薬
剤は、循環（内因性）凝固因子を蓄積し得、そしてそれ
を疾患部位または腫瘍部位内に濃縮する。 【００７２】用語「凝固因子」または凝固剤は、内因性
凝固因子およびその誘導体、または組換え型を含む外か
ら添加された型のこのような因子であり得る。コアギュ
ラント（本発明の「コアギュリガンド（ｃｏａｇｕｌｉ
ｇａｎｄ）」）は、トキシン（イムノトキシン）に対し
て明確な利点を有する。何故なら、これらは、１００％
疾患に限定されないことがわかるマーカーを標的にする
際、顕著な有害な副作用を生じないからである。さら
に、用いられるコアギュラントは、ほとんどの場合ヒト
起源であり、そしてそれ故、リシンＡ鎖のような外来ト
キシンより免疫原性の問題が少ないからである。 【００７３】このような組成物に制限されないが、本発
明に従った組成物の重要な例は、二重特異性抗体であ
り、この抗体は、疾患細胞または疾患関連血管系マーカ
ーの成分に結合する第１の抗原結合領域、および凝固因
子に結合する第２の抗原結合領域を含む。本発明はま
た、このような二重特異性抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａ
ｂ’、Ｆａｂ、およびＦ（ａｂ’）２断片を提供する。
このような二重特異性抗体の１つの現在好ましい例は、
ＭＨＣクラスＩＩ抗原に対して指向される１つの結合部
位、および組織因子に対して指向される別の結合部位を
含む抗体である。 【００７４】さらなる実施態様で、本発明は、上記の結
合リガンドおよび二重特異性抗体の任意または組み合わ
せを薬理学的に受容可能な形態で含む薬学的組成物、お
よび治療用キットを提供する。これは、結合リガンド
が、凝固因子に共有結合している第１の結合領域を有
し、そしてまた結合リガンドにおける第１の結合領域
は、次に凝固因子に結合する第２の結合領域に共有結合
する−結合は動物への投与の前、または投与後に起こる
−薬学的組成物およびキットを含む。 【００７５】本発明に従って、二重特異性、三重特異
性、または多重特異性の結合リガンドの組み合わせを含
む薬学的組成物および治療用キットがまた考慮される。
これは、１つの結合リガンドが疾患細胞または腫瘍細胞
に指向し、そしてもう１つが血管系内皮細胞マーカーま
たは疾患関連支質の成分に対して指向する組み合わせを
含む。抗体、イムノトキシン、免疫エフェクター、化学
療法剤などのような他の別の成分もまた、本発明の組成
物およびキットに含まれ得る。 【００７６】キットはまた、正常組織の内皮細胞で抗原
発現を抑制する際の使用については、シクロスポリンの
ような抗原サプレッサー；および／または疾患関連血管
内皮細胞または支質を誘導して標的化可能な抗原を発現
する際の使用については、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレク
チン、またはＭＨＣクラスＩＩ抗原のような「誘導剤」
を含み得る。例示の誘導剤は、疾患または腫瘍抗原を結
合し、そしてＩＦＮ−γを生成するＴ細胞クローンを含
むが、このようなクローンは、キットを用いて処置され
るべき動物から単離されることが現在好ましい。 【００７７】好ましい誘導剤は、疾患または腫瘍細胞抗
原、あるいは支質成分にさえも結合し、そして所望の標
的抗原の発現を誘導するサイトカイン、コアギュラン
ト、または他の因子を産生し得るエフェクター細胞に結
合する二重特異性抗体である。現在のところ、二重特異
性抗体の１つの好ましい群は、腫瘍抗原に、および活性
化抗原ＣＤ１４またはＣＤ１６に結合して、単球、マク
ロファージ、またはマスト細胞によるＩＬ−１産生を刺
激するような群；ならびに腫瘍抗原に、および活性化抗
原ＣＤ２、ＣＤ３またはＣＤ２８に、そして好ましくは
ＣＤ２８に結合して、ＮＫ細胞によりまたは好ましくは
Ｔ細胞によりＩＦＮ−γ産生を刺激するような群であ
る。 【００７８】二重特異性抗体の第２番目の好ましい群
は、腫瘍抗原にまたは腫瘍支質の成分に、および組織因
子、組織因子誘導体、プロトロンビン、第ＶＩＩ／ＶＩ
Ｉａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、第Ｘ
Ｉ／ＸＩａ因子、またはラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子
アクチベーターに結合して、トロンビン産生を刺激する
ような群である。このような二重特異性抗体を第１の
「誘導」組成物として含むキットは、一般に、Ｐ−セレ
クチンまたはＥ−セレクチンに結合する第１の結合領域
を含む結合リガンドを含む第２の薬学的組成物を含む。 【００７９】本発明の二重特異性リガンド、および所望
による他の成分は、１つまたはそれ以上の適切な容器手
段を用いて、便利なように少量に分けおよびパッケージ
にされ、そして別々の容器は単一のパッケージで調剤さ
れ得る。薬学的組成物およびキットは、本明細書にさら
に記載されている。 【００８０】本発明は、コアギュラントの送達および疾
患処置において有意な臨床的有用性を有しているが、そ
れはまた多くのインビトロ用途を有する。これらは例え
ば、二重特異性化合物である、特定の抗体、リガンド、
またはレセプターの結合能力に基づく種々のアッセイを
含む。従って、本発明の二重特異性凝固リガンドは、本
明細書にさらに記載されるように、イムノブロット、ウ
ェスタンブロット、ドットブロット、ＲＩＡ、ＥＬＩＳ
Ａ、免疫組織化学、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡ
ＣＳ）、免疫沈降、アフィニティクロマトグラフィーな
どのような、標準的な結合アッセイおよびプロトコール
で用いられ得る。 【００８１】なおさらなる実施態様では、本発明は、糖
尿病性網膜症、血管再狭窄、ＡＶＭ、血管腫、血管新生
緑内障、乾癬および慢性関節リウマチ、ならびに血管化
腫瘍成分を有する腫瘍のような疾患を処置するために用
いられ得るように、疾患関連血管系にコアギュラントを
送達する方法に関する。このような方法は一般に、血管
成分を有する疾患を伴うヒト被験体を含む動物に、少な
くとも１つの上記のような二重特異性結合リガンドを含
む薬学的組成物を投与する工程を包含する。 【００８２】組成物は、疾患部位（例えば固形腫瘍）の
血管系で血液凝固を促進するに有効な量および経路によ
り投与される。有効用量は、好適な実施態様および詳細
な実施例中の情報のような、本発明の開示を考慮すれ
ば、当業者に公知である。他の方法のように、例えば、
血管化腫瘍部位への注射のような非経口投与がしばしば
適切である。 【００８３】本発明の方法は、共有結合した凝固因子を
含む結合リガンドを投与する手段、および二重特異性リ
ガンドまたは抗体の第２の結合領域に複合体化されてい
る非共有結合した凝固因子を含む結合リガンドを投与す
る手段の両方により、外因性凝固因子の送達を提供す
る。 【００８４】本発明のさらなる方法は、疾患または腫瘍
血管系への内因性凝固因子の送達を生じる方法を含む。
これは、動物または患者に、内因性凝固因子に結合しそ
してこの因子を疾患関連または腫瘍血管系に濃縮する第
２の結合領域を含む結合リガンドを投与することにより
達成される。 【００８５】なおさらなる方法論の実施態様では、腫瘍
血管系または支質のマーカーが特異的に誘導され、次い
で抗体のような結合リガンドを用いて標的とされ得るこ
とが考慮される。例示の誘導性抗原は、Ｅ−セレクチ
ン、Ｐ−セレクチン、ＭＨＣクラスＩＩ抗原、ＶＣＡＭ
−１、ＩＣＡＭ−Ｉ、エンドグリン、ＬＡＭ−１と反応
性のリガンド、血管アドレシン（ａｄｄｒｅｓｓｉ
ｎ）、および他の接着分子を含み、Ｅ−セレクチンおよ
びＭＨＣクラスＩＩ抗原が現在好適である。 【００８６】誘導しそして次にＭＨＣクラスＩＩタンパ
ク質を標的にする場合、正常組織中のＭＨＣクラスＩＩ
の抑制が一般に必要である。ＭＨＣクラスＩＩ抑制は、
シクロスポリン、または機能的に等価な薬剤を用いて達
成され得る。次いでＭＨＣクラスＩＩ分子は、疾患関連
血管系をエフェクター細胞（一般に誘導性サイトカイン
ＩＦＮ−γを放出する、動物のヘルパーＴ細胞またはＮ
Ｋ細胞）に曝すことなどによる、シクロスポリンに依存
しない手段を用いて疾患関連血管内皮細胞中で誘導され
得る。 【００８７】活性化された単球、マクロファージ、およ
びさらにマスト細胞は、Ｅ−セレクチンを誘導するサイ
トカイン（ＩＬ−１；ＴＮＦ−α； ＴＮＦ−β）を生
成し得るエフェクター細胞である；その一方、ヘルパー
Ｔ細胞、ＣＤ−８陽性Ｔ細胞およびＮＫ細胞は、ＭＨＣ
クラスＩＩを誘導するＩＦＮ−γを生成し得る。ＩＬ−
１を生成するために疾患部位で単球／マクロファージを
活性化すること、またはＩＦＮ−γを生成するために疾
患関連ヘルパーＴ細胞またはＮＫ細胞を活性化すること
は、動物に、エフェクター細胞表面活性化抗原に結合す
る活性化抗体を投与することにより達成され得る。例示
の活性化抗原は、単球／マクロファージについてはＣＤ
１４およびＣＤ１６（ＩｇＥについてはＦｃＲ）；およ
びＴ細胞についてはＣＤ２、ＣＤ３およびＣＤ２８；を
含み、特定の実施態様で使用するためには、ＣＤ１４お
よびＣＤ２８がそれぞれ好適である。 【００８８】特異的な活性化および誘導を達成するため
に、１つの現在好ましい方法は、ＣＤ１４またはＣＤ２
８のようなエフェクター細胞活性化抗原、および疾患ま
たは腫瘍細胞抗原の両方に結合する二重特異性抗体を用
いることである。これらの二重特異性抗体は、疾患また
は腫瘍部位に局在化し、そして単球／マクロファージお
よびＴ細胞をそれぞれ活性化する。標的疾患または腫瘍
成分付近の活性化されたエフェクター細胞は、誘導性サ
イトカイン、この場合、ＩＬ−１およびＩＦＮ−γをそ
れぞれ生成する。 【００８９】正常組織中のＭＨＣクラスＩＩ抑制はま
た、動物に抗ＣＤ−４抗体を投与することにより達成さ
れ得る；動物のＴ細胞によるＩＦＮ−γ産生を抑制する
この機能は、ＭＨＣクラスＩＩ発現の阻害を生じる。Ｍ
ＨＣクラスＩＩ分子は、再び、疾患部位をＩＦＮ−γの
みに曝すことにより疾患関連血管内皮細胞で特異的に誘
導され得る。これを達成するための１つの手段は、疾患
部位にある抗原に結合するＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞クロー
ンを動物投与することによる。このＩＦＮ−γ産生Ｔ細
胞は、好ましくは、インビトロで増殖した腫瘍浸潤性白
血球（ＴＩＬ）のような、動物の疾患部位から得られる
浸潤性白血球である。 【００９０】二重特異性抗体を用いて、トロンビンのよ
うなコアギュラント産生を、腫瘍部位のような局所環境
でのみ誘導する方法がまた提供される。さらに、これ
は、一般に、腫瘍細胞または腫瘍支質の成分、および組
織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、第ＶＩＩ／
ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、
第ＸＩ／ＸＩａ因子、またはラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ
因子アクチベーターに結合する二重特異性抗体を含む薬
学的組成物を動物に投与することにより達成され得る。
次いで、Ｅ−セレクチンまたはＰ−セレクチンに結合す
る抗体が、凝固因子または凝固因子に結合する第２の結
合領域に連結し、そして動物の血流中に導入される。 【００９１】より一般的な組み合わせ処理療法もまた可
能であり、ここでは、例えば、本発明の腫瘍凝固エレメ
ントを、放射線療法または化学療法のような現存する抗
腫瘍療法と組み合わせるか、または抗腫瘍イムノトキシ
ンのような第２の免疫学的試薬の使用と組み合わせる。
良性疾患の新規の処置方法もまた、現在用いられている
他の療法と組み合わされ得る。 【００９２】従って、１つの局面において、本発明は、
以下の（ａ）および（ｂ）を含む結合リガンドを提供す
る： （ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関
連支質の成分に結合する第１結合領域；この第１結合領
域が作動可能に連結した （ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領
域。 【００９３】１つの実施形態において、上記第１結合領
域は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、または抗体の抗原結合
性領域を含み得る。 【００９４】別の実施形態において、上記第１結合領域
は、、抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、Ｆａｂまたは
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを含み得る。 【００９５】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、、腫瘍細胞、腫瘍血管系の成分、または腫瘍支
質の成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【００９６】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍細胞の細胞表面抗原に結合する抗体の抗原
結合性領域を含み得る。 【００９７】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、細胞表面腫瘍抗原ｐ１８５ ＨＥＲ２、乳汁ムチ
ンコアタンパク質、ＴＡＧ−７２、ルイスａ、ガン胎児
性抗原（ＣＥＡ）、または腫瘍関連抗原に結合する抗体
の抗原結合性領域を含み得、この腫瘍関連抗原は、９．
２．２７、ＯＶ−ＴＬ３、ＭＯｖ１８、Ｂ３、ＫＳ１／
４、２６０Ｆ９およびＤ６１２からなる群から選択され
る抗体に結合し得る。 【００９８】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、、腫瘍血管系の成分に結合する抗体の抗原結合
性領域を含み得る。 【００９９】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍血管系細胞表面レセプターに結合する抗体
の抗原結合性領域を含み得る。 【０１００】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質、ＶＥＧＦ／ＶＰ
Ｆレセプター、ＦＧＦレセプター、ＴＧＦβレセプタ
ー、ＴＩＥ、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレ
クチン、αｖβ３インテグリン、プレイオトロピン、エ
ンドシアリンまたはエンドグリンに結合する抗体の抗原
結合性領域を含み得る。 【０１０１】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、エンドグリンに結合する抗体の抗原結合性領域
を含み得る。 【０１０２】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、モノクローナル抗体ＴＥＣ−４またはモノクロ
ーナル抗体ＴＥＣ−１１と同じエピトープに結合する抗
体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１０３】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＶＥＧＦレセプターに結合する抗体の抗原結合
性領域を含み得る。 【０１０４】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、モノクローナル抗体３Ｅ１１、３Ｅ７、５Ｇ
６、４Ｄ８または１０Ｂ１０と同じエピトープに結合す
る抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１０５】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、モノクローナル抗体ＴＥＣ−１１０と同じエピ
トープに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１０６】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍血管系細胞表面レセプターに結合するリガ
ンドに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１０７】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥ
に結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンイソ
型、スキャッターファクター、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、ＰＤＧＦまたはＴＩ
ＭＰに結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１０８】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥ
に結合するリガンドまたは腫瘍関連フィブロネクチンイ
ソ型に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１０９】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、誘導性の腫瘍血管系成分に結合する抗体の抗原
結合性領域を含み得る。 【０１１０】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、コアギュラントにより誘導性の腫瘍血管系成分
に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１１１】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、トロンビンにより誘導性の腫瘍血管系成分に結
合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１１２】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、Ｐ−セレクチンまたはＥ−セレクチンに結合す
る抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１１３】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、サイトカインによって誘導性の腫瘍血管系成分
に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１１４】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、単球、マクロファージ、マスト細胞、ヘルパー
Ｔ細胞、ＣＤ８−陽性Ｔ細胞またはＮＫ細胞が放出する
サイトカインによって誘導性の腫瘍血管系成分に結合す
る抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１１５】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、サイトカインＩＬ−１、ＬＩ−４、ＴＮＦ−
α、ＴＮＦ−βまたはＩＦＮ−γによって誘導性の腫瘍
血管系成分に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得
る。 【０１１６】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、Ｅ−セレクチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−
１、エンドグリンまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合す
る抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１１７】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、Ｅ−セレクチンに結合する抗体の抗原結合性領
域を含み得る。 【０１１８】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する抗体の抗原結
合性領域を含み得る。 【０１１９】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、リガンド：レセプター複合体に結合する抗体で
あり得るが、このリガンドまたはレセプターがリガン
ド：レセプター複合体になっていない場合には、このリ
ガンドまたはこの因子レセプターに結合しない抗体の抗
原結合性領域を含み得る。 【０１２０】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、モノクローナル抗体２Ｅ５、３Ｅ５または４Ｅ
５と同じエピトープに結合する抗体の抗原結合性領域を
含み得る。 【０１２１】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍支質の成分に結合する抗体の抗原結合性領
域を含み得る。 【０１２２】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、テネイシンに結合する抗体の抗原結合性領域を
含み得る。 【０１２３】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、基底膜成分に結合する抗体の抗原結合性領域を
含み得る。 【０１２４】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、活性化血小板に結合する抗体の抗原結合性領域
を含み得る。 【０１２５】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、誘導性の腫瘍支質成分に結合する抗体の抗原結
合性領域を含み得る。 【０１２６】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、コアギュラントによって誘導性の腫瘍支質成分
に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１２７】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、トロンビンによって誘導性の腫瘍支質成分に結
合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１２８】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＲＩＢＳに結合する抗体の抗原結合性領域を含
み得る。 【０１２９】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、疾患細胞または疾患関連血管系の成分に結合す
るリガンドまたはレセプターを含み得る。 【０１３０】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍細胞表面レセプターに結合するリガンド、
または腫瘍細胞表面分子に結合するリガンドに結合する
レセプターの可溶性結合ドメインを含み得る。 【０１３１】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍血管系の成分に結合するリガンドまたはレ
セプターを含み得る。 【０１３２】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍血管系内皮細胞表面レセプターに結合する
リガンドを含み得る。 【０１３３】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥ
に結合するリガンド、腫瘍関連フィブロネクチンイソ
型、スキャッターファクター、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）、血小板第４因子（ＰＦ４）、ＰＤＧＦまたはＴＩ
ＭＰを含み得る。 【０１３４】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦを含み得る。 【０１３５】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＦＧＦを含み得る。 【０１３６】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、腫瘍血管系内皮細胞表面レセプターに結合する
リガンドに結合するレセプターの可溶性結合ドメインを
含み得る。 【０１３７】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦレセプターの可溶性結合ドメ
インを含み得る。 【０１３８】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、凝固因子に作動可能に連結し得る。 【０１３９】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、ビタミンＫ依存性ＩＩ／ＩＩａ凝固因子、ＶＩＩ／
ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子またはＸ／Ｘａ因子を
含み得る。 【０１４０】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子を含み
得る。 【０１４１】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、ビタミンＫ依存性凝固因子をコードする遺伝子を原
核宿主中で発現させることによって調製され得る。 【０１４２】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、ビタミンＫ依存性凝固因子タンパク質を処理して、
その対応のグルタミン酸残基を除去または変更すること
によって調製され得る。 【０１４３】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、その対応のグルタミン酸残基を欠くビタミンＫ依存
性凝固因子をコードする操作された凝固因子遺伝子を調
製すること、およびこの操作された遺伝子を組換え宿主
細胞中で発現させることによって調製され得る。 【０１４４】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、組織因子または組織因子誘導体を含み得る。 【０１４５】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、ＶＩＩ因子を活性化する能力が欠損した変異組織因
子を含み得る。 【０１４６】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、約１５７位と約１６７位との間のアミノ酸領域にお
ける変異を伴う組織因子を含み得る。 【０１４７】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は変異組織因子を含み得、１５８位のＴｒｐはＡｒｇに
変化し；１６２位のＳｅｒはＡｌａに変化し；１６４位
のＧｌｙはＡｌａに変化し；または１５８位のＴｒｐは
Ａｒｇに変化し、かつ１６２位のＳｅｒはＡｌａに変化
し得る。 【０１４８】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は短縮型組織因子を含み得る。 【０１４９】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は二量体の短縮型組織因子を含み得る。 【０１５０】さらなる実施形態において、上記凝固因子
はラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベーターを含み
得る。 【０１５１】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は血小板活性化化合物を含み得る。 【０１５２】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、トロンボキサンＡ２またはトロンボキサンＡ２シン
ターゼを含み得る。 【０１５３】さらなる実施形態において、上記凝固因子
は、フィブリン溶解のインヒビターを含み得る。 【０１５４】さらなる実施形態において、上記凝固因子
はα２−抗プラスミンを含み得る。 【０１５５】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、凝固因子に結合する第２結合領域に作動可能に
連結し得る。 【０１５６】さらなる実施形態において、上記結合リガ
ンドは、上記第２結合領域に結合した凝固因子をさらに
含み得る。 【０１５７】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、凝固因子に結合する抗体の抗原結合性領域を含
み得る。 【０１５８】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、あるいは抗体のｓｃ
Ｆｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２フ
ラグメントを含み得る。 【０１５９】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、ビタミンＫ依存性ＩＩ／ＩＩａ凝固因子、ＶＩ
Ｉ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子またはＸ／Ｘａ因
子に結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１６０】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因子に
結合する抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１６１】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、組織因子に結合する抗体の抗原結合性領域を含
み得る。 【０１６２】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、変異組織因子に結合する抗体の抗原結合性領域
を含み得る。 【０１６３】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、短縮型組織因子に結合する抗体の抗原結合性領
域を含み得る。 【０１６４】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、二量体の短縮型組織因子に結合する抗体の抗原
結合性領域を含み得る。 【０１６５】さらなる実施形態において、上記第２結合
領域は、ラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチベータ、
トロンボキサンＡ２またはα２−抗プラスミンに結合す
る抗体の抗原結合性領域を含み得る。 【０１６６】別の実施形態において、上記第１結合領域
は、共有結合を介して上記凝固因子または上記第２結合
領域に作動可能に連結し得る。 【０１６７】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、化学的架橋リンカーを介して上記凝固因子また
は上記第２結合領域に作動可能に連結し得る。 【０１６８】さらなる実施形態において、上記結合リガ
ンドは、宿主細胞中で組換えベクターを発現させること
によって調製される融合タンパク質であり得、このベク
ターは、同じリーディングフレーム中に、上記凝固因子
または第２結合領域をコードするＤＮＡセグメントに作
動可能に連結した上記第１結合領域をコードするＤＮＡ
セグメントを含み得る。 【０１６９】別の実施形態において、上記第１結合領域
は、アビジン：ビオチンの組み合わせを用いて、上記凝
固因子または上記第２結合領域に作動可能に連結し得
る。 【０１７０】別の実施形態において、上記結合リガンド
は二重特異性抗体としてさらに規定され得、この二重特
異性抗体は、腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または
腫瘍関連支質の成分に結合する第１抗原結合性領域を含
み、この第１抗原結合性領域は、凝固因子に結合する第
２抗原結合性領域に作動可能に連結し得る。 【０１７１】さらなる実施形態において、上記結合リガ
ンドは、ＩｇＧ抗体、ＩｇＭ抗体、あるいは二重特異性
抗体のｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、ＦａｂまたはＦ（ａ
ｂ’）２フラグメントとしてさらに規定され得る。 【０１７２】さらなる実施形態において、上記結合リガ
ンドは、短縮型組織因子に結合する第２抗原結合性領域
に作動可能に連結している、ＭＨＣクラスＩＩタンパク
質に結合する第１抗原結合性領域を含む二重特異性抗体
としてさらに規定され得る。 【０１７３】別の局面において、本発明は、以下の
（ａ）および（ｂ）を含む結合リガンドを提供する： （ａ）腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍関
連支質の成分に結合する第１結合領域；この第１結合領
域が作動可能に連結した （ｂ）操作された凝固因子、または操作された凝固因子
に結合する第２結合領域。 【０１７４】１つの実施形態において、上記操作された
凝固因子は、Ｇｌａ改変を欠くビタミンＫ依存性凝固因
子であり得る。 【０１７５】別の実施形態において、上記操作された凝
固因子は、Ｇｌａ改変を欠く、ＩＩ／ＩＩａ凝固因子、
ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子またはＸ／Ｘ
ａ因子であり得る。 【０１７６】さらなる実施形態において、上記操作され
た凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子遺伝子を原核
宿主中で発現させることによって調製され得る。 【０１７７】さらなる実施形態において、上記操作され
た凝固因子は、ビタミンＫ依存性凝固因子タンパク質を
処理して、その対応のグルタミン酸残基を除去または変
更することによって調製され得る。 【０１７８】さらなる実施形態において、上記操作され
た凝固因子は、対応するグルタミン酸残基を欠くビタミ
ンＫ依存性凝固因子をコードする操作された凝固因子遺
伝子を調製すること、およびこの操作された遺伝子を組
換え宿主細胞中で発現させることによって調製され得
る。 【０１７９】さらなる実施形態において、上記操作され
た凝固因子は、第２の組織因子または誘導体に作動可能
に結合した第１の組織因子または誘導体を含む組織因子
構築物であ得る。 【０１８０】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は短縮型組織因子を含み得る。 【０１８１】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、疎水性膜挿入部分を含み得る。 【０１８２】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、約３と約２０との間の疎水性アミノ酸の連続
部分を含む短縮型組織因子を含み得る。 【０１８３】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は短縮型組織因子を含み得、この短縮型組織因子
は、この短縮型組織因子のＮ末端またはＣ末端に位置す
る疎水性アミノ酸の連続部分を含み得る。 【０１８４】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、脂肪酸を含む短縮型組織因子を含み得る。 【０１８５】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、２つの短縮型組織因子を含み得、これらの各
々は膜挿入部分を含み得る。 【０１８６】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、ジスルフィド、チオエーテルまたはペプチド
結合で作動可能に連結した第１および第２の組織因子ま
たは誘導体を含み得る。 【０１８７】別の実施形態において、上記第１結合領域
は、操作された凝固因子に結合する第２結合領域に作動
可能に連結し得る。 【０１８８】なお別の実施形態において、上記第１結合
領域は、操作された凝固因子に作動可能に連結し得る。 【０１８９】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、生物学的に除去可能な結合を介して上記操作さ
れた凝固因子に結合し得る。 【０１９０】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、選択的に切断可能なペプチド結合を介して上記
操作された凝固因子に結合し得る。 【０１９１】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、ウロキナーゼ、プラスミン、トロンビン、ＩＸ
ａ因子、Ｘａ因子またはメタロプロテイナーゼに対する
切断部位を含むペプチドリンカーを介して、上記操作さ
れた凝固因子に結合し得る。 【０１９２】別の局面において、本発明は、第２の組織
因子または誘導体に作動可能に連結した第１の組織因子
または誘導体を含む組織因子構築物を提供する。 【０１９３】１つの実施形態において、上記組織因子構
築物は、作動可能に連結された第１、第２および第３の
組織因子または組織因子誘導体を含み得る。 【０１９４】別の実施形態において、上記組織因子構築
物は、作動可能に連結された約５個の組織因子または組
織因子誘導体を含み得る。 【０１９５】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、作動可能に連結された約１０個の組織因子ま
たは組織因子誘導体を含み得る。 【０１９６】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、作動可能に連結された約２０個の組織因子ま
たは組織因子誘導体を含み得る。 【０１９７】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、縮型組織因子を含み得る。 【０１９８】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、疎水性膜挿入部分を含む短縮型組織因子を含
み得る。 【０１９９】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、約３と約２０との間の疎水性アミノ酸の連続
部分を含む短縮型組織因子を含み得る。 【０２００】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は短縮型組織因子を含み得、この短縮型組織因子
は、この短縮型組織因子のＮ末端またはＣ末端に位置す
る疎水性アミノ酸の連続部分を含み得る。 【０２０１】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、脂肪酸を含む短縮型組織因子を含み得る。 【０２０２】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、２つの短縮型組織因子を含み得、これらの各
々が疎水性膜挿入部分を含み得る。 【０２０３】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、末端システイン残基を含むように改変された
短縮型組織因子を含み得る。 【０２０４】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は２つの短縮型組織因子を含み得、これらの各々
は末端システイン残基を含むように改変され得る。 【０２０５】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、上記システイン残基に作動可能に連結した抗
体または抗体の抗原結合性領域をさらに含み得る。 【０２０６】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、選択的に切断可能なペプチドリンカーを含む
ように改変された短縮型組織因子を含み得る。 【０２０７】さらなる実施形態において、上記選択的に
切断可能なペプチドリンカーは、ウロキナーゼ、プラス
ミン、トロンビン、ＩＸａ因子、Ｘａ因子またはメタロ
プロテイナーゼについての切断部位を含み得る。 【０２０８】さらなる実施形態において、上記選択的に
切断可能なペプチドリンカーは、間質コラゲナーゼ、ゼ
ラチナーゼまたはストロメリシンについての切断部位を
含み得る。 【０２０９】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、上記選択的に切断可能なペプチドリンカーに
作動可能に連結した抗体または抗体の抗原結合性領域を
さらに含み得る。 【０２１０】別の実施形態において、上記組織因子構築
物は、その配列中に作動可能に連結した一連のユニッ
ト：システイン残基、選択的に切断可能なペプチドリン
カー、疎水性アミノ酸の連続部分、第１の短縮型組織因
子および第２の短縮型組織因子を含み得る。 【０２１１】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、その配列中に作動可能に連結した一連のユニ
ット：第１のシステイン残基、選択的に切断可能なペプ
チドリンカー、第１の疎水性アミノ酸の連続部分、第１
の短縮型組織因子、第２の短縮型組織因子および第２の
疎水性アミノ酸の連続部分を含み得る。 【０２１２】さらなる実施形態において、上記組織因子
構築物は、上記システイン残基に作動可能に連結した抗
体または抗体の抗原結合性領域をさらに含み得る。 【０２１３】さらなる局面において、本発明は、以下の
（ａ）および（ｂ）を含む結合リガンドを薬理学的に受
容可能な形態で含む薬学的組成物を提供する： （ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関
連支質の成分に結合する第１結合領域；この第１結合領
域が作動可能に連結した （ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領
域。 【０２１４】１つの実施形態において、上記結合リガン
ドは、凝固因子に共有結合した第１結合領域を含み得
る。 【０２１５】別の実施形態において、上記結合リガンド
は、凝固因子に結合する第２結合領域に共有結合した第
１結合領域を含み得る。 【０２１６】さらなる実施形態において、上記結合リガ
ンドは、上記第２結合領域に非共有結合的に結合した凝
固因子をさらに含み得る。 【０２１７】さらなる実施形態において、上記結合リガ
ンドは二重特異性抗体であり得る。 【０２１８】さらなる実施形態において、上記第１結合
領域は、組織因子、組織因子誘導体、あるいは抗体の抗
原結合性領域に作動可能に連結し、この抗体は組織因子
または組織因子誘導体に結合し得る。 【０２１９】なおさらなる局面において、本発明は、適
切な容器手段中に以下の（ａ）および（ｂ）を含むキッ
トを提供する： （ａ）第１の薬学的組成物であって、疾患関連血管系ま
たは疾患関連支質における標的抗原の発現を誘導し得る
生物学的薬剤を含む、第１の薬学的組成物；および
（ｂ）第２の薬学的組成物であって、以下の（ｉ）およ
び（ｉｉ）を含む結合リガンドを含む、第２の薬学的組
成物： （ｉ）疾患関連血管系または疾患関連支質の誘導性標的
抗原に結合する第１結合領域；この第１結合領域が作動
可能に連結した（ｉｉ）凝固因子、または凝固因子に結
合する第２結合領域。 【０２２０】１つの実施形態において、上記第１の薬学
的組成物は、疾患関連血管内皮細胞上の標的抗原の発現
を誘導し得る生物学的薬剤を含み得る。 【０２２１】別の実施形態において、上記第１の薬学的
組成物は、白血球細胞の細胞表面上の活性化抗原および
血管化腫瘍の腫瘍細胞の細胞表面上の腫瘍抗原に結合す
る二重特異性抗体を含み得る。 【０２２２】さらなる実施形態において、上記第１の薬
学的組成物は、活性化抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ１４、
ＣＤ１６（ＩｇＥについてはＦｃＲ）、ＣＤ２８または
Ｔ細胞レセプター抗原に結合する二重特異性抗体を含み
得る。 【０２２３】さらなる実施形態において、上記第１の薬
学的組成物は、ＣＤ１４に結合し、そして単球／マクロ
ファージ細胞によるＩＬ−１の発現を誘導する二重特異
性抗体を含み得る。 【０２２４】さらなる実施形態において、上記第２の薬
学的組成物は、Ｅ−セレクチンに結合する第１結合領域
を含む結合リガンドを含み得る。 【０２２５】さらなる実施形態において、上記第１の薬
学的組成物は、ＣＤ２８に結合し、そしてＴ細胞による
ＩＦＮ−γの発現を誘導する二重特異性抗体を含み得
る。 【０２２６】さらなる実施形態において、上記第２の薬
学的組成物は、ＭＨＣクラスＩＩ抗原に結合する第１結
合領域を含む結合リガンドを含み得る。 【０２２７】さらなる実施形態において、上記キット
は、正常組織の血管内皮細胞におけるＭＨＣクラスＩＩ
抗原の発現を抑制し得る抗原を含む、第３の薬学的組成
物をさらに含み得る。 【０２２８】さらなる実施形態において、上記キット
は、シクロスポリンを含む第３の薬学的組成物をさらに
含み得る。 【０２２９】さらなる実施形態において、上記第１の薬
学的組成物は、腫瘍抗原ｐ１８５Ｈ ＥＲ２、乳汁ムチン
コアタンパク質、ＴＡＧ−７２、ルイスａ、ガン胎児性
抗原（ＣＥＡ）、または腫瘍関連抗原に結合する二重特
異性抗体を含み得、この腫瘍関連抗原は、９．２．２
７、ＯＶ−ＴＬ３、ＭＯｖ１８、Ｂ３、ＫＳ１／４、２
６０Ｆ９およびＤ６１２からなる群から選択される抗体
に結合し得る。 【０２３０】別の実施形態において、上記第１の薬学的
組成物は、疾患関連支質成分における標的抗原の発現を
誘導し得る生物学的薬剤を含み得る。 【０２３１】さらなる実施形態において、上記第１の薬
学的組成物は、腫瘍細胞または腫瘍支質の成分；および
組織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、ＶＩＩ／
ＶＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ
／ＸＩａ因子またはラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アク
チベーターに結合する二重特異性抗体を含み得る。 【０２３２】さらなる実施形態において、上記第２の薬
学的組成物は、Ｐ−セレクチンに結合する第１結合領域
を含む結合リガンドを含み得る。 【０２３３】さらなる実施形態において、上記第２の薬
学的組成物は、Ｅ−セレクチンに結合する第１結合領域
を含む結合リガンドを含み得る。 【０２３４】なお別の局面において、本発明は、疾患関
連血管系に凝固因子を送達するための医薬の調製におけ
る結合リガンドの使用を提供し、この結合リガンドは、
以下の（ａ）および（ｂ）を含む： （ａ）疾患細胞、疾患関連血管系の成分、または疾患関
連支質の成分に結合する第１結合領域；この第１結合領
域が作動可能に連結した （ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領
域。 【０２３５】１つの実施形態において、上記結合リガン
ドは、外因性凝固因子を疾患関連血管系に送達するため
の医薬の調製において使用され得、この結合リガンド
は、凝固因子に共有結合した第１結合領域を含み得る。 【０２３６】他の実施形態において、上記結合リガンド
は、外因性凝固因子を疾患関連血管系に送達するための
医薬の調製において使用され得、この結合リガンドは、
凝固因子に非共有結合的に結合する第２結合領域に共有
結合した第１結合領域を含み得る。 【０２３７】別の実施形態において、上記結合リガンド
は、外因性凝固因子を疾患関連血管系に送達するための
医薬の調製において使用され得、この結合リガンドは、
外因性凝固因子に結合する第２結合領域に共有結合した
第１結合領域を含み得、そしてこの医薬を動物に投与す
るとこの因子を疾患関連血管系に集中させ得る。 【０２３８】なお別の実施形態において、上記医薬は、
良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、糖尿病性網膜症、血管再
狭窄、動静脈性奇形（ＡＶＭ）、血管腫、血管新生緑内
障、慢性関節リウマチまたは乾癬の処置において使用さ
れることが意図され得る。 【０２３９】さらに別の実施形態において、上記医薬
は、血管化腫瘍を有する動物の処置において使用される
ことが意図され得る。 【０２４０】さらなる実施形態において、上記医薬は、
動物の腫瘍関連血管系または腫瘍関連支質における標的
化可能な成分の発現の誘導の後に使用されることが意図
され得、この医薬は、誘導された標的化可能な成分に結
合する第１結合領域を含む結合リガンドを含み得る。 【０２４１】さらなる実施形態において、腫瘍関連血管
系における上記標的化可能な成分の発現は、サイトカイ
ンによって誘導され得る。 【０２４２】さらなる実施形態において、腫瘍関連血管
系における上記標的化可能な成分の発現は、上記動物の
白血球細胞から放出されるサイトカインによって誘導さ
れ得る。 【０２４３】さらなる実施形態において、腫瘍関連血管
系における上記標的化可能な成分の発現は、上記動物の
単球、マクロファージ、マスト細胞、ヘルパーＴ細胞、
ＣＤ８−陽性Ｔ細胞またはＮＫ細胞から放出されるサイ
トカインによって誘導され得る。 【０２４４】さらなる実施形態において、腫瘍関連血管
系における上記標的化可能な成分の発現は、サイトカイ
ンＩＬ−１、ＬＩ−４、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−βまたは
ＩＦＮ−γによって誘導され得る。 【０２４５】さらなる実施形態において、上記動物の上
記白血球細胞は、白血球細胞表面活性化抗原に結合する
活性化抗体を含む薬学的組成物をこの動物に投与するこ
とによって活性化されて、サイトカインを放出し得る。 【０２４６】さらなる実施形態において、上記活性化抗
体は、白血球細胞表面活性化抗原ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ
１４、ＣＤ１６、ＩｇＥについてのＦｃＲ、ＣＤ２８ま
たはＴ細胞レセプター抗原に結合し得る。 【０２４７】さらなる実施形態において、上記活性化抗
体は、動物腫瘍内で、活性化された白血球および腫瘍細
胞に結合および架橋する二重特異性抗体であり得る。 【０２４８】さらなる実施形態において、上記活性化抗
体は、ＣＤ１４またはＣＤ２８、および腫瘍細胞の細胞
表面抗原に結合する二重特異性抗体であり得る。 【０２４９】さらなる実施形態において、上記Ｅ−セレ
クチン、ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、エンドグリンま
たはＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現は、腫瘍関連血管系に
おいて誘導され得る。 【０２５０】さらなる実施形態において、上記Ｅ−セレ
クチンの発現は、腫瘍関連血管系において誘導され得
る。 【０２５１】さらなる実施形態において、上記ＭＨＣク
ラスＩＩ抗原の発現は、腫瘍関連血管系において誘導さ
れ得る。 【０２５２】さらなる実施形態において、動物の正常組
織における内皮細胞による上記ＭＨＣクラスＩＩ抗原の
発現は、この動物へのシクロスポリンの投与によって抑
制され得；そして、次いで腫瘍関連血管系におけるＭＨ
ＣクラスＩＩ抗原の発現は、ＣＤ２８および腫瘍細胞の
細胞表面抗原に結合する二重特異性抗体のこの動物への
投与によって誘導され得る。 【０２５３】さらなる実施形態において、動物の正常組
織における内皮細胞による上記ＭＨＣクラスＩＩ抗原の
発現は、この動物のＴ細胞におけるＩＦＮ−γ産生を抑
制する抗ＣＤ４抗体のこの動物への投与によって抑制さ
れ得；そして、次いで腫瘍関連血管系におけるＭＨＣク
ラスＩＩ抗原の発現は、上記疾患部位中の抗原に結合す
るＩＦＮ−γ−産生Ｔ細胞クローンのこの動物への投与
によって誘導され得る。 【０２５４】さらなる実施形態において、上記ＩＦＮ−
γ−産生Ｔ細胞クローンは、以下： （ａ）この動物の疾患部位から組織断片を取り出す工
程； （ｂ）この疾患部位から、浸潤した白血球を抽出する工
程；および （ｃ）この浸潤した白血球をインビトロで拡大させてＩ
ＦＮ−γ産生クローンを提供する工程、を包含する方法
によって調製され得る。 【０２５５】さらなる実施形態において、腫瘍関連血管
系における上記標的化可能な成分の発現は、トロンビン
によって誘導され得る。 【０２５６】さらなる実施形態において、上記トロンビ
ンの産生は、腫瘍細胞または腫瘍支質の成分、および組
織因子、組織因子誘導体、プロトロンビン、ＶＩＩ／Ｖ
ＩＩａ因子、ＩＸ／ＩＸａ因子、Ｘ／Ｘａ因子、ＸＩ／
ＸＩａ因子またはラッセルクサリヘビ蛇毒Ｘ因子アクチ
ベーターに結合する二重特異性抗体を含む薬学的組成物
を動物に投与することによって誘導され得る。 【０２５７】さらなる実施形態において、上記Ｐ−セレ
クチンの発現は、腫瘍関連血管系において誘導され得
る。 【０２５８】さらなる実施形態において、上記Ｅ−セレ
クチンの発現は、腫瘍関連血管系において誘導され得
る。 【０２５９】なおさらなる局面において、本発明は、ガ
ンを処置するための医薬の調製における凝固性結合リガ
ンドの使用を提供し、この結合リガンドは、以下の
（ａ）および（ｂ）を含む： （ａ）腫瘍細胞、腫瘍関連血管系の成分、または腫瘍関
連支質の成分に結合する第１結合領域；この第１結合領
域が作動可能に連結した （ｂ）凝固因子、または凝固因子に結合する第２結合領
域。 【０２６０】１つの実施形態において、上記医薬は、非
経口投与のための処方物であり得る。 【０２６１】他の実施形態において、上記医薬は、血管
化腫瘍部位中に注入されるための処方物であり得る。 【０２６２】別の実施形態において、上記医薬は、ヒト
患者における使用に適している。 【０２６３】なお別の実施形態において、上記凝固性結
合リガンドは、組織因子、短縮型組織因子、二量体組織
因子、あるいは組織因子または組織因子誘導体に結合す
る抗体の抗原性結合領域に作動可能に連結した第１結合
領域を含み得る。 【０２６４】 【発明の実施の形態】モノクローナル抗体（ＭＡｂ）お
よびイムノトキシン（ＩＴ）は、リンパ腫および白血病
の治療に大きな可能性を示している（Ｌｏｗｄｅｒら、
１９８７。Ｖｉｔｅｔｔａら、１９９１）が、ヒトの全
てのガンの９０％以上を占める（Ｓｈｏｃｋｌｅｙら、
１９９１）ガン腫およびその他の固形腫瘍に対しては、
現在のところ臨床治験において比較的非効果的であるこ
とがわかっている（ＢｙｅｒｓおよびＢａｌｄｗｉｎ、
１９８８。ＡｂｒａｍｓおよびＯｌｄｈａｍ、１９８
５）。この主な理由は、高分子は容易には固形腫瘍中に
浸出せず（Ｓａｎｄｓ、１９８８。Ｅｐｅｎｅｔｏｓ
ら、１９８６）、いったん腫瘍塊中に入ると、腫瘍細胞
間の緊密な結合（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１）、繊維間
質（Ｂａｘｔｅｒら、１９９１）、間隙圧力勾配（Ｊａ
ｉｎ、１９９０）、および結合部位バリア（Ｊｕｗｅｉ
ｄら、１９９２）の存在のために均一に分布し得ないた
めである。 【０２６５】従って、固形腫瘍を処置するための新しい
ストラテジーの開発において、腫瘍細胞そのものよりも
腫瘍の血管系を標的化する工程を包含する方法は、ある
種の利点を提供すると思われる。例えば腫瘍血管系特異
的フィブリン形成による腫瘍を通る血流の障害の誘導
は、腫瘍部位における流入および流出プロセスを妨害
し、従って抗腫瘍効果が生じる。腫瘍への血液供給を停
止させることは、腫瘍関連血管における凝固促進−フィ
ブリン溶解バランスを、凝固剤（ｃｏａｇｕｌａｔｉｎ
ｇ ａｇｅｎｔ）に特異的に曝すことによって凝固プロ
セス側にシフトすることを通じて達成され得る。 【０２６６】本発明は、腫瘍特異的凝固に代表される特
異的な血液凝固を得るための、様々な手段を提供する。
これは、少なくとも一つの成分が免疫的標的化成分また
は成長因子ベースの標的化成分であり、凝固を直接的ま
たは間接的に刺激し得る少なくとも一つの他の成分が用
いられる、二重特異性または多重特異性の結合リガンド
を用いることによって達成される。 【０２６７】（Ａ．標的化可能疾患部位）本発明によっ
て提供される組成物および方法は、血管部分を有する良
性または悪性腫瘍などのいずれの疾患の処置にも幅広く
適用可能である。このような血管系関連疾患は、ＢＰ
Ｈ、糖尿病性網膜症、血管再狭窄、動静脈性奇形（ＡＶ
Ｍ）、髄膜腫、血管腫、血管新生緑内障および乾癬、な
らびに血管線維腫、関節炎、アテローム性動脈硬化プラ
ーク、角膜移植血管新生、血友病関節、過形成性瘢痕、
ｏｓｌｅｒ−ｗｅｂｅｒ症候群（ｏｓｌｅｒ−ｗｅｂｅ
ｒｓｙｎｄｒｏｍｅ）、化膿肉芽腫、後水晶体繊維増殖
症、鞏皮症、トラコーマ、血管接着、滑膜炎、皮膚炎お
よび子宮内膜症さえも含む。 【０２６８】代表的な血管形成性腫瘍は、酸素および栄
養素の供給のために血管部分を必要とする固形腫瘍、特
にガン腫である。本発明を用いて処置され得る固形腫瘍
の例は、肺、胸部、卵巣、胃、膵臓、喉頭、食道、精
巣、肝臓、耳下腺、胆管、結腸、直腸、子宮頚部、子
宮、子宮内膜、腎臓、膀胱、前立腺、および甲状腺のガ
ン腫、扁平上皮細胞ガン腫、腺ガン腫、小細胞ガン腫、
メラノーマ、 神経膠腫、神経芽腫などを含むがこれに
限定されない。 【０２６９】本発明の二重特異性剤の一つの結合領域
は、凝固剤を腫瘍領域に送達し得る、すなわち上記に示
すような腫瘍部位に局在化させることが可能な成分であ
る。凝固剤は、若干広く分布しても、トキシン部分の場
合において発生が知られているような激しい副作用を伴
わないため、二重特異性リガンドの標的化成分に対する
必要条件は比較的厳密ではない。標的化剤は従って、腫
瘍細胞成分、腫瘍血管系成分、腫瘍細胞に結合するまた
は一般的に関連する成分、腫瘍血管系に結合するまたは
一般的に関連する成分、腫瘍細胞外マトリックスまたは
間質の成分、および腫瘍血管系中に見られる細胞型さえ
も対象とし得る。 【０２７０】例えばイムノトキシンを用いる場合に必要
となる非常に厳密な標的化という問題は、腫瘍血管系は
「プロトロンビン産生性（ｐｒｏｔｈｒｏｍｂｏｔｉ
ｃ）」であり凝固傾向にあるという事実によってもまた
軽減される。従って、特異的標的化手段を達成すること
により、凝固は非腫瘍部位中の血管系よりも腫瘍血管系
において促進される。従って、特異的標的化は、標的化
剤の生物分布特性に関連する純粋に物理的な用語という
よりもむしろ、機能的な用語であり、有用な標的が完全
に腫瘍に制限されず、腫瘍特異性凝固の促進に有効な標
的化リガンドが投与後に身体の他の部位で見出されるこ
とはあり得ないことではない。 【０２７１】（１．腫瘍細胞標的）腫瘍を構成する悪性
細胞は、腫瘍細胞の比較的特異的なマーカーに結合可能
な領域を有する二重特異性リガンドを用いて標的化され
得る。腫瘍細胞への結合が、結合した凝固剤を腫瘍へ局
在化させることにより、特異的な凝固が達成される。更
に、血管周辺腫瘍細胞への物理的な接近可能性に起因し
て血管に最も近い腫瘍細胞付近に二重特異性剤が集中す
る可能性が高いために、これは凝固を促進するための特
に効果的な手段であることが予想される。 【０２７２】多くのいわゆる「腫瘍抗原」が記載されて
いるが、そのいずれも本発明において標的として用いる
ことが可能である。固形腫瘍関連抗原の例を多数、本明
細書中の表Ｉ中に列挙した。このような抗原に対する抗
体の調製および使用は、充分に当該技術の範囲内であ
り、抗体例も同時に表Ｉに列挙しておく。 【０２７３】標的化可能腫瘍を規定するもう一つの手段
は、腫瘍細胞によって発現された抗原の生化学的特性を
記載するのではなく、腫瘍細胞そのものの特性を考慮し
て説明される。従って、（ＡＴＣＣカタログから）公的
に入手可能なヒト腫瘍細胞株を例示する意味で表ＩＩを
提供する。 【０２７４】表ＩＩに提供した情報は一例であり、年度
または範囲による制限は意図していない。任意の後年の
ＡＴＣＣカタログを参照することによって、他の適切な
細胞株を同定することが可能である。また、特定の細胞
型が所望であるならば、そのような細胞を得るための手
段および／またはその即時入手可能な供給源は、当該技
術分野の当業者に公知である。従って、科学文献の分析
により、標的化することを所望する任意の腫瘍細胞型の
細胞について適切な選択を容易に行い得る。 【０２７５】 【表１】 【０２７６】 【表２】 （（ａ）抗腫瘍細胞抗体）腫瘍抗原標的を認識するため
の容易な手段は、その特定の抗原に対する結合親和性を
有する抗体を使用することである。固形腫瘍抗原に対す
る幅広い数の抗体が公知である。いくつかの有用な抗腫
瘍抗体を上記表Ｉに示している。しかし当業者には直ち
に理解されるように、表Ｉに示す抗体のいくつかは、治
療用途に対して適切な生化学的特性を有さないか、十分
な腫瘍特異性を有さない可能性がある。その一例は、細
胞質抗原を認識するＭＵＣ８−２２である。一般に、こ
れらのような抗体は、モデル系またはスクリーニングア
ッセイにおけるような研究的実施態様においてのみ有用
である。 【０２７７】一般に、本発明のこれらの局面において使
用される抗体は、好ましくは、細胞表面に接近可能な抗
原および腫瘍細胞によって優先的にあるいは特異的に発
現される抗原を認識する。このような抗体はまた好まし
くは、例えばＫｄ＜２００ｎＭ、好ましくは＜１００ｎ
Ｍを示す高い親和特性を示し、生命を維持している（ｌ
ｉｆｅ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）通常組織、例えば心
臓、腎臓、脳、肝臓、骨髄、結腸、胸部、前立腺、甲状
腺、胆嚢、肺、副腎、筋肉、神経繊維、膵臓、皮膚、ま
たはその他のヒト身体中の生命を維持している器官また
は組織から選ばれる一つ以上の組織に対しては、有意な
反応性を示さない。本発明の目的において最も重要な
「生命を維持している」組織は、低反応性の観点から言
えば、心臓、腎臓、中枢神経系および末梢神経系組織お
よび肝臓を含む。本明細書で使用する用語「有意な反応
性」とは、免疫組織化学分析に適した条件下において特
定の組織に適用された際に、大部分ネガティブな細胞ば
かりのフィールド中にほんの僅かのポジティブな細胞が
散りばめられた状態であって染色を引き起こさないある
いは無視可能な程度の染色しか引き起こさないような、
抗体または抗体フラグメントをいう。 【０２７８】本発明での使用が考えられる表Ｉ内の抗体
中で可能性が特に高い抗体は、固形腫瘍に高い選択性を
有するものである。例えば、多くの乳ガン、肺ガン、お
よび結腸／直腸ガンの表面に選択的に見られるＴＡＧ７
２およびＨＥＲ−２プロトオンコジーンタンパク質に結
合する抗体（Ｔｈｏｒら、１９８６。Ｃｏｌｃｈｅｒ
ら、１９８７。Ｓｈｅｐａｒｄら、１９９１）；ＭＯｖ
１８およびＯＶ−ＴＬ３ならびに乳ムチンコアタンパク
質およびヒト乳脂肪小球体に結合する抗体（Ｍｉｏｔｔ
ｉら、１９８５。Ｂｕｒｃｈｅｌｌら、１９８３）；お
よび高Ｍｒメラノーマ抗原に結合する抗体９．２．２７
（Ｒｅｉｓｆｅｌｄら、１９８２）である。更に有用な
抗体は、ほぼ全ての卵巣ガン腫において均一に発現する
ことが知られている、葉酸結合タンパク質に対する抗
体；扁平上皮細胞ガン腫および大多数の神経膠腫におい
て過剰発現されるオンコジーンのｅｒｂファミリーに対
する抗体；および現行の前臨床評価および臨床評価の対
象として知られるその他の抗体である。 【０２７９】抗体Ｂ３、ＫＳＩ／４、ＣＣ４９、２６０
Ｆ９、ＸＭＭＣＯ−７９１、Ｄ６１２およびＳＭ３は、
当該分野で通常実施されている標準的な前臨床試験後の
臨床実施態様における使用に特に適切であると思われ
る。Ｂ３（米国特許第５，２４２，８１３号；Ｂｒｉｎ
ｋｍａｎら、１９９１）は、ＡＴＣＣ受託番号ＨＢ １
０５７３を有する；ＫＳ１／４は米国特許第４，９７
５，３６９号に記載されるように作製し得る；Ｄ６１２
（米国特許第５，１８３，７５６号）は、ＡＴＣＣ受託
番号ＨＢ ９７９６を有する。 【０２８０】腫瘍関連標的を規定するための別の手段
は、腫瘍細胞によって発現された抗原の生化学的特性を
記載するのではなく、腫瘍細胞の特性を考慮して説明す
る。従って、本発明者らは、表ＩＩに挙げた腫瘍細胞に
優先的に結合する任意の抗体を、二重特異性リガンドの
標的化成分として使用し得ると考える。優先的な腫瘍細
胞結合もまた、腫瘍細胞に高親和性を示し、かつ、上記
に定義された生命維持している正常細胞または組織に対
して有意な反応性を有さない抗体に基づく。 【０２８１】本発明は従って、本明細書に記載する標的
化された凝固方法に使用される抗体を生成するためのい
くつかの手段を提供する。腫瘍細胞特異的抗体を生成す
るためには、腫瘍細胞抗原を含有する組成物を用いて動
物を免疫化し、本明細書中以下において詳細に説明する
ように、得られた抗体のなかで適切な特異性を有するも
のを選択することになるであろう。免疫化組成物は、表
Ｉ中の任意の抗原の精製されたあるいは部分的に精製さ
れた調製物；表Ｉ中の任意の抗原を富化した（ｅｎｒｉ
ｃｈｅｄ）膜調製物（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｅｐａｒ
ａｔｉｏｎ）等の組成物；表ＩＩ中に挙げた任意の細
胞；または、表ＩＩ中に挙げた任意の細胞タイプを含む
細胞混合物または細胞集団を含有していてもよい。 【０２８２】もちろん、抗体の供給源に関わらず、ヒト
処置における本発明の実施の際には、臨床的に標的化さ
れた腫瘍が最終的に選択された抗原を発現することを前
もって確実にすることが好ましい。これは、例えば外科
的生検のような腫瘍組織サンプルを抗原について試験す
ることまたは恐らくは循環している放出抗原（ｓｈｅｄ
ａｎｔｉｇｅｎ）を試験することを包含する、比較的
容易なアッセイによって達成される。これは、腫瘍に対
する反応性に関してハイブリドーマの「バンク」由来の
抗体の結合親和性を試験するＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫
吸着アッセイ）のような免疫学的スクリーニングアッセ
イにおいて容易に実施し得る。その後、適切な腫瘍選択
性および親和性を示す抗体を選択して、本発明の二重特
異性抗体の調製のために用いることができる。 【０２８３】周知の交差反応性現象のため、最初の抗原
をヒト細胞から得る免疫化プロトコルに加えて、最初に
使用される抗原がマウスや霊長類のような動物由来であ
るような免疫化プロトコルから有用な抗体が得られ得る
ことが予想される。ヒト起源の抗原を用いる場合、これ
らはヒト腫瘍細胞株から得てもよく、または、問題とな
っている特定の患者からの生体サンプルを得ることによ
って調製してもよい。実際、患者の腫瘍に対する「特別
に誂えた（ｃｕｓｔｏｍ−ｔａｉｌｏｒｅｄ）」抗体の
誘起のための方法は公知であり（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ
ら、１９９０）、本発明においての使用が考えられる。 【０２８４】（（ｂ）更なる腫瘍細胞標的および結合リ
ガンド）腫瘍細胞抗原への結合により凝固剤を腫瘍部位
に向けるために、抗体の使用に加えて他のリガンドも用
いることが可能である。過剰発現されたレセプター（エ
ストロゲンレセプター、ＥＧＦレセプター）または変異
レセプターである腫瘍抗原に関しては、対応するリガン
ドを標的化剤として用いることが可能である。 【０２８５】内皮細胞レセプターリガンドと同様に、特
異的または優先的に腫瘍細胞に結合する成分が存在し得
る。例えば、腫瘍抗原が過剰発現されたレセプターであ
る場合は、腫瘍細胞をインビボで特異的なリガンドでコ
ートし得る。その後にリガンドに対する抗体またはレセ
プター自体の形態を用いてリガンドを標的化することが
可能と思われる。これらのタイプの標的化剤の具体例
は、ＴＩＥ−１またはＴＩＥ−２リガンドに対する抗
体、第４血小板因子に対する抗体、および白血球接着結
合タンパク質である。 【０２８６】（２．他の疾患標的）更なる実施態様にお
いて、第一の結合領域は、腫瘍部位以外の疾患部位にお
いて特異的または優先的に発現される標的分子に結合す
る成分であってもよい。 【０２８７】他の疾患細胞に関連する標的分子の例は、
例えば、乾癬に関連する白血球接着分子；増殖性糖尿病
性網膜症に関連するＦＧＦ；様々な疾患における活性化
内皮細胞に関連する第４血小板因子；および血管増殖性
疾患に関連するＶＥＧＦを含む。上記疾患のいずれか一
つを有する動物または患者は、疾患部位に凝固を特異的
に誘導することによって恩恵を受けると思われる。 【０２８８】ＫｌａｇｓｂｕｒｎおよびＦｏｌｋｍａｎ
（１９９０）に記載される、通常の血管依存性病因を有
することが知られている疾患もまた、本明細書に記載す
る二重特異性リガンドを用いて処置し得る。特に、血管
内皮細胞標的化リガンドまたは間質標的化リガンドを用
いて疾患部位における凝固を達成できる。ＢＰＨ、糖尿
病性網膜症、血管再狭窄、血管癒着、ＡＶＭ、髄膜腫、
血管腫、血管新生緑内障、リューマチ性関節炎および乾
癬の処置が現在特に考えられる。 【０２８９】（３．疾患関連血管系細胞標的）血管系の
細胞は、本発明における標的としての使用が意図され
る。これらの場合、二重特異性リガンドの１つの結合領
域が、疾患関連血管系内皮細胞によって優先的に発現さ
れる接近可能マーカーに結合し得る。血管内皮細胞が、
疾患領域、および局所的な異常生理プロセスによる産物
に近接しているため、血管マーカーの搾取作用が可能と
なる。例えば、腫瘍血管内皮細胞は、内皮細胞の表現型
プロフィールを変化させる、腫瘍細胞および腫瘍由来産
物にさらされる。 【０２９０】腫瘍細胞は、リンホカイン、モノカイン、
コロニー刺激因子、成長因子および血管形成誘導因子の
ような腫瘍由来産物を合成する（ｅｌａｂｏｒａｔｅ）
ことが知られており、これらの腫瘍由来産物は、近隣の
血管内皮細胞（Ｋａｎｄｅｌら、１９９１；Ｆｏｌｋｍ
ａｎ、１９８５ａ、ｂ）およびサイトカイン（Ｂｕｒｒ
ｏｗｓら、１９９１； Ｒｕｃｏら、１９９０； Ｂｏ
ｒｄｅｎら、１９９０）に作用する。腫瘍産物は、内皮
細胞に結合し、そして特定の分子の発現を選択的に誘導
する。これらの誘導された分子が、本発明の特定の局面
によって提供される腫瘍内皮特異性コアギュラント送達
を用いて標的化され得る。腫瘍内の血管内皮細胞は、多
様な正常組織内の内皮細胞より３０倍速い速度で増殖し
（Ｄｅｎｅｋａｍｐら、１９８２）、このことは増殖関
連決定基が、腫瘍血管内皮細胞のマーカーとして作用し
得ることを示唆している。 【０２９１】本発明の特定の実施態様において、二重特
異性リガンドの標的化成分は、腫瘍血管系に対して比較
的高い特異性を有する成分である。これらの標的化成分
は、腫瘍内皮において発現される分子と結合するが、正
常内皮細胞の表面においては、ほとんどまたは全く発現
のない成分として定義され得る。このような特異性は、
当業者にとっては慣例である、組織切片の免疫染色の標
準的な手順によって評価され得る。 【０２９２】しかし、上述したように、本発明の利得
は、選択性の要求が、先行技術の方法、特にイムノトキ
シンを用いる方法において以前必要とされていたほど厳
密ではない点にある。これはなぜなら、凝固剤の誤った
標的化に伴ういかなる副作用も、トキシンの誤った標的
化から生じる副作用と比較すると最小となるからであ
る。 【０２９３】従って、本発明の二重特異性リガンドまた
は抗体を用いて標的化される分子は、腫瘍血管系上にお
いて、正常内皮細胞よりも高いレベルにて発現される分
子と一般的に提唱される。 【０２９４】（（ａ）疾患における血管内皮細胞マーカ
ー）疾患部位または疾患環境内の血管内皮細胞の表面に
おいて優先的に発現することが知られている分子は、本
明細書中において、「自然疾患関連血管内皮細胞マーカ
ー」と称される。この用語は、増加した、または不適切
な脈管形成または内皮細胞の増殖に関連した疾患におい
て発現される内皮細胞成分を、簡潔にいうために用いら
れる。１つの特定の例として、腫瘍由来因子に応答して
インサイチュで発現される腫瘍内皮細胞成分が挙げられ
る。これらの成分はまた、「自然誘導腫瘍内皮細胞マー
カー」とも称される。 【０２９５】ＶＥＧＦ／ＶＰＦ（血管内皮増殖因子／血
管透過性因子）、およびＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）
ファミリーの構成要素の両方が、腫瘍血管系内または腫
瘍血管系上において濃縮される。従って、対応するレセ
プターは、腫瘍血管系上に潜在的な攻撃の標的を提供す
る。例えば、ＶＥＧＦレセプターは、齧歯類およびヒト
の両方において、正常組織内の内皮細胞と対照的に、腫
瘍内皮細胞上においてアップレギュレートされることが
知られている（Ｔｈｉｅｍｅら、１９９５）。おそら
く、これは腫瘍微環境の特徴である低酸素の結果である
（Ｌｅｉｔｈら、１９９２）。ＦＧＦレセプターはま
た、低酸素にさらされた内皮細胞上において３倍アップ
レギュレートされ、それゆえ腫瘍においてアップレギュ
レートされると考えられている（Ｂｉｃｋｎｅｌｌおよ
びＨａｒｒｉｓら、１９９２）。 【０２９６】内皮細胞上のＴＧＦβ（トランスフォーミ
ング成長因子β）レセプター（エンドグリン）は、分裂
細胞上でアップレギュレートされ、他の標的を提供す
る。本発明者の一人は、エンドグリンが、培養中の、活
性化されて分裂しているＨＵＶＥＣにおいてアップレギ
ュレートされ、そして広範囲の固形腫瘍および胎盤胎児
部を含む、血管新生の部位における内皮細胞上でヒト組
織において強く発現されることを見いだした。対照的
に、前新生物病巣を含む、多様な非悪性成人組織の大半
における内皮細胞は、ほとんどまたは全くエンドグリン
を含有しない。重要なことに、エンドグリン発現は、Ｔ
ＥＣ−４およびＴＥＣ−１１抗体が低いレベルで良性線
維腺種および初期のガンに結合すること、ならびにこれ
らの抗体が高いレベルで後期腺管内ガンおよび浸潤ガン
に結合することにより示されるように、胸部における新
生物進行と相関すると考えられている。 【０２９７】他の自然疾患関連血管内皮細胞マーカー
は、ＴＩＥ、ＶＣＡＭ−１、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレ
クチン、αＶβ３インテグリン、プレイオトロピンおよ
びエンドシアリンを含み、それぞれが本発明を用いて標
的化され得る。 【０２９８】（（ｂ）サイトカイン誘導性血管内皮マー
カー）しばしば身体における局所的な機能不全を起こす
疾患プロセスの性質により、他の組織に比較的影響する
ことなく、疾患部位を操作する方法が利用可能である。
これは、動物の身体内において別個の物として存在する
悪性および良性腫瘍に特に当てはまる。例えば、腫瘍血
管内皮細胞に特異的なさらなるマーカーをつくるよう
に、腫瘍環境を操作し得る。これらの方法は、概して固
形腫瘍において自然に生じる腫瘍環境を模倣し、また、
近接する血管内皮細胞の表面において特定の分子の特異
的発現を誘導する、成長因子またはサイトカインのよう
なシグナル因子の局所的な産生を伴う。 【０２９９】疾患または腫瘍環境における血管内皮細胞
の表面において発現するように人工的に誘導され得る分
子群は、本明細書において「誘導性内皮細胞マーカ
ー」、または特定的には誘導性腫瘍内皮細胞マーカーと
称される。この用語は、動物内の疾患または腫瘍発達プ
ロセスの一部として誘導されるマーカーではなく、人工
的に誘導される、つまり人の手による操作の結果誘導さ
れるマーカーを指すのに用いられる。上記定義された用
語「誘導性マーカー」を、「自然マーカー」も例えば腫
瘍由来因子によって誘導されるという事実にも関わら
ず、本出願における簡潔な表記のために選択した。 【０３００】従って、本発明を実施するためには必要で
はないが、疾患関連血管系の表面上の血管内皮抗原標的
の選択的誘起のための技法が利用可能であり、これは、
所望であれば本発明と併用して用いられ得る。これらの
技法は、抗原発現、すなわち細胞表面提示を操作して、
標的抗原が、疾患関連血管系の表面において発現または
利用可能にされるが、正常内皮の表面上では発現されな
い、あるいは接近可能または結合のために利用可能にさ
れない、または少なくともより少ない程度にされるよう
にする。 【０３０１】腫瘍内皮マーカーは、腫瘍由来サイトカイ
ン（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９１；Ｒｕｃｏら、１９９
０）および血管形成誘導因子（Ｍｉｇｎａｔｔｉら、１
９９１）によって誘導され得る。本発明によって提供さ
れる、腫瘍内皮において特異的に誘導され得、次いで二
重特異性凝固リガンドを用いて標的化され得る細胞表面
マーカーの例には、表ＩＩＩに示されるものが含まれる
（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、１９８７； Ｄｕｓｔｉｎ
ら、１９８６； Ｏｓｂｏｒｎら、１９８９； Ｃｏｌ
ｌｉｎｓら、１９８４）。 【０３０２】提案されるマーカーの誘導のメカニズム；
ＩＬ−１およびＩＦＮ−γのような誘導、すなわち「中
間サイトカイン」；ならびに、その標的化によってサイ
トカインの放出が生じる白血球細胞タイプおよび関連す
るサイトカイン活性分子もまた、表ＩＩＩに示されてい
る。特異的なマーカーの誘導の際には、二重特異性「サ
イトカイン誘導」または、「抗原誘導」抗体が通常必要
とされる。この抗体は、腫瘍の場所における適切なサイ
トカインの放出を選択的に誘導し、従って、血管内皮細
胞による、所望の標的抗原の発現を選択的に誘導する。
二重特異性抗体は、腫瘍塊およびサイトカイン産生白血
球の細胞を架橋し、その結果白血球を活性化し、サイト
カインを放出する。 【０３０３】これらのような、二重特異性抗体の調製お
よび使用は、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１６およびＣＤ２
８を認識する架橋抗体が、第２抗原と架橋して、サイト
カイン産生を選択的に誘起するという先に示された事実
に部分的に基づいている（Ｑｉａｎら、１９９１）。本
発明においては、首尾良く腫瘍細胞架橋された白血球の
みが活性化され、サイトカインを放出するので、サイト
カイン放出は、腫瘍の場所に限定される。従って、Ｅ−
セレクチンのような所望のマーカーの発現も同様に、腫
瘍血管系の内皮に限定される。 【０３０４】 【表３】 表ＩＩＩに示される可能な誘導性マーカーの内、Ｅ−セ
レクチンおよびＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬ
Ａ−ＤＱのようなＭＨＣクラスＩＩ抗原（Ｃｏｌｌｉｎ
ｓら、１９８４）が、臨床実施態様と合わせて使用され
る断然最も好ましい標的であることに留意することが重
要である。表ＩＩＩの他の接着分子は、正常組織、通常
はリンパ器官内および内皮上において、変化する程度に
発現し、このことはこれらの標的化をおそらく、動物モ
デルにおいて、または正常組織におけるそれらの発現が
有意な副作用なしに阻害され得る場合にのみに適切にし
ている。Ｅ−セレクチンまたはＭＨＣクラスＩＩ抗原の
標的化が好ましい。なぜなら、これらの抗原の発現が、
腫瘍結合内皮において選択的に最も直接的に促進しそう
であるからである。 【０３０５】（Ｅ−セレクチン）正常内皮の表面におい
て発現されない抗原の標的化は、誘導法の最も率直な形
態である。Ｅ−セレクチンは、正常内皮血管系、または
他のヒト細胞タイプにおいて発現されない接着分子であ
るが（Ｃｏｔｒａｎら、１９８６）、ＩＬ−１、ＴＮ
Ｆ、リンホトキシンおよび細菌エンドトキシンのような
サイトカインの作用によって、内皮細胞の表面上に誘導
され得る（Ｂｅｖｉｌａｃｑｕａら、１９８７）。これ
は、ＩＦＮ−γによっては誘導されない（Ｗｕら、１９
９０）。従って、Ｅ−セレクチンの発現は、そのような
サイトカインの選択的な送達を介して、または腫瘍環境
においてそのようなサイトカインの選択的な放出を生じ
る組成物の使用を介して、腫瘍内皮中に選択的に誘導さ
れ得る。 【０３０６】二重特異性抗体は、腫瘍部位において、１
つ以上の上記またはその他の適切なサイトカインの選択
的な放出を生じ得るが、身体のその他の部分において放
出を生じ得ない組成物の一例である。そのような二重特
異性抗体は、本明細書において、「抗原誘導抗体」と称
され、当然、標的化および凝固成分を有する、本発明の
任意の二重特異性抗体とは異なる。抗原誘導抗体は、単
球／マクロファージ系列（ｌｉｎｅａｇｅ）、Ｔ細胞、
および／またはＮＫ細胞、あるいは肥満細胞のようなサ
イトカインエフェクター細胞と、標的化された固形腫瘍
塊の腫瘍細胞とを架橋するように設計される。次いで、
この架橋は、架橋の部位、すなわち腫瘍に局在化された
サイトカインの放出をもたらす。 【０３０７】有効な抗原誘導抗体は、一方で選択された
腫瘍細胞表面抗原（例えば、表Ｉにおける腫瘍細胞表面
抗原）を認識し、他方で選択された白血球細胞タイプの
表面上の選択された「サイトカイン活性化」抗原を認識
する。「サイトカイン活性化」抗原という用語は、抗体
またはそのフラグメント、もしくは自然に生じる因子ま
たはその合成アナログのようなエフェクター分子によっ
て結合されると、それが可溶性因子であっても他の細胞
上の膜結合カウンターレセプターであっても、白血球細
胞によってサイトカインの放出を促進する白血球の表面
上の種々の既知の分子のいずれをも指すために用いられ
る。サイトカイン活性化分子の例にはそれぞれ、ＩＬ−
１およびＴＮＦαの放出を活性化するＣＤ１４（ＬＰＳ
レセプター）およびＩｇＥに対するＦｃＲ；ならびにＩ
ＦＮγおよびＴＮＦβの放出を活性化するＣＤ１６、Ｃ
Ｄ２、またはＣＤ３、または、ＣＤ２８が含まれる。 【０３０８】そのような抗原誘導二重特異性抗体は、い
ったん腫瘍を有する動物の血流に導入されると、腫瘍内
の腫瘍細胞に結合し、それらの腫瘍細胞を、腫瘍に浸潤
したエフェクター細胞（例えば単球／マクロファージ）
と架橋し、その後、腫瘍内のサイトカインの選択的な放
出をもたらす。しかし、重要なことに、腫瘍および白血
球の架橋なしに、抗原誘導抗体は、サイトカインの放出
をもたらさない。従って、腫瘍から離れた身体の部分に
おいて、サイトカイン放出は生じないため、サイトカイ
ン誘導分子（例えば、Ｅ−セレクチン）の発現は、腫瘍
内皮内のみに生じる。 【０３０９】適切な二重特異性抗体と架橋されると、架
橋された白血球によってサイトカインの放出を生じる、
多数の有用な「サイトカイン活性化」抗原が知られてい
る。この目的のために通常好ましい標的は、単球および
マクロファージの表面において見いだされるＣＤ１４で
ある。ＣＤ１４は架橋されると、単球／マクロファージ
を刺激し、ＩＬ−１（Ｓｃｈｕｔｔら、１９８８； Ｃ
ｈｅｎら、１９９０）、およびおそらく他のサイトカイ
ンを放出し、これらは次いで、近接する血管系上のＥ−
セレクチンの出現を刺激する。Ｅ−セレクチン誘導およ
び標的化に関連した他の可能な架橋の標的には、肥満細
胞上に見いだされるＩｇＥに対するＦｃＲ；ＮＫ細胞上
に見いだされるＩｇＧ（ＣＤ１６）に対するＦｃＲ；お
よびＴ細胞の表面上に見いだされるＣＤ２、ＣＤ３また
はＣＤ２８が含まれる。他の白血球細胞タイプよりも、
固形腫瘍の単球／マクロファージ浸潤が相対的に分布す
るため、これらの内、ＣＤ１４標的化が通常望ましい。 【０３１０】誘導実施態様の例において、固形腫瘍を有
している動物に、二重特異性（Ｆａｂ’−Ｆａｂ’）抗
ＣＤ１４／抗腫瘍抗体（例えば、高Ｍｒメラノーマ抗原
ＯＶ−ＴＬ３に対する抗−ＣＥＡ、９．２．２７抗体、
または卵巣関連抗原に対するＭＯｖ １８抗体）を注射
する。抗体は、その腫瘍結合活性によって、腫瘍内に局
在化し、次いで、腫瘍内の単球およびマクロファージ
を、それらのＣＤ１４抗原を架橋することによって活性
化する（Ｓｃｈｕｔｔら、１９８８； Ｃｈｅｎら、１
９９０）。活性化された単球／マクロファージは、抗腫
瘍性活性を有し（Ｐａｌｌｅｒｏｎｉら、１９９１）、
そして腫瘍血管内皮細胞上のＥ−セレクチン抗原をすば
やく誘導するＩＬ−１およびＴＮＦを放出する（Ｂｅｖ
ｉｌａｃｑｕａら、１９８７； Ｐｏｂｅｒら、１９９
１）。 【０３１１】（ＭＨＣクラスＩＩ抗原）本発明における
使用が考えられる誘導性マーカーの第２の好ましいグル
ープは、ＨＬＡ−ＤＡ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−Ｄ
Ｑを含むＭＨＣクラスＩＩ抗原（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１
９８４）である。クラスＩＩ抗原は、ヒトを含む数種類
の種のほとんどの正常な組織内の血管内皮細胞上で発現
される。インビトロ（Ｃｏｌｌｉｎｓら、１９８４；Ｄ
ａａｒら、１９８４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９９
０）およびインビボ（Ｇｒｏｅｎｅｗｅｇｅｎら、１９
８５）での研究により、血管内皮細胞によるクラスＩＩ
抗原の発現には、ＴＨ１細胞によって形成され、そして
ＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によってもより低い程度
に形成されるＩＦＮ−γの継続した存在が要求されるこ
とが示されている。 【０３１２】ＭＨＣクラスＩＩ抗原は血管内皮細胞に特
有のものでなく、マウス（Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ、１９
７６）およびヒト（Ｄａａｒら、１９８４）の双方にお
いて、Ｂ細胞、活性化されたＴ細胞、単球／マクロファ
ージ系統の細胞、およびある種の上皮細胞上においても
構成的（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｌｙ）に発現する。
「正常な」内皮上でのＭＨＣクラスＩＩ抗原の発現のた
め、それらの標的化はＥ−セレクチンほどには簡単では
ない。しかし、正常な組織内でのクラスＩＩ分子の発現
を効果的に抑制する能力を有するシクロスポリンＡ（Ｃ
ｙｃｌｏｓｐｏｒｉｎ Ａ； ＣｓＡ）など（Ｇｒｏｅ
ｎｅｗｅｇｅｎら、１９８５）の免疫抑制剤と関連して
使用することによって、ＭＨＣクラスＩＩ抗原の誘導お
よび標的化が可能となる。ＣｓＡは、Ｔ細胞およびＮＫ
細胞の活性化を防止することによって作用し（Ｇｒｏｅ
ｎｅｗｅｇｅｎら、１９８５；ＤｅＦｒａｎｃｏ、１９
９１）、それによってＩＦＮ−γの基底レベル（ｂａｓ
ａｌ ｌｅｖｅｌ）を内皮上におけるクラスＩＩの発現
を維持するのに必要とされるレベル以下に減少させる。 【０３１３】やはり免疫抑制効果を有し、クラスＩＩ発
現を抑制する能力を示すと思われる、シクロスポリン
Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｇなどを含む、ＣｓＡに関連するその
他各種のシクロスポリンが存在する。同様に有効であり
得るその他の作用剤には、ＦＫ５０６およびラパマイシ
ン（ｒａｐａｍｙｃｉｎ）が含まれる。 【０３１４】従って、ＭＨＣクラスＩＩ誘導および標的
化の実施態様の実施では、腫瘍を有する動物を、クラス
ＩＩ発現を抑制するために効果的な用量のＣｓＡまたは
他のクラスＩＩ免疫抑制剤で事前に処置することが必要
である。これはＣｓＡの場合、代表的には約１０から約
３０ ｍｇ／ｋｇ体重のオーダーである。正常組織内で
一旦抑制されると、クラスＩＩ抗原は、ここでも二重特
異性抗体の使用を通じて、腫瘍の内皮内に選択的に誘導
され得る。 【０３１５】この場合、抗原を誘導する二重特異性抗体
は、腫瘍細胞マーカーと、ＩＦＮ−γの生成を誘導する
ことのできるエフェクター細胞の表面上に見られる活性
化抗原とに対する特異性を有する。そのようなエフェク
ター細胞とは、一般的にはヘルパーＴ細胞（ＴＨ）また
はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。これらの実施
態様では、クラスＩＩ抗原の発現がＩＦＮ−γを用いて
達成され、他のサイトカインでは達成されないという点
で、Ｔ細胞またはＮＫ細胞（ＣＤ１６が使用される場
合）が腫瘍中に存在し、サイトカイン中間体を生成する
必要がある。従って、本発明のこの局面の実施のために
は、抗原を誘導する二重特異性抗体による標的化のため
のサイトカイン活性化抗原としてＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ
２８、最も好ましくはＣＤ２８、を選択することが望ま
しい。 【０３１６】腫瘍中で活性化されるべきＴ細胞は、血管
系に隣接するものである。細胞にとって最もアクセスし
得る領域であり、二重特異性抗体が最も集中するところ
でもあるからである。活性化されたＴ細胞は、その後、
ＩＦＮ−γを分泌し、これが隣接する腫瘍血管系上にク
ラスＩＩ抗原を誘導する。 【０３１７】一方のアームが腫瘍抗原に対して向けられ
ており、もう一方のアームがＣＤ２８に対して向けられ
ている二重特異性（Ｆａｂ’−Ｆａｂ’）抗体の使用
が、現状では好ましい。この抗体は、腫瘍中でＴ細胞上
のＣＤ２８抗原を架橋し、これは、（例えば、一般に腫
瘍細胞によって分泌されるＩＬ−１によって提供される
（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９１：Ｒｕｃｏら、１９９
０））第２の信号と組合わさった場合、Ｔ細胞をＣＡ
２＋−非依存性ＣｓＡ−非抑制性の経路を通じて活性化
することが示されている（Ｈｅｓｓら、１９９１；Ｊｕ
ｎｅら、１９８７；Ｂｊｏｒｎｄａｈｌら、１９８
９）。 【０３１８】種々のサイトカイン活性化分子に対する抗
体の調製も、当該分野で周知である。例えば、白血球に
よる、サイトカイン生成を誘導する能力を有する抗−Ｃ
Ｄ１４および抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体の調製お
よび使用は、今ではいくつかの研究室によって記述され
ている（Ｓｃｈｕｔｔら、１９８８；Ｃｈｅｎら、１９
９０；およびＪｕｎｅら、１９９０で、それぞれ概説さ
れている）。さらに、その他のメカニズムおよびその他
の活性化抗原を通じて白血球によるサイトカインの放出
を刺激するモノクローナル抗体の調製もまた、公知であ
る（Ｃｌａｒｋら、１９８６；Ｇｅｐｐｅｒｔら、１９
９０）。 【０３１９】さらなる実施態様では、クラスＩＩ分子の
発現を抑制し、そして腫瘍が存在する部分でのクラスＩ
Ｉ分子の発現を選択的に引き出すための別のアプローチ
が、意図される。ＣｓＡおよび二重特異性活性化抗体の
双方の使用を回避するこのアプローチは、Ｔ細胞による
ＩＦＮ−γの生成を抑制すること（例えば抗−ＣＤ４抗
体の使用を通じて（Ｓｔｒｅｅｔら、１９８９））によ
って、クラスＩＩ分子の発現が効果的に阻害され得ると
いう事実を利用する。この実施態様の使用において、Ｉ
ＦＮ−γの生成は抗−ＣＤ４を投与することによって阻
害され、結果的にクラスＩＩ発現の一般的な抑制とな
る。クラスＩＩは、その後、例えば腫瘍内部においての
み活性化可能である腫瘍特異的Ｔ細胞の使用により、腫
瘍サイトにおいてのみ誘導される。 【０３２０】この処置モードにおいては、一般的には動
物またはヒトの患者をＩＦＮ−γの生成を抑制するため
に効果的な用量の抗−ＣＤ４によって事前に処置し、そ
れによってクラスＩＩ分子の発現を抑制する。効果的な
用量は、例えば、約４〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重のオーダ
ーである。クラスＩＩ発現が抑制された後は、腫瘍細胞
の表面上に発現される抗原に対して特異的な、ＩＮＦ−
γを生成するＴ細胞クローン（例えば、Ｔｈ１または細
胞毒性のＴリンパ球、ＣＴＬ）が調製され、血流内へ導
入される。これらのＴ細胞はそれらの抗原認識能力のた
め腫瘍塊に局在化され、そのような認識が行われる際に
ＩＦＮ−γを放出する。このように、サイトカインの放
出はここでも腫瘍に対してのみ制限されて、従って、ク
ラスＩＩ分子の発現を腫瘍血管系に限定する。 【０３２１】ＩＦＮ−γを生成するＴ細胞クローンは、
末梢の血液から入手し得るが（Ｍａｚｚｏｃｃｈｉら、
１９９０）、好ましいソースは腫瘍塊の中からである
（Ｆｏｘら、１９９０）。そのようなＴ細胞クローンの
現行での好ましい調製手段では、患者から腫瘍塊の一部
分を取り除き；（必要に応じてコラゲナーゼ消化を用い
て）細胞を分離し；密度勾配遠心分離を用いて腫瘍に浸
透する白血球を濃縮し、続いて、（例えば特異性抗体と
補体とによる処置によって）その他の白血球の部分集合
を枯渇させ；その後、腫瘍に浸透する白血球をインビト
ロで拡大（ｅｘｐａｎｄ）させて、ＩＦＮ−γを生成す
るクローンを供給する。このクローンは、必然的に、患
者と免疫学的に適合し、従って、患者によって十分に許
容される。 【０３２２】各個別のクローンのサイトカイン分泌パタ
ーンを１４日毎に決定することによって、高ＩＦＮ−γ
生成Ｔ細胞クローンを、拡大させた白血球からさらに選
択し、そのことによって格別の利益を達成することがで
きることが提案されている。この目的のため、静止した
クローンは有糸分裂的または抗原的に２４時間刺激さ
れ、それらの培養上澄液は、例えば、特異的サンドイッ
チＥＬＩＳＡ技術（Ｃｈｅｒｗｉｎｓｋｉら、１９８
９）を使用して、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５およびＩＬ−１０の存在についてアッセイされ
る。ＴＨ１クローンの特徴的なサイトカイン分泌パター
ンである、高レベルのＩＬ−２およびＩＦＮ−γを分泌
するクローンが選択される。腫瘍特異性は、増殖アッセ
イを用いて確認される。 【０３２３】さらに、抗−ＣＤ４抗体として、抗−ＣＤ
４ Ｆａｂを採用することが好ましい。その理由は、こ
の抗体は注入後２４時間以内に身体から除去され、従っ
て後で投与される腫瘍認識Ｔ細胞クローンの抑制を生じ
させないからである。腫瘍特異性を有するＴ細胞クロー
ンの調製は、一般に当該分野で周知であり、例えば固形
の黒色腫に浸透するリンパ球からのＴ細胞クローンの生
成および特徴付けによって示される（Ｍａｅｄａら、１
９９１）。 【０３２４】ＭＨＣクラスＩＩ抑制−誘導法のいずれを
使用するにしても、静脈注射される抗−クラスＩＩ抗体
が、外皮細胞または肝臓および脾臓以外の正常な臓器内
の単球／マクロファージに達するようには見えないとい
う事実より、結果的に更なる利益が得られそうである。
これは、おそらく、ほとんどの正常な臓器内の血管内皮
は、肝臓および脾臓内でのように有窓性を有さずタイト
であり、従って抗体はクラスＩＩ−陽性細胞に達するた
めに基底膜を横切って拡散せねばならないからである。
また、例えば架橋に続いて、結果として生じ得るいかな
るＢ細胞除去も、これらの細胞がクラスＩＩ陰性の先祖
細胞から補充されるので、重要な問題を提示しそうにな
い（Ｌｏｗｅら、１９８６）。Ｂリンパ腫の患者に起こ
るＢ細胞の殺傷さえも、明らかな害を生じるものではな
い（Ｖｉｔｅｔｔａら、１９９１）。 【０３２５】要約すると、本発明の腫瘍凝固組成物およ
び抗体はすっきりとシンプルであり、それらの操作性に
関して抗原の誘導を必要としないが、抗原を誘導する二
重特異性抗体の、本発明と組み合わせた使用も意図され
ている。そのような抗体は一般的に、本発明の二重特異
性凝固リガンドに先立って、投与される。 【０３２６】一般的に言って、「免疫原性」の腫瘍であ
るほど、例えば腫瘍内のＴ細胞の抗−ＣＤ２８／抗−腫
瘍二重特異性抗体を通じての架橋を含む、ＭＨＣクラス
ＩＩアプローチにより適している。その理由は、これら
の腫瘍はＴ細胞によってより浸透されやすいからであ
り、このことはこの方法が有効であるための前提条件だ
からである。免疫原性固形腫瘍の例として、腎臓ガン
腫、黒色腫、少数の乳ガンおよび結腸ガンの他に、可能
性のあるものとして膵臓ガン、胃ガン、肝臓ガン、肺ガ
ンおよび神経膠ガンが含まれる。これらの腫瘍は、「免
疫原性」として言及される。それは、これらが宿主中で
免疫反応を引き起こす証拠が在り、細胞免疫療法を施せ
ることが判明しているからである（Ｙａｍａｕｅら、１
９９０）。黒色腫および大腸ガンの場合、これらの事例
での使用が最も好ましい抗体は、Ｂ７２．３（抗−ＴＡ
Ｇ−７２）およびＰＲＳＣ５／ＰＲ４Ｃ２（抗−Ｌｅｗ
ｉｓａ）または９．２．２７（抗−高 Ｍｒ 黒色腫抗
原）である。 【０３２７】全ての起源の固形腫瘍の多数について、マ
クロファージ／単球中間体を採用する抗−ＣＤ１４アプ
ローチがより適切である。これは、ほとんどの腫瘍はマ
クロファージを豊富に含んでいるからである。マクロフ
ァージを豊富に含む腫瘍の例として、ほとんどの乳ガン
腫、結腸ガン腫および肺ガン腫が含まれる。これらの事
例での使用が好ましい抗−腫瘍抗体の例として、抗−Ｈ
ＥＲ−２、Ｂ７２．３、ＳＭ−３、ＨＭＦＧ−２、およ
びＳＷＡ１１がある（Ｓｍｉｔｈら、１９８９）。 【０３２８】（（ｃ）コアギュラント誘導性マーカー）
トロンビン、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／Ｘａ因子、プ
ラスミンおよび、間質性コラゲナーゼ、ストロメリシン
およびゼラチナーゼなどの金属結合タンパク分解酵素な
どのコアギュラントは、ある種のマーカーを誘導するよ
うにも作用する。特に、Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチ
ン、ＰＤＧＦおよびＩＣＡＭ−１は、トロンビンによっ
て誘導される（Ｓｕｇａｍａら、１９９２；Ｓｈａｎｋ
ａｒら、１９９４）。 【０３２９】従って、この誘導については、抗−コアギ
ュラント／抗−腫瘍二重特異性抗体が利用される。抗体
は、その腫瘍結合活性によって腫瘍内に局在化される。
その後、二重特異性体はコアギュラント（例えばトロン
ビン）を腫瘍内に濃縮し、結果的に腫瘍血管内皮細胞上
でのＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンの誘導が得ら
れる（Ｓｕｇａｍａら、１９９１；Ｓｈａｎｋａｒら、
１９９４）。 【０３３０】あるいは、短縮型組織因子の腫瘍細胞また
は内皮への標的化が、腫瘍内でのトロンビンの堆積を誘
導する。トロンビンが堆積されると、腫瘍血管内皮細胞
上にＥ−セレクチンおよびＰ−セレクチンが誘導され
る。 【０３３１】（（ｄ）血管内皮細胞マーカーに対する抗
体）疾患関連血管系標的を認識するための直載的な手段
は、自然環境においてまたは人工的な手段によって誘導
されたものかに関係なく、特定の細胞表面レセプター、
分子または抗原に対して結合親和力を有する抗体を使用
する。これらは、例えば腫瘍血管内皮細胞上に存在する
ことが知られているもの、腫瘍に由来する因子に反応し
て誘導あるいは過剰発現されるもの、およびヒトの手に
よる操作に従って誘導されるものである、全ての細胞表
面成分に対する抗体を含む。表ＩＶおよび表Ｖに、有用
な抗体およびそれらの特性を要約する。 【０３３２】 【表４】 【０３３３】 【表５】 本発明で使用し得るさらなる２種類の抗体は、Ｒｅｔｔ
ｉｇら（１９９２）およびＷａｎｇら（１９９３）によ
って記載された、ヒトの腫瘍の血管系内に発現されるが
ほとんどの正常な組織内では発現されない、未知の機能
を有する関連のない抗原に対する抗体である。 【０３３４】Ｋｉｍら（１９９３）によって記載された
抗体も、特にこの抗体がインビボで血管形成を阻害し腫
瘍の成長を抑制したので、本発明で使用し得る。 【０３３５】ヒトの腫瘍について特異的であることが以
前に示されていない抗体も使用し得る。例えば、Ｖｅｎ
ｋａｔｅｓｗａｒａｎら（１９９２）は、抗−ＦＧＦ
ＭＡｂｓの生成を記載した。Ｘｕら（１９９２）は、Ｆ
ＧＦレセプター（ｆｌｇ）イソ型に対する、１６個のイ
ソ型およびドメイン特異的ポリクローナルおよびモノク
ローナル抗体のパネルの開発および特徴付けを行った。
Ｍａｓｓｏｇｌｉａら（１９８７）も、ＦＧＦに対する
ＭＡｂｓを報告した。 【０３３６】（（ｅ）疾患血管系に対する抗体の生成）
上記の抗体および科学文献において公知で公表されてい
るその他の抗体など、既知の抗体を利用することに加え
て、以下により詳細に説明されるように、通常の免疫化
手順を使用することによっても新規な抗体を生成し得
る。周知の疾患関連血管マーカー抗原に対する抗体を生
成するために、抗原を含む免疫原性組成物によって動物
を免疫化する。これは、抗原を含む、あるいは抗原が濃
縮された膜調製物；細胞または膜から分離されたような
抗原の比較的精製された形態；例えば、天然の抗原抽出
物または組換型宿主細胞から得られた抗原の組換型の形
態を用いる、種々の精製工程によって得られるような、
抗原の高度に精製された形態であり得る。 【０３３７】本発明は、疾患関連血管系内皮細胞上に存
在する抗原に対する抗体を生成するための更なる方法を
も提供し、それらの方法は抗原の生化学的本質が未知で
ある場合であっても使用に適切である。これらの方法
は、腫瘍血管系内皮細胞に対する抗体の生成を通じて例
示される。この様式により抗体の生成を達成する第１の
手段には、動物またはヒトの患者の腫瘍部位から得られ
る血管内皮細胞の調製物が用いられる。そのような細胞
の調製物で単に実験動物を免疫化することにより、生成
される抗体を回収する。この方法の最も有効な形態は、
特異的抗体がついで選択されるが、これは従来のハイブ
リドーマ技術および腫瘍血管系内皮細胞に対するスクリ
ーニングを使用することにより達成され得る。 【０３３８】上記方法の発展は、インビトロで腫瘍血管
系事象を模倣するものであり、細胞の精製は必要ではな
い。この方法の使用では、内皮細胞を、動物中よりもむ
しろ細胞培養中の腫瘍馴化培地から得られ得るような、
腫瘍に由来する生成物にさらす。この方法は、一般的に
内皮細胞を腫瘍馴化培地で刺激すること、および刺激さ
れた内皮細胞を免疫原として適用し、抗体の収集物を調
製することを包含する。ここでも、特異的抗体が選択さ
れるが、それは例えば従来のモノクローナル抗体技術、
または免疫化し動物の脾臓から単離されたＲＮＡから調
製された組み合わせ的な免疫グロブリンファージミドラ
イブラリなどのその他の技術を用いる。腫瘍に刺激され
た血管内皮を優先的に認識し、正常なヒト成人の組織と
よりも腫瘍関連内皮細胞とより強く反応する特異的抗体
が選択される。 【０３３９】この点に関して使用を意図される刺激され
た内皮細胞は、例えば、ヒト臍静脈内皮細胞（ｈｕｍａ
ｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌ
ｉａｌ ｃｅｌｌｓ； ＨＵＶＥ）、ヒト皮膚細血管内
皮細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｍｉｃｒｏｖａｓ
ｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ；Ｈ
ＤＥＭＣ）、ヒト伏在静脈内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｓａ
ｐｈｅｎｏｕｓ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ
ｃｅｌｌｓ）、ヒト大網脂肪内皮細胞（ｈｕｍａｎ ｏ
ｍｅｎｔａｌ ｆａｔ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅ
ｌｌｓ）、その他のヒト細血管内皮細胞、ヒト脳の毛細
管内皮細胞などである。本願明細書の記述に従い、他種
からの内皮細胞が、腫瘍馴化培地によって刺激され得、
免疫抗原として用いられてハイブリドーマを生成し抗体
を生産することも意図される。すなわち腫瘍で刺激され
たヒトの血管内皮細胞と交差反応する抗体、および／ま
たは前臨床モデルで使用する抗体を生成することも、意
図される。 【０３４０】本明細書において、「腫瘍馴化培地」は、
ひとつまたはそれ以上の腫瘍に由来するサイトカイン、
リンフォカインまたはその他のエフェクター分子を含有
する培養培地のような組成物または培地として定義され
る。最も典型的には、腫瘍馴化培地は、選択された腫瘍
細胞が培養され、従ってそのような腫瘍に由来する生成
物が濃縮される培養培地から調製される。培地のタイプ
は、少なくとも初期の時点で腫瘍細胞の増殖を維持する
のに適切な養分と条件とを含有する限り、特に重要とは
考えられない。腫瘍馴化培地から物質を抽出しさらには
分離し、ひとつまたはそれ以上の抽出物を内皮細胞に適
用することも、もちろん可能である。 【０３４１】培地の調製のために使用される腫瘍のタイ
プに関しては、究極的に本発明を使用する分析または処
置を受ける腫瘍を模倣するまたはそれに類似する腫瘍を
採用することがもちろん好ましい。従って、例えば、乳
ガンの治療のためのプロトコールの開発を予測する場
合、ＺＲ−７５−１、Ｔ４７Ｄ、ＳＫＢＲ３、ＭＤＡ−
ＭＢ−２３１などの乳ガン細胞を採用することが好まし
い。結直腸腫瘍の場合、ＨＴ２９ガン腫と同様ＤＬＤ−
１、ＨＣＴ１１６若しくはＳＷ４８またはＳＷ１２２
が、例として言及され得る。肺腫瘍の場合、ＮＣＩ−Ｈ
６９、ＳＷ２、ＮＣＩ Ｈ２３、ＮＣＩ Ｈ４６０、Ｎ
ＣＩ Ｈ６９、またはＮＣＩ Ｈ８２が、例として言及
され得る。黒色腫の場合の良い例は、ＤＸ．３、Ａ３７
５、ＳＫＭＥＬ−２３、ＨＭＢ−２、ＭＪＭ、Ｔ８また
は実際にＶＵＰである。上記のいかなる場合も、処置さ
れるべき腫瘍から生成された細胞、すなわち生検から得
られた細胞も採用され得ることが更に考えられる。 【０３４２】一旦調製されると、腫瘍馴化培地は、つい
で内皮細胞の細胞表面上の腫瘍内皮細胞特異的マーカー
の出現を刺激するために用いられる。例えば、選択され
た内皮細胞を腫瘍馴化培地（またはそれに由来する生成
物）の存在下で培養することを含む。ここでも、採用さ
れる内皮細胞のタイプは、それが最終的に治療または診
断されるべき特定の腫瘍の血管系に関連する内皮細胞を
一般的に代表する限り、決定的に重要でないことが提案
される。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥ）またはヒト皮
膚細血管内皮細胞（ＨＤＭＥＣ、Ｋａｒａｓｅｋ、１９
８９）を適用することが好ましい。なぜならヒトにその
起源を有し、サイトカイン成長因子および血管形成因子
に反応し、容易に得られるからである。しかし、インビ
トロで培養し得るいかなる内皮細胞も本発明の実施にお
いて採用され得、やはり有益な結果を達成し得ることが
期待されている。ＥＡ．ｈｙ９．２６、ＥＣＶ３０４、
ヒトの伏在静脈内皮細胞などが、例として言及され得
る。 【０３４３】一旦、腫瘍に由来する生成物を用いて刺激
されると、内皮細胞はその後、モノクローナル抗体（Ｍ
Ａｂ）の調製の免疫原として適用される。抗原細胞表面
マーカーに対するＭＡｂを調製する技術はまったく明確
であり、当業者に周知の技術を使用することにより容易
に実施され得る。これは、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓ
ｔｅｉｎ（１９７５）の手順によって例示され、以下で
更に説明される。 【０３４４】一般的に言って、刺激された内皮細胞を使
用してＭＡｂを調製する好ましい方法は、以下の手順を
包含する。ヒト腫瘍由来の細胞または細胞株が、組織培
養で４日間またはそれ以上増殖される。組織培養上澄液
（「腫瘍馴化培地」）を腫瘍細胞培養液から取り出し、
ＨＵＶＥＣの培養液へ５０％（ｖ／ｖ）の最終濃度とな
るように加える。２日間の培養の後、ＨＵＶＥＣは非酵
素的に回収され、１〜２×１０６個の細胞がマウスの腹
腔内に注入される。このプロセスを、２週間の間隔をお
いて３回繰り返し、最終の免疫化は静脈ルートによる。
３日後、脾臓細胞を採取し、通常のプロトコール（Ｋｏ
ｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、１９７５）に従って
ＳＰ２／０骨髄腫細胞と融合し、適切な反応性を有する
抗体を生成するハイブリドーマを限界希釈法によってク
ローン化する。 【０３４５】結果として生じるハイブリドーマのコレク
ションから、活性化されていない血管内皮を認識する以
上に活性化された血管内皮を認識する抗体を生成する、
ひとつまたはそれ以上のハイブリドーマを選択する。ひ
とつのゴールは、正常な内皮に対する結合親和力を実質
的に有しない抗体の同定である。しかし、先行技術と比
較した際、本発明においてはこの特性は決定的ではな
い。いずれにしても、腫瘍により活性化された内皮細胞
のひとつまたはそれ以上のタイプに対する適切な抗体生
成ハイブリドーマは、例えばＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＩＲ
ＭＡ、ＩＩＦ、または同様の免疫アッセイを用いるスク
リーニングによって、一般的に同定される。一旦候補が
同定されると、活性化されていないまたは「正常な」内
皮あるいはその他の正常な組織または細胞のタイプに対
する反応性の欠損についてのテストが望まれている。こ
の様に、特定の適用に際して予測される望ましくない高
レベルの正常な交差反応性を有する抗体を生成するハイ
ブリドーマを排除し得る。 【０３４６】（（ｆ）抗エンドグリン抗体）上記の技術
を使用することにより、腫瘍血管内皮細胞に対する比較
的特異性を有する抗体が調製および分離された。ひとつ
の特定の例では、ＨＴ２９ガン腫細胞を用いて馴化培地
を調製し、ついで、これを用いて培養中のＨＵＶＥ細胞
を刺激した。結果として生じたＨＴ２９−活性化ＨＵＶ
Ｅ細胞は、ついで、ハイブリドーマバンクの調製の免疫
原として用いられ、ハイブリドーマバンクはＨＴ２９−
活性化ＨＵＶＥ細胞を使用するＥＬＩＳＡ−スクリーニ
ング、さらにはヒトの腫瘍および正常組織の切片の免疫
組織学的分析によってスクリーニングされた。このバン
クから、腫瘍血管内皮細胞抗原を認識する抗体が選択さ
れた。 【０３４７】腫瘍内皮細胞抗体４および腫瘍内皮細胞抗
体１１（ＴＥＣ４およびＴＥＣ１１）と命名されたＭＡ
ｂは、上記方法を使用して得られた。ＴＥＣ４およびＴ
ＥＣ１１によって認識される抗原は、最終的には分子エ
ンドグリンであると決定された。ＴＥＣ４およびＴＥＣ
１１によって認識されるエンドグリン上のエピトープは
刺激されたＨＵＶＥ細胞の細胞表面上に存在し、刺激さ
れていない細胞の表面上には最小限度でのみ（または免
疫学的に接近可能な程度）存在する。エンドグリンに対
するＭＡｂはすでに生成されている。しかし、ＨＵＶＥ
ＣまたはＴＣＭ−活性化ＨＵＶＥＣ細胞表面決定基との
反応性をＦＡＣＳまたは間接免疫蛍光検査法によって分
析することにより、ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１によ
って認識されるエピトープが４４Ｇ４と命名された以前
の抗体（ＧｏｕｇｏｓおよびＬｅｔａｒｔｅ、１９８
８）のそれとは異なることが示される。 【０３４８】公知の任意の抗エンドグリン抗体（例え
ば、ＧｏｕｇｏｓおよびＬｅｔａｒｔｅ、１９８８；Ｇ
ｏｕｇｏｓら、１９９２；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、１９
９２；Ｂｕｈｒｉｎｇら、１９９１）が本発明と関連し
て使用され得るが、ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１ ｍ
Ａｂが特に適切であると考えられる。これは、それらが
広範囲の固形腫瘍の（および数種類の慢性炎症性状態お
よび胎児胎盤における）毛細血管および細静脈内皮細胞
を「中程度」から「強度」で標識するが、正常で健康な
成人の組織の大多数においては血管の比較的弱い染色を
示すからである。ＴＥＣ−１１は実質的に非内皮細胞と
反応性を示さないため、特に好ましい。さらに、ＴＥＣ
−４とＴＥＣ−１１の双方とも補体結合性であり、それ
により腫瘍血管床内の内皮細胞の選択的溶解をも誘導す
る能力が与えられる。 【０３４９】ＭＡｂ ＴＥＣ−４およびＴＥＣ−１１と
交差反応する抗体、すなわちＴＥＣ−４またはＴＥＣ−
１１と同じエピトープでのエンドグリンに結合するもの
も、本発明で有効であると考えられる。ＴＥＣ−４また
はＴＥＣ−１１と同じエピトープでエンドグリンに結合
する抗体の同定は、まったく明白な事柄である。このこ
とは、抗体の競合を評価することのできる種々の免疫学
的スクリーニングアッセイの中の任意のものを用いて容
易に決定することができる。例えば、検査されるべきテ
スト抗体がＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１のそれとは異
なるソース、例えばウサギから得られる場合、あるいは
異なるイソ型、例えばＩｇＧ１またはＩｇＧ３である場
合でも、競合ＥＬＩＳＡが使用され得る。競合ＥＬＩＳ
Ａのそのような一実施態様では、ＴＥＣ−４またはＴＥ
Ｃ−１１を異なる量のテスト抗体と共に事前に混合し
て、ついで抗原でコートしたＥＬＩＳＡプレートのウェ
ルに適用する。抗−ネズミまたは抗−ＩｇＭ２次抗体の
いずれかを使用することによって、結合したＴＥＣ−４
またはＴＥＣ−１１抗体のみを検出することができ、そ
れらの結合は、ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１のいずれ
かと同じエピトープを認識するテスト抗体の存在によっ
て減少される。 【０３５０】ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１とテスト抗
体との間の抗体競合の研究を行うために、最初にＴＥＣ
−４またはＴＥＣ−１１を検出可能な標識、例えばビオ
チンもしくは酵素または放射性標識など標識し得、その
後の同定を可能とする。これらの場合は、標識された抗
体を試験されるべきテスト抗体と共に種々の比率（例え
ば、１：１、１：１０および１：１００）でインキュベ
ートし、適切な時間の後、標識されたＴＥＣ−４または
ＴＥＣ−１１抗体の反応性をアッセイし、これを、イン
キュベーション中に競合する抗体（テスト）が含まれな
かった場合のコントロール値と比較する。 【０３５１】アッセイは、抗体結合に基づく免疫学的ア
ッセイの範囲内のひとつであればいかなるものでも良
く、ＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１抗体は、それらの標
識を検出することにより、例えばビオチン化された抗体
の場合はストレプトアビジンを使用し、または酵素的標
識に関する発色基質を使用することによって、または単
に放射性標識を検出することによって検出される。ＴＥ
Ｃ−４またはＴＥＣ−１１と同じエピトープに結合する
抗体は、結合について効果的に競合し得、ＴＥＣ−４ま
たはＴＥＣ−１１結合を著しく減少する。これは標識さ
れた抗体の結合の減少によって証明される。本ケースで
は、標識されたＴＥＣ−４またはＴＥＣ−１１抗体をテ
スト抗体と混合した後、残りの反応性を決定するのに適
切なアッセイとして、例えば、ヒトのエンドグリンを用
いるＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたはウエスタンブロット；エ
ンドグリンの免疫沈降反応；ヒトエンドグリンを発現す
る組換型細胞のＥＬＳＡ、ＲＩＡまたは免疫蛍光染色；
腫瘍血管系内皮細胞の間接免疫蛍光染色；ＨＵＶＥＣま
たはＴＣＭ−活性化ＨＵＶＥＣ細胞表面決定基との反応
性の間接免疫蛍光検査；およびＦＡＣＳ分析が含まれ
る。この後者の方法が最も好適であり、ＴＥＣ−４およ
びＴＥＣ−１１によって認識されるエピトープが４４Ｇ
４（ＧｏｕｇｏｓおよびＬｅｔａｒｔｅ、１９８８）の
それとは異なることを示すために採用された。 【０３５２】いかなるテスト抗体も存在しない状況下で
の標識されたＴＥＣ−４抗体またはＴＥＣ−１１抗体の
反応性は、高いコントロール値である。低いコントロー
ル値は、標識された抗体と同じタイプの標識されていな
い抗体と共にインキュベートすることによって得られる
が、それは競合が生じ、標識された抗体の結合が減少す
るときである。標識された抗体反応性のテスト抗体存在
下における著しい減少は、同じエピトープを認識するテ
スト抗体、すなわち標識された抗体と「交差反応」する
ものが存在することを示す。本願のこの局面における
「著しい減少」とは、約１：１の比率での少なくとも約
１０％〜５０％、またはより好ましくは約１：１００の
比率での約９０％に等しいまたはそれ以上の結合の再生
可能な（すなわち首尾一貫して観察される）減少として
定義され得る。 【０３５３】「交差反応性アッセイ」の使用は、ＴＥＣ
−４またはＴＥＣ−１１という面における上記の説明の
ように、本発明に使用し得るいかなる抗体に対しても適
用され得る。従って、腫瘍細胞の構成成分、腫瘍血管系
の構成成分、腫瘍細胞関連成分、腫瘍血管系関連成分、
腫瘍細胞外のマトリクス成分、または本明細書にリスト
されている細胞タイプと本明細書にリストされている抗
体のいかなるものとも同じエピトープで結合し、抗体競
合アッセイによって決定される抗体は、凝固剤と組み合
わされ二重特異性リガンドを形成する場合、本発明の範
囲に入る抗体となる。 【０３５４】（（ｇ）血管内皮細胞結合リガンドの使
用）成長因子レセプターのような、内皮細胞表面分子に
結合、あるいはそれと相互作用することが知られている
生物学的リガンドは、標的化成分としても使用され得
る。 【０３５５】この意味において標的として有用であると
考えられる成長因子またはリガンドとして、ＶＥＧＦ／
ＶＰＦ、ＦＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥに結合するリガン
ド、腫瘍関連フィブロネクチンイソ型、消散因子（ｓｃ
ａｔｔｅｒ ｆａｃｔｏｒ）、肝細胞増殖因子（ＨＧ
Ｆ）、血小板因子４（ＰＦ４）、ＰＤＧＦおよびＴＩＭ
Ｐが含まれる。 【０３５６】特に好ましい標的は、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、
ＦＧＦファミリーのタンパク質およびＴＧＦβである。
Ａｂｒａｈａｍら（１９８６）はＦＧＦをクローン化
し、従って組換えタンパク質として入手可能である。Ｆ
ｅｒｒａｒａら（１９９１）によって報告されているよ
うに、１２１、１６５、１８９、および２０６個のアミ
ノ酸を有する４種のＶＥＧＦがクローン化されている。 【０３５７】（（ｈ）結合リガンドの標的化）抗体また
は特異的標的化リガンドはまた、腫瘍のような疾患部位
内の血管内皮細胞の表面に結合するいかなる成分に対し
ても向けられ得る。このような成分は、腫瘍環境に応答
する内皮細胞上で、内皮細胞上に既に存在する特異的細
胞表面レセプターに、あるいは誘導または過剰発現され
たレセプターに結合する、腫瘍由来のリガンドおよび抗
原（例えば、増殖因子）によって例示される。腫瘍血管
関連標的はまた、腫瘍由来の内皮細胞結合因子とも命名
され得る。 【０３５８】成功的な疾患標的化のために必要である特
異性のレベルは達成される。なぜなら、部分的には、局
所内皮細胞が、正常内皮細胞上に存在しないか、または
過小発現もしくはマスクされるレセプターを発現または
現すために誘導されるからである。腫瘍について、その
他の組織のために用い得るリガンドの量が減少すること
で、腫瘍中の内皮細胞が腫瘍由来の因子を捕獲し、そし
てそれらを細胞表面に結合させるという事実のために、
さらなる特異性が得られる。血液および組織液のプール
中に分配することによる、因子またはリガンドのさらな
る希釈と組み合わされた場合、正常組織内の内皮細胞
は、比較的少数のこのような因子を結合すると予期され
る。従って、操作上は、細胞表面結合リガンドまたは因
子は、腫瘍内皮細胞マーカーとして使用することができ
る。 【０３５９】腫瘍細胞自身による生成に加え、腫瘍内皮
細胞結合因子はまた、腫瘍に浸潤したその他のタイプの
細胞（例えば、マクロファージおよびマスト細胞）から
生じ得るか、あるいは腫瘍内部で活性化される血小板に
よって形成され得る。 【０３６０】腫瘍血管系関連標的として有用であると考
えられるさらなる増殖因子またはリガンドとして、ＥＧ
Ｆ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＴＧＦβ、ＨＧＦ （ＮａＫａ
ｍｕｒａ、１９９１）、アンジオトロピン（ａｎｇｉｏ
ｔｒｏｐｉｎ）、ＴＧＦ−α、ＴＮＦ−α、ＰＤ−ＥＣ
ＧＦおよびＴＩＥ結合リガンド（Ｂｉｃｋｎｅｌｌおよ
びＨａｒｒｉｓ、１９９２）が包含される。現在の好ま
しい標的として、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、ＦＧＦファミリー
のタンパク質形成転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）；ＴＧ
Ｆ−α；腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）；アンジオト
ロピン；血小板由来内皮細胞増殖因子（ＰＤ−ＥＣＧ
Ｆ）；ＴＩＥ結合リガンド；プレイオトロピンが含まれ
る。 【０３６１】本発明の別の局面は、リガンド−レセプタ
ー複合体上のみに存在するエピトープに特異的である標
的化抗体またはそれ由来の結合領域の使用であり、その
エピトープは、個々の（遊離の）リガンドおよび非結合
形態レセプターの双方に存在しない。これらの抗体は、
リガンド（例えば、増殖因子）がそのレセプター（例え
ば、増殖因子レセプター）に結合して、特異的に結合し
た複合体を形成する場合に生じる独特のコンホメーショ
ンを認識し、そしてそれに結合する。このようなエピト
ープは、リガンドまたはレセプターの非複合体上には存
在しない。 【０３６２】発明者らは、これらの抗体が結合するリガ
ンド−レセプター複合体が、非腫瘍関連内皮細胞上より
も腫瘍関連内皮細胞上に著しく多数で存在することに注
目する。従って、このような抗体は標的化剤として有用
であり、そして本発明の二重特異性コアギュラントの特
異性をさらに増加させるように作用する。 【０３６３】（（ｉ）レセプター構築物）内皮細胞表面
レセプターの可溶性結合ドメインはまた、本発明の標的
化リガンドとしての使用も考えられる。この概念は、一
般的に、種々のインビトロおよびインビボでの結合プロ
トコールで利用されている周知のサンドイッチ結合現象
に基づく。基本的には、内皮細胞が特異的なレセプター
を発現すると、細胞は対応するリガンドに結合し、そし
てそれを吸着する。ついで、リガンドがシステム内へ導
入されると、さらなるレセプター構築物に結合するため
にそれらが用いられ得る。 【０３６４】有用な内皮細胞レセプターの範囲は、前述
のセクションで同定されており、ＶＥＧＦ／ＶＰＦ、Ｆ
ＧＦ、ＴＧＦβ、ＴＩＥ−１およびＴＩＥ−２が特に好
ましい標的である。これらのレセプターのそれぞれは、
標的化リガンドとしての使用のための可溶性結合ドメイ
ンを形成するために操作され得る。 【０３６５】（４．疾患関連支質細胞標的） （（ａ）細胞外マトリクス／支質標的）腫瘍病理におけ
る基底膜マーカーの有用性が、Ｂｉｒｅｍｂａｕｔら
（１９８５）によって記載された。これらの研究によ
り、基底膜（ＢＭ）マーカー、タイプＩＶコラーゲン、
ラミニン（ＬＭ）、ヘパラン硫酸プロテオグリカン（Ｈ
ＳＰ）、およびフィブロネクチン（ＦＮ）の分布が、腫
瘍病理において崩壊したことが示された。Ｂｕｒｔｉｎ
ら（１９８３）はまた、ヒトの転移リンパ節内の基底膜
および結合組織抗原の変更を記載した。 【０３６６】本発明での使用のための好ましい標的はＲ
ＩＢＳである。Ｕｇａｒｏｖａら（１９９３）は、コン
ホメーション的変化がフィブリノーゲン中に発生し、そ
して血小板膜糖タンパク質ＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａとの相
互作用によって誘導されることを報告した。活性化され
た血小板上でのフィブリノーゲンの膜糖タンパク質ＧＰ
ＩＩｂ−ＩＩＩａへの結合は、血小板の凝集を導く。こ
の相互作用の結果、遊離リガンドではなく結合リガンド
によって発現される、レセプター誘導の結合部位、ＲＩ
ＢＳ、エピトープの発現によって証明されるように、フ
ィブリノーゲン中におけるコンホメーション的変化が得
られる。 【０３６７】２つのＲＩＢＳエピトープが、Ｕｇａｒｏ
ｖａら（１９９３）によって局在化された。１つの配列
はγ１１２〜１１９に在り、ＭＡｂ ９Ｆ９によって認
識される；２つ目はＡα９５〜９８のＲＧＤＦ配列であ
り、ｍＡｂ １５５Ｂ１６によって認識される。これら
のエピトープはまた、フィブリノーゲンのプラスチック
表面上への吸着およびプラスミンによる分子の消化によ
って露呈される。エピトープのタンパク質分解による曝
露と同時に、Ａα−鎖のカルボキシル末端面の切断が生
じ、フラグメントＸ２を形成する。フィブリノーゲン中
でのＡα ９５〜９８でのＲＧＤＦ配列の非アクセス性
は、この配列が分子のＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａへの初期結
合に参加しないことを示唆する。 【０３６８】フィブリノーゲンのそのレセプターへの結
合は、Ａα−鎖のカルボキシル末端面のコンホメーショ
ンを変更し、分子のＤドメインとＥドメインとの間のコ
イルドコイル（ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ）の結合セグメ
ント内に在る配列を露呈し、ＲＩＢＳエピトープを生成
する。実際的には、ＲＩＢＳ配列は、凝固リガンド（ｃ
ｏａｇｕｌｉｇａｎｄ）を用いて標的化の際に使用する
ためのエピトープとして提案される。従って、ＭＡｂ
９Ｆ９およびＭＡｂ１５５Ｂ１６は、Ｚａｍａｒｒｏｎ
ら（１９９１）によって記載された抗体のように、都合
良く使用し得る。 【０３６９】（（ｂ）付加的細胞標的）本発明は、疾患
領域内に見られる細胞のタイプに対して標的化を行うこ
とによって、コアギュラントを疾患関連血管系に向ける
ために使用し得るという、さらなる長所を有する。 【０３７０】血小板は、傷ついた血管壁に付着し損傷部
位に蓄積することによって、止血および血栓形成に関与
する。生理学的条件下での初期の出血停止は、血管の損
傷部位における血小板の堆積がその原因であるが、それ
は、病理学的条件下では、その後の虚血性組織損傷およ
び血栓による塞栓形成によって、血管閉塞を導き得る。 【０３７１】血小板とその環境との相互作用、および血
小板とそれ自身との相互作用は、細胞表面で始められる
複雑なプロセスを表す。従って、表面膜は、血管壁およ
び血漿成分を含む外部媒体と内部の血小板との間の反応
性界面を提供する。 【０３７２】活性化された血小板上に発現される多量体
の血小板タンパク質であるｐ−１１５（Ｈａｙｗａｒｄ
ら、１９９１）は、本発明を使用して標的化され得る。
血小板は、複雑な生化学的および形態学的変化を経るこ
とによって、多数の刺激剤に応答する。これらの変化
は、付着、凝集、および凝固を含む生理学的プロセスに
含まれる。血小板の活性化は、モノクローナル抗体によ
って認識され得る膜の変更を生じる。モノクローナル抗
体であるＪＳ−１（Ｈａｙｗａｒｄら、１９９１）は、
凝固リガンドの一部分として使用されることが考えられ
る、このような抗体のひとつである。 【０３７３】リガンドに誘導される結合部位（ＬＩＢ
Ｓ）は、リガンド結合がレセプターの形状変化を引き起
こした後、細胞表面レセプター上に発現される部位であ
り、その後の生物学的事象を仲介する。これらは、ＲＩ
ＢＳに対する対応物として見なされ、そして本発明で使
用するための好ましい標的でもある。 【０３７４】１３個の抗−ＬＩＢＳ抗体がＦｒｅｌｉｎ
ｇｅｒら（１９９０；１９９１）によって開発され、そ
れらの内のいずれもが、本明細書中の記載に従って、疾
患または腫瘍の部位へコアギュラントを送達するために
使用し得る。マウスのモノクローナル抗血小板抗体であ
るＭＡ−ＴＳＰＩ−１（ヒトのトロンボスポンジンに対
する）ならびにＤｅｗｅｒｃｈｉｎら（１９９１）のＭ
Ａ−ＰＭＩ−２、ＭＡ−ＰＭＩ−１、およびＭＡ−ＬＩ
ＢＳ−１（ヒトの血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ
上のＬＩＢＳに対する）もまた、Ｈｅｙｎｅｎら（１９
９４）のＲＵＵ２．４１およびＬＩＢＳ−１；Ｔｏｍｉ
ｙａｍａら（１９９２）のＯＰ−Ｇ２；およびＡｂ−１
５のように、使用され得る。 【０３７５】他の多くの標的（例えば、平滑筋細胞、周
皮細胞、線維芽細胞、マクロファージならびに浸潤性リ
ンパ球および白血球上の抗原）も使用し得る。 【０３７６】（Ｂ．凝固剤）本発明の二重特異性薬剤の
第２のアーム（ａｒｍ）あるいは要素は、凝固を促進し
得る成分である。「凝固促進薬剤」は、凝固因子、凝固
を間接的に刺激する因子であり得、あるいは、凝固因子
または凝固を間接的に刺激する因子を結合および放出し
得る第２結合領域の形態であり得る。 【０３７７】（１．凝固因子）以下に示す薬剤によって
例示されるように、様々な凝固因子が本発明に関連して
用いられ得る。凝固因子が第１結合薬剤と共有結合する
場合、機能性凝固部位とは異なる部位が分子の連結に用
いられる。凝固因子の、活性部位あるいは機能性領域と
は異なる適切な結合領域もまた、以下のセクションのそ
れぞれに記載される。 【０３７８】（（ａ）組織因子）組織因子（ＴＦ）は、
血液凝固を開始し得る１つの因子である。ＴＦは血液凝
固の外因性経路の活性化因子であり、生理学的に正常な
状態においては、血液と直接接触しない（Ｏｓｔｅｒｕ
ｄら、１９８６；Ｎｅｍｅｒｓｏｎ、１９８８、Ｂｒｏ
ｚｅ、１９９２；Ｒｕｆ＆Ｅｄｉｎｇｔｏｎ、１９９
４）。しかし、血管の損傷時、あるいは特定のサイトカ
インまたはエンドトキシンにより活性化された場合、内
皮（下）細胞（Ｗｅｉｓｓら、１９８９）または特定の
血液細胞（Ｗａｒｒら、１９９０）のいずれかによって
ＴＦは血液に曝される。次いで、ＴＦは、正常な状態に
おいては低濃度で血液中を循環するＶＩＩａ因子（Ｗｉ
ｌｄｇｏｏｓｅら、１９９２）と複合体を形成し、そし
て、このＴＦ／ＶＩＩａ因子複合体は、Ｘ因子のＸａ因
子への活性化によって、凝固カスケードを開始する。カ
スケードによって、最終的に、フィブリンが形成され
る。 【０３７９】この連続する事象が起こるために、ＴＦ：
ＶＩＩａ複合体は、リン脂質表面と結合しなければなら
ず、この表面にはＩＸまたはＸ因子を有する凝固開始複
合体が会合し得る（Ｒｕｆら、１９９１；Ｐａｂｏｒｓ
ｋｙら、１９９１；Ｂａｃｈら、１９８６）。この理由
のために、遺伝子を短縮することによって貫膜および細
胞質領域を除去した短縮型ＴＦ（即ちｔＴＦ）は、天然
ＴＦのＸ因子の１０万分の１の活性化活性を有する可溶
性タンパク質である（Ｒｕｆら、１９９１）。 【０３８０】（（ｂ）血餅形成因子（ｃｌｏｔｔｉｎｇ
Ｆａｃｔｏｒｓ））トロンビン、第Ｖ／Ｖａ因子およ
び誘導体、第ＶＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子および誘導体、
第ＩＸ／ＩＸａ因子および誘導体、第Ｘ／Ｘａ因子およ
び誘導体、第ＸＩ／ＸＩａ因子および誘導体、第ＸＩＩ
／ＸＩＩａ因子および誘導体、第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ
因子および誘導体、第Ｘ因子活性化因子および第Ｖ因子
活性化因子もまた、本発明に使用され得る。 【０３８１】（（ｃ）ヘビ毒コアギュラント）ラッセル
クサリヘビ蛇毒が凝固タンパク質を含有することは、Ｗ
ｉｌｌｉａｍｓおよびＥｓｎｏｕｆによって１９６２年
に明らかにされた。Ｋｉｓｉｅｌ（１９７９）は、第Ｖ
因子を活性化するヘビ毒糖タンパク質を単離し、Ｄｉ
Ｓｃｉｐｉｏら（１９７７）は、その毒からのプロテア
ーゼがヒト第Ｘ因子を活性化することを明らかにした。
この第Ｘ因子活性化因子は、本発明において使用するこ
とが意図された成分である。 【０３８２】ラッセルクサリヘビ蛇毒中に存在する第Ｘ
因子活性化因子に特異的なモノクローナル抗体（例え
ば、Ｐｕｋｒｉｔｔａｙａｋａｍｅｅら、１９８３、の
ＭＰ１）もまた生成されており、人体内の特異的標的部
位に薬剤を送達するために用いられ得る。 【０３８３】（（ｄ）プロスタグランジンおよび合成酵
素）トロンボキサンＡ２は、内因性の過酸化物（ｅｎｄ
ｏｐｅｒｏｘｉｄｅｓ）から、血小板ミクロソーム内の
酵素シクロオキシゲナーゼおよびトロンボキサンシンテ
ターゼの連続的作用によって形成される。トロンボキサ
ンＡ２は、血小板によって容易に生成され、そして、強
力な血管収縮因子であり、血小板の凝集を起こし得る
（Ｗｈｉｔｔｌｅら、１９８１）。 【０３８４】トロンボキサンＡ２およびその活性類似体
の両方は、本発明において使用することが意図されてい
る。トロンボキサンＡ２生成のための合成プロトコル
は、Ｂｈａｇｗａｔら（１９８５）に記載されている。
Ｏｈｕｃｈｉｄａら（１９８１）によって記載されたト
ロンボキサンＡ２類似体（特に化合物２）は、本発明に
使用することが特に意図されている。 【０３８５】トロンボキサンシンターゼ、および血小板
を活性化するプロスタグランジンを合成する他の酵素も
また、本発明において「コアギュラント」として用いら
れ得る。ＳｈｅｎおよびＴａｉ（１９８６ａ；ｂ）は、
トロンボキサンシンターゼのモノクローナル抗体および
免疫アフィニティー精製を記載し；また、Ｗａｎｇら
（１９９１）は、ヒトトロンボキサンシンターゼのため
のｃＤＮＡを報告している。 【０３８６】（（ｅ）フィブリン溶解の阻害剤）α２抗
プラスミン、すなわちα２プラスミン阻害剤は、ヒトの
血漿に天然に存在するプロテナーゼ阻害剤であり、プラ
スミノーゲン活性化因子によって誘導されるフィブリン
塊（ｃｌｏｔｓ）の溶解を効果的に阻害する機能を果た
す（Ｍｏｒｏｉ＆Ａｏｋｉ、１９７６）。α２抗プラス
ミンは、特に強力な阻害剤であり、本発明において使用
することが意図されている。 【０３８７】α２抗プラスミンは精製され得るが、これ
は最初にＭｏｒｏｉ＆Ａｏｋｉ（１９７６）に記載され
ている。他の精製スキームもまた用いられ得る。例え
ば、プラスミノーゲンセファロース上でのアフィニティ
ークロマトグラフィー、ＤＥＡＥセファデックス上での
イオン交換クロマトグラフィー、およびコンカナバリン
Ａセファロース上でのクロマトグラフィーを行う；ある
いは、プラスミンＡ鎖（ＬＢＳＩ）内の３つのＮ末端三
重ループ構造を含有するエラスターゼ消化（ｅｌａｓｔ
ａｓｅ−ｄｉｇｅｓｔｅｄ）プラスミノーゲン処方剤
（ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）を有するセファロースカラ
ム上でのアフィニティークロマトグラフィーを行い、次
いでゲル濾過を行う（それぞれ、Ｗｉｍａｎ＆Ｃｏｌｌ
ｅｎ、１９７７；Ｗｉｍａｎ、１９８０）、などであ
る。 【０３８８】α２抗プラスミンのｃＤＮＡ配列（Ｔｏｎ
ｅら、１９７７）が利用できるので、α２抗プラスミン
生成の好適な方法は、組換え発現による。 【０３８９】α２抗プラスミンに対するモノクローナル
抗体もまた利用でき、本発明の二重特異性結合リガンド
の実施態様として使用され得る。例えば、Ｈａｔｔｅｙ
ら（１９８７）は、α２抗プラスミンに対する２つのＭ
Ａｂ、ＭＰＷ２ＡＰおよびＭＰＷ３ＡＰを記載した。こ
れらのＭＡｂのそれぞれは、同等に良好に、天然のα２
抗プラスミンと反応することが報告されているので、そ
れら両方が、外因性のα２抗プラスミンを標的部位に送
達するため、あるいは内因性のα２抗プラスミンを蓄積
してそれを標的領域内に濃縮するために使用され得る。
Ｍｉｍｕｒｏおよび共同研究者によって記載されたＪＴ
ＰＩ−２などの他の抗体もまた使用され得る。 【０３９０】（２．凝固因子を結合する薬剤）本発明の
他の群の二重特異性凝固リガンドは、標的化領域が凝固
因子に直接連結されるのではなく、凝固因子に結合する
第２結合領域に連結される。 【０３９１】第２結合領域を用いて凝固因子を結合およ
び送達する場合、その結合領域は、凝固誘導能力を大き
く損なわないような凝固因子上の部位を認識するように
選択される。このような結合に適した凝固因子の領域
は、前のセクションに記載したように、標的化領域への
共有結合に適した領域と、一般的に同じである。 【０３９２】しかし、このクラスの二重特異性リガンド
は、腫瘍部位あるいは領域への送達の後に、凝固因子を
放出することが予想され得るため、第２結合薬剤あるい
は抗体への結合に適した凝固因子の領域には、より大き
な柔軟性がある。また別の利点は、二重特異性抗体が、
ｔＴＦ注入の前に予め局在化され得ることであり、これ
は、必要なｔＴＦの量、ひいては毒性を低減し得る。 【０３９３】この方法での使用に適切な第２結合領域
は、一般的に、凝固因子に対する結合特異性を有する抗
体の抗原結合部位であり、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ’、
ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントなどの抗体の
機能性部分を含む。 【０３９４】組織因子、トロンビン、プレカリクレイン
（ｐｒｅｋａｌｌｉｋｅｉｎ）、第Ｖ／Ｖａ因子、第Ｖ
ＩＩＩ／ＶＩＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、第Ｘ／
Ｘａ因子、第ＸＩ／ＸＩａ因子、第ＸＩＩ／ＸＩＩａ因
子、第ＸＩＩＩ／ＸＩＩＩａ因子、ラッセルクサリヘビ
蛇毒、トロンボキサンＡ２またはα２抗プラスミンに対
する抗体あるいはそのフラグメントを含有する二重特異
性結合リガンドは、本発明のこの局面の実施態様の例示
である。 【０３９５】（Ｃ．連結手段）第１標的化領域および第
２凝固領域は、作動可能に連結され、これにより、各領
域が、重大な障害を伴わずに、意図された機能を果たす
ことが可能になる。このように、標的化領域は、腫瘍環
境標的の範囲から選択されるように、意図された標的に
結合することが可能であり、また、凝固領域は、直接的
または間接的に、例えば結合した因子の放出によって、
血液凝固あるいは血餅形成を促進することが可能であ
る。 【０３９６】標的化領域結合機能を評価するために必要
とされることは、二重特異性リガンドが依然として、複
合体を形成していない第１結合領域と実質的に同じ方法
で、標的化された成分に結合することを確かめるため
に、結合アッセイを行うことである。適切な結合アッセ
イは、通常用いられるタイプのアッセイであり、第１標
的化領域が抗体である免疫学的な結合アッセイ、および
／または他の生化学的な結合アッセイであり、例えば、
１２５ヨウ素標識されたタンパク質または他の放射標識
された成分を用いてリガンド−レセプター結合を評価
し、スキャッチャードプロットを生成するようなアッセ
イである。 【０３９７】このようなアッセイにおける標的抗原ある
いは標的成分は、天然または組み換え体供給源から精製
されるタンパク質、膜濃縮調製物、無傷の（ｉｎｔａｃ
ｔ）細胞および組織切片を含む数多くの形態で提供され
得る。一般に、タンパク質組成物が使用される場合、そ
れらは、マイクロタイタープレート、膜、などの固体の
支持体に、あるいは、カラムマトリクスにさえ固定され
る。また、生理学的標的を反映する標的組成物を使用す
るのが一般的に好ましく、標的が通常、細胞関連である
ので、組織および細胞自体を含む無傷の細胞を含む組成
物の使用もまた好ましい。 【０３９８】二重特異性複合体の機能性結合の確認に用
いられる種々の免疫学的アッセイは、例えば、ウエスタ
ンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、固定細胞を用いたＥＬ
ＩＳＡ、免疫組織化学、および蛍光活性化細胞ソーティ
ング（ＦＡＣＳ）を含む。このようなアッセイの全ての
実施は、一般に、当業者には公知であり、本明細書でさ
らに開示される。 【０３９９】上記または他の結合アッセイのいずれにお
いても、二重特異性化合物の標的化領域結合機能の評価
は容易なことであり、二重特異性リガンドと、複合化し
ていない第１結合領域とは、通常、比較を容易にするた
めに、同じ条件下で平行してアッセイに供される。効果
的な二重特異性リガンドは、大きな障害を伴わずに、つ
まり、複合化していない第１結合領域と実質的に同じ様
に、標的に結合する。複合化していない結合領域アッセ
イの結果を１００％の基準値とすると、本明細書の用
語、二重特異性リガンドの「実質的な結合」とは、二重
特異性リガンドが少なくとも約５０％の結合、より好ま
しくは、約５０％から約８０％の間の結合、さらに、最
も好ましくは、約８０％から約１００％の間の結合を示
すことを意味する。 【０４００】二重特異性リガンドが、コアギュラントに
結合する第２結合領域を含む場合、例えば、二重特異性
抗体である場合、さらに有用なアッセイは、二重特異性
リガンドの両方のアームの結合機能が同時に評価できる
タイプのものである。これは、例えば、二重特異性リガ
ンドまたは抗体との架橋を介する、放射標識されたコア
ギュラントの標的細胞への結合を評価することによって
達成される。このようなアッセイは、Ｂ２１−２／１０
Ｈ１０二重特異性抗体を用いた、ｔＴＦの標的細胞への
結合によって例示され、実施例ＩＩに記載されている。 【０４０１】二重特異性リガンドの凝固剤機能を決定す
ることもまた、容易なことである。ここで必要とされる
ことは、二重特異性リガンドを用いた凝固アッセイを行
い、それが、複合化していない凝固剤と実質的に同じ方
法で、凝固を促進する機能を果たすことを確かめること
である。このことは、それら自体が共に凝固因子である
「凝固剤」、および凝固因子に結合する第２結合領域で
あるものについて当てはまる。当然、後者の場合、第２
結合領域への結合を可能にするために、二重特異性リガ
ンドは、ｉｎ ｖｉｔｒｏあるいはｅｘ ｖｉｖｏアッ
セイにおいて凝固因子と予め複合化される。 【０４０２】１つの適切な凝固アッセイは、必要に応じ
て予めコアギュラントと複合化される二重特異性リガン
ドが、血漿サンプルと混合される。このアッセイにおい
ては、フィブリンストランドの出現が凝固を示す。した
がって、効果的な二重特異性リガンドは、フィブリンス
トランドが出現するまでの時間を短縮し、特に、コント
ロールのレベルと比較して経過時間を有意に短縮するこ
とが期待される。 【０４０３】上記アッセイの改変例は、まず、適切な標
的細胞を有効な条件下および十分な時間、二重特異性リ
ガンドにさらして結合させること、非特異的に結合した
成分を除去するために細胞を洗浄すること、次いで、洗
浄された細胞を血漿内で再懸濁することを包含する。こ
のアッセイでは、二重特異性リガンドで効果的にコーテ
ィングされた細胞のみが、フィブリンストランドが出現
するまでの時間を短縮すると期待される。このタイプの
アッセイは、それ自体が二重特異性構築物の機能の両
方、即ち、細胞の初期標的化、およびその後の局在化さ
れた凝固を評価するアッセイである点で好ましい。 【０４０４】二重特異性化合物の凝固機能を、複合化し
ていない凝固剤のそれと比較するためには、再び、平行
したアッセイが行われる。効果的な二重特異性リガンド
は、大きな障害を伴わずに、凝固を促進する機能を果た
す、つまり、複合化していない凝固剤と実質的に同じ様
に機能する。複合化していないコアギュラントアッセイ
の結果を１００％の基準値とすると、本明細書の用語
「実質的な機能」とは、二重特異性リガンドが少なくと
も約５０％の凝固、より好ましくは、約５０％から約８
０％の間の凝固、さらに、最も好ましくは、約８０％か
ら約１００％の間の凝固を示すことを意味する。 【０４０５】二重特異性リガンドの２つの機能性領域は
合成化学技術あるいは組み換えＤＮＡ技術を用いて連結
され得る。これらの技術のそれぞれは、通常採用され、
当業者には周知であり、実施例Ｉにおいて、また、以下
の詳細な説明によってさらに例示される。 【０４０６】（１．生化学的架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉ
ｎｋｅｒ））一般に、抗体または他の標的化成分の凝固
剤への結合には、イムノトキシンの調製のために開発さ
れたものと同じ技術が適用される。しかし、生理学的に
用いられるようになる特定の量の複合化していない凝固
剤が、特に厳密なものを意図しないゆえに、本技術に相
当な利点があることは明らかである。このように、いか
なる架橋剤の安定性要件も、イムノトキシンなどの他の
構築物に採用されるリンカー程厳密ではない。したがっ
て、イムノトキシンにおける使用に適したあらゆる架橋
剤もまた本発明において使用できることが、一般的なガ
イドラインとして考慮され得、そして、さらなるリンカ
ーもまた考慮され得る。 【０４０７】トキシンに加えて、他の様々な化学療法お
よび薬理学的な薬剤が抗体に連結され、薬理学的に機能
することが明らかになっている接合体が形成されている
（例えば、Ｖａｉｃｋｕｓら、１９９１、参照）。調査
された抗腫瘍性薬剤の例は、ドキソルビシン、ダウノマ
イシン、メトトレキセート、およびビンブラスチンその
他を含む（Ｄｉｌｌｍａｎら、１９８８；Ｐｉｅｔｅｒ
ｓｚら、１９８８）。また、ネオカルチノスタチン（Ｋ
ｉｍｕｒａら、１９８３）、マクロマイシン（ｍａｃｒ
ｏｍｙｃｉｎ）（Ｍａｎａｂｅら、１９８４）、トレニ
モン（ｔｒｅｎｉｍｏｎ）（Ｇｈｏｓｅ、１９８２）お
よびαアマニチン（α−ａｍａｎｉｔｉｎ）（Ｄａｖｉ
ｓ ＆ Ｐｒｅｓｔｏｎ、１９８１）などの他の薬剤の
結合が記載されている。上記科学論文のそれぞれに記載
される連結技術もまた、本発明に関連して使用すること
が意図されている。 【０４０８】架橋試薬を用いて２つの異なる分子の官能
基、例えば結合および凝固剤を互いに結びつける分子架
橋が形成される。２つの異なるタンパク質を段階的に連
結するために、望ましくないホモポリマーの形成を排除
するヘテロ２機能性架橋剤が用いられ得る（表ＶＩ）。 【０４０９】 【表６】 例示的なヘテロ二官能性架橋剤は２つの反応基を含む：
一方は一級アミン基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシン
イミド）と反応し、他方はチオール基（例えば、ピリジ
ルジスルフィド、マレイミド、ハロゲンなど）と反応す
る。架橋剤は、一級アミン反応基を介して、一方のタン
パク質（例えば、選択された抗体またはフラグメント）
のリジン残基（単数または複数）と反応し得、そして既
に第１のタンパク質に結合した架橋剤は、チオール反応
基を介して、他方のタンパク質（例えば、コアギュラン
ト）のシステイン残基（遊離メルカプト基）と反応す
る。 【０４１０】従って、好適なコアギュラントまたは凝固
結合領域は、一般には、架橋のために利用可能な官能基
を有するか、または有するように誘導体化されることが
理解され得る。この要件により、広範囲な基をこの様式
で用い得ることが制限されるとは考えられない。例え
ば、一級または二級アミン基、ヒドラジド基またはヒド
ラジン基、カルボキシルアルコール基、リン酸基、もし
くはアルキル化基が、結合または架橋のために用いられ
得る。連結技術の概略については、Ｇｈｏｓｅ＆Ｂｌａ
ｉｒ（１９８７）を参照のこと。 【０４１１】架橋剤の２つの反応基の間のスペーサーア
ーム（ｓｐａｃｅｒ ａｒｍ）は様々な長さおよび化学
組成を有し得る。スペーサーアームが長いほど、接合成
分の柔軟性（ｆｌｅｘｉｂｉｌｉｔｙ）が良好になり、
一方、ブリッジのいくつかの特定の成分（例えば、ベン
ゼン基）により、反応基に安定性の増加がもたらされる
か、または様々な局面の作用に対する化学結合の耐性
（例えば、還元剤に対するジスルフィド結合の耐性）の
増加がもたらされ得る。Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−
Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａのようなペプチドスペーサーの使用
もまた意図される。 【０４１２】血液中で適切な安定性を有する架橋剤を用
いるのが好ましい。標的化剤および凝固剤を接合するた
めにうまく用いられ得る数多くのタイプのジスルフィド
結合含有結合剤が知られている。立体的に障害をもつジ
スルフィド結合を含む結合剤は、インビボにおいてより
高い安定性を示し、これにより作用部位での結合前にコ
アギュラントが放出されるのを防止し得ることが分か
る。従って、このような結合剤は、結合剤１つの好適な
グループである。 【０４１３】イムノトキシンで使用するのに最も好適な
架橋剤の１つはＳＭＰＴである。ＳＭＰＴは、隣接する
ベンゼン環およびメチル基によって「立体障害をもつ」
ジスルフィド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジ
スルフィド結合の立体障害は、組織および血液中に存在
し得るグルタチオンのようなチオレートアニオンによる
攻撃から結合を保護する機能を有し、これにより、結合
した薬剤が腫瘍部位に送達される前に接合体が分離する
のを防ぐのを補助すると考えられる。ＳＭＰＴ薬剤もま
た、本発明の二重特異性凝固リガンドと共に用いられ得
ることが意図される。 【０４１４】多くの既知の他の架橋剤と同様に、ＳＭＰ
Ｔ架橋剤は、システインのＳＨまたは一級アミンのよう
な官能基（例えば、リジンのεアミノ基）を架橋する能
力を有する。別の可能なタイプの架橋剤としては、スル
ホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジドサリチルアミ
ド）エチル−１，３’−ジチオプロピオネートのような
切断可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性
光反応性フェニルアジドが挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ
−スクシンイミジル基は一級アミノ基と反応し、フェニ
ルアジドは（光分解の際に）非選択的に任意のアミノ酸
残基と反応する。 【０４１５】立体障害をもつ架橋剤に加えて、立体障害
をもたない結合剤もまた本発明において使用され得る。
保護されたジスルフィドを含有または生成するとは考え
られない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤ
Ｐ、および２−イミノチオラン（Ｗａｗｒｚｙｎｃｚａ
ｋ＆Ｔｈｏｒｐｅ，１９８７）がある。このような架橋
剤の使用は当該分野では充分理解されている。 【０４１６】ひとたび接合体化されると、二重特異性薬
剤は通常は精製され、未接合体化標的化剤またはコアギ
ュラントおよび他の混入物質から接合体が分離される。
未接合標的化剤を取り除いて、接合体化種と未接合体化
種との間で抗原をめぐる競合が起こる可能性を防ぐこと
が重要である。充分な純度を有する接合体を提供してこ
れらを臨床的に有用にする際に、多くの精製技術が利用
可能である。ゲル濾過、ゲル透析または高速液体クロマ
トグラフィーのような、サイズ分離に基づく精製方法が
一般に最も有用である。Ｂｌｕｅ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ
分離のような他のクロマトグラフィー技術もまた用いら
れ得る。 【０４１７】（２．組換え融合タンパク質）本発明の二
重特異性標的コアギュラントはまた、分子生物学技術に
よって調製される融合タンパク質であり得る。このよう
な目的を達成するために組換えＤＮＡ技術を用いること
は、現在では当業者にとって通常の作業である。このよ
うな方法としては、例えば、インビトロにおける組換え
ＤＮＡ法、合成技術、およびインビボにおける組換え／
遺伝子組換えがある。さらに、ＤＮＡおよびＲＮＡ合成
は、自動合成機を用いて行い得る（例えば、Ｓａｍｂｒ
ｏｏｋら、１９８９；およびＡｕｓｕｂｅｌら、１９８
９に記載されている技術を参照）。 【０４１８】一般に、融合タンパク質を調製するために
は、結合リガンドまたは他の標的化領域をコードする遺
伝子またはｃＤＮＡのようなＤＮＡコード領域を、凝固
因子または凝固結合領域をコードするＤＮＡコード領域
（すなわち、遺伝子またはｃＤＮＡ）に結合させる。こ
れは、代表的には、凝固因子をコードする第２ＤＮＡセ
グメントに作動可能に連結した第１結合領域をコードす
る第１ＤＮＡセグメントを、同じリーディングフレーム
内に含む発現ベクターを調製する工程を包含する。配列
は、核酸全体を翻訳すると本発明の所望の二重特異性化
合物が得られるような方法で結合する。発現ベクター
は、挿入されたＤＮＡ領域より上流側に、ＤＮＡの転写
を促進し、これによりコードされる組換えタンパク質の
発現を促進するように作用する１つまたはそれ以上のプ
ロモーターを含む。これが「組換え発現」の意味であ
る。 【０４１９】特定の結合領域またはコアギュラントが好
適であるが、コードＤＮＡが直ちに利用できない場合
は、これは、所望のタンパク質をコードするＤＮＡ分子
をＤＮＡライブラリー（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノム
ライブラリー）から得る「分子クローニング」の技術を
用いて得られ得る。このような手順では、適切なＤＮＡ
ライブラリーが、例えば、タンパク質に対する抗体を用
いる発現スクリーニングプロトコル、または活性アッセ
イを用いてスクリーニングされる。もしくは、スクリー
ニングは、タンパク質のアミノ酸配列部分を考慮して、
または関連タンパク質をコードする遺伝子のＤＮＡ配列
から設計されたオリゴヌクレオチドプローブのハイブリ
ダイゼーションに基づいてもよい。このようなスクリー
ニングプロトコルの操作は当業者には周知であり、科学
文献、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）に詳細
に記載されている。 【０４２０】組換えＤＮＡ技術により産生されるとき
は、本発明の標的化剤／凝固剤化合物は「融合タンパク
質」と呼ばれる。このような融合タンパク質は、少なく
とも、本発明で定義される標的化剤および凝固剤を含
み、そしてこれらの薬剤は作動可能に結合されることが
理解される。融合タンパク質はまた、得られる融合タン
パク質の標的化または凝固活性にある程度の影響を与え
ない限り、標的化剤および凝固剤化合物を作動可能に連
結するペプチドスペーサーのようなさらなるペプチド配
列を含み得る。 【０４２１】組換え二重特異性タンパク質リガンドは、
いわゆる天然に産生されたタンパク質を化学的に架橋す
ることによって生成される二重特異性構築物とは異なり
得る。特に、例えば、グリコシル化およびリン酸化のよ
うな翻訳後の修飾の程度は、同じ２つのタンパク質の組
換え融合体と化学的融合体との間で異なり得る。これは
重大な問題であるとはみなされないが、当業者であれ
ば、臨床設定で使用する前に、組換え融合タンパク質
が、意図したように、そして他のデータから想定される
ように機能するかどうかを確認し得る。 【０４２２】組換え発現の１つの利点は、結合領域を、
例えばその長さおよび／またはアミノ酸組成が容易に変
動し得るように容易に操作し得ることである。所望であ
れば、本発明の２つの薬剤を作動可能に連結するため
に、切断不能なペプチドスペーサーが提供され得る。同
様に、固有の切断部位を有するペプチドを２つの化合物
の間に挿入し得る。 【０４２３】特定の場合、所望であれば、ジスルフィド
結合ループ構造に折り畳み得る、標的化剤および凝固剤
を作動可能に連結するペプチドスペーサーを提供するこ
とが可能である。ループ内のタンパク質分解性切断によ
り、標的化剤と凝固剤とが単一のジスルフィド結合のみ
によって連結されているヘテロ二量体ポリペプチドが生
成される（例えば、Ｌｏｒｄら、１９９２参照）。 【０４２４】様々な宿主発現系でタンパク質の発現を実
現するために、適切な核酸および転写／翻訳制御配列を
含む発現ベクターを構築するための多くの標準的な技術
が利用可能である。発現に利用し得る細胞型としては、
標的化剤／凝固剤コード化配列を含有する、組換えバク
テリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミ
ドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換された細菌（例え
ば、大腸菌、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；標的化剤／凝固
剤コード配列を含む組換え酵母発現ベクターにより形質
転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ
ｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；標的化剤／凝固剤コード配列を含
む組換えウィルス発現ベクター（例えば、バキュロウィ
ルス）を感染させた昆虫細胞系；組換えウィルス発現ベ
クター（例えば、カリフラワーモザイクウィルスＣａＭ
Ｖ；タバコモザイクウィルスＴＭＶ）を感染させた、ま
たは標的化剤／凝固剤コード配列を含む組換えプラスミ
ド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質
転換された植物細胞系；および哺乳類細胞のゲノム由来
のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモータ
ー）、または哺乳類ウィルス由来のプロモーター（例え
ば、アデノウィルス後期プロモーター；ワクシニアウィ
ルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を
有する哺乳類細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨ
Ｋ、２９３、３Ｔ３）のような微生物があるが、これら
に限定されない。 【０４２５】細菌系では、発現される標的化剤／凝固剤
構築物について意図される用途に応じて、多くの発現ベ
クターが有利に選択され得る。例えば、多量の二重特異
性薬剤を産生する場合は、容易に精製される高レベルの
融合タンパク質産物の発現を指向するベクターが望まし
い。このようなベクターとしては、標的化剤／凝固剤コ
ード配列が、ｌａｃ ｚコード領域を有するベクターの
フレーム内に個別に連結され得、これによりｌａｃ Ｚ
産物部分をさらに含む融合タンパク質が提供される、大
腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒら、１９
８３）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅら、１９８５；
Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅら、１９８９）などがあるが、これ
らに限定されない。ｐＧＥＸベクターは、標的化剤／凝
固剤の組み合わせのような外来ポリペプチドを、グルタ
チオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）をさらに含む
融合タンパク質として発現するためにも用いられ得る。
一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、グ
ルタチオン−アガロースビーズへの吸着およびこの後の
遊離グルタチオンの存在下での溶出によって、溶解した
細胞から容易に精製され得る。ｐＧＥＸベクターはトロ
ンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むよ
うに設計され、これにより融合タンパク質全体の中の結
合剤／凝固タンパク質がＧＳＴ部分から放出され得る。 【０４２６】１つの有用な昆虫系では、Ａｕｔｏｇｒａ
ｐｈ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウィルス（Ａ
ｃＮＰＶ）が、外来遺伝子を発現するためのベクターと
して用いられる。このウィルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒ
ａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。標的化剤
／凝固剤コード配列は、ウィルスの非必須領域（例え
ば、ポリヘドリン遺伝子）にクローン化され、ＡｃＮＰ
Ｖプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）
の制御下に配置され得る。二重特異性リガンドコード配
列を首尾良く挿入することによって、ポリヘドリン遺伝
子が不活性となり、非閉塞（ｎｏｎ−ｏｃｃｌｕｄｅ
ｄ）組換えウィルス（例えば、ポリヘドリン遺伝子によ
ってコードされるタンパク質コートを欠いたウィルス）
が産生される。このような組換えウィルスは、次に、挿
入した遺伝子を発現させるＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒ
ｕｇｉｐｅｒｄａ細胞を感染させるために用いられる
（例えば、Ｓｍｉｔｈら、１９８３；＊Ｓｍｉｔｈの米
国特許第４，２１５，０５１号参照）。 【０４２７】哺乳類宿主細胞では、多数のウィルスベー
スの発現系が利用され得る。アデノウィルスを発現ベク
ターとして用いる場合は、標的化剤／凝固剤コード配列
を、アデノウィルス転写／翻訳制御接合体（例えば、後
期プロモーターおよび三部分（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ）
リーダー配列）に連結し得る。このキメラ遺伝子は、次
に、インビトロにおけるまたはインビボにおける組換え
によってアデノウィルスゲノムに挿入され得る。ウィル
スゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）
への挿入により、生存能力があり、感染宿主内に二重特
異性タンパク質を発現し得る組換えウィルスが得られる
（例えば、Ｌｏｇａｎら、１９８４参照）。 【０４２８】挿入された標的化剤／凝固剤コード配列を
効率的に翻訳するためには、特異的な開始シグナルもま
た必要であり得る。このようなシグナルは、ＡＴＧ開始
コドンおよび隣接する配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを
含む外因性の翻訳制御シグナルをさらに備える必要があ
り得る。当業者であれば容易にこれを決定し、必要なシ
グナルを備え得る。開始コドンは、挿入物全体の翻訳を
確実にするために、所望のコード配列のリーディングフ
レームと同調（すなわちインフレーム）していなければ
ならないことは周知である。これらの外因性翻訳制御シ
グナルおよび開始コドンは、天然および合成を問わず多
様な起源から得られ得る。適切な転写エンハンサー要
素、転写ターミネーターなどを加えることによって、発
現効率が増強され得る（Ｂｉｔｔｎｅｒら、１９８７参
照）。 【０４２９】さらに、挿入された配列の発現を調節する
か、または遺伝子産物を所望の特異的な様式で修飾およ
びプロセスする宿主細胞株が選択され得る。タンパク質
産物のこのような修飾（例えば、グリコシル化）および
プロセッシング（例えば、切断）は、タンパク質の機能
にとって重要であり得る。宿主細胞はそれぞれ、タンパ
ク質の翻訳後プロセッシングおよび修飾のための特徴的
かつ特異的な機構を有する。発現された外来タンパク質
の適切な修飾およびプロセッシングを確実にするため
に、適切な細胞株または宿主系が選択され得る。この目
的のために、遺伝子産物の一次転写、グリコシル化、お
よびリン酸化の適切な処理のための細胞機構を有する真
核生物宿主細胞が用いられ得る。このような哺乳類宿主
細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、
ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８などがあ
るが、これらに限定されない。 【０４３０】組換えタンパク質を長期にわたり高収量で
産生するためには、安定した発現が好ましい。例えば、
標的化剤／凝固リガンドをコードする構築物を安定して
発現する細胞株が設計され得る。ウィルスの複製起点を
含む発現ベクターを用いるよりむしろ、宿主細胞は、適
切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサ
ー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位な
ど）によって制御される標的化剤／凝固剤ＤＮＡおよび
選択マーカーにより形質転換され得る。外来ＤＮＡの導
入後、設計された細胞を富養培地で１〜２日増殖させ、
次に選択培地に置き換える。組換えプラスミド中の選択
マーカーによりこの選択に対する耐性が付与され、細胞
がそれぞれの染色体にプラスミドを安定して組み込み、
増殖してフォーカスを形成し、これが次にクローン化さ
れ、拡大されて細胞株となり得る。 【０４３１】ヘルペス単純ウィルスチミジンキナーゼ
（Ｗｉｇｌｅｒら、１９７７）、ヒポキサンチン−グア
ニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌ
ｓｋａら、１９６２）、およびアデニンホスホリボシル
トランスフェラーゼ遺伝子（Ｌｏｗｙら、１９８０）を
含むがこれらに限定されない多くの選択系が用いられ
得、これらはそれぞれ、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−、または
ａｐｒｔ−細胞で用いられ得る。また、メトトレキセー
トに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒら、
１９８０；Ｏ’Ｈａｒｅら、１９８１）；ミコフェノー
ル酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ
ら、１９８１）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する
耐性を付与するｎｅｏ（Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐ
ｉｎら、１９８１）；およびヒグロマイシンに対する耐
性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅら、１９８
４）の選択の基礎として、代謝拮抗物質耐性が用いられ
得る。 【０４３２】（Ｄ．抗体）抗体が二重特異性リガンドの
一方または両方の一部として用いられる場合、抗体の選
択は、一般に腫瘍のタイプおよび選択される凝固リガン
ドに依存する。しかし、ある有利点は、特定のタイプの
抗体の適用により達成され得る。例えば、ＩｇＧベース
の抗体は、そのＦａｂ’対応物よりも良好な結合能力お
よび遅い血中クリアランスを示すことが予測され得る
が、Ｆａｂ’フラグメントベースの組成物は、一般に、
良好な組織浸透能力を示す。 【０４３３】（１．モノクローナル抗体）抗体を調製し
特徴付けする手段は当業者に周知である（例えば、＊Ａ
ｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａ
ｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８）。 【０４３４】モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生成する
方法は、一般に、ポリクローナル抗体を調製するための
方針と同じ方針に沿って始める。簡単にいえば、ポリク
ローナル抗体は、動物を、用いられている抗原組成物お
よびプロトコル（例えば、正常細胞集団に寛容になり、
次いで腫瘍細胞集団で免疫すること）に依存して、免疫
寛容前または免疫寛容前でないいずれかに、本発明に従
って免疫原性組成物で免疫し、そして免疫された動物か
ら抗血清を回収することにより、調製される。広範な動
物種が抗血清の生成に用いられ得る。代表的には、抗−
抗血清の生成に用いられる動物は、ウサギ、マウス、ラ
ット、ハムスター、モルモット、またはヤギである。ウ
サギの血液量が比較的大量であるため、ウサギはポリク
ローナル抗体の生成のための好適な選択である。 【０４３５】当該分野で周知のように、所定の組成物は
その免疫原性が変化し得る。従って、宿主の免疫系をブ
ーストすることがしばしば必要であり、これはペプチド
またはポリペプチド免疫原をキャリアに結合することに
より達成され得る。代表的かつ好適なキャリアは、キー
ホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびウシ血
清アルブミン（ＢＳＡ）である。オボアルブミン、マウ
ス血清アルブミン、またはウサギ血清アルブミンのよう
な他のアルブミンもまた、キャリアとして用いられ得
る。ポリペプチドをキャリアタンパク質に結合する手段
は当該分野において周知であり、そしてグルタルアルデ
ヒド、ｍ−マレイミドベンゾイル（ｍａｌｅｉｍｉｄｏ
ｂｅｎｃｏｙｌ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエス
テル、カルボジイミド（ｃａｒｂｏｄｉｉｍｙｄｅ）、
およびビス−ジアゾ化ベンジジン（ｂｉｓ−ｄｉａｚｏ
ｔｉｚｅｄ）を含む。 【０４３６】当該分野においてまた周知のように、特定
の免疫原組成物の免疫原性は、アジュバントのような公
知の免疫応答の非特異的刺激剤の使用により増強され得
る。代表的かつ好適なアジュバントとしては、完全フロ
イントアジュバント（死滅Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓを含む免疫応答の非特異的
刺激剤）、不完全フロイントアジュバント、および水酸
化アルミニウムアジュバントが挙げられる。 【０４３７】ポリクローナル抗体の産生に用いられる免
疫原組成物の量は、免疫原の性質ならびに免疫に用いら
れる動物によって変化する。種々の経路が免疫原の投与
に用いられ得る（皮下、筋肉内、皮内、静脈内、および
腹腔内）。ポリクローナル抗体の産生は、免疫後の種々
の時点で免疫された動物の血液をサンプリングすること
によりモニターされ得る。第二に、追加接種もまた与え
られ得る。追加免疫および力価検定のプロセスは、適切
な力価が達成されるまで繰り返され得る。所望の力価レ
ベルが得られると、免疫された動物を出血させ得、そし
て血清を単離して保存し、および／または動物をＭＡｂ
を生成するために用い得る。 【０４３８】ＭＡｂは、＊米国特許第４，１９６，２６
５号（本明細書中に参考として援用される）に例示され
るように、周知の技法の使用により容易に調製され得
る。代表的には、この技法は、選択された免疫原組成物
（例えば、精製または部分精製腫瘍細胞あるいは血管内
皮細胞タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または完
全な細胞組成物）で適切な動物を免疫することを包含す
る。免疫する組成物は、抗体産生細胞を刺激するために
効果的な様式で投与される。マウスおよびラットのよう
な齧歯類は好適な動物であるが、ウサギ、ヒツジ蹄叉細
胞の使用もまた可能である。ラットの使用はある有利点
を提供し得る（＊Ｇｏｄｉｎｇ、１９８６、６０−６１
頁）が、マウスが好適であり、ＢＡＬＢ／ｃマウスが最
も好適であり、これは最も日常的に用いられ、そして一
般に、より高い割合の安定な融合を生じる。 【０４３９】免疫後、抗体産生能力のある体細胞、特に
Ｂリンパ球（Ｂ細胞）が、ＭＡｂ生成プロトコルにおけ
る使用について選択される。これらの細胞は、生検され
た脾臓、扁桃腺、またはリンパ節から、あるいは末梢血
サンプルから得られ得る。脾臓細胞および末梢血細胞が
好適であり、前者は、分裂形質芽球期における抗体産生
細胞の豊富な供給源であるためであり、そして後者は末
梢血が容易に入手し可能であるからである。時折、パネ
ルの動物が免疫され、そして最高の抗体力価を有する動
物の脾臓が取り出され、そして脾臓リンパ球が脾臓をシ
リンジでホモジナイズすることにより得られている。代
表的には、免疫されたマウス由来の脾臓は、約５×１０
７〜２×１０８のリンパ球を含む。 【０４４０】免疫された動物由来の抗体産生Ｂリンパ球
は、次いで、不死化ミエローマ細胞の細胞、一般に免疫
された動物と同種の細胞、と融合される。好適には、ハ
イブリドーマ産生融合手順に使用するために適したミエ
ローマ細胞株は非抗体産生であり、高い融合効率、およ
び次いで、所望の融合細胞（ハイブリドーマ）のみの増
殖を支持するある選択培地中での増殖を不可能にする酵
素欠損を有する。 【０４４１】多くのミエローマ細胞の任意の１つが、当
業者に知られているように用いられ得る（＊Ｇｏｄｉｎ
ｇ，６５−６６頁、１９８６；＊Ｃａｍｐｂｅｌｌ、７
５−８３頁、１９８４）。例えば、免疫された動物がマ
ウスである場合、Ｐ３−Ｘ６３−／Ａｇ８、Ｘ６３−Ａ
ｇ８．６５３、ＮＳ１／１．Ａｇ ４ １、Ｓｐ２１０
−Ａｇ１４、ＦＯ、ＮＳＯ／Ｕ、ＭＰＣ−１１、ＭＰＣ
１１−Ｘ４５−ＧＴＧ１．７、およびＳ１９４／５ＸＸ
０ Ｂｕｌを使用し得；ラットについては、Ｒ２１０．
ＲＣＹ．ＲＣＹ３、Ｙ３−Ａｇ １．２．３、ＩＲ９８
３Ｆ、４Ｂ２１０、または上記に挙げたマウス細胞株の
１つを使用し得；そして、Ｕ−２６６、ＧＭ１５００−
ＧＲＧ２、ＬＩＣＲ−ＬＯＮ−ＨＭｙ２、およびＵＣ７
２９−６はヒト細胞融合と関連して全て有用である。 【０４４２】１つの好ましいマウスミエローマ細胞はＡ
６３−Ａ６８、６５３ミエローマ細胞株であり、これは
ＡＴＣＣから容易に入手可能である。用いられ得る別の
マウスミエローマ細胞株は、８−アザグアニン耐性マウ
スミエローマＳＰ２／０非産生細胞株である。 【０４４３】抗体産生脾臓細胞またはリンパ節細胞とミ
エローマ細胞とのハイブリッドを生成する方法は、通
常、体細胞をミエローマ細胞と４：１の割合で混合する
工程を包含するが、この割合は、細胞膜の融合を促進す
る１つの薬剤または複数の薬剤（化学物質または電気的
物質）の存在下、それぞれ約２０：１〜約１：１まで変
化し得る。Ｓｅｎｄａｉウイルスを用いる融合方法は、
ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５；１９
７６）に記載されており、そして３７％（ｖ／ｖ）ＰＥ
Ｇのようなポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を用いる
方法がＧｅｆｔｅｒら（１９７７）により記載されてい
る。電気的に誘導される融合方法の使用もまた適切であ
る（＊Ｇｏｄｉｎｇ，７１−７４頁、１９８６）。 【０４４４】融合手順は、通常、低い頻度、約１×１０
−６〜１×１０−８で生存可能なハイブリッドを産生す
る。しかし、これは、選択培地中で培養することによ
り、生存可能な融合されたハイブリッドが親の非融合細
胞（特に正常には無限に分裂し続ける非融合ミエローマ
細胞）から分化されるような問題を提起しない。この選
択培地は、一般に、組織培養培地でヌクレオチドの新規
合成をブロックする薬剤を含む培地である。代表的かつ
好適な薬剤は、アミノプテリン、メトトレキセート、お
よびアザセリンである。アミノプテリンおよびメトトレ
キセートは、プリンおよびピリミジンの両方の新規合成
をブロックするが、アザセリンはプリン合成のみをブロ
ックする。アミノプテリンまたはメトトレキセートが用
いられる場合、培地にヌクレオチド供給源としてヒポキ
サンチンおよびチミジンが補充される（ＨＡＴ培地）。
アザセリンが用いられる場合、培地にヒポキサンチンが
補充される。 【０４４５】好適な選択培地はＨＡＴである。ヌクレオ
チドサルベージ経路の操作可能な細胞のみが、ＨＡＴ培
地中で生存し得る。ミエローマ細胞はサルベージ経路の
重要な酵素（例えば、ヒポキサンチンホスホリボシルト
ランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ））が欠損しており、そし
てそれらは生存し得ない。Ｂ細胞はこの経路を操作し得
るが、培養物中での生存期間が限定されており、一般
に、約２週間以内に死滅する。従って、選択培地中で生
存し得る細胞のみがミエローマおよびＢ細胞から形成さ
れるハイブリッドである。 【０４４６】この培養は、特定のハイブリドーマが選択
されるハイブリドーマの群を提供する。代表的には、ハ
イブリドーマの選択は、マイクロタイタープレートで単
一のクローンの希釈により細胞を培養すること、次いで
所望の反応性について（約２〜３週後）個々のクローン
上清を試験することにより行われる。このアッセイは、
例えば、ラジオイムノアッセイ、酵素免疫アッセイ、細
胞障害性アッセイ、プラークアッセイ、ドット免疫結合
アッセイなどのように、感度が高く、簡単、かつ迅速で
あるべきである。 【０４４７】次いで、選択されたハイブリドーマは連続
希釈され、そして個々の抗体産生細胞株中にクローニン
グされ、次いで、このクローンは、ＭＡｂを提供するた
めに無限に増殖され得る。この細胞株は、ＭＡｂ産生の
ために２つの基本的な方法で利用され得る。ハイブリド
ーマのサンプルは、最初の融合用の体細胞およびミエロ
ーマ細胞を提供するために用いられたタイプの組織適合
性動物に（しばしば腹腔に）注入され得る。注入された
動物は、融合された細胞ハイブリッドにより産生される
特異的モノクローナル抗体を分泌する腫瘍を発生する。
次いで、この動物の体液（例えば、血清または腹水）
は、高濃度でＭＡｂを提供するために採取され得る。個
々の細胞株はまたインビトロで培養され得、ここではＭ
Ａｂが高濃度で容易に得られ得る培養培地中に自然に分
泌される。いずれかの手段により産生されるＭＡｂは、
所望であれば、濾過、遠心分離、および種々のクロマト
グラフ法（例えば、ＨＰＬＣまたはアフィニティークロ
マトグラフィー）を用いてさらに精製され得る。 【０４４８】発明者らはまた、モノクローナル抗体を生
成するために分子クローニングアプローチを使用するこ
とを意図する。このために、組み合わせ免疫グロブリン
ファージミドライブラリーは、免疫された動物の脾臓か
ら単離されるＲＮＡから調製され、そして適切な抗体を
発現するファージミドは、抗原を発現する細胞およびコ
ントロール細胞（例えば、正常細胞対腫瘍細胞）を用い
てパンニングすることにより選択される。このアプロー
チが従来のハイブリドーマ技術よりも有利な点は、１ラ
ウンドで約１０４倍多くの抗体が産生およびスクリーニ
ングされ得ること、および、ＨおよびＬ鎖の組み合わせ
により新しい特異性が生じることであり、このことは適
切な抗体を見出す機会をさらに増加させる。 【０４４９】本発明でＭＡｂを用いる場合、これは、ヒ
ト、マウス、サル、ラット、ハムスター、ニワトリ、ま
たはさらにウサギ起源であり得る。本発明は、ヒト抗
体、ヒト定常および／または可変領域ドメインを有する
マウス、ラット、または他の種由来の「ヒト化」または
キメラ抗体、および他の組換え抗体ならびにこれらのフ
ラグメントの使用を意図する。もちろん、調製の容易さ
および試薬の迅速な入手可能性のため、代表的にはマウ
スモノクローナル抗体が好ましい。 【０４５０】（２．機能的抗体結合領域）標的化剤抗体
または抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、
Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖ）の起源または由
来は、二重特異性リガンドの調製に実際に用いられる抗
体またはフラグメントが所望の結合特性を示す限りは、
本発明の実施に特に重要であるとは考えられない。 【０４５１】Ｆｃ部分が除去されている抗体調製物を使
用する必要があり得る。免疫グロブリン分子のフラグメ
ント化は、制御されたタンパク質分解により達成され得
るが、その条件は、種および免疫グロブリンクラスまた
はサブクラスによりかなり変化する。２価Ｆ（ａｂ’）
２フラグメントは、通常、１価ＦａｂまたはＦａｂ’フ
ラグメントよりも好適である。 【０４５２】（Ｆａｂ）Ｆａｂフラグメントは、非特異
的チオールプロテアーゼであるパパインによる全免疫グ
ロブリンのタンパク質分解より得られ得る。パパイン
は、まず、システイン、２−メルカプトエタノール、ま
たはジチオトレイトールを用いて活性部位におけるスル
フヒドリル（ｓｕｌｐｈｙｄｒｙｌ）基を還元すること
により活性化されなければならない。ストック酵素中の
重金属は、最大酵素活性を確実にするためにＥＤＴＡ
（２ｍＭ）を用いるキレート形成により除去すべきであ
る。酵素および基質は、正常には１：１００の重量比で
一緒に混合される。インキュベーション後、反応は、ヨ
ードアセトアミドを用いるチオール基の不可逆的アルキ
ル化によってまたは単に透析によって停止され得る。消
化の完全性はＳＤＳ−ＰＡＧＥによりモニターされるべ
きであり、そして種々の画分は、プロテインＡ−セファ
ロースまたはイオン交換クロマトグラフィーにより分離
されるべきである。 【０４５３】（Ｆ（ａｂ’）２）ウサギおよびヒト起源
のＩｇＧからのＦ（ａｂ’）２フラグメントを調製する
ための通常の手順は、酵素ペプシン（プロトコル７．
３．２）によるタンパク質分解により制限される。条件
（酢酸緩衝液中１００×抗体過剰ｗ／ｗ、ｐＨ ４．
５、３７℃）は、抗体が重鎖間ジスルフィド結合のＣ末
端側で切断されることを示唆する。マウスＩｇＧの消化
速度はサブクラスによって変化し得、そしていくつかの
未消化または完全に分解されたＩｇＧを含まない高収率
の活性Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを得ることは困難で
あり得る。特に、ＩｇＧ２ｂは完全な分解を非常に受け
やすい。他のサブクラスは、最適な結果を生じるために
異なるインキュベーション条件を必要とする。 【０４５４】ペプシンによるラットＩｇＧの消化は、
０．１Ｍ 酢酸緩衝液、ｐＨ ４．５中での透析、およ
び次いで１％ｗ／ｗペプシンとの４時間のインキュベー
ションを包含する条件を必要とし；ＩｇＧ１およびＩｇ
Ｇ２ａの消化は、最初に０．１Ｍ ギ酸緩衝液、ｐＨ
２．８に対して４℃で１６時間透析し、次いで酢酸緩衝
液に対して透析する場合は改良される。ＩｇＧ２ｂで
は、０．１Ｍ リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ ７．８
中、３７℃にて４時間、スタフィロコッカスのＶ８プロ
テアーゼ（３％ｗ／ｗ）とインキュベーションすること
によってさらに一貫した結果が得られる。 【０４５５】（３．二重特異性抗体）一般に、二重特異
性抗体の調製もまた、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）に
より例示されるように、当業者に周知である。二重特異
性抗体は、例えば、ガン患者を処置するために（Ｂａｕ
ｅｒら、１９９１）臨床的に用いられている。二重特異
性抗体の調製の１つの方法は、一方は標的された腫瘍細
胞抗原および他方は凝固剤（または活性化抗原のような
他の所望の標的）に特異性を有する抗体の別個の調製を
包含する。 【０４５６】二重特異性抗体はまた、免疫療法剤として
の使用のために特に開発されている。抗原誘発とともに
初期に述べられているように、これらの抗体のいくつか
がリンパ球と腫瘍抗原とを架橋するために開発された
（Ｎｅｌｓｏｎ，１９９１；Ｓｅｇａｌら、１９９
２）。例としては、Ｔ細胞と、例えば、ＣＤ３において
腫瘍抗原とを結合し、ならびに標的細胞に極めて接近し
てＴＣＲ／ＣＤ３複合体を物理的に架橋することにより
リンパ球活性化を引き起こすキメラ分子を包含する（Ｓ
ｔａｅｒｚら、１９８５；Ｐｅｒｅｚら、１９８５；１
９８６ａ；１９８６ｂ；Ｔｉｎｇら、１９８８）。 【０４５７】実際に、ガン腫、リンパ腫、白血病、およ
びメラノーマの腫瘍細胞は、Ｔ細胞による二重特異性抗
体媒介死滅を受けやすいことが報告されている（Ｎｅｌ
ｓｏｎ、１９９１；Ｓｅｇａｌら、１９９２；ｄｅＬｅ
ｉｊら、１９９１）。これらのタイプの二重特異性抗体
はまた、悪性の腫瘍標的に対していくつかの第Ｉ相臨床
試験で用いられている。それらは本発明によれば新規な
組成物ではないが、二重特異性架橋抗体を本明細書に記
載される二重特異性凝固リガンドとともに組み合わせて
使用することもまた意図される。二重特異性架橋抗体
は、参考文献（例えば、ｄｅＬｅｉｊら（１９９１）；
Ｃｌａｒｋら（１９９１）；Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら（１
９９２）；Ｂｏｌｈｕｉｓら（１９９２）；およびＮｉ
ｔｔａら（１９９０））に記載されるように投与され得
る。 【０４５８】二重特異性抗体の調製について当該分野で
は多くの方法が公知であるが、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９
８７）の方法は、２つの選択された抗体からの消化性Ｆ
（ａｂ’γ）２フラグメントの調製、次いで別個のＦａ
ｂ’γＳＨフラグメントを提供するためのそれぞれの還
元を包含する。結合されるべき２つのパートナーのうち
の１つにおけるＳＨ基は、次いで、ｏ−フェニレンジマ
レイミドのような架橋試薬でアルキル化されて、一方の
パートナーにおいて遊離のマレイミド基を提供する。次
いで、このパートナーは、チオエーテル結合によって他
方に結合されて、所望のＦ（ａｂ’γ）２ヘテロ接合体
を得る。 【０４５９】調製、高収量、および再現性の容易さのた
め、Ｇｌｅｎｎｉｅら（１９８７）の方法は、しばしば
二重特異性抗体の調製に好適であるが、用いられ得るお
よび発明者らにより意図される多くの他のアプローチが
ある。例えば、他の技術は公知であり、ＳＰＤＰまたは
プロテインＡとの架橋が行われるか、あるいは三重特異
性構築物が調製される（Ｔｉｔｕｓら、１９８７；Ｔｕ
ｔｔら、１９９１）。 【０４６０】二重特異性抗体を産生する別の方法は、２
つのハイブリドーマの融合によるクアドローマ（ｑｕａ
ｄｒｏｍａ）の形成である（Ｆｌａｖｅｌｌら、１９９
１、１９９２；Ｐｉｍｍら、１９９２；Ｆｒｅｎｃｈ
ら、１９９１；Ｅｍｂｌｅｔｏｎら、１９９１）。本明
細書中で用いられる用語「クアドローマ」は、２つのＢ
細胞ハイブリドーマの生産的融合を記載するために用い
られる。現在の標準的技術を用いて、２つの抗体産生ハ
イブリドーマが融合されて娘細胞を得、そして次いで、
両セットのクローン型の免疫グロブリン遺伝子の発現を
維持したこれらの細胞が選択される。 【０４６１】クアドローマを生成する好ましい方法は、
親ハイブリドーマの少なくとも１つの酵素欠損変異体の
選択を包含する。次いで、この第１の変異体ハイブリド
ーマ細胞株が、例えば、ヨードアセトアミドに致死的に
曝された、その継続した生存が妨げられる第２のハイブ
リドーマの細胞に融合される。細胞融合は、致死的に処
理されたハイブリドーマから酵素欠損に関する遺伝子を
獲得することによる第１のハイブリドーマのレスキュ
ー、および第１のハイブリドーマへの融合による第２の
ハイブリドーマのレスキューを可能にする。同じイソ型
であるが異なるサブクラスの免疫グロブリンの融合が、
好ましいが、必要とされるわけではない。混合サブクラ
ス抗体は、好ましいクアドローマの単離のための代替ア
ッセイの使用を可能にする。 【０４６２】より詳細には、クアドローマ開発およびス
クリーニングの１つの方法は、第１の選択ＭＡｂを分泌
するハイブリドーマ株を得、そして必須代謝酵素である
ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェ
ラーゼ（ＨＧＰＲＴ）を欠損しているこの株を作製する
ことを包含する。ハイブリドーマの欠損変異体を得るた
めに、細胞を８−アザグアニンの漸増濃度（１×１０
−７Ｍ〜１×１０−５Ｍ）の存在下で増殖させる。変異
体を限界希釈によりサブクローン化し、そしてヒポキサ
ンチン／アミノプテリン／チミジン（ＨＡＴ）感受性に
ついて試験する。培養培地は、例えば、１０％ＦＣＳ、
２ｍＭ Ｌ−グルタミン、および１ｍＭペニシリン−ス
トレプトマイシンを補充したＤＭＥＭからなり得る。 【０４６３】第２の所望のＭＡｂを産生する相補ハイブ
リドーマ細胞株は、標準的な細胞融合技術（Ｇａｌｆｒ
ｅら、１９８１）によるか、またはＣｌａｒｋら、（１
９８８）により記載のプロトコルを用いることにより、
クアドローマを生成するために用いられる。簡単にいえ
ば、４．５×１０７個のＨＡＴ−感受性第１細胞を、致
死用量の不可逆性の生化学的インヒビターであるヨード
アセトアミド（リン酸緩衝化生理食塩水中５ｍＭ）で、
融合前に、３０分間氷上で前処理した２．８×１０７個
のＨＡＴ−耐性第２細胞と混合する。細胞融合をポリエ
チレングリコール（ＰＥＧ）を用いて誘導し、そして細
胞を９６ウェルマイクロ培養プレートに播種する。クア
ドローマをＨＡＴ含有培地を用いて選択する。二重特異
性抗体含有培養物を、例えば、固相イソ型特異的ＥＬＩ
ＳＡおよびイソ型特異的免疫蛍光染色を用いて、同定す
る。 【０４６４】二重特異性抗体を同定するための１つの同
定の実施態様では、マイクロタイタープレート（Ｆａｌ
ｃｏｎ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗ
ａｒｅ）のウェルが、親ハイブリドーマ抗体の１つと特
異的に相互作用し、かつ両抗体と交差反応性を有さない
試薬でコートされる。プレートは洗浄され、ブロックさ
れ、そして試験されるべき上清（ＳＮ）が各ウェルに添
加される。プレートは室温で２時間インキュベートさ
れ、上清は捨てられ、プレートは洗浄され、そして希釈
アルカリホスファターゼ−抗抗体接合体が室温で２時間
添加される。プレートは洗浄され、そしてホスファター
ゼ基質（例えば、Ｐ−ニトロフェニルリン酸（Ｓｉｇｍ
ａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ））が各ウェルに添加される。プ
レートはインキュベートされ、３Ｎ ＮａＯＨが各ウェ
ルに添加されて反応を停止させ、そしてＯＤ４１０値が
ＥＬＩＳＡリーダーを用いて測定される。 【０４６５】別の同定実施態様では、ポリ−Ｌ−リジン
で前処理したマイクロタイタープレートが、標的細胞の
１つを各ウェルに結合させるために用いられ、次いで細
胞が、例えば、１％グルタルアルデヒドを用いて固定化
され、そして二重特異性抗体が、それらの無傷細胞への
結合能力について試験される。さらに、ＦＡＣＳ、免疫
蛍光染色、イディオタイプ特異的抗体、抗原結合競合ア
ッセイ、および抗体特徴付けの分野において一般的な他
の方法が、本発明と共に、好ましいクアドローマを同定
するために用いられ得る。 【０４６６】クアドローマを単離した後、二重特異性抗
体が他の細胞産物から精製される。これは、免疫グロブ
リン精製の当業者に公知の種々のタンパク質単離手順に
より達成され得る。抗体を調製および特徴付けする手段
は、当該分野において周知である（例えば、★Ａｎｔｉ
ｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ
ｌ，１９８８を参照のこと）。 【０４６７】例えば、選択されたクアドローマからの上
清が、プロテインＡまたはプロテインＧセファロースカ
ラムに通され、ＩｇＧを結合する（イソ型に依存す
る）。次いで、結合された抗体が、例えば、ｐＨ５．０
クエン酸緩衝液で溶出される。ＢｓＡｂを含有する溶出
画分が、等張緩衝液に対して透析される。あるいは、溶
出液はまた、抗免疫グロブリンセファロースカラムに通
される。次いで、ＢｓＡｂが、３．５Ｍ塩化マグネシウ
ムで溶出される。次いで、このようにして精製されたＢ
ｓＡｂは、例えば、上記のように、イソ型特異的ＥＬＩ
ＳＡおよび標的細胞の免疫蛍光染色アッセイにより、結
合活性について試験される。 【０４６８】精製ＢｓＡｂおよび親抗体はまた、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、続いて銀またはクマシーで
染色することにより特徴づけおよび単離され得る。これ
は、親抗体の一方が他方より高い分子量を有する場合に
可能である。その場合、ＢｓＡｂのバンドは、２つの親
抗体のバンド間の中間部に移動する。サンプルの還元
は、２つの異なる見かけ分子量を有する重鎖の存在を確
証する。 【０４６９】さらに、組換え技術が、一般に抗体の調製
のために、現在利用可能である。このことにより、所望
の二重特異性を有する抗体をコードする組換え抗体遺伝
子の調製が可能となる（Ｖａｎ Ｄｕｋら、１９８
９）。従って、最も好ましい結合特性を有するモノクロ
ーナル抗体を選択した後、これらの抗体に関するそれぞ
れの遺伝子が、例えば、ファージ発現ライブラリーの免
疫スクリーニングにより、単離され得る（ＯｉおよびＭ
ｏｒｒｉｓｏｎ，１９８６；ＷｉｎｔｅｒおよびＭｉｌ
ｓｔｅｉｎ，１９９１）。次いで、Ｆａｂコードドメイ
ンの再配列により、適切なキメラ構築物が容易に得られ
得る。 【０４７０】（Ｅ．結合アッセイ）本発明は、動物およ
びヒト処置法（ｒｅｇｉｍｅｎ）において重要な有用性
を有するが、これは、多くの他の実施用途もまた有す
る。これらの用途は、一般に、二重特異性化合物の特異
的結合能に関連する。本発明の全ての化合物は、少なく
とも１つの標的および結合成分（例えば、抗体、リガン
ド、レセプターなど）を含むので、得られる二重特異性
構築物は、本来の抗体、リガンド、またはレセプターな
どが用いられ得る事実上全ての結合実施態様において用
いられ得る。コアギュラントまたは他の結合領域の存在
は、いずれの結合アッセイにおいても第１の結合領域の
有用性を打ち消さない。 【０４７１】このようにして、二重特異性凝固リガンド
は、標準的な結合アッセイにおいて用いられ得る。この
結合アッセイとしては、例えば、免疫ブロット、ウェス
タンブロット、および抗原が固体支持体マトリックス
（例えば、ニトロセルロース、ナイロン、またはそれら
の組合せ）上に固定化されている他のアッセイが挙げら
れる。それらリガンドは、単に「抗体基質」として用い
られ得るか、または標準的な二次試薬が許容不能に高い
バックグラウンドを生じさせる抗原の検出で用いられ
る、より特異的な検出手段を提供するために用いられ得
る。これは、研究される抗原がそれ自身免疫グロブリン
であるか、または他の抗体がこの手順において用いられ
る（ＥＬＩＳＡの場合において以下に例示する）場合、
特に有用である。 【０４７２】二重特異性結合リガンドはまた、解凍した
ばかりの組織塊およびホルマリン固定化パラフィン包埋
組織塊の両組織塊と共に、免疫組織化学；蛍光活性化細
胞選別、フローサイトメトリー、またはフローマイクロ
フルオロメトリー；複合体混合物から標的抗原を分離す
るための免疫沈降（この場合、それらが分子格子を形成
できるため、二次マトリックス結合試薬を用いなくても
沈降を達成し得る）；抗原または細胞精製実施態様（例
えば、アフィニティークロマトグラフィー、特定の場合
では、１つまたはそれ以上の細胞集団の同時一工程高速
精製さえも包含する）；および本明細書中に示される情
報を与えられる当業者に公知の多くの他の結合アッセイ
において、用いられ得る。 【０４７３】一例として、本発明の二重特異性リガンド
は、ＥＬＩＳＡアッセイにおいて用いられ得る。多くの
タイプのＥＬＩＳＡが知られており、そして当該分野に
おいて日常的に実施されている。二重特異性リガンド
は、実施される特定のＥＬＩＳＡタイプおよび検出され
るべき「抗原」（成分）に依存して、いずれの結合工程
においても用いられ得る。従って、リガンドは、プレー
トをコートするように用いられ得、抗原として結合部位
に関して競合し得、一次結合リガンド、二次結合リガン
ド、または三次または他の結合リガンドとしてさえ標準
曲線を作成し得る。以下に記載する代表的な様式をさら
に考慮し、多くのＥＬＩＳＡ実施様式が当業者に公知で
ある。 【０４７４】ＥＬＩＳＡの１つの形態では、結合標的
（一般的に抗体自身である）が、ポリスチレンマイクロ
タイタープレートのウェルのような選択された表面、好
ましくはタンパク質親和性を示す表面上に固定化され
る。洗浄して不完全に吸着した物質を除去した後、試験
抗血清に関して抗原的に中性であると知られる非特異的
タンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、
カゼイン、または粉乳溶液）でアッセイプレートウェル
を結合またはコートすることが望ましい。これは、固定
化表面上の非特異的吸着部位のブロックを可能にし、従
って表面上の抗血清の非特異的結合により引き起こされ
るバックグラウンドを低下させる。 【０４７５】これらのＥＬＩＳＡタイプ（一般的にサン
ドイッチＥＬＩＳＡと呼ばれる）において、プレート結
合抗体は、抗原を「捕捉」するために用いられる。第１
の抗体をウェルに結合させ、非反応性物質でコートして
バックグラウンドを低下させ、そして洗浄して非結合物
質を除去した後、固定化表面は、本発明の代表的な実施
態様において、免疫複合体（抗原／抗体）形成が導かれ
る様式で、検出および／または力価測定されるべき抗原
性物質を含有する試験サンプルと接触される。これらの
実施態様は、臨床サンプルまたは生体抽出液においてリ
ガンドを検出するために、特に有用である。サンプル
は、好ましくは、ＢＳＡ、ウシγグロブリン（ＢＧ
Ｇ）、およびリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、なら
びに界面活性剤（例えばＴｗｅｅｎ）の溶液で希釈され
る。 【０４７６】次いで、重層した抗血清が、２〜４時間、
好ましくは２５〜３７℃の目安の温度でインキュベート
される。インキュベーション後、抗血清接触表面は、非
免疫複合物質を除去するように洗浄される。好ましい洗
浄手順は、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ、またはホウ酸緩衝液の
ような溶液を用いる洗浄を包含する。 【０４７７】結合抗原と試験サンプルとの間で特異的免
疫複合体を形成し、続いて洗浄した後、免疫複合体形成
の発生および量は、同じ複合体を二次特異的結合成分
（一般に抗体ベースの成分である）に供することにより
決定され得る。特定の実施態様では、本発明の二重特異
性リガンドは、この工程において用いられるように提案
されている。次いで、特異的結合工程および洗浄工程が
さらに実施される。 【０４７８】本発明の代表的な実施態様において検出手
段を提供するために、検出標識に結合されている第３の
抗体が用いられる。検出標識としては、適切な色素原基
質とインキュベートさせた際に発色を生じさせる結合酵
素が挙げられる。第３のまたは三次の標識抗体は、二重
特異性リガンドの一成分に対して結合親和性を有する。
最終免疫複合体は、適切な結合工程および洗浄工程の後
に、標識を検出することにより決定される。この標識の
検出は、例えば、色素原基質とインキュベートすること
により行われる。色素原基質としては、例えば、尿素お
よびブロモクレゾールパープル、または２，２’−アジ
ノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−６−スルホ
ン酸［ＡＢＴＳ］およびＨ２Ｏ２が挙げられる。次い
で、定量は、例えば、可視スペクトル分光光度計を用い
て、発色の程度を測定することにより達成される。 【０４７９】上記のＥＬＩＳＡタイプと共に、二次検出
試薬として二重特異性凝固リガンドを用いることは、別
個の利益を有する。例えば、そのことにより、通常標的
される典型的な抗体定常領域とは異なる二重特異性リガ
ンドの部分に特異的な三次の標識抗体の使用が可能にな
る。特に、二重特異性構築物の凝固部分（または凝固結
合領域）に特異的である三次結合リガンドが用いられ得
る。免疫複合体形成を検出するこの新規な手段は、サン
ドイッチＥＬＩＳＡにおいて特に有用な改良特異性を与
える。このサンドイッチＥＬＩＳＡでは、三次抗体が、
意図された二次抗体にちょうど結合するのではなく、プ
レートをコートするために用いられる本来の物質（すな
わち、本来の抗体）と交差反応し、そして結合し得る。
二重特異性リガンドの非抗体部分に対して、または新規
な抗原結合領域に対してさえも標識三次成分を指向する
ことにより、非特異的結合の問題および異例に高いバッ
クグラウンドは回避される。 【０４８０】二重特異性リガンドのさらなる実施用途
は、それらの凝固能を利用することにより明らかであ
る。提案された全ての化合物は凝固を誘導し得るので、
それらは、凝固を一成分として包含する任意のアッセイ
において、例えば、コントロールとして用いられ得る。
標的成分の存在は、このようなアッセイにおいて、他と
は独立した各成分機能として、コアギュラントの有用性
を打ち消さない。 【０４８１】（Ｆ．組織因子結合二重特異性抗体の有効
な用途）初めの方で述べたように、組織因子（ＴＦ）
は、血液凝固を開始させ得る１つの因子である。ＴＦ
は、血管損傷において、または特定のサイトカインによ
る活性化後に、血液に曝される。次いで、利用可能なＴ
Ｆが、第ＶＩＩａ因子と複合体を形成し、最終的にフィ
ブリン形成を生じる凝固カスケードを開始させる。 【０４８２】１つの代表的な実施態様において、本発明
者らは、１つの抗原結合部位では腫瘍血管系内皮細胞上
の抗原に対する特異性を有し、そして他方の抗原結合部
位ではヒトＴＦの細胞外ドメインに対する特異性を有す
る二重特異性抗体を合成した。ヒトＴＦに対して特異性
を有する抗体は、第ＶＩＩａ因子複合体形成事象または
ＴＦ／ＶＩＩａ活性を妨害することなく、高い親和性で
ＴＦに結合することが既に示された（Ｍｏｒｒｉｓｓｅ
ｙら、１９８８）。全長ヒトＴＦを用いる代わりに、本
発明者らは、短縮型（ｔＴＦ）を用いた。この短縮型
は、細胞質ドメインならびに膜貫通ドメインを欠く。短
縮されたＴＦは、第ＶＩＩａ因子と複合体を形成し得る
が、凝固誘導活性を欠く。これはおそらく、凝固開始複
合体（第Ｘ因子を含む）がアセンブルし得る膜表面と、
複合体を形成し得ないからである。 【０４８３】この腫瘍血管系内皮細胞表面特異的標的構
築物の有効性を分析するために用いられるマウスモデル
は、最近確立されたモデルであり、このモデルでは、Ｍ
ＨＣクラスＩＩ抗原（正常組織の血管系には存在しな
い）が、腫瘍細胞により分泌されるＩＦＮ−γによる誘
導により、腫瘍血管系で発現される（Ｂｕｒｒｏｗｓ
ら、１９９２；ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１
９９３）。静脈内に投与された抗クラスＩＩ抗体は迅速
かつ強く腫瘍血管系に局在化することが実証されている
（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２）。 【０４８４】本発明者らは、Ｃ１３００（Ｍｕγ）腫瘍
生成マウスにおいて、抗ＭＨＣクラスＩＩ／抗ＴＦ二重
特異性抗体が、ｔＴＦと共に投与される場合、腫瘍の血
管系において特異的に凝固を誘導し得ることを、本明細
書中において実証する。実際に、抗体：ｔＴＦ複合体の
静脈内投与は、腫瘍血管系の迅速な血栓症を誘導し、７
０％の動物で腫瘍退縮を完了した。二重特異性抗体単
独、ｔＴＦ抗体単独、ｔＴＦ存在下または非存在下の任
意のイソ型適合性コントロール抗体のいずれもが、同一
の効果を誘起し得なかった。このことは、Ｂ２１−２／
１０Ｈ１０二重特異性抗体が、標的細胞およびｔＴＦを
架橋し得る「コアギュリガンド」として作用し、それに
よりｔＴＦが第Ｘ因子を活性化し得、そして凝固カスケ
ードを開始させ得ることを示している。これはまた、固
形腫瘍の処置におけるコアギュリガンドの明らかな成功
を示す。 【０４８５】（Ｇ．薬学的組成物およびキット）本発明
の薬学的化合物は、一般に薬学的に受容可能なキャリア
または水性媒体に溶解または分散した有効量の二重特異
性凝固リガンドを包含する。 【０４８６】用語「薬学的に受容可能」または「薬理学
的に受容可能」は、動物またはヒトに、適切に投与され
るとき、有害な、アレルギー性のまたはその他の不都合
な反応を起こさない分子実体および組成物をいう。本明
細書中で用いられるように、「薬学的に受容可能なキャ
リア」としては、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、
コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張化剤（ｉ
ｓｏｔｏｎｉｃ ａｇｅｎｔ）および吸収遅延剤（ａｂ
ｓｏｒｐｔｉｏｎ ｄｅｌａｙｉｎｇ ａｇｅｎｔ）な
どが挙げられる。薬学的活性物質に対するこのような媒
体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の
従来の媒体または薬剤は、活性成分と適合しないもので
はない限り、本治療組成物中でのその使用が意図され
る。補助活性成分もまた、組成物に取り入られ得る。 【０４８７】（１．非経口処方物）本発明の二重特異性
リガンドは、しばしば非経口投与のために処方される。
例えば、静脈内、筋肉内、皮下または他のそのような経
路を経る注射（腫瘍部位または疾病部位に直接点滴する
ことを含む）のために処方される。活性成分として腫瘍
標的化凝固剤を含有する水性組成物は、本発明の開示を
考慮すれば当業者に理解される。代表的には、このよう
な組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかのように
注射可能なものとして調製され得る。注射前に液体を加
えて溶液または懸濁液を調製するために用いられるのに
適する固体の形態もまた、調製され得る。そして調製物
はまた、乳化もされ得る。 【０４８８】遊離塩基または薬理学的に受容可能な塩の
ような活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロ
ースのような界面活性剤と適切に混合された水中で調製
され得る。分散体はまた、グリセロール、液体ポリエチ
レングリコール、およびそれらの混合物、ならびにオイ
ル中で調製され得る。通常の保存および使用条件下で
は、これらの調製物は、保存剤を含有し微生物の成育を
防止する。 【０４８９】注射用途に適した薬学的形態としては、無
菌水溶液または分散体；ゴマ油、ピーナッツ油、または
水性プロピレングリコールを含有する処方物；および無
菌注射溶液または分散体の用時調製のための無菌粉末が
挙げられる。すべての場合で、形態は、無菌でなければ
ならず、容易にシリンジで使用できる程度まで流動的で
なければならない。それは、製造および保存条件下で安
定でなければならず、微生物（例えば、細菌類および真
菌類）の混入作用に対して保護されなければならない。 【０４９０】二重特異性リガンドまたは抗体は、中性ま
たは塩の形態で組成物の中に処方され得る。薬学的に受
容し得る塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基に
より形成される）を包含し、そしてこれは無機酸（例え
ば、塩酸またはリン酸）または有機酸（例えば、酢酸、
シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）により形成され
る。遊離カルボキシル基により形成される塩はまた、無
機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、
水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化
第二鉄）および有機塩基（例えば、イソプロピルアミ
ン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）
から誘導され得る。 【０４９１】キャリアはまた、例えば、水、エタノー
ル、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレング
リコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、
それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または
分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン
のようなコーティングの使用により、分散の場合には要
求される粒子の大きさの維持により、および界面活性剤
の使用により維持され得る。微生物の作用を防止するこ
とは、種々の抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベ
ン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメ
ロサールなど）により達成され得る。多くの場合、等張
化剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）を含有するこ
とが好ましい。注射可能な組成物の吸収を延長すること
は、吸収を遅延する薬物（例えば、アルミニウムモノス
テアレートおよびゼラチン）の組成物中での使用で達成
され得る。 【０４９２】無菌注射溶液は、適切な溶媒中の必要量の
活性化合物を、必要に応じて上に列挙した種々の他の成
分と組み合わせ、続いて滅菌濾過を行うことにより調製
される。一般に、分散物は、種々の滅菌された活性成分
を、塩基性分散媒および上に列挙したもののうち必要と
される他の成分を含有する無菌ビヒクルの中に組み入れ
ることにより調製される。無菌注射溶液の調製のための
無菌粉末の場合、調製の好ましい方法は真空乾燥技術お
よび凍結乾燥技術であり、それらの技法は、活性成分と
付加的な所望の成分との粉末を、あらかじめ無菌濾過さ
れたそれらの溶液から生成する。 【０４９３】処方されると、溶液は、投薬処方物に適合
した方法および治療に効果のあるような量で、投与され
る。処方物は、種々の剤形（例えば、上記の注射溶液の
タイプ）で容易に投与されるが、薬物放出カプセルなど
もまた、用いられ得る。 【０４９４】本発明に従った適切な薬学的組成物は、一
般に、予定される使用に応じて、受容し得る薬学的希釈
剤または賦形剤（例えば、無菌水溶液）と混合して最終
濃度の範囲にされた、ある量の二重特異性リガンドを含
有する。調製技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６
版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎ
ｙ、１９８０（本明細書中で参考として援用される）に
より例示されるように当該分野で周知である。エンドト
キシン混入は、安全レベル（例えば、０．５ｎｇ／ｍｇ
タンパク質未満）で最小限に維持されるべきことが理解
される。さらに、ヒト投与については、調製品は、ＦＤ
Ａ Ｏｆｆｉｃｅ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔ
ａｎｄａｒｄｓにより要求されるような無菌性、発熱
性、一般安全性および純度標準を満たすべきである。 【０４９５】治療効果量は、本明細書中（例えば、実施
例ＩＩＩ参照）に詳述する研究で示されるように、動物
モデルを用いて容易に決定され得る。固形腫瘍を有する
実験動物は、臨床環境に移される前に適切な治療用量を
最適化するのに、よく用いられる。このようなモデル
は、効果的な抗ガンストラテジーを予測するのに、非常
に信頼性のあることが知られている。例えば、実施例Ｉ
ＩＩで用いられるように、腫瘍を有するマウスは、前臨
床試験で広く用いられる。 【０４９６】本発明者は、Ｃ１３００（Ｍｏ８）腫瘍を
有するマウスを用い、毒性限界、および最小限の毒性で
至適な抗腫瘍効果を与える二重特異性の作用範囲を決定
した。 【０４９７】ガンの処置においての使用のための有効量
は、１週間あたり約１回の頻度でＩＶルートを経て投与
される場合、約０．１ｍｇ／ｋｇと約２ｍｇ／ｋｇとの
間、および好ましくは約０．８ｍｇ／ｋｇと約１．２ｍ
ｇ／ｋｇとの間であると、現在のところ提示されてい
る。処置される被験体の状態により、用量のいくらかの
変化は必然的に生じる。投与に対して責任のある人は、
いずれにしても、個々の患者に対して適切な用量を決定
する。このような最適化および調整は、当該分野で日常
的に行われ、そして決して過度の実験量を表さない。 【０４９８】本発明の一つの局面は、循環から内因性凝
固因子を蓄積し、腫瘍部位内にそれを濃縮する、複合化
していない二重特異性結合リガンドを投与することによ
る腫瘍部位への凝固剤の送達に関することに留意すべき
である。これらの場合、用いられる薬学的組成物は、標
的化領域およびコアギュラント結合領域を有するリガン
ドを含有するが、他の点では一般に上記のものと同じで
ある。 【０４９９】非経口投与（例えば、静脈内注射または筋
肉内注射）用に処方された化合物に加えて、他の薬学的
に受容され得る形態（例えば、錠剤または他の経口投与
のための固形物、時間放出（ｔｉｍｅ ｒｅｌｅａｓ
ｅ）カプセル、リポソーム形態など）もまた意図され
る。処置される状態に応じて、他の薬学的処方物もまた
用いられ得る。例えば、皮膚炎および乾癬のような病的
状態を処置するために適切な局所処方物；および糖尿病
性網膜症のための眼用処方物。 【０５００】（２．摂取可能な処方物）特定の実施態様
では、活性化合物は、経口投与され得る。このことは、
消化酵素によるタンパク質分解に、一般に耐性の、また
は耐性となる薬剤について意図される。このような化合
物は、化学的に設計または修飾された薬剤；右旋性ペプ
チジル薬剤；リポソーム処方物；およびペプチダーゼ分
解およびリパーゼ分解を避けるために時間放出カプセル
に入った処方物を包含することが意図される。 【０５０１】経口投与のために、活性二重特異性化合物
は、例えば不活性希釈剤または消化され得る食用キャリ
アと共に投与され得る。あるいは、それらは、堅いまた
は軟らかいシェルのゼラチンカプセル内に封入される
か、あるいは錠剤として圧縮されるか、あるいは食餌内
に直接組み入れられる。経口治療投与のために、活性化
合物は、賦形剤に組み入れられ、そして摂取し得る錠
剤、舌下錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸
濁液、シロップ、カシェ剤（ｗａｆｅｒ）などの形態で
用いられる。このような組成物および調製物は、少なく
とも０．１％の活性二重特異性コアギュラントを含有す
るべきである。組成物および調製物の割合は、当然変化
し得、好ましくはユニットの重量の約２％〜約６０％の
間であり得る。このような治療に有用な組成物中の活性
化合物の量は、適切な用量が得られるような量である。 【０５０２】錠剤、トローチ、丸剤、カプセルなどは、
また：結合剤（例えば、ゴムトラガカント、アラビアゴ
ム、コーンスターチ、またはゼラチン）；賦形剤（例え
ば、リン酸ジカルシウム）；崩壊剤（例えば、コーンス
ターチ、ポテトスターチ、アルギン酸など）；滑剤（例
えば、ステアリン酸マグネシウム）を含有し得、そして
甘味料（例えば、スクロース、ラクトース、またはサッ
カリン）または香料（例えば、ペパーミント、冬緑油、
またはチェリー香料）が添加され得る。用量単位形態が
カプセルの場合、上記のタイプの材料に加えて液体キャ
リアが含有され得る。 【０５０３】種々の他の材料は、コーティングとして、
またはそれ以外に用量単位の物理的形態を改変するよう
に存在し得る。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル
は、シェラック、糖またはその両方でコートされ得る。
エリキシル剤のシロップは、活性化合物、甘味料として
のスクロース、保存剤としてのメチルパラベンおよびプ
ロピルパラベン、染料、および香料（例えば、チェリー
香料またはオレンジ香料）を含有し得る。当然、任意の
用量単位形態の調製に用いられる任意の材料は、薬学的
に純粋で、用いられる量で実質的に無毒であるべきであ
る。さらに、活性化合物は、持続放出調製物および処方
物に組み入れられ得る。 【０５０４】（３．リポソーム処方物）本発明の二重特
異性凝固リガンドはまた、所望であれば、リポソーム調
製物として処方され得る。以下の情報は、本発明のコア
ギュラントを組み入れたリポソーム処方物の製造におい
て利用され得る。リン脂質は、水に分散された場合、脂
質と水のモル比に依存してリポソームを形成する。リポ
ソームの物理的特性は、ｐＨ、イオン強度および二価カ
チオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質
および極性物質に対して低い浸透性を示すが、高温にお
いて相転移して、これによりその浸透性が著しく変わ
る。相転移は、ゲル状態として知られる密に充填された
秩序ある構造から、流体状態として知られるゆるく充填
されたあまり秩序のない構造への変化を意味する。この
相転移は、特有の相転移温度で起こり、イオン、糖およ
び薬物に対する浸透性の増加を生じる。 【０５０５】温度に加えて、タンパク質に曝されること
で、リポソームの浸透性は、変わり得る。特定の可溶タ
ンパク質（例えば、シトクロームｃ）は、二重層に結合
し、変形させ、そして貫入し、それにより浸透性の変化
を引き起こす。コレステロールは、見かけ上リン脂質を
さらに堅密に充填することにより、タンパク質のこの貫
入を阻害する。本発明での使用について最も有用なリポ
ソーム形成は、コレステロール、またはＰＥＧさえ含有
することは、意図される。 【０５０６】溶質をトラップする能力は、異なるタイプ
のリポソームの間で変化する。例えば、多層ベシクル
（ＭＬＶ）は、溶質をトラップすることにおいて適度に
効果があり、小さな単層ベシクル（ＳＵＶ）は、十分で
はない。ＳＵＶは、サイズ分布において均一性および再
現性の点で有利であるが、サイズとトラップ効率との間
の妥協（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）は、大きい単層ベシク
ル（ＬＵＶ）により示される。これらは、エーテルエバ
ポレーションにより調製され、そして溶質トラップにお
いて、ＭＬＶより３〜４倍効果がある。 【０５０７】リポソーム特性に加えて、化合物のトラッ
プにおける重要な決定因子は、化合物自体の物理化学的
性質である。極性化合物は、水性空間でトラップされ、
そして非極性化合物は、ベシクルの脂質二重層に結合す
る。極性化合物は、浸透によりまたは二重層が破壊され
たときに遊離されるが、非極性化合物は、二重層が温度
またはリポタンパク質への曝露により破壊されない限
り、二重層と結びついたままである。両方のタイプと
も、相転移温度において最大外向き流出速度（ｅｆｆｌ
ｕｘ ｒａｔｅ）を示す。 【０５０８】リポソームは、以下の４つの異なるメカニ
ズムを経て、細胞と相互作用する：網内系の食細胞（例
えば、マクロファージおよび好中球）によるエンドサイ
トーシス；非特異的な弱い疎水性の力または静電力、あ
るいは細胞表面成分との特異的な相互作用のどちらかに
よる細胞表面への吸着；リポソームの脂質二重層の細胞
質膜への挿入による細胞質膜との融合（細胞質の中への
リポソーム内容物の同時放出を伴う）；およびリポソー
ム内容物との任意の会合なしでのリポソーム脂質の細胞
膜または細胞下（ｓｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ）膜への転
移、あるいはその逆による。どのメカニズムが作用し、
そして１つより多くのメカニズムが同時に作用するかど
うかを決定することは、しばしば困難である。 【０５０９】静脈内に注射されたリポソームの成りゆき
（ｆａｔｅ）および性質は、それらの物理的性質（例え
ば、大きさ、流動性、および表面電荷）に依存する。そ
れらは、それらの組成に依存して、数時間から数日間、
組織に残存し、そして血中での半減期は、数分から数時
間の範囲である。より大きいリポソーム（例えば、ＭＬ
ＶおよびＬＵＶ）は、網内系の食作用細胞により速やか
に取り込まれるが、循環系の生理学が、大部分の部位で
このような大きな種の排出（ｅｘｉｔ）を制限する。そ
れらは、毛細管内皮（例えば、肝臓または脾臓の洞様血
管）に存在する大きな開口部または孔においてのみ排出
され得る。従って、これらの器官は、取り込みの主要部
位である。一方、ＳＵＶは、より広い組織分布を示す
が、なお肝臓および脾臓中に高度に隔離（ｓｅｑｕｅｓ
ｔｅｒ）される。一般に、このインビボでの性質は、リ
ポソームの大きいサイズを受け入れやすい器官および組
織のみへのリポソームの集中を決定する。これは、明ら
かに血液を含んでいるので、このことは、それらの本発
明と組み合わせた使用の限定とはならない。 【０５１０】他の実施態様では、本発明の二重特異性成
分は、リポソーム表面と混合され得、薬物内容物を、標
的細胞表面上に位置する特異的抗原レセプターに導く。
炭水化物決定因子（細胞−細胞間の認識、相互作用、お
よび付着において役割を有する糖タンパク質または糖脂
質細胞表面成分）もまた、認識部位として用いられ得
る。なぜならそれらは、リポソームを特定の細胞タイプ
に導く能力があるからである。主として、リポソーム調
製物の静脈内注射が用いられるが、他の投与経路もまた
考え得ることは意図されている。 【０５１１】（４．局所処方物）局所使用のための二重
特異性コアギュラントの処方物、例えば、クリーム、軟
膏およびゲルとしての処方物もまた意図される。油性ま
たは水溶性軟膏基剤の調製物もまた、当業者に周知であ
る。例えば、これらの組成物としては、植物油、動物性
脂肪、およびさらに好ましくは石油から得られた半固体
炭水化物が挙げられ得る。用いられる特定の成分として
は、白色軟膏、黄色軟膏、セチルエステルワックス、オ
レイン酸、オリーブ油、パラフィン、ワセリン、白色ワ
セリン、鯨ロウ、スターチグリセリン剤、白色ワック
ス、黄色ワックス、ラノリン、無水ラノリン、およびグ
リセリルモノステアレートが挙げられ得る。 【０５１２】種々の水溶性軟膏基剤もまた用いられ得、
例としては、グリコールエーテルおよびその誘導体、ポ
リエチレングリコール、ステアリン酸ポリオキシル４
０、およびポリソルベートが挙げられる。所望であれ
ば、皮膚を通しての送達すら、例えば、経皮パッチ、イ
オン浸透療法、または電気移送（ｅｌｅｃｔｒｏｔｒａ
ｎｓｐｏｒｔ）により、用いられ得る。 【０５１３】（５．眼用処方物）本発明の二重特異性凝
固リガンドはまた、眼用溶液としての使用に適した薬学
的組成物に処方され得る。このような眼用溶液は、例え
ば、糖尿病性網膜症の処置において重要である。従っ
て、糖尿病性網膜症の処置のために、本発明の二重特異
性接合体は、治療を必要とする被験者の目に、従来の薬
学的な慣行（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈ
ａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」第１５
版、１４８８〜１５０１頁（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈ
ｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ））に従って調製
された眼用調製物の形態で投与される。 【０５１４】眼用調製物は、新規の二重特異性コアギュ
ラントまたはその薬学的に受容可能な塩を、薬学的に受
容可能な溶液、懸濁液、または軟膏中において、約０．
０１重量％〜約１重量％、好ましくは約０．０５重量％
〜約０．５重量％の濃度で含有する。いくらかの濃度の
変化は、用いる特定の化合物、処置される被験体の状態
などにより、必然的に生じる。そして、処置の責任者
は、個別の被験体について最も適した濃度を決定する。
眼用調製物は、好ましくは無菌水溶液の形態であり、所
望であれば、付加的な成分（例えば、保存剤、緩衝剤、
張度調節剤、抗酸化剤および安定剤、非イオン性湿潤剤
または清澄剤、増粘剤など）を含有する。 【０５１５】このような溶液中での使用に適した保存剤
としては、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウ
ム、クロロブタノール、チメロサールなどが挙げられ
る。適切な緩衝剤としては、ホウ酸、重炭酸ナトリウム
および重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸
カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナ
トリウム、二リン酸ナトリウムなどが挙げられ、ｐＨを
約６〜８の間、好ましくは約７〜７．５の間に維持する
に充分な量である。適切な張度調節剤は、デキストラン
４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリ
ン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリ
ウムなどであり、眼用溶液の塩化ナトリウム当量は、
０．９±０．２％の範囲である。 【０５１６】適切な抗酸化剤および安定剤としては、重
亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ亜硫
酸ナトリウム、チオ尿素などが挙げられる。適切な湿潤
剤および清澄剤としては、ポリソルベート８０、ポリソ
ルベート２０、ポロキサマー２８２、およびチロキサポ
ールが挙げられる。適切な増粘剤としては、デキストラ
ン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒ
ドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピル
セルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、
ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリ
ビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが
挙げられる。眼用調製物は、従来の方法（例えば、点眼
液の形態でまたは眼用溶液中に目を浸すことにより）に
より治療が必要とされる被験体の目に、局所的に投与さ
れる。 【０５１７】（６．治療キット）本発明はまた、本明細
書中で記載された二重特異性凝固リガンドを含む治療キ
ットを提供する。このようなキットは、一般に、本発明
に従う少なくとも一つの二重特異性リガンドの薬学的に
受容可能な処方物を、適切な容器手段中に含有する。キ
ットはまた、以下のものを含有し得る：他の薬学的に受
容可能な処方物（例えば、一般に異なる標的成分を有す
るさらなる二重特異性凝固リガンドを含有する処方
物）；複合化されていない余分の凝固因子；二重特異性
抗体、Ｔ細胞、または例えば抗原誘導で用いられる他の
機能成分；抗原抑制で用いられる成分（例えば、シクロ
スポリン）；異なる抗腫瘍部位の抗体またはイムノトキ
シン；および１つ以上の一連の（ａ ｒａｎｇｅ ｏ
ｆ）化学療法薬剤。 【０５１８】組み合わせキットで用いられる好ましい薬
剤としては、疾患関連血管内皮細胞を誘導して、標的化
可能な抗原（例えば、Ｅ−セレクチンまたはＭＨＣクラ
スＩＩ抗原）を発現し得る薬剤が挙げられる。誘導剤と
しては、疾患抗原または腫瘍抗原に結合し、そしてＩＦ
Ｎ−γを産生するＴ細胞クローンが挙げられ得る。好ま
しい誘導剤としては、疾患細胞抗原または腫瘍細胞抗
原、ならびにサイトカインの同化により標的抗原発現を
誘導し得るエフェクター細胞と結合する二重特異性抗体
が挙げられる。 【０５１９】このように、さらに本発明は、適切な容器
手段中に以下を含有するキットを包含する：エフェクタ
ー細胞表面（すなわち、単球／マクロファージ、マスト
細胞、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞）上の活性化抗原、およ
び疾患細胞の細胞表面上の抗原に結合する二重特異性抗
体を含有する第１の薬学的組成物；および、二重特異性
リガンドを含む第２の薬学的組成物。この二重特異性リ
ガンドは、活性化エフェクター細胞またはそれからのサ
イトカインにより誘導される内皮細胞抗原に結合する第
１結合領域を含み、ここでのこの第１結合領域は、凝固
因子または凝固因子に結合する第２結合領域と作動可能
に連結している。 【０５２０】活性化抗原ＣＤ１４、ＣＤ１６（ＩｇＥに
ついてはＦｃＲ）、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８またはＴ
細胞レセプター抗原に結合する二重特異性抗体を含有す
る第１の薬学的組成物を含むキットが好ましく、ＣＤ１
４結合二重特異性抗体またはＣＤ２８結合二重特異性抗
体を含有する第１の薬学的組成物を含むキットがさらに
好ましい。ＣＤ１４またはＣＤ１６の結合を経た単球／
マクロファージまたはマスト細胞の活性化は、Ｅ−セレ
クチンを誘導するＩＬ−１産生を生じ、他方、ＣＤ２、
ＣＤ３、またはＣＤ２８の結合を経たＴ細胞の活性化
は、ＭＨＣクラスＩＩを誘導するＩＦＮ−γ産生を生じ
る。従って、Ｅ−セレクチンまたはＭＨＣクラスＩＩ抗
原に結合する第１結合領域を含む、二重特異性リガンド
を含有する、第２の薬学的組成物を含むキットもまた好
ましい。 【０５２１】キットは、任意の追加の成分があってもな
くても二重特異性凝固リガンドを含有する単一の容器手
段を有し得る。あるいは、キットは、それぞれの所望さ
れる薬剤に対して異なる容器手段を有し得る。二重特異
性凝固リガンドを生成するのに必要な別々の成分を含む
キットもまた意図される。 【０５２２】キットの成分が１つ以上の液体溶液として
供給されるとき、その液体溶液は水溶液であり、無菌水
溶液が特に好ましい。しかし、キットの成分は、乾燥粉
末として供給され得る。試薬または成分が乾燥粉末とし
て供給されるとき、粉末は、適切な溶媒の添加により再
構成される。溶媒もまた、他の容器手段中で供給され得
ることは想像される。 【０５２３】キットの容器手段としては、一般に、少な
くとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、瓶、シリン
ジまたは他の容器手段が挙げられ、その中に二重特異性
凝固リガンドおよび他の所望される薬剤が入れられ得、
好ましくは適切に小分けされる。追加の成分が含有され
る場合、キットはまた、一般に第２のバイアルまたは他
の容器を有し、追加の成分はその中に入れられ、別々に
計画された用量の投与を可能にする。キットは、無菌の
薬学的に受容可能な緩衝剤または他の希釈剤を含有する
ための第２／第３の容器手段もまた含有し得る。 【０５２４】キットはまた、二重特異性リガンドを動物
または患者に投与する手段（例えば、１つ以上の針また
はシリンジ、あるいは点眼容器、ピペット、あるいは同
様の器具）を有し、それにより処方物が動物内に注入さ
れ得、または身体の疾患領域に適用され得る。本発明の
キットはまた、代表的には、バイアルなどおよび他の成
分を市販のための密閉するための手段（例えば、所望の
バイアルおよび他の器具を入れて保存する、射出成型ま
たはブロー成型プラスチック容器）を含み得る。 【０５２５】以下の実施例は、本発明の好ましい実施態
様を説明するために包含される。以下の実施例において
開示された技術が、本発明者により発見され、本発明の
実施において良好に作用する技術を表し、従ってその実
施についての好ましい様式を構成すると考えられること
は、当業者により理解されるべきである。しかし、当業
者は、本発明の真意および範囲から逸脱することなし
に、多くの改変が開示された特定の実施態様においてな
され得、同様の結果を得ることは、本発明の開示を考慮
して理解すべきである。 【０５２６】本発明において、特定の血液凝固の達成に
使用される種々の組成物および方法が開示されている。
これは、二重特異性抗体を用いたコアギュラントの部位
特異的送達による、腫瘍の退行を引き起こす特定のイン
ビボにおける腫瘍血管系の凝固によって例示される。 【０５２７】以下の図面は本明細書の一部をなすもので
あり、本発明の特定の局面を更に説明するために添付さ
れている。本発明は、これら図面のうち一つ以上を本明
細書に記載した具体的な実施例の詳細な説明とともに参
照することにより、よりよく理解され得るであろう。 【０５２８】 【実施例】（実施例Ｉ） （二重特異性凝固抗体の合成）本実施例は、腫瘍部位に
コアギュラントを特異的に導き得る二重特異性抗体（す
なわち、「コアギュリガンド」）の合成を記載する。 【０５２９】（Ａ．材料および方法） （１．試薬）ペプシン（Ａ；ＥＣ ３．４．２３．
１）、Ｅｌｌｍａｎ試薬（ＥＲ；５，５’−ジチオ−ビ
ス（２−ニトロ安息香酸、ＤＮＴＢ）、２−メルカプト
エタノール（２−ＭＥ）、亜砒酸ナトリウム（ＮａＡｓ
Ｏ２）、およびウサギ脳トロンボプラスチン（アセトン
粉末）を、Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ ＭＯ．から得た。Ｓｅｐｈａｄｅｘ
Ｇ−２５およびＧ−１００を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｌ
ＫＢ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から得た。 【０５３０】（２．ヒト短縮型組織因子（ｔＴＦ））組
換えヒト短縮型ＴＦ（ｔＴＦ）を、２つの異なる方法の
１つを用いて調製した。 【０５３１】方法Ｉ：Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターの構
築。ｔＴＦ（残基１〜２１８）をコードするｃＤＮＡ
を、ｃＤＮＡの上流のトロンビン切断部位に対するコー
ド領域の添加を可能にするプライマー５’−ＧＡＡＧＡ
ＡＧＧＧＡＴＣＣＴＧＧＴＧＣＣＴＣＧＴＧＧＴＴＣＴ
ＧＧＣＡＣＴＡＣＡＡＡＴＡＣＴ−３’（５’−プライ
マー；配列番号２８）および５‘−ＣＴＧＧＣＣＴＣＡ
ＡＧＣＴＴＡＡＣＧＧＡＡＴＴＣＡＣＣＴＴＴ−３’
（３’−プライマー；配列番号２９）を用いるＰＣＲに
より増幅した。ＰＣＲ産物を、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩを用いて切断し、発現ベクターｐＴｒｃＨｉｓ
Ｃ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＢａｍＨＩおよびＨｉｎ
ｄＩＩＩ部位の間に連結した。 【０５３２】ＤＨ５α細胞を連結混合物で形質転換し、
そしてアンピシリンの存在下での選択の後に組換えプラ
スミドを単離した。Ｅ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１を、組換え
プラスミドｐＴｒｃＨｉｓＣ−ｔＴＦを用いて形質転換
し、そして得られた形質転換体をタンパク質発現に用い
た。方法Ｉ：Ｅ．ｃｏｌｉからのｔＴＦの発現、再折畳
み、および精製。ポリ（ｈｉｓ）−ｔＴＦ融合タンパク
質を、ｐＴｒｃ−ＨｉｓＣ−ｔＴＦで形質転換したＢＬ
２１細胞を用いて発現させた。接種培養物（ＬＢ培地中
１０ｍｌ）を、３７℃にて振盪しながら一晩増殖させ
た。 【０５３３】接種培養物を増殖培地に添加し、次いでこ
れを３７℃にて振盪しながら増殖させた。５５０ｎｍの
吸光度が約０．５に達した場合、１０ｍｌの１００ｍＭ
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドを添加
した。振盪を、３７℃にて約２０時間（定常期まで）続
けた。 【０５３４】細胞を、遠心分離（１０，０００×ｇ、２
０分間）により回収し、そしてインクルージョンボディ
ーを以下のように単離した（試薬の量は、細胞ペースト
１グラムあたりである）。細胞ペーストを、４ｍｌの１
０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１ｎＭ ＭｇＣｌ２、０．１７ｍｇ／ｍｌ ＰＭＳ
Ｆ、２ｍｇ／ｍｌ ニワトリ卵白リゾチーム（Ｓｉｇｍ
ａ）に懸濁した。ベンゾナーゼ（２５０単位，ＥＭ Ｓ
ｃｉｅｎｃｅ）を添加した懸濁物を、室温にて１．５時
間、緩やかに混合し、次いで１２，０００ｇにて１５分
間遠心分離した。 【０５３５】ペレットを、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ
７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、３％ＮＰ４０（２ｍｌ）
中に再懸濁し、５０％の力で１分間超音波処理し、そし
て１２，０００×ｇにて２０分間遠心分離した。ペレッ
トを水中に再懸濁し、５０％の力で２０〜３０秒間超音
波処理し、そして１２，０００×ｇにて２０分間遠心分
離した。水洗を繰り返し、最終的なペレット（インクル
ージョンボディーが非常に多い）を６Ｍ 塩化グアニジ
ウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭリン酸、１０ｍＭ
β−メルカプトエタノール、ｐＨ８．０（１ｇインク
ルージョンボディーあたり９ｍｌの）中に、室温にて一
晩、緩やかに混合することにより懸濁した。 【０５３６】懸濁物を、１２，０００×ｇにて２０分間
遠心分離し、そして上清をニッケルニトリロ酢酸（Ｎｉ
−ＮＴＡ，Ｑｉａｇｅｎ）カラムに載せた。カラムを、
同じ６Ｍ 塩化グアニジウム緩衝液ｐＨ８、次いでｐＨ
７を用いて連続的に洗浄し、次いでｐＨを４まで減少さ
せることによりタンパク質を溶出させた。 【０５３７】融合タンパク質を含有するＮｉ−ＮＴＡカ
ラム画分を合わせ、そしてジチオトレイトールを５０ｍ
Ｍに添加した。溶液を、室温にて一晩保持し、次いで６
Ｍ尿素、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、０．０２％アジ化ナトリ
ウム（ｐＨ８．０）中に約１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃
度に希釈し、そして同じ緩衝液の１０〜２０容量に対し
て４℃にて透析した。緩衝液を、２Ｍ 尿素、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ 還元
グルタチオン、０．５ｍＭ 酸化グルタチオン、０．０
２％アジ化ナトリウム（ｐＨ８．０）（折畳み緩衝液）
に変えた。透析をさらに２日続け、緩衝液を新鮮な折畳
み緩衝液に交換し、そして透析をさらに２日続けた。 【０５３８】次いで、溶液を２０ｍＭ ＴＥＡに対して
十分に透析し、透析バッグから取り出し、ヒトトロンビ
ン（約５００部組換えタンパク質あたり１部（ｗ／
ｗ））で室温にて一晩処理し、そしてＨＲ−１０／１０
ｍｏｎｏ−Ｑ陰イオン交換カラムに載せた。ｔＴＦタ
ンパク質を、３０分間にわたって、０〜１５０ｍＭまで
直線的に濃度が増加するＮａＣｌを含有する２０ｍＭ
ＴＥＡ緩衝液（流速３ｍｌ／分）を用いて溶出した。 【０５３９】方法ＩＩ：ｔＴＦ相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）
の調製。Ｊ−８２細胞（ヒト膀胱ガン）由来のＲＮＡ
を、ｔＴＦのクローン化に用いた。全ＲＮＡを、Ｇｌａ
ｓｓＭａｘＴＭ ＲＮＡマイクロ単離試薬（Ｇｉｂｃｏ
ＢＲＬ）を用いて単離した。ＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍ
ｐ ＲＮＡ ＰＣＲキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅ
ｒ）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。ｔＴＦ ｃＤＮＡ
を、同じキットで、以下の２つのプライマーで増幅し
た： 【０５４０】 【表７】 下線を付した配列は、ｔＴＦのＮ末端およびＣ末端をコ
ードする。５’プライマーの残りの配列は、 発現ベク
ターへのｔＴＦのクローン化を可能にするＮｃｏＩの制
限部位であり、そしてトロンビンに対する切断部位をコ
ードする。３’プライマーの配列は、発現ベクターにｔ
ＴＦをクローン化するためのＨｉｎｄＩＩＩ部位であ
る。ＰＣＲ増幅を、製造者により提案されるように行っ
た。簡略には、７５μＭ ｄＮＴＰ；０．６μＭプライ
マー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を用いて、９５℃にて３
０秒間、５５℃にて３０秒間、および７２℃にて３０秒
間の３０サイクルを行った。 【０５４１】方法ＩＩ．ベクター構築。Ｅ．ｃｏｌｉ発
現ベクターＨ６ｐＱＥ−６０を、ｔＴＦ（Ｌｅｅら，１
９９４）発現のために用いた。ＰＣＲ増幅したｔＴＦ
ｃＤＮＡを、ＮｃｏＩ部位とＨｉｎｄＩＩＩ部位との間
に挿入した。Ｈ６ｐＱＥ−６０は、発現されるタンパク
質がＮ末端に（Ｈｉｓ）６配列を有するように組み込ま
れた（Ｈｉｓ）６コード配列を有し、このタンパク質は
Ｎｉ−ＮＴＡカラムで精製し得る。 【０５４２】方法ＩＩ．ｔＴＦ精製。ｔＴＦを含有する
Ｈ６ｐＱＥ−６０ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ−１細
胞に形質転換した。細胞を、ＯＤ６００＝０．５まで増
殖させ、そしてＩＰＴＧを３０μＭまで添加し、ｔＴＦ
産生を誘導した。細胞を、３０℃にて１８時間振盪した
後に回収した。細胞ペレットを、６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌに
おいて変成し、そして溶解物をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑ
ｉａｇｅｎ）に載せた。結合したｔＴＦを、６Ｍ尿素で
洗浄し、そして６Ｍ〜１Ｍの尿素のグラジエントを用い
て室温にて１６時間再折畳みさせた。カラムを、洗浄緩
衝液（０．０５Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４、０．３Ｍ ＮａＣ
ｌ、１０％グリセロール）で洗浄し、そしてｔＴＦを、
洗浄緩衝液中の０．２Ｍ イミダゾールで溶出させた。 【０５４３】溶出したｔＴＦを濃縮し、そしてＧ−７５
カラムに載せた。ｔＴＦモノマーを回収し、そしてトロ
ンビンで処理してＨ６ペプチドを除去した。これは、５
００部のｔＴＦ（ｗ／ｗ）に対して１部のトロンビン
（Ｓｉｇｍａ）を添加することにより、室温にて１８時
間行った。混合物をベンズアミジンＳｅｐｈａｒｏｓｅ
６Ｂトロンビンアフィニティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）に通過させることにより、トロンビンをｔＴＦか
ら除去した。 【０５４４】ｔＴＦは、第ＶＩＩａ因子に結合し、およ
び第ＶＩＩａ因子の触媒活性（Ｒｕｆｅｔら、１９９
１）を増強する酵母またはチャイニーズハムスター卵巣
細胞由来の組換えｔＴＦと同一の能力を有した。ドデシ
ル硫酸ナトリウム中のポリアクリルアミドゲル電気泳動
により分析した場合、これは、約２４ｋＤの分子量を有
する単一成分として移動した。 【０５４５】（３．モノクローナル抗体）Ｂ２１−２
（ＴＩＢ−２２９）ハイブリドーマおよびＳＦＲ８−Ｂ
６ハイブリドーマ（ＨＢ−１５２、以下ＳＦＲ８と称す
る）を、ＡＴＣＣから得た。両方のハイブリドーマは、
ラットＩｇＧ２ｂ抗体を分泌し、これを培養上清からプ
ロテインＧアフィニティークロマトグラフィーにより精
製した。Ｂ２１−２抗体は、Ａ−２０細胞ならびにＢＡ
ＬＢ／ｃ／ｎｕ／ｎｕマウス中に増殖したＣ１３００
（Ｍｕγ）トランスフェクタント腫瘍の血管系上に発現
されるＩ−Ａｄ抗原と反応する。ＳＦＲ８抗体は、ＨＬ
Ａ−Ｂｗ６エピトープに対して指向し、そしてＢ２１−
２抗体に対するイソタイプのマッチしたネガティブコン
トロールとして供する。 【０５４６】ＴＦ９／１０Ｈ１０（１０Ｈ１０と称す
る）であるマウスＩｇＧ１は、ＴＦ／第ＶＩＩａ因子活
性を妨害することなくヒトＴＦと反応性であり、そして
Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙら（１９８８）に記載のように産生
した。 【０５４７】細胞株ＭＲＣ ＯＸ７（ＯＸ７と称する）
を、Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ博士（ＭＲＣ Ｃｅｌｌ
ｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｕｎｉｔ，Ｕｎｉｖ
ｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅ
ｎｇｌａｎｄ）から得た。これは、Ｔリンパ球上のＴｈ
ｙ １．１抗原を認識する、マウスＩｇＧ１抗体ＯＸ７
抗体を分泌した。これを、ＴＦ９／１０Ｈ１０に対する
ネガティブコントロールにマッチしたイソタイプとして
用いた。 【０５４８】全ての抗体を、培養上清からプロテインＧ
アフィニティークロマトグラフィーにより精製した。 【０５４９】（４．二重特異性抗体の合成）Ｆ（ａ
ｂ’）２フラグメントを、それぞれのＩｇＧを２％（ｗ
／ｖ）ペプシンで３７℃にて５〜９時間消化し、そして
フラグメントをＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００クロマトグ
ラフィーにより精製することにより得た。二重特異性抗
体Ｂ２１−２／１０Ｈ１０、ＳＦＲ８／１０Ｈ１０、お
よびＢ２１−２／ＯＸ７の合成を、微小な改変を加えた
Ｂｒｅｎｎａｎら（１９８５）の方法に従って実行し
た。 【０５５０】二重特異性抗体Ｂ２１−２／１０Ｈ１０、
ＳＦＲ８／１０Ｈ１０、ＯＸ７／１０Ｈ１０、およびＢ
２１−２／ＯＸ７を、微小な改変を加えたＢｒｅｎｎａ
ｎら（１９８５）の方法に従って合成した。簡略には、
Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを、ＩｇＧ抗体からペプシ
ンでの消化により得、そしてクロマトグラフィーＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ１００により均一に精製した。Ｆ（ａ
ｂ’）２フラグメントを、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ＰＢＳＥ
緩衝液）および９ｍＭ ＮａＡｓＯ２を含有する０．１
Ｍリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．８）中の５ｍＭ
２−メルカプトエタノールを用いて２０℃にて１６時間
還元した。Ｅｌｌｍａｎ試薬（ＥＲ）を、２５ｍＭの最
終濃度になるように添加し、２０℃にて３時間後、Ｅｌ
ｌｍａｎ誘導Ｆａｂ’フラグメント（Ｆａｂ’−ＥＲ）
を、ＰＢＳＥにおいてＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５のカラ
ム条で未反応ＥＲから分離した。 【０５５１】二重特異性抗体を形成させるために、１つ
の抗体に由来するＦａｂ’−ＥＲを、限外濾過セル中に
約２．５ｍｇ／ｍｌまで濃縮し、そして１０ｍＭ ２−
メルカプトエタノールを用いて２０℃にて１時間還元し
た。得られたＦａｂ’−ＳＨをＰＢＳＥにおいてＳｅｐ
ｈａｄｅｘ Ｇ２５のカラムを通して濾過し、そして第
２の抗体から調製した等モル量のＦａｂ’−ＥＲと混合
した。混合物を、限外濾過により約３ｍｇ／ｍｌまで濃
縮し、そして２０℃にて１６時間撹拌した。反応産物を
Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ１００のカラムで分画し、そして
二重特異性抗体（１１０ｋＤａ）を含有する画分を１ｍ
ｇ／ｍｌに濃縮し、そして０．０２％アジ化ナトリウム
中で４℃にて貯蔵した。 【０５５２】（Ｂ．結果） （１．二重特異性抗体の分析）Ｆ（ａｂ’）２フラグメ
ントおよび二重特異性調製物の分子量を、Ｐｈａｒｍａ
ｃｉａ ＬＫＢ−Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ ＬＫＢ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を用
いる４〜１５％グラジエントゲルでのＳＤＳ−Ｐａｇｅ
電気泳動により決定した。二重特異性ならびにホモダイ
マー対ヘテロダイマーの％を、ＦＡＣＳ分析により決定
した（実施例ＩＩ）。 【０５５３】ＳＤＳ−Ｐａｇｅ電気泳動による（および
ＦＡＣＳ、実施例ＩＩによる）二重特異性抗体の分析
は、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０ 二重特異性が、いずれか
の起源の４％未満のホモダイマーおよび１４０ｋＤまた
は５５ｋＤの分子量を有する、＜１０％フラグメントを
含有することを示した。調製物の約１０％は、おそらく
（いずれかの起源の）超軽鎖と付着したＦ（ａｂ’）２
構築物である１４０ｋＤフラグメントよりなった。 【０５５４】（実施例ＩＩ） （凝固抗体結合およびインビトロでの機能）本実施例
は、凝固抗体（コアギュリガンド）の二重特異性を示
し、そして特異的結合、細胞送逹、および凝固がコアギ
ュリガンドを用いてインビトロで達成されることを示
す。 【０５５５】（Ａ．材料および方法） （１．細胞）Ａ２０細胞株（これは、Ｉ−Ａｄポジティ
ブＢＡＬＢ／ｃ Ｂ細胞リンパ腫である）を、アメリカ
ンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ；Ｒｏｃｋ
ｖｉｌｌｅ，ＭＤ；ＴＩＢ−２０８）から購入した。Ａ
２０細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣ
Ｓ）、０．２ｍＭ Ｌ−グルタミン、２００単位／ｍｌ
ペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシ
ン、１８ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、０．１ｍＭ非必須アミノ酸
混合物、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを補充した
ＤＭＥＭ（この培地を、以下完全ＤＭＥＭ培地と称す
る；全ての試薬をＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ
ｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ，ＭＤから得た）中で増殖
させた。２−ＭＥを、Ａ２０細胞に対して０．０６４ｍ
Ｍの最終濃度で完全ＤＭＥＭに添加する。培養物を、９
０％空気／１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中において３７℃
にて維持した。 【０５５６】Ｊ８２（ＴＦを発現するヒト胆嚢ガン）
を、ＡＴＣＣ（ＨＴＢ−１）から得た。細胞は、完全Ｄ
ＭＥＭ中で付着して増殖した。 【０５５７】Ｃ１３００神経膠腫細胞株を、自然発症腫
瘍（これは、Ａ／Ｊａｘマウス（Ｄｕｎｈａｍ＆Ｓｔｅ
ｗａｒｔ，１９５３）中で生じた）から樹立した。Ｃ１
３００（Ｍｕγ）１２株（以下、Ｃ１３００（Ｍｕγ）
と称する）は、ＩＦＮ−γ発現レトロウイルスｐＳＶＸ
（Ｍｕγ ΔＡｓ）（Ｗａｔａｎｂｅら，１９８９）を
用いるマウスＩＦＮ−−γ遺伝子を有するＣ１３００神
経膠腫細胞のトランスフェクションに由来した。ＩＦＮ
−γ発現レトロウイルスを、Ｄｒ．Ｙ．Ｗａｔａｎａｂ
ｅ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｙｏｔｏ Ｕｎｉｖｅ
ｒｓｉｔｙ，Ｊａｐａｎ）から得た。 【０５５８】Ｃ１３００（Ｍｕγ）１２細胞を、１０％
（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２．４ｍＭ Ｌ−
グルタミン、２００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ
／ｍｌストレプトマイシン、１００μＭ非必須アミノ
酸、１μＭピルビン酸ナトリウム、１８μＭ ＨＥＰＥ
Ｓ、および１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８（Ｇｅｎｅｔｉｃｉ
ｎ；Ｓｉｇｍａ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅ
ａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）中で維持した。培養物を、９
０％空気／１０％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃にて維
持した。 【０５５９】Ｔｈｙ １．１−発現ＡＫＲ−ＡマウスＴ
リンパ球細胞株を、Ｄｒ．Ｉ．ＭａｃＬｅｎｎａｎ教授
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
ａｌＰａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ Ｕｎ
ｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａ
ｎｄ）から得て、そして完全ＤＭＥＭ中で増殖させた。 【０５６０】（２．間接的免疫蛍光）Ａ２０細胞を、Ｐ
ＢＳ／０．２％ ＢＳＡ／０．０２％ Ｎａ−アジド
（以下、ＦＡＣＳ緩衝液と称する）中に４×１０６細胞
／ｍｌで再懸濁した。Ｊ８２細胞を、ＰＢＳ／ＥＤＴＡ
（０．２％ ｗ／ｖ）を用いてフラスコから穏やかな条
件下で放出させ、そしてＦＡＣＳ緩衝液中に４×１０６
細胞／ｍｌで再懸濁した。５０μｌの細胞懸濁物を、丸
底９６ウェルプレートのウェル中の１次抗体の５０μｌ
の適切な系列希釈物に添加した。室温にて１５分間のイ
ンキュベーション後、細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で３回洗
浄した。最後の上清を除去した後、ＦＡＣＳ緩衝液中で
１対２０希釈でフルオレセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）に結合させた５０μｌの２次抗体を細胞に添加
した。細胞を、さらに１５分間室温にてインキュベート
し、そしてＦＡＣＳ緩衝液で３回洗浄した。フルオレセ
インと会合した細胞を、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ
Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）で
測定した。データを、Ｌｙｓｉｓ ＩＩプログラムを用
いて分析した。ＦＩＴＣ−抗−ラットイムノグロブリン
を２次抗体として用いた場合、正常なマウス血清（１０
％ ｖ／ｖ）を、マウス細胞との非特異的交差反応をブ
ロックするために添加した。 【０５６１】（３．タンパク質の放射性標識）タンパク
質を、ＭａｓｏｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９８
０）、（プロトコル２）により記載されるクロラミンＴ
プロトコルに従って１２５ヨウ素を用いて標識した。ヨ
ウ素化産物をＧ２５で精製し、そしてモノクローナルフ
ラグメントの場合は５％ ＤＭＳＯおよび５ｍｇ／ｍｌ
ウシＩｇＧの存在下で、そしてｔＴＦの場合は５％ Ｄ
ＭＳＯおよび５ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡの存在下で−７０℃
にて貯蔵した。比活性は、２．５μＣｉ／μｇと４．８
μＣｉ／μｇとの間の範囲であった。 【０５６２】（４．結合研究）ヒトｔＴＦを、Ｍａｓｏ
ｎおよびＷｉｌｌｉａｍｓ（１９８０）により記載され
るクロラミンＴ手順（プロトコル２）を用いて２．５〜
４．８μＣｉ／μｇの比活性まで１２５ヨウ素で標識し
た。２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび０．０２％アジ化ナト
リウムを含有するＰＢＳ中のＡ２０細胞の２×１０６細
胞／ｍｌの懸濁液を、９６ウェル丸底マイクロタイター
プレートのウェルに５０μｌの容量で分配した。ウェル
に、同じ緩衝液中に８〜０．０２μｇ／ｍｌの濃度範囲
にわたって調製した２５μｌの二重特異性抗体を添加し
た。 【０５６３】同じ緩衝液中の２５μｌの８μｇ／ｍｌの
１２５Ｉ−ｔＴＦを各ウェルに添加し、モル過剰のｔＴ
Ｆを得た。プレートを振盪し、そして４℃にて１時間イ
ンキュベートした。次いで、細胞を、２ｍｇ／ｍｌ Ｂ
ＳＡを含有する０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを用いてプ
レート中で３回洗浄した。ウェルの内容物を、微小遠心
管中のジブチルフタレートおよびビス（２−エチルヘキ
シル）フタレート油の１０：１１（ｖ／ｖ）混合物上に
ピペットした。チューブを７５００ｇにて１．５分間遠
心分離し、そして液体窒素中で瞬間凍結させた。細胞を
含有するチップを、切り離した。細胞ペレット中および
上清中の放射活性を、γカウンター中で測定した。 【０５６４】（５．凝固アッセイ）上記結合アッセイに
用いられたマイクロプレートと同一のマイクロプレート
を、１２５Ｉ−ｔＴＦの代わりに非標識ｔＴＦを添加し
たことを除いて同じ条件で設定した。４℃にて１時間イ
ンキュベーション後、細胞を前述のように３回洗浄し、
そして２ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡおよび１２．５ｍＭ Ｃａ
Ｃｌ２を含有する７５μｌの０．９％ ＮａＣｌに再懸
濁した。ウェルの内容物を、５ｍｌ透明プラスチックチ
ューブに移し、そして３７℃に暖めた。各チューブに、
３０μｌのクエン酸処理マウス血漿を３７℃にて添加し
た。最初のフィブリンストランドを形成した時間を記録
した。 【０５６５】（Ｂ．結果） （１．抗体二重特異性）ＳＦＲ８／１０Ｈ１０に関する
二重特異性を、標的細胞としてのＪ２８細胞（ＴＦポジ
ティブ）および１０Ｈ１０の存在を示すためのＦＩＴＣ
−抗−マウス免疫グロブリンを用いてＦＡＣＳにより示
した。ＦＩＴＣ−抗−ラットイムノグロブリンを用いて
ＳＦＲ８の存在を示した。平均蛍光強度−対−濃度曲線
は、両方の株の一致した。これは、マウスおよびラット
の両方のアームが二重特異性調製物中に存在することを
示す。 【０５６６】（２．抗体結合）１２５ヨウ素標識Ｂ２１
−２ Ｆａｂ’およびＳＦＲ８ Ｆａｂ’を用いる結合
研究は、Ａ２０細胞に対するＢ２１−２ Ｆａｂ’の結
合の飽和に達するする濃度が２１．５ｎＭであることを
示した。ＳＦＲ８ Ｆａｂ’は、２１．５ｎＭでは、Ｂ
２１−２ Ｆａｂ’については細胞あたり５３０，００
０分子であるのに対して、細胞あたり５０，０００未満
の分子数でＡ２０細胞に非特異的に結合した。 【０５６７】（３．コアギュラント送逹および拘束）コ
ントロールの二重特異性抗体と比較した、ｔＴＦをＢ２
１−２／１０Ｈ１０二重特異性抗体を媒介してＡ２０細
胞に架橋させる能力を研究するために、Ａ２０細胞を、
示すような濃度範囲の二重特異性抗体および１２５Ｉ−
ｔＴＦとともにインキュベートした。飽和は、１０ｎＭ
（１μｇ／ｍｌ）以上の二重特異性抗体の濃度で達成さ
れ、この時、平均３１０，０００分子のｔＴＦが各Ａ２
０細胞に結合した。結合は特異的であった。なぜなら、
ｔＴＦ結合が、イソタイプにマッチするコントロールの
二重特異性抗体（ＳＦＲ８／１０Ｈ１０またはＢ２１−
２／ＯＸ７）のいずれにも媒介されなかったからであ
る。これらの抗体は、ｔＴＦを拘束するために必要とさ
れる２つの特性のうちの１つのみを有する（図１）。 【０５６８】（４．凝固）二重特異性抗体によりＡ２０
細胞に結合しているｔＴＦが、凝固を誘導し得るか否か
を調査するために、本発明者らは、まず第１に、Ａ２０
細胞を２１．５ｎＭ 二重特異性抗体および６９ｎＭ
ｔＴＦとともにインキュベートした。得られた凝固時間
に対する影響を、表ＶＩＩに示す。これらの第１の研究
は、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０およびｔＴＦの複合体でコ
ートされたＡ２０細胞が、フィブリン形成を誘導し得る
ことを示した：これは、凝固時間を、１４０秒（用いら
れる特定の条件下で添加される抗体またはＴＦの非存在
下で凝固するＣａＣｌ２中のマウス血漿についての時
間）から６０秒に短縮した。対照的に、コントロールの
二重特異性抗体は、凝固の活性化を誘導しなかった：こ
れらの場合では、凝固時間は、１４０秒であった。 【０５６９】後の研究は、最初の研究の結果を確認およ
び拡張した。ｔＴＦがＢ２１−２／１０Ｈ１０で拘束さ
れているＡ２０細胞にマウス血漿を添加すると、迅速に
凝集した。フィブリンストランドは、非処理Ａ２０細胞
へ添加される血漿中における１６４秒と比較して血漿添
加の３６秒後に見られた（表ＶＩＩ）。ｔＴＦが細胞に
拘束されている場合にのみ凝固が誘導される：ｔＴＦ単
独、ホモダイマーＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’フラグメン
ト、またはｔＴＦの拘束に必要な２つの特性のうち１つ
しか有さない二重特異性抗体とともにインキュベートし
た細胞については、凝固時間における影響は見られなか
った。 【０５７０】各Ａ２０細胞に拘束されたｔＴＦ分子の平
均数のｌｏｇとマウス血漿の凝固を誘導した細胞につい
ての速度との間には、直線関係が存在した（図２）。細
胞あたり３００，０００分子のｔＴＦを有する細胞は４
０秒で凝固を誘導したが、細胞あたり２０，０００分子
を有する細胞でさえも凝固は非処理細胞（１９０秒）に
ついてよりも有意に速かった（１４０秒）。 【０５７１】 【表８】 １二重特異性抗体であるＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ’
フラグメント（０．３３μｇ／１０５細胞／１００μ
ｌ）ならびにｔＴＦ（０．１７μｇ／１０５細胞／１０
０μｌ）を、Ａ２０細胞とともに４℃にて１時間、０．
２％ ｗ／ｖアジ化ナトリウム中でインキュベートし
た。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウムおよび
血漿を添加し、そして第１のフィブリンストランドが形
成される時間を記録した。２ ３連測定の相加平均±標準偏差 （実施例ＩＩＩ） （インビボでの特定腫瘍脈管系特異的凝固）本実施例
は、ヒト組織因子に対する送逹ビヒクルとしての二重特
異性抗体コアギュリガンドの投与後にもたらされる腫瘍
脈管系のインビボでの特異的凝固を記載する。 【０５７２】（Ａ．材料および方法） （１．試薬）マウス血液を心臓穿刺により得、そして
３．８％緩衝化クエン酸の１／１０容量に回収した。血
液を３０００ｇにて１０分間遠心分離し、そして血漿を
少量で瞬間凍結し、そして−７０℃にて貯蔵した。 【０５７３】（２．動物）ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／ｎｕマ
ウスを、Ｓｉｍｏｎｓｅｎ（Ｇｉｌｒｏｙ，ＣＡ）から
得て、そしてＳＰＦ条件下で維持した。 【０５７４】（３．Ｃ１３００（Ｍｕγ）マウスモデル
および処理）腫瘍モデルは、３つの改良を加えた以外
は、以前に記載された（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２；
Ｂｕｒｒｏｗｓ＆Ｔｈｏｒｐｅ，１９９３）通りであっ
た。第１に、異なる抗体であるＢ２１−２を用いた。こ
の抗体は、両方の分子を認識する、以前に用いたＭ５／
１１４抗体とは異なり、Ｉ−Ａｄを認識するが、Ｉ−Ｅ
ｄを認識しない。Ｂ２１−２抗体は、Ｍ５／１１４より
も約１０培良好な親和性を有する。第２に、ＢＡＬＢ／
ｃ ｎｕ／ｎｕマウスにおいて連続的に増殖する、以前
に用いたＣ１３００（Ｍｕγ）１２株のサブ株を用い
た。以前に用いたＣ１３００（Ｍｕγ）１２細胞は、連
続的に増殖する腫瘍を形成させるために非感染Ｃ１３０
０細胞と混合しなければならなかった。Ｃ１３００（Ｍ
ｕγ）ｔ１Ｐ３と称する新しいサブ株を、以下ではＣ１
３００（Ｍｕγ）という。第３に、腸内細菌が胃腸内上
皮においてＩ−Ａｄを誘導することを防止するために、
マウスの飲料水中にテトラサイクリンを添加することは
不必要であった。イムノトキシンとは異なり、コアギュ
リガンドは、Ｉ−Ａｄ発現胃腸上皮を損傷しない。 【０５７５】固形腫瘍の確立のために、１．５×１０７
Ｃ１３００（Ｍｕγ）細胞を、ＢＡＬＢ／ｃ ｎｕ／
ｎｕマウスの右脇腹中に皮下的に注射した。腫瘍が直径
０．８ｃｍまで増殖したら、マウスをランダムにそれぞ
れ７〜８匹のマウスを含む異なる処置グループに割り当
てた。 【０５７６】コアギュリガンドを、総容量２．５ｍｌの
０．９％ ＮａＣｌ中に二重特異性抗体（１４０μｇ）
およびｔＴＦ（１１０μｇ）を混合し、そしてこれらを
４℃にて１時間放置することにより調製した。次いで、
マウスにこの混合物（すなわち、１４μｇの二重特異性
抗体および１１μｇのｔＴＦ）０．２５ｍｌの静脈内注
射を受けさせた。他のマウスは、１４μｇの二重特異性
抗体単独、または１１μｇのｔＴＦ単独を受けた。この
注射を、尾の静脈の１つに約４５秒間にわたってゆっく
りと行い、そして同じ静脈に２００μｌの第２の注射が
続いた。この注射手順は、マウスに急速に注入される場
合（１〜２秒間）に見られる尾の静脈の血栓を防ぐため
に適している。７日後、処置を繰り返した。 【０５７７】垂直腫瘍直径を、規則的な間隔をおいて測
定し、そして腫瘍容量を、以下の式に従って評価した： 容量＝短径２×長径×π／６。 【０５７８】腫瘍容量の差を、統計的有意さについて２
つの独立サンプルについてＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ−
Ｗｉｌｃｏｘｏｎ非パラメトリック試験を用いて試験し
た（Ｇｉｂｂｏｎｓ，１９７６）。 【０５７９】組織病理学的分析については、動物を、処
置後にメトファンを種々の時間で用いて麻酔し、そして
ヘパリン処理生理食塩水を用いる潅流により放血した。
５００ＩＵのヘパリンをｉ．ｖ．注射し、動物をメトフ
ァンで麻酔し、そして肝臓から血液が一掃されるまで
０．６ｍｌ／分の流速でＰＢＳを用いて全身の循環を潅
流した。腫瘍および正常な組織を取り出し、そしてホル
マリン固定した（４％ｖ／ｖ）。組織のパラフィン切片
を切断し、そしてフィブリンの検出のために標準的なＭ
ａｒｔｉｕｓ Ｓｃａｒｌｅｔ Ｂｌｕｅ（ＭＳＢ）ト
リクロム技術を用いて、ならびに細胞形態学のためにヘ
マトキシリンおよびエオシンを用いて染色した。 【０５８０】（Ｂ．結果） （１．改良腫瘍モデル）前記のＣ１３００（Ｍｕγ）腫
瘍モデル（Ｂｕｒｒｏｗｓら、１９９２）を改良するた
めに、本発明者らは、Ｃ１３００（Ｍｕγ）細胞株を、
その親細胞であるＣ１３００と混合することなく増殖し
得るが、腫瘍の内皮細胞上でＩ−ＡｄＭＨＣ ＩＩクラ
ス抗原をいまだ発現し得る細胞株にサブクローン化し
た。本発明者らは、ＦＡＣＳにより測定されるように、
このモデルに使用される初期の抗Ｉ−Ａｄ抗体（Ｍ５／
１１４．１５．２）よりも、その抗原に対して５倍〜１
０倍高い親和性を有する抗Ｉ−Ａｄ抗体（Ｂ２１−２）
を使用した。この新規抗Ｉ−Ａｄ抗体を用いるインビボ
分布研究は、Ｍ５／１１４．１５．２が示したのと同一
の組織分布パターンを示した。Ｂ２１−２を用いる濃い
染色は、腫瘍血管内皮において見られ、薄い染色から中
程度の染色は、肝臓中のクッパー細胞、脾臓中の周辺帯
ならびに小腸および大腸のいくつかの領域に見られた。
他の正常組織中の血管は、染色されなかった。 （２．適切なインビボ用量の決定）マウスの尾静脈に静
脈内注射された最大耐性用量は、１６μｇのＢ２１−２
／１０Ｈ１０プラス１１μｇのｔＴＦであった。この用
量で、マウスは体重が減少せず、正常な外観および活動
レベルを有していた。２０μｇのＢ２１−２／１０Ｈ１
０プラス１６μｇのｔＴＦのより高い用量では、１０匹
のマウスのうち２匹が、最終的には消散する局所的皮膚
出血を発生した。より低い用量を、インビボ研究に採用
した。静脈内で与えられた短縮型ＴＦ自体は、５０μｇ
で無毒であった。 【０５８１】（３．腫瘍血管系における特異的凝固およ
び梗塞形成）Ｂ２１−２／１０Ｈ１０（２０μｇ）およ
びｔＴＦ（１６μｇ）からなる凝固リガンド（ｃｏａｇ
ｕｌｉｇａｎｄ）の、固体Ｃ１３００（Ｍｕγ）腫瘍を
有するマウスへの静脈内投与により、３０分以内に腫瘍
は黒化した挫傷外観を生じた。腫瘍内での現象の時間経
過の組織学的研究は、凝固リガンドの注射３０分後、腫
瘍の全ての領域中の全ての血管が、血栓形成したことを
示した（図３Ｂ）。血管は、血小板凝集、パックされた
赤血球およびフィブリンを含んでいた。この時点で、腫
瘍細胞は、健常であり、未処置マウスの腫瘍細胞と形態
学的に区別できなかった（図３Ａ）。 【０５８２】４時間までに、腫瘍細胞の窮迫の徴候が明
らかになった。腫瘍細胞の大部分は、互いに分離し始
め、そしてピクノーゼ核を発生した（図３Ｃ）。赤血球
は、通常、腫瘍間隙中に観察された。２４時間までに、
腫瘍壊死の進行が腫瘍中で見られた（図３Ｄ）。７２時
間までに、腫瘍の中央領域全体が形態学的に不明瞭な壊
死組織片（ｄｅｂｒｉｓ）に凝集した。 【０５８３】試験した３つの腫瘍のうち１つにおいて、
５〜１０細胞層厚の腫瘍細胞の生存可能縁が、腫瘍の周
辺で見られた。その周辺部で、腫瘍が周辺の正常組織に
浸潤していた。同一の腫瘍の連続切片の免疫組織学的検
査は、腫瘍浸潤領域中の血管がＩＩクラス抗原を欠いて
いたことを示した。 【０５８４】３０分または２４時間前にＢ２１−２／１
０Ｈ１０二重特異性抗体（２０μｇ）のみを受けたコン
トロールマウス由来の腫瘍は、梗塞形成の徴候を示さな
かった。ｔＴＦ（１６μｇ）のみ、あるいはＢ２１−２
／ＯＸ７またはＳＦＲ８／１０Ｈ１０との組み合わせを
受けたマウス由来の腫瘍は、注射後３０分では梗塞形成
の徴候を示さなかったが、注射後２４時間では腫瘍中の
偶発的な血管（全ての血管の約２０％）が梗塞形成し
た。これらは、腫瘍の核において最も一般的であるよう
であった。 【０５８５】血栓または形態学的異常が、凝固リガンド
またはｔＴＦの投与の３０分後、４時間後および２４時
間後に腫瘍を有するマウスから取られた肝臓、腎臓、
肺、腸、心臓、脳、副腎、膵臓および脾臓のパラフィン
切片において見られなかった。 【０５８６】（４．固形腫瘍の腫瘍退行）図４は、Ｂ２
１−２／１０Ｈ１０およびｔＴＦからなる凝固リガンド
を、直径０．８ｃｍの腫瘍を有するマウスに投与した、
代表的な抗腫瘍研究の結果を示す。腫瘍は、それらの処
置前サイズの約半分に退行した。７日目で処置を繰り返
すことにより、腫瘍はさらに、通常は完全に退行した。
７匹の動物のうち５匹において、完全な退行が得られ
た。２匹のマウスは、４か月後および６か月後に続いて
再発した。これらの抗腫瘍効果は、全ての他の群と比較
した場合、統計学的に高度に有意（Ｐ＜０．００１）で
ある。 【０５８７】ｔＴＦのみ、またはイソ型が一致したコン
トロールの二重特異性抗体（ＳＦＲ８／１０Ｈ１０また
はＢ２１−２／ＯＸ７）と混合したｔＴＦで処置したマ
ウスの腫瘍は、抗体または希釈剤のみを受ける群の腫瘍
よりも、よりゆっくり増殖した。これらの違いは、１２
日〜１４日で統計学的に有意（Ｐ＜０．０５）であっ
た。従って、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０凝固リガンドで見
られた抗腫瘍効果の一部は、ｔＴＦ自体のわずかな非特
異的作用のためである。 【０５８８】研究の最後で、希釈剤のみで処置し、そし
て２．０ｃｍ３および２．７ｃｍ３の非常に大きな腫瘍
（すなわち、体重の１０％〜１５％）を有した２匹のマ
ウスに、凝固リガンド治療を行った。両方とも、完全な
緩解を有したが、それらの腫瘍はその後、腫瘍増殖の元
の部位で再増殖した。 【０５８９】（Ｃ．議論）本研究は、凝固を誘導する能
力を事実上有しない可溶性ヒトｔＴＦが、腫瘍内皮細胞
に対して二重特異性抗体により標的化される場合、腫瘍
血管系に対して強力なトロンボゲンとなることを示す。
インビトロ凝固の研究は、ｔＴＦの血栓活性の修復が、
細胞表面上の抗原への架橋を介して仲介されることを示
した。 【０５９０】ｔＴＦは、高親和性を有する第ＶＩＩ因子
および第ＶＩＩａ因子を結合し、そしてＶＩＩａの触媒
活性を高めるが、血漿の凝固を誘導しない。なぜなら、
ｔＴＦ：ＶＩＩａ複合体は、第ＩＸ因子および第Ｘ因子
の効率的な活性化のために膜表面と会合しなければなら
ないからである（Ｒｕｆら、１９９１；Ｋｒｉｓｈｎａ
ｓｗａｍｙら、１９９２）。二重特異性抗体によるｔＴ
Ｆ：ＶＩＩａの細胞表面への連結は、ｔＴＦ：ＶＩＩａ
を膜の極近くに近接させることにより凝固を誘導する能
力を修復する：膜リン脂質は、第ＩＸ因子または第Ｘ因
子との凝固開始複合体が、凝固プロセスにおいて中間体
を組立て、そして効率的に生成し得る表面を提供する。 【０５９１】ＩＩクラスに対する凝固リガンドの、ＩＩ
クラスを発現する血管系を有する腫瘍を有するマウスへ
の投与は、腫瘍中の血管の急速な血栓症を引き起こし
た。これに引き続き、大部分の動物における腫瘍の梗塞
および完全な腫瘍退行があった。完全な退行が得られな
かった動物において、腫瘍は、腫瘍が周囲の正常組織に
浸潤した腫瘍周辺部の腫瘍細胞の生存縁から再増殖し
た。腫瘍の増殖端での血管は、ＩＩクラス抗原を欠いて
いた。従って、凝固リガンドによるこれらの血管の血栓
症がないことを説明する。これらの生存細胞は、既に見
出されているように（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐ
ｅ、１９９３）、腫瘍細胞自体に作用する薬物を同時投
与することにより死滅され得るようである。 【０５９２】凝固リガンドの抗腫瘍効果は、抗ＩＩクラ
ス抗体および脱グリコシル化リシンＡ鎖からなるイムノ
トキシンを用いる同一の腫瘍モデルにおいて得られる効
果（ＢｕｒｒｏｗｓおよびＴｈｏｒｐｅ、１９９３）と
類似の大きさであった。２つの薬剤間の１つの違いは、
作用の速度である。凝固リガンドは、３０分未満で腫瘍
血管の血栓症を誘導する。一方、イムノトキシンは同様
の効果を達成するのに６時間要した。イムノトキシンは
よりゆっくり作用する。なぜなら、血栓症は、タンパク
質合成の閉鎖により生じる内皮細胞損傷に対して二次的
であるからである。 【０５９３】イムノトキシンと凝固リガンドとの間の第
２の重要な違いは、それらが異なる毒性の副作用を有す
ることである。イムノトキシンは、抗生物質を与えて、
腸内細菌によるＩＩクラス誘導を抑制しない限り、ＩＩ
クラス発現の胃腸上皮の致死破壊を生じた。凝固リガン
ドは、血液を除いて凝固因子が存在しないことから予想
されるように胃腸損傷を生じなかったが、高用量で投与
された場合に、いくつかのマウスにおいて凝固障害を生
じた。 【０５９４】本報告に記載される知見は、ヒト凝固誘導
タンパク質を腫瘍血管系に対して標的化する治療能力を
示す。臨床適用のため、抗体または他のリガンドは、固
形腫瘍の血管内皮細胞の表面に存在するが、正常組織の
内皮細胞に存在しない分子に結合することが必要とされ
る。腫瘍内皮マーカーは、腫瘍由来血管形成因子（Ｆｏ
ｌｋｍａｎ、１９８５）またはサイトカイン（Ｂｕｒｒ
ｏｗｓら、１９９１；Ｒｕｃｏら、１９９０）により直
接誘導され得るか、あるいは新血管形成中の内皮細胞の
急速な増殖（ＤｅｎｅｋａｍｐおよびＨｏｂｓｏｎ、１
９８２）および転移（Ｆｏｌｋｍａｎ、１９８５）に関
し得る。 【０５９５】いくつかの候補抗体が記載されている。エ
ンドグリンに対する抗体であるＴＥＣ−１１は、ヒト腫
瘍内皮細胞に選択的に結合する特定の例である。 【０５９６】他の抗体として、エンドシアリンに対する
ＦＢ５（Ｒｅｔｔｉｇら、１９９２）、エンドグリン様
分子に対するＥ−９（Ｗａｎｇら、１９９３）、フィブ
ロネクチンのイソ型に対するＢＣ−１（Ｃａｒｎｅｍｏ
ｌｌａら、１９８９）ならびに骨肉腫関連抗原に対する
ＴＰ−１およびＴＰ−３（Ｂｒｕｌａｎｄら、１９８
８）が挙げられる。ＣＤ３４は、転移性内皮細胞および
腫瘍および胎児組織における出芽性毛細管（ｂｕｄｄｉ
ｎｇ ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ）のアルブミン（ａｂｌ
ｕｍｉｎａｌ）プロセスに対してアップレギュレートさ
れることが報告されている（Ｓｃｈｌｉｎｇｅｍａｎｎ
ら、１９９０）。血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に
対するレセプターは、おそらく低酸素症に応答して（Ｔ
ｈｉｅｍｅら、１９９５）腫瘍血管においてアップレギ
ュレートされ（Ｐｌａｔｅら、１９９３；Ｂｒｏｗｎ
ら、１９９３）、そして腫瘍血管においてＶＥＧＦを選
択的に濃縮する（Ｄｖｏｒａｋら、１９９１）。 【０５９７】凝固誘導タンパク質をこれらのおよび他の
腫瘍内皮細胞マーカーに標的化することによる腫瘍梗塞
形成の誘導は、固形腫瘍の処置への価値のある新規アプ
ローチとして提案される。専らヒト凝固リガンドを産生
するために、ヒト（またはヒト化）抗体のヒト凝固タン
パク質への結合は、特に意図される。従って、与えられ
る処置過程を繰返すことにより、初期腫瘍およびその転
移の両方と戦うことが可能となる。 【０５９８】（実施例ＩＶ） （短縮型組織因子（ｔＴＦ）構築物の合成）ｔＴＦは、
本明細書では成熟組織因子タンパク質の細胞外ドメイン
（成熟タンパク質のアミノ酸１〜２１９；配列番号２
３）として示される。配列番号２３は、例えば、配列番
号２２によりコードされる。 【０５９９】（Ａ．Ｈ６［ｔＴＦ］）Ｈ６ Ａｌａ Ｍ
ｅｔ Ａｌａ［ｔＴＦ］。ｔＴＦ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮ
Ａ）を、以下のように調製した：Ｊ−８２細胞（ヒト膀
胱ガン）由来のＲＮＡを、ｔＴＦのクローニングのため
に使用した。全ＲＮＡを、ＧｌａｓｓＭａｘＴＭ ＲＮ
Ａマイクロ単離試薬（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を用いて単
離した。ＲＮＡを、ＧｅｎｅＡｍｐ ＲＮＡ ＰＣＲキ
ット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてｃＤＮＡに
逆転写した。ｔＴＦ ｃＤＮＡを、同一キットを用いて
以下の２つのプライマーで増幅した： ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＴ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ（配列番
号１） ３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ
Ｔ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＴＴ
ＣＴ（配列番号２） 下線を引いた配列は、ｔＴＦのＮ−末端をコードする。
５’プライマー中の残りの配列は、発現ベクターへのｔ
ＴＦのクローニングを可能にするＮｃｏＩの制限部位で
ある。３’プライマー中の配列は、発現ベクターへのｔ
ＴＦのクローニングのためのＨｉｎｄＩＩＩ部位であ
る。ＰＣＲ増幅を、製造者により提案されるように実施
した。簡潔に述べると、７５μＭ ｄＮＴＰ；０．６μ
Ｍプライマー、１．５ｍＭ ＭｇＣｌ２を使用し、そし
て９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７２℃で３０
秒の３０サイクルを実施した。 【０６００】Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターＨ６ ｐＱＥ−
６０を、ｔＴＦを発現するために使用した（Ｌｅｅら、
１９９４）。ＰＣＲ増幅ｔＴＦ ｃＤＮＡを、ＮｃｏＩ
とＨｉｎｄ３部位との間に挿入した。Ｈ６ ｐＱＥ−６
０は、組込まれた（Ｈｉｓ） ６コード配列を有し、その
結果発現タンパク質は、Ｎ−末端で（Ｈｉｓ）６配列を
有し、これはＮｉ−ＮＴＡカラムで精製し得る。 【０６０１】ｔＴＦを精製するため、ｔＴＦ含有Ｈ６
ｐＱＥ−６０ ＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＧ−１細胞
に形質転換した。細胞をＯＤ６００＝０．５まで増殖
し、そしてＩＰＴＧを３０μＭまで添加し、ｔＴＦ産生
を誘導した。３０℃で１８時間振盪後、細胞を採集し
た。細胞ペレットを６Ｍ Ｇｕ−ＨＣｌ中で変性し、そ
して溶解液をＮｉ−ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に載
せた。結合ｔＴＦを６Ｍ尿素で洗浄し、そしてｔＴＦ
を、室温で１６時間、６Ｍ〜１Ｍ尿素の勾配で再び折り
畳んだ（ｒｅｆｏｌｄ）。カラムを洗浄緩衝液（０．０
５ ＮａＨ２ＰＯ４、０．３Ｍ ＮａＣｌ、１０％グリ
セロール）で洗浄し、そしてｔＴＦを洗浄緩衝液中の
０．２Ｍイミドゾール（Ｉｍｉｄｏｚｏｌｅ）で溶出し
た。溶出したｔＴＦを濃縮し、そしてＧ−７５カラムに
載せた。ｔＴＦ単量体を採取した。 【０６０２】（Ｂ．ｔＴＦ）Ｇｌｙ［ｔＴＦ］。Ｇｌｙ
ｔＴＦ相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＰＣＲにおいて
５’プライマーを以下のプライマーで置き換えたこと以
外は前記セクションで記載したのと同一の方法で調製し
た。 ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＣＴＴ
ＣＴＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＣＴ（配
列番号３） 下線を引いた配列は、ｔＴＦのＮ−末端をコードする。
残りの配列は、ＮｃｏＩの制限部位およびトロンビンの
切断部位をコードする。 【０６０３】Ｈ６ ｐＱＥ−６０発現ベクターおよびタ
ンパク質精製の手法は、最終タンパク質生成物をトロン
ビンで処理してＨ６ペプチドを除去したこと以外は上記
と同一である。これを、１部のトロンビン（Ｓｉｇｍ
ａ）を５００部のｔＴＦ（ｗ／ｗ）に添加することによ
り行い、そして切断を室温で１８時間実施した。混合物
をベンズアミジンセファロース６Ｂトロンビンアフィニ
ティーカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に通すことによ
り、トロンビンをｔＴＦから除去した。 【０６０４】（Ｃ．システイン改変ｔＴＦＳ）ｔＴＦ構
築物を、Ｎ末端またはＣ末端システインで改変して、ジ
スルフィド結合を介する誘導体化抗体への結合を容易に
した。 【０６０５】Ｈ６ Ｃ［ｔＴＦ］。（Ｈｉｓ）６ Ａｌ
ａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｃｙｓ−［ｔＴＦ］。ＰＣＲにお
いて５’プライマーを以下のプライマーで置き換えたこ
と以外は前記セクションに記載のように、ＤＮＡを作製
した。 ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＴ ＧＣＴ ＣＡＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ
ＡＴＡ ＣＴＧ ＴＧ（配列番号４） すべての手法は、Ｎ−末端ｃｙｓを交換可能な酸化剤／
還元剤で保護したこと以外は、上記と同一であった。 【０６０６】Ｃ［ｔＴＦ］。Ｇｌｙ Ｓｅｒ Ｃｙｓ
［ｔＴＦ２−２１９］。ＰＣＲにおいて５’プライマー
を以下のプライマーで置き換えたこと以外は前記セクシ
ョンに記載のように、ＤＮＡを作製した。 ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ
ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ
ＣＴ（配列番号５） ベクター構築物およびタンパク質精製は、上記のように
トロンビン処理を使用して（Ｈｉｓ）６を除去したこと
以外は、（Ｈｉｓ）６ Ａｌａ Ｍｅｔ Ａｌａ Ｃｙ
ｓ ［ｔＴＦ］構築物について記載したのと同一であ
る。 【０６０７】Ｈ６ ［ｔＴＦ］Ｃ。（Ｈｉｓ）６ Ａｌ
ａ Ｍｅｔ Ａｌａ ［ｔＴＦ］Ｃｙｓ。３’プライマ
ーを以下のプライマーで置き換えたこと以外は（Ｈｉ
ｓ） ６ ＡＭＡ ［ｔＴＦ］セクションに記載と同一の
方法で、ＤＮＡを作製した。 ３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ
Ｇ ＣＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ
ＴＴＴ ＣＴ（配列番号６） 下線を引いた配列は、ｔＴＦのＣ末端をコードする。残
りの配列は、ｔＴＦを発現ベクターにクローニングする
ためのＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。 【０６０８】全ての手法は、１０ｍＭ β−ＭＥを６Ｍ
Ｇｕ−ＨＣｌ変性溶液中で使用し、Ｃ末端システイン
を交換可能な酸化剤／還元剤で保護したこと以外はｔＴ
Ｆセクションに記載と同一であった。 【０６０９】他の［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ単量体（例えば、
［ｔＴＦ １−２２０］ Ｃｙｓ、［ｔＴＦ １−２２
１］ Ｃｙｓおよび［ｔＴＦ １−２２２］ Ｃｙｓ）
もまた、同一の方法論を用いて作製（および結合）す
る。 【０６１０】（Ｄ．Ｃリンカー［ｔＴＦ］）Ｃリンカー
［ｔＴＦ］であるＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−（Ｇｌｙ）
４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓｅｒ−（Ｇｌｙ）４−Ｓ
ｅｒ−［ｔＴＦ］もまた構築した。ｃＤＮＡを、以下の
２工程のＰＣＲ手法を用いて作製した： ＰＣＲ１：リンカーＤＮＡの増幅 ＮｃｏＩ部位、トロンビン切断部位、システイン、リン
カーおよびｔＴＦのＮ末端をコードするｃＤＮＡを、以
下のプライマーを用いて増幅した： ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ
ＧＣＧ ＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ Ｇ
ＧＣ（配列番号７） ３’プライマー：５’ ＡＧＴ ＡＴＴ ＴＧＴ ＡＧ
Ｔ ＧＣＣ ＴＧＡ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＣＣ ＡＣＣ
ＴＣＣ ＡＣＴ（配列番号８） 下線を引いた配列は、リンカーペプチドをコードする。
ＰＣＲにおいて使用したＤＮＡテンプレートは、以下の
リンカーをコードする二重鎖ＤＮＡであった。 配列：ＧＧＡ ＧＧＣ ＧＧＴ ＧＧＡ ＴＣＡ ＧＧ
Ｃ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＴ ＡＧＴ ＧＧＡ ＧＧＴ
ＧＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ（配列番号９） ｔＴＦセクションに記載と同一のＰＣＲ条件を用いた。
９５ｂ．ｐ．増幅生成物を、ＰＣＲ２においてｔＴＦ
ＤＮＡに結合した。 【０６１１】ＰＣＲ２：ＣｙｓリンカーＤＮＡのｔＴＦ
ＤＮＡへの結合。ＰＣＲに使用したＤＮＡテンプレー
トは、２つの重複ＤＮＡであった：上記のＰＣＲ１由来
の９５ｂ．ｐ．ＤＮＡおよびｔＴＦ ＤＮＡ。使用した
プライマーは以下であった： ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧ（配列番号１０） ３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ
Ｔ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＣ ＴＴＴ
ＣＴ（配列番号１１） ７４０ｂ．ｐ．の最終ＰＣＲ生成物を、ＮｃｏＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩで消化し、そしてｔＴＦセクションに記
載のようにＨ６ ｐＱＥ ６０に挿入した。 【０６１２】ベクター構築物およびタンパク質精製手法
は、Ｃ［ｔＴＦ］セクションに記載と全て同一である。 【０６１３】（実施例Ｖ） （二量体組織因子の合成）組織因子二量体が、凝固開始
時に単量体よりも強力であり得ることを、本発明者らは
推論した。Ｊ８２膀胱ガン細胞の表面上の天然の組織因
子が、二量体として存在し得ることが可能である（Ｆａ
ｉｒら、１９８７）。１つの第ＶＩＩ因子または第ＶＩ
Ｉａ因子分子の１つの組織因子分子への結合はまた、別
の第ＶＩＩ因子または第ＶＩＩａ因子の別の組織因子へ
の結合を促進し得る（Ｆａｉｒら、１９８７；Ｂａｃｈ
ら、１９８６）。さらに、組織因子は、サイトカインレ
セプターファミリーのメンバーに対して構造的相同性を
示し（Ｅｄｇｉｎｇｔｏｎら、１９９１）、これらのい
くつかは二量体化して活性レセプターを形成する（Ｄａ
ｖｉｅｓおよびＷｌｏｄａｗｅｒ、１９９５）。従っ
て、本発明者らは以下のようにＴＦ二量体を合成した。 【０６１４】（Ａ．［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］） 構造Ｇｌｙ［ｔＴＦ］ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇｌ
ｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ ［ｔＴＦ］を
有するＧｌｙ ［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］を作製し
た。２つのＤＮＡ断片を、以下のように、別々にＰＣＲ
増幅し、結合し、そしてベクターに挿入した： ＰＣＲ１：ｔＴＦおよびリンカーＤＮＡの５’半分の調
製。ＰＣＲにおけるプライマー配列は以下の通りであ
る： ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ
ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ
ＣＴ（配列番号１２） ３’プライマー：５’ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＡＣ
Ｃ ＧＣＣ ＡＣＣ ＡＧＡ ＴＣＣ ＡＣＣ ＧＣＣ
ＴＣＣ ＴＴＣ ＴＣＴ ＧＡＡ ＴＴＣ ＣＣＣ
ＴＴＴ ＣＴ（配列番号１３） Ｇｌｙ［ｔＴＦ］ ＤＮＡをＤＮＡテンプレートとして
使用した。さらにＰＣＲ条件はｔＴＦセクションに記載
の通りであった。 【０６１５】ＰＣＲ２：リンカーＤＮＡの３’半分およ
びｔＴＦ ＤＮＡの調製。ＰＣＲにおけるプライマー配
列は以下の通りであった： ５’プライマー：５’ ＣＧＣ ＧＧＡ ＴＣＣ ＧＧ
Ｃ ＧＧＴ ＧＧＡ ＧＧＣ ＴＣＴ ＴＣＡ ＧＧＣ
ＡＣＴ ＡＣＡ ＡＡＴ ＡＣＴ ＧＴ（配列番号１
４） ３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ
Ｔ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＴＣ
Ｔ（配列番号１５）。 【０６１６】ｔＴＦ ＤＮＡをＰＣＲにおいてテンプレ
ートとして使用した。ＰＣＲ１由来の生成物を、Ｎｃｏ
ＩおよびＢａｍＨで消化した。ＰＣＲ２由来の生成物
を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨ１で消化した。消化
したＰＣＲ１ ＤＮＡおよびＰＣＲ２ ＤＮＡを、Ｎｃ
ｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化のＨ６ ｐＱＥ ６０Ｄ
ＮＡと結合した。 【０６１７】ベクター構築物およびタンパク質精製のた
めの手法は、Ｇｌｙ ［ｔＴＦ］セクションに記載と同
一であった。 【０６１８】（Ｂ．Ｃｙｓ ［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴ
Ｆ］） 構造Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ｃｙｓ ［ｔＴＦ ２−２１９］
（Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ （Ｇ
ｌｙ）４ Ｓｅｒ ［ｔＴＦ］を有するＣｙｓ［ｔＴ
Ｆ］リンカー［ｔＴＦ］もまた構築した。ＤＮＡを、以
下のプライマーを用いてＰＣＲにより作製した： ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ
ＣＴＴ ＧＣＧ ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ
ＣＴ（配列番号１６） ３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ
Ｔ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＴ ＴＴＣ
Ｔ（配列番号１７） ［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］ ＤＮＡをテンプレート
として使用した。残りのＰＣＲ条件は、ｔＴＦセクショ
ンに記載と同一であった。ベクター構築物およびタンパ
ク質精製は、全て、Ｈ６Ｃ［ｔＴＦ］の精製に記載の通
りであった。 【０６１９】（Ｃ．［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］ ｃ
ｙｓ） タンパク質構造［ｔＴＦ］ （Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ
（Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ（Ｇｌｙ）４ Ｓｅｒ ［ｔＴ
Ｆ］ Ｃｙｓを有する［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］
ｃｙｓ二量体もまた作製した。ＤＮＡを、以下のプライ
マーを用いてＰＣＲにより作製した： ５’プライマー：５’ ＧＴＣ ＡＴＧ ＣＣＡ ＴＧ
Ｇ ＣＣＣ ＴＧＧ ＴＧＣ ＣＴＣ ＧＴＧ ＧＴＴ
ＧＣＡ ＣＴＡ ＣＡＡ ＡＴＡ ＣＴ（配列番号１
８） ３’プライマー：５’ ＴＧＡ ＣＡＡ ＧＣＴ ＴＡ
Ｇ ＣＡＴ ＴＣＴ ＣＴＧ ＡＡＴ ＴＣＣ ＣＣＴ
ＴＴＣ Ｔ（配列番号１９） ［ｔＴＦ］リンカー［ｔＴＦ］ ＤＮＡをテンプレート
として使用した。残りのＰＣＲ条件は、ｔＴＦセクショ
ンに記載と同一であった。ベクター構築物およびタンパ
ク質精製は、［ｔＴＦ］ ｃｙｓセクションの精製に記
載のように再度実施した。 【０６２０】（Ｄ．化学的結合二量体） ［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ単量体を化学的に結合して、［ｔＴ
Ｆ］ Ｃｙｓ−Ｃｙｓ［ｔＴＦ］二量体を形成する。こ
れを、室温で１時間、等モル量のＤＴＴを保護した［ｔ
ＴＦ］ Ｃｙｓに添加して脱保護し、そして［ｔＴＦ］
ＣｙｓのＣ末端でシステインを曝すことにより行う。
等モル量の保護した［ｔＴＦ］ Ｃｙｓを、ＤＴＴ／
［ｔＴＦ］ Ｃｙｓ混合物に添加し、そして室温で１８
時間インキュベーションを続ける。二量体をＧ−７５ゲ
ル濾過カラムで精製する。 【０６２１】Ｃｙｓ ［ｔＴＦ］単量体を、同一の方法
を用いて化学的に結合して、二量体を形成する。 【０６２２】（実施例ＶＩ） （組織因子変異体の合成）ｔＴＦ結合第ＶＩＩ因子を第
ＶＩＩａ因子に変換する能力を欠く２つのｔＴＦ変異体
を記載する。第ＶＩＩ因子と比較して、血漿中に第ＶＩ
Ｉａ因子は３００倍少なく存在する（Ｍｏｒｒｉｓｓｅ
ｙら、１９９３）。従って、循環性の変異体ｔＴＦは、
凝固をほとんど開始し得ず、それゆえ非常に低い毒性を
示す。凝固リガンドにおいて、一旦変異体ｔＴＦが結合
抗体を介して腫瘍部位に局所化すると、第ＶＩＩａ因子
が注入されてｔＴＦ結合第ＶＩＩ因子と交換する。変異
体は、第ＶＩＩａ因子の存在下で活性である。 【０６２３】（Ａ．［ｔＴＦ］Ｇ１６４Ａ）「［ｔＴ
Ｆ］Ｇ１６４Ａ」は、Ａｌａにより置換されたｔＴＦの
アミノ酸１６４（Ｇｌｙ）を有する変異体タンパク質構
造を有する。Ｃｈａｍｅｌｅｏｎ二重鎖部位特異的変異
誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を、変異体の生成
に使用する。ＤＮＡテンプレートはＧｌｙ［ｔＴＦ］
ＤＮＡであり、そして変異誘発プライマーの配列は以下
である： ５’ ＣＡＡ ＧＴＴ ＣＡＧ ＣＣＡ ＡＧＡ ＡＡ
ＡＣ（配列番号２０） 上記のベクター構築物およびタンパク質精製手法を、Ｇ
ｌｙ［ｔＴＦ］の精製に使用する。 【０６２４】（Ｂ．［ｔＴＦ］ Ｗ１５８Ｒ Ｓ１６２
Ａ） ［ｔＴＦ］Ｗ１５８Ｒ Ｓ１６２Ａは、ｔＴＦのアミノ
酸１５８（Ｔｒｐ）がＡｒｇで置換され、そしてアミノ
酸１６２（Ｓｅｒ）がＡｌａで置換されている二重変異
体である。［ｔＴＦ］ Ｇ１６４Ａについての記載と同
一の変異誘発方法を使用する。変異誘発プライマーは以
下である： ５’ ＡＣＡ ＣＴＴ ＴＡＴ ＴＡＴ ＣＧＧ ＡＡ
Ａ ＴＣＴ ＴＣＡＧＣＴ ＴＣＡ ＧＧＡ ＡＡＧ
（配列番号２１） 前記ベクター構築物およびタンパク質精製手法を、Ｇｌ
ｙ［ｔＴＦ］の精製に使用する。 【０６２５】（実施例ＶＩＩ） （組織因子接合体の合成） （Ａ．化学的誘導体化および抗体結合）抗体ｔＴＦ接合
体を、ジスルフィド結合を介して、化学的に誘導体化し
た抗体を化学的に誘導体化したｔＴＦに結合することに
より合成した（図５に例示するように）。 【０６２６】抗体を５倍モル過剰のスクシンイミジルオ
キシカルボニル−α−メチル α−（２−ピリジルジチ
オ）トルエン（ＳＭＰＴ）と室温で１時間反応させて、
抗体１分子あたり平均２個のピリジルジスルフィド基を
有する誘導体化抗体を得た。誘導体化抗体を、ゲルパー
ミエーションクロマトグラフィーにより精製した。 【０６２７】抗体に対して２．５倍モル過剰のｔＴＦ
を、４５倍モル過剰の２−イミノチオラン（２ＩＴ）と
室温で１時間反応させて、ｔＴＦ１分子あたり平均１．
５個のスルフヒドリル基を有するｔＴＦを得た。誘導体
化ｔＴＦもまた、ゲルパーミエーションクロマトグラフ
ィーにより精製し、そして直ちに誘導体化抗体と混合し
た。 【０６２８】混合物を放置して室温で７２時間反応さ
せ、次いでＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムに添
加して抗体−ｔＴＦ接合体を遊離ｔＴＦおよび遊離した
ピリジン−２−チオンから分離した。接合体を、抗ｔＴ
Ｆカラムのアフィニティークロマトグラフィーにより遊
離抗体から分離した。最終接合体生成物の優勢な分子種
は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価されるように、より少
量の多置換接合体（Ｍｒ約２０２，０００以下）を有す
る単置換抗体−ｔＴＦ接合体（Ｍｒ 約１７６，００
０）であった。 【０６２９】（Ｂ．システイン改変ｔＴＦの誘導体化抗
体への結合）抗体−Ｃ［ＴＦ］および［ｔＴＦ］Ｃ接合
体を、ジスルフィド結合を介して、システイン改変ｔＴ
Ｆを化学的に誘導体化した抗体に直接結合することによ
り合成した（図５に例示するように）。 【０６３０】抗体を、１２倍モル過剰の２ＩＴと室温で
１時間反応させて、抗体１分子あたり平均１．５個のス
ルフヒドリル基を有する誘導体化抗体を得た。誘導体化
抗体をゲルパーミエーションクロマトグラフィーにより
精製し、そして直ちに２倍モル過剰のシステイン改変ｔ
ＴＦと混合した。混合物を放置して室温で２４時間反応
させ、次いで接合体を、上記のようにゲルパーミエーシ
ョンクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマト
グラフィーにより精製した。 【０６３１】最終接合体の優勢な分子種は、ＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥにより評価されるように、より少量の多置換接合
体（Ｍｒ 約２０２，０００以下）を有する単置換接合
体（Ｍｒ 約１７６，０００）であった。 【０６３２】（Ｃ．システイン改変ｔＴＦのＦａｂ’フ
ラグメントへの結合）抗体 Ｆａｂ’−Ｃ［ｔＴＦ］お
よび［ｔＴＦ］Ｃ接合体を調製する。このような接合体
は、インビボにおいてより強力であり得る。なぜなら、
このような接合体は、制限された内在化（ｉｎｔｅｒｎ
ａｌｉｚａｔｉｏｎ）能により、２価接合体よりも長く
細胞表面上に残存するからである。Ｆａｂ’フラグメン
トを、２倍モル過剰のシステイン改変ｔＴＦと２４時間
混合し、次いで接合体を、上記のようにゲルパーミエー
ションクロマトグラフィーおよびアフィニティークロマ
トグラフィーにより精製する。 【０６３３】（Ｄ．ｔＴＦ接合体の凝固活性）ｔＴＦ接
合体を、Ａ２０細胞に対する表面上で発現されるＩＩク
ラス抗原に結合するＢ２１−２モノクローナル抗体を用
いて調製した。接合体を、化学的に誘導体化したｔＴＦ
およびシステイン改変ｔＴＦを用いて調製し、そしてＣ
ａＣｌ ２中のマウス血漿を凝固する接合体の能力を、Ａ
２０細胞の表面への結合後測定した。 【０６３４】両方のＢ２１−２接合体は、用量依存様式
で、ＣａＣｌ２中のマウス血漿（コントロール）の凝固
時間を短縮した。ｔＴＦ接合体は、二重特異性抗体Ｂ２
１−２／１０Ｈ１０を用いて、Ａ２０細胞の表面にｔＴ
Ｆを連結した場合に生じるのと同様の凝固促進を示した
（図６）。 【０６３５】（Ｅ．抗腫瘍細胞ｔＴＦ接合体）ｔＴＦが
腫瘍血管内皮細胞に標的化される場合、ｔＴＦが腫瘍血
管内で凝固を誘導することが既に確立されている（実施
例Ｉ〜ＩＩＩ）。本発明者らは、ｔＴＦが腫瘍細胞の表
面に標的化される場合、凝固が腫瘍血管内で誘導される
ことを意図した。 【０６３６】３つの抗腫瘍細胞抗体（ＫＳ１／４、Ｄ６
１２、およびＸＭＭＣＯ−７９１）を、上記の「ｔＴＦ
接合体の調製」セクションに記載のようにｔＴＦに結合
した。ＫＳ１／４を、Ｓｃｒｉｐｐｓ Ｒｅｓｅａｒｃ
ｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、Ｃａｌｉ
ｆｏｒｎｉａのＤｒ．Ｒ．Ｒｅｉｓｆｅｌｄから得た。
そしてこれは米国特許第４，９７５，３６９号にも記載
されている；Ｄ６１２は、ＮＣＩ、Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ ｏｆ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、Ｍａｒｙｌａｎ
ｄのＤｒ．Ｊ．Ｓｃｈｌｏｍから得、米国特許第５，１
８３，７５６号に記載されており、そしてＡＴＣＣハイ
ブリドーマ細胞株アクセション番号ＨＢ ９７９６由来
の培養上澄みから得られ得る；ＸＭＭＣＯ−７９１は、
ＡＴＣＣから購入したハイブリドーマ細胞株由来の組織
培養上澄みから精製した。 【０６３７】ヒト結腸ガン細胞株Ｗｉｄｒを、ＫＳ１／
４に対する標的細胞として使用した。Ｗｉｄｒ細胞をＡ
ＴＣＣから購入し、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血
清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ
中、空気において１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で維
持した。ヒト結腸ガン細胞株ＬＳ１４７Ｔを、Ｄ６１２
に対する標的細胞として使用した。ＬＳ１４７Ｔ細胞を
ＡＴＣＣから購入し、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児
血清、Ｌ−グルタミンおよび抗生物質を補充したＲＰＭ
Ｉ中、空気において５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で維
持した。ヒトの非小細胞肺ガン細胞株Ｈ４６０を、ＸＭ
ＭＣＯ−７９１に対する標的細胞として使用した。Ｈ４
６０細胞を、Ｄｒ．Ａｄｉ Ｇａｚｄａｒ、Ｓｉｍｍｏ
ｎｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ ｏｆ Ｔｅｘａｓ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔｅｒｎ
Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ、Ｄａｌｌａｓ、Ｔｅｘ
ａｓから得、そして１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清、Ｌ
−グルタミンおよび抗生物質を補充したＤＭＥＭ中、空
気において１０％（ｖ／ｖ）ＣＯ２雰囲気中で維持し
た。３つの細胞株は全て、付着性単層として増殖した。 【０６３８】接合体を、関連の標的抗原を発現する腫瘍
細胞に結合した場合、ＣａＣｌ２中のマウス血漿の凝固
時間を増大する能力について試験した。腫瘍細胞を、Ｐ
ＢＳ中の０．０５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡを用いて組織培
養フラスコから取り出した。細胞を、ＴＦ９−６Ｂ４お
よびＴＦ８−５Ｇ９抗体でプレインキュベートして任意
の天然の組織因子活性を中和し（Ｍｏｒｒｉｓｅｙら、
１９８８）、次いで凝固アッセイをＡ２０細胞について
記載の通りに実施した。 【０６３９】全ての３つの接合体は、標的細胞株に結合
した場合、用量依存様式で、ＣａＣｌ２中のマウス血漿
（コントロール）の凝固時間を短縮した（図７）。これ
は、ｔＴＦが細胞表面に標的化された場合、凝固が腫瘍
細胞の表面で加速されたことを示す。 【０６４０】（実施例ＶＩＩＩ） （組織因子プロドラッグの合成）例示的なｔＴＦプロド
ラッグは以下の構造を有する：ｔＴＦ１−２１９（Ｘ）
ｎ１（Ｙ）ｎ２Ｚリガンド、ここでｔＴＦ
１−２１９は、サイトゾルドメインおよび膜貫通ドメイ
ンを除いたＴＦを表し；Ｘは、長さｎ１のアミノ酸（Ａ
Ａ）の疎水性膜貫通ドメイン（１−２０ ＡＡ）を表
し；Ｙは、長さｎ２のＡＡの親水性プロテアーゼ認識配
列（適切なプロテアーゼ認識を確実にするに十分なＡ
Ａ）を表し；Ｚは、ジスルフィドチオエステルまたは他
の結合基（例えば、（Ｃｙｓ）１−２）を表し；リガン
ドは、腫瘍細胞、腫瘍ＥＣ、結合組織（支質）または基
底膜マーカーを認識する抗体または他の標的化部分を表
す。 【０６４１】ｔＴＦプロドラッグは、疾患組織（すなわ
ち、腫瘍）への局所化を可能にする静脈内注射を意図す
る。一旦疾患組織に局所化されると、内因性プロテアー
ゼ（すなわち、メタロプロテイナーゼ、トロンビン、第
Ｘａ因子、第ＶＩＩａ因子、第ＩＸａ因子、プラスミ
ン）は、プロドラッグ由来の親水性プロテアーゼ認識配
列を切断する。これは、疎水性膜貫通配列を局所細胞膜
に挿入することを可能にする。一旦その尾部（ｔａｉ
ｌ）が膜内に挿入すると、ｔＴＦは凝固誘導特性を回復
し、その結果疾患組織の血管において凝固を形成する。 【０６４２】（実施例ＩＸ） （Ｇｌａ修飾を欠く凝固因子の合成）Ｇｌａ（γ−カル
ボキシグルタミン酸）修飾を欠くビタミンＫ依存性凝固
因子（第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、
第ＩＸ／ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子）は、凝固リ
ガンドの形成に有用であることを意図する。Ｇｌａ修飾
を欠く凝固因子は、貧弱な凝固剤である。なぜなら、非
修飾因子は脂質膜と効率的に会合しないからである：リ
ガンドを介した因子の腫瘍の血管または他の部位への標
的化により、因子は細胞表面近傍に戻されるはずであ
り、そしてその部位での凝固の進行を可能にするはずで
ある。 【０６４３】「Ｇｌａ」は、存在するＧｌｕ（グルタミ
ン酸）残基の翻訳後修飾により作製される。Ｇｌａ修飾
を欠くビタミンＫ依存性凝固因子（第ＩＩ／ＩＩａ因
子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子およ
び第Ｘ／Ｘａ因子）は、ＧｌｕをＧｌａに改変しない宿
主（例えば、細菌）中でビタミンＫ依存性凝固因子をコ
ードする遺伝子を発現することにより作製され得る。第
ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＶＩＩａ因子、第ＩＸ／
ＩＸａ因子および第Ｘ／Ｘａ因子のそれぞれをコードす
るＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号２４、配列番号２
５、配列番号２６および配列番号２７として本明細書に
包含される。従って、原核生物の発現は簡単である。 【０６４４】このようなＧｌａ欠失因子はまた、この遺
伝子を発現する前に、この場合は実質的に任意の宿主細
胞において、相当するＧｌｕ残基を他のアミノ酸に変化
させるように上記の配列のいずれか（配列番号２４、配
列番号２５、配列番号２６、および配列番号２７）を変
異させることにより作製され得る。変化されるべきコド
ンは、ＧＡＧコドンである（ＧＡＡもまたＧｌｕをコー
ドし、これは避けられるべきである）。例示として第Ｖ
ＩＩ因子を用いて、Ｇｌａ「ドメイン」は、一般に２１
６〜３２５領域に位置する。第一のＧｌａコードトリプ
レットは、配列番号２５の２３１に存在し、そして最後
は、配列番号２５の３１８から伸長する。ＧＡＧコドン
は、分子生物学的技術を用いて容易に変化され得る。 【０６４５】図８は、上記のビタミンＫ依存性凝固因子
の各々のＧｌａドメインが、類似した領域に位置するこ
とを示す。それ故、配列番号２４、配列番号２６、およ
び配列番号２７のいずれか１つにおける、いわゆる「相
当する」Ｇｌｕ残基の変異はまた、容易に理解される。 【０６４６】以下のコドンの表は、所定のＧｌａコード
コドンまたは配列を改変することにおいて作製される変
異の容易な選択を可能にするために提供される。 【０６４７】 【表９】部位特異的変異誘発は、基礎を成すＤＮＡの特定の変異
誘発およびこのＤＮＡへの１つ以上のヌクレオチド配列
の変化の導入による、Ｇｌａ改変されていない個々のビ
タミンＫ依存性凝固因子の調製における使用が意図され
る技術である。 【０６４８】部位特異的変異誘発は、横断される欠失連
結部の両側に安定な２重鎖を形成するための十分なサイ
ズおよび配列の複雑さのプライマー配列を提供するため
に、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴ
ヌクレオチド配列、ならびに十分な数の隣接したヌクレ
オチドの使用により変異体を生成させる。代表的には、
改変される配列の結合部の両側に約５〜１０残基を有す
る、約１７〜２５ヌクレオチドの長さのプライマーが好
ましい。 【０６４９】一般には、部位特異的変異誘発の技術は、
Ａｄｅｌｍａｎら、（１９８３）のような刊行物および
上記のＴＦ変異体研究により例示されるように、当該分
野において周知である。この技術は、代表的には１本鎖
および２本鎖形態の両方で存在するファージベクターを
使用する。部位特異的変異誘発において有用な代表的な
ベクターは、Ｍ１３ファージ（Ｍｅｓｓｉｎｇら、１９
８１）のようなベクターを包含する。これらのファージ
は、容易に商業的に入手可能であり、そしてこれらの使
用は、一般に当業者に周知である。２本鎖プラスミドは
また、目的の遺伝子をプラスミドからファージに移す工
程を削除する部位特異的変異誘発において日常的に用い
られる。 【０６５０】一般に、本明細書による部位特異的変異誘
発は、最初に１本鎖ベクターを得ること、または２本鎖
ベクターの２本鎖を融解して分離することにより実施さ
れる。このベクターは、ビタミンＫ依存性凝固因子をコ
ードするＤＮＡ配列をその配列内に含む。所望の変異配
列を保有するオリゴヌクレオチドプライマーが（一般的
には、例えばＣｒｅａら、（１９７８）の方法により合
成的に）調製される。次いで、このプライマーは、１本
鎖ベクターとアニールされ、そして変異保有鎖（ｍｕｔ
ａｔｉｏｎ−ｂｅａｒｉｎｇ ｓｔｒａｎｄ）の合成を
完了するために、Ｅ．ｃｏｌｉポリメラーゼＩ Ｋｌｅ
ｎｏｗフラグメントのようなＤＮＡ重合酵素に供され
る。従って、ヘテロ２重鎖が形成され、ここで１つの鎖
は、本来の非変異配列をコードし、そして第２の鎖は所
望の変異を保有する。次いで、このヘテロ２重鎖ベクタ
ーは、適切な細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）を形質
転換するために使用され、そして変異配列アレンジメン
トを保有する組換えベクターを含有するクローンが選択
される。 【０６５１】（実施例Ｘ） （さらなる抗腫瘍血管系抗体）本実施例は、腫瘍血管系
と正常な組織の血管系とを区別することにおける使用の
ための腫瘍由来内皮細胞「結合因子」に対する抗体の生
成を記載する。特に、血管透過因子（ＶＰＦ）（血管内
皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）とも呼ばれる）に対する抗
体およびｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）に対す
る抗体の生成を記載する。 【０６５２】ＦＧＦに関してさらに詳細には、Ｇｏｍｅ
ｚ−ＰｉｎｉｌｌａおよびＣｏｔｍａｎ（１９９２）；
Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、（１９９２）（塩基性線維芽細
胞増殖因子の局在化を記載している）；Ｘｕら、（１９
９２）（ＦＧＦの発現および免疫化学的分析に関す
る）；Ｒｅｉｌｌｙら、（１９８９）（モノクローナル
抗体に関する）；Ｄｉｘｏｎら、（１９８９）（ＦＧＦ
検出および特徴付けに関する）；Ｍａｔｓｕｚａｋｉ
ら、（１９８９）（ヘパリン結合成長因子に対するモノ
クローナル抗体に関する）；ならびにＨｅｒｂｌｉｎお
よびＧｒｏｓｓ（１９９２）（血管系に関連した固形腫
瘍におけるｂＦＧＦについての結合部位を議論してい
る）を引用し得る。 【０６５３】本研究において、ウサギを、ツベルクリン
（精製されたタンパク質誘導体、ＰＰＤ）またはチログ
ロブリンキャリアーとカップリングした、ヒトＶＥＧ
Ｆ、マウスＶＥＧＦ、モルモットＶＥＧＦ、ヒトｂＦＧ
Ｆ、マウスｂＦＧＦ、またはモルモットｂＦＧＦのＮ末
端ペプチドで過免疫した。これらのペプチドは、２５〜
２６アミノ酸の長さであり、そしてＣ末端残基としてシ
ステインを用いてペプチド合成機で合成した。抗血清
を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅマトリックスにカップリングし
たペプチドのカラムにおいてアフィニティー精製した。 【０６５４】ＶＥＧＦに対する抗体を、ＥＬＩＳＡなら
びにモルモットの腫瘍および正常組織の凍結切片におけ
るそれらの染色パターンにより同定した。モルモットＶ
ＥＧＦおよびヒトＶＥＧＦに対するポリクローナル抗体
は、それぞれ、モルモットＬ１０腫瘍および種々のヒト
腫瘍（耳下腺ガン、卵巣ガン、乳ガン）の凍結切片上の
大多数の血管内皮細胞と反応した。抗ヒトＶＥＧＦ抗体
は、正常なヒト腎臓糸球体における内皮細胞を取り囲む
糸球体間質細胞および肝臓における内皮細胞を染色した
が、しかし正常なヒトの胃、脚の筋肉、および脾臓にお
ける血管を染色しなかった。抗モルモットＶＥＧＦ抗体
は、腎臓、脳、脾臓、心臓、精嚢、肺、大腸、胸腺、前
立腺（ｐｒｏｓｔｒａｔｅ）、肝臓、精巣、および骨格
筋を含む正常な組織のいずれにおいても内皮細胞を染色
しなかった。 【０６５５】ヒトＦＧＦに対するポリクローナル抗体
は、耳下腺ガンおよび卵巣ガンにおける内皮細胞を染色
したが、しかし乳ガンにおける内皮細胞を染色しなかっ
た。抗ヒトＦＧＦ抗体は、ヒト腎臓における糸球体内皮
細胞を染色したが、しかし正常な胃、脚の筋肉、および
脾臓における内皮細胞を染色しなかった。 【０６５６】モルモットＶＥＧＦ、ヒトＶＥＧＦおよび
モルモットｂＦＧＦに対するモノクローナル抗体を、Ｐ
ＰＤまたはチログロブリンにカップリングしたＮ末端配
列ペプチド（ペプチドのＣ末端にシステインを有する）
でＢＡＬＢ／ｃマウスを免疫することにより調製した。
規定された配列の合成ペプチド免疫原は、以下に示さ
れ、そしてそれぞれ配列番号３０、配列番号３１、およ
び配列番号３２で表される： 【０６５７】 【表１０】 ペプチドを、スクシミジル４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣ
Ｃ）でチログロブリンを誘導体化し、そして誘導体とペ
プチドを反応させることにより、チログロブリンまたは
ＰＰＤに接合させた。これは、チログロブリンへのチオ
エーテル結合により連結される１つ以上のペプチド配列
を有する接合体を与える。 【０６５８】特に、上記配列に対するモノクローナル抗
体の生成を、以下の手順を用いて達成した：ＢＡＬＢ／
ｃマウスを、いくつかの部位へのペプチド−ＰＰＤまた
はペプチド−チログロブリンでの連続した注射により免
疫した。最後の注射の４または５日後に、脾臓を取り出
し、そして脾細胞を、Ｍｏｒｒｏｗら、（１９９１）に
刊行された手順に従ってポリエチレングリコールを用い
て、Ｐ３ｘＧ３Ａｇ８．６５３骨髄腫細胞と融合した。 【０６５９】個々のハイブリドーマ上清を以下のように
スクリーニングした： 第１のスクリーニング：ペプチド−チログロブリン被覆
したプレートにおけるＥＬＩＳＡ。 第２のスクリーニング：チログロブリンへのＳＭＣＣに
より連結されたシステインにおけるＥＬＩＳＡ。 第３のスクリーニング：モルモット株１０腫瘍またはヒ
ト耳下腺ガンの凍結切片の間接的免疫ペルオキシダーゼ
染色。 第４のスクリーニング：種々の悪性および正常なモルモ
ットおよびヒトの組織の凍結切片の間接的免疫ペルオキ
シダーゼ染色。 【０６６０】ペプチド−チログロブリンに結合するが、
しかしシステイン−チログロブリンに結合しない抗体を
選択した。これらの抗体は、正常な組織における内皮細
胞に結合するよりも強力に悪性腫瘍における内皮細胞に
結合した（表ＶＩＩＩ）。 【０６６１】 【表１１】（Ａ．ヒトおよびモルモット組織切片のＧＶ９７染色）
モルモットＶＥＧＦ Ｎ末端に対するＧＶ９７抗体は、
種々のヒト悪性組織（表ＩＸ）および正常組織（表Ｘ）
における内皮細胞に結合した。 【０６６２】悪性腫瘍における内皮細胞への結合は、正
常組織における内皮細胞への結合を超過する傾向があっ
た。 【０６６３】モルモット腫瘍（株１０肝細胞性ガン）お
よび正常組織における内皮細胞の染色は、分布および強
度においてヒト組織に観察された染色と類似した（表Ｘ
Ｉ）。 【０６６４】表において、＋は、ネガティブな結果に対
立するものとしてのポジティブな結果を示す。数値２
＋、３＋、および４＋は、当該研究分野で日常的に理解
されるように、増大する強度のポジティブシグナルをい
う。 【０６６５】 【表１２】 【０６６６】 【表１３】 【０６６７】 【表１４】 （Ｂ．ＧＶ９７の可溶性ヒトＶＥＧＦとの反応性の欠
失）ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター（Ｆｌｋ−１）また
はレセプターに結合（または複合体化）したＶＥＧＦに
特異的である抗体を同定するために、ＥＬＩＳＡスクリ
ーニングプロトコルを開発した。手順は以下の通りであ
る：最初に、９６ウェルＥＬＩＳＡプレート（丸底）
を、感作緩衝液中の１０μｇ／ｍｌの１００μｌ／ウェ
ルのＦＬＫ／ｓｅａｐで被覆した（外側のウェルはブラ
ンクのままにした）。一晩のインキュベーション後、こ
のプレートを、一晩の間４℃にて、ＰＢＳで２回洗浄し
た。次に、ＦＬＫ／Ｓｅａｐ被覆したプレートを、２５
０μｌ／ウェルのＰＢＳ＋ＣＡＨ（５％）溶液で１時間
３７℃にてブロックした。ブロッキング溶液を除去し、
プレートを、ペーパータオル上で勢いよく叩いた。 【０６６８】次いでブロックしたプレートを、結合にお
いて２μｇ／ｍｌで１００μｌ／ウェルのＶＥＧＦ−１
６５（Ｄｒ．Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ，Ｕｎｉｖｅｒ
ｓｉｔｙ ｏｆ Ｍｉｎｎｅｓｏｔａから入手した酵母
において生成されたＶＥＧＦ１６５ ａａ形態）＋０．
１μｇ／ｍｌヘパリンとともに室温で４時間または４℃
で一晩インキュベートした。ＶＥＧＦ溶液を回収し、そ
してプレートをＰＢＳ−ｔｗｅｅｎ（０．１０％）で２
回洗浄した。次に、１００μｌ／ウェルのハイブリドー
マ融合上清をウェルに添加し、そして１時間３２℃にて
インキュベートした。この上清のインキュベーションの
後、プレートをＰＢＳ ｔｗｅｅｎで３回洗浄し、次い
でＰＢＳ ｔｗｅｅｎ＋ＣＡＨ（５％）中に１：１００
０で、１００μｌウェルの二次抗体（ＫＰＬ，Ｇｔ抗マ
ウスＩｇＧ）とともに１時間３７℃にてインキュベート
した。 【０６６９】二次抗体とのインキュベーションの後、プ
レートを、ＰＢＳ ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、１００μ
ｌ／ウェルの基質（クエン酸緩衝液＋Ｈ２Ｏ２に溶解し
たＳｕｂｓｔｒａｔｅ Ｓｉｇｍａ ＯＰＤ）とともに
２０分間インキュベートし、そしてＣａｍｂｒｉｄｇｅ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅ
ａｄｅｒ（Ｍｏｄｅｌ ７５２０）において４９０ｎｍ
で読み取った。適切なコントローウェルより高い吸光度
を有するウェルを、ポジティブとして選択し、そしてさ
らに特徴付けた。 【０６７０】ＧＶ９７は、組換えＶＥＧＦ被覆ＥＬＩＳ
Ａプレートに結合せず、しかも組換えヒトＶＥＧＦは、
ＧＶ９７被覆したＥＬＩＳＡプレートに結合しないこと
を見出した。可溶性組換えヒトＶＥＧＦは、５０μｇ／
ｍｌで添加された場合でさえ、組織学的な切片における
腫瘍内皮への５μｇ／ｍｌ ＧＶ９７の結合をブロック
しなかった。 【０６７１】これらのデータは、組換えヒトＶＥＧＦに
おいて隠されるが、ＶＥＧＦが内皮細胞上のそのレセプ
ターに結合すると接近可能になるＶＥＧＦのエピトープ
を、ＧＶ９７が認識することを示唆している。 【０６７２】（Ｃ．株１０保有モルモットにおけるＧＶ
９７局在化）組織学的切片から得られた染色データとは
対照的に、ＧＶ９７抗体は、株１０腫瘍保有モルモット
への注射の後、腫瘍内皮細胞に選択的に局在化した（表
ＸＩＩ）。この腫瘍における内皮細胞の染色は、中程度
の強さであったが、一方、種々の器官における正常な内
皮の染色は、検出不能であった。 【０６７３】（Ｄ．抗−ｂＦＧＦは、腫瘍内皮細胞に選
択的に結合する）ＧＶ９７およびＧＦ８２（これらは、
モルモットｂＦＧＦのＮ末端に対して惹起された）は、
モルモット株１０腫瘍の凍結反応における内皮細胞およ
び２つの型のヒト悪性腫瘍における内皮細胞に強く結合
した（表ＸＩＩＩ）。対照的に、種々のモルモット正常
組織における内皮細胞の比較的弱い染色が観察された。 【０６７４】 【表１５】 【０６７５】 【表１６】 （実施例ＸＩ） （ヒト処置プロトコル）本実施例は、本発明の二重特異
性結合および凝固リガンドを用いるヒト処置プロトコル
に関する。これらのリガンドは、種々のヒトのガンおよ
びさらに他の疾患（例えば、中期またはより長期の血流
の停止が有利である、良性前立腺肥大症および慢性関節
リウマチ）の臨床的処置における使用が意図される。 【０６７６】二重特異性リガンドは、抗腫瘍治療におい
て特に有用な道具であると考えられている。動物研究を
含む本明細書に示されるデータ、ならびにリンパ腫の処
置（Ｇｌｅｎｎｉｅら、１９８８）、Ｔ細胞標的化（Ｎ
ｏｌａｎおよびＫｅｎｎｅｄｙ，１９９０）および薬物
標的化（Ｐａｕｌｕｓ，１９８５）に関する当該分野に
おける知識から、適切な用量および処置法は、容易に開
発され得る。 【０６７７】当然、広範な使用の前に、さらなる動物研
究および臨床治験が行われる。患者の処置およびモニタ
リングを含む、臨床治験を行うための種々の要素は、本
開示の見解から当業者に公知である。以下の情報は、こ
のような治験を確立することにおける使用のための一般
的な指針として示されている。 【０６７８】研究のために選択される患者は、従来の治
療の少なくとも１つの課程に応答し得ず、そして身体検
査、研究室技術、またはＸ線撮影手順により決定される
客観的に測定され得る疾患を有しなければならないこと
が意図される。マウスモノクローナル抗体部分が用いら
れる場合、患者は、マウス免疫グロブリンに対するアレ
ルギーの病歴を有していないべきである。いかなる化学
療法も、研究に入る少なくとも２週間前に止められるべ
きである。 【０６７９】二重特異性リガンド投与に関して、３つの
管腔ポートを備える留置中心静脈カテーテル（ｉｎｄｗ
ｅｌｌｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｖｅｎｏｕｓ ｃａｔ
ｈｅｔｅｒ ｗｉｔｈ ａ ｔｒｉｐｌｅ ｌｕｍｅｎ
ｐｏｒｔ）の使用において特定の利点が見出されると
考えられる。二重特異性リガンドは、例えば、０．２２
μｍフィルターを用いて濾過され、そして例えば、生理
食塩水で、１００ｍｌの最終用量まで適切に希釈される
べきである。使用前に、試験試料もまた、同様の方法で
濾過され、そしてその濃度は、Ａ２８０を測定すること
により濾過の前および後に評価されるべきである。予測
される回収率は、８７〜９９％の範囲内であるべきであ
り、次いでタンパク質損失のための調整が説明され得
る。 【０６８０】二重特異性リガンドは、各患者に２〜７日
間隔に２〜４回の注入で、約４〜２４時間の期間にわた
って投与され得る。投与はまた、７日間にわたる定常速
度の注入により実施され得る。任意の用量レベルで与え
られる注入は、観察される任意の毒性に依存するべきで
ある。従って、グレードＩＩ毒性が、任意の単回の注入
後、または定常速度の注入の特定の期間に達成された場
合、毒性が改善されない限り、さらなる用量は差し控え
られるか、または定常速度の注入は停止されるべきであ
る。増加した用量の二重特異性凝固リガンドは、任意の
カテゴリーにおいて、患者の約６０％が受容し得ないグ
レードＩＩＩまたはグレードＩＶ毒性を示すまで患者の
群に投与されるべきである。この値の２／３である用量
は、安全な用量として定義され得る。 【０６８１】身体検査、腫瘍測定、および臨床検査は、
勿論、処置の前にそして一ヶ月後までの間隔で実施され
るべきである。臨床試験は、全血球数、血清クレアチニ
ン、クレアチンキナーゼ、電解質、尿素、窒素、ＳＧＯ
Ｔ、ビリルビン、アルブミン、および総血清タンパク質
を含むべきである。処置後６０日までに採取される血清
試料は、完全な二重特異性リガンドまたはその成分およ
びリガンドのいずれかまたは両方の部分に対する抗体の
存在についてラジオイムノアッセイにより評価されるべ
きである。任意の標準的なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳ
ＡまたはＲＩＡ）を用いる、血清の免疫学的分析は、治
療薬剤の薬物動態学およびクリアランスの評価を可能に
する。 【０６８２】抗腫瘍応答を評価するために、患者は、最
後の注入から４８時間〜１週間に検査され、そして３０
日後に再び検査されるべきであることが意図される。触
知可能な疾患が存在する場合、全ての塊の２つの垂直直
径は、処置の間毎日、治療の完了後１週間以内、および
３０日目に測定されるべきである。触知不可能な疾患を
測定するために、一連のＣＴスキャンが、４８時間〜１
週間目に、そして３０日目に再び、胸部、腹部、および
骨盤を通して１−ｃｍ間隔で実施され得る。組織試料は
また、疾患部位からの生検、あるいは適切である場合
は、血液または液体試料までも用いて、組織学的に、お
よび／またはフローサイトメトリーにより評価されるべ
きである。 【０６８３】臨床的な応答は、条件にあった尺度により
定義され得る。例えば、完全な応答は、処置１ヶ月後の
全ての測定可能な腫瘍の消失により定義され得る。一
方、部分的な応答は、全ての腫瘍部位が拡大を示さな
い、処置１ヶ月後の全ての評価し得る腫瘍結節の直角を
なす直径の積の合計の５０％以上の減少により定義され
得る。同様に、混合応答は、１つ以上の部位における進
行を伴って、処置１ヶ月後の全ての測定可能な病巣の直
角をなす直径の積の５０％以上の減少により定義され得
る。 【０６８４】本明細書中で開示および請求される全ての
組成物および方法は、本開示の見解から、過度の実験を
要することなく作製および遂行され得る。本発明の組成
物および方法は、好ましい実施態様に関して記載されて
いるが、改変が、本発明の概念、精神、および範囲を逸
脱することなく、本明細書中に開示される組成物、方
法、および方法の工程または一連の工程に適用され得る
ことは当業者に明らかである。さらに詳細には、化学的
および生理学的の両方で関連する特定の薬剤が、同一ま
たは類似した結果が達成されながら本明細書中に記載さ
れる薬剤に代用され得ることは明らかである。当業者に
明らかな全てのこのような類似した置換および改変は、
添付の請求の範囲により定義される本発明の精神、範
囲、および概念内にあると考えられる。 【０６８５】（参考文献）以下の参考文献は、これらの
文献が本明細書に述べられている事柄の例示的な手順ま
たは他の詳細な追加事項を提供する範囲で、本明細書中
に参考として援用される。 【０６８６】 【表１７】 【０６８７】 【発明の効果】本発明により、特異的凝固、例えば、腫
瘍血管系中の凝固を達成する使用のための、副作用が制
限された新規な組成物および方法が提供される。 【０６８８】 【配列表】 (1)一般的情報： (i)出願人： 名称：ボード オブ リージェンツ, ザ ユニバーシティ オブ テキサス システム 番地：201 ウエストセブンス ストリート 市：オースティン 州：テキサス 国：アメリカ合衆国 郵便番号：7870 電話番号：(512)499-4462 テレファックス：(512)499-4523 および 名称：ザ スクリプス リサーチ インスティチュート 番地：10666ノース トレイ パインズ ロード 市：ラホヤ 州：カリフォルニア 国：アメリカ合衆国 郵便番号：92037 (ii)発明者：トープ, フィリップイー. エジントン,トーマス エス. (iii)発明の名称：血管系の特異的凝固のための方法および組成物 (iv)配列数：３２ (v)連絡住所： (A)名称：アーノルド,ホワイト アンド ダーキー (B)番地：ピー.オー. ボックス 4433 (C)市：ヒューストン (D)州：テキサス (E)国：アメリカ合衆国 (F)郵便番号：77210 (vi)コンピューター読み出し形態： (A)媒体型：フロッピー（登録商標）ディスク (B)コンピューター：IBM PC 互換用 (C)OS：PC-DOS/MS-DOS, ASCII (vii)現在の出願データ： (A)出願番号：PCT/US95/07439 (B)出願日：1995年6月7日 (C)分類：不明 (viii)先願データ： (A)出願番号：US08/273,567 (B)出願日：1994年7月11日 (ix)代理人／事務所情報： (A)氏名：パーカー, デビットエル. (B)登録番号：32,165 (C)照会／記録番号：UTFD433P--- （x)電話回線情報： (A)電話：(512)418-3000 (B)テレファックス：(713)789-2679 (C)テレックス：79-0924 (2) 配列番号１の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 27 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号１: GTCATGCCAT GGCCTCAGGCACTACAA 27 (2) 配列番号２の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 32 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号２: TGACAAGCTT ATTCTCTGAA TTCCCCCTTTCT 32 (2) 配列番号３の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 47 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号３: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGCTT CTGGCACTACAAATACT 47 (2) 配列番号４の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 38 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D)トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号４: GTCATGCCAT GGCCTGCTCA GGCACTACAAATACTGTG 38 (2) 配列番号５の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 50 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号５: GTCATGCCAT GGCCCTGGTG CCTCGTGGTT CTTGCGGCACTACAAATACT 50 (2) 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Lys 35 40 45 Cys Phe Tyr ThrThr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu Ile Val 50 55 60 Lys Asp Val LysGln Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80 Gly Asn Val GluSer Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95 Ser Pro Glu PheThr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr 100 105 110 Ile Gln Ser PheGlu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125 Asp Glu Arg ThrLeu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140 Asp Val Phe GlyLys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 150 155 160 Ser Ser Ser GlyLys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175 Ile Asp Val AspLys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val 180 185 190 Ile Pro Ser ArgThr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205 Cys Met Gly GlnGlu Lys Gly Glu Phe Arg Glu 210 215 (2) 配列番号２４の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 1947 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列：配列番号２４: TGCAGCTGCC TGGCTGCCTG GCCCTGGCTG CCCTGTGTAGCCTTGTGCAC AGCCAGCATG 60 TGTTCCTGGC TCCTCAGCAA GCACGGTCGC TGCTCCAGCGGGTCCGGCGA GCCAACACCT 120 TCTTGGAGGA GGTGCGCAAG GGCAACCTAG AGCGAGAGTGCGTGGAGGAG ACGTGCAGCT 180 ACGAGGAGGC CTTCGAGGCT CTGGAGTCCT CCACGGCTACGGATGTGTTC TGGGCCAAGT 240 ACACAGCTTG TGAGACAGCG AGGACGCCTC GAGATAAGCTTGCTGCATGT CTGGAAGGTA 300 ACTGTGCTGA GGGTCTGGGT ACGAACTACC GAGGGCATGTGAACATCACC CGGTCAGGCA 360 TTGAGTGCCA GCTATGGAGG AGTCGCTACC CACATAAGCCTGAAATCAAC TCCACTACCC 420 ATCCTGGGGC CGACCTACAG GAGAATTTCT GCCGCAACCCCGACAGCAGC AACACGGGAC 480 CCTGGTGCTA CACTACAGAC CCCACCGTGA GGAGGCAGGAATGCAGCATC CCTGTCTGTG 540 GCCAGGATCA AGTCACTGTA GCGATGACTC CACGCTCCGAAGGCTCCAGT GTGAATCTGT 600 CACCTCCATT GGAGCAGTGT GTCCCTGATC GGGGGCAGCAGTACCAGGGG CGCCTGGCGG 660 TGACCACACA TGGGCTCCCC TGCCTGGCCT GGGCCAGCGCACAGGCCAAG GCCCTGAGCA 720 AGCACCAGGA CTTCAACTCA GCTGTGCAGC TGGTGGAGAACTTCTGCCGC AACCCAGACG 780 GGGATGAGGA GGGCGTGTGG TGCTATGTGG CCGGGAAGCCTGGCGACTTT GGGTACTGCG 840 ACCTCAACTA TTGTGAGGAG GCCGTGGAGG AGGAGACAGGAGATGGGCTG GATGAGGACT 900 CAGACAGGGC CATCGAAGGG CGTACCGCCA CAAGTGAGTACCAGACTTTC TTCAATCCGA 960 GGACCTTTGG CTCGGGAGAG GCAGACTGTG GGCTGCGACCTCTGTTCGAG AAGAAGTCGC 1020 TGGAGGACAA AACCGAAAGA GAGCTCCTGG AATCCTACATCGACGGGCGC ATTGTGGAGG 1080 GCTCGGATGC AGAGATCGGC ATGTCACCTT GGCAGGTGATGCTTTTCCGG AAGAGTCCCC 1140 AGGAGCTGCT GTGTGGGGCC AGCCTCATCA GTGACCGCTGGGTCCTCACC GCCGCCCACT 1200 GCCTCCTGTA CCCGCCCTGG GACAAGAACT TCACCGAGAATGACCTTCTG GTGCGCATTG 1260 GCAAGCACTC CCGCACCAGG TACGAGCGAA ACATTGAAAAGATATCCATG TTGGAAAAGA 1320 TCTACATCCA CCCCAGGTAC AACTGGCGGG AGAACCTGGACCGGGACATT GCCCTGATGA 1380 AGCTGAAGAA GCCTGTTGCC TTCAGTGACT ACATTCACCCTGTGTGTCTG CCCGACAGGG 1440 AGACGGCAGC CAGCTTGCTC CAGGCTGGAT ACAAGGGGCGGGTGACAGGC TGGGGCAACC 1500 TGAAGGAGAC GTGGACAGCC AACGTTGGTA AGGGGCAGCCCAGTGTCCTG CAGGTGGTGA 1560 ACCTGCCCAT TGTGGAGCGG CCGGTCTGCA AGGACTCCACCCGGATCCGC ATCACTGACA 1620 ACATGTTCTG TGCTGGTTAC AAGCCTGATG AAGGGAAACGAGGGGATGCC TGTGAAGGTG 1680 ACAGTGGGGG ACCCTTTGTC ATGAAGAGCC CCTTTAACAACCGCTGGTAT CAAATGGGCA 1740 TCGTCTCATG GGGTGAAGGC TGTGACCGGG ATGGGAAATATGGCTTCTAC ACACATGTGT 1800 TCCGCCTGAA GAAGTGGATA CAGAAGGTCA TTGATCAGTTTGGAGAGTAG GGGGCCACTC 1860 ATATTCTGGG CTCCTGGAAC CAATCCCGTG AAAGAATTATTTTTGTGTTT CTAAAACTAT 1920 GGTTCCCAAT AAAAGTGACTCTCAGCG 1947 (2) 配列番号２５の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 2462 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列：配列番号２５: TCAACAGGCA GGGGCAGCAC TGCAGAGATT TCATCATGGTCTCCCAGGCC CTCAGGCTCC 60 TCTGCCTTCT GCTTGGGCTT CAGGGCTGCC TGGCTGCAGGCGGGGTCGCT AAGGCCTCAG 120 GAGGAGAAAC ACGGGACATG CCGTGGAAGC CGGGGCCTCACAGAGTCTTC GTAACCCAGG 180 AGGAAGCCCA CGGCGTCCTG CACCGGCGCC GGCGCGCCAACGCGTTCCTG GAGGAGCTGC 240 GGCCGGGCTC CCTGGAGAGG GAGTGCAAGG AGGAGCAGTGCTCCTTCGAG GAGGCCCGGG 300 AGATCTTCAA GGACGCGGAG AGGACGAAGC TGTTCTGGATTTCTTACAGT GATGGGGACC 360 AGTGTGCCTC AAGTCCATGC CAGAATGGGG GCTCCTGCAAGGACCAGCTC CAGTCCTATA 420 TCTGCTTCTG CCTCCCTGCC TTCGAGGGCC GGAACTGTGAGACGCACAAG GATGACCAGC 480 TGATCTGTGT GAACGAGAAC GGCGGCTGTG AGCAGTACTGCAGTGACCAC ACGGGCACCA 540 AGCGCTCCTG TCGGTGCCAC GAGGGGTACT CTCTGCTGGCAGACGGGGTG TCCTGCACAC 600 CCACAGTTGA ATATCCATGT GGAAAAATAC CTATTCTAGAAAAAAGAAAT GCCAGCAAAC 660 CCCAAGGCCG AATTGTGGGG GGCAAGGTGT GCCCCAAAGGGGAGTGTCCA TGGCAGGTCC 720 TGTTGTTGGT GAATGGAGCT CAGTTGTGTG GGGGGACCCTGATCAACACC ATCTGGGTGG 780 TCTCCGCGGC CCACTGTTTC GACAAAATCA AGAACTGGAGGAACCTGATC GCGGTGCTGG 840 GCGAGCACGA CCTCAGCGAG CACGACGGGG ATGAGCAGAGCCGGCGGGTG GCGCAGGTCA 900 TCATCCCCAG CACGTACGTC CCGGGCACCA CCAACCACGACATCGCGCTG CTCCGCCTGC 960 ACCAGCCCGT GGTCCTCACT GACCATGTGG TGCCCCTCTGCCTGCCCGAA CGGACGTTCT 1020 CTGAGAGGAC GCTGGCCTTC GTGCGCTTCT CATTGGTCAGCGGCTGGGGC CAGCTGCTGG 1080 ACCGTGGCGC CACGGCCCTG GAGCTCATGG TGCTCAACGTGCCCCGGCTG ATGACCCAGG 1140 ACTGCCTGCA GCAGTCACGG AAGGTGGGAG ACTCCCCAAATATCACGGAG TACATGTTCT 1200 GTGCCGGCTA CTCGGATGGC AGCAAGGACT CCTGCAAGGGGGACAGTGGA GGCCCACATG 1260 CCACCCACTA CCGGGGCACG TGGTACCTGA CGGGCATCGTCAGCTGGGGC CAGGGCTGCG 1320 CAACCGTGGG CCACTTTGGG GTGTACACCA GGGTCTCCCAGTACATCGAG TGGCTGCAAA 1380 AGCTCATGCG CTCAGAGCCA CGCCCAGGAG TCCTCCTGCGAGCCCCATTT CCCTAGCCCA 1440 GCAGCCCTGG CCTGTGGAGA GAAAGCCAAG GCTGCGTCGAACTGTCCTGG CACCAAATCC 1500 CATATATTCT TCTGCAGTTA ATGGGGTAGA GGAGGGCATGGGAGGGAGGG AGAGGTGGGG 1560 AGGGAGACAG AGACAGAAAC AGAGAGAGAC AGAGACAGAGAGAGACTGAG GGAGAGACTC 1620 TGAGGACATG GAGAGAGACT CAAAGAGACT CCAAGATTCAAAGAGACTAA TAGAGACACA 1680 GAGATGGAAT AGAAAAGATG AGAGGCAGAG GCAGACAGGCGCTGGACAGA GGGGCAGGGG 1740 AGTGCCAAGG TTGTCCTGGA GGCAGACAGC CCAGCTGAGCCTCCTTACCT CCCTTCAGCC 1800 AAGCCCCACC TGCACGTGAT CTGCTGGCCC TCAGGCTGCTGCTCTGCCTT CATTGCTGGA 1860 GACAGTAGAG GCATGAACAC ACATGGATGC ACACACACACACGCCAATGC ACACACACAG 1920 AGATATGCAC ACACACGGAT GCACACACAG ATGGTCACACAGAGATACGC AAACACACCG 1980 ATGCACACGC ACATAGAGAT ATGCACACAC AGATGCACACACAGATATAC ACATGGATGC 2040 ACGCACATGC CAATGCACGC ACACATCAGT GCACACGGATGCACAGAGAT ATGCACACAC 2100 CGATGTGCGC ACACACAGAT ATGCACACAC ATGGATGAGCACACACACAC CAAGTGCGCA 2160 CACACACCGA TGTACACACA CAGATGCACA CACAGATGCACACACACCGA TGCTGACTCC 2220 ATGTGTGCTG TCCTCTGAAG GCGGTTGTTT AGCTCTCACTTTTCTGGTTC TTATCCATTA 2280 TCATCTTCAC TTCAGACAAT TCAGAAGCAT CACCATGCATGGTGGCGAAT GCCCCCAAAC 2340 TCTCCCCCAA ATGTATTTCT CCCTTCGCTG GGTGCCGGGCTGCACAGACT ATTCCCCACC 2400 TGCTTCCCAG CTTCACAATA AACGGCTGCG TCTCCTCCGCACACCTGTGG TGCCTGCCAC 2460 CC 2462 (2) 配列番号２６の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 1437 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列：配列番号２６: ATGCAGCGCG TGAACATGAT CATGGCAGAA TCACCAAGCCTCATCACCAT CTGCCTTTTA 60 GGATATCTAC TCAGTGCTGA ATGTACAGTT TTTCTTGATCATGAAAACGC CAACAAAATT 120 CTGAATCGGC CAAAGAGGTA TAATTCAGGT AAATTGGAAGAGTTTGTTCA AGGGAACCTT 180 GAGAGAGAAT GTATGGAAGA AAAGTGTAGT TTTGAAGAACCACGAGAAGT TTTTGAAAAC 240 ACTGAAAAGA CAACTGAATT TTGGAAGCAG TATGTTGATGGAGATCAGTG TGAGTCCAAT 300 CCATGTTTAA ATGGCGGCAG TTGCAAGGAT GACATTAATTCCTATGAATG TTGGTGTCCC 360 TTTGGATTTG AAGGAAAGAA CTGTGAATTA GATGTAACATGTAACATTAA GAATGGCAGA 420 TGCGAGCAGT TTTGTAAAAA TAGTGCTGAT AACAAGGTGGTTTGCTCCTG TACTGAGGGA 480 TATCGACTTG CAGAAAACCA GAAGTCCTGT GAACCAGCAGTGCCATTTCC ATGTGGAAGA 540 GTTTCTGTTT CACAAACTTC TAAGCTCACC CGTGCTGAGGCTGTTTTTCC TGATGTGGAC 600 TATGTAAATC CTACTGAAGC TGAAACCATT TTGGATAACATCACTCAAGG CACCCAATCA 660 TTTAATGACT TCACTCGGGT TGTTGGTGGA GAAGATGCCAAACCAGGTCA ATTCCCTTGG 720 CAGGTTGTTT TGAATGGTAA AGTTGATGCA TTCTGTGGAGGCTCTATCGT TAATGAAAAA 780 TGGATTGTAA CTGCTGCCCA CTGTGTTGAA ACTGGTGTTAAAATTACAGT TGTCGCAGGT 840 GAACATAATA TTGAGGAGAC AGAACATACA GAGCAAAAGCGAAATGTGAT TCGAGCAATT 900 ATTCCTCACC ACAACTACAA TGCAGCTATT AATAAGTACAACCATGACAT TGCCCTTCTG 960 GAACTGGACG AACCCTTAGT GCTAAACAGC TACGTTACACCTATTTGCAT TGCTGACAAG 1020 GAATACACGA ACATCTTCCT CAAATTTGGA TCTGGCTATGTAAGTGGCTG GGCAAGAGTC 1080 TTCCACAAAG GGAGATCAGC TTTAGTTCTT CAGTACCTTAGAGTTCCACT TGTTGACCGA 1140 GCCACATGTC TTCGATCTAC AAAGTTCACC ATCTATAACAACATGTTCTG TGCTGGCTTC 1200 CATGAAGGAG GTAGAGATTC ATGTCAAGGA GATAGTGGGGGACCCCATGT TACTGAAGTG 1260 GAAGGGACCA GTTTCTTAAC TGGAATTATT AGCTGGGGTGAAGAGTGTGC AATGAAAGGC 1320 AAATATGGAA TATATACCAA GGTATCCCGG TATGTCAACTGGATTAAGGA AAAAACAAAG 1380 CTCACTTAAT GAAAGATGGA TTTCCAAGGT TAATTCATTGGAATTGAAAA TTAACAG 1437 (2) 配列番号２７の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 1126 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (xi) 配列：配列番号２７: GGATTCGAAG GCAAAAACTG TGAATTATTC ACACGGAAGCTCTGCAGCCT GGACAACGGG 60 GACTGTGACC AGTTCTGCCA CGAGGAACAG AACTCTGTGGTGTGCTCCTG CGCCCGCGGG 120 TACACCCTGG CTGACAACGG CAAGGCCTGC ATTCCCACAGGGCCCTACCC CTGTGGGAAA 180 CAGACCCTGG AACGCAGGAA GAGGTCAGTG GCCCAGGCCACCAGCAGCAG CGGGGAGGCC 240 CCTGACAGCA TCACATGGAA GCCATATGAT GCAGCCGACCTGGACCCCAC CGAGAACCCC 300 TTCGACCTGC TTGACTTCAA CCAGACGCAG CCTGAGAGGGGCGACAACAA CCTCACCAGG 360 ATCGTGGGAG GCCAGGAATG CAAGGACGGG GAGTGTCCCTGGCAGGCCCT GCTCATCAAT 420 GAGGAAAACG AGGGTTTCTG TGGTGGAACC ATTCTGAGCGAGTTCTACAT CCTAACGGCA 480 GCCCACTGTC TCTACCAAGC CAAGAGATTC GAAGGGGACCGGAACACGGA GCAGGAGGAG 540 GGCGGTGAGG CGGTGCACGA GGTGGAGGTG GTCATCAAGCACAACCGGTT CACAAAGGAG 600 ACCTATGACT TCGACATCGC CGTGCTCCGG CTCAAGACCCCCATCACCTT CCGCATGAAC 660 GTGGCGCCTG CCTGCCTCCC CGAGCGTGAC TGGGCCGAGTCCACGCTGAT GACGCAGAAG 720 ACGGGGATTG TGAGCGGCTT CGGGCGCACC CACGAGAAGGGCCGGCAGTC CACCAGGCTC 780 AAGATGCTGG AGGTGCCCTA CGTGGACCGC AACAGCTGCAAGCTGTCCAG CAGCTTCATC 840 ATCACCCAGA ACATGTTCTG TGCCGGCTAC GACACCAAGCAGGAGGATGC CTGCCAGGGG 900 GACAGCGGGG GCCCGCACGT CACCCGCTTC AAGGACACCTACTTCGTGAC AGGCATCGTC 960 AGCTGGGGAG AGGGCTGTGC CCGTAAGGGG AAGTACGGGATCTACACCAA GGTCACCGCC 1020 TTCCTCAAGT GGATCGACAG GTCCATGAAA ACCAGGGGCTTGCCCAAGGC CAAGAGCCAT 1080 GCCCCGGAGG TCATAACGTC CTCTCCATTA AAGTGAGATCCCACTC 1126 (2) 配列番号２８の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 45 塩基対 (B)型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号２８: GAAGAAGGGA TCCTGGTGCC TCGTGGTTCT GGCACTACAAATACT 45 (2) 配列番号２９の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 30 塩基対 (B) 型： 核酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： 他の核酸 (A) 説明： /desc = 「ＤＮＡ」 (xi) 配列：配列番号２９: CTGGCCTCAA GCTTAACGGAATTCACCTTT 30 (2) 配列番号３０の情報: (i) 配列の特色： (A)長さ： 25 アミノ酸 (B) 型： アミノ酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列：配列番号３０: Ala Pro Met AlaGlu Gly Glu Gln Lys Pro Arg Glu Val Val Lys Phe 1 5 10 15 Met Asp Val TyrLys Arg Ser Tyr Cys 20 25 (2) 配列番号３１の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 26 アミノ酸 (B) 型： アミノ酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列：配列番号３１: Ala Pro Met AlaGlu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys 1 5 10 15 Phe Met Asp ValTyr Gln Arg Ser Tyr Cys 20 25 (2) 配列番号３２の情報: (i) 配列の特色： (A) 長さ： 25 アミノ酸 (B) 型： アミノ酸 (C) 鎖の数： 一本鎖 (D) トポロジー： 直鎖状 (ii) 配列の種類： ペプチド (xi) 配列：配列番号３２: Met Ala Ala GlySer Ile Thr Thr Leu Pro Ala Leu Pro Glu Gly Gly 1 5 10 15 Asp Gly Gly AlaPhe Ala Pro Gly Cys 20 25
【図面の簡単な説明】 【図１】図１は、Ｂ２１−２／１０Ｈ１０二重特異性抗
体を介した、ｔＴＦのＡ２０細胞への繋ぎ止め（ｔｅｔ
ｈｅｒｉｎｇ）を示す。Ａ２０細胞を様々な濃度のＢ２
１−２／１０Ｈ１０（白四角）、ＳＦＲ８／１０Ｈ１０
（黒丸）またはＢ２１−２／ＯＸ７（白丸）および過剰
量の１２５Ｉ−ｔＴＦと共に、アジ化ナトリウムの存在
下４℃にて１時間インキュベートした。細胞に結合した
１２５Ｉ−ｔＴＦの数を、実施例ＩＩに説明するように
決定した。 【図２】図２は、Ａ２０細胞当たりの繋ぎ止められたｔ
ＴＦ分子の数と、血漿の凝固を誘導する能力との関係を
示す。Ａ２０細胞を、様々な濃度のＢ２１−２／１０Ｈ
１０および過剰量のｔＴＦと共にアジ化ナトリウムの存
在下４℃にて１時間インキュベートした。細胞を洗浄
し、３７℃に加温し、カルシウムおよびマウス血漿を加
え、最初のフィブリン鎖が形成されるまでの時間を記録
した（横座標）。Ａ２０細胞を、二重特異性抗体および
１２５Ｉ−ｔＴＦと共に４℃にて１時間インキュベート
する同一の研究を行って、細胞に特異的に結合したｔＴ
Ｆの数を、実施例ＩＩに説明するように決定した（縦座
標）。未処理のＡ２０細胞に加えられた血漿（すなわち
ｔＴＦ分子０個／細胞）は、１９０秒で凝固した。 【図３】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃおよび図３Ｄは、コア
ギュリガンド投与後の血管血栓形成および腫瘍壊死の時
間経過を示す。直径０．８ ｃｍのＣ１３００（Ｍｕ
γ）腫瘍を有する３匹のマウスのグループに、１４μｇ
のＢ２１−２／１０Ｈ１０および１１μｇのｔＴＦから
なるコアギュリガンドの静脈内注射をおこなった。図３
Ａ；注射前：血管は完全（ｉｎｔａｃｔ）であり腫瘍細
胞は健常である。図３Ｂ；０．５時間：腫瘍全体にわた
る血管が血栓を有している；腫瘍細胞は健常である。図
３Ｃ；４時間：全腫瘍血管中に稠密な血栓が存在してお
り、腫瘍細胞は分離して核凝縮が発生している。腫瘍間
隙内に赤血球が見える。図３Ｄ；２４時間：腫瘍全体に
わたって進行した腫瘍壊死。矢印は血管を示す。 【図４】図４は、腫瘍血管系を照準とするコアギュリガ
ンド治療によって誘導された固形腫瘍の退行を示す。直
径約０．８ｃｍのＣ１３００（Ｍｕγ）腫瘍を有するＮ
ｕ／ｎｕマウスに、ｔＴＦ（１１μｇ）と混合したＢ２
１−２／１０Ｈ１０（１４μｇ）の静脈内注射を、１週
間間隔で２回おこなった（矢印）（白四角）。コントロ
ールグループのマウスには、ｔＴＦのみ（黒丸）、Ｂ２
１−２／１０Ｈ１０のみ（白丸）または希釈液（黒四
角）を同用量与えた。イソ型適合性（ｍａｃｈｅｄ）コ
ントロール二重特異性抗体（ＳＦＲ８／１０Ｈ１０、Ｏ
Ｘ７／１０Ｈ１０またはＢ２１−２／ＯＸ７）およびｔ
ＴＦを同用量与えた他のコントロールグループのマウス
は、ｔＴＦのみを与えられた動物におけるものと同様な
腫瘍応答を示した。グループ毎のマウスの数は７または
８であった。 【図５】図５は、抗体−ｔＴＦ構築物の例である。この
図は、化学的に誘導体化された抗体をジスルフィド結合
を介して化学的に誘導体化されたｔＴＦに連結すること
によって合成された接合体と、様々なＴＦまたはＴＦ二
量体の抗体およびそのフラグメントへの連結によって合
成された接合体との両方を示している。 【図６】図６は、Ａ２０細胞に結合した際のｔＴＦ接合
体の血餅形成活性を示す。Ａ２０細胞を、様々な濃度の
二重特異性Ｂ２１−２／１０Ｈ１０＋Ｈ６［ｔＴＦ］を
１：１のモル濃度比で１時間予備混合したもの（白四
角）、Ｂ２１−２抗体−Ｈ ６Ｃ［ｔＴＦ］（黒丸）、お
よびＢ２１−２抗体−Ｈ６［ｔＴＦ］（黒三角）と共に
アジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュベー
トした。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウムお
よびマウス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成され
るまでの時間を記録した。結果を、ｔＴＦ不在下の血餅
形成時間の％血餅形成時間として表している。 【図７】図７は、抗腫瘍細胞ｔＴＦ接合体の血餅形成活
性を示す。ＴＦ９−６Ｂ４およびＴＦ８−５Ｇ９抗体と
プレインキュベートしたＬＳ１７４細胞（黒四角）、Ｗ
ｉｄｒ細胞（黒丸）およびＨ４６０細胞（黒三角）を、
様々な濃度の、Ｄ６１２抗体−Ｈ６Ｃ［ｔＴＦ］（黒四
角）、ＫＳ１／４抗体−Ｈ６［ｔＴＦ］（黒丸）、およ
びＸＭＭＣＯ７９１抗体−Ｈ６［ｔＴＦ］（黒三角）と
共にアジ化ナトリウムの存在下４℃にて１時間インキュ
ベートした。細胞を洗浄し、３７℃に加温し、カルシウ
ムおよびマウス血漿を加え、最初のフィブリン鎖が形成
されるまでの時間を記録した。結果を、ｔＴＦ不在下の
血餅形成時間の％血餅形成時間として表している。 【図８】図８は、第ＩＩ／ＩＩａ因子、第ＶＩＩ／ＩＩ
ａ因子、第ＩＸ／ＩＸａ因子、および第Ｘ／Ｘａ因子、
のＧｌａドメイン（γ−カルボキシグルタミン酸）を示
す。矢印は、シグナルペプチド切断部位およびペプチド
切断部位ならびに活性化切断部位（斜めの矢印）を表し
ている。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 13/08 Ａ６１Ｐ 13/08 17/06 17/06 19/02 19/02 27/02 27/02 27/06 27/06 35/00 35/00 Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (71)出願人 593052785 ザ スクリップス リサーチ インスティ テュート アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92037 ラ ジョラ ノース トーリー パインス ロード 10550 (72)発明者 フィリップ イー． トルペ アメリカ合衆国 テキサス 75214， ダ ラス， ウエストレイク アベニュー 6918 (72)発明者 トーマス エス． エドギントン アメリカ合衆国 カリフォルニア 92037, ラ ホヤ， アベニダ デ ラ プラヤ 2362

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  1. 【特許請求の範囲】 【請求項１】 図５に示される構造を有する結合リガン
    ド。
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